MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

(Fe), beruna (Pb), nikela (Ni) eta zinka (Zn).
Lurzoruaren laginak modu berean prozesatu ziren.
Metalotioneina-mailen determinazio
espektrofotometrikoa
MT-mailak sulfidrilo taldeen (-SH) determinazio
espektrofotometrikoaren bitartez estimatu ziren
(UNEP/RAMOGE, 1999). MTen kontzentrazioa,
laginaren -SH edukina espertrofotometro bitartez
kuantifikatu da, Ellman erreaktiboa (5,5 ditiobis 2
azido nitrobenzoikoa; DTNB) erabiliz. Laburki,
liseri-guruinaren zatiak 1 g ehun emateko taldekatu
ziren, eta motoreak gidatutako teflonezko
homogeneizagailuan ß-merkaptoetanola,
fenilmetanosulfonilfluorido (PMSF) eta
leupeptinadun indargetzaile homogeneizatzai-
learen 3 bolumenetan homogeneizatu ziren.
Homogeneizatuak 30000x g-tan 20 min 0-4ºC-tan
zentrifugatu ziren. Gainjalkinean zeuden pisu
molekular baxuko proteinak etanol absolutu
hotzean (-20ºC), eta ondoz ondoko 6000x g-ko
zentrifugazioaren bitartez prezipitatu ziren. MTtan
joria zen pisu molekular baxuko frakzioa 0.25 M
NaCl, 1 N HCl eta 4 nM EDTA zuen indargetzailean
berresekitu zen. Erreferentziazko kurba
estandarrak, 1 mg glutation/ml 0.25 M NaCl stock
disoluzioa erabiliz sortu ziren. MTen ebaluazio
espektrofotometrikoa 0.43 mM DTNB 0.2 M fosfato
indargetzailean erreaktibo gisa erabiliz egin zen,
absorbantzia 412 nm-tan neurtuz.
Autometalografia
Parafinazko ebakien talde bat
autometalografiaz tindatu zen. Autometalografia
Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa
metalak zilarrezko hauspeakin beltz gisa
ikustarazteko argazkilaritzan oinarritutako teknika
da (Danscher, 1984). Ebakiak (7 µm), xilenoz
desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko
etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean
(40ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak
ondoren, eta gela ilunean, argazki-emultsio geruza
fin eta uniforme batez estali ziren (Ilford Nuclear
Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra).
Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean
(30 minutu) eta Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur
distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt,
Alemania) errebelatzaile komertziala erabiliz
errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren,
errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa
zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez eta,
azkenik, erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa-
Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu
zen 10 minutuz. Laginak, Kaiser gelatina
glizerinatuan muntatu ziren.
BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan
irudi-analisi bitartez
Liseri-zelulen lisosometan zeuden BSDen
azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto
& Marigómez, 1997a; 1997b), emaitzak BSDen
dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argi-
mikroskopiazko irudiak (x100 handipenean) B&W-
CCD TV kamera, HR-TV kolorezko pantaila, Leitz
mikroskopioa, PC ordenagailua, PIP 1024 (Matrox
Electronic Systems Ltd., Dorval, Kanada) sistema
eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak
garatutako softwarea erabiliz eskuratu ziren.
Ondoren, eskuz eta softwarearen laguntzarekin
193