MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

zeuden momentuan.
BrdU immunohistokimika
Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean
(%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10
azido azetikoa) ordu batez fixatu ziren 4°C-tan,
goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie
batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu
ziren, 60°C-tan. Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera)
American Optical mikrotomo batean erdietsi ziren,
eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilano)
silanizatutako portaobjektuetan jaso ziren.
Ondoren, ebakiak xilenoz desparafinatu,
etanolezko bainu-serie batean hidratatu, eta
PBSaz (fosfato indargetzaile salinoa; ingelesez,
Phosphate-Buffered saline) garbitu ziren.
Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, ebakiak
%3 zuen H 2 O 2 -an 5 minutuz inkubatu ziren eta
berriro PBSaz garbitu ziren. DNA, ordu batez
37°C-tan 0.1N HCl-z desnaturalizatu zen. Ebakiak,
borato indargetzailean (pH=8.5) neutralizatu eta
PBSaz garbitu ziren. Ondoren, ebakiak Vectastain
Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, Burlingame,
Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak) hornitutako
serum blokeatzaile normalean (NBS, ingelesez;
Normal Blocking Serum) ordu batez inkubatu ziren,
giro-tenperaturan, eta berriro PBSaz garbitu ziren.
Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz
espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza; 1:10 %0.1
behi-albumina seruma zuen PBSan) inkubatu
ziren. Laginak PBSaz garbitu, eta ondoren,
Vectastain Elite ABC Kit-a erabiliz abidina-biotina-
entzima (ABC) metodoaren bidez
immunokonplexuak ikustarazi ziren. Laburki,
ebakiak, PBSan diluitutako sagu aurkako zaldiaren
Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra
IgG antigorputz sekundario 30 minutuz biotinilatuan
inkubatu ziren, eta ondoren PBSan biziki garbitu
ziren. Peroxidasa jardueraren ikustaraztea, sodio
azetato indargetzailean (pH = 5.2) 3-amino-9-
ethylkarbazola eta %0.015 H 2 O 2 zituen
kromogeno-disoluzioa erabiliz erdietsi zen.
Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu (10
segundu), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina
glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse
Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak)
muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50
(Olympus, Tokio, Japonia) mikroskopioari atxiki
zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi
ziren.
Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa
Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argi-
mikroskopioan konkateka zuzenaren bidez burutu
zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen
proportzioa antzemateko asmoz, lagin bakoitzean
1000 zelula zenbatu ziren, beste ikerketetan
erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et
al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Aldez aurretik
egindako behaketa histologikoek, liseri-epitelioaren
tubulu moduko ebakidura bakoitzean gutxienez 20-
30 zelula daudela erakutsi zuten. Hori dela eta,
eguneroko lana errazteko asmoz, zelula BrdU-
positiboen zenbaketa aleatorioki hautatutako 40
tubulu moduko ebakiduretan burutu zen (800-1200
zelula) liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki
konduktu sekundarioen ebakidura bakoitzean 70-
90 zelulak agertzen direnez gero, zelula BrdU-
positiboen zenbaketa 10 konduktu sekundarioen
ebakiduretan burutu zen (700-900 zelula). Horrek,
123