MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

AZIL KoA-OXIDASA (AOX) JARDUERAREN NEURKETA (Small et al., 1985).
1.- Bareen liseri-guruinak TVBE indargetzailean homogenizatu eta 500 g-tan zentrifugatu,
15 minutuz eta 4ºC-tan.
TVBE indargetzailea pH 7.6 (100 ml)
NaHCO3 8.4 mg
0.1M EDTA 1 ml
%0.1 etanol 0.1 ml
%10 Triton X-100 0.1 ml
H2O distilatua 100 ml
2.- Gainjalkinaren 100 µl (beharrezko diluzioan) hartu eta 1.9 ml inkubazio-mediora gehitu.
Nahasketa 5 minutuz eta 25ºC-tan iluntasunean mantendu. Substratuaren (Palmitoil-KoA
(Sigma P-9276) 3 mM) 10 µl gehitu, nahastu eta absorbantziaren aldaketa neurtu 502 nm-tan 3
minutuz.
Inkubazio-medioa
0.5M potasio fosfato indargetzailea 2 ml
DCF disoluzioa* 2 ml
Errefrau peroxidasa 1200 mU/ml (Sigma P-8250) 1 ml
4 M NaN 3 (Sigma S-2002) 1 ml
%10 Triton X-100 (Sigma X-100) 2 ml
H 2 O distilatua 100 ml arte
*1 ml egiteko: 1.3 mg diklorofluoreszeina (DCF) (Molecular Probes D-399) 100 µl
dimetilformamida + 900 µl 0.01 N NaOH-an disolbatu.
Potasio fosfato indargetzailea 0.5 M pH 7.4
KH2PO4 680 mg
H2O distilatua 10 ml
K 2 HPO 4 3H 2 O 1140 mg
H 2 O distilatua 10 ml
KH 2 PO 4 disoluzioa K 2 HPO 4 3H 2 O disluzioari gehitu pH 7.4 lortu arte.
Substratu disoluzioa (3 mM palmitoil-KoA oxidasa)
Palmitoil-KoA (Sigma, P-9276) ur distilatuan disolbatu, beharrezko kontzentrazioa
lortu arte. 0.5 ml-tako alikuotetan izoztu eta gorde.
3.- AOX jardueraren neurketa honela burutu:
mUnitate/ml = (Absorbantziaren aldaketa/minutu) x (erreakzio-bolumena/lagin-bolumena)
x (mg proteina/ml).
mUnitate/mg proteina = (mUnitate/ml) / ( mg proteina/ml)
Metodologi-eranskina
235