esadia16 - Roche

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L’infezione da HBV: la trasmissione sessuale e materno-fetale
del legame avviene mediante chemiluminescenza. L’intensità
del segnale è direttamente proporzionale alla quantità
di HBV – DNA. La curva di calibrazione del sistema in
esame avviene con standards esterni; il range di linearità
è compreso tra 0.5 e 6000 pg/mL, mentre la sensibilità
del metodo è di 150.000 copie/mL.
Branched – DNA
L’estrazione del DNA avviene mediante lisi cellulare. Il
DNA target, così ottenuto, viene legato a delle sonde
dette Target Probes e adeso al pozzetto mediante delle
Capture Probes. Si aggiungono delle Preamplifier Probes
che ibridizzano con le Target Probes e poi avviene l’aggiunta
delle Amplifier Probes che si legano alle Preamplifier
Probes.
L’ultimo passaggio consiste nell’aggiunta delle Label Probes,
coniugate con fosfatasi alcalina, che si legano alle
Amplifier Probes e il rilevamento di tale legame avviene
mediante chemiluminescenza. La curva di calibrazione
dell’intero sistema avviene con standards esterni; il range
di linearità è compreso tra 0.7 e 5.000 Meq/mL e la sensibilità
del metodo è di 700.000 copie/mL
PCR quantitativa
Questa tecnica consta di 3 fasi:
1) Si parte sempre con l’estrazione dell’HBV-DNA dal siero
o dal plasma.
2) Il target di DNA, così ottenuto, viene fatto reagire con
una miscela (Master Mix) contenente 2 primers specifici,
i deossinucleotidi fosfati e l’enzima DNA polimerasi
necessario per l’amplificazione del segnale.
3) La fase di rivelazione del prodotto della PCR (copie di
DNA target) avviene mediante ibridazione con una
sonda specifica per HBV-DNA.
La calibrazione di questo metodo avviene mediante l’utilizzo
di uno Standard Interno a concentrazione nota, che
viene aggiunto al sistema all’inizio dell’amplificazione e
coamplificato contemporaneamente al target di HBV – DNA.
Il range di linearità del metodo è compreso tra 200 e
200.000 copie/mL e la sensibilità è di 200 copie/mL.
Attualmente è disponibile anche una PCR automatizzata
(Cobas Amplicor Monitor) in cui viene automatizzata la
fase di rivelazione dell’amplificato.
Altri metodi molecolari usati per porre diagnosi di infezione
da HBV sono:
a) Quantificazione di HBV – DNA mediante Real Time PCR:
rivelazione in tempo reale del DNA virale fino a 10 x 10 6
copie/mL, mediante l’osservazione della cinetica dei
cicli iniziali della reazione di amplificazione.
b) Genotipizzazione del virus: al momento sono stati
identificati 7 genotipi.
c) Ricerca e dosaggio di HBV – DNA nelle cellule epatiche.
La scelta della metodica biomolecolare da utilizzare
dipende essenzialmente dal tipo di informazione che si
vuole ottenere.
L’amplificazione mediante PCR, infatti, consente di rilevare
nel siero del paziente anche quantità piccolissime di
HBV-DNA. Ciò diventa di fondamentale importanza per il
monitoraggio dei pazienti HBeAg negativi/HBeAb positivi
che nella nostra area geografica rappresentano la maggior
parte dei casi di epatite cronica. All’interno di questo
vasto gruppo ci sono pazienti in cui la viremia è costante
e presenta valori rilevabili anche con l’ibridazione diretta,
altri in cui la replicazione di HBV è soppressa o è a valori
molto bassi, rivelabili solo mediante PCR.
Infine, ci sono i cosiddetti “portatori cronici asintomatici
o portatori sani di HBV” in cui la viral load è costantemente
soppressa e gli indici di funzionalità epatica sono
nella norma.
Questi pazienti, però, devono comunque essere monitorati
nel tempo perché in alcuni casi ci può essere riattivazione
virale che può sfociare anche in epatite fulminante,
oltrechè portare nel tempo all’evoluzione verso la cirrosi
o l’epatocarcinoma. Infine, la PCR quantitativa risulta
molto utile per il monitoraggio della viremia di pazienti
in trattamento terapeutico con Interferone o Lamivudina
ed è fondamentale eseguire l’esame prima dell’inizio del
trattamento terapeutico.
Terapia anti – HBV
La terapia anti – HBV si basa, fondamentalmente, su due
classi di farmaci:
● Farmaci immunomodulatori :Interferone, Timosina a-1,
Interleuchina 12
● Farmaci inibitori della polimerasi virale :Lamivudina
(3TC), Famciclovir, Adefovir dipivoxil, Lobucavir. Gli ultimi
2 sono degli inibitori molto potenti e attivi del
virus, anche dopo comparsa di mutanti YMDD del gene
p in pazienti sottoposti a trattamento prolungato con
Lamivudina (escape mutant).
● Associazione tra Interferone e Lamivudina
Vaccinazione anti – HBV
In Italia è obbligatoria a 1 anno e a 12 anni, e per tutte
le categorie a rischio.
Ora si dispone di vaccini ottenuti con tecniche di DNA
ricombinante, come l’antigene ricombinante da cellule di
lievito (dal 1991 è l’unico autorizzato).