MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

Metodologi-eranskina
4.- Ebakiak PBS-an garbitu eta peroxidasa jarduera endogenoa %3 H 2 O 2 duen
metanola 10 minutuz erabiliz blokeatu.
PBS
NaCl 16 g
KCl 0.4 g
NaH 2 PO 4 H 2 O 0.46 g
Na 2 HPO 4 12H 2 O 6.8 g
H 2 O distilatua 2 l
5.- Ebakiak PBS-tan garbitu (3 x 10 min) eta %0.1 BSA duen PBS-tan ordu batez
inkubatu.
6.- Ondoren, ebakiak PCNA antigorputzarekin (PC10 klona) (Sigma P-8825) inkubatu
(1:1500 diluzioa), %0.1 BSA duen PBS-tan, 4ºC-tan eta gau osoan.
7.- Ebakiak PBS-tan garbitu (3 x 10 min) eta antigorputza abidina-biotina entzima
konplexuaren bitartez ikustarazi Vectastain Elite ABC Kit-a (Burlingame) erabiliz. Horrela, ebakiak
biotinilatutako arratoiaren aurkako zaldiaren antigorputz sekundarioan inkubatu (1:200 diluzioa) 30
minutuz giro tenperaturan. Ondoren, ebakiak PBS-tan garbitu eta gero (3 x 10 min) ABC
erreaktiboan inkubatu 25 minutuz eta giro-tenperaturan.
8.- PBS-tan garbiketak egin ondoren, ebakien peroxidasa jarduera diaminobenzidina
(DAB) disoluzio kromogenoa erabiliz ikustarazi.
DAB disoluzio kromogenoa
DAB 0.06 g
PBS 75 ml
H2O2 25 µl
9.- Ebakiak Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatzen dira eta ur distilatuan
garbitu onodoren Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.
B) BrdU IMMUNOHISTOKIMIKA
B-1) Peroxidasa bidezko detekzioa.
1.- Disekzionatutako laginak aurretik azaldu bezala prestatu.
2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren ebakiak
xiloletan eta etanolezko bainutan desparafinatu eta hidratatu.
3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuratzea egin daiteke.
Horretarako ebakiak %0,5 tripsina duen TBS-tan 5 minutuz murgildu.
230