Radicali liberi e antiossidanti in medicina dello sport - Gastone CRM

Eugenio Luigi Iorio
Seconda Edizione Italiana – 2007
Radicali
liberi
e
antiossidanti
in medicina
dello sport

Lo stress ossidativo costituisce un capitolo della biochimica relativamente recente che, probabilmente
per il suo carattere di “trasversalità” o “interdisciplinarietà”, non ha ancora trovato una sua adeguata e soddisfacente
collocazione in Medicina dello Sport e nella Medicina in genere.
E’ noto, infatti, che un’accentuazione dei processi ossidativi, di cui è spesso espressione un’aumentata
produzione di radicali liberi, può accelerare il fisiologico processo dell’invecchia-mento e risulta associata ad
almeno 100 patologie, dall’ictus cerebrale all’infarto del miocardio, dal diabete mellito all’obesità, dal morbo
di Parkinson alla malattia di Alzheimer, dal morbo di Crohn all’artrite reumatoide, dall’AIDS al cancro, e così
via.
Tuttavia, al contrario di queste condizioni morbose, abbastanza ben definite sotto il profilo nosografico,
lo stress ossidativo non esibisce una propria sintomatologia, non dà luogo ad un vero e proprio quadro clinico
e, pertanto, al medico che non ne sospetta l’esistenza, non fornisce elementi tali da suggerire un adeguato
approfondimento diagnostico. Eppure, l’esecuzione di alcune semplici indagini biochimiche consentirebbe
un immediato inquadramento del problema, evitando al paziente una serie di conseguenze tali da comprometterne
la durata e/o la qualità della vita già nel breve o medio termine.
A rendere più complesso questo quadro – già di per sé poco confortante – c’è da aggiungere che se il
medico, per una serie di ragioni, non sempre è adeguatamente “informato” sull’argomento, l’analista di laboratorio
non è generalmente “attrezzato” per eseguire test miranti alla valutazione dello stress ossidativo.
E intanto – paradossalmente – terapisti, farmacisti, allenatori sportivi e persino estetisti continuano a
prescrivere e/o suggerire all’atlea potenzialmente a rischio di stress ossidativo l’assunzione di integratori ad
attività antiossidante. Non importa se quest’ultima sia reale o presunta. Non importa se quegli antiossidanti
prescritti senza una precisa indicazione o, comunque, senza una documentata necessità, si rivelino essere
essi stessi causa di ulteriore danno da accumulo o da azione pro-ossidante paradossa.
Infatti, secondo una prassi ormai consolidata, non è abitualmente prevista l’esecuzione preliminare di
test biochimici, pur disponibili per la routine clinica, per dimostrare – tramite l’identificazione e la quantificazione
nei fluidi extracellulari e/o nei tessuti di adeguati marker biochimici – la necessità oggettiva di tali formulazioni.
In altri termini, mentre è ormai acquisito che un farmaco ipocolesterolemizzante va assunto solo
dopo che un test abbia documentato inequivocabilmente una condizione di ipercolesterolemia, è diffusa la
tendenza all’uso di antiossidanti anche quando non è necessario, proprio perché non è ancora diventata
buona prassi eseguire preliminarmente una valutazione di laboratorio dello stress ossidativo.
Tali concetti assumono particolare rilevanza nel campo della Medicina dello Sport. Infatti, se è vero che
una moderata attività fisica contribuisce in varia misura a ridurre la morbilità e la mortalità relative alle patologie
vascolari e a numerose forme di cancro, non v’è dubbio che l’esercizio strenuo o, comunque, inadeguato,
favorisce l’insorgenza di lesioni da stress ossidativo, sia a livello dell’apparato locomotore che a livello sistemico.
Pertanto, tutti coloro che svolgono attività fisica e, in special modo gli atleti, dovrebbero periodicamente
sottoporsi ad una valutazione dello stress ossidativo al fine di prevenire – attraverso non solo un più
“fisiologico” regime di allenamento ma anche un più razionale sfruttamento delle proprie capacità antiossidanti
ed un più oculato impiego di integratori – patologie locali o generalizzate legate alla presenza di una
quantità eccessiva di specie chimiche reattive e, in particolare, di radicali liberi dell’ossigeno.
Questo obiettivo può essere oggi facilmente raggiunto grazie all’esecuzione di semplici test biochimici,
quali il d-ROMs test ed il BAP test, che consentono una valutazione globale – cioè sia del versante pro- che
di quello anti-ossidante, rispettivamente – del bilancio ossidativo dell’atleta, sia esso dilettante o professionista.
Tali test possono essere eseguiti in un comune laboratorio di analisi ma, per essere più vicini alle esigenze
dello sportivo, anche presso lo studio dello specialista in Medicina dello Sport o nei Centri Fitness, attraverso
strumentazioni dedicate, quali il sistema FREE o il sistema FRAS.
Le evidenze scientifiche accumulatesi nell’ultimo decennio indicano, in particolare, che il d-ROM test,
consente l’identificazione e la definizione circostanziata di una condizione di stress ossidativo negli sportivi,
rendendo possibile, quando indicato, il monitoraggio di un’eventuale terapia antiossidante.
Questo volume vuol essere un aiuto non solo per i medici ma anche per i sanitari ed i tecnici impegnati
nei delicati settori dello sport e del fitness, sempre più “asfissiati” da logiche di mercato non solo lontane dallo
spirito agonistico ma anche irrispettose della dignità e del benessere dello sportivo.
Al chimico pientino Mauro Carratelli, “inventore” dei test per la valutazione dello stress ossidativo qui descritti,
e a tutti i medici sportivi che hanno documentato l’utilità di questo approccio altamente innovativo
nella pratica clinica routinaria, l’apprezzamento della comunità scientifica e la mia incondizionata stima personale.
Salerno, 18 dicembre 2007. Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD
Presidente
Osservatorio Internazionale Stress Ossidativo
3

Indice
5
Indice
Capitolo 1 Specie chimiche reattive e radicali liberi ……………………………………………. Pag. 5
1. 1 Generalità e definizioni ………………………………………………………………………………. pag. 5
1. 2 I radicali liberi……………………………………………………………………………………………. pag. 5
1. 3 Meccanismi generali di produzione delle specie chimiche reattive …………………… pag. 6
1. 4 La produzione di specie reattive negli organismi viventi ………………………………… pag. 8
1. 5 Metabolismo delle più importanti specie reattive di interesse biologico ……………. pag. 11
Bibliografia………………………………………………………………………………………………………… pag. 11
Capitolo 2 Il sistema di difesa antiossidante ……………………………………………………... Pag. 13
2. 1 Generalità e definizioni ………………………….…………………………………………………… pag. 13
2. 2 Gli antiossidanti preventivi ………………………………..……………………………………….. pag. 13
2. 3 Gli scavenger di radicali liberi ed i chain breaker ………..………………………………… pag. 15
2. 4 Gli agenti di riparo ……………………………………………………………….…………………... pag. 18
2. 5 Gli agenti di adattamento …………………………………………………………………..……... pag. 18
2. 6 Altri agenti antiossidanti ……………………………………………………………………………. pag. 18
2. 7 Distribuzione del sistema di difesa antiossidante negli organismi viventi ……….. pag. 19
Bibliografia………………………………………………………………………………………
pag. 20
Capitolo 3 Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici. ..…….. Pag. 21
3. 1 Generalità e definizioni ……………………………………………………………………………….. pag. 21
3. 2 Basi biochimiche ………………………………………………………………………………………… pag. 21
3. 3 Eziopatogenesi ………………………………………………………………………………………….. pag. 24
3. 4 Alterazioni del bilancio ossidativo e pratica sportiva…………………………….………… pag. 26
Bibliografia………………………………………………………………………………………………………… pag. 30
Capitolo 4 La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport.…. Pag. 31
4. 1 Premessa …………………………………………………………………………………………………… pag. 33
4. 2 La valutazione dello status pro-ossidante: il d-ROMs test..………………………………. pag. 33
4. 3 La valutazione dello status anti-ossidante: il BAP test…………………………….……….. pag. 33
Bibliografia…………………………………………………………………………………………………………
pag. 45
Capitolo 5 Il d-ROMs test in Medicina dello Sport. Rassegna di studi clinici …………….. Pag. 47
5. 1 Premessa …………………………………………………………………………………………………… pag. 47
6. 2 Le prove da sforzo……………………………………………………………………………………….. pag. 47
6. 3 Discipline sportive ..……………………………………………………………………………………... pag. 48
Bibliografia…………………………………………………………………………………………………………. pag. 51
Considerazioni conclusive ………………………………………………………………………………..
Pag. 53

1. 1 Generalità e definizioni
Le specie chimiche reattive sono agenti di varia
natura – radicalica e non radicalica – accomunati
dalla capacità di ossidare, cioè di sottrarre uno o più
equivalenti riducenti (elettroni o atomi di idrogeno)
ad un gran numero di atomi o molecole organiche
(figura 1. 1) (22).
Radicale
(ossidante)
+
A C C
A
Molecola bersaglio
(es. doppio legame C-C)
-1
OSSIDAZIONE
RIDUZIONE
Figura 1. 1 Azione ossidante delle specie reattive
Alla capacità ossidante, più o meno spiccata a
seconda delle varie specie chimiche, si riconduce
l’attitudine degli agenti in questione a indurre un
danno – detto, appunto, ossidativo – a carico di
componenti strutturali e/o funzionali degli organismi
viventi.
Le specie chimiche reattive di maggiore interesse
biologico sono quelle centrate sull’ossigeno (es.
radicale idrossile e perossido di idrogeno), sul carbonio
es. (radica i alchilici), sull’azoto (es. ossido
nitrico), sul cloro (es. acido ipocloroso) e sullo zolfo
(es. radicale tiilico) (tabella 1. 1).
Tabella 1. 1 Specie reattive di maggiore interesse biologico
Specie chimica Formula Natura Specie chimica Formula Natura
Ozono
Anione superossido
O3 O2
N-R Ossido nitrico NO* R
* Ossigeno singoletto
1
O2*
R
R (?)
Diossido nitrico
Acido nitroso
NO2*
HNO2
R
N-R
Perossido di idrogeno H2O2 N-R Tetrossido di azoto N2O4 N-R
Radicale idrossile
Radicale alcossile
HO*
RO*
R
R
Triossido nitrico
Perossinitrito
N2O3
ONOO
N-R
- N-R
Radicale idroperossile ROO* R Acido perossinitroso ONOOH N-R
Idroperossido ROOH N-R Catione nitronio NO 2+ N-R
Semichinone ( CoQ) Q* R Alchil-perossinitrito ROONO N-R
Fenossile (vit E) E-O* R Acido ipocloroso HClO N-R
N-R: specie non radicalica.
R: specie radicalica.
Nella presente trattazione, tuttavia, si farà riferimento
prevalentemente alle specie reattive centrate
sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS).
L’ossigeno, infatti, oltre ad essere uno degli elementi
quantitativamente più importanti della materia
vivente, nonché la fonte primaria della vita
stessa, attraverso una serie di meccanismi – non
ultimo la stessa respirazione cellulare – induce continuamente
la formazione di specie chimiche con
caratteristiche più o meno spiccate di reattività.
Capitolo 1
Specie chimiche reattive e radicali liberi
+
Nuova molecola
(ridotta, stabile)
Elettrone spaiato
C C
Nuovo radicale
(ossidante)
H H2O 2O 2O 2O 2 + HCl → H H2O 2O 2O 2O + HClO HClO
OSSIDANTE
Acquisizione elettroni
RIDUCENTE
-1
-2
Cessione elettroni
OSSIDAZIONE
+1
6
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
1. 2 I radicali liberi
I radicali liberi o, più semplicemente, radicali,
sono atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno
degli orbitali esterni delle specie che li costituiscono
uno o più elettroni spaiati, indipendentemente dalla
carica elettrica espressa (3, 6, 12).
Per esempio, il radicale della N,N-dietilparafenilendiammina,
il substrato cromogeno del d-ROMs
test (vedi in seguito), è un classico radicale catione,
cioè carico positivamente (figura 1. 2) (1).
CH 3 -CH 2
Ne
L’atomo L’atomo di di Ne
Ne
Solo Solo elettroni elettroni appaiati
appaiati
Atomo (stabile)
N
NH 2
L’atomo di O
Due elettroni spaiati
Radicali liberi dell’ossigeno (instabili)
CH 3 -CH 2
Figura 1. 2 Atomi, molecole e radicali
Il radicale idrossile (HO . Il radicale idrossile (HO )
Un elettrone spaiato
. Il radicale idrossile (HO )
Un elettrone spaiato
. Il radicale idrossile (HO )
Un elettrone spaiato
. )
Un elettrone spaiato
In funzione della distribuzione della carica (nube
elettronica) e/o del proprio potenziale di ossidoriduzione,
i radicali liberi presentano una reattività
più o meno spiccata, legata alla tendenza spontanea
ad esistere come entità aventi tutti gli elettroni
disposti in coppie, condizione che corrisponde alla
stabilità o inerzia chimica (28).
Ne deriva che non tutti i radicali sono ugualmente
reattivi. In genere, quanto più è elevato il
rapporto fra carica e volume, tanto più un radicale
libero è reattivo e, pertanto, tenderà a raggiungere
la propria stabilità strappando elettroni a qualsiasi
specie chimica con la quale viene a contatto, ossidandola
(compatibilmente con il suo potenziale di
ossido-riduzione) (figura 1. 3) (28).
Figura 1. 3 Basi chimiche della reattività radicalica (28)
In tal senso, il radicale ossidrile (HO • ) è uno dei
radicali liberi più instabili e, quindi, reattivi ed
O
N
O
NH 2
CH 3 -CH 2
CH 3 -CH 2
N,N-dietilparafenilendiammina (base) N,N-dietilparafenilendiammina (radicale)
+1.5
+1.0
+0.5
0
-0.5
1.0
-1.5
E7 (R* + e- E7 (R* + e →R) - E7 (R* + e →R) - →R)
+2.0
HO• HO• HO• RO• RO• RO• RS• RS• RS• ROO• ROO• ROO• Potenziale redox
e reattività
* O 2
Asc• SeQ• NAD•
Asc• SeQ• NAD•
Asc• SeQ• NAD•
=COH• =COH• =COH• C(NO 2 ) 4
CO 2
- E 7 (R* →→ → R + e )
-1 -0.5 0 +0.5 +1.0 +1.5 +2.0
+
H
HO• Cl• HO
Radicale idrossile Atomo di cloro
• Cl• HO
Radicale idrossile Atomo di cloro
• Cl• HO
Radicale idrossile Atomo di cloro
• Cl• Radicale idrossile Atomo di cloro
Radicali molto reattivi
(elevato rapporto carica/superficie)
N N
NO 2
O 2 N NO 2
Difenilpicrilidrazide (DPPH)
Un radicale poco reattivo
(basso rapporto carica/superficie)

ossidanti. Infatti, la durata stimata della sua esistenza
è dell’ordine dei nanosecondi (28).
Viceversa, il trifenilmetile [(C 6H 5) 3–C • ] è un radicale
che, in opportune condizioni, può essere persino
isolato in soluzione, proprio per la sua relativa
stabilità o inerzia chimica (28).
Lo stesso radicale catione della N,Ndietilparafenilendiammina,
sopra citato, costituisce
un esempio di radicale relativamente stabile (figura
1. 1) (1).
I radicali liberi vengono classificati sulla base
della natura dell’atomo al quale appartiene l’orbitale
con l’elettrone spaiato. Tra questi assumono particolare
rilevanza biologica i radicali liberi centrati
sull’ossigeno o, più semplicemente, radicali liberi
dell’ossigeno, quali il radicale idrossile (tabella 1. 1).
Un esempio di radicale libero centrato sull’azoto
è fornito dall’ossido nitrico.
1. 3 Meccanismi generali di produzione
delle specie chimiche reattive
Le specie chimiche reattive e, in particolar modo,
i radicali liberi, comunque centrati, possono essere
generati attraverso due meccanismi generali,
non enzimatici oppure enzimatici (18).
In ambedue i casi, una volta formatisi, i radicali
liberi possono dar luogo, in opportune condizioni
ambientali, ad una serie di reazioni a catena, nel
corso delle quali il sito radicalico può essere trasferito
o, eventualmente, inattivato (26, 28).
Le reazioni radicaliche a catena avvengono seguendo
lo stesso schema generale, nel quale è possibile
individuare tre fasi o step principali – inizio,
propagazione e termine – alle quali si accompagnano
spesso reazioni collaterali aventi andamento simile
(figura 1. 4) (18, 28).
Inizio
Propagazione
Termine
Fotolisi/
pirolisi
A : B
+hν
A• A + •B • A + •B • A + •B • A + •B • A + •B • + •B A• Trasferimento
A• Trasferimento
A• Trasferimento
A• Trasferimento
A• Trasferimento
R• R• R• R• R• R : H
A : H
Combinazione
A• A + •B • + •B
A : B
Interazione con
metalli di transizione
AO : OB
Fe2+ Interazione con
metalli di transizione
AO : OB
Fe2+ Interazione con
metalli di transizione
AO : OB
Fe2+ Interazione con
metalli di transizione
AO : OB
Fe2+ Fe2+ AO• + OB -
Fe3+ AO• + OB -
Fe3+ AO• + OB -
Fe3+ AO• + OB -
AO• + OB -
Fe3+ Fe3+ Addizione
R• Addizione
R• Addizione
R• Addizione
R• Addizione
R• CH 2 =CH–
R–CH 2 –CH* –
Scissione
di perossidi perossidi perossidi
RO : OR
RO• RO + •OR • RO + •OR • RO + •OR • RO + •OR • + •OR Figura 1. 4 Schema delle reazioni radicaliche a catena (28)
I principali meccanismi attraverso cui si generano
i radicali liberi – step 1, reazione di inizio – sono
la scissione omolitica e l’interazione con i metalli di
transizione (28).
Con il termine di scissione omolitica si intende
la divisione di una molecola a livello di uno dei suoi
legami covalenti per effetto della somministrazione
di energia (termica, pirolisi, o radiante, radiolisi) con
generazione di due nuove specie chimiche,
+hν
= C = C =
R • R • R • R • R •
Scissione di
azocomposti
RN : : NR
– N 2
R• R + •R • R + •R • R + •R • R + •R • + •R Frammentazione Ri-arrangiamento
R:C – C*= R:C – C*=
– C =
– C =
Disproporzione
– C
– C –
• – – C
– C –
• – C –
+
– C –
• – – C
– C –
• –
+
+
=C* – C:R
– C –
– C –
7
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
ciascuna con un elettrone spaiato, elemento distintivo
dei radicali liberi (figura 1. 5, A).
A
B
A B
Molecola
H
Cl
Molecola
Energia
Acqua
Radicale libero 1
Figura 1. 5 Scissione omolitica (A) e ionizzazione (B)
E’ bene sottolineare che la scissione omolitica
è diversa dalla ionizzazione, che si osserva, per esempio,
dopo aver disciolto in acqua molecole, come
quelle dell’acido cloridrico (HCl), aventi almeno
un legame covalente polarizzato. In questo caso, le
molecole d’acqua, a causa della loro polarità e,
dunque, senza alcuna somministrazione di ener-gia,
riescono a spezzare uno dei legami covalenti polarizzati
della molecola di soluto generando due specie
chimiche caricate di segno opposto, un catione
ed un anione (H + e Cl - , rispettivamente,
nell’esempio considerato) (figura 1. 5, B).
E’ evidente che nella ionizzazione, al contrario
della scissione omolitica, il doppietto elettronico di
legame della molecola originaria non viene separato
ma resta come tale in una delle “neonate” specie
ioniche (l’anione).
Un classico esempio di scissione omolitica è la
radiolisi o fotolisi dell’acqua che genera un atomo
di idrogeno ed un radicale idrossile (7).
Oltre che per scissione omolitica, i radicali liberi
possono essere prodotti in seguito all’interazione di
particolari molecole con alcuni metalli di transizione
(figura 1. 6).
<
A
B
Molecola
A
B
Molecola
Men+1 Men+1 Men Men Men Men+1 Men Men+1 Figura 1. 6 Interazione con metalli di transizione
Nell’interazione con i metalli di transizione,
l’elettone generato dall’ossidazione di un metallo di
transizione in forma ionica (es. da Fe 2+ a Fe 3+ o da
Cu + to Cu 2+ ) spezza un legame covalente di una
molecola bersaglio, generando così un radicale libero
e un anione (1, 13, 14, 16, 27).
Alternativamente, l’elettrone richiesto per ridurre
un metallo di transizione in forma ionica (es. da
Fe 3+ a Fe 2+ o da Cu 2+ a Cu + ) viene estratto dal
legame covalente di una molecola bersaglio, che si
+
A B
H
H
Catione
A
+
Radicale libero
Radicale libero
+
+
+
Radicale libero 2
Cl
Anione
B
Anione
A B
Catione
-
-
+

decompone in un radicale libero ed un catione (1,
13, 14).
Attraverso questo meccanismo, per esempio, il
ferro (Fe 2+ /Fe 3+ ) oppure il rame (Cu + /Cu 2+ ) agiscono
da catalizzatori in una sequenza di reazioni di
ossido-riduzione generando, a partire dai perossidi,
radicali liberi (13, 14, 16).
Nel caso più semplice – descritto per la prima
volta da Fenton – uno ione ferroso (Fe 2+ ), ossidandosi
a ione ferrico (Fe 3+ ), cede il suo elettrone ad
una molecola di perossido di idrogeno (H 2O 2) e ne
scinde uno dei legami covalenti, generando un radicale
libero (il radicale idrossile, HO • ) ed un anione
(ione ossidrile) (13,14, 16, 27).
A sua volta, lo ione ferrico (Fe 3+ ) si riduce – rigenerandosi
come qualsiasi catalizzatore – a ione
ferroso (Fe 2+ ), strappando un elettrone da una seconda
molecola di perossido di idrogeno, che è scissa
in un radicale libero (un radicale peridrossile
(HOO • ), e un catione (uno ione idrogeno, H + ) (figura
1. 7) (13, 14, 16).
H–O–O–H
Perossido
di idrogeno
H–O–O• H–O–O• H–O–O• Radicale
peridrossile
Figura 1. 7 Decomposizione del perossido di idrogeno
Allo stesso modo, anche gli idroperossidi sono
scissi, per azione catalitica del ferro, in radicali alcossilici
(RO • ) e perossilici (ROO • ) (figura 1. 8) (1).
R-O-O-H
R-O-O-H
(Alchil)
(Alchil)
idroperossido
idroperossido
R-O-O .
R-O-O .
R-O-O .
R-O-O .
R-O-O .
R-O-O .
Radicale
(idro)perossilico
Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ H + H + H + H + H + H +
OH- OH- OH- Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ H + H + H +
OH -
OH -
OH -
OH -
OH -
OH -
Fe3+ Fe3+ Fe3+ Fe3+ Fe3+ Fe3+ H–O• H–O• H–O• Radicale
idrossile
H–O–O–H
Perossido
di idrogeno
R-O .
R-O .
R-O .
R-O .
R-O .
R-O .
Radicale
alcossilico
R-O-O-H
(Alchil)
idroperossido
Figura 1. 8 Decomposizione degli idroperossidi
In assenza di catalizzatori, la scissione dei perossidi
– che dà luogo ad un’unica specie radicalica,
quella alcossilica – può avvenire solo in seguito a
somministrazione di energia (figura 1. 4) (28).
Un’ultima modalità di formazione di radicali liberi,
tra quelle di maggiore rilevanza biologica, è la
decomposizione degli azocomposti, dalla quale originano,
per sottrazione di azoto molecolare (N 2) radicali
alchilici (figura 1. 4) (28).
Una volta innescata, una reazione radicalica a
catena tende a propagarsi (step 2).
8
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
Si distinguono 4 meccanismi fondamentali di
propagazione delle reazioni radicaliche: trasferimento,
addizione, frammentazione e riarrangiamento
(28).
Tra questi, il più comune nell’ambito delle reazioni
radicaliche è il trasferimento. In tale modalità,
il radicale libero – generato da una delle precedenti
reazioni di inizio – attacca una molecola sottraendo
ad essa uno dei suoi atomi (generalmente un atomo
di idrogeno). Il risultato finale è la formazione di
una nuova specie reattiva e, in pratica, il trasferimento
del sito radicalico (figura 1. 9A).
A
B
+
A R H
Radicale libero
(ossidante)
Radicale Radicale
ossidrile
Figura 1. 9 Reazione di trasferimento
Con questo meccanismo, per esempio, il radicale
ossidrile (HO • ) attaccando una molecola organica
(R–H), strappa a questa un atomo di idrogeno, generando,
accanto ad una molecola d’acqua (H2O),
un radicale alchilico (R • ) (figura 1. 9, B). Così, il sito
radicalico si trasferisce dal radicale ossidrile al radicale
alchile.
Infine, una reazione radicalica a catena può arrestarsi
(termine, step 3) o per combinazione o per
disproporzione.
In particolare, nella combinazione, che è la reazione
inversa della scissione omolitica, due radicali
liberi reagiscono tra loro dando luogo ad una molecola
non più reattiva (figura 1. 10) (28).
R
Radicale libero 1
(ossidante)
Molecola
bersaglio
+
R 1
Radicale libero 2
(antiossidante)
A H
Nuova
molecola
R R 1
Nuova
molecola
Figura 1. 10 Reazione di combinazione
Il primo radicale agisce come ossidante, mentre
il secondo si comporta come un generico antiossidante
(vedi appresso).
Questo meccanismo – come verrà in seguito discusso
– viene sfruttato per bloccare una reazione
radicalica e in generale, un qualsiasi processo radicalico
a catena, sia esso industriale o biologico, può
essere interrotto grazie all’intervento di agenti denominati
antiossidanti.
+
R
Nuovo radicale
(ossidante)
O H + R H R + H O H
Substrato
organico
Radicale
alchile
Acqua

1. 4 La produzione di specie reattive
negli organismi viventi
Negli organismi viventi le specie chimiche reattive
e, in particolare, i ROS sono generati nel corso
della normale attività metabolica cellulare; alcuni
agenti esogeni, tuttavia, possono incrementarne la
produzione, anche con meccanismo diretto (figura
1. 11) (5-7, 25).
Agenti
esogeni
Figura 1. 11 Meccanismo generale di produzione dei ROS
E’ possibile individuare almeno 5 fonti metaboliche
primarie di radicali liberi, in rapporto al sito cellulare
prevalentemente interessato nella produzione
dei ROS stessi: la plasmamembrana, i mitocondri, i
perossisomi, il reticolo endoplasmatico liscio (microsomi)
e il citosol. E’ bene ricordare che in ciascuna
di queste sedi i ROS vengono prodotti o spontaneamente
o per effetto di reazioni catalizzate da enzimi
o da metalli di transizione (es. ferro o rame)
(figura 1. 12) (24).
NADPH ossidasi
Lipoossigenasi
Xantina ossidasi
Aldeide ossidasi
Produzione
di ROS
Metabolismo
cellulare
NADH deidrogenasi
Citocromo ossidasi
Citocromo P 450
Citocromo b 5
Figura 1. 12 Fonti cellulari primarie di produzione di ROS (24)
La plasmamembrana rappresenta una delle fonti
più importanti di ROS, particolarmente (ma non
esclusivamente) nei leucociti polimorfonucleati
(PMN). Infatti, nella plasmamembrana di queste
cellule sono localizzati diversi enzimi, quali la
NADPH ossidasi e le lipoossigenasi, la cui attivazione
si accompagna alla produzione, rispettivamente
di anione superossido e di intermedi metabolici con
caratteristiche chimiche di perossidi (24).
La NADPH ossidasi è un enzima che catalizza la
formazione di anione superossido da NADPH(H + ) ed
ossigeno molecolare, in seguito a stimolazione specifica
dei PMN, per esempio da parte di endotossine,
batteri, o anticorpi).
La reazione, che avviene verosimilmente in due
tappe, è resa possibile dall’aumentata disponibilità
9
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
di NADPH(H + ), per l’aumentata ossidazione del
glucosio attraverso lo shunt degli esosi, e di
ossigeno molecolare, nell’ambito del cosiddetto “respiratory
burst” (vedi più avanti).
Il sistema della lipoossigenasi, localizzato
anch’esso a livello della plasmamembrana, comprende
tre enzimi, la 5-, la 12-, e la 15lipoossigenasi,
che catalizzano la formazione, a partire
dall’acido arachidonico, del 5-, del 12- e del 15-
HPETE, rispettivamente (29). Queste sostanze sono
chimicamente degli idroperossidi acidi, un gruppo
particolare di ROS spesso indicati con la sigla di
ROM (reactive oxygen metabolites, cioè metaboliti o
derivati reattivi dell’ossigeno).
La produzione di ROS a livello della plasmamembrana
dei PMN, per attivazione della NADPH
ossidasi e/o delle lipossigenasi, avviene, tipicamente,
nel corso di processi reattivi (es. infezioni, immunoreazioni
patogene, infiammazioni).
I mitocondri rappresentano la fonte metabolica
primaria di ROS perché sulle loro creste sono localizzati
i complessi enzimatici della catena respiratoria
deputati alla fosforilazione ossidativa (18).
Idealmente, il trasferimento di elettroni dal
NAD ridotto al citocromo C e da questo all’ossigeno
dovrebbe concludersi, una volta sintetizzato l’ATP,
con la produzione di H2O (riduzione tetravalente
dell’ossigeno molecolare) (18).
Tuttavia, già in condizioni normali, questo processo
non è perfetto, per cui in maniera non facilmente
controllabile una certa quota di elettroni (1-
2%) sfugge al sistema di trasporto dei vari coenzimi
(es. ubichinone, flavoproteine, citocromi, ecc.) e reagisce
direttamente con l’ossigeno molecolare, generando,
così, anione superossido e /o perossido di
idrogeno (riduzione uni- e bivalente dell’ossigeno
molecolare) (18).
Per avere un’idea di questo processo, si consideri
che è stato calcolato che durante un esercizio
fisico intenso nei muscoli scheletrici, a causa
dell’intensa stimolazione metabolica cellulare la
quota di questo shunt elettronico può raggiungere il
15% dell’ossigeno utilizzato dai mitocondri (18).
Il fenomeno della riduzione uni o bivalente
dell’ossigeno molecolare avviene, nei mitocondri,
senza l’intervento di enzimi, al contrario di quanto
osservato in altre sedi cellulari (figura 1. 13) (18).
O O
.
2 2 H2O2 HO .
1e- 1e- 1e- 1e- O O
.
2 2 H2O2 HO .
1e- 1e- 1e- 1e- O O
.
2 2 H2O2 HO .
1e- 1e- 1e- 1e- Riduzione
univalente
2 H + 2 H + 2 H +
Riduzione tetravalente
Riduzione
univalente
Riduzione bivalente
1H + 1H + 1H +
Riduzione bivalente
H H2O 2O 2O
Figura 1. 13 Modalità di riduzione dell’ossigeno molecolare (18)

In altre parole, da un punto di vista squisitamente
chimico la produzione di radicali liberi nel
corso della fosforilazione ossidativa è esattamente
una modalità non enzimatica di produzione di
specie reattive (18).
In realtà, come si è appenna accennato, la generazione
di radicali liberi negli organismi viventi è
strettamente legata ai fenomeni vitali e, pertanto,
costituisce un fenomeno “fisiologico” che avviene
continuamente nel corso di reazioni di ossidoriduzione
attraverso meccanismi sia enzimatici che non
enzimatici (18).
A questo punto è opportuno sottolineare che,
oltre ai mitocondri, esistono anche altre fonti non
enzimatiche di radicali liberi nelle cellule. Per esempio,
i perossinitriti generano spontaneamente radicale
idrossile e radicale nitrossido.
Tuttavia, le reazioni non enzimatiche più importanti
sotto il profilo biologico per la produzione di
radicali liberi sono quelle catalizzate da metalli di
transizione.
In queste reazioni, che richiedono generalmente
ferro o rame allo stato ridotto (rispettivamente
Fe 2+ e Cu + ) il perossido di idrogeno (generato attraverso
varie metaboliche, come si preciserà più
avanti) è scisso in radicale idrossile e ione ossidrile
per inglobamento dell’elettrone strappato al
metallo di transizione, che viene rilasciato in forma
ossidata (rispettivamente Fe 3+ e Cu 2+ ); analoga reazione
subiscono gli idroperossidi, che generano il
radicale alcossile (figure 1. 7 e 1. 8) (13, 14, 16).
Gli enzimi che rigenerano metalli di transizione
allo stato ridotto costituiscono un complesso indicato
con la sigla MCO (sistemi di ossidazione metallocatalizzata)
(27).
Essi comprendono la xantina ossidasi, la NADPH
e la NADH ossidasi, l’acido nicotinico idrossilasi, il
sistema del citocromo P 450, la NADH reduttasi (coenzima
chinonico), la succinico-reduttasi (coenzima
chinonico) e varie proteine a ferro-zolfo non eminico.
I chinoni e i gruppi prostetici flavinici ridotti generati
da questi enzimi riducono a loro volta i metalli
di transizione, provocando la riduzione diretta
dell’ossigeno molecolare a radicale idrossile e/o a
perossido di idrogeno (attraverso la mediazione o
meno dell’anione superossido) (figura 1. 14) (27).
QH 2
O 2
FH 2
O 2
QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- QH*, H- 2H + 2H + 2H +
x2
O *
2
O 2
H2 O2 Fe(II)
F FH +
H2 O2 Fe(II)
F FH +
H2 O2 Fe(II)
F FH +
*OH + OH- *OH + OH + Fe (III)
- *OH + OH + Fe (III)
- + Fe (III)
Fe(III)
Figura 1. 14 Sistemi MCO e ciclo del ferro (27)
10
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
Oltre alla plasmamembrana ed ai mitocondri,
anche i perossisomi rappresentano una fonte importante
di ROS.
In questi organuli cellulari, infatti, avviene un
particolare processo di ossidazione degli acidi grassi,
che è diverso da quello convenzionale (bossidazione).
Nella prima tappa di tale sequenza di
reazioni, una flavoproteina estrae una coppia di atomi
di idrogeno da una molecola di acido grasso
attivato (acil-CoA) trasferendola direttamente
all’ossigeno molecolare, con formazione di perossido
di idrogeno (successivamente inattivato dalla catalasi).
Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) la produzione
di specie reattive passa attraverso il citocromo
P450. Quest’ultimo gioca un ruolo di primo
piano nei processi di detossificazione (19, 20, 24).
Infatti, il citocromo P450 agisce come donatore
immediato di elettroni in molte idrossilazioni, in particolare
quelle che avvengono all’interno degli epatociti
e che sono finalizzate all’inattivazione di ormoni
(es. steroidei) e composti non fisiologici (xenobiotici,
quali tossici e farmaci idrofobici che vengono
in tal modo resi più solubili e meno tossici)
(24).
Il citocromo P450 è una proteina a ferro eminico
presente non solo nel reticolo endoplasmatico del
fegato ma anche nei mitocondri della corticale del
surrene che, in un processo molto complesso e non
ancora perfettamente chiarito, fa da trait-d’union
fra l’NADPH(H + ) (donatore di elettroni) e substrato
da idrossilare (24).
In tale complessa reazione un substrato idrossilabile
(SH) reagisce con NADPH(H + ) ed ossigeno
molecolare (O 2) per formare il corrispondente derivato
idrossilato (S-OH), insieme a NADP + ed acqua.
Una produzione di radicali liberi avviene nella
cellula anche nel corso di numerose altre reazioni
biochimiche, come ad esempio durante l’ossidazione
dell’ipoxantina a xantina e della xantina ad acido
urico, che contrassegnano la fase finale del catabolismo
dei nucleotidi purinici (AMP → IMP → inosina
→ ipoxantina → xantina → acido urico) (24).
Ambedue le suddette reazioni sono catalizzate
dalla xantina deidrogenasi, un enzima a molibdeno.
In particolari condizioni, come nel corso del cosiddetto
danno da ischemia-riperfusione, la xantina
deidrogenasi è convertita in xantina ossidasi. Tale
conversione è legata verosimilmente all’attivazione
di specifiche proteasi, indotta dall’incremento del
calcio libero all’interno della cellula, una delle conseguenze
del danno ossidativo da radicali liberi.
La xantina ossidasi, derivata dal clivaggio proteolitico
della xantina deidrogenasi, diversamente
da quest’ultima, utilizza come accettore finale di elettroni
direttamente l’ossigeno, generando così perossido
di idrogeno ed anione superossido, a partire,
rispettivamente, dall’ipoxantina e dalla xantina
(figura 1. 15).

Ipoxantina Xantina
H 2 O + O 2
← Xantina ossidasi →
H 2 O 2
Xantina Acido Acido urico
urico
O 2
O -
2
Figura 1. 15 Produzione di ROS dal catabolismo purinico
Altre reazioni che generano radicali liberi sono
descritte nella sintesi delle catecolammine (24).
Da quanto esposto finora, si evince che i ROS
rappresentano intermedi quasi obbligati del metabolismo
cellulare. E poiché la loro produzione è
strettamente legata ai fenomeni vitali, a ragione essi
sono stati definiti “insostituibili compagni di viaggio”
della nostra esistenza (4).
Appare evidente che in ciascun sito cellulare, la
produzione di specie reattive ha una sua specifica
funzione. Infatti, è stato riconosciuto che i ROS
giocano un ruolo importante “al servizio della vita”
perché sono coinvolti non solo nel metabolismo cellulare
ma anche nei “processi reattivi”, quali infezioni
e infiammazioni.
Per esempio, l’anione superossido e gli altri ROS
vengono generati sulla superficie esterna della plasmamembrana
dei leucociti attivati. Queste specie
reattive attaccheranno componenti estranei quali
batteri indebolendone la parete e rendendoli più facilmente
accessibili alla fagocitosi e, in definitiva,
alla loro distruzione. Queste attività “immunologiche”
si estrinsecano non solo nei confronti di componenti
estranei ma anche contro componenti “self”
quali tessuti o organi trapiantati (reazione di rigetto).
Questa strategia viene anche utilizzata nel corso
della guarigione di organi o tessuti soggetti a traumi.
Infatti, i leuociti migrano nell’area lesa, si attivano
e iniziano a bombardare le cellule danneggiate
con i radicali liberi che accelerano la loro distruzione,
allontanamento dei sottoprodotti di lisi, e il corrispondente
recupero (rigenerazione) (18).
La produzione di radicali liberi da parte delle
cellule può, talvolta, subire un incremento notevole
per effetto di stimolazioni esterne. Infatti, agenti
fisici, chimici e biologici, da soli o in combinazione
tra loro, possono indurre direttamente la generazione
di ROS o aumentarne la “fisiologica” produzione
attraverso una specifica stimolazione metabolica
(18).
Tra gli agenti fisici, sono da segnalare le radiazioni
ionizzanti e i raggi UV.
Ambedue queste fonti energetiche possono indurre
il fenomeno della scissione omolitica
dell’acqua, detto anche radiolisi o fotolisi a seconda
del tipo di radiazione coinvolto (figura 1. 16) (7).
11
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
H R H UV H R + H
Acqua Radicale
Radicale
idrossile
idrogeno
Figura 1. 16 La fotolisi dell’acqua
In questa reazione la molecola d’acqua assorbe
energia e la utilizza per scindere uno dei suoi due
legami covalenti con l’idrogeno: i prodotti saranno
due radicali liberi, il radicale idrossile e l’atomo di
idrogeno. Considerato che un organismo vivente è
costituito prevalentemente da acqua e che trascorre
gran parte della sua vita sotto l’effetto di radiazioni
(UV o ionizzanti che siano) appare evidente quanto
questo fenomeno incidain maniera sostanziale
sulla produzione di radicali liberi.
Fra gli agenti chimici in grado di stimolare la
produzione di radicali liberi è da citare l’ozono (un
ROS) che genera direttamente radicali perossilici
per interazione con composti fenolici (28).
I due casi finora considerati (radiazioni e ozono)
costituiscono esempi di produzione diretta di specie
reattive. Altri agenti chimici, invece, quali gli idrocarburi
aromatici policiclici o taluni farmaci, inducono
un aumento della produzione dei radicali liberi
attraverso un meccanismo indiretto, attivando il sistema
del citocromo P450 a livello microsomiale.
Agenti biologici che tipicamente inducono un
aumento della produzione di ROS per attivazione
metabolica specifica sono i batteri, nell’ambito del
fisiologico processo di difesa dalle infezioni, e taluni
anticorpi, nell’ambito di alcune reazioni immunopatogene.
In questi casi sono chiamati direttamente in
causa i PMN che, come si è detto, possiedono oltre
alla citata NADPH ossidasi, una serie di enzimi direttamente
coinvolti nella produzione e, in parte,
nell’inattivazione di specie reattive, quali la superossidodismutasi
(SOD), la mieloperossidasi (MPx), la
catalasi (CAT) e la glutatione perossidasi (GPx) (figura
1. 17).
Batteri, endotossine, anticorpi
Ossidazione diretta
del glucosio
Generazione di
NADPH + H +
Generazione di
NADPH + H +
↑ Captazione di
ossigeno
↑ Disponibilità di
ossigeno
Attivazione NADPH ossidasi
HClO
.
O 2
SOD
H H2O 2O 2
MPx CAT GPx
H H2O 2O
NADPH ossidasi
NADPH + O2 → NADP . + H + + O
.
2
NADP . + O2 → NADP + NADPH ossidasi
NADPH + O2 → NADP
+ O
.
2
. + H + + O
.
2
NADP . + O2 → NADP + NADPH ossidasi
NADPH + O2 → NADP
+ O
.
2
. + H + + O
.
2
NADP . + O2 → NADP + + O
.
2
Superossido dismutasi (SOD)
2 O
.
2 + 2 H +
2 + 2 H +
2 + 2 H + → H2 O 2 + O 2
Mieloperossidasi (MPx)
HCl + H 2 O 2 → H 2 O + HClO
Catalasi (CAT)
2 H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2
Glutatione perossidasi (GPx)
2 GSH + H 2 O 2 → 2H 2 O + GSSG
Figura 1. 17 Produzione reattiva di ROS da parte dei PMN

La SOD catalizza la trasformazione dell’anione
superossido in perossido di idrogeno che, a sua volta,
può essere inattivato ad acqua per azione della
CAT o della GPx. Tuttavia, la disponibilità di cloruri
– anche a concentrazioni fisiologiche – rende il perossido
di idrogeno substrato della MPx. Il risultato
finale è la produzione di un agente altamente ossidante,
l’acido ipocloroso (HClO). Come verrà precisato
in seguito, l’HClO può attaccare numerosi substrati
organici e, in particolare, amminoacidi e proteine,
per produrre cloroammine, una potenziale
fonte di radicali alcossilici e perossilici (15, 31).
Infine, giova ricordare che un aumento della
produzione di radicali liberi può osservarsi in situazioni
“fisiologiche”, come ad esempio dopo un intenso
sforzo muscolare o nel corso di numerose
malattie. In quest’ultimo caso, spesso, non è chiaro
fino a che punto i ROS siano la causa o l’effetto della
patologia considerata (vedi più avanti).
1. 5 Metabolismo delle più importanti
specie reattive di interesse biologico
Le più comuni specie reattive di interesse biologico
sono quelle centrate sull’ossigeno, sull’azoto,
sul carbonio e sul cloro (tabella 1. 1).
Tra le specie reattive primarie dell’ossigeno,
l’ossigeno singoletto rappresenta una varietà radicalica
che può originarsi per eccitazione dell’ossigeno
molecolare o per combinazione di radicali perossilici
(figura 1. 18) (2).
O 2
Eccitazione
1
O2
2 ROO• 2 ROO• 2 ROO• 2 ROO• Combinazione
Figura 1. 18 Modalità di generazione dell’ossigeno singoletto
Molto più complessa è, invece, la formazione
dell’anione superossido (figura 1. 19) (11).
Respirazione
polmonare
O 2
NADPH
ossidasi
Catena
respiratoria
Riduzione univalente
HO• HO• HO• Ossidazione
mista NADPH
Reazione di Haber-Weiss
O 2
Citocromi
P 450 e 5 b
Ossidazione mista
ipoxantina
Figura 1. 19 Metabolismo dell’anione superossido
e
Autoossidazione
Xantina
ossidasi
Superossido dismutasi
H 2 O 2
12
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
Infatti, esso risulta dall’addizione, ad una molecola
di ossigeno, di un elettrone, il quale può provenire
da diverse vie metaboliche. Tra queste assumono
rilevante importanza la catena respiratoria
(riduzione univalente), il “respiratory burst” e, in
condizioni di ischemia-riperfusione, il catabolismo
dei nucleotidi purinici. Una volta generato, l’anione
superossido può andare incontro alla reazione di
Fenton, generando il radicale altamente istolesivo
idroperossido, oppure dismutare, per azione della
SOD, a perossido di idrogeno, meno tossico.
Il radicale idrossile, noto per la sua enorme potenzialità
istolesiva, può derivare da un’ampia serie
di reazioni, tra le quali spiccano la catena respiratoria,
la già discussa fotolisi dell’acqua, la decomposizione
del perossido di idrogeno, la scissione spontanea
dei perossinitriti e la reazione dell’ozono con i
nitriti (figura 1. 20) (9, 10).
Respirazione
polmonare
O 2
Figura 1. 20 Metabolismo del radicale idrossile
Infine, il perossido di idrogeno viene generato
prevalentemente attraverso meccanismi di tipo enzimatico
e per via enzimatica è generalmente inattivato
o dà luogo alla formazione di specie chimiche
più ossidanti (figura 1. 21) (2).
Respirazione
polmonare
O 2
HO• HO• HO• O O2* 2* 2* H H2O 2O 2O H H2O 2O 2O 2
Reazione di
Haber-Weiss
Catena
respiratoria
Riduzione univalente
RH
Superossido
dismutasi
Catena
respiratoria
Riduzione bivalente
H 2 O
Radiolisi
Reazione
di Fenton
HO• HO• HO• R • R • R •
Amminoacido
ossidasi
Ossidazione mista
H 2 O 2 ipoxantina
Reazione di
Haber-Weiss Catalasi Perossidasi
H H2O 2O 2O
Scissione
spontanea
Reazione con ozono
HONOO
Fenoli
Xantina
ossidasi
Mieloperossidasi
Figura 1. 21 Metabolismo del perossido di idrogeno
ClO- ClO- ClO- Le specie reattive primarie dell’ossigeno possono
attaccare qualsiasi substrato organico, generando
specie reattive secondarie, note anche come metaboliti
o derivati reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen
metabolites, ROM), quali gli idroperossidi.
Questi, a loro volta, in particolari condizioni, possono
dare origine a specie chimiche particolarmente
reattive quali i radicali perossile e alcossile (1).

Le specie reattive centrate sull’azoto di maggiore
rilevanza biomedica comprendono varietà sia radicaliche
che non radicaliche. Fra le prime sono da
citare l’ossido d’azoto, impropriamente detto ossido
nitrico (NO • ), e il biossido nitrico (NO 2 • ); fra le seconde,
piuttosto numerose, ricordiamo, invece,
l’acido nitroso e il perossinitrito.
L’ossido nitrico, un gas considerato a lungo un
inquinante ambientale, viene prodotto, insieme alla
L-citrullina, a partire dall’amminoacido L-arginina, in
una reazione catalizzata dall’enzima ossido nitrico
sintetasi (nitric oxide synthase, NOS) (17).
Quest’ultimo possiede la singolare proprietà di ospitare
sulla stessa catena polipeptidica due domini ad
azione catalitica, uno reduttasico ed uno ossigenasico,
e richiede come cofattori NADPH e pteridina ridotta
(8). La NOS esiste in almeno 2 isoforme, una
costitutiva (cellule endoteliali, piastrine, neuroni) ed
una inducibile (cellule infiammatorie) (figura 1. 22).
H H2N 2N 2N
NH
NH
NADPH
O 2
H3N + COO- H3N + COO- H3N + COO- L-arginina
H H2N 2N 2N
NH
N–OH
H3N + COO- H3N + COO- H3N + COO- NADPH
O 2
H H2N 2N 2N
NH
Figura 1. 22 Biosintesi del l’ossido nitrico
+ NO
Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un importante
messaggero intra- ed inter-cellulare regolando
molte funzioni quali la pressione arteriosa, la
respirazione, la coagulazione del sangue, e alcune
attività cerebrali (17). Esso, inoltre, gioca un ruolo
determinante nella difesa dalle infezioni batteriche e
nella prevenzione dei tumori (30). Tuttavia, se generato
in quantità abnormi esso è anche un potente
killer cellulare.
Nell’NO gli elettroni spaiati del livello energetico
più esterno (cinque appartenenti all’azoto e sei
all’ossigeno) generano una specie chimica non carica,
dotata di proprietà paramagnetiche e, dunque,
un radicale (figura 1. 23) (17).
Figura 1. 23 Formula di struttura dell’ossido nitico
In quanto radicale libero, l’NO reagisce rapidamente
con altre specie aventi elettroni spaiati.
O
H3N + COO- H3N + COO- H3N + COO- N-idrossiarginina L-citrullina
N O
13
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
L’effetto finale può essere un’ossidazione, una
riduzione oppure il legame con altre molecole, in
funzione del microambiente (figura 1. 24) (17).
N 2 O 3
RS–NO
RNH–NO
R-SH / R-NH 2
NO -
3
Redox
L-arginina
NOS
NO -
2 NO• pH

Specificamente, il perossinitrito è responsabile
della nitrazione dei residui fenolici delle tirosine, che
conduce alla formazione di nitrotirosina, un marker
della tossicità tissutale dell’NO. A pH neutro, il perossinitrito,
genera, a sua volta, l’acido perossinitroso
(ONOOH). Quest’ultimo può attaccare diverse
molecole con produzione secondaria di radicale idrossile
ed altri intermedi reattivi.
Tuttavia, in quanto radicale libero, l’NO può anche
svolgere un’attività antiossidante, come scavenger
dei radicali alcossilici e perossilici.
14
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
La prevalenza dell’una o dell’altra azione dipenderà
dalle concentrazioni relative delle singole specie
reattive implicate.
Per completezza, occorre aggiungere che, oltre
alle specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto, assumono
rilevante importanza, anche i radicali centrati
sul carbonio (importanti intermedi della perossidazione
lipidica) e le specie reattive del cloro (in particolare
l’acido ipocloroso, responsabile della formazione
delle cloroammine), il cui ruolo biologico è descritto
nei capitoli successivi (15, 31).

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2. 1 Generalità e definizioni
Le specie reattive e, in particolare quelle
dell’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), sono
potenzialmente lesive. Per questo motivo, gli organismi
viventi hanno sviluppato nel corso di millenni
di evoluzione un complesso sistema di difesa, costituito
dall’insieme degli antiossidanti.
Gli antiossidanti sono agenti chimicamente eterogenei
(enzimi, vitamine, sostanze similvitaminiche,
oligoelementi, ecc.) in grado di prevenire
o annullare l’azione, tipicamente ossidante, delle
specie chimiche reattive (9, 39).
Gli antiossidanti possono essere classificati secondo
diversi criteri: sulla base dell’origine, in endogeni
ed esogeni, sulla base della natura chimica,
in enzimatici e non enzimatici, e sulla base della solubilità,
in liposolubili e idrosolubili. Sulla base del
meccanismo d’azione prevalente, invece, considerando
solo quelli fisiologici, essi possono essere distinti
in 4 classi principali: antiossidanti preventivi,
scavenger e chain breaker, agenti di riparo e agenti
di adattamento.
2. 2 Gli antiossidanti preventivi
2. 2. 1 Premessa
Gli antiossidanti preventivi sono agenti che, attraverso
vari meccanismi, quali la chelazione dei
metalli di transizione, ed il “quenching” o
l’inattivazione dei perossidi prevengono la formazione
di specie reattive (tabella 2. 1).
Tabella 2. 1 Classificazione degli antiossidanti preventivi
Classe Esempi Meccanismod’azione
Sequestratori
di metalli
Transferrina, lattoferrina Sequestro di ferro
Aptoglobina Sequestro di emoglobina
Emopessina Stabilizzazione dell’eme
Ceruloplasmina, albumina Sequestro di rame
Carotenoidi Quenching dell’ossigeno singoletto
“Quencher”
di ROS Superossido dismutasi
Catalasi
* +
2O2 + 2H → H2O2 + O2
2 H2O2 → 2 H2O + O2
Perossidasi
H2O2 + AH2 → 2 H2O + A
LOOH + AH2 → LOH + H2O + A
Inttivatori o
“breaker” di
perossidi
Glutatione perossidasi (plasmatica)
Glutatione perossidasi dei
perossidi fosfolipidici
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG
PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG
PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG Glutatione perossidasi (intracellulare)
Glutatione–S–trasferasi
H O + 2 GSH → 2 H O + GS–SG
2 2 2
LOOH+2GSH → LOH+H2O+GS–SG
Scissione dei perossidi lipidici
2. 2. 2 Agenti sequestranti i metalli di transizione
Il ferro ed il rame rappresentano due metalli di
transizione essenziali per la sintesi e la modulazione
dell’attività di numerose proteine, specialmente
quelle enzimatiche. Tuttavia, allo stato libero, essi
possono agire da catalizzatori nella scissione dei perossidi
(perossido di idrogeno, H 2O 2, e idroperossidi,
R-OOH), che porta alla generazione di radicali liberi
estremamente reattivi ed istolesivi, quali l’idrossile,
Capitolo 2
Il sistema di difesa antiossidante
17
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
l’alcossile e il perossile, secondo la reazione di Fenton
(vedi capitolo precedente).
Pertanto, la prima strategia di difesa antiossidante
dell’organismo è affidata ad una serie di proteine
aventi la capacità più o meno specifica di
complessare i metalli di transizione ed impedire a
questi ultimi di esistere in forma libera e, quindi, di
esercitare la loro azione lesiva. Tali proteine sono, a
rigore, potenti antiossidanti preventivi, in quanto
impediscono la generazione di radicali liberi (in questo
caso generati dalla scissione metallo-catalizzata
dei perossidi) (20).
Fra le varie proteine ad azione “chelante”, la
ferritina forma un complesso con il ferro all’interno
delle cellule, mentre la transferrina e la lattoferina
legano il ferro nei liquidi extracellulari, nel sangue
circolante e nelle secrezioni, rispettivamente. Va rilevato
che, in condizioni fisiologiche, la concentrazione
plasmatica della transferrina, di circa tre volte
superiore a quella necessaria al normale trasporto
del ferro, assicura l'assenza di ioni ferro nel plasma.
Inoltre, il ferro liberatosi da eventuali processi emolitici
sotto forma di eme – e che risulta cataliticamente
attivo, secondo la reazione di Fenton – viene
“bloccato”, nel sangue circolante, da proteine specifiche
quali l’aptoglobina (che veicola l’emoglobina) e
l’emopessina (che stabilizza l’eme) (35).
La ceruloplasmina ha il compito di chelare specificamente
il rame circolante. Analoga funzione
viene svolta, sebbene in maniera meno specifica,
dall’albumina. Purtroppo, alcune condizioni, quali
l’acidosi, anche lieve, possono indurre una modifica
conformazionale delle proteine plasmatiche impegnate
nel “sequestro” dei metalli di transizione,
provocando il rilascio di questi ultimi in forma libera.
Una volta liberi, il ferro o il rame innescheranno la
reazione di Fenton con scissione degli idroperossidi
organici circolanti in radicali alcossilici e perossilici
estremamente reattivi. Dall’azione di questi dipenderà
in larga misura il danno dell’endotelio ed il
processo di perossidazione di componenti plasmatiche
chiave (es. lipoproteine), eventi fondamentali
nella patogenesi dello stress ossidativo.
2. 2. 3 “Quencher” dell’ossigeno singoletto
L’ossigeno molecolare (O2), in quanto portatore
di due elettroni spaiati ma con spin paralleli negli
orbitali esterni, presenta una natura diradicalica che
ne limita fortemente la reattività. Tuttavia, quando
questi elettroni più esterni riescono ad assorbire
una sufficiente quota di energia essi possono andare
incontro o ad un’inversione di spin o ad un salto

di orbitale (transizione), generando un nuovo stato
dell’ossigeno, denominato ossigeno singoletto ( 1 O2).
E’ stato calcolato che il 20% circa dell’ossigeno molecolare
consumato nel corso del “respiratory burst”
dai leucociti polimorfonucleati subisca questa conversione
ad opera della mieloperossidasi (24).
L’ossigeno singoletto si comporta come un radicale
libero molto reattivo, in grado di attaccare e danneggiare
molecole ad alta densità elettronica, quali
gli acidi grassi poliinsaturi, ricchi di doppi legami,
compresi quelli delle LDL (perossidazione lipidica)
(59).
Gli antiossidanti in grado di “smorzare” l’azione
potenzialmente ossidante dell’ossigeno singoletto
sono detti “quencher” e ne costituiscono importanti
esempi i caroteni e la superossidodismutasi (14).
I caroteni sono lipidi poliisoprenoidi poliinsaturi
a lunga catena carboniosa. Fra le numerose specie
chimiche diffuse in natura (almeno 600) la più studiata
è il β-carotene, presente nei vegetali come
pro-vitamina A, e disponibile anche in commercio
come una miscela di isomeri trans (90%) e cis
(10%) (figura 2. 1) (6, 16, 19, 28, 29, 34).
Figura 2. 1 Formula di struttura del β-carotene
Nei vegetali, i caroteni – abbondantemente distribuiti
nei cloroplasti – esercitano un’importante
funzione di quenching nei confronti dell’ossigeno
singoletto generato durante la fotosintesi (6, 16,
19, 28, 29, 34).
A questo meccanismo è dovuta in larga misura
anche l’azione antiossidante attribuita al β-carotene
negli animali, secondo la reazione:
1 O2 + caroteni → O2 + carotenoidi + Kcal
E’ stato calcolato che una molecola di βcarotene
è in grado di neutralizzare circa 1000 molecole
di ossigeno singoletto senza andare incontro
a rottura. Inoltre, sembra che i carotenoidi plasmatici
siano in grado di inattivare circa il 40% della
specie reattiva dell’ossigeno in questione generata
nel torrente circolatorio, contro il 20% attribuito
all’α-tocoferolo (24).
La superossidodismutasi (SOD), scoperta nel
1968, è un enzima presente praticamente in tutte le
cellule, la cui attività catalitica consiste nella dismutazione
di due molecole di anione superossido in
18
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
una molecola di perossido d'idrogeno ed una di ossigeno,
secondo la reazione:
2O2 • + 2H + → H2O2 + O2
Tra i prodotti della reazione, il perossido d'idrogeno
è un debole ossidante ed è relativamente stabile,
in particolare se confrontato con il precursore
anione superossido. Questo è il motivo per cui la
SOD rientra fra gli enzimi ad azione antiossidante.
In realtà, come si è detto, in particolari condizioni,
quali l’acidosi, in presenza di metalli di transizione
allo stato libero, il perossido d’idrogeno può generare,
secondo la reazione di Fenton, il radicale idrossile,
il più potente radicale istolesivo. Tuttavia, in
condizioni fisiologiche, ciò non accade e se il perossido
d’idrogeno dovesse aumentare oltre misura
nella cellula, esso sarebbe definitivamente inattivato
dalla catalasi (vedi più avanti).
All’interno delle cellule sono state identificate
due isoforme della SOD, la Cu-Zn-SOD e la Mn-
SOD.
La Cu-Zn-SOD è una proteina dimerica, le cui
due subunità, legate tra loro da un ponte disolfuro,
sono costituite ciascuna da una catena polipeptidica
di 151 amminoacidi legata ad atomo di Cu ed uno di
Zn (metalloproteina). Mentre gli ioni Cu probabilmente
giocano un ruolo chiave nella catalisi, consentendo
all’enzima di interconvertirsi nelle sue due
forme funzionali (ossidata e ridotta), gli ioni Zn
sembra abbiano il ruolo di stabilizzare l’enzima dal
punto di vista conformazionale. La Cu-Zn-SOD è localizzata
elettivamente all’interno del citoplasma
(37).
La Mn-SOD è una metalloproteina il cui esatto
meccanismo d’azione, non ancora ben chiarito, si
basa su modifiche redox del manganese. Può trovarsi
sia nel citoplasma che nei mitocondri.
Accanto a queste due forme, intracellulari, di
SOD ne esisterebbe una terza, a localizzazione extracellulare
(EC-SOD).
2. 2. 4 Agenti inattivanti i perossidi
Una classe importante di sostanze derivate
dall’attacco dei ROS su substrati organici, quali lipidi,
amminoacidi, e nucleotidi, sono gli idroperossidi
(R-OOH) che, insieme al perossido di idrogeno
(H2O2), costituiscono i perossidi.
Questi ultimi, pur dotati di una certa capacità
ossidante, sono relativamente stabili. Tuttavia, in
presenza di un metallo di transizione e in ambiente
acido, possono essere decomposti liberando radicali
altamente reattivi, quali l’alcossile, il perossile e
l’idrossile.
Pertanto, fra i sistemi antiossidanti endogeni esiste
una classe di enzimi il cui fine è quello di inattivare
i perossidi, sì da prevenire il danno che potrebbe
derivare dalla loro scissione metallocatalizzata.

Tali agenti vengono genericamente definiti perossidasi
e mostrano un comune meccanismo
d’azione, che prevede la demolizione del perossido
con liberazione di una molecola di ossigeno molecolare
e una di alcool (se il substrato è un idroperossido)
oppure di acqua (se il substrato è il perossido
di idrogeno), secondo la reazione generale:
2 X-O-O-H → 2 X-OH + O 2
(X=H, perossido di idrogeno; X=R, idroperossido)
La perossidasi che ha come substrato il perossido
di idrogeno viene chiamata catalasi (CAT) e rende
possibile la seguente reazione:
2 H2O2 → 2 H2O + O2
Si tratta di un enzima formato da 4 subunità,
ciascuna delle quali contiene un gruppo eme con un
sito attivo, stabilizzato da una molecola di NADPH.
La CAT si trova nella maggioranza delle cellule animali
e vegetali in organuli denominati perossisomi
ove la sua funzione è quella di inattivare il perossido
di idrogeno. Essa è stata ritrovata anche nel citosol
ma il suo ruolo in questo compartimento intracellulare
non è completamente noto. In generale, comunque,
la CAT viene attivata da elevate concentrazione
di perossido di idrogeno e, in qualche modo,
lavora in maniera sequenziale rispetto alla SOD,
svolgendo un’importantissima funzione antiossidante.
Nell’uomo l’enzima è espresso ad elevati livelli
nel fegato e negli eritrociti (37).
Le perossidasi in grado di agire non solo sul perossido
di idrogeno ma anche su altri perossidi organici
e che presentano come cofattore il glutatione
sono chiamate anche glutatione-perossidasi (GSHPx
o GPx) (53).
Il glutatione è un tripeptide – costituito da acido
γ-glutammico, cisteina e glicina – che può esistere
in una forma ridotta (GSH) oppure in una forma dimerica,
ossidata (GS–SG). L’interconversione
dall’una all’altra forma, resa possibile grazie al
gruppo tiolico della cisteina, è sfruttata dalle GPx
per catalizzare reazioni di ossido-riduzione finalizzate
all’inattivazione del perossido di idrogeno o di altri
perossidi, secondo lo schema generale delle perossidasi
sopra riportato (17).
Il glutatione ha una diffusione ubiquitaria nei
mammiferi nei cui tessuti agisce non solo come riducente
dei perossidi (antiossidante preventivo) ma
anche come nucleofilo nei confronti di specie elettrofile
radicaliche, come quelle generate dal metabolismo
di xenobiotici (scavenger) (45, 60).
La concentrazione intracellulare di glutatione
aumenta fortemente in presenza di elevati livelli di
19
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
perossidi. In queste condizioni, per evitare reazioni
collaterali fra i gruppi tiolici delle proteine ed il GS–
SG, quest’ultimo viene escreto grazie all’attivazione
di una specifica traslocasi di membrana ATPdipendente
(5).
La classica GPx catalizza la riduzione del perossido
d’idrogeno ad acqua ed ossigeno molecolare
attraverso la conversione (ossidazione) del GSH a
GS–SG:
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG
La GPX è formata da 4 subunità apparentemente
uguali e contiene selenio sotto forma di selenocisteina
nelle varie subunità. Pertanto, la carenza di
selenio provoca una marcata riduzione dell’attività
dell’enzima. Presente nel citosol e nei mitocondri, la
GPx agisce attraverso un meccanismo piuttosto
complesso che prevede un ciclo di reazioni nel quale
sono coinvolti anche la glutatione transidrogenasi
e la glutatione reduttasi. Sembra, comunque, che la
GPx agisca quando i bassi livelli di perossido
d’idrogeno non sono sufficienti ad attivare la catalasi.
La GPx può anche rimuovere molecole di idroperossidi
lipidici derivati dai processi di lipoperossidazione.
A questo proposito, giova sottolineare che, oltre
alla GPx “classica appena” descritta, esiste anche
una GPx, selenio-dipendente, indicata con la sigla
SeI-GP che non metabolizza il perossido di idrogeno
ma solo i perossidi organici, con un ruolo, quindi,
preferenziale, di protezione specifica nei confronti
della lipoperossidazione (15).
In condizioni ideali, la SOD, la CAT e la GPx agiscono
in maniera ordinata e sequenziale potenziandosi
nel loro importante ruolo di antiossidanti (figura
2. 2).
Figura 2. 2 Ciclo del glutatione e interazioni fra
enzimi antiossidanti
2. 3 Gli scavenger di radicali liberi
ed i chain breaker
2. 3. 1 Premessa
I sistemi di difesa antiossidante, oltre alla “prima
linea”, estremamente specifica, costituita dagli

enzimi (SOD, CAT, GPx), formano anche una seconda
barriera difensiva, aspecifica, alla cui composizione
concorrono gli scavenger e i chain breaker,
sostanze generalmente a basso peso molecolare,
chimicamente eterogenee, alcune idrosolubili, altre
liposolubili (12).
Gli scavenger (lett. “spazzini”) sono agenti che
riducono la concentrazione di radicali liberi rimuovendoli
dal mezzo in cui si trovano, grazie alla loro
capacità di interagire direttamente con essi, e,
quindi, di inattivarli. Essi comprendono l’ubichinone,
i composti tiolici e l’acido urico (5).
I chain breaker (lett. “che spezzano la catena”),
invece, sono agenti in grado di bloccare la propagazione
delle reazioni radicaliche a catena. Tra questi
sono da citare carotenoidi, tocoferoli ed ascorbato.
Secondo alcuni ricercatori, gli scavenger dovrebbero
essere distinti dagli antiossidanti propriamente
detti. Infatti, mentre gli scavenger sono agenti
che riducono la concentrazione di radicali liberi
rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano, gli antiossidanti
(es. difenilammina), invece, sono agenti
che inibiscono il processo dell’autoossidazione, di
cui costituisce un importante esempio l’irrancidimento
dei grassi. Questo fenomeno, ben noto in
scienza dell’alimentazione, viene definito autoossidazione
perché avviene attraverso una sequenza
autocatalitica di reazioni radicaliche in presenza di
ossigeno. Alternativamente si può usare il termine
di perossidazione, in quanto lo stesso processo genera
intermedi con caratteristiche di perossidi
(R–O–OR) (figura 2. 3).
ROOH
RH
R*
RO*
ROH
*OH
RH
H H2O 2O 2O 2O
R*
ROO * ROO * ROO * ROO *
ROOR
RO*
RH H H2O 2O 2O 2O
O 2
ROO*
Figura 2. 3 Ciclo di reazioni della perossidazione
In ogni caso, la linea di difesa costituita da scavenger
e chain breaker è in grado di bloccare l’inizio
o impedire la propagazione delle reazioni radicaliche
a catena.
2. 3. 2 Scavenger
Gli scavenger comprendono un agente liposolubile,
l’ubichinone, ed una serie di agenti idrosolubili,
quali i composti tiolici e l’acido urico.
L’ubichinone è una sostanza liposolubile il cui
nome gli deriva dal fatto di essere presente in tutti i
sistemi di accoppiamento di energia legati alle
membrane. Alternativamente, esso viene chiamato
anche coenzima Q. Dal punto di vista chimico è un
derivato isoprenoide costituito da un anello chinoni-
O 2
R*
RH: molecola organica
ROOH: idroperossido
ROO*: radicale idroperossilico
RO*: radicale alcossilico
20
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
co e da una catena laterale di lunghezza variabile,
in funzione delle numero delle unità ripetitive di isoprene.
Uno dei più noti derivati dell’ubichinone è
il coenzima Q10, detto così perché possiede, appunto,
una catena laterale di 10 unità isopreniche (figura
2. 4).
Figura 2. 4 Formula di struttura del coenzima Q10
Il coenzima Q viene sintetizzato a livello cellulare
lungo la via del mevalonato (la stessa del colesterolo)
che ha inizio nel reticolo endoplasmatico.
Da qui esso viene traslocato nel Golgi e quindi nelle
varie sedi cellulari, quali la plasmamembrana e la
membrana dei mitocondri. Una piccola quota è rilevabile
anche nel sangue.
Oltre ad essere uno dei principali trasportatori
di elettroni, il coenzima Q rientra in un complesso
sistema di ossido-riduzioni a livello mitocondriale
(2).
In realtà, l’ubichinone può comportarsi sia da
scavenger, interagendo interamente con specie radicaliche,
sia da generatore di specie reattive, attraverso
il fenomeno dell’autoossidazione:
CoQ + O2 • ⇔ CoQ • + O2
L’equilibrio di questa reazione dipende dalle
condizioni chimiche del microambiente. Infatti, in
ambiente aprotico l’equilibrio è spostato verso destra
(funzione antiossidante) mentre in un ambiente
idrofilico esso è spostato verso sinistra (funzione
pro-ossidante) (5).
Pertanto, la zona centrale del bilayer fosfolipidico
delle membrane biologiche costituisce un ambiente
ottimale per l’attività antiossidante
dell’ubichinone nei confronti della lipoperossidazione.
Tale attività è esercitata principalmente dalla
forma ridotta del coenzima, detta anche ubichinolo
(QH2). Il relativo meccanismo, tuttavia, resta da
chiarire, anche se sono state avanzate due suggestive
ipotesi. Secondo la prima, l’ubichinone agirebbe
da chain breaker donando idrogeno per ridurre il
radicale perossilico o alcossilico:
CoQH + ROO • → CoQ • + ROOH

Secondo l’altra ipotesi, invece, l’ubichinolo reagirebbe
con la vitamina E ossidata (radicale fenossilico)
consentendone il recupero attraverso una serie
di reazioni cicliche (figura 2. 5).
Figura 2. 5 Possibili interazioni fra ubichinone,
tocoferolo ed ascorbato
Pertanto, l’ubichinone possiede effetti protettivi
nei confronti del danno ossidativo verso i lipidi, le
proteine e il DNA. Nel caso dei lipidi, esso agisce
come preventivo nei confronti sia dell’inizio che della
propagazione, mentre la vitamina E interviene
come chain breaker inibendo specificamente la propagazione,
ma non la reazione di inizio (13, 44).
Tra gli scavenger idrosolubili, i tioli rappresentano
una componente qualitativamente significativa
della barriera antiossidante sia intracellulare (GSH)
che plasmatica. In particolare, i gruppi sulfidrilici
(SH) delle molecole dei componenti plasmatici
(quali, ad esempio, le proteine, P-SH) sono in
grado di opporsi alla fase di propagazione dei processi
radicalici grazie alla loro capacità di inattivare i
radicali alcossilici (RO • ), secondo la reazione:
2 P-SH + 2 RO • 2 PS • + 2 ROH P-S-S-P + 2 ROH
I tioli, inoltre, sono anche in grado di neutralizzare
l’azione istolesiva del radicale idrossilico (HO • ),
secondo la reazione:
2 P-SH + 2 HO • 2 PS • + 2 H 2O P-S-S-P + 2 H 2O
Considerando questi eventi dal punto di vista
stechiometrico, una coppia di gruppi tiolici può ridurre
una coppia di radicali alcossilici (RO • ) o idrossilici
(HO • ), cedendo ad essa due elettroni (sotto
forma di due atomi di idrogeno).
In questo modo ambedue i tipi di radicali vengono
inattivati: i radicali alcossilici sono rilasciati
come molecole di alcool mentre i radicali idrossilici
diventano innocue molecole d’acqua. I gruppi tiolici
ormai ossidati, invece, reagiscono tra loro, generando
ponti disolfuro.
L’acido urico viene prodotto in seguito o
all’ossidazione dell’ipoxantina e della xantina, ad
opera della xantina ossidasi (nel corso del catabolismo
purinico), oppure all’azione catalitica di alcuni
enzimi deidrogenanti (figura 2. 6).
21
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
Figura 2. 6 Formula di struttura dell’acido urico
L’acido urico è una sostanza idrosolubile, a basso
peso molecolare, che si accumula nei liquidi corporei
a concentrazione di 0.25-0.44 mM; a pH fisiologico
esso è presente completamente in forma ionizzata
(urato), carica negativamente; come prodotto
del catabolismo purinico esso viene eliminato attraverso
le urine (18, 52).
Si è visto che l’urato un potente antiossidante
ad azione scavenger nei confronti del radicale idrossile,
dell’acido ipocloroso, dell’ossigeno singoletto e
dell’ozono. Inoltre, esso è in grado di chelare ioni di
metalli di transizione (quali ferro e rame) prevenendo
non solo la generazione di ROS, ma anche
l’ossidazione ferro-dipendente dell’ascorbato e la
stessa lipoperossidazione (10, 21, 40).
2. 3. 3 Chain breaker
I chain breaker comprendono sostanze liposolubili,
quali carotenoidi e tocoferoli, ed agenti idrosolubili,
quali la vitamina C o ascorbato.
Nell’ambito dei carotenoidi bisogna distinguere
la vitamina A dai caroteni propriamente detti.
La vitamina A comprende un’intera classe di sostanze
poliisoprenoidi poliinsature dotate di attività
retinolo-simile.
Nell’uomo la vitamina A viene per lo più generata
dalla scissione ossidativa dei carotenoidi vegetali
per azione di enzimi intestinali, quali la carotene
diossigenasi. Essendo fortemente insatura, essa risulta
molto reattiva nei confronti dei radicali perossilici,
che vengono intrappolati nella sua molecola,
la quale funziona prevalentemente da “chain breaker”
piuttosto che da donatrice di equivalenti riducenti.
In questo modo la vitamina A risulta particolarmente
efficace nel ridurre l’entità della perossidazione
lipidica (figura 2. 7) (5, 25, 31, 57).
Figura 2. 7 Formula di struttura della vitamina A

I caroteni, dei quali si è già parlato come agenti
“quencher”, possono agire anche da chain breaker.
Infatti, si ritiene che il β-carotene sia in grado di interrompere
la lipoperossidazione formando un complesso
proprio con il radicale idroperossilico, bloccandone
l’azione spiccatamente elettrofila (49).
I tocoferoli, riuniti in 8 principali isomeri sotto la
denominazione di vitamina E, sono ampiamente distribuiti
in natura e, in particolare, negli oli vegetali.
Tra essi, la forma α, cioè l’α-tocoferolo è risultata
essere la più importante per l’attività antiossidante
della vitamina E (figura 2. 8) (1, 41, 42).
Figura 2. 8 Formula di struttura della vitamina E
L’α-tocoferolo, singolarmente, agisce come un
antiossidante neutralizzando i radicali lipoperossilici
prima che interagiscano con il substrato, prevenendo,
in questo modo, il danno a carico di strutture
lipidiche complesse e delicate quali le membrane
biologiche e le lipoproteine plasmatiche (32, 46).
Esso può agire anche insinergia con altri antiossidanti,
quali carotenoidi, ubichinone, ascorbato, ecc.
In tale contesto, un’importante interazione è
quella con la vitamina C sulla superficie della plasmamembrana,
in quanto il tocoferolo è lipofilo
mentre l’ascorbato è idrofilo. L’ascorbato – come i
tioli, l’ubichinone, il glutatione e la cisteina – svolge
l’importante ruolo di ridurre il radicale tocoferilico,
rigenerando, così, il tocoferolo (30, 43).
La vitamina E, oltre all’attività antiossidante,
esercita un gran numero di altre funzioni. Infatti,
essa stabilizza le membrane biologiche regolandone
la fluidità, inibisce la lipoossigenasi e modula
l’attività della protein chinasi C (4, 58).
Infine, la vitamina C è una vitamina idrosolubile
la cui attività antiossidante, in vivo, è legata alla capacità
di esistere in una forma ridotta ed una ossidata
tra loro interconvertibili (figura 2. 9).
Figura 2. 9 Formula di struttura dell’acido ascorbico
22
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
Essa è in grado di agire come scavenger nei
confronti dei radicali superossido ed idrossilico e di
intrappolare i radicali idroperossilici nella fase acquosa
prima che diffondano nei lipidi della plasmamembrana,
prevenendo così la lipoperossidazione.
Inoltre, la vitamina C è anche in grado di rigenerare
la forma non radicalica della vitamina E dopo che
questa ha agito con un radicale libero (23, 60).
Come l’ubichinone, comunque, la vitamina C
può anche agire, in determinate circostanze, da agente
pro-ossidante: per esempio, in presenza di
metalli di transizione come il Fe 3+ ed il Cu 2+ può innescare
la perossidazione lipidica. Tuttavia, l’azione
antiossidante della vitamina, in vivo, risulterebbe
globalmente superiore a quella pro-ossidante (48).
2. 4 Gli agenti di riparo
Gli agenti di riparo comprendono esclusivamente
enzimi che intervengono dopo che il danno da
specie reattive si è instaurato. La loro azione –
spesso sequenziale – prevede dapprima
l’identificazione del segmento molecolare ossidato,
poi la separazione del frammento ormai inutilizzabile
e, infine, la sintesi e l’inserimento di un nuovo
segmento in sostituzione di quello danneggiato.
Appartengono agli agenti di riparo le idrolasi
(glicosidasi, lipasi, proteasi), le trasferasi e le polimerasi,
tutte indispensabili per la riparazione del
danno da radicali liberi di importanti molecole o
strutture cellulari (es. DNA, membrane, ecc).
Ovviamente, quando queste attività idrolitiche
superano le capacità di riparazione, esse si traducono
in un ulteriore danno tissutale.
2. 5 Gli agenti di adattamento
Gli agenti di adattamento comprendono tutte
quelle sostanze o tecniche o procedure attraverso
le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante
fisiologico di un organismo.
Per esempio, un corretto esercizio fisico o
l’adozione di un regime alimentare corretto ed equilibrato
sono misure di per sé in grado di controllare
il metabolismo ossidativo attraverso la riduzione
della produzione di specie reattive e l’induzione di
enzimi ad attività antiossidante.
2. 6 Altri agenti antiossidanti
Oltre agli agenti fin qui descritti esistono altre
sostanze ad attività antiossidante, quali la bilirubina,
i ginkolidi e, in particolare l’acido lipoico ed i flavonoidi
(33, 36, 54).
L'acido α-lipoico o acido 6,8-ditioctico, è uno
dei cinque cofattori del complesso sistema enzimatico
che catalizza la decarbossilazione ossidativa
degli α-chetoacidi (piruvato, α-chetoglutarato,
ecc.).

Questa sostanza viene sintetizzata dagli animali
e dall'uomo ma viene anche prontamente assorbita
dagli alimenti (figura 2. 10) (7, 55, 56).
Figura 2. 10 Formule di struttura dell’acido lipoico
Come la vitamina C ed il glutatione, anche
l’acido α-lipoico deve la sua attività antiossidante
alla sua capacità di esistere in una forma ridotta,
l'acido diidrolipoico (DHLA), ed una forma ossidata,
l’acido α-lipoico propriamente detto. Tale azione si
esplicherebbe contro un gran numero di ossidanti,
quali radicale idrossilico, l'acido ipocloroso e l' ossigeno
singoletto. Inoltre, l’acido α-lipoico è in grado
di chelare gli ioni metallici, mentre non risulta attivo
verso il radicale superossido ed il perossido d'idrogeno.
Infine, il DHLA appare inoltre in grado di rigenerare
altri antiossidanti dalla loro forma radicalica
direttamente (es. ascorbato) o indirettamente
(es. vitamina E) (3, 11, 26, 27, 50).
I flavonoidi sono dei polifenoli, ampiamente
presenti nei vegetali, che hanno dimostrato
di possedere una ben documentata attività antiossidante
e di chelazione dei metalli così d poter ricoprire
un ruolo importante nel controllo dello stress ossidativo
(figura 2. 11) (8, 22, 38, 47, 51).
Figura 2. 11 Formula di struttura del diidroflavonolo
23
Capitolo 2. Il sistema di difesa antiossidante
2. 7 Distribuzione del sistema di difesa
antiossidante negli organismi viventi
Il sistema di difesa antiossidante è regolarmente
distribuito nell’organismo, sia a livello extracellulare
che a livello intracellulare.
A livello dei liquidi extracellulari e, in particolare,
nel plasma, l’insieme delle sostanze potenzialmente
in grado di cedere equivalenti riducenti (atomi
di idrogeno o singoli elettroni) sì da soddisfare
“l’avidità di elettroni” che rende i radicali liberi instabili
costituisce la cosiddetta barriera antiossidante.
Ne fanno parte, nel plasma, tutte le proteine e,
in particolar modo, l’albumina, la bilirubina, l’acido
urico, il colesterolo, e i vari antiossidanti esogeni
introdotti con l’alimentazione o sotto forma di integratori
dietetici (ascorbato, tocoferolo, polifenoli
ecc.). Un ruolo di particolare importanza è svolto,
nel contesto di questa barriera, dai gruppi tiolici (-
SH).
All’interno delle cellule il sistema di difesa antiossidante
ha una sua ben precisa compartimentalizzazione
(figura 2. 12).
Vitamina E, PUFA,
β−carotene
Glutatione, GPx, SOD,
selenio, ascorbato,
Catalasi
Ubichinolo, selenio,
vitamina E, SOD, GPx
Vitamina E,
β−carotene
Figura 2. 12 Compartimentalizzazione dei sistemi antiossidanti
E’ importante sottolineare che gli antiossidanti
di tipo enzimatico sono presenti prevalentemente a
livello intracellulare mentre gli altri prevalgono a livello
extracellulare. Qui, gli agenti liposolubili (es.
tocoferoli), entrando nella compagine delle biomembrane,
costituiscono la prima linea di difesa
contro l’attacco dei radicali liberi, mentre quelli idrosolubili
(es. ascorbato), invece, intervengono soprattutto
nel contesto della matrice solubile del citoplasma
e degli organuli cellulari.

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Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
Capitolo 3
Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici
3. 1 Generalità e definizioni
Lo stress ossidativo è una particolare condizione
indotta da un’accentuazione in senso proossidante
dell’equilibrio dinamico fra processi ossidativi
e riduttivi che hanno luogo continuamente in
ogni cellula, quale espressione fisiologica delle
complesse trasformazioni biochimiche del metabolismo
terminale.
Sulla base di questo tentativo di inquadrare un
aspetto della biochimica dinamica che è tuttora oggetto
di ampio dibattito fra i ricercatori, lo stress ossidativo
si configura come un fenomeno che riguarda,
almeno in prima battuta, la singola cellula che,
per effetto della propria attività metabolica, non di
rado sotto lo stimolo di agenti ad essa esterni, è costretta
a subire gli effetti potenzialmente lesivi di
una serie di reazioni indesiderate che accompagnano
quei processi ossidativi da cui dipende la sua
stessa esistenza.
3. 2 Basi biochimiche
Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) rappresentano
una minaccia mortale per la vita della cellula
che ne tiene sotto controllo la produzione grazie
ad un efficiente sistema di difesa (6, 22, 34).
Tuttavia, in particolari condizioni, quando la
produzione di ROS è eccessiva e/o la capacità di
smaltire questi ultimi si riduce, la cellula è costretta
a subire il danno da radicali liberi (5, 27).
Trasferendo il discorso all’intero organismo,
possiamo definire lo stress ossidativo come una
particolare forma di stress chimico indotto dalla
presenza di una quantità eccessiva di specie reattive
per un’aumentata produzione delle stesse e/o
per una ridotta capacità di smaltirne le quantità
comunque prodotte (11).
E’ ovvio che il discorso è ben più complesso, ma
il concetto appena esposto è sufficiente per comprendere
i principali aspetti fisiopatologici dello
stress ossidativo e le relative implicazioni sul piano
diagnostico e terapeutico (figura 3. 1) (16).
Radiazioni,farmaci, metalli pesanti
Fumo di sigaretta, alcool, inquinamento
Esercizio fisico inadeguato, sedentarietà
Infezioni ed altre malattie
Ridotta assunzione
e/o diminuita sintesi
e/o ridotta capacità di utilizzazione
e/o aumentato consumo di antiossidanti
Specie reattive ↑ Difese antiossidanti ↓
Malattie
cardiovascolari
Demenza,
M. di Parkinson
Danno cellulare
Invecchiamento
precoce
Infiammazioni,
tumori
Figura 3. 1 Eziopatogenesi dello stress ossidativo
Altre
malattie
27
Comunque determinatasi, infatti, l’eccessiva
produzione di specie reattive, non più adeguatamente
controllata dai sistemi di difesa antiossidanti,
provoca una serie di alterazioni funzionali e strutturali
della cellula, che possono condurre all’apoptosi
o addirittura alla necrosi (tabella 3. 1) (8, 9, 19).
Tabella 3. 1 Alterazioni biochimiche cellulari nello s. ossidativo
• Perossidazione biomolecole (lipidi, amminoacidi, nucleotidi…)
• Ossidazione e deplezione di GSH
• Ossidazione dei tioli proteici
• Ossidazione dei nucleotidi piridinici
• Lesioni del DNA ed attivaz. poli(ADP-ribosio)polimerasi
• Alterazioni dei meccanismi di trasduzione del segnale
• Alterazioni dell’omeostasi ionica
• Alterazioni del citoscheletro
• Inibizione della glicolisi
• Deplezione di NAD+
• Caduta del potenziale di membrana mitocondriale
• Deplezione di ATP
• Aumento della permeabilità della membrana plasmatica
Sul piano generale, queste lesioni – dapprima
cellulari e poi tissutali – saranno responsabili, infine,
di patologie d’organo, quali ad esempio il morbo di
Crohn o la pancreatite, oppure di condizioni sistemiche,
quali l’invecchiamento precoce, l’aterosclerosi e
così via (7, 10, 30, 35).
Comunque, va ancora una volta precisato che
non sempre è possibile stabilire se i radicali liberi
sono la causa oppure l’effetto delle lesioni osservate
(12).
Le principali cause di aumentata produzione di
ROS sono da individuarsi in fattori ambientali, situazioni
fisiologiche, stile di vita, fattori psicologici, malattie
e fattori iatrogeni (tabella 3. 2).
Tabella 3. 2 Cause di aumentata produzione di specie reattive
Eziologia Esempi
Fattori ambientali Radiazioni, inquinamento
Stati fisiologici Gravidanza (?)
Stile di vita Alimentazione, alcool, fumo, es. fisico incongruo
Fattori psicologici Stress psico-emotivo (?)
Malattie Infiammazioni, infezioni, vasculopatie, tumori
Fattori iatrogeni Farmacoterapia, radioterapia, raggi X
Bisogna sottolineare che il fumo di sigaretta,
l’abuso di alcool ed altri fattori correlati con lo stile
di vita sono importanti responsabili dell’aumento
della produzione di ROS. Lo stesso effetto è indotto
da un’attività fisica incongrua (eccessiva o insufficiente).
Infine, è riconosciuto il ruolo dei numerose
malattie, su base disreattiva o infettiva (es. artrite
reumatoide e infezioni batteriche) nel favorire
l’incremento dei ROS.
Una riduzione delle difese antiossidanti è da
imputarsi sostanzialmente ad un deficit assoluto o
relativo di antiossidanti, comunque determinatosi.
In tale contesto, alcune malattie, quali la celiachia,

possono provocare uno stress ossidativo riducendo
la disponibilità di antiossidanti assunti con
l’alimentazione (tabella 3. 3).
Tabella 3. 3 Cause di ridotte difese antioossidanti
Eziologia Esempi/meccanismi
Ridotta assunzione
Ipovitaminosi,
di antiossidanti
diete monotone
Ridotto assorbimento
Sindromi da malassorbimento,
di antiossidanti
celiachia
Ridotta capacità di utilizzazione Deficit dei meccanismi di cap-
di antiossidanti
tazione e/o trasporto
Insufficienza dei sistemi
Fattori genetici
enzimatici antiossidanti
e/o iatrogeni
Eccessivo consumo
Eccessiva produzione
di antiossidanti
di specie reattive
Assunzione
Sovraccarico del sistema
di farmaci
microsomiale
Malattie Vari
A proposito delle malattie, va precisato che esse
alcune di esse si accompagnano ad un’aumentata
produzione di specie reattive, altre ad una riduzione
delle difese antiossidanti, altre ancora, infine, alla
combinazione di ambedue i meccanismi.
Dal punto di vista biochimico, considerando il
fenomeno dello stress ossidativo all’interno della
cellula, è indubbio che all’origine delle alterazioni
funzionali e strutturali vi è un aumento della produzione
di specie reattive per stimolazione parziale o
generalizzata del metabolismo, spesso sotto la spinta
di fattori esogeni (5, 7, 22, 30).
I ROS, resisi disponibili in grandi quantità, sono
in grado di attaccare qualsiasi substrato con il quale
giungono a contatto, strappando ad essi l’elettrone
o gli elettroni necessari per raggiungere la propria
stabilità. Ciò, a sua volta, innesca processi radicalici
a catena che, se non bloccati tempestivamente,
possono provocare gravi conseguenze sul piano,
dapprima funzionale, poi anche strutturale (figura 3.
2) (5, 6, 8, 16).
Anione superossido O .
2
Radicale idrossile HO*
Radicale peridrossile HO 2 *
Metallidi transizione/
Sistemi enzimatici
Agenti esterni, attività metabolica
Substrati organici RH (glicidi, lipidi,
amminoacidi, nucleotidi, etc.)
Alterazioni funzionali e/o strutturali della cellula
Figura 3. 2 Patogenesi dello stress ossidativo: aspetti biochimici
Fra i vari meccanismi cito- ed isto-lesivi assume
rilevante importanza quello correlato con la formazione
degli idroperossidi (ROOH), una classe di derivati
o metaboliti reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen
metabolites, ROM) (16).
Questo meccanismo, tipico delle reazioni radicaliche
a catena, viene innescato dall’attacco, da parte
di un ROS (X • , per esempio, il radicale istolesivo
HO • ), di un generico substrato organico R-H (es. un
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
Ossigeno singoletto 1 Ossigeno singoletto O2 Perossido di idrogeno H2O2 1O2 Perossido di idrogeno H2O2 Metallidi transizione/
Sistemi enzimatici
Idroperossido R-OOH
Radicale alcossile R-O*
Radicale idroperossile R-OO*
Superamento difese
antiossidanti
28
glicide, un lipide, un amminoacido, un nucleotide
ecc.) (figura 3. 3) (11).
1) X• 1) X + R–H → X–H + R• • + R–H → X–H + R• 2) R• + O2 → R–OO• 3) R–OO• 2) R
+ R1H→ R–OOH + R •
1
4A) R •
1 + R1
• → R1 – R1 4B) R •
1 + R2H → R1H + R •
2 • + O2 → R–OO• 3) R–OO• + R1H→ R–OOH + R •
1
4A) R •
1 + R1
• → R1 – R1 4B) R •
1 + R2H → R1H + R •
2
RH/R RH/R1H/R 1H/R2H 2H = qualsiasi sostanza organica
Figura 3. 3 Reazioni radicaliche e produzione di perossidi
Il radicale HO • , avendo un elettrone spaiato, è
molto reattivo e, giunto a contatto con il substrato
R-H, strappa a quest’ultimo un atomo di idrogeno
per raggiungere la sua stabilità.
In tal modo, però, il sito radicalico è ora trasferito
al substrato che si trasforma in radicale R • .
Quest’ultimo, in presenza di ossigeno molecolare, è
convertito in radicale (idro)perossile ROO • , un nuovo
radicale che, a sua volta, può attaccare un altro
substrato organico R1H trasformandosi in idroperossido
ROOH.
La reazione a catena ormai innescata continuerà
a partire dall’ultimo radicale generato (R1 • ),
fino a quando non interverrà un meccanismo di
terminazione (es. reazione di combinazione, R1 • +
R 1 • , per produrre R1-R 1) oppure un antiossidante.
Il fenomeno della perossidazione – è bene ribadirlo
– non è esclusivo dei lipidi, ma può interessare
qualsiasi substrato organico, dagli amminoacidi alle
proteine, dai carboidrati ai nucleotidi.
Non v’è dubbio, tuttavia, che i lipidi, specialmente
se insaturi, e, quindi, con doppietti di legame
“disponibili” a soddisfare l’avidità di elettroni dei radicali
liberi, costituiscano target importanti
dell’attacco ossidativo, in particolar modo se inseriti
nel contesto di biomembrane e, come tali, maggiormente
esposti all’azione radicalica (16).
La perossidazione lipidica segue lo schema generale
delle reazioni radicaliche appena discusso,
con la variante che, se ad essere colpito è un acido
grasso poliinsaturo, quale l’acido arachidonico, ad
essere attaccato dal radicale istolesivo HO • è uno
dei doppi legami C-C (16).
In questo caso specifico, la sottrazione di un
atomo di iidrogeno da parte del radicale idrossile
genera un radicale centrato sul carbonio, che rapidamente
va incontro ad una redistribuzione dei
doppi legami trasformandosi in diene coniugato.
Quest’ultimo, in presenza di ossigeno si trasforma in
radicale perossilico.
Il radicale perossilico corrispondente rappresenta
un composto chiave in questa sequenza di reazioni,
perché può essere non solo trasformato in
idroperossido, ma andare incontro, per la sua peculiare
struttura chimica, ad ulteriore degradazione

sino a malonildialdeide e, infine, a pentano, se sono
disponibili ulteriori donatori di idrogeno (e, in ultima
analisi, fino a completa utilizzazione del sistema antiossidante);
queste considerazioni sono importanti
perché le attuali tecniche di valutazione dello “status
pro-ossidante” si basano proprio sull’ identificazione
e la successiva quantificazione di una o più
delle classi di intermedi generati nel corso di questo
processo di reazioni a catena (figura 3. 4).
R 1
16
15 14
Figura 3. 4 Perossidazione lipidica e sua valutazione
Comunque prodotti, gli idroperossidi sono sostanze
relativamente stabili e conservano una discreta
capacità ossidante. Pertanto, nella stessa cellula,
se si rendono disponibili metalli di transizione
allo stato libero, essi possono subire la reazione di
Fenton e generare così i più reattivi radicali alcossile
(RO • ) e idroperossile (ROO • ), che amplificano il
danno all’interno della cellula (18, 29).
A causa della potenziale tossicità, si ritiene che
gli idroperossidi vengano espulsi dalla cellula ed
immessi nei fluidi circolanti, fra cui il sangue. Se,
quindi, nel plasma, esistono condizioni tali da indurre
il rilascio di ferro allo stato ionico dalle proteine
circolanti (es. un’acidosi transitoria), si innescherà la
reazione di Fenton che genererà ancora una volta
radicali alcossile e idroperossile che amplificheranno
il danno a livello delle LDL e, soprattutto,
dell’endotelio (18, 32).
In ogni caso, gli idroperossidi plasmatici, conservando,
come nella cellula, ancora una discreta
capacità ossidante ed essendo relativamente stabili,
possono essere opportunamente messi in evidenza
e quantificati (vedi oltre, d-ROMs test) (figura 3. 5).
Agenti esterni
*OH
RH
O 2
Attività metabolica
H 2 O
R*
ROO*
Danno
ossidativo
R 1 *
R 1 H ROOH
Respirazione
Danno
ossidativo
Nucleo
13
12 11
H 2 O HO*
Acido arachidonico radicale
R 1
8
R 2
O OH
R 1
16
15
14
13
11
12
8
R 2
IDROPEROSSIDO
Citoplasma
Cellula
16
15 14
13
Acido arachidonico
R* RH
12 11
Misurazione
diretta MS
Figura 3. 5 Metabolismo ed effetti patogeni degli idroperossidi
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
R-O-O-H R-O*
Fe3+ Fe2+ pH ↓ Fe3+ Fe2+ pH ↓
OH- Ossidazione LDL
OH- Ossidazione LDL
R-O-O* R-O-O-H
H +
Danno H
endoteliale
+
Danno
endoteliale
8
R 2
Vaso sanguigno (capillare)
PENTANO
R 1
15 14 12 11
8
16
13
R 2
Acido arachidonico radicale
O 2
Electron transfer
9
8
6 5
R 1
16
15 13 11
14 12
Diene coniugato
8
R 2
Misurazione
diretta UV
O
11
12 14 15
13
16
Endoperossido ciclico
d–ROMs test
O O2
2
R 1
16
O
15 13
11
14 12
Radicale perossilico
O
8
R 2
O OO2 2
O
R 1
15 13
11
16 14 12
Perossido ciclico
TBAR test
CHO CHO
MDA
ROOH
Cellula
COOH
O
8
CH 3
R 2
29
A tal riguardo, si dice che gli idroperossidi sono
testimoni o marcatori ma anche amplificatori del
danno cellulare da radicali liberi (32).
Anche i livelli di malondialdeide (MDA) nel plasma
o degli alcani (pentano o etano) nell’espirato
forniscono informazioni sulla produzione di radicali
liberi, ma solo quando il sistema antiossidante presente
nel mezzo biologico si è esaurito.
Oltre agli idroperossidi, i ROS sono in grado di
generare diversi prodotti e sottoprodotti di ossidazione
reagendo con biomolecole target, le quali
possono essere più o meno permanentemente modificate,
frammentate o depolimerizzate. Tra questi
sottoprodotti sono da segnalare le cloroammine.
Infatti, diversi studi hanno dimostrato che il “respiratory
burst” dei fagociti attivati (macrofagi e
PMN) è in grado di produrre perossido di idrogeno
sia in vitro che in vivo. Queste cellule possono anche
rilasciare la mieloperossidasi, un enzima a ferro
eminico che catalizza la reazione tra perossido di
idrogeno e ione cloruro (già a concentrazioni fisiologiche)
per produrre il potente ossidante acido ipocloroso
(HClO) (33).
Tale sostanza gioca un ruolo importante nelle
difese messe in atto dai mammiferi contro microrganismi
patogeni, in quanto è dotata di potente
attività battericida (13).
E’ altresì noto, tuttavia, che un’eccessiva o inadeguata
produzione di HClO provoca lesioni a carico
dei tessuti nei mammiferi, e questo si ritiene essere
importante in alcune patologie umane, quali
l’aterosclerosi, le malattie infiammatorie croniche ed
alcune forme di neoplasie (13).
Numerosi studi hanno dimostrato che le proteine
rappresentano i bersagli principali dell’azione
dell’HClO, anche se questo potente ossidante reagisce
con un ampia varietà di altre molecole organiche
target, quali il DNA, i lipidi, il colesterolo,
l’NADH, e i tioli (13).
In particulare, è stato dimostrato mediante EPR
che l’HClO reagisce con i gruppi amminici di amminoacidi
e proteine per produrre cloroammine. Queste,
a loro volta, si decompongono e generano radicali
liberi, dimostrabili mediante tecniche di spin
trapping combinate con l’EPR, quali i radicali perossilici
ed alcossilici (13).
Secondo l’ipotesi più accreditata, il carbonio alfa
dell’amminoacido che ha subito l’attacco dell’acido
ipocloroso trasformandosi in cloroammina, si trasforma
in un sito radicalico. Il conseguente attacco
dell’ossigeno genera un radicale perossilico che, dimerizzando,
forma il tetrossido corrispondente. Dalla
scissione di quest’ultimo originerebbero, con
l’ossigeno molecolare, i radicali alcossilici. Il processo
descritto, che è favorito ma non dipende
dall’aggiunta di ioni ferro, sembra giocare un ruolo
determinante nell’amplificare il danno ossidativo da
radicali liberi nei fluidi extracellulari, quali il sangue,
anche quando, appunto, non sono disponibili metalli

di transizione allo stato libero (13). In ogni caso
questa possibilità alternativa di produrre radicali perossilici
e alcossilici rende ancora più importante il
significato delle informazioni fornite dal d-ROMs test
che, come verrà discusso dettagliatamente in seguito,
consente di dosare non solo gli idroperossidi generati
dalle “classiche” reazioni di perossidazione,
ma anche questi importantissimi marker di stress
ossidativo generati dalla decomposizione delle cloroammine.
Infine, fra gli altri meccanismi biochimici coinvolti
nel danno da radicali liberi sono da citare la
formazione di legami crociati, la condensazione di
proteine, la depolimerizzazione dell’acido ialuronico
(a livello della matrice extracellulare), l’interruzione
di uno o ambedue i filamenti del DNA, ecc. (tabella
3. 4) (15, 26).
Tabella 3. 4 Bersagli dei ROM e relativi prodotti di ossidazione
Specie Molecola
Prodotti di
reattive bersaglio ossidazione
Radicale idrossile
Radicale peridrossile
Lipidi (PUFA)
Idroperossidi
lipidici
Radicale idrossile
Radicale peridrossile
Proteine
Molecole con legami crociati,
idroperossidi
Radicale idrossile Acido
Glucosidi,
Radicale peridrossile jaluronico idroperossidi
Radicale idrossile DNA/RNA
Filamenti interrotti,
8-idrossiguanosina
3. 3 Eziopatogenesi
La produzione di specie reattive – si è detto –
avviene in ben definiti siti cellulari: plasmamembrana,
mitocondri, reticolo endoplasmatico liscio (microsomi),
perossisomi e citosol.
Va sottolineato che la generazione di ROS in
ciascuno di questi siti e gli effetti che da essa ne
scaturiscono assume caratteristiche peculiari in
rapporto alla specificità dello stimolo ed alle modalità,
qualità e quantità di specie reattive prodotte.
E’ evidente che la produzione di ROS da parte
dei PMN, conseguente ad attivazione della plasmamembrana,
richiede stimoli diversi da quelli necessari
per la generazione di specie reattive dalle cellule
muscolari, associata all’attivazione del metabolismo
mitocondriale.
In linea di massima, infatti, uno stimolo flogistico
tenderà prevalentemente ad attivare la plasmamembrana
dei PMN laddove un intenso esercizio
muscolare tenderà ad esaltare prevalentemente
l’attività metabolica mitocondriale delle cellule muscolari.
Ciascuna delle due situazioni, inoltre, è accompagnata
dalla produzione di specie reattive almeno
in parte diverse, per il diverso corredo enzimatico
delle cellule e delle relative strutture subcellulari interessate.
Per esempio, i mitocondri delle cellule muscolari,
che non possiedono la mieloperossidasi non potranno
generare HClO, che potrà essere prodotto
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
30
solo dalla plasmamembrana dei PMN attivati. Infine,
anche gli effetti sistemici delle due condizioni
saranno diverse.
Sulla base di queste considerazioni si può associare
a ciascun sito cellulare coinvolto nella produzione
di specie reattive un particolare tipo di stress
ossidativo: indotto prevalentemente da modificazioni
reattive della superficie cellulare, indotto
prevalentemente da una ridotta efficienza della respirazione
cellulare, secondario prevalentemente ad
induzione farmacometabolica, indotto prevalentemente
da variazioni della tensione intracellulare di
ossigeno e da meccanismi multipli combinati (figura
3. 6).
NADPH ossidasi
Lipoossigenasi
Stress ossidativo
da modificazioni reattive
della superficie cellulare
Xantina ossidasi
Aldeide ossidasi
Stress ossidativo
da variazioni
intracellulari della pO 2
NADH deidrogenasi
Citotocromo ossidasi
Stress ossidativo
da ridotta efficienza della
respirazione cellulare
Citocromo P 450
Citocromo b 5
Stress ossidativo
da induzione
farmacometabolica
Figura 3. 6 Fonti cellulari di ROS e stress ossidativo
E’ evidente che questa impostazione rappresenta
un’ipersemplificazione della ben più complessa e
multiforme situazione biochimica che si osserva a
livello cellulare, tissutale e sistemico nello stress ossidativo.
Rimanendo nell’esempio comparativo appena
discusso della plasmamembrana dei PMN e dei mitocondri
delle cellule muscolari, non bisogna dimenticare
che nelle condizioni disreattive, quali le infezioni,
la febbre indotta dall’attivazione dei PMN si
associa ad un’esaltazione del metabolismo e, viceversa,
lo sforzo muscolare intenso può associarsi a
condizioni infiammatorie, ritenute responsabili di lesioni
traumatiche dell’apparato muscoloscheletrico.
In altri termini, è difficile distinguere nettamente
uno stress ossidativo indotto da modificazioni reattive
della superficie cellulare da uno stress ossidativo
indotto da ridotta efficienza della respirazione
cellulare.
Anzi, estendendo ancor di più il discorso, nella
patogenesi del danno muscolare legato ad esercizio
fisico strenuo entra in gioco anche il meccanismo
dell’ischemia-riperfusione, che è alla base dello
stress ossidativo da variazioni della pO2 intracellulare.
E’ per questo motivo che nella classificazione
dei diversi tipi di stress ossidativo si è convenuto di
usare la circumlocuzione “stress ossidativo indotto
prevalentemente da…”.
Pur nella consapevolezza degli inevitabili limiti
legati ai tentativi di classificare i fenomeni biologici,
l’individuazione di cinque pattern di stress ossidativo

conserva, tuttavia, un’indubbia valenza didattica e
concettuale e, pertanto, può essere di grande aiuto
non solo al clinico, per l’inquadramento diagnostico
del soggetto con compromissione del bilancio redox,
ma anche al terapeuta, per orientare la scelta
nel complesso labirinto delle opzioni attualmente
disponibili (tabella 3. 5).
Tabella 3. 5 Pattern fondamentali dello stress ossidativo (SO)
SO* Sito † Meccanismo † ROS/ROM Correlazioni
I Membrana
Generazione
ac. arachidonico
Idroperossidi
An. superossido
Processi reattivi
(infiammazione)
Attivazione
NADPH ossidasi
An. superossido
Processi reattivi
(infiammazione)
II Mitocondri
Attivazione
metabolica
An. superossido Ipernutrizione,
Perossido di H es. fis. inadeguato
Disfunzione An. superossido Mitocondriopatie
mitocondriale Perossido di H (prim. o sec.)
III Microsomi
Attivazione
citocromi P450/b5
Vari
Alcol, farmaci,
xenobiotici
IV Citosol
Attivazione
xantina ossidasi
An. superossido Mal. da ischemia-
Perossido di H riperfusione
V
Almeno
due
Multipli
Variabilmente
centrati ‡
Fumo, inquinanti,
radiazioni
I: SO prevalentemente da modifiche reattive della superficie cellulare; II: SO
prevalentemente da ridotta efficacia della respirazione cellulare; III: SO
prevalentemente da induzione farmaco-metabolica; IV: SO prevalentemente
da variazioni della pO2 intracellulare; V: SO da meccanismi multipli. †
Prevalente. ‡ Carbonio, azoto, cloro ecc
Lo stress ossidativo indotto prevalentemente da
modificazioni reattive della superficie cellulare è
provocato dall’attivazione della plasmamembrana
che, come si è detto, è sede di attività enzimatiche
generatrici di ROS (28).
Questo tipo di stress ossidativo è generato, nella
sua forma più caratteristica, da una massiccia attivazione
dei leucociti pomorfonucleati ad opera di
batteri o endotossine o immunocomplessi (1).
Tali agenti, infatti, legandosi alla plasmamembrana
possono attivare l’NADPH ossidasi, con produzione
di anione superossido (figura 3. 7) (23).
Batteri
MPx MPx
PLA 2
H 2 O 2
Figura 3. 7 Produzione di specie reattive da PMN attivati
Anche l’attivazione delle lipoossigenasi, localizzate
sulla plasmamembrana dei PMN, si accompagna
a produzione di perossidi.
Lo stress ossidativo da modificazioni reattive
della superficie cellulare è tipico dei processi reattiquali
infezioni (es. batteriche) e infiammazioni (es.
artrite reumatoide).
Lo stress ossidativo indotto prevalentemente da
una ridotta efficienza della respirazione cellulare è
provocato da un’alterazione della funzionalità dei
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
PL AA PG
SOD SOD
Fenton/HW Fenton/HW
ROOH
Fe/Cu
Fe/Cu
NADPH-Ox NADPH-Ox
.
O 2
Proteasi
O 2
Cl- H2O R-NH Cl
2
RH H2O -
H2O R-NH2 RH H2O HClO OH .
R-NHCl HClO OH R*
.
R-NHCl R*
31
mitocondri che, come è noto, costituiscono una delle
fonti primarie di produzione di ROS (31). Nel caso
più semplice, l’aumentata produzione di specie reattive
è legata ad un’eccessiva attivazione metabolica,
quale si riscontra ad esempio durante lo sforzo fisico
intenso o nell’iperalimentazione; in questo caso
le specie reattive maggiormente generate sono i
prodotti di riduzione non tetravalente dell’ossigeno,
quali, ad esempio, l’anione superossido (15).
E’ anche possibile che un aumento della produzione
di ROS per ridotta efficienza della respirazione
cellulare sia legato ad una patologia primaria dei
mitocondri ovvero all’innescarsi di un circolo
vizioso (attivazione metabolica → produzione di
ROS da shunt elettronico → disfunzione mitocondriale
→ riduzione dell’efficienza respiratoria → ulteriore
produzione di ROS da shunt elettronico) (2,
4).
Lo stress ossidativo secondario prevalentemente
ad induzione farmacometabolica è provocato da
un’attivazione del sistema di idrossilazione a funzione
disintossicante del citocromo P450. Ne sono frequenti
cause l’etilismo cronico e l’esposizione a xenobiotici
(20).
In questi casi possono essere prodotte specie
reattive anche non centrate sull’ossigeno (es. il radicale
del paracetamolo, un comunissimo antipiretico
e analgesico) (21).
Lo stress ossidativo indotto prevalentemente da
variazioni della tensione intracellulare di ossigeno è
tipico delle lesioni da ischemia-riperfusione che si
osservano nell’infarto e in seguito ad interventi di
rivascolarizzazione chirurgica o trapianto di organi
(3, 17, 25).
Si ritiene che in questi casi entri in gioco
l’attivazione della xantina ossidasi con produzione di
perossido di idrogeno e anione superossido (figura
3. 8) (14, 24).
Infarto, bypass, trapianti
Macroischemia
Microischemia
pO 2 ↓
Acidosi
Sedentarietà
Deficit pompe
Disponibilità ossigeno ↓
Lattato ↑
Cellula
Glicolisi
Stato ridotto mitocondri ↑
anaerobica ↑
Rilascio Fe2+ / 3+
Amplificazione del danno
Rilascio F
dalle proteine
e2+ / 3+
Amplificazione del danno
Rilascio F
dalle proteine
e2+ / 3+
Amplificazione del danno
dalle proteine
Fosforilazione
ossidativa↓
Creatina ↑ Osmolarità ↑
Creatina-P↓
Sintesi ATP ↓ Decompartimentalizzazione
Disorganizzazione citoscheletro
ADP ↑
Attacco substrati
organici
AMP ↑
IMP ↑
H 2O2↑
.
O2 ↑
ROO* RO*
ROOH↑
ROOH
Inosina ↑ Ipoxantina Xantina
Xantina
Ossidasi
Acido urico
Vaso sanguigno
Deficit pompe
Calcio ↑
citosolico
Attivazione
proteasi
Danno
membrana
Alterazioni
omeostasi ionica
Xantina
deidrogenasi
Figura 3. 8 Meccanismi del danno da ischemia-riperfusione
Infine, il fumo di sigaretta, l’esposizione ad inquinanti
atmosferici o a radiazioni ionizzanti o UV
ovvero ad agenti tossici saranno responsabili di
uno stress ossidativo conseguente all’attivazione di
meccanismi multipli combinati.

3. 4 Alterazioni del bilancio ossidativo
e pratica sportiva
In condizioni ordinarie, le fibre muscolari possiedono
un efficiente sistema antiossidante in grado
di tenere sotto controllo la produzione eccessiva di
ROS.
Infatti, sia gli antiossidanti endogeni (SOD, GPx,
ubichinolo,) che quelli esogeni (vitamine, oligominerali
e sostanze simil-vitaminiche) giocano un importante
ruolo protettivo prevenendo, annullando o
contrastando l’azione potenzialmente lesiva delle
specie chimiche reattive sull’apparato muscoloscheletrico.
Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che un
adeguato regime di allenamento e/o l’assunzione
mirata di integratori antiossidanti è effettivamente
in grado di potenziare i sistemi di difesa antiossidanti
dell’organismo, riducendo l’entità dei processi
di perossidazione dopo attività fisica intensa.
Tuttavia, se all’esercizio fisico intenso si associa
anche una compromissione dei sistemi di difesa
antiossidanti, i ROS sono liberi di attaccare e di
danneggiare qualsiasi componente cellulare, dai glicidi
ai lipidi, dalle proteine agli acidi nucleici.
In generale, qualsiasi attività fisica incongrua
può associarsi ad una condizione di stress ossidativo.
Infatti, tanto la sedentarietà quanto la pratica
sportiva strenua possono provocare, attraverso uno
squilibrio tra produzione ed inattivazione di ROS, un
aumento dei processi perossidativi con conseguenti
lesioni tissutali e/o sistemiche, non di rado a carico
dello stesso apparato muscolo-scheletrico (lesioni
da traumatiche e/o da overuse, tendiniti, ecc.) (figura
3. 9).
ATTIVITA’ FISICA INADEGUATA
Aumentata produzione specie
reattive (O2 . , HO . , H2O2)
Figura 3. 9 Patogenesi delle lesioni da stress ossidativo
dell’apparato muscolo-scheltrico
In particolare, un’attività fisica eccessiva può
provocare una condizione di stress ossidativo sia
favorendo la generazione di ROS sia abbassando le
difese antiossidanti. A sua volta, l’aumento della
produzione di ROS è da ricondursi principalmente
all’incremento del ritmo delle ossidazioni biologiche
a livello dei mitocondri.
Infatti, come è ampiamente noto, sulle creste di
questi organuli sono localizzati i componenti della
catena respiratoria, ove gli equivalenti riducenti
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
Compromissione della barriera
antiossidante (SOD, vit C)
OSSIDAZIONE DI BIOMOLECOLE CON PRODUZIONE
DI ROM (IDROPEROSSIDI, CLORAMMINE)
DANNO OSSIDATIVO APPAR. MUSCOLO-SCHELETRICO
(infiammazioni, overuse. traumi…)
32
(coppie di atomi di idrogeno) estratti dai subsrati
ossidabili del metabolismo cellulare (glucosio, acidi
grassi, proteine, etc.) vengono “trasportati” fino al
loro accettore finale, l’ossigeno molecolare.
In questo ciclo di reazioni redox la differenza di
potenziale esistente fra il primo e l’ultimo dei “trasportatori”
(il NAD ridotto e l’ossigeno molecolare,
rispettivamente), viene sfruttata per generare ATP,
a partire da ADP e fosfato (fosforilazione ossidativa).
Di norma, ogni coppia di equivalenti riducenti
che “entra” nella catena respiratoria “viene accettata”
da un atomo di ossigeno generando una molecola
d’acqua. Tuttavia, anche a riposo, una quota di
equivalenti riducenti “sfugge”, nel corso della respirazione
cellulare, al controllo dei sofisticati meccanismi
di regolazione localizzati sulle creste mitocondriali,
generando specie chimiche parzialmente ridotte
dell’ossigeno, quale, ad esempio, l’anione superossido.
Tale quota, oscilla, secondo i diversi studi
pubblicati sull’argomento, dall’1 fino al 3%, e, in
condizioni normali, viene immediatamente neutralizzata
dai sistemi di difesa antiossidanti.
L’intensità del flusso “anomalo” di equivalenti
riducenti verso l’ossigeno per generare specie chimiche
di riduzione alternativa, non tetravalente, è
notevole negli organi con attività metabolica elevata,
quali i muscoli scheletrici, soprattutto nel corso
di attività particolarmente impegnative per carico di
lavoro e/o durata. Infatti, sembra che in condizioni
di esercizio fisico strenuo la quota di ossigeno ridotto
a ROS può raggiungere, nei muscoli, circa il 15%
della quota resa disponibile dall’emoglobina e poi
dalla mioglobina.
Pertanto, un’attività fisica eccessiva, specialmente
in soggetti non adeguatamente allenati, provoca
come conseguenza diretta ed immediata una
produzione elevata di ROS a livello mitocondriale.
Se i sistemi di difesa antiossidanti localizzati a
livello mitocondriale sono efficienti, il danno ossidativo
può essere circoscritto.
Se, tuttavia, le difese antiossidanti, messe a dura
prova dallo shunt anomalo di elettroni, vengono
superate, i ROS generati a livello delle creste mitocondriali
possono attaccare virtualmente qualsiasi
substrato organico e, in particolare, i lipidi e il DNA.
La perossidazione dei lipidi provoca una progressiva
riduzione dell’efficienza del processo di fosforilazione
ossidativa con abbassamento dei livelli
di ATP ed incremento della concentrazione di nucleotidi
e nucleosidi adenilici e dei loro prodotti di degradazione
(vedi più avanti).
D’altra parte, il DNA mitocondriale che, al contrario
di quello nucleare, non possiede un rivestimento
proteico, è facile preda del danno ossidativo
con conseguenti alterazioni dell’espressione genica.
Si innesca, così, un circolo vizioso nel quale i
ROS, prodotti in seguito ad attività fisica incongrua
a livello della catena respiratoria, finiscono con il

danneggiare i mitocondri stessi favorendo l’ulteriore
“escape” di equivalenti riducenti e, quindi, l’ulteriore
produzione di specie chimiche reattive centrate
sull’ossigeno.
I mitocondri, comunque, non rappresentano
l’unica sorgente di aumenatata produzione di ROS
in seguito ad attività fisica eccessiva.
Per esempio, numerose evidenze indicano che
l’esercizio strenuo riproduce nel muscolo scheletrico
una condizione molto simile a quella osservata nel
miocardio nel cosiddetto danno da ischemiariperfusione.
Infatti, nel corso della contrazione muscolare,
l’ATP è convertito in ADP + Pi e l’energia sviluppatasi
da tale reazione viene sfruttata per compiere il
lavoro meccanico, cioè la contrazione. L’ADP viene,
quindi, ri-fosforilato ad ATP sia attraverso la fosforilazione
ossidativa che attraverso l’idrolisi delle riserve
locali di creatin-P.
Nel muscolo scheletrico sottoposto ad attività
particolarmente intensa e/prolungata, così come accade
nel miocardio durante un’ischemia grave (es.
infarto), la quantità di ossigeno diventa insufficiente
al fabbisogno cellulare, generando una condizione
di parziale anaerobiosi (32).
Una volta esaurite le riserve di creatin-P e di
ATP, i mitocondri, non più in grado di rigenerare
adeguate quantità di ATP, faviriscono l’accumulo di
ADP e di AMP che, per via enzimatica, sono progressivamente
degradati ad IMP, ipoxantina e xantina.
Se il danno ossidativo cellulare è tale da indurre
la conversione della xantina deidrogenasi in xantina
ossidasi, quest’ultima catalizzerà la formazione di
perossido d’idrogeno e di anione superossido, rispettivamente
dall’ipoxantina e dalla xantina (32).
Dal punto di vista biochimico, i prodotti primari
dell’attacco dei ROS – generati sia a livello mitocondriale
che nel citosol – sono i cosiddetti metaboliti
reattivi dell’ossigeno (ROM), che comprendono varie
specie chimiche, quali gli idroperossidi.
Questi ultimi, sebbene relativamente stabili, in
presenza di metalli di transizione – liberatisi in seguito
al danno ossidativo dai depositi intracellulari –
possono decomporsi generando specie radicaliche
altamente reattive, quali l’alcossile e il perossile, che
amplificano il danno a carico delle componenti strutturali
della fibra muscolare scheletrica (proteine
contrattili, citoscheletro, membrane).
In definitiva, la compromissione della funzione
mitocondriale, insieme all’estensione dei processi
radicalici a catena ad altre componenti cellulari, innesca
una serie di reazioni indesiderate il cui esito
finale è la necrosi o l’apoptosi cellulare.
Pertanto, lo stress ossidativo associato ad esercizio
fisico eccessivo almeno due dei quattro meccanismi
patogenetici fondamentali in precedenza
analizzati: una ridotta efficienza della respirazione
cellulare (stress ossidativo di tipo II) ed un abbas-
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
33
samento della pressione parziale di ossigeno cellulare
(stress ossidativo di tipo IV) (vedi tabella 3. 5).
Tuttavia, l’aumentata produzione di ROS in seguito
ad esercizio fisico strenuo rende i muscoli, i
tendini e le articolazioni particolarmente suscettibili
alle lesioni traumatiche e da “overuse”, condizioni
tutte legate all’attivazione di processi infiammatori.
Infatti, sottoprodotti del danno ossidativo cellulare
possono attivare la NADPH ossidasi la lipoossigenasi
localizzate a livello della plasmamembrana
dei leucociti polimorfonucleati e dei macrofagi
favorendo, rispettivamente, la produzione di anione
superossido ed idroperossidi.
Pertanto, accanto ai due meccanismi primari
sopra postulati, lo stress ossidativo da attività fisica
esagerata è da ricondursi, almeno, in parte ad
un’attivazione della plasmembrana (stress ossidativo
tipo I).
Il danno ossidativo a carico dell’apparato muscoloscheletrico
non si limita a danneggiare le cellule
ma si estende anche alla matrice extracellulare
propagandosi a distanza attraverso il sangue.
Infatti, a livello degli spazi extracellulari, la
mieloperossidasi leucocitaria, in presenza di cloruri,
converte il perossido di idrogeno in acido ipocloroso;
questo potente ossidante fisiologico è in grado
di attaccare amminoacidi, proteine e nucleotidi generando
come sottoprodotti del danno ossidativo le
clorammine. Attraverso questo ed altri meccanismi
l’acido ialuronico viene depolimerizzato favorendo la
diffusione del processo infiammatorio e di eventuali
patogeni, il collageno forma legami crociati perdendo
le sue proprietà meccaniche, le fibre elastiche
vengono depolimerizzate e tutto ciò contribuisce al
danno ossidativo delle componenti non muscolari
dell’apparato locomotore (tendini, legamenti,capsuile
articolari, sinovie, menischi) (32).
D’altra parte, gli idroperossidi, generati
dall’ossidazione ROS-mediata dei vari substrati organici
(lipidi, proteine, nucleotidi) sono prodotti potenzialmente
lesivi che la cellula elimina rilasciandoli
nel sangue.
Infatti, se in un particolare distretto, a causa
dell’aumentata attività muscolare, viene a crearsi
una condizione di relativa ipossia, le cellule interssate
attivano immediatamente il metabolismo anaerobio
generando cataboliti acidi, quali il lattato.
Quest’ultimo può indurre una transitoria riduzione
del pH locale – acidosi – la quale, a sua volta, può
favorire il rilascio di metalli di transizione – ferro e
rame – dalle rispettive proteine plasmatiche (transferrina
e ceruloplasmina).
Tali metalli catalizzeranno la scissione degli idroperossidi
circolanti – derivanti dai processi ossidativi
cellulari – in radicali alcossilici e perossilici, in
definitiva responsabili dell’estensione del danno ossidativo
a distanza, in larga misura mediato dal
danno endoteliale sia diretto che indiretto (ossidazione
delle lipoproteine).

A causa della loro relativa stabilità molti ROM
circolanti, tra cui gli idroperossidi e le clorammine,
possono essere oggi quantificati attraverso il d-
ROMs test. Quest’ultimo si basa sulla proprietà degli
idroperossidi di generare in presenza di ioni ferro
radicali alcossilici e idroperossilici. In questo senso,
pertanto, gli idroperossidi presenti nei liquidi biologici
vengono considerati non solo come marker pre-
Capitolo 3. Stress ossidativo ed attività sportiva. Aspetti fisiopatologici e clinici.
34
coci ma anche come amplificatori del danno ossidativo
tissutale. Anche i livelli di malonildialdeide
(MDA) plasmatica o di pentano espirato forniscono
informazioni sul danno ossidativo cellulare, ma, al
contrario degli idroperossidi, costituiscono indicatori
tardivi di danno ossidativo, positivizzandosi solo dopo
che il sistema antiossidante (o riducente) locale
si è completamente esaurito (vedi figura 3. 4).

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Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
Capitolo 4
La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
4. 1 Premessa
La valutazione dello stress ossidativo nei soggetti
che praticano attività sportiva, a qualsiasi livello,
amatoriale o professionale, è la condizione indispensabile
per prevenire il danno tissutale da ROS
ed altre specie chimiche reattive e per monitorare
l’andamento e la risposta al trattamento (specifico
e/o antiossidante a quadro clinico conclamato (lesioni
traumatiche, da overuse, infiammazioni etc.)
(1, 15, 24).
Le tecniche di laboratorio disponibili per identificare
e quantificare un marcatore biochimico in un
campione biologico prevedono, generalmente, una
fase di estrazione che consenta il passaggio
dell’analita di interesse dal materiale prelevato in un
fluido con caratteristiche chimico-fisiche simili (per
esempio estrazione dal siero dei lipoperossidi, sostanze
liposolubili, in una soluzione cloroformiometanolo,
in grado di sciogliere i grassi). Segue,
poi, una fase di separazione più fine, durante la
quale l’estratto (lipidico o acquoso), grazie ad opportune
tecniche cromatografiche (in fase gassosa
o in fase liquida ad alta risoluzione, HPLC) viene risolto
in una serie di frazioni. Infine, grazie,
all’impiego di idonei metodi di rivelazione (spettrometria
di massa, spettrofotometria, fluorimetria, potenziometria,
ecc) è possibile identificare, grazie ad
uno standard noto, in quale delle frazioni si trova
l’analita di interesse e, in definitiva, precisarne, con
ragionevole sicurezza, la natura e la concentrazione.
Purtroppo, questa metodologia solo raramente
è applicabile nella routine clinica quando l’obiettivo
della valutazione è lo stress ossidativo. Infatti, i radicali
liberi sono, per definizione, specie chimiche
estremamente reattive, a brevissima emivita, e
l’unica tecnica in grado di evidenziarli è la spettroscopia
di risonanza di spin dell’elettrone (ESR o
EPR) che, eseguita talvolta con particolari accorgimenti
(metodi di spin trap), costituisce il golden
standard per valutazioni nel vivente (1, 17, 27).
Sfortunatamente, però, l’ESR è una tecnica
piuttosto complessa, richiede una strumentazione e
delle professionalità non disponibili in tutti i laboratori,
ed è particolarmente costosa, per cui viene
utilizzata non per indagini di routine o studi di
screening, quanto, piuttosto, per validare altri metodi
di laboratorio, come accaduto, per esempio,
proprio con il d-ROMs test (1).
Anche quando correttamente eseguita, comunque,
l’ESR fornisce informazioni solo sulla componente
pro-ossidante dello stress ossidativo e non su
quella antiossidante. Si è ripetutamente sottolinea-
37
to, invece, che lo stress ossidativo è la conseguenza
della rottura di un equilibrio tra produzione di specie
reattive ed efficienza dei sistemi di difesa antiossidanti.
Questo squilibrio porta ad un eccesso di metaboliti
reattivi dell’ossigeno, quali, ad esempio, gli
idroperossidi (ROOH) che, versati in circolo, vanno
a costituire i marcatori e gli amplificatori del danno
tissutale e, in definitiva, i responsabili ultimi, insieme
ad altri prodotti di ossidazione, dell’invecchiamento
e delle patologie dell’apparato locomotore
correlate con lo stress ossidativo (1, 11, 16, 23).
Sulla base di queste considerazioni preliminari,
è opportuno che la valutazione di laboratorio dello
stress ossidativo in Medicina dello Sport sia “globale”,
cioè tenga conto sia della componente proossidante
che di quella anti-ossidante, anche alla
luce del ruolo, ampiamente documentato, dei ROM
quali marcatori ed amplificatori del danno cellulare
(7, 19) (figura 3. 9).
In realtà, i test di laboratorio attualmente disponibili
esplorano o la componente pro-ossidante
(produzione di specie reattive) (1–3, 9, 18, 20, 22)
o la componente anti-ossidante (attività antiossidante)
dello stress ossidativo (4–6, 11–14, 26) (tabella
4. 1).
Tabella 4. 1 Comuni metodi di laboratorio
per la valutazione dello stress ossidativo
Status proossidante Status antiossidante
d-ROMs test OXY-Adsorbent test
TBAR (MDA) BAP
Lipoperossidi TAS
Isoprostani -SHp test
Chemiluminescenza Dos. singoli antiossidanti
Poichè, come si è detto, l’ESR non è utilizzabile
di routine, la valutazione dello status pro-ossidante
di un individuo viene abitualmente eseguita con una
serie di metodiche che alcuni ricercatori hanno battezzato
con il termine di “fingerprinting” (impronta
digitale) (21).
Secondo questo approccio, l’esistenza in un organismo
vivente di specie reattive, non altrimenti
misurabili routinariamente, viene valutata attraverso
la documentazione (nei tessuti e/o nei liquidi extracellulari)
della presenza di specie molecolari variamente
modificate dall’attacco dei radicali liberi (21).
In tale contesto, poiché la perossidazione è uno
dei più comuni meccanismi del danno indotto dai
ROS, il dosaggio degli idroperossidi fornisce
un’indicazione molto affidabile dello status proossidante
di un individuo. E, più in generale, la do-

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
cumentazione nei fluidi biologici della presenza di
idroperossidi, così come di MDA o di isoprostani,
fornisce “l’impronta digitale” più o meno accurata e
fedele della componente ossidante dello stress ossidativo
di un individuo (8, 11, 20, 22, 23, 25).
I test per la valutazione della componente antiossidante
mirano generalmente a determinare lo
“spessore” o “potere” o “attività” della barriera antiossidante
plasmatica nel suo complesso (4–6, 12–
14, 26, 30) e, in alcuni casi specifici, a quantificarne
alcune importanti componenti, quali ad esempio i
gruppi tiolici o singoli antiossidanti (es. ascorbato,
tocoferoli) (10, 11).
Tale valutazione si rende necessaria ogni qualvolta
si sospetti una situazione di stress ossidativo
(anche a fronte di valori normali o addirittura ridotti
di test dello status proossidante) e, più in generale,
ogni qualvolta si intende monitorare una terapia antiossidante.
Uno dei pannelli particolarmente utili nella valutazione
globale dello stress ossidativo prevede la
contemporanea determinazione dello status proossidante,
attraverso il d-ROMs test (1), e dello status
antiossidante, attraverso il BAP test (ed eventuali
altri metodi) (figura 4. 1).
ATTIVITA’ FISICA INADEGUATA
Aumentata produzione
specie reattive
d-ROMS TEST
VALUTAZIONE GLOBALE
DELLO STRESS OSSIDATIVO
Compromissione
barriera antiossidante
BAP TEST
PREVENZIONE DANNO OSSIDATIVO APPAR. MUSCOLO-
SCHELETRICO E MONITORAGGIO TEARAPIA
Figura 4. 1 Pannello per la valutazione globale dello stress ossidativo
in medicina sportiva
In particolare, il d-ROMs test consente la determinazione
dei metaboliti reattivi dell’ossigeno (1,
11), mentre il BAP test consente la valutazione
dell’efficienza della barriera antiossidante plasmatica.
Ambedue i test si basano sul principio della fotometria
e possono essere effettuati, sia su sangue
intero che su plasma/siero, mediante o un comune
fotometro, in qualsiasi laboratorio di analisi, oppure
un’attrezzatura analitica dedicata (sistemi FRAS 4 e
FREE), presso l’ambulatorio del medico sportivo o in
palestra (7, 10, 19). Quest’ultimo rappresenta, indubbiamente,
un aspetto indubbiamente innovativo
e interessante. Infatti, l’impiego di una strumentazione
analitica dedicata di facile uso consente di
giungere in tempo reale alla formulazione di un giudizio
non solo generico di stress ossidativo ma di
definire anche se all’origine di esso vi è un’eccessiva
produzione di specie reattive (d-ROMs test) e/o una
ridotta efficienza dei sistemi di difesa antiossidante
a livello plasmatici (BAP test).
38
Esistono, ovviamente, numerosi altri test per
questo tipo di valutazione, come indicato in tabella
1, ma è obiettivo di questo capitolo presentare il
principio e le applicazioni in medicina sportiva solo
di questo pannello e, in particolare, del d-ROMs
test. Laddove necessario, comunque, sono forniti
elementi per una valutazione comparativa tra le diverse
metodiche attualmente disponibili (es. il test
della malonildialdeide ed il FRAP).
4. 2 La valutazione dello status
pro-ossidante: il d-ROMs test
4. 2. 1 Principio
Il d-ROMs test è un test fotometrico che, come
indica il nome, consente di determinare, in un campione
biologico, la concentrazione dei ROM (reactive
oxygen metabolites) e, in particolare degli idroperossidi
(ROOH), generati nelle cellule dall’attacco
ossidativo dei ROS su svariati substrati biochimici
(glicidi, lipidi, amminoacidi, proteine, nucleotidi
ecc.) (1).
Attraverso il d-ROMs test, i ROM contenuti in un
campione biologico, quale, ad esempio, il siero, dopo
aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano
un derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile
e quantificabile per via fotometrica (1).
La concentrazione dei ROM, che correla direttamente
con l’intensità del colore rilevato, viene espressa
in unità di concentrazione di facile impiego
nella pratica clinica. Tali unità sono indicate con la
sigla U CARR dal cognome del chimico pientino
(Carratelli) che ha inventato, brevettato e sviluppato
il d-ROMs test (1).
Alla base del d-ROMs test vi è un meccanismo
già descritto a proposito dell’innesco delle reazioni
radicaliche a catena: l’interazione con metalli di
transizione (vedi capitolo 1).
Il principio è quello del la reazione di Fenton,
verificato per il perossido di idrogeno e successivamente
ampliato da Haber e Weiss, secondo cui un
metallo di transizione in forma ionica (es. ferro o
rame) catalizza la scissione di un idroperossido
(ROOH), generando nuove specie radicaliche, quali
l’idroperossile (ROO • ) o l’alcossile (RO • ), a seconda
che, rispettivamente, lo ione catalizzante si ossidi
(Fe 2+ →Fe 3+ o Cu + →Cu 2+ ) oppure si riduca
(Fe 3+ →Fe 2+ o Cu 2+ →Cu + ), secondo le reazioni:
ROOH + Fe 2+ (Cu + ) → RO • + OH - + Fe 3+ (Cu 2+ )
ROOH + Fe 3+ (Cu 2+ ) → ROO • + H + + Fe 2+ (Cu + )
Se ad una soluzione contenente idroperossidi e
tracce di un metallo di transizione in forma ionica si
aggiunge una sostanza il cui potenziale di ossidazione
è tale che i radicali generati dalla decomposizione
degli idroperossidi stessi (alcossili e perossili)

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
possano strappare ad essa l’elettrone necessario
per raggiungere la propria stabilità, tale sostanza
sarà a sua volta radicalizzata, come previsto dalla
seconda fase delle reazioni radicaliche a catena (reazione
di trasferimento del sito radicalico, vedi capitolo
1) (1).
E’ ovvio che se la sostanza in questione ha la
proprietà ottica di cambiare colore nel momento in
cui viene ossidata ed è sufficientemente stabile in
questa forma, sarà possibile, con le opportune tecniche
fotometriche, risalirne alla concentrazione,
che risulterà direttamente proporzionale a quella
delle specie radicaliche generate in vitro e, in definitiva,
a quella degli idroperossidi inizialmente presenti
nel campione analizzato (1).
Nel d-ROMs test, dunque, gli idroperossidi contenuti
in un campione biologico – per comodità espositiva,
nel siero – vengono messi nelle condizioni
previste dalla reazione di Fenton per generare in
vitro radicali idroperossilici ed alcossilici.
In pratica, un’aliquota di siero viene diluita in
una soluzione tampone (acetato) a pH acido (4.8).
In queste condizioni, il ferro ionico dapprima legato
alle sieroproteine, si rende disponibile in forma libera,
catalizzando, in vitro, la scissione degli idroperossidi,
inizialmente presenti nel campione di sangue,
in radicali idroperossilici ed alcossilici.
A questa soluzione viene, quindi, aggiunta una
sostanza (cromogeno) che ha la proprietà di cambiare
colore nel momento in cui viene ossidata.
Il cromogeno impiegato nel d-ROMs test è la
N,N-dietil-parafenilendiammina, una sostanza incolore
che la proprietà di conferire alla soluzione nella
quale è disciolta un colore rosato quando, ossidandosi,
cioè cedendo un elettrone, si trasforma nel radicale
catione corrispondente (figura 4. 2) (1).
CH 3 -CH 2
N
CH 3 -CH 2
Base Base amminica
amminica
NH 2
CH 3 -CH 2
Idrogeno
Carbonio
Azoto
Figura 4. 2 La N, N-dietil-parafenilendiammina,
il substrato cromogeno del d-ROMs test
NH 2
Nel d-ROMs test l’ossidazione della N,Ndietilparafenilendiammina
avviene ad opera dei radicali
idroperossilici ed alcossilici. Il catione derivato
dall’ammina, colorato inm rosa, pur essendo un radicale,
è abbastanza stabile per cui è possibile determinarne
la concentrazione per via fotometrica,
nelle condizioni di lavoro previste (lunghezza d’onda
505 0 546 nmetri) (1).
Ovviamente, la concentrazione del complesso
colorato sarà direttamente correlata con il livello di
N
+
CH 3 -CH 2
Radicale catione
39
idroperossidi inizialmente presenti nel campione da
analizzare, secondo lo schema di reazioni:
per i radicali alcossilici
1) R–OOH + Fe 2+ → R–O • + Fe 3+ + OH -
2) R–O • + A-NH2 → R–O - + [A–NH2 • ] +
per i radicali perossilici
1) R–OOH + Fe 3+ → R–OO • + Fe 2+ + H +
2) R–OO • + A–NH 2 → R–OO - + [A–NH 2 • ] +
dove:
– R–OOH è un generico idroperossido
– R–O • è il radicale alcossilico corrispondente
– R–OO • è il radic. idroperossilico corrispondente
– A–NH2 è la N, N-dietil-parafenilendiammina, cioè il
substrato cromogeno (incolore) del d-ROMs test
– [A–NH2 • ] + è il radicale catione, colorato, del substrato
cromogeno.
I risultati del d-ROMs test vengono espressi in
unità arbitrarie, le UNITA’ CARRATELLI o U CARR
(dove 1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL), a
causa dell’eterogeneità delle specie chimiche presenti
inizialmente nel campione biologico da testare
e per una serie di ragioni di ordine pratico che verranno
discusse in seguito (1).
Il d-ROMs test è stato validato mediante tecnica
ESR (1). Inoltre, sulla base dei dati finora pubblicati
eseguiti con tecnica fotometrica, il d-ROMs test è
risultato un test affidabile, in grado di fornire determinazioni
precise ed accurate, correlate con la
concentrazione, sia in cinetica che in endpoint, sia
in soggetti normali che in pazienti affetti da svariate
patologie (28, 29).
4. 2. 2 Metodica
Il d-ROMs test può essere eseguito sia su sangue
intero (sistema FRAS 4) sia su plasma/siero (sistema
FREE). A scopo esemplificativo si riporta la
metodica analitica generale su siero o plasma sottolineando,
tuttavia, che la procedura risulta estremamente
semplificata con l’impiego della strumentazione
dedicata, dotata di display auto-istruente
(vedi appresso).
Prima di procedere all’esecuzione dell’analisi, bisogna
preparare lo standard (o calibratore), fornito
direttamente col kit sotto forma di siero liofilo a matrice
umana a titolo noto (U CARR), indicato
sull’etichetta.
A questo scopo è sufficiente aggiungere al liofilizzato
il volume di acqua distillata previsto (secondo
le indicazioni del produttore) e mescolare la soluzione
così ottenuta con delicatezza (evitando di

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
formare schiuma, indice indesiderato di denaturazione
proteica all’interfacie aria-liquido).
Si suggerisce di attendere 10 minuti e quindi
rimescolare la soluzione con le medesime precauzioni.
In ogni caso, prima di eseguire il test è assolutamente
indispensabile assicurarsi che tutto il liofilizzato
sia stato completamente disciolto.
In queste condizioni, tra l’altro, la soluzione così
ricostituita di calibratore può essere conservata a
–20 °C ed è stabile per 6 mesi.
Dopo aver portato i reagenti (R1, miscela cromogena,
ed R2, soluzione tampone) alla temperatura
di lavoro, si procede, quindi, all’esecuzione del
test.
Nella procedura cinetica standard si parte preparando
tre soluzioni: il bianco reagente, il campione
(preferibilmente siero fresco) ed il calibratore,
secondo lo schema riportato nella seguente tabella:
Tabella 4. 2 Procedura analitica del d-ROMs test in cinetica
Bianco reag. Campione Calibratore
Reagente R1 10 µL 10 µL 10 µL
Reagente R2 1 mL 1 mL 1 mL
H2O distillata 10 µL – –
Campione – 10 µL –
Calibratore – – 10 µL
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente
e lasciate ad incubare a 37°C per 1 minuto.
Terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte
a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a
505 nm (A505) o 546 nm (A505) immediatamente e
successivamente, nelle stesse condizioni di lavoro
(37°C), dopo 1, 2 e 3 min. Ai valori di assorbanza
ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae,
quindi, il valore di assorbanza del bianco reagente.
I risultati del test saranno espressi in U
CARR applicando la seguente formula:
U CARR = ∆Abs/min x F
dove:
• ∆Abs/min sono le differenze medie dei valori di
assorbanza misurati a 1, 2, 3 e 3 minuti;
• F è un fattore di correzione con un valore predeterminato.
A questo punto è opportuno fare alcune precisazioni.
Si è detto che i risultati del d-ROMs test,
anche per l’eterogeneità delle specie chimiche valutabili
con questo metodo (idroperossidi di derivazione
cellulare e prodotti di ossidazione delle cloroammine),
sono espressi in U CARR.
Perché si è scelto di usare queste unità di misura
“arbitrarie”? Per rispondere a questa domanda
bisogna anticipare un dato sperimentale che sarà
ampiamente discusso in seguito e cioè che, eseguendo
il d-ROMs test su un campione piuttosto
numeroso (circa 5.000) di soggetti apparentemente
sani, si è visto che l’incremento per minuto dei valo-
40
ri di assorbanza a 505 nm (∆A505/min) varia fra
0.023 e 0.031, distribuendosi, nella popolazione
testata, secondo un tipico profilo gaussiano.
E’ evidente che l’impiego di tale notazione (terza
cifra decimale) non consente un’immediata valutazione
e, soprattutto, un’adeguata discriminazione
dei valori di concentrazione di idroperossidi da essa
sottesa.
Pertanto, per ovviare a questo problema di natura
squisitamente pratica ed avere un range adeguatamente
ampio di variazioni, si è stabilito di esprimere
il risultato del d-ROMs test in unità convenzionali,
le U CARR, appunto, che si ottengono
moltiplicando la variazione di assorbanza registrata
fotometricamente per un prestabilito fattore di correzione,
il fattore F (generalmente compreso tra
9.000 e 10.000).
Va ribadito che tale operazione di “correzione”
si rende necessaria esclusivamente per rendere più
agevoli al medico – abituato a interpretare valori,
come quello del colesterolo, del range delle centinaia
di unità – la lettura e l’interpretazione del test
(che altrimenti sarebbero “appesantite” dall’impiego
di una serie di cifre decimali).
Negli strumenti dedicati, quali il FREE ed il
FRAS, è possibile, via software, impostare il fattore
di correzione sulla base dei risultati del d-ROMs test
eseguito sul siero di controllo a titolo noto fornito
dal produttore.
Ad ogni modo, tuttavia, per avere una valutazione
assoluta, è stato sperimentalmente stabilito
che 1 U CARR corrisponde a 0.08 mg di H 2O 2/dL.
Nella procedura endpoint si parte preparando
tre soluzioni: il bianco reagente, il campione (siero
o plasma eparinato) ed il calibratore, secondo lo
schema riportato nella seguente tabella:
Tabella 4. 3 Procedura analitica del d-ROMs test in endpoint
Bianco reagente Campione Calibratore
Reagente R1 10 µL 10 µL 10 µL
Reagente R2 1 mL 1 mL 1 mL
H2O distillata 5 µL – –
Campione – 5 µL –
Calibratore – – 5 µL
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente
e lasciate ad incubare a 37°C per 75
minuti. Appena terminata l’incubazione, esse vanno
sottoposte a lettura fotometrica, misurando
l’assorbanza a 505 nm (A505) o 546 nm (A546). Ai valori
di assorbanza ottenuti per il campione e per il
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza
del bianco reagente (azzeramento con bianco reagente).
I risultati del test saranno espressi in U CARR
applicando la seguente formula:
Abs campione
U CARR = Abs standard x [standard]
dove:
• Abs sono i valori di assorbanza misurati (per il
campione e per lo standard);

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
• [standard ] è la concentrazione dello standard.
Va aggiunto che gli strumenti dedicati (sistemi
FREE e FRAS) sono programmati per eseguire
l’analisi del d-ROMs test con appositi kit.
Tuttavia, se si ha la necessità di dover effettuare
il test su un comune fotometro o su un analizzatore
multiplo, si può anche operare, in alternativa
alle procedure descritte, con una miscela di lavoro
realizzata mescolando il reagente R 1 (cromogeno)
ed il reagente R 2 (tampone) nel rapporto di 1:100 e
utilizzando il campione come “starter”.
Tale miscela di lavoro ha il vantaggio di essere
stabile per circa 12 ore (più che sufficienti per una
seduta analitica), se conservata, ovviamente a 2-
8°C e al riparo dalla luce.
4. 2. 3 Interpretazione dei risultati
La disponibilità di una metodica precisa ed affidabile
ha consentito di stabilire i livelli di riferimento
del d-ROMs nella popolazione normale.
Si è potuto dimostrare, su un campione di circa
5.000 soggetti clinicamente sani (figura 5. 6), che i
valori del test seguono nella popolazione una distribuzione
unimodale, con un picco tra 250 e 300 U
CARR (pari a 20.08-24.00 mg/dL di H2O2), individuato
come il valore di riferimento del test (1).
Serie
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Intervalli
(U CARR)
200-210
211-220
221-230
231-240
241-250
251-260
261-270
271-280
281-290
291-300
300-310
311-320
321-330
331-340
341-350
Totale
Intervalli
(mg H O /dL) 2 2
16.00-16.80
16.88-17.60
17.68-18.40
18.48-19.20
19.28-20.00
20.08-20.80
20.88-21.60
21.68-22.40
22.48-23.20
23.28-24.00
24.08-24.80
24.88-25.60
25.68-25.40
25.48-27.20
27.28-28.00
Frequenze
Figura 4. 3 Valori del d-ROMs test in un campione
di soggetti adulti clinicamente sani
Ovviamente, valori superiori a questo intervallo,
dopo una fascia borderline indicano livelli crescenti
di stress ossidativo (tabella 5. 5).
Tabella 4. 4 Gravità dello stress ossidativo (SO)
sulla base dei valori del d-ROMs test
ROM ROM Stress ossidativo
(U CARR) (mg H2O2/dL) (gravità)
300-320 24.08-25.60 Condizione border-line
321-340 25.68-27.20 Stress ossidativo lieve
341-400 27.28-32.00 Stress ossidativo medio
401-500 32.08-40.00 Stress ossidativo elevato
>500 >40.00 Stress ossidativo elevatissimo
Range normale: 250-300 U CARR
1 U CARR corrisponde a 0.08 mg H 2O 2/dL
Per completezza, va aggiunto che i valori riportati
si riferiscono alla popolazione italiana e non è
escluso che vi possano essere delle oscillazioni in
eccesso o in difetto in funzione di particolarità razziali.
Si è osservato che i risultati del d-ROMs test
non sono significativamente influenzati né dal sesso
(n)
29
89
193
244
342
547
659
731
654
491
256
162
80
57
13
4547
Dati cumulativi
(%)
0.6
2.6
6.8
12.2
19.7
31.8
46.3
62.3
76.7
87.5
93.1
96.7
98.5
99.7
100.0
100.0
41
né dall’età. Tuttavia, i neonati, indipendentemente
dal sesso e dalle modalità del parto, possiedono livelli
ematici di idroperossidi significativamente inferiori
a quelli riscontrati negli adulti; questa differenza
probabilmente riflette la diversa risposta
all’ipossia dei neonati.
Viceversa, la gestazione si associa a valori del
d-ROMs test mediamente più alti rispetto a quelli
osservati nelle donne non gravide.
I risultati del d-ROMs test eseguito ripetutamente
nello stesso soggetto nell’arco della giornata
non mostrano differenze degne di nota, a meno che
non intervengano fattori in grado di indurre una
brusca produzione di perossidi (es. uno sforzo muscolare
intenso).
Infine, non sono state riscontrate differenze significative
nei risultati del d-ROMs test quando il
prelievo viene effettuato su sangue arterioso o su
sangue venoso.
4. 2. 4 Valutazioni comparative
Il d-ROMs test è un test unico nel suo genere.
Tuttavia un confronto parziale è possibile con il test
della MDA, con quello dei lipoperossidi e con il dosaggio
degli isoprostani.
La MDA (malonilaldeide o malonildialdeide,
CHO-CH2-CHO) rappresenta uno dei prodotti finali
della catena di reazioni innescata nelle membrane
cellulari dall'attacco ossidativo, da parte di alcuni
radicali liberi dell'ossigeno (quali il radicale idrossile),
degli acidi grassi poliinsaturi (quali l'acido arachidonico,
costituente appunto dei fosfolipidi di
membrana).
Questa catena di reazioni, nel caso specifico
dell'acido arachidonico, ha come specie chimica
"chiave" dell'intero processo il radicale perossido.
Quest'ultimo, infatti, è posto al "bivio" di due possibili
metabolici, in quanto può essere convertito in
idroperossido (mediante acquisizione di un H) oppure
"imboccare" la via dei perossidi ciclici che, in seguito
ad ulteriori attacchi ossidativi, porta ad una
serie di prodotti terminali, tra i quali la MDA. Questi
ulteriori "attacchi ossidativi" e, quindi, la formazione
di MDA, si realizzano grazie al superamento delle
"difese" antiossidanti del medium nel quale avviene
il processo ossidativo stesso.
Pertanto, anche la presenza di MDA nei liquidi
biologici sarà rilevabile solo quando tutto il sistema
antiossidante endogeno del medium in cui è avvenuto
l'attacco ossidativo si è esaurito.
Sulla base di queste considerazioni, si evince che la
MDA, prodotto quasi "terminale" dell'ossidazione di
vari substrati biologici, quali gli acidi grassi poliinsaturi
di membrana, rappresenta un indicatore piuttosto
tardivo di stress ossidativo. Pertanto, uno dei
maggiori svantaggi dei test basati sulla determinazione
della MDA è relativo al fatto che essi non
sempre sono in grado di poter svelare precocemente
uno stato ossidativo alterato.

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
Viceversa, il d-ROMs test si basa sulla determinazione
del livello di idroperossidi, l'altra classe di
composti che può formarsi a partire dal radicale perossido
(specie chimica "chiave" della catena di reazione
che porta all'ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi
di membrana). Al contrario della MDA, gli
idroperossidi sono composti che si formano precocemente
nella sequenza di reazioni ossidative dei
lipidi di membrana, sono relativamente stabili e,
conservando ancora una discreta capacità ossidante,
possono essere rilevati grazie ad un adeguato
sistema redox (come quello della N,N-dietilparafenilendiammina
del d-ROMs test). Pertanto,
rispetto ai test che valutano la MDA, il d-ROMs test
è in grado di svelare più precocemente stati ossidativi
alterati, con enormi vantaggi sul piano clinico in
termini di prevenzione e monitoraggio terapeutico.
Inoltre, come riportato più volte in letteratura,
la MDA va incontro a molte reazioni secondarie che
riducono l'accuratezza dei risultati ottenuti; infatti,
in quanto reattivo bifunzionale (doppio gruppo aldeidico
CHO) la MDA può formare legami crociati
con proteine o nucleotidi (dando luogo alla formazione
di basi di Shiff) e può essere degradata dal
perossido di idrogeno o ossidata da perossidasi e
xantinaossidasi.
Anche come marcatore di perossidazione lipidica
la MDA si mostra scarsamente specifica; infatti,
essa è stata identificata fra i prodotti di decomposizione
ossidativa di amminoacidi, di carboidrati e di
prostaglandine.
Infine, la MDA può essere anche un prodotto di
ossidazione dell'acido ascorbico, e ciò rende inutilizzabile
il suo dosaggio ai fini di un eventuale monitoraggio
terapeutico in corso di trattamenti antiossidanti.
Viceversa, come dimostrano i numerosi studi
pubblicati sull’argomento, il d-ROMs test è stato impiegato
con successo nel monitoraggio terapeutico
sia in corso di trattamenti antiossidanti che in corso
di trattamenti farmacologici specifici.
Per quanto riguarda i test di lipoperossidazione,
esistono in commercio vari test etichettati come "Lipid
hydroperoxide assay kit".
Tali test presentano una serie di svantaggi, in
quanto prevedono spesso una fase di deproteinizzazione
e di estrazione; inoltre, richiedono tempi lunghi
(circa 30 minuti in tutto) e forniscono un'informazione
molto limitata, in quanto gli idroperossidi
lipidici costituiscono solo una classe degli idroperossidi
totali.
Viceversa, il d-ROMs test, non prevede alcun
pretrattamento del campione biologico (se non la
centrifugazione se si parte da sangue intero), è rapido
(in cinetica, richiede non più di 3 minuti) e, soprattutto,
fornisce un'indicazione globale sullo stato
ossidante del sistema biologico testato, in quanto
consente di dosare tutti gli idroperossidi (anche
quelli derivati dal processo di ossidazione di altri
42
substrati, non solo lipidici, quali ad esempio amminoacidi,
peptidi, ecc.).
Infine, il dosaggio dell’8-isoprostano a livello
plasmatico viene generalmente effettuato mediante
metodica immunoenzimatica. Due gli svantaggi segnalati:
la possibile cross-reattività in fase analitica
e l’informazione limitata a condizioni di stress ossidativo
su base disrfeattiva .
Ad ogni modo occorre segnalare che in un recente
studio comparativo, l’analisi di regressione ha
mostrato una correlazione diretta fra la concentrazione
plasmatica di 8-isoprostano e i valori del d-
ROMs (r=0.68; p

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
ecc.). Inoltre, non è stata segnalata alcuna interazione
apparente fra antiossidanti.
Nel BAP test il “cromogeno” impiegato è il tiocianato,
una sostanza in grado di legarsi agli ioni
ferrici formando un complesso colorato che assorbe
a 505 nm. Nel momento in cui tali ioni ferrici sono
ridotti a ioni ferrosi il suddetto complesso si decolora.
Dopo una breve incubazione a 37°C, valutando
per via fotometrica l’entità della decolorazione, sarà
possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e,
in definitiva, alla capacità riducente, ossia al potere
antiossidante del plasma testato. Tale potere non è
da intendersi in senso assoluto, ma relativo, ovviamente,
al substrato testato, cioè gli ioni ferrici.
Considerando che tali ioni sono già presenti naturalmente
nel nostro organismo, il BAP test fornisce
una misura attendibile del potenziale antiossidante
di quella frazione della barriera plasmatica
all’ossidazione direttamente implicata, per i potenziali
redox in gioco, nella difesa contro l’attacco dei
radicali liberi in condizioni “fisiologiche”.
4. 3. 2 Metodica
Il BAP test può essere eseguito su siero o plasma
(anche eparinizzato) nelle seguenti condizioni
di lavoro: lunghezza d’onda 505 nm, cammino ottico
1 cm, temperatura 37°C, modalità differenziale.
Prima di procedere all’esecuzione del test bisogna
preparare il calibratore, fornito nel kit sotto
forma di siero liofilo a matrice umana a titolo noto,
indicato sull’etichetta.
A questo scopo è sufficiente aggiungere 2 mL di
acqua distillata al liofilizzato e mescolare la soluzione
così ottenuta con delicatezza, avendo cura di attenersi
alle indicazioni di carattere generale descritte
in dettaglio a proposito del d-ROMs test.
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di
lavoro, si preparano tre soluzioni: il bianco reagente,
il campione ed il calibratore, secondo la procedura
indicata nella seguente tabella:
Tabella 4. 5 Procedura analitica del BAP test
Bianco reag. Campione Calibratore
Reagente R1 1 mL 1 mL 1 mL
Reagente R2 50 µL 50 µL 50 µL
H2O distillata 10 µL – –
Campione – 10 µL –
Calibratore – – 10 µL
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente
e lasciate ad incubare a 37°C per 5 minuti.
Terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte
a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a
505 nm, dopo aver azzerato con acqua distillata.
Il potenziale biologico antiossidante del plasma
viene espresso in µmol/L di sostanze antiossidanti
come la Vitamina C, secondo la formula:
[Abs bianco reagente Abs campione]
[Abs bianco reagente Abs calibratore]
dove:
• ABS è l’assorbanza misurata a 505 nm
x [calibratore]
43
• [calibratore] è la concentrazione del calibratore
espressa in µmoli/L.
4. 3. 3 Interpretazione dei risultati
Il valore ottimale stimato del BAP test negli individui
normali è superiore a 2200 µmoli/L. E’ buona
prassi, comunque, che ogni laboratorio determini
l’ampiezza di oscillazione della variabilità biologica
eseguendo un congruo numero di test su soggetti
normali.
In ogni caso, una riduzione dei valori del
test al di sotto dell’intervallo indicato appare direttamente
correlata con una ridotta efficienza della
barriera antiossidante plasmatica (tabella 4. 6).
Tabella 4. 6 Gravità dello stress ossidativo
in rapporto ai valori forniti dal BAP test
µmoli di sostanze anti- Grado di compromissione
ossidanti/mL di campione della barriera antiossidante
2200 – 2000 Condizione border-line
2000 – 1800 Compromissione lieve
1800 – 1600 Compromissione di medio grado
1600 – 1400 Compromissione di elevato grado
< 1400 Gravissima compromissione
Valore ottimale: >2200 µmoli/L
4. 3. 4 Valutazioni comparative
Il test per la valutazione antiossidante con il
quale il BAP test può essere confrontato è il cosiddetto
FRAP test. Un confronto, tuttavia, in linea teorica,
è possibile anche con il TAS.
Il FRAP test, come indica la sigla – che sta per
Ferric Reducing Activity of Plasma – valuta l’attività
antiossidante del plasma come attività ferroriducente.
Pertanto, il suo principio è molto simile a
quello del BAP test.
Infatti, il FRAP test si basa sulla riduzione del
complesso tripiridiltriazina-ferrica (Fe III -TPTZ) a tripiridiltriazina-ferrosa
(Fe II -TPTZ), la quale sviluppa
un intenso colore blu, misurabile fotometricamente
con massimo di assorbimento a 593 nm. La calibrazione
può essere eseguita mediante soluzioni a concentrazioni
note di Fe II (FeSO4 . 7H2O).
Analogamente, il BAP test si basa sull’impiego di
una soluzione colorata ottenuta aggiungendo una
fonte di ioni ferrici ad una miscela cromogena.
L’entità della decolorazione – valutata fotometriamente
a 505 nm – è proporzionale all’attività ferroriducente
del campione.
Sulla base di queste osservazioni, Vassalle (dati
non pubblicati) ha recentemente confrontato le prestazioni
analitiche del BAP test con quelle del FRAP
test su 18 campioni di plasma umano.
I valori medi (± DS) del BAP test è risultato pari
a 3163±770 µmol/L contro 521±132 µmol/L del
FRAP test.
La correlazione tra i due test è risultata accettabile
in 16/18 campioni testati (88.89%).
I rimanenti due non hanno mostrato una buona
correlazione, probabilmente per i più elevati livelli di
lipidi plasmatici che possono interferire con le letture
fotometriche del BAP test (figura 4. 1).

FRAP test (µmol/L)
FRAP (µµmol/l)
800
700
600
500
400
300
200
100
Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
0
1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
BAP test (µmol/L)
Figure 4.4. BAP test vs. FRAP: valutazione comparativa
Per quanto riguarda il TAS (Total Antioxidant
Status, Randox, Crumlin, UK), l’incubazione con
un’attività perossidasica (met-mioglobina)
dell’ABTS ® trasforma quest’ultimo nel radicale catione
corrispondente (ABTS •+® ), il quale assume un
colore blu-verde, rilevabile fotometricamente a 600
nm, a 37 °C. L’aggiunta di antiossidanti provocherà
una decolorazione della miscela cromogena. La
concentrazione di antiossidanti nel campione sarà
direttamente proporzionale all’entità della decolorazione.
I risultati del test sono espressi in mmol/L.
Attualmente, non esistono ancora dati pubblicati
di confronto fra BAP test e TAS. Tuttavia, osservazioni
preliminari suggeriscono che il BAP test –
rispetto al TAS – presenta una migliore standardizzazione
per l’impiego clinico routinario. Infatti, il
BAP test è stato applicato con successo a strumenti
dedicati, quali il FRAS 4, partendo anche da una
piccola quantità di sangue intero. Pertanto, il BAP è
un test affidabile, eseguibile anche nell’ambulatorio
medico o in un centro fitness, in grado di fornire risultati
in termini reali.
Il TAS, invece, va eseguito in laboratori di analisi
specializzati, con prolungamento dei tempi di attesa
delle risposte. Inoltre, il TAS fornisce una valutazione
dell’intero “arsenale” antiossidante del plasma,
compresi i cosiddetti “shock-adsorbers”. Questi
ultimi comprendono, per esempio, le proteine
plasmatiche, le quali, sebbene contribuiscano in
qualche modo all’attività antiossidante (es. mediante
la chelazione di metalli di transizione), sono entità
chimiche riducenti aspecifiche. In altre parole, il
loro livello può anche essere relativamente indipendente
dal “reale” stato antiossidante del plasma o
da eventuali trattamenti farmacologici antiossidanti
in corso. Pertanto, in talune situazioni di iperproteinemia,
quali il mielosa multiplo o plasmocitoma,
un aumento del TAS può non essere necessariamente
correlato con aumentato livello di attività
antiossidante plasmatica.
Al contrario, il BAP test consente di quantificare
il potenziale riducente “reale”, cioè solo que componenti
della barriera antiossidante plasmatica – es.
vitamine e sostanze simil-vitaminiche – che sono
“fisiologicamente” coinvolte nella difesa contro le
44
specie chimiche reattive ed il cui livello può essere
direttamente modificato dalle terapie antiossidanti.
Pertanto, sebbene studi sull’argomento siano
ancora in corso, il BAP test sembra fornire, rispetto
al TAS, un parametro più efficace per valutare il vero
stato antiossidante e più utile per monitorare eventuali
trattamenti antiossidanti.

Capitolo 4. La valutazione biochimica dello stress ossidativo in Medicina dello Sport
1. Alberti A, Bolognini L, Macciantelli D, Carratelli
M. The radical cation of N,N-diethyl-paraphenylendiamine:
a possible indicator of oxidative
stress in biological samples. Res Chem Intermed.
2000. 26 (3): 253-67.
2. Allen RC, Loose LD. Phagocytic activation of a
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N. B. Per una trattazione dettagliata ed esaustiva, completa di riferimenti bibliografici aggiornati, sul d-ROMs
richiedere all’Autore le review: 1) The d-ROMs test: validation, analytical performances and clinical applications;
2) Validation, usefulness, and indications of the DIACRON INTERNATIONAL panel (d-ROMs test, OXYadsorbent
test, -SHp test, BAP test) in global assessment of oxidative stress in humans and animals.

Capitolo 5. Il d-ROMs test in Medicina dello Sport. Rassegna di studi clinici
Capitolo 5
Il d-ROMs test in Medicina dello Sport. Rassegna di studi clinici.
5. 1 Premessa
L’attività fisica sembra essere al centro di un
nuovo “paradosso” scientifico, dopo quello francese,
“il paradosso dello sport”; infatti, a seconda di come
viene svolta, essa può essere sia potente arma preventiva
che causa di patologia (10).
Così, se una corretta attività sportiva migliora la
qualità della vita e contribuisce a ridurre la morbilità
e la mortalità per cardiovasculopatie, tumori e numerose
malattie cronico-degenerative, un esercizio
fisico incongruo altera il normale bilancio ossidativo,
predisponendo all’invecchiamento precoce alle patologie
da stress ossidativo, alle quali si è tatto cenni
nei precedenti capitoli (2).
Quando si parla di esercisio fisico incongruo,
ovviamente, ci si riferisce sia alla carenza che
all’eccesso di attività.
Per esempio, la vita sedentaria favorisce il sovrappeso
e l’obesità, condizioni, entrambe, che tendono
ad associarsi a livelli mediamente più elevati
di ROM nel siero rispetto a quanto riscontrato nei
soggetti normopeso.
A questo proposito, uno studio comparativo ha
dimostrato che un indice di massa corporea (BMI)
superiore a 30, una condizione che corrisponde ad
un’obesità di I° grado secondo la classificazione
dell’OMS, si associa a valori del d-ROMs test significamene
più elevati di quelli rilevati nel gruppo normopeso
di controllo (BMI 350* >28.00*
Un’ora dopo sforzo massimale
(soggetti non allenati)
10 > 350* > 28.00*
Un’ora dopo sforzo massimale
10 < 300** < 24**
(soggetti allenati)
(1) Test al cicloergometro *Nessuno dei soggetti reclutati aveva
livelli inferiori a 350 U CARR (28.00 H2O2/dL). ** Nessuno dei
soggetti reclutati aveva livelli superiori a 300 U CARR (24.00 mg
H2O2/dL).
Risultati analoghi sono stati riscontrati in uno
studio condotto su 10 volontari sottoposti allo stesso
test fino alla comparsa di crampi o dolori muscolari
(5).
Questi dati suggeriscono che l’esecuzione regolare
del d-ROMs test può essere utile nel “calibrare”
l’allenamento e rendere possibili sforzi muscolari più
prolungati agli atleti senza aumentare il rischio di
lesioni da radicali liberi.
5. 3 Football
Alcuni studi hanno valutato il livello sierico di
ROM nel corso di un’intera stagione di football (6, 7,
11). Fra questi degno di nota quello eseguito su 26
calciatori del Bologna, nel momento in cui la squadra
era iscritta alla massima categoria del torneo
professionale italiano (7).

Per ciascun atleta, sottoposto a regime di allenamento
intenso, sono stati eseguiti cinque prelievi
di sangue ed altrettante determinazioni del livello
dei ROM, all’inizio della stagione, e nelle settimane
successive, a cadenza regolare (tabella 5. 2).
Tabella 5. 2 Valori medi del d-ROMs test nei calciatori del Bologna
nel corso di una intera stagione agonistica
Atleti Determinazioni d-ROMs test* Range
26 120 258 ± 37.9 160-376
U CARR (valore medio ± DS)
Il livello di ROM è risultato ≥ 300 U CARR in
26/120 (22%) determinazioni. Un livello di ROM ≥
300 U CARR, almeno una volta, è stato osservato in
10/27 (37%) atleti (2/10 su 4 casi, 2/10 su 3, 4/10
due volte; 2/10 una volta; in nessuno in maniera
persistente). Nel corso della stagione agonistica, la
tendenza si è dimostrata stabile verso elevati livelli
di ROM in 3/20 prelievi, stabile su livelli border-line
in 3/20, stabile nel range di riferimento in 9/20, in
riduzione in 4/20 (per 3 si è osservato un significativo
decremento, per assunzione di integratori). La
tendenza è stata in crescita solo in 1/20.
Inoltre, 10/27 (37%) calciatori hanno mostrato
variazioni significative del TAS (≥1.30 mmol/L) almeno
una volta, ma solo per 3/10 tale test è risultato
≥1.30 mmol/L due volte su 2 campioni, una sola
volta per i rimanenti 7/10. La media (n=85 tests) è
stata 1.40±0.05 mmol/L (range 1.20-1.56); 13/85
sono risultati ≥1.30 mmol/L e 8/13 hanno mostrato
valori crescenti di ROM.
Confrontando i risultati dei due test si è osservata
una leggera tendenza verso una correlazione
inversa fra d-ROMs test e TAS (y=0.0029x + 2.16;
R2=0.52), come atteso. In 8/85 test gli Autori hanno
riscontrato valori di TAS ≥1.30 e livelli di ROM
≥300 CARR U, in 11/85 valori di TAS >1.30 mmol/L
e livelli di ROM 1.30 mmol/L e ROM

E’ interessante rilevare che l’assunzione di antiossidanti
ha ridotto in maniera significativa il livello
di ROM dopo allenamento. Ciò sottolinea ancora
una voltal’utilità del d-ROMs test nella gestione
dell’allenamento e del trattamento antiossidante in
atleti professionisti.
5. 6 Triathlon
Lo stress ossidativo è stato valutato in 10 atleti
di triathlon allenati, a riposo ed dopo una prova da
sforzo (nuoto seguito da corsa) (1)
Il livello di ROM dopo il test è aumentato significativamente
rispetto ai valori rilevati a riposo (figura
5. 4).
CARR U
500
400
300
200
100
0
Resting
p=0,04
Figure 5. 4 Aumento dei valori medi del d-ROMs test in atleti di
triathlon dopo sforzo muscolare
5. 7 Golf
After effort
Il d-ROMs test è stato eseguito in 12 atleti della
Squadra Nazionale Italiana di Golf, dopo una corsa
di 3.000 metri alla massima velocità (1).
Il livello di ROM è aumentato da 234 (DS 55; ES
15), in condizioni di riposo, a 294 (DS 64; ES 18)
dopo attività aerobica. La differenza è apparsa statisticamente
significativa (p=0.001) (figura 5. 5).
CARR U
500
400
300
200
100 100
0
Resting
p=0,001
After effort
Figura 5. 5 Aumento significativo dei valori del d-ROMs test
in giocatori di golf dopo sforzo
5. 8 Ciclismo
In uno studio longitudinale, è stato monitorato
il livello di stress ossidativo in un campione di 12
atleti prima e dopo una gara ciclistica di gran fondo
(150 km) (1).
In sei dei dodici ciclisti reclutati, il d-ROMs
test è stato ripetuto anche dopo 2 giorni, a riposo, e
dopo 10 giorni di trattamento antiossidante specifico
(A RD Stenovit ® ) (figura 5. 6).
Capitolo 5. Il d-ROMs test in Medicina dello Sport. Rassegna di studi clinici
n = 10
n = 12
49
U CARR
500
400
300
200
100
0
Riposo
(n=12)
p ≤ 0.001 vs riposo iniziale
Immediatamente Due giorni dopo Dopo 10 10 giorni
dopo la corsa* (n=12) la corsa (n=6) di terapiay terapiay (n=6) (n=6) *150 km
Figura 5. 6 Andamento dei valori del d-ROMs test
in una gara ciclistica di gran fondo (150 km)
Il trial ha confermato che gli atleti presentano
in condizioni basali, prima della gara, livelli sierici di
ROM nei limiti della norma. L’intenso sforzo muscolare
si accompagna ad un considerevole e statisticamente
significativo incremento dei valori del d-
ROMs test che, tuttavia, tendono a ridursi già due
giorni dopo la gara, con maggior rapidità nei soggetti
sottoposti ad integrazione antiossidante.
E’ interessante notare in questo studio l’utilità
del d-ROMs test nella gestione della terapia antiossidante
dopo gare ciclistiche impegnative, le quali si
accompagnano in assoluto a valori di d-ROMs test
tra i più elevati, nell’ambito delle varie discipline
sportive.
5. 9 Corsa
La determinazione dei ROM sierici è stata effettuata
su un campione di 50 soggetti adulti, di età
media 25.5±2.7 anni (±DS) e di sesso maschile,
tutti partecipanti ad una corsa cittadina per un percorso
complessivo di 10.5 km (8).
Il d-ROMs test è stato eseguito su campioni di
sangue intero, prelevati prima (t0), al traguardo
(t1), ed 1 ora dopo la fine (t2) della competizione.
I livelli di ROM sierici sono passati da
243.4±22.6 (t 0) a 281.2±21.7 (t 1), fino a
333.2±19.7 (t 2). Le variazioni osservate sono risultate
statisticamente significative (figura 5. 7).
U CARR
500
400
300
200
100
n=31; 25.5±2.7 anni
Km 10.5
0
Partenza Traguardo 1 h dopo
Figure 5. 7 Time-course dei valori del d-ROMs test
dopo una corsa cittadina
5. 10 Miscellanea
In un ultimo studio, il livello di ROM nel siero è
risultato compreso nel range di 110-516 U CARR in
407 athletes (332 calciatori professionisti di 7 squa-

dre del massimo Campionato, 24 sciatori della specialità
“cross-country” e 51 atleti della specialità
“skyrunners) (6).
Un aumento al di sopra della soglia di normalità
di 300 U CARR U è stato osservato in 382/1071
(35.66%) campioni.
Negli stessi atleti i risultati del TAS sono apparsinel
range di 1.06-1.69 mmol/L, al di sotto della
Capitolo 5. Il d-ROMs test in Medicina dello Sport. Rassegna di studi clinici
50
soglia definita come normale (1.30 mmol/L) in
84/954 (8.80%) professionisti.
Infine, come atteso, i livelli di ROM hanno mostrato
una lieve correlazione, in senso inverso, con i
valori del TAS, suggerendo che l’aumentata produzione
di radicali liberi negli atleti testati può essere
una conseguenza di una ridotta efficienza dei sistemi
antiossidanti di difesa.

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52
Informazione pubblicitaria

La perossidazione di substrati organici (lipidi,
amminoacidi, proteine, nucleotidi, etc.) da parte
delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) è la diretta
conseguenza di un’alterazione del normale bilancio
tra produzione ed eliminazione di radicali liberi.
Nel corso dell’attività fisica, i processi perossidativi
interessano sia le fibre muscolari scheletriche in
attiva contrazione che la matrice extracellulare. Pertanto,
le conseguenze del danno ossidativo si ripercuotono
non solo sul muscolo (predisposizione alle
lesioni traumatiche, flogistiche e da overuse) ma
anche sul tessuto connettivo dell’apparato locomotore
(flogosi articolari e periarticolari, tendiniti, borsiti)
e sulle cellule ematiche eventualmente migrate
o stravasate. A questo proposito, sono ben note le
lesioni a carico delle membrane dei leucociti (con
conseguente riduzione dell’efficacia delle difese immunitarie
e maggiore predisposizione alle malattie
infettive) e degli eritrociti (emolisi con conseguente
riduzione della capacità di trasporto dell’ossigeno al
sistema muscolo-scheletrico).
Ognuno di questi eventi può provocare, direttamente
o indirettamente, una riduzione delle prestazioni
sia in soggetti che prendono parte a normali
programmi di fitness sia in atleti professionisti.
Sulla base di queste evidenze, appare chiaro
che chiunque pratichi attività sportiva con regolarità
ed impegno dovrebbe sottoporsi periodicamente ad
una valutazione dello stress ossidativo, allo scopo di
ottimizzare e personalizzare il proprio programma di
allenamento e, eventualmente, raggiungere migliori
prestazioni grazie ad una migliore comprensione
della propria fisiopatologia muscolare, senza correre
i rischi delle lesioni da radicali liberi.
Poiché lo stress ossidativo negli atleti è sempre
la risultante di un’aumentata produzione di specie
chimiche reattive e/o di una compromissione delle
difese antiossidanti, qualsiasi valutazione dovrebbe
tener conto di ambedue le componenti patogenetiche.
Per questo motivo, il d-ROMs test ed il BAP test
rappresentano gli strumenti ideali per la determinazione
dello stress ossidativo negli atleti. Infatti,
mentre il primo fornisce informazioni sullo status
pro-ossidante, il secondo consente di valutare
l’efficienza dei sistemi di difesa antiossidanti.
Il d-ROMs test, nel panorama delle opzioni attualmente
disponibili per la valutazione dello status
pro-ossidante, è senza dubbio il più idoneo da praticare
negli sportivi. Esso, infatti, come dimostrano le
evidenze discusse nel precedente capitolo, consente
di valutare il livello dei metaboliti reattivi
dell’ossigeno (ROM) e, in particolare, la concentra-
Considerazioni conclusive
53
Considerazioni conclusive
zione degli idroperossidi e delle cloroammine nel
siero, nel plasma o nel sangue intero.
Gli idroperossidi sono universalmente riconosciuti
essere tra i “marcatori” più affidabili dello
stress ossidativo. Essi, inoltre, essendo dotati di una
certa capacità ossidante, in determinate condizioni,
non infrequenti nell’atleta sotto sforzo, quali una
transitoria acidosi, possono subire la scissione in radicali
liberi altamente reattivi (alcossili e perossili)
per l’azione catalitica del ferro, liberato dalle proteine
plasmatiche. Per questo, gli idroperossidi sono
considerati anche importanti amplificatori del danno
e, pertanto, il loro livello va rigorosamente tenuto
sotto controllo.
Le cloroammine rappresentano importanti marcatori
della componente infiammatoria dello stress
ossidativo. Come è noto, infatti, le cloroammine sono
generate dall’azione su amminoacidi, nucleotidi e
proteine, dell’acido ipocloroso, a sua volta prodotto
per reazione catalitica dalla mieloperossidasi leucocitaria
sul perossido di idrogeno, in presenza di ioni
cloruro.
I dati presentati nel precedente capitolo indicano
che coloro i quali praticano regolarmente attività
fisica, sia a livello amatoriale che professionale, presentano
un livello di ROM generalmente inferiore a
quello individuato nella popolazione generale di riferimento
(

po sforzo. Questa evidenza conferma che un trattamento
specifico ed efficace può essere effettivamente
importante negli atleti per compensare le
alterazioni – create per effetto dell’intensa e/o prolungata
attività fisica – fra produzione ed eliminazione
di radicali liberi.
Queste ed altre osservazioni indicano che il d-
ROMs test costituisce un metodo semplice ed affidabile
non solo per prevenire e monitorare lo stress
ossidativo ma anche per “personalizzare” i programmi
di allenamento e l’integrazione antiossidante
in tutti gli sportivi.
In tale contesto, occorre rilevare come i dati
forniti da questo test si correlino in maniera inversa
con quelli del TAS, a indicare che un’aumentata
produzione di specie reattive negli sportivi è spesso
anche una consequenza della ridotta efficienza della
barriera antiossidante.
Riguardo a questo aspetto, appaiono incoraggianti
i primi risultati ottenuti negli sportivi con il
BAP test che, rispetto al TAS, offre il vantaggio di
una migliore standardizzazione per la clinica routinaria
e la possibilità di valutare in maniera più specifica
l’efficacia dei trattamenti antiossidanti.
In conclusione, poiché lo stress ossidativo è responsabile
di alterazioni funzionali e/o strutturali
della cellula, che non risparmiano neppure il DNA,
depositario dell’informazione genetica, è di vitale
Capitolo 6. I test di laboratorio per la valutazione dello status antiossidante
importanza che chiunque pratichi con regolarità ed
impegno attività sportiva si sottoponga ad una valutazione
globale dello stress ossidativo.
Questo obiettivo è oggi a portata di mano dei
medici sportivi e degli allenatori grazie ai nuovi sistemi
analitici dedicati, quali il FRAS 4 ed il FREE
che consentono di determinare “in tempo reale” ed
in maniera estremamente precisa sia la produzione
di specie reattive (d-ROMs test) che l’efficienza dei
sistemi antiossidanti (BAP test).
L’impiego di queste tecniche altamente innovative
consente oggi di valutare se il regime di allenamento
è adatto e, eventualmente, mettere in atto
misure correttive per ottimizzarlo, anche basate su
miglioramenti dello stile di vita o su un più razionale
impiego di integratori antiossidanti.
La medesima strategia, infine, può essere particolarmente
utile allo scopo di ottenere un indice
della condizione psico-fisica dell’atleta durante la
fase di riposo o nel corso di una stagione di attività
competitiva, dopo intensi sforzi fisici. Infatti,
un’alterazione del bilancio ossidativo (elevati valori
del d-ROMs test e/o ridotti livelli del BAP test) potrebbe
suggerire l’esistenza di una condizione subclinica
di patologia in atto o una scarsa capacità di
recupero, sulla base della quale mettere in atto un
programma di allenamento tagliato su misura per
ogni singolo atleta.

Per informazioni rivolgersi a:
Dr Eugenio Luigi Iorio, MD, PhD
Osservatorio Internazionale dello Stress Ossidativo
Via Paolo Grisignano 21 – 84127 Salerno
Telefono & FAX +39 089 711 952
e–mail: eugenioluigi.iorio@alice.it
web site: ww.osservatoriostressossidativo.org
Seconda Edizione Italiana, dicembre 2007
L’Autore e l’Editore non rispondono di eventuali errori rilevati nel presente volume né dell’uso improprio del suo contenuto