MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

TBS, pH 7.6 (100 ml)
Tris 0.605 g
NaCl 0.877 g
H 2 O distilatua 100 ml
4.- Ebakiak PBS-an garbitu eta peroxidasa aktibitate endogenoa %3 H 2 O 2 duen
metanola 10 minutuz erabiliz blokeatzen da.
5.- Ebakiak 11.36 N HCl-an ordu batez inkubatu 37ºC-tan DNA harizpien bereizketa
lortzeko. Ondoren sodio tetraborato indargetzailean inkubatu (2 x 5 min).
Sodio tetraboratoa 0.1 M, pH 8.5 (100ml)
B4O7Na2 3.814 g
H2O distilatua 100 ml
6.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta %0.1 BSA duen PBS-an ordu batez
inkubatu.
7.- Ondoren, ebakiak BrdU antigorputzarekin (Roche) (1:100 diluzioa) inkubatu %0.1 BSA
duen PBS-an, ordu batez eta giro tenperaturan.
8.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta antigorputza abidina-biotina entzima
konplexuaren bitartez ikustarazi Vectastain Elite ABC Kit-a (Burlingame) erabiliz. Horrela, ebakiak
biotinilatutako arratoiaren aurkako zaldiaren antigorputz sekundarioan inkubatu (1:200 diluzioa) 30
minutuz giro tenperaturan. Ondoren, ebakiak PBS-an garbitu ostean (3 x 10 min), ABC
erreaktiboan 25 minutuz inkubatu giro-tenperaturan.
9.- PBS-an garbiketak egin ondoren, ebakien peroxidasa jarduera 3 amino 9 etilkarbazol
(AEC) (Sigma A-6926) disoluzio kromogenoa erabiliz ikustarazi.
AEC kromogenoaren disoluzioa
AEC disoluzioa 200 µl
Sodio azetatoa 0.05 M 4 ml
H2O2 2 µl
AEC Disoluzioa
AEC 20 mg
Dimetilformamida 2.5 ml
Sodio azetatoa 0.05 M, pH 5.2 (100 ml)
Sodio azetatoa 0.6804 g
H 2 O distilatua 100 ml
Metodologi-eranskina
10.- Ebakiak, Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatu eta ur distilatuan
garbitu eta ondoren Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.
231