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Riarrangiamento geni
immunoglobuline
C. Pioli 2009/2010
Immunologia Molecolare 2009/2010
- C. Pioli

• Nelle cellule non linfoidi i segmenti genici
codificanti la regione V sono “distanti” dalla
sequenza che codifica per la regione C
• Nei linfociti B maturi la regione V assemblata
è molto più vicina alla regione C
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• Le catene leggere k e l e le catene pesanti sono
codificate da famiglie multi-geniche separate
• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multigenica
contiene diverse sequenze codificanti, dette
segmenti genici, separate da regioni non codificanti
• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti
genici vengono riarrangiati e avvicinati per formare geni
funzionali
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La regione V è codificata
da più di un segmento genico
• La regione V L della catena leggera è codificata da
2 segmenti genici
– il primo segmento codifica per i primi 95-101 a.a.
• segmento genico V
– il secondo segmento codifica per pochi a.a. (fino a 13)
• segmento genico J
– L’unione dei segmenti V e J crea un esone continuo
(VJ) che codifica per l’intera regione V L
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V L
C L
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La regione V è codificata
da più di un segmento genico
• La regione V H della catena pesante è codificata
da 3 segmenti genici
– segmento genico V
– segmento genico D
– segmento genico J
– L’unione dei segmenti V, D e J crea un esone continuo
(VDJ) che codifica per l’intera regione V H
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V H
C m2
C m3
C m1
C m4
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Cm1 Cm2 Cm3 Cm4

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Germline organization of Ig light- and
heavy-chain loci in human genome
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Chromosome localization of Ig loci
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DNA catena k germ-line
DNA catena k riarrangiato
Trascritto primario catena k
Riarrangiamento catena k
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V-J joining
Trascrizione

Trascritto primario catena k
mRNA catena k
Polipeptide nascente catena k
Catena k
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RNA splicing + poliadenilazione
Traduzione
Coda poli-A

Riarrangiamento catena pesante
DNA catena H germ line
V-DJ joining
D-J joining
Trascrizione
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DNA catena H riarrangiato
Trascritto primario

Co-espressione di IgM e IgD
• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena
pesante contiene sia gli esoni per la catena m che per la d
– Il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)
• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia
mRNA per m che per d
• La cellula B naive esprime IgM e IgD con la stessa
specificità antigenica
– Stesso VDJ per catena pesante m e d
– Catena leggera associata identica
• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresse
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Trascritto primario catena H
mRNA catena H
Polipeptide nascente catena H
Catena H
splicing alternativo
Catena Hm Catena Hd
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Recombination Signal Sequence, RSS
• Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle sequenze
dette recombination signal sequences (RSS)
– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V
– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J
– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D
• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di
ricombinazione
• Ciascuna RSS contiene
– una sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi (eptamero)
– una sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi (nonamero)
– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23 paia di
basi
• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e corrisponde
a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica
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Sequenze RSS
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“Regola 12/23”
Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può
ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp
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Il complesso della ricombinasi V(D)J
• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica
V(D)J è detto ricombinasi V(D)J
• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2
– i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi
specifica dei linfociti (B e T)
• necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
– topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T
• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il
riarrangiamento dei geni per il recettore dell’antigene
• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi
ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA
– DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80,
Artemis
• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le
sequenze codificanti
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Fasi della ricombinazione 1
• RAG1 e RAG2
riconoscono RSS
– (alla formazione del complesso
partecipano anche altre proteine)
• le RRS di un segmento V e
di uno J sono portate in
prossimità
Segmento genico V
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Segmento genico J
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RSS - 1 giro
RSS - 2 giri

Fasi della ricombinazione 2
• taglio di un filamento di
DNA da parte di RAG-1 e
RAG-2 alla giunzione
delle RSS con le
sequenze codificanti
– tra eptamero e segmento
genico codificante
Segmento genico V
Segmento genico J
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RSS - 1 giro
RSS - 2 giri

Fasi della ricombinazione 3
• l’estremità tagliata del
segmento genico codificante,
viene unita al filamento
opposto producendo una
“forcina”
• all’estremità della RSS,
viene prodotta una doppia
rottura del DNA
Segmento genico V
Immunologia Segmento Molecolare 2009/2010 genico J
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RSS - 1 giro
RSS - 2 giri

Ricombinazione 4
• Vengono reclutate altre proteine
– Ku70/Ku80
• La forcina viene tagliata in
posizione casuale
– RAG/Artemis
– l’estremità viene poi modificata da
• esonucleasi
• TdT (terminal deoxynucleotidyl
transferase)
• Riparo e legame delle sequenze
codificanti e di quelle segnale
– DNA ligasi IV
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Generazione della diversità anticorpale
(GOD, Generation Of Diversity)
• Molteplici segmenti genici
– diverse combinazioni V-(D)-J
• Flessibilità nel processo di giunzione
– aggiunta e rimozione di nucleotidi
• Combinazione di catene pesanti e leggere
• Ipermutazione somatica
– in linfociti B attivati
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200 1.2x106 6x103 x
=
120
Possibili combinazioni teoriche
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x
6x103 0.72x106 =
1.92x10 6
+
=

Variabilità
Variabilità degli aminoacidi nelle Ig
Figure 3-6
Variabilità: HV3 HV3>HV1 ha una e HV2;
varibilità HV3 catena maggiore pesante>
HV3 di HV1 catena e HV2 leggera
Regione V catena pesante Regione V catena leggera
FR, frame regionImmunologia HV, Molecolare hyper-variable 2009/2010 region
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Variabilità

La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J codifica
per la regione ipervariabile 3 (HV3) che corrisponde al CDR3
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HV regions

Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
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Eptamero della RSS
Eptamero della RSS
• l’estremità tagliata del
segmento genico
codificante, viene unita al
filamento opposto
producendo una “forcina”
• (v. slides precedenti)

Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
(P-addition)
• Quando la forcina viene
tagliata si produce un
filamento singolo
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• Gli enzimi di riparazione
aggiungono nucleotidi
complementari a questa
sequenza generando una
sequenza palindromica
– P-nucleotidi
• Variazioni nella posizione
del taglio della forcina
generano variazioni in
questa sequenza

Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
(N-addition)
• Durante la ricombinazione D-J e V-DJ,
la terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT) aggiunge fino a 15
nucleotidi a entrambi le giunzioni D-J
e V-DJ.
• I nucleotidi aggiunti generano
sequenze randomiche
• La N-addition contribuisce largamente
alla variabilità del CDR3 della catena
pesante
• La N addition si verifica quasi
esclusivamente nella catena pesante
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Esclusione allelica
• Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati
della catena pesante di un solo cromosoma e
i geni riarrangiati della catena leggera di un
solo tipo (k o l) di un solo cromosoma
– esclusione allelica
• Assicura che una cellula B funzionale
esprima una sola catena pesante e una sola
leggera
una sola specificità antigenica
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Esclusione allelica in singole cellule B
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