d-ROMs Test E Stress Ossidativo
d-ROMs Test E Stress Ossidativo
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Eugenio Luigi Iorio<br />
Prima Edizione – 2003<br />
d-<strong>ROMs</strong><br />
<strong>Test</strong><br />
E<br />
<strong>Stress</strong><br />
<strong>Ossidativo</strong><br />
DIACRON International
La struttura molecolare riportata in copertina è la formula chimica tridimensionale rielaborata al computer della N,N -<br />
dietilparafenilendiammina, il substrato cromogeno del d-<strong>ROMs</strong> test (brevetto DIACRON International s. a. s., Grosseto, Italia
3<br />
Prefazione<br />
Lo stress ossidativo costituisce un capitolo relativamente recente della biochimica che, probabilmente<br />
per il suo carattere di “trasversalità” o “interdisciplinarietà”, non ha ancora trovato una sua adeguata e<br />
soddisfacente collocazione in medicina.<br />
E’ noto, infatti, che un’accentuazione dei processi ossidativi, di cui è spesso espressione un’aumentata<br />
produzione di radicali liberi, può accelerare il fisiologico processo dell’invecchiamento e risulta associata ad<br />
almeno 50 patologie, dall’ictus cerebrale all’infarto del miocardio, dal diabete mellito all’obesità, dal morbo di<br />
Parkinson alla malattia di Alzheimer, dal morbo di Crohn all’artrite reumatoide, dall’AIDS al cancro, e così<br />
via.<br />
Tuttavia, al contrario di queste condizioni morbose, abbastanza ben definite sotto il profilo nosografico,<br />
lo stress ossidativo non esibisce una propria sintomatologia, non dà luogo ad un vero e proprio quadro<br />
clinico e, pertanto, al medico che non ne sospetta l’esistenza, non fornisce elementi tali da suggerire un<br />
adeguato approfondimento diagnostico, laddove l’esecuzione di alcune semplici indagini di laboratorio<br />
consentirebbe un immediato inquadramento del problema, evitando al paziente una serie di conseguenze<br />
tali da comprometterne la durata e/o la qualità della vita già nel breve o medio termine.<br />
A rendere più complesso questo quadro – già di per sé poco confortante – c’è da aggiungere che se il<br />
medico, per una serie di ragioni, non sempre è adeguatamente “informato” sull’argomento, l’analista di<br />
laboratorio non è generalmente “attrezzato” per l’esecuzione di test miranti alla valutazione dello stress<br />
ossidativo.<br />
E intanto – paradossalmente – terapisti, farmacisti, allenatori sportivi e persino estetisti continuano a<br />
prescrivere e/o suggerire al soggetto potenzialmente a rischio di stress ossidativo l’assunzione di integratori<br />
ad attività antiossidante. E non importa se quest’ultima sia reale o presunta.<br />
Infatti, secondo una prassi ormai consolidata, non è abitualmente prevista l’esecuzione preliminare di<br />
test di laboratorio, pur disponibili per la routine clinica, per dimostrare – tramite l’identificazione e la<br />
quantificazione nei fluidi extracellulari e/o nei tessuti di adeguati marker biochimici – la necessità oggettiva di<br />
tali formulazioni.<br />
In altri termini, mentre è ormai acquisito che un farmaco ipocolesterolemizzante va assunto solo dopo<br />
che un test abbia documentato inequivocabilmente una condizione di ipercolesterolemia, è diffusa la<br />
tendenza all’uso di antiossidanti anche quando non è necessario, proprio perché non è ancora diventata<br />
buona prassi eseguire preliminarmente una valutazione di laboratorio dello stress ossidativo.<br />
Lo scopo del presente lavoro è quello di fornire una serie di evidenze scientifiche – ormai consolidate<br />
dalla letteratura biomedica – a sostegno del concetto che solo un’adeguata valutazione di laboratorio può<br />
consentire l’identificazione e la definizione circostanziata di una condizione di stress ossidativo e rendere<br />
possibile, quando indicato, il monitoraggio di un’eventuale terapia antiossidante.<br />
Il presente lavoro vuol essere un aiuto per il clinico ed i terapisti in genere, compresi i farmacisti ed i<br />
biologi. Esso non ripropone come un testo esaustivo nel campo della medicina di laboratorio dello stress<br />
ossidativo ma intende fornire semplicemente una breve panoramica riguardo ai più recenti progressi nella<br />
valutazione del bilancio ossidativo. Il più interessante test qui discusso appare essere il d-<strong>ROMs</strong> test, che<br />
consente la valutazione del livello sierico degli idroperossidi, marker ed amplificatori del danno ossidativo<br />
tissutale. Finora sono stati pubblicati circa un centinaio di lavori, quasi a sottolineare la sua importanza nella<br />
pratica clinica. A questo riguardo si ringraziano per l’aiuto tutti gli Autori degli studi clinici e sperimentali<br />
riportati in questo volume e, in particolare, Mauro Carratelli, l’ “inventore” del d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Grosseto, 6 marzo 2003 Dr Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD<br />
Science Manager Diacron International
Prefazione<br />
Indice<br />
4<br />
Indice<br />
Pag. 3<br />
Capitolo 1 Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno pag. 5<br />
1. 1 Generalità e definizioni pag. 5<br />
1. 2 Meccanismi di produzione delle specie reattive nei viventi pag. 7<br />
1. 3 Metabolismo delle più importanti specie reattive di interesse biologico pag. 11<br />
1. 4 Il sistema di difesa antiossidante<br />
pag. 12<br />
Capitolo 2 Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici. pag. 14<br />
2. 1 Generalità e definizioni pag. 14<br />
2. 2 Basi biochimiche pag. 14<br />
2. 3 Eziopatogenesi pag. 17<br />
2. 4 <strong>Stress</strong> ossidativo e invecchiamento pag. 19<br />
2. 5 <strong>Stress</strong> ossidativo e malattie<br />
pag. 20<br />
Capitolo 3 Il ruolo del laboratorio nella valutazione dello stress ossidativo. Una overview.<br />
pag. 23<br />
Capitolo 4 I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante pag. 25<br />
4. 1 Il d−<strong>ROMs</strong> test pag. 25<br />
4. 2 Gli altri test<br />
pag. 38<br />
Capitolo 5 I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante pag. 40<br />
5. 1 L’OXY−Adsorbent test pag. 40<br />
5. 2 Il BAP test pag. 43<br />
5. 3 L’-SHp test<br />
pag. 44<br />
Capitolo 6 La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo pag. 47<br />
6. 1 Il sistema FREE pag. 47<br />
6. 2 Il sistema FRAS<br />
pag. 48<br />
Capitolo 7 Considerazioni conclusive e linee-guida pag. 50<br />
Capitolo 8 Selezione bibliografica pag. 53<br />
8. 1 Bibliografia generale per autore pag. 53<br />
8. 2 Bibliografia per aree di interesse medico pag. 59
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
Capitolo 1<br />
Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
1. 1 Generalità e definizioni<br />
I radicali liberi o, più semplicemente, radicali,<br />
sono atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno<br />
degli orbitali esterni delle specie che li<br />
costituiscono uno o più elettroni spaiati,<br />
indipendentemente dalla carica elettrica espressa;<br />
per esempio, il radicale della N,Ndietilparafenilendiammina,<br />
il substrato cromogeno<br />
del d-<strong>ROMs</strong> test (vedi in seguito), è un classico<br />
esempio di radicale catione, cioè carico<br />
positivamente (figura 1. 1).<br />
Ne<br />
Un atomo di Ne<br />
Solo elettroni appaiati<br />
Un atomo di O<br />
Due elettroni spaiati<br />
Atomo (stabile)<br />
Radicali liberi dell’ossigeno (instabili)<br />
CH CH3-CH2 3-CH2 3-CH2 3-CH2 3-CH2<br />
N<br />
+<br />
O<br />
Figura 1. 1 Atomi e radicali<br />
Il radicale idrossile (*OH)<br />
Un elettrone spaiato<br />
In funzione della distribuzione della carica<br />
(nube elettronica) e/o del proprio potenziale di<br />
ossido-riduzione, i radicali liberi presentano una<br />
reattività più o meno spiccata, legata alla tendenza<br />
spontanea ad esistere come entità aventi tutti gli<br />
elettroni disposti in coppie, condizione che<br />
corrisponde alla stabilità o inerzia chimica. Ne<br />
deriva che non tutti i radicali sono ugualmente<br />
reattivi. In genere, quanto più è elevato il rapporto<br />
fra carica e volume, tanto più un radicale libero è<br />
reattivo e, pertanto, tenderà a raggiungere la<br />
propria stabilità strappando elettroni a qualsiasi<br />
specie chimica con la quale viene a contatto,<br />
ossidandola (compatibilmente con il suo potenziale<br />
di ossido-riduzione) (figura 1. 2).<br />
A<br />
Radicale libero<br />
(ossidante)<br />
Figura 1. 2 I radicali liberi agiscono come ossidanti<br />
In tal senso, il radicale ossidrile (HO*) è uno<br />
dei radicali liberi più instabili e, quindi, reattivi ed<br />
NH 2<br />
O<br />
CH 3-CH2<br />
Il radicale catione della N,N-dietilparafenilendiammina<br />
(il substrato cromogeno del d-<strong>ROMs</strong> test)<br />
Un esempio di radicale relativamente stabile<br />
+<br />
+<br />
C C A C C<br />
Molecola bersaglio<br />
(es. doppio legame C -C)<br />
ossidazione<br />
Nuova molecola<br />
(ridotta, stabile)<br />
H<br />
Elettrone spaiato<br />
Nuovo radicale<br />
(ossidato, instabile)<br />
5<br />
ossidanti. Infatti, la durata stimata della sua<br />
esistenza è dell’ordine dei nanosecondi.<br />
Viceversa, il trifenilmetile [(C6H5)3–C*] è un<br />
radicale che, in opportune condizioni, può essere<br />
persino isolato in soluzione, proprio per la sua<br />
relativa stabilità o inerzia chimica. Lo stesso<br />
radicale catione della N,Ndietilparafenilendiammina,<br />
appena citato,<br />
costituisce un esempio di radicale relativamente<br />
stabile (figura 1. 1).<br />
I radicali liberi vengono classificati sulla base<br />
della natura dell’atomo al quale appartiene<br />
l’orbitale con l’elettrone spaiato. Esistono, quindi,<br />
radicali liberi centrati sull’ossigeno, sul carbonio,<br />
sull’azoto, o sul cloro, solo per citare quelli di più<br />
immediato interesse in patologia umana.<br />
Nella presente trattazione, tuttavia, si farà<br />
riferimento prevalentemente ai radicali liberi<br />
centrati sull’ossigeno, noti più semplicemente come<br />
radicali liberi dell’ossigeno.<br />
Quest’ultimo, infatti, oltre ad essere uno degli<br />
elementi quantitativamente più importanti della<br />
materia vivente, nonché la fonte primaria della vita<br />
stessa, attraverso una serie di meccanismi – non<br />
ultimo la stessa respirazione cellulare – induce<br />
continuamente la formazione di specie chimiche<br />
con caratteristiche di reattività.<br />
A tal riguardo, occorre sottolineare che i<br />
radicali liberi dell’ossigeno rientrano nella più<br />
grande famiglia delle specie reattive dell’ossigeno<br />
(reactive oxygen species, ROS).<br />
Con questo termine si intende una classe di<br />
specie chimiche reattive derivate dall’ossigeno, di<br />
natura non necessariamente radicalica, tutte<br />
accomunate dalla tendenza più o meno spiccata ad<br />
ossidare vari substrati organici (carboidrati, lipidi,<br />
amminoacidi, proteine, nucleotidi, ecc.).<br />
Classici esempi di ROS di natura radicalica<br />
sono l’ossigeno singoletto e il radicale idrossile.<br />
L’ozono ed il perossido di idrogeno, invece, sono<br />
specie reattive non radicaliche dell’ossigeno.<br />
I radicali liberi, comunque centrati, possono<br />
essere generati attraverso diversi meccanismi e,<br />
una volta formati, danno luogo generalmente ad<br />
una serie di reazioni a catena, nel corso delle quali<br />
il sito radicalico può essere trasferito o,<br />
eventualmente, inattivato.<br />
Si distinguono, pertanto, tre step nelle reazioni<br />
radicaliche a catena: inizio, propagazione e termine<br />
(figura 1. 3).
Figura 1. 3 Schema delle reazioni radicaliche a catena<br />
I principali meccanismi attraverso cui si<br />
generano i radicali liberi – step 1, reazione di inizio<br />
– sono la scissione omolitica e l’interazione con i<br />
metalli di transizione.<br />
Con il termine di scissione omolitica si intende<br />
la divisione di una molecola a livello di uno dei suoi<br />
legami covalenti per effetto della somministrazione<br />
di energia (termica, pirolisi, o radiante, radiolisi)<br />
con generazione di due nuove specie<br />
chimiche, ciascuna con un elettrone spaiato,<br />
elemento distintivo dei radicali liberi (figura 1. 4,<br />
A).<br />
A<br />
B<br />
Inizio<br />
Propagazione<br />
Termine<br />
A B<br />
Molecola<br />
H<br />
Cl<br />
Molecola<br />
Fotolisi/<br />
pirolisi<br />
A : B<br />
+hν<br />
A• A + •B • A + •B • A + •B • A + •B • A + •B • + •B<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
R• R• R• R• R• R : H<br />
A : H<br />
Combinazione<br />
A• A + •B • + •B<br />
A : B<br />
Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe 2+<br />
Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe 2+<br />
Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe 2+<br />
Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe 2+ Fe 2+<br />
Energia<br />
Acqua<br />
AO • + OB -<br />
Fe 3+<br />
AO • + OB -<br />
Fe 3+<br />
AO • + OB -<br />
Fe 3+<br />
AO • + OB -<br />
AO • + OB -<br />
Fe 3+ Fe 3+<br />
Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• CH 2 =CH–<br />
R–CH 2 –CH* –<br />
Radicale libero 1<br />
Figura 1. 4 Scissione omolitica (A) e ionizzazione (B)<br />
E’ bene sottolineare che la scissione omolitica<br />
è ben diversa dalla ionizzazione che si osserva,<br />
per esempio, dopo aver disciolto in acqua molecole<br />
aventi almeno un legame covalente polarizzato (es.<br />
HCl). In questo caso, le molecole d’acqua, a causa<br />
della loro polarità e, dunque, senza alcuna<br />
somministrazione di energia, riescono a spezzare<br />
uno dei legami covalenti polarizzati della molecola<br />
di soluto generando due specie chimiche caricate<br />
di segno opposto, un catione ed un anione (H + e<br />
Cl - , rispettivamente, nell’esempio considerato)<br />
(figura 1. 4, B).<br />
E’ evidente che nella ionizzazione, al contrario<br />
della scissione omolitica, il doppietto elettronico di<br />
legame della molecola originaria non viene<br />
separato ma resta come tale in una delle “neonate”<br />
specie ioniche (l’anione).<br />
Un classico esempio di scissione omolitica è la<br />
radiolisi o fotolisi dell’acqua che genera un atomo<br />
di idrogeno ed un radicale idrossile (vedi più<br />
avanti).<br />
Oltre che per scissione omolitica, i radicali liberi<br />
possono essere prodotti in seguito all’interazione di<br />
+<br />
A B<br />
H<br />
Catione<br />
Scissione<br />
di perossidi<br />
RO : OR<br />
+hν<br />
RO• RO + •OR • RO + •OR • RO + •OR • RO + •OR • + •OR<br />
Frammentazione<br />
R:C – C*=<br />
= C = C =<br />
R • R • R • R • R •<br />
– C =<br />
– C =<br />
Disproporzione<br />
– C<br />
– C –<br />
• – – C<br />
– C –<br />
• – C –<br />
+<br />
– C –<br />
• – – C<br />
– C –<br />
• –<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
Scissione di<br />
azocomposti<br />
RN : : NR<br />
R• R + •R • R + •R • R + •R • R + •R • + •R<br />
Radicale libero 2<br />
Cl<br />
Anione<br />
– N 2<br />
Ri-arrangiamento<br />
R:C – C*=<br />
=C* – C:R<br />
– C –<br />
– C –<br />
-<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
6<br />
particolari molecole con alcuni metalli di transizione<br />
(figura 1. 5).<br />
A<br />
B<br />
Molecola<br />
A<br />
B<br />
Molecola<br />
Men+1 Men+1 Men Men Men Men+1 Men Men+1 Radicale libero<br />
Figura 1. 5 Interazione con metalli di transizione<br />
Nell’interazione con i metalli di transizione,<br />
l’elettone generato dall’ossidazione di un metallo di<br />
transizione in forma ionica (es. da Fe 2+ a Fe 3+ o da<br />
Cu + to Cu 2+ ) spezza un legame covalente di una<br />
molecola bersaglio, generando così un radicale<br />
libero e un anione.<br />
Alternativamente, l’elettrone richiesto per<br />
ridurre un metallo di transizione in forma ionica (es.<br />
da Fe 3+ a Fe 2+ o da Cu 2+ to Cu + ) viene estratto dal<br />
legame covalente di una molecola bersaglio, che si<br />
decompone in un radicale libero ed un catione.<br />
Attraverso questo meccanismo, per esempio,<br />
il ferro (Fe 2+ /Fe 3+ ) o il rame (Cu + /Cu 2+ ) agiscono da<br />
catalizzatori in una sequenza di reazioni di ossidoriduzione<br />
generando radicali alcossilici (RO*) e<br />
perossilici (R–O–O*) a partire dai perossidi<br />
(R–O–O–R).<br />
Nel caso più semplice – descritto per la prima<br />
volta da Fenton – uno ione ferroso (Fe 2+ ),<br />
ossidandosi a ione ferrico (Fe 3+ ), cede il suo<br />
elettrone ad una molecola di perossido di idrogeno<br />
(H2O2) e ne scinde uno dei legami covalenti,<br />
generando un radicale libero (il radicale idrossile,<br />
HO*) ed un anione (ione ossidrile).<br />
A sua volta, lo ione ferrico (Fe 3+ ) si riduce –<br />
rigenerandosi come qualsiasi catalizzatore – a<br />
ione ferroso (Fe 2+ ), strappando un elettrone da una<br />
seconda molecola di perossido di idrogeno, che è<br />
scissa in un radicale libero (un radicale peridrossile<br />
(HOO*), e un catione (uno ione idrogeno, H + )<br />
(figura 1. 6).<br />
H-O-O-H<br />
Perossido di<br />
idrogeno<br />
H-O-O*<br />
Radicale<br />
peridrossile<br />
Fe2+ Fe2+ Fe2+ H + H + H +<br />
Figura 1. 6 Decomposizione del perossido di idrogeno<br />
Allo stesso modo, anche gli idroperossidi sono<br />
scissi, per azione catalitica del ferro, in radicali<br />
alcossilici (RO*) e perossilici (ROO*) (figura 1. 7).<br />
A<br />
Radicale libero<br />
Fe3+ Fe3+ Fe3+ +<br />
+<br />
B<br />
Anione<br />
A B<br />
OH- OH- OH- H-O*<br />
Radicale<br />
idrossile<br />
Catione<br />
H-O-O-H<br />
Perossido di<br />
idrogeno<br />
-<br />
+
R-O-O-H<br />
Idroperossido<br />
R-O-O*<br />
Radicale<br />
(idro)perossile<br />
Fe2+ Fe2+ Fe2+ H + H + H +<br />
OH- OH- OH- Fe3+ Fe3+ Fe3+ R-O*<br />
Radicale<br />
alcossile<br />
H-O-O-H<br />
Idroperossido<br />
Figura 1. 7 Decomposizione degli idroperossidi<br />
In assenza di catalizzatori, la scissione dei<br />
perossidi – che dà luogo ad un’unica specie<br />
radicalica, quella alcossilica – può avvenire solo in<br />
seguito a somministrazione di energia (figura 1. 3).<br />
Un’ultima modalità di formazione di radicali<br />
liberi, tra quelle di maggiore rilevanza biologica, è<br />
la decomposizione degli azocomposti, dalla quale<br />
originano, per sottrazione di azoto molecolare (N2)<br />
radicali alchilici (figura 1. 3).<br />
Una volta innescata, una reazione radicalica a<br />
catena tende a propagarsi (step 2).<br />
Si distinguono 4 meccanismi fondamentali di<br />
propagazione delle reazioni radicaliche:<br />
trasferimento, addizione, frammentazione e<br />
riarrangiamento.<br />
Tra questi, il più comune nell’ambito delle<br />
reazioni radicaliche è il trasferimento. In questa<br />
modalità, il radicale libero – generato da una delle<br />
precedenti reazioni di inizio – attacca una molecola<br />
sottraendo ad essa uno dei suoi atomi<br />
(generalmente un atomo di idrogeno). Il risultato<br />
finale è la formazione di una nuova specie reattiva<br />
e, in pratica, il trasferimento del sito radicalico<br />
(figura 1. 8A).<br />
A<br />
B<br />
+<br />
A R H<br />
Radicale libero<br />
(ossidante)<br />
Radicale<br />
ossidrile<br />
Molecola<br />
bersaglio<br />
A H<br />
Nuova<br />
molecola<br />
Figura 1. 8 Reazione di trasferimento<br />
Con questo meccanismo, per esempio, il<br />
radicale ossidrile (HO*) attaccando una molecola<br />
organica (R-H), strappa a questa un atomo di<br />
idrogeno, generando, accanto ad una molecola<br />
d’acqua (H2O), un radicale alchilico (R*) (figura 1.<br />
8, B). Con questo meccanismo, il sito radicalico si<br />
trasferisce dal radicale ossidrile al radicale alchile.<br />
Infine, una reazione radicalica a catena può<br />
arrestarsi (termine, step 3) o per combinazione o<br />
per disproporzione.<br />
In particolare, nella combinazione, che è la<br />
reazione inversa della scissione omolitica, due<br />
+<br />
R<br />
Nuovo radicale<br />
(ossidante)<br />
O H + R H R + H O H<br />
Substrato<br />
organico<br />
Radicale<br />
alchile<br />
Acqua<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
7<br />
radicali liberi reagiscono tra loro dando luogo ad<br />
una molecola non più reattiva (figura 1. 9).<br />
R<br />
Radicale libero 1<br />
(ossidante)<br />
+<br />
R 1<br />
Radicale libero 2<br />
(antiossidante)<br />
Figura 1. 9 Reazione di combinazione<br />
R R 1<br />
Nuova<br />
molecola<br />
Il primo radicale agisce come ossidante,<br />
mentre il secondo si comporta come un generico<br />
antiossidante (vedi appresso).<br />
Questo meccanismo viene sfruttato per<br />
bloccare una reazione radicalica e in generale, un<br />
qualsiasi processo radicalico a catena può essere<br />
interrotto grazie all’intervento di agenti denominati,<br />
genericamente antiossidanti.<br />
1. 2 Meccanismi di produzione<br />
delle specie reattive nei viventi<br />
Negli organismi viventi i ROS sono generati nel<br />
corso della normale attività metabolica cellulare;<br />
alcuni agenti esogeni, tuttavia, possono<br />
incrementarne la produzione, anche con<br />
meccanismo diretto (figura 1. 10).<br />
Agenti<br />
esterni<br />
Produzione<br />
di ROS<br />
Metabolismo<br />
cellulare<br />
Figura 1. 10 Meccanismo generale di produzione dei ROS<br />
E’ possibile individuare almeno 5 fonti<br />
metaboliche primarie di radicali liberi, in rapporto al<br />
sito cellulare prevalentemente interessato nella<br />
produzione dei ROS stessi: la plasmamembrana, i<br />
mitocondri, i perossisomi, il reticolo endoplasmatico<br />
liscio (microsomi) e il citosol. E’ bene precisare che<br />
in ciascuna di queste sedi i ROS vengono prodotti<br />
o spontaneamente o per effetto di reazioni<br />
catalizzate da enzimi o da metalli di transizione (es.<br />
ferro o rame) (figura 1. 11).
NADPH ossidasi<br />
Lipoossigenasi<br />
Xantina ossidasi<br />
Aldeide ossidasi<br />
Figura 1. 11 Fonti cellulari primarie di produzione di ROS<br />
La plasmamembrana rappresenta una delle<br />
fonti più importanti di ROS, particolarmente (ma<br />
non esclusivamente) nei leucociti polimorfonucleati<br />
(PMN). Infatti, nella plasmamembrana di queste<br />
cellule sonolocalizzati diversi enzimi, quali la<br />
NADPH ossidasi e le lipoossigenasi, la cui<br />
attivazione si accompagna alla produzione,<br />
rispettivamente di anione superossido e di<br />
intermedi metabolici con caratteristiche chimiche di<br />
perossidi.<br />
La NADPH ossidasi è un enzima che catalizza<br />
la formazione di anione superossido da<br />
NADPH(H + ) ed ossigeno molecolare, in seguito a<br />
stimolazione specifica dei PMN, per esempio da<br />
parte di endotossine, batteri, o anticorpi).<br />
La reazione, che avviene verosimilmente in<br />
due tappe, è resa possibile dall’aumentata<br />
disponibilità di NADPH(H+), per l’aumentata<br />
ossidazione del glucosio attraverso lo shunt<br />
degli esosi, e di ossigeno molecolare, nell’ambito<br />
del cosiddetto “respiratory burst” (figura 1. 12).<br />
1) NADPH + O2 ⎯⎯⎯→ NADP* + H + *<br />
+ O 2<br />
2) NADP* + O2 ⎯⎯⎯→ NADP + *<br />
+ O 2<br />
NADH deidrogenasi<br />
Citocromo ossidasi<br />
Citocromo P 450<br />
Citocromo b 5<br />
Figura 1. 12 Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi<br />
Il sistema della lipoossigenasi, localizzato<br />
anch’esso a livello della plasmamembrana,<br />
comprende tre enzimi, la 5-, la 12-, e la 15lipoossigenasi,<br />
che catalizzano la formazione, a<br />
partire dall’acido arachidonico, del 5-, del 12- e del<br />
15-HPETE, rispettivamente. Queste sostanze sono<br />
chimicamente degli idroperossidi acidi, un gruppo<br />
particolare di ROS spesso indicati con la sigla di<br />
ROM (reactive oxygen metabolites, cioè metaboliti<br />
o derivati reattivi dell’ossigeno).<br />
La produzione di ROS a livello della<br />
plasmamembrana dei PMN, per attivazione della<br />
NADPH ossidasi e/o delle lipossigenasi, avviene,<br />
tipicamente, nel corso di processi reattivi (es.<br />
infezioni, immunoreazioni patogene,<br />
infiammazioni).<br />
I mitocondri rappresentano la fonte metabolica<br />
primaria di ROS perché sulle loro creste sono<br />
localizzati i complessi enzimatici della catena<br />
respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa.<br />
Idealmente, il trasferimento di elettroni dal NAD<br />
ridotto al citocromo C e da questo all’ossigeno<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
8<br />
dovrebbe concludersi, una volta sintetizzato l’ATP,<br />
con la produzione di H2O (riduzione tetravalente<br />
dell’ossigeno molecolare). Tuttavia, già in<br />
condizioni normali, questo processo non è perfetto,<br />
per cui in maniera non facilmente controllabile una<br />
certa quota di elettroni (1-2%) sfugge al sistema di<br />
trasporto dei vari coenzimi (es. ubichinone,<br />
flavoproteine, citocromi, ecc.) e reagisce<br />
direttamente con l’ossigeno molecolare,<br />
generando, così, anione superossido e /o<br />
perossido di idrogeno (riduzione uni- e bivalente<br />
dell’ossigeno molecolare).<br />
Per avere un’idea di questo processo, si<br />
consideri che è stato calcolato che durante un<br />
esercizio fisico intenso nei muscoli scheletrici, a<br />
causa dell’intensa stimolazione metabolica<br />
cellulare la quota di questo shunt elettronico può<br />
raggiungere il 15% dell’ossigeno utilizzato dai<br />
mitocondri.<br />
Il fenomeno della riduzione uni o bivalente<br />
dell’ossigeno molecolare avviene, nei mitocondri,<br />
senza l’intervento di enzimi, al contrario di quanto<br />
osservato in altre sedi cellulari (figura 1. 13).<br />
O O<br />
.<br />
2 2 H2O2 HO .<br />
1e- 1e -<br />
1e- 1e- O O<br />
.<br />
2 2 H2O2 HO .<br />
1e- 1e -<br />
1e- 1e- O O<br />
.<br />
2 2 H2O2 HO .<br />
1e- 1e -<br />
1e- 1e- Riduzione<br />
univalente<br />
2 H + 2 H + 2 H +<br />
Riduzione tetravalente<br />
Riduzione<br />
univalente<br />
Riduzione bivalente<br />
1H + 1H + 1H +<br />
Riduzione bivalente<br />
H H2O 2O 2O<br />
Figura 1. 13 Modalità di riduzione dell’ossigeno molecolare<br />
In altre parole, da un punto di vista<br />
squisitamente chimico la produzione di radicali<br />
liberi nel corso della fosforilazione ossidativa è<br />
esattamente una modalità non enzimatica di<br />
produzione di specie reattive.<br />
In realtà, come si è appenna accennato, la<br />
generazione di radicali liberi negli organismi viventi<br />
è strettamente legata ai fenomeni vitali e, pertanto,<br />
costituisce un fenomeno “fisiologico” che avviene<br />
continuamente nel corso di reazioni di<br />
ossidoriduzione attraverso meccanismi sia<br />
enzimatici che non enzimatici.<br />
A questo punto è opportuno sottolineare che,<br />
oltre ai mitocondri, esistono anche altre fonti non<br />
enzimatiche di radicali liberi nelle cellule. Per<br />
esempio, i perossinitriti generano spontaneamente<br />
radicale idrossile e radicale nitrossido.<br />
Tuttavia, le reazioni non enzimatiche più<br />
importanti sotto il profilo biologico per la produzione<br />
di radicali liberi sono quelle catalizzate da metalli di<br />
transizione. In queste reazioni, che richiedono<br />
generalmente ferro o rame allo stato ridotto<br />
(rispettivamente Fe 2+ e Cu + ) il perossido di<br />
idrogeno (generato attraverso varie metaboliche,<br />
come si preciserà più avanti) è scisso in radicale<br />
idrossile e ione ossidrile per inglobamento
dell’elettrone strappato al metallo di transizione,<br />
che viene rilasciato in forma ossidata<br />
(rispettivamente Fe 3+ e Cu 2+ ), secondo il<br />
meccanismo sopra discusso dell’interazione con<br />
metalli di transizione:<br />
HOOH + Fe 2+ ⎯→ HO* + OH - + Fe 3+<br />
oppure<br />
HOOH + Cu + ⎯→ HO* + OH - +Cu 2+<br />
Analoga reazione subiscono gli idroperossidi,<br />
che generano il radicale alcossile:<br />
ROOH + Fe 2+ ⎯→ RO* + OH - + Fe 3+<br />
oppure<br />
ROOH + Cu + ⎯→ RO* + OH - + Cu 2+<br />
Gli enzimi che rigenerano metalli di transizione<br />
allo stato ridotto costituiscono un complesso<br />
indicato con la sigla MCO (sistemi di ossidazione<br />
metallo-catalizzata). Essi comprendono la xantina<br />
ossidasi, la NADPH e la NADH ossidasi, l’acido<br />
nicotinico idrossilasi, il sistema del citocromo P450,<br />
la NADH reduttasi (coenzima chinonico), la<br />
succinico-reduttasi (coenzima chinonico) e varie<br />
proteine a ferro-zolfo non eminico. I chinoni e i<br />
gruppi prostetici flavinici ridotti generati da questi<br />
enzimi riducono a loro volta i metalli di transizione,<br />
provocando la riduzione diretta dell’ossigeno<br />
molecolare a radicale idrossile e/o a perossido di<br />
idrogeno (attraverso la mediazione o meno<br />
dell’anione superossido) (figura 1. 14).<br />
QH 2<br />
O 2<br />
FH 2<br />
O 2<br />
QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- 2H + 2H + 2H +<br />
x2<br />
O *<br />
2<br />
O 2<br />
H2 O2 Fe(II)<br />
F FH +<br />
H2 O2 Fe(II)<br />
F FH +<br />
H2 O2 Fe(II)<br />
F FH +<br />
*OH + OH- *OH + OH + Fe (III)<br />
- *OH + OH + Fe (III)<br />
- + Fe (III)<br />
Fe(III)<br />
Figura 1. 14 Sistemi MCO e ciclo del ferro<br />
Oltre alla plasmamembrana ed ai mitocondri,<br />
anche i perossisomi rappresentano una fonte<br />
importante di ROS. In questi organuli cellulari,<br />
infatti, avviene un particolare processo di<br />
ossidazione degli acidi grassi, che è diverso da<br />
quello convenzionale (β−ossidazione). Nella prima<br />
tappa di tale sequenza di reazioni, una<br />
flavoproteina estrae una coppia di atomi di<br />
idrogeno da una molecola di acido grasso<br />
attivato(acil-CoA) trasferendola direttamente<br />
all’ossigeno molecolare, con formazione di<br />
perossido di idrogeno (successivamente inattivato<br />
dalla catalasi).<br />
Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) la<br />
produzione di specie reattive passa attraverso il<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
9<br />
citocromo P450. Quest’ultimo gioca un ruolo di<br />
primo piano nei processi di detossificazione.<br />
Il citocromo P450 agisce come donatore<br />
immediato di elettroni in molte reazioni di<br />
idrossilazione, in particolare quelle che avvengono<br />
all’interno degli epatociti e che sono finalizzate<br />
all’inattivazione di ormoni (es. steroidei) e composti<br />
non fisiologici (xenobiotici, quali tossici e farmaci<br />
idrofobici che vengono in tal modo resi più solubili<br />
e meno tossici).<br />
Il citocromo P450 è una proteina a ferro eminico<br />
presente non solo nel reticolo endoplasmatico del<br />
fegato ma anche nei mitocondri della corticale del<br />
surrene che, in un processo molto complesso e<br />
non ancora perfettamente chiarito, fa da traitd’union<br />
fra l’NADPH(H + ) (donatore di elettroni) e<br />
substrato da idrossilare. In tale complessa reazione<br />
un substrato idrossilabile (SH) reagisce con<br />
NADPH(H + ) ed ossigeno molecolare (O2) per<br />
formare il corrispondente derivato idrossilato<br />
(S-OH), insieme a NADP + ed acqua.<br />
Una produzione di radicali liberi avviene nella<br />
cellula anche nel corso di numerose altre reazioni<br />
biochimiche, come ad esempio durante<br />
l’ossidazione dell’ipoxantina a xantina e della<br />
xantina ad acido urico, che contrassegnano la fase<br />
finale del catabolismo dei nucleotidi purinici<br />
(AMP IMP inosina ipoxantina xantina acido<br />
urico).<br />
Ambedue le suddette reazioni sono catalizzate<br />
dalla xantina deidrogenasi, un enzima a molibdeno.<br />
In particolari condizioni, come nel corso del<br />
cosiddetto danno da ischemia-riperfusione, la<br />
xantina deidrogenasi è convertita in xantina<br />
ossidasi (probabilmente per clivaggio proteolitico<br />
calcio-dipendente). Quest’ultima, utilizzando come<br />
accettore finale di elettroni direttamente l’ossigeno,<br />
genera perossido di idrogeno e anione<br />
superossido, a partire, rispettivamente,<br />
dall’ipoxantina e dalla xantina (figura 1. 15).<br />
Ipoxantina Xantina<br />
H 2 O + O 2<br />
H 2 O 2<br />
← Xantina ossidasi →<br />
Xantina Acido urico<br />
Figura 1. 15 Produzione di ROS dal catabolismo purinico<br />
Altre reazioni che generano radicali liberi sono<br />
descritte nella sintesi delle catecolammine.<br />
Da quanto esposto finora, si evince che i ROS<br />
rappresentano intermedi quasi obbligati del<br />
metabolismo cellulare. E poiché la loro produzione<br />
è strettamente legata ai fenomeni vitali, a ragione<br />
essi sono stati definiti “insostituibili compagni di<br />
viaggio” della nostra esistenza.<br />
O 2<br />
O -<br />
2
Appare evidente che in ciascun sito cellulare,<br />
la produzione di specie reattive ha una sua<br />
specifica funzione. Infatti, è stato riconosciuto che i<br />
ROS giocano un ruolo importante “al servizio della<br />
vita” perché sono coinvolti non solo nel<br />
metabolismo cellulare ma anche nei “processi<br />
reattivi”, quali infezioni e infiammazioni. In verità,<br />
l’anione superossido e gli altri ROS vengono<br />
generati sulla superficie esterna della<br />
plasmamembrana dei leucociti attivati. Queste<br />
specie reattive attaccheranno componenti estranei<br />
quali batteri indebolendone la parete e rendendoli<br />
più facilmente accessibili alla fagocitosi e, in<br />
definitiva, alla loro distruzione. Queste attività<br />
“immunologiche” si estrinsecano non solo nei<br />
confronti di componenti estranei ma anche contro<br />
componenti “self” quali tessuti o organi trapiantati<br />
(reazione di rigetto). Questa strategia viene anche<br />
utilizzata nel corso della guarigione di organi o<br />
tessuti soggetti a traumi. Infatti, i leuociti migrano<br />
nell’area lesa, si attivano e iniziano a bombardare<br />
le cellule danneggiate con i radicali liberi che<br />
accelerano la loro distruzione, allontanamento dei<br />
sottoprodotti di lisi, e il corrispondente recupero<br />
(rigenerazione).<br />
La produzione di radicali liberi da parte delle<br />
cellule può, talvolta, subire un incremento notevole<br />
per effetto di stimolazioni esterne. Infatti, agenti<br />
fisici, chimici e biologici, da soli o in combinazione<br />
tra loro, possono indurre direttamente la<br />
generazione di ROS o aumentarne la “fisiologica”<br />
produzione attraverso una specifica stimolazione<br />
metabolica.<br />
Tra gli agenti fisici, sono da segnalare le<br />
radiazioni ionizzanti e i raggi UV. Ambedue queste<br />
fonti energetiche possono indurre il fenomeno della<br />
scissione omolitica dell’acqua, detto anche radiolisi<br />
o fotolisi a seconda del tipo di radiazione coinvolto<br />
(figura 1. 16).<br />
H R H UV H R + H<br />
Acqua Radicale<br />
Radicale<br />
idrossile<br />
idrogeno<br />
Figura 1. 16 La fotolisi dell’acqua<br />
In questa reazione la molecola d’acqua<br />
assorbe energia e la utilizza per scindere uno dei<br />
suoi due legami covalenti con l’idrogeno: i prodotti<br />
saranno due radicali liberi, il radicale idrossile e<br />
l’atomo di idrogeno. Considerato che un organismo<br />
vivente è costituito prevalentemente da acqua e<br />
che trascorre gran parte della sua vita sotto l’effetto<br />
di radiazioni (UV o ionizzanti che siano) appare<br />
evidente quanto questo fenomeno incida in<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
10<br />
maniera sostanziale sulla produzione di radicali<br />
liberi.<br />
Fra gli agenti chimici in grado di stimolare la<br />
produzione di radicali liberi è da citare l’ozono (un<br />
ROS) che genera direttamente radicali perossilici<br />
per interazione con composti fenolici.<br />
I due casi finora considerati (radiazioni e<br />
ozono) costituiscono esempi di produzione diretta<br />
di specie reattive.<br />
Altri agenti chimici, invece, quali gli idrocarburi<br />
aromatici policiclici o taluni farmaci, inducono un<br />
aumento della produzione dei radicali liberi<br />
attraverso un meccanismo indiretto, attivando il<br />
sistema del citocromo P450 a livello microsomiale.<br />
Agenti biologici che tipicamente inducono un<br />
aumento della produzione di ROS per attivazione<br />
metabolica specifica sono i batteri, nell’ambito del<br />
fisiologico processo di difesa dalle infezioni, e<br />
taluni anticorpi, nell’ambito di alcune reazioni<br />
immunopatogene. In questi casi, come accennato<br />
a proposito della plasmamembrana, sono chiamati<br />
direttamente in causa i PMN. Questi ultimi, infatti,<br />
possiedono oltre alla citata NADPH ossidasi, una<br />
serie di enzimi direttamente coinvolti nella<br />
produzione e, in parte, inattivazione di specie<br />
chimiche reattive, quali la superossidodismutasi<br />
(SOD), la mieloperossidasi (MPx), la catalasi (CAT)<br />
e la glutatione perossidasi (GPx) (figura 1. 17).<br />
Batteri, endotossine , anticorpi<br />
Ossidazione diretta<br />
del glucosio<br />
Generazione di<br />
NADPH + H +<br />
Generazione di<br />
NADPH + H +<br />
↑ Captazione di<br />
ossigeno<br />
↑ Disponibilità di<br />
ossigeno<br />
Attivazione NADPH ossidasi<br />
HClO<br />
.<br />
O 2<br />
SOD<br />
H H2O 2O 2<br />
MPx<br />
CAT GPx<br />
H H2O 2O<br />
NADPH ossidasi<br />
NADPH + O 2 → NADP . + H + + O<br />
.<br />
2<br />
NADP . + O 2 → NADP + NADPH ossidasi<br />
NADPH + O 2 → NADP<br />
+ O<br />
.<br />
2<br />
. + H + + O<br />
.<br />
2<br />
NADP . + O 2 → NADP + NADPH ossidasi<br />
NADPH + O 2 → NADP<br />
+ O<br />
.<br />
2<br />
. + H + + O<br />
.<br />
2<br />
NADP . + O 2 → NADP + + O<br />
.<br />
2<br />
Superossido dismutasi (SOD)<br />
2 O<br />
.<br />
2 + 2 H +<br />
2 + 2 H +<br />
2 + 2 H + → H2 O 2 + O 2<br />
Mieloperossidasi (MPx)<br />
HCl + H 2 O 2 → H 2 O + HClO<br />
Catalasi (CAT)<br />
2 H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2<br />
Glutatione perossidasi (GPx)<br />
2 GSH + H 2 O 2 → 2H 2 O + GSSG<br />
Figura 1. 17 Produzione reattiva di ROS da parte dei PMN<br />
La SOD catalizza la trasformazione dell’anione<br />
superossido in perossido di idrogeno che, a sua<br />
volta, può essere inattivato ad acqua per azione<br />
della CAT o della GPx. Tuttavia, la disponibilità di<br />
cloruri – anche a concentrazioni fisiologiche –<br />
rende il perossido di idrogeno substrato della MPx.<br />
Il risultato finale è la produzione di un agente<br />
altamente ossidante, l’acido ipocloroso (HClO).<br />
Come verrà precisato in seguito, l’HClO può<br />
attaccare numerosi substrati organici e, in<br />
particolare, amminoacidi e proteine, per produrre<br />
cloroammine, una potenziale fonte di radicali<br />
alcossilici e perossilici.<br />
Infine, giova ricordare che un aumento della<br />
produzione di radicali liberi può osservarsi in<br />
situazioni “fisiologiche”, come ad esempio dopo un<br />
intenso sforzo muscolare o nel corso di numerose<br />
malattie. In quest’ultimo caso, spesso, non è chiaro
fino a che punto i ROS siano la causa o l’effetto<br />
della patologia considerata (vedi più avanti).<br />
1. 3 Metabolismo delle più importanti<br />
specie reattive di interesse biologico<br />
Le più comuni specie reattive di interesse<br />
biologico sono quelle centrate sull’ossigeno,<br />
sull’azoto, sul carbonio e sul cloro (tabella 1. 1).<br />
Tabella 1. 1 Specie reattive di maggiore interesse biologico<br />
Specie chimica Formula Natura Specie chimica Formula Natura<br />
Ozono<br />
Anione superossido<br />
Ossigeno singoletto<br />
O3<br />
*<br />
O2<br />
1<br />
O2*<br />
N-R<br />
R<br />
R (?)<br />
Ossido nitrico<br />
Diossido nitrico<br />
Acido nitroso<br />
NO*<br />
NO2*<br />
HNO2<br />
R<br />
R<br />
N-R<br />
Perossido di idrogeno H2O2 N-R Tetrossido di azoto N2O4 N-R<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale alcossile<br />
HO*<br />
RO*<br />
R<br />
R<br />
Triossido nitrico<br />
Perossinitrito<br />
N2O3<br />
ONOO<br />
N-R<br />
- N-R<br />
Radicale idroperossile ROO* R Acido perossinitroso ONOOH N-R<br />
Idroperossido ROOH N-R Catione nitronio NO 2+ N-R<br />
Semichinone ( CoQ) Q* R Alchil-perossinitrito ROONO N-R<br />
Fenossile (vit E) E-O* R Acido ipocloroso HClO N-R<br />
N-R: specie non radicalica.<br />
R: specie radicalica.<br />
Tra le specie reattive primarie dell’ossigeno<br />
citate nel paragrafo precedente, l’ossigeno<br />
singoletto rappresenta una varietà radicalica che<br />
può originarsi per eccitazione dell’ossigeno<br />
molecolare o per combinazione di radicali<br />
perossilici (figura 1. 18).<br />
O 2<br />
Eccitazione<br />
1<br />
O2<br />
Combinazione<br />
ROO*<br />
Figura 1. 18 Modalità di generazione dell’ossigeno singoletto<br />
Molto più complessa è, invece, la formazione<br />
dell’anione superossido (figura 1. 19).<br />
Respirazione<br />
polmonare<br />
O 2<br />
HO*<br />
NADPH<br />
ossidasi<br />
Ossidazione mista NADPH Autoossidazione<br />
Catena<br />
respiratoria<br />
Riduzione univalente<br />
Reazione di Haber-Weiss<br />
O 2<br />
Ossidazione mista<br />
ipoxantina<br />
Citocromi<br />
P 450 e 5 b<br />
Figura 1. 19 Metabolismo dell’anione superossido<br />
Xantina<br />
ossidasi<br />
Il radicale idrossile, noto per la sua enorme<br />
potenzialità istolesiva, può derivare da un’ampia<br />
serie di reazioni, tra le quali spiccano la già<br />
e<br />
Superossido dismutasi<br />
H H2O 2O 2O 2<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
11<br />
discussa fotolisi dell’acqua e la decomposizione del<br />
perossido di idrogeno (figura 1. 20).<br />
Respirazione<br />
polmonare<br />
O 2<br />
O O2* 2* 2* H H2O 2O 2O<br />
H H2O 2O 2O 2<br />
Reazione di Haber-Weiss<br />
Catena<br />
respiratoria<br />
Riduzione univalente<br />
RH<br />
H H2O 2O 2O<br />
Radiolisi<br />
HO*<br />
R*<br />
Reazione di Fenton<br />
Scissione spontanea<br />
Reazione con ozono<br />
Fenoli<br />
Figura 1. 20 Metabolismo del radicale idrossile<br />
Infine, il perossido di idrogeno viene generato<br />
prevalentemente attraverso meccanismi di tipo<br />
enzimatico e per via enzimatica è generalmente<br />
inattivato o dà luogo alla formazione di specie<br />
chimiche più ossidanti (figura 1. 21).<br />
Respirazione<br />
polmonare<br />
O 2<br />
HO*<br />
Superossido<br />
dismutasi<br />
Catena<br />
respiratoria<br />
Riduzione bivalente<br />
H H2O 2O 2O 2<br />
H H2O 2O 2O<br />
Ossidazione mista<br />
ipoxantina<br />
Figura 1. 21 Metabolismo del perossido di idrogeno<br />
HONOO<br />
Amminoacido<br />
ossidasi<br />
Xantina<br />
ossidasi<br />
Reaz. di Haber-Weiss Catalasi Perossidasi Mieloperossidasi<br />
ClO- Superossido dismutasi ClO- Superossido dismutasi ClO- Superossido dismutasi<br />
Le specie reattive primarie dell’ossigeno<br />
possono attaccare qualsiasi substrato organico,<br />
generando specie reattive secondarie, note anche<br />
come metaboliti o derivati reattivi dell’ossigeno,<br />
quali gli idroperossidi. Questi ultimi, a loro volta, in<br />
particolari condizioni, possono dare origine a<br />
specie chimiche particolarmente reattive quali i<br />
radicali perossile e alcossile.<br />
Le specie reattive centrate sull’azoto di<br />
maggiore rilevanza biomedica comprendono<br />
varietà sia radicaliche che non radicaliche. Fra le<br />
prime sono da citare l’ossido nitrico (NO*) e il<br />
biossido nitrico (NO2*); fra le seconde, piuttosto<br />
numerose, ricordiamo, invece, l’acido nitroso e il<br />
perossinitrito.<br />
L’ossido nitrico, un gas considerato per<br />
decenni un inquinante ambientale, viene prodotto,<br />
insieme alla L-citrullina, a partire dall’amminoacido<br />
L-arginina, in una reazione catalizzata dall’enzima<br />
ossido nitrico sintetasi (nitric oxide synthase, NOS).<br />
Quest’ultimo possiede la singolare proprietà di<br />
ospitare sulla stessa catena polipeptidica due<br />
domini ad azione catalitica, uno reduttasico ed uno<br />
ossigenasico, e richiede come cofattori NADPH e<br />
pteridina ridotta. La NOS esiste in numerose
isoforme, alcune costitutive (cellule endoteliali,<br />
piastrine, SN) ed altre inducibili (macrofagi, PMN,<br />
cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, epatociti)<br />
(figura 1. 22).<br />
H 2 N<br />
H 2 N<br />
HN<br />
HO<br />
L-arginina<br />
+<br />
NH 2<br />
O<br />
NOS<br />
NADPH, O 2 , BH 4<br />
H 2 N<br />
H 2 N<br />
L-citrullina<br />
Figura 1. 22 Biosintesi del l’ossido nitrico<br />
Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un<br />
importante messaggero intra- ed inter-cellulare<br />
regolando molte funzioni quali la pressione<br />
arteriosa, la respirazione, la coagulazione del<br />
sangue, e alcune attività cerebrali. Esso, inoltre,<br />
gioca un ruolo determinante nella difesa dalle<br />
infezioni batteriche e nella prevenzione dei tumori.<br />
Tuttavia, se generato in quantità abnormi esso è<br />
anche un potente killer cellulare.<br />
Nell’NO gli elettroni spaiati del livello<br />
energetico più esterno (cinque appartenenti<br />
all’azoto e sei all’ossigeno) generano una specie<br />
chimica non carica, dotata di proprietà<br />
paramagnetiche e, dunque, un radicale.<br />
In quanto radicale libero, l’NO reagisce<br />
rapidamente con altre specie aventi elettroni<br />
spaiati; l’effetto può essere un’ossidazione, una<br />
riduzione oppure il legame con altre molecole, in<br />
funzione del microambiente (figura 1. 22).<br />
N N2O 2O 2O 3<br />
R-SH / R-NH 2<br />
RS-NO<br />
RNH-NO<br />
NO -<br />
3<br />
Redox<br />
pH
Gli scavenger, che agiscono attraverso vari<br />
meccanismi, possono essere di natura idrofila<br />
(albumina, urato, ascorbato, urato) oppure lipofila<br />
(carotenoidi, vitamina E, ubichinolo).<br />
Secondo alcuni ricercatori, gli scavenger<br />
dovrebbero essere distinti dagli antiossidanti<br />
propriamente detti. Infatti, mentre gli scavenger<br />
(es. α−tocoferolo) sono agenti che riducono la<br />
concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal<br />
mezzo in cui si trovano, gli antiossidanti (es.<br />
difenilammina), invece, sono agenti che inibiscono<br />
il processo dell’autoossidazione, di cui costituisce<br />
un importante esempio l’irrancidimento dei grassi.<br />
Questo fenomeno, ben noto in scienza<br />
dell’alimentazione, viene definito autoossidazione<br />
perché avviene attraverso una sequenza<br />
autocatalitica di reazioni radicaliche in presenza di<br />
ossigeno. Alternativamente si può usare il termine<br />
di perossidazione, in quanto lo stesso processo<br />
genera intermedi con caratteristiche di perossidi<br />
(R–O–OR) (figura 1. 23).<br />
ROOH<br />
RH<br />
R*<br />
RO*<br />
ROH<br />
*OH<br />
RH<br />
H H2O 2O 2O 2O<br />
R*<br />
Figura 1. 23 Il processo di autoossidazione o perossidazione<br />
Attraverso questo processo alcuni grassi alimentari<br />
irrancidiscono e le biomembrane degli organismi<br />
viventi vengono ossidate.<br />
ROO *<br />
ROO *<br />
ROO *<br />
ROO *<br />
ROOR<br />
RO*<br />
RH H 2 O<br />
O 2<br />
ROO*<br />
Gli agenti di riparo comprendono<br />
esclusivamente enzimi che intervengono dopo che<br />
il danno da specie reattive si è instaurato. La loro<br />
azione – spesso sequenziale – prevede dapprima<br />
l’identificazione del segmento molecolare ossidato,<br />
poi la separazione del frammento ormai<br />
inutilizzabile e, infine, la sistensi e l’inserimento di<br />
un nuovo segmento in sostituzione di quello<br />
danneggiato. Appartengono agli agenti di riparo le<br />
idrolasi (glicosidasi, lipasi, proteasi), le trasferasi e<br />
le polimerasi, tutte indispensabili per la riparazione<br />
del danno da radicali liberi di importanti molecole o<br />
strutture cellulari (es. DNA, membrane, ecc).<br />
Infine, gli agenti di adattamento comprendono<br />
tutte quelle sostanze o tecniche o procedure<br />
attraverso le quali è possibile potenziare il sistema<br />
O 2<br />
R*<br />
RH: molecola organica<br />
ROOH: idroperossido<br />
ROO*: radicale idroperossilico<br />
RO*: radicale alcossilico<br />
Capitolo 1. Radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno<br />
13<br />
antiossidante fisiologico di un organismo. Per<br />
esempio, un corretto esercizio fisico o l’adozione di<br />
un regime alimentare corretto ed equilibrato sono<br />
misure di per sé in grado di controllare il<br />
metabolismo ossidativo attraverso la riduzione<br />
della produzione di specie reattive e l’induzione di<br />
enzimi ad attività antiossidante .<br />
Il sistema di difesa antiossidante è<br />
regolarmente distribuito nell’organismo, sia a livello<br />
extracellulare che a livello intracellulare.<br />
A livello dei liquidi extracellulari e, in<br />
particolare, nel plasma, l’insieme delle sostanze<br />
potenzialmente in grado di cedere equivalenti<br />
riducenti (atomi di idrogeno o singoli elettroni) sì da<br />
soddisfare “l’avidità di elettroni” che rende i radicali<br />
liberi instabili costituisce la cosiddetta barriera<br />
antiossidante. Ne fanno parte, nel plasma, tutte le<br />
proteine e, in particolar modo, l’albumina, la<br />
bilirubina, l’acido urico, il colesterolo, e i vari<br />
antiossidanti esogeni introdotti con l’alimentazione<br />
o sotto forma di integratori dietetici (ascorbato,<br />
tocoferolo, polifenoli ecc.). Un ruolo di particolare<br />
importanza è svolto, nel contesto di questa<br />
barriera, dai gruppi tiolici (-SH).<br />
All’interno delle cellule il sistema di difesa<br />
antiossidante ha una sua ben precisa<br />
compartimentalizzazione (figura 1. 24).<br />
Vitamina E<br />
Acidi grassi poliinsaturi<br />
b-carotene<br />
Glutatione<br />
Ascorbato<br />
Selenio<br />
Vitamina E,<br />
Ascorbato<br />
b-carotene<br />
Catalasi<br />
Selenio<br />
Vitamina E<br />
Ubichinone<br />
Vitamina E<br />
b-carotene<br />
Figura 1. 24 Compartimentalizzazione dei sistemi antiossidanti<br />
Il sistema antiossidante comprende alcuni<br />
enzimi (superossidodismutasi, catalasi e<br />
perossidasi) ed una serie di sostanze assunte<br />
dall’esterno (vitamine e sostanze analoghe ad<br />
attività antiossidante, quali i polifenoli,<br />
oligoelementi ecc). Alcuni di questi agenti sono<br />
liposolubili (es. tocoferoli) e, entrando nella<br />
compagine delle biomembrane, costituiscono la<br />
prima linea di difesa contro l’attacco dei radicali<br />
liberi. Altri, invece, sono idrosolubili (es. ascorbato)<br />
ed intervengono soprattutto nel contesto della<br />
matrice solubile del citoplasma e degli organuli<br />
cellulari.
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
Capitolo 2<br />
Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
2. 1 Generalità e definizioni<br />
Lo stress ossidativo è una particolare<br />
condizione indotta da un’accentuazione in senso<br />
pro-ossidante dell’equilibrio dinamico fra processi<br />
ossidativi e riduttivi che hanno luogo<br />
continuamente in ogni cellula, quale espressione<br />
fisiologica delle complesse trasformazioni<br />
biochimiche del metabolismo terminale.<br />
Sulla base di questo tentativo di inquadrare un<br />
aspetto della biochimica dinamica che è tuttora<br />
oggetto di ampio dibattito fra i ricercatori, lo stress<br />
ossidativo si configura come un fenomeno che<br />
riguarda, almeno in prima battuta, la singola cellula<br />
che, per effetto della propria attività metabolica,<br />
non di rado sotto lo stimolo di agenti ad essa<br />
esterni, è costretta a subire gli effetti<br />
potenzialmente lesivi di una serie di reazioni<br />
indesiderate che accompagnano quei processi<br />
ossidativi da cui dipende la sua stessa esistenza.<br />
2. 2 Basi biochimiche<br />
I ROS rappresentano una minaccia mortale<br />
per la vita della cellula che ne tiene sotto controllo<br />
la produzione grazie ad un efficiente sistema di<br />
difesa. Tuttavia, in particolari condizioni, quando la<br />
produzione di ROS è eccessiva e/o la capacità di<br />
smaltire questi ultimi si riduce, la cellula è costretta<br />
a subire il danno da radicali liberi.<br />
Trasferendo il discorso all’intero organismo,<br />
possiamo definire lo stress ossidativo come una<br />
particolare forma di stress chimico indotto dalla<br />
presenza di una quantità eccessiva di specie<br />
reattive per un’aumentata produzione delle stesse<br />
e/o per una ridotta capacità di smaltirne le quantità<br />
comunque prodotte ( figura 2. 1).<br />
Radiazioni,farmaci, metalli pesanti<br />
Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento<br />
Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà<br />
Infezioni ed altre malattie<br />
Malattie<br />
cardiovascolari<br />
Ridotta assunzione<br />
e/o diminuita sintesi<br />
e/o ridotta capacità di utilizzazione<br />
e/o aumentato consumo di antiossidanti<br />
Specie reattive › Difese antiossidanti fl<br />
Demenza,<br />
M. di Parkinson<br />
Danno cellulare<br />
Invecchiamento<br />
precoce<br />
Infiammazioni,<br />
tumori<br />
Altre<br />
malattie<br />
Figura 2. 1 Eziopatogenesi schematica dello stress ossidativo<br />
E’ ovvio che il discorso è ben più complesso,<br />
ma il concetto appena esposto è sufficiente per<br />
comprendere i principali aspetti fisiopatologici dello<br />
14<br />
stress ossidativo e le relative implicazioni sul piano<br />
diagnostico e terapeutico.<br />
Comunque determinatasi, infatti, l’eccessiva<br />
produzione di specie reattive, non più<br />
adeguatamente controllata dai sistemi di difesa<br />
antiossidanti, provoca una serie di alterazioni<br />
funzionali e strutturali della cellula, che possono<br />
condurre all’apoptosi o addirittura alla necrosi<br />
(tabella 2. 1).<br />
Tabella 2. 1 Alterazioni biochimiche cellulari nello s. ossidativo<br />
• Perossidazione biomolecole (glicidi, lipidi, amminoacidi, nucleotidi…)<br />
• Ossidazione e deplezione di GSH<br />
• Ossidazione dei tioli proteici<br />
• Ossidazione dei nucleotidi piridinici<br />
• Lesioni del DNA ed attivazione della poli(ADP-ribosio)polimerasi<br />
• Alterazioni dei meccanismi di trasduzione del segnale<br />
• Alterazioni dell’omeostasi ionica<br />
• Alterazioni del citoscheletro<br />
• Inibizione della glicolisi<br />
• Deplezione di NAD+<br />
• Caduta del potenziale di membrana mitocondriale<br />
• Deplezione di ATP<br />
• Aumento della permeabilità della membrana plasmatica<br />
Sul piano generale, queste lesioni – dapprima<br />
cellulari e poi tissutali – saranno responsabili,<br />
infine, di patologie d’organo, quali ad esempio il<br />
morbo di Crohn o la pancreatite, oppure di<br />
condizioni sistemiche, quali l’invecchiamento<br />
precoce, l’aterosclerosi e così via.<br />
Comunque, va sottolineato ancora una volta<br />
che non sempre è possibile stabilire se i radicali<br />
liberi sono la causa oppure l’effetto delle lesioni<br />
osservate.<br />
Le principali cause di aumentata produzione di<br />
ROS sono da individuarsi in fattori ambientali,<br />
situazioni fisiologiche, stile di vita, fattori<br />
psicologici, malattie e fattori iatrogeni, ecc. (tabella<br />
2. 2).<br />
Tabella 2. 2 Cause di aumentata produzione di specie reattive<br />
Eziologia Examples<br />
Fattori ambientali Radiazioni, inquinamento<br />
Stati fisiologici Gravidanza (?)<br />
Stile di vita Alimentazione, alcool, fumo, esercizio fisico incongruo<br />
Fattori psicologici <strong>Stress</strong> psico-emotivo (?)<br />
Malattie Traumi, infiammazioni, infezioni, vasculopatie, neoplasie<br />
Fattori iatrogeni Farmacoterapia, radioterapia, raggi X<br />
Bisogna sottolineare che il fumo di sigaretta,<br />
l’abuso di alcool ed altri fattori correlati con lo stile<br />
di vita sono responsabili dell’aumento della<br />
produzione di ROS. Lo stesso effetto è indotto da<br />
un’attività fisica incongrua (eccessiva o<br />
insufficiente). Infine, è riconosciuto il ruolo dei<br />
numerose malattie, su base disreattiva o infettiva<br />
(es. artrite reumatoide e infezioni batteriche) nel<br />
favorire l’incremento dei ROS.<br />
Una riduzione delle difese antiossidanti è da<br />
imputarsi sostanzialmente ad un deficit assoluto o
elativo di antiossidanti, comunque determinatosi.<br />
In tale contesto, alcune malattie, quali la celiachia,<br />
possono provocare uno stress ossidativo riducendo<br />
la disponibilità di antiossidanti assunti con<br />
l’alimentazione (tabella 2. 3).<br />
Tabella 2. 3 Cause di ridotte difese antioossidanti<br />
Eziologia Esempi<br />
Ridotta assunzione di AO Ipovitaminosi, diete monotone<br />
Ridotto assorbimento di AO Sindromi da malassorbimento, celiachia<br />
Ridotta capacità di utilizzazione di AO Deficit dei mec. di captazione e/o trasporto<br />
Insufficienza dei sistemi enzimatici AO Fattori genetici e/o iatrogeni<br />
Eccessivo consumo di AO Eccessiva produzione di specie reattive<br />
Assunzione di farmaci Sovraccarico del sistema microsomiale<br />
Malattie Vari<br />
AO: antiossidanti<br />
A proposito delle malattie, va precisato che<br />
esse alcune di esse si accompagnano ad<br />
un’aumentata produzione di specie reattive, altre<br />
ad una riduzione delle difese antiossidanti, altre<br />
ancora, infine, alla combinazione di ambedue i<br />
meccanismi.<br />
Spesso, tuttavia, non è chiaro se i radicali liberi<br />
ne siano la causa oppure l’effetto o addirittura un<br />
semplice epifenomeno.<br />
Dal punto di vista biochimico, considerando il<br />
fenomeno all’interno della cellula, è indubbio che<br />
all’origine delle alterazioni funzionali e strutturali vi<br />
è un aumento della produzione di specie reattive<br />
per stimolazione parziale o generalizzata del<br />
metabolismo, spesso sotto la spinta di fattori<br />
esogeni. I ROS, resisi disponibili in grandi quantità,<br />
sono in grado di attaccare qualsiasi substrato con il<br />
quale giungono a contatto, strappando ad essi<br />
l’elettrone o gli elettroni necessari per raggiungere<br />
la propria stabilità. Ciò, a sua volta, innesca<br />
processi radicalici a catena che, se non bloccati<br />
tempestivamente, possono provocare gravi<br />
conseguenze sul piano, dapprima funzionale, poi<br />
anche strutturale (figura 2. 2).<br />
Anione superossido O .<br />
2<br />
Radicale idrossile HO*<br />
Radicale peridrossile HO 2 *<br />
Metallidi transizione/<br />
Sistemi enzimatici<br />
Agenti esterni, attività metabolica<br />
Substrati organici RH (glicidi, lipidi,<br />
amminoacidi, nucleotidi , etc.)<br />
Idroperossido R-OOH<br />
Radicale alcossile R-O*<br />
Radicale idroperossile R-OO*<br />
Alterazioni funzionali e/o strutturali della cellula<br />
Ossigeno singoletto 1 Ossigeno singoletto O2 Perossido di idrogeno H2O2 1O2 Perossido di idrogeno H2O2 Metallidi transizione/<br />
Sistemi enzimatici<br />
Superamento difese<br />
antiossidanti<br />
Figura 2. 2 Patogenesi dello stress ossidativo: aspetti biochimici<br />
Fra i vari meccanismi cito- ed isto-lesivi<br />
assume rilevante importanza quello correlato con<br />
la formazione degli idroperossidi (ROOH), una<br />
classe di derivati o metaboliti reattivi dell’ossigeno<br />
(reactive oxygen metabolites, ROM).<br />
Questo meccanismo, tipico delle reazioni<br />
radicaliche a catena, viene innescato dall’attacco,<br />
da parte di un ROS (per esempio, il radicale<br />
istolesivo *OH), di un generico substrato organico<br />
R-H (es. un glicide, un lipide, un amminoacido, un<br />
nucleotide ecc.) (figura 2. 3).<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
15<br />
R–H + HO* → R* + H2O<br />
R* + O2 → ROO*<br />
ROO* → ROOH + R1*<br />
R1* + R 1* → R1*–R1*<br />
Figura 2. 3 Reazioni radicaliche e produzione di perossidi<br />
Il radicale *OH, avendo un elettrone spaiato, è<br />
molto reattivo e, giunto a contatto con il substrato<br />
R-H, strappa a quest’ultimo un atomo di idrogeno<br />
per raggiungere la sua stabilità.<br />
In questo modo, però, il sito radicalico è ora<br />
trasferito al substrato che si trasforma in radicale<br />
R*. Quest’ultimo, in presenza di ossigeno<br />
molecolare, è convertito in radicale (idro)perossile<br />
ROO*, un nuovo radicale che, a sua volta, può<br />
attaccare un altro substrato organico R1H<br />
trasformandosi in idroperossido ROOH.<br />
La reazione a catena ormai innescata<br />
continuerà a partire dall’ultimo radicale generato<br />
(R1*), fino a quando non interverrà un meccanismo<br />
di terminazione (es. reazione di combinazione, R1*<br />
+ R1*, per produrre R1-R1) oppure un antiossidante.<br />
Il fenomeno della perossidazione – è bene<br />
ribadirlo – non è esclusivo dei lipidi, ma può<br />
interessare qualsiasi substrato organico, dagli<br />
amminoacidi alle proteine, dai carboidrati ai<br />
nucleotidi.<br />
Non v’è dubbio, tuttavia, che i lipidi,<br />
specialmente se insaturi, e, quindi, con doppietti di<br />
legame “disponibili” a soddisfare l’avidità di<br />
elettroni dei radicali liberi, costituiscano target<br />
importanti dell’attacco ossidativo, in particolar<br />
modo se inseriti nel contesto di biomembrane e,<br />
come tali, maggiormente esposti all’azione<br />
radicalica.<br />
La perossidazione lipidica segue lo schema<br />
generale delle reazioni radicaliche appena<br />
discusso, con la variante che, se ad essere colpito<br />
è un acido grasso poliinsaturo, quale l’acido<br />
arachidonico, ad essere attaccato dal radicale<br />
istolesivo HO* è uno dei doppi legami C-C.<br />
In questo caso specifico, la sottrazione di un<br />
atomo di iidrogeno da parte del radicale idrossile<br />
genera un radicale centrato sul carbonio, che<br />
rapidamente va incontro ad una redistribuzione dei<br />
doppi legami trasformandosi in diene coniugato.<br />
Quest’ultimo, in presenza di ossigeno si trasforma<br />
in radicale perossilico.<br />
Il radicale perossilico corrispondente<br />
rappresenta un composto chiave in questa<br />
sequenza di reazioni, perché può essere non solo<br />
trasformato in idroperossido, ma andare incontro,<br />
per la sua peculiare struttura chimica, ad ulteriore<br />
degradazione fino a malonildialdeide e, infine, a<br />
pentano, se sono disponibili ulteriori donatori di<br />
idrogeno (e, in ultima analisi, fino a completa<br />
utilizzazione del sistema antiossidante) (figura 2.<br />
4).
20<br />
H 3 C<br />
20<br />
H 3 C<br />
20<br />
H 3 C<br />
20<br />
H 3 C<br />
20<br />
H 3 C<br />
20<br />
H 3 C<br />
Figura 2. 4 Schema della perossidazione lipidica<br />
Comunque prodotti, gli idroperossidi sono<br />
sostanze relativamente stabili e conservano una<br />
discreta capacità ossidante. Pertanto, nella stessa<br />
cellula, se si rendono disponibili metalli di<br />
transizione allo stato libero, essi possono subire la<br />
reazione di Fenton e generare così i più reattivi<br />
radicali alcossile (RO*) e idroperossile (ROO*), che<br />
amplificano il danno all’interno della cellula.<br />
A causa della potenziale tossicità, si ritiene che<br />
gli idroperossidi vengano espulsi dalla cellula ed<br />
immessi nei fluidi circolanti, fra cui il sangue. Nel<br />
plasma, quindi, se esistono condizioni tali da<br />
indurre il rilascio di ferro allo stato ionico dalle<br />
proteine circolanti (es. un’acidosi transitoria), si<br />
innescherà la reazione di Fenton che genererà<br />
ancora una volta radicali alcossile e idroperossile<br />
che amplificheranno il danno a livello delle LDL e,<br />
soprattutto, dell’endotelio. In ogni caso, gli<br />
idroperossidi plasmatici, conservando, come nella<br />
cellula, ancora una discreta capacità ossidante ed<br />
essendo relativamente stabili, possono essere<br />
opportunamente messi in evidenza e quantificati<br />
(vedi oltre, d-<strong>ROMs</strong> test) (figura 2. 5).<br />
Agenti esterni<br />
*OH<br />
RH<br />
O 2<br />
Attività metabolica<br />
H O 2<br />
R*<br />
ROO*<br />
Danno<br />
ossidativo<br />
R 1 *<br />
R 1 H ROOH<br />
Respirazione<br />
Nucleo<br />
MDA<br />
16<br />
16<br />
16<br />
16<br />
15 14<br />
15 14<br />
15 14<br />
15<br />
14<br />
Danno<br />
ossidativo<br />
13<br />
13<br />
13<br />
13<br />
Citoplasma<br />
Cellula<br />
12 11<br />
12 11<br />
12 11<br />
12<br />
11<br />
O<br />
O<br />
15 13<br />
11<br />
16 14 12<br />
OH<br />
O<br />
15 13<br />
11<br />
16 14 12<br />
8<br />
*OH<br />
H 2 O<br />
O 2<br />
8<br />
8<br />
Transfer elettronico<br />
8<br />
8<br />
RH<br />
R<br />
8<br />
R-O-O-H R-O*<br />
Fe 3+<br />
Fe 2+ pH fl Fe 3+<br />
Fe 2+ pH fl<br />
OH- Ossidazione LDL<br />
OH- Ossidazione LDL<br />
R-O-O* R-O-O-H<br />
H +<br />
Danno H<br />
endoteliale<br />
+<br />
Danno<br />
endoteliale<br />
Vaso sanguigno (capillare)<br />
1<br />
COOH<br />
ROOH<br />
Cellula<br />
Figura 2. 5 Metabolismo ed effetti patogeni degli idroperossidi<br />
A tal riguardo, si dice che gli idroperossidi sono<br />
testimoni o marcatori ma anche amplificatori del<br />
danno cellulare da radicali liberi.<br />
Anche i livelli di malondialdeide (MDA) nel<br />
plasma o degli alcani (pentano o etano)<br />
nell’espirato forniscono informazioni sulla<br />
produzione di radicali liberi, ma solo quando il<br />
sistema antiossidante presente nel mezzo<br />
biologico si è esaurito.<br />
5<br />
5<br />
5<br />
5<br />
5<br />
5<br />
1 COOH<br />
1<br />
COOH<br />
1<br />
COOH<br />
1<br />
COOH<br />
Acido<br />
arachidonico<br />
Acido arachidonico<br />
radicale<br />
[Acido arachidonico<br />
radicale]<br />
Diene coniugato<br />
dell’acido arachidonico<br />
1<br />
COOH Radicale perossilico<br />
dell’acido arachidonico<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
Idroperossido<br />
(d-<strong>ROMs</strong> test)<br />
16<br />
Oltre agli idroperossidi, i ROS sono in grado di<br />
generare diversi prodotti e sottoprodotti di<br />
ossidazione reagendo con biomolecole target, le<br />
quali possono essere più o meno<br />
permanentemente modificate, frammentate o<br />
depolimerizzate. Tra questi sottoprodotti sono da<br />
segnalare le cloroammine.<br />
Infatti, diversi studi hanno dimostrato che il<br />
“respiratory burst” dei fagociti attivati (macrofagi e<br />
PMN) è in grado di produrre perossido di idrogeno<br />
sia in vitro che in vivo. Queste cellule possono<br />
anche rilasciare la mieloperossidasi, un enzima a<br />
ferro eminico che catalizza la reazione tra<br />
perossido di idrogeno e ione cloruro (già a<br />
concentrazioni fisiologiche) per produrre il potente<br />
ossidante acido ipocloroso (HClO).<br />
Tale sostanza gioca un ruolo importante<br />
nelle difese messe in atto dai mammiferi contro<br />
microrganismi patogeni, in quanto è dotata di<br />
potente attività battericida.<br />
E’ altresì noto, tuttavia, che un’eccessiva o<br />
inadeguata produzione di HClO provoca lesioni a<br />
carico dei tessuti nei mammiferi, e questo si ritiene<br />
essere importante in alcune patologie umane, quali<br />
l’aterosclerosi, le malattie infiammatorie croniche<br />
ed alcune forme di neoplasie.<br />
Numerosi studi hanno dimostrato che le<br />
proteine rappresentano i bersagli principali<br />
dell’azione dell’HClO, anche se questo potente<br />
ossidante reagisce con un ampia varietà di altre<br />
molecole organiche target, quali il DNA, i lipidi, il<br />
colesterolo, l’NADH, e i tioli.<br />
In particulare, è stato dimostrato mediante EPR<br />
che l’HClO reagisce con i gruppi amminici<br />
di amminoacidi e proteine per produrre<br />
cloroammine. Queste, a loro volta, si<br />
decompongono e generano radicali liberi,<br />
dimostrabili mediante tecniche di spin trapping<br />
combinate con l’EPR, quali i radicali perossilici ed<br />
alcossilici.<br />
Secondo l’ipotesi più accreditata, il carbonio<br />
alfa dell’amminoacido che ha subito l’attacco<br />
dell’acido ipocloroso trasformandosi in<br />
cloroammina, si trasforma in un sito radicalico. Il<br />
conseguente attacco dell’ossigeno genera un<br />
radicale perossilico che, dimerizzando, forma il<br />
tetrossido corrispondente. Dalla scissione di<br />
quest’ultimo originerebbero, con l’ossigeno<br />
molecolare, i radicali alcossilici.<br />
Il processo descritto, che è favorito ma non<br />
dipende dall’aggiunta di ioni ferro, sembra giocare<br />
un ruolo determinante nell’amplificare il danno<br />
ossidativo da radicali liberi nei fluidi extracellulari,<br />
quali il sangue, anche quando, appunto, non sono<br />
disponibili metalli di transizione allo stato libero.<br />
In ogni caso questa possibilità alternativa di<br />
produrre radicali perossilici e alcossilici rende<br />
ancora più importante il significato delle<br />
informazioni fornite dal d-<strong>ROMs</strong> test che, come<br />
verrà discusso dettagliatamente in seguito,<br />
consente di dosare non solo gli idroperossidi<br />
generati dalle “classiche” reazioni di
perossidazione, ma anche questi importantissimi<br />
marker di stress ossidativo generati dalla<br />
decomposizione delle cloroammine.<br />
Infine, fra gli altri meccanismi biochimici<br />
coinvolti nel danno da radicali liberi sono da citare<br />
la formazione di legami crociati, la condensazione<br />
di proteine, la depolimerizzazione<br />
dell’acido ialuronico, l’interruzione di uno o<br />
ambedue i filamenti del DNA, ecc (tabella 2. 4).<br />
Tabella 2. 4 Bersagli dei ROM e relativi prodotti di ossidazione<br />
Specie<br />
Molecola<br />
Prodotti di<br />
reattive<br />
bersaglio ossidazione<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale peridrossile<br />
Lipidi (PUFA) Idroperossidi lipidici<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale peridrossile<br />
Proteine<br />
Molecole con legami<br />
crociati, idroperossidi<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale peridrossile<br />
Acido jaluronico<br />
Glucosidi,<br />
idroperossidi<br />
Radicale idrossile DNA/RNA<br />
Filamenti interrotti,<br />
8-idrossiguanosina<br />
2. 3 Eziopatogenesi<br />
La produzione di specie reattive – si è detto –<br />
avviene in ben definiti siti cellulari:<br />
plasmamembrana, mitocondri, reticolo<br />
endoplasmatico liscio (microsomi), perossisomi e<br />
citosol.<br />
Va sottolineato che la generazione di ROS in<br />
ciascuno di questi siti e gli effetti che da essa ne<br />
scaturiscono assume caratteristiche peculiari in<br />
rapporto alla specificità dello stimolo ed alle<br />
modalità, qualità e quantità di specie reattive<br />
prodotte.<br />
E’ evidente che la produzione di ROS da parte<br />
dei PMN, conseguente ad attivazione della<br />
plasmamembrana, richiede stimoli diversi da quelli<br />
necessari per la generazione di specie reattive<br />
dalle cellule muscolari, associata all’attivazione del<br />
metabolismo mitocondriale.<br />
In linea di massima, infatti, uno stimolo<br />
flogistico tenderà prevalentemente ad attivare la<br />
plasmamembrana dei PMN laddove un intenso<br />
esercizio muscolare tenderà ad esaltare<br />
prevalentemente l’attività metabolica mitocondriale<br />
delle cellule muscolari.<br />
Ciascuna delle due situazioni, inoltre, è<br />
accompagnata dalla produzione di specie reattive<br />
almeno in parte diverse, per il diverso corredo<br />
enzimatico delle cellule e delle relative strutture<br />
subcellulari interessate.<br />
Per esempio, i mitocondri delle cellule<br />
muscolari, che non possiedono la mieloperossidasi<br />
non potranno generare HClO, che potrà essere<br />
prodotto solo dalla plasmamembrana dei PMN<br />
attivati. Infine, anche gli effetti sistemici delle due<br />
condizioni saranno diverse.<br />
Sulla base di queste considerazioni si può<br />
associare a ciascun sito cellulare coinvolto nella<br />
produzione di specie reattive un particolare tipo di<br />
stress ossidativo: indotto prevalentemente da<br />
modificazioni reattive della superficie cellulare,<br />
indotto prevalentemente da una ridotta efficienza<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
17<br />
della respirazione cellulare, secondario<br />
prevalentemente ad induzione farmacometabolica,<br />
indotto prevalentemente da variazioni della<br />
tensione intracellulare di ossigeno e da<br />
meccanismi multipli combinati (figura 2. 6).<br />
NADPH ossidasi<br />
Lipoossigenasi<br />
<strong>Stress</strong> ossidativo da<br />
modifiche reattive della<br />
superficie cellulare<br />
Xantina ossidasi<br />
Aldeide ossidasi<br />
<strong>Stress</strong> ossidativo da<br />
variazioni della<br />
pO 2 intracellulare<br />
NADH deidrogenasi<br />
Citotocromo ossidasi<br />
<strong>Stress</strong> ossidativo da<br />
ridotta efficacia della<br />
respirazione cellulare<br />
Citocromo P 450<br />
Citocromo b 5<br />
<strong>Stress</strong> ossidativo<br />
da induzione<br />
farmacometabolica<br />
Figura 2. 6 Fonti cellulari di ROS e stress ossidativo<br />
E’ evidente che questa impostazione<br />
rappresenta un’ipersemplificazione della ben più<br />
complessa e multiforme situazione biochimica che<br />
si osserva a livello cellulare, tissutale e sistemico<br />
nello stress ossidativo.<br />
Rimanendo nell’esempio comparativo appena<br />
discusso della plasmamembrana dei PMN e dei<br />
mitocondri delle cellule muscolari, non bisogna<br />
dimenticare che nelle condizioni disreattive, quali le<br />
infezioni, la febbre indotta dall’attivazione dei PMN<br />
si associa ad un’esaltazione del metabolismo e,<br />
viceversa, lo sforzo muscolare intenso può<br />
associarsi a condizioni infiammatorie, ritenute<br />
responsabili di lesioni traumatiche dell’apparato<br />
muscoloscheletrico.<br />
In altri termini, è difficile distinguere nettamente<br />
uno stress ossidativo indotto da modificazioni<br />
reattive della superficie cellulare da uno stress<br />
ossidativo indotto da ridotta efficienza della<br />
respirazione cellulare.<br />
Anzi, estendendo ancor di più il discorso, nella<br />
patogenesi del danno muscolare legato ad<br />
esercizio fisico strenuo entra in gioco anche il<br />
meccanismo dell’ischemia-riperfusione, che è alla<br />
base dello stress ossidativo da variazioni della pO2<br />
intracellulare.<br />
E’ per questo motivo che nella classificazione<br />
dei diversi tipi di stress ossidativo si è convenuto di<br />
usare la circumlocuzione “stress ossidativo indotto<br />
prevalentemente da…”.<br />
Pur nella consapevolezza degli inevitabili limiti<br />
legati ai tentativi di classificare i fenomeni biologici,<br />
l’individuazione di cinque pattern di stress<br />
ossidativo conserva, tuttavia, un’indubbia valenza<br />
didattica e concettuale e, pertanto, può essere di<br />
grande aiuto non solo al clinico, per<br />
l’inquadramento diagnostico del soggetto con<br />
compromissione del bilancio redox, ma anche al<br />
terapeuta, per orientare la scelta nel complesso<br />
labirinto delle opzioni terapeutiche attualmente<br />
disponibili (tabella 2. 5).
Tabella 2. 5 Pattern fondamentali dello stress ossidativo (SO)<br />
SO* Sito † Meccanismo † ROS/ROM Correlazioni<br />
I Membrana<br />
Generazione ac.<br />
arachidonico<br />
Idroperossidi, a.<br />
superossido<br />
Processi reattivi<br />
(infiammazione)<br />
Attivazione NADPH<br />
ossidasi<br />
A. superossido<br />
Processi reattivi<br />
(infiammazione)<br />
II Mitocondri<br />
Attivazione<br />
metabolica<br />
A. superossido<br />
Perossido di H<br />
Ipernutrizione,<br />
es. inadeguato<br />
Disfunzione A. superossido Mitocondriopatie<br />
mitocondriale Perossido di H (prim. o sec.)<br />
III Microsomi<br />
Attivazione citocromi<br />
P450/b5<br />
Varii<br />
Alcol, farmaci,<br />
xenobiotici<br />
IV Citosol<br />
Attivazione xantina<br />
ossidasi<br />
A. superossido<br />
Perossido di H<br />
Malattie da<br />
ischemiariperfusione<br />
V Almeno due Multipli<br />
Variabilmente<br />
centrati ‡<br />
Fumo,<br />
inquinanti,<br />
radiazioni<br />
I: SO prevalentemente da modifiche reattive della superficie cellulare; II:<br />
SO prevalentemente da ridotta efficacia della respirazione cellulare; III:<br />
SO prevalentemente da induzione farmaco-metabolica; IV: SO<br />
prevalentemente da variazioni della pO2 intracellulare; V: SO da<br />
meccanismi multipli. † Prevalente. ‡ Carbonio, azoto, cloro ecc<br />
Lo stress ossidativo indotto prevalentemente<br />
da modificazioni reattive della superficie cellulare è<br />
provocato dall’attivazione della plasmamembrana<br />
che, come si è detto, è sede di attività enzimatiche<br />
generatrici di ROS.<br />
Questo tipo di stress ossidativo è generato,<br />
nella sua forma più caratteristica, da una massiccia<br />
attivazione dei leucociti pomorfonucleati ad opera<br />
di batteri o endotossine o immunocomplessi.<br />
Questi agenti, infatti, legandosi alla<br />
plasmamembrana possono attivare l’NADPH<br />
ossidasi, con produzione di anione superossido<br />
(figura 2. 7).<br />
Figura 2. 7 Produzione di specie reattive da PMN attivati<br />
Anche l’attivazione delle lipoossigenasi,<br />
localizzate sulla plasmamembrana dei PMN, si<br />
accompagna a produzione di perossidi (figura 2. 8).<br />
H + H +<br />
Batteri<br />
MPx MPx<br />
1 2 4<br />
3<br />
H H<br />
cis, cis-1,4-pentadiene<br />
H<br />
PLA 2<br />
H 2 O 2<br />
Figura 2. 8 Produzione di perossidi lipoossigenasi-dipendente<br />
5<br />
Idroperossido<br />
PL AA PG<br />
O OO2 2<br />
O – O<br />
O – O<br />
O – OH<br />
SOD SOD<br />
Fenton/HW Fenton/HW<br />
ROOH<br />
Fe/Cu<br />
NADPH-Ox NADPH-Ox<br />
O 2<br />
Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ Fe/Cu<br />
.<br />
Proteasi<br />
O 2<br />
Cl- H2O R-NH Cl<br />
2<br />
RH H2O -<br />
H2O R-NH2 RH H2O HClO OH .<br />
R-NHCl HClO OH R*<br />
.<br />
R-NHCl R*<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
18<br />
Lo stress ossidativo da modificazioni reattive<br />
della superficie cellulare è tipico dei processi<br />
reattivi, quali infezioni (es. batteriche) e<br />
infiammazioni (es. artrite reumatoide).<br />
Lo stress ossidativo indotto prevalentemente<br />
da una ridotta efficienza della respirazione cellulare<br />
è provocato da un’alterazione della funzionalità dei<br />
mitocondri che, come è noto, costituiscono una<br />
delle fonti primarie di produzione di ROS. Nel caso<br />
più semplice, l’aumentata produzione di specie<br />
reattive è legata ad un’eccessiva attivazione<br />
metabolica, quale si riscontra ad esempio durante<br />
lo sforzo fisico intenso o nell’iperalimentazione; in<br />
questo caso le specie reattive maggiormente<br />
prodotte sono i prodotti di riduzione non<br />
tetravalente dell’ossigeno, quali l’anione<br />
superossido e il perossido d’idrogeno. E’ anche<br />
possibile che un aumento della produzione di ROS<br />
per ridotta efficienza della respirazione cellulare sia<br />
legato ad una patologia primaria dei mitocondri<br />
ovvero all’innescarsi di un circolo vizioso<br />
(attivazione metabolica → produzione di ROS da<br />
shunt elettronico → disfunzione mitocondriale →<br />
riduzione dell’efficienza respiratoria → ulteriore<br />
produzione di ROS da shunt elettronico).<br />
Lo stress ossidativo secondario<br />
prevalentemente ad induzione farmacometabolica<br />
è provocato da un’attivazione del sistema di<br />
idrossilazione a funzione disintossicante del<br />
citocromo P450. Ne sono frequenti cause l’etilismo<br />
cronico e l’esposizione a xenobiotici. In questi casi<br />
possono essere prodotte specie reattive anche non<br />
centrate sull’ossigeno (es. il radicale del<br />
paracetamolo, un comunissimo antipiretico e<br />
analgesico).<br />
Lo stress ossidativo indotto prevalentemente<br />
da variazioni della tensione intracellulare di<br />
ossigeno è tipico delle lesioni da ischemiariperfusione<br />
che si osservano nell’infarto e in<br />
seguito ad interventi di rivascolarizzazione<br />
chirurgica o trapianto di organi.<br />
Si ritiene che in questi casi entri in gioco<br />
l’attivazione della xantina ossidasi con produzione<br />
di perossido di idrogeno e anione superossido<br />
(figura 2. 9).<br />
Infarto, bypass, trapianti<br />
Macroischemia<br />
Microischemia<br />
pO 2 ↓<br />
Acidosi<br />
Sedentarietà<br />
Deficit pompe<br />
Disponibilità ossigeno ↓<br />
Lattato ↑<br />
Cellula<br />
Glicolisi<br />
Stato ridotto mitocondri ↑<br />
anaerobica ↑<br />
Rilascio F e2+ / 3+<br />
Amplificazione del danno<br />
Rilascio F<br />
dalle proteine<br />
e2+ / 3+<br />
Amplificazione del danno<br />
Rilascio F<br />
dalle proteine<br />
e2+ / 3+<br />
Amplificazione del danno<br />
dalle proteine<br />
Fosforilazione<br />
ossidativa ↓<br />
Creatina ↑ Osmolarit à ↑<br />
Creatina -P↓<br />
Sintesi ATP ↓ Decompartimentalizzazione<br />
Disorganizzazione citoscheletro<br />
ADP ↑<br />
Attacco substrati<br />
organici<br />
AMP ↑<br />
IMP ↑<br />
H 2O2↑<br />
.<br />
O2 ↑<br />
ROO* RO*<br />
ROOH ↑<br />
ROOH<br />
Inosina ↑ Ipoxantina Xantina<br />
Xantina<br />
Ossidasi<br />
Acido urico<br />
Vaso sanguigno<br />
Calcio ↑<br />
citosolico<br />
Attivazione<br />
proteasi<br />
Deficit pompe<br />
Danno<br />
membrana<br />
Alterazioni<br />
omeostasi ionica<br />
Xantina<br />
deidrogenasi<br />
Figura 2. 9 Meccanismi del danno da ischemia-riperfusione
Infine, il fumo di sigaretta, l’esposizione ad<br />
inquinanti atmosferici o a radiazioni ionizzanti o UV<br />
ovvero ad agenti tossici saranno responsabili di<br />
uno stress ossidativo conseguente all’attivazione di<br />
meccanismi multipli combinati.<br />
2. 4 <strong>Stress</strong> ossidativo e invecchiamento<br />
Nel corso degli ultimi decenni sono state<br />
formulate almeno 20 ipotesi per spiegare le cause<br />
e i meccanismi dell’invecchiamento, da quella di<br />
una modifica delle proteine (anomalie della sintesi<br />
– modifiche post-traduzionali – alterazioni del<br />
turnover), a quella dell'incapacità nel riparare i<br />
danni al DNA, fino a quella dei pace-maker (in<br />
base alla quale alcuni organi o sistemi perdendo<br />
funzionalità trascinano nell'invecchiamento).<br />
Ovviamente, l’aspetto genetico, costituisce la<br />
base di molte di queste ipotesi: non a caso si dice<br />
che il metodo più sicuro per andare avanti con gli<br />
anni è avere dei genitori longevi.<br />
Tuttavia, un ruolo decisamente importante<br />
sembra essere svolto anche da alcuni cofattori,<br />
apparentemente acquisiti, quali, ad esempio, il<br />
sovrappeso, l’eccesso calorico e l’attività fisica<br />
inadeguata, tutti in qualche modo correlati con la<br />
produzione di radicali liberi. Non è escluso,<br />
pertanto, che lo stress ossidativo, attraverso anche<br />
questa via, oltre a quelle note (danno primario a<br />
carico di molecole target essenziali, quali il DNA e<br />
le proteine) possa contribuire alla riduzione della<br />
longevità.<br />
Infatti, è noto che la condizione di sovrappeso<br />
favorisce la rottura del bilancio redox, laddove la<br />
restrizione calorica e l'attività fisica costante (di tipo<br />
"salutistico") tendono a riequilibrarlo.<br />
In particolare, il sovrappeso – valutabile<br />
mediante il cosiddetto indice di massa corporea,<br />
IMC o BMI, che esprime il rapporto tra peso in Kg e<br />
quadrato dell'altezza in cm – è un noto fattore che<br />
riduce la sopravvivenza in entrambi i sessi. Indici di<br />
massa corporea tra 19 e 21.9 (considerando la<br />
normalità a 22.5) si sono dimostrati associati a un<br />
basso rischio di mortalità, mentre indici più elevati<br />
sono apparsi correlati ad un rischio maggiore.<br />
Curiosamente, si è anche osservato che il<br />
rischio relativo di mortalità correlato alla massa<br />
corporea è più basso negli anziani rispetto ai<br />
giovani. Ad ogni modo, è noto come la massa<br />
corporea si possa controllare attraverso l'attività<br />
fisica e la restrizione calorica.<br />
Negli animali da laboratorio, la restrizione<br />
calorica favorisce la longevità e riduce la morbilità,<br />
soprattutto quella legata a patologie cardiovascolari<br />
e tumorali. Il fenomeno è decisamente da correlarsi<br />
sia alla ridotta produzione di radicali liberi a livello<br />
mitocondriale sia all’aumentata efficienza, in<br />
queste condizioni, dei sistemi di difesa<br />
antiossidanti, fattori, entrambi, in grado di ridurre<br />
l’entità dello stress ossidativo. Infatti, come verrà<br />
discusso in seguito, i soggetti in sovrappeso<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
19<br />
presentano al d-<strong>ROMs</strong> test, rispetto ai normopeso,<br />
livelli significativamente più alti di idroperossidi.<br />
L’attività fisica gioca un ruolo decisivo nel<br />
rompere o riequilibrare il bilancio redox e, dunque,<br />
nel favorire o rallentare l’invecchiamento,<br />
rispettivamente.<br />
Infatti, l’attività fisica intensa e concentrata nel<br />
tempo favorisce un temporaneo aumento del livello<br />
di radicali liberi da attivazione mitocondriale,<br />
proprio in coincidenza del momento in cui<br />
incrementa il consumo di O2 sotto sforzo. Poiché la<br />
domanda di ossigeno non può essere soddisfatta<br />
dalla richiesta, si crea una situazione comparabile<br />
ad una riduzione del flusso sanguigno (ischemia).<br />
Subentrando una condizione di parziale<br />
anaerobiosi, i livelli muscolari di ipoxantina<br />
aumentano. Infine, nel momento in cui il flusso<br />
sanguigno diviene in grado di soddisfare la<br />
richiesta di ossigeno (riperfusione) la concomitante<br />
attivazione della xantina ossidasi favorisce la<br />
conversione dell’ipoxantina in xantina ed acido<br />
urico, con produzione di anione superossido e<br />
perossido di idrogeno.<br />
Viceversa, l’attività fisica regolare e costante,<br />
stimola nell'individuo allenato, ovvero abituato allo<br />
sforzo, l’attivazione dei sistemi antiossidanti<br />
fisiologici e migliora le capacità di tamponamento<br />
dell'acidosi, riducendo, di fatto la gravità e<br />
l’intensità dello stress ossidativo comunque<br />
prodotto.<br />
Nelle persone anziane, come è noto, la spesa<br />
energetica totale (TEE, total energy expenditure)<br />
appare ridotta, principalmente per diminuzione<br />
dell'attività fisica ma anche, seppur in grado<br />
minore, del metabolismo basale (BMR, basal<br />
metabolic rate). Non si osservano, invece, riduzioni<br />
significative dell'effetto termico dell'alimentazione<br />
(TEF, termic effect of feeding), il quale ha una forte<br />
correlazione con il consumo di ossigeno e quindi<br />
con la produzione di radicali liberi. Sembrerebbe<br />
verificarsi lo stesso fenomeno dello sforzo fisico nel<br />
soggetto non allenato, ovvero l'inerzia dei sistemi<br />
antiossidanti che prolunga, in questo caso, l'effetto<br />
dell'impatto calorico. D’alra parte, nell'anziano si<br />
verifica il ben noto decremento della massa<br />
muscolare (LBN, lean body mass) con incremento<br />
della massa lipidica in ambedue i sessi. I fattori<br />
coinvolti in questi eventi dipendono almeno in parte<br />
dall'attività fisica e dalla diminuzione del GH<br />
(growth hormon). Di fatto, aumentando l'attività<br />
fisica si può riportare la LBM a livelli simili a quelli<br />
dell'età giovanile. All'appropriata attività fisica,<br />
conseguirà il benessere di tutto l'apparato<br />
cardiovascolare e quindi una riduzione della<br />
morbilità e mortalità cardiovascolare, con favorevoli<br />
ripercussioni, in definitiva, sulla longevità.<br />
In conclusione, la riduzione dello stress<br />
ossidativo – ottenuta mediante il controllo del peso<br />
corporeo, la restrizione calorica e l’adeguata attività<br />
fisica – sia attraverso dei meccanismi diretti (più<br />
efficiente controllo dell’equilibrio redox) che indiretti<br />
(riduzione della morbilità e della mortalità) può
contribuire efficacemente al rallentamento del<br />
fisiologico processo dell’invecchiamento.<br />
2. 5 <strong>Stress</strong> ossidativo e malattie<br />
2. 5. 1 Premessa<br />
L’intervento dei radicali liberi è stato chiamato<br />
in causa nella patogenesi di almeno 50 diverse<br />
malattie. Anche se in molti casi la formazione dei<br />
radicali è secondaria all’evento patogeno primario,<br />
l’innesco di reazioni a catena a partire dalle specie<br />
reattive comunque prodotte può contribuire ad<br />
aggravare il danno cellulare, anche attraverso un<br />
vero e proprio effetto “tossico”.<br />
I radicali liberi sono coinvolti direttamente nel<br />
danno cellulare e tissutale che si riscontra nella<br />
malattia aterosclerotica, nel diabete mellito, nelle<br />
malattie su base infiammatoria, in corso di tumori e<br />
in alcune epato- e broncopneumopatie. In<br />
generale, tuttavia, non vi è patologia umana nella<br />
quale non sia documentabile un qualche ruolo<br />
patogeno delle specie reattive dell’ossigeno<br />
(nefropatie, endocrinopatie, malattia di Alzheimer,<br />
malattia di Parkinson, colite ulcerosa, pancreatite,<br />
malattie metaboliche, ecc.).<br />
2. 5. 2 Radicali liberi e malattie cardiovascolari<br />
Le malattie cardiovascolari rappresentano<br />
attualmente la principale causa di morte nei Paesi<br />
Occidentali e, in particolare, in quelli Europei e<br />
Nordamericani. Alla base della maggior parte delle<br />
malattie cardiovascolari note, quali l’ictus cerebrale<br />
e l’infarto del miocardio, vi è l’aterosclerosi. Con<br />
questo termine intendiamo una patologia<br />
generalmente a distribuzione sistemica<br />
caratterizzata da un ispessimento dell’intima o, in<br />
generale, dello strato dell’arteria prospiciente il<br />
lume vasale.<br />
Sono stati descritti tre tipi di ispessimento o<br />
“placche”, di gravità crescente: placche<br />
ateromasiche, placche fibrose e placche<br />
complicate.<br />
Le placche ateromasiche si presentano come<br />
sollevamenti più o meno pronunciati dell’intima,<br />
disposti lungo il maggior asse del vaso, di colorito<br />
giallognolo. All’esame microscopico appaiono<br />
costituite da “foam cells”, cellule ricche di lipidi che<br />
possono derivare sia dalle cellule della<br />
muscolatura liscia che dai macrofagi.<br />
Le placche fibrose, probabilmente derivate<br />
dalla degenerazione dei depositi lipidici delle<br />
placche ateromasiche, appaiono come lesioni più o<br />
meno tondeggianti, del diametro di circa 1 cm,<br />
generalmente biancastre. Una tipica placca fibrosa<br />
consiste di un “tappo” fibroso, costituito da cellule<br />
della muscolatura liscia e tessuto connettivo<br />
contenente collagene, elastina e proteoglicani, che<br />
copre un’area ricca di macrofagi, cellule muscolari<br />
lisce, linfociti T, e da un “core” necrotico più<br />
profondo, che contiene detriti cellulari, depositi<br />
lipidici extracellulari e cristalli di colesterolo. La<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
20<br />
placca fibrosa è in grado di avviare l’ostruzione del<br />
vaso dalla cui parete si sviluppa.<br />
Le placche complicate, infine, sono<br />
probabilmente placche fibrose alterate da necrosi,<br />
deposizione di calcio, emorragie e trombosi,<br />
fenomeni nei quali gioca un ruolo determinante la<br />
cascata infiammatoria. L’ischemia cerebrale e<br />
l’infarto del miocardio avvengono quando il lume di<br />
un’arteria con caratteristiche di vaso terminale<br />
viene occluso completamente, generalmente da un<br />
trombo che si è formato sulla placca.<br />
I radicali liberi giocano un ruolo determinante<br />
nella patogenesi delle lesioni aterosclerotiche<br />
attraverso l’ossidazione delle LDL. Questo<br />
processo è innescato dalle cellule endoteliali<br />
arteriose, dalle cellule della muscolatura liscia e dai<br />
macrofagi. L’ossidazione delle LDL, a sua volta,<br />
porta alla degradazione degli acidi grassi<br />
poliinsaturi con la coniugazione dei corrispondenti<br />
frammenti ai fosfolipidi e all’apoproteina B.<br />
Quest’ultima, successivamente, va incontro a sua<br />
volta a frammentazione e, modificando la sua<br />
conformazione, viene riconosciuta dai recettori<br />
scavenger presenti sulla membrana dei<br />
monociti/macrofagi e, quindi, fagocitata da questi<br />
ultimi. L’espressione dei suddetti recettori, però, al<br />
contrario di quanto si osserva per i comuni recettori<br />
per le LDL, non è modulata da alcun meccanismo<br />
di “down-regulation”, per cui i macrofagi,<br />
inglobando progressivamente LDL ossidate, si<br />
trasformano in foam cells ricche di grassi.<br />
L’accumulo di queste cellule nello spazio<br />
subendoteliale danneggia l’endotelio sovrastante<br />
rendendo possibile l’aggregazione delle piastrine e<br />
il rilascio di potenziali mitogeni che contribuiscono<br />
a favorire lo sviluppo della lesione. Le LDL<br />
ossidate, dal canto loro, hanno delle proprietà che<br />
le rendono più aterogenetiche delle LDL native:<br />
sono citotossiche, inducono l’espressione di<br />
molecole di adesione e la produzione di sostanze<br />
chemiotattiche, inibiscono l’attività di fattori di<br />
rilasciamento endotelio-dipendenti, incrementano<br />
l’espressione di fattori tissutali, attivano le piastrine<br />
e le cellule T, e stimolano la crescita delle cellule<br />
muscolari lisce, l’inibitore dell’attivatore del<br />
plasminogeno e, più in generale, la reazione<br />
immmunitaria.<br />
Il danno da radicali liberi nelle malattie<br />
cardiovascolari, comunque, non si esaurisce nel<br />
favorire lo sviluppo dell’aterosclerosi. Infatti, le<br />
evidenze accumulatesi nel corso degli ultimi<br />
trent’anni hanno dimostrato un ruolo chiave delle<br />
specie reattive nella patogenesi delle lesioni<br />
tissutali da cardiovasculopatie anche attraverso<br />
l’induzione del cosiddetto danno “da ischemiariperfusione”.<br />
Infatti, durante la riperfusione di<br />
tessuti ischemici, si possono formare specie<br />
reattive dell’ossigeno, attraverso l’attivazione della<br />
xantina ossidasi. Come è noto, nel tessuto<br />
normale, questo enzima agisce come deidrogenasi<br />
trasferendo una coppia di equivalenti riducenti<br />
(elettroni) al NAD + trasformando la xantina in
ipoxantina e quest’ultima in acido urico. Nel corso<br />
di un’ischemia sufficientemente protratta,<br />
probabilmente per effetto dell’ossidazione di alcuni<br />
gruppi tiolici e/o di una proteolisi limitata calciodipendente,<br />
la xantina ossidasi può modificare la<br />
sua attività catalitica acquisendo la capacità, nella<br />
successiva fase di riperfusione, di trasferire gli<br />
elettroni direttamente all’ossigeno molecolare, con<br />
produzione di anione superossido. All’enorme<br />
accumulo di questa specie reattiva è, dunque,<br />
riconducibile il danno da ischemia-riperfusione,<br />
proprio nel momento in cui l’ossigeno viene<br />
reintrodotto nei tessuti ischemici. Questo<br />
meccanismo gioca un ruolo determinante nelle<br />
lesioni osservate in corso di ischemia cerebrale e<br />
dopo infarto del miocardio.<br />
2. 5. 2 Radicali liberi e diabete mellito<br />
La maggior parte delle evidenze finora<br />
accumulate sul ruolo dei radicali liberi<br />
nell’eziopatogenesi del diabete riguarda il diabete<br />
mellito di tipo 2, lo stadio finale di una sindrome<br />
cronica e progressiva causata da diverse<br />
combinazioni di insulino-resistenza e riduzione<br />
della funzione delle cellule pancreatiche, dovuta a<br />
danni di natura genetica o acquisita.<br />
Il diabete mellito di tipo 2 rappresenta solo la<br />
“punta dell’iceberg” di disturbi metabolici di lunga<br />
durata in grado di esercitare effetti deleteri su<br />
tessuti ed organi. Una diagnosi tempestiva e un<br />
trattamento adeguato dei pazienti può essere utile<br />
per evitare le complicanze tardive del diabete<br />
preservando la qualità della vita del paziente.<br />
I radicali liberi giocano un ruolo rilevante nella<br />
patogenesi del diabete mellito di tipo 2. In questa<br />
condizione morbosa, infatti, accanto all’aumentata<br />
produzione di specie reattive dell’ossigeno,<br />
secondaria all’iperglicemia e/o all’aumentata<br />
resistenza insulinica, si osserva<br />
contemporaneamente anche una riduzione delle<br />
difese antiossidanti, fino a configurare il classico<br />
quadro fisiopatologico dello stress ossidativo. Si<br />
ritiene che le specie radicaliche siano in grado di<br />
compromettere l’azione dell’insulina, contribuendo<br />
a far aumentare la glicemia, mentre l’iperglicemia e<br />
l’insulino-resistenza, da sole, possono favorire lo<br />
stress ossidativo (la prima, in particolare, riducendo<br />
l’efficienza delle difese antiossidanti).<br />
Schematizzando al massimo il discorso, quindi, i<br />
radicali liberi sono coinvolti nella patogenesi del<br />
diabete mellito di tipo 2 almeno attraverso due<br />
meccanismi fondamentali: l’iperglicemia e<br />
l’insulino-resistenza.<br />
L’iperglicemia è ritenuta una delle principali<br />
cause responsabili dell’aumento della<br />
concentrazione plasmatica di radicali liberi nel<br />
diabete mellito. Tre i meccanismi postulati alla<br />
base dell’aumenta produzione di specie reattive<br />
dell’ossigeno: la glicazione non enzimatica,<br />
l’autoossidazione del glucosio e l’attivazione<br />
intracellulare della via dei polioli.<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
21<br />
La glicazione non enzimatica è legata alle<br />
proprietà chimiche intrinseche del glucosio.<br />
Quest’ultimo, infatti, è una poliossialdeide e, come<br />
tale, conserva la reattività del suo gruppo<br />
carbonilico nei confronti dei gruppi amminici di<br />
amminoacidi, proteine e nucleotidi. Tra i prodotti di<br />
questa reattività, sono da segnalare i cosiddetti<br />
AGE (advanced glycation end products) la cui<br />
formazione è favorita dalle specie reattive<br />
dell’ossigeno. Il significato patogenetico di questi<br />
fenomeni è notevole, se si pensa che l’accumo di<br />
AGE si accompagna a danni microvascolari in<br />
distretti critici (retina, nervi periferici, rene).<br />
Il glucosio, sempre per le sue intrinseche<br />
proprietà chimiche, può autoossidarsi, generando<br />
direttamente radicali liberi e altre sostanze<br />
ossidanti. Come altri monosaccaridi, infatti, esso<br />
può subire l’azione catalitica di tracce di metalli di<br />
transizione allo stato libero (es. ferro o rame)<br />
generando radicale idrossile, anione superossido,<br />
perossido di idrogeno e derivati carbonilici tossici.<br />
Questi ultimi contribuiscono notevolmente ad<br />
amplificare il danno ossidativo a carico di altri<br />
target molecolari, quali le proteine.<br />
L’attivazione intracellulare della via dei polioli è<br />
secondaria all’aumentata disponibilità di glucosio<br />
intracellulare libero che, non potendo essere<br />
metabolizzato attraverso la glicolisi a causa del<br />
deficit insulinico, è trasformato dall’aldoso reduttasi<br />
in sorbitolo. Quest’ultimo si accumula nella cellula<br />
e, convertito in fruttosio dalla sorbitolodeidrogenasi,<br />
provoca un aumento del rapporto<br />
NADH/NAD + citosolico. La suddetta alterazione del<br />
bilancio redox (pseudoipossia iperglicemica)<br />
favorisce la produzione di anione superossido<br />
attraverso la riduzione della PGG2 a PGH2 da parte<br />
della prostaglandina idroperossidasi NADHdipendente.<br />
L’insulino-resistenza, che provoca i suoi effetti<br />
più deleteri soprattutto a livello del fegato e del<br />
muscolo scheletrico, si associa ad un aumentato<br />
livello di perossidazione lipidica, almeno in modelli<br />
animali. A questo proposito, in colture di adipociti,<br />
si è osservato che l’insulina fa aumentare la<br />
produzione di perossido di idrogeno il quale, a sua<br />
volta, sembra in grado di mimare l’azione<br />
dell’ormone stesso; infatti, la somministrazione di<br />
vanadio riproduce l’azione mediata dall’insulina<br />
attraverso il rilascio intracellulare di radicali liberi.<br />
D’altra parte, l’iperinsulinemia, in vivo, riduce le<br />
concentrazioni di vitamina E. Nel complesso,<br />
queste osservazioni suggeriscono, dunque, che<br />
livelli aumentati di insulina, tipici dell’insulinoresistenza,<br />
possono provocare stress ossidativo.<br />
A conclusione di questa breve panoramica,<br />
occorre sottolineare che i radicali liberi possono<br />
assumere un ruolo determinante nella patogenesi<br />
non solo della malattia diabetica in sé ma anche<br />
delle complicanze ad essa legate, quali le<br />
cardiovasculopatie, la neuropatia, la embriofetopatia,<br />
ecc. In particolare, è noto che i pazienti<br />
diabetici presentano un deficit dell’attività
microbicida, probabilmente riconducibile ad una<br />
difettosa funzione fagocitaria (ridotta produzione di<br />
specie reattive da parte dei leucociti<br />
polimorfonucleati).<br />
In ultimo, l’aumentata produzione di radicali<br />
liberi e/o la ridotta efficienza dei meccanismi di<br />
difesa antiossidanti osservati nel diabete mellito di<br />
tipo 2 possono accelerare il fisiologico processo di<br />
invecchiamento riducendo ulteriormente<br />
l’aspettativa di vita dei pazienti.<br />
2. 5. 3 Ruolo dei radicali liberi in oncologia<br />
L’intervento delle specie reattive dell’ossigeno<br />
è decisivo nei tumori indotti da radiazioni ionizzanti,<br />
da xenobiotici, da metalli e da composti chimici<br />
cancerogeni. In particolare, le radiazioni ionizzanti<br />
agiscono inducendo la fotolisi dell’acqua, che<br />
genera il radicale idrossile.<br />
Noto per la sua straordinaria capacità<br />
istolesiva, quest’ultimo, insieme ad altre specie<br />
reattive, è in grado di interrompere i filamenti di<br />
DNA o ossidarne le basi, producendo la 8idrossiguanosina.<br />
L’effetto mutageno che ne consegue può<br />
favorire la trasformazione neoplastica.<br />
Capitolo 2. Lo stress ossidativo. Aspetti fisiopatologici e clinici.<br />
22<br />
2. 5. 4 Ruolo dei radicali liberi nelle epatopatie<br />
Nel fegato hanno sede i sistemi enzimatici<br />
deputati al metabolismo dell’etanolo ed alla<br />
biotrasformazione degli xenobiotici, compresi i<br />
farmaci. In particolare, i microsomi degli epatociti<br />
sono direttamente responsabili della produzione di<br />
specie reattive nel modello di stress ossidativo da<br />
induzione farmacometabolica. Lo squilibrio fra<br />
status pro-ossidante e difese antiossidanti che ne<br />
consegue è ritenuto responsabile del danno<br />
cellulare che si osserva in corso di epatopatie<br />
alcoliche, da tossici e da farmaci.<br />
2. 5. 6 Radicali liberi e broncopneumopatie<br />
Nel corso dell’ultimo decennio si sono<br />
accumulate molte evidenze di ordine sperimentale<br />
e clinico che suggeriscono un ruolo cruciale del<br />
danno cellulare mediato da specie reattive nella<br />
patogenesi di svariate situazioni ed affezioni<br />
dell’apparato respiratorio. Lo spettro di tali<br />
condizioni va da semplici effetti del fumo di<br />
sigaretta nel soggetto normale ai danni cronici<br />
caratterizzati dalla distruzione dell’interstizio<br />
polmonare (enfisema polmonare) o, viceversa, da<br />
un suo irreversibile ispessimento (fibrosi<br />
intertsiziale da agenti esogeni o da iperossia) fino a<br />
manifestazioni acute che richiedono un trattamento<br />
intensivo (distress respiratorio dell’adulto).
Capitolo 3. Il ruolo del laboratorio nella valutazione dello stress ossidativo. Una overview.<br />
Capitolo 3<br />
Il ruolo del laboratorio nella valutazione dello stress ossidativo. Una overview.<br />
La valutazione dello stress ossidativo nei<br />
soggetti sani o in pazienti sottoposti a<br />
farmacoterapia è la condicio sine qua non per<br />
prevenire il danno tissutale e per monitorare<br />
l’andamento e la risposta al trattamento di una<br />
eventuale patologia in atto in tutte quelle situazioni<br />
correlate con la presenza di specie reattive.<br />
Le tecniche di laboratorio disponibili per<br />
identificare e quantificare un marcatore biochimico<br />
in un campione biologico prevedono generalmente<br />
una fase di estrazione che consenta il passaggio<br />
dell’analita di interesse dal materiale prelevato in<br />
un fluido con caratteristiche chimico-fisiche simili<br />
(per esempio estrazione dal siero dei lipoperossidi,<br />
sostanze liposolubili, in una soluzione cloroformiometanolo,<br />
in grado di sciogliere i grassi). Segue,<br />
poi, una fase di separazione più fine, durante la<br />
quale l’estratto (lipidico o acquoso), grazie ad<br />
opportune tecniche cromatografiche (in fase<br />
gassosa o in fase liquida ad alta risoluzione,<br />
HPLC) viene risolto in una serie di frazioni. Infine,<br />
grazie, all’impiego di idonei metodi di rivelazione<br />
(spettrometria di massa, spettrofotometria,<br />
fluorimetria, potenziometria, ecc) è possibile<br />
identificare, grazie ad uno standard noto, in quale<br />
delle frazioni si trova l’analita di interesse e, in<br />
definitiva, precisarne, con ragionevole sicurezza, la<br />
natura e la concentrazione.<br />
Purtroppo, questa metodologia solo raramente<br />
è applicabile nella routine clinica quando l’obiettivo<br />
della valutazione è lo stress ossidativo. Infatti, i<br />
radicali liberi sono, per definizione, specie chimiche<br />
estremamente reattive, a brevissima emivita, e<br />
l’unica tecnica in grado di evidenziarli è la<br />
spettroscopia di risonanza di spin dell’elettrone<br />
(ESR o EPR) che, eseguita talvolta con particolari<br />
accorgimenti (metodi di spin trap), costituisce il<br />
golden standard per valutazioni nel vivente.<br />
Sfortunatamente, però, l’ESR è una tecnica<br />
piuttosto complessa, richiede una strumentazione e<br />
delle professionalità non disponibili in tutti i<br />
laboratori, ed è particolarmente costosa, per cui<br />
viene utilizzata non per indagini di routine o studi di<br />
screening, quanto, piuttosto, per validare altri<br />
metodi di laboratorio, come accaduto, per esempio,<br />
proprio con il d-<strong>ROMs</strong> test (vedi più avanti).<br />
Anche quando correttamente eseguita,<br />
comunque, l’ESR fornisce informazioni solo sulla<br />
componente pro-ossidante dello stress ossidativo e<br />
non su quella antiossidante. Si è ripetutamente<br />
sottolineato, invece, che lo stress ossidativo è la<br />
conseguenza della rottura di un equilibrio tra<br />
produzione di specie reattive ed efficienza dei<br />
sistemi di difesa antiossidanti. Questo squilibrio<br />
porta ad un eccesso di metaboliti reattivi<br />
23<br />
dell’ossigeno, quali gli idroperossidi (ROOH) che,<br />
versati in circolo, vanno a costituire i marcatori e gli<br />
amplificatori del danno tissutale e, in definitiva, i<br />
responsabili ultimi, insieme ad altri prodotti di<br />
ossidazione, dell’invecchiamento e delle patologie<br />
correlate con lo stress ossidativo.<br />
Sulla base di queste considerazioni preliminari,<br />
è opportuno che la valutazione di laboratorio dello<br />
stress ossidativo sia “globale”, cioè tenga conto sia<br />
della componente pro-ossidante che di quella antiossidante,<br />
anche alla luce del ruolo, finora<br />
ripetutamente sottolineato degli idroperossidi quali<br />
marcatori ed amplificatori del danno cellulare<br />
(figura 3. 1).<br />
Aumentata produzione di<br />
specie reattive<br />
(O2 . , HO . , H2O2…)<br />
Compromissione della<br />
barriera antiossidante<br />
(ascorbato, SOD,…)<br />
Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi<br />
R-OOH<br />
(una classe di ROM)<br />
Idroperossidi (marker, testimoni e amplificatori del danno<br />
cellulare) nei liquidi extracellulari<br />
Invecchiamento e malattie correlate con lo stress ossidativo<br />
(ictus, infarto, diabete, obesità, demenza, m. Parkinson, tumori…)<br />
Figura 3. 1 Valutazione dello stress ossidativo e idroperossidi<br />
In realtà, i test di laboratorio attualmente<br />
disponibili esplorano o la componente proossidante<br />
(produzione di specie reattive) o la<br />
componente anti-ossidante (attività antiossidante)<br />
dello stress ossidativo (tabella 3. 1).<br />
Tabella 3. 1 Comuni metodi di laboratorio<br />
per la valutazione dello stress ossidativo<br />
Status proossidante Status antiossidante<br />
d-<strong>ROMs</strong> test OXY-Adsorbent test<br />
TBAR (MDA) BAP<br />
Lipoperossidi TAS<br />
Isoprostani -SHp test<br />
Chemiluminescenza Dosaggio singoli antiossidanti<br />
Poichè, come si è detto, l’ESR non è<br />
utilizzabile di routine, la valutazione dello status<br />
pro-ossidante di un individuo viene abitualmente<br />
eseguita con una serie di metodiche che alcuni<br />
ricercatori hanno battezzato con il termine di<br />
“fingerprinting” (impronta digitale). Secondo questo<br />
approccio, la presenza in un organismo vivente di<br />
specie reattive, non altrimenti misurabili<br />
routinariamente, viene dedotta indirettamente,<br />
grazie alla documentazione (nei tessuti e/o nei<br />
liquidi extracellulari) della presenza di specie<br />
molecolari variamente modificate dall’attacco dei
Capitolo 3. Il ruolo del laboratorio nella valutazione dello stress ossidativo. Una overview.<br />
radicali liberi. In tale contesto, poiché la<br />
perossidazione è uno dei più comuni meccanismi<br />
del danno indotto dai ROS, il dosaggio degli<br />
idroperossidi fornisce un’indicazione molto<br />
affidabile dello status pro-ossidante di un individuo.<br />
E, più in generale, la documentazione nei fluidi<br />
biologici della presenza di idroperossidi, così come<br />
di MDA o di isoprostani, fornisce “l’impronta<br />
digitale” più o meno accurata e fedele della<br />
componente ossidante dello stress ossidativo di un<br />
individuo.<br />
I test per la valutazione della componente<br />
antiossidante mirano generalmente a determinare<br />
lo “spessore” o “potere” o “attività” della barriera<br />
antiossidante plasmatica nel suo complesso e, in<br />
alcuni casi specifici, a quantificarne alcune<br />
importanti componenti, quali ad esempio i gruppi<br />
tiolici o singoli antiossidanti (es. ascorbato,<br />
tocoferoli). Tale valutazione si rende necessaria<br />
ogni qualvolta si sospetti una situazione di stress<br />
ossidativo (anche a fronte di valori normali o<br />
addirittura ridotti di test dello status proossidante)<br />
e, più in generale, ogni qualvolta si intende<br />
monitorare una terapia antiossidante.<br />
Uno dei pannelli particolarmente utili nella<br />
valutazione globale dello stress ossidativo è quello<br />
sviluppato da Diacron International sas e che<br />
comprende un test per la determinazione dello<br />
status pro-ossidante (il d-<strong>ROMs</strong> test) e tre test per<br />
la determinazione dello status antiossidante (OXYadsorbent<br />
test, BAP test ed -SHp test) (figura 3. 2).<br />
Aumentata produzione di<br />
metaboliti reattivi<br />
d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Compromissione barriera<br />
antiossidante<br />
OXY-, BAP,SHp test<br />
Valutazione globale<br />
dello stress ossidativo<br />
Prevenzione e monitoraggio delle<br />
patologie correlate allo stress ossidativo<br />
Figura 3. 2 La valutazione globale dello stress ossidativo<br />
24<br />
Più specificamente, tale pannello prevede la<br />
determinazione per via spettrofotometrica sia dei<br />
metaboliti reattivi dell’ossigeno (d-<strong>ROMs</strong> test) sia<br />
della barriera antiossidante plasmatica (Oxy–<br />
Adsorbent test, BAP e –SHp test) in campioni<br />
biologici (a seconda dei casi, sangue intero,<br />
plasma, siero, estratti tissutali o cellulari).<br />
Questi test possono essere eseguiti non solo<br />
con un comune fotometro (manualmente) ma<br />
anche con un analizzatore multiplo (in automatico).<br />
Tuttavia, l’aspetto più interessante e innovativo<br />
consiste nel fatto che è possibile eseguire in parte<br />
o tutto il pannello grazie ad apparecchi dedicati di<br />
facile uso, quali il sistema FREE (sviluppato da<br />
Diacron International, Grosseto) ed il sistema<br />
FRAS (sviluppato da Iram s.r.l., Parma). L’impiego,<br />
sempre consigliabile, di questi affidabili strumenti si<br />
impone, per ragioni di opportunità pratiche, quando<br />
non si dispone di un fotometro con le specifiche<br />
richieste (termostatazione, filtri per particolari<br />
lunghezze d’onda, ecc.) o quando si vuole<br />
approfondire specificamente le tematiche dello<br />
stress ossidativo senza impegnare altri fotometri<br />
necessari per l’esecuzione di altre analisi.<br />
I capitoli immediatamente seguenti si<br />
prefiggono l’obiettivo di presentare il pannello di<br />
test e gli strumenti dedicati sviluppi da Diacron<br />
International per la valutazione globale dello stress<br />
ossidativo.
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
Capitolo 4<br />
I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
4. 1 Il d-<strong>ROMs</strong> test<br />
4. 1. 1 Principio e validazione<br />
4. 1. 1. 1 Aspetti teorici<br />
Il d-<strong>ROMs</strong> test è un test spettrofotometrico che<br />
consente di determinare, in un campione biologico,<br />
la concentrazione degli idroperossidi (ROOH),<br />
generati nelle cellule dall’attacco ossidativo dei<br />
ROS su svariati substrati biochimici (glicidi, lipidi,<br />
amminoacidi, proteine, nucleotidi ecc.).<br />
La sigla ROM vuole sottolineare che gli analiti<br />
misurati dal test, gli idroperossidi, sono dei<br />
metaboliti reattivi dell’ossigeno (Reactive Oxygen<br />
Metabolites, ROM).<br />
Attraverso il d-<strong>ROMs</strong> test gli idroperossidi di un<br />
campione biologico, quale, ad esempio, il siero,<br />
dopo aver reagito con un apposito cromogeno<br />
sviluppano un derivato colorato (dal rosa al rosso)<br />
rilevabile e quantificabile per via spettrofotometrica.<br />
La concentrazione degli idroperossidi, che<br />
correla direttamente con l’intensità del colore<br />
rilevato, viene espressa in unità di concentrazione<br />
di facile impiego nella pratica clinica. Tali unità<br />
sono indicate con la sigla U CARR dal cognome<br />
del chimico pientino (Carratelli) che ha inventato e<br />
brevettato il d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Alla base del d-<strong>ROMs</strong> test vi è un meccanismo<br />
già descritto a proposito dell’innesco delle reazioni<br />
radicaliche a catena: l’interazione con metalli di<br />
transizione (figure 1. 5, 1. 6 e 1. 7).<br />
Il principio è quello del la reazione di Fenton,<br />
verificato per il perossido di idrogeno e<br />
successivamente ampliato da Haber e Weiss,<br />
secondo cui un metallo di transizione in forma<br />
ionica (es. ferro o rame) catalizza la scissione di un<br />
idroperossido (ROOH), generando nuove specie<br />
radicaliche, l’idroperossile (ROO*) o l’alcossile<br />
(RO*), a seconda che, rispettivamente, lo ione<br />
catalizzante si ossidi (Fe 2+ →Fe 3+ o Cu + →Cu 2+ )<br />
oppure si riduca (Fe 3+ →Fe 2+ o Cu 2+ →Cu + ) (figura<br />
4. 1).<br />
ROOH + Fe 2+ (Cu + ) RO* + OH - + Fe 3+ (Cu 2+ )<br />
ROOH + Fe 3+ (Cu 2+ ) ROO* + H + + Fe 2+ (Cu + )<br />
Figura 4. 1 Generazione di radicali liberi dagli idroperossidi<br />
Se ad una soluzione contenente idroperossidi<br />
e tracce di un metallo di transizione in forma ionica<br />
si aggiunge una sostanza il cui potenziale di<br />
ossidazione è tale che i radicali generati dalla<br />
decomposizione degli idroperossidi stessi (alcossili<br />
25<br />
e perossili) possano strappare ad essa l’elettrone<br />
necessario per raggiungere la propria stabilità, tale<br />
sostanza sarà a sua volta radicalizzata, come<br />
previsto dalla seconda fase delle reazioni<br />
radicaliche a catena (reazione di trasferimento del<br />
sito radicalico, figura 1. 8). E’ ovvio che se la<br />
sostanza in questione ha la proprietà ottica di<br />
cambiare colore nel momento in cui viene ossidata<br />
ed è sufficientemente stabile in questa forma, sarà<br />
possibile, con le opportune tecniche<br />
spettrofotometriche, risalirne alla concentrazione,<br />
che risulterà direttamente proporzionale a quella<br />
delle specie radicaliche generate in vitro e, in<br />
definitiva, a quella degli idroperossidi inizialmente<br />
presenti nel campione analizzato.<br />
Nel d-<strong>ROMs</strong> test, dunque, gli idroperossidi<br />
contenuti in un campione biologico – per comodità<br />
espositiva, nel siero – vengono messi nelle<br />
condizioni previste dalla reazione di Fenton per<br />
generare in vitro radicali idroperossilici ed<br />
alcossilici.<br />
In pratica, un’aliquota di siero viene diluita in<br />
una soluzione tampone (acetato) a pH 4.8. In<br />
queste condizioni, il ferro ionico dapprima legato<br />
alle sieroproteine, si rende disponibile in forma<br />
libera, catalizzando, in vitro, la scissione degli<br />
idroperossidi, inizialmente presenti nel campione di<br />
sangue, in radicali idroperossilici ed alcossilici.<br />
A questa soluzione viene, quindi, aggiunta una<br />
sostanza (cromogeno) che ha la proprietà di<br />
cambiare colore nel momento in cui viene ossidata.<br />
Il cromogeno impiegato nel d-<strong>ROMs</strong> test è la<br />
N,N-dietil-parafenilendiammina (figura 4. 2).<br />
CH CH3-CH 3-CH 2<br />
N<br />
CH 3 -CH 2<br />
NH 2<br />
Figura 4. 2 La N, N-dietil-parafenilendiammina,<br />
il substrato cromogeno del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Questa sostanza ha la proprietà di lasciarsi<br />
ossidare dai radicali idroperossilici ed alcossilici,<br />
trasformandosi in una forma cationica colorata in<br />
rosa, anch’essa radicalica, ma abbastanza stabile<br />
da consentirne la determinazione quantitativa per
via fotometrica, nelle condizioni di lavoro<br />
previste (lunghezza d’onda 505 0 546).<br />
La concentrazione del complesso colorato<br />
sarà direttamente correlata con il livello di<br />
idroperossidi inizialmente presenti nel campione da<br />
analizzare (figura 4. 3).<br />
1A) R-OOH + Fe 2+ → R-O* + Fe 3+ + OH -<br />
1B) R-O* + A-NH2 → R-O - + [A-NH2*] +<br />
2A) R-OOH + Fe 3+ → R-OO* + Fe 2+ + H +<br />
2B) R-OO* + A-NH2 → R-OO - + [A-NH2*] +<br />
dove:<br />
– R-OOH è un generico idroperossido<br />
– R-O* è il radicale alcossilico del generico idroperossido<br />
– R-OO* è il rad. idroperossilico del generico idroperossido<br />
– A-NH2 è la N, N-dietil-parafenilendiammina, cioè il substrato<br />
cromogeno del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
– [A-NH2*] + è il radicale catione, colorato, del substrato<br />
cromogeno<br />
Figura 4. 3 Principio e reazioni del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
I risultati del d-<strong>ROMs</strong> test vengono espressi in<br />
unità arbitrarie, le UNITA’ CARRATELLI o U CARR<br />
(dove 1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL), a<br />
causa dell’eterogeneità delle specie chimiche<br />
presenti inizialmente nel campione biologico da<br />
testare. Il significato delle U CARR sarà discusso<br />
più avanti nel corso della trattazione.<br />
4. 1. 1. 2 Aspetti sperimentali<br />
Il d-<strong>ROMs</strong> test, come si è detto, si basa sullo<br />
studio spettrofotometrico dell'aumento dell'intensità<br />
della colorazione rossa che si sviluppa quando un<br />
piccolo campione di siero di sangue umano viene<br />
aggiunto ad una soluzione di N,N-dietil-parafenilendiammina<br />
(cromogeno) tamponata a pH 4,8.<br />
La comparsa della colorazione è attribuita alla<br />
formazione, per ossidazione, del radicale catione<br />
dell'ammina, che verrebbe generato dalla<br />
concomitante ossidazione dei radicali alcossilici e<br />
perossilici derivanti dalla scissione degli<br />
idroperossidi presenti nel campione per azione<br />
catalitica degli ioni Fe 2+ ed Fe 3+ rilasciati dalle<br />
sieroproteine nell'ambiente acido creato in vitro.<br />
La conferma sperimentale che effettivamente<br />
abbiano luogo le suddette reazioni è stata ottenuta<br />
integrando alcuni dati elettrochimici con i risultati<br />
ottenuti in parallelo dalla spettrofotometria e dalla<br />
spettroscopia di risonanza di spin dell’elettrone<br />
(ESR), la tecnica sperimentale più adatta alla<br />
rilevazione della presenza di radicali ed alla loro<br />
identificazione in un campione.<br />
Anzitutto, la stima dei potenziali redox delle<br />
specie chimiche implicate suggerisce che la<br />
reazione tra un generico radicale alcossile o<br />
perossile con la N,N-dietilparafenilendiammina è<br />
termodinamicamente possibile.<br />
Sulla base di questa valutazione indiretta, il d-<br />
<strong>ROMs</strong> test è stato sottoposto alla ESR. Pertanto,<br />
10 μL di un campione di siero, 10 μL di cromogeno<br />
e 980 μL di tampone acetato (pH 4.8) sono stati<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
26<br />
inseriti in una cella piatta da ESR collocata nella<br />
cavità risonante di uno spettrometro ESR.<br />
Eseguendo scansioni successive, al tempo<br />
zero si è osservata la comparsa di una linea di<br />
fondo piatta che, con il passare dei minuti, si è<br />
trasformata in un segnale ESR costituito da una<br />
sola riga, larga circa 5 mT e caratterizzata da un<br />
fattore g di 2.00478, la cui intensità è andata<br />
aumentando progressivamente sino a raggiungere<br />
un massimo per poi calare lentamente. Tale<br />
segnale indica incontestabilmente la presenza di<br />
un radicale (figura 4. 4).<br />
g = 2.00478<br />
3440 3460 3480 3500 3500<br />
Figura 4. 4 Il segnale ESR è consistente<br />
con la presenza di un radicale<br />
[G]<br />
0 min<br />
150 min<br />
Tuttavia, poiché non è possibile associare tale<br />
segnale ad una specie ben precisa solo sulla base<br />
del valore del fattore g, che pure sarebbe coerente<br />
con quello del radicale catione del cromogeno, si è<br />
valutata la struttura iperfine, impiegando un valore<br />
di modulazione 10 volte più basso (0,01 mT).<br />
Lo spettro registrato in queste nuove condizioni<br />
è risultato composto da molte righe (più di mille),<br />
mostrando una struttura iperfine molto complicata,<br />
ma al contempo ricca di informazioni sulla natura<br />
della specie che ne è responsabile.<br />
Il risultato ottenuto su siero è stato confermato<br />
ripetendo l’esperimento su un sistema modello, nel<br />
quale il campione biologico è stato sostituito da<br />
una soluzione tampone a pH 4.8 contenente, oltre<br />
alla N,N-dietil-parafenilendiammina (cromogeno), il<br />
terz-butilidroperossido (in sostituzione degli<br />
idroperossidi sierici) e del solfato ferroso, quale<br />
catalizzatore (in sostituzione del ferro sierico).<br />
E’ stato, quindi, eseguito lo spettro ESR ad alta<br />
risoluzione (m.a.=0.0075 mT) e i risultati<br />
sperimentali sono stati confrontati con quelli<br />
dello spettro simulato al computer.<br />
Sulla base dei risultati ottenuti confrontando,<br />
con adeguati programmi di calcolo, lo spettro<br />
teorico da quello ottenuto sperimentalmente, si è<br />
giunti alla conclusione inequivocabile che la specie<br />
paramagnetica responsabile dello spettro<br />
osservato è proprio il radicale catione del<br />
cromogeno del d-<strong>ROMs</strong> test, cioè della N,N-dietilparafenilendiammina<br />
(figura 4. 5).
Figura 4. 5 Spettro ESR ad alta risoluzione (m.a.=0.0075 mT)<br />
sperimentale (a) e spettro simulato da computer (b) esibiti dal<br />
sistema sperimentale tBuOOH/DEPPD/FeSO4/buffer dopo 420<br />
sec dal mescolamento (tBuOOH: terz-butilidroperossido;<br />
DEPPD: N,N-dietilparafenilendiammina)<br />
D’altra parte, si è detto che, nel corso degli<br />
esperimenti, nella soluzione contenuta nella cella<br />
piatta dell’ESR, l’intensità della colorazione rossa<br />
osservata aumenta progressivamente nel tempo.<br />
Poiché molti radicali allo stato ionico esibiscono<br />
una propria colorazione, su base qualitativa, si è<br />
assunto che il fenomeno cromatico fosse<br />
riconducibile alla presenza, in soluzione, di specie<br />
chimiche reattive colorate allo stato ionico.<br />
Pertanto, allo scopo di verificare, questa volta<br />
su basi quantitative, al correttezza dell’assunto,<br />
l’esperimento iniziale è stato seguito nel tempo<br />
monitorando contemporaneamente sia il segnale<br />
ESR che quello fotometrico (assorbanza a 505<br />
nm).<br />
Con questo approccio, si osservato che i profili<br />
dell'intensità ESR e dell'assorbanza a 505 nm nel<br />
tempo per due campioni dello stesso siero<br />
coincidono palesemente fino al raggiungimento del<br />
massimo.<br />
Anche in questo caso, il risultato sperimentale<br />
ottenuto è stato confermato ripetendo questo<br />
esperimento su un sistema modello (figura 4. 6).<br />
Intensità EPR (unità arbitrarie)<br />
1.0<br />
0.5<br />
0<br />
0 25 50 75 100 0 25 50 75 100<br />
Tempo (min)<br />
Tempo ( min)<br />
(A) Profilo nel tempo, a temperatura ambiente, dell’intensità spettrale normalizzata (•) e delle letture<br />
A505 (p), esibito dal sistema DEPPD (3.7 x 10-3 M)/tBuOOH (3.9 x 10-5 M)/FeSO4 (2.8x10-5 M) a<br />
temperatura ambiente. (B) Profilo nel tempo delle letture A505 esibite dai sistemi DEPPD (3.7 x 10 -3<br />
M)/tBuOOH (3.9 x 10-5 M)/FeSO4 (2.8x10-5 M) ( •), DEPPD (3.7 x 10-3 M)/tBuOOH (2.0 x 10-5 M )/FeSO4<br />
(2.8x10-5 M) (¢) e DEPPD (3.7 x 10 -3 M)/tBuOOH (0.95 x 10 -5 M )/FeSO4 (2.8x10-5 (A) Profilo nel tempo, a temperatura ambiente, dell’intensità spettrale normalizzata (•) e delle letture<br />
A505 (p), esibito dal sistema DEPPD (3.7 x 10<br />
M) (p) a<br />
temperatura ambiente. tBuOOH: terz-butilidroperossido; DEPPD: N,N-dietilparafenilendiammina.<br />
-3 M)/tBuOOH (3.9 x 10-5 M)/FeSO4 (2.8x10-5 M) a<br />
temperatura ambiente. (B) Profilo nel tempo delle letture A505 esibite dai sistemi DEPPD (3.7 x 10 -3<br />
M)/tBuOOH (3.9 x 10-5 M)/FeSO4 (2.8x10-5 M) ( •), DEPPD (3.7 x 10-3 M)/tBuOOH (2.0 x 10-5 M )/FeSO4<br />
(2.8x10-5 M) (¢) e DEPPD (3.7 x 10 -3 M)/tBuOOH (0.95 x 10 -5 M )/FeSO4 (2.8x10-5 (A) Profilo nel tempo, a temperatura ambiente, dell’intensità spettrale normalizzata (•) e delle letture<br />
A505 (p), esibito dal sistema DEPPD (3.7 x 10<br />
M) (p) a<br />
temperatura ambiente. tBuOOH: terz-butilidroperossido; DEPPD: N,N-dietilparafenilendiammina.<br />
-3 M)/tBuOOH (3.9 x 10-5 M)/FeSO4 (2.8x10-5 M) a<br />
temperatura ambiente. (B) Profilo nel tempo delle letture A505 esibite dai sistemi DEPPD (3.7 x 10 -3<br />
M)/tBuOOH (3.9 x 10-5 M)/FeSO4 (2.8x10-5 M) ( •), DEPPD (3.7 x 10-3 M)/tBuOOH (2.0 x 10-5 M )/FeSO4<br />
(2.8x10-5 M) (¢) e DEPPD (3.7 x 10 -3 M)/tBuOOH (0.95 x 10 -5 M )/FeSO4 (2.8x10-5 M) (p) a<br />
temperatura ambiente. tBuOOH: terz-butilidroperossido; DEPPD: N,N-dietilparafenilendiammina.<br />
Figura 4. 6 Il radicale catione della N,N-dietilparafenilendiammina,<br />
responsabile dello spettro ESR, è anche responsabile<br />
dell’assorbimento nel visibile a 505 nm<br />
Questo dato indica, in definitiva, che l'aumento<br />
dell'assorbanza nel tempo è dovuto all'aumento<br />
della quantità di radicale catione del cromogeno,<br />
che a sua volta è dipendente dalla quantità di<br />
idroperossidi inizialmente presente nel campione di<br />
siero analizzato.<br />
a<br />
b<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
0.8<br />
0.4<br />
0<br />
Assorbanza a 505 nm (A 505 )<br />
27<br />
4. 1. 1. 3 Aspetti biochimico-clinici<br />
Le performance del d-<strong>ROMs</strong> test, eseguito sia<br />
con metodica manuale che in automatico, sono<br />
state valutate mediante spettrofotometria.<br />
I parametri analitici presi in considerazione<br />
sono stati: la cinetica della reazione, l’effetto della<br />
temperatura sulla velocità di reazione, la linearità<br />
della reazione, i limiti di sensibilità della metodica,<br />
l’imprecisione analitica, la stabilità nel tempo dei<br />
campioni conservati a due diverse temperature (+4<br />
e –20 °C), l’influenza sui risultati del test del tipo di<br />
prelievo e di eventuali fattori bioumorali interferenti.<br />
La cinetica della reazione, l’effetto della<br />
temperatura sulla velocità di reazione e la linearità<br />
segnale-concentrazione sono state valutate<br />
eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test su siero sia in manuale<br />
(spettrofotometro Shimadzu CL-750) che in<br />
automatico (spettrofotometro UVIKON 941 PLUS).<br />
In tali condizioni analitiche, monitorando nel tempo<br />
l’incremento dell’assorbanza a 505 nm, la reazione<br />
del d-<strong>ROMs</strong> test è apparsa lineare a 37°C<br />
nell’intervallo di misura più frequentemente<br />
utilizzato (1÷4 minuti).<br />
Ripetendo il test su 12 differenti sieri si sono<br />
osservate solo delle lievi differenze tra i campioni,<br />
verosimilmente dipendenti dalle differenti specie<br />
molecolari di idroperossidi coinvolte nella reazione.<br />
L’effetto della temperatura sulla velocità di reazione<br />
(valutata in termini mAbs/min) nella finestra di<br />
misura utilizzata (1÷4 minuti) è risultato evidente e<br />
tale da rendere necessario l’utilizzo di<br />
termostatazione per le misure cinetiche (optimum<br />
37 °C). La linearità segnale/concentrazione,<br />
valutata misurando la velocità media (mAbs/min)<br />
nell’intervallo di tempo più frequentemente<br />
utilizzato (1÷4 min) in funzione dell’aumento<br />
progressivo di volume (spettrofotometro Shimadzu<br />
CL-750) o delle diluizione (spettrofotometro<br />
UVIKON 941 PLUS) del campione è risultata<br />
ottima.<br />
Risultati sovrapponibili sono stati ottenuti<br />
eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test anche con<br />
apparecchiature diverse, sia diluendo i campioni,<br />
con metodica manuale (fotometro Shimadzu CL<br />
7000), che aumentandone i volumi, in automatico<br />
(Arco, Biogamma). Un esempio di linearità, riferito<br />
ad analisi cinetica, è riportato nella figura 4. 7.<br />
Volume di campione<br />
Figura 4. 7 Linearità segnale-concentrazione nel d-<strong>ROMs</strong> test
Il range di linearità del d-<strong>ROMs</strong> test, valutato<br />
con metodica in automatico (Arco, Biogamma) è<br />
risultato compreso fra 50 e 500 CARR U. Pertanto,<br />
valori superiori a 500 CARR richiedono la diluizione<br />
del campione.<br />
Per quanto riguarda l’imprecisione analitica, in<br />
uno studio condotto eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test in<br />
cinetica, con metodica manuale (fotometro<br />
Shimadzu CL 7000), la precisione nella serie<br />
(n=30) per un solo livello (alto) ha dato un CV di<br />
0.89%.<br />
In uno studio immediatamente successivo, nel<br />
quale il d-<strong>ROMs</strong> test è stato eseguito su siero sia in<br />
manuale (spettrofotometro Shimadzu CL-750) che<br />
in automatico (spettrofotometro UVIKON 941<br />
PLUS) sono stati evidenziati valori di imprecisione<br />
analitica altrettanto accettabili (tabella 4. 1).<br />
Tabella 4. 1 Imprecisione analitica del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Parametri statistici Siero A Siero B<br />
Media (mAbs/min) 28.9 ± 29.7 21.0 ± 21.5<br />
CV intraserie (%) 0.73 ± 1.75 1.00 ± 1.30<br />
CV tra serie (%) 1.27 ± 1.60 0.67 ± 1.28<br />
CV totale (%) 1.76 ± 2.09 1.46 ± 1.63<br />
A: siero ad alto titolo di idroperossidi; B: siero a basso titolo di idroperossidi<br />
Questo dato è stato confermato da un altro<br />
studio, ove eseguendo l’analisi in manuale, il CV<br />
intraserie è stato pari al 2.2% (valore riferito a 20<br />
aliquote di siero fresco), mentre quello interserie è<br />
stato del 3.7% (valore riferito a 20 aliquote di siero<br />
congelato).<br />
Più recentemente, eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test in<br />
cinetica, in automatico (Arco, Biogamma), il CV<br />
intraserie valutato su 20 aliquote di siero fresco ha<br />
fornito il valore di 2.1% mentre il CV interserie,<br />
valutato su 20 aliquote di siero congelato è stato di<br />
3.1%. Risultati sostanzialmente sovrapponibili sono<br />
stati ottenuti, nelle medesime condizioni analitiche,<br />
con un’altra apparecchiatura (Hitachi 717), ove la<br />
valutazione di due pool di sieri ha fornito un CV<br />
intraserie di 3.3% e 2.5% (rispettivamente per il<br />
livello A, basso, e B, alto) e un CV interserie, per<br />
ambedue le aliquote di pool testate, pari a 4.5%.<br />
Altri studi hanno valutato l’effetto sul d-<strong>ROMs</strong><br />
test delle modalità di conservazione del campione,<br />
e, in particolare il ruolo della temperatura.<br />
In uno dei primi studi, eseguendo il d-<strong>ROMs</strong><br />
test in cinetica, con metodica manuale (fotometro<br />
Shimadzu CL 7000) la conservazione del siero a<br />
+4°C si è accompagnata a una lieve riduzione dei<br />
valori del test mentre la conservazione a –20° fino<br />
a 48 ore non ha sortito alcun effetto. Più<br />
recentemente, eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test in<br />
cinetica, con metodica in automatico (Hitachi 717),<br />
la conservazione –20°C fino a 3 mesi non ha<br />
influito significativamente sulle performance del<br />
test.<br />
Eseguendo l’analisi in cinetica, con metodica<br />
manuale (fotometro Shimadzu CL 7000), non sono<br />
state segnalate differenze statisticamente<br />
significative, nei risultati del d-<strong>ROMs</strong> test, tra<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
28<br />
prelievo arterioso e prelievo venoso effettuato nello<br />
stesso paziente.<br />
Ai fini della valutazione dell’interferenza,<br />
eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test in cinetica, con metodica<br />
manuale (fotometro Shimadzu CL 7000), i risultati<br />
del test non sono stati influenzati né dal livello di<br />
bilirubina (fino a 3 mg/dL), né dalla con contrazione<br />
di creatinina (fino a 19 g/dL), né dall’azotemia ( fino<br />
a 590 mg/dL), né dalla trigliceridemia (fino a 750<br />
mg/dL). Nelle medesime condizioni analitiche,<br />
l’impiego di K EDTA come anticoagulante in<br />
provetta ha reso gli idroperossidi non dosabili,<br />
mentre il citrato, ha comportato una sottostima dei<br />
valori; l’eparina, che in alcune valutazioni<br />
preliminari sembrava indurre una soprastima dei<br />
valori non ha dimostrato, in realtà, alcuna capacità<br />
di influenzare i risultati del d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
In un altro studio, eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test in<br />
cinetica, con metodica in automatico (Hitachi 717),<br />
le massime concentrazioni consentite (espresse in<br />
mmoli/L) per ottenere risultati analitici attendibili<br />
sono state 0.068 per l’emoglobina, 171 per la<br />
bilirubina e 28.22 per i trigliceridi.<br />
In conclusione, sulla base dei dati qui<br />
analizzati, è possibile affermare che il d-<strong>ROMs</strong> test<br />
è in grado di fornire determinazioni precise ed<br />
accurate, correlate con la concentrazione, sia in<br />
cinetica che in endpoint. In particolare, disponendo<br />
di un adeguato sistema di termostatazione, è<br />
possibile eseguire il d-<strong>ROMs</strong> test sia in manuale<br />
che in automatico con risultati sostanzialmente<br />
sovrapponibili.<br />
4. 1. 2 Composizione del kit<br />
Il d-ROMS test è disponibile sotto forma di vari<br />
kit, in funzione del campione biologico da testare<br />
(sangue intero, plasma, siero, liquidi infiammatori,<br />
estratti cellulari ecc.) e della strumentazione con la<br />
quale va effettuata l’analisi. A questo proposito,<br />
infatti, va sottollineato che il d-<strong>ROMs</strong> test può<br />
essere eseguito sia con comuni apparecchiature di<br />
laboratorio (fotometro o analizzatore multiplo) che<br />
con sistemi dedicati, quali il FREE ed il FRAS.<br />
In ogni caso, un kit di d-<strong>ROMs</strong> test contiene, di<br />
base, una miscela cromogena, a base di N,N-dietilparafenilendiammina<br />
(reagente R 1 ) ed un tampone<br />
di reazione, a base di acetato (reagente R 2 )<br />
(tabella 4. 2).<br />
Tabella 4. 2 Esempio di kit di d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Reagenti*<br />
Reagente R1<br />
Miscela cromogena<br />
Reagente R2<br />
Tampone acetato (pH 4.8)<br />
Confezioni disponibili**<br />
MC 001 MC 002 MC 003<br />
Reagente R1 1 x 0.5 mL 1 x 1 mL 1 x 2 mL<br />
Reagente R2 1 x 50 mL 2 x 50 mL 4 x 50 mL<br />
*Conservare a 2-8°C. Tutti i reagenti restano stabili fino alla<br />
data di scadenza riportata sulla confezione se non esposti al<br />
contatto diretto con la luce solare. ** La confezione varia in<br />
funzione sia della strumentazione analitica impiegata per<br />
l’esecuzione del test sia della natura del campione biologico<br />
da testare.
Per calibrare lo strumento analitico è<br />
disponibile un siero di controllo a titolo conosciuto.<br />
4. 1. 3 Condizioni di lavoro<br />
Il d-<strong>ROMs</strong> test può essere eseguito su sangue<br />
intero (sistema dedicato FRAS), su plasma fresco,<br />
su siero eparinizzato ed altri fluidi biologici o estratti<br />
cellulari (sistema dedicato FREE).<br />
In ogni caso, anche con strumenti analitici non<br />
dedicati, manuali (comuni fotometri) o automatici<br />
(analizzatori multipli), le condizioni di lavoro<br />
sperimentalmente stabilite e standardizzate per il<br />
d-<strong>ROMs</strong> test – che può essere eseguito sia in<br />
cinetica sia in end-point – sono le seguenti:<br />
lunghezza d’onda 505 or 546 nm, cammino ottico<br />
1 cm, e temperatura 37 °C.<br />
4. 1. 4 Procedura analitica<br />
Il d-<strong>ROMs</strong> test può essere eseguito sia in<br />
cinetica che in endpoint. In ambedue i casi, prima<br />
di procedere all’esecuzione dell’analisi, bisogna<br />
preparare lo standard (o calibratore), fornito<br />
opzionalmente col kit sotto forma di siero liofilo a<br />
matrice umana a titolo noto (U CARR), indicato<br />
sull’etichetta.<br />
A questo scopo è sufficiente aggiungere al<br />
liofilizzato il volume di acqua distillata previsto<br />
(secondo le indicazioni del produttore) e mescolare<br />
la soluzione così ottenuta con delicatezza<br />
(evitando di formare schiuma, indice indesiderato<br />
di denaturazione proteica all’interfacie aria-liquido).<br />
Si suggerisce di attendere 10 minuti e quindi<br />
rimescolare la soluzione con le medesime<br />
precauzioni.<br />
In ogni caso, prima di eseguire il test è<br />
assolutamente indispensabile assicurarsi che tutto<br />
il liofilizzato sia stato completamente disciolto. In<br />
queste condizioni, tra l’altro, la soluzione così<br />
ricostituita di calibratore può essere conservata a –<br />
20 °C ed è stabile per 6 mesi.<br />
Dopo aver portato i reagenti (R1, miscela<br />
cromogena, ed R2, soluzione tampone) alla<br />
temperatura di lavoro, si procede, quindi,<br />
all’esecuzione del test.<br />
Nella procedura cinetica standard si parte<br />
preparando tre soluzioni: il bianco reagente, il<br />
campione (preferibilmente siero fresco) ed il<br />
calibratore, secondo lo schema riportato nella<br />
seguente tabella:<br />
Tabella 4. 3 Procedura analitica del d-<strong>ROMs</strong> test in cinetica<br />
Bianco reag. Campione Calibratore<br />
Reagente R1 10 μL 10 μL 10 μL<br />
Reagente R2 1 mL 1 mL 1 mL<br />
H2O distillata 10 μL<br />
Campione 10 μL<br />
Calibratore 10 μL<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate<br />
delicatamente e lasciate ad incubare a 37°C per 1<br />
minuto. Terminata l’incubazione, esse vanno<br />
sottoposte a lettura fotometrica, misurando<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
29<br />
l’assorbanza a 505 nm (A505) o 546 nm (A505)<br />
immediatamente e successivamente, nelle stesse<br />
condizioni di lavoro (37°C), dopo 1, 2 e 3 min. Ai<br />
valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il<br />
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza<br />
del bianco reagente. I risultati del test saranno<br />
espressi in U CARR applicando la seguente<br />
formula:<br />
U CARR = ΔAbs/min x F<br />
dove:<br />
• ΔAbs/min sono le differenze medie dei valori di<br />
assorbanza misurati a 1, 2, 3 e 3 minuti;<br />
• F è un fattore di correzione con un valore<br />
predeterminato.<br />
A questo punto è opportuno fare alcune<br />
precisazioni. Si è detto che i risultati del d -<strong>ROMs</strong><br />
test, anche per l’eterogeneità delle specie chimiche<br />
valutabili con questo metodo (idroperossidi di<br />
derivazione cellulare e prodotti di ossidazione delle<br />
cloroammine), sono espressi in U CARR.<br />
Perché si è scelto di usare queste unità di<br />
misura “arbitrarie”? Per rispondere a questa<br />
domanda bisogna anticipare un dato sperimentale<br />
che sarà ampiamente discusso in seguito e cioè<br />
che, eseguendo il d-<strong>ROMs</strong> test su un campione<br />
piuttosto numeroso (circa 5.000) di soggetti<br />
apparentemente sani, si è visto che l’incremento<br />
per minuto dei valori di assorbanza a 505 nm<br />
(ΔA505/min) varia fra 0.023 e 0.031,<br />
distribuendosi, nella popolazione testata, secondo<br />
un tipico profilo gaussiano.<br />
E’ evidente che l’impiego di tale notazione<br />
(terza cifra decimale) non consente un’immediata<br />
valutazione e, soprattutto, un’adeguata<br />
discriminazione dei valori di concentrazione di<br />
idroperossidi da essa sottesa.<br />
Pertanto, per ovviare a questo problema di<br />
natura squisitamente pratica ed avere un range<br />
adeguatamente ampio di variazioni, si è stabilito di<br />
esprimere il risultato del d-<strong>ROMs</strong> test in unità<br />
convenzionali, le U CARR, appunto, che si<br />
ottengono moltiplicando la variazione di<br />
assorbanza registrata fotometricamente per un<br />
prestabilito fattore di correzione, il fattore F<br />
(generalmente compreso tra 9.000 e 10.000).<br />
Va ribadito che tale operazione di “correzione”<br />
si rende necessaria esclusivamente per rendere<br />
più agevoli al medico – abituato a interpretare<br />
valori, come quello del colesterolo, del range delle<br />
centinaia di unità – la lettura e l’interpretazione del<br />
test (che altrimenti sarebbero “appesantite”<br />
dall’impiego di una serie di cifre decimali).<br />
Negli strumenti dedicati, quali il FREE ed il<br />
FRAS, è possibile, via software, impostare il fattore<br />
di correzione sulla base dei risultati del d-<strong>ROMs</strong><br />
test eseguito sul siero di controllo a titolo noto<br />
fornito dal produttore.
Ad ogni modo, tuttavia, per avere una<br />
valutazione assoluta, è stato sperimentalmente<br />
stabilito che 1 U CARR corrisponde a 0.08 mg di<br />
H2O2/dL.<br />
Nella procedura endpoint si parte preparando<br />
tre soluzioni: il bianco reagente, il campione (siero<br />
o plasma eparinato) ed il calibratore, secondo lo<br />
schema riportato nella seguente tabella:<br />
Tabella 4. 4 Procedura analitica del d-<strong>ROMs</strong> test in endpoint<br />
Bianco reag. Campione Calibratore<br />
Reagente R1 10 μL 10 μL 10 μL<br />
Reagente R2 1 mL 1 mL 1 mL<br />
H2O distillata 5 μL − −<br />
Campione − 5 μL −<br />
Calibratore − − 5 μL<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate<br />
delicatamente e lasciate ad incubare a 37°C per 75<br />
minuti. Appena terminata l’incubazione, esse<br />
vanno sottoposte a lettura fotometrica, misurando<br />
l’assorbanza a 505 nm (A505) o 546 nm (A546). Ai<br />
valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il<br />
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza<br />
del bianco reagente (azzeramento con bianco<br />
reagente). I risultati del test saranno espressi in U<br />
CARR applicando la seguente formula:<br />
U CARR =<br />
Abs campione<br />
Abs standard<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
x [standard]<br />
dove:<br />
• Abs sono i valori di assorbanza misurati (per il<br />
campione e per lo standard);<br />
• [standard ] è la concentrazione dello standard.<br />
Va aggiunto che gli strumenti dedicati (FREE e<br />
FRAS) sono programmati per eseguire ambedue le<br />
modalità di analisi del d-<strong>ROMs</strong> test sopra descritte<br />
con appositi kit. Tuttavia, se si ha la necessità di<br />
dover effettuare il test su un comune fotometro o<br />
su un analizzatore multiplo, si può anche operare,<br />
in alternativa alle procedure descritte, con una<br />
miscela di lavoro realizzata mescolando il reagente<br />
R1 (cromogeno) ed il reagente R2 (tampone) nel<br />
rapporto di 1:100 e utilizzando il campione come<br />
“starter”. Tale miscela di lavoro ha il vantaggio di<br />
essere stabile per circa 12 ore (più che sufficienti<br />
per una seduta analitica), se conservata,<br />
ovviamente a 2-8°C e al riparo dalla luce.<br />
4. 1. 5 Interpretazione dei risultati<br />
La disponibilità di una metodica precisa ed<br />
affidabile ha consentito di stabilire i livelli ematici di<br />
riferimento del d-<strong>ROMs</strong> nella popolazione normale.<br />
Si è potuto dimostrare, su un campione di circa<br />
5.000 soggetti clinicamente sani, che il livello di<br />
idroperossidi circolanti determinati con il d-<strong>ROMs</strong><br />
test segue nella popolazione una distribuzione<br />
unimodale (figura 4. 8 A), con un picco tra 250 e<br />
300 U CARR (pari a 20.08-24.00 mg/dL di H2O2),<br />
individuato come il valore di riferimento del test<br />
(figura 4. 8 B).<br />
30<br />
Frequenze<br />
A<br />
B<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
Serie<br />
-<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
13<br />
14<br />
15<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15<br />
Serie (U CARR)<br />
Intervalli<br />
(U CARR)<br />
200-210<br />
211-220<br />
221-230<br />
231-240<br />
241-250<br />
251-260<br />
261-270<br />
271-280<br />
281-290<br />
291-300<br />
300-310<br />
311-320<br />
321-330<br />
331-340<br />
341-350<br />
Totale<br />
Intervalli<br />
(mg H 2 O 2 /dL)<br />
16.00-16.80<br />
16.88-17.60<br />
17.68-18.40<br />
18.48-19.20<br />
19.28-20.00<br />
20.08-20.80<br />
20.88-21.60<br />
21.68-22.40<br />
22.48-23.20<br />
23.28-24.00<br />
24.08-24.80<br />
24.88-25.60<br />
25.68-25.40<br />
25.48-27.20<br />
27.28-28.00<br />
Frequenze<br />
Figura 4. 8 Distribuzione dei valori del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
nella popolazione apparentemente sana<br />
Ovviamente, valori superiori a questo<br />
intervallo, dopo una fascia borderline (301-320 U<br />
CARR) indicano livelli progressivamente crescenti<br />
di stress ossidativo (tabella 4. 5).<br />
Tabella 4. 5 Gravità dello stress ossidativo (SO)<br />
sulla base dei valori del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Idroperossidi Idroperossidi <strong>Stress</strong> ossidativo<br />
(U CARR) (mg H2O2/dL) (gravità)<br />
300-320 24.08-25.60 Condizione border-line<br />
321-340 25.68-27.20 <strong>Stress</strong> ossidativo lieve<br />
341-400 27.28-32.00 <strong>Stress</strong> ossidativo medio<br />
401-500 32.08-40.00 <strong>Stress</strong> ossidativo elevato<br />
>500 >40.00 <strong>Stress</strong> ossidativo elevatissimo<br />
Range normale: 250-300 U CARR<br />
1 U CARR corrisponde a 0.08 mg H2O2/dL<br />
Per completezza, va aggiunto che i valori<br />
riportati si riferiscono alla popolazione italiana e<br />
non è escluso che vi possano essere delle<br />
oscillazioni in eccesso o in difetto in funzione di<br />
particolarità razziali.<br />
Si è anche osservato che i risultati del d-<strong>ROMs</strong><br />
test non sono significativamente influenzati né dal<br />
sesso né dall’età.<br />
Tuttavia, i neonati, indipendentemente dal<br />
sesso e dalle modalità del parto (via vaginale o<br />
taglio cesareo), possiedono livelli ematici di<br />
idroperossidi significativamente inferiori a quelli<br />
riscontrati negli adulti; questa differenza<br />
probabilmente riflette la diversa risposta all’ipossia<br />
dei neonati (figura 4. 9).<br />
(n)<br />
29<br />
89<br />
193<br />
244<br />
342<br />
547<br />
659<br />
731<br />
654<br />
491<br />
256<br />
162<br />
80<br />
57<br />
13<br />
4547<br />
Dati cumulativi<br />
(%)<br />
0.6<br />
2.6<br />
6.8<br />
12.2<br />
19.7<br />
31.8<br />
46.3<br />
62.3<br />
76.7<br />
87.5<br />
93.1<br />
96.7<br />
98.5<br />
99.7<br />
100.0<br />
100.0
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
Figura 4. 9 Valori del d-<strong>ROMs</strong> test nei neonati<br />
Viceversa, la gravidanza si associa a valori del<br />
d-<strong>ROMs</strong> test mediamente più alti rispetto a quelli<br />
osservati nelle donne non in gestazione (figura 4.<br />
10).<br />
U CARR<br />
0<br />
900<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
Parto vaginale<br />
(n=71)<br />
Taglio cesareo<br />
(n=27)<br />
Asfissia IP<br />
(n=20)<br />
100<br />
0<br />
mesi<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
Figura 4. 10 Andamento del d-<strong>ROMs</strong> test in gravidanza<br />
I risultati del d-<strong>ROMs</strong> test eseguito<br />
ripetutamente nello stesso soggetto nell’arco della<br />
giornata non mostrano differenze degne di nota, a<br />
meno che non intervengano fattori in grado di<br />
indurre una brusca produzione di perossidi (es. uno<br />
sforzo muscolare intenso).<br />
Infine, non sono state riscontrate differenze<br />
significative nei risultati del d-<strong>ROMs</strong> test quando il<br />
prelievo viene effettuato su sangue arterioso o su<br />
sangue venoso.<br />
4. 1. 6 Trial clinici<br />
Il d-<strong>ROMs</strong> test si è dimostrato validissimo<br />
nell’individuazione di soggetti a rischio di stress<br />
ossidativo per fattori legati allo stile di vita, quali<br />
quali il fumo di sigaretta, l’assunzione di bevande<br />
alcoliche, l’attività fisica inadeguata ed il<br />
sovrappeso.<br />
In particolare, si è visto che i forti fumatori<br />
presentano, all’incirca nel 70% dei casi, livelli sierici<br />
di idroperossidi significativamente più elevati<br />
rispetto a quelli riscontrabili, a parità di ogni<br />
altra condizione, nei non fumatori; la normalità<br />
dei risultati del test in una percentuale non<br />
trascurabile di fumatori suggerisce l’esistenza di<br />
una differente reattività, in questa popolazione di<br />
soggetti, alle sostanze biologicamente attive<br />
presenti nel fumo di sigaretta (figura 4. 10).<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
No asfissia IP<br />
(n=78)<br />
Parto<br />
31<br />
U CARR<br />
Figura 4. 10 Valori elevati del d-<strong>ROMs</strong> test nei fumatori<br />
Analogamente, gli alcolisti presentano valori<br />
del d-<strong>ROMs</strong> test significativamente più elevati<br />
rispetto a quelli rilevabili nei non bevitori (figura 4.<br />
11).<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Non fumatori<br />
(n=28)<br />
Controlli<br />
(n=42)<br />
p
Tabella 4. 6 Valori medi del d-<strong>ROMs</strong> test in soggetti sani(1)<br />
Timing n U CARR mgH2O2/dL<br />
Immediatamente dopo sforzo<br />
massimale<br />
20 > 350* >28.00*<br />
Un’ora dopo sforzo massimale<br />
(soggetti non allenati)<br />
10 > 350* > 28.00*<br />
Un’ora dopo sforzo massimale<br />
10 < 300** < 24**<br />
(soggetti allenati)<br />
(1) <strong>Test</strong> al cicloergometro *Nessuno dei soggetti reclutati aveva livelli<br />
inferiori a 350 U CARR (28.00 H2O2/dL). ** Nessuno dei soggetti<br />
reclutati aveva livelli superiori a 300 U CARR (24.00 mg H 2O2/dL).<br />
Diverse discipline sportive che comportano un<br />
considerevole impegno muscolare, per l’intensità<br />
e/o per la durata dello sforzo, si accompagnano<br />
costantemente all’incremento dei valori del d-<br />
<strong>ROMs</strong> test al termine della prestazione.<br />
A questo proposito, in uno studio longitudinale,<br />
è stato monitorato il livello di stress ossidativo in un<br />
campione di 12 atleti prima e dopo una gara<br />
ciclistica di gran fondo (150 km). In sei dei dodici<br />
ciclisti reclutati, il d-<strong>ROMs</strong> test è stato ripetuto<br />
anche dopo 2 giorni, a riposo, e dopo 10 giorni di<br />
trattamento antiossidante specifico (ARD Stenovit ® )<br />
(figura 4. 12).<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Riposo<br />
(n=12)<br />
Immediatamente<br />
dopo la corsa* (n=12)<br />
Figura 4. 12 Valutazione dello stress ossidativo<br />
in una gara ciclistica di gran fondo<br />
Il trial ha confermato che gli atleti presentano in<br />
condizioni basali, prima della gara, livelli sierici di<br />
idroperossidi nei limiti della norma. L’intenso sforzo<br />
muscolare si accompagna ad un considerevole<br />
incremento dei valori del d-<strong>ROMs</strong> test che, tuttavia,<br />
tendono a ridursi già due giorni dopo la gara. E’<br />
interessante notare che il ritorno ai valori basali di<br />
idroperossidi è favorito dal trattamento<br />
antiossidante.<br />
Il sovrappeso e, in maggior misura, l’obesità,<br />
anche se lieve, tendono ad associarsi a livelli<br />
mediamente più elevati di idroperossidi nel siero<br />
rispetto ai soggetti normopeso.<br />
A questo proposito, uno studio comparativo ha<br />
dimostrato che un indice di massa corporea (BMI)<br />
superiore a 30, una condizione che corrisponde ad<br />
un’obesità di I° grado secondo la classificazione<br />
dell’OMS, si associa a valori del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
significamene più elevati di quelli rilevati nel gruppo<br />
normopeso di controllo (BMI
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Prima della terapia<br />
Figura 4. 14 La terapia antiossidante riduce in modo significativo<br />
i livelli di stress ossidativo nella m. di Alzheimer<br />
Analogo effetto positivo sulla demenza senile<br />
ha dimostrato di possedere, in un altro trial<br />
controllato, il trattamento chelante con Dpenicillamina.<br />
Più recentemente, si è visto che pazienti con<br />
sclerosi laterale amiotrafica presentano, rispetto a<br />
soggetti sani di controllo, più elevati livelli sierici di<br />
idroperossidi al d-<strong>ROMs</strong> test. Questo dato<br />
suggerisce che i radicali liberi possano giocare un<br />
ruolo importante nella patogenesi della<br />
degerazione neuronale osservata in questa<br />
malattia.<br />
Nel complesso i risultati qui presentati indicano<br />
che il d-<strong>ROMs</strong> test è utile per monitorare il livello di<br />
stress ossidatvio e le sue conseguenze in alcune<br />
condizioni morbose di interesse neuropsichiatrico<br />
altamente invalidanti ed onerose per la società.<br />
Le patologie cardio-vascolari, che forniscono<br />
esempi paradigmatici per comprendere il ruolo<br />
patogeno delle specie reattive, rappresentano un<br />
altro dei campi più fertili di applicazione del d-<br />
<strong>ROMs</strong> test.<br />
In tale contesto, si è osservato che pazienti<br />
ipertesi non trattati presentano livelli sierici di<br />
idroperossidi significativamente più elevati rispetto<br />
a quelli rilevabili dei soggetti normotesi (figura 4.<br />
15).<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
p
Figura 4. 19 Effetto sinergico della terapia combinata sulla<br />
riduzione dei livelli di stress ossidativo nella stenosi carotidea<br />
In pazienti con stenosi carotidea serrata<br />
sottoposti a endoarteriectomia carotidea, il<br />
trattamento con dipiridamolo per via orale si è<br />
dimostrato in grado di ridurre, in uno studio<br />
controllato con placebo, i livelli di stress ossidativo<br />
associati con l’ischemia cerebrale transitoria che<br />
inevitabilmente accompagna questo tipo di<br />
intervento (figura 4. 20).<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
* ** * *<br />
Basale 15’ clamp 30’ clamp<br />
Figura 4. 21 Riduzione dello stress ossidativo associato<br />
all’endarteriectomia carotidea con dipiridamolo orale<br />
Questo trial fornisce la conferma sperimentale<br />
e clinica che l’ischemia seguita da riperfusione<br />
realmente si accompagna ad un aumento dei livelli<br />
di radicali liberi e che il d-<strong>ROMs</strong> test è uno<br />
strumento formidabile per prevenire il danno<br />
ossidativo in quelle condizioni in cui viene<br />
ripristinata la circolazione in un distretto arterioso<br />
che aveva subito in precedenza una riduzione del<br />
flusso sanguigno.<br />
Infatti, pazienti sottoposti ad angioplastica<br />
coronaria presentano al termine dell’intervento un<br />
incremento significativo del livello sierico di<br />
idroperossidi (figura 4. 22).<br />
U CARR<br />
U CARR<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Solo TS (n=12)<br />
p
Il d-<strong>ROMs</strong> test è stato impiegato con successo<br />
anche nella valutazione dello stress ossidativo<br />
associato a patologie renali e, in particolare,<br />
nell’insufficienza renale cronica. E’ stato possibile<br />
dimostrare, per esempio, che i soggetti sottoposti a<br />
trapianto renale sono ad alto rischio di stress<br />
ossidativo, così come il trattamento emodialitico,<br />
che si rende indispensabile nelle fasi avanzate<br />
dell’insufficienza renale cronica, si accompagna ad<br />
un incremento significativo del livello degli<br />
idroperossidi sierici (figura 4. 25).<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Controlli<br />
(n=25)<br />
p
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
p
Il d–<strong>ROMs</strong> test, inoltre, andrebbe eseguito su<br />
tutti i soggetti affetti da patologie – oltre una<br />
cinquantina – che risultano in qualche modo<br />
correlate con lo stress ossidativo, dalla demenza<br />
senile al m. di Parkinson, dall’ictus all’infarto, dal m.<br />
di Crohn all’artrite reumatoide, dall’AIDS ad alcune<br />
neoplasie e così via. In tutti questi casi le finalità<br />
del d–<strong>ROMs</strong> test sono monitorare lo stress<br />
ossidativo e prevenirne le sue conseguenze,<br />
monitorare l’efficacia della terapia specifica sulla<br />
patologia in atto e, aspetto non trascurabile,<br />
monitorare l’efficacia della terapia specifica, in<br />
associazione con l’eventuale trattamento<br />
antiossidante integrativo, sullo stress ossidativo<br />
associato alla patologia in atto.<br />
Riguardo a quest’ultima finalità, occorre<br />
sottolineare che in molte delle patologie sopra<br />
elencate, quasi tutte ad andamento cronico, lo<br />
stress ossidativo tende a configurarsi come un<br />
fattore di rischio aggiuntivo e, come tale, deve<br />
essere controllato per rendere ottimali i risultati<br />
della terapia. In altri termini, l’evidenza, attraverso il<br />
d-<strong>ROMs</strong> test, di una condizione di stress ossidativo<br />
costituisce un indice di controllo incompleto della<br />
malattia e, pertanto, suggerisce al clinico un<br />
approccio terapeutico integrato ove trovino<br />
adeguata collocazione non solo i farmaci o gli<br />
interventi chirurgici tradizionali, ma anche la<br />
correzione dello stile di vita e, eventualmente,<br />
l’assunzione di antiossidanti.<br />
Infine, sono candidati al d-<strong>ROMs</strong> test tutti quei<br />
soggetti sottoposti ad interventi terapeutici sia di<br />
tipo farmacologico (es. antiblastici, pillola, ecc.) sia<br />
di tipo chirurgico (es. trapianti di organo, interventi<br />
di rivascolarizzazione, ecc.), compresa la dialisi, in<br />
grado di compromettere il bilancio ossidativo in<br />
senso proossidante. Le finalità è quella di<br />
identificare e prevenire lo stress ossidativo e le sue<br />
conseguenze e, in particolare, monitore l’efficacia<br />
di eventuali misure messe in atto per prevenire il<br />
danno tissutale da stress ossidativo.<br />
4. 1. 7. 2 Le aree di interesse del d–<strong>ROMs</strong> test<br />
Le aree di interesse del d–<strong>ROMs</strong> test, come<br />
ampiamente discusso (vedi paragrafo 4. 1. 6, studi<br />
clinici), sono numerose e coprono tutto l’ambito<br />
della medicina tradizionale.<br />
Limitando il campo alle applicazioni che hanno<br />
trovato finora il supporto di incontrovertibili<br />
evidenze sperimentali e cliniche, le branche in cui il<br />
d-<strong>ROMs</strong> test ha dimostrato la sua validità sono tra<br />
l’altro: la neuropsichiatria, la cardioangiologia, la<br />
broncopneumologia, l’epatologia, la nefrologia,<br />
l’ematologia, la diabetologia, l’endocrinologia,<br />
l’andrologia, la reumatologia, la dietologia e la<br />
dietoterapia, l’infettivologia, l’oncologia, la geriatria,<br />
la medicina sportiva e l’otorinolaringoiatria (tabella<br />
4. 8).<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
37<br />
Tabella 4. 8 Aree di interesse ed applicazioni del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Disciplina Esempi<br />
Neuropsichiatria<br />
• Malattia di Alzheimer<br />
• Sclerosi Laterale Amiotrofica<br />
Otorinolaringoiatria • Sindrome di Ménière<br />
• Stenosi carotidea<br />
• Cardiopatia ischemica<br />
Cardioangiologia • Ipertensione arteriosa<br />
• Vasculopatie periferiche<br />
• Insufficienza venosa<br />
Broncopneumologia • Broncopneumopatia cronica ostruttiva<br />
Epatologia • Epatopatia alcolica<br />
Nefrologia<br />
• Insufficienza renale cronica<br />
• Emodialisi<br />
Ematologia<br />
• Sindromi mielodisplastiche<br />
• Sindrome trombofilica<br />
Diabetologia<br />
• Diabete mellito 1<br />
• Diabete mellito 2<br />
Malattie dei ricambio<br />
• Obesità<br />
• Dislipidemie<br />
Endocrinologia • Terapia estroprogestinica<br />
Andrologia • Infertilità maschile<br />
Ostetricia • Gravidanza<br />
Neonatologia • Sindrome asfittica<br />
Malattie genetiche • Sindrome di Down<br />
Reumatologia • Artrite reumatoide<br />
Infettivologia • AIDS<br />
Oncologia<br />
• Linfomi e leucemie<br />
• Radio e chemioterapia<br />
Medicina dello sport<br />
• Calcio<br />
• Ciclismo<br />
4. 1. 7. 3 Considerazioni conclusive<br />
e punti di forza del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
• Il d-<strong>ROMs</strong> è l’unico test attualmente disponibile<br />
per la valutazione complessiva della componente<br />
lesiva, pro-ossidante, dello stress ossidativo (v.<br />
confronto con altre metodiche), che unisce a<br />
questa specificità a) una standardizzazione<br />
estremamente utile nella pratica clinica routinaria<br />
(vedi scelta delle unità di misura) e b) la<br />
possibilità di integrarsi perfettamente, nell’attuale<br />
panorama della diagnosi di laboratorio, con altri<br />
test sullo stress ossidativo (vedi TAS).<br />
• Il d-<strong>ROMs</strong> è un test estremamente preciso e<br />
affidabile, che ha superato brillantemente l’esito<br />
di sofisticate procedure di controllo, di<br />
valutazione e di validazione da parte di enti di<br />
ricerca di riconosciuta valenza internazionale<br />
(Università, Consiglio Nazionale delle Ricerche),<br />
come attestano le numerose pubblicazioni<br />
scientifiche recensite nella letteratura scientifica<br />
internazionale.<br />
• Il d-<strong>ROMs</strong> test richiede una strumentazione<br />
relativamente semplice (un fotometro<br />
termostatato ed una centrifuga) comunemente<br />
disponibili presso qualsiasi laboratorio di analisi;<br />
inoltre, esso può essere eseguito anche con una<br />
strumentazione dedicata (sistemi FRAS e<br />
FREE).<br />
• Il d -<strong>ROMs</strong> test possiede tutti i vantaggi di un<br />
mono test (rilevazione fotometrica diretta di<br />
un’unica miscela di reazione, contenente il<br />
campione e il reattivo cromogeno).<br />
• Il d-<strong>ROMs</strong> test, eseguito con la strumentazione<br />
dedicata, richiede una minima manualità, con<br />
notevole riduzione delle possibilità di errore; non
è richiesta, fin dall’inizio, alcuna particolare<br />
conoscenza di biochimica analitica; utile, invece<br />
l’esperienza che con esso si acquisisce.<br />
• Il d-<strong>ROMs</strong> test non è influenzato in maniera<br />
significativa dalla presenza di altre sostanze<br />
normalmente presenti nel sangue e dotate di<br />
attività antiossidante (es. bilirubina, acido urico<br />
ecc.). Evitare l’emolisi ed il prelievo in provette<br />
contenenti chelanti (quali EDTA o CITRATO)<br />
sono le uniche precauzioni richieste; è possibile,<br />
invece, eseguire il test sia su plasma fresco o<br />
eparinato che su siero o sangue intero.<br />
• Il d-<strong>ROMs</strong> è un test che si presta in maniera<br />
eccellente per l’impiego nella prevenzione e nel<br />
monitoraggio delle condizioni correlate allo stress<br />
ossidativo, anche in rapporto ad eventuali<br />
interventi terapeutici; lo confermano gli oltre 80<br />
lavori scientifici attualmente recensiti in<br />
letteratura.<br />
4. 2 Altri test<br />
4. 2. 1 Premessa<br />
Di fronte all’ipotesi di una valutazione globale<br />
dello stress ossidativo e/o di una valutazione<br />
comparativa fra test, è bene ricordare che test di<br />
laboratorio abitualmente impiegati per la<br />
valutazione dello stress ossidativo ne misurano o<br />
la componente pro-ossidante, come il d-<strong>ROMs</strong> test,<br />
o la componente antiossidante, come l’ OXY-<br />
Adsorbent test, il BAP e l’–SHp test (tabella 3. 1).<br />
Sulla base di queste considerazioni, il d-<strong>ROMs</strong><br />
test può essere confrontato con i test che<br />
esplorano la componente pro-ossidante dello<br />
stress ossidativo, mentre non ha alcun senso<br />
confrontare il d-<strong>ROMs</strong> test con il cosiddetto TAS<br />
(Total Antioxidant Status) o il BAP (vedi oltre).<br />
4. 2. 2 MDA test<br />
La MDA (malonilaldeide o malonildialdeide,<br />
CHO-CH2-CHO) rappresenta uno dei prodotti finali<br />
della catena di reazioni innescata nelle membrane<br />
cellulari dall'attacco ossidativo, da parte di alcuni<br />
radicali liberi dell'ossigeno (quali il radicale<br />
idrossile), degli acidi grassi poliinsaturi (quali l'acido<br />
arachidonico, costituente appunto dei fosfolipidi di<br />
membrana).<br />
Questa catena di reazioni, nel caso specifico<br />
dell'acido arachidonico, ha come specie chimica<br />
"chiave" dell'intero processo il radicale perossido.<br />
Quest'ultimo, infatti, è posto al "bivio" di due<br />
possibili metabolici, in quanto può essere<br />
convertito in idroperossido (mediante acquisizione<br />
di un H) oppure "imboccare" la via dei perossidi<br />
ciclici che, in seguito ad ulteriori attacchi ossidativi,<br />
porta ad una serie di prodotti terminali, tra i quali la<br />
MDA (vedi figura 2. 4). Questi ulteriori "attacchi<br />
ossidativi" e, quindi, la formazione di MDA, si<br />
realizzano grazie al superamento delle "difese"<br />
antiossidanti del medium nel quale avviene il<br />
processo ossidativo stesso.<br />
Capitolo 4. I test di laboratorio per la valutazione dello status ossidante<br />
38<br />
Pertanto, anche la presenza di MDA nei liquidi<br />
biologici sarà rilevabile solo quando tutto il sistema<br />
antiossidante endogeno del medium in cui è<br />
avvenuto l'attacco ossidativo si è esaurito.<br />
Sulla base di queste considerazioni, si evince che<br />
la MDA, prodotto quasi "terminale" dell'ossidazione<br />
di vari substrati biologici, quali gli acidi grassi<br />
poliinsaturi di membrana, rappresenta un indicatore<br />
piuttosto tardivo di stress ossidativo. Pertanto, uno<br />
dei maggiori svantaggi dei test basati sulla<br />
determinazione della MDA è relativo al fatto che<br />
essi non sempre sono in grado di poter svelare<br />
precocemente uno stato ossidativo alterato.<br />
Viceversa, il d-<strong>ROMs</strong> test si basa sulla<br />
determinazione del livello di idroperossidi, l'altra<br />
classe di composti che può formarsi a partire dal<br />
radicale perossido (specie chimica "chiave" della<br />
catena di reazione che porta all'ossidazione degli<br />
acidi grassi poliinsaturi di membrana). Al contrario<br />
della MDA, gli idroperossidi sono composti che si<br />
formano precocemente nella sequenza di reazioni<br />
ossidative dei lipidi di membrana, sono<br />
relativamente stabili e, conservando ancora una<br />
discreta capacità ossidante, possono essere<br />
rilevati grazie ad un adeguato sistema redox (come<br />
quello della N,N-dietil-parafenilendiammina del d-<br />
<strong>ROMs</strong> test). Pertanto, rispetto ai test che valutano<br />
la MDA, il d-<strong>ROMs</strong> test è in grado di svelare più<br />
precocemente stati ossidativi alterati, con enormi<br />
vantaggi sul piano clinico in termini di prevenzione<br />
e monitoraggio terapeutico.<br />
Inoltre, come riportato più volte in letteratura, la<br />
MDA va incontro a molte reazioni secondarie che<br />
riducono l'accuratezza dei risultati ottenuti; infatti, in<br />
quanto reattivo bifunzionale (doppio gruppo<br />
aldeidico CHO) la MDA può formare legami crociati<br />
con proteine o nucleotidi (dando luogo alla<br />
formazione di basi di Shiff) e può essere degradata<br />
dal perossido di idrogeno o ossidata da perossidasi<br />
e xantinaossidasi.<br />
Anche come marcatore di perossidazione<br />
lipidica la MDA si mostra scarsamente specifica;<br />
infatti, essa è stata identificata fra i prodotti di<br />
decomposizione ossidativa di amminoacidi, di<br />
carboidrati e di prostaglandine, Infine, la MDA può<br />
essere anche un prodotto di ossidazione dell'acido<br />
ascorbico, e ciò rende inutilizzabile il suo dosaggio<br />
ai fini di un eventuale monitoraggio terapeutico in<br />
corso di trattamenti antiossidanti.<br />
Viceversa, come dimostrano i numerosi studi<br />
pubblicati sull’argomento, il d-<strong>ROMs</strong> test è stato<br />
impiegato con successo nel monitoraggio<br />
terapeutico sia in corso di trattamenti antiossidanti<br />
che in corso di trattamenti farmacologici specifici.<br />
4. 2. 3 Determinazione dei lipoperossidi<br />
Per quanto riguarda i test di<br />
lipoperossidazione, esistono in commercio vari test<br />
etichettati come "Lipid hydroperoxide assay kit".<br />
Tali test presentano una serie di svantaggi, in<br />
quanto prevedono spesso una fase di
deproteinizzazione e di estrazione; inoltre,<br />
richiedono tempi lunghi (circa 30 minuti in tutto) e<br />
forniscono un'informazione molto limitata, in quanto<br />
gli idroperossidi lipidici costituiscono solo una<br />
classe degli idroperossidi totali.<br />
Viceversa, il d-<strong>ROMs</strong> test, non prevede alcun<br />
pretrattamento del campione biologico (se non la<br />
centrifugazione se si parte da sangue intero), è<br />
rapido (in cinetica, richiede non più di 3 minuti) e,<br />
soprattutto, fornisce un'indicazione globale sullo<br />
stato ossidante del sistema biologico testato, in<br />
quanto consente di dosare tutti gli idroperossidi<br />
(anche quelli derivati dal processo di ossidazione di<br />
altri substrati, non solo lipidici, quali ad esempio<br />
amminoacidi, peptidi, ecc.).<br />
4. 2. 4 Dosaggio degli isoprostani<br />
Il dosaggio dell’8-isoprostano a livello<br />
plasmatico viene generalmente effettuato mediante<br />
metodica immunoenzimatica. Due gli svantaggi<br />
segnalati: la possibile cross-reattività in fase<br />
analitica e l’informazione limitata a condizioni di<br />
stress ossidativo su base disrfeattiva.<br />
Ad ogni modo occorre segnalare che in un<br />
recente studio comparativo, l’analisi di regressione<br />
ha mostrato una correlazione diretta fra la<br />
concentrazione plasmatica di 8-isoprostano e i<br />
valori del d-<strong>ROMs</strong> (r=0.68; p
Capitolo 5. I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante<br />
Capitolo 5<br />
I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante<br />
5. 1 L’ OXY-Adsorbent test<br />
5. 1. 1 Principio<br />
5. 1. 1. 1 Presupposti scientifici<br />
Numerose sostanze presenti nel plasma sono<br />
in grado di “tamponare” la potenziale capacità<br />
ossidante delle specie reattive dell’ossigeno.<br />
Virtualmente, ogni agente, sia esso “endogeno”<br />
(es. GSH, proteine, bilirubina, acido urico,<br />
colesterolo, ecc.) o “esogeno” (es. carotenoidi,<br />
ascorbato, vitamina E, ecc.) in grado di “donare”<br />
elettroni blocca la potenziale lesività di un radicale<br />
libero, la cui reattività è proprio legata alla<br />
particolare “carenza” di queste piccole particelle<br />
negative.<br />
Ovviamente, qualsiasi “insulto” a tale barriera<br />
plasmatica può contribuire al danno ossidativo dei<br />
tessuti (figura 5. 1).<br />
Vaso sanguigno Cellula<br />
Figura 5. 1 Rappresentazione schematica della<br />
barriera antiossidante plasmatica<br />
L’OXY–Adsorbent test valuta la capacità del<br />
plasma di opporsi all’azione ossidante massiva di<br />
una soluzione di acido ipocloroso (HClO).<br />
Quest’ultimo, come è noto, è un agente<br />
altamente ossidante sia in vitro che in vivo.<br />
L’azione sbiancante e, talvolta, disinfettante, delle<br />
varechine, per esempio, è legata proprio all’azione<br />
ossidante dell’acido ipocloroso diluito in esse<br />
contenuto.<br />
D’altra parte, in condizioni patologiche – ad es.<br />
in seguito ad un’infezione batterica – i leucociti<br />
polimorfonucleati attivati producono HClO a partire<br />
dal perossido d’idrogeno (H2O2) e dallo ione cloruro<br />
(Cl - ), attraverso una reazione catalizzata dalla<br />
mieloperossidasi; una volta prodotto, l’acido agisce<br />
come ossidante naturale contro l’attacco dei<br />
microrganismi patogeni, contribuendo alla<br />
risoluzione dell’infezione.<br />
Il meccanismo chimico dell’azione ossidante<br />
dell’HClO non è conosciuto nei minimi particolari,<br />
ma è verosimile che esso preveda la generazione<br />
di intermedi radicalici dell’alogeno e la formazione<br />
di cloroammine (come discusso nel paragrafo 2. 2).<br />
40<br />
In ogni caso, nell’OXY-Adsorbent test la scelta<br />
del reattivo è caduta sull’acido ipocloroso perché<br />
questo è un antiossidante non solo potente ma<br />
anche “fisiologico” e, pertanto, meglio in grado di<br />
mimare situazioni che si verificano in vivo.<br />
Nell’OXY-Adsorbent, in pratica, un campione di<br />
plasma viene sottoposto, per un prederminato<br />
intervallo di tempo (10 minuti primi), all’azione<br />
ossidante massiva di una soluzione di acido<br />
ipocloroso a titolo noto, in evidente eccesso<br />
rispetto alla “capacità antiossidante” del campione<br />
da testare.<br />
L’acido ipocloroso, verosimilmente attraverso<br />
intermedi radicalici, ossiderà, compatibilmente con<br />
il suo potenziale di ossidazione, tutti i gruppi<br />
chimici disponibili delle molecole componenti la<br />
barriera antiossidante plasmatica.<br />
Al termine dell’intervallo previsto per<br />
l’ossidazione massiva, resterà nella soluzione<br />
iniziale un’aliquota di acido ipocloroso, in forma<br />
radicalica, non “adsorbito” dalla barriera<br />
plasmatica, ormai completamente ossidata.<br />
Se, a questo punto, si aggiunge al sistema un<br />
cromogeno (quale la N,N-dietilparafenilendiammina),<br />
in grado di reagire<br />
ossidandosi a spese dei radicali dell’acido ancora<br />
presenti in soluzione, questi ultimi potranno essere<br />
dosati fotometricamente, per differenza (rispetto ad<br />
un opportuno “standard” costituito dal solo acido<br />
ipocloroso).<br />
La concentrazione del complesso colorato sarà<br />
direttamente proporzionale alla concentrazione di<br />
HClO rimasta in eccesso e indirettamente<br />
proporzionale alla capacità antiossidante del<br />
plasma analizzato.<br />
In altri termini, tanto più elevata sarà la<br />
concentrazione di HClO rimasto in eccesso, tanto<br />
più alta sarà la concentrazione del complesso<br />
colorato e, quindi, tanto più bassa sarà la capacità<br />
antiossidante del plasma (o di altro campione<br />
biologico) in esame.<br />
5. 1. 1. 2 Aspetti biochimico-clinici<br />
Le performance dell’OXY-adsorbent test,<br />
eseguito sia con metodica manuale, sono state<br />
valutate mediante spettrofotometria.<br />
I parametri analitici presi in considerazione<br />
sono stati, soprattutto, la linearità della reazione e<br />
l’imprecisione analitica.<br />
Un’esempio di linearità del saggio è riportato<br />
nella figura 5. 2.
Figura 5. 2 Esempio di linearità della reazione<br />
dell’OXY-Adsorbent test<br />
Per quanto concerne l’imprecisione analitica, in<br />
uno studio il CV intra-serie, valutato su 20 aliquote<br />
di siero fresco, è stato pari al 2.2%, mentre il CV<br />
interserie su 20 aliquote di siero congelato è stato<br />
del 6.3%. In un altro trial, invece, il CV intraserie su<br />
20 aliquote di siero fresco è stato pari a 2.5%,<br />
quello interserie su 20 aliquote di siero congelato<br />
6.3%.<br />
5. 1. 2 Composizione del kit<br />
Il tipico kit dell’OXY-Adsorbent test contiene, di<br />
base, una soluzione ossidante (acido ipocloroso,<br />
reagente R1), una miscela cromogena (N,N-dietilparafenilendiammina,<br />
reagente R 2 ) ed un<br />
calibratore (siero di controllo a titolo noto, reagente<br />
R 3 ) (tabella 5. 1).<br />
Tabella 5. 1 Composizione del kit dell’OXY-Adsorbent test<br />
Reagente R1<br />
Reagente R2<br />
Reagente R3<br />
Volume di campione (μL)<br />
Reagenti*<br />
Capitolo 5. I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante<br />
Soluzione ossidante<br />
Miscela cromogena<br />
Calibratore<br />
Confezioni disponibili<br />
MC 434 MC 435<br />
Reagente R1 2 x 25 mL 4 x 25 mL<br />
Reagente R2 1 x 0.5 mL 1 x 1 mL<br />
Reagente R3 1 x 1 mL 1 x 1 mL<br />
*Conservare a 2-8°C. Tutti i reagenti restano stabili fino alla<br />
data di scadenza riportata sulla confezione se non esposti al<br />
contatto diretto con la luce solare.<br />
L’OXY-Adsorbent test può essere eseguito sia<br />
con un normale fotometro che con una<br />
strumentazione dedicata, quale il sistema FREE<br />
(vedi più avanti). In ogni caso, per calibrare<br />
l’apparecchiatura analitica è disponibile un siero di<br />
controllo liofilo a matrice umana a titolo noto.<br />
5. 1. 3 Condizioni di lavoro<br />
L’OXY-Adsorbent può essere eseguito su<br />
plasma o siero freschi nelle seguenti condizioni di<br />
lavoro: lunghezza d’onda 505 o 546 nm, cammino<br />
ottico 1 cm, e temperatura ambiente.<br />
L’analisi può essere eseguita solo con la<br />
modalità endpoint.<br />
41<br />
5. 1. 4 Procedura analitica<br />
Prima di procedere all’esecuzione del test<br />
bisogna preparare il calibratore, fornito<br />
opzionalmente col kit sotto forma di siero liofilo a<br />
matrice umana a titolo noto, indicato sull’etichetta.<br />
A questo scopo è sufficiente aggiungere al<br />
liofilizzato il volume di acqua distillata previsto<br />
(secondo le indicazioni del produttore) e mescolare<br />
la soluzione così ottenuta con delicatezza, avendo<br />
cura di attenersi alle indicazioni di carattere<br />
generale descritte in dettaglio nel paragrafo 4. 1. 4<br />
a proposito del d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di<br />
lavoro, si preparano tre soluzioni: il bianco<br />
reagente, il campione ed il calibratore. Tuttavia, a<br />
differenza degli altri test, quali il d-<strong>ROMs</strong> e il BAP,<br />
nell’OXY-Asdsorbent test il campione e il<br />
calibratore non possono essere usati come tali ma<br />
solo dopo averli diluiti con acqua distillata nel<br />
rapporto di 1:100, secondo lo schema riportato in<br />
tabella:<br />
Tabella 5. 2 Procedura analitica dell’OXY-Adsorbent test<br />
Bianco reag. Campione Calibratore<br />
Reagente R1 1 mL 1 mL 1 mL<br />
H2O distillata 10 μL − −<br />
Campione* − 10 μL −<br />
Calibratore* − − 10 μL<br />
*In soluzione diluita 1:100<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate<br />
delicatamente e lasciate ad incubare a temperatura<br />
ambiente per 10 minuti.<br />
Appena terminata l’incubazione, dopo aver<br />
aggiunto a ciascuna di esse 10 L di reagente R2<br />
(miscela cromogena), si passa immediatamente<br />
alla lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a<br />
505 nm (A505) o 546 nm (A546). Ai valori di<br />
assorbanza ottenuti per il campione e per il<br />
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza<br />
del bianco reagente. I risultati del test, ovvero la<br />
capacità antiossidante del campione analizzato,<br />
saranno espressi in moli di HClO/mL di<br />
campione, secondo la formula:<br />
(Abs bianco – Abs campione)<br />
(Abs bianco – Abs standard)<br />
x [standard]<br />
Dove:<br />
• Abs sono i valori di assorbanza (del bianco, del<br />
campione e dello standard)<br />
• [standard ] è la concentrazione dello standard.<br />
Normalmente, 1 mL di plasma umano è in<br />
grado di “adsorbire” almeno 350 μmoli di HClO.<br />
5. 1. 5 Interpretazione dei risultati<br />
Valori inferiori a 350 μmoli di HClO indicano<br />
una riduzione dello “spessore” della barriera<br />
antiossidante e correlano direttamente con la<br />
gravità del danno da questa subito. Infatti, quanto<br />
più elevato sarà l’“eccesso” di radicali dell’HClO<br />
rilevato fotometricamente al termine dell’intervallo
previsto per l’ossidazione massiva, tanto più la<br />
barriera risulterà ridotta, e viceversa (tabella 5. 2).<br />
Tabella 5. 2 Gravità dello stress ossidativo in rapporto<br />
ai valori forniti dall’OXY-Adsorbent test<br />
μmoli HClO/mL Grado di compromissione della<br />
di campione<br />
barriera antiossidante<br />
350-320 Riduzione lieve<br />
319-280 Riduzione media<br />
279-250 Riduzione elevata<br />
350 μmoli HClO/mL di campione<br />
5. 1. 6 Studi clinici<br />
L’OXY-Adsorbent test si è dimostrato molto<br />
affidabile nella valutazione della capacità<br />
antiossidante totale del plasma in diversi studi<br />
clinici, integrando i risultati del d-<strong>ROMs</strong> test nella<br />
valutazione globale dello stress ossidativo. Esso va<br />
sempre eseguito nei casi in cui i valori di d-<strong>ROMs</strong><br />
test risultano particolarmente elevati.<br />
In particolare, si è visto che pazienti DOWN<br />
esprimono, rispetto ai controlli, valori<br />
significativamente più elevati del d-<strong>ROMs</strong> test e più<br />
bassi dell’OXY-Adsorbent test (p
agione di una barriera antiossidante praticamente<br />
normale o addirittura superiore alla norma.<br />
A conclusione di questa breve panoramica<br />
sulle applicazioni cliniche, occorre sottolineare che<br />
l’OXY-Adsorbent test, con opportuni accorgimenti<br />
tecnici, può essere eseguito anche su preparati o<br />
estratti vegetali in fase acquosa (es. succhi di<br />
frutta, succo di pomodoro, vini, ecc.). Esso,<br />
pertanto, è utilissimo per valutare l’attività<br />
antiossidante di un prodotto in soluzione acquosa<br />
che vanti, sulla carta, proprietà anti-radicali liberi.<br />
5. 2 Il BAP test<br />
5. 2. 1 Presupposti scientifici e principio<br />
L’insieme delle sostanze presenti nel plasma<br />
contribuisce, come si è detto a proposito dell’OXY-<br />
Adsorbent test, alla costituzione della cosiddetta<br />
barriera antiossidante plasmatica. Il potere<br />
(antiossidante) di quest’ultima può essere valutato<br />
saggiandone, non solo la capacità di opporsi<br />
all’ossidazione da parte di un predeterminato<br />
agente ossidante (l’acido ipocloroso, nell’OXY-<br />
Adsorbent test), ma anche, più semplicemente, di<br />
ridurre un derminato substrato, ossidante,<br />
adeguatamente prescelto sulla base del suo<br />
potenziale redox.<br />
In ultima analisi, infatti, la cosiddetta attività<br />
antiossidante altro non è, in termini rigorosamente<br />
chimici, che un’attività riducente, cioè<br />
idrogeno/elettron-donatrice.<br />
Se la riduzione del substrato ossidante<br />
(“sensore”) viene fatta avvenire in presenza di un<br />
agente (“cromogeno”) – in grado di modificare le<br />
sue caratteristiche cromatiche (es. cambiando<br />
colore o decolorandosi) – nel momento in cui tutto<br />
il sistema è completo, mettendo a contatto<br />
un’aliquota di plasma con il substrato ossidante e il<br />
cromogeno, sarà anche possibile, per via<br />
fotometrica, con opportuni filtri, “leggere” il segnale<br />
indotto dall’avvenuta riduzione e, in definitiva,<br />
quantificare l’attività antiossidante presente nel<br />
campione di plasma analizzato in termini di attività<br />
riducente (rispetto a quel determinato substrato<br />
utilizzato come ossidante-sensore).<br />
Nel BAP (Biological Antioxidant Potential)<br />
l’agente ossidante – utilizzato come “sensore” – è il<br />
cloruro ferrico (FeCl3) e, quindi, il “potere”<br />
antiossidante, ovvero riducente, del plasma, viene<br />
valutato misurando la capacità del campione in<br />
esame di ridurre il ferro di una soluzione di cloruro<br />
ferrico da ione ferrico (Fe 3+ ) a ione ferroso (Fe 2+ ).<br />
I risultati del test sono espressi come μmoli di<br />
ferro ridotto per L di campione.<br />
Le variazioni di assorbanza sono lineari in un<br />
ampio range di concentrazione, come documentato<br />
da prove eseguite non solo su plasma, ma anche<br />
su soluzioni contenenti uno o più antiossidanti in<br />
forma pura (es. trolox, α−tocoferolo, ascorbato,<br />
acido urico ecc.). Inoltre, non è stata segnalata<br />
alcuna interazione apparente fra antiossidanti.<br />
Capitolo 5. I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante<br />
43<br />
Nel BAP test il “cromogeno” impiegato è il<br />
tiocianato, una sostanza in grado di legarsi agli ioni<br />
ferrici formando un complesso colorato che<br />
assorbe a 505 nm. Nel momento in cui tali ioni<br />
ferrici sono ridotti a ioni ferrosi il suddetto<br />
complesso si decolora. Dopo una breve<br />
incubazione a 37°C, l’entità della decolorazione –<br />
misurata in termini di A505 rispetto ad uno standard<br />
a titolo noto, un siero di controllo, aggiustando lo<br />
zero con acqua distillata – sarà direttamente<br />
proporzionale alla concentrazione degli ioni ferrosi,<br />
ovvero alla capacità ferrico-riducente degli<br />
antiossidanti presenti nel campione, che può<br />
essere assunta, in definitiva, come una misura del<br />
“potere antiossidante” del plasma testato.<br />
5. 2. 2 Composizione del kit<br />
Il tipico kit del BAP test contiene, di base, una<br />
soluzione di tiocianato (reagente R1), una soluzione<br />
di cloruro ferrico, FeCl3 (reagente R 2 ) ed un<br />
calibratore (siero umano liofilizzato) (tabella 5. 3).<br />
Tabella 5. 3 Composizione del kit del BAP test<br />
Reagente R1<br />
Reagente R2<br />
Reagenti*<br />
Soluzione di tiocianato<br />
Soluzione di cloruro ferrico (FeCl3)<br />
Calibratore Siero umano liofilizzato a titolo noto<br />
Confezioni disponibili<br />
MC 436 MC 437<br />
Reagente R1 1 x 50 mL 2 x 50 mL<br />
Reagente R2 1 x 2.5 mL 1 x 5.0 mL<br />
Calibratore 1 x 2 mL 1 x 2 mL<br />
*Conservare a 2-8°C. Tutti i reagenti restano stabili fino alla<br />
data di scadenza riportata sulla confezione se non esposti al<br />
contatto diretto con la luce solare.<br />
Il BAP test può essere eseguito sia con un<br />
normale fotometro che con una strumentazione<br />
dedicata, quale il sistema FREE (e, a breve, il<br />
sistema FRAS).<br />
In ogni caso, per calibrare l’apparecchiatura<br />
analitica è disponibile, nella confezione, un siero di<br />
controllo liofilo a matrice umana.<br />
5. 2. 3 Condizioni di lavoro<br />
Il BAP test può essere eseguito su siero o<br />
plasma fresco eparinizzato nelle seguenti<br />
condizioni di lavoro: lunghezza d’onda 505 nm,<br />
cammino ottico 1 cm, temperatura 37°C.<br />
L’analisi è eseguita con la modalità<br />
differenziale.<br />
5. 2. 4 Procedura analitica<br />
Prima di procedere all’esecuzione del test<br />
bisogna preparare il calibratore, fornito nel kit sotto<br />
forma di siero liofilo a matrice umana a titolo noto,<br />
indicato sull’etichetta.<br />
A questo scopo è sufficiente aggiungere 2 mL<br />
di acqua distillata al liofilizzato e mescolare la<br />
soluzione così ottenuta con delicatezza, avendo<br />
cura di attenersi alle indicazioni di carattere
generale descritte in dettaglio nel paragrafo 4. 1. 4<br />
a proposito del d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di<br />
lavoro, si preparano tre soluzioni: il bianco<br />
reagente, il campione ed il calibratore, secondo la<br />
procedura indicata nella seguente tabella:<br />
Tabella 5. 4 Procedura analitica del BAP test<br />
Bianco reag. Campione Calibratore<br />
Reagente R1 1 mL 1 mL 1 mL<br />
Reagente R2 50 μL 50 μL 50 μL<br />
H2O distillata 10 μL − −<br />
Campione − 10 μL −<br />
Calibratore − − 10 μL<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate<br />
delicatamente e lasciate ad incubare a 37°C per 5<br />
minuti. Terminata l’incubazione, esse vanno<br />
sottoposte a lettura fotometrica, misurando<br />
l’assorbanza a 505 nm, dopo aver azzerato con<br />
acqua distillata.<br />
L’attività antiossidante ferro-riducente del<br />
plasma viene espressa come μmoli di ferro ferrico<br />
ridotto per L di campione, secondo la formula:<br />
[Abs bianco reagente Abs campione]<br />
[Abs bianco reagente Abs calibratore]<br />
Capitolo 5. I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante<br />
x [calibratore]<br />
dove:<br />
- ABS è l’assorbanza misurata a 505 nm<br />
- [calibratore] è la concentrazione del calibratore<br />
espressa in μmoli/L.<br />
5. 2. 5 Interpretazione dei risultati<br />
Il range stimato del BAP test negli individui<br />
normali è 2200–4000 μmoli/L. E’ buona prassi,<br />
comunque, che ogni laboratorio determini<br />
l’ampiezza di oscillazione della variabilità biologica<br />
eseguendo un congruo numero di test su soggetti<br />
normali. In ogni caso, una riduzione dei valori del<br />
test al di sotto dell’intervallo indicato appare<br />
direttamente correlata con una ridotta efficienza<br />
della barriera antiossidante plasmatica.<br />
Valori di Riferimento<br />
espressi in μmol/L di sostanze antiossidanti come la Vitamina C<br />
> 2200 VALORE OTTIMALE<br />
2200 - 2000 VALORE DI ATTENZIONE O BORDER LINE<br />
2000−1800 STATO DI DISCRETA CARENZA<br />
1800-1600 STATO DI CARENZA<br />
1600-1400 STATO DI FORTE CARENZA<br />
< 1400 STATO DI FORTISSIMA CARENZA<br />
5. 3 -SHp test<br />
5. 3. 1 Principio<br />
44<br />
I tioli rappresentano una componente<br />
qualitativamente significativa della barriera<br />
antiossidante plasmatica (figura 5. 6).<br />
-SH Altri gruppi chimici<br />
Figura 5. 6 Rappresentazione schematica della barriera<br />
antiossidante plasmatica<br />
Infatti, i gruppi sulfidrilici delle molecole dei<br />
componenti plasmatici (quali, ad esempio, le<br />
proteine, P-SH) possono opporsi alla fase di<br />
propagazione dei processi perossidativi inattivando<br />
i radicali sia alcossilici (RO*) che idrossilici (HO*),<br />
rispettivamente, secondo le reazioni:<br />
2 P-SH + 2 RO* à 2 PS* + 2 ROH à P-S-S-P + 2 ROH<br />
2 P-SH + 2 HO* à 2 PS* + 2 H2O à P-S-S-P + 2 H2O<br />
In pratica, considerando l’evento dal punto di<br />
vista stechiometrico, una coppia di gruppi tiolici può<br />
ossidare una coppia di radicali alcossililici (RO*) o<br />
idrossilici (*OH), cedendo ad essa due elettroni<br />
(sotto forma di due atomi di idrogeno). In questo<br />
modo ambedue i tipi di radicali vengono inattivati: i<br />
radicali alcossilici sono rilasciati come molecole di<br />
alcool mentre i radicali idrossilici diventano innocue<br />
molecole d’acqua. I gruppi tiolici ormai ossidati,<br />
invece, reagiscono tra loro, generando ponti<br />
disolfuro.<br />
Va ricordato, in tale contesto, che i gruppi<br />
sulfidrilici ossidandosi contrastano l’attacco di<br />
alcuni radicali liberi istolesivi, ma, quando si<br />
formano nel contesto di molecole proteiche,<br />
possono avere conseguenze indesiderate. Per<br />
esempio la formazione di un ponte disolfuro fra i<br />
residui di cisteina di due diverse proteine può<br />
portare ad una sorta di “polimerizzazione”. Se il<br />
ponte disolfuro, invece, si crea nell’ambito della<br />
stessa catena, la proteina può modificare<br />
stabilmente la sua conformazione. In ambedue i<br />
casi è possibile che le proteine coinvolte nella<br />
formazione di legami –S–S– subiscano<br />
un’alterazione delle proprie capacità funzionali.
L’ –SHp test si basa sulla capacità dei gruppi<br />
–SH di sviluppare un complesso colorato<br />
determinabile fotometricamente (picco di massima<br />
assorbanza, 405 nm) quando reagiscono con<br />
l’acido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB). Il<br />
“titolo” di tioli è direttamente proporzionale<br />
all’intensità del colore rilevato strumentalmente.<br />
Il test ha mostrato un grado accettabile di<br />
imprecisione analitica. Infatti, il CV intraserie su 20<br />
aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello<br />
interserie su 20 aliquote di siero congelato 3.3%.<br />
5. 3. 2 Composizione del kit<br />
Un tipico kit di –SHp test contiene, di base, una<br />
soluzione tampone (reagente R1), una miscela<br />
cromogena (DTNB, reagente R2) e un calibratore<br />
(L-cisteina in polvere predosata, reagente R3)<br />
(tabella 5. 5).<br />
Tabella 5. 5 Composizione del kit dell’ –SHp test kit<br />
Reagenti*<br />
Reagente R1 Soluzione tampone (pH 7.6)<br />
Reagente R2<br />
Miscela cromogena**<br />
Reagente R3<br />
L-cisteina***<br />
Confezioni disponibili<br />
MC MC<br />
Reagente R1 1 x 50 mL 4 x 50 mL<br />
Reagente R2 1 x 1 mL 1 x 4 mL<br />
Reagente R3 1 x 1 mL 1 x 1 mL<br />
*Conservare a 2-8°C. Tutti i reagenti restano stabili fino alla<br />
data di scadenza riportata sulla confezione se non esposti al<br />
contatto diretto con la luce solare.**DTNB. ***Polvere<br />
predosata per la preparazione dello standard.<br />
L’analisi può essere effettuata sia con una<br />
strumentazione dedicata, quale il sistema FREE,<br />
sia con un normale fotometro.<br />
5. 3. 3 Condizioni di lavoro<br />
L’ –SHp test va eseguito su siero o plasma<br />
freschi nelle seguenti condizioni di lavoro:<br />
lunghezza d’onda 405 nm, cammino ottico 1 cm,<br />
temperatura ambiente. Si può eseguire l’analisi<br />
solo con la modalità end point.<br />
5. 3. 4 Procedura analitica<br />
Prima di procedere all’esecuzione del test<br />
bisogna preparare anzitutto lo standard, fornito<br />
opzionalmente col kit sotto forma di siero liofilo a<br />
matrice umana a titolo noto, indicato sull’etichetta.<br />
A questo scopo è sufficiente aggiungere al<br />
liofilizzato il volume di acqua distillata previsto<br />
(indicato dal produttore) e mescolare la soluzione<br />
così ottenuta con delicatezza, avendo cura di<br />
attenersi alle indicazioni di carattere generale<br />
descritte in dettaglio nel paragrafo 4. 1. 4 a<br />
proposito del d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di<br />
lavoro, si prepara, quindi, la soluzione del<br />
calibratore per i gruppi tiolici (L-cisteina). In pratica<br />
si scioglie la L-cisteina in polvere (R3) in 25 mL di<br />
acqua distillata e si prepara da essa, per diluizione,<br />
una soluzione 496 mM di gruppi tiolici. Tale<br />
Capitolo 5. I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante<br />
45<br />
soluzione è stabile per 2-3 hr e 2-3 giorni, a<br />
temperatura ambiente o +4°C, rispettivamente. A<br />
questo punto avendo pronti lo standard di siero e il<br />
calibratore “chimico”, si preparano cinque<br />
soluzioni, seguendo lo schema riportato nella<br />
seguente tabella:<br />
Tabella 5. 6 Procedura analitica dell’ –SHp test<br />
Bianco<br />
reagente<br />
Bianco<br />
standard<br />
Bianco<br />
campione<br />
Campione Standard<br />
R1 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL<br />
R2 20 μL – – 20 μL 20 μL<br />
Acqua 50 μL 20 μL 20 μL – –<br />
Standard – 50 μL – – 50 μL<br />
Campione – – 50 μL 50 μL –<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate<br />
delicatamente e lasciate ad incubare a temperatura<br />
ambiente per 3-4 minuti. Terminata l’incubazione,<br />
esse vanno sottoposte a lettura fotometrica,<br />
misurando l’assorbanza a 405 nm.<br />
I risultati del test, ovvero la capacità<br />
antiossidante o titolo tiolico del campione<br />
analizzato, saranno espressi in moli di –SH/L di<br />
campione, secondo la formula:<br />
[Abs campione-(bianco campione + Abs bianco reagente)]<br />
[Abs standard-(Abs bianco standard + Abs bianco reagente)]<br />
x 496<br />
dove: Abs sono i valori di assorbanza a 405 nm<br />
osservate per le soluzioni analizzate.<br />
5. 3. 5 Interpretazione dei risultati<br />
Il range negli individui normali è 450–650<br />
μmoli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto<br />
di questo intervallo si correla direttamente con una<br />
ridotta efficienza della barriera antiossidante tiolica.<br />
5. 3. 6 Studi clinici<br />
Il titolo dei tioli, determinato mediante l’–SHp<br />
test, è risultato più basso rispetto ai controlli nella<br />
sindrome di Down (figura 5. 7), ove, come si è visto<br />
in precedenza, anche l’OXY-Adsorbent fornisce<br />
valori inferiori alla norma, contro il palese<br />
incremento del d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
U CARR<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Controlli<br />
(n=20)<br />
p
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
800<br />
U CARR<br />
200<br />
100<br />
0<br />
d-<strong>ROMs</strong> test<br />
Controlli<br />
(n=8)<br />
p
Capitolo 6. La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo<br />
Capitolo 6<br />
La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo<br />
6. 1 Il sistema FREE<br />
Il FREE è un sistema analitico integrato che<br />
consente di eseguire, grazie alle sue particolari<br />
specifiche tecniche, qualsiasi tipo di analisi chimica<br />
basata sul principio della fotometria (nell’ambito<br />
dell’ampio campo spettrale per il quale è<br />
predisposto) (tabella 6. 1).<br />
Tabella 6. 1 Caratteristiche tecniche del sistema FREE<br />
Caratteristiche generali<br />
Dimensioni 30 x 30 x 36 (h) cm<br />
Peso 8 kg<br />
Alimentazione 115 – 230 VAC 50-60Hz<br />
Consumo 83 VA<br />
Fusibile linea<br />
Sistema fotometrico<br />
T 1AL<br />
Sorgente luminosa Lampada alogena a lunga durata (1)<br />
Campo spettrale 320 – 680 nm<br />
Filtri di corredo 340, 405, 505, 546, 578, 630 (2)<br />
Filtri opzionali 2 posizioni per altrettanti filtri opzionali<br />
Vano lettura 1 cuvetta (volume minimo 400 μL)<br />
Cammino ottico 1 cm<br />
Sistema di termostatazione A secco, Peltier riscaldante-raffreddante<br />
Sensibilità termostatazione 0.1 °C<br />
Stabilizzaz. termostatazione Da 25 a 37 °C in 7 min<br />
Fotorivelatore Rivelatore ottico allo stato solido<br />
Campo di misura Da -200 a +2500 OD<br />
Linearità fotometrica Da –0.3000 a 2.9999 O. D. (>1%)<br />
Risoluzione 0.0001 O. D.<br />
Accuratezza fotometrica ±2% a 700 O. D.<br />
Ripetibilità ± 1 digit<br />
Deriva Inferiore a 0.005 in O. D. per ora<br />
Tempo di misura 0.3 secondi<br />
Azzeramento<br />
Blocco termostatico<br />
Automatico<br />
A 9 posti (3)<br />
Programmazione ed elaborazione dati<br />
Tastiera 17 tasti funzionali e 1 tasto per il timer (4)<br />
Software Residente su memoria FLASH (5)<br />
Programmi memorizzabili Fino a 150<br />
Metodiche programmabili Cinetica, end point, fixed time (6)<br />
Tipi di fitting Lineare, punto a punto, cubico<br />
Interfaccia RS 232 a 9 poli per collegamento al PC<br />
Display Alfanumerico a cristalli liquidi (7)<br />
Stampante Grafica, termica, con 192 punti / riga (8)<br />
Presentazione risultati Dati gezzi, calibrazione, cinetiche<br />
Altri dispositivi<br />
Condizioni operative<br />
Autodiagnosi, allarmi per patologie<br />
Temperatura 15-32°C (in funzione) – 0-50°C (spento)<br />
Umidità relativa 20-80 % (in funzione) – 0-90% (spento)<br />
Altitudine < 2000 m (in funzione)<br />
Sicurezza DIRETTIVA 73/23/CEE (9)<br />
Compatibilità elettromagnetica<br />
(1)<br />
Da 20 W<br />
(2)<br />
Con 8 nm di banda passante<br />
DIRETTIVA 89/336/CEE<br />
(3)<br />
Per cuvette quadrate e cilindriche<br />
(4)<br />
12 per inserim. dati alfanum., 2 per comandi stampa, 3 per gest. fotom.<br />
(5)<br />
Aggiornabile mediante porta seriale<br />
(6)<br />
Con Fattore K<br />
(7)<br />
4 righe da 20 caratteri<br />
(8)<br />
Stampa automatica dei risultati<br />
(9)<br />
NORME: CEI-EN 61010-1, CLASSE I; CATEGOR. INSTALLAZIONE II<br />
Il FREE è un sistema “aperto” che riunisce in<br />
una sola unità analitica un fotometro ed un un vano<br />
di termostatazione a secco, ambedue gestiti da un<br />
sistema computerizzato in grado di ricevere,<br />
elaborare ed esportare dati.<br />
47<br />
Le dimensioni abbastanza contenute e la<br />
funzionalità del design rendono il FREE uno<br />
strumento facilmente collocabile in qualsiasi<br />
contesto, dal laboratorio alla farmacia, dallo studio<br />
medico all’ospedale, dal centro benessere alla<br />
clinica.<br />
Il fotometro, alimentato da lampada alogena e<br />
con fotorivelatore allo stato solido, è predisposto<br />
per 8 filtri, 6 dei quali disponibili di default (340,<br />
405, 505, 546, 578 e 630 nm) e due opzionali, in<br />
grado di coprire il campo spettrale compreso fra<br />
320 e 680 nm. Il sistema di termostatazione, del<br />
tipo Peltier, copre l’intero intervallo fra 20 e 45 °C<br />
(con una sensibilità di 0.1 °C e un tempo di<br />
stabilizzazione, da 25 a 37°C, di circa 7 min).<br />
Il vano di termostatazione, a secco, consente<br />
di alloggiare 9 cuvette a base quadrata o cilindrica.<br />
Tutte le funzioni del FREE sono controllate da<br />
un microprocessore con memoria FLASH<br />
(aggiornabile attraverso porta seriale) che<br />
consente di memorizzare fino a 150 programmi. E’<br />
così possibile fissare per ciascuna metodica,<br />
attraverso una tastiera alfanumerica a membrana,<br />
la lunghezza d’onda, la temperatura, la durata<br />
dell’incubazione, il tipo di reazione, l’eventuale K<br />
factor, l’unità di misura, e i valori di normalità.<br />
L’ouput è affidato ad un display a cristalli liquidi,<br />
per le operazioni di programmazione, e ad una<br />
stampante termica, per la stampa dei risultati, delle<br />
curve di calibrazione e delle cinetiche. Una porta<br />
seriale collegabile ad un PC consente non solo<br />
l’aggiornamento del software ma anche<br />
l’esportazione dei dati.<br />
l sistema FREE viene fornito come tale e, su<br />
richiesta del cliente, insieme con una<br />
minicentrifuga (6000 r.p.m.), per la separazione del<br />
siero/plasma, dotata di 6 posizioni, nelle quali<br />
possono essere inserite anche le cuvette destinate<br />
alla lettura fotometrica.<br />
Sono disponibili, inoltre, degli accessori (es.<br />
micropipette), del materiale monouso (es. puntali,<br />
provette), degli standard (es. sieri di controllo) e dei<br />
kit dedicati.<br />
A quest’utimo proposito, il FREE, anzitutto, è<br />
predisposto per l’esecuzione dell’intero pannello di<br />
test per la valutazione globale dello stress<br />
ossidativo, ossia il d-<strong>ROMs</strong> test, l’OXY-adsorbent<br />
test, il BAP test e l’ –SHp test. La sigla FREE,<br />
infatti, sta per Free Radical Elective Evaluator,<br />
ossia valutatore elettivo di radicali liberi. In tal<br />
senso, il FREE è un apparecchio “dedicato”. Esso,<br />
tuttavia, consente di effettuare, mediante apposita<br />
programmazione, anche la maggior parte dei test<br />
laboratoristici di routine e, pertanto, costituisce un<br />
sistema “aperto” (tabella 6. 2).
Tabella 6. 2 <strong>Test</strong> eseguibili con il sistema FREE<br />
Scopo Matrice Esempi<br />
Valutare stress Plasma d-<strong>ROMs</strong> test, OXY-adsorbent test<br />
ossidativo o siero<br />
BAP test, −SHp test<br />
Sangue intero Ematrocrito, emoglobina<br />
Acido urico, albumina, α−amilasi,<br />
bilirubina (diretta e totale), calcio,<br />
creatina chinasi, cloruri,<br />
colesterolo (totale, libero,<br />
Chimica clinica<br />
di routine<br />
Plasma o siero<br />
HDL), creatinina, ferro, fosfatasi<br />
alcalina, fosforo inorganico,<br />
fruttosammina, γ−GT, glucosio,<br />
GPT(AST), GPT (ALT), lipasi,<br />
magnesio, potassio, proteine<br />
totali, trigliceridi, urea<br />
Urina Acido citrico, indolo, proteine<br />
Liquido seminale Acido citrico<br />
Ideale per approfondire le problematiche<br />
diagnostiche dello stress ossidativo, il FREE è un<br />
sistema progettato specificamente per i ricercatori<br />
e per gli operatori dei laboratori di analisi. Tuttavia,<br />
la straordinaria semplicità d’uso, unitamente<br />
all’estrema flessibilità, rende questo apparecchio<br />
utilizzabile, con un minimo di esperienza, in<br />
qualsiasi contesto diagnostico (studi medici,<br />
cliniche, ospedali, farmacie, centri benessere,<br />
palestre, ecc.), con il duplice vantaggio per il<br />
paziente di poter ottenere il risultato dei test<br />
effettuati su di lui in tempo reale, senza il disagio di<br />
doversi rivolgere ad un laboratorio di analisi<br />
esterno. Il FREE, infine, consente di eseguire test a<br />
costi bassissimi insieme ad un preciso controllo di<br />
qualità.<br />
6. 2 Il sistema FRAS<br />
Il FRAS (release 3) è un sistema analitico<br />
integrato costituito da un fotometro dedicato con<br />
centrifuga incorporata progettato per consentire<br />
esclusivamente l’esecuzione del d-<strong>ROMs</strong> test su<br />
sangue intero, ottenuto generalmente mediante<br />
prelievo di sangue capillare. Esso, pertanto, viene<br />
fornito insieme al kit del d-ROMS test che ne<br />
costituisce parte integrante.<br />
La sigla FRAS sta per Free Radical Analytical<br />
System, ossia sistema per l’analisi dei radicali<br />
liberi.<br />
L’aspetto tecnologico maggiormente innovativo<br />
del FRAS 3 è l'integrazione della centrifuga nel<br />
modulo analitico, che consente all’operatore di<br />
disporre di un unico strumento in grado di svolgere<br />
sia le funzioni di fotometro che quelle di centrifuga.<br />
Benché la procedura del d-<strong>ROMs</strong> test sia<br />
abbastanza semplice, FRAS 3 dispone di un<br />
display autoistruente che fornisce, oltre alle<br />
temperature del fotometro e della centrifuga, anche<br />
i messaggi operativi (in varie lingue). Ciò è<br />
possibile grazie al particolare software che gestisce<br />
la strumentazione e che può essere aggiornato<br />
attraverso il collegamento con un normale PC.<br />
Particolarmente interessante è la gestione<br />
dell’output. Infatti, FRAS 3 consente, grazie alla<br />
sua piccola stampante, l’emissione di uno scontrino<br />
con intestazione personalizzabile e,<br />
Capitolo 6. La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo<br />
48<br />
opzionalmente, grazie ad una porta seriale<br />
(RS232), l’archiviazione dei dati in un normale PC.<br />
FRAS 3, infine, dispone di un sistema di<br />
sicurezza, che blocca la centrifuga al momento<br />
dell’apertura dello sportello, e può essere collegato<br />
a qualsiasi tipo di alimentazione di rete (tabella 6.<br />
3).<br />
Tabella 6. 3 Caratteristiche tecniche del FRAS 3<br />
Caratteristiche generali<br />
Dimensioni 39 x 26 x 12 cm<br />
Peso Circa 3,9 kg<br />
Alimentazione 85 ÷ 265 VAC, 50 ÷ 60 Hz<br />
Consumo 50 W<br />
Sistema fotometrico<br />
Lampada Focalizzata a lunga durata<br />
Campo spettrale 505 nm ottenuti con filtro interferenziale (1)<br />
Principio di misura Assorbanza. Legge di Lambert e Beer.<br />
Vano lettura 37°C con temperatura visualizzata sul display<br />
Centrifuga<br />
Velocità di rotazione 6000 rpm ± 5%<br />
Capacità 2 – 4 posti<br />
Temperatura 37°C visualizzata in tempo reale sul display<br />
Software<br />
Programma Residente su memoria FLASH (4)<br />
Interfaccia RS 232 a 9 poli per collegamento al PC<br />
Display<br />
LCD alfanumerico retroilluminato (3)<br />
Stampante<br />
Tipologia Grafica, termica, con 192 dots per linea<br />
Emissione risultato Stampa automatica del risultato (2)<br />
Autodiagnosi<br />
Automatica con visualizzazione degli errori<br />
Condizioni di esercizio<br />
Temperatura Ambiente, 15 ÷ 35°C<br />
Umidità relativa Fino ad un massimo del 90%<br />
Sicurezza DIRETTIVA 73/23/CEE (5)<br />
Compat. elettromag. DIRETTIVA 89/336/CEE<br />
(1)<br />
Con 8 nm di larghezza di banda<br />
(2)<br />
Con possibilità di personalizzare l'intestazione e ripetere la stampa<br />
(3)<br />
Con 4 righe da 20 caratteri<br />
(4)<br />
Aggiornabile con collegamento seriale a PC<br />
(5)<br />
NORME: CEI-EN 61010-1, CLASSE I; CATEGOR. INSTALLAZIONE II<br />
Il kit del d-ROMS test per il FRAS 3 è fornito in<br />
una pratica confezione da 50 test (tabella 6. 4).<br />
Tabella 6. 4 Il kit del d-<strong>ROMs</strong> test dedicato per il FRAS 3<br />
Componente Descrizione Confezione Conservazione<br />
Lancetta Dispositivo per digito- 2 x 25 pezzi Temperatura<br />
pungidito puntura a scatto, sterile,<br />
monouso<br />
ambiente<br />
Capillare Sottilissimo cilindro di 1 x 50 pezzi Temperatura<br />
vetro della capacità di 20<br />
μL per la raccolta del<br />
sangue capillare<br />
ambiente<br />
Reagente R1 Miscela cromogena in 1 flacone da 1 2-8 °C, al riparo<br />
contenitore con mL dalla luce diretta*<br />
Reagente R2<br />
dispensatore a gocce<br />
Soluzione tampone (pH 2 x 25 pezzi 15-25°C, al riparo<br />
4.8) contenente<br />
dalla luce diretta*<br />
stabilizzanti e conservanti<br />
in miniprovetta<br />
predosata, tipo “Eppendorf”<br />
(contenitore di<br />
forma conica con tappo<br />
integrato, incolore,<br />
monodose, monouso)<br />
Cuvetta Cuvetta in polietilene 2 x 25 pezzi Temperatura<br />
tappabile, prismatica, di<br />
dimensioni alla base di<br />
1.0 x 1.0 cm<br />
ambiente<br />
Tappo per Tappo a vite cilindrico 1 x 50 pezzi Temperatura<br />
cuvetta<br />
grigio<br />
ambiente<br />
Siero di controllo Siero liofilo a matrice 1 flacone da 2-8 °C, al riparo<br />
(opzionale) umana<br />
ricostituire con<br />
1 mL di acqua<br />
distillata<br />
dalla luce diretta*<br />
*In tali condizioni i reattivi sono stabili sino alla data di scadenza<br />
indicata sulla confezione
La procedura analitica è molto semplice. Una<br />
goccia di sangue, prelevata per digitopuntura, è<br />
raccolta in un piccolo capillare e, insieme a questo<br />
tubicino, immersa in una provetta contenente una<br />
soluzione tampone lievemente acida. Il campione,<br />
dopo una delicata agitazione, è trasferito in<br />
cuvetta, ove viene aggiunta una goccia di reattivo<br />
cromogeno. La nuova soluzione è, quindi,<br />
sottoposta a centrifugazione e, infine, alla lettura<br />
fotometrica.<br />
In questa procedura, il sangue raccolto nel<br />
capillare viene messo a contatto con la soluzione<br />
tampone lievemente acida per consentire il rilascio<br />
del ferro dalle proteine plasmatiche. Una volta<br />
libero, questo metallo di transizione, analogamente<br />
a quanto accade in vivo in condizioni di acidosi,<br />
catalizza in vitro la trasformazione degli<br />
idroperossidi contenuti nel campione in radicali<br />
alcossili e perossili.<br />
Capitolo 6. La strumentazione dedicata nella valutazione dello stress ossidativo<br />
49<br />
Quando viene aggiunta la soluzione di<br />
cromogeno, la N,N-dietil-parafenilendiammina in<br />
essa disciolta reagisce con i radicali generati in<br />
vitro radicalizzandosi a sua volta ed assumendo un<br />
colore rosato. Si versa il contenuto della provettina<br />
nella cuvetta di lettura. La successiva breve<br />
centrifugazione consente la sedimentazione della<br />
parte corpuscolata del sangue.<br />
Si pone, quindi, la cuvetta nel vano di lettura; il<br />
fotometro potrà trasformare l’intensità del colore<br />
(che è proporzionale alla quantità di radicali e,<br />
quindi, di idroperossidi presenti inizialmente nel<br />
campione) in unità di concentrazione (U CARR), a<br />
cui possono corrispondere determinati livelli di<br />
stress ossidativo.<br />
FRAS 3 un sistema progettato specificamente<br />
per il medico, sia di base che specialista, e per il<br />
farmacista.
Il punto di partenza nella valutazione di<br />
laboratorio dello stress ossidativo è l’esecuzione<br />
del d-<strong>ROMs</strong> test attraverso la strumentazione<br />
dedicata (sistemi FREE e FRAS) o quella al<br />
momento disponibile (comune fotometro o<br />
analizzatore multiplo).<br />
Il d-<strong>ROMs</strong> test andrebbe effettuato in<br />
condizioni di buona salute o “basali” perché,<br />
valutando anche lo stato metabolico<br />
dell’organismo, fornisce risultati che sono<br />
influenzati dallo stile di vita.<br />
Ognuno dovrebbe conoscere tale valore di<br />
riferimento, specifico di ogni individuo e rientrante<br />
nell’ambito della variabilità documentata nella<br />
popolazione generale.<br />
Ad esso bisogna rapportarsi per ogni controllo<br />
che si rendesse necessario in futuro, in relazione a<br />
situazioni fisiologiche (es. attività fisica),<br />
parafisiologiche (es. gravidanza) o francamente<br />
patologiche (es. infarto) ovvero in rapporto a<br />
specifici interventi terapeutici (es. chemioterapici,<br />
cortisonici, contraccettivi orali ecc.).<br />
In ogni caso, i risultati del d-<strong>ROMs</strong> test, che<br />
valuta il livello degli idroperossidi, testimoni e<br />
indicatori dello stress ossidativo, devono essere<br />
inquadrati dal medico nella situazione clinica del<br />
singolo paziente.<br />
Sulla base dei risultati dei numerosi studi finora<br />
pubblicati in materia, è oggi possibile tracciare una<br />
serie di linee-guida orientative per una corretta<br />
interpretazione e, quindi, gestione dei risultati del<br />
d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Di fronte a valori inferiori a 250 U CARR,<br />
definiti come normali, bisogna interrogarsi se la<br />
procedura è stata eseguita in maniera corretta o<br />
meno.<br />
A tal proposito vi sono alcuni errori da evitare<br />
in fase analitica.<br />
Essi riguardano le modalità del prelievo e di<br />
disinfezione della cute, il tipo di anticoagulante<br />
eventualmente usato, l’emolisi del campione, le<br />
modalità di conservazione dei reagenti, ecc<br />
(tabella 7. 1).<br />
Capitolo 7<br />
Considerazioni conclusive e linee-guida<br />
50<br />
Capitolo 7. Considerazioni conclusive e linee-guida<br />
Tabella 7. 1 d-<strong>ROMs</strong> test: errori da evitare<br />
Fase critica Accorgimento<br />
Usare solo alcool etilico, perché<br />
Disinfezione della superficie<br />
queste sostanze interferiscono<br />
cutanea con sali di alchilammonio<br />
con i risultati del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
o derivati ossidanti del cloro<br />
(sottostima)<br />
Evitare qualsiasi trauma, perché<br />
Prelievo ematico l’emolisi interferisce con i risultati<br />
del d-<strong>ROMs</strong> test (sottostima)<br />
Usare solo eparina se necessario<br />
Impiego di coagulanti<br />
perché EDTA e CITRATO<br />
della classe dei chelanti<br />
interferiscono con i risultati del d-<br />
(EDTA o CITRATO)<br />
<strong>ROMs</strong> test (sottostima)<br />
Conservare il reagente R1 a 2-8<br />
°C e tenerlo lontano dal contatto<br />
Modalità di conservazione<br />
diretto con le radiazioni solari. In<br />
della soluzione di cromogeno<br />
tali condizioni esso rimane stabile<br />
(reagente R1)<br />
fino alla data di scadenza riportata<br />
sulla confezione.<br />
Se non è possibile effettuare<br />
l’analisi subito dopo il prelievo,<br />
Modalità di conservazione conservare il siero a +4° C o a –<br />
del prelievo<br />
20 °C ed eseguire il test entro<br />
l’intervallo prestabilito per queste<br />
temperature<br />
Se la procedura è corretta, l’anamnesi e<br />
l’esame obiettivo dovranno chiarire se il soggetto è<br />
affetto da una patologia o segue regimi terapeutici<br />
particolari, che possono “mascherare” il livello reale<br />
di idroperossidi. Per esempio, il trattamento con<br />
cortisonici, talvolta anche ad uso topico, riduce<br />
considerevolmente il livello di idroperossidi<br />
falsando il risultato reale del d-<strong>ROMs</strong> test In tutti<br />
questi casi è opportuno ripetere il test dopo un<br />
congruo intervallo di tempo, dopo aver messo in<br />
atto gli interventi diagnostici e terapeutici del<br />
singolo caso. In aggiunta a quanto esposto, va<br />
ricordato che gli stati cachettici in genere si<br />
accompagnano a valori bassissimi del d-<strong>ROMs</strong> test<br />
a causa del rallentamento di tutti i processi<br />
metabolici (figura 7. 1).<br />
Procedura errata<br />
Emolisi<br />
Chelanti<br />
Ripetere il test<br />
immediatamente<br />
Assenza str.<br />
ossidativo<br />
< 250 U CARR (valori normali)<br />
Non evidenza di patologia in atto<br />
Monitorare<br />
lo stile di vita<br />
Ripetere il test<br />
dopo 6 mesi<br />
Controllare la procedura<br />
Razza orientale<br />
(?)<br />
Procedura corretta<br />
Anamnesi ed esame obiettivo<br />
Condizione<br />
di atleta<br />
Controllare<br />
regime<br />
allenamento<br />
Abuso di<br />
antiossidanti<br />
Controllare<br />
regime terapia<br />
Ripetere il test<br />
dopo 4 mesi<br />
Possibile<br />
patologia<br />
Evidenza<br />
patologia<br />
Ulteriori<br />
indagini<br />
Eventuale<br />
terapia<br />
specifica<br />
Figura 7. 1 d-<strong>ROMs</strong> test: linee guida 1<br />
(valori
normale del d-<strong>ROMs</strong> test è in genere sufficiente<br />
per escludere una condizione di stress ossidativo<br />
in atto, fermo restando che avere un valore del d-<br />
<strong>ROMs</strong> test “nella norma” non esclude l’esistenza<br />
di patologie in atto ma indica solo la presenza di un<br />
livello sierico di idroperossidi che rientra nella<br />
media rilevata nella popolazione clinicamente<br />
asintomatica ed apparentemente sana.<br />
Poiché è importante che tale valore resti<br />
normale nel tempo, il medico suggerirà il<br />
mantenimento o l’adozione di stili salutari di vita,<br />
consiglierà regimi idonei di allenamento se si<br />
svolge attività sportiva e inviterà il paziente a<br />
ripetere il test dopo 6-8 mesi.<br />
Se, tuttavia, il paziente nel corso di precedenti<br />
determinazioni aveva in passato valori<br />
significativamente inferiori a quello rilevato al<br />
momento (es. un valore attuale di 290 U CARR<br />
contro un valore pregresso di 210 U CARR), è<br />
possibile che sia intervenuta una condizione di<br />
stress ossidativo e, dunque, è da sospettarsi una<br />
patologia in atto che, se confermata, richiederà gli<br />
interventi diagnostici e terapeutici indicati e la<br />
ripetizione del test dopo 3 mesi (in funzione della<br />
malattia e della terapia intrapresa) (figura 7. 2).<br />
Non evidenza<br />
patologia in atto<br />
Non evidenza<br />
stress ossidativo<br />
Monitorare<br />
stile di vita<br />
Ripetere<br />
il test<br />
dopo 6-8 mesi<br />
250-300 U CARR (valori normali)<br />
Anamnesi ed esame obiettivo<br />
Precedente valore<br />
Gravidanza<br />
avanzata<br />
Monitorare<br />
gestazione<br />
Interventi<br />
specifici<br />
Integrazione<br />
antiossidante<br />
Ripetere il test<br />
ogni 10 giorni<br />
>400 U CARR (stress ossidativo elevato-elev.mo)<br />
Pillola<br />
anticoncez.<br />
Anamnesi ed esame obiettivo<br />
Terapia<br />
in atto<br />
Chemioterapia<br />
Radio-terapia Mal. cardiovascolari<br />
Eventuali<br />
interventi specifici<br />
Integrazione<br />
antiossidante<br />
Ripetere il test<br />
dopo 30 giorni<br />
Patologia<br />
in atto<br />
Malattia<br />
disreattiva<br />
Ulteriori indagini<br />
con valutazione dello status antiossidante<br />
Figura 7. 5 d-<strong>ROMs</strong> test: linee guida 5<br />
(valori >400 U CARR)<br />
Malattia de-<br />
generativa<br />
Nel caso in cui, dopo la terapia antiossidante<br />
non si registrasse un abbassamento del valore dei<br />
radicali liberi, sarà utile fare le seguenti<br />
considerazioni:<br />
1. La terapia non è stata efficace (ad es. per una<br />
bassa concentrazione plasmatica degli<br />
antiossidanti)<br />
52<br />
Capitolo 7. Considerazioni conclusive e linee-guida<br />
2. E' intervenuto un fenomeno di proossidazione<br />
durante la terapia (ad es. causa di un<br />
iperdosaggio di antiossidanti)<br />
3. E' stata attivata un'altra fonte di idroperossidi (ad<br />
es. per una infiammazione del cavo orale, o per<br />
intensi esercizi fisici, etc.) durante la terapia<br />
4. L'operatore ha commesso un errore durante il<br />
rilevamento dello stress ossidativo<br />
Pertanto, per avere una risposta corretta,<br />
occorre sapere:<br />
1. Si è sicuri che il paziente non abbia in corso<br />
qualche malattia?<br />
2. Si è sicuri che il paziente durante la terapia non<br />
sia andato incontro a patologie intercorrenti?<br />
3. Quale è l'esatta composizione del cocktail<br />
antiossidante usato?<br />
4. Quale è la concentrazione plasmatica della<br />
Vitamina C e della Vitamina E nel paziente?<br />
5. E' disponibile un controllo, vale a dire i risultati<br />
ottenuti su una persona con la stessa malattia<br />
trattata con il medesimo cocktail di<br />
antiossidanti?<br />
La risposta a questi quesiti può fornire la<br />
soluzione del caso esaminato.
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
53<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
Tutti i lavori scientifici selezionati nel capito 8 del presente volume sono disponibili sotto forma di abstract.<br />
Della maggior parte di essi, previo il consenso degli Autori, sono disponibili anche le versioni originali.<br />
Per maggiori informazioni contattare il direttore scientifico,<br />
dott. Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD, ai seguenti recapiti:<br />
DIACRON International s. r. l.<br />
58 100 Grosseto, via Zircone 8 – Italia<br />
Phone 0039 0564 467 922 – FAX 0039 0564 467 684<br />
e–mail: eugenioluigi.iorio@diacron.com – web site www.diacron.com<br />
1. Akkus I, Can UG, Caglayan O, Gurbilek M,<br />
Kalak S, Bor MA, Dikici I Lipid peroxidation<br />
and antioxidant status in serum,<br />
erythrocytes and leucocytes of children with<br />
insulin-dependent Diabetes Mellitus.<br />
Proceedings of the 16 th International<br />
Congress of Clinical Chemistry, London,<br />
UK. 1996.<br />
2. Alberti A Report of a EPR experiment on<br />
Diacron’s kit [original title “Esperimento EPR<br />
sul kit Diacron”]. I.Co.C.E.A. – National<br />
Council of Research. Research Area.<br />
Bologna, Italy. 1997. EXPERIMENTAL<br />
REPORT.<br />
3. Alberti A The d-<strong>ROMs</strong> test. Model and<br />
chemical basis [original title “Il d-<strong>ROMs</strong> test.<br />
Modello e basi chimiche”]. I.Co.C.E.A. –<br />
National Council of Research. Research<br />
Area. Bologna, Italy. 1997. 1997.<br />
EXPERIMENTAL REPORT.<br />
4. Alberti A, Bolognini L, Carratelli M, Della<br />
Bona MA, Macciantelli D Assessing<br />
oxidative stress with the d-<strong>ROMs</strong> test. Some<br />
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the SFRR Europe Summer Meeting. 26-28<br />
June 1997, Abano Terme, Italy. 1997. P 82-<br />
83.<br />
5. Alberti A, Bolognini L, Macciantelli D,<br />
Carratelli M The radical cation of N,Ndiethyl-para-phenylendiamine:<br />
a possible<br />
indicator of oxidative stress in biological<br />
samples. Res Chem Intermed. 2000. 26 (3):<br />
253-67.<br />
6. Alberti A, Della Bona MA, Bolognini L,<br />
Carratelli M, Macciantelli D. Assessing<br />
oxidative stress in living organisms by ESR<br />
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European ESR Meeting. Leipzig, Germany.<br />
1997. P 2.<br />
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Gazzotti RM, Di Lorenzo D Application of<br />
different methods to evaluate oxidative<br />
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of hemodialyzed patients. 2002. CLINICAL<br />
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8. Allegra C, Bartolo M jr, Sarcinella R<br />
Evaluation of pharmacological effects of a<br />
homeopathic medication in primary tardive<br />
lymphoedema of lower extremities by<br />
means of microlymphography and free<br />
radicals detection. Clinical Report S.<br />
Giovanni Hospital. Rome, Italy. 2000. P 1-4<br />
(Named srl Editor, Milan, Italy).<br />
9. Allegra L, Blasi F, Capone P, Centenni S,<br />
Gogo R, Damato S, Patrigni G, Piatti G,<br />
Rampolli C, Rizzato G Optimisation of N-<br />
Acetylcysteine dosage for its mucolytic and<br />
antioxidant activities [original title<br />
“Ottimizzazione dei dosaggi della NAC per<br />
l’espressione delle sue proprietà mucoattive<br />
ed antiossidanti”]. Giornale Italiano delle<br />
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11. Bamonti F, De Vecchi A, Novembrino C,<br />
Buccianti G, De Franceschi M, Baragetti I,<br />
Ippolito S, Maiolo AT. Oxidative stress and<br />
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12. Bamonti F, Novembrino C, Cighetti G,<br />
Annaloro C, Luchesini C, De Franceschi M,<br />
Bortone L, Della Volpe A, Ippolito S,<br />
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13. Belcaro G, Carratelli M, Cesarone MR,<br />
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14. Beltrami G, Fanton F, Schiavottiello G<br />
Determination of free radicals in different<br />
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17. Buonocore G, Perrone S, Longini M,<br />
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birth and on the seventh day of life Pediatr<br />
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18. Campise M, Tarantino A, Bamonti F,<br />
Novembrino C, Ippolito S, Lonati S,<br />
Montanino G, Ponticelli C, Cornelli U<br />
Oxidative status in kidney transplantation.<br />
2002. MEETING COMMUNICATION. IN<br />
PRESS.<br />
19. Capunzo M, Iorio EL, Cavallo P Correlation<br />
between oxidative stress and plasma lipids<br />
levels: results of a preliminary study [original<br />
title “Correlazione fra stress ossidativo e<br />
livello di lipidi plasmatici: risultati di uno<br />
studio preliminare”]. I Quaderni<br />
dell’Università di Salerno. 2001. 91-102.<br />
20. Carratelli M, Porcaro R, Ruscica M, De<br />
Simone E, Bertelli AAE, Corsi MM Reactive<br />
54<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
Oxygen Metabolites (<strong>ROMs</strong>) and prooxidant<br />
status in children with Down Syndrome.<br />
International Journal of Clinical<br />
Pharmacology Research. 2001. 21 (2): 79-<br />
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21. Carratelli M, Spagnoli U, De Toma G,<br />
Guerreschi F, D’Ascenzio G Application of a<br />
new method to evaluate oxidative damage<br />
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Cornelli U, De Sanctis MT, Incandela I,<br />
Barsotti A, Terranova R, Nicolaides A A<br />
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Belcaro G, Dugall M, Acerbi G. Variations in<br />
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29. Cornelli U, Terranova R, Luca S, Cornelli M,<br />
Alberti A Bioavailability and antioxidant<br />
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Etnomedicina. 23-28 September 2001. Isla<br />
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55<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
37. Dolci A, Nanni G, Roi GS, Palli R, Banfi G.<br />
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antioxidant status in a professional players<br />
team during a football season. 1998.<br />
CLINICAL REPORT.<br />
38. Formigoni A, Calderone D, Pezzi P,<br />
Panciroli A Changes in “oxidative status”<br />
during the dry period and the first month of<br />
lactation in dairy cows [original title<br />
“Evoluzione dello “status ossidativo” nella<br />
bovina da latte: osservazioni preliminari”].<br />
Proceedings of the 12 th National Congress<br />
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Pisa, Italy. 1997. P 203-4.<br />
39. Franzini A, Luraschi P, Pagani A Direct<br />
measurement of reactive oxygen<br />
metabolites in blood serum: analytical<br />
assesment of a novel method [original title<br />
“Misura diretta dei metaboliti reattivi<br />
dell’ossigeno nel siero: valutazione analitica<br />
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1996. Suppl. 1/5-6: 89.<br />
40. Gerardi GM, Usberti M, Martini G, Albertini<br />
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hemodialyzed patients and its relationship to<br />
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41. Giannattasio A, De Chiara M, Basile G,<br />
Peticca M, De Rosa M, Zarrilli S, Metafora<br />
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46. Iamele L, Vernocchi A, Amboni P, Pasinetti<br />
G, Auriema A., Bellan C, Tempra A Normal<br />
values of free radicals in newborns and<br />
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47. Incandela L, Belcaro G, Cesarone MR, De<br />
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Nicolaides AN, Bucci M, Barsotti A, Martines<br />
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2-5 April 2001. Maui, Hawaii, USA. 2001.<br />
P60.<br />
50. Iorio EL, Carratelli M, Alberti A A simple test<br />
to monitor the oxidative stress by<br />
evaluating total serum hydroperoxides.<br />
Proceedings of the 2 nd International<br />
Conference on Oxidative <strong>Stress</strong> and Aging.<br />
2-5 April 2001. Maui, Hawaii, USA. 2001.<br />
P25.<br />
51. Iorio EL, Escalona M, De Prisco R,<br />
Attianese P, Caratelli M. Impairment of<br />
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de Margarita, Venezuela. 2001.<br />
52. Iorio EL, Quagliuolo L, Carratelli M. The d-<br />
<strong>ROMs</strong> test: a method to monitor oxidative<br />
stress in vascular diseases [Original title “d-<br />
<strong>ROMs</strong> test: metodo di monitoraggio dello<br />
stress ossidativo nelle patologie vascolari”].<br />
Minerva Cardioangiologica. 2002. 50 (6,<br />
suppl. 1): 143-144.<br />
56<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
53. Ippolito S, Bamonti F, Novembrino C, De<br />
Franceschi M, Massaro P, Cortelezzi A,<br />
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54. Ippolito S, Bamonti-Catena F, Novembrino<br />
C, Cortellezzi A, Fracchiolla NS, Di Cataldo<br />
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55. Ippolito S, Caruso R, Novembrino C,<br />
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57. La Torre F, Orlando A, Silipigni A,<br />
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58. Liotti F, Maselli R, De Prisco R, Iorio EL, De<br />
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59. Mariani MM The assessment of oxidative<br />
stress before, during and after EDTA<br />
chelation therapy by means of the d-<strong>ROMs</strong><br />
test [original title “Studio dello stress<br />
ossidativo tramite d-<strong>ROMs</strong> test prima<br />
durante e dopo terapia chelante con<br />
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50 (6, suppl. 1): 138-139.<br />
60. Marzatico. Use of d-<strong>ROMs</strong> test in a pilot<br />
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62. Novembrino C, Bamonti F. Ippolito S,<br />
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63. Palumbo R, Bondanini F, Vitaliano E,<br />
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64. Palumbo R, Chiaretti B, Bondanini F,<br />
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65. Palumbo R, Chiaretti B, Vitaliano E,<br />
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269.<br />
57<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
67. Parmigiani S, Gambini L, Massari A,<br />
Pezzani I, Payer C, Bevilacqua G.<br />
Evaluation of reactive oxygen metabolites<br />
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69. Pontiggia P, Silvotti MG, Martano F,<br />
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70. Rampoldi C. The measurement of<br />
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title “La misura dei fenomeni ossidoriduttivi”]<br />
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71. Rizzato G Death due to air pollution: role of<br />
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da inquinamento atmosferico: ruolo dello<br />
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212.<br />
72. Serra A, Garozzo A, Cocuzza S, D'Amico<br />
VA, Carnevale G, Maiolino L Role of free<br />
radicals and their determination by means of<br />
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title “Ruolo dei radicali liberi e loro<br />
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62.<br />
74. Squitti R, Rossini PM, Cassetta E, Moffa F,<br />
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80. Usberti M, Gerardi G, Bufano G, Tira P,<br />
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Dionisio C, Pozzi D, Lisi A, Santoro N, Grimaldi S<br />
The Diacron’s kit for the monitoring of plasma free<br />
radicals: correlation with stress and pathological<br />
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8. 2 Bibliografia per aree di interesse medico<br />
59<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
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Iorio EL, Carratelli M, Alberti A A simple test to<br />
monitor the oxidative stress by evaluating total<br />
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“Valutazione dei livelli di stress ossidativo in vivo<br />
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Iamele L, Fiocchi R, Vernocchi A Evaluation of an<br />
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2002. 40 (7): 673-6.<br />
Trotti R, Carratelli M, Barbieri M. Performance and<br />
clinical application of a new, fast method for the<br />
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of human plasma. Free Radic Res. 2002. 36 (8):<br />
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8. 2. 2 Neuropsichiatria<br />
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Kusmic C, Rocchi A, Pastorini E, Murri L. Impaired
xidative metabolism and lipid peroxidation in<br />
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Squitti R, Rossini PM, Cassetta E, Moffa F,<br />
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Eur J Clin Invest 2002. 32 (1) : 51-9.<br />
8. 2. 3 Malattie cardiovascolari<br />
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(2): 141-145.<br />
Incandela L, Belcaro G, Cesarone MR, De Sanctis<br />
MT, Griffin M, Cacchio M, Nicolaides AN, Bucci M,<br />
Barsotti A, Martines G, Cornelli U, Di Renzo A<br />
Oxygen-free radical decrease in hypertensive<br />
patients treated with lercanidipine Int Angiol. 2001.<br />
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metodo di monitoraggio dello stress ossidativo<br />
nelle patologie vascolari”]. Minerva<br />
Cardioangiologica. 2002. 50 (6, suppl. 1): 143-144.<br />
Mariani MM The assessment of oxidative stress<br />
before, during and after EDTA chelation therapy by<br />
means of the d-<strong>ROMs</strong> test [original title “Studio<br />
60<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
dello stress ossidativo tramite d-<strong>ROMs</strong> test prima<br />
durante e dopo terapia chelante con EDTA”].<br />
Minerva Cardioangiologica. 2002. 50 (6, suppl. 1):<br />
138-139.<br />
Novembrino C, Bamonti F. Ippolito S, Lorenzano F,<br />
Lonati S, Della Noce C, Tonini A, Accinni R A new<br />
approach to the risk for cardiovascular diseases<br />
[original title “Nuovo approccio al rischio di<br />
patologia cardiovascolare”]. Biochimica Clinica.<br />
2002. 26 (3): 267.<br />
8. 2. 4 Malattie del sangue e degli organi<br />
ematopoetici<br />
Bamonti F, Novembrino C, Cighetti G, Annaloro C,<br />
Luchesini C, De Franceschi M, Bortone L, Della<br />
Volpe A, Ippolito S, Lambertenghi Deliliers G<br />
Assessment of oxidative stress in hemopoietic<br />
stem cell transplantation (HSCT). Biochimica<br />
Clinica. 2001. 25: 60.<br />
Ippolito S, Bamonti F, Novembrino C, De<br />
Franceschi M, Massaro P, Cortelezzi A, Fracchiolla<br />
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oxidative stress in myeloprolyferative and<br />
myelodysplastic syndromes. Clin Chem Lab Med.<br />
2001. 39 (Special Supplement): S269.<br />
Ippolito S, Bamonti-Catena F, Novembrino C,<br />
Cortellezzi A, Fracchiolla NS, Di Cataldo D,<br />
Guggiari E, Ciani A, Maiolo AT Oxidative stress in<br />
myelodysplastic syndromes. Biochimica Clinica.<br />
2001. 25: 61.<br />
Trotti R. Carratelli M, Barbieri M, Micieli G, Bosone<br />
D, Rondanelli P., Bo P Oxidative stress and<br />
thrombophilic condition in alcoholics without severe<br />
liver disease. 2001. Haematologica. 86: 85-91.<br />
8. 2. 5 Malattie dell’apparato respiratorio<br />
Liotti F, Maselli R, De Prisco R, Iorio EL, De Seta<br />
C, Sannolo N Antioxidant agents in work<br />
environment and professional<br />
bronchopneumopathies [original title “Agenti<br />
antiossidanti in ambiente di lavoro e<br />
broncopneumopatie professionali”]. Proceedings of<br />
the Meeting “Giornate Scientifiche della Facoltà<br />
2000”. 17-19 May 2000. Second University of<br />
Naples, Naples, Italy. 2000. P 555-556.<br />
Rizzato G Death due to air pollution: role of<br />
oxidative stress and protection of an antioxidant<br />
aerosol [original title “Mortalità da inquinamento<br />
atmosferico: ruolo dello stress ossidativo e potere<br />
tampone di un aerosol antiossidante”]. Giornale<br />
Italiano delle Malattie Toraciche. 2000. 54 (3): 204-<br />
212.<br />
Allegra L, Blasi F, Capone P, Centenni S, Gogo R,<br />
Damato S, Patrigni G, Piatti G, Rampolli C, Rizzato<br />
G Optimisation of N-Acetylcysteine dosage for its
mucolytic and antioxidant activities [original title<br />
“Ottimizzazione dei dosaggi della NAC per<br />
l’espressione delle sue proprietà mucoattive ed<br />
antiossidanti”]. Giornale Italiano delle Malattie<br />
Toraciche. 2001. 55 (6): 476-484.<br />
Anzalone GE, Danesi P, Goti P, Melocchi F Effect<br />
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oxygen metabolites (ROM) in plasma of COPD<br />
patients. Le malattie dell’apparato respiratorio.<br />
2001. 4: 41-45.<br />
Verduri A, Del Donno M, Chetta A, Olivieri D Free<br />
radical of oxygen measurement on capillary blood<br />
in healthy smokers, COPD patients and control<br />
subjects [original title “Misurazione dei radicali liberi<br />
dell’ossigeno su sangue capillare in fumatori sani,<br />
pazienti BPCO e soggetti di controllo”].<br />
Proceedings of the Congress “Capitolo Italiano<br />
Chest”. 20-22 June 2002. Naples, Italy. 2002.<br />
8. 2. 6 Malattie renali<br />
<strong>Test</strong>a Effects of a vitamin E-modified membrane<br />
(CL-E) on plasma oxidative stress markers of<br />
hemodialyzed patients [original title “Effetti di un<br />
filtro modificato con vitamina E su alcuni marker<br />
plasmatici di stress ossidativo in pazienti<br />
emodializzati”]. Report of the Hospital of Cremona.<br />
Cremona, Italy. 1999. CLINICAL REPORT.<br />
Usberti M, Bufano G, Lima G, Gazzotti RM, Tira P,<br />
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survival reduces the need of erythropoietin in<br />
hemodialyzed patients treated with exogenous<br />
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Palumbo R, Bondanini F, Vitaliano E, Chiaretti B,<br />
Galliani M, Tarquini G, Travaglia S, Paone A,<br />
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reactive oxygen metabolites determination [original<br />
title “Emodialisi e stress ossidativo: determinazione<br />
dei derivati dei metaboliti reattivi dell’ossigeno”].<br />
Giornale Italiano di Nefrologia. 2000. 17 (3, Special<br />
Number): 73.<br />
Palumbo R, Chiaretti B, Bondanini F, Vitaliano E,<br />
Tarquini G, Galliani M, Di Blasi S, Paone A.<br />
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Palumbo R, Chiaretti B, Vitaliano E, Bondanini F,<br />
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Association. First combined congress with<br />
European Kidney Research Association. 17-20<br />
September 2000. Nice, France. 2000. P 246.<br />
61<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
Bamonti F, De Vecchi A, Novembrino C, Buccianti<br />
G, De Franceschi M, Baragetti I, Ippolito S, Maiolo<br />
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Novembrino C, Bamonti F, Campise MR, Tarantino<br />
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Campise M, Tarantino A, Bamonti F, Novembrino<br />
C, Ippolito S, Lonati S, Montanino G, Ponticelli C,<br />
Cornelli U Oxidative status in kidney<br />
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COMMUNICATION. IN PRESS.<br />
Gerardi GM, Usberti M, Martini G, Albertini A,<br />
Sugherini L, Pompella A, Di Lorenzo D Plasma<br />
total antioxidant capacity in hemodialyzed patients<br />
and its relationship to other biomarkers of oxidative<br />
stress and lipid peroxidation. Clin Chem Lab Med.<br />
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Usberti M, Gerardi G, Bufano G, Tira P, Micheli A,<br />
Albertini A, Floridi A, Di Lorenzo D, Galli F. Effects<br />
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hemodialyzed patients. Am J Kidney Dis. 2002.<br />
40(3): 590-9.<br />
8. 2. 7 Nutrizione, diabetologia<br />
e malattie del ricambio<br />
Akkus I, Can UG, Caglayan O, Gurbilek M, Kalak<br />
S, Bor MA, Dikici I Lipid peroxidation and<br />
antioxidant status in serum, erythrocytes and<br />
leucocytes of children with insulin-dependent<br />
Diabetes Mellitus. Proceedings of the 16 th<br />
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Vitola NM, Paraggio C, De Luna A, Nigro C Dosing<br />
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alcohol abuse [original title “Il dosaggio dei radicali<br />
liberi serici quale possibile marker di abuso<br />
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Italy. 1999. CLINICAL STUDY. IN PRESS.<br />
Iorio EL Courses of feeding education in the<br />
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“Corsi di educazione alimentare nelle scuole:<br />
mangiare bene – mangiare sicuro”]. Scientific<br />
Nutrition Today. 2000. 2: 17.
Tanganelli I, Ciccoli L, Tansi R, Borgogni P, Rossi<br />
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Diabetes Research and Clinical Practice. 2000. 50<br />
(Suppl 1): S1.<br />
Capunzo M, Iorio EL, Cavallo P Correlation<br />
between oxidative stress and plasma lipids levels:<br />
results of a preliminary study [original title<br />
“Correlazione fra stress ossidativo e livello di lipidi<br />
plasmatici: risultati di uno studio preliminare”]. I<br />
Quaderni dell’Università di Salerno. 2001. 91-102.<br />
Cornelli U, Terranova R, Luca S, Cornelli M, Alberti<br />
A Bioavailability of some food supplementations in<br />
men and women using the d-<strong>ROMs</strong> test as a<br />
marker of oxidative stress. J Nutr. 2001. 131: 3208-<br />
3211.<br />
De Prisco R, Attianese P, Lione D, Balestrieri C,<br />
Iorio EL Oxidative stress and serum lipids.<br />
Proceedings of the 10 th Congreso Italolatinoamericano<br />
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September 2001. Isla de Margarita, Venezuela.<br />
2001.<br />
Iorio EL, Escalona M, De Prisco R, Attianese P,<br />
Caratelli M. Impairment of redox balance in obesity.<br />
Proceedings of the 10 th Congreso Italolatinoamericano<br />
de Etnomedicina. 23-28<br />
September 2001. Isla de Margarita, Venezuela.<br />
2001.<br />
Cornelli U, Terranova R, Luca S, Cornelli M, Alberti<br />
A Bioavailability and antioxidant activity of some<br />
food supplements in men and women using the d-<br />
<strong>ROMs</strong> test as a marker of oxidative stress [original<br />
title “Biodisponibilità ed attività antiossidante di<br />
alcuni supplementi nutrizionali. <strong>Test</strong> d-<strong>ROMs</strong>:<br />
marker dello stress ossidativo”]. La Medicina<br />
Biologica. 2002. 2: 35-40.<br />
Ippolito S, Caruso R, Novembrino C, Bamonti-<br />
Catena, Della Noce C, Lorenzano E, Camolo J,<br />
Tonini A, Lonati S, Rosina M, Accinni R<br />
Dislipidemia and oxidative stress. Ital J Biochem.<br />
2002. 51 (3-4): 129.<br />
8. 2. 8 Andrologia<br />
Giannattasio A, De Chiara M, Basile G, Peticca M,<br />
De Rosa M, Zarrilli S, Metafora S, Hall L A new<br />
method for the assay of sperm membranes<br />
lipoperoxides in normal and pathological human<br />
semen. J Endocrinol Invest. 1998. 21 (Suppl 7):<br />
187.<br />
8. 2. 9 Reumatologia<br />
Giordano N, Battisti E, Geraci S, Santacroce C,<br />
Lucani B, Fortunato M, Mattii G, Gennari C.<br />
Analgesic-antiinflammatory effect of a 100 Hz<br />
variable magnetic field in RA. Clin Exp Rheumatol.<br />
2000. 18 (2): 263.<br />
62<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
8. 2. 10 Malattie infettive<br />
Pontiggia P, Silvotti MG, Martano F, Cuppone<br />
Curto F, Rotella GB, Sabato A The role of whole<br />
body hyperthermia in AIDS patients: effects on the<br />
free radicals level. Med Biol Environm 1995. 23 (2):<br />
279-282.<br />
8. 2. 11 Oncologia<br />
La Torre F, Orlando A, Silipigni A, Giacobello T,<br />
Pergolizzi S, Aragona M Increase of oxygen free<br />
radicals and their derivatives in chemo- and<br />
radiation treated neoplasm patients [original title<br />
“Incremento dei radicali liberi dell’ossigeno e dei<br />
loro derivati in pazienti neoplastici chemio e<br />
radiotrattati”]. Minerva Medica. 1996. 86: 1-4.<br />
8. 2. 12 Otorinolaringoiatria<br />
Serra A, Garozzo A, Cocuzza S, D'Amico VA,<br />
Carnevale G, Maiolino L Role of free radicals and<br />
their determination by means of d-<strong>ROMs</strong> test in<br />
Ménière’s diseases [original title “Ruolo dei radicali<br />
liberi e loro determinazione mediante d-ROMS test<br />
nella malattia di Ménière”]. Progressi in Audiologia<br />
e Vestibologia. 1999. 3: 1-2.<br />
8. 2. 13 Neonatologia e pediatria<br />
Iamele L, Amboni P, Felletti S, Pasinetti G,<br />
Auriema A, Vernocchi A Reference values of<br />
hydroperoxides in the blood serum of newborns<br />
and adults [original title “Valori di riferimento di<br />
idroperossido nel siero di neonati e adulti”].<br />
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Iamele L, Vernocchi A, Amboni P, Pasinetti G,<br />
Auriema A., Bellan C, Tempra A Normal values of<br />
free radicals in newborns and comparison with<br />
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Parmigiani S, Gambini L, Massari A, Pezzani I,<br />
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Parmigiani S, Gambini L, Massari A, Pezzani I,<br />
Bevilacqua G Evaluation by micromethod of<br />
reactive oxygen metabolites in the newborn:<br />
assessment of normality standards [original title<br />
“Valutazione con micrometodo dei metaboliti<br />
reattivi dell’ossigeno nel neonato: determinazione<br />
degli standard di normalità”]. Proceedings of the 7 th<br />
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Corsi MM, Fulgenzi A, Gualandri V, Ferrero ME,<br />
Gaja G Free radicals, ROS, and lipoperoxides in<br />
blood plasma of children with 21 trisomy syndrome
[original title “Radicali liberi, ROS, e lipoperossidi,<br />
LPO, nel plasma di bambini con trisomia 21”].<br />
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11-14 May 1999. Naples, Italy. 1999. P 31.<br />
Buonocore G, Perrone S, Longini M, Terzuoli L,<br />
Bracci R Total hydroperoxide and advanced<br />
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babies. Pediatric Research. 2000. 47 (2): 221-4.<br />
Parmigiani S, Payer C, Massari A, Bussolati G,<br />
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Carratelli M, Porcaro R, Ruscica M, De Simone E,<br />
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Buonocore G, Perrone S, Longini M, Vezzosi P,<br />
Marzocchi B, Paffetti P, Bracci R. Oxidative stress<br />
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day of life Pediatr Res. 2002. 52(1): 46-9.<br />
8. 2. 14 Geriatria<br />
Cornelli U, Cornelli M, Terranova R, Luca S,<br />
Belcaro G Ageing and free radicals [original title<br />
“Invecchiamento e radicali liberi”]. Progress in<br />
Nutrition. 2000. 3: 37-50.<br />
Cornelli U, Terranova R, Luca S, Di Mauro C,<br />
Cornelli M Oxidative stress and senile dementia<br />
[original title “Lo stress ossidativo e la demenza<br />
senile”]. La Medicina Biologica. 2001. 3: 11-15.<br />
8. 2. 15 Medicina dello sport<br />
Dolci A, Nanni G, Roi GS, Palli R, Banfi G. Oxygen<br />
free radicals and total antioxidant status in a<br />
professional players team during a football season.<br />
1998. CLINICAL REPORT.<br />
Beltrami G, Fanton F, Schiavottiello G<br />
Determination of free radicals in different sporting<br />
activities and their application [original title<br />
“Determinazione dei radicali liberi in differenti<br />
attività sportiva e sue applicazioni”]. Report of<br />
Italian Baseball And Softball Medical Federal<br />
Commission. Scientific Institute for Sport Italian<br />
National Olympic Committee (CONI), Rome, Italy.<br />
1999. CLINICAL REPORT.<br />
Dolci A, Mathias M Muller Oxidative stress induced<br />
by physical exercise: the biochemical monitoring.<br />
Proceedings of the Meeting “Medical Laboratory of<br />
63<br />
Capitolo 8. Selezione bibliografica<br />
Physical Exercise and Sports”. 6-7 december 2001.<br />
Padua, Italy. 2001. P 18.<br />
Iorio EL, Carratelli M, Quagliuolo L, Caletti G<br />
Oxidative stress evaluation in athletes Proceedings<br />
of the 2 nd International Conference on Oxidative<br />
<strong>Stress</strong> and Aging. 2-5 April 2001. Maui, Hawaii,<br />
USA. 2001. P60.<br />
8. 2. 16 Medicina omeopatica<br />
Allegra C, Bartolo M jr, Sarcinella R Evaluation of<br />
pharmacological effects of a homeopathic<br />
medication in primary tardive lymphoedema of<br />
lower extremities by means of microlymphography<br />
and free radicals detection. Clinical Report S.<br />
Giovanni Hospital. Rome, Italy. 2000. P 1-4<br />
(Named srl Editor, Milan, Italy).<br />
8. 2. 17 Medicine alternative<br />
Carratelli M, Spagnoli U, De Toma G, Guerreschi<br />
F, D’Ascenzio G Application of a new method to<br />
evaluate oxidative damage in patients treatet with<br />
ozone-therapy [original title “Applicazione di un<br />
nuovo metodo per la valutazione del danno<br />
ossidativo in pazienti trattati con ozonoterapia”].<br />
1999. CLINICAL REPORT.<br />
Marzatico. Use of d-<strong>ROMs</strong> test in a pilot study on<br />
the effects of a acute and chronic transcutaneous<br />
administration of ginkgo biloba [original title<br />
“Utilizzo del d-<strong>ROMs</strong> test in uno studio pilota sugli<br />
effetti di una somministrazione transdermica acuta<br />
e cronica di ginkgo biloba”]. 1999. CLINICAL<br />
REPORT<br />
8. 2. 18 Medicina veterinaria<br />
Formigoni A, Calderone D, Pezzi P, Panciroli A<br />
Changes in “oxidative status” during the dry period<br />
and the first month of lactation in dairy cows<br />
[original title “Evoluzione dello “status ossidativo”<br />
nella bovina da latte: osservazioni preliminari”].<br />
Proceedings of the 12 th National Congress<br />
“Associazione Scientifica di Produzione Animale”<br />
23-26 June 1997. University of Pisa, Department of<br />
Animal Productions. Pisa, Italy. 1997. P 203-4.<br />
Brambilla G, Fiori M, Archetti LI Evaluation of the<br />
oxidative stress in growing pigs by microplate<br />
assays. J Vet Med A. 2001. 48: 33-38.<br />
Hiss RM, Sauerwein SH. The effects of feeding<br />
antioxidative supplements on haptoglobin (Hp) and<br />
serum amyloid A (SAA) serum concentrations in<br />
horses. Report of Biofocus GmbH,<br />
Recklinghausen, Germany and Institute of<br />
Physiology, Biochemistry and Hygiene of Domestic<br />
Animals, Bonn University, Germany. 2002.<br />
EXPERIMENTAL REPORT.<br />
Stampato a Grosseto, Italia – Prima Edizione, Marzo 2003<br />
Tutti i diritti riservati. © Copyright DIACRON International s. r. l., Grosseto, Italia. 2003.<br />
L’Editore non risponde di eventuali errori rilevati nel presente volume né dell’uso improprio del suo contenuto
Kits & tools per la valutazione globale dello stress ossidativo<br />
La DIACRON International s. r. l. (Grosseto) ha sviluppato un pannello di test per valutare<br />
globalmente il bilancio ossidativo, rilevando sia la produzione di metaboliti reattivi dell’ossigeno<br />
o ROM (d-<strong>ROMs</strong> test, brevetto DIACRON International s. a. s., Grosseto) sia la barriera<br />
antiossidante (OXY–Adsorbent test, BAP, e –SHp test) in matrici biologiche (es. sangue intero,<br />
siero, plasma, ecc.). I test possono essere eseguiti sia con un analizzatore automatico sia con<br />
una strumentazione dedicata (Sistema FREE, prodotto da DIACRON International s. r.<br />
l.,Grosseto). Il d-<strong>ROMs</strong> test può essere eseguito anche con il Sistema FRAS SYSTEM (prodotto<br />
da IRAM s. r. l., Parma).<br />
d-<strong>ROMs</strong> test: determinazione fotometrica dei metaboliti reattivi dell’ossigeno<br />
Gli idroperossidi, “marker” e “amplificatori” del danno tissutale generato dalla perossidazione di<br />
lipidi, amminoacidi, proteine, ed acidi nucleici, sono relativamente stabili e mantengono nei<br />
fluidi biologici una buona capacità ossidante. Pertanto, in questo test, gli idroperossidi (una<br />
classe di ROM), dopo aver reagito con un cromogeno adeguatamente tamponato, sviluppano<br />
un derivato colorato, che viene rilevato fotometricamente. La concentrazione di idroperossidi,<br />
direttamente proporzionale all’intensità del colore, viene espressa in Unità Carratelli (1 U CARR<br />
= 0.08 mg perossido di idrogeno/dL). Il range di riferimento del test nella popolazione normale<br />
è di 250–300 U CARR. Un incremento di tali valori indica un livelloprogressivamnete crescente<br />
di stress ossidativoo. Il d-<strong>ROMs</strong> test è uno strumento utilissimo nella pratica clinica routinaria.<br />
OXY–Adsorbent test: determinazione fotometrica<br />
del potenziale antiossidante plasmatico<br />
Numere sostanze presenti nel plasma (es carotenoidi, ascorbato, vitamina E, bilirubina, acido<br />
urico, etc) sono in grado di “adsorbire” la “potenzialità” ossidante delle specie reattive.<br />
Pertanto, qualsiasi danno a carico della “barriera plasmatica all’ossidazione” può provocare un<br />
danno ossidativo a livello dei tessuti. In tale contesto, l’OXY-Adsorbent test valuta la capacità<br />
del plasma di opporsi all’azione ossidante massiva di un eccesso di acido ipocloroso (HClO) in<br />
soluzione acquosa. Questo obiettivo è conseguito determinando fotometricamente i radicali<br />
residui dell’acido che non hanno reagito. Normalmente, 1 mL di plasma umano è in grado di<br />
“adsorbire” almeno 350 μmoli di HClO. Una riduzione di tali valori si correla direttamente con la<br />
gravità del danno inflitto alla “barriera plasmatica all’ossidazione”. Infatti, se “l’eccesso” dei<br />
radicali dell’HClO dopo ossidazione massiva è alto, la barriera plasmatica è ridotta, e viceversa.<br />
– SHp test: determinazione fotometrica dei tioli plasmatici<br />
I tioli proteici rappresentano una componente significativa della “barriera plasmatica<br />
all’ossidazione”. Infatti, i gruppi tiolici delle proteine sieriche sono in grado di opporsi alla fase<br />
di propagazione dei processi ossidativi inattivando i radicali alcossilici e perossilici. Questo test<br />
si basa sulla capacità dei gruppi –SH di sviluppare un complesso colorato quando reagiscono<br />
con il 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoato (DTNB). Il “titolo” dei tioli è direttamente proporzionale<br />
all’intensità del colore. Il range del test nella popolazione normale è 450–650 μmoli -SH/L. Una<br />
riduzione di tali valori si correla direttamente con una ridotta efficienza della barriera tiolica.<br />
Per eseguire l’intero pannello di test è disponibile<br />
il Sistema FREE, prodotto da DIACRON International s. r. l., Grosseto<br />
Per eseguire solo il d-<strong>ROMs</strong> test su sangue intero<br />
è ora disponibile il Sistema FRAS prodotto da IRAM s. r. l., Parma, Italy<br />
Per ordini e per qualsiasi informazione contattare:<br />
DIACRON International s. r. l.<br />
58 100 Grosseto, via Zircone 8<br />
Tel 0039 0564 467 922 – FAX 0039 0564 467 684<br />
e–mail: international@diacron.com –site web: ww.diacron.com<br />
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