MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

Metodologi-eranskina
B-2) Fosfatasa alkalino bidezko detekzioa.
1.- Disekzionatutako laginak aurretik azaldu bezala prestatu.
2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren, ebakiak
xiloletan eta etanolezko bainutan desparafinatu eta hidratatu.
3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuraketa burutu daiteke.
Horretarako ebakiak %0.5 tripsina duen TBS-an 5 minutuz murgildu.
TBS, pH 7.6 (100 ml)
Tris 0.605 g
NaCl 0.877 g
H 2 O distilatua 100 ml
4.- Ebakiak PBS-an garbitu.
5.- Ebakiak 11.36 N HCl-an ordu batez inkubatu 37ºC-tan, DNA harizpien bereizketa lortzeko.
Ondoren, sodio tetraborato indargetzailean inkubatu (2 x 5 min).
Sodio tetraboratoa 0.1M, pH 8.5 (100ml)
B4O7Na2 3.814 g
H2O distilatua 100 ml
6.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta %5 BSA duen PBS-an 20 minutuz inkubatu.
7.- Ondoren, ebakiak BrdU antigorputzarekin (Roche) inkubatu (1:100 diluzioa) %1 BSA
duen PBS-an, ordu batez eta giro-tenperaturan.
8.- Ebakiak PBS-an garbitu (5 minutuz etangabe irabiatzen) eta antigorputza abidinabiotina-entzima
konplexuaren bitartez ikustarazi, Sigma Mouse Extravidin Alkaline Phosphatase
Staining Kit-a (Sigma EXTRA 2A) erabiliz. Horrela, ebakiak biotinilatutako arratoiaren aurkako
ahuntzaren antigorputz sekundarioarekin inkubatu (1:20 diluzioa) 20 minutuz giro-tenperaturan.
Ondoren, ebakiak PBS-an garbitu ostean (5 minutuz etengabe irabiatzen) Fosfatasa alkalinoan
itsatsita daraman extrabidinarekin inkubatu (1:20 diluzioa) 20 minutuz eta giro-tenperaturan.
9.- Laginak TBS-an garbitu 5 minutuz eta fosfatasa alkalino jarduera Fast Red TR/Naphtol
tabletak sustrato gisa erabiliz ikustarazi (Sigma F-4523).
10.- Ebakiak Mayer Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatu eta ur
distilatuan garbitu ostean Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.
232