esadia16 - Roche

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notevolmente la messa a punto facilitando lo sviluppo
e la diffusione di tests per la determinazione di genomi
virali (HCV e HIV RNA) o per l’analisi qualitativa e
quantitativa di trascritti.
Allo stesso tempo, la possibilità di utilizzare un unico
lotto di enzimi e di reattivi per tutti i cicli richiesti
dalla PCR consentì anche di sviluppare apparecchiature
(thermalcycler) in grado di eseguire in automatico ed
in tempi più rapidi le fasi di denaturazione, riconoscimento
ed estensione dei primers che inizialmente richiedevano
tre termostati differenti ed un costante intervento
manuale dell’operatore.
Altre due interventi fondamentali per la definitiva consacrazione
della PCR quale metodica non solo di ricerca
ma anche di diagnostica clinica, furono la sterilizzazione
dei campioni da analizzare per eliminare eventuali
contaminazioni di prodotti (ampliconi) di amplificazioni
precedenti, e la rilevazione di sostanze ad attività
inibitoria sulle polimerasi.
Il primo obbiettivo, l’eliminazione della contaminazione
da “carry-over”quale principale causa di falsi positivi,
fu raggiunto sostituendo tra i componenti della
reazione i nucleotidi dTTP con dUTP e rendendo così gli
ampliconi riconoscibili e degradabili dall’enzima uracyl-
N-glicosilasi (Amperase®) prima che possano fungere
da stampo per la Taq o Tth polimerasi.
La soluzione del secondo problema, i falsi negativi dovuti
ad inibizione enzimatica, fu risolta in maniera
ugualmente efficace aggiungendo al mezzo di reazione
una molecola di DNA o RNA sintetico, denominato controllo
interno, che simulasse dal punto di vista fisicochimico
la molecola bersaglio senza interferire con la
sua amplificazione e rilevazione. Il controllo interno,
aggiunto a concentrazione nota, funge quindi da riferimento
qualitativo e quantitativo della efficacia della
Fig. 2
Sviluppo tecnologico
e progressiva
automazione
della PCR
Fig. 1
I passaggi chiave che
permisero il
trasferimento della
PCR dal laboratorio
di ricerca a quello
clinico-diagnostico
PCR garantendone l’integrità dei risultati (Figura 1).
Superati questi ostacoli iniziali, la PCR è andata incontro
ad un’evoluzione costante e rapidissima, sia dal
punto di vista tecnologico che applicativo.
L’evoluzione tecnologica
Dopo la messa a punto dei primi “thermal cyclers”,
sono stati successivamente sviluppate apparecchiature
in grado di eseguire in automatico le fasi di amplificazione
e rilevamento ed, in seguito, anche quella preliminare
della preparazione del campione con estrazione
degli acidi nucleici .
In questi sistemi, l’integrazione di sofisticati componenti
hardware e software, di reagenti pronti all’uso e
di provette di reazione usa e getta disegnate ad hoc,
realizza un ambiente sicuro a prova di contaminazione
e di errore umano.
La progressiva automazione della PCR, infatti, ne ha
migliorato l’accuratezza per le ridotte manipolazioni
manuali dei campioni e dei reattivi e ne ha completato
la standardizzazione necessaria per un’adeguata qualità
dei risultati in ambito diagnostico-clinico (Figura 2).
Uno degli ultimi sviluppi metodologici della PCR è la
tecnica “real-time” che viene eseguita in fase omogenea
e produce risultati durante lo svolgimento stesso
dell’amplificazione.
Questa metodica, nota anche come Taqman, consente
di rilevare un segnale fluorescente che si genera per la
scissione enzimatica di una sonda opportunamente
marcata allorchè essa si ibridizzi ad una sequenza complementare.
L’intensità della fluorescenza è direttamente
proporzionale alla quantità del DNA o RNA in esame
e ne permette un’accurata quantificazione. Per la sua
aumentata sensibilità e più esteso range dinamico,