IL LIEVITO - Microbiologia Generale

IL LIEVITO

MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/18

La cellula di lievito
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Caratteristiche generali
Fungo unicellulare appartenente alla divisione ascomicete
Cresce su substrati semplici
Ha un tempo di generazione di circa 2 ore
Si possono effettuare degli studi di genetica classica
Può essere manipolato geneticamente
trasformazione
disponibilità di diversi tipi di plasmidi.
S. cerevisiae è stato il primo eucariote completamente sequenziato:
il genoma è circa 3,5 volte quello di E. coli, esistono circa 6000 geni
(in E. coli sono circa 2000) di cui solo per una parte si conosce la
funzione
Può essere utilizzato come modello semplice per i complicati
processi che avvengono nelle cellule degli eucarioti superiori.
Viene utilizzato in numerosi processi biotecnologici.
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Sebbene i lieviti abbiano una complessità genetica più grande dei batteri,
contengono 3.5 volte più DNA rispetto a Escherichia coli, condividono con
quest’ultimo molti vantaggi tecnici che hanno consentito un rapido progresso
nel campo della genetica molecolare.
Alcune delle proprietà che rendono il lievito particolarmente adatto per gli
studi biologici includono la crescita rapida, forma unicellulare in forma
dispersa, la facilità della replica plating e l’isolamento di mutanti, un sistema
genetico ben definito e una ampia versatilità di sistemi di trasformazione.
Il S. cerevisiae è vitale anche se porta numerosi marcatori genetici. Essendo
non-patogeno, il lievito può essere maneggiato tranquillamente senza
particolari precauzioni. E’ infatti considerato un organismo GRAS (Generally
Regarded As Safe). Ampie quantità di normale lievito panario sono
commercialmente disponibili e possono fornire una risorsa a buon mercato per
gli studi biochimici.
Al contrario di molti altri microrganismi, i ceppi di S. cerevisiae possono
esistere in forma stabile sia in forma aploide che in forma diploide. In questo
modo le mutazioni recessive possono essere isolate e se ne può studiare il
fenotipo nei ceppi aploidi; i ceppi diploidi possono essere utilizzati per
generare mutazioni in geni essenziali e per test di complementazione.
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Colorazione delle cellule di lievito con
rodamina-falloidina: messa in evidenza
della actina
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Parete cellulare del lievito
• I costituenti principali della parete del lievito sono:
• 1. 1,3-β-glucano: è il maggiore componente e forma lo scheletro fibroso
della parete
• 2. 1,6-β-glucano: collega i componenti esterni ed interni della parete
• 3. mannoproteine: si trovano sulla superficie esterna della parete. Sono
estensivamente glicosilate. La loro presenza limita la permeabilità ai soluti
della parete. Le mannoproteine sono modificate mediante l’aggiunta di un
ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI)
• 4. chitina: contribuisce alla insolubilità delle fibre. Si localizza nel collo di
emergenza della gemme e forma una cicatrice. Contando le cicatrici si può
risalire al numero di gemme prodotte da una cellula.
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Colorazione delle cellule di lievito con
calcofluoro: messa in evidenza della
chitina
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• Lo sviluppo delle tecniche di trasformazione del DNA ha reso il lievito particolarmente
accessibile alla clonazione genica e a tecniche di ingegneria genetica. Geni strutturali
corrispondenti a praticamente qualsiasi tratto genetico possono essere isolati mediante
complementazione da banche plasmidiche. I vettori utilizzati per la trasformazione del
lievito sono di tre tipi: vettori integrativi (YIp), che si integrano a bassa frequenza nel
genoma, vettori ad alto numero di copie (YEp), che si replicano autonomamente grazie
all’origine di replicazione del plasmide 2µ ed infine, vettori a basso numero di copie
(YCp), che si replicano grazie ad una sequenza di replicazione autonoma (ARS). e che
contengono anche una sequenza centromerica (CEN).Sono inoltre disponibili gli YAC,
cromosomi artificiali di lievito, che vengono utilizzati per clonare grandi frammenti di
DNA (200-800 Kb); tali vettori sono lineari e contengono anche sequenze telomeriche
oltre ad una origine di replicazione (ARS ) e al centromero (CEN).Grazie alla tecniche
del DNA ricombinante ed alla costruzione di vettori di clonaggio e di espressione, il
lievito Saccharomyces cerevisiae viene utilizzato per la produzione di proteine
eterologhe.Rispetto ad E. coli, le proteine prodotte in lievito possono subire le
appropriate modifiche a livello post-traduzionale quali la glicosilazione. Inoltre, le
proteine eterologhe secrete da ceppi ingegnerizzati mostrano un corretto ripiegamento
e sono facilmente recuperate dal terreno di coltura.Ciò ha permesso di produrre in
lievito il primo vaccino umano, l’antigene del core dell’epatite B, ed il primo prodotto di
impiego nel settore alimentare, la rennina (Sherman, 1997).
• Infine, le potenzialità del lievito in quanto organismo modello è illustrata dal fatto che
molti geni di mammifero vengono introdotti in lievito per un’analisi sistematica della
funzione dei corrispondenti prodotti genici.
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Vettore batterico
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Classi di vettori di lievito
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GENETICA CLASSICA
• La segregazione dei cromosomi in S. cerevisiae avviene in maniera simile
a tutti gli altri eucarioti con una prima ed una seconda divisione
meiotica. Durante la meiosi, le cellule di S. cerevisiae vanno incontro a
cambiamenti morfogenetici. Ogni cellula diploide produce quattro spore
apolidi contenute in un asco, chiamato anche tetrade. L’associazione
fisica di tutti i prodotti di una singola meiosi all’interno di una tetrade,
consente un’analisi genetica della progenie molto precisa.
• L’analisi genetica dei prodotti meiotici all’interno di una tetrade
richiede un metodo noto come “dissezione delle tetradi” che consiste
nella separazione delle quattro spore di una tetrade su un terreno solido.
Qui le spore germineranno e intraprenderanno il ciclo di vita mitotico.
• Per la dissezione delle tetradi è necessario un trattamento con un enzima
litico (zimoliasi o glusulasi) che digerisca parzialmente la parete
dell’asco. Quindi, con l’ausilio di un micromanipolatore, è possibile
separare le spore.
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A B
C
D
Terreno minimo
privo di istidina
Gene essenziale
Replica
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Scopi dell’analisi delle tetradi
• Verificare l’effetto di una mutazione
• Analizzare la distanza sul cromosoma tra due marcatori
genetici
• Creare doppi mutanti
• Verificare la relazione esistente tra due geni mediante
l’analisi del doppio mutante
• Verificare se una mutazione è dominante o recessiva
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Isolamento ed analisi di mutanti
• Screening: ricerca di mutanti nei quali ogni candidato è
testato per il fenotipo mutante.
• Si può pensare di fare uno screening su circa 50000 cloni
• Selezione: descrive l’uso di particolari condizioni che
consentono la crescita preferenziale o la sopravvivenza di
organismi con un particolare fenotipo.
• E’ importante per isolare mutazioni rare; si possono
analizzare anche 10 7 colonie per piastra
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Un esempio di
screening
genetico
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Test per verificare se un mutante è
dominante o recessivo
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Test di complementazione
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Letalità sintetica
mutazione1
mutazione2
mutazione1+2
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Letalità sintetica
P P P P P
P
P
P
P P
P
P
P
P
P
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P
P

Uso del lievito come sistema modello
Esiste l’omologo in lievito (YeO)
Idendificazione di un ORF umana (HuO)
La funzione è nota La funzione non è nota
Complementazione
del mutante di
lievito con la HuO
Uso della genetica
di lievito per studi
di strutturafunzione
Costruzione del mutante
Il mutante non ha
un fenotipo
Sovrespressione del
cDNA HuO e YeO,
isolamento di mutanti
ts di YeO, isolamento
di coletali al mutante
YeO (letalità sintetica)
Non esiste l’omologo in lievito
Sovra-espressione del cDNA
HuO in lievito e
osservazione del fenotipo
Il mutante ha un fenotipo
Complementazione del
mutante di lievito con la HuO
Uso della genetica di lievito
per studi di struttura-funzione
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Uso del lievito come sistema modello
• Le persone altruiste fanno cose straordinarie, danno prima che qualcosa gli sia
chiesto, fanno cose senza la necessità di essere ringraziati, si preoccupano non
soltanto per se stessi, ma anche per altri individui che apparentemente non si
preoccupano del loro futuro, a volte sacrificano la loro vita per il bene della
comunità. Queste persone sono molto rare nella maggior parte delle società.
• E’ molto difficile trovare dei microrganismi altruisti, ma uno studio sul lievito ha
dimostrato che in alcune condizioni, le cellule di lievito si suicidano per il bene di
altre cellule circostanti.
• Nelle cellule di mammifero la morte programmata di una cellula viene definita
apoptosi.
• In organismi multicellulari, le cellule muoiono in continuazione. Se le cellule
destinate a morire lo facessero semplicemente lisando, potrebbero rilasciare un
gran numero di molecole tossiche nell’area che le circonda e potrebbero così
danneggiare le cellule in quest’aria. Nell’apoptosi invece, la morte cellulare è molto
organizzata e come risultato si ha che i danni alle cellule vicine sono molto limitati.
In pratica, quasi tutte le molecole tossiche che risultano dalla morte cellulare sono
distrutte durante l’apoptosi. Ciò è molto utile se una parte dell’essere vivente sta
morendo; sarebbe controproducente infatti compromettere la salute dell’intero
organismo solo perché una parte è malata.
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Uso del lievito come sistema modello
• Ora, per quale motivo una cellula di lievito vorrebbe uccidersi? In fondo sono
organismi unicellulari che devono “pensare” solo a loro stessi. L’ossigeno, sebbene sia
importante per una rapida crescita cellulare, può causare dei gravi danni. In
presenza di un elevata concentrazione di radicali liberi molte cellule di lievito
moriranno. Se morissero rilasciando il loro contenuto cellulare pieno di molecole
tossiche, anche i pochi sopravvissuti morirebbero. Ciò sarebbe deleterio per la
continuazione della specie se è presente nell’ambiente una elevata concentrazione di
ossigeno. Per evitare di perdere tutti i membri di una popolazione di lievito anche le
cellule di lievito quindi intraprendono il processo apoptotico. Il risultato sarà in un
danno minore per le cellule sopravvissute; oltretutto si renderanno disponibili
nutrienti per le cellule sopravvissute, importanti nella ripopolazione di un’altra
nicchia.
• L’apoptosi è una materia di studio importante in quanto a volte nel nostro corpo
alcune cellule sopprimono la via che porta ad apoptosi, trasformando tali cellule in
cellule cancerogene.
• Conoscere meglio come viene controllato il processo apoptotico potrebbe essere utile
per delucidare alcuni segreti propri delle cellule cancerogene e quindi potrebbe
aiutare nello sviluppo di terapie per il trattamento di queste cellule impazzite.
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Marcatori citologici di apoptosi nel lievito
e nei mammiferi
1. Rotture nella doppia elica del DNA
Queste rotture causano la presenza di estremità 3’-OH
libere che possono essere messe in evidenza mediante una
specifica colorazione denominata TUNEL (pan. C e G)
2. Condensazione della cromatina
La condensazione della cromatina si può osservare
tramite una colorazione del DNA nucleare con il
colorante DAPI. In questo caso si osserverà una
marginazione della colorazione sulla membrana nucleare
a formare un anello (pan.A, B, E, F)
La condensazione della cromatina è anche visibile al ME
(pan. I e J)
3. Esposizione della fosfatidilserina
sulla membrana cellulare
(pan. D e H)
K.U. Frolich, F. Madeo, FEBS Letters 473 (2000) 6-9
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Uso del lievito come sistema modello per
lo studio dell’apoptosi
• Le proteine della famiglia Bcl-2 svolgono un ruolo
fondamentale nella regolazione dell’apoptosi, e comprendono
fattori che promuovono l’apoptosi (Bax e Bak) e fattori che
bloccano il processo (Bcl-2 e Bcl-X L ).
• La completa sequenza genomica di S. cerevisiae ha mostrato
assenza di geni omologhi ai principali regolatori apoptotici
descritti nei metazoi (Bax, Bcl-2, Apaf-1).
• Tuttavia l’espressione eterologa della proteina Bax in S.
cerevisiae conferisce al lievito un fenotipo letale. Inoltre, la
cellula va incontro a cambiamenti molecolari e morfologici
caratteristici dell’apoptosi.
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Espressione della proteina umana pro-
apoptotica hBax in lievito
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Uso del lievito per l’solamento di geni
importanti per la funzione di Bax
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I mutanti cdc
• I mutanti cdc (cell division cycle) sono quelli che in condizioni restrittive
arrestano la crescita in un particolare stadio del ciclo cellulare.
• Sono stati di fondamentale importanza per determinare gli eventi che
consentono la progressione nel ciclo cellulare e le proteina coinvolte in tali
processi.
• Anche in questo caso si è rivelata una sorprendente omologia con i processi che
avvengono nelle cellule degli eucarioti superiori.
• Il premio Nobel nel 2001 è stato assegnato a L. Hartwell, P. Nurse e T. Hunt
per i loro studi sul ciclo cellulare.
• La maggior parte dei mutanti cdc del lievito S. cerevisiae sono stati isolati e
caratterizzati nel laboratorio di L. Hartwell.
• P. Nurse si è occupato dello studio del ciclo cellulare nel lievito
Schizosaccharomyces pombe, che per certi versi è più simile alle cellule degli
eucarioti superiori.
• Questo lievito si riproduce per schizogonia (scissione binaria) e, pur avendo lo
stesso contenuto in DNA del S. cerevisiae, il materiale genomico è organizzato
in tre grandi cromosomi
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