URA3 - Farmaciaunina2.it

Fonti naturali:
Proteine di interesse
farmaceutico
Prodotti difficili da isolare
Possono comportare reazioni immunitarie (diff. sp.)
Contaminazione virale e patogenica
Difficile soddisfare la domanda
Proteine ricombinanti:
Più economiche
Più “safe”
Rifornimento infinito

Processo a sei step:
Isolamento del gene di interesse
Introduzione del gene in un vettore di espressione
Trasformazione nella cellula ospite
Crescita delle cellule mediante processi di
fermentazione
Isolamento & purificazione della proteina
Formulazione del prodotto finale

Batteri
Vantaggi Svantaggi
Crescono velocemente (8 hrs
per produrre una proteina)
Rese elevate (50-500 mg/L)
Basso costo del terreno
Costi di fermentazione
contenuti
Difficoltà di esprimere proteine di
grosse dimensioni (>50 kD)
Incapacità di glicosilare e rimuovere
il peptide segnale
Proteine eucariote a volte tossiche
Incapacità di gestire proteine ricche
di S-S
Vantaggi Altri vantaggi
Rese elevate (50-5000 mg/L)
Basso costo del terreno
Costi di fermentazione
contenuti
Lieviti
Possono esprimere proteine di
grosse dimensioni (>50 kD)
Glicosilazione e rimozione del
peptide segnale
Presenza di chaperonine che
consentono un folding corretto
Gestiscono proteine ricche di S-S

LIEVITO:
L’ E. coli degli Eucarioti

Complessità genomica
Organism Size (MB) Genes genes/MB
E. coli 4.6 4400 950
Lievito 12.1 5800 480
Drosophila 180 13700 80
Uomo 2900 27000 9.3

Utilizzo del lievito come modello sperimentale:
vantaggi
• Terreno economico - LB simile
• Duplicazione rapida - lievito - 90 min., E. coli - 20 min., uomo anni
• Tool genetici ben sviluppati – Stati: aploide/diploide;
Ricombinazione e isolamento mutanti
• Geneticamente conservato – I lieviti sono più “vicini” all’uomo di E. coli
• Completamente sequenziato- 5800 genes, 40% ORFs di funzione sconosciuta
• Pochi introni- cDNA
• Trasformabile – Modifica numero copie di geni; Eliminazione geni specifici
• Buon sistema modello- Molti geni sono conservati tra uomo e lievito

Saccharomyces cerevisiae:
Adattabilità a svariate condizioni ambientali
Produzione vino e birra: tolleranza basso pH, alta conc etanolo
Panificazione: produzione di CO 2 rapidamente da zucchero
Cell factory: GRAS, facile da ingegnerizzare
Drug screening: eucariota, ma facile da usare come batteri
Sistema modello: studio del funzionamento delle cellule

Saccharomyces cerevisiae come SISTEMA MODELLO
1997 – PRIMO eucariota sequenziato
6607 ORFs
Saccharomyces Genome Database
http://www.yeastgenome.org/
Genoma mitocondriale – 2micron circle
Telomeri e centromeri semplici
Ridondanza
4885 ORFs, 73.94% 912 ORFs, 13.8% 810 ORFs, 12.26%

Candida albicans
•Lievito patogeno;
•ife

Schizosaccharomyces pombe:
(Fission yeast)
È utilizzato come organismo modello in biologia molecolare e
cellulare
Cancro
Diabete
Fibrosi cistica
Danni DNA/errori replicazione
Si riproduce mediante scissione binaria
4800 ORF, 3 cromosomi, solitamente aploide
Disacidificazione vini

Altri lieviti importanti:
Kluyveromyces lactis: milk yeast; organismo modello
sfruttato per la fermentazione su lattosio
Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolytica:
sistemi usati per la produzione di proteine
Altri funghi importanti:
Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora....: Funghi
filamentosi, microrganismi modello

Ciclo vitale dei lieviti
Budding Yeast Fission Yeast

•Condensazione dei cromosomi non visibile
•Inizio fuso fase S non G2
•Membrana nucleare intatta
•Dimensioni
Ciclo cellulare del lievito

•Dimensioni aploide vs
diploide
•Homothallic
Ciclo vitale del lievito
Nitrogen starvation

Il sesso nei lieviti!
Risposta ai fattori a- o alpha-
Componenti conservate tra uomo e lievito
Legame dei fattori a- o alpha- ad un recettore
specifico
Riorientamento della cellula
Cascata MAP
Arresto del ciclo cellulare
Espressione geni necessari per la fusione
1
2
Recettori transmembrana a
Associate a proteine-G
1: Orientamento della cellula
2: Arresto del ciclo cellulare
3: Espressione geni per la fusione
3

•In natura…2n!
•Mating type switch
•Funzione del mating
Formazione di un lievito diploide:

Processo a sei step:
Isolamento del gene di interesse
Introduzione del gene in un vettore di espressione
Trasformazione nella cellula ospite
Crescita delle cellule mediante processi di
fermentazione
Isolamento & purificazione della proteina
Formulazione del prodotto finale

Come si sceglie il vettore
giusto????
Compatibile con la cellula ospite
Necessita di una buona combinazione di:
Promotori forti
ribosome binding sites
Sequenze di terminazione
affinity tag o sequenze per rendere le proteine solubili
Siti di restrizione multi-enzyme

Clonaggio in lievito:
Clonaggio e preparazione di plasmidi
molto inefficiente (shuttle-vectors)
Numero di copie di plasmidi per cellula: 1-
50
Può contenere più di un plasmide
contemporaneamente
Sistema di ricombinazione omologa
affidabile ed efficiente

Vettori Shuttle
Integrato, low copy, molto stabile
High copy (20-40/cell),
relativamente stabile
High copy, instabile
Low copy (2), stabile

Integrative plasmids (YIp):
Backbone di un vettore
di E. coli (pBR322,
pUC19, pBLUESCRIPT)
Marcatore di selezione
per lievito (URA3, HIS3,
TRP1, LEU2)
Origine di replicazione per
lievito: assente
Propagati mediante
integrazione genomica
Vettori-shuttle Lievito-E. coli
Amp-resistance
Pst I (4795)
Apa LI (3971)
Apa LI (5217)
PMB1
Apa LI (3473)
YIp5: pBR322 più gene URA3
YIp5
5541bp
Eco R I (2)
Cla I (28)
Xma I (2541)
Sma I (2543)
Hin d III (33)
Bam H I (379)
URA3
Ava I (2541)
Tet-resistance
Pst I (1644)
Nco I (1867)

Integrazione del plasmide nel genoma di lievito:
Ricombinazione omologa
Duplicazione della regione target
La linearizzazione del plasmide incrementa il tasso di
ricombinazione
Intergazione stabile
X
ura3
X
plasmide
ura3
plasmide
URA3
URA3
genoma
genoma

Costruzione di un null mutant

Vettori-shuttle Lievito-E. coli
Plasmidi episomali (YEp):
Backbone di u vettore
di E. coli (pBR322,
pUC19, pBLUESCRIPT)
Marcatore di selezione
per lievito (URA3, HIS3,
TRP1, LEU2)
Origine di replicazione del
plasmide 2micron del
lievito
Propagati stabilmente
high copy number ( 20-50
per cellula)
L’uso di marker ”difettosi”
può spingere il numero di
plasmidi fino a 200/cell
PMB1
Apa LI (5701)
Amp-resistance
Apa LI (6199)
Pst I (7023)
Ava I (4835)
Apa LI (7445)
Tet-resistance
EcoR I (2)
YEp24
7769bp
BamH I (3785)
Hind III (106)
URA3
Xma I (3379)
Ava I (3379)
Sma I (3381)
Hind III (3439)
2micron ORI
Ava I (1391)
Pst I (2001)
EcoR I (2242)
Cla I (2268)
Hind III (2273)
Pst I (2482)
Nco I (2705)
YEp24: pBR322 plus the URA3 gene, plus 2micron origin

Replicative centromeric plasmids
(YCp) :
backbone di u vettore di E. coli
(pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT)
Marcatore di selezione per lievito
(URA3, HIS3, TRP1, LEU2)
origine di replicazione cromosomale
ARS (autonomously replicating
sequence)
centromero CEN di cromosoma di
lievito
Propagati stabilmente
Basso numero di copie (1 per cellula)
Vettori-shuttle Lievito-E. coli
Amp-resistance
Apa LI (6380)
PMB1
Apa LI (5882)
Apa LI (5457)
Pst I (5451)
Pst I (7204)
ARS1
Ava I (4703)
Apa LI (7626)
CEN4
EcoR I (2)
Cla I (28)
YCp50
7950bp
Hind III (33)
BamH I (379)
Tet-resistance
POLY
Pst I (1644)
Nco I (1867)
URA3
Xma I (2541)
Ava I (2541)
Sma I (2543)
POLY
YCp50: pBR322 plus the URA3 gene, plus CEN4, plus ARS1

Delezione genica in lievito
1) In vitro: realizzazione costrutto (gene marcatore affiancato da porzioni del
gene da eliminare)
2) In vivo: Inserimento del costrutto in lievito dove sostituisce il gene target
3) Analisi genotipica e fenotipica per confermare la delezione
in vitro
in vivo
GDI
URA3
URA3
Gene di interesse
X X
URA3
Inserimento del GDI in un plasmide
Ricombinazione omologa in lievito
Delezione del GDI dal genoma

Delezione genica in lievito
Come generare il costrutto per la delezione:
(1)Digestione con enzimi di restrizione e successiva ligazione
(2)PCR in due volte senza step di clonaggio
(3)Unico step di PCR con primer lunghi

ResI
ResI
Delezione genica in lievito (1)
Digestione con enzimi di restrizione e successiva ligazione
URA3
URA3
ResII
ResI
ResII
URA3
ResI
ResII
ResI
GDI
ResII
GDI
ResII

Delezione genica in lievito (2)
√ PCR in due volte senza step di clonaggio
GDI
URA3
URA3
URA3

Delezione genica in lievito (3)
√ Unico step di PCR con primer lunghi:
URA3

Altri usi dell’integrazione genica (1)
Inserimento nella cassetta di delezione di un gene reporter (lacZ) che
lo pone sotto il controllo del promotore del GDI per studiarne
l’espressione
Usando tale costrutto in un diploide si può studiare l’espressione
genica (monitorando l’attivita’ della beta–galattosidase) prima nel
diploide in caso di un gene essenziale
Promotore X
lacZ
GDI1
URA3
Cellula diploide

Altri usi dell’integrazione genica (2)
Taggaggio genico: Inserimento nella cassetta del GDI in frame con
lacZ/ GFP/immuno-tag per ottenere una proteina di fusione
facilmente rilevabile o purificabile.
GDI
GFP
URA3

POP-out del marcatore
Riutilizzare il marcatore per successive delezioni
Eliminazione di tracce di DNA esogeno
Up REPEAT URA3 REPEAT Dw
Up OLD Dw
Terreno contente un composto che impedisce
la crescita alle cellule contenenti il gene URA3
Terrene non contenente uracile
OLD
Up
URA3
REPEAT
REPEAT
Up REPEAT Dw
Dw

Applicazioni della ricombinazione
omologa in lievito: clonaggio mediante
gap-repair
1) Cotrasformazione del gene di interesse con il plasmide
2) Cotrasformazione di 2 geni di interesse con il plasmide
3) Ricombinazione tra il plasmide scelto e genoma
1
X
gapped plasmid
GDI
X
repair fragment
2
gapped plasmid
X
YFG1 GDI
X
3
gapped plasmid
YFG1 GDI
X X
Copia genomica usata per riparare il gap;
Il templato viene duplicato

Cloning Mutants by Gapped
Plasmid Repair

Promotori: costitutivi
ADH1 – alcohol dehydrogenase
GPD – glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
PMA1 – plasma membrane H + -ATPase
PDR5 – pleiotropic drug resistant pump
PMA1 & PDR5 –L’ espressione può raggiungere
anche il 10% delle proteine della membrana
plasmatica

Gal1
Promotori: Inducibili
CUP1 – metalothionein gene promoter
Inducibile grazie all’aggiunta di ioni rame
PHO 5 – indotto da basse concentrazioni di fosfato
inorganico extracellulare
HSE – tandem heat shock elements
Indotto da incremento della temperatura fino a 37 o C

Gal1
Promotori: Inducibili
GAL genes – metabolismo del galattosio
Inducibile dal galattosio
Represso in presenza di glucosio
Antimalarian drug

Pichia pastoris
Similitudini con Saccharomyces cerevisiae:
Facile da manipolare
Più veloce, più semplice, meno costoso di altri sistemi
eucariotici
Vantaggi rispetto a Saccharmoyces cerevisiae:
Livello di espressione di proteine eterologhe 10-100 volte
SUPERIORE!!!!
Pichia è un lievito metilotrofico (metabolizza metanolo)
CH 3 OH
AOX
O 2 H 2 O 2
HCHO

2 geni codificano per l’alcohol oxidase:
AOX1e AOX2
Pichia pastoris
AOX1 principale responsabile dell’attività
AOX1 inducibile con metanolo
Può raggiungere fino al 30% delle proteine totali solubili in
cellule cresciute con metanolo
Controllato a livello trascrizionale
Simile al promotore Gal1: Trascrizione repressa da glucosio,
anche in presenza di metanolo

Ceppi di Pichia mutanti utilizzati nelle strategie produttive:
Fenotipi :
1) Mut + : AOX1 e AOX2 sono presenti e funzionali, crescono rapidamente su metanolo
2) Mut s : “slow”, sono aox1- AOX2 più lenti (5-10% attività presente) (utilizzati, ad es, per
produzione di antigeni contro epatite B)
3) Mut - : mutanti aox1,2-, incapaci di crescere su metanolo. Crescono molto più
lentamente, utili in alcuni casi nella produzione di proteine ricombinanti
Sviluppati vettori soprattutto di integrazione (che avviene principalmente per
ricombinazione omologa)
Ottimizzato l’uso di promotori, soprattutto quelli della via di utilizzo del metanolo
Possibilità di utilizzo di marcatori sia metabolici (principalmente HIS4) sia antibiotici
(principalmente zeocina)
Possibilità di produrre la proteina eterologa nel citoplasma oppure secreta nel mezzo. La
sequenza “leader” pre-pro dell’alpha factor di S. cerevisiae viene utilizzata frequentemente
per guidare la secrezione.
Sviluppati ceppi deleti in proteasi, in associazione o meno con ottimizzazione di strategie
di coltivazione

Vantaggi per P. pastoris
Cresce fino a raggiungere densità cellulari estremamente
elevate
Intracellulare o Secrete
Pichia secerne poche proteine native (0,5%)
Poche proteasi nel mezzo
Purificazione più semplice!!!
Elevate rese di prodotto
Esempio: Sea Raven anti-freeze protein
40 mg/L (secreta)
Pichia pastoris
Esempio: Hepatitis B virus surface antigen
Resa= 400 mg/L (intracellulare)

Produzione di proteine umane ricombinanti
Problema: Glicosilazione inappropriata

Soluzione 1: eliminare il problema!!
Insulina – proteina terapeutica espressa in E.coli e lievito
Non richiede glicosilazione
La maggior parte delle proteine umane richiedono la
glicosilazione

Soluzione 2: Ingegnerizzare l’ospite
Eliminare il pathway di glicosilazione endogeno
(ceppo och1: delezione della alpha 1-6 mannosyltransferase)
Introdurre il pathway dell’uomo attivo
mannosidases I and II
N-acetylglucosaminyl transferases I and II
uridine 5'-diphosphate (UDP)-N-acetylglucosamine
transporter.
Verificare: Introduzione del gene reporter umano K3
(ha un singolo sito di glicosilazione)

Isolati ceppi di lievito che
mostrano alte rese di proteina
reporter umana K3
caratterizzata da glicosilazione
human-like
Hamilton, SR (2003) Production of Complex Human Glycoproteins in Yeast.
Science 301: 1244 - 1246.
Soluzione 2: Ingegnerizzare l’ospite.
Questo lavoro descrive la “humanization” del pathway di glicosilazione di Pichia.

ANTIBODY DEPENDENT CELL CITOTOXICITY:
3
APPLICAZIONI: PRODUZIONE DI ANTICORPI IN
PICHIA
1
2
1) Il dominio variabile dell’anticorpo lega la cellula target
2) La cellula killer NK lega la regione costante Fc dell’anticorpo
1) La cellula killer distrugge la cellula target
Problema: Anticorpi che non sono N-glicosilati
possono legare l’antigene ma non mediano l’ADCC
Utilizzo di ceppi di Pichia pastoris
“glicoengineered”
per produrre anticorpi funzionanti nell’uomo