6a lezione genetica batterica.pdf - ch.unich - 'G. d'Annunzio'

Genetica batterica
Giovanni Di Bonaventura, PhD, B.Sc.
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)
Fondazione Università “G. d’Annunzio”
0871 54 15 19 (lab)
333 169 65 59 (cell)
gdibonaventura@unich.it

Genoma batterico
Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di
due componenti:
- Cromosoma (geni essenziali)
- Elementi extracromosomici “mobili” (MGEs)
(non essenziali, responsabili del trasferimento
genetico orizzontale o verticale)
- plasmidi
- elementi trasponibili
- sequenze di inserzione
- trasposoni
- elementi invertibili

Cromosoma batterico
Singolo (microrganismi aploidi)
DNA bicatenario
DNA (prevalentemente) circolare
lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia
burgdorferi
Mosaico in natura – soggetto agli effetti del
trasferimento genetico orizzontale (contiene geni di
diversa provenienza)
Trasferimento genetico orizzontale – il trasferimento
(e successiva integrazione) di geni tra diverse cellule
Dimensioni variabili (0.6-8.6 Mb; 1100-1400 m)
Replicazione bidirezionale, da una singola origine

Replicazione DNA batterico
Escherichia coli: cromosoma
rilasciato in seguito a lisi batterica

MGEs: Plasmidi
Elementi genetici extracromosomici in grado di
replicarsi autonomamente
Episoma = plasmide in grado di integrarsi nel
cromosoma batterico
DNA bicatenario circolare (lineare in Streptomyces spp)
Presenza di numerosi e “caratteristici” (gruppi di
compatibilità) plasmidi in un singolo batterio: dimensioni =
1/k n. copie
Qualità dell’informazione genetica
• Scarsa omologia (“estranei”) con il cromosoma e raramente
indispensabili per la sopravvivenza e moltiplicazione
batterica in condizioni “ottimali”
• Informazione per replicazione indipendente (se unica
informazione = plasmidi “criptici”)
• Codificano per fattori di virulenza batterica:
• Produzione di pili, tossine, adesine, siderofori,
• Fattori R: determinanti dell’antibiotico-resistenza
• Plasmidi F: sessuali o coniugativi
• Plasmidi F’ (Hfr): integrati nel cromosoma (alternanza tra
forma libera ed integrata = episoma)

Plasmidi

Duplicazione “rolling circle” di DNA-plasmidi
1. Plasmide
circolare
4. Sintesi DNA
DNA sintetizzato
3’ 3’
Roll 5’
2. Rottura di
una catena nick
5. Termine replicazione, ligazione
Roll
3. Spiazzamento
di catena Punto di nuova
sintesi di DNA
5’
Replicazione
discontinua
Catena
spiazzata
5’ 3’
5’
una catena completa

Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2)
Caratteristica traslocazione tra “elementi” diversi
(cromosoma, plasmidi) del genoma batterico.
Generalmente, la traslocazione avviene all’interno
della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi di
trasferimento di materiale genetico)
eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione)
Due meccanismi di trasposizione:
conservativa – nessuna duplicazione di elemento
replicativa – duplicazione di elemento
La trasposizione induce un effetto “mutageno”:
mutazione letale
mutazione non letale

Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2)
Sequenze di Inserzione
(IS) – piccole dimensioni
(800-2.000 bp), integrazione
sito-specifica mediante
sequenze invertite e ripetute,
“core” codificante solo per
trasposizione (solo effetto
mutageno).
Trasposoni – rilevanti
dimensioni (> 2.000 bp),
integrazione sito-specifica
mediante IS, “core”
contenente uno o più geni (es.
geni per farmaco-resistenza).

Altri MGEs: Elementi trasponibili (2 di 2)
Elementi invertibili – oltre a geni codificatori per la
trasposizione, presenza di “DNA-invertasi” capace di
invertire l’elemento di 180° (rispetto ad un asse
centrale virtuale) nella sua locazione cromosomica –
“variazione di fase flagellare” H1/H2 in Salmonella
Isole genomiche – integrate nel cromosoma mediante
fago, veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity
island) e per la vita simbiontica

Meccanismi di variazione batterica
Mutazione genica
Trasferimento genico e ricombinazione
Coniugazione
Trasformazione
Trasduzione
Conversione lisogenica
Fusione del protoplasto

Mutazioni
Mutazione = modificazione della sequenza nucleotidica
Mutazioni spontanee (10 -7 - 10 -11 bp / generazione) insorte durante la
duplicazione del DNA (low frequency) o in seguito a fenomeni di
inversione/traslocazione (high freq.).
Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici (ag. alchilanti, ac.
nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi X, U.V.), biologici (virus)
Tipologie:
– Mutazioni MICROlesionali (puntiformi):
• Transizione (sostituzione tra basi puriniche/pirimidiniche)
• Transversione (sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur)
• Frameshift (inserzione o perdita di una base)
– Mutazioni MACROlesionali:
• Delezione (di sequenze)
• Duplicazione (di sequenze)
• Inversione e Traslocazione (di sequenze)
Effetti sul fenotipo:
– Generalmente, sono compatibili con la sopravvivenza del batterio, grazie
alla sua eterogeneità genetica
– Mutazioni missense (silente: sequenza aa immutata), nonsense (STOP
codon), frameshift (sequenza aa modificata)
– Possono essere “letali”

Mutazioni missense (transversione),
nonsense e frameshift

Coniugazione
Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato
da plasmide che richiede un contatto “fisico” tra due
cellule batteriche:
Pilo sessuale (Gram-negativi)
Ferormoni (Gram-positivi)
Plasmidi coniugativi – plasmidi che possono essere
trasferiti tra cellule mediante coniugazione
Plasmide F – plasmide della “fertilità” (F – fertility)
geni rep – codificano per la replicazione
geni tra - codificano per il trasferimento
geni mob - codificano per la mobilizzazione
4 elementi IS – mediano l’integrazione nell’endogenote

Coniugazione: tipi cellulari
Cellula F + - cellula contenente un plasmide F
- (cellula donatrice o “maschile”)
Cellula F - - cellula non contenente un plasmide F
- (cellula ricevente o “femminile”)
Cellula Hfr – cellula contenente un plasmide F integrato
nel cromosoma (Hfr – high frequency of recombination)
- (cellula donatrice o “maschile”)
Pilo sessuale – struttura superficiale prodotta da cellule
F + che media lo specifico contatto tra cellule F + e F - , ed
il trasferimento del plasmide

Coniugazione: F + x F -
1. F + (donatore) contenente un
plasmide F + codificante per il
pilo sessuale.
2. Formazione “coppia
coniugativa”. Rottura in oriT di
una catena del plasmide F + .
3. Retrazione del pilo sessuale e
formazione di un ponte
intercellulare. Una catena del
plasmide F + entra in F - .
4. Sintesi della catena
complementare di F + in
entrambi i batteri, adesso in
grado di produrre il pilo
sessuale.
Nella coniugazione F+ x F- non
si assiste a trasferimento di
DNA cromosomico
2
4
1
3

Coniugazione: F + x F -

Coniugazione: Hfr x F -
1. Formazione Hfr: inserzione di un
plasmide F+ nel nucleoide del
batterio accettore.
2. Formazione “coppia
coniugativa”. Rottura
monocatenaria del DNA a livello
del plasmide F + integrato.
3. Retrazione pilo sex e formazione
ponte intercellulare. Ingresso del
DNA monocatenario nel batterio
accettore. Interruzione
spontanea della coniugazione:
solo una parte del DNA donatore
verrà trasferita all’accettore.
4. Il donatore sintetizza una copia
complementare del DNA
rimanendo Hfr. L’accettore
sintetizza una catena
complementare del DNA
trasferito.
4
2
-Degradazione
(nessun effetto)
1
3
-Circolarizzazione
(plasm. coniugativo)
-Integrazione
(nuovi caratteri)

Integrazione del plasmide F nel cromosoma
a formare una cellula Hfr
plasmide F
cellula Hfr
plasmide F
integrato
cellula F +
sequenze di
inserzione
(IS) nel
plasmide
plasmide F
integrazione del plasmide F
cromosoma
IS
IS
IS3
gd
IS3
IS2
ricombinazione
omologa tra
elementi IS

Coniugazione: Hfr x F -

Cellula F +
Pilo F
Cellula F -

Coniugazione nei Gram+
• Enterococcus faecalis
• Produzione e rilascio di ferormoni da parte
della cellula “accettrice” (femminile)
• Ferormoni inducono produzione della
sostanza aggregante alla superficie della
cellula “donatrice” (maschile)
• Formazione di aggregati cellulari con
trasferimento del plasmide coniugativo

Significato della coniugazione
Significato clinico:
Principale meccanismo di trasferimento
di geni per l’antibiotico-resistenza
Trasferimento di geni codificanti per fattori
di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori)
Significato ambientale:
Trasferimento di resistenza a erbicidi ed
idrocarburi aromatici
Resistenza batterica ai metalli pesanti
Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto
tra Rhizobia
Plasmidi Ti da Agrobacterium possono trasferire
geni alle piante
(meccanismo di trasferimento genico tra Domini)
Significato evoluzionistico:
Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico

Trasformazione
Assunzione di frammenti di DNA solubile
dall’ambiente circostante da parte di cellule
batteriche “competenti” (Bacillus, Haemophilus,
Neisseria, Pneumococcus)
Meccanismo di trasferimento genetico
“evoluto” da una primitiva esigenza nutrizionale
Influenzato da:
Dimensioni DNA
Sensibilità DNA a nucleasi
“Competenza” della cellula “accettrice”
naturale o indotta artificialmente

Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)
Streptococcus pneumoniae

Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)

Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono
nel DNA la “sostanza trasformante”

Trasformazione batterica
1. Morte e degradazione del
batterio “donatore”.
2. Un frammento di DNA
bicatenario (ds) interagisce
con specifiche proteine (DNAbinding
protein) alla superficie
della cellula “competente”. Il
DNA è reso monocatenario
(ss) da una nucleasi.
3. La proteina Rec A promuove
la ricombinazione omologa tra
il DNA ss donatore e quello ss
recipiente.
4. Lo scambio è completato.
Formazione di heteroduplex:
una sola delle cellule figlie
risulterà essere “trasformata”.
2
4
1
3

Trasformazione batterica

Trasformazione batterica: competenza
La cellula accettrice, per poter essere trasformata,
deve trovarsi in una particolare condizione che prende
il nome di competenza
Competenza – capacità cellulare di “catturare” il DNA.
“Fattore di competenza” (Gram+) induce:
modificazioni di parete cellulare (autolisina)
formazione/attivazione di proteine DNA-binding
e nucleasi
competenza naturale (Bacillus, Neisseria spp.)
competenza indotta artificialmente (P. aeruginosa,
E. coli, S. typhimurium) – trattamento “a freddo”
con CaCl 2 (bassa efficienza, utilizzato di routine
nel clonaggio di DNA in E. coli) - elettroporazione

Trasformazione batterica nei Gram-
Mancanza del “fattore di competenza”, sostituito
da particolari condizioni del mezzo colturale:
Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp.
in condizioni permissive per la sintesi proteica ma
non per la crescita completa.

Significato della trasformazione
Significato biotecnologico:
Clonaggio di geni “utili”
Significato evoluzionistico:
Meccanismo di evoluzione/adattamento batterico

Trasduzione
La trasduzione consiste nel trasferimento di
frammenti di DNA tra due cellule batteriche
mediante un batteriofago (virus batterico).
Esistono 2 tipi di trasduzione:
1. Trasduzione generalizzata: (teoricamente)
qualsiasi gene può essere trasferito
2. Trasduzione specializzata: solo specifici geni
possono essere trasferiti

Batteriofago T4
…infetta Escherichia coli

Trasduzione
generalizzata (1 di 2)
1. Un fago litico adsorbe ad un
batterio sensibile.
2. Penetrazione del genoma
fagico nel batterio. Utilizzo
dei sistemi metabolici cellulari
per la sintesi e l’assemblaggio
delle componenti virali.
3. In alcuni casi, un frammento di
DNA batterico o un plasmide
possono essere erroneamente
inseriti in alcuni capsidi virali
(particelle trasducenti).
2
1
3

Trasduzione
generalizzata (2 di 2)
4. Rilascio dei fagi batterici in
seguito a lisi batterica.
5. Il fago trasduttore adsorbe
ad un batterio sensibile.
6. Penetrazione del DNA fagico.
7. DNA fagico ricombina con il
DNA della cellula accettrice.
7
5
4
6

Trasduzione generalizzata

Trasduzione
specializzata (1 di 2)
1-2. Un fago temperato adsorbe al
batterio sensibile e vi inietta
il suo genoma.
3. Il genoma fagico ricombina
con il nucleoide batterico
divenendo un profago.
4. In presenza di stimoli adeguati,
un frammento del DNA batterico
viene escisso come parte del
genoma fagico. 4
2
1
3

Trasduzione
specializzata (2 di 2)
5. Durante la replicazione fagica il
DNA batterico viene inserito nel
genoma fagico. Tutti i fagi
veicolano il frammento di DNA
batterico.
6. Il fago adsorbe ad una batterio
sensibile iniettandovi il suo genoma.
7. Il genoma fagico contenente il DNA
trasdotto ricombina con il nucleoide
della cellula accettrice.
6
5
7

Trasduzione specializzata

Adattamento ed evoluzione batterica
Mutazione e selezione “classiche”
(Selezione naturale ed evoluzione)
Acquisizione di geni da altri batteri -
Trasferimento genico ORIZZONTALE:
- Coniugazione
- Trasformazione
- Trasduzione
Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica)
Trasferimento genico VERTICALE
La ricombinazione genica è coinvolta in ogni
fenomeno generante variabilità genica

Quantità (valori percentuali) di DNA “atipico”
(trasferito) nei genomi batterici
Circa il 13% del genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante
trasferimento genico orizzontale.

Ricombinazione genica
Scambio “fisico” di materiale
genetico tra due molecole di DNA
Importante processo evolutivo in
quanto promuove la diversità
genetica (permettendo un rapido
adattamento)
Coinvolta nella coniugazione,
trasformazione, trasduzione e
trasposizione
Ricombinazione tra DNA
lineare (a) e plasmidico (b).

Ricombinazione genica
A) Ricombinazione OMOLOGA – scambio genetico tra
sequenze di DNA omologhe
Molto complessa - in E.coli richiede oltre 25 geni,
Alcuni prodotti genici coinvolti:
RecA – catalizza la ricombinazione,
ubiquitaria nei procarioti
RecBCD – attività nucleasica ed elicasica
proteine leganti DNA singola elica -
stabilizzano il DNA a singola elica
B) Ricombinazione SITO-SPECIFICA:
trasposizione (nella trasposizione)
meccanismo integrasi-mediato (nei fagi)
trasposoni integrativi e coniugativi

Ricombinazione omologa nei batteri
Meccanismo e Tipologie

Conversione lisogenica
• Integrazione del genoma fagico
mediante ricombinazione sitospecifica
• DNA profagico “silente”
• Occasionale (essiccamento, U.V.,
radiazioni ionizzanti, agenti
mutageni) derepressione di parte
del DNA profagico
• Espressione di numerose proprietà
patogene dei batteri:
• Produzione di tossine (tox difterica,
indotta da carenza di Fe 3+ )
• Adesine ed antigeni di superficie
(Salmonella O antigen)

Fusione del protoplasto
• Protoplasto = citoplasma + nucleo
• Fusione di due protoplasti trattati
con lisozima e penicillina