TESI DI DOTTORATO - Padis - Sapienza

TESI DI DOTTORATO
I parte: “VALUTAZIONE DEL RUOLO E DEL MECCANISMO DI AZIONE DEL
VEGF (VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR) SULLE CELLULE
DELL’ALBERO BILIARE INTRAEPATICO”
II parte: “STUDIO DI IGF1 ED ESTROGENI COME BASE PER
L’INDIVIDUAZIONE DI UNA INTERAZIONE IGF1 – EE - VEGF NELLA
MODULAZIONE DEL COLANGIOCARCINOMA”
Dott.ssa BARBARA BARBARO
Dottorato di Ricerca in EPATOLOGIA SPERIMENTALE E CLINICA. (XVIII ciclo)
Dipartimento di Anatomia Umana
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA
“LA SAPIENZA”
Direttore della scuola: Chiar.mo Prof. E. GAUDIO ,
Tutore: Chiar.mo Prof. A. F. ATTILI; Coadiuvatore Chiar.mo Prof. D. ALVARO
Docanti Esaminatori: Chiar.mo Prof. Raggio O., Chiar.mo Prof. Onori P.
ABSTRACT
Abbiamo dimostrato che:
(i) I colangiociti esprimono mRNA e le proteine di: VEGF-A and -C, VEGFR-2 e VEGFR-3 e
secernono VEGF; (ii) la secrezione del VEGF e l’espressione del VEGFR-2 e del VEGFR-3
incrementa in colangiociti BDL; (iii) bloccando il VEGF in vivo tramite la somministrazione di
anticorpi anti-VEGF-A o –C diminuisce la proliferazione dei colangiociti dopo BDL; (iv) in ratti
normali, la somministrazione in vivo di r-VEGF-A or r-VEGF-C induce la proliferazione dei
colangiociti ; and (v) in vitro, VEGF-A incrementa la proliferazione delle cellule NRICC attraverso
l’attivazione della via IP3/Ca 2+ /PKC-α
e la fosforilazione di Src/ERK1/2. (vi) nei ratti BDL, HAL
(hepatic artery ligation) induce: una marcata diminuzione del plessso peribiliare, un aumento del
tasso di apoptosi ed un marcato decremento della proliferazione e secrezione dei colangiociti;
questa condizione si associava con una diminuzione di AKT fosforilata. Quando ai ratti sottoposti a
BDL+HAL somministriamo r-VEGF-A gli effetti negativi di HAL sul plesso peribiliare e sulle
funzioni dei colangiociti non si verificano. Conclusioni: Lo studio dimostra che i colangiociti
esprimono il VEGF, che modula la risposta proliferativa adattativa dei colangiociti alla colestasi,
attraverso un meccanismo autocrino, oltre che paracrino. Quindi la regolazione della secrezione di
VEGF potrebbe rappresentare un importante strategia di controllo del bilancio proliferazione/morte
cellulare in nel corso di colangiopatie e potrebbe prevenire le conseguenze di danni ischemici sui
dotti biliari.

Il ruolo del VEGF e della neogenesi vascolare nella crescita neoplastica é attualmente oggetto di
numerose ricerche ma nulla, riguardo a questo, é conosciuto sul colangiocarcinoma. D’altra parte
l’aver osservato che il VEGF è un fattore che interviene nella proliferazione dei colangiociti sarà
interessante andare ad osservare come esso moduli la crescita del colangiocarcinoma, già oggetto di
studio nel valutare la modulazione ad opera di estrogeni ed igf1.
Abbiamo investigato l’ espressione del recettore degli estrogeni (ER), di insulin-like growth factor
1 (IGF1), ed IGF1-R (recettore) nel colangiocarcinoma umano ed in linee cellulari di
colangiocarcinoma (HuH-28, TFK-1, Mz-ChA-1) e valuatato il ruolo degli estrogeni e dell’ IGF1
nella modulazione della crescita neoplastica.. In serum-deprived HuH-28 cells, serum readmission
induced a marked stimulation of cell proliferation which was inhibited by ER and IGF1-R
antagonists. Risultati Il colangiocarcinoma intraepatico umano e la linea cellulare HUH 28
esprimono i recettori per gli estrogeni di tipo α e β ed il recettore dell’IGF1; il 17β-estradiolo e
l’IGF1 stimolano la proliferazione delle cellule HUH28, inibiscono l’apoptosi ed esercitano un
effetto additivo17βQuesti effetti sono associati ad un aumento del recettore ER α, dell’attivazione
delle vie di trasduzione del segnale che coinvolgono ERK1/2 ed AKT, ed ad una diminuita
espressione del recettore ERβ. . Infine, la trasfezione di oligonucleotidi antisenso per IGF1R
determina una marcata diminuzione della proliferazione delle cellule HUH 28. Conclusioni. Il
colangiocarcimoma intraepatico umano esprime i recettori degli estrogeni e dell’IGF1 che
cooperano nella modulazione della crescita cellulare e della proliferazione. La modulazione di tali
recettori potrebbe quindi rappresentare un strategia per contrastare la progressione della malattia.
Occorrerà indagare se esistono interazioni tra VEGF-IGF1-ESTROGENI nella modulazione
della proliferazione dei dotti biliari, sarà interessante indagare la modulazione della crescita
del colangiocarcinoma, mettendo in evidenza se, e qualora esistesse, quale sia la sinergia di
azione di tali fattori.
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INTRODUZIONE
L’ALBERO BILIARE
L’albero biliare è una rete di dotti interconnessi tra di loro, delineato da cellule epiteliali
denominate “colangiociti”; esso gioca un ruolo chiave nel determinare la composizione finale
della bile che arriva al duodeno, attraverso una serie di processi di secrezione ed assorbimento
[Alpini, 1988 ; LeSage, 1999 ; Lesage, 1996 ][Alpini, 2001].
Caratteristiche anatomiche e funzionali dell’epitelio biliare.
L’epitelio biliare si estende dal canale di Hering fino ai larghi dotti extraepatici ed è diviso in
tre differenti segmenti che includono il dotto biliare extraepatico, i piccoli ed i larghi dotti
biliari intraepatici (Alpini G, et al. 1996), (Alpini G, Roberts SK et al, 1996)
Tenendo conto delle dimensioni dei dotti, nell’uomo, l’epitelio biliare intraepatico è stato
suddiviso in: piccoli duttuli biliari ( 800 um in diametro) (Kanno N, et al,
2000); (Ludwig J, et al., 1987).
Più semplicemente, sulla base di differenze morfologiche, fenotipiche e funzionali tra i dotti
di differente diametro, il sistema di dotti biliari intraepatici (in generale, sia di uomo che di
ratto) è stato suddiviso in: dotti piccoli (15 um in
diametro). (Alpini G, Prall RT, LaRusso NF. 2001) (Alpini G, et al. 1996), (Alpini G, Roberts
SK et al, Gastroenterology 1996).
I dotti piccoli sono formati da 4-5 colangiociti e sono caratterizzati dalla presenza di una
membrana basale, tight junctions e microvilli che si proiettano nel lume del dotto biliare
colangiociti poi diventano progressivamente più grandi e più colonnari man mano che si
arriva ai grandi dotti (Schaffner F, et al, Am J Pathol 1961) (Steiner JW et al, Am J Pathol
1961)
Esiste cioè una eterogeneità non solo tra i dotti, ma proprio tra i colangiociti stessi, che
consiste in una differenziazione non solo morfologica, ma anche funzionale (Alpini G, Prall
RT, LaRusso NF. 2001). I colangiociti grandi presentano un basso rapporto
nucleo/citoplasma, a differenza dei piccoli colangiociti che possiedono un nucleo grande e
scarso citoplasma (Benedetti A, et al, 1996)
Un alto rapporto nucleo/citoplasma è tipico di cellule poco differenziate, in cui il grosso
nucleo è sintesi e deposito di RNA messaggero, pronto per essere poi tradotto. Questo
supporta l’ipotesi che i colangiociti piccoli siano considerati delle cellule primitive. Tra l’altro
queste cellule non esprimono tutti i recettori e canali di membrana che invece sono stati
descritti nei colangiociti grandi (Kanno N, et al, 2000)
L’eterogeneità funzionale dei colangiociti ha un importante rilevanza clinica, in quanto molte
colangiopatie sono caratterizzate, almeno inizialmente, da un danno specifico e ristretto ad
una determinata sottopopolazione di dotti. D’altra parte i colangiociti piccoli e quelli grandi
rispondono differentemente, in termini di attività proliferativa, secretoria ed apoptotica, al
danno epatico.
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da: Alpini, G., McGill, And LaRusso N.F., The Pathobiology of Biliary Epithelia
(HEPATOLOGY 2002).
Le funzioni dei colangiociti.
La secrezione di bile da parte del fegato dipende da interazioni funzionali tra epatociti e
colangiociti (Alpini G, Prall RT, LaRusso NF. 2001) (Kanno N, et al, 2000). La bile prodotta
dagli epatociti e riversata nello spazio canalicolare, ricca in sali biliari, glutatione, lipidi,
proteine ed altri soluti organici nello spazio canalicolare tra gli epatociti genera un gradiente
osmotico che favorisce l’ingresso di acqua (Nathanson MH, Boyer JL, 1991). I colangiociti
poi determinano la fluidità e l’alcalinità della bile canalicolare mediante una serie di
meccanismi di secrezione e di riassorbimento che ne determinano la composizione finale.
Nonostante che i colangiociti costituiscano una percentuale molto piccola della totale
popolazione cellulare del fegato, rappresentano infatti solo il 2-5% della massa epatica, la
secrezione duttale contribuisce a formare circa il 10% del flusso di bile totale nell’uomo ed il
30% nei ratti (Alpini G, Lenzi R,et al, 1988,1989).
La secrezione duttale è coordinatamente regolata da ormoni gastrointestinali, peptidi (Cho
WK, Boyer JL. 1999), sali biliari (Alpini G, 1999), enzimi (es. la fosfatasi alcalina) (Alvaro
D, et al, 1998). e dal controllo nervoso (LeSage G, et al, 2002). (Alvaro D, et al 1997)
(Marzioni et al 2003; 2005).
Uno dei più importanti ormoni gastrointestinali studiati che stimola la secrezione duttale
(Alpini G, et al, 1989, 1996, 1998, 2000) (Glaser S. et al.1997), è certamente la secretina, che
è secreta dalle cellule S del piccolo intestino durante la fase post-prandiale. La secretina
determina nell’uomo un incremento del flusso biliare da 0.67 a 1.54 mL/min. Quest’ormone
interagisce con i suoi recettori (SR), che nel fegato, sono espressi solo dai colangiociti, ed in
particolare solo dai colangiociti grandi (Alpini G, Ulrich II C, et al, 1994)
L’ interazione della secretina con i suoi recettori produce l’attivazione della protein chinasi A
(PKA), Glaser S, et al 2003) (LeSage GD. et al 2002) quindi l’incremento dei livelli di cAMP
intracellulare 1,5,6,10,11,32, l’apertura dei canali del cloro CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator) (Fitz JG, 1993), funzionalmente accoppiati allo
scambiatore Cl-/HCO3-( Alvaro D, Mennone A, Boyer JL. 1997), Na+-indipendente,
localizzato a livello apicale dei colangiociti, che determina la conclusiva secrezione di
bicarbonato nella bile.
Questa è una delle più importanti e comunemente più studiate funzioni dell’epitelio biliare in
quanto la secrezione di bicarbonato rappresenta la forza osmotica che guida tutta la secrezione
fluida duttale.
Tra tutte le cellule del fegato solo i colangiociti esprimono il recettore per la secretina e,
questo fatto insieme con la ripetuta osservazione che l’iperplasia dei dotti biliari è
caratterizzata da una conseguente aumentata espressione dei recettori per la secretina (Alpini
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G. et al,, 1998; 2001) (LeSage G. et al, 1999; 1996) (Alpini G. et al, 1994), da aumentati
livelli di cAMP stimolati da secretina (Alpini G. et al, 1998); (Glaser S. et al, 1997; 2000)
(LeSage G. et al, 1999) e da un aumento della coleresi indotta da secretina (Alpini G. et al,
1988) (Glaser S. et al, 1997) (Lesage G. et al, 1996); e che inversamente la perdita dei
colangiociti è accoppiata ad una ridotta espressione dei recettori per la secretina ed una
diminuita espressione di cAMP e di secrezione duttale indotta da questo ormone (Alpini G. et
al, 2001) (LeSage G. et al, 1999), ha fatto si che l’osservazione funzionale dei dotti biliari (in
termini di SR, cAMP, coleresi), potesse essere un indizio funzionale di proliferazione.
Tra gli altri ormoni gastrointestinali che regolano la secrezione duttale, la somatostatina e la
gastrina, a differenza della secretina, diminuiscono la secrezione di bile.
La somatostatina legandosi ai i suoi recettori (SSTR2), individuati solo nei colangiociti grandi
sia di ratto che di uomo, esercita il suo effetto inibitorio sia sulla proliferazione che sulla
secrezione basale e stimolata da secretina, diminuendo i livelli di cAMP intracellulare (Tietz
PS, et al, 1995).. La gastrina diminuisce la secrezione duttale di bile indotta da secretina ed i
livelli di cAMP, interagendo con i recettori CCK-B (ma non CCK-A) posti sulla membrana
basolaterale dei colangiociti, (Glaser S, Benedetti A, et al, 2000) diminuendo i livelli di
cAMP intracellulare, della secrezione di bicarbonato ed incrementando invece l’apoptosi dei
colangiociti.
Tra i vari fattori che regolano la proliferazione dei colangiociti (LeSage G. et al 2001) (Alvaro
D. et al 2000), grande interesse hanno destato gli estrogeni, avendo osservato che le
colangiopatie sono molto più diffuse nelle donne che negli uomini. Recentemente il nostro
gruppo di ricerca ha dimostrato che i colangiociti esprimono sia il recettore per gli estrogeni
di tipo (ER-α) che quello di tipo (ER-β). L’espressione di tali recettori è correlata alla
proliferazione e si osserva una loro overespressione associata alla proliferazione che si
verifica nelle colangiopatie umane (Alvaro D, et al, 2004; 2000; 2002) (Alvaro D, Onori P, et
al 2002).
Studi effettuati in colangiociti di ratto indicano che gli estrogeni interagiscono e potenziano
l’effetto di fattori di crescita sulla proliferazione dei colangiociti (Gigliozzi A, et al 2004)
(Alvaro D, et al 2005).. Specificamente, il nostro gruppo si è interessato alle interazioni degli
estrogeni con altri fattori, in particolare con l’IGF1, un fattore di crescita prodotto in massima
parte dal fegato. Il 17β-estradiolo marcatamente potenzia l’effetto proliferativo dell’IGF-1 su
colangiociti isolati di ratto, interagendo sia a livello recettoriale che post-recettoriale (Alvaro
D, Drudi Metalli V, et al, 2005). Interazioni simili tra IGF1 ed estrogeni modulano la crescita
neoplastica di tumori che ne esprimono i recettori, inclusi i tumori della mammella,
dell’ovario e dell’endometrio (Helle SI: et al, 2004) (Wimalasena J et al, 1993) (Hata H, et al,
1998).
Si conosce poco invece, sul ruolo degli estrogeni e dell’ IGF1 nella modulazione della crescita
e progressione del colangiocarcinoma, per cui il nostro gruppo si è interessato all’effetto di
queste sostanze e dei loro inibitori sul tumore dell’albero biliare intraepatico, utilizzando delle
linee cellulari di colangiocarcinoma (Alvaro D. and Barbaro B. et al AJP in press.)
I colangiociti sono target di una grossa quantità di malattie conosciute in generale come
“Vanishing Bile Duct Syndromes” (Boyer JL. 1997). caratterizzate dalla progressiva
scomparsa dei dotti biliari, può portare ad un grave grado di duttopenia, con ovvie gravissime
conseguenze per la funzionalità epatica. Le colangiopatie infatti sono responsabili di più del
20% dei trapianti di fegato negli adulti e dell’ 80% delle indicazioni di trapianto di fegato in
età pediatrica.
In vari tipi di colangiopatie, nei primi stadi della malattia, quando cioè la scomparsa dei dotti
non è ancora grave, la perdita dei dotti biliari è controbilanciata da un meccanismo di
proliferazione compensatoria, che rallenta il decorso della malattia (Alvaro D. et al, 2000).
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I colangiociti infatti sono cellule che posseggono una marcata capacità proliferativi.
In queste situazioni la proliferazione è indotta inizialmente nei grandi colangiociti ed è un
evento critico che ha come scopo quello di compensare il deficit funzionale dovuto alla
diminuzione progressiva dei dotti biliari, infatti i colangiociti proliferanti mostrano
un’aumentata attività secretoria, ma si ipotizza che vengano stimolati a proliferare anche i
colangiociti piccoli, che assumono poi il fenotipo dei grandi colangiociti, cioè di cellule ben
differenziate che presentano la maggior parte dei recettori descritti nei colangiociti. I piccoli
colangiociti potrebbero così essere considerati una sorta di cellule totipotenti pronte a
proliferare (Alpini G, Glaser SS, et al, 1998).
Molti modelli animali sono stati prodotti al fine di capire al meglio quali sono i meccanismi
che regolano la proliferazione, l’apoptosi, la secrezione, il trasporto, i meccanismi di
traduzione del segnale nei colangiociti e le corrispondenti disfunzioni che portano alle
colangiopatie. Il modello animale più usato per studiare la proliferazione dei colangiociti è
senza dubbio il modello di ratto BDL (Bile Duct Ligation), che utilizza la legatura del dotto
biliare principale per mimare ciò che succede nelle malattie colestatiche croniche (Alpini,
1988; 1998; 2001) (LeSage, 1999)
Altri modelli sperimentali che inducono un danno all’albero biliare sono ad esempio la
somministrazione di tetracloride di carbonio (LeSage et al, 1999) che specificamente
distrugge i grandi colangiociti, con conseguente attivazione e differenziazione dei piccoli
colangiociti che, per compensare la perdita dei grandi dotti via via si accrescono ed assumono
un fenotipo sempre più simile a quest’ultimi, esprimendo recettori e fattori tipici dei grandi
colangiociti. I modelli per lo studio dell’innervazione dei dotti biliari comprendono sia
l’interruzione dell’innervazione parasimpatica mediante vagotomia, i cui danni sulla
proliferazione biliare possono essere prevenuti dalla somministrazione di taurocolato (TC)
(Marzioni M. et al. 2003) o la distruzione delle terminazioni adrenergiche mediante 6OHDA
(6-hydroxydopamine) (LeSage G. et al 2002), modelli che hanno permesso di approfondire le
conoscenze sulla regolazione nervosa dei colangiociti, alla scoperta e comprensione delle vie
di attivazione dei recettori per l’acetilcolina, dei recettori edrenergici ((LeSage G. et al 2004)
del recettore per la serotonina ((Marzioni M. et al. 2005) ed alla comprensione del loro
funzionamento.
L’ ALBERO BILIARE ED IL PLESSO PERIBILIARE
La vascolarizzazione dell’albero biliare intraepatico è rappresentata dal Plesso Peribiliare che
origina dall’arteria epatica. Esso è un’importante rete vascolare che circonda i dotti biliari a
cui è strettamente correlato, infatti, alterazioni nella struttura dell’albero biliare intraepatico si
traducono in cambiamenti strutturali adattativi del plesso peribiliare. Per esempio nel modello
colestatico di ratto BDL, in cui si ha induzione della proliferazione dei colangiociti, si instaura
un parallelo aumento della massa del plesso peribiliare, fondamentale per assicurare un
apporto metabolico e gassoso alla massa biliare che si sta espandendo. Tuttavia, è dimostrato
che l’iperplasia del plesso peribiliare si instaura successivamente a quella dei dotti biliari,
suggerendo che l’imput alla proliferazione è dato dai colangiociti (Gaudio E. et al, 1996);
questo concetto è basilare per comprendere quali sono i meccanismi che regolano la
comunicazione tra vari tipi cellulari, soprattutto in situazioni di danno epatico.
In ratti normali, i colangiociti sono in uno stato quiescente, la legatura dell’ arteria epatica non
è di per sè sufficiente per indurre un danno alle vie biliari, suggerendo che arterie accessorie,
asi collaterali oppure anastomosi tra il PBP ed il sistema portale possono intervenire per
evitare gli effetti del blocco del flusso arterioso attraverso l’arteria epatica principale
(Burczynski FJ et al 1996). Anche studi effettuati in “guinea pigs “ normali, l’interruzione
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dell’apporto di sangue ai dotti biliari intraepatici (mediante momentanea legatura dell’arteria
epatica) non altera l’attività secretoria dei colangiociti (Tavoloni N et al 1985).
Esistono tuttavia poche informazioni riguardo al ruolo dell’apporto sanguigno attraverso
l’arteria epatica in condizioni patologiche.
IL VEGF
Il VEGF (VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR) è un fattore di crescita
identificato inizialmente come un potente mitogeno per le cellule endoteliali; esso è di
fondamentale importanza sia per la fisiologia che per la patologia vascolare, tra cui
vasodilatazione, permeabilità vascolare, migrazione, e meccanismi di sopravvivenza (Ferrara
N, et al 2003) (Larrivee B, et al 2000) (Zachary I. 2003).
Il VEGF inoltre, induce la mobilitazione di cellule precursori endoteliali verso tessuti
ischemici, che differenzieranno in cellule vascolari (Ferrara N, et al 2003) (Larrivee B, et al
2000) (Zachary I. 2003), ed è uno dei fattori essenziali per lo sviluppo vascolare prenatale ed
è nota la sua azione diretta nei fenomeni di angiogenesi associati a tumori (Ferrara N.,1996).
Oggi il termine VEGF più propriamente indica il VEGF-A, in quanto appartiene ad una
famiglia di fattori di crescita tra cui: il VEGF-B, -C, -D, -E ed il PGF (placenta growth
factor), tutti espressi nei mammiferi tranne il VEGF-E che è espresso nei virus a DNA a
doppia elica, (Zachary I. e Gliki G., 2001).
Esistono svariate isoforme di VEGF-A derivanti da splicing alternativo, per esempio dallo
splicing alternativo dell’mRNA di un singolo gene del VEGF-A umano, contenente 8 esoni,
derivano le isoforme of 121, 145, 165, 189 e di 206 residui aminoacidici (Neufeld et al, 1996)
(Poltorak Z. et al, 1997). Si ritiene che le isoforme 145, 189 e 206 dopo essere state secrete,
vengano trattenute all’interno della matrice extracellulare, e che le isoforme 121 e 165 siano
quelle ritenute biologicamente più attive.
Similmente al gene umano, il gene codificante per il VEGF-A di topo, così come quello di
ratto, è formato da 8 esoni e, l’mRNA risultante dà origine, sempre per splicing alternativo, a
3 isoforme corrispondenti a quelle di 121, 165 e 188 AA. (Shima DT.et al, 1996) (Levy AP.et
al, 1995).
La maggiore funzione del VEGF-C sembra essere quella di un fattore di crescita per i vasi
linfatici (Jeltsch M, et al 1997) (Kukk E. et al, 1996), ma sempre maggiori evidenze
affermano la presenza e l’azione di questo fattore in cellule epiteliali.
Sono stati identificati tre tipi di recettori per il VEGF: il VEGFR-1 (Flt-1) che lega il VEGF-
B, il Pigf ed il VEGF-A ; il VEGFR-2 (Flk-1) che lega il VEGF-A il VEGF- E ed anche, ma
in maniera più blanda, il VEGF-C; ed il VEGFR3 (Flt-4) che lega i VEGF-C e –D.(Ferrara
N, 2003) (Larrivee B, 2000) (Zachary I. 003).
[Da: Ian Zachary and Georgia Gliki (Cardiovascular Research 49 (2001) 568–581)]
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L’ espressione del VEGF e dei suoi recettori non è ristretta alle sole cellule endoteliali, infatti
è espresso anche nelle cellule vascolari del muscolo liscio, negli osteoblasti, in miotubi
rigeneranti e nelle cellule staminali ematopoietiche. Svariati studi hanno poi dimostrato che il
VEGF è secreto da numerosi tipi di cellule epiteliali, nelle quali modula, attraverso
meccanismi autocrini e paracrini molte funzioni, tra cui la proliferazione, l’apoptosi, la
permeabilità e la secrezione (Uchida S, et al 2003).
Svariati studi su carcinomi epatici, evidenziano la presenza del VEGF, come fattore
importante per la crescita tumorale. E’ stato visto che carcinomi epatici piccoli e ben
differenziati ricevono sangue dalla vena porta; man mano che le dimensioni del tumore
aumentano l’apporto di sangue avviene anche attraverso l’arteria epatica (Reynaert H, et al
2001). Tumori di grossa entità determinano non solo angiogenesi ma anche la formazione di
nuovi vasi linfatici che in ultima analisi potrebbero portare alla formazione di metastasi
linfonodali. Il mediatore principale della linfangiogenesi è proprio il VEGF C.
Il ruolo del VEGF nella patofisiologia dei colangiociti, le cellule epiteliali proprie dell’albero
biliare, è sconosciuto. Siamo andati quindi a valutare il ruolo del VEGF nella regolazione
della proliferazione dei colangiociti di ratto in 2 modelli sperimentali:
-dopo legatura del dotto biliare principale (BDL), un modello sperimentale di fibrosi o
-dopo legatura sia del dotto biliare principale che dell’arteria epatica (BDL+HAL), condizione
in cui la maggiore richiesta di sangue ricco di ossigeno e fattori nutritivi dovuta all’aumento
di massa dopo BDL, non viene soddisfatta a causa della legatura dell’arteria epatica;
condizione che può simulare l’ischemia post-trapianto, causa di notevoli complicazioni che
sfociano in colangiopatie.
SCOPO DELLA RICERCA
Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare l’espressione del VEGF-A e del VEGF-C
e dei loro recettori in colangiociti normali e proliferanti dopo BDL; ed, in vivo, di determinare
il ruolo di questo fattore di crescita nella regolazione della proliferazione e secrezione dei
colangiociti, in corso di colangiopatie. Successivamente di controllare attraverso quali
meccanismi di trasduzione del segnale il VEGF svolge la sua azione.
Dato che è documentato il cross-talk tra l’epitelio biliare ed il plesso peribiliare, in quanto
quest’ultimo va incontro a modificazioni adattative, a seguito dei cambiamenti dell’albero
biliare, abbiamo voluto indagare le conseguenze funzionali e morfologiche della legatura
dell’arteria epatica (HAL), e se il VEGF fosse in grado di mediare la risposta dei colangiociti
a questa condizione.
METODOLOGIA SPERIMENTALE
Materiali utilizzati
I reagenti sono stati acquistati dalla Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a meno che non
indicato diversamente.
Gli anticorpi contro: l’antigene nucleare di proliferazione cellulare (PCNA, # sc-56, mouse
IgG), VEGF-A (# sc-507, rabbit IgG), VEGF-C (# sc-9047, rabbit IgG), VEGFR-1 (# sc-316,
rabbit IgG), VEGFR-2 (# sc-505, rabbit IgG), e VEGFR-3 (# sc-637, rabbit IgG) sono stati
acquistati da Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Il substrato per -
glutamyltranspeptidase ( -GT), da Polysciences (Warrington, PA), la secretina porcina da
Peninsula (Belmont, CA). L’anticorpo mouse anti-cytokeratin 19 (CK-19) dalla Amersham
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(Arlington Heights, IL). Il VEGF ricombinante (mouse r-VEGF-A e r-VEGF-C) da Leinco
Technologies Inc. (St. Louis, MO). Il kit RIA per la determinazione del cAMP intracellulare
ed il kit per la determinazione di IP3 intracellulare sono stati acquistati da Amersham
(Arlington Heights, IL).. Gli anticorpi anti-fosfo-Src-Tyr 139 (rabbit), anti-fosfo Src-Tyr 530
(goat), ed anti-total Src (mouse) L’anticorpo anti-ERK (clone C-16), (rabbit monoclonal
(IgG)) che riconosce le MAPK, p44 e p42, ed anti-fosfo-ERK (pERK) (clone N-18), (goat
monoclonal IgG) che riconosce le forme fosforilate di p44 ep42, sono stati acquistati da Santa
Cruz Biotechnology.
Modelli animali
Ratti maschi di ceppo Fischer 344 (peso compreso tra 150 e 175 g.), mantenuti in un ambiente
a temperatura costante di 22°C con un ciclo luce-buio di 12 ore ed alimentati ad libitum con
cibo standard per ratti e con libero accesso all’acqua.
Gli studi sono stati condotti in:
1. ratti normali;
2. ratti BDL (sottoposti a legatura del dotto biliare principale per 1 settimana)(Alpini G. et al
1998)
3. ratti BDI (sottoposti ad incannulazione del dotto biliare principale per la raccolta della bile
prima o dopo l’uso di sostanze iniettate mediante cannula giugulare) (Alpini G. et al 1994)
4. ratti che immediatamente dopo BDL o BDI, sono stati trattati con un’iniezione giornaliera
per 7 giorni di siero non-immune (controllo), o anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C (10
ng al giorno)*;
5. ratti normali a cui sono state impiantate delle minipompe intraperitoneali che rilasciano
gradualmente: 0.2% albumina bovina (BSA) (controllo), r-VEGF-A o r-VEGF-C (2.5
nmol/kg/ora)* in presenza di BSA, per 1settimana;
6. ratti BDL + HAL (che oltre alla legatura del dotto biliare principale, sono stati sottoposti
alla legatura dell’arteria epatica (Davis B, 1987).
7. ratti ai quali dopo BDL o BDI, + HAL sono state impiantate delle minipompe
intraperitoneali che rilasciano gradualmente: 0.2% albumina bovina (BSA), r-VEGF-A o r-
VEGF-C (2.5 nmol/kg/ora)* in presenza di BSA, per 1settimana.
Prima di ogni procedura i ratti sono stati anestetizzati mediante un'iniezione
intraperitoneale di sodium-pentobarbital (50 mg/kg di peso corporeo).
8. NRICC (Normal Rat Intrahepatic Cholangiocyte Culture): coltura di colangiociti
intraepatici da ratti normali recentemente sviluppata e caratterizzata da (Alpini G. et al 2003).
* La dose (nM) di anti-VEGF-A, anti-VEGF-C, r-VEGF-A o r-VEGF-C somministrate ai ratti
è stata scelta secondo la concentrazione (nM) di VEGF trovata nel siero degli animali
utilizzati (vedi in risultati). La dose è simile a quella trovata nel ratto e nell’uomo (Yin R, et al
2000) (Assy N, et al, 1999).
Isolamento dei colangiociti.
Da ogni gruppo di animali sono stati isolati i colangiociti puri al 97-100%, come dimostrato
dalla istochimica per la γ-GT (Alpini G. et al 2001), mediante la tecnica di separazione per
immunoaffinità (LeSage GD, et al, 2002) usando un anticorpo monoclonale di topo (IgM,
gentilmente provvisto dal Dr. R. Faris, Brown University, Providence, RI) diretto contro un
antigene di membrana non identificato, espresso da tutti i colangiociti intraepatici di ratto
(Ishii M, et al, 1989). Il numero di cellule e la viability (>97%) sono stati valutati mediante il
trypan blue.
9

Secrezione in vitro
Subito dopo l’isolamento i colangiociti (1x10 6 ) sono stati incubati a 37 o C per zero o 6 ore,
centrifugati a 1,500 rpm per 10 minuti a 4 o C, ed il supernatante (100 ul) è stato usato per
misurare la concentrazione del VEGF mediante un kit ELISA (Peninsula Laboratories, Inc,
San Carlos, CA). La secrezione del VEGF (ng/1x10 6 cells) è stata calcolata come la
differenza tra l’ammontare di VEGF a 6 ore e quello al tempo zero.
Immunoistochimica su fettine (5 um) di fegato in paraffina.
Le sezioni di fegato sono state appoggiate su vetrini ricoperti di poli-L-lisina allo 0.1%. Dopo
la deparaffinazione, l’attività della perossidasi endogena è stata bloccata incubando per 30
minuti con perossido d’idrogeno metanolico (2.5%). La biotina endogena bloccata mediante
biotin blocking system (Dako, Milan, Italy) seguendo le istruzioni del fornitore. Le sezioni
sono state poi bagnate con alcohol e con PBS (phosphate-buffered saline) pH 7.4, quindi
incubate overnight a 4°C con anticorpi specifici per VEGF-A, VEGF-C, VEGFR-1, VEGFR-
2 o VEGFR-3 diluiti 1:400. Sono stati effettuati dei lavaggi con PBS di 5 minuti, e poi
incubati per 10 minuti a temperatura ambiente con l’anticorpo secondario biotinilato (Dako
LSAB2, code K0675), quindi con Dako ABC (Dako LSAB2, code K0675) e sviluppati con 3-
3' diaminobenzidine (DAB). Le sezioni sono state quindi analizzate con una Olympus BX-5
1 light microscopy (Tokyo, Japan) con Videocam (Spot Insight, Diagnostic Instrument, Inc.
Sterling Heights, MI) e processate con Image Analysis System (IAS - Delta Sistemi, Roma).
Le sezioni non incubate con l’anticorpo primario sono servite come controlli negativi.
Immunoistochimica su colangiociti isolati.
Colangiociti isolati posti su vetrino mediante cytospin sono stati incubati at 4°C overnight con
anticorpi anti-VEGFR-1, anti-VEGFR-2 o anti-VEGFR-3 (diluizione 1:1000), bloccati con
siero normale di capra, e poi incubati con un anticorpo secondario coniugato con la
perossidasi (HRPO) (Histofine Simple Stain Rat MAX PO (MULTI)®, Nichirei, Tokyo,
Japan) per 3 ore a temperatura ambiente. I prodotti di reazione sono stati visualizzati con la
soluzione substrato DAB. Quindi i vetrini sono stati osservati in microscopia ottica (Nikon,
Tokyo, Japan) con l’ausilio di una CCD camera digitale. L’immunoistochimica per il VEGF-
A ed il VEGF-C su cellule isolate è stata effettuata con anticorpi anti VEGF-A o VEGF-C
diluiti 1:400, at 4°C overnight; dopo alcuni lavaggi con PBS, sono stati incubati per 10 minuti
a temperatura ambiente con un anticorpo secondario biotinilato (Dako LSAB2, codice
K0675), quindi con Dako ABC (Dako LSAB2, codice K0675) e sviluppato con 3-3'
diaminobenzidine (DAB).
Le sezioni sono state quindi analizzate con una Olympus BX-5 1 light microscopy (Tokyo,
Japan) con Videocam (Spot Insight, Diagnostic Instrument, Inc. Sterling Heights, MI) e
processate con Image Analysis System (IAS - Delta Sistemi, Roma). Le sezioni non incubate
con l’anticorpo primario sono servite come controlli negativi.
Istochimica per il controllo della proliferazione.
La proliferazione dei colangiociti di ogni specifico gruppo di animali è stata valutata
misurando il numero di colangiociti PCNA-positivi e di dotti CK-19- e γ-GT-positivi in
sezioni di fegato (5 um). (Alpini G, Phinizy JL, et al, 2003).
E’ stata quindi effettuata una controcolorazione con ematossilina ed esaminate in maniera
random, con un microscopio ottico Olympus BX 51 (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo,
Japan). I dati sono stati espressi come: (i) il numero di colangiociti PCNA-positivi per ogni
100 colangiociti; e (ii) % di dotti CK-19-positivi valutata in dieci differenti campi (10X o
20X) del vetrino ottenuto da almeno 6 sezioni di fegato prese in modo random dal lobo
mediano. L’istochimica per visualizzare i dotti γ-GT-positivi (massa duttale intraepatica) è
stata effettuata su sezioni congelate (5 um). I dati sono stati espressi come il numero di dotti γ-
GT-positivi contati in sette differenti campi.
10

Istochimica per il controllo dell’apoptosi.
L’apoptosi dei colangiociti è stata valutata mediante la metodica TUNEL in sezioni di fegato
(5 um) da ogni selezionato gruppo di animali. Dopo la controcolorazione con ematossilina, le
sezioni sono state esaminate con un Olympus BX-40 light microscope (Tokyo, Japan)
corredato di camera digitale.
RT-PCR
RNA totale è stato estratto da colangiociti puri mediante GenElute total mammalian RNA Kit
(Sigma Chemical Co), retrotrascritto ed amplificato mediante AmplyTaq DNA polymerase
(PE Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizzando specifici primers costruiti dalla
INVITROGEN Corporation;
1) i primers per VEGFR-1, basati sulla sequenza pubblicata del VEGFR1 di ratto (Sato T. et
al 2001) sono: senso 5'-TTCCGGACTTTCAACACCTC-3' ed antisenso 5'-
CCGAATAGCGAGCAGATTTC-3', la lunghezza del framento:199 bp e le condizioni della
PCR: 35 cicli di: 30 sec. a 94°C, 30 sec a 60°C, 45 sec. a 72°C. Abbiamo usato RNA totale di
cuore ratto ed RNA transfer di lievito come controlli positivo e negativo rispettivamente;
2) i primers per VEGFR-2, basati sulla sequenza pubblicata del VEGFR-2 di ratto (Sato T. et
al 2001) sono: senso 5'-GTGATTGCCATGTTCTTCTGGC-3' ed antisenso 5'-
TCAGACATGAGAGCTCGATGCT-3', la lunghezza del frammento: 337 bp e le condizioni
della PCR: 35 cicli di: 30 sec. a 94°C, 30 sec a 60°C, 45 sec. a 72°C. Abbiamo usato RNA
totale di cuore ratto ed RNA transfer di lievito come controlli positivo e negativo
rispettivamente;
3) i primers per VEGFR-3, basati sulla sequenza pubblicata del VEGFR-3 umano (Zhang X.
Et al 2005) sono: senso 5'-CACTCCCGCCATACGCCACATCAT-3' and antisenso 5'-
CTGCTCTCTATCTGCTCAAACTCC-3', la lunghezza del frammento: 435 bp e le
condizioni della PCR: 35 cicli di: 30 sec. a 94°C, 30 sec a 60°C, 45 sec. a 72°C. Abbiamo
usato RNA totale di cuore ratto ed RNA transfer umano come controlli positivo e negativo
rispettivamente;
4) i primers per VEGF-A, basati sulla sequenza pubblicata del VEGF-A di ratto (Rosmorduc
O et al 1999) sono: (senso 5'-ACCTCCACCATGCCAAGT-3' ed antisenso 5'-
TAGTTCCCGAAACCCTGA-3', la lunghezza dei frammenti: 434, 565, and 687 bp
corrispondenti alle isoforme derivanti dallo splicing alternativo e le condizioni della PCR: 35
cicli di: 30 sec. a 94°C, 30 sec a 57°C, 45 sec. a 72°C. Abbiamo usato RNA totale di cuore
umano ed RNA transfer umano come controlli positivo e negativo rispettivamente;
5) i primers per VEGF-C, basati sulla sequenza pubblicata del VEGF-C di ratto (Kirkin V. et
al 2001) sono: (senso 5'-GCCAATCACACTTCCTGCCG-3' ed antisenso 5'-
CTGGCAGGTGTCTTCATCCAAC-3', la lunghezza del frammento: 615 bp e le condizioni
della PCR: 35 cicli di: 30 sec. a 94°C, 30 sec a 54°C, 45 sec. a 72°C. Abbiamo usato RNA
totale di cuore umano ed RNA transfer umano come controlli positivo e negativo
rispettivamente.
6) Per controllare che fosse usata la stessa quantità di RNA in ogni PCR, abbiamo effettuato
la RT-PCR dell’ housekeeping gene gliceraldeide-3-fosfato-deidrogenasi (GAPDH)
utilizzando i primers basati sulla sequenza della GAPDH di ratto (Fort P.,et al 1985): senso 5'-
GTGACTTCAACAGCAACTCCCATTC-3' ed antisenso 5'-
GTTATGGGGTCTGGGATGGAATTGTG-3', la lunghezza del frammento: 294 bp, le
condizioni della PCR: 35 cicli di: 30 sec. a 94°C, 30 sec a 52°C, 45 sec. a 72°C, utilizzando
RNA totale di rene di ratto ed RNA transfer di lievito come controlli positivo e negativo
rispettivamente;
11

Western blot
Le cellule sono state solubilizzate in lysis buffer contenente:15 mM Tris HCl (pH 7.4), 5mM
EDTA, 100mM NaCl, Igepal 1%, 2 mM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride), 2mM
benzamidina e 1% aprotinina in ghiaccio per 30 minuti. Dopo una breve sonicazione i
campioni sono stati centrifugati a 10,000 g per 20 secondi a 4°C; del supernatante è stata
determinata la concentrazione delle proteine mediante BIO-RAD Protein Assay-Dye Reagent
(BIO-RAD Laboratories GmbH). Così 10 µg di lisato totale di colangiociti puri sono stati
diluiti in 6x LSB (Laemly sample buffer) contenente 0.3 M 2-mercaptoethanolo e blu di
bromofenolo e sottoposti a SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) in gel al 4-
12%. Successivamente è stato effettuato il trasferimento su nitrocellulosa e le proteine di
interesse visualizzate utilizzando anticorpi primari specifici I blots sono stati normalizzati
confrontando gli immunoblots della -actina, (housekeeping protein). L’intensità delle bande
è stata determinata mediante densitometria-video usando ChemiImager TM 4000 low light
imaging system (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA).
Valutazione della Secretione Duttale.
Studi precedenti hanno mostrato che la proliferazione dei colangiociti è sempre associata con
un’ aumentata secrezione duttale e di cAMP per cui, è stata misurata la secrezione di bile e di
bicarbonato (Kanno et al 2000), basale e stimolata da secretina mediante in ratti BDI. (Alpini
G. 2003; 1999) (LeSage G. et al 1996; 2001) (Glaser S. et al 2000; 2003).
Dopo anestesia, i ratti sono stati preparati chirurgicamente per il prelievo della bile come
descritto da Alpini et al l988. Una vena giugulare è stata incannulata per l’infusione di Krebs
Ringer Henseleit (KRH) o secretina (100 nM) sciolta in KRH. Quando il flusso biliare
diventava costante, i ratti venivano infusi per 30 minuti con secretina, seguita da una finale
infusione di KRH per altri 30 minuti. Durante questo tempo la bile veniva raccolta in tubi
pre-pesati, ogni 10 minuti. La concentrazione di bicarbonato (misurata come CO2 totale) era
determinata mediante ABL 520 Blood Gas System (Radiometer Medical A/S, Copenhagen,
Denmark).
Saggio per la determinazione di cAMP: dopo l’ isolamento, i colangiociti da ogni gruppo di
animali sono stati incubati per 1 ora a 37oC (per rigenerare le proteine di membrana
danneggiate dagli enzimi proteolitici usati per l’isolamento delle cellule)(Kato A. et al 1992) e
successivamente incubati a temperatura ambiente per 5 minuti con 0.2% BSA (basale) o
secretina (100 nM) (Alpini G. 2003; 1999) (LeSage G. et al 1996; 2001) (Glaser S. et al 2000;
2003) con 0.2% BSA. I livelli di cAMP intracellulare (espressi in fmol per 10 5 cellule) sono
stati determinati mediante un kit RIA. (Amersham Life Science).
Valutazione della proliferazione in coltura di NRICC stimolate con rVEGF-A e rVEGF-
C ed inibitori di alcune vie di traduzione del segnale
Le cellule NRICC sono state coltivate fino al 70% di confluenza 9, e successivamente
stimolate con : (i) 0.2% BSA (basale) per 48 ore; o (ii) r-VEGF-A o r-VEGF-C (entrambi a
100 nM con 0.2% BSA) per 48 ore essendo state pre-incubate o meno con BAPTA/AM, un
chelante del [Ca2+]i (Kanno N et al 2001) (5 uM for 2 hours), Gö6976, un inibitore di PKC-
(Morales-Mulia S. et al 2001) (1 uM per 2 ore) o PP2 (un inibitore di Src, 1 uM per 2 ore)
(Alvaro D. et al 2001). Successivamente abbiamo misurato la proliferazione valutando
l’espressione del PCNA mediante immunoblotting o mediante un kit colorimetrico che
evidenzia il numero di cellule biologicamente attive (MTS assay, CellTiter 96AQueous;
12

Promega Corp., Madison, WI) in colture di cellule poste in piastre da 96 pozzetti (10,000
cellule /pozzetto); il numero di cellule è stato valutato mediante assorbanza a 490 nm.
Valutazione dei livelli di IP3 and Ca2+
-Per la misurazione dell’IP3 intracellulare, le NRICC sono state incubate per 1 ora a 37°C e
successivamente stimolate per 10 minuti a 22 C con: (i) 0.2% albumina sierica bovina
(BSA); o (ii) r-VEGF-A o r-VEGF-C (entrambi a 100 nM con 0.2% BSA) essendo state preincubate
o meno con PP2 (un un inibitore di Src, 1 uM per 10 min) (Alvaro D. et al 2001). I
livelli di IP3 intracellulare sono stati valutati mediante un kit per la determinazione di IP3
[ 3 H] (Amersham).
-La misurazione dei livelli di calcio è stata fatta mediante fluo-3 AM (Molecular Probes,
Eugene, Oregon) ed un Fluoroskan Ascent FL (ThermoLabsystems, Helsinki, Finland).
(Kassack M et al 2002) Le NRICC (4 x 10 4 per pozzetto) sono state trattate per 1 ora a
temperatura ambiente con fluo-3 AM 5 M in soluzione Tyrode (TSS, 137 mM NaCl, 2.7
mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM NaH2PO4, 12 mM NaHCO3 and 5.5 mM glucose) with
O.1% Pluronic F-127 (Molecular Probes, Eugene, Oregon), secondo le istruzioni del kit. La
lunghezza d’onda utilizzata è stata di 485 nm, e la concentrazione di [Ca 2+ ]i è stata calcolata
come: [Ca2+]i = Kd(F-Fmin)/(Fmax-F), dove Fmax è l’intensità della fluorescenza misurata
dopo permeabilizzazione delle cellule con 1% NP-40; Fmin , è l’intensità minima della
fluorescenza misurata dopo trattamento con 0.1 M EGTA, un chelante del Ca2+ ; la Kd di
fluo-3 AM era a390 nm (Kao J. Et al 1994)
Valutazione degli effetti di “BDL”, “HAL” e della somministrazione di anticorpi anti-
VEGF-A e –C su: peso corporeo, morfologia del fegato, necrosi ed infiammazione.
Circa 10 differenti aree portali sono state esaminate mediante colorazione con ematossilinaeosina
di sezioni incluse in paraffina (4 um di spessore) ed esaminati con un microscopio
ottico Olympus BX 40 (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan).
I risultati sono stati classificati in 4 gradi di gravità (-, +, ++, +++) rispetto ai campioni di ratti
BDL (utilizzati come controllo interno, posti con grado +).
La microcircolazione epatica è stata valutata dal gruppo del prof.Gaudio mediante la tecnica
di “corrosion cast” (Gaudio E. et al, Gastronterology 1996). In breve, questa tecnica utilizza
una resina iniettata nell’aorta, dopo la sua polimerizzazione il fegato viene macerato in NaOH
al 20% e ciò che rimane è una sorta di calco della vascolatura epatica, che viene poi
esaminato con un microscopio elettronico a scansione.
Analisi statistica
Tutti i dati sono espressi come mean ± SEM. Differenze tra i gruppi sono state analizzate
mediante il test di Student (t test) per l’analisi di 2 guppi e l’analisi di varianza (ANOVA) per
l’analisi di gruppi maggiori di due.
13

RISULTATI
I colangiociti di ratto esprimono il VEGFR-2 ed il VEGFR-3, il VEGF-A ed il VEGF-C e
secernono VEGF
I dotti biliari di ratti normali e BDL esprimono il VEGFR-2 ed il VEGFR-3, ma non il
VEGFR-1. L’immunoistochimica, mostra che l’espressione di VEGFR-2 e di VEGFR-3 era
più alta nei dotti biliari di ratti BDL che di ratti normali [% colangiociti VEGFR-2 positivi
:46.0 ± 3.2 (BDL) vs. 12.0 ± 1.2 (normali) (p

L’immunoblotting mostra che l’espressione di VEGFR-2 e VEGFR-3 era significativamente
più alta in colangiociti da ratti BDL piuttosto che in colangiociti da ratti normali. (Figura 1c).
Mediante immunoistochimica in sezioni di fegato (Figura 2a), abbiamo trovato che i
colangiociti intraepatici di ratti normali e BDL esprimono il VEGF-A ed il VEGF-C e che
questi fattori sono maggiormente espressi in ratti BDL rispetto a ratti normali.
15
Fig. 1c
Fig.1b

L’analisi molecolare mediante RT-PCR mostra che sia i colangiociti normali che quelli BDL,
esprimono l’ mRNA per il VEGF-A e per il VEGF-C. Come in altri studi, (Rosmorduc et al
1999) tre bande a: 687 bp, 565 bp e 434 bp corrispondenti rispettivamente alle tre isoforme di
VEGF derivanti da splicing alternativo dell’mRNA, l’isoforma VEGF-A 188, l’isoforma
VEGF-A164, e l’isoforma VEGF-A120, erano presenti in colangiociti sia normali che BDL
(Figura 2c). L’espressione della GAPDH era similarlmente espressa sia in colangiociti
normali che da quelli isolati da ratti BDL (Figura 2b).
16
Fig.2a
Fig.2b

Con l’immunoblotting, troviamo che il VEGF-A ed il VEGF-C sono espressi in colangiociti
normali e la loro espressione aumenta dopo BDL (Figura 2c).
Ancora, abbiamo trovato il VEGF nel supernatante di colture primarie di colangiociti normali,
indicando che i colangiociti intraepatici di ratto secernono VEGF. Dopo BDL, la quantità di
VEGF secreto nel medium è significativamente aumentata rispetto alla quantità di VEGF
secreto da colangiociti normali (Figure 2 d).
17
Fig. 2d
Fig.2c

La somministrazione di anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C fa diminuire la
proliferazione dei colangiociti
Il trattamento dei ratti BDL con anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C per 1 settimana, non
ha provocato cambiamenti di peso rispetto ai ratti trattati solo con siero non immunizzato, così
come non si sono notate differenze nel grado di infiammazione portale, necrosi e danno
lobulare. La somministrazione di anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C a ratti che hanno
subìto BDL fa diminuire l’espressione della proteina PCNA (un indice di replicazione
cellulare) rispetto ai colangiociti di ratti BDL trattati solo con siero non-immunizzato. In
figura 3 è rappresentato l’immunoblot corrispondente (dati espressi in rapporto alla b-actina x
100, unità arbitrarie): colangiociti di ratti BDL trattati con anti-VEGF-A (40.4 ± 5.1unità
arbitrarie, n =8) o anti-VEGF-C (44.3 ± 6.8 unità arbitrarie, n =8) siero non immunizzato
(65.3 ± 6.5 unità arbitrarie, n =8
18
Fig.3
Il trattamento con anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C a ratti BDL diminuisce, in sezioni
di fegato, il numero di colangiociti PCNA- e CK-19- positivi e di dotti -GT positivi.
Quando ratti BDL sono stati trattati simultaneamente con entrambi gli anticorpi anti-VEGF-A
+ C abbiamo ottenuto un maggiore decremento del numero di colangiociti PCNA- and CK-
19-positivi e di dotti biliari GT-positivi,

Treatment
BDL + non-immune
serum
BDL + anty-VEGF-
A antibody
BDL + anty-VEGF-
C antibody
BDL + anty-VEGF-
A+C antibody
PCNA-positive
Cholangiocytes
(n = 5)
39.0 ± 1.9
17.0 ± 1.0
17.0 ± 1.3
6.4 ± 0.9
19
CK-19-positive
Cholangiocytes
(n = 6)
133.8 ± 5.7
82.7 ± 1.0
77.0 ± 3.3
54.5 ± 3.7
Bile Duct
Volum (%)
(n = 11)
7.0 ± 0.6
1.2 ± 0.2
1.9 ± 0.3
0.4 ± 0.06
La somministrazione cronica di anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C ai ratti BDL
inibisce l’aumento di cAMP e d bicarbonato secreto nella bile.
Abbiamo valutato gli effetti della somministrazione cronica di siero non-immunizzato o di
anticorpi anti-VEGF-A o anti-VEGF-C sui livelli di cAMP basali e stimolati da secretina e
sulla quantità di bicarbonato presenti nella bile, due parametri funzionali della proliferazione
dei colangiociti (Alpini G. 2003; 1999) (LeSage G. et al 1996; 2001) (Glaser S. et al 2000;
2003).
o I livelli intracellulari di cAMP di colangiociti isolati da ratti BDL trattati con siero nonimmunizzato
erano simili a quelli di colangiociti da ratti BDL. Come in numerosi studi
precedenti, l’aggiunta di secretina incrementava i livelli di cAMP di colangiociti isolati da
ratti BDL e trattati con siero non-immunizzato (Glaser S, et al 2000; 2003). In accordo con il
concetto che il blocco della secrezione di VEGF da parte dei colangiociti inibisce la
proliferazione di colangiociti BDL, la somministrazione di anticorpi anti-VEGF-A o anti-
VEGF-C faceva diminuire sia la sintesi di cAMP basale che di quella stimolata da secretina
rispetto al cAMP di colangiociti isolati da ratti trattati con siero non-immunizzato (Figura 4).
Fig. 4
Tab. 1

o Il flusso biliare e la concentrazione di bicarbonato della bile di ratti BDI trattati con siero
non-immunizzato erano simili a quelli di ratti BDI non trattati (Tabella 1)). In accordo con
studi precedenti (Alpini G. et al 1988), la secretina incrementava il flusso di bile e la
secrezione di bicarbonato (Tabella 1). La somministrazione di anticorpi anti-VEGF-A o anti-
VEGF-C diminuiva il flusso biliare la concentrazione e la secrezione di bicarbonato (rispetto
ai ratti BDI trattati con siero non-immunizzato) e bloccava l’effetto stimolatorio della
secretina sulla secrezione di bile e di bicarbonato (Tabella 2).
L’inibizione della proliferazione e della secrezione duttale stimolata dalla secretina, dei
colangiociti di ratti BDL (causata dalla somministrazione di anticorpi anti-VEGF-A o
anti-VEGF-C) dipende da una diminuita espressione proteica e secrezione di VEGF
(Meccanismo autocrino).
La concentrazione sierica di VEGF in ratti normali era di 226.12 ± 5.6 ng/ml, n = 4 come
descritto anche da altri autori nel ratto e nell’uomo (Yin R et al 2000) ( Assy N. et al 1999)
Dopo BDL, c’è un incremento della concentrazione di questo fattore: [VEGF] = 291.04 ±
10.04, n = 4 (p < 0.05).
In ratti BDL trattati con anticorpi anti-VEGF A ed anti-VEGF C, in cui si vede una diminuita
induzione della proliferazione dei colangiociti e della secrezione duttale, abbiamo controllato
l’espressione e la secrezione di VEGF ed abbiamo trovato che: la somministrazione di
anticorpi anti-VEGF-A ed anti-VEGF-C ai ratti BDL riduce nei colangiociti l’espressione
delle proteine VEGF-A e VEGF-C; la secrezione di VEGF nel medium da parte di
colangiociti isolati da tali ratti diminuisce rispetto ai colangiociti isolati da ratti BDL trattati
con siero non immunizzato (Figura 5).
20
Tab. 2

21
Fig. 5
La somministratione di r-VEGF-A e r-VEGF-C a ratti normali induce la proliferazione
dei colangiociti che è associata all’attivazione della via IP3/Ca2+/PKC- e la
fosforilazione di Src ed ERK1/2
a) La sommnistrazione cronica di r-VEGF-A o r-VEGF-C a ratti normali induce la
proliferazione dei colangiociti, come dimostrato, in sezioni di fegato, da un aumentato numero
di colangiociti PCNA- e CK-19-positivi e dei dotti -GT-positivi, rispetto a ratti normali
trattati con soluzione salina (tabella 3).
Tab. 3.
b) Nelle colture di colangiociti normali (NRICC), sia il r-VEGF-A che il r-VEGF-C
aumentano la proliferazione cellulare, come dimostrato con l’utilizzo del saggio MTS in cui si
evidenzia un incremento dell’assorbanza cellulare (un indice del numero di cellule) rispetto ai
valori basali (Figura 6).

22
Fig. 6
Anche l’espressione proteica del PCNA aumenta nelle NRICC trattate con r-VEGF-A o r-
VEGF-C (100nM), rispetto alle stesse cellule non trattate e questo incremento in PCNA viene
bloccato da BAPTA/AM, un chelante del calcio (5uM per 2 ore) (Kanno N et al J Hepatol.
2001), da Gö6976 un inibitore di PKC- u per 2 oreMartiny-Baron
G, et al, J Biol Chem
1993) e da PP2 un inibitore di Src u per 2 oreAlvaro
et al Hepatology 2002). (Figura 7)
Fig. 7

c) Parallelamente all’aumento della proliferatione, sia il r-VEGF-A che il r-VEGF-C
determinano una diminuzione della fosforilazione di Src Tyr 530 (resultato non disponibile),
ma un aumento della fosforilazione dei residui Tyr 139 (che regolano positivamente l’attività
di Src) (Stephens LR et al 2001) (Figure 8), cambiamenti che insieme indicano un’ aumentata
attivià di Src.
23
Fig. 8
d) Ancora troviamo che nelle NRICC entrambi r-VEGF-A e r-VEGF-C aumentano la
fosforilazione di ERK1/2 (Figura 9). Nè r-VEGF-A nè r-VEGF-C alterano la fosforilazione di
p38 o JNK.
Fig. 9

e) Nelle NRICC, trattate con r-VEGF-A o r-VEGF-C abbiamo trovato che c’è un aumento di
IP3 (Figura 9) e dei livelli di [Ca2+]i (Tabella 3) rispetto a NRICC trattate con albumina
sierica bovina (BSA) allo 0.2%. Abbiamo inoltre trovato che l’aumento dei livelli di IP3
dovuto al VEGF-A ed al VEGF-C, non era bloccato dal PP2, (inibitore di Src), indicando che
Src interviene a valle degli aumenti di IP3/Ca2+.
24
Tab. 3
Fig. 10
f) Abbiamo inoltre visto che nelle cellule NRICC, sia r-VEGF-A che r-VEGF-C inducono in
vitro la fosforilazione della PKC- Ca2+-dipendente, (Figura 11), che già in altri lavori
abbiamo dimostrato essere coinvolta nella regolazione delle funzioni dei colangiociti (Alpini
G. et al 2002) (Glaser S. et al 2000).

25
Fig. 11
Effetto di HAL e r-VEGF-A su peso corporeo, morfologia epatica, necrosi ed
infiammazione
Nessun cambiamento in peso corporeo è stato osservato tra i gruppi di ratti BDL (161.7 ± 4.0
gm), BDL + HAL (172.3 ± 7.0 gm) e BDL + HAL + r-VEGF-A (165.6 ± 5.6 gm). Non sono
state osservate differenze significative nel grado di infiammazione portale, necrosi, e danno
lobulare tra i ratti BDL ed i ratti che (immediatamente dopo BDL + HAL) sono stati trattati
con BSA allo 0.2% o r-VEGF-A per 1 settimana (Tabella 4).
Trattamento
BDL 1 week
BDL + HAL +
0.2% BSA
1 week
BDL + HAL + r-
VEGF-A
1 week
Infiammazione
+
+/-
+/-
Necrosi
+
+/-
+/-
Danno
lobulare
+
+/-
+
Tab. 4

Effetto di HAL e r-VEGF-A sul plesso peribiliare e sull’espressione del VEGF
Il plesso peribiliare chiaramente visibile nei ratti BDL 1 settimana, mediante la tecnica di
“corrosion cast” e microscopia elettronica (Gaudio E. et al, 1996), non è stato osservato nei
ratti BDL + HAL, risultato plausibile dato che il plesso peribiliare è supportato dall’arteria
epatica. In ratti normali, il PBP è visibile più facilmente nel largo tratto portale. Nel piccolo
tratto portale, il PBP è caratterizzato da uno strato singolo di capillari o anche da un singolo
capillare. Il trattamento con r-VEGF-A nei ratti BDL+HAL previene la scomparsa del PBP.
Il pattern microvascolare osservato dopo somministrazione di r-VEGF-A nei ratti BDL +
HAL evidenzia un PBP con caratteristiche simili a quelle già descritte nei ratti BDL (Gaudio
E. et al, 1996) (Figura 12).
26
Fig. 12
L’ immunoistochimica in sezioni di fegato da ratti BDL mostra che HAL induce un
decremento nel numero di colangiociti VEGF-A-positivi e del numero di recettori VEGFR-2
e VEGFR-3. La diminuzione di VEGF-A e dei recettori VEGFR-2 e –3 osservata nei ratti
BDL + HAL non si osserva se subito dopo BDL + HAL comincia il trattamento con r-VEGF-
A, ma si ottiene una condizione simile a quella di ratti BDL (Tabella 5).

Treatment
BDL 1 week
(n = 6)
BDL + HAL +
0.2% BSA
1 week
(n = 6)
BDL + HAL +
r-VEGF-A
1 week
(n = 6)
VEGF-A
expression
(% positive
cholangiocyte)
78.3 ± 3.9
23.1 ± 2.7*
74.9 ± 2.9 #
VEGFR-1
expression
(% positive
cholangiocytes)
Negative
Negative
Negative
In colangiociti di ratti BDL+HAL, si asiste ad una marcata diminuzione della secrezione del
VEGF rispetto a colangiociti di ratti BDL di 1 settimana. La somministrazione di r-VEGF-A
previene, nei colangiociti, il decremento della secrezione di VEGF indotta da HAL. Negli
epatociti, a differenza dei colangiociti, la secrezione di VEGF non aumenta nei ratti BDL, e
comunque la legatura dell’arteria epatica riduce ulteriormente la secrezione di tale fattore.
Come nei colangiociti, in ratti BDL + HAL + r-VEGF la quantità di VEGF secreta
incrementa. (Figura 13).
27
VEGFR-2
expression
(% positive
cholangiocytes)
46.2 ± 3.2
25.6 ± 1.8*
48.1 ± 3.7
VEGFR-3
expression
(% positive
cholangiocytes)
49.4 ± 2.9
10.5 ± 2.1*
81.6 ± 3.2 #

28
Fig. 13
Apoptosi dei colangiociti
Come altri studi hanno già dimostrato (Marzioni M. et al, 2003), l’analisi TUNEL in sezioni
di fegato di ratti normali e BDL, mostra pochi corpi apoptotici. Quando i ratti sono sottoposti
a BDL + HAL, il numero colangiociti che va incontro ad apoptosi, aumenta (p < 0.05; n = 8)
rispetto a quanto osservato in sezioni di fegato di ratti BDL. HAL non ha nessun effetto
sull’entità dell’ apoptosi di colangiociti di ratti normali (risultati non mostrati). La
somministrazione cronica di r-VEGF-A previene l’incremento dell’apoptosi dei colangiociti
indotto da HAL nei ratti BDL (Figura 14).

Proliferazione dei Colangiociti
29
Fig.14
o In sezioni di fegato di ratti BDL + HAL, in numero di colangiociti PCNA- e CK-19positivi
(p

icarbonato stimolato dalla secretina, che invece risultano simili a quelli osservati in ratti
BDL.
o In accordo con altri studi (Kanno N. et al 2000), la secretina incrementa i livelli di
cAMP intracellulare p

colangiociti e cellule endoteliali, che media i loro cambiamenti adattativi durante il danno
epatico.
La proliferazione del Plesso Peribiliare (PBP) comunque avviene successivamente a quella
dell’epitelio biliare (Gaudio E. et al, 1996) Anche recenti ulteriori approfondimenti da parte
del nostro gruppo, in ratti con legatura del dotto biliare principale da 1 settimana (ratti BDL 1
settimana), hanno messo in evidenza che solo i colangiociti (e rari epatociti) esprimono il
PCNA, mentre le cellule endoteliali sono negative per questo antigene di proliferazione. Dopo
2 settimane di BDL, invece, proliferano sia i colangiociti che le cellule endoteliali mostrando
un’alta positività per il PCNA. Anche l’espressione del fattore VIII (un marker delle cellule
endoteliali) aumenta solo dopo 2 settimane di BDL e non dopo una, confermando che
l’espansione del PBP segue in ordine temporale l’incremento della massa dei dotti biliari.
Premesso ciò, è ragionevole supporre che i colangiociti proliferanti modulano la risposta
adattativa del letto vascolare. Con questo background, abbiamo valutato il ruolo del VEGF nel
modulare la patofisiologia dei colangiociti di ratto dopo BDL.
Abbiamo dimostrato che:
1. il VEGFR-2 ed il VEGFR-3 sono presenti in colangiociti normali, e la loro
espressione aumenta dopo BDL;
2. il VEGF-A ed il VEGF-C sono espressi nei colangiociti normali, e la loro espressione
aumenta dopo BDL; inoltre,
3. nel medium di colture primarie di colangiociti normali abbiamo trovato una discreta
quantità di VEGF, che aumenta significativamente nel medium di colangiociti isolati da ratti
BDL.
A questo punto lo studio è proseguito per comprendere se e come il VEGF fosse implicato
nella regolazione della proliferazione dei colangiociti e successivamente nelle interrelazioni
con il plesso peribiliare, indispensabile per sostenere le richieste metaboliche della massa
biliare proliferante.
Per far questo, abbiamo sottoposto gli animali prima alla legatura del dotto biliare (BDL) per
indurre la proliferazione e subito dopo al trattamento cronico con anticorpi anti-VEGF, per 1
settimana, in particolare con anticorpi anti-VEGF-A ed anti-VEGF-C, che legano il dominio
funzionale del VEGF-A e del VEGF-C. Questo trattamento in vivo ha inibito la proliferazione
dei colangiociti indotta da BDL, e quando gli anticorpi venivano somministrati insieme,
l’effetto inibitorio sulla proliferazione era maggiore. Dato che il VEGF-A ed il VEGF-C
attivano meccanismi del segnale simili, ci si potrebbe aspettare che il VEGF-A sia abile a
compensare in caso di blocco del VEGF-C e viceversa.
In realtà noi riscontriamo che non c’è compensazione tra i due fattori, cioè otteniamo lo stesso
effetto inibitorio sia con il VEGF-A che con il VEGF-C; inoltre quando in ratti BDL i due
anticorpi vengono somministrati insieme, si ottiene un effetto inibitorio maggiore.
Colture primarie di epatociti, mettono in evidenza che anche queste cellule secernono il
VEGF, come dimostrato anche da altri autori (LeCouter J et al 2003) (Taniguchi E et al
2001); questo potrebbe far pensare alla possibilità che la crescita dei colangiociti sia regolata
anche da un meccanismo paracrino ad opera degli epatociti; però, a differenza di ciò che
succede nei colangiociti, la secrezione epatocitaria di VEGF non aumenta dopo BDL e non
cambia dopo somministrazione di anticorpi anti-VEGF, per cui noi proponiamo il VEGF,
secreto dai colangiociti, modula, attraverso un meccanismo autocrino, la proliferazione
dell’albero biliare intraepatico. anche se una via paracrina ad opera degli epatociti e
probabilmente di altre cellule epatiche non può essere esclusa. E’ chiaro che ulteriori studi
andranno fatti per individuare la presenza del VEGF in altri tipi cellulari epatici, per
comprendere quali sono le comunicazioni intercellulari, soprattutto in corso di colangipatie.
Inoltre abbiamo trattato ratti normali con r-VEGF-A o r-VEGF-C per una settimana ed
abbiamo riscontrato che questi fattori di crescita determinano un incremento della
31

proliferazione colangiocitaria. Così per valutare direttamente il ruolo ed il meccanismo di
azione mediante il quale il VEGF modula la proliferazione dei colangiociti abbiamo incubato
le cellule NRICC (colture di colangiociti normali di ratto) (Alpini G. et al 2003) (che, come i
colangiociti isolati di fresco esprimono il VEGFR-2 ed il VEGFR-3) con r-VEGF-A o r-
VEGF-C ed abbiamo dimostrato la capacità del VEGF di indurre in vitro la proliferazione dei
colangiociti. Per quanto riguarda la via di trasduzione del segnale coinvolta, sempre nelle
NRICC abbiamo visto che il VEGF induce un incremento dei livelli di IP3 e di Ca 2+
intracellulari, come pure la fosforilazione di PKC- e di Src.
Svariati studi hanno messo in evidenza che anche nelle cellule endoteliali il VEGF induce
l’attivazione della fosfolipasi C gamma (PLC- ), con conseguente rilascio di diacilglicerolo
ed IP3, aumento del Ca 2+ intracellulare ed attivazione di PKC ((Taniguchi E et al 2001)
(McLaughlin AP, et al 2001); anche in queste cellule gli inibitori di PKC ne diminuiscono la
proliferazione (Spyridopoulos I, et al 2002).
Abbiamo inoltre trovato che nei colangiociti isolati il VEGF induce la fosforilazione di
ERK1/2 (ma non di p38 e JNK). Quest’ultimo risultato suggerisce un ruolo chiave delle
isoforme ERK 1/2 delle MAPK nella regolazione della proliferazione dei colangiociti, in
quanto l’attivazione di queste chinasi avviene anche ad opera di altri fattori che inducono la
proliferazione delle cellule biliari, come ad esempio gli estrogeni e l’ IGF-1 (Alvaro D. et al
2000; 2001).
Abbiamo riscontrato che nelle NRICC, il VEGF incrementa la fosforilazione della tirosina
Tyr 139 di Src, che la regola positivamente (Stephens LR, et al). Src è una proteina adattatrice
legata alle proteine-G accoppiate ai recettori di membrana e la sua attivazione nelle cellule
endoteliali è stata considerata una delle prime fasi dell’attivazione del signaling del VEGF
(Chou MT et al 2002). In generale comunque Src può rappresentare uno dei primi step
dell’attivazione della cascata RAS/RAF/MEK/ERK. I nostri esperimenti indicano che
l’attivazione di Src ad opera del VEGF nei colangiociti, è un evento successivo all’aumento di
IP3 ed alla mobilitazione del Ca2+ , dato che nelle cellule NRICC l’incremento di IP3 e Ca2+
indotto dal VEGF non è influenzato dal PP2, un inibitore specifico di Src.
Questi dati concorrono ad indicare il VEGF come un fattore importante, che, con un
meccanismo autocrino, ha un ruolo chiave nel modulare la risposta proliferativa dei
colangiociti alla colestasi.
Sulla base di questi risultati, è stato molto interessante indagare se e come il
VEGF possa intervenire nella regolazione dei meccanismi che si instaurano a seguito di
interruzzione dell’apporto vascolare arterioso (per esempio ad opera di clamps durante
operazioni chirurgiche, trapianti, o a causa di vere e proprie occlusioni arteriose, etc.), in
corso di colangiopatia.
Abbiamo quindi condotto degli esperimenti su ratti sottoposti a BDL e subito a HAL (Hepatic
Artery Ligation) per una settimana, e ratti sottoposti a BDL + HAL a cui subito veniva
impiantata una minipompa intraperitoneale che continuamente rilasciava dosi costanti di r-
VEGF-A, sempre per una settimana, mettendoli in relazione a ratti con solo BDL.
La legatura dell’arteria epatica blocca tutti gli effetti dovuti alla legatura del dotto biliare
(BDL). Lo studio dimostra infatti che nei ratti BDL, la legatura dell’arteria epatica HAL: (i)
blocca la formazione del plesso peribiliare; (ii) diminuisce l’immunolocalizzazione di
VEGFR-2 e di VEGFR-3 e del VEGF in sezioni di fegato, e la secrezione del VEGF nei
colangiociti. (iii) incrementa l’apoptosi e diminuisce la proliferazione dei colangiociti; (iv)
diminuisce la sintesi di cAMP basale e stimolata da secretina; (v) diminuisce il flusso biliare e
la secrezione di bicarbonato basali e stimolati da secretina.
Tutti gli effetti avversi di HAL sul plesso peribiliare, sull’ espressione e secrezione del VEGF,
e sull’attività proliferativa e secretoria indotta da BDL, sono prevenuti dalla somministrazione
cronica in vivo di r-VEGF.
32

Siccome abbiamo dimostrato che il VEGF non è espresso in condizioni normali, ma
marcatamente espresso e secreto dai colangiociti proliferanti di ratti BDL, (Barbaro B. et al
2002) i risultati ottenuti con la legatura dell’arteria epatica, ci suggeriscono che l’interruzione
dell’apporto di sangue arterioso ai colangiociti BDL, caratterizzata, d’altronde, dal mancato
sviluppo del plesso peribiliare, compromette la sintesi di VEGF, con conseguente blocco della
proliferazione ed aumento dell’apoptosi. D’altra parte, questo è confermato dal fatto che tutti
gli effetti della legatura dell’arteria epatica sui ratti BDL non si verificano quando c’è la
contemporanea somministrazione cronica in vivo di r-VEGF. Inoltre la dose di r-VEGF
somministrata induce dei livelli sierici di VEGF simili a quelli trovati nei ratti BDL, che sono
significativamente più alti di quelli di ratti normali.
La legatura dell’arteria epatica non ha nessun effetto in fegati di ratti normali confermando
altri studi in cui, questo è stato spiegato con la presenza di arterie accessorie o di anastomosi
tra il PBP ed il sistema portale, che, se necessario, intervengono per supplire all’ interruzione
dell’apporto di sangue attraverso l’arteria epatica (Itai Y et al 1997) (Burczynski FJ et al
1996) (Castaing D et al 1980). Evidentemente, quando i dotti biliari intraepatici proliferano
dopo BDL, l’apporto di sangue attraverso l’arteria epatica diventa fondamentale per
sostentare la massa duttale che si sta espandendo. A questo punto, d’altra parte non si può
escludere che la diminuita espressione e secrezione di VEGF in ratti BDL + HAL sia una
conseguenza della diminuita proliferazione dei dotti a causa del diminuito afflusso di sangue.
In ogni caso, comunque, la ridotta sintesi e quindi il minor rilascio di VEGF da parte dei
colangiociti, gioca un ruolo importante nel compromettere la proliferazione e l’aumento della
secrezione duttale indotte da BDL.
CONCLUSIONI
In conclusione, il nostro studio indica che il VEGF, con un meccanismo autocrino, ha un
ruolo chiave nel modulare la risposta proliferativa dei colangiociti alla colestasi. In altre
parole, lo studio ci indica l’attivazione del sistema del VEGF come un meccanismo protettivo
durante il danno epatico sperimentale, suggerendo che la regolazione della sintesi o della
secrezione epatica di VEGF, può rappresentare un’importante potenziale strategia terapeutica
di controllo del bilancio proliferazione/perdita dei colangiociti nel corso di colangiopatie.
Questo studio ha delle notevoli implicazioni cliniche dato che lesioni ischemiche dei dotti
biliari sono considerate possibili cause di disordini colestatici, in particolare dopo trapianto di
fegato, operazioni chirurgiche epatiche e chemioterapia intra-arteriosa (Kirkin V, et al 2001)
(Fort P, et al 1985)
Durante il trapianto di fegato, infatti, i colangiociti sono bersaglio di danni ischemici,
purtroppo non sempre reversibili, associati sia al processo di ischemia-riperfusione, che
proprio a lesioni chirurgiche dell’arteria epatica (Batts KP et al 1998) (Ben-Ari Z et al 2003).
Anche durante le malattie colestatiche croniche, soprattutto nella colangite sclerosante
primaria, lesioni dell’arteria epatica o delle sue diramazioni, sono considerate una delle
principali cause del danno dei dotti biliari e della colestasi correlata (Siegel EG et al 1998).
Questo studio, quindi può servire come background sperimentale per comprendere meglio la
patofisiologia dei colangiociti nelle malattie colestatiche, in relazione al supporto vascolare
arterioso.
Gli effetti benefici del VEGF sono quindi da prendere in considerazione nel management di
queste condizioni patologiche.
La questione è delicata dal momento che il VEGF è uno dei fattori di crescita principali
implicati nell’angiogenesi e, come si evince anche dal nostro studio, un fattore che promuove
intensamente la proliferazione cellulare.
Sono in continua crescita gli studi per poter trovare dei farmaci anti-angiogenetici e
specificatamente anticorpi anti-VEGF o recettori solubili che impediscono il normale legame
del VEGF ai suoi recettori, oppure farmaci anti tirosina chinatici, per contrastare la crescita
33

neoplastica. D’altra parte esistono sempre nuovi metodi per stimolare la produzione di VEGF
o proprio per veicolare questo fattore in tessuti ischemici per stimolarne la
neovascolarizzazione.
Il dilemma è sempre quello di poter trovare un bilanciamento tra proliferazione ed apoptosi.
34

II PARTE
INTRODUZIONE
Più di un secolo fa la ricerca sull’angiogenesi portò all’osservazione che la crescita dei tumori
umani è spesso accompagnata da un aumento della rete vascolare. L’esistenza di fattori
prodotti dal tumore capaci di promuovere la formazione e la crescita di nuovi vasi è un passo
cruciale per la crescita tumorale sostenuta da una rete vascolare che cresce di pari passo col
tumore stesso..
Il ruolo del VEGF e della neogenesi vascolare nella crescita neoplastica é attualmente oggetto
di numerose ricerche ma nulla, riguardo a questo, é conosciuto sul colangiocarcinoma. D’altra
parte l’aver osservato che il VEGF è un fattore che interviene nella proliferazione dei
colangiociti sarà interessante andare ad osservare come esso moduli la crescita del
colangiocarcinoma.
Avendo già cominciato ad osservare l’espressione di recettori per il 17β-estradiolo e per
l’IGF1, ho continuato a studiare la proliferazione del colangiocarcinoma ad opera dell’ l’IGF1
e degli estrogeni (EE), già evidenziati essere dei modulatori positivi della crescita
colangiocitaria, risultati che illustrerò nella seconda parte di questa tesi.
Questo studio getterà ulteriori basi allo studio successivo del ruolo del VEGF, diretto ed in
cooperazione con gli altri fattori di crescita, tra cui IGF1 ed EE, nella modulazione della
crescita della massa tumorale.
COLANGIOCARCINOMA
Il colangiocarcinoma è un adenocarcinoma, che origina dai colangiociti. Esso costituisce
attualmente una sfida sia dal punto di vista diagnostico che terapeutico, rappresentando una
delle neoplasie a prognosi più infausta
Dal punto di vista anatomico il colangiocarcinoma può essere classificato in due forme, intra
ed extraepatica e dal punto di vista morfologico può essere suddiviso in 3 tipi: (I) formante
massa, (II) a crescita periduttale e (III) a crescita intraduttale.(Gores GJ, 2003).
Il colangiocarcinoma è contraddistinto da una condizione di infiammazione cronica,
associata ad una parziale ostruzione del flusso biliare, che, dopo un certo periodo di latenza,
risulta in grado di scatenare il processo carcinogenetico.
Un ruolo chiave nel processo carcinogenetico sarebbe svolto dall’ossido nitrico, l’eccessiva
produzione del quale, determinata dall’induzione, ad opera delle citochine pro-infiammatorie
(TNF-α, IL-6 etc.), dell’ossido nitrico sintetasi inducibile, determinerebbe un danno
ossidativo a carico del DNA dei colangiociti (Park J et al, 1999)
Il colangiocarcinoma è oggi considerato una neoplasia “fatale”, essendo diagnosticato per lo
più tardivamente quando le terapie attualmente disponibili sono applicabili soltanto nella metà
dei pazienti.
Esso si caratterizza per una notevole resistenza ai comuni chemioterapici tanto che non esiste
attualmente alcun trattamento capace di rallentarne la progressione. (Blendis L et al 2004).
Nell’ultima decade sono stati portati a termine numerosi studi volti ad individuare le
alterazioni molecolari ed i geni interessati nella trasformazione neoplastica dei colangiociti e
quindi, successivamente, una terapia rivolta contro specifici targets molecolari.
Le mutazioni del gene K-ras, ad esempio, sono risultate più frequenti nella forma ilare mentre
quelle dell’oncogene BRAF, dell’oncosoppressore DCP4/Smad4 (un importante componente
a valle della cascata del fattore di crescita TGF-β), di p53 e p16 sono prevalenti nelle forme
distali. Inoltre, studi di immunoistochimica hanno mostrato che i recettori ad attività
tirosinchinasica Erb-B2 e Met, l’aspartil(asparaginil)β-idrossilasi, una proteina implicata nella
migrazione cellulare, e la ciclina D1 risultano overespressi nel colangiocarcinoma mentre il
recettore Fas e quelli della β catenina e della caderina E risultano down-regolati, favorendo
35

così l’escape delle cellule tumorali dalla sorveglianza immune e l’adesione a distanza (Gores
GJ, 2003). Nell’ultimo anno un interesse crescente hanno suscitato un gruppo di proteine
altamente glicosilate, denominate mucine, l’espressione immunoistochimica di alcune (MUC1
e MUC4) e sierica di altre (MUC5AC) è stata correlata ad una prognosi peggiore del
colangiocarcinoma, mentre l’espressione di altre, come ad esempio MUC2, ad una prognosi
più favorevole. Sulla base di queste scoperte, sono stati condotti in vivo e in vitro diversi
studi preclinici basati sull’impiego di inibitori di specifici targets molecolari, come ad
esempio il celecoxib,un inibitore selettivo della COX-2, che è stato sperimentato sia su linee
cellulari umane che di ratto, ottenendo una inibizione dose-dipendente della crescita e
un’induzione dell’apoptosi delle cellule di colangiocarcinoma (Gores GJ, 2003).
RUOLO DI ESTROGENI E IGF-1 NELLA PATOLOGIA DEI COLANGIOCITI
I colangiociti costituiscono il bersaglio del danno in un gruppo di malattie colestatiche
croniche (colangiopatie) recentemente classificate come “Sindrome da vanificazione dei dotti
biliari” (Boyer JL et al 1997). Tali malattie, infatti, si caratterizzano per la progressiva
distruzione dei dotti biliari intraepatici evolvente, nelle fasi terminali, verso una grave
condizione duttopenica. La cirrosi biliare primitiva (CBP) e la colangite sclerosante primitiva
(CSP) sono le patologie maggiormente responsabili della sindrome da vanificazione dei dotti
biliari nell’uomo. Il colangiocarcinoma e la formazione delle cisti epatiche in corso di
ADPKD sono altre due manifestazioni patologiche originanti dai colangiociti che mettono in
evidenza quanto sia fondamentale il controllo dei processi proliferativi ed apoptotici a carico
dei colangiociti. La proliferazione dei colangiociti, come meccanismo di riparazione del
danno si verifica in molte, se non in tutte, le condizioni di danno epatico e, secondo il
pensiero emergente, potrebbe influenzare l’anatomia e la fisiopatologia dell’intero fegato, in
quanto i colangiociti proliferanti, producono e secernono diverse citochine, fattori di crescita,
neuropeptidi ed ormoni, attraverso i quali si instaura un cross-talk tra i colangiociti e le altre
cellule parenchimali e mesenchimali epatiche (vedi introduzione I parte). La CBP è la più
frequente delle colangiopatie duttopeniche acquisite ed attualmente è considerata una malattia
a dimorfismo sessuale colpendo specificatamente le donne ed insorgendo prevalentemente nel
periodo peri-post menopausale. Recentemente, inoltre, è emerso che la terapia sostitutiva
estrogenica esercita effetti favorevoli sulla progressione della malattia. La malattia policistica
epatica in corso di ADPKD, al contrario, è fortemente influenzata nella sua insorgenza e
progressione dallo stimolo estrogenico. Da queste evidenze è nato da tempo l’interesse per lo
studio della regolazione da parte degli estrogeni della proliferazione dei dotti biliari.
Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che gli estrogeni svolgono un ruolo importante
nel favorire la proliferazione dei colangiociti. Nei ratti BDL esiste un forte aumento
dell’espressione dei recettori degli estrogeni, inoltre, la proliferazione indotta durante BDL
regredisce marcatamente nei ratti BDL trattati con antagonisti dei recettori per gli estrogeni
(tamoxifen ed Ici) o sottoposti ad ovariectomia (Alvaro D. et al 2000, 2002). Gli estrogeni
agirebbero sia in maniera diretta (genomica), che indiretta (non genomica) con attivazione
delle vie intracellulari (Ras/Raf/Erk) che sono tipiche dei fattori di crescita (Alvaro D. et al
2002). Gli estrogeni potrebbero, quindi, agire sulla proliferazione dei colangiociti potenziando
l’effetto dei fattori di crescita. Tra i vari fattori di crescita l’IGF1 è sicuramente il più
interessante sia perché il fegato ne è la principale sede di produzione, sia perché una serie di
studi condotti su cellule che esprimono recettori degli estrogeni hanno dimostrato l’effetto di
potenziamento tra estrogeni ed IGF-1 sulla modulazione di proliferazione, apoptosi cellulare e
differenziazione tissutale. In aggiunta l’IGF1 è stato recentemente molto studiato nella
patologia neoplastica e i suoi livelli sierici sono strettamente correlati con la rapidità di
crescita di vari tumori come quello della mammella e del pancreas. Alte concentrazioni
sieriche di IGF-1, in aggiunta, sono associate ad aumentato rischio di cancro della mammella,
36

della prostata, del colon-retto, del pancreas e del polmone (Zhou J et al, 2001, Kaaks R et al,
2000, Ma J et al, 1999, Yu H, et al 1999, Lin Y et al 2004).
L’IGF1 agisce tramite specifici recettori (IGF-R) e i suoi effetti sono mediati da proteine di
legame (IGFBP) che possono agire indipendentemente dal legame con IGF-1 (Jones JI 1995).
I recettori per IGF1 hanno struttura eterotetramerica (Ullrich A et al, 1986, Kuiper GG et al
1996) e sono collegati a diverse vie di trasduzione del segnale come ad esempio quella delle
docking proteins IRS e PI3 chinase/Akt e la cascata di Shc, Ras, Raf, Erk attraverso le quali
è in grado di modulare la crescita, la differenziazione, la proliferazione e l’apoptosi delle
cellule (Shelton JG et al, 2004)
In diversi tumori è stato dimostrato come l’azione del IGF1 e del suo recettore, iperespresso
nella cellula neoplastica, risulta sganciata dalla controregolazione da parte di IGFBP così da
costituire un loop che automantiene la proliferazione cellulare neoplastica (Scharf JG et al,
2003). In varie cellule è stata dimostrata un’azione sinergistica tra estrogeni e IGF1 (Stoica A
et al, 2000) e, sebbene nel gene per IGF1 non sia stato mai trovato nessun “responsive
element” agli estrogeni, è noto che gli estrogeni promuovono una induzione dose e tempo
dipendente della risposta cellulare all’IGF1, (Kahlert S et al, 2000) dato questo dimostrato sia
in organi sessuali (Zhou J et al , 2001) che in altri, come ad esempio negli osteoblasti
(Kassem M et al 1998) e nel cervello (Cardona-Gomez GP et al 2001). Abbiamo
recentemente dimostrato che gli estrogeni e l’IGF-1 svolgono un ruolo cruciale nel modulare
la proliferazione dei colangiociti normali. Estrogeni ed IGF1, infatti, stimolano marcatamente
la proliferazione dei colangiociti, ne inibiscono l’apoptosi ed esercitano effetti additivi
(Alvaro D. et al 2005).
SCOPO DELLA RICERCA
Lo scopo generale del presente studio è quello di valutare il ruolo e i meccanismi di
trasduzione del segnale attraverso cui estrogeni ed IGF1 modulano la proliferazione delle
cellule di colangiocarcinoma e di valutare possibili interazioni tra estrogeni ed IGF1. Il fine
ultimo è di verificare se il blocco della funzione estrogenica e/o di IGF1 possa rappresentare
una strategia terapeutica per tale neoplasia.
Scopi specifici
1) indagare l’espressione dei recettori degli estrogeni (ER-α, ER-β) e dell’ IGF-1 (IGF1-R) in
biopsie epatiche di pazienti affetti da colangiocarcinoma intraepatico;
2) valutare l’espressione di ER-α, ER-β, IGF-1R, IGF-1 da parte di cellule appartenenti ad
una linea cellulare (HuH-28) derivante da cellule di colangiocarcinoma umano intraepatico;
3) valutare gli effetti di estrogeni ed IGF1 sulle capacità proliferative della linea HUH-28;
4) valutare le vie di transduzione intracellulare del segnale attraverso cui IGF1 ed estrogeni
modulano la proliferazione e l’apoptosi delle cellule di colangiocarcinoma umano e se c’è una
costituitiva iperattivazione di queste vie nel colangiocarcinoma umano;
5) valutare se IGF1 ed estrogeni svolgono un effetto additivo sulla proliferazione ed apoptosi
di linee cellulari derivate da colangiocarcinoma umano interagendo sinergisticamente a vari
livelli delle vie di transduzione del segnale.
6) valutare se la transfezione di oligonucleotidi antisenso per il recettore di IGF1 è in grado di
rallentare o bloccare la crescita di linee cellulari derivate dal colangiocarcinoma umano .
37

METODOLOGIA SPERIMENTALE
Materiali
I reagenti sono stati acquistati dalla Sigma (St. Louis, Mo) o come altrimenti specificato. I
terreni di coltura e il siero per le colture cellulari sono stati acquistati dalla Gibco-InVitrogen
(Gaithersburg, mD). L’anticorpo bloccante l’IGF-1R, αIR3, è stato acquistato dalla
Oncogene-DBA (DBA Italia, srl, Segrate, Milano, Italia).
Microscopia Ottica e Immunoistochimica del colangiocarcinoma umano
Lo studio è stato effettuato su 18 pazienti ( 9F, età 60-75 e 9M, età 63-73 anni) affetti da
colangiocarcinoma intraepatico presentantesi come unica massa all’interno del fegato. Di
questi, 10/18 erano stati sottoposti a biopsia epatica ecoguidata, mentre i restanti 8 pazienti a
resezione chirurgica (4 pazienti) o trapianto epatico (4 pazienti). Come controlli normali sono
state usate 10 biopsie epatiche di pazienti con istologia normale (5F, età 58-69 e 5M, età 60-
72) sottoposti a laparotomia. I frammenti di fegato (0.5 cm) sono stati fissati in formalina al
10% per 2-4 h ed inclusi in paraffina a bassa temperatura di fusione (55-57°C) dopodichè
sono state ricavate sezioni di 3-4 µm colorate con ematossilina - eosina e con tricromica di
Masson. Per effettuare l’immunoistochimica, le sezioni sono state montate su vetrini ricoperti
con poly-L-lisina allo 0.1%. Dopo la deparaffinizzazione, l’attività perossidasica endogena è
stata bloccata mediante incubazione per 30 min in perossido di idrogeno metanolico (2,5%).
Successivamente è stata bloccata la biotina endogena con un kit apposito (code X0590; Dako,
Copenhagen, Denmark) secondo le indicazioni del fornitore. Le sezioni sono state poi reidradate
in alcool e lavate con PBS ( pH 7.4 ) prima di applicare l’anticorpo primario. Le sezioni sono
state incubate O.N. a 4°C con i seguenti anticorpi: a) anticorpo monoclonale anti-citocheratina
19 (CK-19 ; Dako, Copenhagen, Denmark), PCNA (Dako, PC10); anti-ERalpha (un cocktail di
tre anticorpi monoclonali: SC-314, D-12, F-10, ognuno in proporzione del 33%; diluizione
1:100; Santa Cruz Inc, CA, USA); c)anticorpo monoclonale anti-ER-β (GenTex, San Antonio,
Texas, USA); d) anti-IGF-I (Santa Cruz, Inc., CA, USA; diluito 1:70); e) anti-IGF1-R (Santa
Cruz, Inc., USA; diluito 1:80). Dopo i lavagi iI campioni sono stati poi lavati con PBS ed
incubati per 10 min a temperatura ambiente con anticorpo secondario biotinilato (Dako LSAB
Plus System , HRP, code K0690, Milano, Italia ), e sviluppati con 3-3’ diaminobenzidina
(DAB). Per tutte le immunoreazioni sono stati inclusi controlli negativi e positivi. Lo studio
al microscopio ottico e l’analisi immunoistochimica sono stati condotti con microscopio
ottico Olympus BX-5 1 (Tokyo, Japan) e videocamera Olympus BX-5 LM (Spot Insight,
Diagnostic Instrument, Inc Sterling Heights, MI) e processate con un Sistema di analisi
d’immagine (IAS - Delta Sistemi, Roma- Italia). Sia lo studio al microscopio ottico che quello
immunoistochimico sono stati condotti indipendentemente da tre patologi . L’espressione
immunoistochimica di ER-α e ER-β è stata valutata come precedentemente descritto (Alvaro
d. et al 2004). Brevemente, 6 vetrini sono stati analizzati per ciascun campione di fegato
normale e colangiocarcinoma. I colangiociti neoplastici o normali sono stati conteggiati in
maniera random, in 6 campi non sovrapposti (magnificazione 20X) per ogni vetrino e i dati
espressi come % di cellule positive. L’uso di materiale umano è stato approvato dall’apposito
comitato locale istituzionale.
Linee cellulari neoplastiche
Le cellule Mz-ChA-1 (originanti dalla colecisti) sono state donate dal Dr. J.G. Fitz
(Università del Texas, Southwest Medical Center, Dallas, TX). Le cellule di
colangiocarcinoma HuH-28 (originanti dai dotti biliari intraepatici) (Knuth A et al 1985) e le
cellule TFK-1 (originanti dai dotti biliari extraepatici) (Kusaka Y et al 1988; Saijyo S et al
38

1995) sono state acquistate dalla Cancer Cell Repository, Tohoku University, Japan. Le
cellule Mz-ChA-1, TFK-1 e HuH-28 sono state mantenute in terreno CRML 1066. La linea di
HCC umano Alex (PRF/PLC/5) è stata donata dal Prof. R. Mazzanti (Università di Firenze,
Italia) ed è stata conservata in terreno MEM Eagle. La linea cellulare SW 480 di
coloncarcinoma umano (donata dal Dr. E. Porfiri Università Politecnica di Ancona, Italia) è
stata coltivata in terreno di Leibovitiz L15. La linea cellulare MCF7 (donata dal Prof. Filetti
Policlinico Umberto I Roma) è stata coltivata in terreno RPMI. Ai terreni di coltura veniva
aggiunto siero fetale bovino al 10% ed antibiotici all’1%.
Proliferazione ed apoptosi
Gli studi in vitro sono stati condotti sulla linea cellulare di colangiocarcinoma umano
intraepatico HuH-28. Le cellule sono state mantenute in terreno CMRL contenente il 10% di
siero fetale bovino, oltre che antibiotici. Per valutare l’effetto di 17β-estradiolo o IGF1 sulla
proliferazione e sull’apoptosi, le cellule HuH-28 sono state private di siero per 48h (controlli=
C) e poi trattate nuovamente con siero, 17β-estradiolo, IGF1 e/o antagonisti recettoriali, per
ulteriori 48h. In dettaglio, il terreno delle cellule è stato rimpiazzato con terreno fresco senza o
con siero dove sono stati poi aggiunti gli agenti testati. La proliferazione cellulare è stata
saggiata mediante il kit colorimetrico CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell
Proliferation Assay, MTS Kit, (Promega, Madison, WI), seguendo le istruzioni del fornitore.
L’indice di proliferazione è stato calcolato come rapporto (x 100) tra il numero delle cellule
(MTS assay) sotto condizioni di stimolo e non (Controlli). La proliferazione è stata anche
valutata mediante l’espressione proteica di PCNA (western-blot) o mediante l’incorporazione
di Timidina Triziata nel DNA come precedentemente descritto.
L’apoptosi è stata valutata mediante un kit colorimetrico per la caspasi 3 (Sigma), basato
sull’idrolisi del peptide substrato acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA) ad
opera della caspasi 3 dei campioni da saggiare, risultante nel rilascio di p-nitroanilina (pNA)
colorata. Per questo saggio, le cellule sono state lisate nell’appropriato lysis buffer prodotto
dal fornitore (50mM HEPES, pH 7.4, 5mM CHAPS, 5mM DTT ). La concentrazione di pNA
rilasciata dal substrato è stata ricavata dai valori di assorbanza a 405 nm. L’attività della
caspasi 3 è stata espressa come variazione percentuale rispetto ai controlli.
Analisi Western-Blot
Per l’analisi western-blot, le procedure sono le stesse descritte in parte I, usando i seguenti
anticorpi primari ( Santa Cruz): 1) anti-PCNA: anticorpo monoclonale di topo (1:300); 2)
anti-IGF1: anticorpo policlonale di capra (1:100); 3) anti-IGF1-Rb: anticorpo policlonale di
coniglio (1:400 ); 4) anti-ER-α: anticorpo policlonale di coniglio (1:200); 5) anti-ER-β:
anticorpo policlonale di coniglio (1:200); 6) anti-tERK: anticorpo policlonale di coniglio
(1:1000); 7) anti-pERK: anticorpo monoclonale di topo (1:800); 7) anti-AKT: anticorpo
monoclonale di topo (1:200 ); 8) anti-pAKT: anticorpo policlonale di coniglio (1:300 ).
Come anticorpi secondari sono stati utilizzati: anti-mouse IgG (1:2000 Sigma), anti-rabbit
IgG (1:10.000; Sigma), anti-capra IgG (1:10.000 Sigma), o anti-chicken IgG (1:10.000
Chemicon),tutti coniugati alla per ossidasi. L’intensità delle bande è stata determinata con
scansione videodensometrica (Ultra Violet Products, Cambridge, England ) ed espressa come
unità arbitrarie normalizzate per l’espressione di β-actina ( i.e. proteina testata /β-actina x
100 ).
Analisi RT-PCR di ER nelle linee cellulari
L’RNA totale delle cellule è stato estratto mediante il kit Micro-Fast Track II (Invitrogen, San
Diego, CA) secondo le istruzioni del fornitore. L’RNA totale (1 µg) è stato retrotrascritto
madiante la trascrittasi inversa AMV (Roche diagnostics, Mannheim, Germania). I primers per
ER-α 5’-AAGGAGACTCGCTACTGT-3’(senso) e 5’-TCAAAGATCTCCACCATGCC-3’
39

(antisenso) (Inoue S. et al 1996), sono stati sintetizzati dalla Invitrogen corporation. La
gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stata usata come “housekeeping” gene. La PCR
è stata condotta nelle seguenti condizioni: 30 cicli di 1 min. a 94°C, 1 min. a 57°C e 2 min. a 72
°C.
Transfezione delle cellule HuH-28 con oligonucletidi fosforotioati antisenso per IGF1-R
Oligonucletidi fosfotioati antisenso (S-ODN) per il codone 2-7 della sequenza del
prepropeptide del recettore dell’IGF-I (Muller M. et al, 1998; Ullrich A. et al 1986), senso e
oligonucleotidi di controllo mismatch sono stati acquistati dalla Invitrogen (Invitrogen S.R.L
San Giuliano Milanese, Milano, Italia). Le sequenze utilizzate corrispondono a 5’-TCC TCC
GGA GCC AGA CTT-3’ (antisenso), 5’-AAG TCT GGC TCC GGA GGA-3’ (senso), 5’-
TGA GCC CTC CTC CGT AGA-3’ (mismatch 1) e 5’-CTC TGA GCC AGA CGT CTC-3’
(mismatch 2). Le cellule HuH-28 sono state mantenute in terreno CMRL 1066 addizionato
con penicillina-streptomicina-glutamina 1% + siero fetale bovino 10% (Invitrogen). Secondo
l’apposito protocollo, un giorno prima della transfezione, le cellule HuH-28 sono state
piastrate nel terreno di coltura (10% siero fetale bovino + 0.5% antibiotici) per ottenere il
50% di confluenza al momento della transfezione. Gli oligonucletidi antisenso fosforotioati
sono stati transfettati nelle cellule usando il reagente Oligofectamine (Invitrogen). Le cellule
sono state lavate due volte con terreno privo di siero e successivamente incubate con
soluzione S-ODN-oligofectamine a 37°C in incubatore a CO2 per 4 ore (terreno senza siero).
Poi, un terreno contenente il 30% di siero e l’1% di antibiotici è stato aggiunto alle cellule
senza rimuovere la soluzione per la transfezione (30% siero) e, dopo 2 giorni, è stata
analizzata l’espressione proteica di IGF1-R, ER e PCNA.
Analisi Statistica
I dati sono presentati come media aritmetica ± deviazione standard. L’analisi statistica è stata
effettuata usando il test di Fisher. In tutti i casi, è stata considerata significativa una p< 0.05.
RISULTATI
Immunoistochimica per ER, IGF1 e IGF-R in biopsie di colangiocarcinoma umano
I colangiociti dei dotti biliari intraepatici di fegato umano normale (n = 10 biopsie) sono
risultati tutti negativi allo studio immunoistochimico per ER-α, ER-β, IGF1 e IGF1-R (Fig.
1A, 2A). Al contrario, tutti i 18 colangiocarcinomi umani intraepatici hanno mostrato una
marcata positività sia per ER-α che per ER-β che coinvolge rispettivamente l’81.0 ± 3.5 % e
l’82.5 ± 3.7 % delle cellule, con localizzazione sia a livello citoplasmatico che nucleare (Fig.
1B). Le 18 biopsie di colangiocarcinoma umano hanno mostrato una intensa positività sia per
IGF1 che per IGF1-R coinvolgente il 60.8 ± 2.8 % e il 64.4 ± 3.2 % delle cellule
rispettivamete, con localizzazione prevalentemente a livello del citoplasma (Fig. 2B).
40

ER α ER β
A IGF1 IGF1R
B
A
B
41
Normal
human
liver
CC
human
liver
Fig. 1
Fig. 2
Normal
human
liver
CC
human
liver

Analisi Western-blot per ER, IGF1 e IGF1-R in linee cellulari di colangiocarcinoma
umano
L’analisi mediante Western-blot ha mostrato che ER-α è espresso dalla linea HuH-28
(colangiocarcinoma umano intraepatico) ma non dalla linee TFK-1 (colangiocarcinoma
umano extraepatico) e Mz-ChA-1 (carcinoma umano della colecisti) (n=5) (Fig. 3). Mediante
RT-PCR qualitativa il messaggero per ER-α è stato trovato anche nelle linee TFK-1 and Mz-
ChA-1 (Fig. 4) e, per tale motivo, i dati ottenuti mediante western-blot indicano che queste
due linee cellulari non esprimono la proteina recettoriale ER-α o la esprimono a livelli molto
bassi.. La massa proteica di IGF1 e IGF1-R (Fig. 5) (n=5) è risultatata simile nelle cellule
HuH-28 e TFK-1 senza significative differenze rispetto alle linee cellulari derivate da
carcinoma epatocellulare umano (Alex) o coloncarcinoma umano (SW480) usato come
controllo positivo. Al contrario, la linea MZ-ChA-1 ha mostrato una massa proteica di IGF1 e
IGF1-R significativamente più bassa (p< 0.01, n = 5) rispetto a tutte le altre linee cellulari
studiate.
Mcf7 HuH 28 Tfk Mz-cha-1
- Mcf7 Tfk Mz-ch Huh - Mcf7 Tfk Mz-ch Huh
28 28
42
ER α
70 KD
ER β
55 KD
β−actin
42KD
Fig. 3
ER-a
740 bp
GAPDH
223 bp
Fig. 4

SW480 Alex
(Colon) HCC HuH28 Mz-cha-1 Tfk
43
IGF1
7 KD
IGF1R
90 KD
β-actin
42 KD
Fig. 5
Ruolo di estrogeni, IGF1 e dei loro recettori nella modulazione della crescita delle linee
cellulari
Per valutare il ruolo e i meccanismi di azione attraverso cui estrogeni e IGF1 modulano la
proliferazione cellulare e l’apoptosi è stata utilizzata solo una linea cellulare, la HUH 28,
cellule di colangiocarcinoma intraepatico. A tale scopo, le cellule HuH-28 sono state
deprivate di siero per 48h, manovra questa in grado di determinare una diminuzione della
proliferazione pari al 55.6 ± 8% (n = 10) ed un incremento dell’apoptosi del 45 ± 5% (n = 10).
Le cellule HuH-28 deprivate di siero (controlli) sono state poi esposte, per ulteriori 48h, a
siero, 17β-estradiolo, IGF1 e/o antagonisti recettoriali. Nei controlli, l’assenza di siero per
48+48 h ha determinato una diminuzione pari al 75.4 ± 6 % (n = 10) della proliferazione e un
aumento dell’apoptosi pari al 54 ± 4 % (n = 10) rispetto alle stesse cellule HuH-28 messe in
coltura con terreno contenente siero. Gli effetti della deprivazione di siero sulla proliferazione
sono stati anche studiati mediante l’incorporazione di timidina triziata nel DNA che ha
confermato i risultati ottenuti mediante le altre metodiche descritte (dato non mostrato).
Quando le cellule HuH-28 sono state esposte per 48 h agli antagonisti di ER, tamoxifen (1
µM; n = 10) ed Ici 182,780 (1 µM; n = 10), o all’anticorpo bloccante l’IGF1-R, αIR3 (1
µg/ml; n = 10), nessun effetto significativo sulla proliferazione è stato osservato (Fig. 6). La
riammissione di siero per 48 h ha indotto un marcato aumento della proliferazione (+ 67 ± 7
%, n = 10) che è stato inibito (p< 0.01) in misura dell’80% (n = 10) dai due antagonisti di ER,
tamoxifene ed Ici 182,780, e, in misura maggiore (inibizione del 93%) dall’anticorpo
bloccante IGF1-R , αIR3 (n =10; Fig. 6). Questo dato indica che la proliferazione delle cellule
HuH-28 dipende largamente dall’attivazione di ER e/o IGF1-R.
Il 17β-estradiolo (10 nM) o l’IGF1 (10 ng/ml, 1.3 nM) aggiunti per 48h alle cellule HuH-28
messe in coltura in terreno contenente siero non ha indotto un significativo incremento della
proliferazione (1.2 ± 0.9 %, n =5, e 0.5 ± 0.4 %, n =5, rispettivamente). Al contrario, quando
il 17β-estradiolo (10 nM) o l’IGF1 (10 ng/ml, 1.3 nM) sono stati aggiunti per 48h alle cellule
HuH-28 in terreno senza siero (da 48h), essi hanno indotto un significativo incremento della
proliferazione (p< 0.01, n =10) (35.5 ± 2.3 and 26.1 ± 2.3 % rispettivamente), e quando i due
agenti sono stati aggiunti simultaneamente, un ulteriore incremento (48.5 ± 2.7 %) della
proliferazione è stato osservato, che è risultato significativamente (p< 0.05, n = 10) più alto
rispetto a quello indotto dal 17β-estradiolo o dall’IGF1 da soli (i.e. 17β-estradiolo + IGF1 vs
17β-estradiolo o IGF1 da soli = p

concentrazione minima capace di incrementare significativamente la proliferazione è risultata
pari a 1 nM per il 17β-estradiolo (aumento del 7.5 ± 1.1 %; n = 8) e a 1 ng/ml per IGF1
(incremento dell’ 8.4 ± 0.9 %; n = 8). Alte concentrazioni di 17β-estradiolo (100 nM; n = 5 o
IGF1 (100 ng/ml; n = 5) non hanno indotto ulteriori incrementi della proliferazione rispetto
alle concentrazioni usate nello studio (dati non mostrati). Abbiamo anche osservato che
l’anticorpo bloccante l’IGF1-R, αIR3, inibisce l’effetto stimolatorio sulla proliferazione del
17β-estradiolo approssimativamente del 50% (n =5, p

I risultati della proliferazione sono stati confermati valutando l’espressione proteica del
PCNA (western-blot) (Fig. 8) che è risultata aumentata significativamente (p< 0.01) dopo
trattamento con 17β-estradiolo o IGF1 (; n = 6) e, quando i due agenti sono stati aggiunti
simultaneamente al terreno di coltura, la massa proteica di PCNA è risultata ulteriormente
incrementata (p< 0.05) rispetto al trattamento con 17β-estradiolo o IGF1 aggiunti
separatamente (n = 6). In contrasto, l’apoptosi (saggio per la caspasi-3) è stata inibita dal
17β-estradiolo o da IGF1 (p< 0.01 vs controlli, n = 8) ed un ulteriore effetto inibitorio è stato
osservato quando le cellule HuH-28, deprivate di siero, sono state esposte a 17β-estradiolo +
IGF1 (p< 0.05 vs 17β-estradiolo o IGF1 da soli; n = 8, Fig. 9).
Espressione
prot.X100 (U.A.)
Apoptosi
(caspasi 3 assay)
b-actin
PCNA
pNa
sviluppata
X100
(U.A.)
0
30
60
C 17β Ε IGF1 17β E+
IGF1
C 17β Ε IGF 17β E+
45
IGF1
Fig. 8
Fig. 9

In Fig. 10 sono mostrate le variazioni dell’espressione proteica dei recettori e delle
proteine del signaling indotte dalla riammissione di siero, da IGF1 o da 17β-estradiolo, nelle
cellule HuH-28 tenute in assenza di siero da 48 h. In associazione all’aumentata espressione
proteica di PCNA, l’aggiunta di siero, di IGF1, di 17β-estradiolo o di IGF1+17β-estradiolo
insieme, determina un aumento dell’espressione proteica di IGF1-R e di ER-α, mentre la
massa proteica di ER-β diminuisce, (p< 0.01 vs controlli senza siero, n =8). In associazione
all’aumento del PCNA, il siero, 17β-estradiolo e l’IGF1 hanno indotto, nelle cellule HUH-28
deprivate di siero un aumento dell’espressione proteica delle forme fosforilate di (p)-AKT e
p-ERK1/2 (p< 0.01 vs controlli, n =8,) e quando le cellule sono state trattate con 17βestradiolo+IGF1,
un ulteriore aumento di p-AKT e p-ERK1/2 è stato osservato (17βestradiolo+IGF1
vs 17β-estradiolo o IGF1 da soli = p

ER-α
70 kD
ER-β
55 kD
IGF1-R
90 kD
t-ERK1/2
p-ERK1/2
t-AKT
56kD
p-AKT
56kD
PCNA
36 KD
C siero 17β Ε IGF 17β E+
IGF1
47
Fig. 10

Transfezione delle cellule HuH-28 con oligonucleotidi antisenso per l’IGF1-R
La trasfezione di oligonucleotidi antisenso (S-ODN) per il recettore dell’IGF-I nelle cellule
HUH-28, che ha determinato la marcata riduzine dell’IGF1R, ha portato ad una riduzione di
circa il 90% (p

Effetto di 17β-estradiolo e IGF1 sulla proliferazione delle linee cellulari con differente
espressione di ER e IGF1-R
Le Fig. 12, fig.13 e fig. 14 mostrano l’effetto di 17β-estradiolo e IGF1 sulla proliferazione
delle cellule HuH-28 rispetto alle cellule MCF7, che costituiscono il prototipo di cellule
responsive agli estrogeni, e delle due altre linee cellulari di colangiocarcinoma, TFK-1
(umano extraepatico) e Mz-ChA-1 (umano della colecisti). Quando il 17β-estradiolo (10 nM)
è stato aggiunto al terreno delle cellule deprivate di siero per 48h esso ha indotto, dopo 48h di
esposizione, un incremento simile della proliferazione delle cellule MCF7 (45.2 ± 3.6 %, n
=10) e HuH-28 (37.4 ± 2.7 %; n =10), entrambi significativamente maggiori (p< 0.01)
rispetto a quelli osservati nelle cellule TFK-1 (15.2 ± 1.7 %, n =10) e Mz-ChA-1 (10.4 ± 1.4
%, n =10). Nelle cellule MCF7, l’effetto proliferativo del 17β-estradiolo è risultato associato
a diminuita espressione proteica di ER-α (p< 0.05 vs controlli, (n =8) e ad invariata
espressione di ER-β (Fig. 12). Questo dato è dissimile rispetto a quello ottenuto nelle cellule
HuH-28, dove l’espressione proteica di ER-α risulta aumentata (p< 0.05 vs controlli, n =8)
mentre quella di ER-β diminuita (p

ER α
ER β
β actin
C 17β−E C 17β−E C 17β−E C 17β−E
MCF7 HUH28 TKK MZ-CHA-1
DISCUSSIONE
50
Fig. 14
I risultati principali dello studio dimostrano che: 1) ER-α, ER-β, IGF1 e IGF-R sono espressi
nel colangiocarcinoma umano intraepatico e nella linea cellulare di colangiocarcinoma umano
intraepatico HuH-28; 2) inibitori di ER e di IGF1-R inibiscono marcatamente la crescita delle
cellule della linea HuH-28 indotta dal siero; 3) il 17β-estradiolo e l’IGF-1 stimolano la
proliferazione ed inibiscono l’apoptosi della linea cellulare HuH-28 ed esercitano effetti
additivi; 4) la risposta proliferativa delle cellule HuH-28 stimolate da 17β-estradiolo e da
IGF-1 è risultata simile a quella osservata nella linea MCF7 (cancro della mammella) ma
maggiore rispetto a quella osservata nelle altre due linee cellulari di colangiocarcinoma (TFK-
1 e Mz-ChA-1) che non esprimono ER-α all’analisi western-blot; 5) la proliferazione delle
cellule HuH-28 indotta da 17β-estradiolo e da IGF-1 è associata ad aumentata espressione
proteica di ER-α, p-ERK1/2, p-AKT ma a diminuita espressione proteica di ER-β; 6) la
trasfezione delle cellule HuH-28 con oligonucleotidi antisenso per IGF1-R ne inibisce
marcatamente la proliferazione. Dapprima abbiamo studiato mediante immunoistochimica
l’espressione di ER, IGF1 e IGF1-R in biopsie epatiche di pazienti affetti da
colangiocarcinoma intraepatico presentantesi come singola lesione nel fegato. Mentre i
colangiociti di fegato normale sono risultati negativi per ER-α, ER-β, IGF-1 ed IGF-1R, più
dell’80% delle cellule di colangiocarcinoma ha mostrato marcata positività sia per ER-α che
ER-β in tutti i diciotto pazienti esaminati, con localizzazione sia a livello citoplasmatico che
nucleare, quest’ultima essendo indicativa di recettori attivati. Inoltre, le cellule di
colangiocarcinoma umano intraepatico hanno mostrato una marcata positività per IGF1 e
IGF1-R con localizzazione prevalentemente a livello citoplasmatico. Le biopsie di
colangiocarcinoma sono state ottenute da donne in post-menopausa o maschi, tutti con valori
di bilirubina nella norma. Questo dovrebbe escludere una eventuale influenza dei livelli sierici
di estrogeni (aumentati in corso di colestasi) sull’espressione immunoistochimica di ER. In
aggiunta i colangiocarcinomi esaminati presentavano diversi gradi di differenziazione.
Tuttavia, nonostante le differenze nel sesso, nell’età e nel grado di differenziazione
l’immunoistochimica ha mostrato caratteristiche molto omogenee suggerendo che l’intensa
positività per ER ed IGF1 rappresenta una tipica caratteristica del colangiocarcinoma. In molti
altri tessuti studiati, ER-α è stato sempre associato ad un’azione positiva sulla modulazione
della proliferazione e della crescita cellulare ad opera degli estrogeni (Diel P. et al 2002;

Bardin A. et al 2004). Per ER-β al contrario, non vi sono attualmente evidenze definitive,
anche a causa dell’alta eterogeneità di questo recettore che potrebbe essere costituito da
differenti varianti di splicing (Girault I et al 2004; Mosselman S et al 1996). Recentemente,
una diminuita espressione di ER-β (sia a livello proteico che di mRNA) o un aumentato
rapporto ER-α/ER-β sono stati descritti nei tessuti neoplastici (carcinoma ovarico, mammario,
della prostata e del colon) rispetto ai tessuti normali (Bardin A, Hoffmann P et al 2004). In
tali tessuti la trasformazione e la progressione neoplastica sono stati associati a
sovraespressione di ER-α e a diminuita espressione di ER-β, suggerendo un ruolo opposto dei
due recettori nella regolazione della crescita delle cellule neoplastiche ad opera degli
estrogeni (Lau KM, et al 2000; Bardin A et al 2004). Nel colangiocarcinoma umano
intraepatico, mentre l’espressione immunoistochimica di ER-β è risultata simile rispetto a
condizioni benigne di proliferazione dei colangiociti come la cirrosi biliare primitiva, la
colangite sclerosante e la cirrosi alcolica, l’espressione di ER-α è risultata 4 volte maggiore
(risultato non mostrato), suggerendo un ruolo di tale recettore nella progressione neoplastica.
Tuttavia, ulteriori studi volti ad investigare le isoforme di ER-β preferenzialmente espresse
durante la proliferazione dei colangiociti, sia neoplastica che non, dovrebbero essere svolti.
Successivamente è stata indagata l’espressione di ER, IGF1e IGF1-R in differenti linee
cellulari di colangiocarcinoma ed è emerso che solo la linea derivata dal colangiocarcinoma
umano intraepatico, HuH-28, è risulatata positiva per ER-α e ER-β (western-blot)
analogamente a quanto osservato nelle biopsie di colangiocarcinoma umano intraepatico. Le
cellule HuH-28, inoltre, esprimono anche IGF1 e IGF1-R ad un livello (western-blot) simile
alle linee cellulari derivate da coloncarcinoma o epatocarcinoma, in cui si ritiene che l’IGF1
svolga un ruolo chiave nella modulazione della crescita neoplastica (Kaaks R, et al 2000;
Scharf JG et al 2003). Per tale ragione abbiamo selezionato le cellule HuH-28 per valutare il
ruolo degli estrogeni e dell’IGF1 nella modulazione della crescita cellulare neoplastica.
Abbiamo dimostrato che la proliferazione delle cellule HuH-28 indotta dal siero è
marcatamente inibita da due differenti antagonisti di ER, tamoxifen (Sampson LK et al 1997)
e Ici 182,780 (Diel P et al 1999), così come dall’anticorpo bloccante l’IGF1-R, αIR3
(Surmacz E et al 2003). Questo effetto è specifico sulla proliferazione indotta dal siero, dal
momento che in assenza di siero, gli antagonisti di ER e IGF1-R non hanno mostrato alcun
effetto. Da ciò deriva che gran parte dell’effetto proliferativo del siero è legato all’attivazione
di ER e/o di IGF1-R. Quando le cellule HuH-28 sono state trattate con IGF1 o 17β-estradiolo,
la proliferazione è stata attivata e l’apoptosi (caspasi 3) inibita, e quando i due agenti sono
stati simultaneamente aggiunti, è stato osservato un effetto additivo. Dato interessante emerso
è che l’anticorpo bloccante IGF1-R, αIR3, è risultato in grado di inibire parzialmente l’effetto
del 17β-estradiolo suggerendo così la partecipazione di IGF1 nella stimolazione della crescita
cellulare neoplastica da parte degli estrogeni. Dal momento che la specificità di αIR3 per
l’IGF1 è assoluta i risultati ottenuti indicano una sinergia tra estrogeni e IGF1 nella
modulazione della crescita del colangiocarcinoma, nell’ambito della quale IGF1-R
giocherebbe un ruolo primario. Questo dato è stato ulteriormente confermato dalla
transfezione delle cellule HuH-28 con oligonucleotidi antisenso per IGF1-R, che ha indotto,
in associazione con la diminuita espressione proteica di IGF1-R, una inibizione
dell’espressione del PCNA pari al 90%, indice questo di una marcata inibizione della
proliferazione cellulare.
Quando sono state comparate le linee cellulari a differente espressione di IGF1-R e ER,
è emerso che le due linee cellulari esprimenti ER-α (MCF7 e HuH-28) hanno mostrato una
maggiore risposta proliferativa agli estrogeni rispetto a linee cellulari (Mz-ChA-1, TFK-1)
che sono risultate negative all’analisi western-blot per ER-α e che il tasso di proliferazione
indotto nelle cellule HuH-28 da 17β-estradiolo è risultato simile a quello della linea MCF7,
che dovrebbe essere considerata a tutti gli effetti il prototipo di cellula responsiva agli
estrogeni (40,41). Questo dato ulteriormente supporta il ruolo di ER-α nella modulazione
51

della crescita neoplastica estrogeno-dipendente. Diversi studi hanno mostrato che la
proliferazione delle cellule MCF7 indotta da 17β-estradiolo o da IGF1 è associata ad una
immutata o diminuita espressione proteica di ER-α e ad una immodificata massa proteica di
ER-β (Maggiolini M, et al 2002; del Rio B et al 2004). Questo è l’opposto di quanto
osservato nelle cellule HuH-28 esposte a 17β-estradiolo, in cui l’espressione proteica di ER-α
aumenta mentre quella di ER-β diminuisce. Una ridotta massa proteica di ER-β è stata inoltre
osservata nelle due linee cellulari di colangiocarcinoma che non esprimono ER-α. Queste
differenze potrebbero essere spiegate tenendo conto che sono state descritte diverse isoforme
di ER-β con diversa azione, differente distribuzione tissutale e differente ruolo nella
modulazione della proliferazione cellulare (Herynk MH et al 2004; Inoue S et al 1996; Girault
I. et al 2004). La proliferazione delle cellule HuH-28 indotta dal siero, da IGF1 o da 17βestradiolo
che è risultata associata ad un aumento di IGF1-R ed ER-α e ad una diminuzione
di ER-β, è in accordo con studi condotti su altre neoplasie, in cui è stata osservata una
correlazione inversa tra crescita cellulare ed espressione di ER-β attribuendo a questo
recettore un effetto antiproliferativo (Lau KM et al 2000).
Per quanto concerne l’IGF1, le cellule MCF7 e HuH-28 hanno mostrato una simile risposta
proliferativa a questo fattore, che è risultata maggiore rispetto alle cellule delle linee TFK-1 e
Mz-ChA-1. Mentre la minore risposta all’IGF1 delle cellule Mz-ChA-1 potrebbe essere
correlata alla bassa espressione proteica di IGF1-R (vedi Fig 5), quella delle cellule TFK-1
potrebbe essere correlata all’assenza di ER-α, data l’azione cooperativa dei due recettori
osservata nei nostri esperimenti come pure avevano riportato studi precedenti (Lau KM et al
2000; Kahlert S et al 2000). Esiste attualmente un grande interesse scientifico nell’indagare la
relazione intercorrente fra IGF1, IGF1-R e cancro, anche a fronte delle elevate concentrazioni
sieriche di IGF1 associate con l’aumentato rischio di cancro della mammella, della prostata,
del colonretto, del pancreas e del polmone (Kaaks Ret al 2000; Scharf JG et al 2003; Shi R et
al 2004; Ma J et al 1999; Yu H et al 1999). L’IGF1 influenza grandemente la proliferazione e
la differenziazione cellulare ed è un potente inibitore dell’apoptosi (Jones JI et al 1995).
L’azione dell’IGF1 è predominantemente mediata attraverso il suo recettore, IGF1R, che è
coinvolto in diversi processi oncogenetici ed è overespresso in molte linee cellulari tumorali
ed in alcuni tumori umani, dove sembrerebbe svolgere un ruolo critico nella transformazione,
cancerogenesi e metastatizzazione. Gli estrogeni sembrerebbero agire in diversi punti critici
della cascata di traduzione del segnale attivata dall’IGF1 regolando sia l’espressione di IGF1-
R, IGF1-BP che di proteine segnale cruciali come IRS1, il principale substrato per la
tirosinchinasi dell’IGF1-R (Kahlert S et al 2000). È stato anche osservato che ER-α e IGF1-R,
una volta attivati da agonisti specifici, coprecipitano, e il loro stato di attivazione
(fosforilazione), così come la relativa cascata del segnale risultano potenziati. Infine, i segnali
attivati da estrogeni e da IGF1 possono convergere in differenti vie di trasduzione che
modulano la proliferazione, includenti quella di ERK e di fosfatidilinositolo-3 chinasi/Akt
(Adesanya O et al 1999; Kassem M et al 1998, Martin MB et al 2000). Nelle cellule HuH-28
l’espressione proteica della forma fosforilata di (p)-ERK1/2 e (p)-AKT è risultata aumentata
sotto lo stimolo proliferativo di IGF1 e del 17β-estradiolo ed un ulteriore incremento è stato
ottenuto quando l’IGF1 e il 17β-estradiolo sono stati aggiunti insieme, suggerendo la
convergenza dei due agenti in vie comuni di trasduzione del segnale.
CONCLUSIONI
In conclusione, il presente studio sottolinea il ruolo degli estrogeni e dell’IGF1 nella
regolazione della crescita del colangiocarcinoma umano e suggerisce che la modulazione di
ER e IGF1-R potrebbe rappresentare una futura strategia terapeutica per il management di
questo tumore.
52

PROSPETTIVE FUTURE
Nell’ambito di un progetto di ricerca più generale in cui indagare se esistono interazioni tra
VEGF-IGF1-ESTROGENI nella modulazione della proliferazione dei dotti biliari, sarà
interessante indagare la modulazione della crescita del colangiocarcinoma, mettendo in
evidenza se, e qualora esistesse, quale sia la sinergia di azione di tali fattori.
Recentemente abbiamo dimostrato l’espressione del VEGF A e del VEGF C e dei loro
recettori nella linea di colangiocarcinoma intraepatico umano HUH 28.
Sono in corso esperimenti per valutare se:
o il 17β-estradiolo e l’IGF-1 possano stimolare la secrezione del VEGF nella linea
cellulare HuH-28;
o inibitori di ER e di IGF-R inibiscano l’espressione del VEGF e dei suoi recettori.
o Inibitori del VEGF possano inibire la proliferazione indotta da 17β-estradiolo e l’IGF-
1.
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PUBBLICAZIONI EFFETTUATE
NEI TRE ANNI DI DOTTORATO DI RICERCA
anni 2002-2005
1. VEGF STIMULATES CHOLANGIOCYTE PROLIFERATION THROUGH AN
AUTOCRINE MECHANISM BY CA2+-DEPENDENT PHOSPHORYLATION OF
THE SRC/ERK1/2 PATHWAY
Eugenio Gaudio,# , Barbara Barbaro # , Domenico Alvaro, Shannon Glaser, , Heather
Francis,., Yoshiyuki Ueno, Ph., Cynthia J. Meininger, Antonio Franchitto, Paolo Onori,
Marco Marzioni, Silvia Taffetani, Giammarco Fava, George Stoica, Julie Venter, Ramona
Reichenbach, Ryun Summers, Gianfranco Alpini.
# : Dr. Gaudio And Dr. Barbaro B. equally contributed to this study.
“GASTROENTEROLOGY” in press.
2. HEPATIC ARTERY LIGATION causes bile duct loss in BILE DUCT LIGATED
RATS by vegf-dependent mechanisms
Eugenio Gaudio, Barbara Barbaro # , Domenico Alvaro, Shannon Glaser, Heather Francis,
Antonio Franchitto, Paolo Onori, Yoshiyuki Ueno, Marco Marzioni, Giammarco Fava, Julie
Venter, Ramona Reichenbach, Gianfranco Alpini,
# : Dr. Gaudio And Dr. Barbaro equally contributed to this study.
“AMERICAN JOURNAL OF PHISIOLOGY” in press.
3. ESTROGENS AND INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 MODULATE
NEOPLASTIC CELL GROWTH IN HUMAN CHOLANGIOCARCINOMA.
Domenico Alvaro, Barbara Barbaro # , Antonio Franchitto, Paolo Onori, Shannon S. Glaser,
Gianfranco Alpini, Heather Francis, Luca Marucci, Paola Sterpetti, Veronica Drudi-Metalli,
Stefano Ginanni Corradini, Andrea Onetti Muda, Adolfo F. Attili, Antonio Benedetti, and
Eugenio Gaudio.
63

# : Dr. Alvaro and Dr. Barbaro equally contributed to this study.
Submitted to “American Journal of Pathology”
4. Alvaro D, Metalli VD, Alpini G, Onori P, Franchitto A, Barbaro B, Glaser
SS, Francis H, Cantafora A, Blotta I, Attili AF, Gaudio E.
The intrahepatic biliary epithelium is a target of the growth hormone/insulin like growth
factor 1 axis.
J Hepatol. 2005 Nov;43(5):875-83. Epub 2005 May 31
5. Capitolo 18°: “Nerve regulation of cholangiocyte functions”
BARBARA BARBARO ET AL
IN LIBRO: “ The pathophysiology of Biliary Epithelia.”
Edited by: Alpini G, Alvaro D, Marzioni M, LeSage G and LaRusso N.
Eurekah.com , 2004
6. LeSage GD, Alvaro D, Glaser S, Francis H, Marucci L, Roskams T, Phinizy JL,
Marzioni M, Benedetti A, Taffetani S, Barbaro B, Fava G, Ueno Y, Alpini G.
α-1 adrenergic receptor agonists modulate ductal secretion of bdl rats via ca(2+)- and
pkc-dependent stimulation of cAMP.
HEPATOLOGY. 2004 NOV;40(5):1116-27.
7. Gigliozzi A, Alpini G, Baroni GS, Marucci L, Metalli VD, Glaser SS, Francis H, Mancino
MG, Ueno Y, Barbaro B, Benedetti A, Attili AF, Alvaro D.
Nerve growth factor modulates the proliferative capacity of the intrahepatic biliary
epithelium in experimental cholestasis.
Gastroenterology. 2004 Oct;127(4):1198-209.
8. Baiocchi L, Alpini G, Glaser S, Angelico M, Alvaro D, Francis H, Marzioni M,
Phinizy JL, Barbaro B, LeSage G.
Taurohyodeoxycholate- and tauroursodeoxycholate-induced hypercholeresis is augmented in
bile duct
J HEPATOL. 2003 FEB;38(2):136-47.
ligated rats.
9. Glaser S, Alvaro D, Roskams T, Phinizy JL, Stoica G, Francis H, Ueno Y, Barbaro B,
Marzioni M, Mauldin J, Rashid S, Mancino MG, LeSage G, Alpini G.
Dopaminergic inhibition of secretin-stimulated choleresis by increased PKC-gamma expression and
decrease of PKA activity.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003 Apr;284(4):G683-94.
10. Alpini G, Glaser S, Alvaro D, Ueno Y, Marzioni M, Francis H, Baiocchi L, Stati T,
Barbaro B, Phinizy JL, Mauldin J, Lesage G.
Bile acid depletion and repletion regulate cholangiocyte growth and secretion by a
phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway in rats.
Gastroenterology. 2002 Oct;123(4):1226-37
64

ABSTRACT E PRESENTAZIONI A CONGRESSI INTERNAZIONALI
Barbaro B, Glaser S, Gaudio E, et al. Novel evidence for an autocrine role of VEGF in
the regulation of cholangiocyte proliferation. Gastroenterology 2002; 122:A121.
ORAL PRESENTATION AT THE 53RD ANNUAL MEETING OF THE AASLD
BOSTON, 2002
Barbaro Barbara ET AL
Neutralization of vascular endothelial growth factor c (vegf-c) by chronic administration
of anti-vegf-c antibody inhibits cholangiocyte proliferation and secretin-stimulated ductal
secretion of bile duct ligated (bdl) rats.
ORAL PRESENTATION AT THE ANNUAL MEETING OF AISF:
Insulin like growth factor 1 (igf-1) and estrogens modulate neoplastic cell growth in human
cholangiocarcinoma.
Barbaro B.. et al Feb. 2004
ORAL COMUNICATION AT THE AASLD ANNUAL MEETING IN SAN
FRANCISCO 2005:
Estrogens and igf1 promote the proliferation of hepatic cyst epithelium in in autosomal
dominant polycystic kidney disease (adpkd)
Domenico Alvaro, Paolo Onori, aLESSIA TORRICE, V.CARDINALE, Barbara barbaro,
Gianfranco Alpini, , Antonio Franchitto, G. BATTISTI, DOUGLAS M. Jefferson, Mario
strazzabosco, Adolfo Francesco Attili and Eugenio Gaudio
Poster AASLD ANNUAL MEETING IN SAN FRANCISCO, 2005:
Bile Salts Regulate Proliferation and Apoptosis of Liver Cells by Modulating the IGF1
System and Estrogen Receptors
Veronica DRUDI METALLI*, Barbara BARBARO* Maria Grazia MANCINO*, Vincenzo
CARDINALE* Alessandra MANCINO*, Alessia TORRICE*, Adolfo F. ATTILI* and
Domenico ALVARO°*.
54rd Annual Meeting of the AASLD Boston, 2003
Insulin Like Growth Factor 1 (Igf-1) And Estrogens Cooperate In Modulating The
Proliferation Of Rat Cholangiocytes By Acting At Both Receptor And Post-Receptor Levels.
Domenico Alvaro, Veronica Drudi-Metalli, Barbara Barbaro, Antonio Augello, Vincenzo
Cardinale, Roberto Tari, Maria Grazia Mancino, Adolfo Francesco Attili,, Shannon Glaser, Jo
Lynne Phinizy, Silvia Taffetani, Heather Francis, Gianfranco Alpini.
65