6a lezione genetica batterica.pdf - ch.unich - 'G. d'Annunzio'
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Genetica <strong>batterica</strong><br />
Giovanni Di Bonaventura, PhD, B.Sc.<br />
Centro Scienze dell’Invec<strong>ch</strong>iamento (Ce.S.I.)<br />
Fondazione Università “G. d’Annunzio”<br />
0871 54 15 19 (lab)<br />
333 169 65 59 (cell)<br />
gdibonaventura@uni<strong>ch</strong>.it
Genoma batterico<br />
Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di<br />
due componenti:<br />
- Cromosoma (geni essenziali)<br />
- Elementi extracromosomici “mobili” (MGEs)<br />
(non essenziali, responsabili del trasferimento<br />
genetico orizzontale o verticale)<br />
- plasmidi<br />
- elementi trasponibili<br />
- sequenze di inserzione<br />
- trasposoni<br />
- elementi invertibili
Cromosoma batterico<br />
Singolo (microrganismi aploidi)<br />
DNA bicatenario<br />
DNA (prevalentemente) circolare<br />
lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia<br />
burgdorferi<br />
Mosaico in natura – soggetto agli effetti del<br />
trasferimento genetico orizzontale (contiene geni di<br />
diversa provenienza)<br />
Trasferimento genetico orizzontale – il trasferimento<br />
(e successiva integrazione) di geni tra diverse cellule<br />
Dimensioni variabili (0.6-8.6 Mb; 1100-1400 m)<br />
Replicazione bidirezionale, da una singola origine
Replicazione DNA batterico<br />
Es<strong>ch</strong>eri<strong>ch</strong>ia coli: cromosoma<br />
rilasciato in seguito a lisi <strong>batterica</strong>
MGEs: Plasmidi<br />
Elementi genetici extracromosomici in grado di<br />
replicarsi autonomamente<br />
Episoma = plasmide in grado di integrarsi nel<br />
cromosoma batterico<br />
DNA bicatenario circolare (lineare in Streptomyces spp)<br />
Presenza di numerosi e “caratteristici” (gruppi di<br />
compatibilità) plasmidi in un singolo batterio: dimensioni =<br />
1/k n. copie<br />
Qualità dell’informazione <strong>genetica</strong><br />
• Scarsa omologia (“estranei”) con il cromosoma e raramente<br />
indispensabili per la sopravvivenza e moltiplicazione<br />
<strong>batterica</strong> in condizioni “ottimali”<br />
• Informazione per replicazione indipendente (se unica<br />
informazione = plasmidi “criptici”)<br />
• Codificano per fattori di virulenza <strong>batterica</strong>:<br />
• Produzione di pili, tossine, adesine, siderofori,<br />
• Fattori R: determinanti dell’antibiotico-resistenza<br />
• Plasmidi F: sessuali o coniugativi<br />
• Plasmidi F’ (Hfr): integrati nel cromosoma (alternanza tra<br />
forma libera ed integrata = episoma)
Plasmidi
Duplicazione “rolling circle” di DNA-plasmidi<br />
1. Plasmide<br />
circolare<br />
4. Sintesi DNA<br />
DNA sintetizzato<br />
3’ 3’<br />
Roll 5’<br />
2. Rottura di<br />
una catena nick<br />
5. Termine replicazione, ligazione<br />
Roll<br />
3. Spiazzamento<br />
di catena Punto di nuova<br />
sintesi di DNA<br />
5’<br />
Replicazione<br />
discontinua<br />
Catena<br />
spiazzata<br />
5’ 3’<br />
5’<br />
una catena completa
Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2)<br />
Caratteristica traslocazione tra “elementi” diversi<br />
(cromosoma, plasmidi) del genoma batterico.<br />
Generalmente, la traslocazione avviene all’interno<br />
della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi di<br />
trasferimento di materiale genetico)<br />
eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione)<br />
Due meccanismi di trasposizione:<br />
conservativa – nessuna duplicazione di elemento<br />
replicativa – duplicazione di elemento<br />
La trasposizione induce un effetto “mutageno”:<br />
mutazione letale<br />
mutazione non letale
Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2)<br />
Sequenze di Inserzione<br />
(IS) – piccole dimensioni<br />
(800-2.000 bp), integrazione<br />
sito-specifica mediante<br />
sequenze invertite e ripetute,<br />
“core” codificante solo per<br />
trasposizione (solo effetto<br />
mutageno).<br />
Trasposoni – rilevanti<br />
dimensioni (> 2.000 bp),<br />
integrazione sito-specifica<br />
mediante IS, “core”<br />
contenente uno o più geni (es.<br />
geni per farmaco-resistenza).
Altri MGEs: Elementi trasponibili (2 di 2)<br />
Elementi invertibili – oltre a geni codificatori per la<br />
trasposizione, presenza di “DNA-invertasi” capace di<br />
invertire l’elemento di 180° (rispetto ad un asse<br />
centrale virtuale) nella sua locazione cromosomica –<br />
“variazione di fase flagellare” H1/H2 in Salmonella<br />
Isole genomi<strong>ch</strong>e – integrate nel cromosoma mediante<br />
fago, veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity<br />
island) e per la vita simbiontica
Meccanismi di variazione <strong>batterica</strong><br />
Mutazione genica<br />
Trasferimento genico e ricombinazione<br />
Coniugazione<br />
Trasformazione<br />
Trasduzione<br />
Conversione lisogenica<br />
Fusione del protoplasto
Mutazioni<br />
Mutazione = modificazione della sequenza nucleotidica<br />
Mutazioni spontanee (10 -7 - 10 -11 bp / generazione) insorte durante la<br />
duplicazione del DNA (low frequency) o in seguito a fenomeni di<br />
inversione/traslocazione (high freq.).<br />
Mutazioni indotte da agenti mutageni <strong>ch</strong>imici (ag. al<strong>ch</strong>ilanti, ac.<br />
nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi X, U.V.), biologici (virus)<br />
Tipologie:<br />
– Mutazioni MICROlesionali (puntiformi):<br />
• Transizione (sostituzione tra basi purini<strong>ch</strong>e/pirimidini<strong>ch</strong>e)<br />
• Transversione (sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur)<br />
• Frameshift (inserzione o perdita di una base)<br />
– Mutazioni MACROlesionali:<br />
• De<strong>lezione</strong> (di sequenze)<br />
• Duplicazione (di sequenze)<br />
• Inversione e Traslocazione (di sequenze)<br />
Effetti sul fenotipo:<br />
– Generalmente, sono compatibili con la sopravvivenza del batterio, grazie<br />
alla sua eterogeneità <strong>genetica</strong><br />
– Mutazioni missense (silente: sequenza aa immutata), nonsense (STOP<br />
codon), frameshift (sequenza aa modificata)<br />
– Possono essere “letali”
Mutazioni missense (transversione),<br />
nonsense e frameshift
Coniugazione<br />
Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato<br />
da plasmide <strong>ch</strong>e ri<strong>ch</strong>iede un contatto “fisico” tra due<br />
cellule batteri<strong>ch</strong>e:<br />
Pilo sessuale (Gram-negativi)<br />
Ferormoni (Gram-positivi)<br />
Plasmidi coniugativi – plasmidi <strong>ch</strong>e possono essere<br />
trasferiti tra cellule mediante coniugazione<br />
Plasmide F – plasmide della “fertilità” (F – fertility)<br />
geni rep – codificano per la replicazione<br />
geni tra - codificano per il trasferimento<br />
geni mob - codificano per la mobilizzazione<br />
4 elementi IS – mediano l’integrazione nell’endogenote
Coniugazione: tipi cellulari<br />
Cellula F + - cellula contenente un plasmide F<br />
- (cellula donatrice o “mas<strong>ch</strong>ile”)<br />
Cellula F - - cellula non contenente un plasmide F<br />
- (cellula ricevente o “femminile”)<br />
Cellula Hfr – cellula contenente un plasmide F integrato<br />
nel cromosoma (Hfr – high frequency of recombination)<br />
- (cellula donatrice o “mas<strong>ch</strong>ile”)<br />
Pilo sessuale – struttura superficiale prodotta da cellule<br />
F + <strong>ch</strong>e media lo specifico contatto tra cellule F + e F - , ed<br />
il trasferimento del plasmide
Coniugazione: F + x F -<br />
1. F + (donatore) contenente un<br />
plasmide F + codificante per il<br />
pilo sessuale.<br />
2. Formazione “coppia<br />
coniugativa”. Rottura in oriT di<br />
una catena del plasmide F + .<br />
3. Retrazione del pilo sessuale e<br />
formazione di un ponte<br />
intercellulare. Una catena del<br />
plasmide F + entra in F - .<br />
4. Sintesi della catena<br />
complementare di F + in<br />
entrambi i batteri, adesso in<br />
grado di produrre il pilo<br />
sessuale.<br />
Nella coniugazione F+ x F- non<br />
si assiste a trasferimento di<br />
DNA cromosomico<br />
2<br />
4<br />
1<br />
3
Coniugazione: F + x F -
Coniugazione: Hfr x F -<br />
1. Formazione Hfr: inserzione di un<br />
plasmide F+ nel nucleoide del<br />
batterio accettore.<br />
2. Formazione “coppia<br />
coniugativa”. Rottura<br />
monocatenaria del DNA a livello<br />
del plasmide F + integrato.<br />
3. Retrazione pilo sex e formazione<br />
ponte intercellulare. Ingresso del<br />
DNA monocatenario nel batterio<br />
accettore. Interruzione<br />
spontanea della coniugazione:<br />
solo una parte del DNA donatore<br />
verrà trasferita all’accettore.<br />
4. Il donatore sintetizza una copia<br />
complementare del DNA<br />
rimanendo Hfr. L’accettore<br />
sintetizza una catena<br />
complementare del DNA<br />
trasferito.<br />
4<br />
2<br />
-Degradazione<br />
(nessun effetto)<br />
1<br />
3<br />
-Circolarizzazione<br />
(plasm. coniugativo)<br />
-Integrazione<br />
(nuovi caratteri)
Integrazione del plasmide F nel cromosoma<br />
a formare una cellula Hfr<br />
plasmide F<br />
cellula Hfr<br />
plasmide F<br />
integrato<br />
cellula F +<br />
sequenze di<br />
inserzione<br />
(IS) nel<br />
plasmide<br />
plasmide F<br />
integrazione del plasmide F<br />
cromosoma<br />
IS<br />
IS<br />
IS3<br />
gd<br />
IS3<br />
IS2<br />
ricombinazione<br />
omologa tra<br />
elementi IS
Coniugazione: Hfr x F -
Cellula F +<br />
Pilo F<br />
Cellula F -
Coniugazione nei Gram+<br />
• Enterococcus faecalis<br />
• Produzione e rilascio di ferormoni da parte<br />
della cellula “accettrice” (femminile)<br />
• Ferormoni inducono produzione della<br />
sostanza aggregante alla superficie della<br />
cellula “donatrice” (mas<strong>ch</strong>ile)<br />
• Formazione di aggregati cellulari con<br />
trasferimento del plasmide coniugativo
Significato della coniugazione<br />
Significato clinico:<br />
Principale meccanismo di trasferimento<br />
di geni per l’antibiotico-resistenza<br />
Trasferimento di geni codificanti per fattori<br />
di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori)<br />
Significato ambientale:<br />
Trasferimento di resistenza a erbicidi ed<br />
idrocarburi aromatici<br />
Resistenza <strong>batterica</strong> ai metalli pesanti<br />
Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto<br />
tra Rhizobia<br />
Plasmidi Ti da Agrobacterium possono trasferire<br />
geni alle piante<br />
(meccanismo di trasferimento genico tra Domini)<br />
Significato evoluzionistico:<br />
Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico
Trasformazione<br />
Assunzione di frammenti di DNA solubile<br />
dall’ambiente circostante da parte di cellule<br />
batteri<strong>ch</strong>e “competenti” (Bacillus, Haemophilus,<br />
Neisseria, Pneumococcus)<br />
Meccanismo di trasferimento genetico<br />
“evoluto” da una primitiva esigenza nutrizionale<br />
Influenzato da:<br />
Dimensioni DNA<br />
Sensibilità DNA a nucleasi<br />
“Competenza” della cellula “accettrice”<br />
naturale o indotta artificialmente
Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)<br />
Streptococcus pneumoniae
Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)
Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono<br />
nel DNA la “sostanza trasformante”
Trasformazione <strong>batterica</strong><br />
1. Morte e degradazione del<br />
batterio “donatore”.<br />
2. Un frammento di DNA<br />
bicatenario (ds) interagisce<br />
con specifi<strong>ch</strong>e proteine (DNAbinding<br />
protein) alla superficie<br />
della cellula “competente”. Il<br />
DNA è reso monocatenario<br />
(ss) da una nucleasi.<br />
3. La proteina Rec A promuove<br />
la ricombinazione omologa tra<br />
il DNA ss donatore e quello ss<br />
recipiente.<br />
4. Lo scambio è completato.<br />
Formazione di heteroduplex:<br />
una sola delle cellule figlie<br />
risulterà essere “trasformata”.<br />
2<br />
4<br />
1<br />
3
Trasformazione <strong>batterica</strong>
Trasformazione <strong>batterica</strong>: competenza<br />
La cellula accettrice, per poter essere trasformata,<br />
deve trovarsi in una particolare condizione <strong>ch</strong>e prende<br />
il nome di competenza<br />
Competenza – capacità cellulare di “catturare” il DNA.<br />
“Fattore di competenza” (Gram+) induce:<br />
modificazioni di parete cellulare (autolisina)<br />
formazione/attivazione di proteine DNA-binding<br />
e nucleasi<br />
competenza naturale (Bacillus, Neisseria spp.)<br />
competenza indotta artificialmente (P. aeruginosa,<br />
E. coli, S. typhimurium) – trattamento “a freddo”<br />
con CaCl 2 (bassa efficienza, utilizzato di routine<br />
nel clonaggio di DNA in E. coli) - elettroporazione
Trasformazione <strong>batterica</strong> nei Gram-<br />
Mancanza del “fattore di competenza”, sostituito<br />
da particolari condizioni del mezzo colturale:<br />
Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp.<br />
in condizioni permissive per la sintesi proteica ma<br />
non per la crescita completa.
Significato della trasformazione<br />
Significato biotecnologico:<br />
Clonaggio di geni “utili”<br />
Significato evoluzionistico:<br />
Meccanismo di evoluzione/adattamento batterico
Trasduzione<br />
La trasduzione consiste nel trasferimento di<br />
frammenti di DNA tra due cellule batteri<strong>ch</strong>e<br />
mediante un batteriofago (virus batterico).<br />
Esistono 2 tipi di trasduzione:<br />
1. Trasduzione generalizzata: (teoricamente)<br />
qualsiasi gene può essere trasferito<br />
2. Trasduzione specializzata: solo specifici geni<br />
possono essere trasferiti
Batteriofago T4<br />
…infetta Es<strong>ch</strong>eri<strong>ch</strong>ia coli
Trasduzione<br />
generalizzata (1 di 2)<br />
1. Un fago litico adsorbe ad un<br />
batterio sensibile.<br />
2. Penetrazione del genoma<br />
fagico nel batterio. Utilizzo<br />
dei sistemi metabolici cellulari<br />
per la sintesi e l’assemblaggio<br />
delle componenti virali.<br />
3. In alcuni casi, un frammento di<br />
DNA batterico o un plasmide<br />
possono essere erroneamente<br />
inseriti in alcuni capsidi virali<br />
(particelle trasducenti).<br />
2<br />
1<br />
3
Trasduzione<br />
generalizzata (2 di 2)<br />
4. Rilascio dei fagi batterici in<br />
seguito a lisi <strong>batterica</strong>.<br />
5. Il fago trasduttore adsorbe<br />
ad un batterio sensibile.<br />
6. Penetrazione del DNA fagico.<br />
7. DNA fagico ricombina con il<br />
DNA della cellula accettrice.<br />
7<br />
5<br />
4<br />
6
Trasduzione generalizzata
Trasduzione<br />
specializzata (1 di 2)<br />
1-2. Un fago temperato adsorbe al<br />
batterio sensibile e vi inietta<br />
il suo genoma.<br />
3. Il genoma fagico ricombina<br />
con il nucleoide batterico<br />
divenendo un profago.<br />
4. In presenza di stimoli adeguati,<br />
un frammento del DNA batterico<br />
viene escisso come parte del<br />
genoma fagico. 4<br />
2<br />
1<br />
3
Trasduzione<br />
specializzata (2 di 2)<br />
5. Durante la replicazione fagica il<br />
DNA batterico viene inserito nel<br />
genoma fagico. Tutti i fagi<br />
veicolano il frammento di DNA<br />
batterico.<br />
6. Il fago adsorbe ad una batterio<br />
sensibile iniettandovi il suo genoma.<br />
7. Il genoma fagico contenente il DNA<br />
trasdotto ricombina con il nucleoide<br />
della cellula accettrice.<br />
6<br />
5<br />
7
Trasduzione specializzata
Adattamento ed evoluzione <strong>batterica</strong><br />
Mutazione e se<strong>lezione</strong> “classi<strong>ch</strong>e”<br />
(Se<strong>lezione</strong> naturale ed evoluzione)<br />
Acquisizione di geni da altri batteri -<br />
Trasferimento genico ORIZZONTALE:<br />
- Coniugazione<br />
- Trasformazione<br />
- Trasduzione<br />
Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica)<br />
Trasferimento genico VERTICALE<br />
La ricombinazione genica è coinvolta in ogni<br />
fenomeno generante variabilità genica
Quantità (valori percentuali) di DNA “atipico”<br />
(trasferito) nei genomi batterici<br />
Circa il 13% del genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante<br />
trasferimento genico orizzontale.
Ricombinazione genica<br />
Scambio “fisico” di materiale<br />
genetico tra due molecole di DNA<br />
Importante processo evolutivo in<br />
quanto promuove la diversità<br />
<strong>genetica</strong> (permettendo un rapido<br />
adattamento)<br />
Coinvolta nella coniugazione,<br />
trasformazione, trasduzione e<br />
trasposizione<br />
Ricombinazione tra DNA<br />
lineare (a) e plasmidico (b).
Ricombinazione genica<br />
A) Ricombinazione OMOLOGA – scambio genetico tra<br />
sequenze di DNA omologhe<br />
Molto complessa - in E.coli ri<strong>ch</strong>iede oltre 25 geni,<br />
Alcuni prodotti genici coinvolti:<br />
RecA – catalizza la ricombinazione,<br />
ubiquitaria nei procarioti<br />
RecBCD – attività nucleasica ed elicasica<br />
proteine leganti DNA singola elica -<br />
stabilizzano il DNA a singola elica<br />
B) Ricombinazione SITO-SPECIFICA:<br />
trasposizione (nella trasposizione)<br />
meccanismo integrasi-mediato (nei fagi)<br />
trasposoni integrativi e coniugativi
Ricombinazione omologa nei batteri<br />
Meccanismo e Tipologie
Conversione lisogenica<br />
• Integrazione del genoma fagico<br />
mediante ricombinazione sitospecifica<br />
• DNA profagico “silente”<br />
• Occasionale (essiccamento, U.V.,<br />
radiazioni ionizzanti, agenti<br />
mutageni) derepressione di parte<br />
del DNA profagico<br />
• Espressione di numerose proprietà<br />
patogene dei batteri:<br />
• Produzione di tossine (tox difterica,<br />
indotta da carenza di Fe 3+ )<br />
• Adesine ed antigeni di superficie<br />
(Salmonella O antigen)
Fusione del protoplasto<br />
• Protoplasto = citoplasma + nucleo<br />
• Fusione di due protoplasti trattati<br />
con lisozima e penicillina