Radicali liberi e antiossidanti in medicina dello sport - Gastone CRM
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Eugenio Luigi Iorio<br />
Seconda Edizione Italiana – 2007<br />
<strong>Radicali</strong><br />
<strong>liberi</strong><br />
e<br />
<strong>antiossidanti</strong><br />
<strong>in</strong> medic<strong>in</strong>a<br />
<strong>dello</strong> <strong>sport</strong>
Lo stress ossidativo costituisce un capitolo della biochimica relativamente recente che, probabilmente<br />
per il suo carattere di “trasversalità” o “<strong>in</strong>terdiscipl<strong>in</strong>arietà”, non ha ancora trovato una sua adeguata e soddisfacente<br />
collocazione <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport e nella Medic<strong>in</strong>a <strong>in</strong> genere.<br />
E’ noto, <strong>in</strong>fatti, che un’accentuazione dei processi ossidativi, di cui è spesso espressione un’aumentata<br />
produzione di radicali <strong>liberi</strong>, può accelerare il fisiologico processo dell’<strong>in</strong>vecchia-mento e risulta associata ad<br />
almeno 100 patologie, dall’ictus cerebrale all’<strong>in</strong>farto del miocardio, dal diabete mellito all’obesità, dal morbo<br />
di Park<strong>in</strong>son alla malattia di Alzheimer, dal morbo di Crohn all’artrite reumatoide, dall’AIDS al cancro, e così<br />
via.<br />
Tuttavia, al contrario di queste condizioni morbose, abbastanza ben def<strong>in</strong>ite sotto il profilo nosografico,<br />
lo stress ossidativo non esibisce una propria s<strong>in</strong>tomatologia, non dà luogo ad un vero e proprio quadro cl<strong>in</strong>ico<br />
e, pertanto, al medico che non ne sospetta l’esistenza, non fornisce elementi tali da suggerire un adeguato<br />
approfondimento diagnostico. Eppure, l’esecuzione di alcune semplici <strong>in</strong>dag<strong>in</strong>i biochimiche consentirebbe<br />
un immediato <strong>in</strong>quadramento del problema, evitando al paziente una serie di conseguenze tali da comprometterne<br />
la durata e/o la qualità della vita già nel breve o medio term<strong>in</strong>e.<br />
A rendere più complesso questo quadro – già di per sé poco confortante – c’è da aggiungere che se il<br />
medico, per una serie di ragioni, non sempre è adeguatamente “<strong>in</strong>formato” sull’argomento, l’analista di laboratorio<br />
non è generalmente “attrezzato” per eseguire test miranti alla valutazione <strong>dello</strong> stress ossidativo.<br />
E <strong>in</strong>tanto – paradossalmente – terapisti, farmacisti, allenatori <strong>sport</strong>ivi e pers<strong>in</strong>o estetisti cont<strong>in</strong>uano a<br />
prescrivere e/o suggerire all’atlea potenzialmente a rischio di stress ossidativo l’assunzione di <strong>in</strong>tegratori ad<br />
attività antiossidante. Non importa se quest’ultima sia reale o presunta. Non importa se quegli <strong>antiossidanti</strong><br />
prescritti senza una precisa <strong>in</strong>dicazione o, comunque, senza una documentata necessità, si rivel<strong>in</strong>o essere<br />
essi stessi causa di ulteriore danno da accumulo o da azione pro-ossidante paradossa.<br />
Infatti, secondo una prassi ormai consolidata, non è abitualmente prevista l’esecuzione prelim<strong>in</strong>are di<br />
test biochimici, pur disponibili per la rout<strong>in</strong>e cl<strong>in</strong>ica, per dimostrare – tramite l’identificazione e la quantificazione<br />
nei fluidi extracellulari e/o nei tessuti di adeguati marker biochimici – la necessità oggettiva di tali formulazioni.<br />
In altri term<strong>in</strong>i, mentre è ormai acquisito che un farmaco ipocolesterolemizzante va assunto solo<br />
dopo che un test abbia documentato <strong>in</strong>equivocabilmente una condizione di ipercolesterolemia, è diffusa la<br />
tendenza all’uso di <strong>antiossidanti</strong> anche quando non è necessario, proprio perché non è ancora diventata<br />
buona prassi eseguire prelim<strong>in</strong>armente una valutazione di laboratorio <strong>dello</strong> stress ossidativo.<br />
Tali concetti assumono particolare rilevanza nel campo della Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport. Infatti, se è vero che<br />
una moderata attività fisica contribuisce <strong>in</strong> varia misura a ridurre la morbilità e la mortalità relative alle patologie<br />
vascolari e a numerose forme di cancro, non v’è dubbio che l’esercizio strenuo o, comunque, <strong>in</strong>adeguato,<br />
favorisce l’<strong>in</strong>sorgenza di lesioni da stress ossidativo, sia a livello dell’apparato locomotore che a livello sistemico.<br />
Pertanto, tutti coloro che svolgono attività fisica e, <strong>in</strong> special modo gli atleti, dovrebbero periodicamente<br />
sottoporsi ad una valutazione <strong>dello</strong> stress ossidativo al f<strong>in</strong>e di prevenire – attraverso non solo un più<br />
“fisiologico” regime di allenamento ma anche un più razionale sfruttamento delle proprie capacità <strong>antiossidanti</strong><br />
ed un più oculato impiego di <strong>in</strong>tegratori – patologie locali o generalizzate legate alla presenza di una<br />
quantità eccessiva di specie chimiche reattive e, <strong>in</strong> particolare, di radicali <strong>liberi</strong> dell’ossigeno.<br />
Questo obiettivo può essere oggi facilmente raggiunto grazie all’esecuzione di semplici test biochimici,<br />
quali il d-ROMs test ed il BAP test, che consentono una valutazione globale – cioè sia del versante pro- che<br />
di quello anti-ossidante, rispettivamente – del bilancio ossidativo dell’atleta, sia esso dilettante o professionista.<br />
Tali test possono essere eseguiti <strong>in</strong> un comune laboratorio di analisi ma, per essere più vic<strong>in</strong>i alle esigenze<br />
<strong>dello</strong> <strong>sport</strong>ivo, anche presso lo studio <strong>dello</strong> specialista <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport o nei Centri Fitness, attraverso<br />
strumentazioni dedicate, quali il sistema FREE o il sistema FRAS.<br />
Le evidenze scientifiche accumulatesi nell’ultimo decennio <strong>in</strong>dicano, <strong>in</strong> particolare, che il d-ROM test,<br />
consente l’identificazione e la def<strong>in</strong>izione circostanziata di una condizione di stress ossidativo negli <strong>sport</strong>ivi,<br />
rendendo possibile, quando <strong>in</strong>dicato, il monitoraggio di un’eventuale terapia antiossidante.<br />
Questo volume vuol essere un aiuto non solo per i medici ma anche per i sanitari ed i tecnici impegnati<br />
nei delicati settori <strong>dello</strong> <strong>sport</strong> e del fitness, sempre più “asfissiati” da logiche di mercato non solo lontane dallo<br />
spirito agonistico ma anche irrispettose della dignità e del benessere <strong>dello</strong> <strong>sport</strong>ivo.<br />
Al chimico pient<strong>in</strong>o Mauro Carratelli, “<strong>in</strong>ventore” dei test per la valutazione <strong>dello</strong> stress ossidativo qui descritti,<br />
e a tutti i medici <strong>sport</strong>ivi che hanno documentato l’utilità di questo approccio altamente <strong>in</strong>novativo<br />
nella pratica cl<strong>in</strong>ica rout<strong>in</strong>aria, l’apprezzamento della comunità scientifica e la mia <strong>in</strong>condizionata stima personale.<br />
Salerno, 18 dicembre 2007. Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD<br />
Presidente<br />
Osservatorio Internazionale Stress Ossidativo<br />
3
Indice<br />
5<br />
Indice<br />
Capitolo 1 Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong> ……………………………………………. Pag. 5<br />
1. 1 Generalità e def<strong>in</strong>izioni ………………………………………………………………………………. pag. 5<br />
1. 2 I radicali <strong>liberi</strong>……………………………………………………………………………………………. pag. 5<br />
1. 3 Meccanismi generali di produzione delle specie chimiche reattive …………………… pag. 6<br />
1. 4 La produzione di specie reattive negli organismi viventi ………………………………… pag. 8<br />
1. 5 Metabolismo delle più importanti specie reattive di <strong>in</strong>teresse biologico ……………. pag. 11<br />
Bibliografia………………………………………………………………………………………………………… pag. 11<br />
Capitolo 2 Il sistema di difesa antiossidante ……………………………………………………... Pag. 13<br />
2. 1 Generalità e def<strong>in</strong>izioni ………………………….…………………………………………………… pag. 13<br />
2. 2 Gli <strong>antiossidanti</strong> preventivi ………………………………..……………………………………….. pag. 13<br />
2. 3 Gli scavenger di radicali <strong>liberi</strong> ed i cha<strong>in</strong> breaker ………..………………………………… pag. 15<br />
2. 4 Gli agenti di riparo ……………………………………………………………….…………………... pag. 18<br />
2. 5 Gli agenti di adattamento …………………………………………………………………..……... pag. 18<br />
2. 6 Altri agenti <strong>antiossidanti</strong> ……………………………………………………………………………. pag. 18<br />
2. 7 Distribuzione del sistema di difesa antiossidante negli organismi viventi ……….. pag. 19<br />
Bibliografia………………………………………………………………………………………<br />
pag. 20<br />
Capitolo 3 Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici. ..…….. Pag. 21<br />
3. 1 Generalità e def<strong>in</strong>izioni ……………………………………………………………………………….. pag. 21<br />
3. 2 Basi biochimiche ………………………………………………………………………………………… pag. 21<br />
3. 3 Eziopatogenesi ………………………………………………………………………………………….. pag. 24<br />
3. 4 Alterazioni del bilancio ossidativo e pratica <strong>sport</strong>iva…………………………….………… pag. 26<br />
Bibliografia………………………………………………………………………………………………………… pag. 30<br />
Capitolo 4 La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport.…. Pag. 31<br />
4. 1 Premessa …………………………………………………………………………………………………… pag. 33<br />
4. 2 La valutazione <strong>dello</strong> status pro-ossidante: il d-ROMs test..………………………………. pag. 33<br />
4. 3 La valutazione <strong>dello</strong> status anti-ossidante: il BAP test…………………………….……….. pag. 33<br />
Bibliografia…………………………………………………………………………………………………………<br />
pag. 45<br />
Capitolo 5 Il d-ROMs test <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport. Rassegna di studi cl<strong>in</strong>ici …………….. Pag. 47<br />
5. 1 Premessa …………………………………………………………………………………………………… pag. 47<br />
6. 2 Le prove da sforzo……………………………………………………………………………………….. pag. 47<br />
6. 3 Discipl<strong>in</strong>e <strong>sport</strong>ive ..……………………………………………………………………………………... pag. 48<br />
Bibliografia…………………………………………………………………………………………………………. pag. 51<br />
Considerazioni conclusive ………………………………………………………………………………..<br />
Pag. 53
1. 1 Generalità e def<strong>in</strong>izioni<br />
Le specie chimiche reattive sono agenti di varia<br />
natura – radicalica e non radicalica – accomunati<br />
dalla capacità di ossidare, cioè di sottrarre uno o più<br />
equivalenti riducenti (elettroni o atomi di idrogeno)<br />
ad un gran numero di atomi o molecole organiche<br />
(figura 1. 1) (22).<br />
Radicale<br />
(ossidante)<br />
+<br />
A C C<br />
A<br />
Molecola bersaglio<br />
(es. doppio legame C-C)<br />
-1<br />
OSSIDAZIONE<br />
RIDUZIONE<br />
Figura 1. 1 Azione ossidante delle specie reattive<br />
Alla capacità ossidante, più o meno spiccata a<br />
seconda delle varie specie chimiche, si riconduce<br />
l’attitud<strong>in</strong>e degli agenti <strong>in</strong> questione a <strong>in</strong>durre un<br />
danno – detto, appunto, ossidativo – a carico di<br />
componenti strutturali e/o funzionali degli organismi<br />
viventi.<br />
Le specie chimiche reattive di maggiore <strong>in</strong>teresse<br />
biologico sono quelle centrate sull’ossigeno (es.<br />
radicale idrossile e perossido di idrogeno), sul carbonio<br />
es. (radica i alchilici), sull’azoto (es. ossido<br />
nitrico), sul cloro (es. acido ipocloroso) e sullo zolfo<br />
(es. radicale tiilico) (tabella 1. 1).<br />
Tabella 1. 1 Specie reattive di maggiore <strong>in</strong>teresse biologico<br />
Specie chimica Formula Natura Specie chimica Formula Natura<br />
Ozono<br />
Anione superossido<br />
O3 O2<br />
N-R Ossido nitrico NO* R<br />
* Ossigeno s<strong>in</strong>goletto<br />
1<br />
O2*<br />
R<br />
R (?)<br />
Diossido nitrico<br />
Acido nitroso<br />
NO2*<br />
HNO2<br />
R<br />
N-R<br />
Perossido di idrogeno H2O2 N-R Tetrossido di azoto N2O4 N-R<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale alcossile<br />
HO*<br />
RO*<br />
R<br />
R<br />
Triossido nitrico<br />
Peross<strong>in</strong>itrito<br />
N2O3<br />
ONOO<br />
N-R<br />
- N-R<br />
Radicale idroperossile ROO* R Acido peross<strong>in</strong>itroso ONOOH N-R<br />
Idroperossido ROOH N-R Catione nitronio NO 2+ N-R<br />
Semich<strong>in</strong>one ( CoQ) Q* R Alchil-peross<strong>in</strong>itrito ROONO N-R<br />
Fenossile (vit E) E-O* R Acido ipocloroso HClO N-R<br />
N-R: specie non radicalica.<br />
R: specie radicalica.<br />
Nella presente trattazione, tuttavia, si farà riferimento<br />
prevalentemente alle specie reattive centrate<br />
sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS).<br />
L’ossigeno, <strong>in</strong>fatti, oltre ad essere uno degli elementi<br />
quantitativamente più importanti della materia<br />
vivente, nonché la fonte primaria della vita<br />
stessa, attraverso una serie di meccanismi – non<br />
ultimo la stessa respirazione cellulare – <strong>in</strong>duce cont<strong>in</strong>uamente<br />
la formazione di specie chimiche con<br />
caratteristiche più o meno spiccate di reattività.<br />
Capitolo 1<br />
Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
+<br />
Nuova molecola<br />
(ridotta, stabile)<br />
Elettrone spaiato<br />
C C<br />
Nuovo radicale<br />
(ossidante)<br />
H H2O 2O 2O 2O 2 + HCl → H H2O 2O 2O 2O + HClO HClO<br />
OSSIDANTE<br />
Acquisizione elettroni<br />
RIDUCENTE<br />
-1<br />
-2<br />
Cessione elettroni<br />
OSSIDAZIONE<br />
+1<br />
6<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
1. 2 I radicali <strong>liberi</strong><br />
I radicali <strong>liberi</strong> o, più semplicemente, radicali,<br />
sono atomi o raggruppamenti di atomi aventi <strong>in</strong> uno<br />
degli orbitali esterni delle specie che li costituiscono<br />
uno o più elettroni spaiati, <strong>in</strong>dipendentemente dalla<br />
carica elettrica espressa (3, 6, 12).<br />
Per esempio, il radicale della N,N-dietilparafenilendiamm<strong>in</strong>a,<br />
il substrato cromogeno del d-ROMs<br />
test (vedi <strong>in</strong> seguito), è un classico radicale catione,<br />
cioè carico positivamente (figura 1. 2) (1).<br />
CH 3 -CH 2<br />
Ne<br />
L’atomo L’atomo di di Ne<br />
Ne<br />
Solo Solo elettroni elettroni appaiati<br />
appaiati<br />
Atomo (stabile)<br />
N<br />
NH 2<br />
L’atomo di O<br />
Due elettroni spaiati<br />
<strong>Radicali</strong> <strong>liberi</strong> dell’ossigeno (<strong>in</strong>stabili)<br />
CH 3 -CH 2<br />
Figura 1. 2 Atomi, molecole e radicali<br />
Il radicale idrossile (HO . Il radicale idrossile (HO )<br />
Un elettrone spaiato<br />
. Il radicale idrossile (HO )<br />
Un elettrone spaiato<br />
. Il radicale idrossile (HO )<br />
Un elettrone spaiato<br />
. )<br />
Un elettrone spaiato<br />
In funzione della distribuzione della carica (nube<br />
elettronica) e/o del proprio potenziale di ossidoriduzione,<br />
i radicali <strong>liberi</strong> presentano una reattività<br />
più o meno spiccata, legata alla tendenza spontanea<br />
ad esistere come entità aventi tutti gli elettroni<br />
disposti <strong>in</strong> coppie, condizione che corrisponde alla<br />
stabilità o <strong>in</strong>erzia chimica (28).<br />
Ne deriva che non tutti i radicali sono ugualmente<br />
reattivi. In genere, quanto più è elevato il<br />
rapporto fra carica e volume, tanto più un radicale<br />
libero è reattivo e, pertanto, tenderà a raggiungere<br />
la propria stabilità strappando elettroni a qualsiasi<br />
specie chimica con la quale viene a contatto, ossidandola<br />
(compatibilmente con il suo potenziale di<br />
ossido-riduzione) (figura 1. 3) (28).<br />
Figura 1. 3 Basi chimiche della reattività radicalica (28)<br />
In tal senso, il radicale ossidrile (HO • ) è uno dei<br />
radicali <strong>liberi</strong> più <strong>in</strong>stabili e, qu<strong>in</strong>di, reattivi ed<br />
O<br />
N<br />
O<br />
NH 2<br />
CH 3 -CH 2<br />
CH 3 -CH 2<br />
N,N-dietilparafenilendiamm<strong>in</strong>a (base) N,N-dietilparafenilendiamm<strong>in</strong>a (radicale)<br />
+1.5<br />
+1.0<br />
+0.5<br />
0<br />
-0.5<br />
1.0<br />
-1.5<br />
E7 (R* + e- E7 (R* + e →R) - E7 (R* + e →R) - →R)<br />
+2.0<br />
HO• HO• HO• RO• RO• RO• RS• RS• RS• ROO• ROO• ROO• Potenziale redox<br />
e reattività<br />
* O 2<br />
Asc• SeQ• NAD•<br />
Asc• SeQ• NAD•<br />
Asc• SeQ• NAD•<br />
=COH• =COH• =COH• C(NO 2 ) 4<br />
CO 2<br />
- E 7 (R* →→ → R + e )<br />
-1 -0.5 0 +0.5 +1.0 +1.5 +2.0<br />
+<br />
H<br />
HO• Cl• HO<br />
Radicale idrossile Atomo di cloro<br />
• Cl• HO<br />
Radicale idrossile Atomo di cloro<br />
• Cl• HO<br />
Radicale idrossile Atomo di cloro<br />
• Cl• Radicale idrossile Atomo di cloro<br />
<strong>Radicali</strong> molto reattivi<br />
(elevato rapporto carica/superficie)<br />
N N<br />
NO 2<br />
O 2 N NO 2<br />
Difenilpicrilidrazide (DPPH)<br />
Un radicale poco reattivo<br />
(basso rapporto carica/superficie)
ossidanti. Infatti, la durata stimata della sua esistenza<br />
è dell’ord<strong>in</strong>e dei nanosecondi (28).<br />
Viceversa, il trifenilmetile [(C 6H 5) 3–C • ] è un radicale<br />
che, <strong>in</strong> opportune condizioni, può essere pers<strong>in</strong>o<br />
isolato <strong>in</strong> soluzione, proprio per la sua relativa<br />
stabilità o <strong>in</strong>erzia chimica (28).<br />
Lo stesso radicale catione della N,Ndietilparafenilendiamm<strong>in</strong>a,<br />
sopra citato, costituisce<br />
un esempio di radicale relativamente stabile (figura<br />
1. 1) (1).<br />
I radicali <strong>liberi</strong> vengono classificati sulla base<br />
della natura dell’atomo al quale appartiene l’orbitale<br />
con l’elettrone spaiato. Tra questi assumono particolare<br />
rilevanza biologica i radicali <strong>liberi</strong> centrati<br />
sull’ossigeno o, più semplicemente, radicali <strong>liberi</strong><br />
dell’ossigeno, quali il radicale idrossile (tabella 1. 1).<br />
Un esempio di radicale libero centrato sull’azoto<br />
è fornito dall’ossido nitrico.<br />
1. 3 Meccanismi generali di produzione<br />
delle specie chimiche reattive<br />
Le specie chimiche reattive e, <strong>in</strong> particolar modo,<br />
i radicali <strong>liberi</strong>, comunque centrati, possono essere<br />
generati attraverso due meccanismi generali,<br />
non enzimatici oppure enzimatici (18).<br />
In ambedue i casi, una volta formatisi, i radicali<br />
<strong>liberi</strong> possono dar luogo, <strong>in</strong> opportune condizioni<br />
ambientali, ad una serie di reazioni a catena, nel<br />
corso delle quali il sito radicalico può essere trasferito<br />
o, eventualmente, <strong>in</strong>attivato (26, 28).<br />
Le reazioni radicaliche a catena avvengono seguendo<br />
lo stesso schema generale, nel quale è possibile<br />
<strong>in</strong>dividuare tre fasi o step pr<strong>in</strong>cipali – <strong>in</strong>izio,<br />
propagazione e term<strong>in</strong>e – alle quali si accompagnano<br />
spesso reazioni collaterali aventi andamento simile<br />
(figura 1. 4) (18, 28).<br />
Inizio<br />
Propagazione<br />
Term<strong>in</strong>e<br />
Fotolisi/<br />
pirolisi<br />
A : B<br />
+hν<br />
A• A + •B • A + •B • A + •B • A + •B • A + •B • + •B A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
A• Trasferimento<br />
R• R• R• R• R• R : H<br />
A : H<br />
Comb<strong>in</strong>azione<br />
A• A + •B • + •B<br />
A : B<br />
Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe2+ Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe2+ Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe2+ Interazione con<br />
metalli di transizione<br />
AO : OB<br />
Fe2+ Fe2+ AO• + OB -<br />
Fe3+ AO• + OB -<br />
Fe3+ AO• + OB -<br />
Fe3+ AO• + OB -<br />
AO• + OB -<br />
Fe3+ Fe3+ Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• Addizione<br />
R• CH 2 =CH–<br />
R–CH 2 –CH* –<br />
Scissione<br />
di perossidi perossidi perossidi<br />
RO : OR<br />
RO• RO + •OR • RO + •OR • RO + •OR • RO + •OR • + •OR Figura 1. 4 Schema delle reazioni radicaliche a catena (28)<br />
I pr<strong>in</strong>cipali meccanismi attraverso cui si generano<br />
i radicali <strong>liberi</strong> – step 1, reazione di <strong>in</strong>izio – sono<br />
la scissione omolitica e l’<strong>in</strong>terazione con i metalli di<br />
transizione (28).<br />
Con il term<strong>in</strong>e di scissione omolitica si <strong>in</strong>tende<br />
la divisione di una molecola a livello di uno dei suoi<br />
legami covalenti per effetto della somm<strong>in</strong>istrazione<br />
di energia (termica, pirolisi, o radiante, radiolisi) con<br />
generazione di due nuove specie chimiche,<br />
+hν<br />
= C = C =<br />
R • R • R • R • R •<br />
Scissione di<br />
azocomposti<br />
RN : : NR<br />
– N 2<br />
R• R + •R • R + •R • R + •R • R + •R • + •R Frammentazione Ri-arrangiamento<br />
R:C – C*= R:C – C*=<br />
– C =<br />
– C =<br />
Disproporzione<br />
– C<br />
– C –<br />
• – – C<br />
– C –<br />
• – C –<br />
+<br />
– C –<br />
• – – C<br />
– C –<br />
• –<br />
+<br />
+<br />
=C* – C:R<br />
– C –<br />
– C –<br />
7<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
ciascuna con un elettrone spaiato, elemento dist<strong>in</strong>tivo<br />
dei radicali <strong>liberi</strong> (figura 1. 5, A).<br />
A<br />
B<br />
A B<br />
Molecola<br />
H<br />
Cl<br />
Molecola<br />
Energia<br />
Acqua<br />
Radicale libero 1<br />
Figura 1. 5 Scissione omolitica (A) e ionizzazione (B)<br />
E’ bene sottol<strong>in</strong>eare che la scissione omolitica<br />
è diversa dalla ionizzazione, che si osserva, per esempio,<br />
dopo aver disciolto <strong>in</strong> acqua molecole, come<br />
quelle dell’acido cloridrico (HCl), aventi almeno<br />
un legame covalente polarizzato. In questo caso, le<br />
molecole d’acqua, a causa della loro polarità e,<br />
dunque, senza alcuna somm<strong>in</strong>istrazione di ener-gia,<br />
riescono a spezzare uno dei legami covalenti polarizzati<br />
della molecola di soluto generando due specie<br />
chimiche caricate di segno opposto, un catione<br />
ed un anione (H + e Cl - , rispettivamente,<br />
nell’esempio considerato) (figura 1. 5, B).<br />
E’ evidente che nella ionizzazione, al contrario<br />
della scissione omolitica, il doppietto elettronico di<br />
legame della molecola orig<strong>in</strong>aria non viene separato<br />
ma resta come tale <strong>in</strong> una delle “neonate” specie<br />
ioniche (l’anione).<br />
Un classico esempio di scissione omolitica è la<br />
radiolisi o fotolisi dell’acqua che genera un atomo<br />
di idrogeno ed un radicale idrossile (7).<br />
Oltre che per scissione omolitica, i radicali <strong>liberi</strong><br />
possono essere prodotti <strong>in</strong> seguito all’<strong>in</strong>terazione di<br />
particolari molecole con alcuni metalli di transizione<br />
(figura 1. 6).<br />
<<br />
A<br />
B<br />
Molecola<br />
A<br />
B<br />
Molecola<br />
Men+1 Men+1 Men Men Men Men+1 Men Men+1 Figura 1. 6 Interazione con metalli di transizione<br />
Nell’<strong>in</strong>terazione con i metalli di transizione,<br />
l’elettone generato dall’ossidazione di un metallo di<br />
transizione <strong>in</strong> forma ionica (es. da Fe 2+ a Fe 3+ o da<br />
Cu + to Cu 2+ ) spezza un legame covalente di una<br />
molecola bersaglio, generando così un radicale libero<br />
e un anione (1, 13, 14, 16, 27).<br />
Alternativamente, l’elettrone richiesto per ridurre<br />
un metallo di transizione <strong>in</strong> forma ionica (es. da<br />
Fe 3+ a Fe 2+ o da Cu 2+ a Cu + ) viene estratto dal<br />
legame covalente di una molecola bersaglio, che si<br />
+<br />
A B<br />
H<br />
H<br />
Catione<br />
A<br />
+<br />
Radicale libero<br />
Radicale libero<br />
+<br />
+<br />
+<br />
Radicale libero 2<br />
Cl<br />
Anione<br />
B<br />
Anione<br />
A B<br />
Catione<br />
-<br />
-<br />
+
decompone <strong>in</strong> un radicale libero ed un catione (1,<br />
13, 14).<br />
Attraverso questo meccanismo, per esempio, il<br />
ferro (Fe 2+ /Fe 3+ ) oppure il rame (Cu + /Cu 2+ ) agiscono<br />
da catalizzatori <strong>in</strong> una sequenza di reazioni di<br />
ossido-riduzione generando, a partire dai perossidi,<br />
radicali <strong>liberi</strong> (13, 14, 16).<br />
Nel caso più semplice – descritto per la prima<br />
volta da Fenton – uno ione ferroso (Fe 2+ ), ossidandosi<br />
a ione ferrico (Fe 3+ ), cede il suo elettrone ad<br />
una molecola di perossido di idrogeno (H 2O 2) e ne<br />
sc<strong>in</strong>de uno dei legami covalenti, generando un radicale<br />
libero (il radicale idrossile, HO • ) ed un anione<br />
(ione ossidrile) (13,14, 16, 27).<br />
A sua volta, lo ione ferrico (Fe 3+ ) si riduce – rigenerandosi<br />
come qualsiasi catalizzatore – a ione<br />
ferroso (Fe 2+ ), strappando un elettrone da una seconda<br />
molecola di perossido di idrogeno, che è scissa<br />
<strong>in</strong> un radicale libero (un radicale peridrossile<br />
(HOO • ), e un catione (uno ione idrogeno, H + ) (figura<br />
1. 7) (13, 14, 16).<br />
H–O–O–H<br />
Perossido<br />
di idrogeno<br />
H–O–O• H–O–O• H–O–O• Radicale<br />
peridrossile<br />
Figura 1. 7 Decomposizione del perossido di idrogeno<br />
Allo stesso modo, anche gli idroperossidi sono<br />
scissi, per azione catalitica del ferro, <strong>in</strong> radicali alcossilici<br />
(RO • ) e perossilici (ROO • ) (figura 1. 8) (1).<br />
R-O-O-H<br />
R-O-O-H<br />
(Alchil)<br />
(Alchil)<br />
idroperossido<br />
idroperossido<br />
R-O-O .<br />
R-O-O .<br />
R-O-O .<br />
R-O-O .<br />
R-O-O .<br />
R-O-O .<br />
Radicale<br />
(idro)perossilico<br />
Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ H + H + H + H + H + H +<br />
OH- OH- OH- Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ H + H + H +<br />
OH -<br />
OH -<br />
OH -<br />
OH -<br />
OH -<br />
OH -<br />
Fe3+ Fe3+ Fe3+ Fe3+ Fe3+ Fe3+ H–O• H–O• H–O• Radicale<br />
idrossile<br />
H–O–O–H<br />
Perossido<br />
di idrogeno<br />
R-O .<br />
R-O .<br />
R-O .<br />
R-O .<br />
R-O .<br />
R-O .<br />
Radicale<br />
alcossilico<br />
R-O-O-H<br />
(Alchil)<br />
idroperossido<br />
Figura 1. 8 Decomposizione degli idroperossidi<br />
In assenza di catalizzatori, la scissione dei perossidi<br />
– che dà luogo ad un’unica specie radicalica,<br />
quella alcossilica – può avvenire solo <strong>in</strong> seguito a<br />
somm<strong>in</strong>istrazione di energia (figura 1. 4) (28).<br />
Un’ultima modalità di formazione di radicali <strong>liberi</strong>,<br />
tra quelle di maggiore rilevanza biologica, è la<br />
decomposizione degli azocomposti, dalla quale orig<strong>in</strong>ano,<br />
per sottrazione di azoto molecolare (N 2) radicali<br />
alchilici (figura 1. 4) (28).<br />
Una volta <strong>in</strong>nescata, una reazione radicalica a<br />
catena tende a propagarsi (step 2).<br />
8<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
Si dist<strong>in</strong>guono 4 meccanismi fondamentali di<br />
propagazione delle reazioni radicaliche: trasferimento,<br />
addizione, frammentazione e riarrangiamento<br />
(28).<br />
Tra questi, il più comune nell’ambito delle reazioni<br />
radicaliche è il trasferimento. In tale modalità,<br />
il radicale libero – generato da una delle precedenti<br />
reazioni di <strong>in</strong>izio – attacca una molecola sottraendo<br />
ad essa uno dei suoi atomi (generalmente un atomo<br />
di idrogeno). Il risultato f<strong>in</strong>ale è la formazione di<br />
una nuova specie reattiva e, <strong>in</strong> pratica, il trasferimento<br />
del sito radicalico (figura 1. 9A).<br />
A<br />
B<br />
+<br />
A R H<br />
Radicale libero<br />
(ossidante)<br />
Radicale Radicale<br />
ossidrile<br />
Figura 1. 9 Reazione di trasferimento<br />
Con questo meccanismo, per esempio, il radicale<br />
ossidrile (HO • ) attaccando una molecola organica<br />
(R–H), strappa a questa un atomo di idrogeno, generando,<br />
accanto ad una molecola d’acqua (H2O),<br />
un radicale alchilico (R • ) (figura 1. 9, B). Così, il sito<br />
radicalico si trasferisce dal radicale ossidrile al radicale<br />
alchile.<br />
Inf<strong>in</strong>e, una reazione radicalica a catena può arrestarsi<br />
(term<strong>in</strong>e, step 3) o per comb<strong>in</strong>azione o per<br />
disproporzione.<br />
In particolare, nella comb<strong>in</strong>azione, che è la reazione<br />
<strong>in</strong>versa della scissione omolitica, due radicali<br />
<strong>liberi</strong> reagiscono tra loro dando luogo ad una molecola<br />
non più reattiva (figura 1. 10) (28).<br />
R<br />
Radicale libero 1<br />
(ossidante)<br />
Molecola<br />
bersaglio<br />
+<br />
R 1<br />
Radicale libero 2<br />
(antiossidante)<br />
A H<br />
Nuova<br />
molecola<br />
R R 1<br />
Nuova<br />
molecola<br />
Figura 1. 10 Reazione di comb<strong>in</strong>azione<br />
Il primo radicale agisce come ossidante, mentre<br />
il secondo si comporta come un generico antiossidante<br />
(vedi appresso).<br />
Questo meccanismo – come verrà <strong>in</strong> seguito discusso<br />
– viene sfruttato per bloccare una reazione<br />
radicalica e <strong>in</strong> generale, un qualsiasi processo radicalico<br />
a catena, sia esso <strong>in</strong>dustriale o biologico, può<br />
essere <strong>in</strong>terrotto grazie all’<strong>in</strong>tervento di agenti denom<strong>in</strong>ati<br />
<strong>antiossidanti</strong>.<br />
+<br />
R<br />
Nuovo radicale<br />
(ossidante)<br />
O H + R H R + H O H<br />
Substrato<br />
organico<br />
Radicale<br />
alchile<br />
Acqua
1. 4 La produzione di specie reattive<br />
negli organismi viventi<br />
Negli organismi viventi le specie chimiche reattive<br />
e, <strong>in</strong> particolare, i ROS sono generati nel corso<br />
della normale attività metabolica cellulare; alcuni<br />
agenti esogeni, tuttavia, possono <strong>in</strong>crementarne la<br />
produzione, anche con meccanismo diretto (figura<br />
1. 11) (5-7, 25).<br />
Agenti<br />
esogeni<br />
Figura 1. 11 Meccanismo generale di produzione dei ROS<br />
E’ possibile <strong>in</strong>dividuare almeno 5 fonti metaboliche<br />
primarie di radicali <strong>liberi</strong>, <strong>in</strong> rapporto al sito cellulare<br />
prevalentemente <strong>in</strong>teressato nella produzione<br />
dei ROS stessi: la plasmamembrana, i mitocondri, i<br />
perossisomi, il reticolo endoplasmatico liscio (microsomi)<br />
e il citosol. E’ bene ricordare che <strong>in</strong> ciascuna<br />
di queste sedi i ROS vengono prodotti o spontaneamente<br />
o per effetto di reazioni catalizzate da enzimi<br />
o da metalli di transizione (es. ferro o rame)<br />
(figura 1. 12) (24).<br />
NADPH ossidasi<br />
Lipoossigenasi<br />
Xant<strong>in</strong>a ossidasi<br />
Aldeide ossidasi<br />
Produzione<br />
di ROS<br />
Metabolismo<br />
cellulare<br />
NADH deidrogenasi<br />
Citocromo ossidasi<br />
Citocromo P 450<br />
Citocromo b 5<br />
Figura 1. 12 Fonti cellulari primarie di produzione di ROS (24)<br />
La plasmamembrana rappresenta una delle fonti<br />
più importanti di ROS, particolarmente (ma non<br />
esclusivamente) nei leucociti polimorfonucleati<br />
(PMN). Infatti, nella plasmamembrana di queste<br />
cellule sono localizzati diversi enzimi, quali la<br />
NADPH ossidasi e le lipoossigenasi, la cui attivazione<br />
si accompagna alla produzione, rispettivamente<br />
di anione superossido e di <strong>in</strong>termedi metabolici con<br />
caratteristiche chimiche di perossidi (24).<br />
La NADPH ossidasi è un enzima che catalizza la<br />
formazione di anione superossido da NADPH(H + ) ed<br />
ossigeno molecolare, <strong>in</strong> seguito a stimolazione specifica<br />
dei PMN, per esempio da parte di endotoss<strong>in</strong>e,<br />
batteri, o anticorpi).<br />
La reazione, che avviene verosimilmente <strong>in</strong> due<br />
tappe, è resa possibile dall’aumentata disponibilità<br />
9<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
di NADPH(H + ), per l’aumentata ossidazione del<br />
glucosio attraverso lo shunt degli esosi, e di<br />
ossigeno molecolare, nell’ambito del cosiddetto “respiratory<br />
burst” (vedi più avanti).<br />
Il sistema della lipoossigenasi, localizzato<br />
anch’esso a livello della plasmamembrana, comprende<br />
tre enzimi, la 5-, la 12-, e la 15lipoossigenasi,<br />
che catalizzano la formazione, a partire<br />
dall’acido arachidonico, del 5-, del 12- e del 15-<br />
HPETE, rispettivamente (29). Queste sostanze sono<br />
chimicamente degli idroperossidi acidi, un gruppo<br />
particolare di ROS spesso <strong>in</strong>dicati con la sigla di<br />
ROM (reactive oxygen metabolites, cioè metaboliti o<br />
derivati reattivi dell’ossigeno).<br />
La produzione di ROS a livello della plasmamembrana<br />
dei PMN, per attivazione della NADPH<br />
ossidasi e/o delle lipossigenasi, avviene, tipicamente,<br />
nel corso di processi reattivi (es. <strong>in</strong>fezioni, immunoreazioni<br />
patogene, <strong>in</strong>fiammazioni).<br />
I mitocondri rappresentano la fonte metabolica<br />
primaria di ROS perché sulle loro creste sono localizzati<br />
i complessi enzimatici della catena respiratoria<br />
deputati alla fosforilazione ossidativa (18).<br />
Idealmente, il trasferimento di elettroni dal<br />
NAD ridotto al citocromo C e da questo all’ossigeno<br />
dovrebbe concludersi, una volta s<strong>in</strong>tetizzato l’ATP,<br />
con la produzione di H2O (riduzione tetravalente<br />
dell’ossigeno molecolare) (18).<br />
Tuttavia, già <strong>in</strong> condizioni normali, questo processo<br />
non è perfetto, per cui <strong>in</strong> maniera non facilmente<br />
controllabile una certa quota di elettroni (1-<br />
2%) sfugge al sistema di tra<strong>sport</strong>o dei vari coenzimi<br />
(es. ubich<strong>in</strong>one, flavoprote<strong>in</strong>e, citocromi, ecc.) e reagisce<br />
direttamente con l’ossigeno molecolare, generando,<br />
così, anione superossido e /o perossido di<br />
idrogeno (riduzione uni- e bivalente dell’ossigeno<br />
molecolare) (18).<br />
Per avere un’idea di questo processo, si consideri<br />
che è stato calcolato che durante un esercizio<br />
fisico <strong>in</strong>tenso nei muscoli scheletrici, a causa<br />
dell’<strong>in</strong>tensa stimolazione metabolica cellulare la<br />
quota di questo shunt elettronico può raggiungere il<br />
15% dell’ossigeno utilizzato dai mitocondri (18).<br />
Il fenomeno della riduzione uni o bivalente<br />
dell’ossigeno molecolare avviene, nei mitocondri,<br />
senza l’<strong>in</strong>tervento di enzimi, al contrario di quanto<br />
osservato <strong>in</strong> altre sedi cellulari (figura 1. 13) (18).<br />
O O<br />
.<br />
2 2 H2O2 HO .<br />
1e- 1e- 1e- 1e- O O<br />
.<br />
2 2 H2O2 HO .<br />
1e- 1e- 1e- 1e- O O<br />
.<br />
2 2 H2O2 HO .<br />
1e- 1e- 1e- 1e- Riduzione<br />
univalente<br />
2 H + 2 H + 2 H +<br />
Riduzione tetravalente<br />
Riduzione<br />
univalente<br />
Riduzione bivalente<br />
1H + 1H + 1H +<br />
Riduzione bivalente<br />
H H2O 2O 2O<br />
Figura 1. 13 Modalità di riduzione dell’ossigeno molecolare (18)
In altre parole, da un punto di vista squisitamente<br />
chimico la produzione di radicali <strong>liberi</strong> nel<br />
corso della fosforilazione ossidativa è esattamente<br />
una modalità non enzimatica di produzione di<br />
specie reattive (18).<br />
In realtà, come si è appenna accennato, la generazione<br />
di radicali <strong>liberi</strong> negli organismi viventi è<br />
strettamente legata ai fenomeni vitali e, pertanto,<br />
costituisce un fenomeno “fisiologico” che avviene<br />
cont<strong>in</strong>uamente nel corso di reazioni di ossidoriduzione<br />
attraverso meccanismi sia enzimatici che non<br />
enzimatici (18).<br />
A questo punto è opportuno sottol<strong>in</strong>eare che,<br />
oltre ai mitocondri, esistono anche altre fonti non<br />
enzimatiche di radicali <strong>liberi</strong> nelle cellule. Per esempio,<br />
i peross<strong>in</strong>itriti generano spontaneamente radicale<br />
idrossile e radicale nitrossido.<br />
Tuttavia, le reazioni non enzimatiche più importanti<br />
sotto il profilo biologico per la produzione di<br />
radicali <strong>liberi</strong> sono quelle catalizzate da metalli di<br />
transizione.<br />
In queste reazioni, che richiedono generalmente<br />
ferro o rame allo stato ridotto (rispettivamente<br />
Fe 2+ e Cu + ) il perossido di idrogeno (generato attraverso<br />
varie metaboliche, come si preciserà più<br />
avanti) è scisso <strong>in</strong> radicale idrossile e ione ossidrile<br />
per <strong>in</strong>globamento dell’elettrone strappato al<br />
metallo di transizione, che viene rilasciato <strong>in</strong> forma<br />
ossidata (rispettivamente Fe 3+ e Cu 2+ ); analoga reazione<br />
subiscono gli idroperossidi, che generano il<br />
radicale alcossile (figure 1. 7 e 1. 8) (13, 14, 16).<br />
Gli enzimi che rigenerano metalli di transizione<br />
allo stato ridotto costituiscono un complesso <strong>in</strong>dicato<br />
con la sigla MCO (sistemi di ossidazione metallocatalizzata)<br />
(27).<br />
Essi comprendono la xant<strong>in</strong>a ossidasi, la NADPH<br />
e la NADH ossidasi, l’acido nicot<strong>in</strong>ico idrossilasi, il<br />
sistema del citocromo P 450, la NADH reduttasi (coenzima<br />
ch<strong>in</strong>onico), la succ<strong>in</strong>ico-reduttasi (coenzima<br />
ch<strong>in</strong>onico) e varie prote<strong>in</strong>e a ferro-zolfo non em<strong>in</strong>ico.<br />
I ch<strong>in</strong>oni e i gruppi prostetici flav<strong>in</strong>ici ridotti generati<br />
da questi enzimi riducono a loro volta i metalli<br />
di transizione, provocando la riduzione diretta<br />
dell’ossigeno molecolare a radicale idrossile e/o a<br />
perossido di idrogeno (attraverso la mediazione o<br />
meno dell’anione superossido) (figura 1. 14) (27).<br />
QH 2<br />
O 2<br />
FH 2<br />
O 2<br />
QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- 2H + 2H + 2H +<br />
x2<br />
O *<br />
2<br />
O 2<br />
H2 O2 Fe(II)<br />
F FH +<br />
H2 O2 Fe(II)<br />
F FH +<br />
H2 O2 Fe(II)<br />
F FH +<br />
*OH + OH- *OH + OH + Fe (III)<br />
- *OH + OH + Fe (III)<br />
- + Fe (III)<br />
Fe(III)<br />
Figura 1. 14 Sistemi MCO e ciclo del ferro (27)<br />
10<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
Oltre alla plasmamembrana ed ai mitocondri,<br />
anche i perossisomi rappresentano una fonte importante<br />
di ROS.<br />
In questi organuli cellulari, <strong>in</strong>fatti, avviene un<br />
particolare processo di ossidazione degli acidi grassi,<br />
che è diverso da quello convenzionale (bossidazione).<br />
Nella prima tappa di tale sequenza di<br />
reazioni, una flavoprote<strong>in</strong>a estrae una coppia di atomi<br />
di idrogeno da una molecola di acido grasso<br />
attivato (acil-CoA) trasferendola direttamente<br />
all’ossigeno molecolare, con formazione di perossido<br />
di idrogeno (successivamente <strong>in</strong>attivato dalla catalasi).<br />
Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) la produzione<br />
di specie reattive passa attraverso il citocromo<br />
P450. Quest’ultimo gioca un ruolo di primo<br />
piano nei processi di detossificazione (19, 20, 24).<br />
Infatti, il citocromo P450 agisce come donatore<br />
immediato di elettroni <strong>in</strong> molte idrossilazioni, <strong>in</strong> particolare<br />
quelle che avvengono all’<strong>in</strong>terno degli epatociti<br />
e che sono f<strong>in</strong>alizzate all’<strong>in</strong>attivazione di ormoni<br />
(es. steroidei) e composti non fisiologici (xenobiotici,<br />
quali tossici e farmaci idrofobici che vengono<br />
<strong>in</strong> tal modo resi più solubili e meno tossici)<br />
(24).<br />
Il citocromo P450 è una prote<strong>in</strong>a a ferro em<strong>in</strong>ico<br />
presente non solo nel reticolo endoplasmatico del<br />
fegato ma anche nei mitocondri della corticale del<br />
surrene che, <strong>in</strong> un processo molto complesso e non<br />
ancora perfettamente chiarito, fa da trait-d’union<br />
fra l’NADPH(H + ) (donatore di elettroni) e substrato<br />
da idrossilare (24).<br />
In tale complessa reazione un substrato idrossilabile<br />
(SH) reagisce con NADPH(H + ) ed ossigeno<br />
molecolare (O 2) per formare il corrispondente derivato<br />
idrossilato (S-OH), <strong>in</strong>sieme a NADP + ed acqua.<br />
Una produzione di radicali <strong>liberi</strong> avviene nella<br />
cellula anche nel corso di numerose altre reazioni<br />
biochimiche, come ad esempio durante l’ossidazione<br />
dell’ipoxant<strong>in</strong>a a xant<strong>in</strong>a e della xant<strong>in</strong>a ad acido<br />
urico, che contrassegnano la fase f<strong>in</strong>ale del catabolismo<br />
dei nucleotidi pur<strong>in</strong>ici (AMP → IMP → <strong>in</strong>os<strong>in</strong>a<br />
→ ipoxant<strong>in</strong>a → xant<strong>in</strong>a → acido urico) (24).<br />
Ambedue le suddette reazioni sono catalizzate<br />
dalla xant<strong>in</strong>a deidrogenasi, un enzima a molibdeno.<br />
In particolari condizioni, come nel corso del cosiddetto<br />
danno da ischemia-riperfusione, la xant<strong>in</strong>a<br />
deidrogenasi è convertita <strong>in</strong> xant<strong>in</strong>a ossidasi. Tale<br />
conversione è legata verosimilmente all’attivazione<br />
di specifiche proteasi, <strong>in</strong>dotta dall’<strong>in</strong>cremento del<br />
calcio libero all’<strong>in</strong>terno della cellula, una delle conseguenze<br />
del danno ossidativo da radicali <strong>liberi</strong>.<br />
La xant<strong>in</strong>a ossidasi, derivata dal clivaggio proteolitico<br />
della xant<strong>in</strong>a deidrogenasi, diversamente<br />
da quest’ultima, utilizza come accettore f<strong>in</strong>ale di elettroni<br />
direttamente l’ossigeno, generando così perossido<br />
di idrogeno ed anione superossido, a partire,<br />
rispettivamente, dall’ipoxant<strong>in</strong>a e dalla xant<strong>in</strong>a<br />
(figura 1. 15).
Ipoxant<strong>in</strong>a Xant<strong>in</strong>a<br />
H 2 O + O 2<br />
← Xant<strong>in</strong>a ossidasi →<br />
H 2 O 2<br />
Xant<strong>in</strong>a Acido Acido urico<br />
urico<br />
O 2<br />
O -<br />
2<br />
Figura 1. 15 Produzione di ROS dal catabolismo pur<strong>in</strong>ico<br />
Altre reazioni che generano radicali <strong>liberi</strong> sono<br />
descritte nella s<strong>in</strong>tesi delle catecolamm<strong>in</strong>e (24).<br />
Da quanto esposto f<strong>in</strong>ora, si ev<strong>in</strong>ce che i ROS<br />
rappresentano <strong>in</strong>termedi quasi obbligati del metabolismo<br />
cellulare. E poiché la loro produzione è<br />
strettamente legata ai fenomeni vitali, a ragione essi<br />
sono stati def<strong>in</strong>iti “<strong>in</strong>sostituibili compagni di viaggio”<br />
della nostra esistenza (4).<br />
Appare evidente che <strong>in</strong> ciascun sito cellulare, la<br />
produzione di specie reattive ha una sua specifica<br />
funzione. Infatti, è stato riconosciuto che i ROS<br />
giocano un ruolo importante “al servizio della vita”<br />
perché sono co<strong>in</strong>volti non solo nel metabolismo cellulare<br />
ma anche nei “processi reattivi”, quali <strong>in</strong>fezioni<br />
e <strong>in</strong>fiammazioni.<br />
Per esempio, l’anione superossido e gli altri ROS<br />
vengono generati sulla superficie esterna della plasmamembrana<br />
dei leucociti attivati. Queste specie<br />
reattive attaccheranno componenti estranei quali<br />
batteri <strong>in</strong>debolendone la parete e rendendoli più facilmente<br />
accessibili alla fagocitosi e, <strong>in</strong> def<strong>in</strong>itiva,<br />
alla loro distruzione. Queste attività “immunologiche”<br />
si estr<strong>in</strong>secano non solo nei confronti di componenti<br />
estranei ma anche contro componenti “self”<br />
quali tessuti o organi trapiantati (reazione di rigetto).<br />
Questa strategia viene anche utilizzata nel corso<br />
della guarigione di organi o tessuti soggetti a traumi.<br />
Infatti, i leuociti migrano nell’area lesa, si attivano<br />
e <strong>in</strong>iziano a bombardare le cellule danneggiate<br />
con i radicali <strong>liberi</strong> che accelerano la loro distruzione,<br />
allontanamento dei sottoprodotti di lisi, e il corrispondente<br />
recupero (rigenerazione) (18).<br />
La produzione di radicali <strong>liberi</strong> da parte delle<br />
cellule può, talvolta, subire un <strong>in</strong>cremento notevole<br />
per effetto di stimolazioni esterne. Infatti, agenti<br />
fisici, chimici e biologici, da soli o <strong>in</strong> comb<strong>in</strong>azione<br />
tra loro, possono <strong>in</strong>durre direttamente la generazione<br />
di ROS o aumentarne la “fisiologica” produzione<br />
attraverso una specifica stimolazione metabolica<br />
(18).<br />
Tra gli agenti fisici, sono da segnalare le radiazioni<br />
ionizzanti e i raggi UV.<br />
Ambedue queste fonti energetiche possono <strong>in</strong>durre<br />
il fenomeno della scissione omolitica<br />
dell’acqua, detto anche radiolisi o fotolisi a seconda<br />
del tipo di radiazione co<strong>in</strong>volto (figura 1. 16) (7).<br />
11<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
H R H UV H R + H<br />
Acqua Radicale<br />
Radicale<br />
idrossile<br />
idrogeno<br />
Figura 1. 16 La fotolisi dell’acqua<br />
In questa reazione la molecola d’acqua assorbe<br />
energia e la utilizza per sc<strong>in</strong>dere uno dei suoi due<br />
legami covalenti con l’idrogeno: i prodotti saranno<br />
due radicali <strong>liberi</strong>, il radicale idrossile e l’atomo di<br />
idrogeno. Considerato che un organismo vivente è<br />
costituito prevalentemente da acqua e che trascorre<br />
gran parte della sua vita sotto l’effetto di radiazioni<br />
(UV o ionizzanti che siano) appare evidente quanto<br />
questo fenomeno <strong>in</strong>cida<strong>in</strong> maniera sostanziale<br />
sulla produzione di radicali <strong>liberi</strong>.<br />
Fra gli agenti chimici <strong>in</strong> grado di stimolare la<br />
produzione di radicali <strong>liberi</strong> è da citare l’ozono (un<br />
ROS) che genera direttamente radicali perossilici<br />
per <strong>in</strong>terazione con composti fenolici (28).<br />
I due casi f<strong>in</strong>ora considerati (radiazioni e ozono)<br />
costituiscono esempi di produzione diretta di specie<br />
reattive. Altri agenti chimici, <strong>in</strong>vece, quali gli idrocarburi<br />
aromatici policiclici o taluni farmaci, <strong>in</strong>ducono<br />
un aumento della produzione dei radicali <strong>liberi</strong><br />
attraverso un meccanismo <strong>in</strong>diretto, attivando il sistema<br />
del citocromo P450 a livello microsomiale.<br />
Agenti biologici che tipicamente <strong>in</strong>ducono un<br />
aumento della produzione di ROS per attivazione<br />
metabolica specifica sono i batteri, nell’ambito del<br />
fisiologico processo di difesa dalle <strong>in</strong>fezioni, e taluni<br />
anticorpi, nell’ambito di alcune reazioni immunopatogene.<br />
In questi casi sono chiamati direttamente <strong>in</strong><br />
causa i PMN che, come si è detto, possiedono oltre<br />
alla citata NADPH ossidasi, una serie di enzimi direttamente<br />
co<strong>in</strong>volti nella produzione e, <strong>in</strong> parte,<br />
nell’<strong>in</strong>attivazione di specie reattive, quali la superossidodismutasi<br />
(SOD), la mieloperossidasi (MPx), la<br />
catalasi (CAT) e la glutatione perossidasi (GPx) (figura<br />
1. 17).<br />
Batteri, endotoss<strong>in</strong>e, anticorpi<br />
Ossidazione diretta<br />
del glucosio<br />
Generazione di<br />
NADPH + H +<br />
Generazione di<br />
NADPH + H +<br />
↑ Captazione di<br />
ossigeno<br />
↑ Disponibilità di<br />
ossigeno<br />
Attivazione NADPH ossidasi<br />
HClO<br />
.<br />
O 2<br />
SOD<br />
H H2O 2O 2<br />
MPx CAT GPx<br />
H H2O 2O<br />
NADPH ossidasi<br />
NADPH + O2 → NADP . + H + + O<br />
.<br />
2<br />
NADP . + O2 → NADP + NADPH ossidasi<br />
NADPH + O2 → NADP<br />
+ O<br />
.<br />
2<br />
. + H + + O<br />
.<br />
2<br />
NADP . + O2 → NADP + NADPH ossidasi<br />
NADPH + O2 → NADP<br />
+ O<br />
.<br />
2<br />
. + H + + O<br />
.<br />
2<br />
NADP . + O2 → NADP + + O<br />
.<br />
2<br />
Superossido dismutasi (SOD)<br />
2 O<br />
.<br />
2 + 2 H +<br />
2 + 2 H +<br />
2 + 2 H + → H2 O 2 + O 2<br />
Mieloperossidasi (MPx)<br />
HCl + H 2 O 2 → H 2 O + HClO<br />
Catalasi (CAT)<br />
2 H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2<br />
Glutatione perossidasi (GPx)<br />
2 GSH + H 2 O 2 → 2H 2 O + GSSG<br />
Figura 1. 17 Produzione reattiva di ROS da parte dei PMN
La SOD catalizza la trasformazione dell’anione<br />
superossido <strong>in</strong> perossido di idrogeno che, a sua volta,<br />
può essere <strong>in</strong>attivato ad acqua per azione della<br />
CAT o della GPx. Tuttavia, la disponibilità di cloruri<br />
– anche a concentrazioni fisiologiche – rende il perossido<br />
di idrogeno substrato della MPx. Il risultato<br />
f<strong>in</strong>ale è la produzione di un agente altamente ossidante,<br />
l’acido ipocloroso (HClO). Come verrà precisato<br />
<strong>in</strong> seguito, l’HClO può attaccare numerosi substrati<br />
organici e, <strong>in</strong> particolare, amm<strong>in</strong>oacidi e prote<strong>in</strong>e,<br />
per produrre cloroamm<strong>in</strong>e, una potenziale<br />
fonte di radicali alcossilici e perossilici (15, 31).<br />
Inf<strong>in</strong>e, giova ricordare che un aumento della<br />
produzione di radicali <strong>liberi</strong> può osservarsi <strong>in</strong> situazioni<br />
“fisiologiche”, come ad esempio dopo un <strong>in</strong>tenso<br />
sforzo muscolare o nel corso di numerose<br />
malattie. In quest’ultimo caso, spesso, non è chiaro<br />
f<strong>in</strong>o a che punto i ROS siano la causa o l’effetto della<br />
patologia considerata (vedi più avanti).<br />
1. 5 Metabolismo delle più importanti<br />
specie reattive di <strong>in</strong>teresse biologico<br />
Le più comuni specie reattive di <strong>in</strong>teresse biologico<br />
sono quelle centrate sull’ossigeno, sull’azoto,<br />
sul carbonio e sul cloro (tabella 1. 1).<br />
Tra le specie reattive primarie dell’ossigeno,<br />
l’ossigeno s<strong>in</strong>goletto rappresenta una varietà radicalica<br />
che può orig<strong>in</strong>arsi per eccitazione dell’ossigeno<br />
molecolare o per comb<strong>in</strong>azione di radicali perossilici<br />
(figura 1. 18) (2).<br />
O 2<br />
Eccitazione<br />
1<br />
O2<br />
2 ROO• 2 ROO• 2 ROO• 2 ROO• Comb<strong>in</strong>azione<br />
Figura 1. 18 Modalità di generazione dell’ossigeno s<strong>in</strong>goletto<br />
Molto più complessa è, <strong>in</strong>vece, la formazione<br />
dell’anione superossido (figura 1. 19) (11).<br />
Respirazione<br />
polmonare<br />
O 2<br />
NADPH<br />
ossidasi<br />
Catena<br />
respiratoria<br />
Riduzione univalente<br />
HO• HO• HO• Ossidazione<br />
mista NADPH<br />
Reazione di Haber-Weiss<br />
O 2<br />
Citocromi<br />
P 450 e 5 b<br />
Ossidazione mista<br />
ipoxant<strong>in</strong>a<br />
Figura 1. 19 Metabolismo dell’anione superossido<br />
e<br />
Autoossidazione<br />
Xant<strong>in</strong>a<br />
ossidasi<br />
Superossido dismutasi<br />
H 2 O 2<br />
12<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
Infatti, esso risulta dall’addizione, ad una molecola<br />
di ossigeno, di un elettrone, il quale può provenire<br />
da diverse vie metaboliche. Tra queste assumono<br />
rilevante importanza la catena respiratoria<br />
(riduzione univalente), il “respiratory burst” e, <strong>in</strong><br />
condizioni di ischemia-riperfusione, il catabolismo<br />
dei nucleotidi pur<strong>in</strong>ici. Una volta generato, l’anione<br />
superossido può andare <strong>in</strong>contro alla reazione di<br />
Fenton, generando il radicale altamente istolesivo<br />
idroperossido, oppure dismutare, per azione della<br />
SOD, a perossido di idrogeno, meno tossico.<br />
Il radicale idrossile, noto per la sua enorme potenzialità<br />
istolesiva, può derivare da un’ampia serie<br />
di reazioni, tra le quali spiccano la catena respiratoria,<br />
la già discussa fotolisi dell’acqua, la decomposizione<br />
del perossido di idrogeno, la scissione spontanea<br />
dei peross<strong>in</strong>itriti e la reazione dell’ozono con i<br />
nitriti (figura 1. 20) (9, 10).<br />
Respirazione<br />
polmonare<br />
O 2<br />
Figura 1. 20 Metabolismo del radicale idrossile<br />
Inf<strong>in</strong>e, il perossido di idrogeno viene generato<br />
prevalentemente attraverso meccanismi di tipo enzimatico<br />
e per via enzimatica è generalmente <strong>in</strong>attivato<br />
o dà luogo alla formazione di specie chimiche<br />
più ossidanti (figura 1. 21) (2).<br />
Respirazione<br />
polmonare<br />
O 2<br />
HO• HO• HO• O O2* 2* 2* H H2O 2O 2O H H2O 2O 2O 2<br />
Reazione di<br />
Haber-Weiss<br />
Catena<br />
respiratoria<br />
Riduzione univalente<br />
RH<br />
Superossido<br />
dismutasi<br />
Catena<br />
respiratoria<br />
Riduzione bivalente<br />
H 2 O<br />
Radiolisi<br />
Reazione<br />
di Fenton<br />
HO• HO• HO• R • R • R •<br />
Amm<strong>in</strong>oacido<br />
ossidasi<br />
Ossidazione mista<br />
H 2 O 2 ipoxant<strong>in</strong>a<br />
Reazione di<br />
Haber-Weiss Catalasi Perossidasi<br />
H H2O 2O 2O<br />
Scissione<br />
spontanea<br />
Reazione con ozono<br />
HONOO<br />
Fenoli<br />
Xant<strong>in</strong>a<br />
ossidasi<br />
Mieloperossidasi<br />
Figura 1. 21 Metabolismo del perossido di idrogeno<br />
ClO- ClO- ClO- Le specie reattive primarie dell’ossigeno possono<br />
attaccare qualsiasi substrato organico, generando<br />
specie reattive secondarie, note anche come metaboliti<br />
o derivati reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen<br />
metabolites, ROM), quali gli idroperossidi.<br />
Questi, a loro volta, <strong>in</strong> particolari condizioni, possono<br />
dare orig<strong>in</strong>e a specie chimiche particolarmente<br />
reattive quali i radicali perossile e alcossile (1).
Le specie reattive centrate sull’azoto di maggiore<br />
rilevanza biomedica comprendono varietà sia radicaliche<br />
che non radicaliche. Fra le prime sono da<br />
citare l’ossido d’azoto, impropriamente detto ossido<br />
nitrico (NO • ), e il biossido nitrico (NO 2 • ); fra le seconde,<br />
piuttosto numerose, ricordiamo, <strong>in</strong>vece,<br />
l’acido nitroso e il peross<strong>in</strong>itrito.<br />
L’ossido nitrico, un gas considerato a lungo un<br />
<strong>in</strong>qu<strong>in</strong>ante ambientale, viene prodotto, <strong>in</strong>sieme alla<br />
L-citrull<strong>in</strong>a, a partire dall’amm<strong>in</strong>oacido L-arg<strong>in</strong><strong>in</strong>a, <strong>in</strong><br />
una reazione catalizzata dall’enzima ossido nitrico<br />
s<strong>in</strong>tetasi (nitric oxide synthase, NOS) (17).<br />
Quest’ultimo possiede la s<strong>in</strong>golare proprietà di ospitare<br />
sulla stessa catena polipeptidica due dom<strong>in</strong>i ad<br />
azione catalitica, uno reduttasico ed uno ossigenasico,<br />
e richiede come cofattori NADPH e pterid<strong>in</strong>a ridotta<br />
(8). La NOS esiste <strong>in</strong> almeno 2 isoforme, una<br />
costitutiva (cellule endoteliali, piastr<strong>in</strong>e, neuroni) ed<br />
una <strong>in</strong>ducibile (cellule <strong>in</strong>fiammatorie) (figura 1. 22).<br />
H H2N 2N 2N<br />
NH<br />
NH<br />
NADPH<br />
O 2<br />
H3N + COO- H3N + COO- H3N + COO- L-arg<strong>in</strong><strong>in</strong>a<br />
H H2N 2N 2N<br />
NH<br />
N–OH<br />
H3N + COO- H3N + COO- H3N + COO- NADPH<br />
O 2<br />
H H2N 2N 2N<br />
NH<br />
Figura 1. 22 Bios<strong>in</strong>tesi del l’ossido nitrico<br />
+ NO<br />
Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un importante<br />
messaggero <strong>in</strong>tra- ed <strong>in</strong>ter-cellulare regolando<br />
molte funzioni quali la pressione arteriosa, la<br />
respirazione, la coagulazione del sangue, e alcune<br />
attività cerebrali (17). Esso, <strong>in</strong>oltre, gioca un ruolo<br />
determ<strong>in</strong>ante nella difesa dalle <strong>in</strong>fezioni batteriche e<br />
nella prevenzione dei tumori (30). Tuttavia, se generato<br />
<strong>in</strong> quantità abnormi esso è anche un potente<br />
killer cellulare.<br />
Nell’NO gli elettroni spaiati del livello energetico<br />
più esterno (c<strong>in</strong>que appartenenti all’azoto e sei<br />
all’ossigeno) generano una specie chimica non carica,<br />
dotata di proprietà paramagnetiche e, dunque,<br />
un radicale (figura 1. 23) (17).<br />
Figura 1. 23 Formula di struttura dell’ossido nitico<br />
In quanto radicale libero, l’NO reagisce rapidamente<br />
con altre specie aventi elettroni spaiati.<br />
O<br />
H3N + COO- H3N + COO- H3N + COO- N-idrossiarg<strong>in</strong><strong>in</strong>a L-citrull<strong>in</strong>a<br />
N O<br />
13<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
L’effetto f<strong>in</strong>ale può essere un’ossidazione, una<br />
riduzione oppure il legame con altre molecole, <strong>in</strong><br />
funzione del microambiente (figura 1. 24) (17).<br />
N 2 O 3<br />
RS–NO<br />
RNH–NO<br />
R-SH / R-NH 2<br />
NO -<br />
3<br />
Redox<br />
L-arg<strong>in</strong><strong>in</strong>a<br />
NOS<br />
NO -<br />
2 NO• pH
Specificamente, il peross<strong>in</strong>itrito è responsabile<br />
della nitrazione dei residui fenolici delle tiros<strong>in</strong>e, che<br />
conduce alla formazione di nitrotiros<strong>in</strong>a, un marker<br />
della tossicità tissutale dell’NO. A pH neutro, il peross<strong>in</strong>itrito,<br />
genera, a sua volta, l’acido peross<strong>in</strong>itroso<br />
(ONOOH). Quest’ultimo può attaccare diverse<br />
molecole con produzione secondaria di radicale idrossile<br />
ed altri <strong>in</strong>termedi reattivi.<br />
Tuttavia, <strong>in</strong> quanto radicale libero, l’NO può anche<br />
svolgere un’attività antiossidante, come scavenger<br />
dei radicali alcossilici e perossilici.<br />
14<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
La prevalenza dell’una o dell’altra azione dipenderà<br />
dalle concentrazioni relative delle s<strong>in</strong>gole specie<br />
reattive implicate.<br />
Per completezza, occorre aggiungere che, oltre<br />
alle specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto, assumono<br />
rilevante importanza, anche i radicali centrati<br />
sul carbonio (importanti <strong>in</strong>termedi della perossidazione<br />
lipidica) e le specie reattive del cloro (<strong>in</strong> particolare<br />
l’acido ipocloroso, responsabile della formazione<br />
delle cloroamm<strong>in</strong>e), il cui ruolo biologico è descritto<br />
nei capitoli successivi (15, 31).
1. Alberti A, Bologn<strong>in</strong>i L, Macciantelli D, Carratelli<br />
M. The radical cation of N,N-diethyl-paraphenylendiam<strong>in</strong>e:<br />
a possible <strong>in</strong>dicator of oxidative<br />
stress <strong>in</strong> biological samples. Res Chem Intermed.<br />
2000. 26 (3): 253-67.<br />
2. Badwey JA, Karnowsky ML. Active oxygen species<br />
and the function of phagocytic leukocytes.<br />
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3. Cheeseman KH, Slater TF. An <strong>in</strong>troduction to<br />
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4. Cooper KH. Antioxidant Revolution. Inksl<strong>in</strong>gers<br />
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6. Demopoulos HB. The basis of free radical pathology.<br />
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1985. Pp. 2-30.<br />
8. Förstermann U, Boissel J-P, Kle<strong>in</strong>ert H. Expressional<br />
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9. Freeman BA, Crapo JD. Biology of disease: free<br />
radicals and tissue <strong>in</strong>jury. Lab Invest. 1982.<br />
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10. Fridovich I. Superoxide radical: an endogenous<br />
toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1983.<br />
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11. Grisham MB, McCord JM. Chemistry and cytotoxycity<br />
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12. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free radicals <strong>in</strong> biology<br />
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13. Halliwell B, Gutteridge JMC. Oxygen free radicals<br />
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Biophys. 1986. 246: 501-514.<br />
Bibliografia<br />
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Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
14. Halliwell B, Gutteridge JMC. Role of free radicals<br />
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Lecture. December, 8. 1998. 178-198.<br />
18. Karlsson J. Antioxidants and exercise. Human<br />
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19. Knecht KT, DeGray lA, Mason RP. Free radical<br />
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20. Kolodziejczyk P, Reszka K, Lown IW. Enzymatic<br />
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antitumor agent mitoxantrone. Free Radical Biol<br />
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21. Lembo G. Increased basal nitric oxide release<br />
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26. Pryor WA. Oxy-radicals and related species:<br />
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27. Stadtman ER. Prote<strong>in</strong> modification <strong>in</strong> oxidative<br />
stress. In Paoletti R, Samuelsson B, Catapano<br />
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Pp. 117-134.<br />
28. Tann<strong>in</strong>i M. <strong>Radicali</strong> <strong>liberi</strong>: aspetti generali. In<br />
Bompiani GD, Galluzzo A. <strong>Radicali</strong> <strong>liberi</strong> <strong>in</strong> fisiologia<br />
e patologia. Edizioni M<strong>in</strong>erva Medica, Tor<strong>in</strong>o.<br />
1990. Pp. 3-18.<br />
29. Wetterholm A, Samuelsson B. The lipoxygenase<br />
system. In Paoletti R, Samuelsson B, Catapano<br />
AL, Poli A, R<strong>in</strong>etti M. Oxidative processes and<br />
16<br />
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali <strong>liberi</strong><br />
antioxidants. Raven Press, New York. 1994.<br />
Pp. 33-51.<br />
30. W<strong>in</strong>k DA, Hanbauer I, Krishna MC, DeGraffW,<br />
Samson J, Mitchell JB. Nitric oxide protects<br />
aga<strong>in</strong>st cellular damage and cytotoxicity from<br />
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31. W<strong>in</strong>terbourn CC. Comparative reactivities of<br />
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peroxide-chloride, and similarity<br />
of the oxidant to hypochlorite. Biochim<br />
Biophys Acta. 1985. 840: 204-210.
2. 1 Generalità e def<strong>in</strong>izioni<br />
Le specie reattive e, <strong>in</strong> particolare quelle<br />
dell’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), sono<br />
potenzialmente lesive. Per questo motivo, gli organismi<br />
viventi hanno sviluppato nel corso di millenni<br />
di evoluzione un complesso sistema di difesa, costituito<br />
dall’<strong>in</strong>sieme degli <strong>antiossidanti</strong>.<br />
Gli <strong>antiossidanti</strong> sono agenti chimicamente eterogenei<br />
(enzimi, vitam<strong>in</strong>e, sostanze similvitam<strong>in</strong>iche,<br />
oligoelementi, ecc.) <strong>in</strong> grado di prevenire<br />
o annullare l’azione, tipicamente ossidante, delle<br />
specie chimiche reattive (9, 39).<br />
Gli <strong>antiossidanti</strong> possono essere classificati secondo<br />
diversi criteri: sulla base dell’orig<strong>in</strong>e, <strong>in</strong> endogeni<br />
ed esogeni, sulla base della natura chimica,<br />
<strong>in</strong> enzimatici e non enzimatici, e sulla base della solubilità,<br />
<strong>in</strong> liposolubili e idrosolubili. Sulla base del<br />
meccanismo d’azione prevalente, <strong>in</strong>vece, considerando<br />
solo quelli fisiologici, essi possono essere dist<strong>in</strong>ti<br />
<strong>in</strong> 4 classi pr<strong>in</strong>cipali: <strong>antiossidanti</strong> preventivi,<br />
scavenger e cha<strong>in</strong> breaker, agenti di riparo e agenti<br />
di adattamento.<br />
2. 2 Gli <strong>antiossidanti</strong> preventivi<br />
2. 2. 1 Premessa<br />
Gli <strong>antiossidanti</strong> preventivi sono agenti che, attraverso<br />
vari meccanismi, quali la chelazione dei<br />
metalli di transizione, ed il “quench<strong>in</strong>g” o<br />
l’<strong>in</strong>attivazione dei perossidi prevengono la formazione<br />
di specie reattive (tabella 2. 1).<br />
Tabella 2. 1 Classificazione degli <strong>antiossidanti</strong> preventivi<br />
Classe Esempi Meccanismod’azione<br />
Sequestratori<br />
di metalli<br />
Transferr<strong>in</strong>a, lattoferr<strong>in</strong>a Sequestro di ferro<br />
Aptoglob<strong>in</strong>a Sequestro di emoglob<strong>in</strong>a<br />
Emopess<strong>in</strong>a Stabilizzazione dell’eme<br />
Ceruloplasm<strong>in</strong>a, album<strong>in</strong>a Sequestro di rame<br />
Carotenoidi Quench<strong>in</strong>g dell’ossigeno s<strong>in</strong>goletto<br />
“Quencher”<br />
di ROS Superossido dismutasi<br />
Catalasi<br />
* +<br />
2O2 + 2H → H2O2 + O2<br />
2 H2O2 → 2 H2O + O2<br />
Perossidasi<br />
H2O2 + AH2 → 2 H2O + A<br />
LOOH + AH2 → LOH + H2O + A<br />
Inttivatori o<br />
“breaker” di<br />
perossidi<br />
Glutatione perossidasi (plasmatica)<br />
Glutatione perossidasi dei<br />
perossidi fosfolipidici<br />
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG<br />
PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG<br />
PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG Glutatione perossidasi (<strong>in</strong>tracellulare)<br />
Glutatione–S–trasferasi<br />
H O + 2 GSH → 2 H O + GS–SG<br />
2 2 2<br />
LOOH+2GSH → LOH+H2O+GS–SG<br />
Scissione dei perossidi lipidici<br />
2. 2. 2 Agenti sequestranti i metalli di transizione<br />
Il ferro ed il rame rappresentano due metalli di<br />
transizione essenziali per la s<strong>in</strong>tesi e la modulazione<br />
dell’attività di numerose prote<strong>in</strong>e, specialmente<br />
quelle enzimatiche. Tuttavia, allo stato libero, essi<br />
possono agire da catalizzatori nella scissione dei perossidi<br />
(perossido di idrogeno, H 2O 2, e idroperossidi,<br />
R-OOH), che porta alla generazione di radicali <strong>liberi</strong><br />
estremamente reattivi ed istolesivi, quali l’idrossile,<br />
Capitolo 2<br />
Il sistema di difesa antiossidante<br />
17<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
l’alcossile e il perossile, secondo la reazione di Fenton<br />
(vedi capitolo precedente).<br />
Pertanto, la prima strategia di difesa antiossidante<br />
dell’organismo è affidata ad una serie di prote<strong>in</strong>e<br />
aventi la capacità più o meno specifica di<br />
complessare i metalli di transizione ed impedire a<br />
questi ultimi di esistere <strong>in</strong> forma libera e, qu<strong>in</strong>di, di<br />
esercitare la loro azione lesiva. Tali prote<strong>in</strong>e sono, a<br />
rigore, potenti <strong>antiossidanti</strong> preventivi, <strong>in</strong> quanto<br />
impediscono la generazione di radicali <strong>liberi</strong> (<strong>in</strong> questo<br />
caso generati dalla scissione metallo-catalizzata<br />
dei perossidi) (20).<br />
Fra le varie prote<strong>in</strong>e ad azione “chelante”, la<br />
ferrit<strong>in</strong>a forma un complesso con il ferro all’<strong>in</strong>terno<br />
delle cellule, mentre la transferr<strong>in</strong>a e la lattofer<strong>in</strong>a<br />
legano il ferro nei liquidi extracellulari, nel sangue<br />
circolante e nelle secrezioni, rispettivamente. Va rilevato<br />
che, <strong>in</strong> condizioni fisiologiche, la concentrazione<br />
plasmatica della transferr<strong>in</strong>a, di circa tre volte<br />
superiore a quella necessaria al normale tra<strong>sport</strong>o<br />
del ferro, assicura l'assenza di ioni ferro nel plasma.<br />
Inoltre, il ferro liberatosi da eventuali processi emolitici<br />
sotto forma di eme – e che risulta cataliticamente<br />
attivo, secondo la reazione di Fenton – viene<br />
“bloccato”, nel sangue circolante, da prote<strong>in</strong>e specifiche<br />
quali l’aptoglob<strong>in</strong>a (che veicola l’emoglob<strong>in</strong>a) e<br />
l’emopess<strong>in</strong>a (che stabilizza l’eme) (35).<br />
La ceruloplasm<strong>in</strong>a ha il compito di chelare specificamente<br />
il rame circolante. Analoga funzione<br />
viene svolta, sebbene <strong>in</strong> maniera meno specifica,<br />
dall’album<strong>in</strong>a. Purtroppo, alcune condizioni, quali<br />
l’acidosi, anche lieve, possono <strong>in</strong>durre una modifica<br />
conformazionale delle prote<strong>in</strong>e plasmatiche impegnate<br />
nel “sequestro” dei metalli di transizione,<br />
provocando il rilascio di questi ultimi <strong>in</strong> forma libera.<br />
Una volta <strong>liberi</strong>, il ferro o il rame <strong>in</strong>nescheranno la<br />
reazione di Fenton con scissione degli idroperossidi<br />
organici circolanti <strong>in</strong> radicali alcossilici e perossilici<br />
estremamente reattivi. Dall’azione di questi dipenderà<br />
<strong>in</strong> larga misura il danno dell’endotelio ed il<br />
processo di perossidazione di componenti plasmatiche<br />
chiave (es. lipoprote<strong>in</strong>e), eventi fondamentali<br />
nella patogenesi <strong>dello</strong> stress ossidativo.<br />
2. 2. 3 “Quencher” dell’ossigeno s<strong>in</strong>goletto<br />
L’ossigeno molecolare (O2), <strong>in</strong> quanto portatore<br />
di due elettroni spaiati ma con sp<strong>in</strong> paralleli negli<br />
orbitali esterni, presenta una natura diradicalica che<br />
ne limita fortemente la reattività. Tuttavia, quando<br />
questi elettroni più esterni riescono ad assorbire<br />
una sufficiente quota di energia essi possono andare<br />
<strong>in</strong>contro o ad un’<strong>in</strong>versione di sp<strong>in</strong> o ad un salto
di orbitale (transizione), generando un nuovo stato<br />
dell’ossigeno, denom<strong>in</strong>ato ossigeno s<strong>in</strong>goletto ( 1 O2).<br />
E’ stato calcolato che il 20% circa dell’ossigeno molecolare<br />
consumato nel corso del “respiratory burst”<br />
dai leucociti polimorfonucleati subisca questa conversione<br />
ad opera della mieloperossidasi (24).<br />
L’ossigeno s<strong>in</strong>goletto si comporta come un radicale<br />
libero molto reattivo, <strong>in</strong> grado di attaccare e danneggiare<br />
molecole ad alta densità elettronica, quali<br />
gli acidi grassi poli<strong>in</strong>saturi, ricchi di doppi legami,<br />
compresi quelli delle LDL (perossidazione lipidica)<br />
(59).<br />
Gli <strong>antiossidanti</strong> <strong>in</strong> grado di “smorzare” l’azione<br />
potenzialmente ossidante dell’ossigeno s<strong>in</strong>goletto<br />
sono detti “quencher” e ne costituiscono importanti<br />
esempi i caroteni e la superossidodismutasi (14).<br />
I caroteni sono lipidi poliisoprenoidi poli<strong>in</strong>saturi<br />
a lunga catena carboniosa. Fra le numerose specie<br />
chimiche diffuse <strong>in</strong> natura (almeno 600) la più studiata<br />
è il β-carotene, presente nei vegetali come<br />
pro-vitam<strong>in</strong>a A, e disponibile anche <strong>in</strong> commercio<br />
come una miscela di isomeri trans (90%) e cis<br />
(10%) (figura 2. 1) (6, 16, 19, 28, 29, 34).<br />
Figura 2. 1 Formula di struttura del β-carotene<br />
Nei vegetali, i caroteni – abbondantemente distribuiti<br />
nei cloroplasti – esercitano un’importante<br />
funzione di quench<strong>in</strong>g nei confronti dell’ossigeno<br />
s<strong>in</strong>goletto generato durante la fotos<strong>in</strong>tesi (6, 16,<br />
19, 28, 29, 34).<br />
A questo meccanismo è dovuta <strong>in</strong> larga misura<br />
anche l’azione antiossidante attribuita al β-carotene<br />
negli animali, secondo la reazione:<br />
1 O2 + caroteni → O2 + carotenoidi + Kcal<br />
E’ stato calcolato che una molecola di βcarotene<br />
è <strong>in</strong> grado di neutralizzare circa 1000 molecole<br />
di ossigeno s<strong>in</strong>goletto senza andare <strong>in</strong>contro<br />
a rottura. Inoltre, sembra che i carotenoidi plasmatici<br />
siano <strong>in</strong> grado di <strong>in</strong>attivare circa il 40% della<br />
specie reattiva dell’ossigeno <strong>in</strong> questione generata<br />
nel torrente circolatorio, contro il 20% attribuito<br />
all’α-tocoferolo (24).<br />
La superossidodismutasi (SOD), scoperta nel<br />
1968, è un enzima presente praticamente <strong>in</strong> tutte le<br />
cellule, la cui attività catalitica consiste nella dismutazione<br />
di due molecole di anione superossido <strong>in</strong><br />
18<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
una molecola di perossido d'idrogeno ed una di ossigeno,<br />
secondo la reazione:<br />
2O2 • + 2H + → H2O2 + O2<br />
Tra i prodotti della reazione, il perossido d'idrogeno<br />
è un debole ossidante ed è relativamente stabile,<br />
<strong>in</strong> particolare se confrontato con il precursore<br />
anione superossido. Questo è il motivo per cui la<br />
SOD rientra fra gli enzimi ad azione antiossidante.<br />
In realtà, come si è detto, <strong>in</strong> particolari condizioni,<br />
quali l’acidosi, <strong>in</strong> presenza di metalli di transizione<br />
allo stato libero, il perossido d’idrogeno può generare,<br />
secondo la reazione di Fenton, il radicale idrossile,<br />
il più potente radicale istolesivo. Tuttavia, <strong>in</strong><br />
condizioni fisiologiche, ciò non accade e se il perossido<br />
d’idrogeno dovesse aumentare oltre misura<br />
nella cellula, esso sarebbe def<strong>in</strong>itivamente <strong>in</strong>attivato<br />
dalla catalasi (vedi più avanti).<br />
All’<strong>in</strong>terno delle cellule sono state identificate<br />
due isoforme della SOD, la Cu-Zn-SOD e la Mn-<br />
SOD.<br />
La Cu-Zn-SOD è una prote<strong>in</strong>a dimerica, le cui<br />
due subunità, legate tra loro da un ponte disolfuro,<br />
sono costituite ciascuna da una catena polipeptidica<br />
di 151 amm<strong>in</strong>oacidi legata ad atomo di Cu ed uno di<br />
Zn (metalloprote<strong>in</strong>a). Mentre gli ioni Cu probabilmente<br />
giocano un ruolo chiave nella catalisi, consentendo<br />
all’enzima di <strong>in</strong>terconvertirsi nelle sue due<br />
forme funzionali (ossidata e ridotta), gli ioni Zn<br />
sembra abbiano il ruolo di stabilizzare l’enzima dal<br />
punto di vista conformazionale. La Cu-Zn-SOD è localizzata<br />
elettivamente all’<strong>in</strong>terno del citoplasma<br />
(37).<br />
La Mn-SOD è una metalloprote<strong>in</strong>a il cui esatto<br />
meccanismo d’azione, non ancora ben chiarito, si<br />
basa su modifiche redox del manganese. Può trovarsi<br />
sia nel citoplasma che nei mitocondri.<br />
Accanto a queste due forme, <strong>in</strong>tracellulari, di<br />
SOD ne esisterebbe una terza, a localizzazione extracellulare<br />
(EC-SOD).<br />
2. 2. 4 Agenti <strong>in</strong>attivanti i perossidi<br />
Una classe importante di sostanze derivate<br />
dall’attacco dei ROS su substrati organici, quali lipidi,<br />
amm<strong>in</strong>oacidi, e nucleotidi, sono gli idroperossidi<br />
(R-OOH) che, <strong>in</strong>sieme al perossido di idrogeno<br />
(H2O2), costituiscono i perossidi.<br />
Questi ultimi, pur dotati di una certa capacità<br />
ossidante, sono relativamente stabili. Tuttavia, <strong>in</strong><br />
presenza di un metallo di transizione e <strong>in</strong> ambiente<br />
acido, possono essere decomposti liberando radicali<br />
altamente reattivi, quali l’alcossile, il perossile e<br />
l’idrossile.<br />
Pertanto, fra i sistemi <strong>antiossidanti</strong> endogeni esiste<br />
una classe di enzimi il cui f<strong>in</strong>e è quello di <strong>in</strong>attivare<br />
i perossidi, sì da prevenire il danno che potrebbe<br />
derivare dalla loro scissione metallocatalizzata.
Tali agenti vengono genericamente def<strong>in</strong>iti perossidasi<br />
e mostrano un comune meccanismo<br />
d’azione, che prevede la demolizione del perossido<br />
con liberazione di una molecola di ossigeno molecolare<br />
e una di alcool (se il substrato è un idroperossido)<br />
oppure di acqua (se il substrato è il perossido<br />
di idrogeno), secondo la reazione generale:<br />
2 X-O-O-H → 2 X-OH + O 2<br />
(X=H, perossido di idrogeno; X=R, idroperossido)<br />
La perossidasi che ha come substrato il perossido<br />
di idrogeno viene chiamata catalasi (CAT) e rende<br />
possibile la seguente reazione:<br />
2 H2O2 → 2 H2O + O2<br />
Si tratta di un enzima formato da 4 subunità,<br />
ciascuna delle quali contiene un gruppo eme con un<br />
sito attivo, stabilizzato da una molecola di NADPH.<br />
La CAT si trova nella maggioranza delle cellule animali<br />
e vegetali <strong>in</strong> organuli denom<strong>in</strong>ati perossisomi<br />
ove la sua funzione è quella di <strong>in</strong>attivare il perossido<br />
di idrogeno. Essa è stata ritrovata anche nel citosol<br />
ma il suo ruolo <strong>in</strong> questo compartimento <strong>in</strong>tracellulare<br />
non è completamente noto. In generale, comunque,<br />
la CAT viene attivata da elevate concentrazione<br />
di perossido di idrogeno e, <strong>in</strong> qualche modo,<br />
lavora <strong>in</strong> maniera sequenziale rispetto alla SOD,<br />
svolgendo un’importantissima funzione antiossidante.<br />
Nell’uomo l’enzima è espresso ad elevati livelli<br />
nel fegato e negli eritrociti (37).<br />
Le perossidasi <strong>in</strong> grado di agire non solo sul perossido<br />
di idrogeno ma anche su altri perossidi organici<br />
e che presentano come cofattore il glutatione<br />
sono chiamate anche glutatione-perossidasi (GSHPx<br />
o GPx) (53).<br />
Il glutatione è un tripeptide – costituito da acido<br />
γ-glutammico, ciste<strong>in</strong>a e glic<strong>in</strong>a – che può esistere<br />
<strong>in</strong> una forma ridotta (GSH) oppure <strong>in</strong> una forma dimerica,<br />
ossidata (GS–SG). L’<strong>in</strong>terconversione<br />
dall’una all’altra forma, resa possibile grazie al<br />
gruppo tiolico della ciste<strong>in</strong>a, è sfruttata dalle GPx<br />
per catalizzare reazioni di ossido-riduzione f<strong>in</strong>alizzate<br />
all’<strong>in</strong>attivazione del perossido di idrogeno o di altri<br />
perossidi, secondo lo schema generale delle perossidasi<br />
sopra riportato (17).<br />
Il glutatione ha una diffusione ubiquitaria nei<br />
mammiferi nei cui tessuti agisce non solo come riducente<br />
dei perossidi (antiossidante preventivo) ma<br />
anche come nucleofilo nei confronti di specie elettrofile<br />
radicaliche, come quelle generate dal metabolismo<br />
di xenobiotici (scavenger) (45, 60).<br />
La concentrazione <strong>in</strong>tracellulare di glutatione<br />
aumenta fortemente <strong>in</strong> presenza di elevati livelli di<br />
19<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
perossidi. In queste condizioni, per evitare reazioni<br />
collaterali fra i gruppi tiolici delle prote<strong>in</strong>e ed il GS–<br />
SG, quest’ultimo viene escreto grazie all’attivazione<br />
di una specifica traslocasi di membrana ATPdipendente<br />
(5).<br />
La classica GPx catalizza la riduzione del perossido<br />
d’idrogeno ad acqua ed ossigeno molecolare<br />
attraverso la conversione (ossidazione) del GSH a<br />
GS–SG:<br />
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG<br />
La GPX è formata da 4 subunità apparentemente<br />
uguali e contiene selenio sotto forma di selenociste<strong>in</strong>a<br />
nelle varie subunità. Pertanto, la carenza di<br />
selenio provoca una marcata riduzione dell’attività<br />
dell’enzima. Presente nel citosol e nei mitocondri, la<br />
GPx agisce attraverso un meccanismo piuttosto<br />
complesso che prevede un ciclo di reazioni nel quale<br />
sono co<strong>in</strong>volti anche la glutatione transidrogenasi<br />
e la glutatione reduttasi. Sembra, comunque, che la<br />
GPx agisca quando i bassi livelli di perossido<br />
d’idrogeno non sono sufficienti ad attivare la catalasi.<br />
La GPx può anche rimuovere molecole di idroperossidi<br />
lipidici derivati dai processi di lipoperossidazione.<br />
A questo proposito, giova sottol<strong>in</strong>eare che, oltre<br />
alla GPx “classica appena” descritta, esiste anche<br />
una GPx, selenio-dipendente, <strong>in</strong>dicata con la sigla<br />
SeI-GP che non metabolizza il perossido di idrogeno<br />
ma solo i perossidi organici, con un ruolo, qu<strong>in</strong>di,<br />
preferenziale, di protezione specifica nei confronti<br />
della lipoperossidazione (15).<br />
In condizioni ideali, la SOD, la CAT e la GPx agiscono<br />
<strong>in</strong> maniera ord<strong>in</strong>ata e sequenziale potenziandosi<br />
nel loro importante ruolo di <strong>antiossidanti</strong> (figura<br />
2. 2).<br />
Figura 2. 2 Ciclo del glutatione e <strong>in</strong>terazioni fra<br />
enzimi <strong>antiossidanti</strong><br />
2. 3 Gli scavenger di radicali <strong>liberi</strong><br />
ed i cha<strong>in</strong> breaker<br />
2. 3. 1 Premessa<br />
I sistemi di difesa antiossidante, oltre alla “prima<br />
l<strong>in</strong>ea”, estremamente specifica, costituita dagli
enzimi (SOD, CAT, GPx), formano anche una seconda<br />
barriera difensiva, aspecifica, alla cui composizione<br />
concorrono gli scavenger e i cha<strong>in</strong> breaker,<br />
sostanze generalmente a basso peso molecolare,<br />
chimicamente eterogenee, alcune idrosolubili, altre<br />
liposolubili (12).<br />
Gli scavenger (lett. “spazz<strong>in</strong>i”) sono agenti che<br />
riducono la concentrazione di radicali <strong>liberi</strong> rimuovendoli<br />
dal mezzo <strong>in</strong> cui si trovano, grazie alla loro<br />
capacità di <strong>in</strong>teragire direttamente con essi, e,<br />
qu<strong>in</strong>di, di <strong>in</strong>attivarli. Essi comprendono l’ubich<strong>in</strong>one,<br />
i composti tiolici e l’acido urico (5).<br />
I cha<strong>in</strong> breaker (lett. “che spezzano la catena”),<br />
<strong>in</strong>vece, sono agenti <strong>in</strong> grado di bloccare la propagazione<br />
delle reazioni radicaliche a catena. Tra questi<br />
sono da citare carotenoidi, tocoferoli ed ascorbato.<br />
Secondo alcuni ricercatori, gli scavenger dovrebbero<br />
essere dist<strong>in</strong>ti dagli <strong>antiossidanti</strong> propriamente<br />
detti. Infatti, mentre gli scavenger sono agenti<br />
che riducono la concentrazione di radicali <strong>liberi</strong><br />
rimuovendoli dal mezzo <strong>in</strong> cui si trovano, gli <strong>antiossidanti</strong><br />
(es. difenilamm<strong>in</strong>a), <strong>in</strong>vece, sono agenti<br />
che <strong>in</strong>ibiscono il processo dell’autoossidazione, di<br />
cui costituisce un importante esempio l’irrancidimento<br />
dei grassi. Questo fenomeno, ben noto <strong>in</strong><br />
scienza dell’alimentazione, viene def<strong>in</strong>ito autoossidazione<br />
perché avviene attraverso una sequenza<br />
autocatalitica di reazioni radicaliche <strong>in</strong> presenza di<br />
ossigeno. Alternativamente si può usare il term<strong>in</strong>e<br />
di perossidazione, <strong>in</strong> quanto lo stesso processo genera<br />
<strong>in</strong>termedi con caratteristiche di perossidi<br />
(R–O–OR) (figura 2. 3).<br />
ROOH<br />
RH<br />
R*<br />
RO*<br />
ROH<br />
*OH<br />
RH<br />
H H2O 2O 2O 2O<br />
R*<br />
ROO * ROO * ROO * ROO *<br />
ROOR<br />
RO*<br />
RH H H2O 2O 2O 2O<br />
O 2<br />
ROO*<br />
Figura 2. 3 Ciclo di reazioni della perossidazione<br />
In ogni caso, la l<strong>in</strong>ea di difesa costituita da scavenger<br />
e cha<strong>in</strong> breaker è <strong>in</strong> grado di bloccare l’<strong>in</strong>izio<br />
o impedire la propagazione delle reazioni radicaliche<br />
a catena.<br />
2. 3. 2 Scavenger<br />
Gli scavenger comprendono un agente liposolubile,<br />
l’ubich<strong>in</strong>one, ed una serie di agenti idrosolubili,<br />
quali i composti tiolici e l’acido urico.<br />
L’ubich<strong>in</strong>one è una sostanza liposolubile il cui<br />
nome gli deriva dal fatto di essere presente <strong>in</strong> tutti i<br />
sistemi di accoppiamento di energia legati alle<br />
membrane. Alternativamente, esso viene chiamato<br />
anche coenzima Q. Dal punto di vista chimico è un<br />
derivato isoprenoide costituito da un anello ch<strong>in</strong>oni-<br />
O 2<br />
R*<br />
RH: molecola organica<br />
ROOH: idroperossido<br />
ROO*: radicale idroperossilico<br />
RO*: radicale alcossilico<br />
20<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
co e da una catena laterale di lunghezza variabile,<br />
<strong>in</strong> funzione delle numero delle unità ripetitive di isoprene.<br />
Uno dei più noti derivati dell’ubich<strong>in</strong>one è<br />
il coenzima Q10, detto così perché possiede, appunto,<br />
una catena laterale di 10 unità isopreniche (figura<br />
2. 4).<br />
Figura 2. 4 Formula di struttura del coenzima Q10<br />
Il coenzima Q viene s<strong>in</strong>tetizzato a livello cellulare<br />
lungo la via del mevalonato (la stessa del colesterolo)<br />
che ha <strong>in</strong>izio nel reticolo endoplasmatico.<br />
Da qui esso viene traslocato nel Golgi e qu<strong>in</strong>di nelle<br />
varie sedi cellulari, quali la plasmamembrana e la<br />
membrana dei mitocondri. Una piccola quota è rilevabile<br />
anche nel sangue.<br />
Oltre ad essere uno dei pr<strong>in</strong>cipali tra<strong>sport</strong>atori<br />
di elettroni, il coenzima Q rientra <strong>in</strong> un complesso<br />
sistema di ossido-riduzioni a livello mitocondriale<br />
(2).<br />
In realtà, l’ubich<strong>in</strong>one può comportarsi sia da<br />
scavenger, <strong>in</strong>teragendo <strong>in</strong>teramente con specie radicaliche,<br />
sia da generatore di specie reattive, attraverso<br />
il fenomeno dell’autoossidazione:<br />
CoQ + O2 • ⇔ CoQ • + O2<br />
L’equilibrio di questa reazione dipende dalle<br />
condizioni chimiche del microambiente. Infatti, <strong>in</strong><br />
ambiente aprotico l’equilibrio è spostato verso destra<br />
(funzione antiossidante) mentre <strong>in</strong> un ambiente<br />
idrofilico esso è spostato verso s<strong>in</strong>istra (funzione<br />
pro-ossidante) (5).<br />
Pertanto, la zona centrale del bilayer fosfolipidico<br />
delle membrane biologiche costituisce un ambiente<br />
ottimale per l’attività antiossidante<br />
dell’ubich<strong>in</strong>one nei confronti della lipoperossidazione.<br />
Tale attività è esercitata pr<strong>in</strong>cipalmente dalla<br />
forma ridotta del coenzima, detta anche ubich<strong>in</strong>olo<br />
(QH2). Il relativo meccanismo, tuttavia, resta da<br />
chiarire, anche se sono state avanzate due suggestive<br />
ipotesi. Secondo la prima, l’ubich<strong>in</strong>one agirebbe<br />
da cha<strong>in</strong> breaker donando idrogeno per ridurre il<br />
radicale perossilico o alcossilico:<br />
CoQH + ROO • → CoQ • + ROOH
Secondo l’altra ipotesi, <strong>in</strong>vece, l’ubich<strong>in</strong>olo reagirebbe<br />
con la vitam<strong>in</strong>a E ossidata (radicale fenossilico)<br />
consentendone il recupero attraverso una serie<br />
di reazioni cicliche (figura 2. 5).<br />
Figura 2. 5 Possibili <strong>in</strong>terazioni fra ubich<strong>in</strong>one,<br />
tocoferolo ed ascorbato<br />
Pertanto, l’ubich<strong>in</strong>one possiede effetti protettivi<br />
nei confronti del danno ossidativo verso i lipidi, le<br />
prote<strong>in</strong>e e il DNA. Nel caso dei lipidi, esso agisce<br />
come preventivo nei confronti sia dell’<strong>in</strong>izio che della<br />
propagazione, mentre la vitam<strong>in</strong>a E <strong>in</strong>terviene<br />
come cha<strong>in</strong> breaker <strong>in</strong>ibendo specificamente la propagazione,<br />
ma non la reazione di <strong>in</strong>izio (13, 44).<br />
Tra gli scavenger idrosolubili, i tioli rappresentano<br />
una componente qualitativamente significativa<br />
della barriera antiossidante sia <strong>in</strong>tracellulare (GSH)<br />
che plasmatica. In particolare, i gruppi sulfidrilici<br />
(SH) delle molecole dei componenti plasmatici<br />
(quali, ad esempio, le prote<strong>in</strong>e, P-SH) sono <strong>in</strong><br />
grado di opporsi alla fase di propagazione dei processi<br />
radicalici grazie alla loro capacità di <strong>in</strong>attivare i<br />
radicali alcossilici (RO • ), secondo la reazione:<br />
2 P-SH + 2 RO • 2 PS • + 2 ROH P-S-S-P + 2 ROH<br />
I tioli, <strong>in</strong>oltre, sono anche <strong>in</strong> grado di neutralizzare<br />
l’azione istolesiva del radicale idrossilico (HO • ),<br />
secondo la reazione:<br />
2 P-SH + 2 HO • 2 PS • + 2 H 2O P-S-S-P + 2 H 2O<br />
Considerando questi eventi dal punto di vista<br />
stechiometrico, una coppia di gruppi tiolici può ridurre<br />
una coppia di radicali alcossilici (RO • ) o idrossilici<br />
(HO • ), cedendo ad essa due elettroni (sotto<br />
forma di due atomi di idrogeno).<br />
In questo modo ambedue i tipi di radicali vengono<br />
<strong>in</strong>attivati: i radicali alcossilici sono rilasciati<br />
come molecole di alcool mentre i radicali idrossilici<br />
diventano <strong>in</strong>nocue molecole d’acqua. I gruppi tiolici<br />
ormai ossidati, <strong>in</strong>vece, reagiscono tra loro, generando<br />
ponti disolfuro.<br />
L’acido urico viene prodotto <strong>in</strong> seguito o<br />
all’ossidazione dell’ipoxant<strong>in</strong>a e della xant<strong>in</strong>a, ad<br />
opera della xant<strong>in</strong>a ossidasi (nel corso del catabolismo<br />
pur<strong>in</strong>ico), oppure all’azione catalitica di alcuni<br />
enzimi deidrogenanti (figura 2. 6).<br />
21<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
Figura 2. 6 Formula di struttura dell’acido urico<br />
L’acido urico è una sostanza idrosolubile, a basso<br />
peso molecolare, che si accumula nei liquidi corporei<br />
a concentrazione di 0.25-0.44 mM; a pH fisiologico<br />
esso è presente completamente <strong>in</strong> forma ionizzata<br />
(urato), carica negativamente; come prodotto<br />
del catabolismo pur<strong>in</strong>ico esso viene elim<strong>in</strong>ato attraverso<br />
le ur<strong>in</strong>e (18, 52).<br />
Si è visto che l’urato un potente antiossidante<br />
ad azione scavenger nei confronti del radicale idrossile,<br />
dell’acido ipocloroso, dell’ossigeno s<strong>in</strong>goletto e<br />
dell’ozono. Inoltre, esso è <strong>in</strong> grado di chelare ioni di<br />
metalli di transizione (quali ferro e rame) prevenendo<br />
non solo la generazione di ROS, ma anche<br />
l’ossidazione ferro-dipendente dell’ascorbato e la<br />
stessa lipoperossidazione (10, 21, 40).<br />
2. 3. 3 Cha<strong>in</strong> breaker<br />
I cha<strong>in</strong> breaker comprendono sostanze liposolubili,<br />
quali carotenoidi e tocoferoli, ed agenti idrosolubili,<br />
quali la vitam<strong>in</strong>a C o ascorbato.<br />
Nell’ambito dei carotenoidi bisogna dist<strong>in</strong>guere<br />
la vitam<strong>in</strong>a A dai caroteni propriamente detti.<br />
La vitam<strong>in</strong>a A comprende un’<strong>in</strong>tera classe di sostanze<br />
poliisoprenoidi poli<strong>in</strong>sature dotate di attività<br />
ret<strong>in</strong>olo-simile.<br />
Nell’uomo la vitam<strong>in</strong>a A viene per lo più generata<br />
dalla scissione ossidativa dei carotenoidi vegetali<br />
per azione di enzimi <strong>in</strong>test<strong>in</strong>ali, quali la carotene<br />
diossigenasi. Essendo fortemente <strong>in</strong>satura, essa risulta<br />
molto reattiva nei confronti dei radicali perossilici,<br />
che vengono <strong>in</strong>trappolati nella sua molecola,<br />
la quale funziona prevalentemente da “cha<strong>in</strong> breaker”<br />
piuttosto che da donatrice di equivalenti riducenti.<br />
In questo modo la vitam<strong>in</strong>a A risulta particolarmente<br />
efficace nel ridurre l’entità della perossidazione<br />
lipidica (figura 2. 7) (5, 25, 31, 57).<br />
Figura 2. 7 Formula di struttura della vitam<strong>in</strong>a A
I caroteni, dei quali si è già parlato come agenti<br />
“quencher”, possono agire anche da cha<strong>in</strong> breaker.<br />
Infatti, si ritiene che il β-carotene sia <strong>in</strong> grado di <strong>in</strong>terrompere<br />
la lipoperossidazione formando un complesso<br />
proprio con il radicale idroperossilico, bloccandone<br />
l’azione spiccatamente elettrofila (49).<br />
I tocoferoli, riuniti <strong>in</strong> 8 pr<strong>in</strong>cipali isomeri sotto la<br />
denom<strong>in</strong>azione di vitam<strong>in</strong>a E, sono ampiamente distribuiti<br />
<strong>in</strong> natura e, <strong>in</strong> particolare, negli oli vegetali.<br />
Tra essi, la forma α, cioè l’α-tocoferolo è risultata<br />
essere la più importante per l’attività antiossidante<br />
della vitam<strong>in</strong>a E (figura 2. 8) (1, 41, 42).<br />
Figura 2. 8 Formula di struttura della vitam<strong>in</strong>a E<br />
L’α-tocoferolo, s<strong>in</strong>golarmente, agisce come un<br />
antiossidante neutralizzando i radicali lipoperossilici<br />
prima che <strong>in</strong>teragiscano con il substrato, prevenendo,<br />
<strong>in</strong> questo modo, il danno a carico di strutture<br />
lipidiche complesse e delicate quali le membrane<br />
biologiche e le lipoprote<strong>in</strong>e plasmatiche (32, 46).<br />
Esso può agire anche <strong>in</strong>s<strong>in</strong>ergia con altri <strong>antiossidanti</strong>,<br />
quali carotenoidi, ubich<strong>in</strong>one, ascorbato, ecc.<br />
In tale contesto, un’importante <strong>in</strong>terazione è<br />
quella con la vitam<strong>in</strong>a C sulla superficie della plasmamembrana,<br />
<strong>in</strong> quanto il tocoferolo è lipofilo<br />
mentre l’ascorbato è idrofilo. L’ascorbato – come i<br />
tioli, l’ubich<strong>in</strong>one, il glutatione e la ciste<strong>in</strong>a – svolge<br />
l’importante ruolo di ridurre il radicale tocoferilico,<br />
rigenerando, così, il tocoferolo (30, 43).<br />
La vitam<strong>in</strong>a E, oltre all’attività antiossidante,<br />
esercita un gran numero di altre funzioni. Infatti,<br />
essa stabilizza le membrane biologiche regolandone<br />
la fluidità, <strong>in</strong>ibisce la lipoossigenasi e modula<br />
l’attività della prote<strong>in</strong> ch<strong>in</strong>asi C (4, 58).<br />
Inf<strong>in</strong>e, la vitam<strong>in</strong>a C è una vitam<strong>in</strong>a idrosolubile<br />
la cui attività antiossidante, <strong>in</strong> vivo, è legata alla capacità<br />
di esistere <strong>in</strong> una forma ridotta ed una ossidata<br />
tra loro <strong>in</strong>terconvertibili (figura 2. 9).<br />
Figura 2. 9 Formula di struttura dell’acido ascorbico<br />
22<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
Essa è <strong>in</strong> grado di agire come scavenger nei<br />
confronti dei radicali superossido ed idrossilico e di<br />
<strong>in</strong>trappolare i radicali idroperossilici nella fase acquosa<br />
prima che diffondano nei lipidi della plasmamembrana,<br />
prevenendo così la lipoperossidazione.<br />
Inoltre, la vitam<strong>in</strong>a C è anche <strong>in</strong> grado di rigenerare<br />
la forma non radicalica della vitam<strong>in</strong>a E dopo che<br />
questa ha agito con un radicale libero (23, 60).<br />
Come l’ubich<strong>in</strong>one, comunque, la vitam<strong>in</strong>a C<br />
può anche agire, <strong>in</strong> determ<strong>in</strong>ate circostanze, da agente<br />
pro-ossidante: per esempio, <strong>in</strong> presenza di<br />
metalli di transizione come il Fe 3+ ed il Cu 2+ può <strong>in</strong>nescare<br />
la perossidazione lipidica. Tuttavia, l’azione<br />
antiossidante della vitam<strong>in</strong>a, <strong>in</strong> vivo, risulterebbe<br />
globalmente superiore a quella pro-ossidante (48).<br />
2. 4 Gli agenti di riparo<br />
Gli agenti di riparo comprendono esclusivamente<br />
enzimi che <strong>in</strong>tervengono dopo che il danno da<br />
specie reattive si è <strong>in</strong>staurato. La loro azione –<br />
spesso sequenziale – prevede dapprima<br />
l’identificazione del segmento molecolare ossidato,<br />
poi la separazione del frammento ormai <strong>in</strong>utilizzabile<br />
e, <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e, la s<strong>in</strong>tesi e l’<strong>in</strong>serimento di un nuovo<br />
segmento <strong>in</strong> sostituzione di quello danneggiato.<br />
Appartengono agli agenti di riparo le idrolasi<br />
(glicosidasi, lipasi, proteasi), le trasferasi e le polimerasi,<br />
tutte <strong>in</strong>dispensabili per la riparazione del<br />
danno da radicali <strong>liberi</strong> di importanti molecole o<br />
strutture cellulari (es. DNA, membrane, ecc).<br />
Ovviamente, quando queste attività idrolitiche<br />
superano le capacità di riparazione, esse si traducono<br />
<strong>in</strong> un ulteriore danno tissutale.<br />
2. 5 Gli agenti di adattamento<br />
Gli agenti di adattamento comprendono tutte<br />
quelle sostanze o tecniche o procedure attraverso<br />
le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante<br />
fisiologico di un organismo.<br />
Per esempio, un corretto esercizio fisico o<br />
l’adozione di un regime alimentare corretto ed equilibrato<br />
sono misure di per sé <strong>in</strong> grado di controllare<br />
il metabolismo ossidativo attraverso la riduzione<br />
della produzione di specie reattive e l’<strong>in</strong>duzione di<br />
enzimi ad attività antiossidante.<br />
2. 6 Altri agenti <strong>antiossidanti</strong><br />
Oltre agli agenti f<strong>in</strong> qui descritti esistono altre<br />
sostanze ad attività antiossidante, quali la bilirub<strong>in</strong>a,<br />
i g<strong>in</strong>kolidi e, <strong>in</strong> particolare l’acido lipoico ed i flavonoidi<br />
(33, 36, 54).<br />
L'acido α-lipoico o acido 6,8-ditioctico, è uno<br />
dei c<strong>in</strong>que cofattori del complesso sistema enzimatico<br />
che catalizza la decarbossilazione ossidativa<br />
degli α-chetoacidi (piruvato, α-chetoglutarato,<br />
ecc.).
Questa sostanza viene s<strong>in</strong>tetizzata dagli animali<br />
e dall'uomo ma viene anche prontamente assorbita<br />
dagli alimenti (figura 2. 10) (7, 55, 56).<br />
Figura 2. 10 Formule di struttura dell’acido lipoico<br />
Come la vitam<strong>in</strong>a C ed il glutatione, anche<br />
l’acido α-lipoico deve la sua attività antiossidante<br />
alla sua capacità di esistere <strong>in</strong> una forma ridotta,<br />
l'acido diidrolipoico (DHLA), ed una forma ossidata,<br />
l’acido α-lipoico propriamente detto. Tale azione si<br />
esplicherebbe contro un gran numero di ossidanti,<br />
quali radicale idrossilico, l'acido ipocloroso e l' ossigeno<br />
s<strong>in</strong>goletto. Inoltre, l’acido α-lipoico è <strong>in</strong> grado<br />
di chelare gli ioni metallici, mentre non risulta attivo<br />
verso il radicale superossido ed il perossido d'idrogeno.<br />
Inf<strong>in</strong>e, il DHLA appare <strong>in</strong>oltre <strong>in</strong> grado di rigenerare<br />
altri <strong>antiossidanti</strong> dalla loro forma radicalica<br />
direttamente (es. ascorbato) o <strong>in</strong>direttamente<br />
(es. vitam<strong>in</strong>a E) (3, 11, 26, 27, 50).<br />
I flavonoidi sono dei polifenoli, ampiamente<br />
presenti nei vegetali, che hanno dimostrato<br />
di possedere una ben documentata attività antiossidante<br />
e di chelazione dei metalli così d poter ricoprire<br />
un ruolo importante nel controllo <strong>dello</strong> stress ossidativo<br />
(figura 2. 11) (8, 22, 38, 47, 51).<br />
Figura 2. 11 Formula di struttura del diidroflavonolo<br />
23<br />
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante<br />
2. 7 Distribuzione del sistema di difesa<br />
antiossidante negli organismi viventi<br />
Il sistema di difesa antiossidante è regolarmente<br />
distribuito nell’organismo, sia a livello extracellulare<br />
che a livello <strong>in</strong>tracellulare.<br />
A livello dei liquidi extracellulari e, <strong>in</strong> particolare,<br />
nel plasma, l’<strong>in</strong>sieme delle sostanze potenzialmente<br />
<strong>in</strong> grado di cedere equivalenti riducenti (atomi<br />
di idrogeno o s<strong>in</strong>goli elettroni) sì da soddisfare<br />
“l’avidità di elettroni” che rende i radicali <strong>liberi</strong> <strong>in</strong>stabili<br />
costituisce la cosiddetta barriera antiossidante.<br />
Ne fanno parte, nel plasma, tutte le prote<strong>in</strong>e e,<br />
<strong>in</strong> particolar modo, l’album<strong>in</strong>a, la bilirub<strong>in</strong>a, l’acido<br />
urico, il colesterolo, e i vari <strong>antiossidanti</strong> esogeni<br />
<strong>in</strong>trodotti con l’alimentazione o sotto forma di <strong>in</strong>tegratori<br />
dietetici (ascorbato, tocoferolo, polifenoli<br />
ecc.). Un ruolo di particolare importanza è svolto,<br />
nel contesto di questa barriera, dai gruppi tiolici (-<br />
SH).<br />
All’<strong>in</strong>terno delle cellule il sistema di difesa antiossidante<br />
ha una sua ben precisa compartimentalizzazione<br />
(figura 2. 12).<br />
Vitam<strong>in</strong>a E, PUFA,<br />
β−carotene<br />
Glutatione, GPx, SOD,<br />
selenio, ascorbato,<br />
Catalasi<br />
Ubich<strong>in</strong>olo, selenio,<br />
vitam<strong>in</strong>a E, SOD, GPx<br />
Vitam<strong>in</strong>a E,<br />
β−carotene<br />
Figura 2. 12 Compartimentalizzazione dei sistemi <strong>antiossidanti</strong><br />
E’ importante sottol<strong>in</strong>eare che gli <strong>antiossidanti</strong><br />
di tipo enzimatico sono presenti prevalentemente a<br />
livello <strong>in</strong>tracellulare mentre gli altri prevalgono a livello<br />
extracellulare. Qui, gli agenti liposolubili (es.<br />
tocoferoli), entrando nella compag<strong>in</strong>e delle biomembrane,<br />
costituiscono la prima l<strong>in</strong>ea di difesa<br />
contro l’attacco dei radicali <strong>liberi</strong>, mentre quelli idrosolubili<br />
(es. ascorbato), <strong>in</strong>vece, <strong>in</strong>tervengono soprattutto<br />
nel contesto della matrice solubile del citoplasma<br />
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Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
Capitolo 3<br />
Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici<br />
3. 1 Generalità e def<strong>in</strong>izioni<br />
Lo stress ossidativo è una particolare condizione<br />
<strong>in</strong>dotta da un’accentuazione <strong>in</strong> senso proossidante<br />
dell’equilibrio d<strong>in</strong>amico fra processi ossidativi<br />
e riduttivi che hanno luogo cont<strong>in</strong>uamente <strong>in</strong><br />
ogni cellula, quale espressione fisiologica delle<br />
complesse trasformazioni biochimiche del metabolismo<br />
term<strong>in</strong>ale.<br />
Sulla base di questo tentativo di <strong>in</strong>quadrare un<br />
aspetto della biochimica d<strong>in</strong>amica che è tuttora oggetto<br />
di ampio dibattito fra i ricercatori, lo stress ossidativo<br />
si configura come un fenomeno che riguarda,<br />
almeno <strong>in</strong> prima battuta, la s<strong>in</strong>gola cellula che,<br />
per effetto della propria attività metabolica, non di<br />
rado sotto lo stimolo di agenti ad essa esterni, è costretta<br />
a subire gli effetti potenzialmente lesivi di<br />
una serie di reazioni <strong>in</strong>desiderate che accompagnano<br />
quei processi ossidativi da cui dipende la sua<br />
stessa esistenza.<br />
3. 2 Basi biochimiche<br />
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) rappresentano<br />
una m<strong>in</strong>accia mortale per la vita della cellula<br />
che ne tiene sotto controllo la produzione grazie<br />
ad un efficiente sistema di difesa (6, 22, 34).<br />
Tuttavia, <strong>in</strong> particolari condizioni, quando la<br />
produzione di ROS è eccessiva e/o la capacità di<br />
smaltire questi ultimi si riduce, la cellula è costretta<br />
a subire il danno da radicali <strong>liberi</strong> (5, 27).<br />
Trasferendo il discorso all’<strong>in</strong>tero organismo,<br />
possiamo def<strong>in</strong>ire lo stress ossidativo come una<br />
particolare forma di stress chimico <strong>in</strong>dotto dalla<br />
presenza di una quantità eccessiva di specie reattive<br />
per un’aumentata produzione delle stesse e/o<br />
per una ridotta capacità di smaltirne le quantità<br />
comunque prodotte (11).<br />
E’ ovvio che il discorso è ben più complesso, ma<br />
il concetto appena esposto è sufficiente per comprendere<br />
i pr<strong>in</strong>cipali aspetti fisiopatologici <strong>dello</strong><br />
stress ossidativo e le relative implicazioni sul piano<br />
diagnostico e terapeutico (figura 3. 1) (16).<br />
Radiazioni,farmaci, metalli pesanti<br />
Fumo di sigaretta, alcool, <strong>in</strong>qu<strong>in</strong>amento<br />
Esercizio fisico <strong>in</strong>adeguato, sedentarietà<br />
Infezioni ed altre malattie<br />
Ridotta assunzione<br />
e/o dim<strong>in</strong>uita s<strong>in</strong>tesi<br />
e/o ridotta capacità di utilizzazione<br />
e/o aumentato consumo di <strong>antiossidanti</strong><br />
Specie reattive ↑ Difese <strong>antiossidanti</strong> ↓<br />
Malattie<br />
cardiovascolari<br />
Demenza,<br />
M. di Park<strong>in</strong>son<br />
Danno cellulare<br />
Invecchiamento<br />
precoce<br />
Infiammazioni,<br />
tumori<br />
Figura 3. 1 Eziopatogenesi <strong>dello</strong> stress ossidativo<br />
Altre<br />
malattie<br />
27<br />
Comunque determ<strong>in</strong>atasi, <strong>in</strong>fatti, l’eccessiva<br />
produzione di specie reattive, non più adeguatamente<br />
controllata dai sistemi di difesa <strong>antiossidanti</strong>,<br />
provoca una serie di alterazioni funzionali e strutturali<br />
della cellula, che possono condurre all’apoptosi<br />
o addirittura alla necrosi (tabella 3. 1) (8, 9, 19).<br />
Tabella 3. 1 Alterazioni biochimiche cellulari nello s. ossidativo<br />
• Perossidazione biomolecole (lipidi, amm<strong>in</strong>oacidi, nucleotidi…)<br />
• Ossidazione e deplezione di GSH<br />
• Ossidazione dei tioli proteici<br />
• Ossidazione dei nucleotidi pirid<strong>in</strong>ici<br />
• Lesioni del DNA ed attivaz. poli(ADP-ribosio)polimerasi<br />
• Alterazioni dei meccanismi di trasduzione del segnale<br />
• Alterazioni dell’omeostasi ionica<br />
• Alterazioni del citoscheletro<br />
• Inibizione della glicolisi<br />
• Deplezione di NAD+<br />
• Caduta del potenziale di membrana mitocondriale<br />
• Deplezione di ATP<br />
• Aumento della permeabilità della membrana plasmatica<br />
Sul piano generale, queste lesioni – dapprima<br />
cellulari e poi tissutali – saranno responsabili, <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e,<br />
di patologie d’organo, quali ad esempio il morbo di<br />
Crohn o la pancreatite, oppure di condizioni sistemiche,<br />
quali l’<strong>in</strong>vecchiamento precoce, l’aterosclerosi e<br />
così via (7, 10, 30, 35).<br />
Comunque, va ancora una volta precisato che<br />
non sempre è possibile stabilire se i radicali <strong>liberi</strong><br />
sono la causa oppure l’effetto delle lesioni osservate<br />
(12).<br />
Le pr<strong>in</strong>cipali cause di aumentata produzione di<br />
ROS sono da <strong>in</strong>dividuarsi <strong>in</strong> fattori ambientali, situazioni<br />
fisiologiche, stile di vita, fattori psicologici, malattie<br />
e fattori iatrogeni (tabella 3. 2).<br />
Tabella 3. 2 Cause di aumentata produzione di specie reattive<br />
Eziologia Esempi<br />
Fattori ambientali Radiazioni, <strong>in</strong>qu<strong>in</strong>amento<br />
Stati fisiologici Gravidanza (?)<br />
Stile di vita Alimentazione, alcool, fumo, es. fisico <strong>in</strong>congruo<br />
Fattori psicologici Stress psico-emotivo (?)<br />
Malattie Infiammazioni, <strong>in</strong>fezioni, vasculopatie, tumori<br />
Fattori iatrogeni Farmacoterapia, radioterapia, raggi X<br />
Bisogna sottol<strong>in</strong>eare che il fumo di sigaretta,<br />
l’abuso di alcool ed altri fattori correlati con lo stile<br />
di vita sono importanti responsabili dell’aumento<br />
della produzione di ROS. Lo stesso effetto è <strong>in</strong>dotto<br />
da un’attività fisica <strong>in</strong>congrua (eccessiva o <strong>in</strong>sufficiente).<br />
Inf<strong>in</strong>e, è riconosciuto il ruolo dei numerose<br />
malattie, su base disreattiva o <strong>in</strong>fettiva (es. artrite<br />
reumatoide e <strong>in</strong>fezioni batteriche) nel favorire<br />
l’<strong>in</strong>cremento dei ROS.<br />
Una riduzione delle difese <strong>antiossidanti</strong> è da<br />
imputarsi sostanzialmente ad un deficit assoluto o<br />
relativo di <strong>antiossidanti</strong>, comunque determ<strong>in</strong>atosi.<br />
In tale contesto, alcune malattie, quali la celiachia,
possono provocare uno stress ossidativo riducendo<br />
la disponibilità di <strong>antiossidanti</strong> assunti con<br />
l’alimentazione (tabella 3. 3).<br />
Tabella 3. 3 Cause di ridotte difese antioossidanti<br />
Eziologia Esempi/meccanismi<br />
Ridotta assunzione<br />
Ipovitam<strong>in</strong>osi,<br />
di <strong>antiossidanti</strong><br />
diete monotone<br />
Ridotto assorbimento<br />
S<strong>in</strong>dromi da malassorbimento,<br />
di <strong>antiossidanti</strong><br />
celiachia<br />
Ridotta capacità di utilizzazione Deficit dei meccanismi di cap-<br />
di <strong>antiossidanti</strong><br />
tazione e/o tra<strong>sport</strong>o<br />
Insufficienza dei sistemi<br />
Fattori genetici<br />
enzimatici <strong>antiossidanti</strong><br />
e/o iatrogeni<br />
Eccessivo consumo<br />
Eccessiva produzione<br />
di <strong>antiossidanti</strong><br />
di specie reattive<br />
Assunzione<br />
Sovraccarico del sistema<br />
di farmaci<br />
microsomiale<br />
Malattie Vari<br />
A proposito delle malattie, va precisato che esse<br />
alcune di esse si accompagnano ad un’aumentata<br />
produzione di specie reattive, altre ad una riduzione<br />
delle difese <strong>antiossidanti</strong>, altre ancora, <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e, alla<br />
comb<strong>in</strong>azione di ambedue i meccanismi.<br />
Dal punto di vista biochimico, considerando il<br />
fenomeno <strong>dello</strong> stress ossidativo all’<strong>in</strong>terno della<br />
cellula, è <strong>in</strong>dubbio che all’orig<strong>in</strong>e delle alterazioni<br />
funzionali e strutturali vi è un aumento della produzione<br />
di specie reattive per stimolazione parziale o<br />
generalizzata del metabolismo, spesso sotto la sp<strong>in</strong>ta<br />
di fattori esogeni (5, 7, 22, 30).<br />
I ROS, resisi disponibili <strong>in</strong> grandi quantità, sono<br />
<strong>in</strong> grado di attaccare qualsiasi substrato con il quale<br />
giungono a contatto, strappando ad essi l’elettrone<br />
o gli elettroni necessari per raggiungere la propria<br />
stabilità. Ciò, a sua volta, <strong>in</strong>nesca processi radicalici<br />
a catena che, se non bloccati tempestivamente,<br />
possono provocare gravi conseguenze sul piano,<br />
dapprima funzionale, poi anche strutturale (figura 3.<br />
2) (5, 6, 8, 16).<br />
Anione superossido O .<br />
2<br />
Radicale idrossile HO*<br />
Radicale peridrossile HO 2 *<br />
Metallidi transizione/<br />
Sistemi enzimatici<br />
Agenti esterni, attività metabolica<br />
Substrati organici RH (glicidi, lipidi,<br />
amm<strong>in</strong>oacidi, nucleotidi, etc.)<br />
Alterazioni funzionali e/o strutturali della cellula<br />
Figura 3. 2 Patogenesi <strong>dello</strong> stress ossidativo: aspetti biochimici<br />
Fra i vari meccanismi cito- ed isto-lesivi assume<br />
rilevante importanza quello correlato con la formazione<br />
degli idroperossidi (ROOH), una classe di derivati<br />
o metaboliti reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen<br />
metabolites, ROM) (16).<br />
Questo meccanismo, tipico delle reazioni radicaliche<br />
a catena, viene <strong>in</strong>nescato dall’attacco, da parte<br />
di un ROS (X • , per esempio, il radicale istolesivo<br />
HO • ), di un generico substrato organico R-H (es. un<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
Ossigeno s<strong>in</strong>goletto 1 Ossigeno s<strong>in</strong>goletto O2 Perossido di idrogeno H2O2 1O2 Perossido di idrogeno H2O2 Metallidi transizione/<br />
Sistemi enzimatici<br />
Idroperossido R-OOH<br />
Radicale alcossile R-O*<br />
Radicale idroperossile R-OO*<br />
Superamento difese<br />
<strong>antiossidanti</strong><br />
28<br />
glicide, un lipide, un amm<strong>in</strong>oacido, un nucleotide<br />
ecc.) (figura 3. 3) (11).<br />
1) X• 1) X + R–H → X–H + R• • + R–H → X–H + R• 2) R• + O2 → R–OO• 3) R–OO• 2) R<br />
+ R1H→ R–OOH + R •<br />
1<br />
4A) R •<br />
1 + R1<br />
• → R1 – R1 4B) R •<br />
1 + R2H → R1H + R •<br />
2 • + O2 → R–OO• 3) R–OO• + R1H→ R–OOH + R •<br />
1<br />
4A) R •<br />
1 + R1<br />
• → R1 – R1 4B) R •<br />
1 + R2H → R1H + R •<br />
2<br />
RH/R RH/R1H/R 1H/R2H 2H = qualsiasi sostanza organica<br />
Figura 3. 3 Reazioni radicaliche e produzione di perossidi<br />
Il radicale HO • , avendo un elettrone spaiato, è<br />
molto reattivo e, giunto a contatto con il substrato<br />
R-H, strappa a quest’ultimo un atomo di idrogeno<br />
per raggiungere la sua stabilità.<br />
In tal modo, però, il sito radicalico è ora trasferito<br />
al substrato che si trasforma <strong>in</strong> radicale R • .<br />
Quest’ultimo, <strong>in</strong> presenza di ossigeno molecolare, è<br />
convertito <strong>in</strong> radicale (idro)perossile ROO • , un nuovo<br />
radicale che, a sua volta, può attaccare un altro<br />
substrato organico R1H trasformandosi <strong>in</strong> idroperossido<br />
ROOH.<br />
La reazione a catena ormai <strong>in</strong>nescata cont<strong>in</strong>uerà<br />
a partire dall’ultimo radicale generato (R1 • ),<br />
f<strong>in</strong>o a quando non <strong>in</strong>terverrà un meccanismo di<br />
term<strong>in</strong>azione (es. reazione di comb<strong>in</strong>azione, R1 • +<br />
R 1 • , per produrre R1-R 1) oppure un antiossidante.<br />
Il fenomeno della perossidazione – è bene ribadirlo<br />
– non è esclusivo dei lipidi, ma può <strong>in</strong>teressare<br />
qualsiasi substrato organico, dagli amm<strong>in</strong>oacidi alle<br />
prote<strong>in</strong>e, dai carboidrati ai nucleotidi.<br />
Non v’è dubbio, tuttavia, che i lipidi, specialmente<br />
se <strong>in</strong>saturi, e, qu<strong>in</strong>di, con doppietti di legame<br />
“disponibili” a soddisfare l’avidità di elettroni dei radicali<br />
<strong>liberi</strong>, costituiscano target importanti<br />
dell’attacco ossidativo, <strong>in</strong> particolar modo se <strong>in</strong>seriti<br />
nel contesto di biomembrane e, come tali, maggiormente<br />
esposti all’azione radicalica (16).<br />
La perossidazione lipidica segue lo schema generale<br />
delle reazioni radicaliche appena discusso,<br />
con la variante che, se ad essere colpito è un acido<br />
grasso poli<strong>in</strong>saturo, quale l’acido arachidonico, ad<br />
essere attaccato dal radicale istolesivo HO • è uno<br />
dei doppi legami C-C (16).<br />
In questo caso specifico, la sottrazione di un<br />
atomo di iidrogeno da parte del radicale idrossile<br />
genera un radicale centrato sul carbonio, che rapidamente<br />
va <strong>in</strong>contro ad una redistribuzione dei<br />
doppi legami trasformandosi <strong>in</strong> diene coniugato.<br />
Quest’ultimo, <strong>in</strong> presenza di ossigeno si trasforma <strong>in</strong><br />
radicale perossilico.<br />
Il radicale perossilico corrispondente rappresenta<br />
un composto chiave <strong>in</strong> questa sequenza di reazioni,<br />
perché può essere non solo trasformato <strong>in</strong><br />
idroperossido, ma andare <strong>in</strong>contro, per la sua peculiare<br />
struttura chimica, ad ulteriore degradazione
s<strong>in</strong>o a malonildialdeide e, <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e, a pentano, se sono<br />
disponibili ulteriori donatori di idrogeno (e, <strong>in</strong> ultima<br />
analisi, f<strong>in</strong>o a completa utilizzazione del sistema antiossidante);<br />
queste considerazioni sono importanti<br />
perché le attuali tecniche di valutazione <strong>dello</strong> “status<br />
pro-ossidante” si basano proprio sull’ identificazione<br />
e la successiva quantificazione di una o più<br />
delle classi di <strong>in</strong>termedi generati nel corso di questo<br />
processo di reazioni a catena (figura 3. 4).<br />
R 1<br />
16<br />
15 14<br />
Figura 3. 4 Perossidazione lipidica e sua valutazione<br />
Comunque prodotti, gli idroperossidi sono sostanze<br />
relativamente stabili e conservano una discreta<br />
capacità ossidante. Pertanto, nella stessa cellula,<br />
se si rendono disponibili metalli di transizione<br />
allo stato libero, essi possono subire la reazione di<br />
Fenton e generare così i più reattivi radicali alcossile<br />
(RO • ) e idroperossile (ROO • ), che amplificano il<br />
danno all’<strong>in</strong>terno della cellula (18, 29).<br />
A causa della potenziale tossicità, si ritiene che<br />
gli idroperossidi vengano espulsi dalla cellula ed<br />
immessi nei fluidi circolanti, fra cui il sangue. Se,<br />
qu<strong>in</strong>di, nel plasma, esistono condizioni tali da <strong>in</strong>durre<br />
il rilascio di ferro allo stato ionico dalle prote<strong>in</strong>e<br />
circolanti (es. un’acidosi transitoria), si <strong>in</strong>nescherà la<br />
reazione di Fenton che genererà ancora una volta<br />
radicali alcossile e idroperossile che amplificheranno<br />
il danno a livello delle LDL e, soprattutto,<br />
dell’endotelio (18, 32).<br />
In ogni caso, gli idroperossidi plasmatici, conservando,<br />
come nella cellula, ancora una discreta<br />
capacità ossidante ed essendo relativamente stabili,<br />
possono essere opportunamente messi <strong>in</strong> evidenza<br />
e quantificati (vedi oltre, d-ROMs test) (figura 3. 5).<br />
Agenti esterni<br />
*OH<br />
RH<br />
O 2<br />
Attività metabolica<br />
H 2 O<br />
R*<br />
ROO*<br />
Danno<br />
ossidativo<br />
R 1 *<br />
R 1 H ROOH<br />
Respirazione<br />
Danno<br />
ossidativo<br />
Nucleo<br />
13<br />
12 11<br />
H 2 O HO*<br />
Acido arachidonico radicale<br />
R 1<br />
8<br />
R 2<br />
O OH<br />
R 1<br />
16<br />
15<br />
14<br />
13<br />
11<br />
12<br />
8<br />
R 2<br />
IDROPEROSSIDO<br />
Citoplasma<br />
Cellula<br />
16<br />
15 14<br />
13<br />
Acido arachidonico<br />
R* RH<br />
12 11<br />
Misurazione<br />
diretta MS<br />
Figura 3. 5 Metabolismo ed effetti patogeni degli idroperossidi<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
R-O-O-H R-O*<br />
Fe3+ Fe2+ pH ↓ Fe3+ Fe2+ pH ↓<br />
OH- Ossidazione LDL<br />
OH- Ossidazione LDL<br />
R-O-O* R-O-O-H<br />
H +<br />
Danno H<br />
endoteliale<br />
+<br />
Danno<br />
endoteliale<br />
8<br />
R 2<br />
Vaso sanguigno (capillare)<br />
PENTANO<br />
R 1<br />
15 14 12 11<br />
8<br />
16<br />
13<br />
R 2<br />
Acido arachidonico radicale<br />
O 2<br />
Electron transfer<br />
9<br />
8<br />
6 5<br />
R 1<br />
16<br />
15 13 11<br />
14 12<br />
Diene coniugato<br />
8<br />
R 2<br />
Misurazione<br />
diretta UV<br />
O<br />
11<br />
12 14 15<br />
13<br />
16<br />
Endoperossido ciclico<br />
d–ROMs test<br />
O O2<br />
2<br />
R 1<br />
16<br />
O<br />
15 13<br />
11<br />
14 12<br />
Radicale perossilico<br />
O<br />
8<br />
R 2<br />
O OO2 2<br />
O<br />
R 1<br />
15 13<br />
11<br />
16 14 12<br />
Perossido ciclico<br />
TBAR test<br />
CHO CHO<br />
MDA<br />
ROOH<br />
Cellula<br />
COOH<br />
O<br />
8<br />
CH 3<br />
R 2<br />
29<br />
A tal riguardo, si dice che gli idroperossidi sono<br />
testimoni o marcatori ma anche amplificatori del<br />
danno cellulare da radicali <strong>liberi</strong> (32).<br />
Anche i livelli di malondialdeide (MDA) nel plasma<br />
o degli alcani (pentano o etano) nell’espirato<br />
forniscono <strong>in</strong>formazioni sulla produzione di radicali<br />
<strong>liberi</strong>, ma solo quando il sistema antiossidante presente<br />
nel mezzo biologico si è esaurito.<br />
Oltre agli idroperossidi, i ROS sono <strong>in</strong> grado di<br />
generare diversi prodotti e sottoprodotti di ossidazione<br />
reagendo con biomolecole target, le quali<br />
possono essere più o meno permanentemente modificate,<br />
frammentate o depolimerizzate. Tra questi<br />
sottoprodotti sono da segnalare le cloroamm<strong>in</strong>e.<br />
Infatti, diversi studi hanno dimostrato che il “respiratory<br />
burst” dei fagociti attivati (macrofagi e<br />
PMN) è <strong>in</strong> grado di produrre perossido di idrogeno<br />
sia <strong>in</strong> vitro che <strong>in</strong> vivo. Queste cellule possono anche<br />
rilasciare la mieloperossidasi, un enzima a ferro<br />
em<strong>in</strong>ico che catalizza la reazione tra perossido di<br />
idrogeno e ione cloruro (già a concentrazioni fisiologiche)<br />
per produrre il potente ossidante acido ipocloroso<br />
(HClO) (33).<br />
Tale sostanza gioca un ruolo importante nelle<br />
difese messe <strong>in</strong> atto dai mammiferi contro microrganismi<br />
patogeni, <strong>in</strong> quanto è dotata di potente<br />
attività battericida (13).<br />
E’ altresì noto, tuttavia, che un’eccessiva o <strong>in</strong>adeguata<br />
produzione di HClO provoca lesioni a carico<br />
dei tessuti nei mammiferi, e questo si ritiene essere<br />
importante <strong>in</strong> alcune patologie umane, quali<br />
l’aterosclerosi, le malattie <strong>in</strong>fiammatorie croniche ed<br />
alcune forme di neoplasie (13).<br />
Numerosi studi hanno dimostrato che le prote<strong>in</strong>e<br />
rappresentano i bersagli pr<strong>in</strong>cipali dell’azione<br />
dell’HClO, anche se questo potente ossidante reagisce<br />
con un ampia varietà di altre molecole organiche<br />
target, quali il DNA, i lipidi, il colesterolo,<br />
l’NADH, e i tioli (13).<br />
In particulare, è stato dimostrato mediante EPR<br />
che l’HClO reagisce con i gruppi amm<strong>in</strong>ici di amm<strong>in</strong>oacidi<br />
e prote<strong>in</strong>e per produrre cloroamm<strong>in</strong>e. Queste,<br />
a loro volta, si decompongono e generano radicali<br />
<strong>liberi</strong>, dimostrabili mediante tecniche di sp<strong>in</strong><br />
trapp<strong>in</strong>g comb<strong>in</strong>ate con l’EPR, quali i radicali perossilici<br />
ed alcossilici (13).<br />
Secondo l’ipotesi più accreditata, il carbonio alfa<br />
dell’amm<strong>in</strong>oacido che ha subito l’attacco dell’acido<br />
ipocloroso trasformandosi <strong>in</strong> cloroamm<strong>in</strong>a, si trasforma<br />
<strong>in</strong> un sito radicalico. Il conseguente attacco<br />
dell’ossigeno genera un radicale perossilico che, dimerizzando,<br />
forma il tetrossido corrispondente. Dalla<br />
scissione di quest’ultimo orig<strong>in</strong>erebbero, con<br />
l’ossigeno molecolare, i radicali alcossilici. Il processo<br />
descritto, che è favorito ma non dipende<br />
dall’aggiunta di ioni ferro, sembra giocare un ruolo<br />
determ<strong>in</strong>ante nell’amplificare il danno ossidativo da<br />
radicali <strong>liberi</strong> nei fluidi extracellulari, quali il sangue,<br />
anche quando, appunto, non sono disponibili metalli
di transizione allo stato libero (13). In ogni caso<br />
questa possibilità alternativa di produrre radicali perossilici<br />
e alcossilici rende ancora più importante il<br />
significato delle <strong>in</strong>formazioni fornite dal d-ROMs test<br />
che, come verrà discusso dettagliatamente <strong>in</strong> seguito,<br />
consente di dosare non solo gli idroperossidi generati<br />
dalle “classiche” reazioni di perossidazione,<br />
ma anche questi importantissimi marker di stress<br />
ossidativo generati dalla decomposizione delle cloroamm<strong>in</strong>e.<br />
Inf<strong>in</strong>e, fra gli altri meccanismi biochimici co<strong>in</strong>volti<br />
nel danno da radicali <strong>liberi</strong> sono da citare la<br />
formazione di legami crociati, la condensazione di<br />
prote<strong>in</strong>e, la depolimerizzazione dell’acido ialuronico<br />
(a livello della matrice extracellulare), l’<strong>in</strong>terruzione<br />
di uno o ambedue i filamenti del DNA, ecc. (tabella<br />
3. 4) (15, 26).<br />
Tabella 3. 4 Bersagli dei ROM e relativi prodotti di ossidazione<br />
Specie Molecola<br />
Prodotti di<br />
reattive bersaglio ossidazione<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale peridrossile<br />
Lipidi (PUFA)<br />
Idroperossidi<br />
lipidici<br />
Radicale idrossile<br />
Radicale peridrossile<br />
Prote<strong>in</strong>e<br />
Molecole con legami crociati,<br />
idroperossidi<br />
Radicale idrossile Acido<br />
Glucosidi,<br />
Radicale peridrossile jaluronico idroperossidi<br />
Radicale idrossile DNA/RNA<br />
Filamenti <strong>in</strong>terrotti,<br />
8-idrossiguanos<strong>in</strong>a<br />
3. 3 Eziopatogenesi<br />
La produzione di specie reattive – si è detto –<br />
avviene <strong>in</strong> ben def<strong>in</strong>iti siti cellulari: plasmamembrana,<br />
mitocondri, reticolo endoplasmatico liscio (microsomi),<br />
perossisomi e citosol.<br />
Va sottol<strong>in</strong>eato che la generazione di ROS <strong>in</strong><br />
ciascuno di questi siti e gli effetti che da essa ne<br />
scaturiscono assume caratteristiche peculiari <strong>in</strong><br />
rapporto alla specificità <strong>dello</strong> stimolo ed alle modalità,<br />
qualità e quantità di specie reattive prodotte.<br />
E’ evidente che la produzione di ROS da parte<br />
dei PMN, conseguente ad attivazione della plasmamembrana,<br />
richiede stimoli diversi da quelli necessari<br />
per la generazione di specie reattive dalle cellule<br />
muscolari, associata all’attivazione del metabolismo<br />
mitocondriale.<br />
In l<strong>in</strong>ea di massima, <strong>in</strong>fatti, uno stimolo flogistico<br />
tenderà prevalentemente ad attivare la plasmamembrana<br />
dei PMN laddove un <strong>in</strong>tenso esercizio<br />
muscolare tenderà ad esaltare prevalentemente<br />
l’attività metabolica mitocondriale delle cellule muscolari.<br />
Ciascuna delle due situazioni, <strong>in</strong>oltre, è accompagnata<br />
dalla produzione di specie reattive almeno<br />
<strong>in</strong> parte diverse, per il diverso corredo enzimatico<br />
delle cellule e delle relative strutture subcellulari <strong>in</strong>teressate.<br />
Per esempio, i mitocondri delle cellule muscolari,<br />
che non possiedono la mieloperossidasi non potranno<br />
generare HClO, che potrà essere prodotto<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
30<br />
solo dalla plasmamembrana dei PMN attivati. Inf<strong>in</strong>e,<br />
anche gli effetti sistemici delle due condizioni<br />
saranno diverse.<br />
Sulla base di queste considerazioni si può associare<br />
a ciascun sito cellulare co<strong>in</strong>volto nella produzione<br />
di specie reattive un particolare tipo di stress<br />
ossidativo: <strong>in</strong>dotto prevalentemente da modificazioni<br />
reattive della superficie cellulare, <strong>in</strong>dotto<br />
prevalentemente da una ridotta efficienza della respirazione<br />
cellulare, secondario prevalentemente ad<br />
<strong>in</strong>duzione farmacometabolica, <strong>in</strong>dotto prevalentemente<br />
da variazioni della tensione <strong>in</strong>tracellulare di<br />
ossigeno e da meccanismi multipli comb<strong>in</strong>ati (figura<br />
3. 6).<br />
NADPH ossidasi<br />
Lipoossigenasi<br />
Stress ossidativo<br />
da modificazioni reattive<br />
della superficie cellulare<br />
Xant<strong>in</strong>a ossidasi<br />
Aldeide ossidasi<br />
Stress ossidativo<br />
da variazioni<br />
<strong>in</strong>tracellulari della pO 2<br />
NADH deidrogenasi<br />
Citotocromo ossidasi<br />
Stress ossidativo<br />
da ridotta efficienza della<br />
respirazione cellulare<br />
Citocromo P 450<br />
Citocromo b 5<br />
Stress ossidativo<br />
da <strong>in</strong>duzione<br />
farmacometabolica<br />
Figura 3. 6 Fonti cellulari di ROS e stress ossidativo<br />
E’ evidente che questa impostazione rappresenta<br />
un’ipersemplificazione della ben più complessa e<br />
multiforme situazione biochimica che si osserva a<br />
livello cellulare, tissutale e sistemico nello stress ossidativo.<br />
Rimanendo nell’esempio comparativo appena<br />
discusso della plasmamembrana dei PMN e dei mitocondri<br />
delle cellule muscolari, non bisogna dimenticare<br />
che nelle condizioni disreattive, quali le <strong>in</strong>fezioni,<br />
la febbre <strong>in</strong>dotta dall’attivazione dei PMN si<br />
associa ad un’esaltazione del metabolismo e, viceversa,<br />
lo sforzo muscolare <strong>in</strong>tenso può associarsi a<br />
condizioni <strong>in</strong>fiammatorie, ritenute responsabili di lesioni<br />
traumatiche dell’apparato muscoloscheletrico.<br />
In altri term<strong>in</strong>i, è difficile dist<strong>in</strong>guere nettamente<br />
uno stress ossidativo <strong>in</strong>dotto da modificazioni reattive<br />
della superficie cellulare da uno stress ossidativo<br />
<strong>in</strong>dotto da ridotta efficienza della respirazione<br />
cellulare.<br />
Anzi, estendendo ancor di più il discorso, nella<br />
patogenesi del danno muscolare legato ad esercizio<br />
fisico strenuo entra <strong>in</strong> gioco anche il meccanismo<br />
dell’ischemia-riperfusione, che è alla base <strong>dello</strong><br />
stress ossidativo da variazioni della pO2 <strong>in</strong>tracellulare.<br />
E’ per questo motivo che nella classificazione<br />
dei diversi tipi di stress ossidativo si è convenuto di<br />
usare la circumlocuzione “stress ossidativo <strong>in</strong>dotto<br />
prevalentemente da…”.<br />
Pur nella consapevolezza degli <strong>in</strong>evitabili limiti<br />
legati ai tentativi di classificare i fenomeni biologici,<br />
l’<strong>in</strong>dividuazione di c<strong>in</strong>que pattern di stress ossidativo
conserva, tuttavia, un’<strong>in</strong>dubbia valenza didattica e<br />
concettuale e, pertanto, può essere di grande aiuto<br />
non solo al cl<strong>in</strong>ico, per l’<strong>in</strong>quadramento diagnostico<br />
del soggetto con compromissione del bilancio redox,<br />
ma anche al terapeuta, per orientare la scelta<br />
nel complesso labir<strong>in</strong>to delle opzioni attualmente<br />
disponibili (tabella 3. 5).<br />
Tabella 3. 5 Pattern fondamentali <strong>dello</strong> stress ossidativo (SO)<br />
SO* Sito † Meccanismo † ROS/ROM Correlazioni<br />
I Membrana<br />
Generazione<br />
ac. arachidonico<br />
Idroperossidi<br />
An. superossido<br />
Processi reattivi<br />
(<strong>in</strong>fiammazione)<br />
Attivazione<br />
NADPH ossidasi<br />
An. superossido<br />
Processi reattivi<br />
(<strong>in</strong>fiammazione)<br />
II Mitocondri<br />
Attivazione<br />
metabolica<br />
An. superossido Ipernutrizione,<br />
Perossido di H es. fis. <strong>in</strong>adeguato<br />
Disfunzione An. superossido Mitocondriopatie<br />
mitocondriale Perossido di H (prim. o sec.)<br />
III Microsomi<br />
Attivazione<br />
citocromi P450/b5<br />
Vari<br />
Alcol, farmaci,<br />
xenobiotici<br />
IV Citosol<br />
Attivazione<br />
xant<strong>in</strong>a ossidasi<br />
An. superossido Mal. da ischemia-<br />
Perossido di H riperfusione<br />
V<br />
Almeno<br />
due<br />
Multipli<br />
Variabilmente<br />
centrati ‡<br />
Fumo, <strong>in</strong>qu<strong>in</strong>anti,<br />
radiazioni<br />
I: SO prevalentemente da modifiche reattive della superficie cellulare; II: SO<br />
prevalentemente da ridotta efficacia della respirazione cellulare; III: SO<br />
prevalentemente da <strong>in</strong>duzione farmaco-metabolica; IV: SO prevalentemente<br />
da variazioni della pO2 <strong>in</strong>tracellulare; V: SO da meccanismi multipli. †<br />
Prevalente. ‡ Carbonio, azoto, cloro ecc<br />
Lo stress ossidativo <strong>in</strong>dotto prevalentemente da<br />
modificazioni reattive della superficie cellulare è<br />
provocato dall’attivazione della plasmamembrana<br />
che, come si è detto, è sede di attività enzimatiche<br />
generatrici di ROS (28).<br />
Questo tipo di stress ossidativo è generato, nella<br />
sua forma più caratteristica, da una massiccia attivazione<br />
dei leucociti pomorfonucleati ad opera di<br />
batteri o endotoss<strong>in</strong>e o immunocomplessi (1).<br />
Tali agenti, <strong>in</strong>fatti, legandosi alla plasmamembrana<br />
possono attivare l’NADPH ossidasi, con produzione<br />
di anione superossido (figura 3. 7) (23).<br />
Batteri<br />
MPx MPx<br />
PLA 2<br />
H 2 O 2<br />
Figura 3. 7 Produzione di specie reattive da PMN attivati<br />
Anche l’attivazione delle lipoossigenasi, localizzate<br />
sulla plasmamembrana dei PMN, si accompagna<br />
a produzione di perossidi.<br />
Lo stress ossidativo da modificazioni reattive<br />
della superficie cellulare è tipico dei processi reattiquali<br />
<strong>in</strong>fezioni (es. batteriche) e <strong>in</strong>fiammazioni (es.<br />
artrite reumatoide).<br />
Lo stress ossidativo <strong>in</strong>dotto prevalentemente da<br />
una ridotta efficienza della respirazione cellulare è<br />
provocato da un’alterazione della funzionalità dei<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
PL AA PG<br />
SOD SOD<br />
Fenton/HW Fenton/HW<br />
ROOH<br />
Fe/Cu<br />
Fe/Cu<br />
NADPH-Ox NADPH-Ox<br />
.<br />
O 2<br />
Proteasi<br />
O 2<br />
Cl- H2O R-NH Cl<br />
2<br />
RH H2O -<br />
H2O R-NH2 RH H2O HClO OH .<br />
R-NHCl HClO OH R*<br />
.<br />
R-NHCl R*<br />
31<br />
mitocondri che, come è noto, costituiscono una delle<br />
fonti primarie di produzione di ROS (31). Nel caso<br />
più semplice, l’aumentata produzione di specie reattive<br />
è legata ad un’eccessiva attivazione metabolica,<br />
quale si riscontra ad esempio durante lo sforzo fisico<br />
<strong>in</strong>tenso o nell’iperalimentazione; <strong>in</strong> questo caso<br />
le specie reattive maggiormente generate sono i<br />
prodotti di riduzione non tetravalente dell’ossigeno,<br />
quali, ad esempio, l’anione superossido (15).<br />
E’ anche possibile che un aumento della produzione<br />
di ROS per ridotta efficienza della respirazione<br />
cellulare sia legato ad una patologia primaria dei<br />
mitocondri ovvero all’<strong>in</strong>nescarsi di un circolo<br />
vizioso (attivazione metabolica → produzione di<br />
ROS da shunt elettronico → disfunzione mitocondriale<br />
→ riduzione dell’efficienza respiratoria → ulteriore<br />
produzione di ROS da shunt elettronico) (2,<br />
4).<br />
Lo stress ossidativo secondario prevalentemente<br />
ad <strong>in</strong>duzione farmacometabolica è provocato da<br />
un’attivazione del sistema di idrossilazione a funzione<br />
dis<strong>in</strong>tossicante del citocromo P450. Ne sono frequenti<br />
cause l’etilismo cronico e l’esposizione a xenobiotici<br />
(20).<br />
In questi casi possono essere prodotte specie<br />
reattive anche non centrate sull’ossigeno (es. il radicale<br />
del paracetamolo, un comunissimo antipiretico<br />
e analgesico) (21).<br />
Lo stress ossidativo <strong>in</strong>dotto prevalentemente da<br />
variazioni della tensione <strong>in</strong>tracellulare di ossigeno è<br />
tipico delle lesioni da ischemia-riperfusione che si<br />
osservano nell’<strong>in</strong>farto e <strong>in</strong> seguito ad <strong>in</strong>terventi di<br />
rivascolarizzazione chirurgica o trapianto di organi<br />
(3, 17, 25).<br />
Si ritiene che <strong>in</strong> questi casi entri <strong>in</strong> gioco<br />
l’attivazione della xant<strong>in</strong>a ossidasi con produzione di<br />
perossido di idrogeno e anione superossido (figura<br />
3. 8) (14, 24).<br />
Infarto, bypass, trapianti<br />
Macroischemia<br />
Microischemia<br />
pO 2 ↓<br />
Acidosi<br />
Sedentarietà<br />
Deficit pompe<br />
Disponibilità ossigeno ↓<br />
Lattato ↑<br />
Cellula<br />
Glicolisi<br />
Stato ridotto mitocondri ↑<br />
anaerobica ↑<br />
Rilascio Fe2+ / 3+<br />
Amplificazione del danno<br />
Rilascio F<br />
dalle prote<strong>in</strong>e<br />
e2+ / 3+<br />
Amplificazione del danno<br />
Rilascio F<br />
dalle prote<strong>in</strong>e<br />
e2+ / 3+<br />
Amplificazione del danno<br />
dalle prote<strong>in</strong>e<br />
Fosforilazione<br />
ossidativa↓<br />
Creat<strong>in</strong>a ↑ Osmolarità ↑<br />
Creat<strong>in</strong>a-P↓<br />
S<strong>in</strong>tesi ATP ↓ Decompartimentalizzazione<br />
Disorganizzazione citoscheletro<br />
ADP ↑<br />
Attacco substrati<br />
organici<br />
AMP ↑<br />
IMP ↑<br />
H 2O2↑<br />
.<br />
O2 ↑<br />
ROO* RO*<br />
ROOH↑<br />
ROOH<br />
Inos<strong>in</strong>a ↑ Ipoxant<strong>in</strong>a Xant<strong>in</strong>a<br />
Xant<strong>in</strong>a<br />
Ossidasi<br />
Acido urico<br />
Vaso sanguigno<br />
Deficit pompe<br />
Calcio ↑<br />
citosolico<br />
Attivazione<br />
proteasi<br />
Danno<br />
membrana<br />
Alterazioni<br />
omeostasi ionica<br />
Xant<strong>in</strong>a<br />
deidrogenasi<br />
Figura 3. 8 Meccanismi del danno da ischemia-riperfusione<br />
Inf<strong>in</strong>e, il fumo di sigaretta, l’esposizione ad <strong>in</strong>qu<strong>in</strong>anti<br />
atmosferici o a radiazioni ionizzanti o UV<br />
ovvero ad agenti tossici saranno responsabili di<br />
uno stress ossidativo conseguente all’attivazione di<br />
meccanismi multipli comb<strong>in</strong>ati.
3. 4 Alterazioni del bilancio ossidativo<br />
e pratica <strong>sport</strong>iva<br />
In condizioni ord<strong>in</strong>arie, le fibre muscolari possiedono<br />
un efficiente sistema antiossidante <strong>in</strong> grado<br />
di tenere sotto controllo la produzione eccessiva di<br />
ROS.<br />
Infatti, sia gli <strong>antiossidanti</strong> endogeni (SOD, GPx,<br />
ubich<strong>in</strong>olo,) che quelli esogeni (vitam<strong>in</strong>e, oligom<strong>in</strong>erali<br />
e sostanze simil-vitam<strong>in</strong>iche) giocano un importante<br />
ruolo protettivo prevenendo, annullando o<br />
contrastando l’azione potenzialmente lesiva delle<br />
specie chimiche reattive sull’apparato muscoloscheletrico.<br />
Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che un<br />
adeguato regime di allenamento e/o l’assunzione<br />
mirata di <strong>in</strong>tegratori <strong>antiossidanti</strong> è effettivamente<br />
<strong>in</strong> grado di potenziare i sistemi di difesa <strong>antiossidanti</strong><br />
dell’organismo, riducendo l’entità dei processi<br />
di perossidazione dopo attività fisica <strong>in</strong>tensa.<br />
Tuttavia, se all’esercizio fisico <strong>in</strong>tenso si associa<br />
anche una compromissione dei sistemi di difesa<br />
<strong>antiossidanti</strong>, i ROS sono <strong>liberi</strong> di attaccare e di<br />
danneggiare qualsiasi componente cellulare, dai glicidi<br />
ai lipidi, dalle prote<strong>in</strong>e agli acidi nucleici.<br />
In generale, qualsiasi attività fisica <strong>in</strong>congrua<br />
può associarsi ad una condizione di stress ossidativo.<br />
Infatti, tanto la sedentarietà quanto la pratica<br />
<strong>sport</strong>iva strenua possono provocare, attraverso uno<br />
squilibrio tra produzione ed <strong>in</strong>attivazione di ROS, un<br />
aumento dei processi perossidativi con conseguenti<br />
lesioni tissutali e/o sistemiche, non di rado a carico<br />
<strong>dello</strong> stesso apparato muscolo-scheletrico (lesioni<br />
da traumatiche e/o da overuse, tend<strong>in</strong>iti, ecc.) (figura<br />
3. 9).<br />
ATTIVITA’ FISICA INADEGUATA<br />
Aumentata produzione specie<br />
reattive (O2 . , HO . , H2O2)<br />
Figura 3. 9 Patogenesi delle lesioni da stress ossidativo<br />
dell’apparato muscolo-scheltrico<br />
In particolare, un’attività fisica eccessiva può<br />
provocare una condizione di stress ossidativo sia<br />
favorendo la generazione di ROS sia abbassando le<br />
difese <strong>antiossidanti</strong>. A sua volta, l’aumento della<br />
produzione di ROS è da ricondursi pr<strong>in</strong>cipalmente<br />
all’<strong>in</strong>cremento del ritmo delle ossidazioni biologiche<br />
a livello dei mitocondri.<br />
Infatti, come è ampiamente noto, sulle creste di<br />
questi organuli sono localizzati i componenti della<br />
catena respiratoria, ove gli equivalenti riducenti<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
Compromissione della barriera<br />
antiossidante (SOD, vit C)<br />
OSSIDAZIONE DI BIOMOLECOLE CON PRODUZIONE<br />
DI ROM (IDROPEROSSIDI, CLORAMMINE)<br />
DANNO OSSIDATIVO APPAR. MUSCOLO-SCHELETRICO<br />
(<strong>in</strong>fiammazioni, overuse. traumi…)<br />
32<br />
(coppie di atomi di idrogeno) estratti dai subsrati<br />
ossidabili del metabolismo cellulare (glucosio, acidi<br />
grassi, prote<strong>in</strong>e, etc.) vengono “tra<strong>sport</strong>ati” f<strong>in</strong>o al<br />
loro accettore f<strong>in</strong>ale, l’ossigeno molecolare.<br />
In questo ciclo di reazioni redox la differenza di<br />
potenziale esistente fra il primo e l’ultimo dei “tra<strong>sport</strong>atori”<br />
(il NAD ridotto e l’ossigeno molecolare,<br />
rispettivamente), viene sfruttata per generare ATP,<br />
a partire da ADP e fosfato (fosforilazione ossidativa).<br />
Di norma, ogni coppia di equivalenti riducenti<br />
che “entra” nella catena respiratoria “viene accettata”<br />
da un atomo di ossigeno generando una molecola<br />
d’acqua. Tuttavia, anche a riposo, una quota di<br />
equivalenti riducenti “sfugge”, nel corso della respirazione<br />
cellulare, al controllo dei sofisticati meccanismi<br />
di regolazione localizzati sulle creste mitocondriali,<br />
generando specie chimiche parzialmente ridotte<br />
dell’ossigeno, quale, ad esempio, l’anione superossido.<br />
Tale quota, oscilla, secondo i diversi studi<br />
pubblicati sull’argomento, dall’1 f<strong>in</strong>o al 3%, e, <strong>in</strong><br />
condizioni normali, viene immediatamente neutralizzata<br />
dai sistemi di difesa <strong>antiossidanti</strong>.<br />
L’<strong>in</strong>tensità del flusso “anomalo” di equivalenti<br />
riducenti verso l’ossigeno per generare specie chimiche<br />
di riduzione alternativa, non tetravalente, è<br />
notevole negli organi con attività metabolica elevata,<br />
quali i muscoli scheletrici, soprattutto nel corso<br />
di attività particolarmente impegnative per carico di<br />
lavoro e/o durata. Infatti, sembra che <strong>in</strong> condizioni<br />
di esercizio fisico strenuo la quota di ossigeno ridotto<br />
a ROS può raggiungere, nei muscoli, circa il 15%<br />
della quota resa disponibile dall’emoglob<strong>in</strong>a e poi<br />
dalla mioglob<strong>in</strong>a.<br />
Pertanto, un’attività fisica eccessiva, specialmente<br />
<strong>in</strong> soggetti non adeguatamente allenati, provoca<br />
come conseguenza diretta ed immediata una<br />
produzione elevata di ROS a livello mitocondriale.<br />
Se i sistemi di difesa <strong>antiossidanti</strong> localizzati a<br />
livello mitocondriale sono efficienti, il danno ossidativo<br />
può essere circoscritto.<br />
Se, tuttavia, le difese <strong>antiossidanti</strong>, messe a dura<br />
prova dallo shunt anomalo di elettroni, vengono<br />
superate, i ROS generati a livello delle creste mitocondriali<br />
possono attaccare virtualmente qualsiasi<br />
substrato organico e, <strong>in</strong> particolare, i lipidi e il DNA.<br />
La perossidazione dei lipidi provoca una progressiva<br />
riduzione dell’efficienza del processo di fosforilazione<br />
ossidativa con abbassamento dei livelli<br />
di ATP ed <strong>in</strong>cremento della concentrazione di nucleotidi<br />
e nucleosidi adenilici e dei loro prodotti di degradazione<br />
(vedi più avanti).<br />
D’altra parte, il DNA mitocondriale che, al contrario<br />
di quello nucleare, non possiede un rivestimento<br />
proteico, è facile preda del danno ossidativo<br />
con conseguenti alterazioni dell’espressione genica.<br />
Si <strong>in</strong>nesca, così, un circolo vizioso nel quale i<br />
ROS, prodotti <strong>in</strong> seguito ad attività fisica <strong>in</strong>congrua<br />
a livello della catena respiratoria, f<strong>in</strong>iscono con il
danneggiare i mitocondri stessi favorendo l’ulteriore<br />
“escape” di equivalenti riducenti e, qu<strong>in</strong>di, l’ulteriore<br />
produzione di specie chimiche reattive centrate<br />
sull’ossigeno.<br />
I mitocondri, comunque, non rappresentano<br />
l’unica sorgente di aumenatata produzione di ROS<br />
<strong>in</strong> seguito ad attività fisica eccessiva.<br />
Per esempio, numerose evidenze <strong>in</strong>dicano che<br />
l’esercizio strenuo riproduce nel muscolo scheletrico<br />
una condizione molto simile a quella osservata nel<br />
miocardio nel cosiddetto danno da ischemiariperfusione.<br />
Infatti, nel corso della contrazione muscolare,<br />
l’ATP è convertito <strong>in</strong> ADP + Pi e l’energia sviluppatasi<br />
da tale reazione viene sfruttata per compiere il<br />
lavoro meccanico, cioè la contrazione. L’ADP viene,<br />
qu<strong>in</strong>di, ri-fosforilato ad ATP sia attraverso la fosforilazione<br />
ossidativa che attraverso l’idrolisi delle riserve<br />
locali di creat<strong>in</strong>-P.<br />
Nel muscolo scheletrico sottoposto ad attività<br />
particolarmente <strong>in</strong>tensa e/prolungata, così come accade<br />
nel miocardio durante un’ischemia grave (es.<br />
<strong>in</strong>farto), la quantità di ossigeno diventa <strong>in</strong>sufficiente<br />
al fabbisogno cellulare, generando una condizione<br />
di parziale anaerobiosi (32).<br />
Una volta esaurite le riserve di creat<strong>in</strong>-P e di<br />
ATP, i mitocondri, non più <strong>in</strong> grado di rigenerare<br />
adeguate quantità di ATP, faviriscono l’accumulo di<br />
ADP e di AMP che, per via enzimatica, sono progressivamente<br />
degradati ad IMP, ipoxant<strong>in</strong>a e xant<strong>in</strong>a.<br />
Se il danno ossidativo cellulare è tale da <strong>in</strong>durre<br />
la conversione della xant<strong>in</strong>a deidrogenasi <strong>in</strong> xant<strong>in</strong>a<br />
ossidasi, quest’ultima catalizzerà la formazione di<br />
perossido d’idrogeno e di anione superossido, rispettivamente<br />
dall’ipoxant<strong>in</strong>a e dalla xant<strong>in</strong>a (32).<br />
Dal punto di vista biochimico, i prodotti primari<br />
dell’attacco dei ROS – generati sia a livello mitocondriale<br />
che nel citosol – sono i cosiddetti metaboliti<br />
reattivi dell’ossigeno (ROM), che comprendono varie<br />
specie chimiche, quali gli idroperossidi.<br />
Questi ultimi, sebbene relativamente stabili, <strong>in</strong><br />
presenza di metalli di transizione – liberatisi <strong>in</strong> seguito<br />
al danno ossidativo dai depositi <strong>in</strong>tracellulari –<br />
possono decomporsi generando specie radicaliche<br />
altamente reattive, quali l’alcossile e il perossile, che<br />
amplificano il danno a carico delle componenti strutturali<br />
della fibra muscolare scheletrica (prote<strong>in</strong>e<br />
contrattili, citoscheletro, membrane).<br />
In def<strong>in</strong>itiva, la compromissione della funzione<br />
mitocondriale, <strong>in</strong>sieme all’estensione dei processi<br />
radicalici a catena ad altre componenti cellulari, <strong>in</strong>nesca<br />
una serie di reazioni <strong>in</strong>desiderate il cui esito<br />
f<strong>in</strong>ale è la necrosi o l’apoptosi cellulare.<br />
Pertanto, lo stress ossidativo associato ad esercizio<br />
fisico eccessivo almeno due dei quattro meccanismi<br />
patogenetici fondamentali <strong>in</strong> precedenza<br />
analizzati: una ridotta efficienza della respirazione<br />
cellulare (stress ossidativo di tipo II) ed un abbas-<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
33<br />
samento della pressione parziale di ossigeno cellulare<br />
(stress ossidativo di tipo IV) (vedi tabella 3. 5).<br />
Tuttavia, l’aumentata produzione di ROS <strong>in</strong> seguito<br />
ad esercizio fisico strenuo rende i muscoli, i<br />
tend<strong>in</strong>i e le articolazioni particolarmente suscettibili<br />
alle lesioni traumatiche e da “overuse”, condizioni<br />
tutte legate all’attivazione di processi <strong>in</strong>fiammatori.<br />
Infatti, sottoprodotti del danno ossidativo cellulare<br />
possono attivare la NADPH ossidasi la lipoossigenasi<br />
localizzate a livello della plasmamembrana<br />
dei leucociti polimorfonucleati e dei macrofagi<br />
favorendo, rispettivamente, la produzione di anione<br />
superossido ed idroperossidi.<br />
Pertanto, accanto ai due meccanismi primari<br />
sopra postulati, lo stress ossidativo da attività fisica<br />
esagerata è da ricondursi, almeno, <strong>in</strong> parte ad<br />
un’attivazione della plasmembrana (stress ossidativo<br />
tipo I).<br />
Il danno ossidativo a carico dell’apparato muscoloscheletrico<br />
non si limita a danneggiare le cellule<br />
ma si estende anche alla matrice extracellulare<br />
propagandosi a distanza attraverso il sangue.<br />
Infatti, a livello degli spazi extracellulari, la<br />
mieloperossidasi leucocitaria, <strong>in</strong> presenza di cloruri,<br />
converte il perossido di idrogeno <strong>in</strong> acido ipocloroso;<br />
questo potente ossidante fisiologico è <strong>in</strong> grado<br />
di attaccare amm<strong>in</strong>oacidi, prote<strong>in</strong>e e nucleotidi generando<br />
come sottoprodotti del danno ossidativo le<br />
cloramm<strong>in</strong>e. Attraverso questo ed altri meccanismi<br />
l’acido ialuronico viene depolimerizzato favorendo la<br />
diffusione del processo <strong>in</strong>fiammatorio e di eventuali<br />
patogeni, il collageno forma legami crociati perdendo<br />
le sue proprietà meccaniche, le fibre elastiche<br />
vengono depolimerizzate e tutto ciò contribuisce al<br />
danno ossidativo delle componenti non muscolari<br />
dell’apparato locomotore (tend<strong>in</strong>i, legamenti,capsuile<br />
articolari, s<strong>in</strong>ovie, menischi) (32).<br />
D’altra parte, gli idroperossidi, generati<br />
dall’ossidazione ROS-mediata dei vari substrati organici<br />
(lipidi, prote<strong>in</strong>e, nucleotidi) sono prodotti potenzialmente<br />
lesivi che la cellula elim<strong>in</strong>a rilasciandoli<br />
nel sangue.<br />
Infatti, se <strong>in</strong> un particolare distretto, a causa<br />
dell’aumentata attività muscolare, viene a crearsi<br />
una condizione di relativa ipossia, le cellule <strong>in</strong>terssate<br />
attivano immediatamente il metabolismo anaerobio<br />
generando cataboliti acidi, quali il lattato.<br />
Quest’ultimo può <strong>in</strong>durre una transitoria riduzione<br />
del pH locale – acidosi – la quale, a sua volta, può<br />
favorire il rilascio di metalli di transizione – ferro e<br />
rame – dalle rispettive prote<strong>in</strong>e plasmatiche (transferr<strong>in</strong>a<br />
e ceruloplasm<strong>in</strong>a).<br />
Tali metalli catalizzeranno la scissione degli idroperossidi<br />
circolanti – derivanti dai processi ossidativi<br />
cellulari – <strong>in</strong> radicali alcossilici e perossilici, <strong>in</strong><br />
def<strong>in</strong>itiva responsabili dell’estensione del danno ossidativo<br />
a distanza, <strong>in</strong> larga misura mediato dal<br />
danno endoteliale sia diretto che <strong>in</strong>diretto (ossidazione<br />
delle lipoprote<strong>in</strong>e).
A causa della loro relativa stabilità molti ROM<br />
circolanti, tra cui gli idroperossidi e le cloramm<strong>in</strong>e,<br />
possono essere oggi quantificati attraverso il d-<br />
ROMs test. Quest’ultimo si basa sulla proprietà degli<br />
idroperossidi di generare <strong>in</strong> presenza di ioni ferro<br />
radicali alcossilici e idroperossilici. In questo senso,<br />
pertanto, gli idroperossidi presenti nei liquidi biologici<br />
vengono considerati non solo come marker pre-<br />
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività <strong>sport</strong>iva. Aspetti fisiopatologici e cl<strong>in</strong>ici.<br />
34<br />
coci ma anche come amplificatori del danno ossidativo<br />
tissutale. Anche i livelli di malonildialdeide<br />
(MDA) plasmatica o di pentano espirato forniscono<br />
<strong>in</strong>formazioni sul danno ossidativo cellulare, ma, al<br />
contrario degli idroperossidi, costituiscono <strong>in</strong>dicatori<br />
tardivi di danno ossidativo, positivizzandosi solo dopo<br />
che il sistema antiossidante (o riducente) locale<br />
si è completamente esaurito (vedi figura 3. 4).
1. Badwey JA, Karnovsky ML. Active oxygen species<br />
and the functions of phagocytic leukocytes.<br />
Ann Rev Biochem. 1980. 46: 695-726.<br />
2. Benzi G. Peroxidation, energy transduction and<br />
mitochondria dur<strong>in</strong>g ag<strong>in</strong>g. Editions John Libbey<br />
Eurotext, Paris. 1990. Pp. 53.<br />
3. Buonocore G, Zani S, Sargent<strong>in</strong>i I, Gioia D, Signor<strong>in</strong>i<br />
C, Bracci R. Hypoxia-<strong>in</strong>duced free iron<br />
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Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
Capitolo 4<br />
La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
4. 1 Premessa<br />
La valutazione <strong>dello</strong> stress ossidativo nei soggetti<br />
che praticano attività <strong>sport</strong>iva, a qualsiasi livello,<br />
amatoriale o professionale, è la condizione <strong>in</strong>dispensabile<br />
per prevenire il danno tissutale da ROS<br />
ed altre specie chimiche reattive e per monitorare<br />
l’andamento e la risposta al trattamento (specifico<br />
e/o antiossidante a quadro cl<strong>in</strong>ico conclamato (lesioni<br />
traumatiche, da overuse, <strong>in</strong>fiammazioni etc.)<br />
(1, 15, 24).<br />
Le tecniche di laboratorio disponibili per identificare<br />
e quantificare un marcatore biochimico <strong>in</strong> un<br />
campione biologico prevedono, generalmente, una<br />
fase di estrazione che consenta il passaggio<br />
dell’analita di <strong>in</strong>teresse dal materiale prelevato <strong>in</strong> un<br />
fluido con caratteristiche chimico-fisiche simili (per<br />
esempio estrazione dal siero dei lipoperossidi, sostanze<br />
liposolubili, <strong>in</strong> una soluzione cloroformiometanolo,<br />
<strong>in</strong> grado di sciogliere i grassi). Segue,<br />
poi, una fase di separazione più f<strong>in</strong>e, durante la<br />
quale l’estratto (lipidico o acquoso), grazie ad opportune<br />
tecniche cromatografiche (<strong>in</strong> fase gassosa<br />
o <strong>in</strong> fase liquida ad alta risoluzione, HPLC) viene risolto<br />
<strong>in</strong> una serie di frazioni. Inf<strong>in</strong>e, grazie,<br />
all’impiego di idonei metodi di rivelazione (spettrometria<br />
di massa, spettrofotometria, fluorimetria, potenziometria,<br />
ecc) è possibile identificare, grazie ad<br />
uno standard noto, <strong>in</strong> quale delle frazioni si trova<br />
l’analita di <strong>in</strong>teresse e, <strong>in</strong> def<strong>in</strong>itiva, precisarne, con<br />
ragionevole sicurezza, la natura e la concentrazione.<br />
Purtroppo, questa metodologia solo raramente<br />
è applicabile nella rout<strong>in</strong>e cl<strong>in</strong>ica quando l’obiettivo<br />
della valutazione è lo stress ossidativo. Infatti, i radicali<br />
<strong>liberi</strong> sono, per def<strong>in</strong>izione, specie chimiche<br />
estremamente reattive, a brevissima emivita, e<br />
l’unica tecnica <strong>in</strong> grado di evidenziarli è la spettroscopia<br />
di risonanza di sp<strong>in</strong> dell’elettrone (ESR o<br />
EPR) che, eseguita talvolta con particolari accorgimenti<br />
(metodi di sp<strong>in</strong> trap), costituisce il golden<br />
standard per valutazioni nel vivente (1, 17, 27).<br />
Sfortunatamente, però, l’ESR è una tecnica<br />
piuttosto complessa, richiede una strumentazione e<br />
delle professionalità non disponibili <strong>in</strong> tutti i laboratori,<br />
ed è particolarmente costosa, per cui viene<br />
utilizzata non per <strong>in</strong>dag<strong>in</strong>i di rout<strong>in</strong>e o studi di<br />
screen<strong>in</strong>g, quanto, piuttosto, per validare altri metodi<br />
di laboratorio, come accaduto, per esempio,<br />
proprio con il d-ROMs test (1).<br />
Anche quando correttamente eseguita, comunque,<br />
l’ESR fornisce <strong>in</strong>formazioni solo sulla componente<br />
pro-ossidante <strong>dello</strong> stress ossidativo e non su<br />
quella antiossidante. Si è ripetutamente sottol<strong>in</strong>ea-<br />
37<br />
to, <strong>in</strong>vece, che lo stress ossidativo è la conseguenza<br />
della rottura di un equilibrio tra produzione di specie<br />
reattive ed efficienza dei sistemi di difesa <strong>antiossidanti</strong>.<br />
Questo squilibrio porta ad un eccesso di metaboliti<br />
reattivi dell’ossigeno, quali, ad esempio, gli<br />
idroperossidi (ROOH) che, versati <strong>in</strong> circolo, vanno<br />
a costituire i marcatori e gli amplificatori del danno<br />
tissutale e, <strong>in</strong> def<strong>in</strong>itiva, i responsabili ultimi, <strong>in</strong>sieme<br />
ad altri prodotti di ossidazione, dell’<strong>in</strong>vecchiamento<br />
e delle patologie dell’apparato locomotore<br />
correlate con lo stress ossidativo (1, 11, 16, 23).<br />
Sulla base di queste considerazioni prelim<strong>in</strong>ari,<br />
è opportuno che la valutazione di laboratorio <strong>dello</strong><br />
stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport sia “globale”,<br />
cioè tenga conto sia della componente proossidante<br />
che di quella anti-ossidante, anche alla<br />
luce del ruolo, ampiamente documentato, dei ROM<br />
quali marcatori ed amplificatori del danno cellulare<br />
(7, 19) (figura 3. 9).<br />
In realtà, i test di laboratorio attualmente disponibili<br />
esplorano o la componente pro-ossidante<br />
(produzione di specie reattive) (1–3, 9, 18, 20, 22)<br />
o la componente anti-ossidante (attività antiossidante)<br />
<strong>dello</strong> stress ossidativo (4–6, 11–14, 26) (tabella<br />
4. 1).<br />
Tabella 4. 1 Comuni metodi di laboratorio<br />
per la valutazione <strong>dello</strong> stress ossidativo<br />
Status proossidante Status antiossidante<br />
d-ROMs test OXY-Adsorbent test<br />
TBAR (MDA) BAP<br />
Lipoperossidi TAS<br />
Isoprostani -SHp test<br />
Chemilum<strong>in</strong>escenza Dos. s<strong>in</strong>goli <strong>antiossidanti</strong><br />
Poichè, come si è detto, l’ESR non è utilizzabile<br />
di rout<strong>in</strong>e, la valutazione <strong>dello</strong> status pro-ossidante<br />
di un <strong>in</strong>dividuo viene abitualmente eseguita con una<br />
serie di metodiche che alcuni ricercatori hanno battezzato<br />
con il term<strong>in</strong>e di “f<strong>in</strong>gerpr<strong>in</strong>t<strong>in</strong>g” (impronta<br />
digitale) (21).<br />
Secondo questo approccio, l’esistenza <strong>in</strong> un organismo<br />
vivente di specie reattive, non altrimenti<br />
misurabili rout<strong>in</strong>ariamente, viene valutata attraverso<br />
la documentazione (nei tessuti e/o nei liquidi extracellulari)<br />
della presenza di specie molecolari variamente<br />
modificate dall’attacco dei radicali <strong>liberi</strong> (21).<br />
In tale contesto, poiché la perossidazione è uno<br />
dei più comuni meccanismi del danno <strong>in</strong>dotto dai<br />
ROS, il dosaggio degli idroperossidi fornisce<br />
un’<strong>in</strong>dicazione molto affidabile <strong>dello</strong> status proossidante<br />
di un <strong>in</strong>dividuo. E, più <strong>in</strong> generale, la do-
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
cumentazione nei fluidi biologici della presenza di<br />
idroperossidi, così come di MDA o di isoprostani,<br />
fornisce “l’impronta digitale” più o meno accurata e<br />
fedele della componente ossidante <strong>dello</strong> stress ossidativo<br />
di un <strong>in</strong>dividuo (8, 11, 20, 22, 23, 25).<br />
I test per la valutazione della componente antiossidante<br />
mirano generalmente a determ<strong>in</strong>are lo<br />
“spessore” o “potere” o “attività” della barriera antiossidante<br />
plasmatica nel suo complesso (4–6, 12–<br />
14, 26, 30) e, <strong>in</strong> alcuni casi specifici, a quantificarne<br />
alcune importanti componenti, quali ad esempio i<br />
gruppi tiolici o s<strong>in</strong>goli <strong>antiossidanti</strong> (es. ascorbato,<br />
tocoferoli) (10, 11).<br />
Tale valutazione si rende necessaria ogni qualvolta<br />
si sospetti una situazione di stress ossidativo<br />
(anche a fronte di valori normali o addirittura ridotti<br />
di test <strong>dello</strong> status proossidante) e, più <strong>in</strong> generale,<br />
ogni qualvolta si <strong>in</strong>tende monitorare una terapia antiossidante.<br />
Uno dei pannelli particolarmente utili nella valutazione<br />
globale <strong>dello</strong> stress ossidativo prevede la<br />
contemporanea determ<strong>in</strong>azione <strong>dello</strong> status proossidante,<br />
attraverso il d-ROMs test (1), e <strong>dello</strong> status<br />
antiossidante, attraverso il BAP test (ed eventuali<br />
altri metodi) (figura 4. 1).<br />
ATTIVITA’ FISICA INADEGUATA<br />
Aumentata produzione<br />
specie reattive<br />
d-ROMS TEST<br />
VALUTAZIONE GLOBALE<br />
DELLO STRESS OSSIDATIVO<br />
Compromissione<br />
barriera antiossidante<br />
BAP TEST<br />
PREVENZIONE DANNO OSSIDATIVO APPAR. MUSCOLO-<br />
SCHELETRICO E MONITORAGGIO TEARAPIA<br />
Figura 4. 1 Pannello per la valutazione globale <strong>dello</strong> stress ossidativo<br />
<strong>in</strong> medic<strong>in</strong>a <strong>sport</strong>iva<br />
In particolare, il d-ROMs test consente la determ<strong>in</strong>azione<br />
dei metaboliti reattivi dell’ossigeno (1,<br />
11), mentre il BAP test consente la valutazione<br />
dell’efficienza della barriera antiossidante plasmatica.<br />
Ambedue i test si basano sul pr<strong>in</strong>cipio della fotometria<br />
e possono essere effettuati, sia su sangue<br />
<strong>in</strong>tero che su plasma/siero, mediante o un comune<br />
fotometro, <strong>in</strong> qualsiasi laboratorio di analisi, oppure<br />
un’attrezzatura analitica dedicata (sistemi FRAS 4 e<br />
FREE), presso l’ambulatorio del medico <strong>sport</strong>ivo o <strong>in</strong><br />
palestra (7, 10, 19). Quest’ultimo rappresenta, <strong>in</strong>dubbiamente,<br />
un aspetto <strong>in</strong>dubbiamente <strong>in</strong>novativo<br />
e <strong>in</strong>teressante. Infatti, l’impiego di una strumentazione<br />
analitica dedicata di facile uso consente di<br />
giungere <strong>in</strong> tempo reale alla formulazione di un giudizio<br />
non solo generico di stress ossidativo ma di<br />
def<strong>in</strong>ire anche se all’orig<strong>in</strong>e di esso vi è un’eccessiva<br />
produzione di specie reattive (d-ROMs test) e/o una<br />
ridotta efficienza dei sistemi di difesa antiossidante<br />
a livello plasmatici (BAP test).<br />
38<br />
Esistono, ovviamente, numerosi altri test per<br />
questo tipo di valutazione, come <strong>in</strong>dicato <strong>in</strong> tabella<br />
1, ma è obiettivo di questo capitolo presentare il<br />
pr<strong>in</strong>cipio e le applicazioni <strong>in</strong> medic<strong>in</strong>a <strong>sport</strong>iva solo<br />
di questo pannello e, <strong>in</strong> particolare, del d-ROMs<br />
test. Laddove necessario, comunque, sono forniti<br />
elementi per una valutazione comparativa tra le diverse<br />
metodiche attualmente disponibili (es. il test<br />
della malonildialdeide ed il FRAP).<br />
4. 2 La valutazione <strong>dello</strong> status<br />
pro-ossidante: il d-ROMs test<br />
4. 2. 1 Pr<strong>in</strong>cipio<br />
Il d-ROMs test è un test fotometrico che, come<br />
<strong>in</strong>dica il nome, consente di determ<strong>in</strong>are, <strong>in</strong> un campione<br />
biologico, la concentrazione dei ROM (reactive<br />
oxygen metabolites) e, <strong>in</strong> particolare degli idroperossidi<br />
(ROOH), generati nelle cellule dall’attacco<br />
ossidativo dei ROS su svariati substrati biochimici<br />
(glicidi, lipidi, amm<strong>in</strong>oacidi, prote<strong>in</strong>e, nucleotidi<br />
ecc.) (1).<br />
Attraverso il d-ROMs test, i ROM contenuti <strong>in</strong> un<br />
campione biologico, quale, ad esempio, il siero, dopo<br />
aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano<br />
un derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile<br />
e quantificabile per via fotometrica (1).<br />
La concentrazione dei ROM, che correla direttamente<br />
con l’<strong>in</strong>tensità del colore rilevato, viene espressa<br />
<strong>in</strong> unità di concentrazione di facile impiego<br />
nella pratica cl<strong>in</strong>ica. Tali unità sono <strong>in</strong>dicate con la<br />
sigla U CARR dal cognome del chimico pient<strong>in</strong>o<br />
(Carratelli) che ha <strong>in</strong>ventato, brevettato e sviluppato<br />
il d-ROMs test (1).<br />
Alla base del d-ROMs test vi è un meccanismo<br />
già descritto a proposito dell’<strong>in</strong>nesco delle reazioni<br />
radicaliche a catena: l’<strong>in</strong>terazione con metalli di<br />
transizione (vedi capitolo 1).<br />
Il pr<strong>in</strong>cipio è quello del la reazione di Fenton,<br />
verificato per il perossido di idrogeno e successivamente<br />
ampliato da Haber e Weiss, secondo cui un<br />
metallo di transizione <strong>in</strong> forma ionica (es. ferro o<br />
rame) catalizza la scissione di un idroperossido<br />
(ROOH), generando nuove specie radicaliche, quali<br />
l’idroperossile (ROO • ) o l’alcossile (RO • ), a seconda<br />
che, rispettivamente, lo ione catalizzante si ossidi<br />
(Fe 2+ →Fe 3+ o Cu + →Cu 2+ ) oppure si riduca<br />
(Fe 3+ →Fe 2+ o Cu 2+ →Cu + ), secondo le reazioni:<br />
ROOH + Fe 2+ (Cu + ) → RO • + OH - + Fe 3+ (Cu 2+ )<br />
ROOH + Fe 3+ (Cu 2+ ) → ROO • + H + + Fe 2+ (Cu + )<br />
Se ad una soluzione contenente idroperossidi e<br />
tracce di un metallo di transizione <strong>in</strong> forma ionica si<br />
aggiunge una sostanza il cui potenziale di ossidazione<br />
è tale che i radicali generati dalla decomposizione<br />
degli idroperossidi stessi (alcossili e perossili)
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
possano strappare ad essa l’elettrone necessario<br />
per raggiungere la propria stabilità, tale sostanza<br />
sarà a sua volta radicalizzata, come previsto dalla<br />
seconda fase delle reazioni radicaliche a catena (reazione<br />
di trasferimento del sito radicalico, vedi capitolo<br />
1) (1).<br />
E’ ovvio che se la sostanza <strong>in</strong> questione ha la<br />
proprietà ottica di cambiare colore nel momento <strong>in</strong><br />
cui viene ossidata ed è sufficientemente stabile <strong>in</strong><br />
questa forma, sarà possibile, con le opportune tecniche<br />
fotometriche, risalirne alla concentrazione,<br />
che risulterà direttamente proporzionale a quella<br />
delle specie radicaliche generate <strong>in</strong> vitro e, <strong>in</strong> def<strong>in</strong>itiva,<br />
a quella degli idroperossidi <strong>in</strong>izialmente presenti<br />
nel campione analizzato (1).<br />
Nel d-ROMs test, dunque, gli idroperossidi contenuti<br />
<strong>in</strong> un campione biologico – per comodità espositiva,<br />
nel siero – vengono messi nelle condizioni<br />
previste dalla reazione di Fenton per generare <strong>in</strong><br />
vitro radicali idroperossilici ed alcossilici.<br />
In pratica, un’aliquota di siero viene diluita <strong>in</strong><br />
una soluzione tampone (acetato) a pH acido (4.8).<br />
In queste condizioni, il ferro ionico dapprima legato<br />
alle sieroprote<strong>in</strong>e, si rende disponibile <strong>in</strong> forma libera,<br />
catalizzando, <strong>in</strong> vitro, la scissione degli idroperossidi,<br />
<strong>in</strong>izialmente presenti nel campione di sangue,<br />
<strong>in</strong> radicali idroperossilici ed alcossilici.<br />
A questa soluzione viene, qu<strong>in</strong>di, aggiunta una<br />
sostanza (cromogeno) che ha la proprietà di cambiare<br />
colore nel momento <strong>in</strong> cui viene ossidata.<br />
Il cromogeno impiegato nel d-ROMs test è la<br />
N,N-dietil-parafenilendiamm<strong>in</strong>a, una sostanza <strong>in</strong>colore<br />
che la proprietà di conferire alla soluzione nella<br />
quale è disciolta un colore rosato quando, ossidandosi,<br />
cioè cedendo un elettrone, si trasforma nel radicale<br />
catione corrispondente (figura 4. 2) (1).<br />
CH 3 -CH 2<br />
N<br />
CH 3 -CH 2<br />
Base Base amm<strong>in</strong>ica<br />
amm<strong>in</strong>ica<br />
NH 2<br />
CH 3 -CH 2<br />
Idrogeno<br />
Carbonio<br />
Azoto<br />
Figura 4. 2 La N, N-dietil-parafenilendiamm<strong>in</strong>a,<br />
il substrato cromogeno del d-ROMs test<br />
NH 2<br />
Nel d-ROMs test l’ossidazione della N,Ndietilparafenilendiamm<strong>in</strong>a<br />
avviene ad opera dei radicali<br />
idroperossilici ed alcossilici. Il catione derivato<br />
dall’amm<strong>in</strong>a, colorato <strong>in</strong>m rosa, pur essendo un radicale,<br />
è abbastanza stabile per cui è possibile determ<strong>in</strong>arne<br />
la concentrazione per via fotometrica,<br />
nelle condizioni di lavoro previste (lunghezza d’onda<br />
505 0 546 nmetri) (1).<br />
Ovviamente, la concentrazione del complesso<br />
colorato sarà direttamente correlata con il livello di<br />
N<br />
+<br />
CH 3 -CH 2<br />
Radicale catione<br />
39<br />
idroperossidi <strong>in</strong>izialmente presenti nel campione da<br />
analizzare, secondo lo schema di reazioni:<br />
per i radicali alcossilici<br />
1) R–OOH + Fe 2+ → R–O • + Fe 3+ + OH -<br />
2) R–O • + A-NH2 → R–O - + [A–NH2 • ] +<br />
per i radicali perossilici<br />
1) R–OOH + Fe 3+ → R–OO • + Fe 2+ + H +<br />
2) R–OO • + A–NH 2 → R–OO - + [A–NH 2 • ] +<br />
dove:<br />
– R–OOH è un generico idroperossido<br />
– R–O • è il radicale alcossilico corrispondente<br />
– R–OO • è il radic. idroperossilico corrispondente<br />
– A–NH2 è la N, N-dietil-parafenilendiamm<strong>in</strong>a, cioè il<br />
substrato cromogeno (<strong>in</strong>colore) del d-ROMs test<br />
– [A–NH2 • ] + è il radicale catione, colorato, del substrato<br />
cromogeno.<br />
I risultati del d-ROMs test vengono espressi <strong>in</strong><br />
unità arbitrarie, le UNITA’ CARRATELLI o U CARR<br />
(dove 1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL), a<br />
causa dell’eterogeneità delle specie chimiche presenti<br />
<strong>in</strong>izialmente nel campione biologico da testare<br />
e per una serie di ragioni di ord<strong>in</strong>e pratico che verranno<br />
discusse <strong>in</strong> seguito (1).<br />
Il d-ROMs test è stato validato mediante tecnica<br />
ESR (1). Inoltre, sulla base dei dati f<strong>in</strong>ora pubblicati<br />
eseguiti con tecnica fotometrica, il d-ROMs test è<br />
risultato un test affidabile, <strong>in</strong> grado di fornire determ<strong>in</strong>azioni<br />
precise ed accurate, correlate con la<br />
concentrazione, sia <strong>in</strong> c<strong>in</strong>etica che <strong>in</strong> endpo<strong>in</strong>t, sia<br />
<strong>in</strong> soggetti normali che <strong>in</strong> pazienti affetti da svariate<br />
patologie (28, 29).<br />
4. 2. 2 Metodica<br />
Il d-ROMs test può essere eseguito sia su sangue<br />
<strong>in</strong>tero (sistema FRAS 4) sia su plasma/siero (sistema<br />
FREE). A scopo esemplificativo si riporta la<br />
metodica analitica generale su siero o plasma sottol<strong>in</strong>eando,<br />
tuttavia, che la procedura risulta estremamente<br />
semplificata con l’impiego della strumentazione<br />
dedicata, dotata di display auto-istruente<br />
(vedi appresso).<br />
Prima di procedere all’esecuzione dell’analisi, bisogna<br />
preparare lo standard (o calibratore), fornito<br />
direttamente col kit sotto forma di siero liofilo a matrice<br />
umana a titolo noto (U CARR), <strong>in</strong>dicato<br />
sull’etichetta.<br />
A questo scopo è sufficiente aggiungere al liofilizzato<br />
il volume di acqua distillata previsto (secondo<br />
le <strong>in</strong>dicazioni del produttore) e mescolare la soluzione<br />
così ottenuta con delicatezza (evitando di
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
formare schiuma, <strong>in</strong>dice <strong>in</strong>desiderato di denaturazione<br />
proteica all’<strong>in</strong>terfacie aria-liquido).<br />
Si suggerisce di attendere 10 m<strong>in</strong>uti e qu<strong>in</strong>di<br />
rimescolare la soluzione con le medesime precauzioni.<br />
In ogni caso, prima di eseguire il test è assolutamente<br />
<strong>in</strong>dispensabile assicurarsi che tutto il liofilizzato<br />
sia stato completamente disciolto.<br />
In queste condizioni, tra l’altro, la soluzione così<br />
ricostituita di calibratore può essere conservata a<br />
–20 °C ed è stabile per 6 mesi.<br />
Dopo aver portato i reagenti (R1, miscela cromogena,<br />
ed R2, soluzione tampone) alla temperatura<br />
di lavoro, si procede, qu<strong>in</strong>di, all’esecuzione del<br />
test.<br />
Nella procedura c<strong>in</strong>etica standard si parte preparando<br />
tre soluzioni: il bianco reagente, il campione<br />
(preferibilmente siero fresco) ed il calibratore,<br />
secondo lo schema riportato nella seguente tabella:<br />
Tabella 4. 2 Procedura analitica del d-ROMs test <strong>in</strong> c<strong>in</strong>etica<br />
Bianco reag. Campione Calibratore<br />
Reagente R1 10 µL 10 µL 10 µL<br />
Reagente R2 1 mL 1 mL 1 mL<br />
H2O distillata 10 µL – –<br />
Campione – 10 µL –<br />
Calibratore – – 10 µL<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente<br />
e lasciate ad <strong>in</strong>cubare a 37°C per 1 m<strong>in</strong>uto.<br />
Term<strong>in</strong>ata l’<strong>in</strong>cubazione, esse vanno sottoposte<br />
a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a<br />
505 nm (A505) o 546 nm (A505) immediatamente e<br />
successivamente, nelle stesse condizioni di lavoro<br />
(37°C), dopo 1, 2 e 3 m<strong>in</strong>. Ai valori di assorbanza<br />
ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae,<br />
qu<strong>in</strong>di, il valore di assorbanza del bianco reagente.<br />
I risultati del test saranno espressi <strong>in</strong> U<br />
CARR applicando la seguente formula:<br />
U CARR = ∆Abs/m<strong>in</strong> x F<br />
dove:<br />
• ∆Abs/m<strong>in</strong> sono le differenze medie dei valori di<br />
assorbanza misurati a 1, 2, 3 e 3 m<strong>in</strong>uti;<br />
• F è un fattore di correzione con un valore predeterm<strong>in</strong>ato.<br />
A questo punto è opportuno fare alcune precisazioni.<br />
Si è detto che i risultati del d-ROMs test,<br />
anche per l’eterogeneità delle specie chimiche valutabili<br />
con questo metodo (idroperossidi di derivazione<br />
cellulare e prodotti di ossidazione delle cloroamm<strong>in</strong>e),<br />
sono espressi <strong>in</strong> U CARR.<br />
Perché si è scelto di usare queste unità di misura<br />
“arbitrarie”? Per rispondere a questa domanda<br />
bisogna anticipare un dato sperimentale che sarà<br />
ampiamente discusso <strong>in</strong> seguito e cioè che, eseguendo<br />
il d-ROMs test su un campione piuttosto<br />
numeroso (circa 5.000) di soggetti apparentemente<br />
sani, si è visto che l’<strong>in</strong>cremento per m<strong>in</strong>uto dei valo-<br />
40<br />
ri di assorbanza a 505 nm (∆A505/m<strong>in</strong>) varia fra<br />
0.023 e 0.031, distribuendosi, nella popolazione<br />
testata, secondo un tipico profilo gaussiano.<br />
E’ evidente che l’impiego di tale notazione (terza<br />
cifra decimale) non consente un’immediata valutazione<br />
e, soprattutto, un’adeguata discrim<strong>in</strong>azione<br />
dei valori di concentrazione di idroperossidi da essa<br />
sottesa.<br />
Pertanto, per ovviare a questo problema di natura<br />
squisitamente pratica ed avere un range adeguatamente<br />
ampio di variazioni, si è stabilito di esprimere<br />
il risultato del d-ROMs test <strong>in</strong> unità convenzionali,<br />
le U CARR, appunto, che si ottengono<br />
moltiplicando la variazione di assorbanza registrata<br />
fotometricamente per un prestabilito fattore di correzione,<br />
il fattore F (generalmente compreso tra<br />
9.000 e 10.000).<br />
Va ribadito che tale operazione di “correzione”<br />
si rende necessaria esclusivamente per rendere più<br />
agevoli al medico – abituato a <strong>in</strong>terpretare valori,<br />
come quello del colesterolo, del range delle cent<strong>in</strong>aia<br />
di unità – la lettura e l’<strong>in</strong>terpretazione del test<br />
(che altrimenti sarebbero “appesantite” dall’impiego<br />
di una serie di cifre decimali).<br />
Negli strumenti dedicati, quali il FREE ed il<br />
FRAS, è possibile, via software, impostare il fattore<br />
di correzione sulla base dei risultati del d-ROMs test<br />
eseguito sul siero di controllo a titolo noto fornito<br />
dal produttore.<br />
Ad ogni modo, tuttavia, per avere una valutazione<br />
assoluta, è stato sperimentalmente stabilito<br />
che 1 U CARR corrisponde a 0.08 mg di H 2O 2/dL.<br />
Nella procedura endpo<strong>in</strong>t si parte preparando<br />
tre soluzioni: il bianco reagente, il campione (siero<br />
o plasma epar<strong>in</strong>ato) ed il calibratore, secondo lo<br />
schema riportato nella seguente tabella:<br />
Tabella 4. 3 Procedura analitica del d-ROMs test <strong>in</strong> endpo<strong>in</strong>t<br />
Bianco reagente Campione Calibratore<br />
Reagente R1 10 µL 10 µL 10 µL<br />
Reagente R2 1 mL 1 mL 1 mL<br />
H2O distillata 5 µL – –<br />
Campione – 5 µL –<br />
Calibratore – – 5 µL<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente<br />
e lasciate ad <strong>in</strong>cubare a 37°C per 75<br />
m<strong>in</strong>uti. Appena term<strong>in</strong>ata l’<strong>in</strong>cubazione, esse vanno<br />
sottoposte a lettura fotometrica, misurando<br />
l’assorbanza a 505 nm (A505) o 546 nm (A546). Ai valori<br />
di assorbanza ottenuti per il campione e per il<br />
calibratore si sottrae, qu<strong>in</strong>di, il valore di assorbanza<br />
del bianco reagente (azzeramento con bianco reagente).<br />
I risultati del test saranno espressi <strong>in</strong> U CARR<br />
applicando la seguente formula:<br />
Abs campione<br />
U CARR = Abs standard x [standard]<br />
dove:<br />
• Abs sono i valori di assorbanza misurati (per il<br />
campione e per lo standard);
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
• [standard ] è la concentrazione <strong>dello</strong> standard.<br />
Va aggiunto che gli strumenti dedicati (sistemi<br />
FREE e FRAS) sono programmati per eseguire<br />
l’analisi del d-ROMs test con appositi kit.<br />
Tuttavia, se si ha la necessità di dover effettuare<br />
il test su un comune fotometro o su un analizzatore<br />
multiplo, si può anche operare, <strong>in</strong> alternativa<br />
alle procedure descritte, con una miscela di lavoro<br />
realizzata mescolando il reagente R 1 (cromogeno)<br />
ed il reagente R 2 (tampone) nel rapporto di 1:100 e<br />
utilizzando il campione come “starter”.<br />
Tale miscela di lavoro ha il vantaggio di essere<br />
stabile per circa 12 ore (più che sufficienti per una<br />
seduta analitica), se conservata, ovviamente a 2-<br />
8°C e al riparo dalla luce.<br />
4. 2. 3 Interpretazione dei risultati<br />
La disponibilità di una metodica precisa ed affidabile<br />
ha consentito di stabilire i livelli di riferimento<br />
del d-ROMs nella popolazione normale.<br />
Si è potuto dimostrare, su un campione di circa<br />
5.000 soggetti cl<strong>in</strong>icamente sani (figura 5. 6), che i<br />
valori del test seguono nella popolazione una distribuzione<br />
unimodale, con un picco tra 250 e 300 U<br />
CARR (pari a 20.08-24.00 mg/dL di H2O2), <strong>in</strong>dividuato<br />
come il valore di riferimento del test (1).<br />
Serie<br />
-<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
13<br />
14<br />
15<br />
Intervalli<br />
(U CARR)<br />
200-210<br />
211-220<br />
221-230<br />
231-240<br />
241-250<br />
251-260<br />
261-270<br />
271-280<br />
281-290<br />
291-300<br />
300-310<br />
311-320<br />
321-330<br />
331-340<br />
341-350<br />
Totale<br />
Intervalli<br />
(mg H O /dL) 2 2<br />
16.00-16.80<br />
16.88-17.60<br />
17.68-18.40<br />
18.48-19.20<br />
19.28-20.00<br />
20.08-20.80<br />
20.88-21.60<br />
21.68-22.40<br />
22.48-23.20<br />
23.28-24.00<br />
24.08-24.80<br />
24.88-25.60<br />
25.68-25.40<br />
25.48-27.20<br />
27.28-28.00<br />
Frequenze<br />
Figura 4. 3 Valori del d-ROMs test <strong>in</strong> un campione<br />
di soggetti adulti cl<strong>in</strong>icamente sani<br />
Ovviamente, valori superiori a questo <strong>in</strong>tervallo,<br />
dopo una fascia borderl<strong>in</strong>e <strong>in</strong>dicano livelli crescenti<br />
di stress ossidativo (tabella 5. 5).<br />
Tabella 4. 4 Gravità <strong>dello</strong> stress ossidativo (SO)<br />
sulla base dei valori del d-ROMs test<br />
ROM ROM Stress ossidativo<br />
(U CARR) (mg H2O2/dL) (gravità)<br />
300-320 24.08-25.60 Condizione border-l<strong>in</strong>e<br />
321-340 25.68-27.20 Stress ossidativo lieve<br />
341-400 27.28-32.00 Stress ossidativo medio<br />
401-500 32.08-40.00 Stress ossidativo elevato<br />
>500 >40.00 Stress ossidativo elevatissimo<br />
Range normale: 250-300 U CARR<br />
1 U CARR corrisponde a 0.08 mg H 2O 2/dL<br />
Per completezza, va aggiunto che i valori riportati<br />
si riferiscono alla popolazione italiana e non è<br />
escluso che vi possano essere delle oscillazioni <strong>in</strong><br />
eccesso o <strong>in</strong> difetto <strong>in</strong> funzione di particolarità razziali.<br />
Si è osservato che i risultati del d-ROMs test<br />
non sono significativamente <strong>in</strong>fluenzati né dal sesso<br />
(n)<br />
29<br />
89<br />
193<br />
244<br />
342<br />
547<br />
659<br />
731<br />
654<br />
491<br />
256<br />
162<br />
80<br />
57<br />
13<br />
4547<br />
Dati cumulativi<br />
(%)<br />
0.6<br />
2.6<br />
6.8<br />
12.2<br />
19.7<br />
31.8<br />
46.3<br />
62.3<br />
76.7<br />
87.5<br />
93.1<br />
96.7<br />
98.5<br />
99.7<br />
100.0<br />
100.0<br />
41<br />
né dall’età. Tuttavia, i neonati, <strong>in</strong>dipendentemente<br />
dal sesso e dalle modalità del parto, possiedono livelli<br />
ematici di idroperossidi significativamente <strong>in</strong>feriori<br />
a quelli riscontrati negli adulti; questa differenza<br />
probabilmente riflette la diversa risposta<br />
all’ipossia dei neonati.<br />
Viceversa, la gestazione si associa a valori del<br />
d-ROMs test mediamente più alti rispetto a quelli<br />
osservati nelle donne non gravide.<br />
I risultati del d-ROMs test eseguito ripetutamente<br />
nello stesso soggetto nell’arco della giornata<br />
non mostrano differenze degne di nota, a meno che<br />
non <strong>in</strong>tervengano fattori <strong>in</strong> grado di <strong>in</strong>durre una<br />
brusca produzione di perossidi (es. uno sforzo muscolare<br />
<strong>in</strong>tenso).<br />
Inf<strong>in</strong>e, non sono state riscontrate differenze significative<br />
nei risultati del d-ROMs test quando il<br />
prelievo viene effettuato su sangue arterioso o su<br />
sangue venoso.<br />
4. 2. 4 Valutazioni comparative<br />
Il d-ROMs test è un test unico nel suo genere.<br />
Tuttavia un confronto parziale è possibile con il test<br />
della MDA, con quello dei lipoperossidi e con il dosaggio<br />
degli isoprostani.<br />
La MDA (malonilaldeide o malonildialdeide,<br />
CHO-CH2-CHO) rappresenta uno dei prodotti f<strong>in</strong>ali<br />
della catena di reazioni <strong>in</strong>nescata nelle membrane<br />
cellulari dall'attacco ossidativo, da parte di alcuni<br />
radicali <strong>liberi</strong> dell'ossigeno (quali il radicale idrossile),<br />
degli acidi grassi poli<strong>in</strong>saturi (quali l'acido arachidonico,<br />
costituente appunto dei fosfolipidi di<br />
membrana).<br />
Questa catena di reazioni, nel caso specifico<br />
dell'acido arachidonico, ha come specie chimica<br />
"chiave" dell'<strong>in</strong>tero processo il radicale perossido.<br />
Quest'ultimo, <strong>in</strong>fatti, è posto al "bivio" di due possibili<br />
metabolici, <strong>in</strong> quanto può essere convertito <strong>in</strong><br />
idroperossido (mediante acquisizione di un H) oppure<br />
"imboccare" la via dei perossidi ciclici che, <strong>in</strong> seguito<br />
ad ulteriori attacchi ossidativi, porta ad una<br />
serie di prodotti term<strong>in</strong>ali, tra i quali la MDA. Questi<br />
ulteriori "attacchi ossidativi" e, qu<strong>in</strong>di, la formazione<br />
di MDA, si realizzano grazie al superamento delle<br />
"difese" <strong>antiossidanti</strong> del medium nel quale avviene<br />
il processo ossidativo stesso.<br />
Pertanto, anche la presenza di MDA nei liquidi<br />
biologici sarà rilevabile solo quando tutto il sistema<br />
antiossidante endogeno del medium <strong>in</strong> cui è avvenuto<br />
l'attacco ossidativo si è esaurito.<br />
Sulla base di queste considerazioni, si ev<strong>in</strong>ce che la<br />
MDA, prodotto quasi "term<strong>in</strong>ale" dell'ossidazione di<br />
vari substrati biologici, quali gli acidi grassi poli<strong>in</strong>saturi<br />
di membrana, rappresenta un <strong>in</strong>dicatore piuttosto<br />
tardivo di stress ossidativo. Pertanto, uno dei<br />
maggiori svantaggi dei test basati sulla determ<strong>in</strong>azione<br />
della MDA è relativo al fatto che essi non<br />
sempre sono <strong>in</strong> grado di poter svelare precocemente<br />
uno stato ossidativo alterato.
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
Viceversa, il d-ROMs test si basa sulla determ<strong>in</strong>azione<br />
del livello di idroperossidi, l'altra classe di<br />
composti che può formarsi a partire dal radicale perossido<br />
(specie chimica "chiave" della catena di reazione<br />
che porta all'ossidazione degli acidi grassi poli<strong>in</strong>saturi<br />
di membrana). Al contrario della MDA, gli<br />
idroperossidi sono composti che si formano precocemente<br />
nella sequenza di reazioni ossidative dei<br />
lipidi di membrana, sono relativamente stabili e,<br />
conservando ancora una discreta capacità ossidante,<br />
possono essere rilevati grazie ad un adeguato<br />
sistema redox (come quello della N,N-dietilparafenilendiamm<strong>in</strong>a<br />
del d-ROMs test). Pertanto,<br />
rispetto ai test che valutano la MDA, il d-ROMs test<br />
è <strong>in</strong> grado di svelare più precocemente stati ossidativi<br />
alterati, con enormi vantaggi sul piano cl<strong>in</strong>ico <strong>in</strong><br />
term<strong>in</strong>i di prevenzione e monitoraggio terapeutico.<br />
Inoltre, come riportato più volte <strong>in</strong> letteratura,<br />
la MDA va <strong>in</strong>contro a molte reazioni secondarie che<br />
riducono l'accuratezza dei risultati ottenuti; <strong>in</strong>fatti,<br />
<strong>in</strong> quanto reattivo bifunzionale (doppio gruppo aldeidico<br />
CHO) la MDA può formare legami crociati<br />
con prote<strong>in</strong>e o nucleotidi (dando luogo alla formazione<br />
di basi di Shiff) e può essere degradata dal<br />
perossido di idrogeno o ossidata da perossidasi e<br />
xant<strong>in</strong>aossidasi.<br />
Anche come marcatore di perossidazione lipidica<br />
la MDA si mostra scarsamente specifica; <strong>in</strong>fatti,<br />
essa è stata identificata fra i prodotti di decomposizione<br />
ossidativa di amm<strong>in</strong>oacidi, di carboidrati e di<br />
prostagland<strong>in</strong>e.<br />
Inf<strong>in</strong>e, la MDA può essere anche un prodotto di<br />
ossidazione dell'acido ascorbico, e ciò rende <strong>in</strong>utilizzabile<br />
il suo dosaggio ai f<strong>in</strong>i di un eventuale monitoraggio<br />
terapeutico <strong>in</strong> corso di trattamenti <strong>antiossidanti</strong>.<br />
Viceversa, come dimostrano i numerosi studi<br />
pubblicati sull’argomento, il d-ROMs test è stato impiegato<br />
con successo nel monitoraggio terapeutico<br />
sia <strong>in</strong> corso di trattamenti <strong>antiossidanti</strong> che <strong>in</strong> corso<br />
di trattamenti farmacologici specifici.<br />
Per quanto riguarda i test di lipoperossidazione,<br />
esistono <strong>in</strong> commercio vari test etichettati come "Lipid<br />
hydroperoxide assay kit".<br />
Tali test presentano una serie di svantaggi, <strong>in</strong><br />
quanto prevedono spesso una fase di deprote<strong>in</strong>izzazione<br />
e di estrazione; <strong>in</strong>oltre, richiedono tempi lunghi<br />
(circa 30 m<strong>in</strong>uti <strong>in</strong> tutto) e forniscono un'<strong>in</strong>formazione<br />
molto limitata, <strong>in</strong> quanto gli idroperossidi<br />
lipidici costituiscono solo una classe degli idroperossidi<br />
totali.<br />
Viceversa, il d-ROMs test, non prevede alcun<br />
pretrattamento del campione biologico (se non la<br />
centrifugazione se si parte da sangue <strong>in</strong>tero), è rapido<br />
(<strong>in</strong> c<strong>in</strong>etica, richiede non più di 3 m<strong>in</strong>uti) e, soprattutto,<br />
fornisce un'<strong>in</strong>dicazione globale sullo stato<br />
ossidante del sistema biologico testato, <strong>in</strong> quanto<br />
consente di dosare tutti gli idroperossidi (anche<br />
quelli derivati dal processo di ossidazione di altri<br />
42<br />
substrati, non solo lipidici, quali ad esempio amm<strong>in</strong>oacidi,<br />
peptidi, ecc.).<br />
Inf<strong>in</strong>e, il dosaggio dell’8-isoprostano a livello<br />
plasmatico viene generalmente effettuato mediante<br />
metodica immunoenzimatica. Due gli svantaggi segnalati:<br />
la possibile cross-reattività <strong>in</strong> fase analitica<br />
e l’<strong>in</strong>formazione limitata a condizioni di stress ossidativo<br />
su base disrfeattiva .<br />
Ad ogni modo occorre segnalare che <strong>in</strong> un recente<br />
studio comparativo, l’analisi di regressione ha<br />
mostrato una correlazione diretta fra la concentrazione<br />
plasmatica di 8-isoprostano e i valori del d-<br />
ROMs (r=0.68; p
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
ecc.). Inoltre, non è stata segnalata alcuna <strong>in</strong>terazione<br />
apparente fra <strong>antiossidanti</strong>.<br />
Nel BAP test il “cromogeno” impiegato è il tiocianato,<br />
una sostanza <strong>in</strong> grado di legarsi agli ioni<br />
ferrici formando un complesso colorato che assorbe<br />
a 505 nm. Nel momento <strong>in</strong> cui tali ioni ferrici sono<br />
ridotti a ioni ferrosi il suddetto complesso si decolora.<br />
Dopo una breve <strong>in</strong>cubazione a 37°C, valutando<br />
per via fotometrica l’entità della decolorazione, sarà<br />
possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e,<br />
<strong>in</strong> def<strong>in</strong>itiva, alla capacità riducente, ossia al potere<br />
antiossidante del plasma testato. Tale potere non è<br />
da <strong>in</strong>tendersi <strong>in</strong> senso assoluto, ma relativo, ovviamente,<br />
al substrato testato, cioè gli ioni ferrici.<br />
Considerando che tali ioni sono già presenti naturalmente<br />
nel nostro organismo, il BAP test fornisce<br />
una misura attendibile del potenziale antiossidante<br />
di quella frazione della barriera plasmatica<br />
all’ossidazione direttamente implicata, per i potenziali<br />
redox <strong>in</strong> gioco, nella difesa contro l’attacco dei<br />
radicali <strong>liberi</strong> <strong>in</strong> condizioni “fisiologiche”.<br />
4. 3. 2 Metodica<br />
Il BAP test può essere eseguito su siero o plasma<br />
(anche epar<strong>in</strong>izzato) nelle seguenti condizioni<br />
di lavoro: lunghezza d’onda 505 nm, camm<strong>in</strong>o ottico<br />
1 cm, temperatura 37°C, modalità differenziale.<br />
Prima di procedere all’esecuzione del test bisogna<br />
preparare il calibratore, fornito nel kit sotto<br />
forma di siero liofilo a matrice umana a titolo noto,<br />
<strong>in</strong>dicato sull’etichetta.<br />
A questo scopo è sufficiente aggiungere 2 mL di<br />
acqua distillata al liofilizzato e mescolare la soluzione<br />
così ottenuta con delicatezza, avendo cura di attenersi<br />
alle <strong>in</strong>dicazioni di carattere generale descritte<br />
<strong>in</strong> dettaglio a proposito del d-ROMs test.<br />
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di<br />
lavoro, si preparano tre soluzioni: il bianco reagente,<br />
il campione ed il calibratore, secondo la procedura<br />
<strong>in</strong>dicata nella seguente tabella:<br />
Tabella 4. 5 Procedura analitica del BAP test<br />
Bianco reag. Campione Calibratore<br />
Reagente R1 1 mL 1 mL 1 mL<br />
Reagente R2 50 µL 50 µL 50 µL<br />
H2O distillata 10 µL – –<br />
Campione – 10 µL –<br />
Calibratore – – 10 µL<br />
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente<br />
e lasciate ad <strong>in</strong>cubare a 37°C per 5 m<strong>in</strong>uti.<br />
Term<strong>in</strong>ata l’<strong>in</strong>cubazione, esse vanno sottoposte<br />
a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a<br />
505 nm, dopo aver azzerato con acqua distillata.<br />
Il potenziale biologico antiossidante del plasma<br />
viene espresso <strong>in</strong> µmol/L di sostanze <strong>antiossidanti</strong><br />
come la Vitam<strong>in</strong>a C, secondo la formula:<br />
[Abs bianco reagente Abs campione]<br />
[Abs bianco reagente Abs calibratore]<br />
dove:<br />
• ABS è l’assorbanza misurata a 505 nm<br />
x [calibratore]<br />
43<br />
• [calibratore] è la concentrazione del calibratore<br />
espressa <strong>in</strong> µmoli/L.<br />
4. 3. 3 Interpretazione dei risultati<br />
Il valore ottimale stimato del BAP test negli <strong>in</strong>dividui<br />
normali è superiore a 2200 µmoli/L. E’ buona<br />
prassi, comunque, che ogni laboratorio determ<strong>in</strong>i<br />
l’ampiezza di oscillazione della variabilità biologica<br />
eseguendo un congruo numero di test su soggetti<br />
normali.<br />
In ogni caso, una riduzione dei valori del<br />
test al di sotto dell’<strong>in</strong>tervallo <strong>in</strong>dicato appare direttamente<br />
correlata con una ridotta efficienza della<br />
barriera antiossidante plasmatica (tabella 4. 6).<br />
Tabella 4. 6 Gravità <strong>dello</strong> stress ossidativo<br />
<strong>in</strong> rapporto ai valori forniti dal BAP test<br />
µmoli di sostanze anti- Grado di compromissione<br />
ossidanti/mL di campione della barriera antiossidante<br />
2200 – 2000 Condizione border-l<strong>in</strong>e<br />
2000 – 1800 Compromissione lieve<br />
1800 – 1600 Compromissione di medio grado<br />
1600 – 1400 Compromissione di elevato grado<br />
< 1400 Gravissima compromissione<br />
Valore ottimale: >2200 µmoli/L<br />
4. 3. 4 Valutazioni comparative<br />
Il test per la valutazione antiossidante con il<br />
quale il BAP test può essere confrontato è il cosiddetto<br />
FRAP test. Un confronto, tuttavia, <strong>in</strong> l<strong>in</strong>ea teorica,<br />
è possibile anche con il TAS.<br />
Il FRAP test, come <strong>in</strong>dica la sigla – che sta per<br />
Ferric Reduc<strong>in</strong>g Activity of Plasma – valuta l’attività<br />
antiossidante del plasma come attività ferroriducente.<br />
Pertanto, il suo pr<strong>in</strong>cipio è molto simile a<br />
quello del BAP test.<br />
Infatti, il FRAP test si basa sulla riduzione del<br />
complesso tripiridiltriaz<strong>in</strong>a-ferrica (Fe III -TPTZ) a tripiridiltriaz<strong>in</strong>a-ferrosa<br />
(Fe II -TPTZ), la quale sviluppa<br />
un <strong>in</strong>tenso colore blu, misurabile fotometricamente<br />
con massimo di assorbimento a 593 nm. La calibrazione<br />
può essere eseguita mediante soluzioni a concentrazioni<br />
note di Fe II (FeSO4 . 7H2O).<br />
Analogamente, il BAP test si basa sull’impiego di<br />
una soluzione colorata ottenuta aggiungendo una<br />
fonte di ioni ferrici ad una miscela cromogena.<br />
L’entità della decolorazione – valutata fotometriamente<br />
a 505 nm – è proporzionale all’attività ferroriducente<br />
del campione.<br />
Sulla base di queste osservazioni, Vassalle (dati<br />
non pubblicati) ha recentemente confrontato le prestazioni<br />
analitiche del BAP test con quelle del FRAP<br />
test su 18 campioni di plasma umano.<br />
I valori medi (± DS) del BAP test è risultato pari<br />
a 3163±770 µmol/L contro 521±132 µmol/L del<br />
FRAP test.<br />
La correlazione tra i due test è risultata accettabile<br />
<strong>in</strong> 16/18 campioni testati (88.89%).<br />
I rimanenti due non hanno mostrato una buona<br />
correlazione, probabilmente per i più elevati livelli di<br />
lipidi plasmatici che possono <strong>in</strong>terferire con le letture<br />
fotometriche del BAP test (figura 4. 1).
FRAP test (µmol/L)<br />
FRAP (µµmol/l)<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
0<br />
1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500<br />
BAP test (µmol/L)<br />
Figure 4.4. BAP test vs. FRAP: valutazione comparativa<br />
Per quanto riguarda il TAS (Total Antioxidant<br />
Status, Randox, Cruml<strong>in</strong>, UK), l’<strong>in</strong>cubazione con<br />
un’attività perossidasica (met-mioglob<strong>in</strong>a)<br />
dell’ABTS ® trasforma quest’ultimo nel radicale catione<br />
corrispondente (ABTS •+® ), il quale assume un<br />
colore blu-verde, rilevabile fotometricamente a 600<br />
nm, a 37 °C. L’aggiunta di <strong>antiossidanti</strong> provocherà<br />
una decolorazione della miscela cromogena. La<br />
concentrazione di <strong>antiossidanti</strong> nel campione sarà<br />
direttamente proporzionale all’entità della decolorazione.<br />
I risultati del test sono espressi <strong>in</strong> mmol/L.<br />
Attualmente, non esistono ancora dati pubblicati<br />
di confronto fra BAP test e TAS. Tuttavia, osservazioni<br />
prelim<strong>in</strong>ari suggeriscono che il BAP test –<br />
rispetto al TAS – presenta una migliore standardizzazione<br />
per l’impiego cl<strong>in</strong>ico rout<strong>in</strong>ario. Infatti, il<br />
BAP test è stato applicato con successo a strumenti<br />
dedicati, quali il FRAS 4, partendo anche da una<br />
piccola quantità di sangue <strong>in</strong>tero. Pertanto, il BAP è<br />
un test affidabile, eseguibile anche nell’ambulatorio<br />
medico o <strong>in</strong> un centro fitness, <strong>in</strong> grado di fornire risultati<br />
<strong>in</strong> term<strong>in</strong>i reali.<br />
Il TAS, <strong>in</strong>vece, va eseguito <strong>in</strong> laboratori di analisi<br />
specializzati, con prolungamento dei tempi di attesa<br />
delle risposte. Inoltre, il TAS fornisce una valutazione<br />
dell’<strong>in</strong>tero “arsenale” antiossidante del plasma,<br />
compresi i cosiddetti “shock-adsorbers”. Questi<br />
ultimi comprendono, per esempio, le prote<strong>in</strong>e<br />
plasmatiche, le quali, sebbene contribuiscano <strong>in</strong><br />
qualche modo all’attività antiossidante (es. mediante<br />
la chelazione di metalli di transizione), sono entità<br />
chimiche riducenti aspecifiche. In altre parole, il<br />
loro livello può anche essere relativamente <strong>in</strong>dipendente<br />
dal “reale” stato antiossidante del plasma o<br />
da eventuali trattamenti farmacologici <strong>antiossidanti</strong><br />
<strong>in</strong> corso. Pertanto, <strong>in</strong> talune situazioni di iperprote<strong>in</strong>emia,<br />
quali il mielosa multiplo o plasmocitoma,<br />
un aumento del TAS può non essere necessariamente<br />
correlato con aumentato livello di attività<br />
antiossidante plasmatica.<br />
Al contrario, il BAP test consente di quantificare<br />
il potenziale riducente “reale”, cioè solo que componenti<br />
della barriera antiossidante plasmatica – es.<br />
vitam<strong>in</strong>e e sostanze simil-vitam<strong>in</strong>iche – che sono<br />
“fisiologicamente” co<strong>in</strong>volte nella difesa contro le<br />
44<br />
specie chimiche reattive ed il cui livello può essere<br />
direttamente modificato dalle terapie <strong>antiossidanti</strong>.<br />
Pertanto, sebbene studi sull’argomento siano<br />
ancora <strong>in</strong> corso, il BAP test sembra fornire, rispetto<br />
al TAS, un parametro più efficace per valutare il vero<br />
stato antiossidante e più utile per monitorare eventuali<br />
trattamenti <strong>antiossidanti</strong>.
Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
1. Alberti A, Bologn<strong>in</strong>i L, Macciantelli D, Carratelli<br />
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Capitolo 4. La valutazione biochimica <strong>dello</strong> stress ossidativo <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport<br />
46<br />
for the detection of hydroperoxides <strong>in</strong> serum.<br />
Panm<strong>in</strong>erva Med 2002. 44 (1): 37-40.<br />
29. Trotti R. Carratelli M, Barbieri M, Micieli G, Bosone<br />
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Medic<strong>in</strong>e. 2004. 42 (1): 84-89.<br />
N. B. Per una trattazione dettagliata ed esaustiva, completa di riferimenti bibliografici aggiornati, sul d-ROMs<br />
richiedere all’Autore le review: 1) The d-ROMs test: validation, analytical performances and cl<strong>in</strong>ical applications;<br />
2) Validation, usefulness, and <strong>in</strong>dications of the DIACRON INTERNATIONAL panel (d-ROMs test, OXYadsorbent<br />
test, -SHp test, BAP test) <strong>in</strong> global assessment of oxidative stress <strong>in</strong> humans and animals.
Capitolo 5. Il d-ROMs test <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport. Rassegna di studi cl<strong>in</strong>ici<br />
Capitolo 5<br />
Il d-ROMs test <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport. Rassegna di studi cl<strong>in</strong>ici.<br />
5. 1 Premessa<br />
L’attività fisica sembra essere al centro di un<br />
nuovo “paradosso” scientifico, dopo quello francese,<br />
“il paradosso <strong>dello</strong> <strong>sport</strong>”; <strong>in</strong>fatti, a seconda di come<br />
viene svolta, essa può essere sia potente arma preventiva<br />
che causa di patologia (10).<br />
Così, se una corretta attività <strong>sport</strong>iva migliora la<br />
qualità della vita e contribuisce a ridurre la morbilità<br />
e la mortalità per cardiovasculopatie, tumori e numerose<br />
malattie cronico-degenerative, un esercizio<br />
fisico <strong>in</strong>congruo altera il normale bilancio ossidativo,<br />
predisponendo all’<strong>in</strong>vecchiamento precoce alle patologie<br />
da stress ossidativo, alle quali si è tatto cenni<br />
nei precedenti capitoli (2).<br />
Quando si parla di esercisio fisico <strong>in</strong>congruo,<br />
ovviamente, ci si riferisce sia alla carenza che<br />
all’eccesso di attività.<br />
Per esempio, la vita sedentaria favorisce il sovrappeso<br />
e l’obesità, condizioni, entrambe, che tendono<br />
ad associarsi a livelli mediamente più elevati<br />
di ROM nel siero rispetto a quanto riscontrato nei<br />
soggetti normopeso.<br />
A questo proposito, uno studio comparativo ha<br />
dimostrato che un <strong>in</strong>dice di massa corporea (BMI)<br />
superiore a 30, una condizione che corrisponde ad<br />
un’obesità di I° grado secondo la classificazione<br />
dell’OMS, si associa a valori del d-ROMs test significamene<br />
più elevati di quelli rilevati nel gruppo normopeso<br />
di controllo (BMI 350* >28.00*<br />
Un’ora dopo sforzo massimale<br />
(soggetti non allenati)<br />
10 > 350* > 28.00*<br />
Un’ora dopo sforzo massimale<br />
10 < 300** < 24**<br />
(soggetti allenati)<br />
(1) Test al cicloergometro *Nessuno dei soggetti reclutati aveva<br />
livelli <strong>in</strong>feriori a 350 U CARR (28.00 H2O2/dL). ** Nessuno dei<br />
soggetti reclutati aveva livelli superiori a 300 U CARR (24.00 mg<br />
H2O2/dL).<br />
Risultati analoghi sono stati riscontrati <strong>in</strong> uno<br />
studio condotto su 10 volontari sottoposti allo stesso<br />
test f<strong>in</strong>o alla comparsa di crampi o dolori muscolari<br />
(5).<br />
Questi dati suggeriscono che l’esecuzione regolare<br />
del d-ROMs test può essere utile nel “calibrare”<br />
l’allenamento e rendere possibili sforzi muscolari più<br />
prolungati agli atleti senza aumentare il rischio di<br />
lesioni da radicali <strong>liberi</strong>.<br />
5. 3 Football<br />
Alcuni studi hanno valutato il livello sierico di<br />
ROM nel corso di un’<strong>in</strong>tera stagione di football (6, 7,<br />
11). Fra questi degno di nota quello eseguito su 26<br />
calciatori del Bologna, nel momento <strong>in</strong> cui la squadra<br />
era iscritta alla massima categoria del torneo<br />
professionale italiano (7).
Per ciascun atleta, sottoposto a regime di allenamento<br />
<strong>in</strong>tenso, sono stati eseguiti c<strong>in</strong>que prelievi<br />
di sangue ed altrettante determ<strong>in</strong>azioni del livello<br />
dei ROM, all’<strong>in</strong>izio della stagione, e nelle settimane<br />
successive, a cadenza regolare (tabella 5. 2).<br />
Tabella 5. 2 Valori medi del d-ROMs test nei calciatori del Bologna<br />
nel corso di una <strong>in</strong>tera stagione agonistica<br />
Atleti Determ<strong>in</strong>azioni d-ROMs test* Range<br />
26 120 258 ± 37.9 160-376<br />
U CARR (valore medio ± DS)<br />
Il livello di ROM è risultato ≥ 300 U CARR <strong>in</strong><br />
26/120 (22%) determ<strong>in</strong>azioni. Un livello di ROM ≥<br />
300 U CARR, almeno una volta, è stato osservato <strong>in</strong><br />
10/27 (37%) atleti (2/10 su 4 casi, 2/10 su 3, 4/10<br />
due volte; 2/10 una volta; <strong>in</strong> nessuno <strong>in</strong> maniera<br />
persistente). Nel corso della stagione agonistica, la<br />
tendenza si è dimostrata stabile verso elevati livelli<br />
di ROM <strong>in</strong> 3/20 prelievi, stabile su livelli border-l<strong>in</strong>e<br />
<strong>in</strong> 3/20, stabile nel range di riferimento <strong>in</strong> 9/20, <strong>in</strong><br />
riduzione <strong>in</strong> 4/20 (per 3 si è osservato un significativo<br />
decremento, per assunzione di <strong>in</strong>tegratori). La<br />
tendenza è stata <strong>in</strong> crescita solo <strong>in</strong> 1/20.<br />
Inoltre, 10/27 (37%) calciatori hanno mostrato<br />
variazioni significative del TAS (≥1.30 mmol/L) almeno<br />
una volta, ma solo per 3/10 tale test è risultato<br />
≥1.30 mmol/L due volte su 2 campioni, una sola<br />
volta per i rimanenti 7/10. La media (n=85 tests) è<br />
stata 1.40±0.05 mmol/L (range 1.20-1.56); 13/85<br />
sono risultati ≥1.30 mmol/L e 8/13 hanno mostrato<br />
valori crescenti di ROM.<br />
Confrontando i risultati dei due test si è osservata<br />
una leggera tendenza verso una correlazione<br />
<strong>in</strong>versa fra d-ROMs test e TAS (y=0.0029x + 2.16;<br />
R2=0.52), come atteso. In 8/85 test gli Autori hanno<br />
riscontrato valori di TAS ≥1.30 e livelli di ROM<br />
≥300 CARR U, <strong>in</strong> 11/85 valori di TAS >1.30 mmol/L<br />
e livelli di ROM 1.30 mmol/L e ROM
E’ <strong>in</strong>teressante rilevare che l’assunzione di <strong>antiossidanti</strong><br />
ha ridotto <strong>in</strong> maniera significativa il livello<br />
di ROM dopo allenamento. Ciò sottol<strong>in</strong>ea ancora<br />
una voltal’utilità del d-ROMs test nella gestione<br />
dell’allenamento e del trattamento antiossidante <strong>in</strong><br />
atleti professionisti.<br />
5. 6 Triathlon<br />
Lo stress ossidativo è stato valutato <strong>in</strong> 10 atleti<br />
di triathlon allenati, a riposo ed dopo una prova da<br />
sforzo (nuoto seguito da corsa) (1)<br />
Il livello di ROM dopo il test è aumentato significativamente<br />
rispetto ai valori rilevati a riposo (figura<br />
5. 4).<br />
CARR U<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Rest<strong>in</strong>g<br />
p=0,04<br />
Figure 5. 4 Aumento dei valori medi del d-ROMs test <strong>in</strong> atleti di<br />
triathlon dopo sforzo muscolare<br />
5. 7 Golf<br />
After effort<br />
Il d-ROMs test è stato eseguito <strong>in</strong> 12 atleti della<br />
Squadra Nazionale Italiana di Golf, dopo una corsa<br />
di 3.000 metri alla massima velocità (1).<br />
Il livello di ROM è aumentato da 234 (DS 55; ES<br />
15), <strong>in</strong> condizioni di riposo, a 294 (DS 64; ES 18)<br />
dopo attività aerobica. La differenza è apparsa statisticamente<br />
significativa (p=0.001) (figura 5. 5).<br />
CARR U<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100 100<br />
0<br />
Rest<strong>in</strong>g<br />
p=0,001<br />
After effort<br />
Figura 5. 5 Aumento significativo dei valori del d-ROMs test<br />
<strong>in</strong> giocatori di golf dopo sforzo<br />
5. 8 Ciclismo<br />
In uno studio longitud<strong>in</strong>ale, è stato monitorato<br />
il livello di stress ossidativo <strong>in</strong> un campione di 12<br />
atleti prima e dopo una gara ciclistica di gran fondo<br />
(150 km) (1).<br />
In sei dei dodici ciclisti reclutati, il d-ROMs<br />
test è stato ripetuto anche dopo 2 giorni, a riposo, e<br />
dopo 10 giorni di trattamento antiossidante specifico<br />
(A RD Stenovit ® ) (figura 5. 6).<br />
Capitolo 5. Il d-ROMs test <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport. Rassegna di studi cl<strong>in</strong>ici<br />
n = 10<br />
n = 12<br />
49<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Riposo<br />
(n=12)<br />
p ≤ 0.001 vs riposo <strong>in</strong>iziale<br />
Immediatamente Due giorni dopo Dopo 10 10 giorni<br />
dopo la corsa* (n=12) la corsa (n=6) di terapiay terapiay (n=6) (n=6) *150 km<br />
Figura 5. 6 Andamento dei valori del d-ROMs test<br />
<strong>in</strong> una gara ciclistica di gran fondo (150 km)<br />
Il trial ha confermato che gli atleti presentano<br />
<strong>in</strong> condizioni basali, prima della gara, livelli sierici di<br />
ROM nei limiti della norma. L’<strong>in</strong>tenso sforzo muscolare<br />
si accompagna ad un considerevole e statisticamente<br />
significativo <strong>in</strong>cremento dei valori del d-<br />
ROMs test che, tuttavia, tendono a ridursi già due<br />
giorni dopo la gara, con maggior rapidità nei soggetti<br />
sottoposti ad <strong>in</strong>tegrazione antiossidante.<br />
E’ <strong>in</strong>teressante notare <strong>in</strong> questo studio l’utilità<br />
del d-ROMs test nella gestione della terapia antiossidante<br />
dopo gare ciclistiche impegnative, le quali si<br />
accompagnano <strong>in</strong> assoluto a valori di d-ROMs test<br />
tra i più elevati, nell’ambito delle varie discipl<strong>in</strong>e<br />
<strong>sport</strong>ive.<br />
5. 9 Corsa<br />
La determ<strong>in</strong>azione dei ROM sierici è stata effettuata<br />
su un campione di 50 soggetti adulti, di età<br />
media 25.5±2.7 anni (±DS) e di sesso maschile,<br />
tutti partecipanti ad una corsa cittad<strong>in</strong>a per un percorso<br />
complessivo di 10.5 km (8).<br />
Il d-ROMs test è stato eseguito su campioni di<br />
sangue <strong>in</strong>tero, prelevati prima (t0), al traguardo<br />
(t1), ed 1 ora dopo la f<strong>in</strong>e (t2) della competizione.<br />
I livelli di ROM sierici sono passati da<br />
243.4±22.6 (t 0) a 281.2±21.7 (t 1), f<strong>in</strong>o a<br />
333.2±19.7 (t 2). Le variazioni osservate sono risultate<br />
statisticamente significative (figura 5. 7).<br />
U CARR<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
n=31; 25.5±2.7 anni<br />
Km 10.5<br />
0<br />
Partenza Traguardo 1 h dopo<br />
Figure 5. 7 Time-course dei valori del d-ROMs test<br />
dopo una corsa cittad<strong>in</strong>a<br />
5. 10 Miscellanea<br />
In un ultimo studio, il livello di ROM nel siero è<br />
risultato compreso nel range di 110-516 U CARR <strong>in</strong><br />
407 athletes (332 calciatori professionisti di 7 squa-
dre del massimo Campionato, 24 sciatori della specialità<br />
“cross-country” e 51 atleti della specialità<br />
“skyrunners) (6).<br />
Un aumento al di sopra della soglia di normalità<br />
di 300 U CARR U è stato osservato <strong>in</strong> 382/1071<br />
(35.66%) campioni.<br />
Negli stessi atleti i risultati del TAS sono appars<strong>in</strong>el<br />
range di 1.06-1.69 mmol/L, al di sotto della<br />
Capitolo 5. Il d-ROMs test <strong>in</strong> Medic<strong>in</strong>a <strong>dello</strong> Sport. Rassegna di studi cl<strong>in</strong>ici<br />
50<br />
soglia def<strong>in</strong>ita come normale (1.30 mmol/L) <strong>in</strong><br />
84/954 (8.80%) professionisti.<br />
Inf<strong>in</strong>e, come atteso, i livelli di ROM hanno mostrato<br />
una lieve correlazione, <strong>in</strong> senso <strong>in</strong>verso, con i<br />
valori del TAS, suggerendo che l’aumentata produzione<br />
di radicali <strong>liberi</strong> negli atleti testati può essere<br />
una conseguenza di una ridotta efficienza dei sistemi<br />
<strong>antiossidanti</strong> di difesa.
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Biochimica Cl<strong>in</strong>ica. 2001. 25 (2): 139.
52<br />
Informazione pubblicitaria
La perossidazione di substrati organici (lipidi,<br />
amm<strong>in</strong>oacidi, prote<strong>in</strong>e, nucleotidi, etc.) da parte<br />
delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) è la diretta<br />
conseguenza di un’alterazione del normale bilancio<br />
tra produzione ed elim<strong>in</strong>azione di radicali <strong>liberi</strong>.<br />
Nel corso dell’attività fisica, i processi perossidativi<br />
<strong>in</strong>teressano sia le fibre muscolari scheletriche <strong>in</strong><br />
attiva contrazione che la matrice extracellulare. Pertanto,<br />
le conseguenze del danno ossidativo si ripercuotono<br />
non solo sul muscolo (predisposizione alle<br />
lesioni traumatiche, flogistiche e da overuse) ma<br />
anche sul tessuto connettivo dell’apparato locomotore<br />
(flogosi articolari e periarticolari, tend<strong>in</strong>iti, borsiti)<br />
e sulle cellule ematiche eventualmente migrate<br />
o stravasate. A questo proposito, sono ben note le<br />
lesioni a carico delle membrane dei leucociti (con<br />
conseguente riduzione dell’efficacia delle difese immunitarie<br />
e maggiore predisposizione alle malattie<br />
<strong>in</strong>fettive) e degli eritrociti (emolisi con conseguente<br />
riduzione della capacità di tra<strong>sport</strong>o dell’ossigeno al<br />
sistema muscolo-scheletrico).<br />
Ognuno di questi eventi può provocare, direttamente<br />
o <strong>in</strong>direttamente, una riduzione delle prestazioni<br />
sia <strong>in</strong> soggetti che prendono parte a normali<br />
programmi di fitness sia <strong>in</strong> atleti professionisti.<br />
Sulla base di queste evidenze, appare chiaro<br />
che chiunque pratichi attività <strong>sport</strong>iva con regolarità<br />
ed impegno dovrebbe sottoporsi periodicamente ad<br />
una valutazione <strong>dello</strong> stress ossidativo, allo scopo di<br />
ottimizzare e personalizzare il proprio programma di<br />
allenamento e, eventualmente, raggiungere migliori<br />
prestazioni grazie ad una migliore comprensione<br />
della propria fisiopatologia muscolare, senza correre<br />
i rischi delle lesioni da radicali <strong>liberi</strong>.<br />
Poiché lo stress ossidativo negli atleti è sempre<br />
la risultante di un’aumentata produzione di specie<br />
chimiche reattive e/o di una compromissione delle<br />
difese <strong>antiossidanti</strong>, qualsiasi valutazione dovrebbe<br />
tener conto di ambedue le componenti patogenetiche.<br />
Per questo motivo, il d-ROMs test ed il BAP test<br />
rappresentano gli strumenti ideali per la determ<strong>in</strong>azione<br />
<strong>dello</strong> stress ossidativo negli atleti. Infatti,<br />
mentre il primo fornisce <strong>in</strong>formazioni sullo status<br />
pro-ossidante, il secondo consente di valutare<br />
l’efficienza dei sistemi di difesa <strong>antiossidanti</strong>.<br />
Il d-ROMs test, nel panorama delle opzioni attualmente<br />
disponibili per la valutazione <strong>dello</strong> status<br />
pro-ossidante, è senza dubbio il più idoneo da praticare<br />
negli <strong>sport</strong>ivi. Esso, <strong>in</strong>fatti, come dimostrano le<br />
evidenze discusse nel precedente capitolo, consente<br />
di valutare il livello dei metaboliti reattivi<br />
dell’ossigeno (ROM) e, <strong>in</strong> particolare, la concentra-<br />
Considerazioni conclusive<br />
53<br />
Considerazioni conclusive<br />
zione degli idroperossidi e delle cloroamm<strong>in</strong>e nel<br />
siero, nel plasma o nel sangue <strong>in</strong>tero.<br />
Gli idroperossidi sono universalmente riconosciuti<br />
essere tra i “marcatori” più affidabili <strong>dello</strong><br />
stress ossidativo. Essi, <strong>in</strong>oltre, essendo dotati di una<br />
certa capacità ossidante, <strong>in</strong> determ<strong>in</strong>ate condizioni,<br />
non <strong>in</strong>frequenti nell’atleta sotto sforzo, quali una<br />
transitoria acidosi, possono subire la scissione <strong>in</strong> radicali<br />
<strong>liberi</strong> altamente reattivi (alcossili e perossili)<br />
per l’azione catalitica del ferro, liberato dalle prote<strong>in</strong>e<br />
plasmatiche. Per questo, gli idroperossidi sono<br />
considerati anche importanti amplificatori del danno<br />
e, pertanto, il loro livello va rigorosamente tenuto<br />
sotto controllo.<br />
Le cloroamm<strong>in</strong>e rappresentano importanti marcatori<br />
della componente <strong>in</strong>fiammatoria <strong>dello</strong> stress<br />
ossidativo. Come è noto, <strong>in</strong>fatti, le cloroamm<strong>in</strong>e sono<br />
generate dall’azione su amm<strong>in</strong>oacidi, nucleotidi e<br />
prote<strong>in</strong>e, dell’acido ipocloroso, a sua volta prodotto<br />
per reazione catalitica dalla mieloperossidasi leucocitaria<br />
sul perossido di idrogeno, <strong>in</strong> presenza di ioni<br />
cloruro.<br />
I dati presentati nel precedente capitolo <strong>in</strong>dicano<br />
che coloro i quali praticano regolarmente attività<br />
fisica, sia a livello amatoriale che professionale, presentano<br />
un livello di ROM generalmente <strong>in</strong>feriore a<br />
quello <strong>in</strong>dividuato nella popolazione generale di riferimento<br />
(
po sforzo. Questa evidenza conferma che un trattamento<br />
specifico ed efficace può essere effettivamente<br />
importante negli atleti per compensare le<br />
alterazioni – create per effetto dell’<strong>in</strong>tensa e/o prolungata<br />
attività fisica – fra produzione ed elim<strong>in</strong>azione<br />
di radicali <strong>liberi</strong>.<br />
Queste ed altre osservazioni <strong>in</strong>dicano che il d-<br />
ROMs test costituisce un metodo semplice ed affidabile<br />
non solo per prevenire e monitorare lo stress<br />
ossidativo ma anche per “personalizzare” i programmi<br />
di allenamento e l’<strong>in</strong>tegrazione antiossidante<br />
<strong>in</strong> tutti gli <strong>sport</strong>ivi.<br />
In tale contesto, occorre rilevare come i dati<br />
forniti da questo test si correl<strong>in</strong>o <strong>in</strong> maniera <strong>in</strong>versa<br />
con quelli del TAS, a <strong>in</strong>dicare che un’aumentata<br />
produzione di specie reattive negli <strong>sport</strong>ivi è spesso<br />
anche una consequenza della ridotta efficienza della<br />
barriera antiossidante.<br />
Riguardo a questo aspetto, appaiono <strong>in</strong>coraggianti<br />
i primi risultati ottenuti negli <strong>sport</strong>ivi con il<br />
BAP test che, rispetto al TAS, offre il vantaggio di<br />
una migliore standardizzazione per la cl<strong>in</strong>ica rout<strong>in</strong>aria<br />
e la possibilità di valutare <strong>in</strong> maniera più specifica<br />
l’efficacia dei trattamenti <strong>antiossidanti</strong>.<br />
In conclusione, poiché lo stress ossidativo è responsabile<br />
di alterazioni funzionali e/o strutturali<br />
della cellula, che non risparmiano neppure il DNA,<br />
depositario dell’<strong>in</strong>formazione genetica, è di vitale<br />
Capitolo 6. I test di laboratorio per la valutazione <strong>dello</strong> status antiossidante<br />
importanza che chiunque pratichi con regolarità ed<br />
impegno attività <strong>sport</strong>iva si sottoponga ad una valutazione<br />
globale <strong>dello</strong> stress ossidativo.<br />
Questo obiettivo è oggi a portata di mano dei<br />
medici <strong>sport</strong>ivi e degli allenatori grazie ai nuovi sistemi<br />
analitici dedicati, quali il FRAS 4 ed il FREE<br />
che consentono di determ<strong>in</strong>are “<strong>in</strong> tempo reale” ed<br />
<strong>in</strong> maniera estremamente precisa sia la produzione<br />
di specie reattive (d-ROMs test) che l’efficienza dei<br />
sistemi <strong>antiossidanti</strong> (BAP test).<br />
L’impiego di queste tecniche altamente <strong>in</strong>novative<br />
consente oggi di valutare se il regime di allenamento<br />
è adatto e, eventualmente, mettere <strong>in</strong> atto<br />
misure correttive per ottimizzarlo, anche basate su<br />
miglioramenti <strong>dello</strong> stile di vita o su un più razionale<br />
impiego di <strong>in</strong>tegratori <strong>antiossidanti</strong>.<br />
La medesima strategia, <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e, può essere particolarmente<br />
utile allo scopo di ottenere un <strong>in</strong>dice<br />
della condizione psico-fisica dell’atleta durante la<br />
fase di riposo o nel corso di una stagione di attività<br />
competitiva, dopo <strong>in</strong>tensi sforzi fisici. Infatti,<br />
un’alterazione del bilancio ossidativo (elevati valori<br />
del d-ROMs test e/o ridotti livelli del BAP test) potrebbe<br />
suggerire l’esistenza di una condizione subcl<strong>in</strong>ica<br />
di patologia <strong>in</strong> atto o una scarsa capacità di<br />
recupero, sulla base della quale mettere <strong>in</strong> atto un<br />
programma di allenamento tagliato su misura per<br />
ogni s<strong>in</strong>golo atleta.
Per <strong>in</strong>formazioni rivolgersi a:<br />
Dr Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD<br />
Osservatorio Internazionale <strong>dello</strong> Stress Ossidativo<br />
Via Paolo Grisignano 21 – 84127 Salerno<br />
Telefono & FAX +39 089 711 952<br />
e–mail: eugenioluigi.iorio@alice.it<br />
web site: ww.osservatoriostressossidativo.org<br />
Seconda Edizione Italiana, dicembre 2007<br />
L’Autore e l’Editore non rispondono di eventuali errori rilevati nel presente volume né dell’uso improprio del suo contenuto