Lezione 10 - Ricombinazione e trasposoni

La ricombinazione del DNA
Ricombinazione omologa
I modelli di Halliday e di Meselson-Redding.
Il complesso RecBCD genera il filamento di DNA “invasore”.
La proteina RecA promuove lo scambio dei filamenti di DNA.
Il complesso RuvABC promuove la migrazione del chiasma
e la risoluzione degli intermedi di Halliday.
Ricombinazione omologa sito-specifica
Tre possibili risultati della ricombinazione sito-specifica.
Integrazione ed escissione del batteriofago lambda.

procarioti
Ansa D e formazione di un DNA
eteroduplex

Giunzione ricombinativa ha la
possibilità di spostarsi in entrambi le
direzioni

Altri eventi di HR
• Appaiamento dipendente dalla sintesi
(SDSA) ricombinazione omologa
mitotica
• Appaiamento del singolo filamento su
ripetizioni dirette (SSA)
• Replicazione indotta da Rottura (BIR)
rottura del DNA con una sola estremità
generalmente sui siti fragili

Coppia di molecole di DNA omologo
(Duplex)

SDSA
1) Viene catturata una sola
estremità
2) Il filamento di neosintesi
viene spostato sul duplex
che prima era danneggiato
e saldato

1) BIR (replicazione indotta dalla rottura)
2) DSB con una sola estremità in sequenze ripetute (siti fragili)
3) Ripara il danno utilizzando una sequenza ripetuta omologa presente
nel cromosoma non omologo (traslocazione non reciproca)

1) SSA avviene in regioni con ripetizioni dirette
2) Vengono generate code al 3’.
3) I singoli filamenti si appaiano grazie all’omologia delle ripetizioni
4) Processamento (rimozione) delle code

Ricombinazioni
• Ricombinazione conservativa sito-specifica (CSSR):
tra due elementi di DNA definiti
• Ricombinazione per trasposizione (trasposizione):
tra sequenze specifiche
e siti non specifici
Hanno in comune le
ricombinasi e la
formazione del complesso
sinaptico

• La CSSR avviene tra due siti specifici o
definiti di DNA
• La trasposizione avviene tra siti specifici
e non specifici di DNA

CSSR: tipi e meccanismo
• I siti di ricombinazione sono composti
da: sequenze di riconoscimento della
ricombinasi e regione dello scambio
• Se hanno la stessa direzione
(ripetizione diretta) permettono
inserzione o delezione
• Se hanno direzione opposta
(ripetizione invertita) permettono la
inversione

CSSR (Ricombinazione conservativa sitospecifica)
Il segmento di DNA che viene spostato porta i siti di ricombinazione
Esempio fago l un sito di ricombinazione sul DNA fagico e l’altro
sul DNA batterico
I siti di ricombinazione sono corti – 20 bp
La CSSR può dar luogo a:
– Inserzione in un sito specifico (es. fago l)
– Delezione di un pezzo di DNA
– Inversione di un pezzo di DNA
Ogni sito di ricombinazione ha:
– Due sequenze di riconoscimento della ricombinasi
– Una sequenza centrale: regione dello scambio

• Membri della famiglia delle integrasi
• Int fago lambda
• Cre del fago P1
• FLP di lievito
• Recombinasi a serina o tirosina

• Reazione tra siti specifici “siti di
ricombinazione” non necessariamente
omologhi in genere 15-50 bp
• Esempio del fago lamba il quale si
integra sul sito in loci specifici “att” di
E. coli
• Escissione tra i siti alle estremità del
profago lineare
• Il gene int del fago codifica un’integrasi
che catalizza la reazione di integrazione

Prodotti di ricombinazione sono
attL ed attR
attP è composto da POP’ elementi
attB è composto da BOB’ elementi
La sequenza centrale O è quella comune dove avviene la ricombinazione

Integrasi di l
• Il passaggio tra lo stato lisogenico
e la crescita litica del fago l
richiede la integrazione o
escissione del DNA fagico.
• L’integrasi l (lInt, a tirosina)
catalizza la ricombinazione tra i
siti attP (phage) e attB (batterio)
• attB di 30 bp ha i due siti di
legame di lInt e la regione del
crossing-over
• attP (240 bp) ha due braccia per
il legame di lInt e del fattore di
integrazione dell’ospite IHF (un
fattore architettonico
• L’escissione richiede Xis

In entrambi i siti attB (23 bp) ed attP (240 bp) vengono creati dei
tagli sfalsati di 7bp e le estremità vengono unite in modo
incrociato. La reazione genera estremità 3’-P e 5’OH
L’integrazione richiede il riconoscimento tra attP ed attB mentre
l’escissione il riconoscimento tra attL ed attR

Ricombinazione fago l
• Il ciclo del fago lambda
implica che:
• Per essere lisogenico
deve essere integrato nel
DNA ospite
• Per entrare nel ciclo litico
deve esser exciso dal
cromosoma.
• I siti di integrazione (attP
e attB) differiscono da
quelli di excisione (attL e
attR)

Meccanismo d’azione

Ricombinasi a Tirosina
• Le ricombinasi a tirosina tagliano ed uniscono due filamenti,
e poi gli altri due. Si ha la formazione di una Holliday junction

Meccanismo delle
ricombinasi: Ricombinasi a
Serina
• Una serina della
ricombinasi attacca il P e
libera il 3’OH. Il legame
può essere riformato
senza richiesta di energia
(conservativo)
• Le ricombinasi a serina
tagliano
contemporaneamente i
due filamenti di DNA
prima dello scambio.
Occorrono 4 subunità

Ricombinazione sito-
specifica e
topoisomerasi
• Le ricombinasi sono correlate alle
topoisomerasi, e la reazione di
ricombinazione somiglia quella di
topoisomerasi eccetto che gli
strands da duplex diversi sono
uniti insieme.
• La reazione conserva energia
usando una tyrosine catalitica
nell’enzima per rompere un
legame fosfodiestere ed unire la
terminazione al 3’.
• due unità enzimatiche si legano
al sito di ricombinazione e i due
dimeri formano un complesso in
cui si ha il trasferimento.

Cre-Lox
Un sistema semplice di ricombinasi a
tirosina si trova nel batteriofago P1.
La Cre recombinase codificata dal
fago catalizza la ricombinazione tra
due sequenze bersaglio.
Le sequenze ricombinanti del fago P1
sono identiche, sono di 34 bpchiamati
loxP. La Cre ricombinase
è sufficiente per la reazione;
nessuna proteina accessoria è
richiesta
Per la sua semplicità ed efficienza, il
sistema Cre/lox è stato adattato per
le cellule eucariote, dove è
diventata una tecnica standard per
site-specific recombination
Struttura di Cre

Cre-lox
Ogni subunità di Cre si lega alla sequenza di
riconoscimento.
Si ha un tetramero sul DNA cruciforme
Cre ha due conformazioni quella verde può
tagliare il DNA. Cambiando la coppia di subunità
attive si taglia anche il secondo filamento

Ricombinasi Hin inverte il DNA
Nella Salmonella la
ricombinasi Hin inverte
una regione di 1000 bp
fiancheggita da siti invertiti
hixL e hixR
In una posizione il
promotore attiva i geni per
la flagellina 2 e
repressore per flagellina 1
Nell’altra induce flagellina 1
Il sistema necessita di un
enhancer a DNA che lega
la proteina Fis

DNA mobile
• La seconda classe di DNA,
interspersed DNA
(moderately repeated DNA,
Intermediate-repeat DNA).
• Fatta da un gran numero di
poche famiglie di sequenze
(45% hu genoma)
• Elementi mobili di DNA o
elementi transposabili.
• Divisi in due categorie:
DNA transposons e
retrotransposons

Genoma e ed evoluzione

Genoma e ed evoluzione
Regioni intergeniche
uniche
Regioni intergeniche
ripetute
Sequenze regolative
Pseudogeni
Relitti?
Non espressi?
DNA microsatellite
3%
DNA altamente
ripetuto
45%

Tendenzialmente all’aumentare della
complessità di un organismo, decresce la
densità genica ed aumentano le sequenze
ripetute.

Genoma

La trasposizione
• Elementi trasponibili o trasposoni.
• Il movimento avviene per un ricombinazione
tra le estremità dell’elemento trasponibile e
una sequenza di DNA della cellula.
• Tre classi
– Trasposoni a DNA
– Retrotrasposoni simili ai virus
– Retrotrasposoni poli-A

Trasposoni
• Ciascuno contiene un gene o più geni
necessari per la propria mobilità
• A volte necessitano di una DNA polimerasi o
girasi o altri enzimi per trasporre

Due tipi
A DNA classe I (procarioti ed eucarioti)
Ad RNA classe II (eucarioti)

Struttura di un trasposone procarioti IS
1) Una sequenza che codifica l’enzima trasposasi o altri enzimi
fiancheggiata da brevi ripetizioni terminali invertite
2) “chiamata sequenza d’inserzione”
3) Il sito bersaglio viene duplicato durante l’inserzione formando
ripetizioni dirette 5-10 bp caratteristica per ogni IS all’estremità
del trasposone

Struttura di un trasposone
1) Il tasso di trasposizione è variabile ed è di circa 1
ogni diecimila elemento per generazione

Trasposoni a DNA: taglia e
• Il DNA con ripetizioni
invertite viene escisso,
• Il complesso sinaptico o
trasposoma
• Nel DNA bersaglio viene
fatta una nick, e si ha
una trans-esterificazione:
trasferimento del
filamento di DNA.
incolla

Fig. 20.7 Organizational maps of bacterial plasmids with transposable elements

IS e Tn nei procarioti

Esempio di DNA transposons:
• Bacterial Insertion Sequences (IS
elements) 1-2 kb.
• La parte centrale codifica una
transposase

Modello di
trasposizione di IS
batteriche
Caratteristiche:
Inverted repeats (50 b)
Direct repeats (5-11 b)

Trasposoni a DNA

meccanismo

Il transposoma
La transposasi è codificata dal
transposone
Occorrono almeno 2 subunità
Ha il ruolo di riconoscere le estremità,
unirle, tagliarle per fare il transposoma,
ed inserire nel DNA bersaglio

La transposizione a DNA con
meccanismo replicativo
• Dopo il trasferimento del
filamento si forma una struttura
con due ramificazioni, che può
fungere da forca replicativa.
• La replicazione termina sulla
seconda forca e produce due
copie del transposone
animazione

Repliconi donatore e
ricevente
Trasposizione replicativa
Cointegrato contiene 2
copie del trasposone
La HR tra le copie del
trasposone rigenera
due repliconi originali
contenente ciascuna
copia del trasposone

Non-replicativa

Tn5

Meccanismi di taglio del filamento non trasferito

1) La HR tra copie multiple di un trasposone causa riarrangiamenti
del DNA ospite
2) La HR tra le ripetizioni di un trasposone può essere precisa o
imprecisa

Disgenesi dell’ibrido in drosophila
1) “elementi P” portati dai ceppi P ma non M
2) l’icrocio tra un maschio P e femmina M
attiva la trasposizione inattivando geni della
fertilità

1) Gli elementi P vengono attivati nella linea germinale da uno splicing
alternativo generando una trasposasi la quale lega sequenze di 10 bp
adiacenti alle ripetizioni invertite avviando una trasposizione di tipo non
replicativo “tipica degli eucarioti”.
2) l’elemento P produce un repressore della trasposizione ereditato per via
materna

Retrotrasposoni (elementi di classe I o
retroelementi)
• Coinvolge un intermedio ad RNA
• limitata agli eucarioti
•Correlati ai provirus retrovirali
nell’oraganizzazione e trasposizione
chiamati (retrotrasposoni LTR)
•Retrotrasposoni o Retroposoni non-LTR
o poli-A utilizzano un sistema di
trasposizione caratteristico

•1) RNA a singola elica
2) Duplica il genoma RNA attraverso un intermedi a DNA
3) Trascrittasi inversa

• Hanno un RNA
intermedio
• Il promotore è su LTR ed
l’RNA viene copiato in
cDNA
• Un’integrasi riconosce le
estremità e dirige il
trasposoma al bersaglio.
Una trascrittasi inversa
sintetizza il DNA

• RNA virale termina con ripetizioni dirette R (10-80 bp)
• 5’ RU5 e 3’ U3R. I segmenti R sono usati x generare ripetizioni
dirette + estese nel DNA lineare
• Accorciamento di 2 bp a ciascuna estremità nella forma integrata
• Dopo l’integrazione l’estremità 3’ di U5 e 5’ di U3 è formata da brevi
ripetizioni invertite

• Trascrittasi inversa
ha un’attività di
• DNA polimerasi
• RNAsi H
• tRNA innesco a
100-200 bp dal 5’
• Salto
intramolecolare o
intermolecolare
• Ha come risultato
si ha l’estensione
dei segmenti
terminali formando
LTR

• “Scelta della
copia”
• scambio di
filamenti
stampo durante
la sintesi del
DNA.
• La sintesi del
filamento +
necessita di un
secondo salto

Modello dell
retrotrascrizione
di RNA
retrovirale
genomico in DNA

• “Scelta della
copia”
• è un
meccanismo
ricombinativo
derivata da uno
scambio nei
filamenti
stampo

• Il DNA lineare a doppia elica viene inserito nel DNA dell’ospite da un
integrasi retrovirale
• Si ha la perdita di 2 bp all’estremità del DNA virale
• La reazione è catalizzata da un integrasi
• L’estremità LTR dei retrovirus e trasposoni virali è formata da un
dinucleotide CA che è conservata e caratteristica
• L’integrasi genera tagli sfalsati sul sito bersaglio separati da 4-6 bp. Il
provirus è fiancheggiato da brevi ripetizioni dirette del sito bersaglio

Tipi comuni
Retroelementi si dividono in tre classi
hanno i meccanismi di TI
Retrotrasposoni
LTR
Ty (lievito) e
copia (drosophila)
Retrotrasposoninon-LTR
SINE
L1 (uomo)
B1,B2, ID,B4 (topo)
SINE (mammifero)
Pseudogeni di trascritti di
Pol III
Terminazioni LTR Nessuna ripetizione Nessuna ripetizione
Ripetizioni nel
bersaglio 4-6 bp 7-21 bp 7-21 bp
Attività
Enzimatiche TI e/o integrasi TI e/o endonucleasi Nessuna
Organizzazione
possono
contenere introni
Uno o due ORF non
interrotti Nessun introne

LTR retrotransposons
• Alcuni contengono long terminal repeats (LTR, 250-600 bp)
• Codificano le proteine tipiche dei retrovirus, eccetto quelle
dell’envelope.
• Codificano reverse transcriptase e integrase
• Nell’uomo la maggior parte deriva dal retrovirus endogeno ERV

Fig. 20.14 The Ty transposable element of yeast
• Nel lievito 5 elementi Ty conosciuti (Ty1-5)
• La classe Ty1/copia è quello + comune rispetto a Ty3/gypsy
• Ty1 contiene 5bp del DNA bersaglio terminale caratteristic
• Frequenza di ricombinazione + bassa rispetto ai procarioti
• Hanno un meccanismo di trasposizione simile ai retrovirus
TyA TyB

• Copia è un retrotrasposone LTR tipico di D. melanogaster
• Sono molto simili tra loro ed abbondanti varia in base al ceppo
• Hanno un sistema di trasposizione simile a Ty di lievito

• Costituiscono metà del genoma umano

Retrotrasposoni senza LTR
Chiamati anche retrotransposoni non virali.
Formano due classi:
– Long interspersed elements (LINE) (6 kb),
promuovono la loro mobilità e forniscono le
proteine per la mobilità di SINE
– Short interspersed elements (SINE) (300 bp)
Hanno sequenze simili ai geni: un promotore e
poliA. Spesso si presentano come
pseudogeni processati, senza il 5’

LINE
• Tre maggiori famiglie: L1, L2 ed L3
• L1 è la più abbondante (21% DNA
totale)
• Codifica: RNA-binding protein (ORF1) e
rev transcriptase/DNA endonuclease
(ORF2).

SINE
• 13% DNA umano
• 100-400 bp. Non codificano proteine.
• Hanno una sequenza ricca in A/T, come
LINE.
• 1.6 milioni di siti, di cui 1.1 sono
elementi Alu

Exon shuffling per ricombinazione tra
interspersed repeats omologhi

Pseudo geni come punti di partenza per esplorare nuove proteine
Il modello classico per spiegare l’origine di nuove strutture proteiche prevede
che da un gene si possano originare delle copie così mentre una copia mantiene
la funzione originale, l’altra è libera di accumulare mutazioni e poter evolvere.
Naturalmente la copia di un gene potrebbe subire vari destini: perdere
funzionalità e diventare uno pseudo-gene, rimanere immutata e quindi costituire
la ridondanza del gene originale oppure evolvere verso nuove e più complesse
funzioni.
Gli pseudo-geni si dividono in processati e non processati. Quelli processati si
trovano su diversi cromosomi rispetto alla copia originale, non hanno introni,
terminano spesso con delle adenine, sono fiancheggiati da ripetizioni e si
trovano solo nei mammiferi. Quelli non processati, si trovano sullo stesso
cromosoma del gene originale, hanno introni, hanno delle mutazioni che fanno
comparire dei codoni di STOP prematuri o eliminare codone di inizio della
traduzione originale, possono produrre un mRNA tronco o intero e si possono
trovare in varie specie.
Un esempio di nuovi geni funzionali evoluti da un gene originale è quello
dell’emoglobina umana, infatti ne esistono varie copie ma espresse in diversi
stadi dello sviluppo.

In bocca al Lupo