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Downloaded from www.immunologyhomepage.com Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo dei linfociti B Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2012/2013
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- Page 10 and 11: Germline organization of Ig light-
- Page 12 and 13: DNA catena k germ-line DNA catena k
- Page 14 and 15: Riarrangiamento catena pesante DNA
- Page 16 and 17: Trascritto primario catena H mRNA c
- Page 18 and 19: Recombination Signal Sequence, RSS
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- Page 32 and 33: Flessibilità nel processo di giunz
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- Page 38 and 39: Esclusione allelica • Ciascuna ce
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<strong>Riarrangiamento</strong> dei <strong>geni</strong><br />
per le Immunoglobuline e<br />
sviluppo dei linfociti B<br />
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• I <strong>geni</strong> che codificano i recettori per gli anti<strong>geni</strong><br />
(BCR e TCR) sono presenti in uno “stato” non<br />
funzionale nella linea germinale<br />
• Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire<br />
durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere<br />
funzionali questi <strong>geni</strong><br />
• Ciascun evento richiede l’introduzione di doppie<br />
rotture nel DNA cromosomico<br />
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Chromosome localization of Ig loci<br />
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• Sia le catene leggere che le catene pesanti sono<br />
codificate da famiglie multi-<strong>geni</strong>che separate<br />
• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multi<strong>geni</strong>ca<br />
contiene diverse sequenze codificanti, dette<br />
segmenti <strong>geni</strong>ci, separate da regioni non codificanti<br />
• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti<br />
<strong>geni</strong>ci vengono riarrangiati<br />
• Il riarrangiamento crea un esone funzionale<br />
corrispondente alla regione variabile<br />
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La regione V L è codificata<br />
da più di un segmento <strong>geni</strong>co<br />
• La regione variabile della catena leggera (V L) è<br />
codificata da 2 segmenti <strong>geni</strong>ci<br />
– segmento <strong>geni</strong>co V<br />
• codifica per i primi 95-101 a.a.<br />
– segmento <strong>geni</strong>co J<br />
• codifica per pochi a.a. (fino a 13)<br />
Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone<br />
continuo (VJ) che codifica per l’intera regione V L<br />
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Corrispondenza tra segmenti <strong>geni</strong>ci e domini Ig<br />
V L<br />
C L<br />
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La regione V H è codificata<br />
da più di un segmento <strong>geni</strong>co<br />
• La regione variabile della catena pesante (V H) è<br />
codificata da 3 segmenti <strong>geni</strong>ci<br />
– segmento <strong>geni</strong>co V<br />
– segmento <strong>geni</strong>co D<br />
– segmento <strong>geni</strong>co J<br />
Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone<br />
continuo (VDJ) che codifica per l’intera regione V H<br />
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Corrispondenza tra segmenti <strong>geni</strong>ci e domini Ig<br />
V H<br />
C m2<br />
C m3<br />
C m4<br />
C m1<br />
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Corrispondenza tra segmenti <strong>geni</strong>ci e domini Ig<br />
V H<br />
C m2<br />
C m3<br />
C m4<br />
C m1<br />
Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 TM Cyt<br />
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Germline organization of Ig light- and<br />
heavy-chain loci in human genome<br />
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DNA catena k germ-line<br />
DNA catena k riarrangiato<br />
Trascritto primario catena k<br />
<strong>Riarrangiamento</strong> catena k<br />
V-J joining<br />
Trascrizione<br />
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Trascritto primario catena k<br />
mRNA catena k<br />
Polipeptide nascente catena k<br />
Catena k<br />
RNA splicing + poliadenilazione<br />
Traduzione<br />
Coda poli-A<br />
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<strong>Riarrangiamento</strong> catena pesante<br />
DNA catena H germ line<br />
V-DJ joining<br />
D-J joining<br />
Trascrizione<br />
DNA catena H riarrangiato<br />
Trascritto primario<br />
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Co-espressione di IgM e IgD<br />
• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena<br />
pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della<br />
catena m che della d<br />
– il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)<br />
• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia<br />
mRNA per m che per d<br />
• La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa<br />
specificità anti<strong>geni</strong>ca<br />
– stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d<br />
– catena leggera associata identica<br />
• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresse<br />
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Trascritto primario catena H<br />
mRNA catena H<br />
Polipeptide nascente catena H<br />
Catena H<br />
splicing alternativo<br />
Catena Hm Catena Hd<br />
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Recombination Signal Sequence, RSS<br />
• Accanto a ciascun segmento <strong>geni</strong>co sono presenti delle<br />
sequenze dette recombination signal sequences (RSS)<br />
– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V<br />
– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J<br />
– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D<br />
• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di<br />
ricombinazione<br />
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Recombination Signal Sequence, RSS<br />
• Ciascuna RSS contiene<br />
– NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi<br />
• sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA<br />
– EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi<br />
• aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio<br />
– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23<br />
paia di basi<br />
• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e<br />
corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica<br />
• la lunghezza dello “spacer” è cruciale per la ricombinazione<br />
– permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero<br />
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Sequenze RSS<br />
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“Regola 12/23”<br />
Un segmento <strong>geni</strong>co fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può<br />
ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp<br />
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Il complesso della ricombinasi V(D)J<br />
• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica<br />
V(D)J è detto ricombinasi V(D)J<br />
• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2<br />
– i prodotti di questi <strong>geni</strong> costituiscono la componente della ricombinasi<br />
specifica dei linfociti (B e T)<br />
• necessari per la generazione dei recettori per l’antigene<br />
– topi KO per uno dei due <strong>geni</strong> Rag non sviluppano linfociti B né T<br />
• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il<br />
riarrangiamento dei <strong>geni</strong> per il recettore dell’antigene<br />
• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi<br />
ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA<br />
– DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80,<br />
Artemis<br />
• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le<br />
sequenze codificanti<br />
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Recombinant-Activating Genes:<br />
RAG-1 e RAG-2<br />
• Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati<br />
• Costituiscono la componente della ricombinasi specifica<br />
dei linfociti (B e T)<br />
• Necessari per la generazione dei recettori per l’antigene<br />
• Il core di RAG-1 contiene<br />
– regione per legame a nonamero<br />
– regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2<br />
– sito catalitico per taglio DNA<br />
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• Il core di RAG-2<br />
Recombinant-Activating Genes:<br />
RAG-1 e RAG-2<br />
– è necessario per il taglio del DNA<br />
– interagisce con RAG1<br />
– aumenta l’affinità di legame con il DNA<br />
• RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4<br />
trimetilata dell’istone H3 (H3K4me3)<br />
– guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva<br />
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Fasi della ricombinazione 1<br />
• RAG1 e RAG2<br />
riconoscono RSS<br />
– (alla formazione del complesso<br />
partecipano anche altre proteine)<br />
• le RSS di un segmento V e<br />
di uno J sono portate in<br />
prossimità<br />
Segmento <strong>geni</strong>co V<br />
Segmento <strong>geni</strong>co J<br />
RSS - 1 giro<br />
RSS - 2 giri
Fasi della ricombinazione 2<br />
• taglio di un filamento di<br />
DNA da parte di RAG-1 e<br />
RAG-2 alla giunzione<br />
delle RSS con le<br />
sequenze codificanti<br />
– tra eptamero e segmento<br />
<strong>geni</strong>co codificante<br />
Segmento <strong>geni</strong>co V<br />
Segmento <strong>geni</strong>co J<br />
RSS - 1 giro<br />
RSS - 2 giri<br />
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Fasi della ricombinazione 3<br />
• l’estremità tagliata del<br />
segmento <strong>geni</strong>co codificante,<br />
viene unita al filamento<br />
opposto producendo una<br />
“forcina”<br />
• all’estremità della RSS,<br />
viene prodotta una doppia<br />
rottura del DNA<br />
Segmento <strong>geni</strong>co V<br />
Segmento <strong>geni</strong>co J<br />
RSS - 1 giro<br />
RSS - 2 giri
Ricombinazione 4<br />
• Vengono reclutate altre proteine<br />
– Ku70/Ku80<br />
• La forcina viene tagliata in<br />
posizione casuale<br />
– RAG/Artemis<br />
– l’estremità viene poi modificata da<br />
• esonucleasi<br />
• TdT (terminal deoxynucleotidyl<br />
transferase)<br />
• Riparo e legame delle sequenze<br />
codificanti e di quelle segnale<br />
– DNA ligasi IV<br />
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Generazione della diversità anticorpale<br />
(GOD, Generation Of Diversity)<br />
• Molteplici segmenti <strong>geni</strong>ci<br />
– diverse combinazioni V-(D)-J<br />
• Flessibilità nel processo di giunzione<br />
– aggiunta e rimozione di nucleotidi<br />
• Combinazione di catene pesanti e leggere<br />
• Ipermutazione somatica<br />
– in linfociti B attivati<br />
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200 1.2x106 6x103 x<br />
=<br />
120<br />
Possibili combinazioni teoriche<br />
x<br />
6x103 0.72x106 =<br />
1.92x10 6<br />
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+<br />
=
Variabilità<br />
Variabilità degli aminoacidi nelle Ig<br />
Figure 3-6<br />
HV3 ha una<br />
variabilità varibilità maggiore<br />
di HV1 e HV2<br />
Regione V catena pesante Regione V catena leggera<br />
FR, frame region HV, hyper-variable region<br />
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Variabilità
La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J<br />
codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che<br />
corrisponde al CDR3<br />
HV1 HV2 HV3<br />
HV1 HV2 HV3<br />
HV regions<br />
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Flessibilità nel processo di giunzione:<br />
aggiunta e rimozione di nucleotidi<br />
Eptamero della RSS<br />
Eptamero della RSS<br />
• l’estremità tagliata del<br />
segmento <strong>geni</strong>co<br />
codificante, viene unita al<br />
filamento opposto<br />
producendo una “forcina”<br />
• (v. diapo precedenti)<br />
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Flessibilità nel processo di giunzione:<br />
aggiunta e rimozione di nucleotidi<br />
(P-addition)<br />
• Quando la forcina viene<br />
tagliata si produce un<br />
filamento singolo<br />
• Gli enzimi di riparazione<br />
aggiungono nucleotidi<br />
complementari a questa<br />
sequenza generando una<br />
sequenza palindromica<br />
– P-nucleotidi<br />
• Variazioni nella posizione<br />
del taglio della forcina<br />
generano variazioni in<br />
questa sequenza<br />
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Flessibilità nel processo di giunzione:<br />
aggiunta e rimozione di nucleotidi<br />
(N-addition)<br />
• Durante la ricombinazione D-J e V-DJ,<br />
la terminal deoxynucleotidyl<br />
transferase (TdT) aggiunge fino a 15<br />
nucleotidi a entrambi le giunzioni D-J<br />
e V-DJ.<br />
• I nucleotidi aggiunti generano<br />
sequenze randomiche<br />
• La N-addition contribuisce largamente<br />
alla variabilità del CDR3 della catena<br />
pesante<br />
• La N addition si verifica quasi<br />
esclusivamente nella catena pesante<br />
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Diversità totale<br />
(combinazioni<br />
V(D)J e catene<br />
L/H + diversità<br />
giunzioni N/P<br />
addition)<br />
Ig TCRab<br />
10 11 10 16<br />
Tuttavia, un individuo ha un repertorio di circa 10 7 cloni B e T<br />
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Esclusione allelica<br />
• Ciascuna cellula B esprime i <strong>geni</strong> riarrangiati<br />
della catena pesante di un solo cromosoma e<br />
i <strong>geni</strong> riarrangiati della catena leggera di un<br />
solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma<br />
– esclusione allelica<br />
• Assicura che una cellula B funzionale<br />
esprima una sola catena pesante e una sola<br />
leggera<br />
una sola specificità anti<strong>geni</strong>ca<br />
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Esclusione allelica in singole cellule B<br />
Ceppo di aplotipo<br />
“a/a” per la catena<br />
pesante delle Ig<br />
Ibrido F1 di aplotipo<br />
“a/b” per la catena<br />
pesante delle Ig<br />
Ceppo di aplotipo<br />
“b/b” per la catena<br />
pesante delle Ig<br />
I due aplotipi diversi<br />
sono espressi<br />
in cellule diverse<br />
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