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Taqman può essere considerata la metodica di scelta<br />
per tutte quei parametri che richiedono una precisa valutazione<br />
dinamica (carica virale, espressione genica,<br />
rapporto mutante-ceppo selvaggio etc.).<br />
Anche per la PCR real-time sono state sviluppate apparecchiature<br />
dedicate delle quali la più recente, il Cobas<br />
Taqman, può essere collegato fisicamente al Cobas Ampliprep<br />
per una completa automazione di tutte le fasi<br />
della reazione.<br />
Il progresso tecnologico della PCR si è anche esteso a<br />
metodiche, strumentazione e sistemi esperti per l’analisi<br />
simultanea di più marcatori, soprattutto negli studi<br />
sul genoma ed in quelli sull’associazione tra profili genetici<br />
e malattia o tra profili genetici e farmaco-metabolismo.<br />
Sono già disponibili supporti miniaturizzati, genechip o<br />
microarray, che, mutuati dalla tecnologia dei microprocessori<br />
per computer, contengono migliaia di sonde per<br />
l’amplificazione ed il rilevamento di un numero pressochè<br />
illimitato di marcatori genici.<br />
L’evoluzione delle applicazioni<br />
La duttilità della PCR, capace di identificare ed analizzare<br />
sequenze nucleotidiche di qualsiasi tipo ed origine<br />
biologica, ne ha esteso le applicazioni a tutti i settori<br />
della biologia e della medicina.<br />
Nel settore delle malattie infettive la PCR è stata particolarmente<br />
utile nella conferma diagnostica di agenti<br />
per i quali non vi siano metodiche convenzionali di isolamento<br />
culturale (HIV, HCV) o test surrogati per componenti<br />
antigeniche (HCV) o che siano presenti a concentrazioni<br />
non rilevabili dalle tecniche tradizionali.<br />
I progressi delle conoscenze sulla biologia e patogenesi<br />
dell’AIDS e dell’epatite virale C e B o sull’oncogenesi<br />
delle lesioni da HPV, ad esempio, sono stati notevolmente<br />
facilitate dalla PCR nelle sue applicazioni qualitative<br />
e quantitative. Il trasferimento di queste metodiche<br />
in ambito clinico ha portato ad una più efficiente<br />
gestione del malato al quale è possibile offrire una<br />
diagnosi più tempestiva ed una prognosi più accurata.<br />
Il seguire nel tempo la carica virale o batterica consente<br />
inoltre di predire l’evoluzione dell’infezione e la gravità<br />
della malattia ad essa correlata con la possibilità<br />
di proporre protocolli sempre più individualizzati di<br />
monitoraggio e terapia.<br />
Anche nel settore delle patologie genetiche la PCR ha<br />
permesso lo sviluppo di test diagnostici per l’identificazione<br />
di portatori di malattie monogeniche, anche in<br />
epoca prenatale, fornendo a soggetti o coppie a rischio<br />
Fig. 3<br />
Loci genetici<br />
analizzati in uno<br />
studio di linkage con<br />
la malattia<br />
coronarica<br />
soluzioni comportamentali o scelte terapeutiche prima<br />
non disponibili.<br />
Uno degli esempi più significativi in questo settore è<br />
quello della poliposi familiare del colon, dove l’uso<br />
della PCR per definire profili genetici associati alla malattia<br />
consente di identificare precocemente, in fase<br />
pre-sintomatica, i portatori del gene affetto ed offrire<br />
loro un monitoraggio tempestivo e opzioni chirurgiche<br />
precoci che possano prevenire la trasformazione maligna<br />
delle lesioni.<br />
Studi di “linkage” sono attualmente in corso per identificare<br />
profili genetici associati a malattie multi-fattoriali,<br />
poligeniche, quali la malattia coronarica, il diabete<br />
o il morbo di Alzheimer.<br />
Uno dei primi esempi della fattibilità di questo approccio<br />
fu un test sviluppato con formato “line-blot” per<br />
analizzare il possibile coinvolgimento nella patogenesi<br />
della malattia coronarica di una serie di geni attivi<br />
nella regolazione della pressione arteriosa, della coagulazione<br />
e del metabolismo lipidico (Fig. 3).<br />
Tuttavia, la complessità ed il numero dei sistemi biologici<br />
coinvolti nella genesi di malattie polifattoriali o<br />
nella carcinogenesi ha richiesto l’impiego di tecnologie<br />
più potenti ed efficaci. L’impiego della tecnologia genechip/microarray<br />
ha permesso ad esempio l’analisi simultanea<br />
dei livelli di espressione di centinaia di geni<br />
la cui attivazione o disattivazione può determinare<br />
prognosi e risposte al trattamento diverse per pazienti<br />
con neoplasie maligne. Risultati incoraggianti sono già<br />
stati prodotti nel caso di numerosi tumori quali quello<br />
epatico, polmonare, mammario, con importanti implicazioni<br />
per l’identificazione di nuovi bersagli per terapie<br />
più mirate e selettive.<br />
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