MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

Jakintza-arloa: Natur Zientziak 

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO 

EPITELIOAREN BERRIZTAPEN 

ZELULARRA ETA BERE 

INPLIKAZIOA 

INGURUMEN-OSASUNAREN 

EBALUAKETAN 

Egilea: BEÑAT ZALDIBAR ARANBURU 

Urtea: 2006 

Zuzendaria: JUAN ANTONIO MARIGÓMEZ ALLENDE 

Unibertsitatea: UPV/EHU 

ISBN: 978-84-8438-190-7

Hitzaurrea 

Dagoeneko ia bi urte igaro dira tesia aurkeztu nuenetik eta denbora tarte 

horretan argiak diren zenbait aldaketa nabarmentzen dira. Tesiaren zati 

teorikoan aipatzen den moduan bi ildo nagusi jorratu dira. Lehendabizi 

moluskuen eta nagusiki muskuiluen liseri-guruineko zelulen berriztapenaren 

azterketa burutzen da. Horretarako, gaur egun indarrean dauden zenbait 

teknika immunohistokimiko erabili dira. Ohikoak eta aski ezagunak ugaztunetan 

baina zenbait kasutan oraindik ere ornogabeetan guztiz hedatu gabe daudenak 

(antigorputz espezifikoen faltagatik edota ehunen ezagutza oraindik ere oso 

sakona ez delako). Bigarren ildoa, moluskuen liseriepitelioan gerta daitezkeen 

aldaketak ingurumen-osasunaren ebaluaketan erabiltzen diren 

biomarkatzaileetan nolako eragina duten ikertzea izan da. Biomarkatzaileak 

antolakuntza maila biologiko sinpleenetan (maila zelular, molekular zein 

tisularrean) gertatzen diren aldaketak dira eta antolakuntza maila biologiko 

konplexuagoetan (populazio edo ekosistema) sortaraz daitezkeen alterazioak 

aurresateko lagungarriak izan daitezke. Ahalik eta erantzun goiztiarragoen 

bilaketa dela eta, azkenengo urteotan biologia molekularreko tresnak gero eta 

gehiago nabarmenduz joan dira eta “omics” bezala ezagutzen diren jarduerak 

(genomics, proteomics, metabonomics…) gero eta pisu zein garrantzi gehiago 

hartuz joan dira. 

Egungo biologiaren tendentzia ikusita, zalantzarik gabe gaur berriz ere nire 

tesiarekin hasiko banintz, tresna molekularren erabilpenak pisu gehiago izango 

luke. Hau da, zelulen proliferazioa aztertzeko immunohistokimikak egiteaz gain, 

hau da, proteina jakin bat ehunean lokalizatzeaz gain, proteina hori kodetzen 

duen RNA mezularia lokalizatzen saiatuko nintzen in situ hibridazioak eginez. 

Eta, biomarkatzaileen atalari dagokionez, zelula- eta ehun-mailako 

biomarktzaileak erabiltzeaz gain, ziur aski, maila molekularreko 

biomarkatzaileren bat ere (gene ezagun baten adierazpen-maila, adibidez) 

erabiliko nuke. Dena den, ugaztunetan aski garatuak dauden teknologia hauek, 

ornogabeetan, aldiz, oraindik lehendabiziko urratsak betetzen ari dituzte. 

Aurretik aipatutako guztia egia bada ere, 2006. urtean Valery Forbes 

ikertzaileak argitaratutako artikulu batean, gaur egungo biomarkatzaileen 

erabilpena eta tendentzia (aipatutako “omics” teknologia) zalantzan jartzen ditu. 

Bertan, biomarkatzaileak, kutsatzaileak nolako mekanismo zelular eta 

molekularren bitartez eragiten duten ezagutzeko baliogarriak direla esaten du, 

baina bere izaera prediktiboaren gainean hodei ilun bat ezartzen du. Hori dela 

eta, ingurumen toxikologian lan egiten dugunoi, epe luzeko esperimentu 

konplexuak egitera bultzatzen gaitu, beraz, ez dirudi hurrengo urteotan lan falta 

izango dugunik. Aldaketa klimatikoa ahaztu gabe, noski, baina hori beste 

historia bat da…

ZOOLOGIA ETA ANIMALI ZELULEN BIOLOGIA SAILA 

DEPARTAMENTO DE ZOOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR ANIMAL 



ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA 

INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN 

Beñat Zaldibar Aranburu 

Biologian Doktore Gradua lortzeko aurkeztutako memoria 

Leioa 2006ko Otsaila

Ikerlan honek hurrengo laguntzak izan ditu: 

Euskal Herriko Unibertsitatea (240110) proiektua (1999-2000) eta 

Ikerkuntza-talde kontsolidatuei emandako laguntzak (2001. tik aurrera) 

Eusko Jaurlaritza (PI-1999-23) proiektua (2001-2002) eta ETORTEK- 

BERRILUR proiektua (2004-2005)

ZOOLOGIA ETA ANIMALI ZELULEN BIOLOGIA SAILA 

DEPARTAMENTO DE ZOOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR ANIMAL 



ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA 

INGURUMEN-OSASUNAREN 

EBALUAKETAN 

Beñat Zaldibar Aranburu 

Biologian Doktore Gradua lortzeko aurkeztutako memoria 

Leioa 2006ko Otsaila

I.- ZATI TEORIKOA.............................................................................................................1 

1.- Moluskuen liseri-guruina....................................................................................5 

1.1.- Bibalbioak (Mytilus eredua).................................................................5 

1.2.- Gastropodo itsastarrak (Littorina eredua).........................................14 

1.3.- Lehorreko gastropodoak (Arion eredua)...........................................17 

1.4.- Liseri-guruinaren plastikotasuna.......................................................21 

1.4.1.- Epitelioaren aldaketa morfologikoak..................................21 

1.4.2.- Zelula-moten ordezkapena................................................22 

1.4.3.- Liseri-guruineko epitelioko zelulen plastizitatea.................23 

2.- Epitelio-ehunen berriztapena...........................................................................25 

2.1.- Epitelioetako zelula amak.................................................................26 

2.2.- Zelulen proliferazioa aztertzeko teknikak..........................................27 

2.2.1.- Fluxu-zitometria..................................................................28 

2.2.2.- Nukleotidoen analogoen erabileran oinarrituriko 

teknikak..........................................................................................28 

3 H-timidinaren bitartezko markaketa....................28 

Bromodeoxiuridina bitartezko markaketa..............29 

2.2.3.- Antigeno nuklearren immunohistokimikan oinarrituriko 

teknikak..........................................................................................31 

Ki67 antigenoaren immunohistokimika.................31 

PCNA antigenoaren immunohistokimika...............32 

Ziklinen menpeko kinasen immunohistokimika.....33 

Ziklinen immunohistokimika..................................34 

2.2.4.- Geneen adierazpenaren azterketan oinarrituriko 

teknikak..........................................................................................34 

2.3.- Zelula amen bitartez berriztaturiko epitelioak...................................37 

2.3.1.- Ugaztunen epidermisa.......................................................37 

2.3.2.- Ugaztunen hestea..............................................................40 

2.3.3.- Ugatz-guruina.....................................................................42 

2.3.4.- Krustazeoen hepatoarea....................................................45 

2.4.- Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioak.....47 

2.4.1.- Area....................................................................................47 

2.4.2.- Listu-guruinak.....................................................................49 

2.4.3.- Ugaztunen gibela...............................................................51 

2.4.4.- Moluskuen liseri-guruina....................................................52

II.- AUZIAREN EGOERA, HIPOTESIA ETA HELBURUAK.............................................69 

III.- EMAITZAK ETA EZTABAIDA.....................................................................................75 

1.- Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseriguruinean...............................................................................................................77 

2.- Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseriguruinean 

eta urdailean........................................................................................103 

3.- Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi, 

adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak............................................119 

4.- Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea 

molusku itsastarraren liseri-guruinean.................................................................139 

5.- Liseri-zelulen tberriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten pean 

esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan.................................163 

6.- Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina 

biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien artean 

lekuzaldatze-esperimentuak ...............................................................................187 

IV.- ONDORIOAK ETA TESIA.........................................................................................217

Zati Teorikoa 

Lan honetan, estuki erlazionaturiko bi ildo nagusi jorratu dira. Lehenengoan 

molusku desberdinen liseri-epitelioko zelulen berriztapena nola burutzen den, eta zelulamota 

desberdinen kopurua eta proportzioa nola eta zein faktoreen arabera aldatzen diren 

aztertu da. Bigarrenean, moluskuen liseri-epitelioaren osaketa zelularrean zenbait faktorek 

bultzatutako aldaketek, ingurumen-toxikologian erabiltzen diren parametroen gainean 

norainoko eragina duten ikertu egin da. Bi ildo horiek, memoria honetan emaitza eta 

ondorioak aurkeztu dituzteneko 6 kapituluetan behin eta berriro uztartuko dira, jorratutako 

gaiak honako hauek izanik: 

1) Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseriguruinean. 

2) Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseriguruinean 

eta urdailean. 

3) Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi, 

adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak. 

4) Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea 

molusku itsastarraren liseri-guruinean. 

5) Liseri-zelulen berriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten pean 

esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan. 

6) Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina 

biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien artean 

lekuzaldatze-esperimentuak. 

Zati teorikoa, bere aldetik, bi atal nagusitan antolatuta dago. Lehenengo atalean, 

ikerlan honetan erabilitako material biologikoa aurkeztu egin da, Mytilus galloprovincialis 

muskuilu, Littorina littorea magurio eta Arion ater barearen liseri-guruinen biologia zelular 

eta tisularrari buruz dakizkigun oinarrizko kontzeptuak azalduz, hain zuzen ere. Halaber, 

beharrezkoa iruditu zaigunean, beste moluskuen espezieen ezaugarriak ere aintzat hartu 

dira, moluskuen liseri-guruinaren azalpen integratu eta konparatua osatzeko asmoz. Oro 

har, liseri-guruinaren funtzioak eta bere osagai zelularren deskribapena eta funtzioak 

azaldu dira. Gainera, moluskuen liseri-epitelioa plastikotasun handikoa denez, zelulamoten 

osaketa ingurumen-faktoreen eraginaren arabera nola eta noraino alda daitekeen 

adierazi dugu. Halaber, zelula-moten artean nagusiak ohi diren liseri-zelulen lisosomen 

edukia eta egitura ingurumen-faktoreen arabera ere alda daitekeenez, eta aldaketa horiek 

ingurumen-toxikologian biomarkatzaile gisa erabiltzen direnez, zelula-moten osaketaren 

aldaketek biomarkatzaileen gainean eduki dezaketen eraginaz ere aritu gara atal honen 

azken parrafoetan. 

3

Zati Teorikoa 

Bigarren atalean, epitelio-ehunetan zelulen berriztapena nola eman daitekeen 

azaltzen saiatu gara, oso laburki izan bada ere. Arestian, zelula amei buruzko zenbait 

oinarrizko orokortasunak adierazi dira. Gero, zelulen proliferazioa detektatzeko gaur arte 

erabilitako metodo ezagunenak azaldu dira. Azkenik, epitelioen berriztapenerako 

mekanismoen barianteak azaldu dira, hoberen ezagutzen diren zenbait epitelioren kasuen 

deskribapena emanez. Barianteak, duten estrategia orokorraren arabera bi taldetan 

sailkatu dira: (a) zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioak, eta (b) zelula amen 

partehartze zuzena ez duten epitelioak. 

Zati teorikoaren ostean, ikerlan honen hipotesia eta helburuak azaldu dira; emaitzei 

buruzko 6 kapituluen ostean, tesia eta ondorioak. Bukatzeko, memoria honen azken atala, 

erabilitako metodo, prozedura eta protokolo nagusiak zehazten dituen Metodologi- 

Eranskina dugu. 

4

1.- MOLUSKUEN LISERI-GURUINA 

Moluskuen liseri-guruina heste ertaineko egitura da, eta elikagaiak xurgatu egiten 

direneko adarkatutako dibertikuluz osatuta dago. Nahiz eta molusku talde desberdinen 

artean aldakortasun handia egon, eskuarki organo handia da oso. Dibertikuluetan 

liseriketa intrazelularra gauzatzen da. Halaber, liseriketa estrazelularrean parte hartzen 

duten entzima batzuen sintesia ere bertan burutzen da. Oro har, elikagaien liseriketaz gain 

bestelako hainbat funtzio betetzen ditu, organismoaren eraenketa metabolikoa eta 

homeostasiaren arduradun nagusia izatea, besteak beste. 

Liseri-guruinak, ikerketa esparru desberdinetan interes handia piztu du. Izan ere, 

animali talde desberdinen liseri-traktuaren eboluzio orokorra ulertu ahal izateko gakoorganoa 

da. Alde batetik, liseriketa intrazelular (berezkoa izaki primitiboetan) eta 

estrazelularraren (berezkoa izaki eboluzionatuetan) arteko bidegurutze ebolutiboa da. 

Bestalde, liseri-traktu ertainari asoziaturiko guruin primitiboenetakoa dugu. 

Ikerlan honetan zehar erabilitako hiru molusku espezietan liseri-guruinaren 

antolakuntza morfofuntzionalean hiru eredu desberdin bereiz ditzakegu, zehaztasun 

gehiagoz banan-banan jarraian azalduko direnak. 

1.1.- Bibalbioak (Mytilus eredua) 

Moluskuen liseri-guruina 

Mytilus galloprovincialis muskuilua bibalbio janari-iragazlea dugu. Iragazi 

beharreko partikulak, mukiaren bitartez bildu eta ezpai-palpoetarantz, eta ondoren 

ahorantz, garraiatzen dira. Gerora, hestegorri laburra igaro ondoren, iragazitako partikulak 

konplexua den urdailera heltzen dira (Salvini-Plawen, 1988). Behin urdailean, partikulak 

estilo kristalinoaren eraginaren ondorioz birrindu egiten dira, urdailean dauden entzima 

hidrolitikoek lehendabiziko liseriketa estrazelularra burutuz. Urdaila traktu ziliatu 

desberdinetan banatuta dago. Bertan, partikulak euren tamainaren arabera sailkatu eta 

banandu ondoren, liseri-guruineko dibertikuluetarantz bideratzen dira, liseri-konduktuen 

sistematik. Liseri-konduktu primarioak urdailetik abiatzen dira, eta beraietatik adarkatzen 

diren kalibre txikiagoko liseri-konduktu sekundarioak liseri-guruineko dibertikuluetara 

iristen dira (Morton, 1983). 

Liseri-guruina, anatomikoki bereizgarriak diren bi lobuluz osatuta dago, 

ezkerraldekoa eta eskubialdekoa, hain zuzen (Owen, 1966). Antolakuntza histologikoari 

dagokionez, hierarkizatutako antolakuntza lobularra ere antzeman da (1. Ird.; Basalo, 

5

Zati Teorikoa 

1998). Ehun konektibo dentsozko kapsula liseri-guruinaren bi lobuluak inguratzen ditu. 

Kapsula horrek loditze-gune nabarmen batzuk agertzen ditu, zeintzuetatik urdaila 

enkapsulatzen duen ehun konektibo dentsozko kapsularekin bat egin arte trenkada 

sendoak proiektatzen baitira. Horrela, dibertikuluen multzoak trenkada sendoen artean 

murgilduta agertu dira (lobulutxo primarioak). Lobulutxo primario bakoitza konduktu 

primario baten inguruan antolatuta dago. Lobulutxo primarioen barruan ehun konektibozko 

xaflek inguratutako lobulutxo sekundarioen taldekapenak bereizi dira. Horrela lobulutxo 

sekundario bakoitzean 5-10 dibertikulu daude, konduktu sekundario berari lotuta daudenak 

(Basalo, 1998). Urdaila zein konduktu primarioen inguruan muskulu leuna dago; konduktu 

sekundario eta dibertikuluetan, ordea, gero eta muskulu gutxiago agertzen da. Izatez, 

dibertikuluetan ez da muskulu leunaren zantzu esangarririk aurkitu (Basalo, 1998). 

Gaur egun molusku bibalbioentzat onartuta dagoen liseri-guruinaren eredua 

Mortonek proposatu zuen 1983. urtean. Eredu horren arabera, liseri-guruina, urdailetik 

abiatutako konduktu (primario eta sekundario) adarkatuen bitartez konektaturik dauden 

6 

1. Irudia: Masson-Golder tindaketa 

trikromikoaz tindatutako muskuiluaren liseriguruinaren 

ebakien irudiak. (A) Muskulu-ehun eta 

ehun konektibozko trenkada bat ikus daiteke. Gezi 

estuek muskulu-zelulak adierazten dituzte. Gezi 

lodiek trenkadaren zatirik zabalena adierazten 

dute. Izarrek, ehun konektibotan joriak diren 

trenkadaren zatirik estuenak adierazten dituzte. (B) 

eta (C) irudiek lagin baten gune beretsuan 

mikrometro batzuen distantzian hartutako bi ebakin 

erakusten dituzte. Geziek trenkadak adierazten 

dituzte. Eskala-marra: 100 μm. (Basalo-tik (1998) 

hartua).


tubulu itsuz osaturik dago (2. Ird.). Dena den, ebakien gainean interpretazioak egiterakoan 

eredu tubular honek zenbait arazo sortu ditu. Tubuluak oso adarkatuta baldin baleude, oso 

luzeak ez balira behintzat, ukondo eta bihurguneen hainbat irudi behatuko lirateke 

ebakietan, eta irudi hauek, berriz, urriak dira. Halaber, tubuluak oso adarkatuta ez baldin 

baleude (Salvini-Plawen, 1988), konduktuak oso handiak izan beharko lirateke, eta 

ebakietan agertzen diren konduktuen ebakidurak, berriz, urriak dira. Azkenik, konduktu eta 

tubuluen arteko loturen bi dimentsiotako irudi eskematikoak plazaratu diren arren (Owen, 

1966; Salvini-Plawen, 1988; Beninger & LePennec, 1991), eskema horiek 3-dimentsiotako 

(3-D) antolakuntza espaziala ezin dute argiro azaldu. Gainera, liseri-dibertikuluetan 

ematen den fluidoen sarrera- eta irteera-prozesuak eta liseriketa intrazelularrerako 

dibertikuluen epitelio-zeluletan ematen diren xurgapen-, jariapen- eta iraizpen-prozesu 

koordinatuak nekez azaldu daitezke eredu tubular honen arabera. 

Aitzitik, 3-D berreraiketak eginez, muskuiluen liseri-guruinean unitate 

morfofuntzionala liseri-albeoloa dela frogatu da (3. Ird.; Marigómez et al., 1995a; 1995b; 

Quincoces, 1995; Lekube, 1997). Liseri-albeoloak, konduktu sekundariotik irekitzen dira, 

2. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako muskuiluaren liseri-guruinaren ebakinen irudiak. (A) Liseri-guruinaren 

ikuspegi orokorra, bertan (K) liseri-konduktuak, (G) liseri-albeoloen ganbarak eta (A) ehatz itxurako luzakinak bereiz 

daitezke. Ehun konektiboak liseri-egiturak inguratzen ditu. (B) Hatz itxurako luzakin baten soslaia xehetasun gehiagoz 

ikusten da. Bertan liseri-zelulak (LZ), eta zelula basofilikoak (ZB) bereiz daitezke. 

7

Zati Teorikoa 

3. Irudia: Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-albeoloen plastikotasunaren irudi adierazgarriak. (A) 3Dberreraiketaz 

lortutako unitate morfofuntzionalaren 3D-modeloa. Bertan konduktua, ganbara eta bertatik ateratzen 

diren behatz itxurako proiekzioak (zenbakiekin adieraziak) bereizi daitezke. Ikus behatz itxurako proiekzioen tamaina 

itsasaldi-erregimenaren arabera nola aldatzen den (A-1, marearteko muskuilua; A-2 mareazpiko muskuilua). (B) 

Liseri-albeoloen morfologia eta tamainaren aldaketak ingurumen-baldintzen arabera. Estres peko egoeretan 

albeoloen bolumenaren proportziorik handiena ganbarari dagokio, tendentzia hori estres egoera gogortzen den 

heinean (gezia) markatuagoa agertzen delarik. (C) Liseriketa-faseak zati distaletatik ganbara-alderaino bidaiatzen 

hartzen duten zentzua (gezia). Zati distalean proiekzioak nagusiki atseden-fasean aurkitzen dira eta ganbara-aldean 

berriztapen-fasean, berriz. 

8


eta, Mortonen ereduko liseri-tubuluak ez bezala, estrukturalki konplexuak dira. Konduktutik 

gertuen dagoen albeoloaren zatia zabalduta agertzen da (ganbara) eta bertatik behatz 

itxurako luzakin tubularrak (4-10 proiekzio) proiektatzen dira. Zenbait kasutan, luzakin 

horiek alde distalean banatuta egon daitezke, eta konduktu sekundario eta ganbararen 

artean estugunea (lepoa) ere ager daiteke. Ganbara zapalduta dago, eta bere dimentsiorik 

txikienean ez da behatz-itxurako luzakinen kalibrea baino handiagoa. Hori dela eta, 

tubuluen ukondo edo adarkatze-gune moduan interpretatu da hainbat lanetan, eta zenbait 

kasutan ere gemazio bidez agertutako tubulu berrien sorgune gisa (Palmer, 1979). 3-D 

berreraiketak emandako ikuspegi berri hori, kriohausturaz lortutako laginak ekorkuntzazko 

mikroskopio elektronikoan aztertuz egiaztatu egin da (Basalo, 1998) (4. Ird.). 

Aipatutako albeoloen deskribapena muskuiluen kasuan indibiduo helduentzat 

baliagarria da, baina muskuilu gazteetan (maskorraren luzera

Zati Teorikoa 

5. Irudia: Liseri-zelula eta zelula basofilikoaren ultrastrukturaren irudi eskematikoa. (A) Liseri-zelularen sistema 

endo-lisosomiko garatuaren osagaiak bereiz daitezke. (B) Zelula basofikoaren soslaia piramidala da, eta erretiku 

endoplasmatiko pikortsua eta Golgi sistema oso garatuak ditu. (Owen-tik (1973) birmoldatua). 

Liseri-albeoloen epitelioan nagusiki 2 zelula-mota aurkitu dira, liseri-zelulak eta 

zelula basofilikoak (Owen, 1972) (2. eta 5. Ird.). 

Liseri-zelulak (5. eta 6. Ird.) azidofilikoak dira. Itxurari dagokionez prismatikoak dira, 

baina kubikoak ere izan daitezke. Erpinaldea, mikrobiloxkez hornituta dago. Mikrobiloxken 

kopurua eta garapena oso aldakorra da, zelulen egoera metabolikoaren arabera 

6. Irudia: Transmisiozko mikroskopio elektroniko bidez lortutako Mytilus galloprovincialis muskuiluaren (A) liserizelula 

(handipena x6000) eta (B) zelula basofilikoaren (handipena x9000) irudiak. Liseri-zelulan sistema 

endolisosomiko garatua argiro beha daiteke. (N) nukleoa, (M) muskulua, (BL) xafla basala, (RB) hondakin-gorputza, 

(HL) heterolisosoma, (HP) heterofagosoma, (JC) lotura-konplexua. Zelula basofilikoa, ordea, elektrodentsoagoa da 

eta erretikulu endoplasmatiko pikortsua eta Golgi sistema oso garatua ditu. (N) nukleoa, (GC) Golgi-konplexua, (CT) 

ehun konektiboa (LF) lipofuszina. (Cajaraville-tik(1989) birmoldatua). 

10


(Cajaraville et al., 1991). Zelula hauek, sistema endo-lisosomiko oso garatua dute, 

liseriketa intrazelularra beraien funtziorik nagusiena delako (Robledo & Cajaraville, 1996). 

Alboetako eta oinaldeko mintzek interdigitazio eta inbaginazioak erakusten dituzte. 

Endozitosi-besikula, heterofagosoma, heterolisosoma, eta hondakin-gorputz ugari daude. 

Endozitosi-besikulak mikrobiloxkekin erlazionaturik agertzen dira, zelularen erpinaldean 

(Owen, 1970; Pal, 1972; Henry et al., 1991). Heterofagosomak, besikula erregularrak eta 

tamaina aldakorrekoak dira, eta, orokorrean, hauek ere erpinaldean deskribatu dira (Owen, 

1973). Heterolisosomak, zelularen erdialdean agertzen dira, heterofagosomak baino 

handiagoak eta esferikoak dira, eta beraien barneko materiala oso heterogeneoa da. 

Azkenik, hondakin-gorputzak zelularen oinaldean agertzen dira. Hondakin-gorputz horiek 

argira askatzen dira, konduktu primario eta sekundarioen argietan ere aurkitu direlarik 

(Cajaraville, 1989). 

Zelula-basofilikoak (5. eta 6. Ird), liseri-zelulak baino kopuru txikiagotan agertzen 

dira liseri-hodietan. Itxura piramidala dute, eta erpinaldean mikrobiloxkak dituzte. Mintzak, 

oinaldean zein alboetan, inbaginazio txikiak ditu. Zelula hauen ezaugarri garrantzitsuena 

basofilia da, duten erretikulu endoplasmatiko pikortsu ugaria dela eta (Henry, 1987). 

Horretaz gain, Golgi aparatua ere oso garatua dute. Nukleoa orokorrean zelularen 

oinaldean agertzen da. Autore batzuk, bigarren zelula basofiliko bat deskribatu dute, 

Cardium edule (Owen, 1970) edo Mytilus edulis (Thompson et al., 1974) moluskuetan. 

Bigarren zelula basofiliko hori, flagelatua omen da. 

Bibalbioen liseri-epitelioaren morfologia aldakorra da, izan ere liseriketa prozesua 

ziklikoa eta dinamikoa denez, aurrera doan heinean liseri-albeoloen epitelioek liseriketafase 

desberdinei dagozkien itxura desberdinak erakusten dituzte (7. Ird., Langton, 1975; 

Robinson & Langton, 1980; Morton, 1983): (a) I mota edo atseden-fasea; (b) II mota edo 

xurgatze-fasea, (c) III mota edo desegite-fasea; eta (d) IV mota edo berregite-fasea. 

Prozesuaren koordinazioa dela eta, eredu tubularrean oinarrituta molusku 

bibalbioen artean klasikoki bi motatako liseriketa-jarduera bereiztu dira: monofasikoa eta 

bifasikoa. Liseriketa monofasikoan, liseri-guruinean tubulu-mota bakarra izango litzateke 

nagusi une bakoitzean, fotoperiodo edo eta itsasaldiaren arabera. Jarduera-mota hori 

Dreissena polymorpha, Cardium edule, Ostrea edulis eta Scrobicularia plana espezieetan 

deskribatu da (Morton, 1969; 1970; 1971; Owen, 1972). Liseriketa monofasikoan liseriketaziklo 

bakoitzean, hau da, itsasaldi-ziklo bakoitzean, II motako tubuluek, I motako tubuluak 

ordezkatzen dituzte, eta amaieran III motako tubuluak dira nagusi. Liseriketa bifasikoan, 

ordea, aldi berean bi tubulu-mota nagusituko lirateke. Prozesu hau Lasaea rubra, Cardium 

edule eta Ostrea edulis espezieetan deskribatu da (McQuiston, 1969; Owen, 1972). Kasu 

11

Zati Teorikoa 

horretan, III motako tubuluen proportzioa liseriketa prozesuan zehar konstante mantentzen 

da, eta I eta II motako tubuluen artean txandakatzea suertatzen da itsasaldi-zikloan zehar 

(McQuiston, 1969). Edozein modutan, tubulu guztietara elikagaia aldi berean, neurri 

berean eta konposizio berarekin heltzen ez denez, liseri-guruinean 4 liseriketa-faseak 

(tubulu-motak) bereiz daitezke aldi berean, proportzio oso desberdinetan bada ere 

(McQuiston, 1969; Robinson & Langton, 1980; Robinson, 1983). 

Lau tubulu-moten existentzian oinarrituz, liseriketa intrazelularra azaltzeko teoria 

bat plazaratu zen (Morton, 1983; Henry, 1987; Beninger & Le Pennec, 1991). Elikagaiak 

heldu bitartean, tubuluak atseden-fasean egongo ziren. Elikagaiak tubuluetara 

iristerakoan, liseri-zelulek elikagaiak xurgatuko lituzkete (xurgatze-fasea), eta liseriketa 

bukatzearekin batera zelula asko deuseztatuko ziren (desegite-fasea). Azkenik, hurrengo 

liseriketa-zikloari ekin ahal izateko, epitelioa zelula berriez hornituko zen (berregite-fasea). 

Teoria horren arabera, liseriketa-zikloa eta epitelioaren berriztapen-zikloa koordinaturik 

egongo ziren (Morton, 1983), eta zelulen berriztapen masiboa ordu gutxitako epean 

suertatu beharko zen. Hau da, liseri-epitelioan zelulen berriztapen-maila izugarri handia 

izan beharko litzateke, eta liseri-tubuluetako epitelioa partzialki (liseriketa difasikoa) edo 

guztiz (liseriketa monofasikoa) berriztatua izango litzateke elikatze-ziklo bakoitzeko, 

etengabe. Aitzitik, epitelio-zelulen zatiketa ez da batere konspikuoa liseri-epitelioan 

(Marigómez et al., 1998a). 

7. Irudia: Liseriketa prozesuan zehar muskuiluen 

liseri-epitelioak hartzen dituen morfologia desberdinak. 

(A) Atseden-fasea, (B) Xurgatze-fasea, (C) Desegitefasea 

(D) Berregite-fasea. (Langton-tik (1975) 

birmoldatua). 

12


Eredu albeolarra aintzat hartzean, tubulu-moten existentziaren eta euren 

txandakatze-ereduaren esangura fisiologikoa oso bestelakoa dela frogatu da. Izan ere, M. 

galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruinean egindako 3-D berreraiketek, liseriketafaseak 

zati distaletatik ganbara-alderaino bidaiatzen duten eta albeolo bereko luzakinetan 

zehar modu sinkronikoan aurrera egiten duten uhinen moduan agertzen direla erakutsi 

dute (3C Ird.; Marigómez et al., 1995a; 1995b). Hau da, luzakinen zati distalen epitelioan 

atseden-fasea nagusitzen den bitartean, hurrengo lakainetan xurgatze- eta desegite-fase 

txandakatuak agertzen dira, ustezko berregite-fasea ganbara-alderantz nagusituz doalarik 

(Quincoces, 1995). Bestalde, entzima- eta lektina-histokimika, eta morfometria aplikatuz, 

liseri-zelulen ezaugarrietan oinarritutako liseriketa-faseen esangura fisiologikoa berraztertu 

8. Irudia: ß-Glukuronidasa entzimaren (A) eta WGA lektinaren bidezko N-azetil glukosamina hondarren (B) 

detektapen histokimikoa liseri-guruineko epitelioan liseriketa-fase desberdinetan. Sailkapen “klasikoaren” arabera: A- 

1/B-1 atseden-fasea izango litzateke, A-2/B-2 xurgatze-fasea, A-3/B-3 desegite-fasea eta A-4/B-4 berregite-fasea. 

Jarduera entzimatiko eta lektinen emaitzen arabera, liseriketa-faseen sailkapena aldatu beharko litzateke. Atsedenfasea, 

xurgatze-fasea izan beharko litzateke (WGA marka bortitza epitelioaren erpinaldean (B-1)), xurgatze-fasea, 

liseritze-fasea (entzimaren jarduera nabarmena eta WGA markaketa lisosometan (A-2 eta B-2)), desegite-fasea, 

liseritze-fase berantiarra (oso lisosoma handiak (A-3)) eta berregite-fasea, atseden-fasea (lisosoma txiki eta urriak eta 

WGA markaketa difuso eta ahula epitelioan zehar barreiatuta (A-4 eta B-4)). 

13

Zati Teorikoa 

da (8. Ird., Marigómez, argitaratu gabe). Berregite-fase "klasikoa" delakoa seguruenik 

atseden-faseari legokioke, liseri-zeluletan lisosoma urriak izanik, ezaugarri histokimikoek 

hori adierazi baitute. Izan ere, marearteko muskuiluak uretatik kanpo nahiko denbora igaro 

ondoren (hau da, elikatzerik ez dutenean), IV-motako tubuluen morfologia nagusitzen da 

(Cajaraville et al., 1991; 1992). Halaber, datu berriek mantentze-fase "klasikoa" xurgapenfaseari 

legokiokeela erakutsi dute, eta desegite-fase delakoan dauden albeoloak 

xurgapen-fase berantiarrari edo liseriketa intrazelularraren fase aurreratuari legozkieke 

(Marigómez, argitaratu gabe). Interpretazio berri honetan, epitelioaren berriztapena inolaz 

ere kontuan hartu ez dena azpimarratzekoa da. 

1.2.- Gastropodo itsastarrak (Littorina eredua) 

Prosobrankio itsastarretan, urdailetik atera ostean elikagaia liseri-guruinera heltzen 

da. Liseri-guruina, gonadarekin batera agertzen da, liseri-gurina/gonada konplexua 

izeneko organoa osatuz (9. Ird.). Liseri-guruinak normalean erraien parterik handiena 

9. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako magurioaren liseri-guruina/gonada konplexuaren ebakinen irudiak.(A) 

Ikuspegi orokorra, bertan liseri-gurineko dibertikuluak eta gonada-folikuluak tartekatuak ikus daitezke.(B) Liseri-azino 

baten soslaia xehetasun gehiagoz beha daiteke. Bertan liseri-zelulak (LZ) eta zelula basofilikoak (ZB) bereizi daitezke. 

14


betetzen du; ugalketa garaian izan ezik, noiz gonadaren tamaina asko emendatzen baita. 

Hala ere, liseri-guruinean tamaina desberdineko 2 lobulu bereiz daitezke, orokorrean 

ezkerreko lobulua handiagoa delarik. Urdaileko aurrealdera 3 konduktu labur eta 

adarkatugabez lotuta dago liseri-guruina. Liseri-guruina hainbat azino adarkatuez osatuta 

dago (Fretter & Graham, 1962), eta bertan elikagaien xurgapena eta liseriketa zein 

hondakinen andeatzea eta iraiztea burutzen dira (Merdsoy & Farley, 1973). Prosobrankio 

itsastarren liseri-guruinean oinarrizko bi zelula-mota daude, liseri-zelula eta zelula 

basofilikoa, alegia (10. Ird.). 

Liseri-zelula, (syn., guruin-zelula, xurgapen-zelula, zelula hepatiko, gibel-zelula, 

bakuolo-zelula, zelula jariatzaile) kolumnarra da, eta erpinaldean mikrobiloxka ugari eta 

proteinetan joriak diren pikor zitoplasmatikoak dauzka (Lufty & Demian, 1967; Mason 

1983; Voltzow, 1994). Oinaldean, zenbaitetan errefringentea izan daitekeen eduki 

heterogeneoa duten besikulak agertzen dira. Tamaina txikiko nukleoa, orokorrean 

erdialdean edo oinaldean kokatzen da. Zelula-mota honen zeregin nagusia liseriketa 

intrazelularra burutzea da (Voltzow, 1994). 

10. Irudia: Liseri-zelula eta zelula basofilikoaren irudi eskematikoak. (A) Zelula basofikoaren soslai piramidala eta 

erretiku endoplasmatiko garatua ikus daitezke, beste organuluekin batera. (B) Liseri-zelula egitura kolumnarra dauka 

eta morfologia desberdinak har ditzake liseriketa fasearen arabera. (cl), zilioa; (cr), zilioaren gorputz basala; (mv), 

mikrobiloxkak; (ps), proteinazko jariapen-pikorrak; (cy), zitosola; (gr), pikor mineralizatuak; (rer), erretikulu 

endoplasmatiko pikortsua; (mi), mitokondrioa; (sv), iraizte-pikorra (gb), diktiosoma; (lin), tolesdura laterala; (nu), 

nukleoa; (nue), nukleoloa; (bin), tolesdura basala; (bl), xafla-basala; (m), muskulua; (hae), hemozianina; (lu), lumena; 

(dv), liseri-bakuoloa; (li), lipidoa, (pv), pinozitosi pikorra; (rb), hondakin-gorputza. (Mason-etik (1983) hartua). 

15

Zati Teorikoa 

Zelula basofilikoa, (syn., zelula jariatzailea, kripta-zelula, iraizte-zelula, hartzitzezelula) 

liseri-zelula baino urriagoa da (Lufty & Demian, 1967; Mason 1983; Voltzow, 1994). 

Hematoxilina-eosinaz tindatzerakoan, zitoplasma liseri-zelularena baino askoz 

basofilikoagoa suertatzen da, izena hortik datorkiolarik. Itxura piramidala edo konokara 

izanik, banaka zein 3-4 zeluletako multzoetan ager daiteke, askotan liseri-tubuluen ertz 

periferikoei asoziatuta. Nukleolo oso nabarmena daukan nukleo handia ageri da oinaldean. 

Erretikulu endoplasmatiko pikortsua oso garatua dago, eta nukleoaren inguruan kokatzen 

da. Bestalde, mintz-pikor zitoplasmatikoen presentzia nabarmena da. Batez ere 

erpinaldean dauden pikor batzuk oso elektrodentsoak dira, eta seguruenik jariapenproteinez 

osatuta daude. Oinalderagontz sakabanaturik dauden beste pikorretan, ordea, 

fosfato kaltzikoa dugu osagai nagusi (Mason, 1983; Marigómez et al., 1990). Zelula 

basofilikoek, kaltzioaren garraioan eta metaketan parte hartzen dute, eta liseriketa 

estrazelularrerako entzimak jariatzen dituzte (Owen, 1956; Fretter & Graham, 1962; 

Merdsoy & Farley, 1973; Mason, 1983). 

Magurioen liseri-guruinean, nahiz eta muskuiluetan deskribatzen diren "tubulumota" 

desberdinak ez agertu, liseri-zelulen pikorren kopuru eta morfologiaren arabera 

liseriketa-prozesuarekin erlazionatutako 3 edo 4 fase bereiztu dira (11. Ird., Sáez et al., 

1990). Xurgapen-fasean pikor eosinofilikoak agertzen dira erpinaldeko ertzean, eta apur 

bat beherago purpura kolorea hartzen duten pikor ilunak. Liseriketa-fase goiztiarrean 

11. Irudia: Liseri-zelulek liserike-fase desberdinetan erakusten dituzten morfologia desberdinen irudi eskematikoa. 

(A) Xurgatze-fasea. Bertan zelularen erpinaldean pikor eosinofilikoak agertzen dira, eta euren azpian pikor ilun eta 

txikiagoak agertzen dira. (B) Liseriketa-fase goiztiarra. Pikor eosinofilikoak erpinaldean ageri dira eta pikor ilunak 

oinalderantz zabaltzen dira. (C) Liseriketa-fase berantiarra. Erpinaldean pikor eosinofilikoek darraite eta oinaldean 

pikor ilunekin batera lipofuszinen antzeko pikor horiak ageri dira. Pikor horiok fase honen karakteristikoak dira. (D) 

Iraizte-fasea. Erpinaldean urriak diren pikor eosinofilikoak zenbait kasutan bakuoloen barruan ageri dira. Lipofuszinen 

antzeko pikorrak oso nabarmenak dira (Sáez et al.-etik (1990) hartuta). 

16

aipatutako pikor ilunagoak zelula osoan zehar barreiaturik agertzen dira. Liseriketa-fase 

berantiarrean, pikor ilunetaz gain lipofuszinen antzeko pikor horiak oinaldean 

nabarmentzen hasten dira (Sáez et al., 1990). Azkenik, iraizte-fasean pikor gutxiago 

agertzen dira, eta bakuolo txikien zein lipofuszina-pikorren presentzia nabaria da. Prozesu 

hori, itsasaldien erregimenarekin estuki erlazionatuta dago. Izan ere, liseriketa batez ere 

itsasbeherako egoeretan gauzatzen da (Sáez et al., 1990). 

1.3.- Lehorreko gastropodoak (Arion eredua) 


Arion ater barearen liseri-guruina gorputzaren atal handia betetzen du, eta 

anatomikoki bereizgarriak diren bi guruin-zatitan bananduta dago: aurreko guruin-zatia, 

normalean txikiena, eta atzeko guruin-zatia. Bi guruin-zati horiek, papoarekin (aurreko 

guruin-zatia) eta urdailarekin (atzeko guruin-zatia) bi konduktu bereizien bitartez 

komunikatuta daude (Roach, 1968). Guruin-zati horiek, aurrekoa zein atzekoa, hainbat 

lobulutan daude bananduta (12. Ird., Runham & Hunter, 1970). Lobulu bakoitza, 

adarkatuak zein multzoka agertzen diren hainbat dibertikuluz osatuta dago. Liseridibertikuluak 

unitate adenomerikoz daude osaturik. Unitate adenomerikoan (13. Ird.), liserikonduktu 

izeneko gune zentral zabala dago, eta bertatik azino-itxurako zabalguneak 

adarkatzen dira (liseri-azinoak). 

12. Irudia: Arion ater barearen liseri-sistemaren irudi eskematikoa. Bertan elikagaien liseriketan parte hartzen 

duten organo desberdinak ageri dira eta liseri-guruinaren izaera lobularra bereiz daiteke. (Argaud & Bounoure-tik 

(1910) birmoldatua). 

17

Zati Teorikoa 

Liseri-konduktuen zein liseri-azinoen epitelioak berdintsuak dira, eta zelula-mota 

berdinez osatuta daude (13. eta 14. Ird.). Liseri-konduktuak kalibre txikiko iraizte-kanal 

izeneko konduktuetara irekitzen dira, gerora papo zein urdailarekin konektatzen duten 

konduktuetara zabaltzen direnak. Iraizte-kanalen epitelioa ziliatua da. Zilioen mugimenduei 

esker elikagaiak liseri-konduktuetatik kanporantz bultzatzen dira. Bestalde, liseriguruinaren 

konduktuen inguruan ehun konektibo eta muskulu-ehun oso garatuak daude. 

Muskulu horrek, urdaileko uzkurketekin batera, elikagaiak liseri-guruinerantz barneratzen 

dituelarik (Walker, 1972; Luchtel et al., 1997). 

Liseri-azino eta -konduktuen epitelioan 3 zelula-mota deskribatu dira: liseri-zelula, 

iraizte-zelula eta kaltzio-zelula (Walker, 1969; Moya, 1973; Babula & Wielinska, 1988) (15. 

eta 16. Ird.). Autore batzuen arabera, laugarren zelula-mota bat ere egongo litzateke, estua 

eta desberdintzatu gabea, Deroceras reticulatum barearen kasuan beste 3 zelula-moten 

aitzindaritzat jo dena (Walker, 1972). Aitzitik, Walker-en (1971) arabera, liseri-zelula iraiztezelula 

bilaka liteke. Izan ere, beste autore batzuek ere, iraizte-zelulak liseri-zelula heldu 

edo zaharkitutzat hartu dituzte (Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). 

Liseri-zelula kolumnarra da (35-40 μm-ko altuera). Erpinaldean mikrobiloxkak eta 

endozitosi-besikulak agertzen ditu. Bertan, lisosomak ere aurkitu dira (Bowen, 1970; 

Triebskorn, 1991), endozitosi-besikulekin fusionatuz gero fagolisosomak ematen 

dituztenak. Fagolisosomek, zenbait tindaketaz kolore berdea hartzen dute, eta horregatik 

green granules (pikor berde) izena eman zaie. Erpinaldeko pikor berde horietan elikagaien 

18 

13. Irudia: Liseri-konduktu eta liserialbeoloen 

irudi eskematikoa. Bertan egitura 

lobulatuak eta liseri-guruinaren osagai 

desberdinak ikus daitezke. 1.- Iraizte-kanala, 2.- 

Iraizte-kanalaren epitelioa, 3.- Kapilarea, 4.- 

Kapilarearen zeharkako sekzioa, 5.- 

Kapilarearen ebakidura ukondo baten altueran, 

6.- Liseri-konduktu bati atxikitutako eta hainbat 

azinoz inguratutako kapilarea, 7.- Liserikonduktua 

8.- Aktibo dagoen epitelioaren irudi 

eskematikoa, 9.- Inaktibo dagoen epitelioaren 

irudi eskematikoa, 10.- Azinoen gainazaleko 

ikuspegi orokorra (Marigómez).


eskurapena eta liseriketa burutzen dira. Oinalderagontz askoz handiagoak diren eta 

liseriketaren hondakinak diren lipofuszinez osatuta dauden yellow granules (pikor hori) 

agertzen dira (Walker, 1972). Nukleoa oinaldean kokaturik dago, eta bere inguruan 

erretikulu endoplasmatikoa, Golgi aparatua eta zenbait kasutan glukogenoa eta lipidotantak 

ere agertzen dira (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Ezaugarri 

utrastruktural berezia manosoma izeneko mintz-egitura dugu (Baumforth et al., 1998). 

Manosomek, sei hodiko errosetatan antolatuta daude, eta hornidura entzimatikoa 

espezifikoa (manitol oxidasa) dute (Moya & Rallo, 1975; Czarna et al., 1985; Baumforth et 

al., 1998). Dirudienez, manosomak gastropodo lurtarren liseri-zeluletan arruntak dira 

(David & Götze, 1963). Oinaldeko zitoplasman, ioi-garraioarekin erlazionatutako fosfatasa 

alkalino jarduera behatu da (Bowen & Davies, 1971). Liseri-zelulek liseriketa-prozesuan 

zehar itxura desberdina erakutsi dezakete, altueraz zein mikrobiloxken eta pikor 

zitoplasmatikoen kopurua aldatuz (Sumner, 1965). 

Kaltzio-zelulak (syn., kripta-zelula; zelula jariatzailea) itxura piramidala duten 

zelulak dira (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Erpinaldean mikrobiloxkak dituzte, 

14. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako barearen liseri-guruinaren ebakien irudiak. (A) Liseri-guruinaren 

ikuspegi orokorra, bertan liseri-azino (A) eta -konduktuak (K) ikus daitezke. (B) Liseri-azino baten soslaia detaile 

gehiagoz beha daiteke. Bertan liseri-zelulak (LZ) , iraizte-zelulak (IZ) eta kaltzio-zelulak (KZ) bereizi daitezke. 

19

Zati Teorikoa 

15. Irudia: Liseri-zelula, kaltzio-zelula eta iraizte-zelularen (A) eta (B) Liseri-zelularen egitura kolumnarra eta 

sistema endo-lisosomiko garatua bereiz daiteke. (C) Kaltzio-zelularen soslaia piramidala da eta kaltzio pikorrak errez 

bereiz daitezke. (D) Iraizte-zelularen bakuolo handia da zelula-mota honen egiturarik bereizgarriena. (Walker-tik 

(1972) birmoldatua). 

eta horien azpian mitokondrioak, erretikulu endoplasmatiko leuna eta hainbat besikula 

pleomorfiko agertzen dira. Zelularen erdialdean proteinetan joriak diren besikulak paraturik 

daude. Oinaldean, nabarmenki handia den nukleoa aurkitu da. Lipido-tantak xafla 

basalaren gaineko zitoplasmaren eremuan ager daitezke. Zelulan zehar material 

heterogeneoa duten pikor biribilak ageri dira tipikoki. Pikor horiek, geruza kontzentrikoz 

paratutako matrizea dute, X-izpien mikroanalisia eta beste metodoen bitartez, behintzat 

Helix aspersa barraskilo eta Arion rufus barearen kasuetan frogatu denez, kaltzio, 

16. Irudia: Transmisiozko mikroskopio elektroniko bidez lortutako bareen (A) liseri-zelula (handipena x 2500), (B) 

kaltzio-zelula (handipena x31400) eta (C) iraizte-zelularen (handipena x3500) irudiak. Liseri-zelulan sistema endolisosomiko 

garatua beha daiteke. Kaltzio-zelulan, pikorren geruza kontzentrikoak bereiz daitezke. Iraizte-zelularen 

erpinaldean dagoen bakuolo handian izaera desberdineko pikorrak ikus daitezke. (Luchtel et al-tik (1997) 

birmoldatua). 

20

magnesio eta fosforoz (CaMgP2O7 moduan) osatuta dagoena (Howard et al., 1981; Mason 

& Simkiss, 1982; Janssen, 1985). Horregatik, pikor horiei kaltzio-esferula izena eman zaie, 

eta zelulei kaltzio-zelularena. Hala ere, beste zenbait elementu ere badaudela egiaztatu 

da, manganesoa, burdina, kobaltoa eta zinka, besteak beste (Simkiss, 1981; Mason & 

Simkiss, 1982, Recio et al., 1988). Kaltzio-zelularen funtzioari dagokionez, proposamen 

ezberdinak plazaratu dira. Ikertzaile batzuen arabera, barne-medioaren pH-a orekatzeko 

indargetzaile gisa funtzionatuko luke kaltzioak (Krigjsman, 1928). Beste autore batzuen 

aburuz, kaltzio-zelulek metabolismo orokorrean eta muki-ekoizpenean ezinbestekoa den 

kaltzio kantitate handien biltegi gisa funtzionatuko lukete (Walker, 1971). 

Iraizte-zelulek erpinaldean mikrobiloxka ugari dituzte, eta hauen azpian hainbat 

pikor eta mitokondrio, erretikulu endoplasmatikoa eta diktiosomak. Hala ere, zelula hauen 

ezaugarririk deigarriena zelularen bolumen gehiena betetzera irits daitekeen bakuolo 

handia da (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Bakuoloaren edukina heterogeneoa 

da, eta batez ere lipofuszinez osatuta dago. Lehen aipatu den bezala, autore batzuen 

arabera, iraizte-zelulak liseri-zeluletatik eratorriak izan litezke (Walker, 1971), afera hori 

oraindik ere eztabaidan dagoen arren (Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). 

1.4.- Liseri-guruinaren plastikotasuna 

1.4.1.- Epitelioaren aldaketa morfologikoak 


Liseri-guruinaren egitura ez da egonkor mantentzen; aitzitik, egoera desberdinen 

aurrean plastikotasun handia erakusten du. Hainbat ikerlanek deskribatutakoaren arabera, 

ingurugiroaren estres-iturrien pean, estrusio apokrino/holokrino eta aufogafia prozesuen 

emendioa behatu da liseri-epitelioan (Soto et al., 1996). Izan ere, kutsatzaile organiko zein 

ez-organikoen pean egondako moluskuetan eta baita bestelako estres orokorreko 

egoeratan (adb., baraualdiaren ondorioz), liseri-epitelioan aldaketa morfologiko 

esanguratsuak behatu dira, epitelioaren altueraren murrizpena eta zelula-moten 

proportzioaren aldaketak, bestek beste (Lowe et al., 1981; Couch, 1984; Marigómez et al., 

1986; 1993; 1996; 1998b; 2005; Recio et al., 1988; Vega et al., 1989; Cajaraville et al., 

1991). 

Liseri-epitelioaren batez besteko lodiera adierazteko MET (ingelesezko Mean 

Epithelial Thickness) parametroa erabili da. Dena den, MET parametroak ezin du bere 

osotasunean liseri-guruineko epitelioak pairatutako aldaketa estruktural guztiak azaldu. 

Liseri-dibertikuluaren tamaina adierazten duen MDR (ingelesezko Mean Diverticular 

21

Zati Teorikoa 

Radius) eta lumenaren kalibrearen adierazlea den MLR (ingelesezko Mean Luminal 

Radius) parametroek ere informazio baliotsua eman dezakete, eta baita MLR/MET eta 

MET/MDR parametro erlatiboek ere (Vega et al., 1989). Orokorrean, estresatutako 

moluskuen MET eta MDR balioak baxuak eta MLR balioak altuak dira. Hala ere, aldaketa 

morfologikoak ez dira beti espero bezala. Zenbait ikerlanetan, MET jaistearekin batera, 

MDR mantendu edo igo daiteke (Cajaraville et al., 1991; Cajaraville et al., 1992). MDR, 

batez ere, estres-iturri iraunkorren aurrean jaisten da esangarriki. Bestalde, marearteko 

bibalbioen kasuan, liseriketa-jarduera fasikoek ere liseri-epitelioaren altueraren gain 

eragina dute. I eta II motetako tubuluen morfologia duen liseri-epitelioa IV motetakoena 

baino garaiagoa da (7. Ird.). Gainera, estres-egoeretan, MLR goratzearekin batera, IV 

motako tubuluen morfologia duen epitelioaren hedapena ere emenda daiteke (Cajaraville 

et al., 1991). Azkenik, zenbait egoera patologikotan, kasik epiteliorik gabeko tubulu 

atrofikoei legokioken V motako epitelio-morfologia aurkitu da (Couch, 1984). 

Halaber, muskuiluen liseri-guruinaren kasuan liseri-albeoloen morfologia eta 

tamaina ere ingurumen-baldintzen arabera alda daitezke. Alde batetik, hatz itxurako 

proiekzioen tamaina, itsasaldi-erregimenaren arabera desberdina izan daiteke. Bestalde, 

egoera normaletan hatz itxurako proiekzioak nabarmenagoak diren bitartean, estres peko 

egoeretan albeoloen proportziorik handiena ganbarari dagokio, 3D-berreraiketetan 

oinarrituta frogatu den moduan (3. Ird.; Quincoces, 1995; Lekube 1997). 

Oro har, ingurumen-baldintzen arabera suertatutako aldaketa morfologikoek, 

epitelioaren masa, hots zelulen masa edo kopurua, oso aldakorra dela agerian utzi dute. 

Gainera, aldaketak, itzulgarriak izanik, ordu gutxitan suertatzen dira gehienetan. Horri 

esker, epitelio-zelulen berriztapenaren garrantziaz jabetu gara, nahiz eta, gerora azalduko 

denez, epitelio honen berriztapenari buruz ezer gutxi dakigun. 

1.4.2.- Zelula-moten ordezkapena 

Morfologian ez ezik, liseri-guruineko epitelioa osatzen duten zelula-moten 

presentzia erlatiboan ere aldakortasun esanguratsua aurkitu da. Oro har, egoera fisiologiko 

eta patologiko jakin desberdinetan zelula basofilikoen presentzia erlatiboa areagotu 

daitekeela deskribatu da. Erantzun hori orokorra da molusku espezien artean, xenobiotiko 

organiko eta metal pean egondako magurio zein bibalbioetan (Rasmussen et al., 1983; 

Lowe, 1988; Cajaraville et al., 1990; 1991; Marigómez et al., 1990; Soto et al., 1997, 2002), 

eta metal pean egondako bareetan (Marigómez et al., 1986, 1996, 1998b) deskribatu den 

bezala. Gainera, bestelako estres-egoeretan (adb., baraualdia eta bizkarroein presentzia) 

22

ere erantzun-mota bera aurkitu da (Yoshino, 1976; Marigómez et al., 1992; 1993). 

Esaterako, Mytilus edulis muskuiluek baraualdi luzea jasan ostean, flagelodun eta 

flagelobako zelula basofilikoen kopuru erlatiboak gora egin zuela ondorioztatu zen 

(Thompson et al., 1974). Gainera, dirudienez, zelula-moten proportzioaren aldaketa behin 

behinekoa dirudi. Adibidez, Littorina littorea magurioaren kasuan, petrolio-eratorrien pean 

egotearen ondorioz zelula basofilikoen proportzioak gora egin arren, erantzuna itzulgarria 

dela ikusi da (Widdows et al., 1984). 

Testuinguru honetan, behatutako zelula-moten kopuru erlatiboen aldaketa liserizelulen 

kopuruaren jaitsiera edo zelula basofilikoen proliferazioaren bitartez burutzen ote 

den argitzeke dago. Litekeena da prozesu biak, liseri-zelulen narriadura eta zelula 

basofilikoen proliferazioa, aldi berean gertatzea. Izan ere, zelula basofilikoen kopuru eta 

desegite-faseko liseri-epitelioaren hedapenaren artean korrelazio positibo esangarria 

aurkitu da (Cajaraville et al., 1990). Beste autore batzuen arabera, ordea, zelula 

basofilikoen proliferazioa estresak induzitutako liseri-zelulen galeraren aurretik gertatuko 

litzateke (Thompson et al., 1974). Zentzu horretan, Widdows et al.-ek (1984) diotenez, 

xenobiotikoek zelula basofilikoen kopuruaren igoera eragingo lukete, estres-egoerei aurre 

egiteko zelula hauek ekoitzitako entzimen eskari handiagoa bailego. 

Estres kronikoa pairatu duten bareetan ere, kaltzio-zelulen kopuru erlatiboren balio 

altuak ikusi dira. Esaterako, kupre-meatzaldean bizi diren bareen liseri-guruineko 

epitelioan zelula-mota nagusia kaltzio-zelula dugu, liseriketa-jarduerei zein kaltzioaren 

metabolismoari dagokienez liseri-guruina berezia izanik (Marigómez et al., 1998b). 

1.4.3. Liseri-guruineko epitelioko zelulen plastizitatea 


Lehenago aipatu den bezala, liseri-zelulak oso sistema endo-lisosomikoa garatua 

dauka, lisosomek zelularen bolumen gehientsua betetzen dutelarik (Marigómez & Baybay- 

Villacorta, 2003). Lisosomen gainean estres-iturri desberdinek eragina izan dezakete, 

kutsadura kimikoak, gazitasun-estresak, muturreko tenperaturek altua, baraualdiak eta 

ugalketari asoziaturiko estres-egoerak, besteak beste (Lowe et al., 1981; Moore et al., 

1987; Lowe, 1988; Cajaraville et al., 1991; 1995a; Marigómez et al., 1991, 1996; Regoli, 

1992; Krishnakumar et al., 1995; Domouhtsidou & Dimitriadis, 2001). Oro har, liseri-zelulen 

lisosometan gerta daitezkeen aldaketak hiru taldetan sailka daitezke: tamainaz 

emendatzea, mintza desegonkortzea eta edukinen izaera aldatzea (Marigómez et al., 

2005). Lisosomen erantzunak berehalakoak dira, eta zenbait kasutan tamainaz 

emendatzea eta mintza desegonkortzea kitzikadura jaso eta ordu gutxitara dagoeneko 

23

Zati Teorikoa 

behatu dira (Lekube et al., 2000; Izagirre et al., 2005). Hori dela eta, lisosomen erantzunak 

estres-biomarkatzaile goiztiar gisa kontsideratu dira (Cajaraville et al., 2000; Marigómez & 

Baybay-Villacorta, 2003; Marigómez et al., 2005). 

Dena dela, lisosomen erantzunak bai kutsatzaile-motaren arabera, bai esposiziodenboraren 

arabera eta baita esposatutako kontzentrazioaren arabera desberdinak izan 

daitezke. Metalen pean egondako muskuilu eta magurioen liseri-zelulen lisosomen 

dentsitate bolumetrikoaren emendatzen den bitartean (Marigómez et al., 1990), kutsatzaile 

organikoen pean egondakoen kasuan, kutsatzailearen izaera, esposizio-denbora eta 

kontzentrazioaren arabera erantzun ezberdinak behatu dira. Esaterako, petrolioaren 

hidrokarburo eta azetonaren pean egondako muskuiluetan, hasiera batean lisosomak 

txikiagoak diren arren (Cajaraville et al., 1995b; Cancio et al., 1998, Marigómez & Baybay- 

Villacorta, 2003), esposizio luzeagoak tamainaz emendatzea dakarkie (Cajaraville et al., 

1995b). Aitzitik, di(2-etilhexil)ftalato gisako zenbait kutsatzaile organiko pean egoteak, 

hasiera-hasieratik lisosomak tamainaz emendatzea eragin dezake (Marigómez & Baybay- 

Villacorta, 2003). 

Azkenik, zelula basofilikoei dagokienez, aipatutako kopuru erlatiboaren emendioa 

gertatzeaz gain, zelulen morfologia eta ultrastrukturan ere aldaketak aurkitu dira 

(Marigómez et al., 1998b; Triebskorn & Kohler, 1996). Kadmio kontzentrazio subletalen 

pean egondako magurioetan, zelula basofilikoen hipertrofia eta basofiliaren galera behatu 

dira, eraldatutako zelula basofiliko hauek liseri-zelula eta zelula basofilikoen arteko 

morfologia erakutsi dutelarik (Marigómez et al., 1990). Ingurumen kutsatuetan 

mantendutako Mizuhopecten yessoensis bibalbioaren liseri-epitelioan ere, tarteko itxurako 

zelula basofilikoak deskribatu dira (Syasina et al., 1997). 

24

2.- EPITELIO-EHUNEN BERRIZTAPENA 

Epitelio-ehunen berriztapena 

Zelula eukariotikoak, jatorriz aske bizi ziren banakako izakiak izan arren eboluzioan 

zehar izaki zelulanitzen partaide espezializatuak bilakatuz joan dira. Hori dela eta, modu 

independentean bizitzeko ezinbestekoak ziren ezaugarriak galduz joan ziren, izaki 

zelulanitzak beren osotasunean bizirik mantentzeko derrigorrezko ezaugarri berriak 

eskuratuz joan ziren bitartean. Izaki zelulanitza osatzen duten zelulak, nahiz eta genoma 

bera partekatu, elkarren artean arras desberdinak dira. Zelulek, aniztasun zabaleko 

zereginak buru ditzaketen organoetan antolatutako hamaika ehun desberdin itxuratzeko 

elkarlanari ekiten diote. Ehunak eta organoak behar bezala ulertzeko, zelulen lan egiteko 

modua eta habitat desberdinetan nola bizi eta hiltzen diren ezagutzea beharrezkoa da 

(Alberts et al., 2002). 

Epitelio-ehuna, animaliak osatzen dituzten lau oinarrizko ehun-motetako bat dugu. 

Oro har, bi era desberdinetan antolatuta dago, zelulen xafla jarrai moduan edo guruin 

moduan. Epitelio-ehunek, oso funtzio desberdinak burutzen dituzte, babespena, zelulen 

arteko garraioa, xurgapena, jariapena eta iragazkortasuna, besteen artean. Epitelioen 

sorrera eta mantentzearen inguruan oinarrizko hainbat galdera erantzuteke daude oraindik 

ere. Zenbait epiteliok, hestea edo larruazala kasu, zelulen ordezkatze-tasa handia erakutsi 

dute (Potten & Loeffler, 1990), beste zenbaitek, ordea, gibela edo area kasu, egoera 

normalean ordezkatze-tasa geldoagoa dute, berriztapen azkarrak behar izatekotan 

moldaera bereziak erakutsi dituzten arren (Finegood et al., 1995; Slack, 1995; Alison et al., 

1997). 

Hurrengo orrialdeetan azalduko diren barne-faktore dibertsoen eraginaz gain, 

farmakoek, gaixotasunek, ebakuntza kirurgikoek eta ingurumen-faktoreek ere epitelioen 

berriztapen-tasa eraendu dezakete. Euren artean, argia/iluntasun zikloa faktore 

nagusitakoa omen da, askotan zelulen proliferazioaren dinamikaren erritmoak eta zikloak 

patroi zirkadiarren arabera gauzatzen baitira. Adibidez, hainbat zianobakterio eta 

protistotan, DNAren sintesia gauez baino ez da ematen. Hori, babes-mekanismo moduan 

interpretatu da, egunez erradiazio ultramoreak DNAren kopia akastunen ekoizpena bultza 

lezakeelako (Reddy et al., 2005). Animalien artean ere, antzeko portaerak behatu dira, bai 

arrainen epidermisean (Dekens et al., 2003) eta baita ugaztunen hezur-muinean 

(Abrahamsen et al., 1997) zein bestelako epitelio-ehunetan ere (Bjarnason & Jordan, 

2002; Barbeito et al., 2003; Brandi et al., 2004). 

25

Zati Teorikoa 

Atal honetan, epitelio desberdinetan zelulen berriztapena zein mekanismoren 

bitartez suertatzen den aurkeztuko dugu. Lehendabizi, sarrera gisa, zelula amen 

kontzeptuaren inguruan orokortasun batzuk eta zelulen proliferazioa aztertzeko teknika 

eskuragarriak azaldu dira laburki. Gerora, epitelioen berriztapenaren estrategia 

desberdinak aurkeztu dira, bi estrategia bereiziz: (a) egoera normaletan zelula amen 

bitartez berriztatzen diren epitelioak; eta (b) nahiz eta bertan ere zelula amak egon, 

normalean desberdintzatutako zelula helduen bitartez berriztatzen diren epitelioak. 

2.1. Epitelioetako zelula amak 

Duela 40 urte inguru, ehun bereko bestelako zelula-motak emateko gai ziren 

zenbait zelula somatiko topatu ziren, zelula amak alegia. Zelula somatiko horiek, 

lehenengo aldiz saguen ehun hematopoietikoan deskribatu ziren (Till & McCullog, 1961). 

Azken urteotan, zelula amen presentzia bestelako ehun-mota desberdinetan ere 

demostratu da, epidermisean, muskuluan, gibelean eta burmuinean, besteak beste (Gage, 

2000; Slack, 2000). Epitelio gehienek, zelula amak dituzte (Slack, 2000). Zelula amak 

definitu nahian, modu funtzionalean egitera behartuta gaude; kasu gehienetan epitelioko 

gainontzeko zelulekiko inolako desberdintasun morfologikorik ez baitute. Zelula amak 

deskribatzen dituzten ezaugarri funtzionalak honako hauek ditugu (Alberts et al., 2002): 

1.- Guztiz desberdintzatu gabeko zelulak dira. 

2.- Mugarik gabe zati daitezke edo, behintzat, organismoak bizirik dirauen bitartean 

zatitzeko gaitasuna manten dezakete. 

3.- Zatiketa zelularra burutu ostean, zelula kume bakoitzak bi aukera ditu; zelula 

ama izaten jarraitu edo eta derberdintzapen-bidea bukaeraraino eraman. 

Epitelio bateko zelula-mota desberdin guztiak sortzeko gaitasuna 

(multipotentzialitatea) zelula amak identifikatzeko sarritan erabili den ezaugarria da. 

Tamalez, gehienetan, gaitasun hori ehuna kaltetu denean baino ez da azaltzen. Hau da, 

egoera normalean zelula ama gehienek desberdintzatutako zelula-mota bakarra 

produzitzen dute (unipotentzialitatea). Gibelaren kasuan, adibidez, hepatozitoen 

berriztapenaz hepatozitoak beraiek arduratzen dira (Michalopoulos & DeFrances, 1997), 

baina, edozein arrazoia dela medio, hepatozitoen zatiketa inhibituta baldin balego, 

hepatozitoen berriztapena konduktuetako zelulek burutuko lukete (Alison et al., 1997). 

Zatiketa zelularraren zinetika ikertu ondoren, zelula amek orokorrean bikoizpentasa 

baxua dutela ondorioztatu da, espero ez bezala. Izatez, epitelio-ehunetan gehien 

zatitzen diren zelulak zelula anplifikatzaile iragankorrak edo TAC (Transit Amplifying Cell) 

26

deitutakoak dira. TAC zelulak hainbat zatiketa-ziklo pairatu eta gero, desberdintzapenprozesuan 

sar daitezke. Euren kopurua altua denean, ehunak desberdintzapenerako 

gaitasun handia duela ikusi da, zelula ama urriak izan arren (Hall & Watt, 1989). 

Oro har, ehunetan zatitzen diren zelulak, zelula amak zein TAC zelulak, toki 

berezietan daude kokaturik. Esaterako, hestearen kasuan zelula amak Lieberkühn kripten 

zati distaletik gertu kokatuta dauden bitartean, TAC zelulak kriptaren altueraren bi heren 

distaletan paratuta daude, eta desberdintzatutako zelulak, aldiz, batez ere heren 

proximalean kokaturik agertu ohi dira (Potten & Loeffler, 1990). 

2.2. Zelulen proliferazioa aztertzeko teknikak 


Ziklo zelularraren kontzeptua, 1950. hamarkadaren inguruan plazaratu zen 

arratoien barrabiletan autorradiografiazko teknikak erabiliz 32P-aren inkorporazioa DNAn 

behatu ondoren (Howard & Pelc, 1950). Ikerlan horren ondorioz, ziklo zelularra 4 fasetan 

banandu zen G1-, S-, G2- eta M-faseak, alegia. Lau fase horietatik deigarriena, eta 

ikuspuntu morfologiko batetik interesgarriena, M-fasea (mitosia) da. Bertan, nukleoa zatitu 

egiten da, eta zelula batetik bi zelula kume sortzen dira. Mitosia gertatu eta gero, zelula 

kumeak, G1-fasean edo lehenengo hazkuntza-fasean sartzen dira. Bertan, zelula sortu 

berriak bere ingurua aztertzen du, eta hazteari ekiten dio. Tamaina nahikoa lortu eta gero, 

eta seinale egokia jasoz gero, S-fasean (sintesia) sartzen da. Bertan nukleoko DNA 

bikoiztu egiten da, eta, DNA zeharo erreplikatuta egon ondoren, zelula G2-fasean sartzen 

da. Bertan, zelulak DNA guztiz erreplikatu dela egiaztatzen du, berriro ere hurrengo Mfasean 

sartu aurretik. G1-fasean dagoen zelulak bere ziklo normala geldiarazi dezake, eta 

espezializatutako atsedenaldian sar daiteke (G0-fasea). Bertan, asteak, hilabeteak edo 

urteak egon daiteke S-fasean berriro sartu arte, beharrezkoa den seinale espezifikoa 

jasotzearen zain. (Alberts et al.,2002). 

Ziklo zelularra eraentzen duen kontrol-sistema molekularra, eboluzioan zehar oso 

kontserbatua da. Esaterako, zelula eukariotiko guztietan zatiketaren kontrolean antzeko 

proteina eraentzaileek dihardute (Hall & Levinson, 1990). Zelulen proliferazioa ehunetan 

ikertzeko, proteina horien eta beren ekoizpenaren azterketaz baliatzen diren teknika 

desberdinak eskuragarri daude. Euren artean erabilienak, fluxu-zitometria, nukleotidoen 

analogoak erabileran oinarrituriko teknikak, immunohisto(zito)kimika eta geneen 

adierazpenaren azterketa molekularra (in situ hibridazioa, PCR...) dira. Moluskuetan zelula 

proliferatzaileak detektatzeko teknikak oso gutxitan erabili dira (1. Taula). Izatez, nahiz eta 

PCNA edo Ki67 moduko proteinak eboluzioan zehar kontserbatuak izan (Prelich et al., 

27

Zati Teorikoa 

1987; Endl & Gerdes, 2000), moluskuen ehunetan zelula proliferatzaileen identifikazioa 

nukleotidoen analogoen erabileran oinarritu da batik bat. 

2.2.1.- Fluxu-zitometria 

Teknika honetan, zelulak seinale batez markatzen dira. Seinaleak, itu-proteina bat 

espezifikoki ezagutzen duen antigorputzen bat zein azido nukleiko berezia ezagutzen duen 

zunda osagarriren bat izan daitezke. Zelulen esekidura batean zenbait zelula espezifikoki 

horrela markatu ondoren, laser-izpi batek zeharkatzen duen zulo batetik zelulen esekidura 

pasarazten da. Orduan, laser-izpiok zeluletan transmititu edo islatu egingo dira, zelulek 

seinalea daramatenentz arabera. Ondorioz, argia transmititu edo islatu den arabera 

zelulak karga elektrostatiko desberdinez hornituko dira, eta eremu elektromagnetiko 

batean zehar pasarazi ondoren banandu daitezke (Alberts et al., 2002). Teknika honen 

bitartez, zelulen kopurua eta zelula bakoitzak duen DNA kopurua ezagutu daitezke. Izan 

ere, aneuploidiarik ez egotekotan, G0- eta G1-fasean dauden zelulak diploideak izango 

dira, G2-fasean dauden zelulak tetraploideak eta S-fasean daudenek tarteko DNA-kopurua 

izango dute. Beraz, zelulen esekidurak erabiliz eta modelo matematiko egokiak aplikatuz, 

zatiketa-zinetika ere iker daiteke (Baisch et al., 1982). Zenbait kasutan, histologiarako 

fixatutako eta parafinan inkluditutako zeluletan ere DNA kopurua kalkula daiteke, laginak 

desparafinatu eta hidratatu ondoren (Hedley et al., 1983). Fluxu-zitometria, egoera 

patologiko desberdinak aztertzeko erabili da, eta bere bidez lortutako proliferazio-indizeek 

tumoreen garapenaren azterketarako ere balio prognostikoa dutela proposatu da (Joensuu 

et al., 1988). Fluxu-zitometriak, zelula proliferatzaileak detektatzeko bestelako tekniken 

aurrean daukan abantaila handienetakoa emaitzen objektibotasuna dugu. Gainera, zelulakopuru 

handiekin lan egin daiteke, eta interesatzen zaizkigun zelulak isolatzea 

ahalbidetzen du. Bestalde, beharrezkoa den ekipamendua oso garestia da, eta lagina 

sakabanatu eta desegituratu behar denez, zelula proliferatzaileen kokapena ehunean ez 

dago aztertzerik. Gainera, zelula proliferatzaileen azpipopulazioak ere galtzen dira. 

2.2.2- Nukleotidoen analogoen erabileran oinarrituriko teknikak 

3 H timidinaren ( 3 H-T) bitartezko markaketa 

Zelulen zinetika ehunetan zuzenean aztertzeko, 1950. hamarkadan 3H timidina 

tritiatuaren ( 3H-T) bitarteko markaketa, teknika estandarrena bilakatu zen. Zelula 

28

ideragarriek 3H-T DNAn eransten dute S-fasean daudenean (17. Ird.), eta ondoren 

timidina hori autorradiografia bitartez ikuskor bihur daiteke. Timidina erradioaktiboa, 

animaliari edo zelulen kultiboari in vivo ematen zaie ( 3H-T-ren pultsua), eta DNA 

sintetizatzen ari diren zelulek markatutako timidina beraien DNAn erantsiko dute. Halaber, 

biopsiaz lortutako materiala eta bestelako lagin-motak aztertzeko, fixapena burutu aurretik 

denbora-tarte luzez timidinaz inkubatu behar dira. In vivo pultsuak burutzeko zailtasuna, 

batetik, zein material erradiaktiboa erabili beharra, bestetik, ezaugarri mugatzaileak izanik, 

azkeneko urteotan 3H-T gero eta gutxiago erabili da histopatologian. Edozein kasutan, 

zenbait ikerketa berezi egiteko edo eta ikerkuntz-zentro espezializatuetan teknika hau gaur 

egun oraindik ere erabilia da (Hale et al., 2003). 

Bromodeoxiuridinaren (BrdU) bitartezko markaketa 


BrdU, timidinaren analogoa den molekula da, eta horregatik DNA sintetizatzen den 

fasean (S-fasea) nukleoan inkorporatzen da 3H-T moduan (17. Ird.). BrdU inkorporatu 

duten zelulak immunohisto(zito)kimika bitartez detekta daitezke, BrdUren aurkako 

17. Irudia: Ziklo zelularraren fasearen arabera adierazten diren markatzaile molekular desberdinak 

29

Zati Teorikoa 

antigorputzak erabiliz, eta mikroskopioan aztertu (18. Ird.; Gratzner 1982; Alison, 1995). 

BrdU immunohisto(zito)kimika S-fasean dauden zelulak identifikatzeko oso erabilgarria da. 

Kasu gehienetan antigorputzarekiko eskuragarritasuna emendatzeko DNA desnaturalizatu 

beharra dago, azido klorhidrikoaz tratatuz edo liseriketa entzimatikoaren bidez (Gratzner et 

al., 1982; Roberts et al., 1985; Kikuyama et al., 1988). BrdU, injekzio bitartez emandako 

pultsu moduan edo etengabe ponpa peristaltikoak erabiliz eman daiteke. Gaur egun, 

teknika hau metodo estandarra bilakatu da, eta horren ondorioz ikerlan desberdinetan 

18. Irudia: Zelula proliferatzaileak detektatzeko erabil daitezkeen teknika desberdinek arratoien hestegorrian 

eman dituzten irudiak. (A) Ki67 immunohistokimika; (B) BrdU immunohistokimika (C) PCNA immunohistokimika; (D) 

H2b, H3 eta H4 histonen mRNAren in situ hibridazioa. (Muskhelishvili et al.-etik (2003) birmoldatua). 

30

lortutako emaitzak konparagarriak izatea lortu da. Hala ere, metodo honek bere 

desabantailak ere badauzka: (1) zenbait kasutan animalia injektatu beharra dago eta beraz 

baimen bereziak ezinbestekoak dira, (2) BrdU S-fasean eransteaz gain DNA 

konpontzerakoan ere DNAri eransten zaio, zelula proliferatzaileen gainestimazioa sor 

lezakeena; eta (3) BrdU mutagenoa denez, epe luzeko ikerketa toxikologikoetan ez da oso 

komenigarria. 

2.2.3- Antigeno nuklearren immunohistokimikan oinarrituriko teknikak 

Ki67 antigenoaren immunohistokimika 


Ki67 proteina nuklearra zelula proliferatzaileak detektatzeko oso antigeno erabilia 

dugu. Ki67 zelula-mota guztietan G1-, S- eta G2-faseetan adierazten den bitartean, G0- fasean ez da adierazten (17. Irudia; Gerdes et al., 1984; Gerlach et al., 1997). Hori dela 

eta, ehunaren hazkuntza-mailaren neurketetarako erabil daiteke. Hala ere, momentuz bere 

funtzioa zein den argitzeke dago (Endl & Gerdes, 2000). Minbiziaren ikerkuntzan zein 

bestelako gaixotasunen diagnostikoan Ki67 antigenoaren immunohistokimika oso erabilia 

izan da (18. Ird.; Scholzen & Gerdes, 2000). Hala ere, proteina honen adierazpenaren eta 

ziklo zelularraren barruan duen kokapenaren inguruan eztabaida ugari dago, eta baita 

proteinaren biziraupenaz ere (Littleton et al., 1991; Bruno & Darzynkiewicz, 1992; 

Goldblum & Appelman, 1995; Oka & Arai, 1996; Scholzen & Gerdes, 2000). Antigeno 

horren desabantailarik garrantzitsuena, antigenoak fixatzaileekiko daukan sentikortasun 

handia da, kasu gehienetan izoztutako materiala erabiltzera bultzatzen duena, informazio 

morfologikoaren galera ekarriz (Endl & Gerdes, 2000). Gainera, giza-antigenoaren aurkako 

antigorputza erabili da gehienetan, hainbat espezieekiko erreakzionagarritasun gurutzatua 

baxu samarra edo nulua izanik. Zorionez, arazo horri irtenbidea emateko asmoz, 

bakteriotan adierazitako gizakiaren Ki67 antigenoaren aurkako antigorputz berezia garatu 

da, MIB-5 izenaz ezagutua dena (Schluter et al., 1993; Gerlach et al., 1997). Izan ere, MIB- 

5 antigorputzak, karraskarien Ki67 antigenoarekiko erreakzionagarritasun gurutzatu oso 

altua du, fixatzaileekiko horren sentikorra ez izanik (Gerlach et al., 1997). 

31

Zati Teorikoa 

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) antigenoaren immunohistokimika 

PCNA, δ eta ε DNA-polimerasen zein DNAren sintesirako beharrezkoak diren 

hainbat entzimen proteina laguntzailea dugu (Kurki et al., 1986; Bravo et al., 1987; Wood 

& Shivji, 1997). PCNA, Miyachi-ren taldeak 1978. urtean lehenengo aldiz deskribatu zuen 

(Miyachi et al., 1978). PCNAren adierazpena G1-fasearen bukaera aldera emendatzen da, 

eta S-fasean zehar lortzen du bere adierazpen mailarik altuena. Ondoren, G2- eta Mfaseetan 

adierazpena berriro ere jaisten da (17. Ird.). Berezitasun hauek direla eta, ziklo 

zelularraren fase desberdinak identifikatzea ahalbide dezake (Foley et al., 1993). PCNAren 

pisu molekularra 36 kDa-koa da, eta immunofluoreszentzia erabiliz bi azpipopulazio 

bereiztu dira. Lehenengoa, soilik DNAren erreplikapen-guneetan dago, eta DNA ekoizten 

den bitartean bere kontzentrazioa igo egiten da. Bigarrena, berriz, nukleoplasman 

sakabanatuta dago, eta ziklo zelularrean zehar beti, gutxi gorabehera, maila beretsuan 

adierazten da (Bravo et al., 1987). Bi azpipopulazio horiek, fixatzaileekiko sentikortasun 

desberdina daukate. Fixatzaile aldehidikoz fixatutako ehunetan bi azpipopulazioak 

detektatzen diren bitartean, fixatzaile alkoholikoak erabiltzen direnean soilik DNAren 

erreplikapen-guneetan dagoen PCNA detektatzen da (PCNA osoaren %20-30-a). 

PCNAren biziraupena 20 ordukoa da (Bravo & MacDonald., 1987). Nahiz eta PCNAz 

markatutako zelula proliferatzaileen indizeak bestelako teknikekin lortutako indizeekin 

konparatzeko arazoak egon diren (Jain et al., 1991; Yu et al., 1991; Visakorpi, 1992; Sarli 

et al., 1995), PCNA immunohisto(zito)kimika oso erabilia izan da, bai oinarrizko ikerketa 

19. Irudia: Mercenaria mercenaria bibalbioaren zelula proliferatzaileen markaketa PCNA immunohistokimika 

erabiliz. Geziek marka positiboa adierazten dute eta gezi-buruek nukleo negatiboak. (A) Liseri-guruineko epitelioko 

zelula proliferatzaileak. B) Zelula proliferatzaileen marka bortitza zakatzen oinaldeko epitelioan. (C) PCNA-markaketa 

positiboa giltzurruneko granulometan murgildutako hemozitoetan. Eskala marra: 13 μm. (Hanselman et al.-etik (2000) 

birmoldatua). 

32

egiteko eta baita pronostiko patologikoetan ere (18. Ird.; Faderl et al., 2002; Lillo et al., 

2002). Hala ere, zelula proliferatzaileak detektatzeko PCNAk duen baliogarritasunak 

hainbat zalantza sortu ditu. Izan ere, PCNAren kopurua zelula-moten zein zelulen egoera 

fisiologiko edo patologikoen arabera esanguratsuki alda daiteke. Beraz, minbizi-zelulak eta 

zelula arruntak bereiztu nahi izan direnean, ez da erreza izan zelulen egoera bakoitzari 

zegozkion PCNA-markaketaren balioak finkatzea (Morris & Mathews, 1989; Hall et al., 

1990; Scholzen & Gerdes, 2000). Gainera, PCNAk DNAren konponketan ere parte har 

dezake, bere adierazpena bikoizten ari ez diren zeluletan ere beha daitekeelarik (Toschi & 

Bravo, 1988; Wood & Shivji, 1997). 

PCNA, eboluzioan zehar nahiko kontserbatua den proteina dugu (Prelich et al., 

1987). Garatutako antigorputz monoklonal komertzialek, batez ere PC10 izenaz ezagutzen 

denak, erreakzionagarritasun gurutzatu sendoa erakutsi dute (19. Ird.), ugaztun, intsektu, 

landare, molusku zein legamien PCNA antigenoekin (1 Taula; Waseem & Lane, 1990; 

González-Melendi et al., 1996; Marigómez et al., 1999; Hanselman et al., 2000). 

Ziklinen menpeko kinasen immunohistokimika 


Zelulen proliferazioa, ziklo zelularreko fase espezifikoetan proteina-kinasa 

konplexu desberdinek eraenduta dago. Konplexu horiek, azpiunitate katalitiko eta berari 

lotutako azpiunitate eraentzaileaz osaturik daude. Proteina-kinasa konplexuen azpiunitate 

katalitikoak ziklinen menpeko kinasak (zmk) dira, eta ziklo zelularrean aurrera egitearen 

eraentzaile nagusiak dira. Kinasa horien jarduera, ziklo zelularrean zehar igo eta jaitsi 

egiten da, eta gorabehera horiek ziklo zelularraren gertaera nagusietan (DNAren 

erreplikapena, mitosia, zitokinesia) gertatzen diren proteina ezberdinen fosforilazioan 

eragina daukate (Morgan, 1997). Adibidez, zmk jakin baten jarduera mitosiaren hasieran 

igoz gero, kromosomen kondentsazioan edo mintz nuklearraren apurketan parte hartzen 

duten proteinen fosforilazioen emendioa bultzatuko litzateke. Hainbat zmk desberdin 

daude, aipagarrienak zmk-1, zmk-2, zmk-4 eta zmk-6 izanik. Ikerlan aplikatu zein 

oinarrizko gehienek, lau zmk horiek izan dituzte aztergai (Palacios et al., 2005; 

Schmetsdorf et al., 2005). 

Zmk aurkako antigorputzei dagokienez, zmk-1 delakoaren PSTAIRE deitutako 

gunea ezagutzen duten antigorputzak garatu dira. Gune hori kontserbatua da, eta 

ugaztunetan gain beste espezie batzuetan antigorputz espezifikoetako elkargarritasun 

gurutzatua frogatu da (Weinstein et al., 1994). Beste zmk aurkako antigorputzei 

dagokienez, ugaztunetaz kanpo apenas informaziorik dago. 

33

Zati Teorikoa 

20. Irudia: Ziklina desberdinen adierazpen-mailak ziklo zelularraren fase desberdinetan. Eskuarki ziklina-mota 

bakoitzak bere adierazpen-piko maximoa ziklo zelularraren fase jakin batean lortzen du. 

Ziklinen immunohistokimika 

Proteina hauek, aurrenez aipatutako ziklinen menpeko kinasekin erlazio zuzena 

dute. Izan ere, ziklinak zmk-konplexuaren azpiunitate eraentzaileak dira. Ziklinak, ziklo 

zelular bakoitzean sintetizatu eta andeatu egiten dira. Kinasa jarduera, ziklinak zmkei 

estuki lotzen zaizkienean baino ez da adierazten. Hainbat ziklina-mota desberdin daude, 

garrantzitsuenak A-, B-, D- eta E-ziklinak izanik (20. Ird.). Ziklo zelularrak aurrera jarrai 

dezan, D-ziklina zmk4 eta zmk6-ri G1-fasean zehar lotu behar zaie (Sherr, 1996). Eziklinak, 

zmk2 edo zmk4-ri lotuz, aktibatu egiten ditu, ziklo zelularra G1-fasetik S-fasera 

pasaraziz. A-ziklina, bere aldetik, zmk2-ri S-fasean lotzen zaio, DNAren sintesia 

ahalbidetuz; eta B ziklina, bestetik, zmk1-ri lotzen zaio, mitosiari bide emanez (Nigg, 1995; 

Edgar & Lehener, 1996). Ziklinen adierazpena, immunohistokimika bitartez azter daiteke, 

minbiziarekin erlazionatutako kasuetan (Zhu et al., 2003) zein oinarrizko ikerketetan 

(Golias et al., 2004) jadanik egin den bezalaxe. Hala eta guztiz ere, ugaztunetatik kanpo 

ziklinei buruzko ikerlan immunohistokimiko urriak burutu dira (1 Taula). 

2.2.4.- Geneen adierazpenaren azterketan oinarrituriko teknikak 

Aldez aurretik ikusi dugunez, ziklo zelularra eraentzen duten zenbait proteina une 

edo fase jakinetan baino ez dira sintetizatzen zikloan zehar, bereziki histonen eta ziklinen 

kasuan alegia (17. Ird.). Proteina horien adierazpena, antigorputzak erabiliz iker daiteke. 

34


1. Taula: Moluskuen ehunetan zelula proliferatzaileak detektatzeko erabili diren teknika desberdinen adibideak. 

Teknika Espeziea Organoa Erreferentzia 

3 

H timidina Achatina fulica Bihotz-muskulua Martynova & Bystrova, 2002 

Crenomytilus grayanus Liseri-traktua Leibson & Frolova, 1994 

Aplysia californica Nerbio-sistema Hickmott & Carew, 1991 

Margaritifera 

margaritifera 

Zakatza Tomasovic & Mix, 1974 

BrdU Planorbarius corneus Mikrogliako 

zelulen kultiboa 

Peruzzi & Sonetti, 2004 

Sepia officinalis Enbrioia Grimaldi et al., 2004 

Melampus bidentatus Garroen nerbiosistema 

Bale et al., 2001 

Pinctada fucata marte nsii Mantu paliala Awaji & Suzuki, 1998 

Helix lucorum Protozerebroa Zakharov et al., 1998 

Incilaria fruhstorferi Hemozeleko 

zelulak 

Furuta et al., 1994 

Mytilus galloprovincialis Zakatzak Martínez-Expósito et al., 1994 

Ki67 Helix pomatia Listu-guruina Pirger et al., 2004 

PCNA Mercenaria mercenaria Liseri-guruina, 

zakatzak, 

hemozitoak 

Hanselman et al., 2000 

Mytilus galloprovincialis Liseri-guruina Marigómez et al., 1999 

Zmk Aplysia californica Begia Sankrithi & Eskin, 1999 

Bulla gouldiana Begia Krucher & Roberts, 1994 

Ziklinak Pecten maximus Liseri-guruina Le Pennec & Le Pennec, 2002 

Dreissena polymorpha Gonada arra Lamers et al., 1999 

Patella vulgata Enbrioia Colas et al., 1993a 

Patella vulgata Oozitoak Colas et al., 1993b 

Spisula soldis sima Enbrioia Hunt et al., 1992 

Patella vulgata Oozitoak Van Loon et al., 1991 

Izan ere, beren funtzioa bete bezain pronto antigenoak andeatu egiten direnez, ziklinen 

kasu, oso informazio baliagarria ematen dute ziklo zelularraren fasea identifikatu ahal 

izateko. Esaterako, A-ziklina S-fasearen bukaera-aldera eta G2-fasean zehar soilik topa 

dezakegu, eta B-ziklina, bestalde, G2-fasearen bukaera-aldera eta M-fasean zehar baino 

ez (20. Ird.). Aldiz, kromatinaren proteina estrukturalak diren histonak oso proteina 

egonkorrak dira, sintetizatu eta gero zelularen ziklo osoan zehar aurki ditzakegularik. 

Adierazpen iragankorra duten ziklinen kasuan zein adierazpen iraunkorra duten histonen 

kasuan, proteina horiek ekoizten dituzten RNA mezularien presentzia, proteinak 

sintetizatzen diren une jakinetan emendatzen dira, gerora maila basaletara itzuliz (17. Ird.). 

Hau da, histonak egonkorrak diren arren, beren geneak S-fasean zehar soilik 

transkribatzen dira. Beraz, zelularen batean histonen RNA mezulariak topatzekotan, 

zalantzarik gabe zelula hori S-fasean dagoena badakigu. Halaber, ziklinen kasuan, ziklina 

desberdinen RNA mezularien sintesia ziklina bakoitza topatu dugun baino aurreneko 

fasean zehar areagotuz doa. Adibidez, B-ziklinaren genearen transkribapena G2-fasean 35

Zati Teorikoa 

zehar areagotuz doa, M-fasearen hasiera-hasieran genearen adierazpenik altuena ematen 

delarik. 

RNA mezulari horiek PCR kuantitatiboaren bidez kuantifika daitezke, DNA-hasle 

egokiak erabiliz. Era berean, ehunaren gainean molekula horiek lokalizatzeko in situ 

hibridazioa erabili ahal da, RNA- zein DNA-zunda osagarriak erabiliz. DNA-hasle egokiak 

diseinatzeko sekuentziaren ezagutza partziala ezinbestekoa da; DNA- eta RNA-zundak 

diseinatzeko, bestalde, sekuentzia nukleotidikoaren ahalik eta zatirik handiena ezagutu 

beharra dago. Proteina homologoek espezien artean nolabaiteko kontserbazio-maila duten 

eta eboluzioan zehar egonkorrak izan daitezkeena jakina da. Haatik, hau ez da egia RNAzunden 

edota DNA-hasleen kasuan, espezie desberdinen proteina beraren sekuentzia 

nukleotidikoak oso desberdinak izan baitaitezke. Sekuentzia nukleotidikoek sekuentzia 

aminoazidikoak baino aldakortasun handiagoa erakusten dute espezien artean, kode 

genetikoaren endekapenaren ondorioz (aminoazido askotarako 4 kodon ezberdin 

baitaude), hain zuzen ere. Hau da, antigorputzak erabiliz proteina bera espezie 

desberdinetan identifika daitekeen arren, RNA-zundek ez dute ezertarako baliogarriak izan 

behar espezie desberdinetan proteina jakin baten RNA mezulariak identifikatzeko. Beraz, 

edozein kasutan, ikertu nahi den espeziearen sekuentzia nukleotidikoaren ezagutza 

minimoa ezinbestekoa da. 

Moluskuen kasuan, histonen hainbat mRNA sekuentzia geneen datu-baseetan 

argitaratu dira, 320 sekuentziatik gora daude eskuragarri (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 

hain zuzen ere. Taldez-talde, eta tesi honetan aztertuko diren espeziei erreparatuz, M. 

galloprovincialis-en histona guztien sekuentzia osoak argitaratu dira (Eirin-Lopez et al., 

2002), eta beste mitilido askorenak ere (M. edulis, M. trossulus, M. californianus eta M. 

chilensis). A. ater eta L. littorea gastropodoen histonen sekuentziarik ez dugu ezagutzen, 

ordea, guztira pulmonatuen 35 sekuentzia desberdin eta orthogastropodoen 78 sekuentzia 

desberdin argitaratu diren arren. Oraintsu, muskuiluaren histonen sekuentziak 50 gene 

desberdineko microarray espezifiko batean erabili dira (Dondero & Viarengo, 2005). 

Moluskuen ziklinen 18 sekuentzia desberdin ere argitaratuak izan dira. Hala ere, ez 

da Mytilus, Arion edo Littorina generoen sekuentziarik argitaratu. Argitaratutako 

sekuentzien artean Dreissenia polymorpha bibalbioaren A-, B-, C- eta D-ziklinen RNA 

mezularien sekuentzia osoak (Lamers et al., 1999) topa ditzakegu. Halaber, beste bi 

bibalbioen sekuentziak identifikatu dira, hala nola Spissula solidissimaren A- eta B-ziklinak 

eta Crasssostrea virginicaren zenbait ziklinen antzekotasun handia duten sekuentzia 

nukleotidiko laburrak edo EST-ak (ingeleraz, Expression Sequence Tags; CD646624 eta 

CD647240 A-ziklina; CD646450 eta 646472 B-ziklina, CD647301 C-ziklina; CD648974 D2- 

36

ziklina eta CD649103 G1-ziklina; ikus NCBI web orrialdea). Crassostrearen sekuentziak 

gainera merkurio pean mantendutako animalien eta animali kontrolen transkriptomak 

konparatuz aurkitu dira; proliferazio zelularra modulatuz ziklina horiek merkurio pean 

mantendutako ostretan gainadierazi edo azpiadierazi egin baitira (Peatman et al., 

argitaratu gabe, ikus NCBI web orrialdea). 

PCNA eta Ki67 sekuentziarik ez da klonatu orain arte. Hala ere, M. 

galloprovincialis-en 435 base paretako EST bat argitaratu da (AJ516167; Venier et al., 

2003, ikus NCBI web orrialdea), zeinen sekuentzia aminoazidikoak Danio rerio eta 

Ictalurus punctatus arrainen PCNAren sekuentziekiko homologia (homologia: 1e-29 ) altua 

baitu. 

2.3.- Zelula amen bitartez berriztaturiko epitelioak 

2.3.1.- Ugaztunen epidermisa 


Epidermisa, jatorri ektodermikoa duen larruazalaren oinarrizko epitelio-osagaia da. 

Zuzenean eta jarraian kanpo-medioarekin kontaktuan egotearen eragina jasotzen duenez, 

epitelioaren berriztapenak, hots zelulen proliferazioak, ikaragarrizko garrantzia du. Hori 

dela eta, ugaztunen epidermisa organismo helduetan epitelio-ehunak nola berriztatzen 

diren ikertzeko ohiko eredu esperimentala izanez, bertako proliferazio zelularraren 

dinamika eta mekanismoak aski ezagunak dira. 

Ugaztunen epidermisa, keratinozitoz osatutako epitelio geruzatua da. 

Keratinozitoek, epidermisari sendotasuna damaion keratina deitutako proteina ekoizten 

dute. Keratinozitoak epitelioaren oinaldetik erpinalderantz desberdintzatuz doaz, eta gora 

egiten duten heinean osaketaz eta itxuraz aldatzen dira. Xafla basalaren gainean ezarrita 

dauden zelulak oinaldeko zelulak dira. Zelula hauek zatitzeko ahalmena dute, geruza 

germinatiboa konfiguratuz. Euren gainean desmosometan joriak izateari esker 

epidermisari trinkotasun mekanikoa eskaintzen dioten zelula handiagoak ditugu (Malpighi 

zelulak). Desmosomen inguruan sortutako arantza itxurako egitura nabarmenak 

edukitzegatik, zelula hauek osatzen duten epitelioaren zatiari geruza arantzatsu izena 

eman zaio, zenbait autorek Malpighi geruza ere deitu duten arren. Hurrengo mailan, 

geruza arantzatsuaren gainean paratuta, pikor zitoplasmatiko elektrodentsoz hornitutako 

zelulek, geruza pikortsu izenaz ezagututakoa osatzen dute. Geruza pikortsu horrek, 

metabolikoki aktiboa den epitelioaren barne-zati eta keratinaz betetako zelula hilez 

osatutako epitelioaren kanpo-zati arteko muga markatzen du. Geruza keratinotsua 

37

Zati Teorikoa 

21. Irudia: Epidermiseko zelula amen kokapena eta beraien banaketa ugaztunetako larruazalean zehar. Baban 

kokatzen diren zelula amek zatitu ondoren papila dermikora, gantz-guruinera zein epidermisaren oinaldera migratzen 

dute, ondoren desberdintzapen-bidean sartuz. (Spradling et al.-etik (2001) birmoldatua). 

izenekoa osatzen duten kanpo-zatiko zelulak etengabe askatzen dira. Gizakiaren kasuan, 

adibidez, geruza keratinotsua milaka aldiz berriztatu behar da bizitzan zehar. Geruza 

germinatiboan zelula amez osatutako keratinozitoen azpipopulazio berezia dago, 

epidermiseko zelula, ile-folikulu eta izerdi-guruinetako zelulen aitzindari izango dena 

(Lavker & Sun, 2000). Zelula amok bi tokitan kokaturik daude nagusiki, folikuluen arteko 

epidermisean eta ile-folikuluaren konkorraren aldean (21. Ird.), azken horiek zatiketan 

gogotsuago dihardutelarik (Ghazizadeh & Taichman, 2001). 

Larruazaleko zelula amak normalean nahiko mantso zatitzen diren bitartean, zelula 

ametatik eratorritako TAC zelulak askoz bizkorrago zatitzen dira (Cotsarelis et al., 1990), 

zelula ama batetik sortu berria den TAC zelula bakoitzak desberdintzatzeari ekin baino 

lehen hiruzpabost zatiketa-ziklo pairazten dituelarik (Jones et al., 1995). TAC zeluletatik 

sortutako zelula kumeek erpinalderantz migratzeari ekiten diote, xafla basaletik urrunduz 

eta bidean zehar integrinen adierazpen-mailen jaitsiera jasoz. Integrinen beherakada 

38


horrek ziklo zelularra geldiaraztea eragiten du, azkenean desberdintzapena oso-osorik 

ekarriz (Morasso & Tomic-Canic, 2005). 

Epidermisaren zati bat kalteturik edo eta zeharo suntsiturik suertatzekotan, kaltea 

inguruko zelula epidermikoek konpontzen dute, proliferazio-tasa areagotuz eta 

suntsitutako guneraino migratuz. Dena den, kalte-motaren arabera erreakzioa ezberdina 

izan daiteke. Adibidez, izpi ultramoreen erradiazioaren aurrean, keratinozitoen 

desberdintzapena bultzatzen da, geruza keratinotsua trinkoago bihurtuz (Sesto et al., 

2002). Haatik, epidermisa mekanikoki larri kaltetzekotan, keratinozitoen proliferazioa eta 

migrazioa gauzatzen dira (Tomic-Canic et al., 2004). Sortu berria den migrazioaren 

helmuga-gunean, zelula ama berrien beharra dago. Horretarako, gune horren alboko 

ertzetako zelula amek zatiketa simetrikoa pairatzen dute, eta zelula ama bakoitzetik bi 

zelula ama kume ateratzen dira, zelula amen kopurua behar bezala emendatuz. Gainera, 

TAC zelulek eta guztiz desberdintzatu gabeko zelulek ere epitelioaren berreskurapenean 

parte har dezakete (Li et al., 2004). Izan ere, epidermiseko xafla basalarekin kontaktuan 

darraiten zelulek, zelula amak izateko gaitasuna gorde dezakete, kontaktua galdu arte 

desberdintzapen-bidean sartzen ez baitira. 

Desberdintzapenaren eraenketa, ß1-integrinak izeneko proteinen menpean dago. 

Dirudienez, ß1-integrinen adierazpen-maila baxua duten zelulek, altua dutenek baino 

zatitzeko ahalmen gehiago dute, zelulak isolatuz gero kolonia berriak sortzeko duten 

gaitasuna ikertzean ondorioztatu dena (Watt, 2000). Adibidez, TAC zelulek ß1-integrinen 

maila baxua dute, zatitzeko gaitasun handia edukiz. Izatez, TAC zelulak zatiketen kopuru 

mugatu batetik aurrera ezin dira berriro ere zatitu; eta, maiztasun handiz zatituz gero, xafla 

basaletik askatu eta desberdintzapen prozesuan murgiltzen dira (Jensen et al., 1999). Hala 

ere, zenbait kasutan, xafla basalarekin kontaktuan darraiten zelulak ere desberdintzatzen 

has daitezke, kontaktu horien iraunkortasuna keratinozitoen patua muga dezakeen faktore 

bakarra ez baita. Izan ere, keratinozitoen patua hainbat aldagaien eragin pean legoke, 

esaterako: zelula amen zatiketa-tasa, zelula amen kumeak zelula ama bilakatzeko 

probabilitatea, TAC zeluletan desberdintzatzen hasi aurretik zenbat zatiketa-ziklo eman 

behar diren, xafla basaletik askatzeko keratinozitoek behar duten denbora, eta 

desberdintzapen-prozesua bere osotasunean erdiesteko behar den denbora, besteak 

beste. Aldagai guzti horien atzetik, hainbat seinale eta informazio-molekulen sare 

desberdinetako partaideen mailan gertatutako aldaketak ditugu. Izatez, epitelioen 

hazkuntza-faktorea (EGF), fibroblastoen hazkuntza-faktorea (FGF), Wnt, Hedgehog, 

Notch, hezurren proteina morfogenetikoa/ß eraldatze-hazkuntza faktorea (BMP/TGF ß) eta 

39

Zati Teorikoa 

integrinen gisako faktore proteikoek epidermisaren hazkuntza eta desberdintzapenean 

parte hartzen dutena badakigu (Oro & Scott, 1998; Dellambra et al., 2000; Watt, 2000). 

2.3.2.- Ugaztunen hestea 

Ugaztunen heste-epitelioan lau zelula-mota nagusi aurkitu dira, hala nola: 

enterozitoak, muki-zelulak (ertz itxiko mukozitoak) edo zelula kaliziformeak (ertz irekiko 

mukozitoak), zelula endokrinoak eta Paneth zelulak. Epitelio horrek, endodermotik 

eratorritako epitelio pseudogeruzatu batean du bere jatorria. Hestearen garapenean zehar, 

jatorrizko epitelioa inbaginatu egiten da, eta inbaginazio eratu berrien zati distaleko zelulak 

zatiketan arituz, inbaginazioak hazi egiten dira. Azkenean, inbaginazio horiek, heste 

meharrean Lieberkühn kriptak eta heste lodian kolon-guruinak bilakatzen dira (Totafurno et 

al., 1987). 

Saguen kasuan, heste-epitelioaren berriztapena bizkor eta etengabe Lieberkühn 

kriptetan gertatzen da. Kripta horietako bakoitzean 250 zelula kokatzen dira batezbeste, 

22. Irudia: Saguan timidina tritiatua injektatu ondoren, zelula amen kokapena eta geroko migrazio-bidea erakutsi 

dituzten hestearen ebakin histologikoak. A) 40 minutu injektatu ondoren, B) egun bat injektatu ondoren, C) 2 egun 

injektatu ondoren, D) 3 egun injektatu ondoren. Irudian segidan markatutako zelulak kriptaren erpinaldera migratuz 

doazela ikus daiteke, baita seinalea diluituz doala ere. (Potten-etik (1998) birmoldatua). 

40


horien artean zelula amak, zelula desberdintzatuak eta zelula migratzaile sortu berriak 

aurki ditzakegularik. Eskuarki, zelula amak kripten heren distalean banatuta daude (Potten 

et al., 2003). TAC zelulak, zelula ametatik eratorriak eta 4-6 aldiz zatitzera iris 

daitezkeenak, kripten bi heren distaletan lokalizatu dira. Heste-kriptak eta -guruinen artean 

hestearen argirantz proiektatutako heste-ebaginazio hazkarak heste-biloxka izenaz 

ezagutu dira. Heste meharrean, biloxka bakoitzaren inguruan, beraz, hainbat Lieberkühn 

kripta daude paratuta, eta kripta horietako zelula amek bai biloxketako eta bai kriptetako 

epitelioak osatzen dituzten lau zelula-motak sor ditzakete. Enterozitoak, muki-zelulak eta 

zelula endokrinoak, heste-biloxken mutur distaleranzko migrazio-bidean dauden bitartean 

desberdintzatu egiten dira. Migrazio hori, 2-5 egunez gauzatzen dena, oso era antolatuan 

burutzen da, zutabeka (22. Ird.; Potten, 1998), eta biloxken mutur distalera heltzerakoan 

zelulak hil egiten dira (Potten, 1998). Bestalde, kolonean zein urdailean, kriptetatik 

23. Irudia: Heste epitelioko zelulen migrazio eta desberdintzapen-bide orokorrak adierazten dituen irudi 

eskematikoa. (Sancho et al.-etik (2004) birmoldatua). 

41

Zati Teorikoa 

migratzen duten zelula gazteak hestearen argi-alderantz edo mukosa-alderantz abiatzen 

dira, zelula amak guruinen zati proximalean kokaturik egonik (Yamada et al., 1992). 

Heste meharreko Paneth zelulek, kripten mutur distalean paratuta daudenak, 

mikrobioen aurkako peptidoak eta hazkuntza-faktoreak jariatzen dituzte, eta hesteepitelioko 

beste zelula-motek ez bezala, kriptetako mutur distalerantz migratzen dute, 

bidean desberdintzatuz doazelarik (23. Ird.). Helmugara, hau da Lieberkühn kriptetara, 

iritsi ondoren biziraupen luze samarra dute (20 egun inguru), hil eta fagozitatuak izan baino 

lehen. 

Azkenik, bestelako zelula amekin alderatuz, hesteko zelula amak apoptosian 

sartzeko gaitasun handiagoa dutela aipatu beharra dago. Halaber, desberdintzapen 

prozesua nahiko itzulgarria dirudi, zelula kume desberdintzatuak, zelula amen 

berezitasunak berriro ere berreskuratzeko gai baitira (Marshman et al., 2002). 

2.3.3.- Ugatz-guruina 

Ugaztun helduen ugatz-guruina, ehun konektibo adipotsuz inguratuta dagoen eta 

epitelio bakunez osatuta dagoen konduktu-sistema da, indibiduo helduen konduktuetan 

distalki albeoloak bereiz daitezkeelarik. Konduktuen artean, primarioak eta sekundarioak 

bereiztu dira, kalibre eta kokapenaren arabera. Konduktu zein aleboloetan, bi zelula-mota 

desberdin deskribatu dira, jariatzaileak eta mioepitelialak alegia (Kordon & Smith, 1998). 

Jatorriz epitelio-zelulak diren zelula mioepitelialek, muskulu-zelulen antzera uzkurkorrak 

izanik, esnea albeoloetatik konduktuetara eroatearen ardura dute, oxitozinaren 

presentzian uzkurtuz. Ugatz-guruinak, jatorri ektodermikoa du. Bere garapenaren 

abiapuntuari dagokionez, ektodermoaren loditze-gune bat aldameneko mesenkiman 

murgilduz zelula ametan joria den baba edo konkor moduko egitura sortzen da. Gerora, 

baba horretatik adarkamenduak desberdintzatuz doaz (Smalley & Ashworth, 2003). Ugatzguruinaren 

tamainaren behin-behineko emendioa eta adarkatutako egituren hedapena, 

hormona-kinada eraginda (Topper & Freeman, 1980), indibiduoaren bizitzan zehar garai 

jakin batzutan ematen da, pubertarora heldutakoan eta haurdunaldian, alegia, bukaerababetan 

zelula amen presentzia nabarmena izanik (Smalley & Ashworth, 2003). 

Konduktuen adarkatze eta murrizketan, zelula amen ekintza eta apoptosiaren bidezko 

heriotza zelularra berebiziko garrantzia duten prozesuak dira (24. Ird.). Hori dela eta, 

ugatz-gurina, desberdintzapen mekanismoak ikertzeko, zelulen proliferazioa eta 

heriotzaren arteko lankidetza barne, askotan erabili den eredu esperimentala dugu (Alberts 

et al., 2002). 

42


Epitelio-zelulen proliferazioari dagokionez, guztiz garatutako ugatz-guruineko 

zelula-mota guztiak zelula ama amankomun batetik (zelula ama multipotentziala) eratorriak 

direla behatu da saguen kasuan (Kordon & Smith, 1998). Alde batetik, zelula esnejariatzaileei 

dagokionez, haurdunaldian zelula ama zatitzen hastea hormonek eragiten 

dute, beren kopurua hamar-hogei biderrez igo araziz. Horrela, konduktuen bukaera-zatiak 

hazi egiten dira, adarkamendu berriak eta, azkenean, zelula jariatzaile desberdintzatuez 

osatutako albeolo dilatatuak eratzen dira (Smalley & Ashworth, 2003). Beste alde batetik, 

zelula mioepitelialak ere, konduktuetako epitelioan dauden zelula ama multipotentzialetik 

eratorriak dira (Liu et al., 2005); albeoloak tapizatzen paratu aurretik oso desberdintzapen 

24. Irudia: (A) Ugatz-guruineko bukaera-konduktuaren alde distalean zelula amak simetrikoki (gezi estuak) zein 

asimetrikoki (gezi lodiak) zatitzen dira. Zatiketa asimetriko baten ostean, zelula kumeak zelula mioepitelialak edo 

konduktu-zelulak emateko desberdintzatzen dira. Argia sortzeko, epitelioko erpinaldean dauden guztiz desberdintzatu 

gabeko zelulak apoptosian sartzen dira. (B) Ugatz-guruineko zelula ama batzuk zatiketa simetrikoa (gezi estuak) eta 

asimetrikoak (gezi lodiak) pairatzen dituzte epitelioa berriztatzeko. Beste zelula amek, ordea, soilik zatiketa 

asimetrikoa pairatzen dute, beraien zelula kumeak albeoloen zelula mioepitelialak eta zelula jariatzaileak emateko 

desberdintzatuz (Smalley & Ashworth-etik (2003) birmoldatua). 

43

Zati Teorikoa 

prozesu luzea pairatu behar duten arren. Zelula ama multipotentzialak, garapen eta 

desberdintzapen fase guztietan xafla basalari lotuta behatu dira (Chepko & Smith, 1997; 

Chepko & Dickson, 2003). Epitelioaren berriztapenean zelula amen partehartzeak 

xehetasun handiz deskribatu da (24. Ird.; Smalley & Ashworth, 2003). Zelula amek, oro har, 

ezaugarri ultrastruktural nabarmenik ez duten arren (arestian aipatu den bezala), ugatzguruineko 

zelula ama multipotentzialak berezko ezaugarri ultrastrukturalak baditu (Chepko 

& Dickson, 2003). 

Aitzitik, zenbait ikerlanek hiru zelula amen mota desberdin daudela iradoki dute. 

Ugatz-guruinaren transplantea jaso duten arratoiak ikertuz, zelula ama multipotentzialaz 

gain beste bi zelula ama desberdin, konduktu sekundariokoak eta albeolokoak alegia, 

egon daitezkeela ondorioztatu da (Kamiya et al., 1999; Kim et al., 2000). Azken biok zelula 

ama multipotentziala aitzindari amankomuna dute, eta bai zelula jariatzaileak zein zelula 

mioepitelialak emango lituzketelarik, norberak bere eskualdean (Kordon & Smith, 1998). 

Horrela orden hierarkikoa jarraituz, konduktu primarioetako zelula ama beste zelula ama 

bion aitzindaria litzateke. 

Esan bezala, zelulen heriotza ere ugatz-guruineko epitelioaren garapenean eta 

berriztapenean oso fenomeno garrantzitsua da. Izatez, esnea ekoizteko beharra 

amaitutakoan, zelula jariatzaileak apoptosi bitartez hiltzen dira, albeolo gehienak 

erregresioz desagertuz. Orduan, makrofagoek, hildako zelulen hondakinak fagozitatzen 

dituzte, ugatz-guruina berriro ere latentzia egoerara itzuliz. Apoptosia hainbat faktore direla 

medio aktibatzen da, esne-jariapena blokeatzen den tokietan TGFß3 (ß3 eraldaketa 

hazkuntza-faktorea; ingeleraz, Transforming Growth Factor ß3) metatuz, adibidez. 

25. Irudia: Penaeus semisulcatus krustazeoaren hepatoarearen tubuluaren irudi eskematikoa. Bertan zelula-mota 

desberdinen kokapena ikus daiteke. (E), zelula amak; (R), zelula birxurgatzaileak; (F), zuntz-zelulak; (B), baba 

itxurako zelulak; (M), zelula txikiak. (Al-Mohanna & Nott-etik (1989) birmoldatua). 

44

Ugatz-guruinaren garapena, obarioko hormona, hormona adenokortikoide eta 

hormona pituitarioen arteko elkarrekintzek eraenduta dago (Topper & Freeman, 1980); 

hormona horiek hazkuntza-faktoreen gainean duten eragina dela medio (Roberts & Sporn 

1992). Hazkuntza-faktore horien artean, hazkuntza-faktore epiteliala (EGF), fibroblastoen 

hazkuntza-faktorea (FGF), α eta ß eraldaketa hazkuntza-faktoreak (TGFα eta TGFß), 

intsulina antzeko hazkuntza-faktorea (ILGF) eta faktore kolonia-kitzikatzailea (CSF1) 

ditugu (Fischer & Lakshmanan, 1990; Derynck, 1992; Roberts & Sporn, 1992; Pollard & 

Hennighausen, 1994). 

2.3.4.- Krustazeoen hepatoarea 


Hepatoarea, krustazeoen heste ertaineko egitura nagusia da, bolumenari zein 

konplexutasunari dagokionez. Bertan, liseriketa-prozesuaren azkeneko faseak betetzen 

26. Irudia: Astacus astacus krustazeoaren hepatoarearen tubuluaren enbrioi-gunearen histologia.orokorra (a-c) 

eta irudi mitotikoen zehaztasunak (d-k).(HS), gune hemolinfatikoa, (A), anafasea, (E), E-zelula, (N), nukleoa, (Me), 

metafasea, (TL), tubuluen argia, (P), profasea, geziburuek PAS gune positiboak adierazten dute, geziek mikrobiloskak 

adierazten dute.(Vogt-etik (1994)-tik hartua. 

45

Zati Teorikoa 

dira, esaterako: 1) aurreko hestetik jasotako elikagaien azken liseriketa; 2) aurreko 

hestean beharrezkoak diren entzimen ekoizpena, 3) liseriketa produktuen xurgapena eta 

metaketa eta 4) hondakinen askapena. Hepatoarearen egitura-ardatz nagusia, konduktu 

primario batek osatzen du; konduktu hori konduktu sekundariotan eta horiek bukaeramutur 

itsuko tubuluetan adarkatuz bukatzen delarik (Gibson & Barker, 1979). Krustazeoen 

espezie desberdinetan, hepatoarearen sorrera eta desberdintzapena une desberdinetan 

gerta daiteke. Zenbaitetan, Penaeus setiferus espeziea kasu, hepatoarea larbaondoko 

fase berantiarrean itxuratzen hasten da; Homarus americanus espeziearen moduko beste 

kasuetan, berriz, enbrioi-fasean (Biesiot, 1986; Lovett & Felder, 1989). 

Dena den, oro har, hepatoarearen epitelioan lau zelula-mota nagusi bereizi dira, 

hala nola: E-, R-, F- eta B-zelulak (25. Ird.). Zenbait espezietan, bosgarren zelula-mota bat 

gehiago ere identifikatu da, M-zelula izena eman zaiona. E-zelulak (E, embrionary cell), 

tubuluen mutur distalean kokaturik, zelula ama gisa jokatzen du, eta beste zelula-mota 

guztien aitzindaria da. R-zelula (R, resorptive cell) birxurgatzailea da, ugariena izanik, eta 

bertan lipido eta glukogenoaren metaketa gauzatzen dira. F-zelulak (F, fiber cells), 

tubuluen eskualde distalean aurki ditzakegu batik bat. B-zelulak (B, blisterlike cells) 

hepatoareako epitelioan deskribatu diren zelula handienak dira, tubuluen bi heren 

proximaletan nagusiak izanik. Azkenik, M-zelulak (M, midget cells), liseri-epitelioaren 

oinaldean kokaturik lumeneraino iristen ez diren zelula gutxi batzuk baino ez dira (Icely & 

Nott, 1992). 

Aurrenez esan bezala, E-zelulek zelula ama gisa dihardute (26. Ird. Vogt, 1994). 

Izan ere, E-zelulek desberdintzapen-maila baxua erakusten dute. Haatik, zenbait autorek 

diotenaren arabera, zelula-mota guztiak ez datoz zuzenean E-zeluletatik. Zehazki, R- eta 

F- zelulak, E-zelulen aldamenean kokaturik daudenak, E-zeluletatik eratorritako bi leinu 

zelular ezberdintzat kontsideratu diren arren, B-zelulak antzerako ezaugarri 

ultrastrukturalak dituzten F-zeluletatik garatuko lirateke. (Loizzi, 1971; Hopkin & Nott, 

1979). Beste autore batzuk, Penaeus monodon espeziean B-zelula gazteak F- eta R-zelula 

gazteetatik zalantzarik gabe bereizi daitezkeenaz jabetu ondoren, B-zelulek euren aldetik 

E-zeluletatik zuzenean sortzen den leinu zelularra osatuko luketeela proposatu dute (Icely 

& Nott, 1992). 

46

2.4.- Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioak 

2.4.1.- Area 


2. Taula: Zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioen zelula-motak, euren funtzioa eta jatorria. 

ZELULA-MOTA FUNTZIOA JATORRIA 

Ugaztunen 

epidermisa 

Keratinozitoak 

Ugaztunen hestea 

Enterozitoak 

Muki-zelulak 

Zelula endokrinoak 

Paneth-zelulak 

Ugatz-guruina 

Zelula jariatzaileak 

Zelula 

mioepitelialak 

Krustazeoen 

hepatoarea 

E zelulak 

R zelulak 

F zelulak 

B zelulak 

M zelulak 

Keratinaren ekoizpena 

(babesa) 

Hidrolasen 

jariapena/elikagaien 

xurgapena 

Mukiaren ekoizpena 

Hormonen jariapena 

Hazkuntza-faktore eta 

mikrobioen aurkako peptidoen 

jariapena 

Esnearen jariapena 

Uzkurketa/mugimendua 

Zelula amak 

Lipido eta glukogenoaren 

metaketa 

Entzimen jariapena 

Elikagaien 

xurgapena/liseriketa 

Hondakinen metaketa 

Epidermiseko zelula amak 

Kriptetako zelula amak. 

Ugatz-epitelioko zelula amak 

E zelulak 

Arean, bi epitelio nagusi daude, entzimak liseri-traktura jariatzen dituzten zelula 

exokrinoz osatutakoa eta odolera hormonak jariatzen dituzten zelula endokrinoz 

osatutakoa. Area exokrinoa, epitelio bakunez osatutako azinoetan antolatuta dago, non 

zelula nagusiak (jariatzaileak), zelula zentroazinarrak eta konduktu-zelulak deskribatu 

baitira. Langerhans irletan mataza moduan korapilatutako epitelio endokrinoari 

dagokienez, 4 zelula-mota bereizi dira, α-zelulek glukagona, ß-zelulek intsulina, γ-zelulek 

47

Zati Teorikoa 

area-polipeptidoa eta δ zelulek somatostatina ekoizten dutelarik (Orci & Unger, 1975; 

Wells, 2003; Jensen, 2004). Garapen embrionarioa ikertu duten autore batzuen aburuz, 

aurrealdeko gastrodermoan kokatutako zelulek, areako epitelio-zelula guztien zelula ama 

moduan dihardute (Le Douarin, 1988). Area helduaren epitelioen berriztapen normala 3H- T eta BrdU pultsuen bidez edo PCNA immunohistokimikaz ikertuz, zelula proliferatzaileak 

azino, konduktu zein Langerhans irletan lokalizatu dira (Githens, 1988; Muller et al., 1990, 

Elsässer et al., 1994). Hala ere, zelula amen identifikazioa eta berriztapen-mekanismoak 

ez daude guztiz argi, eta horren inguruan ezbaika dabiltza ikertzaileen talde desberdinak. 

Alde batetik, epitelioen berriztapen-mekanismoak ezagutzeko, zenbait ikertzaile 

epitelioak esperimentalki kaltetzean induzituriko zelulen proliferazioaren azterketaz baliatu 

dira. Adibidez, kirurgiaren bitartez area osoaren %90-a erauzi ondoren, Langerhans 

irletako epitelioaren berriztapena, gelditu diren bertoko zelula endokrino desberdintzatuen 

zatiketari esker erdietsi daiteke; konduktu-epitelioaren berriztapenaren ardura zelula 

zentroazinar desberdintzatuek duten bitartean (Brockenbrough et al., 1988; Bonner-Weir et 

al., 1993). Berriztapen-prozesua berehalakoa da, erauzketa kirurgikoaren une beretsuan 

hasia hain zuzen ere. Ebakuntza eta gero gelditu diren zelulen kopurua jadanik 7 egunetan 

bikoiztera iristen da. Zatiketa-tasa bizkor hori, 21. egunerarte manten daiteke. Hala ere, 

zelula-mota guztien zatiketa-dinamika ez da berdina. α− eta ß-zelulek, BrdU-markaketarik 

bortitzena kirurgi-erauzketa burutu eta 2 egunetara erakutsi dute, noiz α-zeluletan jorian 

den Langerhans irlen gune periferikoa bereziki handituta agertu baita. 2. egun horretan 

intsulina eta glukagona batera ekoizten dituzten zelulak ere behatu dira, α -zelulak ßzelula 

bihur daitezkeenaren adierazgarritzat har litekeena. Lehenengo 5 egunetan, αzelulen 

proliferazio-tasa, ß-zelulena baino altuagoa den bitartean, 7. egunetik aurrera 

tendentzia hori irauli egiten da, behintzat 14 egun igaro artean (Hayashi et al., 2003). 

Tankera beretsuko zatiketa-dinamika area exokrinoan behatu da. 

27. Irudia: Arearen zati baten kirurgi erauzketa eman eta 3 egunetara BrdU markaketa arearen azino, konduktu 

eta Langerhans irletan (Hayashi et al., 2003. tik hartua). 

48

Bestalde, zelula exokrinoak, endokrinoak emateko ere desberdintza daitezkeela 

esperimentalki frogatu da, saguak espezifikoki ß-zelulak deuseztatzen dituen 

estreptozotozina izeneko farmakoaz tratatuz (Gu et al., 1997) zein area-konduktua 

kirurgikoki buxatuz (Bertelli & Bendayan, 1997). Esperimentu horietan amilasa eta intsulina 

batera ekoitz ditzaketen zelulak deskribatu dira, zelula exokrinoak endokrino bihur 

daitezkeenaren adierazgarritzat har litekeena. Zentzu berean, arratoi transgenikoen 

garapena aztertzean, zelula ametatik eratorritako zelula endokrino eta exokrinoen 

ezaugarriak batera dituen zelula-mota bat aurkitu da (Gu et al., 1994). Halaber, 

konduktuetako zelula amak ß-zelulak emateko desberdintza daitezke, induzituriko kalteei 

erantzunez zein ezohiko eskari metabolikoen aurrean areagotu daitekeena (Bonner-Weir 

& Sharma, 2002). 

Azkenik, arratoi transgenikoak eredu esperimental gisa erabiliz, areako zelula 

endokrinoak zatiketa autologoz baino ez direla zatitzen ere proposatu da, partikularki ßzelulen 

kasuan, egoera normalean zein arearen zati handia erauztekoan ß-zelula 

desberdintzatuetatik soilik sor daitezkeenak (Dor et al., 2004). 

Beraz, α− eta ß-zelulek jatorri berbera omen dutenez, eta zelula endokrino eta 

exokrinoen jatorria ere amankomuna omen denez, guztiok zelula ama beratik eratorriak 

izan daitezkeela pentsa genezake (Herrera 2000). Jatorrizko zelula ama horrek areako 

transkribapen-faktorea edukiko lukeen arren, ez luke hormonen adierazpen-gaitasunik 

izango. Gainera, zelula ama amankomunetik zelula ama endokrino eta exokrinoa bereiztu 

daitezkeenik ezin da baztertu (Seaberg et al., 2004); ezta norberak gerora zelula ama 

espezifikoagoak eman litzakeenik ere. Izan ere, aitzindari endokrinoak, konduktutik gertu 

egon arren, ez lirateke konduktu-epitelioaren osagaiak izango (Gu et al., 2002). 

2.4.2.- Listu-guruinak 


Listu-guruinak, garatze-bidean dagoen mihi-epitelioaren loditze-gune batetik 

sortzen dira, zeinen ondoan, listu-guruinak izango diren baba itxurako formazio bat eratuz, 

kondentsazio mesenkimatikoa ematen baita (Melnick & Jaskoll, 2000). Listu-guruin 

helduek itxura albeolotubularra dute, eta ehun konektiboak enkapsulatzen dituzten hainbat 

lobuluz osaturik daude. Eskualde albeolotubularra, azino jariatzaileen multzoek eta 

konduktuen sistema konplexu batek osatzen dute. Azinoen epitelioan zelula jariatzaileak 

eta zelula mioepitelialak daude; konduktu-epitelioetan, berriz, ez dago zelula jariatzailerik 

eta osmoeraenketa moduko funtzioak bertan betetzen dira (Actis et al., 2002). 

49

Zati Teorikoa 

Timidina tritiatuaz markatutako arratoi helduetan, konduktuen zelula pikortsuak 

konduktu ertaineko oinaldeko zeluletatik eratorriak direla behatu da. Hasiera batean, 

konduktuen zelula pikortsu ildaxkatu bihurtzen dira (tarteko egoera), azkenean zelula 

pikortsu helduak bilakatu arte (Chai et al., 1993; Denny et al., 1993). 3H-T markaketaindizeek 

erakutsi dutenaren arabera, ez dirudi konduktu ertainetako zelula amek bizkor 

zatitzen direnik. Haatik, jarduera proliferatzaile altuena zelula pikortsu ildaxkatuek erakutsi 

dute. Hau da, zelula amak astiro zatitzen diren bitartean, zelula pikortsu ildaxkatuak, agian 

TAC zelulen analogotzat har genitzakeenak, bizkor zatitzen dira, gerora guztiz 

desberdintzatuak direnean zatiketa-tasa berriro ere motelduz doalarik (Chai et al., 1993). 

Listu-guruinetan esperimentalki kalteren bat induzituz, azinoen kopuruan eta 

tamainan murrizpena sortaraztekotan, (adb., apoptosia bultzatuz), konduktuen antzeko 

egitura tubularren agerpena suertatu da (Takahashi et al., 2002). Dirudienez, egitura 

tubular horiek konduktu ertainetatik eratorriak izango lirateke, eta azino-zelulen zelula 

aitzindarien ordezko sortuberriez osatuta egongo lirateke (Takahashi et al., 1998; 2002). 

Beste autore batzuen arabera, berriz, tubulu horiek zelula jariatzaileak galdu dituzten 

azinoak baino ez lirateke izango, zelulen kopuru egokia berreskuratuz gero berriro ere 

funtzionalak bilakatuko liratekeenak (Scott et al., 1999). Bistan denez, momentuz egitura 

tubular horien jatorria eta esangura biologikoa ez daude batere argi. 

Listu-guruinek, kirurgi-buxadura 5 egunez jasan ondoren, konduktuetako zelula 

pikortsu helduek proliferazio-jarduera handia erakutsi dute, 3H-T zein PCNA markaketak 

erabiliz frogatu dena (Takahashi et al., 2000). Aitzitik, listu-guruinen kirurgi-erauzketa 

partziala egin ondoren, azinoen berreskurapena konduktu nagusietako zelulen proliferazio 

eta desberdintzapenaren bitartez gauzatzen dela behatu da, ebakuntza eta gero geratzen 

diren azinoek nolabait ere parte hartzen dutelarik (Hanks & Chaudhry, 1971). 

28. Irudia: Listu-guruineko konduktu nagusia buxatuta duen arratoian burututako PCNA immunohistokimika. 

Azino zein konduktuetako zelulek marka positiboa (geziak) erakutsi dute (Takahashi et al.-etik (2001) hartua). 

50

Bestalde, arratoien listu-guruinetako epitelioan dimorfismo sexuala dagoela 

aipagarria da. Arratoi ar gazteetan, konduktuetan agertzen diren zelula berri gehienak 

konduktu-zelula helduen zatiketatik datoz; hau da, berezko zatiketa edo zatiketa autologoa 

izenekoa ematen da. Zelula berri desberdintzatuen %20 inguru baino ez dira konduktu 

ertainetako zelula ametatik eratorriak, azinoetan dauden gainerako zelula guztiak zelula 

helduen proliferazioz sortuak direlarik. Eme gazteetan, ordea, bai azinoetan zein 

konduktuetan dauden zelulen %60-a zelula ametatik eratorriak dira (Denny et al., 1997). 

Hala ere, emeak heltzen doazen heinean, azinoetako zelula berriak zelula 

desberdintzatuen zatiketa autologoz sortzen dira, zelula amen parte hartzea adinarekin 

batera gutxituz doalarik. Aitzitik, eme helduetan, konduktu-zelulak oraindik ere konduktu 

ertainetako zelula ametatik datoz. Desberdintasun honen gakoa, hazkuntza-abiaduran 

egon daiteke. Izan ere, eme gazteen listu-guruinek oraindik ere hazten jarrai dezakete, 

batez ere azino-eskualdean; nolabaiteko izaera enbrionarioa mantentzera behartuta 

daudela erakutsi lezakeena (Denny et al., 1990). 

2.4.3.- Ugaztunen gibela 


Gibelak jatorri endodermikoa du, endodermoaren alde bentrala loditu egiten da 

gibelaren dibertikulua eratuz. Hepatoblastoek endodermotik migratzen dute baba moduko 

eskualde bereizia itxuratuz eta septum transversum izeneko gunean zehar proliferatzen 

dute (Tosh & Strain, 2005). Gibeleko epitelioen berriztapena, ez da egoera normaletan 

zelula ama gutxi batzuei esker ematen, zelula helduen zatiketa autologoz baizik. 

Esaterako, gibelaren erauzketa kirurgikoa partzialaren ondoren, berriztapena gainontzeko 

hepatozito zein behazun-epitelioko zelula helduen zatiketaz burutzen da (Fausto, 2001). 

Beraz, epitelio-zelula horiek oraindik ere guztiz desberdintzatu gabeak direla esan 

genezake. Are gehiago, hepatozitoak, esaterako, organismoaren biziraupen osoan zehar 

proliferatzeko gai dira. Kirurgi-erauzketa aplikatu eta hepatozitoetan DNAren sintesia hasi 

bitarteko denbora-tartea hainbat faktoreen pean dago, argiztapen-erregimena eta elikatzepatroia, 

besteak beste (Yanagi & Potter, 1977). Aitzitik, farmako kartzinogenikoz trataturiko 

arratoien gibelean, epitelio-zelulen proliferazioa, zelula amatzat har litezkeen eta portaguneko 

Hering kanaletan dauden itxura obaleko zelula txikien zatiketaz hasten da. Zelula 

horiek bipotentzialak lirateke, hepatozitoak zein behazun-epitelioko zelulak emango 

bailituzkete (Theise et al., 1999). Antzeko itxura obaleko zelula txikiak barneko portagunean 

ere deskribatu dira, hepatozito zein areako zelulen aitzindaritzat hartu direnak 

(Tosh & Strain, 2005). 

51

Zati Teorikoa 

Hepatozitoen proliferazioa zerk pizten duen jakiteko hainbat ikerketa burutu dira. 

Esaterako, gibel-ehunaren zatiak edo eta hepatozito isolatuak gibela ez den ehun batera 

transplantatu ostean transplante-hartzailearen gibelaren zati bat ebakuntza bidez 

erauztean, transplantatutako zelulek, gibela ez den ehun horretan dauden arren, DNA 

sintetizatzen hasten dira. Horrek, gibela erregeneratzen den bitartean odolean nolabaiteko 

seinale mitogenikoa agertzen dela iradoki du (Overturf et al., 1999). Izan ere, hepatozitoen 

hazkuntza-faktoreak (HGF; ingeleraz hepatocyte growth factor), berebiziko garrantzia 

omen dauka prozesu horretan. Are gehiago, in vitro mantendutako hepatozitoak, HGFren 

presentzian, eta bestelako zitokinen seinalerik bitarteko izan gabe, zatitzen hasten dira. 

Hala ere, in vivo, HGFz gain, epitelio-hazkuntza faktore (EGF; ingeleraz, epithelial growth 

factor) moduko beste faktore batzuen plasma-kontzentrazioak ere igotzen dira kirurgierauzketaren 

ondorioz. Halaber, intsulina, interleukina 6 (IL6) eta norepinefrina molekulen 

bidezko seinalizazioa ere gibelaren erregenerazioa burutzeko ezinbestekoak dira, nahiz 

eta hepatozitoentzat oinarrizko mitogenoak ez izan. Antza denez, nondik norako orokorrak 

ezagutu diren arren, hepatozitoen proliferazioan diharduten seinale molekularrei buruz 

oraindik ere argilun dexente dago (Michalopoulos & DeFrances, 1997). 

2.4.4.- Moluskuen liseri-guruina 

Krustazeo eta intsektu (Vogt 1994; Loeb et al., 2003; Illa, 2005) zein ornodunetan 

(ikus aurreneko atalak) ez bezala, moluskuen epitelio-ehunen berriztapenaz oso ikerlan 

gutxi burutu dira (Leibson & Frolova 1994). Konkretuki, moluskuen liseri-guruineko 

epitelioaren berriztapenaz egindakoak bereziki urriagoak dira (Hanselmann et al., 2000; 

Marigómez et al., 1999), ehun horren egitura histologikoaz ikerketa ugari egin diren arren 

(Ikus 1. atala). 

52 

29. Irudia: Ostren liseri-epitelioko balizko zelula basofiliko baten anafasea (Yongue-tik (1926) hartua)


Urdaileko zelula amak identifikatu ez diren arren, zatiketa zelularren irudiak 

argitaratzeaz gain, proliferazio zelularra aztertzeko 3H-T bidezko markaketaz baliatu diren 

ikerlanak burutu egin dira (Leibson & Frolova, 1994). Dirudienez, mitosia gertatutakoan, 

zatitzear dauden zelulek xafla basaletik urrundu behar dute, eta lumenaren aldera 

migratzen dute, ondoren zelula kumeek berriro ere epitelioaren oinalderaino itzuliz (Mix, 

1972). Antzeko prozesua Crenomytilus grayanus muskuiluaren heste-epitelioan deskribatu 

da, zelulen proliferazio-tasan sasoi-aldaketa nabarmenak aurkitu direlarik (Leibson & 

Frolova, 1994). Hala ere, zunda espezifikoak erabiliz edo ultrastruktura sakonki aztertuz, 

zelula amak identifikatzera zuzendutako lanik ez dugu ezagutu. 

Bestalde, liseri-guruineko tubuluen epitelioari dagokionez, datu egokien gabezia 

bera dagoen arren, zelula amen presentzia proposatu da. Ostretan, liseri-epitelioko zelulen 

aitzindariak izan omen daitezkeenak, liseri-tubuluetako kriptetan aurkitu dira (29 Ird.; 

Yonge, 1926; Shaw & Battle, 1957; Mix & Sparks, 1971). Izatez, erradiazio ionizatzailez 

trataturiko liseri-tubuluen epitelioan, kriptetako zelula horiek epitelio berriaren sorreraren 

erantzule nagusiak dirudite (Mix & Sparks, 1971). Mytilus edulis muskuiluan eta Pecten 

maximus beiran ere, desberdintzatu gabeko zelula ama bat dagoela proposatu da 

30. Irudia: PCNA immunohistokimika 

muskuiluaren liseri-guruinean eta 

krustazeoaren hepatoarean. Muskuiluen 

liseri-guruinean (a-b eta tarteko irudi txikia) 

positibotasun gehiena liseri-zelulei dagokie 

(geziak), nahiz eta zelula basofiliko 

batzuetan markaketa ere ageri den (gezi 

buruak). Urdaileko zelulek markaketa 

positiboa erakutsi dute (c), eta baita 

hemozitoek (H) ere (irudi txikia). Kontrolebakinetan 

(d) ez da inolako seinalerik 

atzeman. Krustazeoen hepatoarearen Ezeluletan 

(e) markaketa bortitza behatu da. 

Zelulak desberdintzatuz doazen heinean 

markaketa arinago bihurtuz. E-zelulen 

eskualdean irudi mitotikoak (m) ikus 

daitezke. Hepatoarearen kontrolebakinetan 

(f) ez da inolako markarik 

atzeman. Eskala-marra: 10 μm (a-c) eta 20 

μm (d-f) (Marigómez et al.-etik (1999) 

hartua). 

53

Zati Teorikoa 

3. Taula: Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioen zelula-motak, beraien funtzioa eta 

jatorria. 

(Thompson et al., 1974; Henry et al., 1991). Beste autore batzuen aburuz, epitelioaren 

berriztatzearen arduraduna ziliatua, hau da nahiko desberdintzatua, den zelula basofiliko 

berezia izango litzateke. Horrelakorik Cardium edule bibalbio eta Maricrypta monoxyla 

prosobrankio itsastarren kasuan iradoki zen (Owen, 1970; Nelson & Morton, 1979). Datu 

partzial eta eskas horietan oinarrituta, zelula amak zelula basofiloak direna zenbait 

hamarkadetan ontzat hartu da oro har, datu esperimental berrien sustapenik gabe. 

Aitzitik, azken urteotan, Mytilus galloprovincialis muskuiluan, liseri-albeoloetako 

epitelioko 2 zelula-motek, liseri-zelula eta zelula basofilikoa hain zuzen, PCNA 

immunohistokimikaren bitartez S-fasean sartzeko gai direla frogatu da (30. Ird.; Marigómez 

et al., 1999). Gainera, bi zelula-motok EGF hartzaileak erakusten dituzte (Canesi et al., 

2000). Hori dela eta, behintzat espezie honetan, liseri-epitelioko bi zelula helduak zatitzeko 

gai direla dirudi, ugaztunen hepatozito moduan zatiketa autologoaz baliatuz. Ekarpen 

horrek, muskuiluen liseri-guruinean zelula amaren existentzia kolokan utzi du. Hala ere, 

erradiazio ionizatzailearen eraginaren ondorioz jasandako kalte bortitzen aurrean zelula 

54 

ZELULA-MOTA FUNTZIOA JATORRIA 

Ugaztunen area 

á-Zelulak 

ß-Zelulak 

ã-Zelulak 

ä-Zelulak 

Ugaztunen listu -guruina 

Zelulak jariatzaileak 

(exokrinoak) 

Konduktuetako zelulak 


Zelula mioepitelialak 

Zelula parenkimatikoak 

Ugaztunen gibela 

Hepatozitoak 

Moluskuen liseri -guruina 

Liseri-zelula 

Zelula basofilikoa 

Glukagonaren ekoizpena 

Intsulinaren ekoizpena 

Are-polipeptidoaren 

ekoizpena 

Somatostatinaren ekoizpena 

Liseri-entzimen jariapena 

Oreka osmotikoaren 

eraenketa 


Uzkurketa/mugimendua 

Egituraketa 

Funtzio anitzak 

Elikagaien liseriketa 


á-Zelulak/Zelula exokrinoak 

ß-Zelulak/Zelula exokrinoak 

ã-Zelulak/Zelula exokrinoak 

ä-Zelulak/Zelula exokrinoak 

Zelula exokrinoak 

Konduktuetako zelula amak 

Konduktuetako zelula amak/ 


Konduktuetako zelula amak 

Zelula parenkimatikoak 

Hepatozitoak/Hering 

kanaleko zelulak 

Liseri-zelulak/Kriptetako 

zelula amak 

Zelula 

basofilikoak/Kriptetako 

zelula amak


amek liardukete. Azken finean, zelula basofiliko desberdintzatuak (jariatzaileak edo 

ziliatuak) zelula amak direla onartzeko zailtasunak aurkitu ditugun bitartean (Marigómez et 

al., 1999), Mix eta Sparks (1971) ikertzaileek deskribatutako zelula basofilikoak, txikiak eta 

biribilak izanik, zelula amak ez direla esateko ez dugu oinarri sendorik. 

55

Zati Teorikoa 

BIBLIOGRAFIA 

Abrahamsen JF, Smaaland R, Sothern RB, Laerum 

OD (1997) Circadian cell cycle variations of 

erythro- and myelopoiesis in humans. Eur. J. 

Haematol. 58:333-345. 

Actis AB, Lampe PD, Eynard AR (2002) Cellular 

basis and clinical implications of biological 

markers in salivary tissues: Their topological 

distribution in murine submandibular gland. Oral 

Oncol. 38:441-449. 

Alberts B, Jonson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, 

Walter P (2002) Molecular biology of the cell. 4. 

edizioa. Taylor & Francis New York. 1463 orr. 

Alison MR (1995) Assessing cellular proliferation: 

What's worth measuring? Human Exp. Technol. 

14:935-944. 

Alison M, Golding M, Lalani EN, Nagy P, 

Thorgeirsson S, Sarraf C (1997) Wholesale 

hepatocytic differentiation in the rat from 

ductular oval cells, the progeny of biliary stem 

cells. J. Hepatol. 26:343-352. 

Al-Mohanna SY, Nott JA (1989) Functional cytology 

of the hepatopancreas of Penaeus semisulcatus 

(Crustacea: Decapoda) during the moult cycle. 

Mar. Biol. 101:535-544. 

Argaud A, Bounoure L (1910) Contribution a létude 

anatomique et histologique du tube digestif 

dÁrion rufus. S. Anat. Physiol. N. 46:146-174. 

Awaji M, Suzuki T (1998) Monolayer formation and 

DNA synthesis of the outer epithelial cells from 

pearl oyster mantle in coculture with 

amebocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 

34:486-491. 

Babula A, Wielinska L (1988) Ultrastructural studies 

of the digestive system of the slug, Deroceras 

reticulatum (Müller) (Pulmonata). Bull. Soc. Amis 

Sci. Lettres de Poznam. Ser. D. Sci. Biol. 26:73- 

78. 

Baisch H, Beck HP, Christiensen IJ, Hartmann NR, 

Fried J, Dean PN, Gray JW, Jett JH, Johnston 

DA, White RA, Nicolini C, Zeitz S, Watson JV 

(1982) A comparison of mathematical methods 

for the analysis of DNA histograms obtained by 

flow cytometry. Cell Tiss. Kin. 15:235-249. 

56 

Bale SD, Howard TA, Moffett SB (2001) Neuronal 

and non-neuronal responses to nerve crush in a 

pulmonate snail, Melampus bidentatus. Invert. 

Neurosci. 4:105-117. 

Barbeito CG, González NV, Badrán AF (2003) Sex 

and Age-Related temporal variations in 

intestinal-epithelium proliferation in the suckling 

mouse. Chronobiol. Int. 20:97-107. 

Basalo C (1998) Organización morfofuncional de 

los alvéolos de la glándula digestiva del mejillón 

Mytilus galloprovincialis. Lizentziatura-Tesia. 

UPV/EHU. 134 orr. 

Baumforth KR, Grewal N, Large AT, Jones CJ, Perry 

CJ, Connock MJ (1998) Zonal rotor purification 

and characterization of "mannosomes": a 

tubular membrane system in gastropod mollusc 

digestive gland. Anal. Biochem. 263:189-197. 

Beninger PG, Le Pennec M (1991) Functionall 

anatomy of the scallops. 133-166 orr. Non: 

Scallops: biology, ecology and aquaculture. 

Shunway SE (ed). Elsevier, Amsterdam. 

Bertelli E, Bendayan M (1997) Intermediate 

endocrine-acinar pancreatic cells in duct ligation 

conditions. Am. J. Physiol. C 273:1641-1649. 

Biesiot PM (1986) Changes in midgut gland 

morphology and digestive enzyme activities 

associated with development in early stages of 

the American lobster, Homarus americanus. 

Woods Hole Oceanographic Istitution, Publ. 

WHOI-86-20, PB89 190276: Doktoradutza- 

Tesia, 222 orr. 

Bjarnason GA, Jordan R (2002) Rhythms in human 

gastrointestinal mucosa and skin. Chronobiol. 

Int. 19:129-140. 

Boghen A, Farley J (1974) Phasic activity in the 

digestive gland cells of the intertidal 

prosobranch Littorina saxatilis (Olivi) and its 

relation to the tidal cycle. Proc. Malacol. Soc. 

London 41:41-56. 

Bonner-Weir S, Baxter LA, Schuppin GT, Smith FE 

(1993) A second pathway for regeneration of 

adult exocrine and endocrine pancreas. A 

possible recapitulation of embryonic 

development. Diabetes 42:1715-1720. 

Bonner-Weir S, Sharma A (2002) Pancreatic stem 

cells. J. Pathol. 197:519-526.

Bowen ID (1970) The fine structural localization of 

acis phosphatase in the gut epithelial cells of the 

slug, Arion ater (L.). Protoplasma 70:73-81. 

Bowen ID, Davies P (1971) The fine structural 

distribution of acid phosphatase in the digestive 

gland of Arion hortensis (Fre.). Protoplasma 

73:73-81. 

Brandi GM Calabrese C, Pantaleo MA, Morselli 

Labate A, Di Febo G, Hakim R, De Vivo A, Di 

Marco MC & Biasco G (2004) Circadian 

variations of rectal cell proliferation in patients 

affected by advanced colorctal cancer. Can. 

Lett. 208:193-196. 

Bravo R, Frank R, Blundell PA, Mcdonald-Bravo H 

(1987) Cyclin/PCNA is the auxiliar protein of 

DNA polimerase-D. Nature 326:515-517. 

Bravo R, Macdonald-Bravo H (1987) Existence of 

two cyclin proliferating cell nuclear antigen 

during the cell cycle: Association with DNA 

replication sites. J. Cell Biol. 105:1549-1554. 

Brockenbrough JS, Weir GC, Bonner-Weir S (1988) 

Discordance of exocrine and endocrine growth 

after 90% pancreatectomy in rats. Diabetes 

37:232-236. 

Brouard M, Barrandon Y (2003) Controlling skin 

morphogenesis: hope and despair. Curr. Opin. 

Biotechnol. 14:520-525. 

Bruno S, Darzynkiewicz Z (1992) Cell cycle 

dependent expression and stability of the 

nuclear protein detected by Ki-67 antibody in 

HL-60 cells. Cell Prol. 25:31-40. 

Cajaraville MP (1989) Efectos histopatológicos y 

citotóxicos de los hidrocarburos derivados del 

petróleo, y su cuantificación en el mejillón 

Mytilus galloprovincialis (Lmk). Doktoradutza- 

Tesia. 577 orr. 

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez JA, Angulo E 

(1990) Responses of basophilic cells of the 

digestive gland of mussels to petroleum 

hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9:221- 

228. 

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E 

(1991) Consequences of keeping Mytilus in the 

laboratory as assessed by different cellular 

condition indices. Helgol. Meeresunter. 45:445- 

464. 

Bibliografia 

Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E 

(1992) Comparative effects of the water 

accommodated fraction of three oils on mussels 

2.- Quantitative alterations in the structure of the 

digestive tubules. Comp. Biochem. Physiol. C 

102:113-123. 

Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez 

I (1995a) Cellular biomarkers as useful tools in 

the biological monitoring of environmental 

pollution: molluscan digestive lysosomes. 29-55 

orr. Non:. Cell biology in environmental 

toxicology. Cajaraville MP (ed.). University of the 

Basque Country Press Service. Bilbo. 

Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez 

I (1995b) Lysosomes as cellular markers of 

environmental pollution: time- and dosedependent 

responses of the digestive lysosomal 

system of mussels after petroleum hydrocarbon 

exposure. Environ. Toxicol. Water. Qual. 10:1-8. 

Cajaraville MP, Bebianno MJ, Blasco J, Porte C, 

Sarasquete C, Viarengo A (2000) The use of 

biomarkers to assess the impact of pollution in 

coastal environments of the Iberian Peninsula: a 

practical approach. Sci. Tot. Environ. 247:295- 

311. 

Cancio I, Orbea A, Völkl A, Fahimi D, Cajaraville MP 

(1998) Induction of peroxisomal oxidases in 

mussels: comparison of effects of lubricant oil 

and benzo(a)pyrene with two typical peroxisome 

proliferators on peroxisome structure and 

function in Mytilus galloprovincialis. Toxicol. 

Appl. Pharmacol. 149:64-72. 

Canesi L, Malatesta M, Battistelli S, Ciacci C, Gallo 

G, Gazzanelli G (2000) Immunoelectron 

microscope analysis of epidermal growth factor 

receptor (EGFR) in isolated Mytilus 

galloprovincialis (Lam.) digestive gland cells: 

Evidence for ligand-induced changes in EGFR 

intracellular distribution. J. Exp. Zool. 286:690- 

698. 

Chai Y, Klauser DK, Denny PA, Denny PC (1993) 

Proliferative and structural differences between 

male and female mouse submandibular glands. 

Anat. Rec. 235:303-311. 

57

Zati Teorikoa 

Chepko G, Dickson RB (2003) Ultrastructure of the 

putative stem cell niche in rat mammary 

epithelium. Tiss. Cell 35:83-93. 

Chepko G, Smith GH (1997) Three divisioncompetent, 

structurally-distinct cell populations 

contribute to murine mammary epithelial 

renewal. Tiss. Cell. 29:239-253. 

Colas P, Launay C, van Loon AE, Guerrier P 

(1993a) Protein synthesis control cyclin stability 

in metaphase I-arrested oocytes of Patella 

vulgata. Exp. Cell Res. 208:518-521. 

Colas P, Serras F, Van Loon AE (1993b) 

Microinjection of suc 1 transcripts delays the cell 

cycle clock in Patella vulgata embryos. Int. J. 

Dev. Biol. 37:598-594. 

Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM (1990) Labelretaining 

cells reside in the bulge area of 

pilosebaceous unit: implications for follicular 

stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. 

Cell 29:1329-1337. 

Couch J (1984) Atrophy of diverticular epithelium as 

an indicator of environmental irritants in the 

oyster Crassostrea virginica. Mar. Environ. Res. 

14:525-526. 

Czarna Z, Krasowka E, Turska R (1985) The tubular 

structures in the cells of the digestive gland of 

Arion rufus (Mollusca Gastropoda). Zool. 

Poloniae 32: 23-28. 

David H, Götze J (1963) Elektronenmikroskopische 

Befunde an der Mitteldarmdrüse von 

Schnecken. Z. Mikrosk.-Anat. Forsch. (Leipzig). 

70:252-272. 

Daughaday WH, Rotwein P (1989) Insulin-like 

growth factors I and II. Peptide, messenger 

ribonucleic acid and gene structures, serum, and 

tissue concentrations. Endocr. Rev. 10:68-91. 

Dellambra E, Golisano O, Bondanza S, Siviero E, 

Lacal P, Molinari M, D'Atri S, De Luca M (2000) 

Downregulation of 14-3-3sigma prevents clonal 

evolution and leads to immortalization of primary 

human keratinocytes. J. Cell Biol. 29: 149:1117- 

1130. 

Dekens MPS, Santoriello C, Vallone D, Grassi G, 

Withmore D, Foulkes NS (2003). Light regulates 

the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13:2051- 

2057. 

58 

Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1990) 

Three-dimensional localization of DNA synthesis 

in secretory elements of adult female mouse 

submandibular gland. Adv. Dent. Res. 4:34-44. 

Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1993) 

Parenchymal cell proliferation and mechanisms 

for maintenance of granular duct and acinar cell 

populations in adult male mouse submandibular 

gland. Anat. Rec. 235:475-485. 

Denny PC, Ball WD, Redman RS (1997) Salivary 

glands: a paradigm for diversity of gland 

development. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 8:51-75. 

Derynck R (1992) The physiology of transforming 

growth factor-α. Adv. Canc. Res. 58:27-52. 

Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of 

excretory cells in the digestive gland of the land 

snail Helix lucorum. Malacologia 44:145-151. 

Domouhtsidou GP, Dimitriadis VK (2001) Lysosomal 

and lipid alterations in the digestive gland of 

mussels, Mytilus galloprovincialis (L.) as 

biomarkers of environmental stress. Environ. 

Pollut. 115:123-137. 

Dondero F, Viarengo A (2005) Development of novel 

sensitive molecular markers for marine 

environment biomonitoring employing mussels. 

15th SETAC Europe Anual Meeting. Lille. 

Dor Y, Brown J, Martinez OI, Melton DA (2004) Adult 

pancreatic β-cells are formed by self-duplication 

rather than stem-cell differentiation. Nature 

429:41-46. 

Edgar BA, Lehner CF (1996) Developmental control 

of cell cycle regulators: a fly´s perpective. 

Science 274:1664-1672. 

Eirin-López JM, González-Tizón AM, Martínez A, 

Méndez J (2002) Molecular and evolutionary 

analysis of mussel histone genes (Mytilus spp.): 

possible evidence of an "orphon origin" for H1 

histone genes. J. Mol. Evol. 55:272-83. 

Elsasser HP, Biederbick A, Kern HF (1994) Growth 

of rat pancreatic acinar cells quantitated with a 

monoclonal antibody against the proliferating 

cell nuclear antigen. Cell Tiss. Res. 276:603- 

609. 

Endl E, Gerdes J (2000) The Ki-67 protein: 

fascinating forms and an unknown function. Exp. 

Cell Res. 257:231-237.

Faderl S, Keating MJ, Do KA, Liang S.-Y, Kantarjian 

H.M, O'Brien S, Garcia-Manero G, Manshouri T, 

Albitar M (2002) Expression profile of 11 proteins 

and their prognostic significance in patients with 

chronic lymphocytic leukemia (CLL). Leukemia 

16:1045-1052. 

Fausto N (2001) Liver regeneration: From 

laboratory to clinic. Liver Trasn. 7:835-844. 

Finegood DT, Scaglia L, Bonner-Weir S (1995) 

Dynamics of beta-cell mass in the growing rat 

pancreas. Estimation with a simple 

mathematical model. Diabetes 44:249-256. 

Fisher DA, Lakshmanan J (1990) Metabolism and 

effects of epidermal growth factor and related 

growth factors in mammals Endocr. Rev. 11:418- 

442. 

Foley J, Ton T, Maronpot R, Butterworth R, 

Goldworthy TL (1993) Comparison of 

proliferating cell nuclear antigen to tritiated 

thymidine as a marker of proliferating 

hepatocytes in rats. Environ. Health Prespec. 

101:199-205. 

Fretter V, Graham A (1962) British prosobranch 

molluscs. Ray Society. 755 orr. 

Furuta E, Yamaguchi K, Shimozawa A (1994) Bloodcell 

producing site in the land slug Incilaria 

fruhstorferi. Kaibogaku. Zasshi. 69:751-764. 

Gage FH (2000) Mammalian neural stem cells. 

Science 287:1433-1438. 

Gerdes J, Lemke H, wacker H, Schwab HJ, Stein H 

(1984) Cell cycle analysis of a cell proliferation 

asociated human nuclear antigen defined by the 

monoclonal antibody Ki-67. J. Immunol. 

133:1710-1715. 

Gerlach C, Golding M, Larue L, Alison MR, Gerdes 

J (1997) Ki-67 immunoexpression is a robust 

marker of proliferative cells in the rat. Lab. 

Invest. 77:697-698. 

Ghazizadeh S, Taichman LB (2001) Multiple classes 

of stem cells in cuteneous epithelium; a lineage 

analysis of adult mouse skin. EMBO J. 20:1215- 

1222. 

Gibson R, Barker PL (1979) The decapod 

hepatopancreas. Oceangr. Mar. Biol. Ann. Rev. 

17:285-346. 

Bibliografia 

Githens S (1988) The pancreatic duct cell: 

proliferative capabilities, specific characteristics, 

metaplasia, isolation, and culture. J. Pediatr. 

Gastroenterol. Nutr. 7:486-506. 

Goldblum JR, Appelman HD (1995) Stromal tumors 

of the duodenum: A histologic and 

immunohistochemical study of 20 cases. Am. J. 

Sur. Pathol. 19:71-80. 

Golias CH, Charalabopoulos K, Chralabopoulos K 

(2004) Cell proliferation and cell cycle control: a 

mini review. Int. J. Clin. Pract. 58:1134-1141. 

González-Melendi P, Testillano PS, Ahamadian P, 

Fadón B, Risueño MC (1996) New in situ 

approaches to study the induction of pollen 

embryogenesis in Capsicum anuum L. Eur. J. 

Cell Biol. 69:373-386. 

Gratzner HG (1982) Monoclonal antibody to 5bromo- 

and 5-iododeoxyuridine: A new reagent 

for detection of DNA replication. Science 

218:474-475. 

Grimaldi A, Tettamanti G, Rinaldi L, Brivio MF, 

Castellani D, de Eguileor M (2004) Muscle 

differentiation in tentacles of Sepia officinalis 

(Mollusca) is regulated by muscle regulatory 

factors (MRF) related proteins. Dev. Growth 

Differ. 46:83-95. 

Gu D, Lee MS, Krahl T, Sarvetnick N (1994) 

Transitional cells in the regenerating pancreas. 

Development 120:1873-1881. 

Gu D, Arnush M, Sarvetnick N (1997) 

Endocrine/exocrine intermediate cells in 

streptozotocin-treated Ins-IFN-γ transgenic 

mice. Pancreas 15:246-250. 

Gu G, Dubauskaite J, Melton DA (2002) Direct 

evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ 

cells are islet progenitors and are distinct from 

duct progenitors. Development 129:2447-2457. 

Hale SA, Capuco AV, Erdman RA (2003) Milk yield 

and mammary growth effects due to increased 

milking frequency during early lactation. J. Dairy 

Sci. 86:2061-2071. 

Hall PA, Levinson DA (1990) Review: assessment of 

cell proliferation in histological material. J. Clin. 

Pathol. 43:184-192. 

Hall PA, Levison DA, Woods AL, Yu CCW, Kellock 

DB, Watkins JA, Barnes DM, Gillett CE, 

59

Zati Teorikoa 

Camplejohn R, Dover R, Waseem NH, Lane DP 

(1990) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 

immunolocalization in paraffin sections: An index 

of cell proliferation with evidence of deregulated 

expression in some neoplasms. J. Pathol. 

162:285-294. 

Hall PA, Watt F (1989) Stem cells: the generation 

and maintenance of cellular diversity. 

Development 106:619-633. 

Hanks CT, Chaudhry AP (1971) Regeneration of rat 

submandibular gland following partial 

extirpation. A light and electron microscopic 

study. Am. J. Anat. 130:195-208. 

Hanselmann R, Smolowitz R, Gibson D (2000) 

Identification of proliferating cells in hard clams. 

Biol. Bull. 199:199-200. 

Hayashi KY, Tamaki H, Handa K, Takahashi T, 

Kakita A, Yamashina S (2003) Differentiation 

and proliferation of endocrine cells in the 

regenerating rat pancreas after 90% 

pancreatectomy. Arch. Histol. Cytol. 66:163-174. 

Hedley DW, Friedlander ML, Taylor IW, Rugg CA, 

Musgrove EA (1983) Method for analysis of 

cellular DNA content of paraffin-embedded 

pathological material using flow cytometry. J. 

Histochem. Cytochem. 31:1333-1335. 

Henry M (1987) Glande digestive de la palourde 

Ruditapes decussatus, en métabolisme de 

routine. I. La cellule digestive. II La cellule 

sécrétice. Vie Marine 6:7-24. 

Henry M, Bocaud-Camou E, Lefort Y (1991) 

Functional micro-anatomy of digestive gland of 

the marine bivalves. Mar. Environ. Res. 17:286. 

Herrera PL (2000) Adult insulin- and glucagonproducing 

cells differentiate from two 

independent cell lineages. Development 

127:2317-2322. 

Hickmott PW, Carew TJ (1991) An autoradigraphic 

analysis of neurogenesis in juvenile Aplysia 

californica. J. Neurobiol. 22:313-326. 

Hopkin SP, Nott JA (1979) Some observations on 

concentrically structured, intracellular garnules 

in the hepatopancreas of the shore crab 

Carcinus maenas (L.). J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 

59:867-877. 

60 

Hotchin NA, Gandarillas A, Watt FM (1995) 

Regulation of cell surface beta 1 integrin levels 

during keratinocyte terminal differentiation J. 

Cell Biol. Mar. 128:1209-1219. 

Howard A, Pelc SR (1950) P32 autoradiographs of 

mouse testis; preliminary observations of the 

timing of spermatogenic stages. Br. J. Radiol. 

23:634-641. 

Howard B, Mitchell PC, Ritchie A, Simkiss K, Taylor 

M (1981) The composition of intracellular 

granules from the metal-accumulating cells of 

the common garden snail (Helix aspersa). 

Biochem. J. 194:507-511. 

Hunt T, Luca FC, Ruderman JV (1992) The 

requirements for protein synthesis and 

degradation, and the control of destruction of 

cyclins A and B in the meiotic and mitotic cell 

cycles of the clam embryo. J. Cell Biol. 116:707- 

724. 

Icely JD, Nott JA (1992) Digestion and absortion: 

digestive system and associated organs. 147- 

201 orr. Non: Microscopic Anatomy of 

Invertebrates. Harrison FW & Kohn AJ (ed). 10; 

Decapod Crustacea: FW. Wiley-Liss. Inc. New 

York. 

Illa I (2005) Un nuevo modelo para el estudio de la 

diferenciación de las células madre (stem cells): 

el nido de regeneracion de Locusta. 

Doktoradutza-Tesia. Universidad de Navarra. 

164 orr. 

Izagirre U, Ruiz P, Marigómez M (2005) Early 

lysosomal membrane destabilisation on 

exposure to pollutants in mussel digestive cells. 

13 rd Symposium PRIMO. 

Jain S, Filipe MI, Hall PA, Waseem N, Lane DP, 

Levison DA (1991) Prognostic value of 

proliferating cell nuclear antigen in gastric 

carcinoma. J. Clin. Pathol. 44:655-659. 

Janssen HH (1985) Some histological findings of 

the mid-gut gland of the common garden snail, 

Arion rufus (L.) (Syn. A. ater rufus (L.), A. 

emporicorum Férrusac), Gastropoda: 

Stylommatophora. Zool. Anz. 215:33-51. 

Jensen UB, Lowell S, Watt FM (1999) The spatial 

relationship between stem cells and their 

progeny in the basal layer of human epidermis:

a new view based on whole-mount labelling and 

lineage analysis. Development 126:2409-2418. 

Jensen J (2004) Gene regulatory factors in 

pancreatic development. Dev. Dyn. 229:176- 

200. 

Joensuu H, Klemi PJ, Korkeila E (1988) Prognostic 

value of DNA ploidy and proliferative activity in 

Hodkin's disease. Am. J. Clin. Pathol. 90:670- 

673. 

Jones PH, Harper S, Watt FM (1995) Stem cell 

patterning and fate in human epidermis. Cell 

80:83-93. 

Kamiya K, Higgins PD, Tanner MA, Gould MN, 

Clifton KH (1999) Kinetics of mammary 

clonogenic cells and rat mammary cancer 

induction by X-rays or fission neutrons. J. 

Radiat. Res. 40 Suppl:128-137. 

Kikuyama S, Kubora T, Watanabe M, Ishibiki K, Abe 

O (1988) Cell kinetic study of human carcinomas 

using bromodeoxyuridine. Cell Tiss. Kin. 20:1-6. 

Kim ND, Oberley TD, Yasukawa-Barnes J, Clifton 

KH (2000) Stem cell characteristics of 

transplanted rat mammary clonogens. Exp. Cell 

Res. 10: 260:146-159. 

Klauser DK, Denny PA, Denny PC (1993) 

Proliferative and structural differences between 

male and female mouse submandibular glands. 

Anat. Rec. 235:303-313. 

Kordon EC, Smith GH (1998) An entire functional 

mammary gland may comprise the progeny from 

a single cell. Development 125:1921-1930. 

Krijgsman, B (1928) Arbeitsrhythmus der 

Verdauungsdüsen bei Helix pomatia. II. 

Sekretion, Resorption und Phagocytose. Z. 

Vergl. Physiol. 8:187-280. 

Krishnakumar PK, Casillas E, Vanarasi U (1995) 

Effect of environmental contaminants on the 

health of Mytilus edulis from Puget Sound, 

Washington, U.S.A. II. Cytochemical detection of 

subcellular changes in digestive cells. Mar. Biol. 

124:251-259. 

Krucher NA, Roberts MH (1994) Identification of 

CDK- and cyclin-like proteins in the eye of Bulla 

gouldiana. J. Neurobiol. 25:1200-1206. 

Kurki P, Vanderlaan M, Dolbeare F (1986) 

Expression of proliferating cell nuclear antigen 

Bibliografia 

(PCNA)/cyclin during the cell cycle. Exp. Cell 

Res. 166:209-218. 

Lamers AE, Heiney JP, Ram JL (1999) Cloning and 

sequence analysis of two cDNAs encoding 

cyclin A and cyclin B in the zebra mussel 

Dreissena polymorpha. Biochim. Biophys. Acta 

1448:519-24. 

Langton RW (1975) Syncrony in the digestive 

diverticula of Mytilus edulis L. J. Mar. Biol. Ass. 

U.K. 55:221-229. 

Lavker RM, Sun TT (2000) Epidermal stem cells: 

properties, markers, and location. Proc. Natl. 

Acad. Sci. U.S.A. 97:13473-13475. 

Le Douarin NM (1988) On the origin of pancreatic 

endocrine cells. Cell 22:169-171. 

Leibson NL, Frolova LT (1994) Winter-spring 

essential reorganization of cell proliferation in 

the digestive tract epithelia in the mussel 

Crenomytilus grayanus. Mar. Biol. 118: 471-477. 

Lekube X (1997) Mytilus galloprovincialis 

muskuiluaren liseri-guruinaren plastizitatea eta 

dinamika zelularra: 3D-berreraiketa eta PCNA 

bidezko azterketa. Lizentziatura-tesia. 


Lekube X, Cajaraville MP, Marigómez I (2000) Use 

of polyclonal antibodies for the detection of 

changes induced by cadmium in lysosomes of 

aquatic organisms. Sci. Tot. Environ. 247:201- 

212. 

Le Pennec G, Le Pennec M (2002) Molecular 

analysis of the seasonal expression of genes 

coding for different functional markers of the 

digestive gland of the bivalve mollusk Pecten 

maximus (L.). Comp. Biochem. Physiol. B 

133:417-426. 

Li A, Normand P, Redvers R, Kaur P (2004) 

Extensive tissue-regenerative capacity of 

neonatal human keratinocytes stem cells and 

their progeny. J. Clin. Invest. 113:390-400. 

Lillo C, Velasco A, Jimeno D, Cid E, Lara JM, Aijón 

J (2002) The glial design of a teleost optic nerve 

head supporting continuous growth. J. 


Littleton RJ, Baker GM; Soombro IN, Adams RL, 

Whimster WF (1991) Kinetic aspects of Ki-67 

61

Zati Teorikoa 

antigen expression in a normal cell line. Virchow 

Arch. B Path. Incl. Mol. Path. 60:15-19. 

Liu S, Dontu G, Wicha MS (2005) Mammary stem 

cells, self-renewal pathways, and 

carcinogenesis. Breast Canc. Res. 7:86-95. 

Loeb MJ, Clark EA, Blacburn M, Hakim RS, Elsen 

K, Smagghe G (2003) Stem cells from midguts 

of Lepidopteran larvae: clues to the regulation of 

stem cells fate. Arch. Insect. Biochem. Physiol. 

53:186-198. 

Loizzi RF (1971) Interpretation of crayfish 

hepatopancreatic function based on fine 

structural analysis of epithelial cell lines and 

mussel networks. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 

113:420-440. 

van Loon AE, Colas P, Goedemans CE, Neant I, 

Dalbon P, Guerrier P (1991) The role of cyclins 

in the maturation of Patella vulgata oocytes. 

EMBO J. 10:3343-3349. 

Lovett DL, Felder DL (1989) Ontogeny of gut 

morphology in the white shrimp Penaeus 

setiferus (Decapoda, Penaeidae). J. Morphol. 

201:53-68. 

Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of 

oil in the digestive cells of mussels: quantitative 

alterations in cellular and lysosomal structures. 

Aquat. Toxicol. 1:213-226. 

Lowe DM (1988) Alterations in the cellular structure 

of Mytilus edulis resulting from exposure to 

environmental contaminants under field and 

experimental conditions. Mar. Ecol. Prog. Ser. 

46:91-100. 

Luchtel DL, Martin AW, Deyrup-Olsen I, Boer HH 

(1997) Gastropoda: Pulmonata. 459-718 orr. 

Non: Microscopic Anatomy of Invertebrates. FW 

Harrison FW & Kohn AJ (ed). 6B; Mollusca II. 

Wiley-Liss. Inc. 

Lufty RG, Demian ES (1967) The histology of the 

alimentary system of Marisa cornuarietis 

(Mesogastropoda: Ampullariidae). Malacologia 

5:375-422. 

Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986) Copper 

treatment of the digestive gland of the slug Arion 

ater L. 2. Morphometrics and histophysilogy. 

Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36:608-615. 

62 

Marigómez I (1989). Aportacion citohistológicas a la 

evaluación de efectos subletales de cadmio en 

el medio marino: estudios con el prosobranquio 

Littorina littorea. Doktoradutza-Tesia. UPV/EHU. 

430 orr. 

Marigómez I, Vega MM, Cajaraville MP, Angulo E 

(1989) Quantitative responses of the digestive 

lysosomal system of winkles to sublethal 

concentrations of cadmium. Cell Mol. Biol. 

35:555-562. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) 

Histopathology of the digestive gland-gonad 

complex of marine prosobranch Littorina littorea 

(L.) exposed to cadmium. Dis. Aquat. Organ. 

9:229-238. 

Marigómez I, Soto M, Angulo E (1991) Responses 

of winkles digestive cell and their lysosomal 

system to environmental salinity changes. Cell 

Mol. Biol. 37:29-39. 

Marigómez I, Soto M, Angulo E (1992) Seasonal 

variability in the quantitative structure of the 

digestive tubules of Littorina littorea. Aquat. 

Living. Resour. 5:299-305. 

Marigómez I, Soto M, Etxenberria M, Angulo E 

(1993) Effects of size, sex, reproduction and 

trematode infestation on the quantitative 

structure of digestive tubules in stressed 

winkles. Zool. J. B. Anat. 123:319-336. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury 

JR (1995a) Computer assisted 3-D 

reconstruction techniques may provide new 

insights into the pattern of histological 

organisation of the bivalvian digestive gland. 

12th Inter. Malacol. Congr. Vigo. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury 

JR (1995b) A novel model for the histological 

structure of the molluscan digestive gland based 

on computer aided 3D-reconstruction and 

scanning microscopy. VI Cong. SEBC. Congr. 

Lleida. 

Marigómez I, Orbea A, Olabarrieta I, Etxeberria M, 

Cajaraville MP (1996) Structural changes in the 

digestive lysosomal system of sentinel mussels 

as biomarkers of environmental stress in 

Mussel-Watch programmes. Comp. Biochem. 

Physiol. C 113:291-297.

Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X 

(1998a) Cell-type replacement, a succesful 

strategy of molluscs to adapt to chronic 

exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 

18:431-435. 

Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998b) 

Tissue-level biomarkers in sentinel slugs as 

cost-effective tools to assess metal pollution in 

soils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34:167- 

176. 

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) 

Immunochemical localisation of proliferating 

cells in mussel digestive gland tissue. 

Histochem. J. 31:781-788. 

Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutantspecific 

and general lysosomal responses in 

digestive cells of mussels exposed to model 

organic chemicals. Aquat. Toxicol. 64:235-257. 

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia 

L, Cajaraville MP (2005) Cell and tissue 

biomarkers in mussel, and histopathology in 

hake and anchovy from Bay of Biscay after the 

Prestige oil spill (Monitoring campaign 2003). 

Mar. Poll. Bull. (prentsan). 

Marshman E, Booth C, Potten CS (2002) The 

intestinal epithelial stem cell. BioEssays 24:91- 

98. 

Martínez-Expósito MJ, Pasantes JJ, Méndez J 

(1994) Proliferation kinetics of mussel (Mytilus 

galloprovincialis) gill cells. Mar. Biol. 120: 41-45. 

Martynova MG, Bystrova OA (2002) 

Undifferentiated cells in the snail myocardium 

are capable of DNA synthesis and 

myodifferentiation. Biol. Bull. 203:104-111. 

Mason AZ (1983) The uptake, accumulation and 

excretion of metals by the marine prosobranch 

gastropod mollusc Littorina littorea (L). 

Doktoradutza-Tesia. University of Wales, 

Gwyneed (UK). 575 orr. 

Mason AZ, Simkiss K (1982) Sites of mineral 

deposition in mineral-accummulating cells. Exp. 

Cell Res. 139:383-391. 

McQuiston RW (1969) Cyclic activity in the digestive 

diverticula of Lasae rubra (Montagu) (Bivalvia: 

Eulamellibranchia). Proc. Malacol. Soc. London 

38:483-492. 

Bibliografia 

Melnick M, Jaskoll T (2000) Mouse submandibular 

gland morphogenesis: a paradigm for embryonic 

signal processing. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 

11:199-215. 

Merdsoy B, Farley I (1973) Phasic activity in the 

digestive gland of the marine prosobranch 

gastropod, Littorina littorea (L.). Proc. Malacol. 

Soc. London 40:473-482. 

Michalopoulos GK, DeFrances MC (1997) Liver 

regeneration. Science 276:60-66. 

Mix MC (1972) Chronic tissue degeneration in the 

Pacific oyster, Crassostrea gigas, following 

acute irradiation. Radiat. Res. 49:176-189. 

Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive 

tubule tissue of the pacific oyster, Crassostrea 

gigas, damaged by ionizing radiation. J. 

Invertebr. Pathol. 17:172-177. 

Miyachi K, Fritzler MJ, Tan EM (1978) Autoantibody 

to a nuclear antigen in proliferating cells. J. 

Immunol. 121:2228-2234. 

Moore MN, Pipe RK, Farrar SV (1987) Induction of 

lysosomal lipid accumulation and fatty 

degeneration by polycyclic aromatic 

hydrocarbons in molluscan digestive cells. Mar. 

Environ. Res. 17:230-233. 

Morasso M, Tomic-Canic M (2005) Epidermal stem 

cells: the cradle of epidermal determination, 

differentiation and wound healing. Biol. Cell 

97:173-183. 

Morgan DO (1997) Cyclin-dependent kinases: 

Engines, Clocks, and Microprocessors. Ann. 

Rev. Cell Dev. Biol. 13:261-291. 

Morris GF, Mathews MB (1989) Regulation of 

proliferating cell nuclear antigen during the cell 

cycle. J. Biol. Chem. 264:13856-13864. 

Morton JE (1956) The tidal rhythm and action of the 

digestive system of the lamellibranch Lasaea 

rubra. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 35:563-586. 

Morton BS (1969) Studies on the biology of 

Dreissenas polymorpha Pal. II. Correlation of the 

rhythms of adductor activity, feeding, digestion 

and excretion. Proc. Malacol. Soc. London 

38:401-414. 

Morton BS (1970) The tidal rhythm and rhythm of 

feeding and digestion in Cardium edule. J. Mar. 

Biol. Assoc. U.K. 50:499-512. 

63

Zati Teorikoa 

Morton BS (1971) The diurnal rhythm and tidal 

rhythm of feeding and digestion in Ostrea edulis. 

Biol.J. Linn. Soc. 3:329-342. 

Morton B (1979) The diurnal rhythm and the cycle of 

feeding and digestion in the slug Deroceras 

caruanae. J. Zool. 187:135-152. 

Morton B (1983) Feeding and digestion in bivalvia. 

65-147 orr. Non: The Mollusca. 5. Academic 

Press. Saleuddin ASM & Wilburg M (ed.) New 

York. 

Moya J (1973) Estructura fina de algunos elementos 

glandulares y sus anejos en el aparato digestivo 

del limaco común Arion empiricorum, Ferussac 

(Gasterópodo pulmonado). Universidad de 

Bilbao. Doktoradutza-Tesia. 

Moya J, Rallo AM (1975) Intracisternal 

polycylinders: a cytoplasmic structure in cells of 

the terrestrial slug Arion empiricorum Férussac 

(Pulmonata, Stylommatophora). Cell Tiss. Res. 

159:423-433. 

Muller R, Laucke R, Trimper B, Cossel L (1990) 

Pancreatic cell proliferation in normal rats 

studied by in vivo autoradiography with 3 Hthymidine. 

Virchows. Arch. B. Cell Pathol. Incl. 

Mol. Pathol. 59:133-136. 

Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL, 

Henderson EB (2003) Evaluation of cell 

proliferation in rat tissues with BrdU, PCNA, Ki- 

67(MIB-5) Immunohistochemistry and in situ 

hybridization for histone mRNA. J. Histochem. 

Cytochem. 51:1681-1688. 

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and 

epithelial renewal in the digestive gland tubules 

of the marine prosobranch Maoricrypta 

monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 45: 262-283 

Nigg EA (1995) Cyclin-dependent protein kinases: 

key regulators of the eukaryotic cell cycle. 

BioEssays 17:471-480. 

Oka K, Arai T (1996) MIB1 growth fraction is not 

related to prognosis in cervical squamous cell 

carcinoma treated with radiotherapy. Int. J. Gyn. 

Pathol. 15:23-27. 

Orci L, Unger RH (1975) Functional subdivision of 

islets of Langerhans and possible role of D cells. 

Lancet 20: 2:1243-1244. 

64 

Oro AE, Scott MP (1998) Splitting hairs: dissecting 

roles of signaling systems in epidermal 

development. Cell 25: 95:575-578. 

Overturf K, Al-Dhalimy M, Finegold M, Grompe M 

(1999). The repopulation potential of hepatocyte 

population differing in size and prior mitotic 

expansion. J. Am. Pathol. 155:2135-2143. 

Owen G (1956) Observations on the stomach and 

digestive diverticula of the Lamellibranchia II. 

The Nuculidae. Q. J. Microsc. Sci. 97:541-567. 

Owen G (1966) Digestion. Non: Physiology of the 

molluscan. 53-96 orr. Wilbur KM & Yonge CM 

(ed.). 2. Academic Press. New York. 

Owen G (1970) The fine structure of the digestive 

tubules of the marine bivalve Cardium edule. 

Phil. Trans. R. Soc. London Ser. 60:299-318. 

Owen G (1972) Lysosomes, peroxisomes and 

bivalves. Sci. Prog. 60: 299-318. 

Owen G (1973) The fine structure and 

histochemistry of the digestive diverticula of the 

protobranchiate bivalve Nucula sulcata. Proc. R. 

Soc. London B. 183:249-264. 

Pal SG (1972) The fine structure of the digestiv e 

tubules of Mya Arenaria L. II. Digestive cell. 

Proc. Malacol. Soc. London. 40:161-170. 

Palacios J, Honrado E, Ososio A, Cazorla A, Sarrió 

D, Barroso A, Rodríguez S, Cigudosa JC, Diez 

O, Alonso C, Lerma E, Dopazo J, Rivas C, 

Benítez J (2005) Phenotypic characterization of 

BRCA1 and BRCA2 tumors based in a tissue 

microarray study with 37 immunohistochemical 

markers. Breast Cancer Res. Treat. 90:5-14. 

Palmer RW (1979) Histological and histochemical 

study of digestion in the bivalve Arctica islandica 

L. Biol. Bull. 156:115-129. 

Peatman E, Kucuktas H, Li P, He C, Feng J, Wei X, 

Liu Z Differentially expressed oyster 

(Crassostrea virginica) genes after exposure to 

mercury. 2005. eko uztailan eskuratua. 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?d 

b=nucleotide&val=31900849”. 

Peruzzi E, Sonetti D (2004) Microglia proliferation 

as a response to activation in the freshwater 

snail Planorbarius corneus: A BrdU incorporation 

study. Acta Biol. Hung. 55:287-291.

Platt AM (1971) Doktoradutza-Tesia. The Queen´s 

University. Belfast. 

Pirger Z, Elekes K, Kiss T (2004) Functional 

morphology of the salivary gland of the snail, 

Helix pomatia: a histochemical and 

immunocytochemical study. Acta Biol. Hung. 

55:221-232. 

Pollard JW, Hennighausen L (1994) Colony 

stimulating factor 1 is required for mammary 

gland development during pregnancy. Proc. 

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9312-9316. 

Potten CS (1998) Stem cells in gastrointestinal 

epithelium: Numbers, characteristics and death. 

Philo. Trans. R. Soc. London Ser. B Biol. Sci. 

353:821-830. 

Potten CS & Loeffler M (1990) Stem cells: attributes, 

cycles, spirals, pitfalls and uncertainties. 

Lessons for and from the crypt. Development 

110:1001-1020. 

Potten CS, Booth C, Tudor GL, Booth D, Brady G, 

Hurley P, Ashton G, Clarke R, Sakakibara S, 

Okano H (2003) Identification of a putative 

intestinal stem cell and early lineage marker; 

musashi-1. Differentiation 71:28-41. 

Prelich G, Tan CK, Kostura M, Mathews MB, SØ 

AG, Downey KM, Stillman B (1987) Functional 

identity of proliferating cell nuclear antigen and a 

DNA polymerase-δ auxiliar protein. Nature 

326:517-520. 

Quincoces I (1995) Un nuevo modelo de la glándula 

digestiva de Mytilus galliprovincialis (Bivalvia, 

Eulamellibranchia): reconstrucción 

tridimensional asistida por ordenador y 

microscopía electrónica de barrido. 

Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 112 orr. 

Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light 

and electron microscopic studies of the acute 

and chronic toxic effects of N-nitroso 

compounds on the marine mussel Mytilus edulis 

(L.). II. N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine. 

Aquat. Toxicol. 3:301-311 

Reddy AB, Wong GKY, OŃeill J, Maywood ES, 

Hastings MH (2005) Circadian clocks: Neural 

and peripheral pacemakers that impact upon the 

cell division cycle. Mut. Res. 574:76-91. 

Bibliografia 

Recio A, Marigómez JA, Angulo E, Moya J (1988) 

Zinc tratment of the digestive gland of the slug 

Arion ater L. 1. Cellular distribution of zinc and 

cadmium. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 

41:858-864. 

Regoli F (1992) Lysosomal responses as a sensitive 

stress index in biomonitoring heavy metal 

pollution. Mar. Ecol. Prog. Ser. 84:63-69. 

Roach DK (1968) Rhythmic muscular activity in the 

alimentary tract of Arion ater (L) (Gastropoda: 

Pulmonata). Comp. Biochem. Physiol. 24:865- 

878. 

Roberts CG, De Fazio A, Tattersal MH (1985) A 

simple rapid meted for the identification of cyclin 

cells in freshly excised tumors. Cytobios 43:313- 

318. 

Roberts AB, Sporn MB (1992) Differential 

expression of the TGF-β isoforms in 

embryogenesis suggests specific roles in 

developing and adult tissues. Mol. Reprod. Dev. 

32:91-98. 

Robinson WE, Langton RW (1980) Digestion in a 

subtidal population of Mercenaria mercenaria 

(Bivalvia). Mar. Biol. 58:73-79. 

Robinson WE (1983) Assessment of bivalve 

intracellular digestion based on direct 

measurements. J. Moll. Stud. 49:1-8. 

Robledo Y, Cajaraville MP (1996) Ultrastructural and 

cytochemical study of the Golgi vomplex of 

mollusca (Mytilus galloprovincialis) digestive 

cells. Cell Tiss. Res. 284:449-458. 

Rudolph KL, Chang S, Millard M, Schreiber-Agus N, 

DePinho RA (2000) Inhibition of experimental 

liver cirrhosis in mice by telomerase gene 

delivery. Science 287:1253-1258. 

Runham NW, Hunter PJ (1970) Terrestrial Slugs. 

Hutchinson University Library, London. 184 orr. 

Sáez V, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1990) 

Histomorphology and histochemistry of the 

digestive gland of Littorina littorea (L.) in relation 

to experimental tidal conditions, food availability, 

and digestion. Zool. Jb. Anat. 120:185-196. 

Salvini-Plawen LV (1988) The structure and function 

of molluscan digestive systems. 301-379 orr. 

Non: The Molluscan. Form and function 11. 

65

Zati Teorikoa 

Trueman ER & Clarke MR (ed). Academic 

Press, Orlando, Florida. 

Sancho E, Batlle E, Clvers H (2004) Signaling 

pathways in intestinal development and cancer. 

Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 20:695-723. 

Sanskrithi N, Eskin A (1999) Effects of cyclindependent 

kinase inhibitors on transcription and 

ocular circadian rhythm of Aplysia. J. 

Neurochem. 72:605-613. 

Sarli G, Benazzi C, Preziosi R, Marcato PS (1995) 

Assessment of proliferative activity by anti- 

PCNA monoclonal antibodies in formalin-fixed, 

paraffin-embedded samples and correlation with 

mitotic index. Vet. Pathol. 32:93-96. 

Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G, 

Asghar Z, Wheeler MB, Korbutt G, van der Kooy 

D (2004) Clonal identification of multipotent 

precursors from adult mouse pancreas that 

generate neural and pancreatic lineages. Nat. 

Biotechnol. 22:1115-1124. 

Schluter C, Duchowr M, Wohlenberg C, Becker 

MHG, Key G, Flad HD, Gerdes J (1993) The cell 

proliferation-associated antigen of antibody Ki- 

67: A very large, ubiquitous nuclear protein with 

numerous repeated elements, representing a 

new kind of cell cycle-maintaining proteins. J. 

Cell Biol. 123:513-522. 

Schmetsdorf S, Gärtner U, Arendt T (2005) 

Expression of cell cycle-related proteins in 

developing and adult mouse hippocampus. Int. 

J. Dev. Neurosci. 23:101-112. 

Scholzen T, Gerdes J (2000) The Ki-67 protein: 

From the known and the unknown. J. Cell 

Physiol. 182:311-322. 

Scott J, Liu P, Smith PM (1999) Morphological and 

functional characteristics of acinar atrophy and 

recovery in the duct-ligated parotid gland of the 

rat. J. Dent. Res. 78:1711-1719. 

Sesto A, Navarro M, Burslem F, Jorcano JL (2002) 

analysis of the ultraviolet B response in primary 

human keratinocytes using oligonucleotide 

microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 

99:2965-2970. 

Sherr CJ (1996) Cancer cell cycles. Science 

274:1672-1677. 

66 

Simkiss K (1981) Cellular discrimination processes 

in metal accumulating cells. J. Exp. Biol. 94:317- 

327. 

Slack JM (1995) Developmental biology of the 

pancreas. Development 121:1569-1580. 

Slack JM (2000) Stem cells in epithelial tissues. 

Science 287:1431-3. 

Smalley M, Ashworth A (2003) Stem cells and breast 

cancer: a field in transit. Nat. Rev. Canc. 3:832- 

844. 

Sminia T (1981) Gastropods. Non: Invertebrate 

blood cells. 1. 191-232 orr. Ratcliffe NA & 

Rowley AF (ed). New York: Academic Press. 

Smith GH, Gallahan D, Diella F, Jhappan C, Merlino 

G, Callahan R (1995) Constitutive expression of 

a truncated INT3 gene in mouse mammary 

epithelium impairs differentiation and functional 

development. Cell Growth. Differ. 6:563-577. 

Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I 

(1990) A planimetric study of morphological 

variability in the digestive diverticula of Littorina 

littorea (Linnaeus) and Mytilus edulis (Linnaeus). 

J. Moll. Stud. 56:339-344. 

Soto M, Cajaraville MP, Marigómez I (1996) Tissue 

and cell distribution of copper, zinc and cadmium 

in the mussel, Mytilus galloprovincialis, 

determined by autometallography. Tiss. Cell 

28:557-568. 

Soto M, Marigómez I (1997) Metal bioavailability 

assessment in "Mussel-Watch" programmes by 

automated image analysis of BSD in digestive 

cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156:141- 

150. 

Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M, 

Morgan AJ, Marigómez I (2002) Subcellular 

distribution of cadmium and its cellular ligands in 

mussel digestive gland cells as revealed by 

combined autometallography and X-ray 

microprobe analysis. Histochem. J. 34:273-280. 

Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T (2001) 

Stem cells find their niche. Nature 414:98-104. 

Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry 

of the digestive gland cells of Helix. Q. J. 

Microsc. Sci. 106:173-192.

Sumner AT (1966) The fine structure of the digestive 

gland of Helix, Succinea and Testacella. J. Roy. 

Microsc. Soc. 85:181-192. 

Sumner AT (1969) The distribution of some hydrlitic 

enzymes in cells of the digestive gland of certain 

lamellibranchs and gastropods. J. Zool. 158: 

277-291. 

Suzuki A, Nakauchi H, Taniguchi H (2004) 

Prospective isolation of multipotent pancreatic 

progenitors using flow-cytometric cell sorting. 

Diabetes 53:2143-2552. 

Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) 

Morphological alterations in the digestive 

diverticula of Mizuhopecten yessoensis 

(Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of 

Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. 

Res. 44:85-98 

Takahashi S, Nakamura S, Suzuki R, Islam N, 

Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2000). 

Apoptosis and mitosis of parenchyal cells in the 

duct-ligated rat submandibular gland. Tiss. Cell 

32:457-463. 

Takahashi S, Nakamura S, Suzuki R, Shinzato K, 

Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2001) 

Apoptosis and mitosis of myoepithelial cells in 

atrophic rat submandibular glands. J. 


Takahashi S, Schoch E, Walker NI (1998) Origin of 

acinar cell regeneration after atrophy of the rat 

parotid induced by duct obstruction. Int. J. Exp. 

Pathol. 79:293-301. 

Takahashi S, Shinzato K, Nakamura S, Domon T, 

Yamamoto T, Wakita M (2002) The roles of 

apoptosis and mitosis in atrophy of the 

raltsublingual gland. Tiss. Cell 34:297-304. 

Theise ND, Saxena R, Portmann, BC, Thung SN, 

Yee H, Chiriboga L, Kumar A, Crawford JM 

(1999) The canals of Hering and hepatic stem 

cells in humans. Hepatology 30:1425-1433. 

Thompsom RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) 

Effects of starvation on structure and function in 

the digestive gland of the mussel (Mytilus 

edulis). J. Mar. Biol. 54:699-712. 

Till JE, McCulloch EA (1961) A direct measurement 

of the radiation sensitivity of normal mouse bone 

marrow cells. Radiat. Res.14:213-222. 

Bibliografia 

Tosh D, Strain A (2005) Liver stem cells-prospects 

for clinical use. J. Hepatol. 42:75-84. 

Tomasovic SP, Mix MC (1974) Cell renewal in the 

gill of the freshwater mussel Margaritifera 

margaritifera: an autoradiographic study using 

high specific activity tritiated thymidine. J. Cell 

Sci. 14:561-569. 

Tomic-Canic M, Agren MS, Alvarez OM (2004) 

Epidermal repair and the chronic wound. Non: 

The epidermis in wound healing. 25-57 orr. 

Rovee D & Maibach H (ed). CRC Press, U.S.A. 

Topper YJ, Freeman CS (1980) Multiple hormone 

interactions in the developmental biology of the 

mammary gland. Physiol. Rev. 60:1049-1106. 

Toschi L, Bravo R (1988) Changes in 

cyclin/proliferating cell nuclear antigen 

distribution during DNA repair synthesis. J. Cell 

Biol. 107:1623-1628. 

Totafurno J, Bjerkes M, Cheng H (1987) The crypt 

cycle. Crypt and villus production in the adult 

intestinal epithelium. Biophys. J. 52:279-294. 

Triebskorn R (1991) The impact of molluscicides on 

enzyme activities in the hepatropancreas of 

Deroceras reticulatum (Müller). Malacologia 33: 

255-272. 

Triebskorn R, Kohler HR (1996) The impact of 

heavy metals on the grey garden slug, 

Deroceras reticulatum (Muller): Metal storage, 

cellular effects and semi-quantitative evaluation 

of metal toxicity. Environ. Poll. 93:327-343. 

Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) 

Quantitative alterations in digestive cell structure 

of the marine gastropod Littorina littorea on 

exposure to cadmium. Mar. Biol. 103: 547-553. 

Venier P, Pallavicini A, De Nardi B, Lanfranchi G 

(2003) Towards a catalogue of genes 

transcribed in multiple tissues of Mytilus 

galloprovincialis. Gene 314:29-40. 

Visakorpi T (1992) Proliferative activity determined 

by DNA flow cytometry and proliferating cell 

nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry 

as a prognostic factor in prostatic carcinoma. J. 

Pathol. 168:7-13. 

Vogt G (1994) Life-cycle and functional cytology of 

the hepatopancreatic cells of Astacus astacus. 

Crustacea, Decapoda. Zoomorphol. 114:83-101. 

67

Zati Teorikoa 

Voltzow J (1994) Gastropoda: Prosobranchia. Non: 

Microscopic Anatomy of Invertebrates. 5. 111- 

252 orr. Harrison FW & Kohn AJ (ed). Wiley- 

Liss. Inc. 

Walker G (1969) Studies on digestion of the slug 

Agriolimax reticulatus (Müller) (Mollusca, 

Pulmonata, Limacidae). Doktoradutza-Tesia, 

University of Wales. 

Walker G (1971) The cytology, histochemistry, and 

ultrastructure of the cell types found in the 

digestive gland of slug, Agriolimax reticulatus. 

Protoplasma 71: 91-109. 

Walker G (1972) The digestive system of the slug, 

Agriolimax reticulatus (Müller): Experiments on 

phagocytosis and nutrient absortion. Proc. 

Malacol. Soc. 40:33-43. 

Waseem NH, Lane DP (1990) Monoclonal antibody 

analysis of the proliferating cell nuclear antigen 

(PCNA). Structural conservation and the 

detection of a nuclear form. J. Cell Sci. 96:121- 

129. 

Watt FM (2000) Epidermal stem cells as targets for 

gene transfer. Hum. Gene Ther. 16:2261-2266. 

Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu T, 

Baum LG (1994) A novel mammalian protein, 

p55CDC, present in dividing cells is associated 

with protein kinase activity and has homology to 

the Saccharomyces cerevisiae cell division cycle 

proteins Cdc20 and Cdc4. Mol. Cell Biol. 

14:3350-3363. 

Wells JM (2003) Genes expressed in the developing 

endocrine pancreas and their importance for 

stem cell and diabetes research. Diabetes 

Metab. Res. Rev. 19:191-201. 

Widdows J, Moore MN, Lowe DM. 1984. Sublethal 

biological effects and short-term recovery of 

mussels (Mytilus edulis) and winkles (Littorina 

littorea) following chronic exposure to petroleum 

hydrocarbon. Non: Long term effects of oil on 

marine benthic communities in enclosures. 

Norwegian Institute for Water Research/NIVA 

Technical Report No. 0-8200. 

68 

Wood RD, Shivji MKK (1997) Which DNA 

polymerases are used for DNA-repair in 

eukaryotes? Carcinogenesis 18:605-610. 

Yamada K, Yoshitake K, Sato M, Ahnen DJ (1992) 

Proliferating cell nuclear antigen expression in 

normal, preneoplastic, and neoplastic colonic 

epithelium of the rat. Gastroenterology 103:160- 

167. 

Yanagi S, Potter VR (1977) Sequential changes in 

ornithine decarboxylase thymidine kinase, and 

other enzyme activities in regenerating liver in 

rats on controlled feeding schedules. Life Sci. 

1:1509-1519. 

Yonge CM (1926) The digestive diverticula in 

Lamellibranchia. Trans. Roy. Soc. Edinbourgh 

54: 703-718. 

Yoshino TP (1976) Histopathological effects of larval 

digenea on the digestive epithelia of the marine 

prosobranch Cerithidea californica: fine 

structural changes in the digestive gland. J. 

Invert. Pathol. 28:209-216. 

Yu CCW, Hall PA, Fletcher CDM, Camplejohn RS, 

Waseem NH, Lane DP, Levison DA (1991) 

Haemangiopericytomas: The prognostic value of 

immunohistochemical staining with a 

monoclonal antibody to proliferating cell nuclear 

antigen (PCNA). Histopathol. 19:29-33. 

Zakharov IS, Hayes NL, Ierusalimsky VN, 

Nowakowsky RS, Balaban PM (1998) 

Postembryonic neurogenesis in the 

protocerebrum of the terrestrial snail, Helix 

lucorum L. J. Neurobiol. 35:271-276. 

Zhu MH, Ni CR, Zhu Z, Li FM, Zhang SM (2003) 

Immunohistochemical demonstration of cyclins 

A, B, D1, D3 and E in hepatocellular carcinomas 

using tissue microarrays. Zhonghua. Bing. Li. 

Xue. Za. Zhi. 32:440-443.

AUZIAREN EGOERA 

Moluskuen liseri-guruina eraenketa metabolikoaren organo nagusia da. Horrela, 

sistema immunean eta barne medioaren (pH, Ca-kontzentrazioa…) eraenketa 

homeostatikoan parte hartzen du, eta elikagaien liseriketa intrazelular eta estrazelularraren 

zein hondakinen jariapenaren arduradun nagusia da. Dena den, eta zati teorikoan azaldu 

den moduan, moluskuen liseri-guruinaren epitelioa zelula-mota urriz osaturik dago, 2 edo 

3 zelula-mota. Liseri-guruina, gainera, estres peko egoera desberdinetan modu 

neurgarrian erantzuteko gai da, liseri-epitelioaren lodieraren murrizpenarekin edota liseri- 

zelulen lisosomen tamaina eta osagaien aldaketarekin besteak beste. Hala ere, liseri- 

guruineko epitelioan gertatutako aldaketen artean garrantzitsuena beharbada zelula- 

moten ordezkapena da. Horrela, zelula basofilikoen dentsitate erlatiboa liseri-guruinean 

liseri-zelularenaren gainetik emendatu egiten da. Dena den, prozesu hori liseri-zelulen 

galera, zelula basofilikoen proliferazioa edo bi prozesuen elkarrekintzak sortua den argitu 

beharra dago. Liseri-guruinaren antolakuntza-eredua desberdina da molusku espezie 

desberdinen artean eta osaketa zelularra ere desberdina da. Horretaz gain, modelo 

desberdinek erakusten duten plastikotasuna ere desberdina da, hori dela eta nagusiki 

muskuilu itsastarrean deskribatu diren aldaketak beste molusku-ereduetan orokortu 

daitezkeen ere ezagutzea komenigarria litzateke. 

Ugaztunen epitelio-ehun desberdinetan kalteren baten eraginez, epitelio-zelulen 

galera esanguratsua gertatzekotan, epitelioaren berreskurapena bi modu desberdinetan 

ematen da nagusiki; epitelio-ehunen zelula amen zatiketaren bidez, edo oraindik ere 

epitelioan darraiten zelula helduen zatiketen bidez. Moluskuen liseri-guruinean, hala ere, 

zelula amen presentzia oraindik ere argitzeko dago, eta beraz beharrezkoa zaigu epitelio 

honen berriztapena nola ematen den ulertzea, eta baita ere moluskuen bizi-zikloan zehar 

berriztapena nola eraentzen den ezagutzea. 

Hipotesi eta helburuak 

Bestalde, moluskuak ingurugiro kutsaduraren organismo zentinela gisa aspaldi 

erabiliak izan dira. Izan ere, beraien ehunetan kutsatzaileak metatzen dituzte, eta 

kutsatzaileen aurrean modu neurgarrian erantzuteko gai dira. Erantzun neurgarri hauen 

artean biomarkatzaileak ditugu. Biomarkatzaileak antolakuntza-maila xinpleetan ematen 

diren aldaketen neurketak dira, beranduago eta antolakuntza-maila konplexuagoetan 

gertatuko diren aldaketak aurresateko baliogarriak izango zaizkigunak. Hori dela eta, 

organismo hauen gainean, eta batez ere beraien liseri-guruinean, hainbat neurketa 

biologiko (biomarkatzaileak) zein kimiko (biometaketa) burutzen dira. Liseri-guruinean 

gertatzen diren zelula-moten aldaketek, beraz, eragin zuzena eduki dezakete ingurugiro- 

71


kalitatearen jarraipen programetan egindako hainbat neurketetan. Hortaz, zelula-moten 

ordezkapenak neurketa hauetan hainbat alditan behatutako emaitza eztabaidatsuetan 

eragina izan ote dezaken argitu beharra dago. 

HIPOTESIA 

Moluskuen liseri-guruineko epitelioaren berriztapena zelula helduen zatiketa 

autologoz burutzen da eta aldagai naturalen pean alda daiteke. Esaterako, liseri-epitelioan 

ingurumen-estresak bultzatutako zelula-moten ordezkapena, zelula basofilikoen 

proliferazio areagotuak eragiten du. Bederen, zelula-moten osaketaren aldaketa horrek, 

kutsaduraren jarraipen-programetan erabilitako zenbait biomarkatzaileen gainean eragina 

du. 

HELBURUAK 

Aipatutako hipotesia frogatzeko asmoz, ikerlan honetarako hurrengo helburu 

orokor hauek proposatu ditugu: 

1.- Moluskuen liseri-guruinaren epitelioaren berriztapena zelula amen edo zelula 

helduen zatiketaz ematen den argitzea. 

2.- Epitelioaren berriztapenaren dinamika ezagutzea eta beren gain zeintzu 

faktorek eragiten duten zehaztea. 

3.- Moluskuen liseri-guruinean gertatzen den zelula-moten ordezkapena, zelula 

basofilikoen proliferazioak eraginda dagoen antzematea. 

4.- Aldaketa horiek kutsaduraren jarraipenerako erabiltzen diren ohiko hainbat 

biomarkatzaileen gainean nolako eragina duten zehaztea. 

Ikerlanaren helburu orokor horiek segidan azalduko diren eta “Emaitzak eta 

Eztabaida” atalean ekin diegun honako helburu espezifiko hauetan xehatu dira. 

1.- Kutsatzaile metaliko zein organikoek, muskuiluen liseri-guruineko epitelioan 

zelula-moten ordezkapena noiz, nola eta zein puntutaraino eragin dezaketen jakitea. 

2.- Muskuiluen liseri-guruineko epitelioko zelula-moten ordezkapenak 

autometalografiaz errebelatutako zilarrezko hauspeakin beltzen hedapena gisako 

biomarkatzaileen gainean nolako eragina duen zehaztea. 

72

3.- Muskuiluen liseri-guruineko epitelioaren berriztapenak patroi zirkadianoa edo 

zirkamareala jarraitzen ote duen zehaztea. 

4.- Tamaina, sasoi eta itsasaldi-erregimena gisako faktore naturalek Mytilus 

galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-albeolo eta urdaileko zelulen jarduera 

proliferatzailean nolako eragina duten zehaztea 

5.- Kadmioz kutsatutako magurioetan zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen 

kopuruaren murrizpen zuzenarekin edota zelula basofilikoen proliferazioarekin 

erlazionatuta ote dagoen zehaztea. 

6.- Balizko zelula-moten ordezkapen horrek metalen esposizio eta efektu 

bilogikozko biomarkatzaileen gainean eraginik ote duen antzematea. 

7.- Kutsatzaile organiko eta metalikoen nahasketa pean egondako bareen liseri- 

guruinean zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen galerarekin edo kaltzio-zelulen 

proliferazioarekin erlazionatuta dagoen eta prozesu hori itzulgarria ote den zehaztea. 

8.- Prozesu horrek konposatu kimiko horien biometaketan eta efektu eta esposizio- 

biomarkatzaileetan nola eragiten duen finkatzea. 

9.- Kronikoki kutsadura pean egondako bareen liseri-guruineko osaketa zelularra 

zein den zehaztea eta toki garbira lekuzaldatu ondoren liseri-guruinaren osaketa zelularrari 

zein biomarkatzaileen erantzunei dagokionez, kutsadura kroniko horrek sorterazitako 

aldaketak norainoko eragina izan dezaketen esagutzea. 


73


74

Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean 

Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean 

jarritako muskuiluen liseri-guruinean 

Laburpena: Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-epitelioa bi zelula-motez osaturik dago, 

liseri-zelula eta zelula basofilikoa. Egoera normaletan liseri-zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak 

dira, baina kutsatzaileen eraginez zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren emendioa deskribatu da. 

Alterazio horri, zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type replacement) deritzo. 

Autometalografia (AMG), metalak zeluletan lokalizatzearen bidez metal kutsatzaileen ingurune-mailak 

ebaluatzeko erabiltzen den teknika histokimiko sentikorra da, metalak zilarrezko hauspeakin beltz (BSD; 

ingeleraz, black silver deposits) gisa liseri-zelulen lisosometan agertzen direlarik. Ikerlan honen helburuak 

hiru dira. Lehenik, Cd moduko kutsatzaileek CTR eragin dezakeenentz jakitea. Bigarrenik, AMGz 

errebelatutako Cd-ren kokapena zelula-espezifikoa den ultrastruktura-mailan egiaztatzea eta, horrela 

balitz, AMGren bidez egindako estimazioen gain CTRk zer nolako eragina duen ezagutzea. Azkenik, CTR 

gerta dadin kutsatzaile desberdinen zein kontzentrazio beharrezkoak diren eta prozesua itzulgarria den 

finkatzea. Helburu horiek lortzeko, muskuiluak kutsatzaile organiko eta ez-organikoen kontzentrazio pean 

eta denbora-tarte desberdinetan mantendu dira laborategiko bost esperimentu osagarritan. CTR 

kuantifikatzeko, liseri-guruinaren parafinazko ebakietan zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa 

(Vv BAS ) estimatu da estereologiaren bidez. Era berean, BSDen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) irudi- 

analisia erabiliz kalkulatu da. Horrela, Cd-k CTR eragiten duela demostratu dugu. Bestalde, BSD liserizelulen 

lisosomen barruan eta beren mintzaren inguruan lokalizatu dira espezifikoki, eta inoiz ez zelula 

basofilikoetan. BSD, metal espezifikoak ez diren arren, S-ri asoziatutako Cd ioien inguruan eratuak direla 

X izpien mikroanalisia eta mapaketen bidez erakutsi dugu. Lokalizazio zelula-espezifiko horren ondorioz, 

CTRk Vv BSD balioen gainean eragina duela frogatu dugu, ingurumen-metalen bioeskuragarritasunaren 

estimazioak egiterakoan arazoak ekar litzakeena. Bestetik, kutsatzaile organiko, ez-organiko zein beraien 

nahasketek CTR eragin dezaketela ikusi dugu, kutsatzaile desberdinen kontzentrazio eraginkorra 

desberdina den arren. 

Gako-hitzak: zelula-moten ordezkapena, autometalografia, kadmioa, benzo(a)pirenoa, X izpien 

mikroanalisia, muskuilua, liseri-guruina. 

77

Emaitzak eta eztabaida 

Cell-type replacement in the digestive gland of mussels exposed to 

pollutants 

Abstract: The digestive gland epithelium of the mussel Mytilus galloprovincialis (Lmk) is comprised of 

two cell types, namely digestive and basophilic cells. Under normal circumstances digestive cells 

outnumber basophilic cells but under the influence of pollutants a relative increase in the proportion of 

basophilic cells has been described. This alteration has been termed cell-type replacement (CTR). 

Autometallography (AMG) is a sensitive histochemical technique to localize metals in cells as black silver 

deposits (BSD) and has been used in the assessment of environmental metal pollution. BSD are localized 

in the digestive cells lysosomes. The objectives of this work are three. First, to know whether pollutants such 

as Cd were able to induce CTR. Second, to check wether Cd localization revealed by AMG at the 

ultrastructural level were cell-specific and, if so, to determine wether CTR influenced the estimations made 

by AMG. Finally, to determine the effective concentration of various pollutants to provoke CTR and to check 

wether CTR is reversible. For these purposes mussels were exposed to different concentrations of organic 

and inorganic pollutants at various exposure-times in five complementary laboratory experiments. In order 

to quantify CTR, volume density of basophilic cells (Vv BAS ) was estimated on hematoxylin-eosin stained 

sections by means of stereology. Similarly, the volume density of BSD (Vv BSD ) was calculated with the aid 

of an image analysis. Results revealed that Cd provoked CTR. On the other hand, while BSD were 

specifically localized within digestive cells lysosomes, basophilic cells were devoid of BSD. X-ray 

microprobe analisys and X-ray mapping demonstrated that although BSD are not metal specific they were 

mainly formed around the Cd associated to S atoms. Due to this specific localization, CTR influences 

Vv BSD values, and therefore when environmental bioavailable metal levels are estimated this must be 

taken into account. On the other hand, organic and inorganic pollutants or their mixtures can provoke CTR 

although critical concentrations may change. 

Key Words cell-type replacement, autometallography, cadmium, benzo(a)pyrene, X-ray microanalysis, 

mussel, digestive gland. 

78


Sustitución de tipos celulares en la glándula digestiva de mejillones 

expuestos a contaminantes 

Resumen: El epitelio de la glándula digestiva del mejillón Mytilus galloprovincialis (Lmk) está 

constituido por dos tipos celulares, denominados célula digestiva y célula basófila, respectivamente. En 

circunstancias normales las células digestivas son más numerosas que las basófilas pero bajo la influencia 

de contaminantes se ha descrito un aumento en la proporción relativa de células basófílas. Ésta alteración 

ha sido denominada sustitución de tipos celulares (CTR; del inglés, cell-type replacement). La 

autometalografía (AMG) es una técnica histoquímica sensible que mediante la localización de metales en 

las células ha sido utilizada en la evaluación de la contaminación metálica del medio ambiente detectando 

los metales como depósitos negros de plata (BSD; del inglés, black silver deposits) en los lisosomas de las 

células digestivas. El presente estudio tiene tres objetivos. Primero, saber si contaminantes como el Cd son 

capaces de provocar CTR. Segundo, determinar si el Cd revelado mediante AMGa nivel ultrastructural se 

localiza específicamente en un tipo celular, y si así fuera, conocer si CTR tiene alguna influencia en las 

estimaciones hechas sobre los datos obtenidos mediante AMG. Finalmente, establecer las 

concentraciones necesarias por diferentes contaminantes para provocar CTR y determinar si CTR es un 

proceso reversible. Para cumplir estos objetivos se han diseñado cinco experimentos de laboratorio 

complementarios en los que se han expuesto mejillones a diferentes concentraciones durante diferentes 

periodos de tiempo a contaminantes orgánicos e inorgánicos. Para cuantificar CTR se ha estimado la 

densidad volumetrica de células basofílicas (Vv BAS ) en cortes de parafina mediante esterología. Del 

mismo modo, se ha calculado la densidad volumétrica de BSD (Vv BSD ) mediante análisis de imagen. Los 

resultados demuestran que el Cd provoca CTR. Por otro lado, mientras los BSD se localizan asociados a 

la membrana de los lisosomas de las células digestivas, las células basofílicas no muestran BSD. Mediante 

el empleo de microanálisis y mapeo de rayos X se ha demostrado que aunque los BSD no son específicos 

para cada tipo de metal, éstos se forman mayormente alrededor de los átomos de Cd asociados a S. 

Debido a esta localización específica, CTR influye sobre los valores de Vv BSD y por lo tanto puede crear 

problemas al estimar la biodisponibilidad metálica en el medio ambiente. Por otro lado, los contaminantes 

orgánicos, inorgánicos y la mezcla de éstos provocan CTR aunque las concentraciones efectivas son 

diferentes en cada caso. 

Palabras clave: sustitución de tipos celulares, autometalografía, cadmio, benzo(a)pireno, microanálisis de 

rayos X, mejillón, glándula digestiva. 

79


80

SARRERA 

Muskuiluen liseri-guruinaren epitelioa bi zelula- 

motez osaturik dago: liseri-zelulak eta zelula 

basofilikoak (Morton, 1983). Liseri-zelulek oso 

sistema endo-lisosomiko garatua dute, eta batez 

ere barne-liseriketaz arduratzen diren arren, 

kutsatzaileen metaketan eta detoxifikazioan ere 

parte har dezakete (Viarengo, 1989; Cajaraville et 

al., 1995). Zelula basofilikoek duten funtzioa 

momentuz argitzeke dago, baina liseriketa 

estrazelularrean parte har dezakete, horretarako 

beharrezkoak diren entzimak sortu eta jariatzen 

dituztelarik. Izan ere, beraien erretikulu 

endoplasmatiko pikortsua oso garatua dago, eta 

horrek beren basofilia bereizgarria emango lieke 

(Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1998; 

Dimitriadis et al,. 2004). Egoera normaletan liseri- 

zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak dira; 

baina inguruneko estres-iturri desberdinek, 

kutsatzaileek sortutako estresak barne, 

epitelioaren osaketan aldaketak sortarazi ditzakete, 

zelula basofilikoen proportzio erlatiboa emendatuz 

(Thompson et al.,1974; Rasmussen et al., 1983; 

Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990a; 

Syasina et al., 1997; Marigómez et al., 1998). 

Estresak induzitutako alterazio hori, zelula-moten 

ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type 

replacement) izenaz ezagutzen dena, liseri-zelulen 

galerak, zelula basofilikoen proliferazioak edo bi 

prozesu horien konbinaketak sortarazia izan 

daitekeela proposatu da (Marigómez et al., 1990a). 

Muskuiluen kasuan, N-nitroso konposatuek 

(Rasmussen et al., 1983), eta petrolioen eta olio 


lubrifikatzailearen uretan egokitutako frakzioak 

(WAF; ingeleraz, water accomodated fraction; 

Cajaraville et al., 1990a) CTR induzi dezakete. 

Halaber, zelai-ikerketen arabera, metal-kutsadura 

duten lekuetako moluskuen liseri-guruinean ere 

CTR behatu da (Soto & Marigómez,1997a; Syasina 

et al., 1997). 

Zenbait metalek (Cd, Cu, Zn) eta konposatu 

organikok (benzo(a)pirenoa -BaP-), zein beren 

nahasketek CTR eragin dezaketen zehaztea dugu 

ikerlan honen lehengo helburu. Gainera, 

kutsatzaile bakoitzaren kontzentrazio eraginkorra 

zein den ere finkatu nahi dugu. Bestalde, CTR 

prozesuaren mekanismoak ezagutzeko nahian, 

estres-iturria eten ondoren prozesua itzulgarria 

denentz jakitea ere planteatu dugu. Azkenik, CTR 

pairatu duten muskuiluek (adb., zelaian leku 

kutsatuan jasotakoak) laborategian berriro metalen 

pean jarriz gero, CTRri dagokion 

erantzunkortasuna ere aztertu nahi izan dugu. 

Ingurumen-toxikologian, metal kutsatzaileen 

maila bioeskuragarrien (esposizioa) zein beren 

efektu biologikoak neurtzeko biomarkatzaileak 

deritzen neurketak aplikatu ohi dira (Cajaraville et 

al., 2000). Esposizio-biomarkatzaileen artean, 

zeluletan metatutako metalak kuantifikatzeko oso 

sentikorra den autometalografia (AMG) izeneko 

teknika histokimikoa dugu. Teknika horren 

ezaugarri nagusia, duen izugarrizko sentikortasuna 

da, seinale ikuskorra emateko hamar atomo 

katalitikoren presentzia nahikoa izan daitekeelarik 

(Danscher, 1984). Beraz, moluskuen ehunetan 

metalak argi-mikroskopioan lokalizatzeko nahiko 

erabilia izan da. AMG aplikatu ondoren, Cu, Zn, Hg 

81


eta Cd moduko metalak zilarrezko hauspeakin beltz 

(BSD; ingeleraz, black silver deposits) moduan 

agertzen dira markaturik, batez ere liseri-zelulen 

lisosometan (Hemelraad & Herwig, 1988; Herwig et 

al., 1989; Soto et al., 1996a; 1996b; Soto & 

Marigómez, 1997a; 1997b; Domouhtsidou & 

Dimitriadis, 2000; Marigómez et al., 2002). 

Tamalez, teknika hau oso sentikorra den arren, ez 

da batere espezifikoa, metal ezberdinak banan- 

banan ezin baitira identifikatu. Beraz, BSDen 

presentzia ezin da metal jakin baten kokapenarekin 

erlazionatu. Testuinguru honetan, Cd pean 

mantendutako animalietan BSDak espezifikoki Cd 

ioien inguruan sortzen direla frogatu nahi izan dugu, 

elektroi-zunden mikroanalisi (EPMA; ingeleraz, 

electron probe microanalysis) moduko teknika 

mikroskopiko osagarriak AMGrekin batera erabiliz. 

AMG ez bezala, EPMA oso teknika espezifikoa da, 

zelulen osaketa elemental zehatza 

karakterizatzeko erabilia izan dena (Marigómez et 

al., 1990a; Morgan & Morgan, 1998; Dimitriadis & 

Papadaki, 2004). Aldi berean, EPMAren emaitzak, 

Ag eta Cd moduko metal-ioiak kolokalizatzeko oso 

teknika egokia den X izpien mapaketaren bidez 

(Morgan & Morgan, 1998) baieztatzea planteatu 

dugu. 

Bestalde, AMG argi-mikroskopioan aplikatzean 

metalak identifikatu ezin baditugu ere, 

errebelatutako BSD-hedapena metatutako metalen 

mailaren arabera emenda daiteke, bere 

kuantifikazioak metal bioeskuragarrien maila 

adieraz dezakeelarik (Soto & Marigómez, 1997b). 

Izan ere, liseri-lisosometako BSD-hedapena irudi- 

analisi bitartez kuantifikatuz, BSDen dentsitate 

82 

bolumetrikoa (Vv BSD ) deritzon parametroa kalkula 

daiteke. Vv BSD metal-esposizioaren 

biomarkatzaile egokia da, zenbait espezie 

desberdinetan ikusi denez (Soto & Marigómez, 

1997a, 1997b; Da Ros et al., 2000; Porte et al., 

2001). 

Hala ere, biomarkatzaile horren aplikazioari 

dagokionez, CTR fenomenoa aintzakotzat hartu 

beharrekoa da, metala metatzen duten liseri-zelulak 

zelula basofilikoz ordezkatuak baitira, metalak 

metatzeko liseri-guruinak duen gaitasuna aldarazita 

suertatu daitekeelarik (Soto & Marigómez, 1997b; 

Marigómez et al., 2002). Izan ere, metalak metatuz 

doazen heinean, Vv BSD balioek ez dute zertan 

gora egin behar; metala metatzen ez duten zelula 

basofilikoak, liseri-zelulak baino ugariak bilaka 

baitaitezke. Hots, atalase batetik aurrera metalen 

pean jarritako muskuiluetan liseri-epitelioan ematen 

den metaleen metaketa zelula-moten 

proportzioaren arabera alda liteke (Marigómez et 

al., 1990b; 1998). Hori dela eta, Vv BSD moduko 

biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina 

izan dezaken jakitea dugu azken helburu. 

Sarrera honetan aipatutako helburuak 

erdiesteko, bost esperimentu desberdin diseinatu 

ditugu. Guztietan Mytilus galloprovincialis 

muskuiluak laborategiko baldintzen pean 

kutsatzaile desberdinez tratatu dira, denbora tarte 

eta kontzentrazio desberdinetan. Lehenengo 

esperimentuan, Plentziatik hartutako muskuiluak 

CTR induzi lezaken Cd kontzentrazio pean 

mantendu ziren 21 egunez, eta Vv BAS eta Vv BSD 

denbora tarte desberdinetan kalkulatu ziren. 

Halaber, Cd-aren lokalizazio ultrastrukturala eta

BSDen azterketa elementala burutu ziren, Cd-aren 

lokalizazioa zelula-espezifikoa dela ikertzeko 

asmoz. Bigarrenean, Plentziako muskuiluak, CTR 

induzitzen ez duten Cd kontzentrazioak aurkitu 

nahian, Cd kontzentrazio baxuago pean mantendu 

ziren, eta Vv BAS zein Vv BSD kalkulatu ziren. 

Hirugarren esperimentuan, Cu, Cd eta Zn bidezko 

tratamenduen arteko konparaketari ekin zitzaion, 

hiru metalen CTR induzitzeko gaitasuna eta 

Vv BSD balioen gaineko eragina alderatuz. Halaber 

esperimentu honetan, muskuiluak hiru metal 

horiekin 7 egunez tratatu ondoren, CTR itzulgarria 

den jakiteko asmoz, 14 eguneko arazketa-aldia 

aplikatu zen. Laugarren esperimentuan, Plentziako 

muskuiluak, Benzo(a)pireno (BaP) eta Cd + BaP 

pean mantendu ziren 21 egunez, kutsatzaile-mota 

desberdinen arteko elkarrekintzak CTRren gainean 

daukan eragina aztertzeko asmoz. Azkenik, 

bosgarren esperimentuan, aldez aurretik 

estresatutako muskuiluak (Zn-ez kutsatuak, 

Meñakozetik hartuak), laborategira ekarri eta Cd 

kontzentrazio desberdinen pean mantendu ziren 41 

egunez, esposizio esperimentalak CTR areago 

dezakeenentz ikertzeko. 

MATERIAL ETA METODOAK 

Erreaktibo kimikoak 

Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila 

analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis, 

Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkatal- 

etxekoak dira besterik agertu ezean. 


Prozedura esperimentala 

Bestelakorik esan ezean esperimentuetan 

erabilitako muskuilu (Mytilus galloprovincialis Lmk) 

mareartekoak, Plentzian (Bizkaia) (46º 26Í, 2º 

55´M) hartu eta berehala laborategira garraiatu 

ziren. Bertan, muskuiluak, argi ultramore bidez 

esterilizatutako eta karbono aktiboz zein beirazko 

zuntzetan zehar iragazitako itsas-uretan mantendu 

ziren 7 egunez, tenperatura egonkorrean (15- 

16ºC). Muskuiluak baraurik mantendu ziren, 

laborategiko egoerara ohitu egin zitezen, eta 

urdailean zeuzkaten hondakinak hustu zitzaten, 

kutsatzaile peko tratamenduak hasi aurretik 

(moldarazte-tartea). Muskuiluak, esperimentuak 

iraun bitartean, fotoperiodo natural pean mantendu 

ziren, eta ornogabe itsastarrentzako jaki 

komertzialez (Marine Invertebrate Diet, Carolina, 

Burlington, North Carolina, Amerikako Estatu 

Batuak) elikatu ziren. Etengabeko aireztapena 

aplikatu zen, eta ura egunero aldatu zen. 

Lehenengo esperimentua 

1998.eko apirilean hartutako muskuiluak, 

laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 80 µg 

Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan 

gehitua) zuen itsas-uretan mantendu ziren 21 

egunez. Aldi berean, Cd gehitu gabeko kontrol 

serie bat ere burutu zen. Azterketa histologiko, 

autometalografia eta mikoanalisirako laginak 1., 7. 

eta 21. egunetan jaso ziren; absortzio atomikozko 

espektrofotometriarako laginak, ordea, bakarrik 18. 

egunean. 

83


Bigarren esperimentua 

1999.eko martxoan hartutako muskuiluak, 


Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan gehitua) 

zuen itsas-uretan mantendu ziren 7 egunez. Aldi 

berean, Cd gehitu gabeko kontrol serie bat ere 

burutu zen. Azterketa histologikoetarako laginak 1. 

eta 7. egunetan jaso ziren. 

Hirugarren esperimentua 

1999.eko martxoan hartutako muskuiluak 


Cd/l, 10 µg Cu/l zein 10 µg Zn/l-ko kontzentrazioa 

(Cd eta Zn kloruro, Cu sulfato moduan gehituak 

izanik) zuen itsas-uretan 7 egunez tratatu ziren 

(esposizio-taldeak), azkenik 14 egunez ur garbitan 

mantendu zirelarik (arazketa-taldeak). Aldi berean, 

metalik gehitu gabeko kontrol serieak ere burutu 

ziren. Azterketa histologikoak eta autometalografia 

egiteko laginak 1. orduan, eta 1. eta 7. egunetan 

hartu ziren, baita 14 eguneko arazketa-aldiaren 

ostean ere (21. eguna). Absortzio atomikozko 

espektrofotometriaren bidez metal-maila tisularrak 

neurtzeko laginak 1. orduan, eta 1., 7. eta 21. 

egunetan hartu ziren. 

Laugarren esperimentua 

1998.eko apirilean hartutako muskuiluak, 

laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 21 egunez 

tratamendu desberdinak aplikatu zitzaien: (a) 500 

µg Benzo(a)pireno/l-ko kontzentrazioa zuen itsas- 

uretan (BaP talde esperimentala); (b) 80 µg Cd/l 

(kloruro moduan) eta 500 µg BaP/l batera zituen 

itsas-uretan (Cd + BaP talde esperimentala); eta (c) 

84 

uretan disolbagarria izateko, BaP-a dimetil 

sulfoxidotan (DMSO) disolbatu zenez, 500 µg 

DMSO/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-uretan 

mantendu ziren (DMSO kontrola). Aldi berean, Cd- 

rik, BaP-rik zein DMSO-rik gehitu gabeko kontrol 

serie bat ere burutu zen (Itsas-ur kontrola). 

Azterketa histologikoak eta autometalografia 

egiteko laginak esperimentuaren 1., 7. eta 21. 

egunetan jaso ziren. Absortzio atomikozko 

espektrofotometriaren bidez metal-maila tisularrak 

neurtzeko laginak 18. egunean hartu ziren. 

Bosgarren esperimentua 

Meñakozen (43º 24Í, 2º 93´M) 1989.eko 

martxoan hartutako muskuiluak laborategiko 

baldintzei moldatu eta gero, 10 µg Cd/l eta 80 µg 

Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan) zuen 

itsas-uretan 41 egunez mantendu ziren. Aldi 

berean, Cd-rik gehitu gabeko kontrol serie bat ere 

burutu zen. Azterketa histologikoak eta 

autometalografia egiteko laginak, 1., 7., 21., 27. eta 

41, egunetan hartu ziren. 

Analisi kimikoak 

Disekzionatu eta gero, lehenengo, hirugarren 

eta laugarren esperimentuko liseri-guruinak ur 

distilatuan garbitu ziren, eta 120ºC-tara 48 orduz 

labean berotu ziren, guztiz lehortu arte. Lehortutako 

materiala almerizaren laguntzaz txikitu zen, eta 

azido nitriko kontzentratuan liseritu zen. Ondoren, 

azido nitriko kontzentratua plaka beroan lurrundu 

ostean, liseritutako materiala ur distilatuan 

diluitutako 0.1 M azido nitrikoan berresekitu zen. 

Laginak iragazi ondoren, absortzio atomikozko

espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley, 

Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu 

ziren. Lehenengo eta laugarren esperimentuetan 

Cd kontzentrazioak, µg Cd/g ehun pisu lehor 

modura kalkulatu ziren. Hirugarren esperimentuan, 

ordea, metal/maskor-pisua indizeak kalkulatu ziren 

(Soto et al., 1995). Erabilitako estandarrak Merck 

(Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, 

Amerikako Estatu Batuak) merkatal-etxeak 

zertifikatutakoak izan ziren. 

Gertakuntza histologikoa 

Liseri-guruinaren zati txikiak (10 talde 

esperimentaleko) Carnoy fixatzailean fixatu ziren 

4ºC-tan ordu batez (Martoja & Martoja-Pierson, 

1970). Laginak goranzko graduazioko etanoletan 

deshidratatu ziren, metilo bentzoatoan aklaratu 

ziren eta bentzenozko bi bainutan murgildu eta 

gero, parafinan (60ºC) inkluditu ziren. Ebaki 

histologikoak (7 µm) Leitz 1512 eta American 

Optical mikrotomoetan lortu ziren. Liseri-guruinaren 

beste zati txiki batzuk, %2.5 glutaraldehidoa zuen 

kakodilato indargetzailean (0.1 M, pH = 7.2) fixatu 

ziren 4ºC-tan 2 orduz. Gerora, indargetzailean 

garbitu, goranzko graduazioko etanoletan 

deshidratatu eta, azkenik, Epon 812 erretxinan 

inkluditu ziren. Ebaki semifinak (1-3 µm) Leica 

Ultracut (UCT) ultramikrotomoan lortu ziren. 

Autometalografia (argi-mikroskopia) 

Parafinazko ebakiak xilolezko bainuetan 

desparafinatu ostean, beheranzko graduazioko 

etanoletan hidratatu ziren. Bai parafinazko zein 


erretxinazko ebaki semifinak labean (40ºC) 

mantendu ziren guztiz lehortu arte. 

Ondoren, laginak argazki-emultsio geruza fin 

eta uniformez estali ziren, gela ilunean (Ilford 

Nuclear Emulsion L4, Ilford, Mobberley, 

Ingalaterra). Gerora, laginak ilunpean mantendu 

ziren lehortu bitartean (30 minutu), eta 

errebelatzaile komertziala erabiliz errebelatu ziren. 

Parafinazko laginen kasuan, Ultrafin Tetenal SF 

(1:5 diluzioa ur distilatuan; (Tetenal AG & Co, 

Norderstedt, Alemania) errebelatzailea 15 minutuz 

aplikatu zen. Erretxinazko laginen kasuan, ordea, 

Kodak D-19 (Kodak, Paris, Frantzia) (%15 ur 

distilatuan) errebelatzailea, 30-45 minutuz aplikatu 

zen. Ondoren, errebelatzailearen erreakzioa %1 

azido azetikozko disoluzioan minutu batez 

murgilduz geldiarazi zen. Azkenik, Agefix (Agfa 

Agefix, Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 

uretan) fixatzaileaz 10 minutuz fixatu ziren. Laginak 

Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & Co., Inc, 

Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu 

Batuak) montatu ziren. Erretxinan inkluditutako 

ebakiak toluidina urdinez kontrastatu ziren. Metal- 

ioien presentzia, zilarrezko hauspeakin beltzen 

agerpenak adierazten du (Danscher, 1984; Soto et 

al., 1998b). 

Autometalografia (mikroskopio elektronikoa), 

EPMA eta X izpien mapaketa 

Beirazko portetan itsatsitako erretxinan 

inkluditutako 3 µm-ko ebaki semifinetan 

autometalografia aplikatu ondoren, Epon 812 

erretxinan inkluditu ziren berriro ere ebaki ultrafinak 

egiteko. Mikroskopioan behaketa ultrastruktural 

85


morfologikoak egiteko, ebaki ultrafinak kuprezko 

euskarrietan bildu ziren, eta uranilo azetatoz eta 

berun zitratoz kontrastatu ziren. 

Bestalde, mikroanalisia egiteko, ebaki semifinak 

aldez aurretik karbono/formvar-ez estalitako 

aluminiozko euskarrietan (200 mesh) bildu ziren, 

eta berriro ere karbonoz estali ziren. Mikroanalisia, 

energia dispertsibozko espektrometroa lotuta 

zeukan JEOL 1210 STEM mikroskopioan burutu 

zen (kontaketa-denbora = 100 segundu). Espektru- 

analisia egiteko Link ISIS 1.04A softwarea erabili 

zen (Morgan & Morgan, 1998). X izpien mapaketa 

sistema berean burutu zen, Ag (Lα1 -2.984 keV-, 

Lß1 -3.151 keV-), Cd (Lß1 -3.316 keV-) eta S (Kα - 

86 

2.308 keV-) elementuen seinaleak batera 

lokalizatzeko. 

BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan 

irudi-analisiaren bitartez 

Liseri-zelulen lisosometan zeuden BSDen 

hedapena irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen 

(Soto & Marigómez, 1997b), emaitzak BSDen 

dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argi- 

mikroskopiazko irudiak (x100 handipenean) B&W- 

CCD TV kamera, HR-TV kolorezko pantaila, Leitz 

mikroskopioa, PC ordenagailua, PIP 1024 (Matrox 

Electronic Systems Ltd., Dorval, Kanada) sistema 

eta Sevisan S.A. (Bilbo, Espainia) entrepresak 

1. Irudia: Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa Cd pean 21 egunez 

mantendu eta gero. (A) Parafinan inkluditutako materiala. Eskala-marra: 10 µm. (B) Erretxinan inkluditutako liseri-guruinaren ebaki 

semifina, toluidina urdinez kontrastatua. Gezi-buruek liseri-zelulen lisosometan dauden BSDak erakutsi dituzte, zelula basofilikoek 

(izarrak), ordea, ez dute BSDrik erakusten. Eskala-marra: 10 µm. (C) Erretxinan inkluditutako eta kontrastatutako ebaki ultrafina. 

Zelula basofilikoen zitoplasman (BC) ez da BSDrik ikusten, bai ordea, heterolisosometan (gezi-buruak). (N = nukleoa; HL = 

heterolisosoma; L = lumena). Eskala-marra: 1 µm.

garatutako softwarea erabiliz eskuratu ziren. 

Ondoren, eskuz eta softwarearen laguntzarekin 

liseri-zelulen lisosometako BSD eta zitoplasma 

bereizteko segmentazio-prozedura aplikatu zen. 

Neurketak muskuilu bakoitzean 5 eremutan burutu 

ziren, eta talde esperimental bakoitzean 10 

muskuilu erabili ziren; tratamendu bakoitzeko 

guztira 50 neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.- 

ek (1981) proposatutako formulak erabiliz egin 

ziren. Hau da, BSD partikulen tamaina ebakiaren 

lodiera baino txikiagoa zela kontuan hartuz, Holmes 

efektua zuzentzeko faktorea aplikatu zen. 

Zelula basofilikoen analisi estereologikoak 

Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm) Masson- 

Goldner trikromikoz (Martoja & Martoja-Pierson, 

1970) tindatu ziren, zelula basofilikoak argiro 

bereiztu ahal izateko. Ondoren, zelula basofilikoen 

dentsitate bolumetrikoa (Vv BAS ) estereologiaren 

bidez kalkulatu zen. Horretarako, Nikon Optiphot 

mikroskopioari erantsitako marrazketa-tutua erabili 

zen (bukaerako handipena = x670). Multipurpose 

test system M-168 Weibel gratikula erabiliz, zelula 


2. Irudia: Muskuilu kontroletan (zutabe zuria) zein 80 µg Cd /l 

kontzentrazio pean mantendutako (zutabe grisa) muskuiluetan 

kalkulatutako BSDen eta zelula basofilikoen dentsitate 

bolumetrikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen 

dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelula 

basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek 

desbidazio estandarra adierazten dute. Goialdeko asteriskoek 

taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazten dituzte 

(p


basofiliko eta liseri-zelulen gainean ezarritako 

puntuak zenbatu ziren, Vv BAS Delesse 

printzipioaren arabera kalkulatuz (Weibel, 1979). 

Neurketak elkarrengandik urruti (gutxienez 45 µm) 

zeuden 2 ebakietan egin ziren, ebaki bakoitzean 

sigi-saga eginez azarez aukeratutako 5 eremutan, 

hain zuzen. Guztira, talde bakoitzean 100 

zenbaketa egin ziren. 

Estatistika 

Emaitzak estatistikoki aztertzeko SPSS/PC+ 

(SPSS Inc., Microsoft Co.) pakete estatistikoa 

erabili zen. Konfidantza-tarteak Student t testa 

erabiliz kalkulatu ziren, eta taldeen arteko 

desberdintasun estatistiko esangarriak p

egondakoetan, ordea, balioak nabarmenki igo ziren 

(2B eta 3. Ird.). Esperimentuko 1. egunean kontrol 

eta Cd-z trataturiko muskuiluen artean 

desberdintasun esangarririk behatu ez bazen ere, 

7. eta 21. egunetan gorakada esangarria aurkitu 

genuen Cd pean egondako muskuiluen kasuan. 

Autometalografiatutako ebaki ultrafinen gainean 

egindako X izpien mikroanalisiak, BSDetan Cd-a 

eta S-a, Ag-arekin batera zeudela erakutsi zuen (4. 

Ird.). Halaber, emaitz horiek X izpien mapaketaren 

bidez konfirmatu ziren (5. Ird.). Aitzitik, X izpien 

mapaketaren emaitzek ziotenez, Cd-a eta S-a liseri- 

zelulen nukleo zein zitosolean ere lokalizatu ziren, 

seinalea heterolisosometan baino ahulagoa izan 

arren, eta bertan Ag-aren seinalerik ez zegoen 

arren (5. Ird.) 

Bigarren esperimentua 

Vv BSD delakoaren emaitzek, 10 µg Cd/l pean 

mantendutako muskuiluen liseri-lisosometan 

metalen presentzia esperimentuko lehenengo 

egunetik kontrolenetakoetan baino nabarmen 

altuagoa zela erakutsi zuten, joera hori 

esperimentuan zehar mantendu zelarik (6A Ird.). 

Vv BAS balioei dagokienez, esperimentu osoan 

zehar ez zen desberdintasun esangarririk behatu 

Cd pean egondako muskuilu eta muskuilu kontrolen 

artean (6B Ird.). 

Hirugarren esperimentua 

Cd/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar 

ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cu zein 

Zn pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu 

batez Cd-z trataturiko muskuiluen indize hori 


5. Irudia: Cd pean mantendutako muskuiluetan AMG aplikatu 

ondoren, kadmio (Cd), zilar (Ag) eta sufrerako (S) X izpien 

distribuzio-mapak. Lau mikrografiak eremu mikroskopiko 

berean hartuak daude. Gezi-buruek zitosolaren hauspeakinak 

markatzen dituzte liseri-zelula baten heterolisosomen (HL) 

barnean. 

89


kontrolen berdina izan arren, 1 eta 7 egun ondoren 

kontrolarena baino esangarriki altuagoa suertatu 

zen. Arazketa-aldiak, bere aldetik, ez zuen 

Cd/maskor-pisua indizearen inolako beherakadarik 

ekarri; haatik, balioak 7 eguneko tratamendu ostean 

lortutakoak baino are altuagoak suertatu ziren (1. 

Taula). 

Cu/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar 

ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cd zein 

Zn pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu 

batez Cu-z trataturiko muskuiluen indize hori 

kontrolen berdina izan arren, 1 eta 7 egun ondoren 

6. Irudia: Muskuilu kontrol (zutabe zuria) zein 10 µgCd/l pean 

mantendutako (zutabe grisa) muskuiluak. (A) Irudi-analisi 

bitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseriguruineko 

zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. 

Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dute. 

Goialdeko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun 

esangarriak adierazi dute (p

esangarriki jaitsi ziren hiru metalen kasuan, berriro 

ere kontrolen mailara helduz (7A Ird.). 

Liseri-epitelioan zelula basofilikoen proportzio 

erlatiboa kuantifikatzeko erabilitako Vv BAS balioak 

ez ziren esperimentuan zehar aldatu muskuilu 

kontroletan, ezta Cd eta Cu pean mantendutako 

muskuiluetan ere (7B Ird.). Bestalde, 7 egunez Zn- 

az trataturiko muskuiluen liseri-epitelioan Vv BAS 

balioetan gorakada esangarria behatu zen, gerora, 

arazketa-aldiaren ostean kontrolen mailara jaitsi 

zena (7B Ird.). 

Laugarren esperimentua 

Analisi kimikoek, kadmioa BaP-z nahastuta 

egon arren (Cd + BaP taldea), liseri-guruinean Cd- 

a metatu zela erakutsi zuten. Muskuilu kontroletan 

(DMSO-z tratatutakoak) Cd-aren kontzentrazio 


1. Taula: AAS bidez neurtutako liseri-guruineko Cd, Cu eta Zn/maskor-pisua indizea, metal pean ordu batez eta 1, 7 eta 21 egunez 

mantendutako muskuiluetan eta muskuilu kontroletan. Asteriskoek kontrolekiko desberdintasun esangarriak adierazten dituzte 

p


balioen emendioa askoz nabarmenagoa izan zen 

BaP eta Cd + BaP tratamenduetako muskuiluetan 

(8B Ird.). 

Bosgarren esperimentua 

Esperimentuko 1. egunetik, Vv BSD balioak 80 

µg Cd/l kontzentrazio pean egondako muskuiluetan 

kontroletan baino nabarmenki altuagoa izan ziren. 

10 µg Cd/l kontzentrazio pean egondako 

muskuiluetan, berriz, astebete behar izan zen 

Vv BSD balioak kontrolenetatik esangarriki 

desberdinak izatera iristeko. Hala ere, Cd 

kontzentrazio handiaz lau astez trataturiko 

muskuiluetan, Vv BSD balioen behin behineko 

jaitsiera puntuala suertatu zen, 6 aste ostean berriro 

ere Vv BSD balio altuak neurtu zirelarik (9A Ird.). 

92 

Vv BAS balioei dagokienez, muskuilu kontrolek 

balio baxuak erakutsi zituzten esperimentuak iraun 

bitartean. Bestalde, Cd kontzentrazioaren 

menpekoa ez zen igoera esangarria behatu zen Cd 

pean mantendutako muskuiluen Vv BAS balioetan, 

1. astetik aurrera behintzat (9B Ird.). 

EZTABAIDA 

Kadmioak CTR eragin dezake 

Kutsatzaileek zein bestelako estres-iturriek 

muskuiluen liseri-guruinean aldaketak sortarazten 

dituztela ezaguna da; euren artean CTR izenekoa 

(Thompson et al., 1974; Rasmussen et al., 1983; 

Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b; 

Syasina et al., 1997; Marigómez et al., 1998). 

Ikerlan honetan, Cd-ak muskuiluen liseri-guruinean 

CTR prozesua bultza dezakeela baieztatu dugu. 

7. Irudia: Muskuilu kontroletan zein 10 µg/l 

Cd, Cu eta Zn pean jarritakoetan 

kalkulatutako parametro estereologikoak. (A) 

Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen 

dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko 

zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa. 

Segmentu bertikalek desbidazio estandarra 

adierazi dute. Goialdeko matrizetako 

asteriskoek taldeen arteko desberdintasun 

esangarriak adierazi dituzte (p

Laborategiko kontrol esperimentaletan Vv BAS 

balioak 0.05-0.1 µm 3 /µm 3 tartekoak diren 

bitartean, Cd pean egondakoetan 0.15-0.22 

µm 3 /µm 3 -koak izatera irits daitezke. 

Hala ere, eraginkortasun horren atalase kritikoa, 

desberdina da, muskuiluen jatorri eta baldintza 

esperimentalen arabera. Esaterako, Plentziako 

muskuiluetan, 80 µg Cd/l kontzentrazio pean 7 

egunez egotea Vv BAS -aren emendio esangarria 

sortzeko beharrezkoa den bitartean, aldez aurretik 

zelaian Zn-az kutsatutako Meñakozeko 

muskuiluetan laborategian 10 µg Cd/l kontzentrazio 

pean 7 egunez egotea nahikoa da Vv BAS 

emendatzeko. Aitzitik, 10 µg Cd/l kontzentrazio 

pean 7 egunez egoteak Vv BAS balioaren igoerarik 

ez zien ekarri Plentziako muskuiluei. 

Zelula-moten ordezkapen honen arrazoia 

momentuz ezagutzen ez bada ere, autore batzuen 

arabera, kutsaduraren aurkako babes-mekanismoa 

izango litzateke. Alde batetik, zelula basofilikoen 

emendioa, detoxifikazio-prozesuak eragindako 

liseri-zelulen andeakuntzari aurre egiteko 

erantzuna izango litzatekeela proposatu da, zelula 

basofilikoak liseri-epitelioaren berriztapenaz 

arduradunak direla suposatuz (Mix & Sparks, 1971; 

Thompson et al., 1974). Bestalde, kutsatzaile 

organikoen kasuan batik bat, zelula basofilikoek 

aktiboki detoxifikazioan parte hartzen dutenez, 

euren presentzia areagotzea, detoxifikazio- 

prozesuaren ondorioa izan liteke (Widdows, 1984; 

Cajaraville et al., 1990a; Triebskorn & Künast, 

1990). Halaber, Widdows et al.-ek (1984), 

kutsatzaileen aurrean zelula basofilikoen 

kopuruaren gorakada, arazketa-aldiko eskakizun 


energetiko gehigarriari erantzuteko beharrezkoak 

diren entzimen jariapen areagotuarekin erlaziona 

litekeela iradoki zuten. Azkenik, zelula basofilikoen 

emendioa itxurazkoa baino ez dela, eta kutsatzaile 

pean egoteak liseri-zelulen galera ekarri izanaren 

ondorioz zelula basofilikoak nagusitzen direla ere 

proposatu egin da (Marigómez et al., 1990b). 

Izatez, hiru alternatiba horien artean Vv BAS -en 

emendioa zeinek azal dezaken argitzea tesi honen 

helburuetako bat da, geroko kapituluetan jorratuko 

den bezala. 

Metalen metaketa zelula-espezifikoa 

CTR eragiteak, liseri-epitelioko metaketa- 

gaitasunean aldaketa garrantzitsuak sor ditzake. 

Izan ere, zelula-mota desberdinek, kutsatzaileak 

metatzeko gaitasun ezberdina eduki dezakete 

(Marigómez et al., 2002). Moluskuetan, BSD liseri- 

zelulen lisosometan agertu dira batez ere, eta 

beraz, zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren 

igoerak, metalak metatzeko konpartimentua 

murrizten duenez, metatzeko gaitasuna txikitzea 

ekar lezake (Marigómez et al., 1998). 

Ikerlan honetan, ere Cd pean egondako 

muskuiluetan, BSD espezifikoki liseri-zeluletako 

lisosometan agertu dira, argi-mikroskopian 

oinarritutako beste moluskuen espezietan zenbait 

ikerketek diotenarekin bat datorrena (Hemelraad & 

Herwig, 1988; Holwerda, 1991; Giamberini et al., 

1996; Marigómez et al., 1996; 2002; Soto et al., 

1996a, 1996b, Soto & Marigómez, 1997b). 

Lisosomen barruan metalak bahitzeak, metal horien 

toxizitatea jaisten lagunduko luke, behin-behinekoz 

behintzat. Gerora, metaletan joriak diren lisosomak 

93


liseri-dibertikuluen argira askatu eta ondoren 

gorotzekin batera kanporatuko lirateke (Ireland & 

Marigómez, 1992; Viarengo & Nott, 1993; 

Cajaraville et al., 1995; Langston et al., 1998; 

Marigómez et al., 2002). 

Hala ere, argi-mikroskopioaren bidez lortutako 

emaitz horiek ez dira maiz mikroskopia 

elektronikoaren bidez baieztatu, dakigunez. Izatez, 

AMGren aplikazioak maila ultrastrukturalean urriak 

dira (Domouhtsidou & Dimitriadis, 2000; Dimitriadis 

& Papadaki, 2004). 

8. Irudia: DMSO-kontrol taldeko (zutabe zuria) zein BaP 

(zutabe gris argia) eta Cd+BaP (zutabe gris iluna) pean 

mantendutako muskuiluetan kalkulatutako parametro 

estereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen 



desbidazio estandarra adierazi dute. Goialdeko asteriskoek 

taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte 

(p

Arazo horri erantzuna emateko asmoz, 

AMGrekin batera metal-espezifikoak diren X izpien 

mikroanalisia eta X izpien mapaketa izeneko 

teknikak (Morgan et al., 1997) aplikatu egin dira 

ikerlan honetan. 

X izpien mikroanalisiek erakutsi dutenez, Cd eta 

S-a kolokalizatuta agertu dira BSDetako Ag-arekin 

batera, X izpien mapaketaren bidez konfirmatu 

dena. Horrela, Ag-a Cd-aren inguruan, BSDak 

eratuz, nukleatu dela ikusi dugu. Bertan S ere 

egoteak seguruenik Cd-metalotioneina (Cd-MT) 

konplexuen presentziaren frogatzat har liteke, aldez 

aurretik proposatu den bezala (Soto et al. 1996a). 

MT-k metalen presentzian induzigarri eta S-tan 

aberatsak diren proteinak dira, aminoazido guztien 

%33-a zisteinak direlarik (Pavicic et al., 1991; Isani 

et al., 2000; Roesijadi, 1994; 2000). MT nukleoan, 

zein zitosolean eta lisosometan ager daitezke 

(Langston et al., 1998). 

Cd-z trataruriko magurioetan, AMGk liseri- 

epitelioan metatutako Cd-aren frakzio bat soilik 

erakutsi dezakeela proposatu da (Soto et al., 

1996b). Gure ikerlanak hipotesi hori sustatu du. 

Izan ere, X izpien mapaketen emaitzen arabera, 

Cd-a eta S-a liseri-zelulen lisosometatik kanpo, 

zitosolean zein nukleoan, kolokalizaturik leudeke, 

bertan BSDrik ez badago ere. Emaitz horiek Cd-MT 

konplexuen presentziarekin erlaziona daitezke. 

AMGk, lisosometako entzimek Cd-MT konplexua 

liseritu ondoren soilik Cd-a detektatuko lukeen 

bitartean, ezingo luke zitosoleko Cd-MT 

konplexuetan estuki loturik dagoen Cd-a errebelatu, 

Cd ioiak Ag-arekiko behar bezain eskuragarriak ez 

direlako. 


Ondorioz, Cd pean egondako muskuiluen liseri- 

zeluletan AMG bitartez Cd-a lokalizatu dugula esan 

genezake, Cd-aren frakzio osoaren zati bat baino 

ez bada ere, lisosometan Cd-MT konplexu 

liserituetakoa hain zuzen. Beraz, AMG bitartez 

errebelatutako Cd-aren frakzioa liseri-zeluletako 

lisosometan lokalizatu da espezifikoki. Horrek ez du 

esan nahi Cd-aren beste frakziorik ez dagoenik 

liseri-zelulen beste konpartimentuetan edo, zelula 

basofilikoetan ere; baina, behintzat, frakzio horiek 

ezin dira AMG bitartez lokalizatu. 

9. Irudia: Muskuilu kontroletan (puntu zuriak) eta Cd dosi bien 

pean (lerro grisa = 10 µg/l eta lerro beltza = 80 µg/l) 

mantendutako muskuiluetan kalkulatutako parametro 

estereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDen 



desbidazio estandarra adierazi dute. 

95


CTRk BSDen kuantifikazioaren gain duen 

eragina 

AMG bitartez errebelatutako lisosomen barneko 

BSDak, irudi-analisiaren bitartez kuantifika 

daitezke, horrela estimatutako Vv BSD parametroak 

ingurumeneko metal bioeskuragarrien mailak 

adierazi litzakeelarik (Soto & Marigómez, 1997b). 

BSD espezifikoki liseri-zeluletan eratzen direla 

aintzat hartuz gero, metal kutsatzaileek beraiek 

eragindako CTR moduko efektuek AMG bitartez 

estimatutako metalen ingurumen-mailen gainean 

eragina izan dezakete. Izan ere, Soto & Marigómez- 

ek (1997b), arazo horretaz jabetuta, Vv BAS eta 

Vv BSD batera aintzat hartzen zituen protokolo bat 

proposatu zuten metalen esposizio-mailak 

muskuiluen liseri-guruinean AMG aplikatuz 

estimatzeko. 

Ikerlan honetan, balizko eragin hori laborategiko 

esperimentuetan oinarrituta aztertu dugu. Horrela, 

Cd pean mantendutako muskuiluen kasuan, Vv BAS 

nabarmenki igotzerakoan, Vv BSD balioek 

beherantz egin edo, behintzat, ez zuten 

tratamenduaren ondorioz gorantzago egin. 

Esaterako, muskuiluak 80 µg/l-ko Cd 

kontzentrazioaz tratatzean Vv BSD balio altuenak 1. 

egunean lortu ziren (1. esperimentua), eta denbora 

aurrera joan ahala Vv BSD balioak mantendu edo 

jaitsi egin ziren, Vv BAS balioen gorakadarekin 

batera. Halaber, BaP eta Cd + BaP tratamenduen 

ondorioz erantzun berbera ikusi dugu (4. 

esperimentua), eta baita 10 µg/l-ko Zn 

kontzentrazio pean 1 eta 7 egunez mantendutako 

muskuiluen kasuan ere. Zn-aren kasuan, ordea, 

CTR esperimentuko 7. egunean ageri zen. Bertan, 

96 

1. egunean Zn kontzentrazio tisularra eta Vv BSD 

altuak izan ziren bitartean, 7. egunean jaitsi egin 

ziren, Vv BAS gorakadarekin batera. 

Gainera, muskuiluak CTR induzitzen ez duten 

Cd eta Cu kontzentrazio baxuez tratatzerakoan 

Vv BSD balioen dinamikan ez da erregistratu 

aldaketarik esperimentuan zehar (2. eta 3. 

esperimentuak). Izan ere, 10 µg Cd/l 

kontzentrazioz trataturiko bigarren esperimentuko 

muskuiluetan, Vv BSD esangarriki igo zen bitartean, 

Vv BAS ez zen aldatu. 

Bestalde, Cd pean egon ostean 14 eguneko 

arazketa-aldiak, Cd kontzentrazio tisularraren 

igoera sortarazi zuen liseri-guruinean, aldi berean 

Vv BSD jaitsi zen arren. Itxuraz zentzu gutxiko 

aldaketa horiek, liseri-epitelioaren zein ondoko 

ehunen osaketa zelularraren aldaketekin erlaziona 

litezke. Alde batetik, liseri-epitelioaz gain inguruko 

ehun konektiboan eta hemozitoetan ere meta 

daiteke kadmioa (Soto et al., 1996a), eta Vv BSD 

balioek liseri-lisosometan dauden BSDei soilik 

dagozkie. Izan ere, Vv BSD balioak kalkulatzeko, 

beste zeluletan dauden BSD zein AMGk errebelatu 

ez dituen metalak ez dira kontuan hartu, AAS 

aplikatzean, berriz, metal frakzio guztiak batera 

barneratzen dira. Gainera, liseri-lisosometan 

metatutako Cd-a liseri-dibertikuluen argira 

kanporatzen da, ondoren gorotzekin batera 

eliminatua izateko (Marigómez et al., 2002). 

Hondakin horiek BSDetan joriak dira, eta irudi- 

analisi bitartez ez dira kuantifikatu; analisi 

kimikoetan, ordea, hondakin horiek daramaten 

metala ere neurtu den bitartean.

Ondorioz, metal-esposizioaren adierazleak 

diren analisi kimiko zein AMG bidez lortutako 

parametroen gain eragin esanguratsua du CTRk, 

laborategiko esperimentuko metal pean egondako 

muskuiluen kasuan behintzat, aldez aurretik zelai- 

ikerketan oinarrituz proposatu zenarekin bat 

datorrena (Soto & Marigómez, 1997b). 

CTR eragin lezaketen kutsatzaileen maila 

kritikoak 

Vv BSD zein beste biomarkatzaileen gainean 

izan dezaken eragina kontuan hartuz, molusku 

espezie desberdinetan CTR fenomenoa gerta dadin 

beharrezkoak diren kutsatzaile desberdinen 

kontzentrazio kritikoak ezagutzea komeni da. 

Ikerlan honetan, 80 µg Cd/l, 10 µg Zn/l, 500 µg 

DMSO/l eta 500 µg BaP/l-ko dosiek CTR eragin 

dezaketela ondorioztatu dugu, beti ere denbora- 

tarte desberdinetan kutsatzailearen arabera. 

Halaber, 0.25 mg N-metil-N-nitro-N-nitroso- 

guanidinaz 15 egunez zein fuel olioaren %6 WAFez 

35 egunez tratatutako muskuiluetan eta 1.25 mg 

Cd/l-z 17 egunez tratatutako magurioetan CTR 

fenomenoa ere gertatu da (Rasmussen et al., 1983; 

Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b). 

Behe-atalasearen bila, 3. esperimentuan 

muskuiluak Cd, Cu eta Zn dosi baxuz tratatu ziren. 

Bigarren esperimentua egin ondoren, 10 µg Cd/l-ko 

kontzentrazioak 7 egunetan CTRrik eragin ez 

zuena bagenekienez, kontzentrazio esperimental 

hori aukeratu zen 3. esperimenturako. Bertan, 2. 

esperimentuaren emaitzak konfirmatu ziren, eta 

baita ere 10 µg Cu/l-ko kontzentrazioak ez zuela 


CTRrik induzitzen. Zn-aren kasuan, ordea, 10 µg/l- 

ko dosiak CTR jadanik 7. egunean eragin dezake. 

Dosiaren menpeko erantzunak ere Cd pean 

egondako magurioetan behatu dira. Bertan, 20 

egunez 1.25 mg Cd/l kontzentrazioak liseri-epitelioa 

nagusiki zelula basofilikoz osatuta egotea sortarazi 

zuen bitartean, 500 µg Cd/l-ko kontzentrazioa ez 

zen horren eraginkorra suertatu (Marigómez et al., 

1990b). Hain Cd kontzentrazio handiak magurioen 

liseri-guruinean CTRrik ez eragiteak, espezien 

arteko sentikortasuna oso desberdina izan 

daitekeela utzi du agerian. 

CTRren itzulgarritasuna 

CTR fenomenoaren izaera eta beren 

biomarkatzaileen gaineko eragina behar bezala 

ulertzeko, prozesua itzulgarria denentz finkatzea 

ezinbestekoa iruditu zitzaigun. 

Arazketa-prozesuari dagokionez, Zn pean 

mantendutako muskuiluetan, CTR prozesua 

itzulgarria zela egiaztatu zen, behin estres-iturria 

desagertutakoan, liseri-epitelioaren zelulen 

proportzioa berriro ere bere hasierako balioetara 

itzuli baitzen. CTR fenomenoaren itzulgarritasuna 

ez da soilik muskuiluen kasuan ikusi; magurio eta 

bareen kasuetan ere estres-egoera jasan eta gero, 

zenbait egunez arazten utzitakoan, liseri-epitelioko 

zelulen proportzioa berriro ere hasierako egoerara 

itzul daitekeela frogatu da (4. eta 5. Kapituluak). 

CTRaren gainean eragina izan dezaketen 

faktoreak 

CTR fenomenoa noiz eta nola ematen den 

hobeto ulertzeko, bere gainean ingurumen-faktore 

97


desberdinek nolako eragina duten ezagutzea 

beharrezkoa zaigu. Faktore hauen artean, 

muskuiluen adina, itsasaldi-erregimena, urteko 

sasoia, kutsatzaileen arteko elkarrekintza eta aldez 

aurretik kutsatzaile pean egon izana ditugu, 

besteak beste. 

Urteko sasoiari dagokionez, udan Vv BAS 

neguan baino altuagoa da. Sasoiari lotutako 

aldaketa hori ziklo gonadalarekin erlazionatu da 

(Méndez, 1993). 

Kutsatzaileen arteko elkarrekintza ikertzeko 

asmoz, laugarren esperimentuan Cd-arekin batera 

muskuiluak BaP kutsatzaile organikoaren pean jarri 

ziren. Analisi kimikoek diotenez, kutsatzaileen 

nahasketa horrek ez zuen eraginik izan liseri- 

guruinak Cd-a metatzeko duen gaitasunean. 

Emaitza hori, beste ikerlan batzuekin bat dator. Izan 

ere, Cd eta alkilbentzeno sulfonatua kutsatzaile 

organikoaren artean ez da ere ez lehiaketa- 

mekanismorik aurkitu (Da Ros et al., 1995). Hala 

ere, BSDen emaitzek, BaP-k metalen mobilizazioa 

eragin dezakela erakutsi digute. Hau da, BaP 

taldeko muskuiluetan Vv BSD balioak esangarriki 

igo dira esperimentuko lehenengo egunetik. 

Beharbada, BaP-aren eraginez, metal esentzialak 

liseri-zelulen lisosometara mobilizatuak gerta 

litezke. 

Laugarren esperimentu honetan, Cd + BaP 

nahasketak CTR eragiten du, baita BaPk eta 

DMSOk (nahiz eta maila baxuagoan) ere. Cd + BaP 

nahasketak emandako Vv BAS balioak, Cd pean 

mantendutako muskuiluen antzekoak izan dira, 

beraz nahiz eta Cd-a eta BaP-a norberak bere 

98 

aldetik CTR eragin, bien nahasketak ez du erantzun 

gehigarririk ekarri. 

CTR fenomenoaren gainean eragina izan 

dezakeen beste faktoreetako bat, aldez aurretik 

estres-egoera batean egotea izan daiteke. 

Bosgarren esperimentuan, Zn-ez kutsatuta zegoen 

Meñakoz izeneko lekutik (Soto et al., 1995) hartu 

ziren muskuiluak. 7 egunez laborategian ur garbitan 

egon ondoren Plentziako muskuilu kontrolen 

Vv BSD eta Vv BAS balio antzekoak erakutsi 

zituzten. Izan ere, 3. esperimentuan CTR gutxienez 

14 egunetan itzulgarria dela ikusi denez, 7 

egunetan Vv BAS balioak berreskuratzea ez zaigu 

harrigarria gertatu. Gainera, kontrol gisa erabilitako 

muskuiluetan, balioak beste esperimentuen 

kontrolen maila baxuan mantendu ziren 5. 

esperimentuak iraun bitartean. Cd pean jarritako 

muskuiluetan, ordea, aurreneko esperimentuetan 

ez bezala, 10 µg Cd/l-ko kontzentrazioak CTR 

induzitu zuen. Muskuilu hauetan, aldez aurretik 

estres-egoera batean egon izanak, beraien liseri- 

guruineko Vv BAS Plentziako muskuiluetan baino 

errezago goratzea eragin zezakeen. Bestalde, bi 

Cd kontzentrazioen desberdinen pean 

mantendutako muskuiluetan Vv BSD balioen 

jeitsiera behatu zen, Vv BAS balioen aldaketekin 

sinkronian agertu ez ba ziren ere. Gainera, Vv BSD 

balioak Plentziako muskuiluetan (2. esperimentuko 

datuak) baino denbora gehiago behar izan zuten 

modu esangarrian igotzeko. Beraz, aldez-aurretik 

estres-egoera batean egon izanak, dirudienez, CTR 

erantzunaren nondik norakoak, zein metalen 

detoxifikazio-mekanismoak eta -dinamika afekta 

ditzake.

Ondorioak 

Ikerlan honetan lortutako emaitzek dioskutenez, 

muskuiluen liseri-guruinean CTR eragiteko gai da 

kadmioa. Bestalde, Cd-a ehunetan detektatzeko 

erabili den AMG bitartez errebelatutako BSDak, 

liseri-zelulen lisosometan espezifikoki lokalizatu 

dira. Hori dela eta, CTRk Vv BSD balioen gainean 

eragina dauka, metala metatzeko 

konpartimentuaren txikitzearen ondorioz. Bestalde, 

CTR gertatzeko beharrezkoa den kutsatzaile 

desberdinen kontzentrazio-atalaseak zehaztu dira, 

kutsatzaile eta espeziearen arabera desberdinak 

izanik. Halaber, estres-iturria etetean CTR 

itzulgarria izan daitekeela atzeman dugula 

azpimarratzekoa da. Azkenik, CTR prozesuaren 

gainean zenbait faktorek eragina eduki dezaketela 

ikusi dugu; kutsatzaileak nahasketetan agertzea eta 

muskuiluak aldez aurretik estres-egoeran egon 

izana, besteak beste. 

BIBLIOGRAFIA 

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E (1990a) 

Responses of basophilic cells of the digestive gland of 

mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat. 

Org. 9:221-228 

Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1990b) Short-term toxic 

effects of 1-naphthol on the digestive gland-gonad complex 

of the marine prosobranch Littorina littorea (L.): a light 

microscopic study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19:17- 

24 

Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995) 

Cellular biomarkers as useful tools in the biological monito- 

ring of pollution: molluscan digestive lysosomes. :29-55 orr. 

Non: Cell Biology in Environmental Toxicology. Cajaraville 

MP (ed.). University of the Basque Country Press Service. 

Bilbo. 

Cajaraville MP, Bebianno MJ, Blasco J, Porte C, Sarasquete C, 

Viarengo A (2000) The use of biomarkers to assess the 


impact of pollution in coastal environments of the Iberian 

Peninsula: a practical approach. Sci. Total Environ. 

247:295-311. 

Danscher G (1981) Histochemical demonstration of heavy 

metals. A revised version of the sulphide silver method sui- 

table for both light and electronmicroscopy. Histochemistry 

71:1-16. 

Danscher G (1984) Autometallography. A new technique for 

light and electron microscopic visualization of metals in bio- 

logical tissues (gold, silver, metal sulphides and metal sele- 

nides). Histochemistry 81:331-335. 

Da Ros L., Nasci C, Campesan G, Sartorello P, Stocco G, 

Menetto A (1995) Effects of linear alkylbenzene sulphona- 

te (LAS) and cadmium in the digestive gland of mussel, 

Mytilus sp. Mar. Environ. Res. 39:321-324. 

Da Ros L, Nasci C, Marigómez I, Soto M (2000) Biomarkers 

and trace metals in digestive gland of indigenous and 

transplanted mussels, Mytilus galloprovincialis, in Venice 

lagoon, Italy. Mar. Environ. Res. 50:417-423. 

Dimitriadis VK, Domouhtsidou GP, Cajaraville MP (2004) 

Cytochemical and histochemical aspects of the digestive 

gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in 

relation to function. J. Mol. Histol. 35:501-509. 

Dimitriadis VK, Papadaki M (2004) Field application of autome- 

tallography and X-ray microanalysis using the digestive 

gland of the common mussel. Ecotoxicol. Environ. Saf. 59: 

31-37. 

Domouhtsidou GP, Dimitriadis VK (2000) Ultrastructural locali- 

zation of heavy metals (Hg, Ag, Pb, and Cu) in gills and 

digestive gland of mussels, Mytilus galloprovincialis (L.). 

Arch. Environ. Contam. Toxicol. 38:472-478. 

Giamberini L, Auffret M, Pihan JC (1996) Hemocytes of the 

freshwater mussel, Dreissena polymorpha Pallas: cytology, 

cytochemistry and X-ray microanalysis. J. Moll. Stud. 62: 

367-379. 

Hemelraad J, Herwig HJ (1988) Cadmium kinetics in freshwa- 

ter clams. IV. Histochemical localization of cadmium in 

Anodonta cygnea and Anodonta anatina exposed to cad- 

mium chloride. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 17:337- 

343. 

Herwig HJ, Brands F, Kruitwagen E, Zandee DI (1989) 

Bioaccumulation and histochemical localization of cad- 

mium in Dreissena polymorpha exposed to cadmium chlo- 

ride. Aquat. Toxicol. 15:269-286. 

Holwerda DA (1991) Cadmium kinetics in freshwater clams. V. 

Cadmium-copper interaction in metal accumulation by 

99


Anodonta cygnea and characterization of the metal-binding 

protein. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 21:432-437. 

Ireland MP, Marigómez I (1992). The influence of dietary cal- 

cium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mg & P and his- 

tological changes in the digestive gland cells of the snail 

Achatina Fulica Bodwich. J. Moll. Stud. 58:157-168. 

Isani G, Andreani G, Kindt M, Carpene E (2000) 

Metallothioneins (MTs) in marine molluscs. Cell Mol. Biol., 

46: 311-330. 

Langston WJ, Bebianno MJ, Burt GB (1998) Metal handling 

strategies in molluscs. orr: 219-283 Non: Metal Metabolism 

in aquatic envionments. Langston WJ & Bebianno MJ 

(ed.).Chapman & Hall. London. 

Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil on diges- 

tive cells in mussels: quantitative alterations in cellular and 

lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 8:265-272. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990a) Cellular distribu- 

tion of cadmium in the common winkle Littorina littorea (L.) 

determined by X-ray microprobe analysis and histoche- 

mistry. Histochemistry 94: 191-199. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990b) Histopathology 

of the digestive gland-gonad complex of the marine proso- 

branch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. Aquat. 

Org. 9:229-238. 

Marigomez JA, Soto M, Angulo E (1991) Responses of winkles 

digestive cells and their lysosomal system to environmen- 

tal salinity changes. Cell. Mol. Biol. 37:29-39. 

Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level bio- 

markers of biological effect of mercury on sentinel slugs, 

Arion ater. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31:54-62. 

Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart GBJ (1997) Tissue-level 

biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to 

assess metal pollution in soils. Arch. Environ. Contam. 

Toxicol. 34:167-176. 

Marigómez I, Cajaraville, MP, Soto M, Lekube X (1998) Cell- 

type replacement, a successful strategy of molluscs to 

adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 

20:411-414. 

Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Giamberini L 

(2002) Cellular and subcellular distribution of metals in 

molluscs. Microsc. Res. Tech. 56:358-392. 

Martoja R, Martoja-Pierson M (1970) Técnicas de Histología 

Animal. Toray Masson. Barcelona. 350 orr. 

Mason AZ, Jenkins KD (1995) Metal detoxification in aquatic 

100 

organisms. 479-608 orr. Non: Metal speciation and bioavai- 

lability in aquatic systems Tessier A & Turner DR (ed.). 

John Wiley and Sons. New York. 

Mason AZ, Simkiss K (1983) Interactions between metals and 

their distribution in tissues of Littorina littorea (L) collected 

from clean and polluted sites. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 63: 

661-672. 

Mason AZ, Simkiss K, Ryan KP (1984) The ultrastructural loca- 

lization of metals in specimens of Littorina littorea collected 

from clean and polluted sites. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 

64:699-720. 

Méndez PA (1993) Composición celular y estructura tisular de 

la glándula digestiva de mejillones en un programa de 

seguimiento de la contaminación en el estuario de el Abra. 

Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 88 orr. 

Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive tubule tissue of 

the Pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing 

radiation. J. Invert. Pathol. 17: 172-177. 

Morgan AJ, Winters C, Stürzebaum S (1997) X-ray microanaly- 

sis techniques. 245-276 orr. Non: Methods in molecular 

Medicine Biology. 117: Electron Microscopy Methods and 

Protocols Hajibagheri N (ed.). Humana Press Inc. Totowa 

New Jersey. 

Morgan JE, Morgan AJ (1998) The distribution and intracellular 

compartmentation of metals in the endogeic earthworm 

Aporrectodea caliginosa sampled from an unpolluted and a 

metal-contaminated site. Environ. Pollut. 99:167-175. 

Morton B (1983) Feeding and digestion in Bivalvia. 65-147orr. 

Non: The Mollusca 5 Saleuddin ASM & Wilburg M (ed.). 

Academic Press. New York. 

Pavicic S, Balestreri E, Lenzi P, Raspor B, Branica MF(1991) 

Isolation and partial characterization of cadmium induced 

metallothionein-like proteins in Mytilus galloprovincialis. 

Mar. Chem. 36:249-265. 

Pearse AGE (1980) Histochemistry. Theoretical and applied. 

Vol 1. preparative and optical technology. 4. edizioa. 

Edinburgh: Churchill Livingstone. 1055 orr. 

Porte C, Sole M, Borgi V, Martínez M, Chamorro J, Torreblanca 

A, Ortiz-Zarragoitia M, Orbea A, Soto M, Cajaraville MP 

(2001) Chemical, biochemical and cellular responses in 

digestive gland of mussels Mytilus galloprovincialis from 

the Spanish Mediterranean coast. Biomarkers 6:335-350. 

Rainbow PS, Dallinger R (1993) Metal uptake, regulation and 

excretion in freshwater invertebrates. 119-131 orr. Non: 

Ecotoxicology of metals in invertebrates Dallinger R & 

Rainbow PS (ed.). Lewis Publ. Boca Raton, Florida.

Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron 

microscopic studies of the acute and chronic toxic effects 

of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus edu- 

lis (L.). II. N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine. Aquat. 

Toxicol. 3:301-311. 

Recio A, Marigomez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc treat- 

ment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. 

Cellular distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. 

Contam. Toxicol. 41:858-864. 

Roesijadi G (1994) Metallothionein induction as a measure of 

response to metal exposure in aquatic animals. Environ. 

Health Persp. 102:91-95. 

Roesijadi G (2000) Metal transfer as a mechanism for metallo- 

thionein-mediated metal detoxification. Cell Mol. Biol. 46: 

393-405. 

Sokal RR, Rohlf FJ (1979). Biometría. Madrid: Blume. 832 orr. 

Soto M, Kortabitarte M, Marigómez I (1995) Bioavailable heavy 

metals in estuarine waters as assessed by metal/shell- 

weight indices in sentinel mussels Mytilus galloprovincialis. 

Mar. Ecol. Prog. Ser. 125:127-136. 

Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Marigómez I (1996a) 

Autometallographic localization of protein-bound copper 

and zinc in the common winkle, Littorina littorea: a light 

microscopical study. Histochem. J. 28:1-13. 

Soto M, Cajaraville MP, Marigómez I (1996b) Tissue and cell 

distribution of copper, zinc and cadmium in the mussel 

Mytilus galloprovincialis determined by autometallography. 

Tiss. Cell 28:557-568. 

Soto M, Marigómez I (1997a) BSD extent, an index for metal 

pollution screening based on the metal content within 

digestive cell lysosomes of mussels as determined by 

autometallography. Ecotox. Environ. Saf. 37:141-151. 

Soto M, Marigómez I (1997b) Metal bioavailability assessment 

in "Mussel-Watch" programmes by automated image 

analysis of BSD in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. 

Prog. Ser. 156:141-150. 

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigómez I. (1998a) 

Autometallographed metal content in digestive cells of win- 

kles: a cost-effective screening tool to monitor Cu and Zn 

pollution. Aquat. Toxicol. 40:123-140. 

Soto M, Quincoces I, Marigómez I (1998b) 

Autometallographical procedure for the localization of 


metal traces in molluscan tissues by light-microscopy. J. 

Histotechnol. 21:123-127. 

Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological 

alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten 

yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of 

Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 

44:85-98. 

Taylor, MG (1995). Mechanisms of metal immobilization and 

transport in cells. 155-170 orr. Non: Cell Biology in 

Environmental Toxicology. Cajaraville MP (ed.).University 

of the Basque Country Press Service. Bilbo. 

Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of 

starvation on structure and function in the digestive gland 

of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Ass. U. K. 54: 

699-712. 

Triebskorn R, Künast C (1990) Ultrastructural changes in the 

digestive system of Deroceras reticulatum (Mollusca: 

Gastropoda) induced by lethal and sublethal 

concentrations of the carbamate molluscicide cloethocarb. 

Malacologia 32:89-106. 

Viarengo A (1989) Heavy metals in marine invertebrates: 

mechanisms of regulation and toxicity at the cellular level. 

Rev. Aquat. Sci. 1:295-317. 

Viarengo A, Nott JA (1993) Mechanisms of heavy metal cation 

homeostasis in marine invertebrates. Comp. Biochem. 

Physiol. C 103:355-372. 

Viarengo A, Canesi L, Mazzucotelli A, Ponzano E (1993) Cu, Zn 

and Cd content in different tissues of the Antarctic scallop 

Adamussium colbecki, role of metallothionein in heavy 

metal homeostasis and detoxification. Mar. Ecol. Prog. Ser. 

95:163-168. 

Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press. 

London 415 orr. 

Widdows J, Moore MN, Lowe DM. 1984. Sublethal biological 

effects and short-term recovery of mussels (Mytilus edulis) 

and winkles (Littorina littorea) following chronic exposure to 

petroleum hydrocarbon. Non: Long term effects of oil on 

marine benthic communities in enclosures. Norwegian 

Institute for Water Research/NIVA Technical Report No. 0- 

82007. 

101


102

Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean 

Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde 

zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean eta 

urdailean 

Laburpena: Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-guruineko eta urdaileko epitelio-zelulen 

berriztapena bromodeoxiuridinaren (BrdU) immunohistokimika bitartez ikertu da. Muskuiluak 4 mg BrdU/l 

itsas-ur disoluzio pean etengabe mantendu ziren. Tratamenduari ekin eta 6 ordu ondoren, laginak 2 orduro 

hartu ziren 2 egunez. BrdU-markaketa argi-mikroskopioan zuzenean kontaketak eginez estimatu zen, 

balioak zelula BrdU-positiboen ‰ -tan emanez. BrdU erreakzio positiboa liseri-zelulen, zelula basofilikoen, 

eta konduktu zein urdaileko zelulen nukleoetan behatu zen, eta baita hemozitoetan ere. Liseridibertikuluetan, 

zelulen berriztapena eredu zirkamareala jarraituz sinkronizaturik agertu zen: BrdU 

markaketa, itsasbeheran igo eta itsasgoran jeisten zen. Liseri-zeluletan, irudi mitotikoa argiak behatu ziren. 

Lortutako emaitzek, zelula-mota desberdintzatuek proliferatzeari ekin diezaioketela egiaztatu ziguten, aldez 

aurretik egindako Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) immunohistokimikaren emaitzekin bat 

zetorrena. Urdailean ere epitelio-zelulen berriztapena sinkronizatuta zegoela atzeman genuen. 

Gako-hitzak: bromodeoxiuridina, berriztapen zelularra, mitosia, itsasaldia, fotoperiodoa, liseri-guruina, 

bibalbioak. 

103


Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestive 

gland and stomach 

Abstract: Epithelial cell renewal in mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk) digestive gland and stomach 

was investigated by bromodeoxyuridine (BrdU) immunohistochemistry. Mussels were exposed to 4 mg 

BrdU/l seawater continuously. Then, starting after 6 h treatment samples were collected every 2 h for 2 days 

and BrdU labelling was estimated by direct counting at the light microscope as ‰ BrdU positive cells. BrdU 

positive reaction was observed in the nuclei of digestive, basophilic, duct and stomach cells, as well as in 

hemocytes. Cell renewal in digestive diverticula is synchronised following a circatidal pattern: BrdU labelling 

increased during low tide and decreased during high tide. Clearcut mitotic figures were identified in 

digestive cells, which confirmed that mature cell types proliferate, in agreement with the results from 

immunohistochemistry for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry. Epithelial cell 

renewal in the stomach also appeared to be synchronised. 

Key Words: bromodeoxyuridine, cell renewal, mitosis, tide, photoperiod, digestive gland, bivalves. 

Variación circamareal en la proliferación de células epiteliales en glándula 

digestiva y estómago de mejillón 

Resumen Se investigó la renovación de células epiteliales en glándula digestiva y estómago del 

mejillón (Mytilus galloprovincialis, Lmk) mediante inmunohistoquímica de bromodeoxiuridina (BrdU). Se 

expusieron contínuamente mejillones a 4 mg BrdU/l agua de mar. Así,transcurridas 6 h de haberse iniciado 

el tratamiento se recogieron muestras cada dos h durante 2 días y se estimó el marcaje de BrdU mediante 

recuento directo al microscopio fotónico en términos de ‰ de células BrdU positivas. Se observó reacción 

BrdU positiva en los núcleos de las células digestivas, basófilas, de los conductos y del estómago, así 

como en hemocitos. La renovación celular en los divertículos digestivos estaba sincronizada de acuerdo 

con un patrón circamareal: el marcaje con BrdU aumentaba durante la marea baja y disminuía durante la 

marea alta. Se identificaron cortes limpios de figuras mitóticas en células digestivas, lo que confirmó que 

las células maduras son capaces de proliferar, de acuerdo con resultados anteriores de 

inmunohistoquímica de PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). También la renovación de células del 

epitelio del estómago parecía estar sincronizada. 

Palabras clave: bromodeoxiuridina, renovación celular, mitosis, marea, fotoperiodo, glándula digestiva, 

bivalvos. 

104

SARRERA 

Moluskuen liseri-guruin ehunaren oinarrizko 

zelulen berriztapenari dagokionez kasik ikerlanik ez 

dago, egitez. Muskuiluetan, liseri-guruina 

azkenean urdailean zabaltzen diren konduktu 

primarioei konduktu sekundarioen bitartez loturiko 

unitate albeolotubularren multzotan antolatuta 

dago. Unitate albeolotubular horien epitelioa bi 

zelula-mota helduz osaturik dago, liseri-zelulak eta 

zelula basofilikoak deitutakoak, hain zuzen 

(Morton, 1983). Liseri-zelulek elikagaien liseriketa 

intrazelularraren ardura dute, sistema endo- 

lisosomiko erabat garatua daukatelarik. Zelula 

basofilikoak, urriagoak, zelula jariatzaileak dira, 

basofiliaren ezaugarria ematen dien erretikulu 

endoplasmatiko pikortsu garatuaz hornituta 

daudelarik (Dimitriadis et al., 2004). Epitelioa arras 

dinamikoa da, eta elikagaien eskuragarritasunari 

zein bestelako ingurumen-faktoreei erantzunez, bi 

zelula-moten itxura, kopurua eta edukiak ordu gutxi 

batzuetan bortizki alda daitezke (Morton 1983). 

Izan ere, elikatze-ziklo bakoitzean, hots, ordu gutxi 

batzuen buruan, liseri-epitelioa guztiz berriztatzen 

dela proposatu da (Nelson & Morton 1979). Zelulen 

berriztapen bizkor hori gertatu ala ez, zelula 

basofilikoen proportzioa emendatzea dakarren 

epitelioaren berrantolaketa, ingurumen-estresaren 

iturri desberdinek bultzatzen dutena behin eta 

berriz egiaztatu da (Thompson et al. 1974; 

Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990; 

Marigómez et al. 1990; Syasina et al. 1997; 

Marigómez et al. 1998a; 1. Kapitulua). Zelula- 

moten ordezkapena (ingeleraz, Cell Type 


Replacement; CTR) izenaz ezagutzen den 

fenomeno hori, alde batetik, ingurumen-erasoa 

jaso eta ordu gutxietara jada nahiko aurreratua 

egon daiteke, eta, bestalde, zeharo itzulgarria da, 

estresa eten eta egun gutxietara jada zelula-moten 

proportzioa bere onera datorrelarik (Marigómez et 

al., 1998b). Hastapenetako ikerlanetan, CTR zelula 

basofilikoen proliferazioa areagotuak sor zezakeela 

kontsideratu zen (Thompson et al. 1974; 

Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990; 

Marigómez et al. 1990; 1998a). Haatik, zelula 

basofilikoen proliferazioaren ideia guztiz baztertu 

ezin bada ere, oraintsu eginiko esperimentuek 

CTRren gorakadak zelula basofilikoen 

proliferazioan baino gehiago liseri-zelulen galeran 

datzala iradoki dute (Marigómez et al., 1998b; 

Zaldibar et al., 2001). Bestalde, ingurumen-estresa 

sortarazten duten iturriak desagertzekotan liseri- 

zelulak proliferatzeko gai dira, laborategiko 

baldintza kontrolatu pean buruturiko sendabidetze- 

esperimentuetan erakutsi den moduan (Zaldibar et 

al., 2001; 4. & 5. Kapituluak). Zoritxarrez, liseri- 

guruinean zalantzabako irudi mitotikoak bilatzeak 

ez du fruitu onik ekarri orain arte (Thompson et al. 

1974; Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 

1990; Marigómez et al. 1990; Syasina et al. 1997; 

Marigómez et al. 1998a; 1998b; Marigómez et al. 

1999; Zaldibar et al. 2001). 

Izan ere, mitosiak nekez aurkitu dira bibalbioen 

liseri-guruinean. Ikerlan aurrendari batean, Yonge- 

k (1926) anafasean omen zegoen zelula baten 

marrazkia aurkeztu zuen. Autore horrek, zenbait 

zelula basofilikok zelula ama (sic., young cell) 

moduan joka dezaketela, eta, krustazeoen 

105


hepatoarean bezalaxe (Icely & Nott 1992; Vogt 

1994), zelula gaztez osatutako kriptetatik 

(habietatik) zelulen berriztapena abia daitekeela 

iradoki zuen. Are gehiago, erradiazio ionizatzaile 

pean egondako ostretan liseri-guruineko epitelioa 

ea zeharo desagerrarazi ondoren, epitelio-zelulen 

birpopulatzea kripta-zelulen mitosien bidez 

eratutako zelula-habien eraiketaz hasten da (Mix & 

Sparks 1971). Hala ere, nahiz eta itxuraz 

basofilikoak izan, kripta-zelulak txikiak dira, eta ezin 

dira inolaz ere zelula basofiliko heldu (jariatzaile) 

gisa kontsideratu, nahiz eta geroagoko artikuluetan, 

bestelako argibide sustatzailerik gabe, zelula 

basofilikoak bibalbioen liseri-guruineko epitelioaren 

birsortzearen erantzuleak diren zelula gazteak 

direla proposatu den (Fankboner 1971; Palmer, 

1979; Morton 1983). Aitzitik, Proliferating Cell 

Nuclear Antigen (PCNA) immunohistokimikak 

oraintsu erakutsi duenez (Marigómez et al., 1999), 

muskuiluetan bai liseri-zelulak eta baita zelula 

basofilikoak ere desberdintzatzeko, S-fasean 

sartzeko eta proliferatzeko gai dira, sagu helduaren 

listu-guruinetan zatiketa autologoa pairatzen duten 

zenbait zelula-mota helduek egiten duten bezalaxe 

(Denny et al., 1993). Halaber, Mya arenaria-ren 

liseri-tubuluetan ere, epitelio-zelula helduak PCNA - 

positiboak dira (Hanselmann et al., 2000). 

Ondorioz, zelula amek epitelioen berriztapenean 

parte hartuko lukete baina soilik epitelioan kalte 

masiboak ematekotan; bestela, baldintz 

normaletan, epitelio-zelulen berriztapena liseri- 

zelula eta zelula basofiliko helduen zatiketa 

autologoa dela medio burutuko litzateke. 

Ornodunen ehunetan, epitelio-zelulen berriztapen- 

dinamika eta prozesu horretan inplikatutako zelula- 

106 

motek jasandako aldaketak, egoera fisiologiko eta 

patologikoen menpean daudela modu sinesgarrian 

erakutsi da (Karam & Leblond 1993; Santa Barbara 

et al., 2003). 

Muskuiluen liseri-guruineko epitelioaren 

berriztapena sinkronizatuta egonez mitosiak gauez 

burutuko balira, aurreneko ikerlanetan mitosirik 

aurkitu ez izana azalduko litzateke (Marigómez et 

al., 1998b; Zaldibar et al., 2001). Zelulen zatiketa- 

tasan aldamolde zirkadiarrak algetatik hasita 

ugaztunetaraino deskribatu izan dira (Makarov et al. 

1995; Abrahamsen et al. 1998; Bjarnasson et al. 

1999; García et al. 2001). Are gehiago, zenbait 

eredu esperimentaletan behintzat, zelulen 

proliferazioa eta ordezkatze-prozesuak batez ere 

gauez gertatzen direna jakin badakigu (Scheving et 

al., 1978; Abrahamsen et al., 1998; Bjarnasson et 

al., 1999; García et al., 2001). 

Muskuiluen liseri-guruineko zelulen 

proliferazioak patroi zirkadiarra jarraitzen duen 

antzemateko, zelula proliferatzaileen banaketa 

bromodeoxiuridina (BrdU) immunohistokimika 

aplikatuz ikertu da Mytilus galloprovincialis (Lmk.) 

muskuiluan. BrdU timidinaren analogoa da, eta 

ziklo zelularraren S-fasean zehar zelula 

proliferatzaileen DNAri eransten zaio. Muskuiluak, 4 

mg BrdU/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-uretan 

mantendu ziren 2 egunez. BrdUren agerpena 

immunohistokimika bitartez detektatu zen, eta 

zelula proliferatzaileen proportzio erlatiboa (BrdU- 

markaketa) denbora-tarte desberdinetan 

erregistratu zen, BrdU-markaketan aldaketa 

zirkadiarrak identifikatu ahal izateko.







Laginak eta prozedura esperimentala 

Gutxi gorabehera 35-45 mm-ko luzerako 

maskorra zuten mareazpiko M. galloprovincialis 

(Lmk) muskuiluak Plentzian (Bizkaiko Golkoa 

43°24'I, 2°56'M) hartu ziren, uztailan eta goizerdiko 

itsasbeheran (10:12 a.m.). Laginketa mareazpiko 

muskuiluetara mugatu zen, itsasaldien zikloa eta 

fotoperiodoaren arteko elkarrekintza ekiditeko 

asmoz. Muskuiluak (n=80) laborategira garraiatu 

ziren eta 15 l-ko polietilenozko akuario batean 

mantendu ziren 15°C-tan eta etengabeko 

aireztapenaz. Itsas-ura argi ultramorea erabiliz 

esterilizatu zen, eta karbono aktiboz zein beirazko 

zuntzetan zehar iragazi egin zen; esperimentuak 

iraun bitartean itsas-ura ordezkatu ez zelarik. 

Muskuiluei, ornogabe itsastarrentzako jaki 

komertziala (Marine Invertebrate Diet, Carolina, 

Burlington, North Carolina, Amerikako Estatu 

Batuak) egunero eman zitzaien, goizeko 12:00-tan. 

Baldintza horietan, muskuiluak BrdU-tratamendu 

pean 2 egunez mantendu ziren. Hasieran, itsas- 

uretan 4 mg BrdU/l-ko pultsua aplikatu zitzaien, eta 

gerora 2 mg/l-ko pultsuak 4 orduro aplikatu ziren, 

maila zitotoxikoetara heltzeke BrdUren 

eskuragarrita-suna etengabe ziurtatu ahal izateko. 

Horrela, saiakuntza-denboran zehar BrdUren 


galerarik gertatuko ez balitz ere, uretan metatutako 

gehiegizko BrdUren kontzentrazioa 20 mg/l baino 

baxuagoa izango litzateke. Ornogabe itsastarrekin 

egindako pultsu-esperimentuetan BrdUren 

kontzentrazioak 500 mg/l-ko bezain altuak erabili 

dituzte beste ikertzaileek (Candia Carnevali et al., 

1997; Goergen et al., 2002). Hala ere, guk BrdU 

kontzentrazio askoz baxuagoa aplikatzea erabaki 

genuen honako arrazoi hauengatik: (1) muskuiluak 

laborategian egoera egokian mantentzeko ur 

bolumen handia ezinbestekoa zen, (2) 20-40 mg 

BrdU/l baino kontzentrazio altuagoek, muskuiluen 

ehunen zelulen berriztapena inhibi dezakete 

(Martínez-Expósito et al., 1994); eta (3) aurreneko 

ikerketek, 4 mg BrdU/l-ko kontzentrazioa liseri- 

guruineko epitelioan BrdU-markaketa konspikuoa 

erdiesteko nahikoa dela adierazi baitziguten. 

Muskuiluak denbora-tarte desberdinetan sakrifikatu 

ziren, BrdU-markaketaren fluktuazio-erritmoak 

identifikatu ahal izateko. 

Zelula BrdU-positiboen immunohistokimika 

Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean 

(%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10 

azido azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4°C-tan. 

Fixatu ondoren, laginak goranzko graduazioko 

etanolezko bainu-serie batean deshidratatu ziren 

eta parafinan inkluditu ziren 60°C-tan. Ebakiak (3- 

4 µm-ko lodiera) American Optical mikrotomoan 

ebaki ziren eta aldez aurretik (3-amino propil 

trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jaso 

ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren, 

beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie 

batean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz 

107


(PBS; ingeleraz, Phosphate-Buffered Saline) 

garbitu ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa 

ekiditeko, ebakiak %3 zuen H 2 O 2 -an inkubatu ziren 

5 minutuz, eta berriro PBSz garbitu ziren. DNA, 0.1 

N HCl-ez desnaturalizatu zen ordu batez, 37°C-tan. 

Ebakiak, Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector 

Laboratories, Burlingame, California, Amerikako 

Estatu Batuak) hornitutako suero blokeatzailean 

ordu batez inkubatu ziren giro-tenperaturan eta 

berriro ere PBSz garbitu ziren. Gero, ebakiak 

BrdUren aurkako antigorputz espezifikoan (Roche, 

Basilea, Suitza; %0.1 bovine serum albumine zuen 

PBSan 1:10 diluitua) inkubatu ziren. Laginak PBSz 

garbitu ziren, eta ondoren, Vectastain Elite ABC Kit- 

aren bitartez, abidina-biotina entzima-konplexua 

erabiliz antigorputza ikustarazi zen. Laburki, 

ebakiak, PBSn diluitutako saguaren aurkako 

zaldiaren IgG antigorputz sekundario biotinilatuan 

inkubatu ziren, 30 minutuz, eta ondoren PBSn 

garbitu ziren. Peroxidasa jarduera ikustarazteko 

kromogenoaren disoluzioa (3-amino-9- 

etilokarbazola, %0.015 H 2 O 2 zuen sodio azetato 

indargetzailean -pH 5.2- disolbatua) erabili zen. 

Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu ziren 

(10 s), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina 

glizerolatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse 

Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) 

muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50 

(Olympus Tokio Japonia) mikroskopioari atxiki 

zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi 

ziren. 

108 

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa 

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argi- 

mikroskopioan kontateka zuzenaren bidez burutu 

zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen 

proportzioa antzemateko asmoz, 1000 zelula 

zenbatu ziren lagin bakoitzean, beste ikerketetan 

erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et 

al., 1999). Aldez aurretik egindako behaketa 

histologikoek, liseri-epitelioaren tubulu moduko 

ebakidura bakoitzean gutxienez 20-30 zelula 

daudela erakutsi zuten. Hori dela eta, eguneroko 

lana errazteko asmoz, zelula BrdU-positiboen 

zenbaketa aleatorioki hautatutako 40 tubulu 

moduko ebakiduretan burutu zen (800-1200 zelula) 

liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki konduktu 

sekundarioen ebakidura bakoitzean 70-90 zelulak 

agertzen direnez gero, zelula BrdU-positiboen 

zenbaketa 10 konduktu sekundarioen ebakiduretan 

burutu zen (700-900 zelula). Horrek, laginaren 

tamaina egoki lortzearen eta konduktu 

sekundarioen zeharkako ebakidurak lortzearen 

zailtasunaren arteko konpromisozko erabakia 

suposatu zuen. Datuak adierazteko momentuan 

‰--ra pasatu ziren. Urdailean, kontaketa trantsektu 

bat eginez burutu zen, eta guztira 200 zelula 

zenbatu ziren epitelioan barrena. Zelula-kopuru 

baxuago hori, urdailean jarduera proliferatzailea 

oso handia dela egiaztatu ondoren hautatu zen. 

Datuak kasu honetan ere ‰-ko balioetan eman 

dira, aurrekoekin konparagarriak izan ahal izateko. 

Analisi estatistikoak, SPSS/PC+ programa 

erabiliz burutu ziren (SPSS, Microsoft). Denboraren 

eragina ikusi ahal izateko, faktore bateko ANOVA 

burutu zen, eta konparaketa anitzak eginez 

parekatutako batezbestekoen artean 

desberdintasun esangarriak (p

Duncan testa aplikatu zen. Azkenik, erregresio ez 

linealaren analisiak Sigma Plot programaren 

bitartez (SPSS, Microsoft) burutu ziren. 

Mitosien bilaketa 

Beste parafinazko ebaki batzuk (3 µm-koak) 

aldez aurretik deskribatu bezala prozesatu ziren, 

hematoxilina-eosinaz tindatu eta argi- 

mikroskopioan behatu ziren, liseri-guruinaren 

ehunean irudi mitotikoak identifikatzeko asmoz. 

Mikrografiak, Olympus BX50 mikroskopioari atxiki 

zegoen Olympus PM20 kameran lortu ziren. 

EMAITZAK 

Muskuiluen liseri-guruinan, zelula BrdU- 

immunorreaktiboak urdail, konduktu sekundario eta 

liseri-albeoloen epitelioetan lokalizatu egin ziren (1 

Ird.). Liseri-epitelioan, liseri-zelulek zein zelula 

basofilikoek positiboki markatutako nukleoa 

erakutsi zuten, nahiz eta zelula erreakzionagarri 

gehienak liseri-zelulak izan (1A Ird.). Konduktu 

sekundarioetan, zelula BrdU-positiboak zati 

ziliatuetan kokaturik agertu ziren gehien bat (1B 

Ird.). Urdailean beste epitelioetan baino askoz 

zelula immunopositibo gehiago behatu ziren (1C 

Ird.). Azkenik, hemozitoen nukleoetan ere 

markaketa bortitza aurkitu genuen. Hemozitoak, 

sarritan epitelio-zelula BrdU-positiboen azpian 

kokaturik agertu ziren, xafla basalaren (zentzu 

histologikoan) azpian, hain zuzen ere (1B Ird.). 

Gainera, zelulen soberakinak, nukleo BrdU- 

positiboak barne, liseri-traktuaren argian askotan 

behatu ziren, hondakin zelularrekin batera (1D Ird.). 

BrdUren aurkako antigorputzarik gabe inkubatu 


ziren kontrol-ebakiek ez zuten inolako markaketarik 

erakutsi (1E Ird.). 

Faktore bateko ANOVA analisien (1. Taula) zein 

batezbestekoen arteko konparaketa anitza egiteko 

Duncan testaren arabera, BrdU-markaketa 

baloreak laginketa-denboren artean esangarriki 

desberdinak izan ziren. Duncan testaren arabera 

esangarriki desberdinak ziren zenbait azpitalde 

homogeneo bereiztu ziren, 2. Ird.-an erakutsi den 

bezalaxe. Liseri-epitelioan, zelulen ‰20-‰25 

bitartean BrdUz markatuta agertu zen; konduktu 

sekudarioetan, berriz, markaketa 8 aldiz baxuagoa 

izan zen gutxi gorabehera (‰3), eta urdailean 6 

biderrez altuagoa (‰150) (2 Ird.). Liseri-guruineko 

zelulen BrdU-markaketak liseri-zelulen proliferazio- 

tasaren aldaketak islatu zuen batik bat, zelula 

basofiliko BrdU-positiboak oso noizean behin baino 

behatu ez zirelako. Liseri-epitelioan, BrdU- 

markaketaren jaitsiera nabarmenak 20:00-24:00 

eta 08:00-10:00 tarteetan erregistratu ziren, 

bitartean igoerak behatu zirelarik (2A Ird.). 

Esperimentazio-egun bietan aldamolde erritmiko 

berdintsua aurkitu genuen. Erregresio ez-linealaren 

analisiaren ondoren, gutxi gorabehera 12 h-ko 

maiztasuna zuen funtzio sigmoideo bati doitu 

zitzaion, esangarriki. (3 Ird.). BrdU-markaketak 

konduktu sekundarioetan eta urdaileko epitelioan 

antzeko irudi erritmikoen patroia erakutsi zuen (2B, 

C Ird.), baina erregresio ez-lineala eta korrelazio- 

koefizientea ez ziren estatistikoki esangarriak izan. 

Muskuiluen liseri-guruina ohi bezala behatu 

ostean, irudi mitotikoak han-hemenka identifikatu 

ziren liseri-zeluletan (1F Ird.), eta hemozito zein 

urdaileko zeluletan ere. 

109


EZTABAIDA 

PCNA erabiliz aldez aurretik egindako lanek, 

liseri-epitelioa osatzen duten zelula-mota guztiek 

proliferatzeko gaitasuna dutela erakutsi dute 

(Marigómez et al., 1999). Liseri-zelulak zein zelula 

basofilikoak desberdintzatzeko eta mitosian 

sartzeko gai direla proposatu da. Dena den, bere 

biziraupen luzeari esker, PCNA-immunoerreakzio- 

nagarritasuna, zelula amen mitosien bidez 

sortarazitako zelula desberdintzatuen nukleoetan 

ere detekta daiteke (Casasco et al., 1995). Gure 

ikerlan honetan, liseri-zeluletan irudi mitotikoak 

agertu izanak eta BrdU-immunohistokimikaren 

emaitzek, zelulen berriztapena liseri-zelula eta 

zelula basofiliko helduen zatiketa autologoaren 

bitartez erdiesten dela egiaztatu dute. Hala ere, oro 

har, BrdU-markaketa PCNA-markaketa baino 

ahulagoa da. Markatutako zelulen proportzioan 

aurkitutako desberdintasunak, 3 H-Timidina, PCNA 

eta BrdU erabili direneko tasen araberakoak izan 

daitezke (Elsässer et al., 1994; Bromley et al., 

1996; Moriki et al., 1996). Horrela, arratoiaren 

areako zelula azinarretan, zelula PCNA-positiboak 

3 H-Timidina-positiboak baino 10 aldiz ugariagoak 

dira, bi teknika histokimikoen bidez lortutako 

emaitzen artean korrelazio esangarria dagoen 

arren (Elsässer et al., 1994). Azalpenik egokiena, 

seguru asko, PCNAren bizi-iraupena 20 ordukoa 

izatean datza; S-fasearen iraupena baino luzeagoa 

dena, hain zuzen. Hori dela eta, zelula PCNA- 

positiboak ez dira soilik S-fasean daudenak baizik 

eta S-fasean daudenak edo eta oraintsu S-fasea 

110 

gainditu berri dutenak ere. Ondorioz, PCNA 

immunohistokimikak zelula proliferatzaileak 

lokalizatzeko seinale bortitzagoa eskaini dezaken 

arren; proteinaren biziraupen luzeagoak epitelioen 

berriztapenaren dinamikak aztertzeko desabantaila 

suposa diezaguke. BrdU-immunohistokimika, bere 

aldetik, helburu hori betetzeko egokiagoa dela 

dirudi, BrdUren biziraupena laburragoa denez, 

pultsu-esperimentuetan aplikatzeko aukera eskaini 

baitiezaguke. Izatez, proliferazioaren markatzaile 

immunohistokimiko sendoena eta fidagarriena dugu 

BrdU, S-faseak baino ez dituelako identifikatzen 

(Bromley et al., 1996). BrdU-pultsu esperimentuak 

hainbat animali eredutan aplikatu diren arren, 

ornogabe itsastarren kasuan murritzak dira 

(Harzsch et al., 1999; Awaji & Suzuki, 1995; Candia 

Carnevali et al., 1997; Goergen et al., 2002). 

Muskuilu itsastarretan, BrdU-pulsua nola aplikatu 

arazo nagusietakoa izan genuen. Ikerlan honetan, 

BrdU uretan disolbatu zen, eta beraz, elikatze- 

iragazketa aurrera joan ahala BrdU zelulei iristen 

zitzaien. Prozedura horrek, liseri-guruineko 

ehunetan BrdU eranstea ahalbidetzen zuela 

baieztatu zen, aldez aurretik zakatz-ehunetan 

behatu izan zen bezalaxe (Martínez-Expósito et al., 

1994). 

Immunohistokimika aplikatzekotan, pultsu batez 

emandako BrdU, mitosiondoko zeluletan beren 

bizitza osoan zehar detekta daiteke, nukleoan 

seinalea esponentzialki diluituko luketen 

proliferazio-prozesu suzesiboak ez gertatzekotan 

behinik behin (Ward et al., 1991). Ikerlan honetako 

baldintza esperimentalen arabera, BrdU-markaketa 

esperimentuak aurrera egin ahala igoz joango zela

espero genuen. Aitzitik, BrdU-markaketa oso bizkor 

jaitsi zen, 4 orduren buruan: ‰25-tik ‰2-ra unitate 

albeolotubularretan eta ‰150-‰40-ra urdailean (2 

Ird.). Nukleoetatik BrdU-markaketa desagertzea, 


1. Irudia: BrdU-positiboak diren nukleoen identifikazioa (geziak) unitate albeolotubularretako liseri-zeluletan (A), konduktuetan (B), 

urdailean (C) eta urdailaren argian askatutako materialean (D). Kontrol-ebakiean ez da inolako zelula BrdU-positiborik behatu (E). 

Hematoxilina-eosinaz tintatutako kromosomak (gezia) mitosian dagoen liserri-zelula batean (F). A) unitate albeolotubularra; D) 

konduktuko epitelio-zelula; H) hemozitoa; S) urdaileko epitelio-zelula.DC) liseri-zelula; BC) zelula basofilikoa. Eskala-marrak: 25 

µm (A-E); 50 µm (F). 

zelulen zatiketa suzesiboen ondorioa ote dugu, edo 

markatutako zelulak jaio orduko hiltzearen ondorioa 

ote da?. 

Arratoiaren gibeleko epitelio-zeluletan egindako 

111


1. Taula: Ikertutako hiru epitelioetan laginketa-denborak BrdUmarkaketan 

duen eragina finkatzeko egindako faktore bateko 

ANOVA-ren laburpena. P(F), Fisher ratioaren probabilitatea; 

a.g., askatasun-graduak. Estatistikoki esangarriak gertatu ziren 

desberdintasunak (p

2. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun) 

naturalean mantendutako muskuiluen liseri-guruineko BrdUmarkaketa 

(‰ ± desbidazio estandarra) denboraren arabera 

(eguzki-denbora). (A) unitate albeolotubularrak; (B) liserikonduktuak; 

eta (C) urdaileko epitelioa. Tratamendua 

eguerdiko 12:00-tan hasi zen, 4 mg BrdU/l itsas-ur pultsua 

aplikatuz, eta ondoren 2 mg BrdU/l itas-ur gehitu ziren 4 orduro 

(geziak). Muskuiluei janaria bi aldiz (asteriskoak) eman zitzaien 

egunero. Segmentu horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria, 

argitasun-tarteak; marraduna, ilunabar-tarteak; beltza, 

iluntasun-tarteak) adierazi dituzte. Erabilitako ikurren forma eta 

trama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeak 

adierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p


batezbesteko BrdU-markaketa indizea ‰77-110 

bitartekoa da (Potten et al., 1992), arratoiaren 

epitelio gastrikoan ‰150 ingurukoa den bitartean 

(Gama et al., 2000). BrdU-markaketa balio horiek 

guruinak ez diren epitelio normaletan balio-atalase 

maximoak direla dirudi (Bertalanffy 1962; Humme & 

Potten 1980; Potten et al. 1992; Pawlinoski et al., 

1999; Gama et al. 2000), eta ikerlan honetan 

urdailean aurkitutakoen antzekoak dira. Liseri- 

unitate albeolotubularren kasuan aplikatutakoen 

antzeko kalkuluetan oinarrituz, konduktuetako eta 

urdaileko berriztapen osoa 6 hilabetetan (175 egun) 

eta 3 egunetan, hurrenez hurren, burutuko 

litzatekeela ondorioztatu da. Liseri-konduktuetako 

epitelioaren BrdU-markaketa indizea baxua 

kontsidera daiteke, ‰2 eta ‰3 bitarteko indizea 

duen obarisektomizatutako arratoien endometrio- 

aren moduko beste ehunen antzera (Pawlinoski et 

al., 1999). 

Gure emaitzen arabera, muskuiluen liseri- 

unitate albeolotubularretako epitelio-zelulen 

berriztapenak patroi fluktuagarria jarraitzen du. 

Patroi horrek, gailur eta bailarak 6 ordutako 

txandatan agertzen direneko erritmo zirkamareal 

perfektoa irudikatzen du. Antzeko erritmo 

zirkamarealak hainbat ornogabe itsastarren mota 

askotako prozesu fisiologikoetan behatu dira 

(Naylor 1996, Abello et al., 1997). Bi proliferazio- 

ziklo gauzatzen dira egun batean zehar. 

Proliferazio-eredua errepikatu egiten da, zelulak 

itsasgorako orduetan S-fasean sartzen dira, geroko 

orduetan, zatiketa zelular bizkorrak pairatzeko. Izan 

ere, zelula BrdU-positiboak ia desagerturik daude 4 

orduren buruan. Liseri-konduktuetako BrdU- 

114 

markaketa patroia ez da unitate albeolotubularretan 

deskribatutakoaren oso desberdina, baina seinalea 

hain baxua denez laginketa-denboren arteko 

desberdintasunak BrdU-markaketan esangu- 

ratasun biologiko eta esangarritasun estatistikorik 

gabekoak dira. Urdailean ere epitelioaren 

berriztapena sinkronizatuta dagoela dirudi. 

Bibalboen liseri-traktuan epitelio-zelulek zatitu 

baino lehen migratu egiten dutela deskribatu da 

mitosiak epitelioaren erpinaldean gertatuz (Mix 

1970; Leibson & Frolova 1994). Aitzitik, nukleo 

BrdU-positiboak epìtelio-zelulen oinaldeko 

herenean kokaturik daudela aurkitu dugu. 

Gizakiaren aho-epitelioan (Bjarnasson et al., 

1999) eta bizkar-muinean (Abrahamsen et al., 

1998), zein arratoiaren liseri-traktuan ere (Scheving 

et al., 1978), bereziki zelula ugari aurkitu dira S- 

fasean ilunabarrean, gauan zehar beraien kopurua 

nabarmenki jaitsiz. Xaguaren keratinozitoetan S- 

fase gehienak gauez ematen dira (Garcia et al., 

2001). Otarrainaren zerebroan neurogenesiaren 

mailarik altuena ilunabar aldean gertatzen da, gaua 

jarduera fisiologiko maximoaren garaia izanik 

(Goergen et al., 2002). Epitelio-zelulen proliferazio- 

jardueraren aldaketa erritmikoen denbora-patroia 

ehun- eta espezie-espezifikoa izan liteke 

zalantzarik gabe, muskuiluen liseri-guruinean 

elikatze eta liseriketa moduko jarduera zikliko zein 

erritmo marealen menpekoa izanik (Nelson & 

Morton 1979; Morton 1983). Ikerlan honetan, 

marea-ziklo eta fotoperiodoaren arteko 

interferentziak ekiditeko asmoz, bakarrik 

mareazpiko muskuiluak aztertu dira. Hala ere, 

Mytilusen habitata itsasbeherako mailatik metro

gutxi batzutara baino ez da iristen. Eskualde 

horretan animaliek kinada fotikoak eta gorantz zein 

beherantzko mareen pauta erritmikoak ere jasotzen 

dituzte. Ondorioz, marea-erritmoa liseri-sistemaren 

zelulen proliferazioaren prozesu erritmikoak 

gobernatzeko Zeitgeber perfektua izan daiteke, 

kasu honetan bezala muskuiluak mareazpikoak 

badira ere. 

Laburbilduz, liseri-zeluletan irudi mitotikoak 

behatu izanak eta BrdUren emaitzek, zelulen 

berriztapena liseri-guruineko zelula helduen 

zatiketa autologoaren bitartez gauzatzen dela 

egiaztatu dute. Urdaileko eta liseri-unitate 

albeolotubularreko epitelioek, zelulen berriztapen- 

tasa ertaina eta altua bitarteko dute. Epitelio-zelulen 

berriztapena sinkronizatuta dago, 24 ordutan 2 ziklo 

osoak betetzen dituen patroi zirkamareala jarraituz. 

BIBLIOGRAFIA 

Abello P, Warman CG, Naylor E (1997) Circatidal moulting 

rhythm in the shore crab Carcinus maenas. J. Mar. Biol. 

Assoc. U.K. 77:277-280. 

Abrahamsen JF, Smaaland R, Sothern RB, Laerum OD (1998) 

Circadian cell cycle variations of erythro- and myelopoiesis 

in humans. Eur. J. Haematol. 58:333-345. 

Awaji M, Suzuki T (1995) The pattern of cell proliferation during 

pearl sac formation in the Pearl oyster. Fisheries Sci. 

61:747-751. 

Bertalanffy FD (1962) Cell renewal in the gastrointestinal tract 

of man. Gastroenterology 11:472-475. 

Bjarnasson GA, Jordan RCK, Sothern RB (1999) Circadian 

variation in the expression of cell-cycle proteins in human 

oral epithelium. Am. J. Pathol. 154:613-622. 

Bromley M, Rew D, Becciolini A, Balzi M, Chadwick C, Hewitt 

D, Li YQ, Potten CS (1996) A comparison of proliferation 

markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell 

position in the crypts of normal human colonic mucosa. 

Eur. J. Histochem. 40:89-100. 


Cajaraville MP, Díez G, Marigómez JA, Angulo E (1990) 



Org. 9:221-228. 

Candia Carnevali MD, Bonasoro F, Biale A (1997) Pattern of 

bromodeoxyuridine incorporation in the advanced stages 

of arm regeneration in the feather star Antedon 

mediterranea. Cell Tiss. Res. 289:363-374. 

Cantz T, Zuckerman DM, Burda DR, Dandri M, Goricke B, 

Thalhammer S (2003) Quantitative gene expression 

analysis reveals transition of fetal liver to mature 

hepatocytes after transplantation in uPA/RAG-2 mice. Am. 

J. Pathol. 162:37-45. 

Casasco A, Casasco M, Icaro Cornaglia A, Mazzini G, De 

Renzis R, Tateo S (1995) Detection of Bromo- 

deoxyuridine- and Proliferating Cell Nuclear Antigen- 

immunoreactivities in tooth germ. Connective Tiss. Res. 

32:63-70. 

Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1993) Parenchymal 

cell proliferation and mechanisms for maintenance of 

granular duct and acinar cell populations in adult male 

mouse submandibular gland. Anat. Rec. 235:475-485. 

Diermeier S, Schmidt-Bruecken E, Kubbies M, Kuntz-Schughar 

LA, Brockhoff G (2004) Exposure to continuous 

bromodeoxyuridine (BrdU) differentially affects cell cycle 

progression of human breast and bladder cancer cell lines. 

Cell Prolif. 37:195-206. 

Dimitriadis VK, Domouhtsidou GP, Cajaraville MP (2004) 

Cytochemical and histochemical aspects of the digestive 

gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in 

relation to function. J. Mol. Histol. 35:501-509. 

Elsässer HP, Biederbick A, Kern HF (1994) Growth of rat 

pancreatic acinar cells quantitated with a monoclonal 

antibody against the proliferating cell nuclear antigen. Cell 

Tiss. Res. 276:603-609. 

Evarts RP, Hu Z, Omori N, Omori M, Marsden ER, Thorgeirsson 

SS (1996) Precursor-product relationship between oval 

cells and hepatocytes: comparison between tritiated 

thymidine and bromodeoxyuridine as tracers. 

Carcinogenesis 17:2143-2151. 

Fankboner PV (1971) Intracellular digestion of symbiotic 

zooxanthellae by host amoebocytes in giant clams 

(Bivalvia: Tridacnidae), with a note on the nutritional role of 

the hypertrophied siphonal epidermis. Biol. Bull. 141:222- 

234 

115


Fernández-Suárez A, López JM, Carbajo S, Alvarez-Uria M, 

116 

Carbajo-Pérez E (1996) New insights into cytodynamics of 

the hamster Harderian gland as provided by the 

bromodeoxyuridine-labelling method. Histol. Histopathol. 

11:351-355. 

Gama P, Goldfeder EM, Bertacini de Moraes JC, Alvares EP 

(2000) Cell proliferation and death in the gastric epithelium 

of developing rats after glucocorticoid treatments. Anat. 

Rec. 260:213-221. 

García MN, Barbeito CG, Andrini LA, Badrán AF (2001) 

Circadian rhythm of DNA synthesis and mitotic activity in 

tongue keratinocytes. Cell Biol. Inter. 25:179-183. 

Goergen EM, Bagay LA, Rehm K, Benton JL, Beltz BS (2002) 

Circadian control of neurogenesis. J. Neurobiol. 53:90-95. 

Hanselmann R, Smolowitz R, Gibson D (2000) Identification of 

proliferating cells in hard clams. Biol. Bull. 199:199-200. 

Harzsch S, Miller J, Benton J, and Beltz B, (1999) From embryo 

to adult: Persistent neurogenesis and apoptotic cell death 

shape the lobster deutocerebrum. J. Neurosci. 19:3472- 

3485. 

Humme WJ, Potten CS (1980) Changes in proliferative activity 

as cells move along undulating basement membranes in 

stratified squamous epithelium. British J. Dermatol. 

103:499-504. 

Icely JD, Nott JA (1992) Digestion absorption: digestive system 

and associated organs. 147-201 orr. Non: Harrison FW, & 

Humes AG (ed) Microscopic anatomy of invertebrates. 10: 

Decapod Crustacea. Wiley-Liss, New York. 

Karam SK, Leblond CP (1993) Dynamics of epithelial cells in 

the corpus of the mouse stomach. I. Identification of 

proliferative cell types and pinpointing of the stem cell. 

Anat. Rec. 236:259-279. 

Leibson NL, Frolova LT (1994) Winter-spring essential 

reorganization of cell proliferation in the digestive tract 

epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol. 

118:471-477. 

Makarov VN, Schoschina EV, Luning K (1995) Diurnal and 

circadian periodicity of mitosis and growth in marine 

microalgae. 1. Juvenile sporophytes of laminariales 

(phaeophyta). Eur. J. Phycol. 30:261-266. 

Marigómez I, Cajaraville M P, Angulo E (1990) Histopathology 

of the digestive gland-gonad complex of the marine 

prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. 

Aquat. Org. 9:229-238. 

Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart GBJ (1998a) Tissue-level 

biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to 


Toxicol. 34:167-176. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998b) Cell- 

type replacement, a successful strategy of molluscs to 


18:431-435. 

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical 

localisation of proliferating cells in mussel digestive gland 

tissue. Histochem. J. 31:781-788. 

Martínez-Expósito MJ, Pasantes JJ, Méndez J (1994) 

Proliferation kinetics of mussel (Mytilus galloprovincialis) 

gill cells. Mar. Biol. 120:41-45. 

Mix MC (1970) Cell renewal systems in the gut of the oyster, 

Crassostrea gigas. Veliger 14:202-205. 


the Pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing 

radiation. J. Invert. Pathol. 17:172-177. 

Moriki T, Takahashi T, Kataoka H, Hiroi M, Yamane T, Hara H 

(1996) Proliferation marker MIB-1 correlates well with 

proliferative activity evaluated by BrdU in breast cancer: an 

immunohistochemical study including correlation with 

PCNA, p53, c-erbB-2 and estrogen receptor status. Pathol. 

Internat. 46:953-961. 

Morton B (1983) Feeding and digestion in Bivalvia. 65-147 orr. 

Non: Saleuddin A S M. & Wilburg M (ed) The Mollusca. 5. 

Academic Press, New York. 

Naylor E (1996) Crab clockwork: the case for interactive 

circatidal and circadian oscillators controlling rhythmic 

locomotor activity of Carcinus maenas. Chronobiol. 

Internat. 13:153-161. 

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial 

renewal in the digestive gland tubules of the marine 

prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 

45:262-283. 

Okudela K, Ito T, Kameda Y, Nakamura N Kitamura H (1999) 

Immunohistochemical analysis for cell proliferation-related 

protein expression in small cell carcinoma of the 

esophagus; a comparative study with small cell carcinoma 

of the lung and squamous cell carcinoma of the 

esophagus. Histol. Histopathol. 14:479-485. 

Palmer RE (1979) A histological and histochemical study of 

digestion in the bivalve Arctica islandica L. Biol. Bull. 

156:115-129.

Pawlinoski M, Melén-Mucha G, Mucha S (1999) The 

involvement of the renin-angiotensin system in the 

regulation of cell proliferation in the rat endometrium. 

Cell.Mol. Life Sci. 55:506-510. 

Potten CS, Kellett M, Roberts SA, Rew DA, Wilson GD (1992) 

Measurement of in vivo proliferation in human colorectal 

mucosa using bromodeoxyuridine. Gut 33:71-78. 


microscopic studies on the acute and chronic toxic effects 

of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus 

edulis (L.). II N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine. Aquat. 

Toxicol. 3:301-311. 

Santa Barbara P, van den Brink GR, Roberts DJ (2003) 

Development and differentiation of the intestinal 

epithelium. Cell Mol. Life Sci. 60:1322-1332. 

Scheving LE, Burns RE, Pauly JE, Tsai TH, (1978) Circadian 

variation in cell division of the mouse alimentary tract, bone 

marrow and corneal epithelium. Anat. Rec. 191:479-486. 


alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten 



44:85-98. 




of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Ass. U. K. 

54:699-712. 

Van Nest G, Raman RK, Rutter WJ (1983) Effects of 

dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein 

synthesis and secretion during in vitro pancreatic 

development. Dev. Biol. 98:295-303. 

Vogt G (1994) Life-cycle and functional cytology of the 

hepatopancreatic cells of Astacus astacus. Crustacea, 

Decapoda. Zoomorphology 144:83-101. 

Ward JM, Henneman JR, Osipova GY, Anisimov VN (1991) 

Persistence of 5-bromo-2'-deoxyuridine in tissues of rats 

after exposure in early life. Toxicology 70:345-352. 

Yao XH, Sugihara H, Hattori T, Katsura K, Takamatsu T (1998) 

Regulation of apoptotic cell death in the pyloric glands of 

the canine stomach. Virchows Arch. 433:275-280. 

Yonge CM (1926) The digestive diverticula in Lamellibranchia. 

Trans. Roy. Soc. Edin. 54:703-718. 

Zaldibar B, Iturralde J, Cancio I, Marigómez I (2001) Reversible 

cell-type replacement in marine mollusc Littorina littorea 

exposed to cadmium. SETAC Europe Ann. Conf., Vienna. 

117


118

Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra 

Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseriguruin 

eta urdailean: sasoi, adin eta erregimen 

marealari lotutako aldamoldeak 

Laburpena: Tamaina, adin eta itsasaldi-erregimen desberdineko Mytilus galloprovincialis (Lmk) 

muskuiluen liseri-albeolo eta urdaileko epitelioko zelulen jarduera proliferatzailearen aldamolde naturala 

ikertu da sasoi desberdinetan. Muskuiluak, timidinaren analogoa den bromodeoxiuridinarekin (BrdU) 6 

orduz tratatu ondoren, 2 orduro hurrengo 36 ordutan BrdUren immunohistokimika burutu zen. Ondoren, 

zelula BrdU-positiboen proportzio erlatiboa BrdU-markaketa gisa (‰) kuantifikatu zen. Sasoiari 

dagokionez, desberdintasun esangarriak behatu ziren BrdU-markaketan. Udan, udazkenean eta neguan 

baino askoz jarduera proliferatzaile altuagoa neurtu zen. Adin (tamaina) desberdineko animalien artean ez 

zen zelulen jarduera proliferatzaile desberdinarik behatu. Bestalde, marearteko eta mareazpiko muskuiluen 

liseri-guruineko epitelioen artean desberdintasunak aurkitu ziren, bai BrdU-markaketa mailetan, eta baita 

aldamolde-patroian ere, non marearteko muskuiluetan BrdU-markaketa fotoperiodoak zein itsasaldierregimenak 

modulatua baitzegoen eta mareazpiko muskuiluetan, patroi zirkamareala jarraitu baitzuen. 

Gako-hitzak: bromodeoxiuridina, immunohistokimika, liseri-zelula, zelula basofilikoa, berriztapen 

zelularra, erritmo zirkamareala, tamaina, adina, sasoia, marea, bibalbioak. 

119


Epithelial cell renewal in the digestive gland and stomach of mussels: season, 

age and tidal regime related variations 

Abstract: The natural variability in cell proliferation activity in the epithelium of the digestive gland and 

stomach was investigated in mussels, Mytilus galloprovincialis (Lmk), of different age and tidal level at 

different seasons. After treating mussels with the thymidine analogue bromodeoxyuridine (BrdU) for 6 

hours, BrdU immunohistochemistry was performed every 2 hours for the next 36. Then, the relative 

proportion of BrdU positive cells was quantified as BrdU labelling (‰). Marked seasonal differences were 

recorded in BrdU labelling, with much higher proliferating activity in summer than in autumn and winter. Cell 

proliferation seemed not to be significantly dissimilar between mussels of different age (size). In contrast, 

the digestive gland epithelium of mussels from intertidal and subtidal populations differed not only in the 

levels but also in the pattern of variation of BrdU labelling, which in intertidal mussels appeared to be 

modulated by photoperiod and tide, unlike in subtidal mussels, in which variations followed a circatidal 

pattern. 

Key words: bromodeoxyuridine immunohistochemistry, digestive cell, basophilic cell, cell epithelial 

renewal, circatidal rhythm, size, age, season, tide, bivalve. 

Renovación de células digestivas en glándula digestiva y estómago de 

mejillon: variación según la época, edad y régimen mareal 

Resumen: Se ha investigado la variabilidad natural en la actividad proliferativa de las células de la glándula 

digestiva y del estómago de mejillón, Mytilus galloprovincialis (Lmk), de diferente edad y régimen de marea 

en diferentes épocas del año. Los mejillones fueron tratados con bromodeoxiuridina (BrdU), un análogo de 

la timidina, durante 6 horas y en las siguientes 36 horas se realizó la immunohistoquímica de BrdU cada 2 

horas. A continuación, se cuantificó la proporción relativa de células BrdU positivas (‰). Se observaron 

diferencias significativas en el marcaje de BrdU relacionadas con la época del año, siendo la proliferación 

celular mucho más marcada en verano que en otoño e invierno. La proliferación celular no resultó diferente 

entre animales de diferentes edades (tamaño). Por el contrario, en el epitelio de la glándula digestiva de 

mejillones intermareales y submareales no sólo resultó diferente el nivel, sino también el patrón de 

variación del marcaje de BrdU. En mejillones intermareales ese patrón parece modulado por el fotoperiodo 

y la marea, a diferencia de los submareales en los que las variaciones siguen un patrón circamareal. 

Palabras clave: inmunohistoquímica de bromodeoxiuridina, célula digestiva, célula basofílica, renovación 

celular, ritmo circamareal, tamaño, edad, época, marea, bibalvio. 

120

SARRERA 

Muskuiluen liseri-guruineko epitelioa 

desberdintzatutako 2 zelula-motez osaturik dago, 

liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia. Liseri- 

zelulek, oso sistema endo-lisosomiko garatua dute 

eta elikagaien liseriketa intrazelularraz arduratzen 

dira. Zelula basofilikoek, izaera basofiloa damaien 

erretikulu endoplasmatiko pikortsu garatua dute, 

eta liseri-zelulak baino urriagoak dira. Marigómez 

et al.-ek, (1999), PCNA immunohistokimika erabiliz, 

bi zelula-mota horiek proliferatzeko gai direla 

frogatu zuten. Liseri-zeluletan irudi mitotikoak 

aurkitu izanak eta BrdU immunohistokimikak, 

zelulen berriztapena liseri-zelula eta zelula 

basofiliko helduen zatiketa autologoaz burutzen 

dela baieztatu dute (Zaldibar et al., 2004). Liseri- 

dibertikuluen epitelio-zelulen berriztapena 

sinkronizatuta dago patroi zirkamareala jarraituz, 

BrdU-markaketaren aldaketek adierazi zutenez 

(Zaldibar et al., 2004). Esperimentu horiek, 

mareazpiko muskuiluekin soilik burutu ziren arren, 

edonola ere itsasaldi-erregimena eraginkorra zela 

proposatu zen. Dirudienez, liseri-guruineko 

epitelioaren zelulen berriztapena, Izagirre-ren 

(2000) arabera liseri-zelulen jarduera fisiologikoa 

(adb, liseriketa intrazelularra) murrizten deneko 

une jakinetara mugatuta dago. Beraz, jarduera 

fisiologiko eta ziklo zelularraren arteko 

elkarrekintza ezagutzea, liseri-epitelioaren zelulen 

berriztapen ulertzeko oinarrizkoa izango litzateke. 

Testuinguru horretan, liseri-guruinaren gainean 

eragina duten aldagai naturalek (adina, sasoia, 

itsasaldi-erregimena), liseri-guruineko zeluletan 


aurkitutako jarduera proliferatzailearen eredu 

zirkamareala, aldarazi edo modula dezaketen 

finkatzea erronka erabakigarria da. Liseri 

guruinaren forma eta funtzioa, liseritze-iraupena 

eta intentsitatea eta beste prozesu fisiologikoak 

barne, aldagai horien arabera aldatu egiten da 

(Etxeberria et al., 1994; Cancio et al., 1999; 

Fernández-Reiriz et al., 2001; Wong & Cheung, 

2001; Le Pennec & Le Pennec, 2002; Pazos et al., 

2003). Are gehiago, tamaina (adin) desberdineko 

muskuiluek, liseri-guruineko zelulen proliferazio- 

eredu ezberdina dute. Izatez, SDS-PAGE 

elektroforesiaren ondoko PCNAren 

immunotransferentziak, muskuilu txikien (gazte 

heldugabeak) liseri-guruineko zelulak muskuilu 

handienetakoak (helduak) baino proliferazio 

gaitasun handiagoa zutela erakutsi zuten 

(Marigómez et al., 1999). 

Hiru sasoi desberdinetan (negua, udara eta 

udazkena) itsasarteko bi eskualde desberdinetan 

(mareartekoa eta mareazpikoa) hartutako tamaina 

desberdineko (txikiak-gazteak eta handiak- 

helduak) Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen 

liseri-guruineko eta urdaileko zelula 

proliferatzaileen banaketa, BrdU- 

immunohistokimika bitartez ikertu zen. 







121


Atariko esperimentua 

Mareazpiko eta marearteko Mytilus 

galloprovincialis muskuiluen liseri-guruineko eta 

urdaileko zelulen proliferazioa konparatu ahal 

izateko, BrdU-pultsua marearteko muskuiluak 

pairatzen duten urperatze-aldira mugatu behar izan 

zen (6 ordu). Aldez aurretik burututako 

esperimentuak uretango BrdU-esposizio jarraia 

aplikatu ondoren, BrdU-markaketa patroi 

zirkamareala erakutsi zutenez, oraingo honetan 

BrdU-pultsua egunaren unerik egokiena finkatzeko 

zenbait aurretiko esperimentu diseinatu ziren. 

Helburu hori betetzeko, 160 mareazpiko muskuilu 

gazte (maskorraren luzera

zeuden momentuan. 

BrdU immunohistokimika 

Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean 

(%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10 

azido azetikoa) ordu batez fixatu ziren 4°C-tan, 

goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie 

batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu 

ziren, 60°C-tan. Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) 

American Optical mikrotomo batean erdietsi ziren, 

eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilano) 

silanizatutako portaobjektuetan jaso ziren. 

Ondoren, ebakiak xilenoz desparafinatu, 

etanolezko bainu-serie batean hidratatu, eta 

PBSaz (fosfato indargetzaile salinoa; ingelesez, 

Phosphate-Buffered saline) garbitu ziren. 

Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, ebakiak 

%3 zuen H 2 O 2 -an 5 minutuz inkubatu ziren eta 

berriro PBSaz garbitu ziren. DNA, ordu batez 

37°C-tan 0.1N HCl-z desnaturalizatu zen. Ebakiak, 

borato indargetzailean (pH=8.5) neutralizatu eta 

PBSaz garbitu ziren. Ondoren, ebakiak Vectastain 

Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, Burlingame, 

Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak) hornitutako 

serum blokeatzaile normalean (NBS, ingelesez; 

Normal Blocking Serum) ordu batez inkubatu ziren, 

giro-tenperaturan, eta berriro PBSaz garbitu ziren. 

Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz 

espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza; 1:10 %0.1 

behi-albumina seruma zuen PBSan) inkubatu 

ziren. Laginak PBSaz garbitu, eta ondoren, 

Vectastain Elite ABC Kit-a erabiliz abidina-biotina- 

entzima (ABC) metodoaren bidez 

immunokonplexuak ikustarazi ziren. Laburki, 

ebakiak, PBSan diluitutako sagu aurkako zaldiaren 


IgG antigorputz sekundario 30 minutuz biotinilatuan 

inkubatu ziren, eta ondoren PBSan biziki garbitu 

ziren. Peroxidasa jardueraren ikustaraztea, sodio 

azetato indargetzailean (pH = 5.2) 3-amino-9- 

ethylkarbazola eta %0.015 H 2 O 2 zituen 

kromogeno-disoluzioa erabiliz erdietsi zen. 

Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu (10 

segundu), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina 

glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse 

Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak) 

muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50 

(Olympus, Tokio, Japonia) mikroskopioari atxiki 

zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi 

ziren. 

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa 

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argi- 

mikroskopioan konkateka zuzenaren bidez burutu 

zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen 

proportzioa antzemateko asmoz, lagin bakoitzean 

1000 zelula zenbatu ziren, beste ikerketetan 

erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et 

al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Aldez aurretik 

egindako behaketa histologikoek, liseri-epitelioaren 

tubulu moduko ebakidura bakoitzean gutxienez 20- 

30 zelula daudela erakutsi zuten. Hori dela eta, 

eguneroko lana errazteko asmoz, zelula BrdU- 

positiboen zenbaketa aleatorioki hautatutako 40 

tubulu moduko ebakiduretan burutu zen (800-1200 

zelula) liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki 

konduktu sekundarioen ebakidura bakoitzean 70- 

90 zelulak agertzen direnez gero, zelula BrdU- 

positiboen zenbaketa 10 konduktu sekundarioen 

ebakiduretan burutu zen (700-900 zelula). Horrek, 

123


laginaren tamaina egoki lortzearen eta konduktu 

sekundarioen zeharkako ebakidurak lortzearen 

zailtasunaren arteko konpromisozko erabakia 

suposatu zuen. Datuak adierazteko momentuan 

‰-ra pasatu ziren. Urdailean, kontaketa trantsektu 

bat eginez burutu zen, eta guztira 200 zelula 

zenbatu ziren epitelioan barrena. Zelula-kopuru 

baxuago hori, urdailean jarduera proliferatzailea 

oso handia dela egiaztatu ondoren hautatu zen. 

Datuak kasu honetan ere ‰-ko balioetan eman 

dira, aurrekoekin konparagarriak izan ahal izateko. 

EMAITZAK 

Liseri epitelioko liseri-zelula zein zelula 

basofilikoek, BrdU-positibo ziren nukleoak erakutsi 

zituzten, nahiz eta zelula BrdU-positibo gehienak 

liseri-zelulak izan (1. Ird.). Urdaila, nukleo BrdU- 

positibo gehien erakutsi zituen organoa izan zen (1. 

Ird.). Tindaketaren kontrol-ebakietan ez zen inolako 

positibotasunik behatu (1. Ird.). 

Atariko esperimentuak 

BrdU-markaketari dagokionez, liseri-guruin eta 

urdaileko epitelioan patroi zirkamareal 

konparagarria ezagutu zen, seinale/zarata erlazioa 

urdailean txikiagoa izan arren. Beraz, liseri- 

guruineko epitelioko BrdU-markaketa emaitzak 

soilik aurkeztuko dira hemendik aurrera. 

Eguneko pultsu-esperimentuan, muskuilu 

helduetan liseri-guruineko ‰33 zelulek BrdU 

markaketa aurkeztu zuten. Animali gazteetan, 

ordea, markaketa baxuagoa izan zen (‰21) (2A eta 

2C Ird.). Liseri-epitelioaren BrdU-markaketaren 

124 

kuantifikazioari dagozkion emaitzak, liseri-zelulen 

proliferazio-tasan gertatutako aldaketei egokitu 

zitzaizkien, zelula basofiliko BrdU-positiboak 

noizean behin soilik behatu baitziren. Termino 

kualitatiboetan, muskuilu gazte zein helduetan 

aldamolde bera aurkitu zen. Aldamoldea itsasaldi- 

erregimenak (IE) edo argia/iluntasuna zikloak (AIZ) 

gobernatua dagoen zehazteko asmoz, uretan 

murgiltzearen (itsasbeheratik itsasgoranzko bidea) 

eta aire-esposizioaren (itsasgoratik itsasbeherantz) 

uneetako batezbesteko BrdU-markaketa kalkulatu 

zen (1. Taula, 3. Ird). Helburu horretarako, eta 

esperimentua aurrera joan ahala behatutako BrdU- 

markaketan beherakada kontuan hartuz, kalkuluak 

egiteko BrdU-pultsu osteko lehenengo 12 ordutako 

datuak baino ez ziren aintzat hartu. Batezbesteko 

BrdU-markaketaren balio altuena, gaueko 

murgiltze-aldian (marea altua) aurkitu zen muskuilu 

gazte zein helduetan; muskuilu gazteetan, gainera, 

eguneko murgilketa-aldian tarteko balioak 

erregistratu zirelarik (3. Ird.). Bi bidetako ANOVA 

analisiak muskuilu helduetan IE eta IE x AIZ 

faktoreek batezbesteko BrdU-markaketan eragin 

esangarria zutela adierazi zuten, muskuilu 

gazteetan, ordea, IE x AIZ elkarrekintza faktorerik 

esangarriena (p

urera murgiltzearen eta aire-esposizioaren 

uneetako batezbesteko BrdU-markaketa kalkulatu 

zen, egunez zein gauez (1. Taula, 3. Ird.). Helburu 

horretarako, eta BrdU-pultsuaren ostean zein 

hurrengo egun argiko unean BrdU-markaketan piko 

nabarmenik behatu ez zelako kontuan hartuz, 

kalkuluak egiteko BrdU-pultsua eman eta 24 orduko 

osteko datuak baino ez ziren aintzat hartu. 

Batezbesteko BrdU-markaketa maximoa gauez 

behatu zen arren, bereziki muskulilu gazteetan, ez 

zen talde esperimentalen artean desberdintasun 

esangarririk topatu (3. Ird.). Honekin bat, bi bidetako 

ANOVA analisiak, muskuilu gazteetan BrdU- 

markaketaren gainean efektu esangarria soilik AIZ- 

k zuela adierazi zuen. Muskuilu helduetan, bere 

aldetik, IE, AIZ eta beraien elkarrekintzek ez zuten 

efektu esangarririk eduki BrdU-markaketaren 

gainean (2. Taula). 


1. Irudia: BrdU positiboak diren nukleoen identifikazioa (geziak) unitate albeolotubularretako liseri-zeluletan, konduktuetan eta 

urdailean (A-D); D) konduktuko epitelio-zelula), A) unitate albeolotubularra, H) hemozitoa, BC) zelula basofilikoa, DC) liseri-zelula, 

S) urdaileko epitelio-zelula. Ebaki kontrolean ez da inolako zelula BrdU positiborik behatzen (E). Eskala-marra: 50 µm 

Esperimentu nagusiak 

Urte-sasoi, adin eta itsasaldi-erregimenaren 

efektua zelulen proliferazioaren gainean 

Urteko hiru sasoi, eta bi itsasaldi-erregimen 

desberdinetan hartutako bi adineko muskuiluen 

zelulen proliferazioa modu integratu batean 

konparatzeko hainbat parametro desberdin 

kalkulatu ziren (3. Taula). Orotariko BrdU- 

markaketa/egun indizea pultsu osteko lehenengo 

12 orduetan behatutako piko maximoan 

erregistratutako zelula BrdU-positiboen kopurua (A, 

3. Taula), balio hau bikoiztuz 24 ordutako datuak 

islatzeko asmoz (B, 3. Taula) eta zuzenketa-faktore 

batez biderkatuz (C, 3. Taula) 3. Taulako balioak 

lortzeko estimatu ziren. Zuzenketa-faktorea, (ZF) 

aurreko esperimentuetan ez bezala (Zaldibar et al., 

2004), BrdU-gehipena jarraia izan beharrean 6 

125


2. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun) naturalean mantendutako mareazpiko muskuiluen liseri-guruineko BrdU 

markaketa (‰ ± desbidazio estandarra) denboraren arabera (eguzki-denbora). (A) Eguneko pultsuko muskuilu gazteak. (B) 

Gaueko pultsuko muskuilu gazteak. (C) Eguneko pultsuko muskuilu helduak (D) Gaueko pultsuko muskuilu helduak. Geziek BrdU 

pultsua eman zitzaien ordua adierazten dute. Marra horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria, argitasun-tarteak; marraduna, 

ilunabar-tarteak; beltza, iluntasun-tarteak),eta esperimentua egin zeneko egunetako itsasaldi baldintzak (zuri, airean; marra 

ondulatuak, uretan adierazten dituzte).Erabilitako ikurren forma eta trama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeak 

adierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p

handiagoak izan ziren muskuilu gazteetan 

helduetan baino (3. Taula). Udazkeneko 

marearteko eta mareazpiko muskuiluen artean 

desberdintasun harrigarriak behatu ziren, 

marearteko muskuiluetan zelulen proliferazioa 

garrantzitsua zen bitartean, mareazpiko 

muskuiluetan kasik ez baitzegoen. Udan bereziki, 

BrdU-markaketa/egun indizea, muskuilu helduetan 

gazteetan baino altuagoa izan zen (3. taula). 

Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamoldeak 

Neguko eta udazkeneko mareazpiko 

muskuiluetan, liseri-epitelioko zelulen proliferazio- 

jarduera antzemanezina izan zen (3. Taula), beraz 

epitelio-zelulen berriztapenean ez zen inolako 

aldamolderik ageri. Aitzitik, desberdina izan arren, 

udako muskuiluetan zein udazkeneko mareazpiko 

muskuiluetan, zelulen proliferazioan aldamolde 


1. Taula: Atariko esperimentuan ikertutako talde experimentaletako liseri-albeolotan egunez eta gabez zein airean edo uretan 

murgilduta egotean, muskuiluetan kuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketa + desbidazio estandarra. 

EGUNEKO 

PULTSUA 

HELDUAK GAZTEAK 

Airean Uretan Guztira AIREAN Uretan Guztira 

Eguna 1±1.414 1±0.89 2 2.4±2.074 6.5±5.45 8.9 

Gaua 0.44±0.73 16.15±16.49 16.59 2.44±2.92 11.25±+9.02 13.69 

Guztira 1.44 17.15 18.59 4.84 17.75 22.59 

GAUEKO 

PULTSUA 

HELDUAK GAZTEAK 

Airean Uretan Guztira Airean Uretan Guztira 

Eguna 3.75±2.5 2.8±0.83 6.55 1.33±1.53 1±1.41 2.33 

Gaua 2.42±2.71 4.75±3.24 7.17 5.91±5.90 7.9±5.51 13.81 

Guztira 6.17 7.55 13.72 7.24 8.9 16.14 

garbiak antzeman ziren (2A, 2C eta 4. Ird.). 

Marearteko eta mareazpiko muskuiluen artean 

proliferazioaren aldamolde desberdinak identifikatu 

zirela aipatzekoa da. 

Mareazpiko muskuiluek, bai heldu zein gazteek, 

BrdU-markaketaren aldamolde bera erakutsi zuten, 

atariko esperimentuetan (Eguneko pultsu- 

esperimentua 2A eta 2C Ird.) deskribatu zen 

moduan. Hala ere, marearteko muskuiluen BrdU- 

markaketaren aldamoldea arras desberdina izan 

zen, eguneko piko bakarra ageri baitzen eta BrdU- 

markaketa balioak ez baitziren aldatu itsasgoran 

zehar, egunez ezta gauez ere (4. Ird.). Udan, liseri- 

guruineko ‰17.25-a BrdU-positiboak izan ziren. 

BrdU-markaketa, eguneko aire-esposizioan 

emendatzen zen (10:00 eta 12:00-ak bitartean), eta 

ia inolako aldaketarik gabe mantentzen zen aire- 

esposizioko ilunabarreko ordua heldu arte (4A Ird.). 

127


Udazkenean, BrdU-markaketa maximoa (‰18.5), 

goizeko aire-esposizioari (gaua bukaera eta 

eguerdi bitartean zabaltzen zena) egokitu zitzaiona 

(08:00), eta berehala, berriz ere hurrengo 

murgiketa-aldia heldu aurretik, maila basaletara 

bueltatzen zen (4B Ird.). 

128 

3. Irudia: Atariko esperimentuan ikertutako talde 

experimentaletako liseri-albeolotan egunez eta gabez zein 

airean edo uretan murgilduta egotean, muskuiluetan 

kuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketa. (A) Eguneko 

pultsuko muskuilu helduak; (B) Gaueko pultsuko muskuilu 

helduak; (C) Eguneko pultsuko muskuilu gazteak; (D) Gaueko 

pultsuko muskuilu gazteak; (E) BrdU-gehipen jarraiko 

esperimentuan (Zaldibar et al., 2004) lortutako batezbesteko 

BrdU-markaketa. Segmentu bertikalek errore estandarra 

adierazten dute. Goiko asteriskoek taldeen arteko 

desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p

EGUNEKO 

PULTSUA 

Helduak 

Gazteak 

GAUEKO 

PULTSUA 

Helduak 

Gazteak 

PULTSU 

JARRAIA 

Helduak 

MAREARTEKO 

MUSKUILUAK 

Uda 


2. Taula: Atariko esperimentuan, esperimentu nagusian eta argitaratutako BrdU-pultsu jarraia (Zaldibar et al., 2004) izan duten 

muskuiluetan itsasaldi-erregimenak, argia/iluntasuna zikloak zein beraien arteko elkarrekintzak duten eragina finkatzeko egindako 

bi bideetako ANOVA-ren laburpena. p(F), Fisher ratioaren probabilitatea. Estatistikoki esangarriak gertatu ziren desberdintasunak 

(p


eragin zuen BrdU-markaketan; muskuilu helduetan, 

ordea, itsasaldi-erregimena eta argi/iluntasun 

zikloaren interakzioa esangarria izan zen. 

Aldamolde hori, BrdU-pultsu jarraia jaso zuten 

mareazpiko muskuilu handietan behatutakoaren 

antzekoa izan zen (Zaldibar et al., 2004). Seguru 

asko, 6 ordutako pultsuaren ostean suertatutako 

BrdUren eskuragarritasunaren beherakadak, 

etengabeko BrdUren gehipenaren kasuan (Zaldibar 

et al., 2004) ez bezala, BrdUren pultsua eman eta 

12 ordutara proliferazio zelularrean aldamolde 

zirkamareala zergaitik desagertuz joan zen 

azalduko luke. Bereziki muskuilu helduen kasuan, 

zeintzuetan, BrdU-markaketa bortitzagoa izanik 

130 

(piko maximo altuagoak), BrdU-ren hornidura 

mugatua gazteetan baino kritikoagoa suertatuko 

litzatekeen. Baldintza horietan, esperimentu 

honetan zeharreko BrdU-maila eskuragarriak 

muskuiluentzat baxuak izatea litekeena da (Potten 

et al., 1992, Candia Carnevali et al., 1997); hala 

ere, BrdU kontzentrazio ez kaltegarriak erabili 

beharrak alde batetik (ikusi Zaldibar et al., 2004), 

eta esperimentu nagusi hauetan ikertu nahi 

genituen marearteko muskuiluak uretan BrdU pean 

mantentzeko denbora mugatuak bestetik, diseinu 

esperimentalaren nondik norakoak agindu 

zizkiguten. 

4. Irudia: 2 egunez fotoperiodo 

(argitasun/iluntasun) eta erregimen mareal 

(airean/uretan) naturalean mantendutako 

muskuiluen liseri-guruineko BrdU 

markaketa (‰ ± desbidazio estandarra) 

denboraren arabera (eguzki-denbora). (A) 

udako marearteko muskuilu handiak, (B) 

udazkeneko marearteko muskuilu handiak. 

Geziek BrdU pultsua eman zitzaien ordua 

adierazten du. Marra horizontalek, 

argiztapen-baldintzak (zuria, argitasuntarteak; 

marraduna, ilunabar-tarteak; 

beltza, iluntasun-tarteak), eta erregimen 

mareala (uhinak, uretan murgilduta) 

adierazten dituzte. Erabilitako ikurren 

forma eta trama desberdinek esangarriki 

desberdinak diren azpitaldeak adierazi 

dituzte, Duncan testaren arabera (p

Gaueko pultsu-esperimentuan behatutako 

zelulen proliferazioaren aldamoldea desberdina 

izan zen. BrdU-markaketa, soilik gauez emendatu 

zen modu esangarrian, elkarren segidako bi piko 

maximo emanez. Egunez (argialdia) aldiz, soilik 

maila basalak neurtu ziren, baita BrdU-pultsua 

eman eta ondorengo laginketetan ere. Izan ere, 

BrdU-markaketa baliorik baxuenak pultsua eman 

osteko orduetan izatea deigarria da; zeren eta 

eguneko pultsu-esperimentuan BrdU-markaketa 

maximoak BrdU-pultsuaren osteko lehen 

momentuetan, erregistratu ziren. Ugaztunetan, 

liseri-traktuko epitelioaren proliferazio zelularra 

gauez gertatzearen berri eman dute zenbait 

ikerlanek (Scheving et al., 1978; Smaaland, 1996). 

Molusku itsastarretan, prozesu zelular batzuk 

nagusiki gabez eta beste batzuk nagusiki egunez 

gertatzen direla deskribatu den arren (Levy et al., 


3. Taula: Esperimentu nagusiaren talde esperimentaletako muskuiluen liseri-albeolotan kuantifikatutako batezbesteko BrdUmarkaketaren 

laburpena. (A) Lehendabiziko 12 ordutan eskuratutako BrdU-markaketaren piko maximoa. (B) 24 ordutan S-fasean 

sartuko liratekeen zelulak egunero 2 piko ematen direla kontutan hartuta. (C) BrdU-pultsu jarraiako esperimentuaren datuak 

(Zaldibar et al., 2004) kontutan hartuta eta zuzenketa-faktorea sartu eta gero, egunero S-fasean sartuko liratekeen zelula kopuru 

teorikoa. (D) Liseri-epitelioa osoa berriztatzeko beharrezkoa liratekeen egun kopurua.. 

N 

E 

G 

U 

A 

GAZTEAK HELDUAK 

A B C D A B C D 

MAREARTEKOA 5.8 11.6 14.04 70 4 8 9.68 100 

MAREAZPIKOA 6.25 12.5 15.12 66 4.25 8.5 10.28 95 

U 

D 

MAREARTEKOA 10 20 24.2 40 17.25 34.5 41.74 24 

A MAREAZPIKOA 21 42 50.82 20 33 66 79.86 12 

U 

D 

A 

Z 

K 

E 

N 

A 

MAREARTEKOA 10.66 21.32 25.79 38 18.5 37 44.77 22 

MAREAZPIKOA 2.33 4.66 5.64 175 2.4 4.8 5.808 170 

1994), muskuiluetan liseri-zelulen proliferazioak 

aldamolde zirkamareala jarraitzen duela 

demostratu da (Zaldibar et al., 2004). Ildo horretatik, 

emaitzok itsasaldia zelulen proliferazio-zikloa 

gobernatzen duen faktore nagusia dela adierazi 

duten arren, fotoperiodoak, neurri batean 

behintzat, zelulen proliferazio-prozesuak modula 

ditzakeela dirudi. Dena den, fotoperiodoaren 

eragina BrdU-hornidura mugatuak sortutako 

artefaktuaren ondorio soila ere izan liteke. Eguneko 

pultsu-esperimentuan, IE x AIZ elkarrekintza 

esangarria suertatu zeneko animalia helduetan, 

piko maximoak handiagoak izan ziren eta 

lehendabiziko argialdian zehar erregistratu ziren, 

BrdU-ren pultsuaren osteko lehen laginketetan. 

Ikerlan honetako eta baldintza esperimental 

berdinetan burututako BrdU-pultsu jarraian 

lortutako emaitzak alderatzeko, egunez zein gauez 

131


lortutako murgilketa- eta aire esposizio-aldietako, 

eta batezbesteko BrdU-markaketa balioak kalkulatu 

ziren Zaldibar et al., (2004) BrdU pultsu jarraiko 

esperimentuan lortutako datuetatik abiatuz eta 

ikerlan honetan aplikatutako kalkuluetan oinarrituz 

(1. eta 2. Taulak, 3E Ird.). Eguneko pultsu- 

esperimentuko gazteetan gertatzen den moduan, 

batezbesteko BrdU-markaketan soilik itsasaldi- 

erregimenak eragiten du modu esangarrian. 

Ondorioz, atariko bi esperimentuen emaitzak 

kontuan hartuz, esperimentu nagusia burutzeko 

eguneko pultsu-esperimentuaren prozedura 

jarraitzea erabaki zen bi arrazoi nagusi hauek direla 

eta: (a) eguneko pultsu-esperimentuan BrdU- 

markaketa handiagoa erregistratu zen, eta (b) 

eguneko pultsu-esperimentuan aurkitutako 

aldamoldeak, aldez aurretik BrdU-gehipen jarraia 

aplikatu zeneko esperimentuan aurkituriko 

aldamoldearen (Zaldibar et al., 2004) antz gehiago 

du. 

Sasoiaren eragina epitelioko zelulen 

berriztapenean 

Zelulen proliferazio-tasen baliorik altuenak udan 

gertatu ziren. Muskuiluen liseri-guruinean urteko 

sasoiaren arabera aldaketak behatu dira, entzimen 

jardueran (Cancio & Cajaraville, 1999; Le Pennec & 

Le Pennec, 2002), lipido-edukietan (Pazos et al., 

2003), parametro peroxisomikoetan (Cancio et al., 

1999) zein liseri-zelulen lisosomen egituran 

(Etxeberria et al., 1994). Tenperatura epelagoak eta 

eurei lotutako egokitze termikoak zein elikagaien 

presentzia areagotua, liseri-epitelioko dinamikan 

oso garrantzitsuak izan daitezke, liseri-epitelioaren 

132 

aktibazioa emanez. Beraz, udako liseri-epitelioko 

zelulen proliferazio-tasa areagotua, alga- eta 

fitoplankton-bloom-ek sortarazitako elikagaien 

eskuragarritasun handiagoarekin erlazionatuta 

egon daiteke, muskuiluen hazkuntza somatikoaren 

emendioa ekar dezakeena. Are gehiago, udako 

jarduera metabolikoaren igoerak zelulak kaltetzea 

eta zelulen berriztapena handitzea sortu izana ere 

posible da, izan ere, neguko muskuiluekin alderatuz 

udakoen ehunetan DNA-harizpi matxuratu- eta 

proteinen desnaturalizazio-tasa altuagoak ikusi 

baitira (Hofmann & Somero, 1996; Shaw et al., 

2000). Beraz, liseri-guruinean zelulen proliferazio 

areagotua, epitelioaren berriztapen eta egituren 

mantenuarekin zein hazkuntza somatikoarekin 

erlazionatuta egongo litzateke. Era berean, 

udazkenean eta neguko azken hilabeteetan, 

tenperaturaren eta elikagaien eskuragarritasunaren 

jaitsierek, eta honekin batera jarduera metaboliko, 

kalte zelular eta zelulen berriztapenaren jaitsierek 

ikerlan honetan behatutako proliferazio-tasa 

txikituak azalduko lituzkete. Halaber, Japoniako 

itsasoko Cremomytilus grayanus espeziearen liseri- 

traktuan ere, Leibson & Frolova-k (1994) zelulen 

proliferazio-tasaren urteko sasoiarekin 

erlazionatutako aldaketa esangarriak topatu 

zituzten, zelulen proliferazioaren piko maximoak 

maiatza-ekaina aldean eta piko minimoak otsaila- 

martxoan topatu zituztelarik. Autore hauek, zelulen 

proliferazioaren jaitsiera, neguko hilabeteetako 

tenperatura baxuek eragindako jarduera metaboliko 

eta elikadura-jarduera gutxituei egotzi zieten.

Adinarekin erlazionatutako aldaketak epitelio- 

zelulen berriztapenean 

Aldez aurretik PCNA immunohistokimika erabiliz 

muskuilu gazteen liseri-guruinak helduena baino 

proliferazio-jarduera altuagoa zuela erakutsi arren 

(Marigómez et al., 1999), ikerlan honetan ez da 

halakorik behatu. Izatez, muskuilu gazte eta 

helduek antzeko proliferazio-tasak erakutsi 

zituzten. Are gehiago, udan, BrdU-markaketa/egun 

indizea muskuilu helduetan gazteetan baino 

altuagoa izan zen. PCNA eta BrdUren 

sentikortasunak desberdinak izatea (Sarli et al., 

1995; Muskhelishvili et al., 2003), emaitza 

eztabaidatsu hauek azaldu lituzke. Are gehiago, 

PCNAren kasuan ez bezala, BrdU-markaketa, 

pultsu osteko BrdUren eskuragarritasunaren 

araberakoa izango litzateke, eta hori gazte eta 

helduen artean desberdina izan liteke, 

muskuiluetan adinarekin alda daitezkeen elikadura- 

jarduera, asimilazio-eraginkortasun eta beste 

prozesu fisiologikoen menpean egonik (Thompson 

et al., 1974; Bayne et al., 1976). Beraz, uretango 

pultsu berak ez du ziurtatu behar muskuilu gazte 

eta helduek BrdUren kopuru bera eta momentu 

berean jaso behar dutenik. Haatik, termino 

kualitatiboetan behintzat, muskuilu gazte eta 

helduek aldamolde patroi bera erakutsi zuten, liseri- 

epiteliora heldutako BrdUren kopurua faktore 

mugatzaile nagusietakoa ez zela izan iradoki 

zuena. Are gehiago, PCNAren bidez lortutako 

emaitzak immunoblotetan oinarritu ziren, ikerlan 

honetan lortutako BrdUren emaitzek 

immunohistokimika oinarri duten bitartean. Ezin 

daiteke baztertu, PCNA immunohistokimika aplikatu 


ondoren, Marigomez et al.-ek, (1999) aurkitu 

zituzten desberdintasunak, liseri-guruineko epitelio- 

zelulen proliferazio-tasaren arteko 

desberdintasunei baino gehiago, homogeneizatuan 

zeuden beste zelula-mota batzuei egokitzea. BrdU 

bidez lortutako emaitza, berriz, liseri-zelulen 

jarduera proliferatzailearekin zuzenean 

erlazionatuta egongo litzateke. 

Itsasaldi-erregimenaren eragina epitelioko 

zelulen berriztapenean 

Marearteko muskuiluetan, aire-esposizio aldian 

S-fase gehiago erregistratu ziren, baina uretan 

murgildutakoan ez zen BrdU-markaketan 

jeitsierarik behatu. Horrek, murgilketa zein aire- 

esposizio aldietan, DNA erreplikapenak, aurrera 

darraiela esan lezake, baina zatiketa zelularra 

nagusia da animaliak airera esposatuak dauden 

bitartean. Badirudi zelulen zatiketa ezingo zela inoiz 

marea altuan gertatu jatearekin batera, DNAren 

sintesia jatearekin batera eman litekeen bitartean. 

Jatearen eta bestelako zenbait jarduera fisiologiko 

garrantzitsuen arteko denboraren bereizketa 

molusku itsastarren kasuan aski deskribaturik dago 

(Susswein et al., 1983). 

Bestalde, marearteko organismoek euren bide 

metabolikoak egunero birritan aldatu beharrean 

topa daitezke, hipoxiaren aldi luze zein laburrak 

jasateren ondorioz. Hori, beherakada metabolikoen 

bitartez lortzen da, bai energia lortzeko bide 

anaerobikoak aktibatuz zein transkripzioaren 

eraenketa edota proteinen fosforilazio itzulgarrien 

bidezko entzima-jardueraren aldaketaz erdietsi 

daitekeena (Greenway & Storey, 2000; Ton et al., 

133


2003; David et al., 2005; Papandreou et al., 2005). 

Oxigenoaren eskaera modu egokian ez 

hornitzekotan, zelulen kopurua ere txikitu beharra 

dago, beraz, hipoxiarekiko erantzuna, ziklo 

zelularraren gelditze edo eta apoptosiaren indukzio 

gisa deskriba daiteke (Ton et al., 2003; Papandreou 

et al., 2005), ornodunetan hipoxiak induzitutako 

faktorea (HIF-1) izeneko transkripzioaren 

suspertzaile baten kontrolpean suertatzen dena 

(Gracey et al., 2001, Ton et al., 2003; Papandreou 

et al., 2005). Airean egoteak eta ondorengo 

hipoxiak, edo uretan murgiltzearen ondorengo 

beroxigenatzeak, DNAren erreplikapen eta prozesu 

mitotikoen geldiaraztea sor izana aintzat har 

genezake, baina, dirudienez hori ez da ikerlan 

honetan behatu dena. Bi prozesuok, zelulei BrdU 

berriaren eskuratzearen gutxitzea lekarkieke eta 

baita uretan murgilduta egon bitartean S-faseari 

ekin zioten zeluletako BrdU-markaketa metatzea 

ekarri, eta hori ikerlan honetan ez da behatu. Ildo 

beretik, eta HIF-1 tankerako proteina bat 

Crassostrea virginica marearteko moluskuan 

identifikatu den arren (NCBI, CD648099), hipoxia 

larriaren ondorioz azpi eta gainadierazitako zenbait 

gene Crassostrea gigas-en aztertu dituen ikerlan 

berriago batek (David et al., 2005), ez du zelulen 

proliferazio-prozesuan inolako eraenketaren berririk 

eman, ezta areagotutako apoptosi-erantzunarena 

ere. Edozein kasutan, ornodunetan gertatzen den 

modu berean, moluskuen neuronetan ere, hipoxia- 

baldintzek apoptosia piz dezaketela proposatu da 

(Jonas et al., 2005; Papandreou et al., 2005). 

Itsasbehera izan bitartean (6 ordu bakarrik) airean 

egotea areagotutako apoptosi-erantzuna eragitea 

134 

ez da litekeena; baina, hori gertatzekotan, zelulen 

berriztatze altuago hori, ikerlan honetan behatutako 

marearteko indibiduoen liseri-guruineko zelulen 

proliferazio gaitasun areagotuarekin orokorrean 

erlaziona liteke. Edonola ere, marearteko 

muskuiluak mareazpikoekin konparatu direnean 

ehunetan areagotutako kalte-zelularra eta 

proteinen desnaturaltzea behatu dira (Hofmann & 

Somero, 1995). 

Aerobiosi/anaerobiosi baldintzez gain, elikatze- 

jarduera ere, muskuilu itsastarren fisiologia eragiten 

duen faktore nagusienetarikoa da. Itsasaldi- 

erregimenak, muskuiluen liseri-epitelioaren forma 

eta funtzioan berebiziko eragina du, jarraiki 

(mareazpiko muskuiluak) edo txandaka 

(mareartekoak) jaten duten arabera liseri-epitelioak 

modu desberdinean funtzionatzen baitu (Owen, 

1972, Robinson et al. 1981; Izagirre, 2002). Hala 

ere, itsasaldia eta fotoperiodoa estuki erlazionaturik 

daude, bibalbioen elikatze-jarduerari dagokionez 

behintzat. Animaliak, batez ere egunez elikatzen 

dira, fotosintesia dela eta, algak ur-zutabean 

nagusiki egunez agertzen baitira. Beraz, gaua 

endekatutako epitelioa berrizta daitekeen unea 

dugu. Mareateko muskuiluen kasuan, DNAren 

bikoizpena edozein momentutan gerta daiteke, 

baina mitosiak muskuiluak airera esposaturik 

daudenean soilik suertatzen dira, jaten ez dauden 

bitartean, hain zuzen. Are gehiago, liseri-guruineko 

epitelioa dinamikoa da oso, eta berau osatzen 

duten bi zelulen profila, kopurua zein edukia, 

elikagai eta ingurumen baldintzen arabera ordu 

gutxiren buruan bortizki alda daitezke (Thompson et 

al., 1974; Soto & Marigómez, 1997; Syasina et al.,

1997). Ildo beretik, itsasbeheran elikatze-tasa eta 

xurgapen-efizientzia emendatzen dira (Wong & 

Cheung, 2001), eta liseri-entzima ugarien jarduerak 

ur-azpian suspertzen dira (Fernandez-Reiriz et al., 

2001). Honela, elikatze-tasak eta entzima-jarduerak 

doituz, xurgapena egonkor manten daiteke (Wong 

& Cheung, 2001). Liseri-epitelioaren berriztapena 

elikatze-ziklo bakoitzarekin batera burutzen dela 

iradoki da, hau da, marearteko muskuiluetan 

birritan egunero (Nelson & Morton, 1979). Horrela, 

mareazpiko muskuiluetan liseri-zelulen 

proliferazioak aldamolde zirkamareala darraien 

bitartean (Zaldibar et al. 2004; ikerlan honetako 

emaitzak), marearteko muskuiluetan, pairatu 

beharreko baldintza mugatuagoak direla eta, 

itsasaldiak eta fotoperiodoak liseri-zelulen 

proliferazioa agindu lezakete, eta, ondorioz, BrdU- 

markaketen emendioa egunean behin eta bortizki 

gertatuko da. 

Ondorioak 

Talde esperimentalen arteko desberdintasun 

nabarmenenak itsasaldi-erregimen eta urteko 

sasoiaren aldaketekin antzeman dira. Azken finean, 

ez dirudi adinak proliferazio-aldamoldean eragin 

handiegirik duenik. Areagotutako jarduera 

metabolikoa dela eta, uda hazkuntza somatiko 

gehien edo zelulen berriztapen-tasa altuagoa duen 

sasoia dela ondorioztatu dugu, muskuilu gazte zein 

helduek antzeko proliferazio-aldamoldea erakutsiz. 

Bestalde, itsasaldi-erregimen desberdina duten 

muskuiluen artean desberdintasun handiak daude, 

baina, oro har, liseri-epitelioan zelulen proliferazioa 

liseriketa bukatutakoan gertatu behar da. 


BIBLIOGRAFIA 

Bayne BL, Widdows J, Thompson RJ (1976) Physiology I. 121- 

206 orr. Non: Marine mussels, their ecology and 

physiology. Bayne BL (ed). Cambridge University Press. 

Cambridge. 

Cancio I, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of xanthine 

oxidoreductase activity in the digestive gland cells of the 

mussel Mytilus galloprovincialis: A biochemical, 

histochemical and immunochemical study. Biol. Cell 91: 

605-615. 

Cancio I, Ibabe A, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of 

peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in 

mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with 

lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C 123:135-144. 

Candia Carnevali MD, Bonasoro F, Biale A (1997) Pattern of 

bromodeoxyuridine incorporation in the advanced stages 

of arm regeneration in the feather star Antedon 

mediterranea. Cell Tiss. Res. 289:363-374. 

David E, Tanguy A, Pichavant K, Moraga D (2005) Response of 

the Pacific oyster Crassostrea gigas to hypoxia exposure 

under experimental conditions. FEBS J. 272:5635-5662. 

Etxeberria M, Sastre I, Cajaraville MP, Marigómez I (1994) 

Digestive lysosome enlargement induced by experimental 

exposure to metals (Cu, Cd and Zn) in mussels collected 

from a zinc polluted site. Arch. Environ. Toxicol. 27:338- 

345. 

Fernandez-Reiriz MJ, Labarta U, Navarro JM, Velasco A (2001) 

Enzymatic digestive activity in Mytilus chilensis (Hupe 

1854) in response to food regimes and past feeding history. 

J. Comp. Physiol. 171:449-456. 

Gracey AY, Troll JV, Somero GN (2001) Hypoxia-induced gene 

expression profiling in the euryoxic fish Gillichthys 

mirabilis. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 98:1993-1998. 

Greenway SC, Storey KB (2000) Seasonal change and 

prolonged anoxia affect the kinetic properties of 

phosphofructokinase and pyruvate kinase in oysters. 

Comp. Biochem. Physiol. B 170:285-293. 

Hofmann GE, Somero GN (1996) Interspecific variation in 

thermal denaturation of proteins in the congeneric mussels 

Mytilus trossulus and M. galloprovincialis: Evidence from 

the heat-shock response and protein ubiquitination. Mar. 

Biol. 126:65-75 

135


Izagirre U (2002) Itsasaldien, sasoien, elikadura-erregimenen 

eragina liseri-zelulen lisosometan eta euren 

kutsatzaileekiko erantzunetan. Lizentziatura-Tesia. 78 orr. 

Jonas EA, Hickman JA, Hardwick JM, Kaczmarek LK (2005) 

Exposure to hypoxia rapidly induces mitochondrial channel 

activity within a living synapse. J. Biol. Chem. 280:4491- 

4497. 

Leibson, N.L & Frolova, L.T. 1994. Winter-spring essential 

reorganization of cell proliferation in the digestive tract 

epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol. 

118:471-477. 

Le Pennec, G & Le Pennec, M. 2002. Molecular analysis of the 

seasonal expression of genes coding for different 

functional markers of digestive gland of the bibalve mollusk 

Pecten maximus (L). Comp. Biochem. Physiol B 133:417- 

426. 

Levy M, Weller A, Susswein AJ (1994)Learned changes in the 

rate of respiratory pumping in Aplysia fasciata in response 

to increases and decreases in seawater concentration. 

Behav. Neurosci. 108:161-170. 

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical 

localisation of proliferating cells in mussel digestive gland 

tissue. Histochem. J. 31:781-788. 

Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL, Henderson EB 

(2003) Evaluation of cell proliferation in rat tissues with 

BrdU, PCNA, Ki-67(MIB-5) immunohistochemistry and in 

situ hybridization for histone mRNA. J. Histochem. 

Cytochem. 51:1681-1688. 

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial 

renewal in the digestive gland tubules of the marine 

prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 

45:262-283. 

Okudela K, Ito T, Kameda Y, Nakamura N Kitamura H (1999) 

Immunohistochemical analysis for cell proliferation-related 

protein expression in small cell carcinoma of the 

esophagus; a comparative study with small cell carcinoma 

of the lung and squamous cell carcinoma of the 

esophagus. Histol. Histopathol. 14:479-485. 

Owen G (1972) Lysosomes, peroxisomes and bivalves. Sci. 

Prog. Ser. Oxf. 60:229-318. 

Papandreou I, Powel A, Lim AL, Denko N (2005) Cellular 

136 

reaction to hypoxia: sensing and responding to an adverse 

environment. Mut. Res. 569: 87-100. 

Pazos AJ, Sánchez JL, Román G, Pérez-Parallé ML, Abad M 

(2003) Seasonal change in lipid classes and fatty acid 

composition in the digestive gland of Pecten maximus. 

Comp. Biochem. Physiol. B 134: 367-380. 

Potten CS, Kellet M, Rew DA Roberts SA. (1992) Proliferation 

in human gastrointestinal epithelium using 

bromodeoxyuridine in vivo: data for different sites, 

proximity to a tumour, and polyposis coli. Gut 33:524-529. 

Robinson WE, Pennington MR, Langton RW (1981) Variability 

of tubule type within the digestive glands of Mercenaria 

mercenaria L., Ostrea edulis L., Mytilus edulis L. J. Exp. 

Mar. Biol. Ecol. 54:265-276. 

Sarli G, Benazzi C, Preziosi R, Marcato PS (1995) Assessment 

of proliferative activity by anti-PCNA monoclonal antibodies 

in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and correla- 

tion with mitotic index. Vet. Pathol. 32:93-96. 

Scheving LE, Burns ER, Pauly JE, Tsai T (1978) Circadian 

variation in cell division of the mouse alimentary tract, bone 

marrow and corneal epithelium. Anat. Rec. 191:479-486. 

Smaaland R. 1996. Circadian rhythm of cell division. Prog. Cell 

Cycle Res. 2:241-266. 

Shaw JP, Large AT, Livingstone DR, Doyotte A, Renger J, 

Chipman JK, Peters LD (2000) Elevation of cytochrome 

P450-immunopositive protein and DNA damage in mussels 

(Mytilus edulis) transplanted to a contaminated site. Mar. 

Environ. Res. 54:505-509. 

Soto M, Marigómez I (1997) Metal bioavailability assessment in 

“mussel-watch” programmes by automated image analysis 

of autometallographical black silver deposits (BSD) in 

digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156:141- 

150. 

Susswein AJ, Gev S, Feldman E, Markovich S (1983) Activity 

patterns and time budgeting of Aplysia fasciata under field 

and laboratory conditions. Behav. Neural Biol. 39:203-220. 


alterations in the digestive diverticula of Mizuhipecten 



44:85-98. 



of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Assess. U. 

K. 54:699-712. 

Ton C, Stamatiou D, Liew CC (2003) Gene expression profile of 

zebrafish exposed to hypoxia during development. Physiol. 

Genom. 13:97-106.

Wong WH, Cheung SG (2001) Feeding rhythms of the green- 

lipped mussel, Perna viridis (Linnaeus, 1758) (Bivalvia: 

Mytilidae) during spring and neap tidal cycles. J. Exp. Mar. 

Biol. Ecol. 257:13-36. 


Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2004) Circatidal variation in 

epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland 

and stomach. Cell Tiss. Res. 318:395-402. 

137


138

Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean. 

Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio 

pean jarritako Littorina littorea molusku 

itsastarraren liseri-guruinean 

Laburpena: Littorina littorea magurio itsastarren zelula basofilikoen proliferazioa eragiteko 1.25 mg Cd/l 

pean jarri ziren 21 egunez. Ondoren, magurioak itsas-ur garbitan 10 egunez arazten utzi ziren, zelulamoten 

ordezkapena itzulgarria zen antzemateko. Liseri-guruinak, Carnoy fixatzailean fixatu eta analisi 

histologikoak egiteko parafinan inkluditu ziren. Zelula basofilikoen (Vv BAS ) eta liseri-zelulen (Vv DIG ) 

dentsitate bolumetrikoa kuantifikatzeko hematoxilina eosinaz tindatutako ebakien gainean analisi 

estereologikoak burutu ziren. Zelulen tamaina eta kopuru absolutua estimatu ondoren, behatutako 

aldaketek liseri-zelulen galerari eta aldi bereko zelula basofilikoen hipertrofiari egotzi zitzaien, eta ez zelula 

basofilikoen kopuruaren emendioari. Hamar egunetako arazketa-aldiaren ondoren zelula-moten osaketa 

eta tamaina kasik balio normaletara itzuli ziren. PCNA immunohistokimikak, Cd pean egondako eta 

arazketa taldeko magurioen liseri-epitelioan kontrolean baino liseri-zelula proliferatzaile gehiago zeudela 

erakutsi zuen. Hau da, liseri-zelulen galera netoak liseri-zelulen proliferazioaren areagotzearekin bat 

zetorrela iradoki du, zelula basofilikoen ekarpenak zerikusirik ez zuen bitartean. Beraz, Cd pean egoteak, 

Cd-aren detoxifikazioa burutzeko liseri-zelulen berriztapena areagotuko zuela dirudi. Autometalografia 

(AMG) bitartez errebelatzen diren zilarrezko hauspeakin beltzak (BSD; ingeleraz, black silver deposits), 

nagusiki Cd ioien inguruan eratuak, liseri-zelulen lisosometan agertu ziren, zelula basofilikoetan BSDen 

presentziarik behatu ez zen bitartean. Arazketa-aldia burutu eta gero BSD ez ziren horren nabarmenak 

izan. Liseri-zelulen lisosometan gertatutako aldaketak kuantifikatzeko, kriostatoko ebakien gainean ßglukuronidasa 

jardueraren erakusketa histokimikoa gauzatu zen. Gerora, eta irudi-analisi automatizatuaren 

laguntzaz liseri-lisosometan gertatutako aldaketak neurtu ziren. Cd pean mantendutako magurioetan 

handiagotutako lisosomak behatu ziren, arazketa-aldiaren hamar egunak eta gero berriro ere kontrolen 

balioetara itzuliz. Liseri-zelulen proliferazioan ikusitako aldaketek, liseri-zelulen galerak eta zelula 

basofilikoen hipertrofiak, ez zuten ikerlan honetan erabilitako esposiziozko (BSD) eta efektuzko (erantzun 

lisosomikoak) biomarkatzaileen gainean eragin nabarmenik eduki. 

Gako-hitzak: zelula-moten ordezkapena, magurioa, kadmioa, PCNA, liseri-guruina, efektu- eta 

esposizio-biomarkatzaileak. 

139


Reversible cell-type replacement in the digestive gland epithelium of the 

marine mollusc Littorina littorea exposed to cadmium 

Abstract: Marine winkles Littorina littorea were exposed to 1.25 mg/l Cd for 21 days to provoke the 

proliferation of basophilic cells. Then, animals were depurated in clean seawater for 10 days to determine 

whether CTR was reversible. Digestive glands were fixed in Carnoy and paraffin embedded for histological 

analysis. The volume densities of basophilic cells (Vv BAS ) and digestive cells (Vv DIG ) were calculated by 

stereology on haematoxylin-eosin stained sections. Vv BAS raised and Vv DIG decreased in Cd exposed 

animals. After estimation of cell size and absolute cell numbers, these changes were attributed to digestive 

cell loss and concomitant basophilic cell hypertrophy but not to increased numbers of basophilic cells. The 

cell type composition and cell size almost fully returned to normal values after 10 days depuration. 

Accordingly, PCNA immunohistochemistry demonstrated that proliferating digestive cells were more 

abundant in winkles exposed to Cd and after 10 day depuration than in control specimens, suggesting that 

net digestive cell loss was accompanied by increased digestive cell proliferation and that CTR was not 

related to any contribution by basophilic cells. Thus, Cd-exposure seems to provoke an enhanced digestive 

cell turnover in order to cope with Cd detoxification. Autometallography revealed the presence of black silver 

deposits (BSD), most likely formed around Cd ions, in digestive cell lysosomes whereas basophilic cells 

appeared devoid of them. After depuration, BSD were less conspicuous. Changes occurring in digestive cell 

lysosomes were quantified by automatized image analysis on cryostat sections stained to demonstrate ßglucuronidase 

activity. Enlarged lysosomes were observed in Cd-exposed winkles while return to control 

levels ocurred after 10 days depuration. Changes in digestive cell proliferation, digestive cell loss and 

basophilic cell hypertrophy did not apparantly affect the exposure (BSD) and effect (lysosomal responses) 

biomarkers investigated herein. 

Key Words cell-type replacement, winkle, cadmium, PCNA, digestive gland, effect and exposure 

biomarkers. 

140


Sustitución reversible de tipos celulares en el epitelio de la glándula 

digestiva del molusco marino Littorina littorea expuesto a cadmio 

Resumen Bígaros marinos Littorina littorea fueron expuestos a 1.25 mg/l de Cd durante 21 días con 

el fín provocar la proliferación de células basofílicas. Posteriormente, los animales se depuraron por un 

período de 10 días en agua de mar limpia con el fin de observar si el recambio de tipos celulares era 

reversible. Las glándulas digestivas se fijaron en Carnoy fueron incluídas en parafina. La densidad 

volumétrica de células basofílicas (Vv BAS ) y células digestivas (Vv DIG ) se calculó mediante estereología 

en muestras teñidas con hematoxilina-eosina. En los bígaros expuestos a Cd se observó un aumento en 

los valores Vv BAS y un descenso en los valores Vv DIG . Después de estimar el tamaño y el número 

absoluto de células, éstos cambios se atribuyeron a la pérdida de células digestivas y a la hipertrofia 

concomitante de las células basofílicas, y no al aumento de éstas. Después del período de 10 días de 

depuración, la composición de tipos celulares y el tamaño de las células volvieron a valores cercanos a los 

normales. La inmunohistoquímica de PCNA demostró que la proliferación de células digestivas era mayor 

en los bígaros expuestos a Cd y después de 10 días de depuración que en los bígaros control, sugiriendo 

que la pérdida neta de células digestivas viene acompañada por el aumento en la proliferación de células 

digestivas y no tiene relación alguna con la contribución de las células basofílicas. Por lo tanto, la 

exposición a Cd parece provocar una renovación aumentada de células digestivas. Los depósitos negros 

de plata (BSD; del inglés, black silver deposits) mayormente formados alrededor de los iones de Cd y 

revelados mediante autometalografía se localizaron en los lisosomas de las células digestivas, mientras 

que no se detectaron en las células basofílicas. En el grupo de los bígaros depurados los depósitos fueron 

menos llamativos. Se midieron los cambios ocurridos en los lisosomas de las células digestivas mediante 

análisis de imagen sobre muestras de criostato, previamente teñidas para la demostración de la enzima ßglucuronidasa. 

Se observó un mayor tamaño de lisosomas en los bígaros expuesto a Cd, que volvieron a 

los valores controles después de los 10 días de depuración. Los cambios en la proliferación de células 

digestivas, la pérdida de células digestivas y la hipertrofia de células basofílicas no tuvieron efecto sobre 

los biomarcadores de exposición (BSD) y efecto (respuestas lisosómicas) empleados en este trabajo. 

Palabras clave: sustitución de tipos celulares, bígaro, cadmio, PCNA, glándula digestiva, biomarcadores 

de efecto y exposición. 

141


142


SARRERA 

Moluskuen liseri-guruina ingurumen-toxikologia 

ikerketetarako itu-organoa da; izan ere 

,kutsatzaileen metaketa eta detoxifikazioan parte 

hartzen du (Marigómez et al., 2002). Orokorrean, 

molusku gehienen liseri-guruina antzeko 

antolaketa-eredua aurkezten du; hots, liseri- 

dibertikulua epitelio bakun batez osaturik dago eta 

bertan bi zelula-mota agertzen dira, liseri-zelula eta 

zelula basofilikoa, alegia (Morton, 1983). Liseri- 

zelulek, elikagaien liseriketa intrazelularrean parte 

hartzen dute, eta oso sistema endo-lisosomiko 

garatua dute; zelula basofilikoak, bestalde, zelula 

jariatzaileak dira, eta gastropodotan pikor 

mineralizatu zitoplasmatikoak izan ditzakete 

(Mason, 1983). Baldintza fisiologiko normaletan, 

liseri-zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak 

dira, baina estres-egoera desbedinetan, zelula 

basofilikoen proportzio erlatiboa emendatzen da, 

fenomeno hau zelula-moten ordezkapena (CTR; 

ingeleraz, cell type replacement) izenarekin 

ezaguna delarik (Cajaraville et al., 1990a; 

Marigómez et al., 1990). Zelula-moten 

ordezkapena, kutsatzaileen eragin pean egondako 

taxon desberdineko eta habitat desberdineko 

moluskuetan ematen den fenomeno orokorra da 

(Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; 

Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al., 

1990; 1996). Kutsatzaile organiko (Cajaraville et 

al., 1990a) zein metaliko (Soto & Marigómez, 

1997a; 1997b) desberdinen kontzentrazio 

subletalen pean jarritako bibalbioek, nagusiki zelula 

basofilikoz osatutako liseri-guruina aurkezten dute. 

Modu berean, laborategian Cd pean jarritako 

gastropodo itsastarrek, zelula basofiliko 

hipertrofiatuz osatutako liseri-tubuluak aurkezten 

dituzte (Marigómez et al., 1990). Zelula 

basofilikoen kopuru erlatiboaren igoera esangarria 

hidrokarburo aromatikoen pean jarritako 

gastropodo itsastarretan ere behatu da (Cajaraville 

et al., 1990b). 

Zelula-moten ordezkapena, liseri-zelulen 

kopuruaren murrizpenarekin zuzenean edo, zelula 

basofilikoen proliferazioarekin erlazionatuta 

dagoen erantzun beharra dago. Oraintsu, gure 

taldeak muskuiluen liseri-guruineko liseri-zelulak 

zein zelula jariatzaileak PCNA eta BrdUren 

immunohistokimikarekiko erreaktiboak direla 

erakutsi du (Marigómez et al., 1999, Zaldibar et al., 

2004). Beraz, zelula-mota bakoitzak ziklo zelularra 

bere aldetik burutzen du . Bestalde, 1.25 mg Cd/l 

itsas-ur kotzentrazioak, magurioen liseri-guruineko 

zelula basofilikoen proportzio erlatiboen igoera 

esangarria sorterazten duela deskribatu da 

(Marigómez et al., 1990). Ekarpen horiek kontuan 

hartuta, ikerlan honen helburua, zelula-moten 

ordezkapena prozesu itzulgarria ote den, eta 

zelula basofilikoen proliferazioa edo liseri-zelulen 

galera dela medio ematen ote den argitzea da. 

Gainera, prozesua itzulgarria izatekotan zelula- 

moten ratio normalera itzultzea liseri-zelulen 

proliferazioaren areagotze batek eragin ote duen 

finkatu behar da. Helburu horiek betetzeko, 

magurioak 1.25 mg Cd/l itsas-ur kontzentrazio 

pean jarri ziren 3 astez, baldintza esperimental 

horietan zelula-moten ordezkapena sortaraz 

zitekeela bagenekielako (Marigómez et al., 1990), 

143


eta, ondoren, 10 egunez itsas-ur garbitan eduki 

ziren; izan ere, aldez aurretik arazketak zelula 

basofilikoen kopuruan jaitsiera eragin dezakeela 

ikusi da. 

Zelula-moten ordezkapen-prozesuak hainbat 

emaitza biokimiko eta bioenergetiko eztabaidatsu 

azal ditzake, uretan eta muskuilu itsastarren ehun 

bigunetan neurtutako metal-kontzentrazioak 

erlazionatzerakoan behatutako emaitza 

eztabaidakorrak, besteak beste. Marigómez et al. 

(1996, 1998), Soto et al. (1998a) eta Soto & 

Marigómez-ek (1997b) esposizio luze edo 

kronikoen ondorioz liseri-epitelioetan metalen 

metaketarik ematen ez zela aurkitu zuten; izan ere, 

epitelio horietan ez da apenas liseri-zelularik 

ikusten, eta euren lisosomak metaleen metaketa- 

toki nagusia dira. Zelula-espezifiko diren hainbat 

biomarkatzaile (parametro lisosomikoak, 

peroxisomen proliferazioa...) erabiltzen direnean 

lortutako emaitzak interpretatzerakoan, antzeko 

ondorioak lortu daitezke. Kutsatzaileen eragin pean 

jartzeak liseri-zeluletako lisosomen tamainaren 

handipena eragiten du normalean (Cajaraville et al., 

1995a; Etxeberria et al., 1995; Marigómez et al., 

2005a), baina zelai ikerketetan denbora tarte 

laburrez kutsatzaile organikoen pean jarritako 

animalietan lisosomen tamainaren txikipena 

deskribatu da baita (Marigómez & Baybay- 

Villacorta, 2003). Metaketa-gaitasuna eta 

biomarkatzaileen erantzun batzuk zelula-mota 

espezifikoak direnez, zelula-moten osaketan 

ematen diren aldaketak, biometatze eta 

biomarkatzaileen ikerketetan, ustekabeko emaitza 

gisa ager daitezkeela susma daiteke. Testuinguru 

144 

honetan, ikerketa honen bigarren helburua, zelula- 

moten ordezkapenak, metal-esposizio eta efektu 

biologikozko biomarkatzaile ezagunak diren AMGz 

lortutako zilarrezko hauspeakin beltzen (BSD; 

ingeleraz, black silver deposits) hedapenean eta 

lisosomen tamaina aldaketan eraginik ote duen 

ikustea da (Cajaraville et al., 1995a; Marigómez et 

al., 2002). 







Prozedura esperimentala 

2.5-3.5 zm altuera kolumelarreko Littorina 

littorea magurioak merkatu batean eskuratu ziren 

2001. eko urtarrilean eta litro bateko akuarioetan 

mantendu ziren moldatzen 17ºC-tan 7 egunez. 

Girora moldatzeko denbora igaro ondoren, 

magurioak 1.25 mg Cd/l-pean jarri ziren 21 egunez. 

Kontzentrazio subletal horrek liseri-guruineko 

epitelioko zelula basofilikoen proportzio 

erlatiboaren igoera esangarria sortarazten duela 

aldez aurretik egindako esperimentuetan 

deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Esposizio- 

denbora bitartean, magurioak aldez aurretik 

izoztutako Fucus vesiculosus algaz “ad libitum” 

elikatu ziren. Janaria eta ura 2 egunero aldatu ziren. 

Kadmio peko 21 egunak igaro ondoren, talde 

esperimental bakoitzeko 10 magurio hartu ziren, eta


liseri-guruina/gonada konplexua disekzionatu zen 

gero deskribatuko den bezala. Gainontzeko 

magurioak, itsas-ur garbitan mantendu ziren 10 

egunez, arazteko asmoz, eta ondoren aurreko 

magurioen modu berean prozesatu ziren. 

Laginen prozesaketa 

Liseri-guruina/gonada konplexuaren zati txikiak 

Carnoy fixatzailean (%60 etanol absolutua, %30 

kloroformoa eta %10 azido azetikoa) fixatu ziren 

ordu batez 4°C-tan. Fixatu ondoren, laginak 

goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie 

batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu 

ziren 60°C-tan. Ebakiak (7 µm-ko lodiera) 

mikrotomoan ebaki ziren. Ehunaren beste zati txiki 

bat, %10 sakarosa zuen 0.1 M fosfato 

indargetzailean (pH 7.4) murgildu zen 10 minutuz 

4ºC-tan. Ondoren, gehiegizko indargetzailea 

iragazi-papera erabiliz lehortu, eta Cryo-M-Bed 

(TAAB Laboratories Equipments Ltd., Aldermaston, 

Ingalaterra) konposatuan inkluditu zen, amaieran 

laginak nitrogeno likidotan izoztu ziren. Ehunaren 

hirugarren zati bat, zati txikitan xehetu zen (


berberak erabiliz (7 µm), liseri-zelulen (Vv DIG ) eta 

zelula basofilikoen (Vv BAS ) dentsitate 

bolumetrikoak kuantifikatzeko prozedura 

estereologikoa aplikatu zen. Horretarako 

kontaketak lagin bakoitzean azarez aukeratutako 

zelai batetan egin ziren kontaketak guztira talde 

esperimental bakoitzeko 10 kontaketak burutuz. 

Analisi estereologikoak burutzeko Nikon Optiphot 

mikroskopio bati atxiki zegoen irudi-hodi bat erabili 

zen (amaierako handipena x670). Vv DIG eta 

Vv BAS kalkulatzeko Weibel gratikula 

(multipurpouse test system M-168; Weibel, 1979) 

erabili zen eta liseri-zelula zein zelula basofilikotan 

eroritako puntuak kuantifikatu ziren eta kalkuluak 

Delesse-ren printzipioen arabera gauzatu ziren 

(Weibel, 1979). 

Liseri-zelula eta zelula basofilikoen 

bolumenaren estimazio absolutuak dentsitate 

bolumetrikoen datuetan oinarrituz burutu ziren. 

Liseri-zelulek eta zelula basofilikoek betetzen zuten 

bolumena (V DIG = Vv DIG x 17.8 x 10 6 µm 3 ; V BAS 

= Vv BAS x 17.8 x 10 6 µm 3 ) arbitrarioki 

aukeratutako liseri-guruinaren bolumen batekiko 

kalkulatu zen (17.8 x 10 6 µm 3 gutxi gorabehera). 

Bolumen hori kalkulu estereologikoak egiteko 

erabilitako Weibel gratikularen (356000 µm 2 ) 

arbitrarioki aukeratutako 50 µm-ko lodierako 

ebakidura bati dagokio. Lodiera hori zelula 

basofilikorik handiena guztiz barneratua egotea 

ahalbidetzen du. 

Ondoren, liseri-guruineko zati arbitrario horretan 

liseri-zelula eta zelula basofilikoen kopurua 

kalkulatzeko, liseri-zelulek tamaina konstantea 

zutela onartu zen (talde esperimental 

146 

desberdinetan egindako behaketa mikroskopikoek 

liseri-zelulen altueran aldaketa txikiak erakusten 

dituzte, 30-33 µm, kalibrea konstante mantendu 

zelarik, 6-8 µm), eta zelula basofilikoen tamainen 

estimazio errealak aldez aurretik azaldu bezala egin 

ziren. 

PCNA immunohistokimika 

Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) mikrotomo batean 

lortu eta aldez aurretik (3-amino propil 

trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jazo 

ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren, 

beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie 

batean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz 

(PBS; ingeleraz, phosphate-buffered saline) garbitu 

ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, 

ebakiak %3 zuen H 2 O 2 an inkubatu ziren 5 minutuz, 

eta berriro PBS-az garbitu ziren. Ebakiak, 

Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, 

Burlingame, Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak) 

hornitutako suero blokeatzailean 30 minutuz 

inkubatu ziren giro-tenperaturan, eta berriro ere 

PBS-an garbitu ziren. Gero, ebakiak PCNAren 

aurkako antigorputz espezifikoan (PC10, 1:1500 

PBSan) inkubatu ziren. Laginak PBS-az garbitu 

ondoren, Vectastain Elite ABC Kit-aren bitartez eta 

abidina-biotina entzima-konplexua erabiliz 

antigorputza ikustarazi zen. Laburki, ebakiak, PBS- 

an diluitutako saguaren aurkako zaldiaren IgG 

antigorputz sekundario biotinilatuan inkubatu ziren, 

30 minutuz, eta PBS-an garbitu. Peroxidasa 

jarduera 3,3´-diaminobenzidina tetrahidrokloridoa 

(DAB) eta %0.03 H 2 O 2 zuen PBS indargetzailea 

erabiliz ikustarazi zen. Azkenik, ebakiak


hematoxilinaz kontrastatu ziren (10 s), dabilen 

uretan garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan 


Amerikako Estatu Batuak) montatu ziren. 

Mikrografiak, Olympus BX50 mikroskopio batetara 

atxiki zegoen Olympus PM20 argazki-kamera batez 

erdietsi ziren. 

Autometalografia 

Metalak, Danscher-ek (1984) deskribatutako eta 

Soto et al.-ek (1998b) modifikatutako prozedura 

jarraituz determinatu ziren parafinan inkluditutako 

laginetan. Ebakiak (7 µm), laburki xilenoz 

desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko 

etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean 

(37ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak 

ondoren, argazki-emultsio geruza fin eta uniforme 

batez estali ziren gela ilunean (Ilford Nuclear 

Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra). 

Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean 

(30 minutu) eta laginak Ultrafin Tetenal SF (1:5 

diluzioa ur destilatuan) (Tetenal AG & Co, 

Norderstedt, Alemania) errebelatzaile komertziala 

erabiliz errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren, 

errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa 

zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez, eta 

azkenik erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa- 

Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu 

zen 10 minutuz. Hauspeakin beltz (BSD) moduan 

agertutako metalak irudi-analisi baten bitartez 

(Biological Measurement System software BMS- 

Sevisan, Bilbo, Espainia.) kuantifikatu ziren. 

Horrela, BSDen dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) 

kalkulatu zen: Vv BSD = V BSD /V EH non V BSD 

BSDen bolumena den eta V EH ehunaren 

bolumena. 

Lisosomen estereologia 

ß-glukuronidasa entzimaren erreakzio 

histokimikoa fixatu gabeko kriotomo ebakietan 

burutu zen Moore-k (1976) deskribatu eta 

Cajaraville et al.-ek, (1989) modifikatu legez. 

Ebakiak (8 µm) -21ºC-ko kabinako tenperatura 

zuen CM3000 kriotomoan (Leica Instruments 

GmbH, Nussloch, Alemania) lortu ziren, ebakiak 

giro-tenperaturan zeuden portaobjektuetan jazo 

ziren eta -40ºC-tan mantendu ziren tindatu aurretik. 

Ebakiak, 28 mg naphtol AS-BI glucuronide 1.2 ml 

sodio bikarbonatoan (50 mM) disolbatutako eta 100 

ml-arte %2.5 NaCl zuen 0.1 M sodio azetato 

indargetzailean (pH 4.5) murgildu ziren. Disoluzio 

honetan, %20 (W/V) polibinilo alkoholezko 10-21 g 

disolbatu ziren egonkortzaile koloidal gisa. Ebakiak 

40 minutuz 37ºC-tan inkubatu ziren etengabeko 

irabiatzea zuen bainu batean. Ondoren, laginak 

%2.5 NaCl-tan garbitu ziren 2 minutuz eta 37ºC- 

tan,eta %2.5 NaCl eta 1 mg/ml Fast Garnet GBC 

0.1 M fosfato indargetzailean (pH 7.4) tindatu ziren 

10 minutuz giro tenperaturan. Ebakiak, Baker 

formol kaltzikoan (%4 formaldehido, %1 CaCl 2 eta 

%2.5 NaCl) fixatu ziren 10 minutuz 4ºC-tan. 

Laburki, uretan garbitu eta gero %0.1 zuen Fast 

Green FCF disoluzioan kontrastatu zen 2 minutuz. 

Azkenik, ebakiak Kaiser gelatina glizerinatuan 

muntatu ziren. 

Prozedura estereologikoa aplikatuz eta irudi- 

analisia erabiliz liseri-zelulen lisosomen egitura 

kuantifikatu zen (Cajaraville et al., 1995b; 

147


Etxebarria et al., 1994). Sistema, aldez aurretik 

Cajaraville et al.-ek, (1991) deskribatu dutenez 

B&W-CDD bideo-kamera batez, Leitz Laborlux 

mikroskopio batez eta Pentium ordenagailu batez 

osaturik dago, softwarea BMS sistema izanik 

(Sevisan, Bilbo, Espainia). x100 handipeneko 

objektiboa erabili zen eta lisosomak eta liseri- 

zelulen zitoplasma bereiziz irudi binarizatuak erabili 

ziren. Lehenengo neurketak eskuz doitu ziren, lagin 

desberdinen arteko tindaketa-intentsitate 

desberdintasun txikiak ekiditeko asmoz. Irudi- 

analisi sistemak hurrengo parametroak sortzen ditu: 

148 

lisosomen dentsitate bolumetrikoa (Vv LYS = 

V L /V C ), dentsitate superfiziala (Sv LYS = S L /V C ), 

azalera/bolumena ratioa (S/V LYS = S L /V L ) eta 

dentsitate numerikoa (Nv LYS = N L /V C ) non V = 

bolumena, S = azalera, L = lisosomak eta C = liseri- 

zelulen zitoplasma baitira. Formula 

estereologikoak, batezbesteko diametroa 

ebakiduraren lodiera baino txikiagoak duten 

partikulentzako zuzenketa-faktorea dauka sartuta 

(Lowe et al., 1981). Cajaraville et al.-en, (1995a) 

arabera, 5 neurketa burutu ziren liseri-guruin 

bakoitzeko. 

1. Irudia: Magurio kontrol (A eta B) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako magurioen (C eta D) irudi histologikoak, bai hematoxilinaeosinaz 

(A eta C) zein toluidina urdinez (B eta D) tindatutako ebakietan. Geziek zelula basofilikoak adierazten dituzte. L) liseritubuluen 

argia. Eskala-marrak: 50 µm (A, B eta D) eta 25 µm (C).


Estatistika 

Emaitzak estatistikoki analizatzeko SPSS/PC+ 


erabili zen. Lisosomen Vv eta Nv logaritmikoki 

transformatu ziren analisi estatistikoa aplikatu 

aurretik, indibiduoen arteko bariantza 

batezbestekoaren menpekoa zelako. Aldagai 

esperimentalen esangarritasuna, bide bateko 

bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu 

zen, eta parekatutako batezbestekoak, Duncan 

testa erabiliz konparatu ziren. 

EMAITZAK 

Liseri-epitelioaren analisi morfometriko eta 

estereologikoa 

Esperimentuak iraun zuen denbora guztian 

magurio kontrolen liseri-guruinean behatutako 

zelula-mota nagusia pikor zitoplasmatiko 

heterogeneoak zituen liseri-zelula izan zen. Zelula 

basofilikoak, beraien soslai piramidal 

karakteristikoarekin taldekatuak agertu ziren (1A 

eta 1B Ird.). Bestalde, zelula basofilikoen maiztasun 

erlatiboa askoz nabarmenagoa izan zen 21 egunez 

Cd pean jarritako magurioetan (1C eta 1D Ird.). 

Liseri-dibertikuluen lumena dilatatu samarra 

zegoela zirudien (1C Ird.), baina analisi 

estererologikoak egin ondoren animalia kontrol eta 

kutsatuen artean Vv LUMEN balioan 

desberdintasun esangarririk ez zegoela 

ondorioztatu zen (2. Ird.). Are gehiago, Cd pean 

jarritako magurioen liseri-zelulek iraizpenean gogoz 

jarduten ari ziren (1C eta 1D Ird.), baina epitelioaren 

lodierak ez zuen funtsezko murrizketarik pairatu 

(epitelioaren ebakiduraren azalera: kontrolak, 

36633±2894 µm 2 ; Cd pean jarritakoak, 

35640±2761 µm 2 ; araztutakoak, 39514±4028 

µm 2 ). Azkenik, Cd pean jarritako magurioetan, 

zelula basofilikoek, handiagoak izanik, basofilia 

gutxiago zutela (1C eta 1D Ird.) eta pikor 

zitoplasmatikoen populazio heterogeneoagoa 

zutela ematen zuen (1D Ird.). Behaketa hauek 

sendotzeko asmoz irudi-analisiaren laguntzarekin 

zelula basofilikoen tamaina estimatu zen 

ebakiduraren azaleren neurketa zuzenak burutuz. 

3. irudian ikusten denez, Cd pean jarritako 

magurioetan zelula basofilikoen tamaina (bolumena 

µm 3 -tan adierazita) kontrolena baino bi aldiz 

handiagoa izan zen, azken hauek esperimentuak 

iraun bitartean aldakatarik jaso ez zutelarik. Ur 

garbitan 10 egunez arazten egon ondoren, liseri- 

guruinaren epitelioa ezin zen animali kontrolen 

epiteliotik bereizi. Zelula basofilikoen tamaina 

normala berreskuratu zen, euren bolumenaren 

neurketek adierazi zutenez (3. Ird.). 

2. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean 

mantendutako (zutabe grisa) magurioen liseri-tubuluen 

lumenaren dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek 

desbidazio estandarrak adierazi dituzte. 

149


Liseri-guruinaren epitelioko zelula-moten 

osaketan gertatu ziren aldaketak kuantifikatzeko, 

Vv BAS eta Vv DIG kalkulatu ziren (4. Ird.). Bi 

parametroak, osagarriak izanik, Cd pean jarritako 

magurioetan eta magurio kontrol eta 10 egunez 

arazten mantendutako magurioen artean 

esangarriki desberdinak izan ziren (4A eta 4B Ird.). 

Vv BAS -en igoera, edota aldibereko Vv DIG -en 

jaitsiera, liseri-zelulen galerak edota zelula 

basofilikoen ugaritzeak sortua den zehazteko 

asmoz, liseri-zelula eta zelula basofilikoen bolumen 

eta kopuru absolutuen estimazioa burutu zen, 

planimetria eta estereologia batera aplikatuz. 

Termino absolututan, Cd pean jarritako 

magurioetan liseri-zelulen bolumena, berriro ere 10 

egunetako arazketa-aldiaren ondoren jaitsi zen 

kontrolen balioetara bueltatuz (4D Ird.). Bitartean, 

zelula basofilikoen bolumena 10 egunez Cd pean 

jarritako magurioetan igo zen, eta arazketaren egin 

ondoren, berriro ere kontrolen balioetara bueltatu 

zen (4D Ird.). Horrela, 17.8 x 10 6 µm 3 -ko liseri- 

guruinaren zati bati dagokionez, kontroletan liseri- 

3. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mgCd/l pean 

mantendutako (zutabe grisa) magurioen zelula basofilikoen 

batezbesteko bolumena. Segmentu bertikalek desbidazio 

estandarra adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko 



saiakuntza egin ondoren, nukleo PCNA-positiboak 

bestelako egituretatik errez bereiztea lortu zen , 

baina aldez aurretik pentsatutako PCNAren analisi 

kuantitatiboak egitea ezinezkoa suertatu zen. Dena 

den, behaketa kualitatiboak, nahiz eta mugatuak 

izan, interesgarriak suertatu ziren oso. Erabilitako 

4. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen neurketa estereologiko 

desberdinak. (A) Zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa; (B) Liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa; (C) Zelula basofilikoek 

betetzen duten bolumena 17.8 x 10 6 µm 3 bolumenarekiko; (D) Liseri-zelulek betetzen duten bolumena 17.8 x 10 6 µm 3 

bolumenarekiko; (E) Zelula basofilikoen kopurua 17.8 x 10 6 µm 3 -tako bolumen batean: (F) Liseri-zelulen kopurua 17.8 x 10 6 µm 3 

-tako bolumen batean. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrka adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko 



arratoien PCNA aurkako PC10 antigorputz 

komertziala, magurioen zelula proliferatzaileak 

detektatzeko gai izan zen; izan ere, gonadan oso 

erreakzio bortitza behatu zen (5A Ird.). Gonada 

arran, espermatozito primarioetan, sekundarioetan 

baino erreakzio bortitzagoa behatu zen, eta 

espermatida helduek ez zuten PCNA-markaketarik 

erakutsi (5A Ird.). PCNArik gabe inkubatutako 

tindaketa kontroletan ez zen inolako seinalerik ikusi 

(5B Ird.). Gonada emean, erreakzio positiboa 

obozitoen nukleoan soilik behatu zen, nukleoloan 

inolako seinalerik behatu ez zelarik (5C eta 5D Ird.). 

Bestalde, magurio kontroletan liseri-zelulen nukleo 

PCNA-positibo gutxi behatu ziren, eta lipofuszinen 

erreaktibotasunagak sortutako zarata gutxi aurkitu 

genuen (6A-C Ird.). Hala ere, Cd pean jarritako 

magurioetan, lifofuszina eta lisosomen materialak 

PCNA-markaketa bortitza eman zuten (6D-F Ird.), 

magurio kontroletan eta araztuetan behatu ez zena 

(6F-H Ird.). 

152 


Autometalografiak, liseri-zelulen lisosometan 

zilarrezko hauspeakin beltzen (BSD) presentzia 

erakutsi zuen, zelula basofilikoetan BSDrik behatu 

ez zen bitartean (7. Ird.). Magurio kontroletan 

BSDen maila basalak behatu ziren, eta Cd pean 

mantendutako magurioetan askoz erreakzio 

bortitzagoak aurkitu ziren (7A-C Ird.). 10 eguneko 

arazketa-aldia bukatu ondoren, tindaketa-patroia, 

magurio kontroletan ikusitakoaren antzekoa izan 

zen (7D Ird.). Behaketa horiek, Vv BSD gisa 

neurtutako BSDen hedapena neurtzerakoan 

lortutako emaitza kuantitatiboekin bat egin zuten. 

Vv BSD balioak, Cd pean jarritako magurioetan 

magurio kontroletan baino hiru aldiz handiagoak 

izan ziren, eta are gehiago, araztutako magurioen 

artean eta magurio kontrolen artean ez zen 

desberdintasun esangarririk aurkitu (8. Ird). 

Lisosomen egitura-aldaketak 

Lisosomak, ß-glukuronidasa entzimaren 

histokimika erabiliz ikustarazi ziren. Honela, arre- 

5. Irudia: PCNA immunohistokimika burutu ondoren magurioen gonada ar eta emean behatutako immunomarkaketa. (A) PCNAmarkaketa 

positiboa ikusten da espermatogonietan g), espermatozito primario p) eta sekundarioetan s) eta baita espermatidetan 

ere t). Eskala-marra: 25 µm. (B) Antigorputz primariorik gabe inkubatutako lagin kontroletan (folikulu espermatikoa) ez da inolako 

markaketa positiborik behatzen. Eskala-marra: 25 µm. (C) eta (D) PCNAren lokalizazioa gonada emeetan, bai obozito helduetan 

o), zein obozito goiztiarretan e). Nukleoek markaketa positibo bortitza erakusten duten bitartean (geziak), nukleoloetan ez da 

markaketarik behatzen (gezi-buruak). Eskala marra: 50 µm.


purpura koloreko egitura esferiko gisa agertu ziren 

liseri-zelulen zitoplasman. Lisosomak, Cd pean 

jarritako magurioetan kontrol eta araztutako 

taldeenetan baino apur bat handiagoak eta 

ugariagoak ziren (9. Ird.). Lisosomen egituraren 

analisi estereologikoak erakutsi zutenaren arabera, 

nahiz eta S/V LYS eta Nv LYS parametroetan 

desberdintasun esangarririk ez aurkitu Cd-ak, 

6. Irudia: PCNA immunohistokimika magurio kontrol eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako magurioetan. (A eta C) Magurio 

kontrolak, T) liseri-tubuloa, D) liseri-zelula, B) zelula basofilikoa, H) hemozitoa. Geziek liseri-zelula positiboak adierazten dituzte, 

eta gezi-buruek zelula basofiliko positiboak adierazten dituzte. Ikusi lipofuszinen erreaktibogarritasun urria magurio kontroletan (A). 

Eskala-marra: 50 µm (A) eta10 µm (C). (B) Antigorputz primariorik gabe inkubatutako laginetan ez da inolako markaketa positiborik 

behatzen. Eskala-marra: 50 µm. (D-F) Cd pean 21 egunez mantendutako magurioetan lipofuszinak erreakzio bortitza erakusten 

dute. T) liseri-tubuloa, D) liseri-zelula, B) zelula basofilikoa. Geziek liseri-zelula positiboak adierazten dituzte, eta gezi- buruek zelula 

basofiliko positiboak adierazten dituzte. Eskala-marra: 50 µm (D) eta 10 µm (E eta F). (G-H) 10 egunez arazten utzitako 

magurioetan lipofuszinen erreakzionagarritasuna ahulagoa da eta zelula PCNA positibo ugari (geziak) ikus daitezke. T) liseritubuloa. 

Eskala-marra: 50 µm (G) eta 10 µm (H). 

153


Vv LYS balioaren igoera (lisosomen handipena) 

esangarria eragin zuen, arazketa burutu ondoren 

balioak berriro ere kontrolen mailara itzuliz (10. 

Ird.). 

EZTABAIDA 

Moluskuen liseri-guruinean kutsatzaileen eragin 

pean behatutako bestelako erantzunen artean, 

epitelioko zelula-moten ordezkapena (CTR) 

bibalbio eta gastropodoetan fenomeno orokor gisa 

deskribatu da (Widdows et al., 1984; Lowe & 

Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; 

Marigómez et al., 1990; 1996; 2005a; 2005b). 

Zenbait kasutan, bai zelula basofiliko normalek zein 

hipertrofiatutako liseri-guruineko epitelioko parterik 

154 

nagusiena osatuz aurkitu dira, eta horregatik, CTR 

prozesua zelula basofilikoen proliferazioa dela 

medio burutzen dela proposatu da (Rasmussen et 

al., 1983; Lowe & Clarke, 1989: Cajaraville et al., 

1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; Syasina et 

al., 1997). Are gehiago, Yonge (1926) eta Mix & 

Sparks-en (1971) lanetan oinarriturik, orokorrean, 

liseri-guruinaren epitelioaren berriztapen-gaitasuna 

zelula basofilikoei esleitu zaie (Thompson et al., 

1974; Nelson & Morton, 1979). Izatez, zelula 

basofilikoen proliferazioa, babes-mekanismoa izan 

daitekeela iradoki da, non zelula basofilikoak behar 

bezalako baldintzak ematekotan liseri-zelula 

helduetan desberdintzatu baitaitezken (Thompson 

et al., 1974). Zelula basofilikoei eta liseri-zelulei 

funtzio arras desberdinak egokitu zaizkiela kontuan 

7. Irudia: Littorina littorea magurioaren liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa, bai 1.25 mg Cd/l pean 21 egunez 

mantendu eta gero, (A eta B); maguio kontroletan (C); zein 10 egunez arazten mantendutako magurioetan (D). Geziek liseri-zelulen 

lisosometan dauden zilarrezko hauspeakin beltzak adierazten dituzte, gezi-buruek liseri-epitelioko xafla basalean dagoen metala 

adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm.


hartuz gero (Mersoy & Farley, 1973; Mason, 1983), 

Marigómez et al.-ek (1990), aipatutako hipotesia 

betetzeko aukera gutxi daudela iradoki zuten. 

Ikerlan horren arabera, zelula basofilikoz osatutako 

tubuluen agerpenaren erantzulea, liseri-zelulen 

kopuruaren jaitsiera soilik izango litzateke. Are 

gehiago, ikerlan horretan epitelioan neurtutako 

aldaketa morfologikoek eta honako ikerlan honetan 

zelula proliferatzaileak identifikatu izanak, bigarren 

hipotesia baieztatzen dute, geroago ikusiko denez. 

Kutsatzaileen pean jarritako moluskuetan, 

liseri-guruineko epitelioaren masaren galera netoa 

gertatu izana hainbat ikerlanetan frogatu da (Lowe 

et al., 1981; Couch, 1984; Tripp et al., 1984; 

Marigómez et al., 1986; 1993; Minnitti, 1987; Axiak 

et al., 1988; Recio et al., 1988; Lowe & Clarke, 

1989; Vega et al., 1989; Cajaraville et al., 1992; 

Ireland & Marigómez, 1992; Syasina et al., 1997; 

Snyman, et al., 2005). Halaber, zenbait zeharkako 

ebidentziek liseri-dibertikuluen luzeraren 

murrizpena gertatzen dela adierazi dute, esaterako 

kutsatzaileen pean egondako muskuiluen liseri- 

guruinaren 3-D-ko berreraikuntzak egin ondoren 

ikusi zenez, (Quincoces, 1995). Muskuiluetan, 

liseri-guruinaren unitate morfofuntzionala ganbara 

baten bitartez liseri-konduktuetara lotzen diren hatz 

itxurako egiturez osaturik dago (Marigómez et al., 

1995). Metal eta kutsatzaile organikoen pean 

mantendutako muskuiluetan, hatzen luzera 

esangarriki txikitzen da (Quincoces, 1995). Masa 

epitelialaren murrizpen hori, liseri-zelulen 

galerarekin lotuta egon daiteke, eta ondorioz, zelula 

basofilikoen kopuru erlatiboaren itxurazko igoera 

gauzatuko litzateke. Magurioen liseri-dibertikuluak 

ez dira muskuiluenak bezain plastikoak. 

Muskuiluetan, liseri-guruinaren morfologia prozesu 

fisiologiko normaletan ere aldaketa bortitzak 

jasotzen dituen bitartean, (liseriketa-ziklo 

bakoitzean adibidez; Robinson, 1983), 

magurioenaren itxura eta morfologia orokorra askoz 

egonkorragoa da, adibidez liseriketan zehar (Sáez 

et al., 1990). Hala ere, 1.25 mg Cd/l-ko 

kontzentrazio pean egondako magurioetan, liseri- 

epitelioaren lodieraren jaitsiera esangarria gertatu 

zen (Vega et al., 1989), eta beraz, Cd kontzentrazio 

horrek, magurioetan ere masa epitelialaren galera 

garbia eragiten duela ondoriozta daiteke. Ikerlan 

honetan, aipatutako efektuaren ebidentziarik ez da 

behatu; izan ere, Cd pean egondako magurioetan 

Vv LUMEN balioa ez da modu esangarrian aldatu. 

Hala ere, Vega et al.-ek (1989) aplikatutako 

metodologia, lan honetan aplikatutako hurbilketa 

estereologikoa baino sentikorragoa izan zen. Izan 

ere, lan honetan lumenaren tamaina, tubuluen 

tamaina eta epitelioaren lodiera aldi berean 

kalkulatu dira. Gainera, bi esperimentuak urteko 

8. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean 

mantendutako (zutabe grisa) magurioen zilarrezko hauspeakin 

beltzen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalek 

desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek 

taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte 

p


sasoi desberdinetan burutu ziren (errute-garaian, 

abendua-urtarrila versus errute-ostean, otsaila- 

martxoa). Erantzuna termino kualitatibotan 

antzekoa izatea espero bada ere, erantzunaren 

hedadura desberdina izan daiteke, abendua- 

urtarrila garaian (Vega et al., 1989) otsaila-martxoa 

garaian (ikerlan hau) baino erantzun sentikorragoak 

behatuz. Modu berean, CTR erantzuna, nahiz eta 

Cd kontzentrazio berdinak erabili, leunagoa 

suertatu da ikerlan honetan, abendua-urtarrila 

garaian burutu ziren esperimentuekin (Marigómez 

et al., 1990) alderatuz. Are gehiago, Marigómez et 

al.-en (1990) arabera, espero baino zelula 

basofilikoen hipertrofia gutxiago behatu da oraingo 

honetan . 

Zelulen galeraren ebidentziarekin batera, orain 

epitelioko zelulen berriztapen-mekanismoen 

156 

inguruan datu berriak daude eskuragarri. 

Muskuiluen liseri-guruinean, bai liseri-zelulak zein 

zelula basofilikoak PCNA zein BrdU 

immunohistokimikak eginez erreakzionagarriak 

direla frogatu da, eta beraz, bi zelula-motek bere 

ziklo zelularra norberak bere aldetik betetzen dute 

(Marigómez et al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Hori 

dela eta, kutsatzaileen eraginez desagertu diren 

liseri-zelulak ordezkatzeko ez dirudi zelula 

basofilikoak proliferatzen eta desberdintzatzen 

direnik, liseri-zelulek bere aldetik bikoizteko 

gaitasuna baitute. PCNA immunohistokimikaren 

bitartez behatu denez, nahiz eta Cd pean 

mantendutako magurioetan eta araztutako 

magurioetan lipofuszinen erreakzionagarritasun 

handiak emaitza kuantitatiboak lortzerik baimendu 

ez, badirudi Cd-ak liseri-zelulen proliferazioaren 

9. Irudia: Littorina littorea magurioaren liseri-epitelioan ß-glukuronidasa entzimaren jardueraren lokalizazioa histokimika bitartez, 

bai 1.25 mg Cd/l pean 21 egunez mantendu eta gero, (A eta B ); magurio kontroletan (C); zein 10 egunez arazten mantendutako 

magurioetan (D). Geziek lisosomen barneko ß-glukuronidasa jarduera adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm.


areagotzea eragiten duela. Areagotutako 

proliferazio hori, 10 egunez arazten utzitako 

magurioetan oraindik ere mantentzen da. 

Proliferazio-tasak kalkulatzeko gai izan ez garenez, 

arazketa ondoren liseri-guruinean gertatzen den 

zelula-moten berreskurapena, liseri-zelulak gehiago 

proliferatzen dutelako edo liseri-zelula gutxiago 

galtzen direlako ondorioztatzea ezinezkoa zaigu. 

Kadmio pean egondako magurioetan, liseri- 

zelulen bolumen absolutua jaitsi zen 10 egunetako 

arazketa-aldia eta gero, kontrolen balioetara itzuli 

bazen ere. Zelula basofilikoen bolumen absolutua, 

Cd peko tratamenduaren ondoren igo zen eta 

arazketa-aldia eta gero berriro ere kontrolen 

balioetara jaitsi zen. Liseri-zelulen bolumen 

absolutuaren jaitsiera, liseri-zelulen galera netoa 

dela medio eman zen bitartean (1850 liseri-zelula 

galdu ziren liseri-guruinaren 17.8 x 10 6 µm 3 -ko zati 

batean), zelula basofilikoen bolumenaren igoera 

zelulen hipertrofiak sortua da, eta ez zelula 

kopuruaren igoerak, sortua izan zen. 

Ikerlan honetan lortutako emaitza guztiak batera 

kontuan hartuta, CTR, zelula basofilikoen 

proliferazioak sortua baino, gehiago, liseri-zelulen 

10. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta Cd pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen ß-glukuronidasa jardueraren 

parametro estereologikoak (A) Dentsitate bolumetrikoa; (B) Dentsitate superfiziala; (C) Azalera/Bolumena ratioa; (D) Dentsitate 

numerikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun 

esangarriak adierazi dituzte p


galera netoak sortua zela dirudi. Hala ere, liseri- 

zelulen galera neto hori, liseri-zelulen proliferazio 

areagotuarekin batera gertatu zen. Ornodunen 

zeluletan, programatutako heriotza zelularra zein 

zelulen proliferazioa Cd-ak eragiten duena jakina 

da (Beyersmann & Hechtenberg, 1997; Habeebu et 

al., 1998; Piechotta et al., 1999). Cd pean 

egondako Helix pomatia barraskiloetan kontroletan 

baino lau aldiz programatutako heriotza zelular 

gehiago erregistratu da liseri-zeluletan 

(Chavikovsky et al., 2004). Programatutako 

heriotza zelular hori, elkar baztertzaileak ez diren 

autofagia eta apoptosioren konbinaketak eraginda 

dagoela dirudi (Bursch et al., 2000; Chavikovsky et 

al., 2004). Izan ere, oraingo honetan Cd-ak liseri- 

zelulen proliferazioa eragin dezakeela behatu da; 

beraz, liseri-zelulen galera netoa zelulen heriotza 

eta proliferazioaren arteko balantze gisa azal 

daiteke. Beraz, magurioetan, Cd pean egoteak, 

arazketari aurre egiteko liseri-zelulen berriztapena 

areagotzen du. 

Kadmio pean egondako magurioen zelula 

basofilikoen hiperplasia, esposizio-denbora eta 

kontzentrazioaren araberakoa da (Marigómez et al., 

1990). Zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) 

hiperplasia zenbait metalen pean egondako 

lehorreko gastropodoetan ere deskribatu da 

(Marigómez et al. 1996; 1998; Chabicovsky et al. 

2004). Hiperplasia hori fenomeno desberdinekin 

erlazionatu da: (1) liseri-zelulen funtzioak (liseriketa 

intrazelularra barne) kaltetuta egonez gero, 

liseriketa estrazelularrerako entzimen areagotutako 

ekoizpenarekin (Cajaraville et al., 1990b; 

Marigómez et al., 1990); (2) zelula basofilikoetan 

158 

areagotutako detoxifikazio-jarduerekin (Cajaraville 

et al., 1990a; Livingstone & Pipe, 1992; Triebskorn 

& Köhler, 1996); eta (3) apoptosi bidez hildako 

liseri-zelulen fagozitosiarekin (Chabicovsky et al., 

2004), hain zuzen ere. Bestalde, aipatutako 

hiperplasia, liseri-zelulen galerak epitelioan toki 

libre gehiago uzten duenez, zelula basofilikoen 

tamaina eta soslai aldaketekin erlazionatuta egon 

daiteke, ugaztunen urdaileko epitelioan deskribatu 

den bezala (Clarke, 1970). Liseri-guruinaren 

histofisiologiari dagokionez, duela gutxi egindako 

behaketen arabera (argitaratu gabe), ez dirudi 

areagotutako entzimen jariapena azalpen 

sinesgarria denik. Halaber, kutsatzaile organikoen 

pean, baina ez metalen pean, zelula basofilikoen 

erretikulu endoplasmatiko pikortsuan areagotutako 

jarduera detoxifikatzaileen berri eman da 

(Livingstone & Pipe, 1992; Triebskorn & Köhler, 

1996). Edonola ere, metalen detoxifikazioaren 

kasuan partaide nagusiak liseri-zelulak direnez 

(Vega et al., 1989), ikerlan honetako behaketak 

azaltzeko pisu gutxiko aukera dirudi. Azkenik, zelula 

basofilikoek hiltzen ari diren liseri-zelulen hondarren 

fagozitosian parte hartzen dutela hiperplasia 

azaltzeko aukera egokiena izan daiteke. Intsektuen 

epidermisean (Locke, 1985), ugaztunen hepatozito 

(Dini et al., 2002), Sertoli zelula (Nakanishi & 

Shiratsuchi, 2004) eta bestelako epitelio-zeluletan 

(Monks et al., 2005), eta gastropodoen liseri- 

guruineko epitelio-zeluletan (Chavikovsky et al., 

2004), hiltzen diren epitelio-zelulak, alboko epitelio- 

zelulek fagozitatzen dituztela deskribatu da. 

Oraintsu, Cd-z elikatutako bareetan gorputz 

apoptotikoak izan daitezkenak deskribatu dira (5.


Kapitulua). Edonola ere, azken hipotesi hori 

baieztatzeko, teknika immunohistokimikoak erabiliz 

zelula apoptotikoen identifikazio espezifikoak eta 

mikroskopio elektroniko mailan egindako ikerketak 

burutzea beharrezkoa da. 

Ikerlan honen ekarpen garrantzitsuena, CTR 

itzulgarria dela frogatzea izan da: 10 eguneko 

arazketa-aldia eta gero, liseri-zelulak berriz ere 

zelula basofilikoak baino ugariagoak suertatu dira. 

Liseri-zelulen PCNA-markaketa Cd pean 

mantendutako zein araztutako magurioetan 

antzekoa izanik, CTRren itzulgarritasunak liseri- 

zelulen galera moteltzearekin zerikusia behar du 

izan, Cd-aren gabezian liseri-zelulen jarduera 

metabolikoa berriz ere bere egoera normalera 

itzultzea espero baita (Marigómez et al., 1986). 

Beraz, liseri-zelulen berriztapena kutsatzaileen 

gisako ingurumen-faktoreek modulatua dagoela 

dirudienez, zelula-moten osaketa bereizgarria 

ingurumen-baldintza berezi bati egotzi ahal zaio. 

Ingurumen-erasoaren maila eta luzeraren 

araberakoa izan daitekeen moldaera hori, liseri- 

guruinaren fisiologiaren ulermenean eta 

biomarkatzaileen aplikazioan eragina izan dezake, 

itu-zeluletan ezartzen ez diren eta matrize 

analitikoan (liseri-guruina) suertatzen diren 

aldaketak aintzakotzat hartzen ez dituzten 

prozedurak erabiltzen badira. 

Metal-esposizioak sortarazitako CTRk, BSD- 

hedapena bezalako esposizio-biomarkatzaile eta 

lisosomen erantzunak bezalako efektu- 

biomarkatzaileen gainean eragina izan dezakeela 

frogatu da muskuiluetan (Soto et al., 2002; 1. 

Kapitulua). Modu berean, metal-esposizioak 

muskuilu eta magurioen liseri-guruinean 

eragindako masa netoaren aldaketek, AAS bidez 

estimatutako ehunetako metal-zaman eragina izan 

dezakete (Soto et al., 1997a; 1997b). Dirudienez, 

liseri-zelulen galerak eta berreskurapenak, ikerlan 

honetan aplikatutako biomarkatzaileen (BSD- 

hedapena, lisosomen parametro estereologikoak) 

gainean eraginik ez dute. Magurioen liseri- 

guruineko Vv BAS balioak 0,2 µm 3 /µm 3 baino 

handiagoak izan arren, zelula basofilikoak 

saihestuz; lisosomen barneko metal-kopuru eta 

lisosomen handipenaren neurketak zuzenean liseri- 

zelulen gainean egin daitezke. 

Laburbilduz, ikerlan honen ondorioak honako 

hauek dira: (1) "itxurazko" zelula-moten 

ordezkapena liseri-zelulen galerak eta aldibereko 

zelula basofilikoen hipertrofiak sortua dela; (2) 

prozesua itzulgarria dela; (3) liseri-zelulen 

proliferazioa Cd pean mantendutako magurioetan 

areagotzen dela, eta tendentzia hori arazketa- 

aldiaren ondoren mantentzen dela; eta (4) liseri- 

zelulen galera eta berreskurapena ikerlan honetan 

erabilitako maila zelular eta tisularreko 

biomarkatzaileen gainean eraginik ez dirudi duenik. 

BIBLIOGRAFIA 

Axiak V, George JJ, Moore MN (1988) Petroleum hydrocarbons 

in the marine bivalve Venus verrucosa: accumulation and 

cellular responses. Mar. Biol. 97:225-230. 

Beyersmann D, Hechtenberg S (1997) Cadmium, gene regula- 

tion, and cellular signalling in mammalian cells. Toxicol. 


Bursch W, Ellinger A, Gerner CH, Fröhwein U, Schulte- 

Hermann R (2000) Programmed cell death (PCD) apopto- 

sis, autophagic PCD, or others?. Ann. N.Y. Acad. Sci. 

926:1-12. 

159


Cajaraville MP, Marigómez JA, Angulo E (1989) A stereological 

survey of lysosomal structure alterations in Littorina littorea 

exposed to 1-naphtol. Comp. Biochem. Physiol. C 93:231- 

237. 




Org. 9:221-228. 





24. 

Cajaraville MP, Marifómez JA, Angulo E (1991) Automated 

measurement of lysosomal structure alterations in oocytes 

of mussels exposed to petroleum hydrocarbons. Arch. 

Environ. Contam. Toxicol. 21:395-400. 

Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E (1992) 

Comparative effects of the water accommodated fractions 

(WAF) of three oils on mussels. 2.- Quantitative alterations 

in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem. 

Physiol. C 102:113-123. 

Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez I (1995a) 

Lysosomes as cellular markers of environmental pollution: 

time- and dose-dependent responses of the digestive lyso- 

somal system of mussels after petroleum hydrocarbon 

exposure. Environ. Toxicol. Water Qual. 10:1-8. 

Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995b) 

Cellular biomarkers as useful tools in the biological monito- 

ring of environmental pollution: molluscan digestive lysoso- 

mes. 29-45 orr. Non: Cell Biology in Environmental 

Toxicology. Cajaraville MP (ed) University of the Basque 

Country Press Service. Bilbo. 

Chabicovsky M, Klepal W, Dallinger R (2004) Mechanisms of 

cadmium toxicity in terrestrial pulmonates: Programmed 

cell death and metallothionein overload. Environ. Toxicol. 

Chem. 23:648-655. 

Clarke RM (1970) A new method of measuring the rate of shed- 

ding of epithelial cells from the intestinal villus of the rat. 

Gut 11:1015-1019. 

Couch JA (1984) Atrophy of diverticular epithelium as an indi- 

160 

cator of environmental irritants in the oyster, Crassostrea 

virginica. Mar. Environ. Res. 14:525-526. 





Dini L, Pagliara P, Carlà EC (2002) Phagocytosis of apoptotic 

cells by liver: A morphological study. Microsc. Res. Tech. 

57:530-540. 

Etxeberria M, Sastre I, Cajaraville MP, Marigómez I (1994) 

Digestive lysosome enlargement induced by experimental 

exposure to metals (Cu, Cd and Zn) in mussels collected 

from a zinc polluted site. Arch. Environ. Toxicol. 27:338- 

345. 

Etxeberria M, Cajaraville MP, Marigómez I (1995) Changes in 

digestive cell lysosomal structure as biomarkers of environ- 

mental stress in the Urdaibai estuary (Biscay Coast, 

Iberian Peninsula). Mar. Poll. Bull. 30:599-603. 

Habeebu SSM, Liu J, Klaassen CD (1998) Cadmium-induced 

apoptosis in mouse liver. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153:48- 

58. 

Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary cal- 

cium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and his- 

tological changes in the digestive cells in the snail Achatina 

fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58:157-168. 

Livingstone DR, Pipe RK (1992) Mussels and environmental 

contaminants: molecular and cellular aspects. 425-464 orr. 

Non: The Mussel Mytilus: ecology, Physiology, Genetics 

and Culture. EM Gosling (ed). Elsevier Science Publs B.V. 

Amsterdam. 

Locke M (1985) A structural analysis of post embryonic deve- 

lopment. 103-165 orr. Non: Parasites-Their world and ours. 

Mattrick CF & Desser SS (ed). Elsevier Biomedical Press. 

New York. 

Lowe DM, Clarke KR (1989) Contaminant-induced changes in 

the structure of the digestive epithelium of Mytilus edulis. 


Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil in the 

digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellu- 

lar and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1:213-226. 

Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986) Copper treatment of the 

digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Morphometrics 

and histophysiology. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 

36:608-615. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of 

the digestive gland-gonad complex of the marine proso- 


Org. 9:229-238.


Marigómez I, Soto M, Etxeberria M, Angulo E (1993) Effects of 

size, sex, reproduction, and trematode infestation on the 

quantitative structure of digestive tubules in stressed win- 

kles. Zool. Jb. Anat. 123:319-336. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995) 

Computer assisted 3-d reconstruction techniques may pro- 

vide new insides into the pattern of histological organisa- 

tion of the bivalvian digestive gland. 12th Int. Malacol. 

Congr. Vigo. 




Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998) Cell- 

type replacement, a successful strategy of mollusks to 


20:411-414. 

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical loca- 

lisation of proliferating cells in mussel digestive gland tis- 

sue. Histochem. J. 31:781-788. 



molluscs. Microsc. Res. Tech. 56:358-392. 

Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutant-specific and 

general lysosomal responses in digestive cells of mussels 

exposed to model organic chemicals. Aquat. Toxicol. 

64:235-257. 

Marigómez I, Izagirre U, Lekube X (2005a) Lysosomal enlarge- 

ment in the digestive cells of mussels exposed to cadmium, 

bezo[a]pyrene and their combination. Comp. Biochem. 

Physiol. C 141:188-193. 

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L, 

Cajaraville MP (2005b) Cell and tissue biomarkers in mus- 

sel, anh histopathology in hake and anchovy from Bay of 

Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring Campaign 

2003). Mar. Poll. Bull. (prentsan). 

Mason AZ (1983) The uptake, accumulation and excretion of 

metals by the marine prosobranch gastropod mollusc 

Littorina littorea (L). Doktoradutza-Tesia. University of 

Wales, Gwyneed (UK). 575 orr. 

Merdsoy B, Farley I (1973) Phasic activity in the digestive gland 

of the marine prosobranch gastropod, Littorina littorea (L.). 

Proc. Malacol. Soc. London 40:473-482. 

Minnitti F (1987) Effects of copper pollution on the hepatopan- 

creas of Cyclope neritea L. (Mollusca:Gastropoda). Zool. 

Anz. 219:141-146. 


the pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing 


Monks, J., Rosner, D., Geske, F.J., Lehman, L., Hanson, L., 

Neville, M.C., Fadok, V.A. (2005) Epithelial cells as pha- 

gocytes: Apoptotic epithelial cells are engulfed by mam- 

mary alveolar epithelial cells and repress inflammatory 

mediator release. Cell Death Diff. 12:107-114. 

Moore MN (1976) Cytochemical demonstration of latency of 

lysosomal hydrolases in digestive cells of the common 

mussel Mytilus edulis, and changes induced by thermal 

stress. Cell Tiss. Res. 175:279-287. 

Morton B (1983) Feeding and digestion in bivalvia. 65-147 orr. 

Non: The Mollusca. ASM & Wilburg M. (ed). Academic 

Press. Saleuddin. New York. 

Nakanishi Y, Shiratsuchi A (2004) Phagocytic removal of apop- 

totic spermatogenic cells by sertoli cells: Mechanisms and 

consequences. Biol. Pharma. Bull. 27:13-16. 

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial rene- 

wal in the digestive gland tubules of the marine proso- 

branch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 

45:262-283. 

Piechotta G, Lacorn M, Lang T, Kammann U, Simat T, Jenke 

HS, Steinhart H (1999) Apoptosis in dab (Limanda liman- 

da) as possible new biomarker for anthropogenic stress. 

Ecotox. Environ. Saf. 42:50-56. 

Quincoces I (1995) Un nuevo modelo de la glándula digestiva 

de Mytilus galliprovincialis (Bivalvia, Eulamellibranchia): 

reconstrucción tridimensional asistida por ordenador y 

microscopía electrónica de barrido. Lizentziatura-Tesia. 




of N-nitroso compounds on the marine mussel, Mytilus 

edulis (L) II. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine Aquat. 

Toxicol. 3:301-311. 

Recio A, Marigómez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc tratment 

of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Cellular 

distribution of zind and cadmium. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 41:858-864. 

Robinson WE (1983) Assessment of bivalve intracellular diges- 

tion based on direct measuremets. J. Moll. Stud. 49:1-8. 

161


Sáez V, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1990) 

Histomorphology and histochemistry of the digestive gland 

of Littorina littorea (L.) in relation to experimental tidal con- 

ditions, food availability, and digestion. Zool. Jb. Anat. 

120:185-196. 

Snyman RG, Reinecke AJ, Reinecke SA (2005) Quantitative 

changes in the digestive gland cells of the snail Helix 

aspersa after exposure to fungicide copper oxychloride. 


Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I (1990) A pla- 

nimetric study of morphological variability in the digestive 

diverticula of Littorina littorea (Linnaeus) and Mytilus edulis 

Linnaeus. J. Moll. Stud. 56:339-344. 

Soto M, Marigomez I (1997a) BSD extent, an index for metal 





in “mussel-watch” programmes by automated image analy- 

sis of autometallographical black silver deposits (BSD) in 


150. 

Soto M, Ireland MP, Marigómez I (1997a) The contribution of 

metal/shell weight index in target-tissues to metal body 

burdens in sentinel marine mollusks. 1 Littorina littorea. 

Sci. Tot. Environ. 198:135-147. 

Soto M, Ireland MP, Marigómez I (1997b) The contribution of 

metal/shell weight index in target-tissues to metal body 

burdens in sentinel marine mollusks. 2 Mytilus galloprovin- 

cialis. Sci. Tot. Environ. 198:149-160. 

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigomez I (1998a) 

Autometallographed metal content in digestive cells of win- 

kles: a cost-effective screening tool for monitoring Cu and 

Zn pollution. Aquat. Toxicol. 40:123-140. 

Soto M, Quincoces I, Marigómez I (1998b) 

162 

Autometallographical procedure for the localization of 

metal traces in molluscan tissues by light microscopy. J. 

Histotechnol. 21:123-127. 

Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M, Morgan AJ, 

Marigómez I (2002) Subcellular distribution of cadmium 

and its cellular ligands in mussel digestive gland cells as 

revealed by combined autometallography and X-ray micro- 

probe analysis. Histochem. J. 34:273-280. 


alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yes- 

soensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter 

the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44:85-98. 

Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starva- 

tion on structure and function of the digestive gland of the 

mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 54:699- 

712. 

Triebskorn R, Köhler HR (1996) The impact of heavy metals on 

the grey garden slug, Deroceras reticulatum (Muller): Metal 

storage, cellular effects and semi-quantitative evaluation of 

metal toxicity. Environ. Poll. 93:323-343. 

Tripp MR, Fries CR, Craven MA, Grier CE (1984) 

Histopathology of Mercenaria mercenaria as an indicator of 

pollutant stress. Mar. Environ. Res. 14:521-524. 

Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) Quantitative altera- 

tions in the structure of the digestive cell of Littorina littorea 

on exposure to cadmium. Mar. Biol. 103:547-553. 

Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press. 


Widdows J, Bakke T, Bayne BL, Donkin P, Livingstone DR, 

Lowe DM, Moore MN, Evans SV, Moore SL (1984) 

Responses of Mytilus edulis on exposure to the WAF of 

North Sea oil. Mar. Biol. 67:15-31. 


Trans. Roy. Soc. Edin. 54:703-718. 



and stomach. Cell Tiss. Res. 318:395-402.

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lanborategi-ikerketa 

Liseri-zelulen berriztapena kadmio eta 

kerosenozko nahasketa baten pean 

esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko 

epitelioan 

Laburpena: Arion ater (L) bareak lurzoruen osasun-maila ebaluatzeko organismo-behale gisa 

proposatu dira. Kutsatzaile pean egondako bareen liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketak 

behatu dira, aldaketa horien artean esanguratsuena liseri-zelulen galera eta horrekin batera iraizte- eta 

kaltzio-zelulen emendioa izanik. Lan honen helburua, liseri-zelulen galerak efektu- eta esposiziobiomarkatzaileen 

gainean eragina duen, eta zelulen galera hori laborategiko baldintzetan metal eta 

konposatu organikozko nahasketa baten pean jarritako bareetan itzulgarria ote den antzematea da. 

Horretarako, bareak kutsatu gabeko toki batetik (Delika, Euskal Herria) hartu ziren eta 10 µg Cd + %30 

kerosenotik lortutako urari egokitutako frakzioa zuen janariaz 27 egunez elikatu ziren. Gorputzeko metalzama 

eta kerosenoaren mailak kalkulatu ziren erabilitako esposizioa eraginkorra zela baieztatzeko asmoz. 

Esposizio-biomarkatzaile gisa, autometalografia bitartez lortutako zilarrezko hauspeakin beltzen (ingeleraz, 

Black Silver Deposits; BSD) dentsitate bolumetrikoa eta azil-KoA oxidasa (AOX) entzimaren jarduera erabili 

ziren. Efektu-biomarkatzaile gisa, liseri-epitelioa osatzen duten 3 zelula-moten (liseri-, iraizte- eta kaltziozelulak) 

dentsitate bolumetrikoan neurtutako aldaketak erabili ziren. Zelula proliferatzaileak 

bromodeoxiuridinaren (BrdU) immunodetektapenaren bitartez identifikatu ziren. Ikerlan honen emaitzek, 

kutsatzaile pean jarritako bareetan AOX jarduera eta BSD-en denstitate bolumetrikoaren igoera eta liserizelulen 

kopuruaren jaitsiera gertatzen dela islatu zuten, dena den aldaketa horiek liseri-guruineko 

kutsatzaileen metaketa-gaitasunean eta erabilitako efektu- eta esposizio-biomarkatzaileen gainean 

eraginik ez zuten izan. Gainera, liseri-epitelioko zelula-moten osaketan behatutako aldaketa eraldatu hori 

arazte-aldiko 7 egunen buruan itzulgarria zela behatu zen. BrdU-markaketak kutsatzaile pean egoteak 

liseri-zelulen proliferazio areagotua eragiten duela erakutsi zuen, proliferazio-jarduera areagotu hori araztealdian 

zehar ere mantentzen zelarik. 

Gako-hitzak: liseri-guruina, bareak, zelula-moten ordezkapena, kadmioa, kerosenoa, efektu- eta 

esposizio-biomarkatzaileak.. 

163


Digestive cell turnover in the digestive gland epithelium of slugs 

experimentally exposed to a mixture of cadmium and kerosene 

Abstract: Slugs, Arion ater (L), have been proposed as sentinel organisms to assess soil environmental 

health. In slugs under the influence of pollutants changes in the cell-type composition of the digestive-gland 

have been observed, among these changes, the most remarkable one is the loss of digestive cells and the 

related increase of excretory and calcium cells.The aim of the present work was to determine whether 

digestive cell loss affects biomarkers of exposure and effect and whether is reversible in the digestive gland 

of slugs exposed to a mixture or metal and organic pollutants under laboratory conditions. For these 

purposes, slugs collected from a non-polluted site (Delika, Basque Country) were dosed with 10 µg Cd/gr 

+ 30% of the water accommodated fraction of kerosene in the food for 27 days. Metal body burdens and 

kerosene tissue levels were measured. The volume density of black silver deposits (Vv BSD ) revealed by 

autometallography, and the activity of the enzyme acyl-CoA oxidase (AOX) were used as exposure 

biomarkers. As effect biomarkes, changes in the volume density of the three cell types that constitute the 

digestive gland epithelium in slugs (digestive, excretory and calcium cells) were calculated. Proliferating 

cells were identified by means of bromodeoxyuridine (BrdU) immunohistochemistry. The results of the 

present work revealed that the mixture of pollutants provoked an increase in Vv BSD and AOX activity as 

well as a decrease in the number of digestive cells. Anyway, these changes had no effect in the capacity of 

the digestive gland to accumulate or in the effect and exposure biomarkers employed. Moreover, the 

change in cell-type composition measured in the digestive epithelium was reversible after 7 days of 

detoxification. BrdU-labelling showed that exposure to pollutants provoked an enhanced digestive cell 

proliferation, that perdured during detoxification 

Key words: digestive gland, slugs, cell-type replacement, cadmium, kerosene, effect and exposure 

biomarkers. 

164

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa 

Renovación de células digestivas en el epitelio de la glándula digestiva de 

limacos experimentalmente expuestos a una mezcla de cadmio y keroseno 

Resumen: Los limacos, Arion ater (L) han sido propuestos como organismos centinela en la evaluación 

de la salud del suelo. Se han observado cambios en la composición de tipos celulares de la glándula 

digestiva de limacos bajo la influencia de contaminantes. De entre todos estos cambios el más reseñable 

es la pérdida de células digestivas y el aumento de células excretores y de calcio que le acompaña. El 

objetivo del presente trabajo es determinar si la pérdida de células digestivas afecta a los biomarcadores 

de exposición y efecto, y si dicha pérdida es reversible en limacos expuestos a una mezcla de 

contaminantes metálicos y orgánicos en condiciones de laboratorio. Con ese fín, se recogieron limacos de 

un lugar no contaminado (Delika, País Vasco) y se trataron con 10 µg Cd/gr + 30% de la fracción 

acomodada al agua de keroseno en la dieta durante 27 días. Se midió la concentración de Cd y de 

keroseno en la glándula digestiva. La densidad volumétrica de BSD (Vv BSD ), (BSD, del inglés; Black Silver 

Deposit) revelados mediante autometalografía y la actividad del enzima acil-CoA oxidasa fueron los 

biomarcadores de exposición estudiados. Como biomarcadores de efecto se calcularon los cambios en la 

densidad volumétrica de los tres tipos celulares que contituyen el epitelio de la glándula digestiva de 

limacos (células digestivas, excretoras y de calcio). Las células proliferativas se identificaron mediante 

immunohistoquímica de bromodeoxiuridina (BrdU). Los resultados obtenidos demostraron que la mezcla 

de contaminantes provocan un aumento en Vv BSD y en la actividad AOX así como la pérdida de células 

digestivas en limacos, aunque los cambios observados en el epitelio digestivo no afectaron a la capacidad 

de acumulación de contaminantes ni a los biomarcadores de efecto y exposición empleados en el presente 

trabajo. Además, el cambio en la composición de tipos celulares del epitelio digestivo fué reversible 

después de 7 días de depuración. Por otro lado, el marcaje de BrdU demostró que la exposición a 

contaminantes induce la proliferación de las células digestivas y que dicho aumento en la tasa de 

proliferación se mantiene durante el período de detoxificación. 

Palabras clave: glándula digestiva, limacos, recambio de tipo celular, cadmio, keroseno, 

biomarcadores de efecto y exposición. 

165


166

SARRERA 

Moluskuetan, liseri-guruinaren epitelioko zelula- 

moten osaketa larriki aldatuta suerta daiteke 

kutsatzaile-esposizio subletalen ondorioz 

(Rasmussen et al., 1983, Widdows et al., 1984; 

Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 

1990b; Marigómez et al., 1990; 1996; 1998a; 

1998b; Soto et al., 2002). Efektu hori, zelula-moten 

ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type 

replacement) izenaz ezagutu da, eta orokorki 

zelula basofilikoen dentsitate bolumetriko edo 

kopuru erlatibo gisa neurtu da (Rasmussen et al., 

1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; 


1990; 1996; 1998a; 1998b; 1. Kapitulua). CTR, 

kutsadura oean gerta daitekeen zelula basofilikoen 

(kaltzio-zelulen) proliferazioaren ondorioa dela 

iradoki da (Thompson et al., 1974; Rasmussen et 

al., 1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 

1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez 

et al., 1990; 1996). Haatik, Cd pean mantendutako 

magurioetan behatutako zelula basofilikoen 

itxurazko areagotzea nagusiki liseri-zelulen galera 

(DCL; ingeleraz, Digestive Cell Loss) eta aldi 

bereko zelula basofilikoen hipertrofiaren (BDH; 

ingeleraz, Basophilic Cell Hypertrophy) ondorioa 

dela frogatu da berriki (4. Kapitulua). DCL, liseri- 

zelulen proliferazio eta heriotzaren arteko 

desorekaren ondorioa dela dirudi, nahiz eta liseri- 

zelulen kopuruaren galera netoa suertatu, Cd peko 


esposizioak liseri-zelulen proliferazioaren 

emendioa eragiten baitu (4. Kapitulua). 

Muskuilu zein magurioetan, liseri-guruinaren 

epitelioa bi zelula-mota nagusiz osaturik dago, 

liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia; hortaz, 

"itxurazko" CTR, epitelioko zelula-kopuruaren 

galera netoa ematen denez, DCLren ondorio 

zuzena dela onar genezake (1. eta 4. Kapituluak). 

Lehorreko gastropodoen liseri-guruineko epitelioa, 

ordea, morfologikoki desberdintzatutako hiru 

zelula-motez osaturik dago: liseri-zelulak 

(ugarienak), iraizte-zelulak eta kaltzio-zelulak 

(basofilikoak) (Sumner, 1965). Hala ere, iraizte- 

zelulak, bizi-zikloaren azken urratsetan dauden 

liseri-zelulak, eta ez hirugarren zelula-mota 

desberdintzatua, izango liratekeela proposatu da, 

(Porcel et al., 1996; Dimitriadis & Konstantinidou, 

2002). Molusku itsastarretan bezala, kaltzio-zelulen 

(zelula basofilikoen) hipertrofia eta kopuru erlatibo 

emendatuaren berri eman da metalen pean 

mantendutako lehorreko bareetan (Marigómez et 

al. 1996; 1998a). Hala ere, iraizte-zelulen 

proportzio erlatiboa ere emenda daiteke 

(Marigómez et al., 1998a) eta, beraz, bareen liseri- 

guruinean hiru zelula-motetan gertatzen diren 

aldaketak "itxurazko" CTR gainean nola eragiten 

duten argitu beharra dago. Are gehiago, Cd eta Zn 

pean mantendutako magurio eta muskuiluetan 

behintzat, "itxurazko" CTR egun gutxiren buruan 

itzulgarria denez (1. eta 4. kapituluak), moluskuen 

liseri-guruineko epitelio-zelulen berriztatzearen 

ikuspegi orokorra eskuratzeko asmoz, erantzun 

hori zelula-moten osaketa konplexuagoa duten 

167


bareen liseri-guruinean ere itzulgarria ote den 

argitzea komenigarria iruditu zitzaigun. 

168 

Beste alde batetik, muskuiluen kasuan metal- 

esposizioak eragindako CTRk autometalografia 

(AMG) bidez errebelatutako zilarreezko haupeakin 

beltzen (BSD; ingeleraz, Black Silver Deposits) 

BSD-hedapenaren moduko esposizio- 

biomarkatzaileen gainean eragina duena badakigu 

(Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Hala ere, Cd pean 

jarritako magurioetan ez dirudi DCLk BSD- 

hedapenaren gainean eragina duenik, lisosomen 

barneko BSDen neurketa mikroskopikoak liseri- 

zeluletan modu errazean egin baitaitezke, zelula 

basofilikoak taldekaturik agertu ohi direlako. 

Bareetan, metal desberdinen arabera emaitza 

desberdinak erdietsi dira. Dietan 1000 µg Hg/g dosi 

pean 3 aste baino gehiagoz tratatutako bareetan, 

liseri-guruineko epitelioan suertatutako zelula- 

moten osaketaren aldaketak Vv BSD (BSDen 

dentsitate bolumetrikoa) esangarriki eragin zuen, 

liseri-epitelioa nagusiki BSDrik gabeko iraizte- 

zelulez osaturik baitzegoen (Marigómez et al., 

1996). Merkurio pean mantendutako bareetan, BSD 

liseri-zeluletan bereziki ugariak, iraizte-zeluletan 

esangarriki urriagoak eta kaltzio-zeluletan bakanak 

zirela aipatu beharra dago. Aitzitik, Zn pean 

mantendutako bareetan, zelula-moten osaketak ez 

zuen BSD-hedapenean eraginik izan, AMG bidez 

errebelatutako BSDak hiru zelula-motetan 

lokalizatu baitziren (Marigómez et al., 1998a). Cd 

pean jarritako bareetan, aurretiko behaketek 

BSDak iraizte-zeluletan ere bazeudela erakutsi 

zuten, eta, beraz, lotugai-multzo eskuragarrien 

arabera metal desberdinak zelula-mota 

desberdinetan bahitu daitezkeela kontuan hartuz 

(Marigómez et al., 2002), Cd-aren presentzian 

zelula-moten ordezkapenean behatutako aldaketek 

BSD-hedapenaren moduko metal-esposizioaren 

biomarkatzaileen gainean eragina duten ikertzea 

planifikatu genuen. 

Azkenik, metal indibidualen, metalen 

nahasketen, zein kutsatzaile organikoen pean 

jarritako bareen liseri-gurineko epitelioan ere 

"itxurazko" CTR deskribatu da (Müller, 1994; 

Marigómez et al., 1996; 1998a; 6. Kapitulua), baina 

metal eta konposatu organikoen nahasketek 

eragindako efektuei buruz ez dago datu 

eskuragarririk, guk dakigunez. Moluskuen liseri- 

guruinean, zelula-moten osaketari dagokionez 

metal eta hidrokarburoen nahasketen eta 

kutsatzaile indibidualen eragina desberdina denez 

(1. Kapitulua), ikerlan honetan Cd eta kerosenozko 

(beren urari egokitutako frakzioa, hain zuzen; WAF: 

ingeleraz, Water Accommodated Fraction) 

nahasketa kutsatzaile eredu gisa aukeratu zen. 

Horrela, ikerlan honetako helburuak hurrengoak 

dira: (1) metal (Cd) eta kutsatzaile organikozko 

(keroseno-WAF) nahasketa pean mantendutako 

bareen liseri-guruinean DCL dagoen den finkatzea; 

(2) magurioetan bezala, kutsatzaileen pean 

jarritako bareen liseri-guruinean, DCL prozesu 

itzulgarria den frogatzea; eta (3) zelula-moten 

osaketan gertatutako aldaketek BSD-hedapena 

moduko esposizio-biomarkatzaileen gainean 

eragina duten argitzea. Helburu horiekin, Delika 

(Euskal Herria) inguruko toki garbi batetik Arion ater 

bareak hartu ziren. Kadmio eta keroseno-WAF 

nahasketaren dosi subletal pean 27 egunez jarri

ziren, eta ondoren laborategiko egoera garbitan 

mantendu ziren 7 egunez. Neurketa osagarri gisa, 

elikatze-jarduera eta hazkuntza, egunero neurtu 

ziren. Bareen liseri-guruineko Cd eta kerosenoaren 

kontzentrazioak, absortzio atomikozko 

espektrofotometria (AAS) eta gas- 

kromatografia/masa-espektrometria (GC/MS) 

bidez neurtu ziren, hurrenez hurren. Halaber, AMG 

bidez errebelatutako BSDen dentsitate 

bolumetrikoa (Vv BSD ) eta azil-KoA oxidasa (AOX) 

entzimaren jarduera bareen liseri-guruinean, 

metalen eta konposatu organikoen esposizio- 

biomarkatzaile gisa aplikatu ziren, hurrenez hurren. 

Bareen liseri-guruinaren epitelioa osatzen duten 

hiru zelula-moten dentsitate bolumetrikoa (Vv DIG , 

Vv EXC , Vv CAL ) hematoxilina-eosinaz tindatutako 

parafinazko ebakien gainean estereologia erabiliz 

kalkulatu zen. Gainera, liseri-guruinen bolumen- 

unitate arbitrario bateko zelula-kopuru absolutua 

ere estimatu zen. Azkenik, bromodeoxiuridina 

(BrdU) immunohistoki-mika erabiliz zelula 

proliferatzaileak identifikatu ziren. 







Diseinu esperimentala eta laginen prozesaketa 

Arion ater (Linnaeus) lehorreko bareak Iberiar 

penintsularen iparraldeko Delikako (42º 58’I, 3º 


1’M) gune landatar garbian ekainaren bukaeran 

(ar-fasea) hartu ziren. Animaliak laborategira 

garraiatu ziren, eta 15 aleko taldeetan mantendu 

ziren, aireztapen egokia baimentzeko saretxo 

batez estalitako 3 l-ko kutxetan. Kutxak, egunero 

dabilur ugariz garbitu ziren, esperimentuak iraun 

bitartean. 

Elikagairik gabeko moldatze-denbora (7 egun) 

igaro ondoren, bareak egunero azenario, sagar, 

uraza eta kalabaza zati proportzionalak zituen eta 

%1.5 agar uretan zuen "dieta naturalez" elikatu 

ziren. Hogei bare, Cd (10 Cd µg/g) eta %30 

keroseno-WAF nahasketaz tratatu ziren. WAFa, 

900 ml ur distilatu eta 100 ml keroseno gau osoan 

20ºC-tan etengabe irabiatzen nahastuz ekoiztu 

zen. Kadmioa, agar-disoluzioa prestatzeko erabili 

zen uretan kloruro gatz moduan disolbatu zen, 

agar-disoluzioa %30 WAF eta %70 ur distilatuan 

prestatu zelarik. Horrela janariaren Cd eta 

kerosenoaren kontzentrazioak 395.93 µg/g ehun- 

pisu lehor eta 415.36 µg/g ehun-pisu lehor izan 

ziren, hurrenez hurren. Aldi berean, esposatu 

gabeko kontrol seriea ere mantendu zen. 27 egun 

ondoren, Cd + keroseno nahasketaz tratatutako 

bareak 7 egunez "dieta naturalez" elikatu ziren, 

arazte-prozesua ikertzeko asmoz. Tratamenduaren 

erreplika-serie bat gehitu genuen, bestearen 

baldintza berberetan mantendu zena. 

Janaria egunero aldatu zen. Elikatze-jarduera 

determinatzeko, emandako janaria eta utzitako 

janaria egunero pisatu ziren. Bareak ere egunero 

eta taldeka pisatu ziren. 

Esperimentuan zehar analisi kimiko eta 

biologikoak egiteko hainbat animalia beharrezkoak 

169


zirenez, erabilitakoak erreplika-serieko barez 

ordezkatzen ziren animalien dentsitatea konstantea 

mantentzeko asmoz. Izan ere, lehorreko 

gastropodoen fisiologia populazio-dentsitatearen 

arabera esangarriki aldatzen dela deskribatu da 

(Runham & Hunter, 1970). 


Disekzionatutako liseri-guruinak (tratamenduko 

18. egunean, eta 7 egunetako arazte-aldia eta 

gero), ur distilatuan garbitu ziren, eta 120ºC-tara 48 

orduz labean berotu ziren, guztiz lehortu arte. 

Lehortutako materiala almerizaren laguntzaz txikitu 

zen, eta azido nitriko kontzentratuan liseritu zen. 

Ondoren, plaka beroan azido nitriko kontzentratua 

lurrundu ostean, liseritutako materiala ur distilatuan 

diluitutako (0.1 M) azido nitrikoan berresekitu zen. 

Laginak absortzio atomikozko espektrofotometroan 

(PerkinElmer 2280, Wellesley, Massachusetts, 

Amerikako Estatu Batuak) neurtu ziren. 

Kadmioaren kontzentrazioak, µg Cd/g ehun pisu 

lehor modura kalkulatu ziren. Erabilitako 

estandarrak Merck merkatal-etxeak (Merck & Co., 

Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako 

Estatu Batuak) zertifikatutakoak izan ziren. 

Kerosenoa neurtzeko, disekzionatutako liseri- 

guruinak (tratamenduko 18. egunean, eta 7 

eguneko arazte-aldia eta gero), ur distilatuan 

garbitu ostean izoztu egin ziren. Izoztutako 

materiala, liofilizatu, txikitu eta pisatu zen. Ondoren, 

azetonan murgilduta ultrasoinuen bidezko 

erauzketari ekin zitzaion. Iragazi ondoren laginak 

FID detektagailua zuen HP 6890 gas- 

kromatografo/masa-espektrometroan (Hewlett- 

170 

Packard, Palo Alto, California, Amerikako Estatu 

Batuak) neurtu ziren. 

Analisi biologikoetarako esperimentuko 0., 3., 

18., eta 27. egunetan eta arazte-aldiko 7. egunean 

5 bare disekzionatu ziren taldeko. Liseri-guruinaren 

zati txikiak Carnoy fixatzailean (%60 etanol 

absolutua, %30 kloroformoa eta %10 azido 

azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4°C-tan. Fixatu 

ondoren, laginak goranzko graduazioko etanolezko 

bainu-serie batean deshidratatu ziren, eta parafinan 

inkluditu ziren 60°C-tan. 7 µm-ko lodiera zuten 

ebakiak mikrotomoan lortu ziren, eta hematoxilina- 

eosinaz tindatu ziren behaketa morfologikoak eta 

zelula-moten osaketaren neurketak burutu ahal 

izateko. 


Parafinazko ebakiak xilolezko bainuetan 

desparafinatu ostean, beheranzko graduazioko 

etanoletan hidratatu ziren. Parafinazko ebakiak 

labean (40ºC) mantendu ziren guztiz lehortu arte. 

Laginak argazki-emultsio geruza mehe eta 

uniformez estali ziren, gela ilunean (Ilford Nuclear 


Gerora, laginak ilunpean mantendu ziren lehortu 

bitartean (30 minutu), eta errebelatzaile komertziala 

erabiliz Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur 

distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt, 

Alemania) errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren, 

errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikozko 

disoluzioan minutu batez murgilduz geldiarazi zen. 

Azkenik, fixatzaileaz (Agfa Agefix, Agfa-Gevaert 

N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) 10 minutuz fixatu 

ziren. Laginak, Kaiser gelatina glizerinatuan

muntatu ziren. Metal-ioien presentzia, zilarrezko 

hauspeakin beltzen agerpenak adierazten du 

(Danscher, 1984; Soto et al., 1998). 

BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan irudi- 

analisiaren bitartez 


azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto 

& Marigómez, 1997), emaitzak BSDen dentsitate 

bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argi- 





eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak 





Neurketak bare bakoitzean 5 eremutan burutu 

ziren, eta talde esperimental bakoitzean 5 bare 

erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 25 

neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-ek (1981) 

proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da, 

BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino 

txikiagoa zela kontuan hartuz, Holmes efektua 

zuzentzeko faktorea aplikatu zen. 

Epitelioaren konposizio zelularraren analisi 

estereologikoak 

Hematoxilina-eosinaz tindatutako lagin 

berberak erabiliz (7 µm), liseri-zelulen (Vv DIG ), 

kaltzio-zelulen (Vv CAL ) eta iraizte-zelulen (Vv EXC ) 

dentsitate bolumetrikoak kuantifikatzeko prozedura 


estereologikoa aplikatu zen. Horretarako lagin 

bakoitzean azarez aukeratutako zelai batean egin 

ziren kontaketak, guztira talde esperimental 

bakoitzeko 5 kontaketa burutuz. Analisi 

estereologikoak burutzeko Nikon Optiphot 

mikroskopioari atxiki zegoen irudi-hodia erabili zen 

(orotariko handipena: x670). Vv DIG , Vv CAL eta 

Vv EXC kalkulatzeko Weibel gratikula 

(multipurpouse test system M-168; Weibel, 1979) 

erabili zen, eta liseri-zelula, iraizte-zelula zein zelula 

basofilikotan eroritako puntuak zenbatu ziren, 

dentsitate bolumetrikoak Delesse printzipioaren 

arabera kalkulatzeko (Weibel, 1979). 

Liseri-zelula, kaltzio-zelula eta iraizte-zelulen 

estimazio absolutuak dentsitate bolumetrikoen 

datuetan oinarrituz burutu ziren. Liseri-, kaltzio- eta 

iraizte-zelulek betetzen zuten bolumenak 

(V DIG =Vv DIG x 17.8 x 10 6 µm 3 ; V CAL =Vv CAL x 

17.8 x 10 6 µm 3 ; V EXC =Vv EXC x 17.8 x 10 6 µm 3 ) 

arbitrarioki aukeratutako liseri-guruinaren bolumen 

batekiko kalkulatu ziren (17.8 x 10 6 µm 3 gutxi 

gorabehera): bolumen hori kalkulu estereologikoak 

egiteko erabilitako Weibel gratikularen (356000 

µm 2 ) arbitrarioki aukeratutako 50 µm-tako 

lodierako ebakidurari dagokio. Lodiera horrek, 

kaltzio-zelula handiena guztiz barneratua egotea 

ahalbidetzen du. 

Ondoren, liseri-guruineko zati arbitrario horretan 

liseri-, kaltzio- eta iraizte-zelulen kopurua 

kalkulatzeko, zelula-mota guztiek tamaina 

konstantea zutela onartu zen. Horrek iraizte- eta 

kaltzio-zelulen tamainaren azpiestimazioa ekarriko 

zuen, kutsatzaile pean egondako bareetan 

behintzat. 

171


AOX peroxisomikoaren jarduera 

AOX jarduera espektrofotometrikoki 

determinatu zen, 502 nm-ko uhin-luzeera erabiliz, 

Small et al.-ek (1985) ezarritako metodologia 

jarraituz. Bareen liseri-guruinak 4 ml/g ehun pH 7.6 

zuen TVBE indargetzailean (1 mM sodio 

bikarbonatoa, 1 mM EDTA, %0.1 etanola eta %0.01 

Triton X-100) teflonezko homegenizatzailea erabiliz 

izotzezko bainuan homogenizatu ziren. Lagin 

homogenizatuak 500 g-tara zentrifugatu ziren 15 

minutuz 4ºC-tan eta, ondoren, AOX jarduera 

neurtzeko, gainjalkina TVBE indargetzailean 10 

aldiz diluitu zen. Saiakerak, 30 µM palmitoil-CoA 

oxidasa substratu gisa erabiliz, peroxidasa 

endogenoak katalizatutako diklorofluoreszeina 

diazetatoaren (Molecular probes, Eugene, Oregon, 

Amerikako Estatu Batuak) H 2 O 2 menpeko 

oxidazioa du oinarri. Orotariko proteina- 

kontzentrazioa Lowry et al.-ek (1951) garatutako 

metodoan oinarritutako DC protein assay (BioRad, 

Hercules, California, Amerikako Estatu Batuak) 

erabiliz kalkulatu zen, estandar gisa γ-globulina 

erabiliz. 


Liseri-guruineko zelula proliferatzaileak BrdU 

immunohistokimika bidez lokalizatzeko, 27. 

esposizio-eguneko eta arazte-aldi osteko bareei 

3.5 mg BrdU injektatu zitzaien oinean zehar. 

Carnoy-z fixatutako eta parafinan inkluditutako 

ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) American Optical 

mikrotomoan lortu ziren, eta aldez aurretik (3-amino 

propil trietoxisilanoz) silanizatutako 

172 

portaobjektuetan jaso ziren. Ondoren, laginak 

xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko 

graduazioko etanolezko bainu-seriean hidratatu eta 

fosfato indargetzaile salinoz (PBS; ingeleraz, 

Phosphate-Buffered Saline) garbitu ziren. DNA, 0.1 

N HCl-ez desnaturalizatu zen ordu batez, 37°C-tan. 

Ebakiak, %5 bovine serum albumine (BSA) zuen 

suero blokeatzailean ordu batez inkubatu ziren giro- 

tenperaturan eta berriro ere PBS-z garbitu ziren. 

Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz 

espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza); %0.1 BSA 

zuen PBSan 1:10 diluitua) inkubatu ziren. Laginak 

PBS-z garbitu ziren, eta ondoren, abidina-biotina 

entzima-konplexua erabiliz antigorputza ikustarazi 

zen. Laburki, ebakiak, PBS-an diluitutako saguaren 

aurkako ahuntzaren IgG antigorputz sekundario 

biotinilatuan inkubatu ziren, 30 minutuz, eta 

ondoren PBSn garbitu ziren. Fosfatasa alkalinoa 

jarduera ikustarazteko kromogenoaren disoluzioa 

(naftol fast-red zuen PBS indargetzailean 

disolbatua) erabili zen. Azkenik, ebakiak Mayer 

hematoxilinaz kontrastatu (1 minutu), dabiluretan 

garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & 

Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey, 

Amerikako Estatu Batuak) muntatu ziren. 

Mikrografiak, Olympus BX50 (Olympus, Tokio, 

Japonia) mikroskopioari atxiki zegoen Olympus 

PM20 argazki-kameraz erdietsi ziren. 

EMAITZAK 

Bare kontrolek elikatze-jarduera konstantea 

erakutsi zuten esperimentuak iraun bitartean (1B 

Ird.). Maneiu esperimentalak eta laborategiko 

baldintzek jaitsiera txikia eragin zuten bareen

pisuan (1A Ird.). Esperimentuko lehengo sei 

egunetan bare kontrolek zein kutsatzaileen pean 

jarritako bareek antzeko elikatze-jarduera eta 

hazkuntza erakutsi zuten (1. Ird.). 10. egunetik 

aurrera, berriz, kutsatzaile pean jarritako bareetan 

elikatze-jardueran jaitsiera nabarmena behatu zen, 

eta momentu horretatik aurrera beraien pisua 

kontrolena baino txikiago gertatu zen. Arazte-aldia 

igaro eta gero, elikatze-jardueran nolabaiteko 

susperraldia antzeman zen arren, ez zen bareen 

pisuaren igoeran islatu. Hala ere, momentu 

horretaraino neurtutako etengabeko pisu-galerak 

ez zuen luzaroago jarraitu (1. Ird.). 

Bare kontroletan neurtutako Cd kontzentrazioak 

baxuak izan ziren, zelaitik hartutako bareetan 

neurtutakoen antzekoak, eta aldaketarik gabe 

mantendu ziren esperimentuak iraun bitartean. 

Bestalde, kutsatzaileen pean jarritako bareetan Cd 

kontzentrazioa kontroletan neurtutakoak baino 10 

aldiz handiagoak izan ziren esperimentuaren 18. 

egunean, eta arazte-aldia bukatu ondoren balioak 


kontroletan neurtutako mailetara itzuli ziren (1. 

Taula). 

Keroseno kontzentrazio tisularrei dagokienez, 

kutsatzaileen pean 18 egunez jarritako bareetan 

neurtutako kontzentrazioa kontroletan baino 3 aldiz 

handiagoa izan zen esperimentuaren. Arazte-aldia 

bukatu ondoren, bere aldetik, liseri-guruinaren 

keroseno kontzentrazioak kontroletan neurtutako 

mailetara itzuli ziren (1. Taula). 

Kutsatzaile pean jarritako bareetan, BSDak 

liseri-zelulen lisosometan eta iraizte-zelulen 

bakuoloetan lokalizatu ziren (2B Ird.). Gainera, 

liseri-azinoen lumenera iraizitako eta jatorri 

lisosomiko zuten liseri-zelulen hondakinek BSD 

nabarmenak erakutsi zituzten (2C Ird.). Horretaz 

gain, zenbait laginetan liseri-epitelioaren xafla 

basalean BSDen presentzia detektatu zen. Kontrol 

eta araztutako bareen liseri-guruinetan ez zen 

apenas BSDen presentziarik aurkitu (2A eta 2D 

Ird.). Horrekin lotuta, bare kontrolek Vv BSD maila 

basalak erakutsi zituzten. Tratamendu pean 

jarritako bareetan, Vv BSD maila denbora aurrera 

1. Irudia: Bare kontrol eta Cd + keroseno pean mantendutako bareen pisuaren aldaketa (A) eta elikatze-jarduera metatua (B). 

Puntu zuriak bare kontrolei dagozkie eta puntu beltzak kutsatzaileen nahasketaz tratatutako bareei. Beheko geziak esposizio- eta 

arazte-aldiaren nondik norakoak adierazi ditu. 

173


1. Taula: Bare kontrol eta Cd + keroseno pean jarritako bareen liseri-guruinetan neurtutako Cd eta kerosenoaren adierazgarriak 

diren hidrokarburoen gehiketaren kontzentrazioak (µg/g ehun-pisu lehor) esperimentuko 18. egunean eta arazte-aldia bukatu 

ondoren. 

joan heinean handitu zen (3. Ird.), 18 eta 27. 

egunetan bereziki agerian gelditu zena. Araztearen 

174 

Cd 

Kontzentrazioa 

18. Eguna Arazte-aldia 

Kontrola 102.84±78.16 94.36±36.6 

Cd + keroseno 904.672±548.847 168.256±25.6 

Keroseno 

Kontzentrazioa 

18. Eguna Arazte-aldia 

Kontrola 136.64±36.89 114.24±41.25 

Cd + keroseno 415.32±170.14 163.25±52.13 

7 egunak igaro eta gero, Vv BSD balioak kontrolen 

mailetara itzuli ziren (3. Ird.). 

2. Irudia: Metalen lokalizazio autometalografikoa Arion ater barearen liseri-epitelioan: bare kontroletan (A), Cd + keroseno pean 18 

egun egondako bareetan (B), Cd + keroseno pean 27 egun egondako bareetan (C eta irudi txikia), eta 7 eguneko arazte-aldia jaso 

zuten bareetan (D). L, liseri-epitelioaren lumena; gezi-buruak, liseri-zelulen lisosometan dauden zilarrezko hauspeakin beltzak, 

geziak, liseri-epitelioko lumenean dagoen metala. Eskala-marra: 25 µm.

Peroxisomen proliferazioaren adierazle gisa 

neurtutako azil-KoA oxidasa (AOX) jarduera Cd + 

keroseno nahasketa pean induzitu zen 3. egunean 

(4. Ird.). Gerora, AOX jarduera esangarriki jaitsi zen, 

kontrol zein esposatutako bareetan, eta ez zen 

aurkitu taldeen arteko desberdintasun esangarririk 

(4. Ird.). 

Bare kontrolen liseri-guruina nagusiki liseri- 

zelulez osaturik agertu zen, eta iraizte- zein kaltzio- 

zelula urriak taldekaturik agertu ziren (5A Ird.). 18 

(5B Ird.) eta 27 (5C Ird.) egunez Cd + keroseno 

nahasketaz tratatu ondoren, iraizte-zelulen kopurua 

esposizio-denborarekin emendatu zela bistakoa 

zen. Modu berean, kaltzio-zelulak ere 

nabarmenagoak suertatu ziren, eta gainera itxuraz 

hipetrofiaturik ageri ziren,(5B Ird. eta 5C irudi txikia). 

Kutsatzaileen peko esposizioaren ondorio gisa, 

odol-hodiak erlatiboki ugaritu ziren, eta euren 

paretetako Leydig zelulak puztuta agertu ziren. 

Zazpi eguneko arazte-aldiaren ondorioz, liseri- 

guruinaren epitelioak kontrolen itxura berreskuratu 

zuen (5D Ird.), liseri-zelula ugari eta iraizte-zelula 

urriez eratuta egonik; kaltzio-zelulek oraindik ere 

nolabaiteko hipertrofia erakusten jarraitu zuten 

arren. 

Aurrekoarekin bat, Vv CAL , Vv EXC eta Vv DIG 

parametroek, Cd + keroseno nahasketa pean 

jartzeak eta ondorengo arazte-aldiak bareen liseri- 

guruinaren zelula-moten osaketan aldaketa 

esangarriak eragin zituztela adierazi zuten (6. Ird.). 

Bare kontroletan Vv DC balioek ez zuten aldaketarik 

erakutsi, eta modu iraunkorrean 0.8 baliotik gora 

mantendu ziren. Kutsatzaileen pean jarritako 

bareetan, berriz, parametro horretan jaitsiera 


esangarria aurkitu zen esperimentuko 3. egunetik 

aurrera, hortik aurrera antzeko balioak (inoiz ez 0.7 

baliotik behera) lortu zirelarik. Araztearen ondorioz, 

Vv DC balioen igoera esangarria behatu zen, bare 

kontrolen antzeko balioak eskuratuz (6A Ird.). 

Liseri-zelulen batezbesteko tamaina (8 µm-ko 

diametro eta 50 µm altuera) kontuan hartuz, gutxi 

gorabehera liseri-guruineko 17.8 x 10 6 µm 3 zati 

batean (kalkulu estereologikoak burutzeko erabili 

den Weibel gratikularen kaltzio-zelula handiena 

barneratzea ahalbidetzen duen 50 µm-ko lodiera 

arbitrarioaren ebakidurari dagokiona), liseri-zelulen 

kopurua 4275±487 (3. eguna) eta 4797±111 (27. 

eguna) bitartekoa izan zen bare kontroletan; eta 

kutsatzaile pean jarritako bareetan, ordea, 

3736±647 baliora jaitsi zen (21. eguna). Zazpi 

eguneko arazte-aldiaren ondoren, liseri-zelulen 

kopurua 5344 baliora igo zen (6B Ird.). Vv EXC eta 

iraizte-zelulen kopuruan aldaketa deigarriagoak 

antzeman ziren (6C eta 6D Ird.). Vv EXC 3. egunetik 

aurrera hiru aldiz handiagoa izan zen kutsatzaile 

pean jarritako bareetan kontroletan baino, arazte- 

3. Irudia: .Bare kontrol (zutabe zuria) eta Cd + keroseno pean 

mantendutako (zutabe grisa) bareen lisosometan neurtutako 

zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate bolumetrikoa 

(Vv BSD ). Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi 

dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun 



aldiaren ondoren balioak berriro ere bare kontrolen 

mailetara itzuli zirelarik (6C Ird.). Horrela, iraizte- 

zelulen kopurua 243-tik 748-ra emendatu zen, 

arazte-aldiaren ondoren 224-ra bueltatu zen 

bitartean. Bestalde, Vv CAL balioei dagokienez, ez 

zen desberdintasun esangarririk behatu (6E eta 6F 

Ird.). Orotara, epitelio-zelulen kopurua ez zen 

desberdina izan ez esposizio ezta arazte-aldiaren 

ondorioz ere (6G Ird.). 


BrdU-positiboak ziren bareen liseri-guruineko 

zelulen nukleoek kolore gorria erakutsi zuten (7. 

Ird.). Liseri-epitelioan batez ere liseri-zelulak 

positiboki markaturik aurkitu ziren, eta nahiz eta 

iraizte-zelulen lipofuszinen materialak 

erreakzionagarritasuna erakutsi, errez bereiz 

zitekeen nukleo positibo eta sasipositibotasunaren 

artean (7G Ird.). Urdailaren epitelioan ere nukleo 

BrdU-positiboak behatu ziren (7E Ird.). Cd + 

keroseno nahasketa pean jarritako bareetan, eta 

baita arazte-prozesua pairatu zutenetan ere, talde 

kontroletan baino nukleo BrdU-positibo gehiago 

4. Irudia: Bare kontrol (zutabe zuria) eta Cd +keroseno pean 

mantendutako (zutabe grisa) bareen liseri-guruinean 

neurtutako AOX jarduera. Segmentu bertikalek desbidazio 

estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoak taldeen arteko 

desberdintasun esangarria adierazi ditu (p

naturalean gehitzea) zeharo hurbilketa berria izan 

zen. 

Esposizio-biomarkatzaileek ere, kimika 

analitikoaren datuak baieztatu zituzten. Cd + 

keroseno nahasketaz tratatutako bareen liseri- 

zeluletako lisosometan Vv BSD esangarriki igo 

izana, metal-esposizioaren adierazle moduan har 

dezakegu. Era berean, Hg pean egoteak, liseri- 

zeluletako lisosometan BSDen presentzia 

areagotua dakar (Marigómez et al., 1996). Metalen 

metaketa, moluskuen liseri-guruinean oso erantzun 

azkarra dena jakina da; izan ere, Cd pean 

mantendutako muskuiluetan egun bakar batean 

Vv BSD balioak esangarriki goratu ziren (Soto et al., 

2002; 1. Kapitulua). Ikerlan honetan, Vv BSD 


parametroan behatutako aldaketak, denbora eta 

dosiaren menpekoak dira. Hortaz, kerosenoaren 

presentziak bareen liseri-guruinean Cd-aren 

metaketa oztopatu ez zuela ondoriozta daiteke. 

Halaber, Cd + bezo(a)pireno (BaP) pean jarritako 

muskuiluetan, kutsatzaile organikoaren presentziak 

ez zuen Cd-aren metaketa oztopatu liseri- 

guruinean (Marigómez et al., 2005; 1. Kapitulua). 

Bestalde, keroseno eta Cd nahasketa pean 

jarritako bareetan, azil-KoA oxidasa (AOX) jarduera 

bare kontroletan baino altuagoa izan zen 

esperimentuko 3. egunean, bareak kutsatzaile 

organikoen pean (kasu honetan kerosenoa) egon 

izanaren seinale (Cancio & Cajaraville, 2000). AOX 

jarduera estabulazio denborarekin jaitsi zen, 

5. Irudia: Arion ater barearen liseri-guruinaren ebakiak, hematoxilina-eosinaz tindatuak: bare kontrolak (A); Cd + keroseno pean 

18 egunez mantendutako bareak (B); Cd + keroseno pean 27 egunez mantendutako bareak (C eta irudi txikia); eta 7 eguneko 

arazte-aldia jaso duten bareak (D). Asteriskoak, iraizte-zelulak; geziak, kaltzio-zelulak; gezi-buruak, askatzen ari diren kaltziozelulak; 

L, liseri-azinoen lumena. Eskala-marra: 50 µm (A,-D); 25 µm (irudi txikia). 

177


kutsatzaile pean egondako bare zein bare 

kontroletan antzeko jarduerak neurtu zirelarik 

esperimentuko 3. egunetik aurrera. Optimoak ez 

diren elikatze- eta mantenu-egoera esperimental 

luze hauetank, AOX jarduera induzitu ez izana ez 

da harrigarria. Dakigunaren arabera, peroxisomen 

178 

proliferazioaren adierazlea den AOX jarduera 

(Cajaraville et al., 2003) honako honetan erabili da 

lehenendo aldiz lehorreko gastropodoetan 

kutsatzaile organikoen esposizio-biomarkatzaile 

gisa. Bibalbioen AOX jardueran, indibiduoen 

elikadura-egoerak, maneiu-esperimentalak eta 

6. Irudia: Bare kontrol (zutabe zuria) eta kutsatzaile pean 

mantendutako (zutabe grisa) bareen zelula-moten osaketaren 

aldaketak. (A) Liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liserizelulen 

kopurua. (C) Iraizte-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (D) 

Iraizte-zelulen kopurua. (E) Kaltzio-zelulen dentsitate 

bolumetrikoa. (F) Kaltzio-zelulen kopurua. (G) Zelulen kopuru 

totala. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi 

dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun 


ugalketa-zikloak eragina izan dezakete (Cancio et 

al., 1999; Cancio & Cajaraville, 2000; Orbea et al., 

2002). Bareetan, ugal-garapenaren aldaketak aste 

gutxiren buruan gerta daitezke (Marigómez et al., 

1986; Zubiaga, 1986) eta beraz, uztailan zehar, 

feminizazioaren aurretik, non gameto arrak ia guztiz 

garatuak dauden, AOX jardueran aldaketak 


gertatzea ezin daiteke baztertu. Ikerlan honetan 

gertatu den bezala, Cd eta BaP nahasketaren pean 

mantendutako muskuiluetan, AOX jarduera soilik 

esposizio-egun baten ondoren erantzuteko gai izan 

zen, momentu horretatik aurrera, AOX jarduerak 

baxuak izan ziren, muskuilu tratatui eta muskuilu 

kontrolen artean berdintsuak izan zirelarik (Orbea et 

7. Irudia: Arion ater barearen liseri-azinoen epitelioan eta urdaileko-epitelioan egindako BrdU immunohistokimika: Bare kontrola 

(A); Cd + keroseno pean 27 egunez egondako barea (B); 7 eguneko arazte-aldia jaso duten bareak (C-G). Gezi-buruak, nukleo 

BrdU-positiboak; zirkuluak, lipofuszinek sortutako marka sasipositiboak. Eskala-marra: 50 µm (A-E); 25 µm (F & G). 

179


al., 2002). Era berean, BaP pean jarritako bareetan, 

kutsatzaile kimikoen esposizio-biomarkatzaile gisa 

erabilitako benzo(a)pireno hidroxilasa (BPH) 

jarduera, soilik esperimentuko 3. egunean induzitu 

zen, baina ez esposizio-denbora luzeagoetan 

(Hamers et al., 2004). Halaber, BaP pean jarritako 

muskuiluetan, esposizio osteko egun gutxitara 

bakarrik induzitzen da BHP jarduera (Okay et al., 

2000). Beraz, nahiz eta esposizioaren 3. egunetik 

aurrera erregistratutako AOX jarduera baxua izan, 

AOXren indukzio azkarrak, ikerlan honetan 

erabilitako kerosenoaren esposizio-modua 

eraginkorra izan zela argiro erakutsi du. 

Elikatze-jarduera eta hazkuntza, neurri osagarri 

gisa erregistratu ziren esperimentuan zehar. Bare 

zein barraskiloetan, kutsatzaile pean egoteak 

elikatze-jardueran eta hazkuntzan beherakada 

esangarriak sor ditzake (Russell et al., 1981; 

Marigómez et al., 1986b; Laskowski & Hopkin, 

1996; Swaileh & Ezzughayyar, 2000; 5. Kapitulua). 

Hortaz, metalez (Cu, Zn eta Cd) kutsatutako 

tokietatik hartutako bareek, kutsatugabeko tokietan 

hartutako bareekin alderatuz, gorputz osoaren eta 

liseri-guruinaren pisu lehorrean %50-eko 

murrizketa erakutsi zuten (Marigómez et al., 

1998a). Efektu horri dagokionez, eragite-maila 

metalez-metal alda daitekeela esan baharra dago. 

Helix aspersa barraskiloan behatutakoaren 

arabera, Cd-a, Zn-a eta Pb-a baino toxikoagoa da 

elikatze-jarduera, hazkuntza eta heriotza-tasari 

dagokienez (Laskowski & Hopkin, 1996). 

Kutsatzaile organikoek ere, elikatze-jarduera zein 

hazkuntzaren gainean eragina dute, laborategian 

BaP pean jarritako bareek erakutsi zutenez 

180 

(Hamers et al., 2004). BaP pean jarritako bareetan, 

elikatze-jarduera modu azkarrean txikiagotu zen, 

baina gorputzaren pisuan aldaketak soilik 

hirugarren egunetik aurrera gertatu ziren (Hamers 

et al., 2004). Modu berean, ikerlan honetan Cd + 

keroseno pean jarritako bareetan, elikatze-jarduera 

aste batetik aurrera txikiagotu zen, hazkuntzaren 

murrizpena bakarrik 3. astetik aurrera ikusgarria 

izan zen bitartean. 

Metal pean jarritako lehorreko gastropodoen 

liseri-guruinaren xafla basalak loditu egiten dira, 

liseri-zelulak lehendabizi bakuolizatuak ageri eta 

beranduago urriagoak bilakatzen dira, kaltzio- 

zelulak hipertrofiatu egiten dira, kaltzio-zelulak eta 

iraizte-zelulak erlatiboki ugariagoak bilakatzen dira, 

eta odol-zelulak eta ehun konektiboko zelula 

migratzaileak liseri-azinoen inguruan metatzen dira 

(Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; 1998a; 

Recio et al., 1988a; 1988b; Ireland & Marigómez; 

1992, Chabikovsky et al., 2004; Snyman et al., 

2005; 6. Kapitulua). Oro har, Cd + keroseno pean 

jarritako bareetan irudi beretsua ikusi da, 

erantzuna, beraz, orokorra dela dirudi, eta ez metal- 

kutsaduraren espezifikoa. Horrela, emaitza horiek, 

behatutako aldaketak kutsatzaile espezifiko batek 

sorterazitako erantzunak baino gehiago, estres- 

egoera orokorraren aurrean gauzatutako 

erantzunak direla konfirmatu dute, aldez aurretik 

Marigómez et al.-ek, (1996) proposatu bezala. Hala 

ere, kutsatzaile organikoek beraien kabuz efektu 

berdinak, modu kualitatiboan behintzat, sortarazten 

ote dituzten zehazteko ikerlan gehiagoren beharra 

dago.

Efektu horien artean, deigarrienak liseri- 

guruinaren epitelioan behatutako zelula-moten 

osaketari dagozkionak dira. Aldez aurretik 

laborategian egindako ikerlanek agerian utzi 

dutenez, moluskuen liseri-guruinean zelula-moten 

osaketan aldaketa esangarriak 3 eta 21 egun 

bitartean, espeziearen, kutsatzaile, dosi eta 

esposizio-moduaren arabera eta baita ingurumen- 

egoeraren arabera, gerta daitezke (Marigómez et 

al., 1996; 1 eta 4. Kapituluak). Ikerlan honetan 

erabilitako esposizio-modu bera erabiliz, Cu eta Hg- 

z tratatutako bareetan, liseri-epitelioa osatzen duten 

zelula-moten proportzio erlatiboan aldaketak 

behatu dira, iraizpen-jarduera eta estrusio apokrino 

areagotuen ondorioz (Marigómez et al., 1986b; 

1996). 1000 µg Hg/g janari dosiaz 27-30 egunez 

elikatutako bareetan, liseri-zelulen kopurua izugarri 

jaitsi zen, liseri-epitelioa funtsean kaltzio-zelulez eta 

iraizte-zelulez osaturik geratuz (Marigómez et al., 

1996). Cd kontzentrazio subletalen pean 

mantendutako magurioetan antzeko prozesua 

deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Ikerlan 

honetan, Vv DIG eta Vv EXC modu esangarrian 

aldatu ziren, Cd + keroseno esposizio zein 7 

eguneko arazte-aldiaren eraginez. Vv CAL balioak, 

ordea, ez ziren esangarriki aldatu. Horrela, Cd + 

kerosenoz tratatutako bareetan, Vv DIG 

esperimentuko hirugarren egunetik aurrera jaitsi 

zen, eta 7 eguneko arazte-aldiaren ondoren berriro 

ere bare kontroletan neurtutako balioetara itzuli 

zen. Vv EXC balioen aldaketak nabarmenagoak 

izan ziren, 3. tratamendu-egunetik aurrera 

tratatutako bareetan, kontroletan baino hiru aldiz 

handiagoak izatera iritsiz baina, Vv DIG -ren kasuan 


bezalaxe, arazte-aldiaren ondoren kontrol-mailetara 

itzuli ziren. Vv CAL balioei dagokienez, ez dirudi 

tratamenduak kaltzio-zelulen proportzioaren gain 

eragin esangarria izan zuenik. Aitzitik, Cu, Hg eta 

metaleen nahasketan (Cu, Cd, Zn) peko 

esposizioek kaltzio-zelulen dentsitate erlatiboaren 

emendioa eragiten dutela deskribatu da 

(Marigómez et al., 1986b; 1996; 1998). Ikerlan 

honetan, Vv CAL modu esangarrian aldatu ez zen 

arren, itxurazko kaltzio-zelulen presentzia 

erlatiboaren igoera susma zitekeen, mikroskopioan 

egindako behaketa zuzenak kontuan hartuz, 

behintzat. Horrekin bat, Cd + kerosenoz tratatutako 

Vv CAL balioen igoerako joera ageri zen, 

estatistikoki esangarria izan ez arren. Edozein 

kasutan, kaltzio-zelulen proportzioan behatutako 

igoerak iraizte-zeluletan behatutakoen aurrean 

garrantzi gutxikoak izango ziren, beste 

moluskuetan ez bezala (Cajaraville et al., 1990a; 

Marigómez et al., 1990; 1998b; 2005; Soto et al., 

2002; 1 eta 4. Kapituluak). 

Liseri-zelulen batezbesteko tamaina kontuan 

hartuta, beraien kopurua (DCN) 17.8 x 10 6 µm 3 -ko 

liseri-guruineko ehun-zati arbitrario batetarako 

(bolumen unitate arbitrarioa) kalkulatu zen. Bare 

kontroletan, DCN ez zen esangarriki aldatu 

esperimentuak iraun bitartean, batezbesteko balioa 

unitate arbitrario horretan 4500 zelula baino apur 

bat altuagoa izanik. Cd + keroseno tratamenduaren 

eraginez, 750 (%17) liseri-zelula inguru galdu ziren, 

7 eguneko arazte-aldiaren ondorioz unitate 

arbitrario bakoitzeko 1500 liseri-zelula berri agertuz. 

Era berean, Cd pean jarritako magurioetan 1850 

(%13) liseri-zelula galdu ziren, 7 eguneko arazte- 

181


aldiaren ondorioz 2600 liseri-zelula berri sortu 

zirelarik 17.8 x 10 6 µm 3 -ko liseri-guruineko unitate 

arbitrarioko (4. Kapitulua). Cd pean jarritako 

magurioetan, Vv BAS eta zelula basofilikoen 

bolumen absolutua handitu zen, baina ez zen 

aldaketarik behatu zelula basofilikoen kopuruan (4. 

Kapitulua), ikerlan honetan Cd + keroseno pean 

jarritako bareetan behatutako emaitzekin bat 

datorrena. Bestalde, Cd + keroseno pean 27 

egunez mantendutako bareetan 500 (%300) iraizte- 

zelula berri agertu ziren bolumen unitate 

arbitrarioko, 7 eguneko arazte-aldiaren ondorioz 

galdu zirenak, hain zuzen. Aipagarria da, muskuilu 

eta magurioetan gertatu ez bezala, epitelio-zelulen 

kopuru totala kutsatzaileen zein arazte-aldiaren 

eraginez ez zela aldatu. Iraizte-zelula, zelula-mota 

desberdina baino bizi-zikloaren amaieran dagoen 

liseri-zelula dela proposatu da (Porcel et al., 1996; 

Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Liseri- eta 

iraizte-zelulen proportzio erlatiboek kontrako 

zentzuan mugitzen dira baraualdian eta 

kutsatzaileen esposizio pean (Porcel et al. 1996; 

Marigómez et al. 1998; Dimitriadis & Konstantinidou 

2002; 6. Kapitulua). Testuinguru horretan, ikerlan 

honen emaitzek, iraizte-zelulak liseri-zelula “zahar” 

edo “erabiliak” direnaren hipotesia sendotzen dute, 

liseri-zelulen eta iraizte-zelulen kopuru absolutuek, 

tratamendu eta arazte-aldiaren eraginez kontrako 

zentzua jarraitzen baitute. Metalek, bareen liseri- 

guruineko zelulen zahartzapen goiztiarra eragin 

dezaketela aurretik ere proposatu da (Marigómez et 

al., 1986b), Cu pean (dietan zein uretango 

esposizioa) jarritako bareak aztertuz, hain zuzen 

ere. Orokorki, lehorreko gastropodoen liseri- 

182 

guruinean ematen diren iraizte-jarduera eta estrusio 

apokrino areagotuek, alterazio lisosomikoek eta 

lipofuszinen metaketek, kutsatzaileen eragin 

orokorren adierazgarritzat har ditzakegu 

(Marigómez et al., 1996; 1998; Chandran et al., 

2005). Kuprez trataturiko bareetan, jarduera 

fisiologikoaren fase desberdinak histokimikoki 

determinatu ondoren, xurgapena, liseriketa eta 

jariapena tratamenduko lehenengo egunetan 

bizkortu ziren, fase bakoitzak gutxiago irauten 

zuelarik; 300 eta 1000 µg Hg/g janari tratatutako 

bareetan 15. egunetik aurrera, berriz, epitelioa 

atrofiko edo, behintzat, ez horren aktibo bilakatu 

zen (Marigómez et al., 1986b). Hiperaktibitate 

horrek, zergaitik Cd + keroseno tratamenduaren 3. 

egunetik aurrera liseri-zelula gehiago iraizte-zelula 

bilakatzen joatea azalduko luke. Ondorioz, nahiz 

eta magurioetan kutsatzaileek liseri-zelulen galera 

netoa sortarazi, konplexuagoa den bareen liseri- 

guruinean badirudi liseri-zelulak, galdu beharrean, 

iraizte-zelulak bilakatzen direla. Hortaz, bareen 

liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketak 

nabarmenago irudikatzeko, iraizte-zelula/liseri- 

zelula ratioa (ECR; ingeleraz, Excretory to Digestive 

Cell Ratio) parametro sentikorrago gisa proposatu 

dugu, soilik liseri-zelula eta zelula basofilikoz 

osatutako magurioen liseri-guruinean 

proposatutako DCL parametroaren baliokidetzat 

har genezakeena (4. Kapitulua). 

Azkenik, zelula proliferatzaileak BrdU 

immunohistokimika bitartez identifikatu ziren liseri- 

guruineko epitelioan. Hainbat saiakera burutu 

ondoren, fosfatasa alkalinoa (AlP; Chabicovsky et 

al., 2003) aukeratu zen BrdU/anti-BrdU konplexuak

ikustarazteko, aldez aurretik magurio eta 

muskuiluetan erabilitako diamino benzidinak 

bareen liseri-guruinean pikor zitoplasmatiko eta 

lipofuszina ugariekin erreakzionatzen baitzuen 

(Zaldibar et al., 2004; 3 eta 4. Kapituluak). Hala ere, 

iraizte-zelulen bakuoloen lipofuszinen zenbait 

substantzia AlPrekin erreakzionagarriak badira. 

Edonola ere, lipofuszina sasipositibook, liseri- 

guruin eta urdaileko epitelioan behatutako nukleo 

BrdU-positiboetatik zailtasun handirik gabe bereiztu 

genituen. Muskuilu eta magurioetan gertatu zen 

moduan, bareen kasuan ere, urdaileko epitelioan 

liseri-guruineko epitelioan baino BrdU-markaketa 

nabariagoa topatu dugu (Zaldibar et al., 2004; 4. 

Kapitulua). Liseri-guruineko epitelioan, BrdU- 

markaketa batez ere liseri-zeluletan behatu zen, 

kaltzio-zelula urrietan markaketa ahula behatu zen 

bitartean. Iraizte-zelulen nukleoan ez zen BrdU- 

markaketa positiborik aurkitu. Hala ere, 

bakuoloetako lipofuszinen markaketek nukleo 

BrdU-positiboak itzal zitzaketeenez, iraizte-zelulak 

proliferatzeko gai direnentz egiaztatzeko, behaketa 

zehatzagoak egitea ezinbestekoa izango litzateke. 

Edonola ere, Cd + keroseno tratamenduak eta 

ondorengo arazte-aldiak, bareen liseri-zelulen 

proliferazio-intentsitatearen areagotzea eragin dute, 

ikusi dugunez. Izan ere, tratatutako zein araztutatko 

bareetan nukleo BrdU-positibo gehiago daude talde 

kontroleko bareetan baino. Era berean, 

magurioetan, Cd-ak liseri-zelulen proliferazioa 

areagotu zuen, eta proliferazio-tasa altu hori 7 

eguneko arazte-aldiaren ondoren ere antzeko 

mailan mantendu zen (4. Kapitulua). 


Kutsatzaileek zelulen proliferazioa eragin 

dezaketena jakina da (Beyersmann & Hechtenberg, 

1997; Habeebu et al., 1998; Piechotta et al., 1999; 

Chabicovsky et al., 2004). Magurioetan, Cd pean 

egoteak, arazte-prozesuei aurre egin ahal izateko, 

areagotutako liseri-zelulen berriztapena dakar, 

zelulen heriotza eta proliferazioaren arteko balantze 

gisa interpreta daitekeena (4. Kapitulua). Bareetan, 

areagotutako liseri-zelulen proliferazioa iraizte- 

zelula faseranzko progresio areagotuarekin batera 

gertatu zela dirudi. Zentzu horretan, Cu-meatze 

abandonatu batean hainbat belaunaldiz (kutsadura 

kronikoa) bizi izan diren bareen liseri-guruinean, 

iraizte-zelulen kopuru erlatibo altuaren berri eman 

da; non liseri-zelulek pikor zitoplasmatikoen 

iraizpenean bortizki baitziharduten eta oso 

bakuolizaturik ageri baitziren (Marigómez et al., 

1998a). 

Aldez aurretik metal pean jarritako magurio eta 

muskuiluetan deskribatu den moduan (1 eta 4. 

Kapituluak), Cd + keroseno nahasturaz trataturiko 

bareetan suertatutako zelula-moten osaketaren 

aldaketak ere, 7 eguneko arazte-aldiaren ostean 

itzulgarriak izan ziren. Liseri-zelulen proliferazioa 

tratatu eta araztutako bareen artean desberdina ez 

dela dirudienez, behatutako leheneratzea liseri- 

zeluletatik iraizte-zeluletaranzko progresioa 

moteltzean datzala pentsa genezake, eta hori 

epitelio-jarduera kutzatsailea ez egotean moteldu 

izanarekin bat letorke (Marigómez et al., 1986b; 

1998a; Chandran et al., 2005; 4. Kapitulua). Beraz, 

ingurumen-baldintz jakin bakoitzari zelula-moten 

osaketa bereizgarri bat eslei lekioke. 

183


Liseri-zelulen kopuru erlatiboaren murrizpen eta 

kaltzio-zelulen, eta batez ere, iraizte-zelulen kopuru 

erlatiboaren emendioaren berri, metalez 

kutsatutako ingurunetan bizitako lehorreko bareen 

liseri-guruinean ere eman da (Marigómez et al. 

1998a). Ikerlan honek, zelula-moten osaketaren 

aldaketok itzulgarriak direla erakutsi du, 

laborategiko baldintzetan behintzat. Dena den, 

ingurumen naturaletan animaliak beren bizitza 

osoan zehar metal pean kronikoki egon daitezke, 

eta beren erantzunak deskribatutakoen antzekoak 

liratekeenentz argitu beharrean gaude oraindik ere 

(Wang & Rainbow, 2005), hurrengo kapituluan 

jorratuko denez. 

Azkenik, zelula-moten osaketan metal- 

esposizioak eragindako aldaketek, BSD-hedapena 

gisako esposizio-biomarkatzaileen gainean eragina 

izan ditzaketeenaren berri eman da muskuiluen 

kasuan (Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Aitzitik, ez 

dirudi Cd + keroseno esposizio eta ondoko arazte- 

aldian zehar bareetan suertatutako aldaketek, BSD- 

hedapena parametroaren gainean eragina izan 

zutenik, Vv BSD aldaketak dosi eta denboraren 

menpekoak baitziren. Arrazoia, magurioetan 

gertatzen den moduan, bareen liseri-guruinaren 

epitelioko ezaugarri berezietan datza, non 

lisosomen barneko metalen neurketa 

mikroskopikoak liseri-zelulen gainean zuzenean 

egin baitaitezken (4. Kapitulua), liseri-zelula 

kopurua basala izanik ere. 

BIBLIOGRAFIA 

Beeby A, Richmond L (2002) Evaluation of Helix aspersa as a 

184 

sentinel for mapping metal pollution. Ecol. Indt. 1:261-270. 

Beyersmann D, Hechtenberg S (1997) Cadmium, gene regula- 

tion, and cellular signalling in mammalian cells. Toxicol. 





Org. 9:221-228. 





24. 

Cajaraville MP, Cancio I, Ibabe I, Orbea A (2003) Peroxisome 

proliferation as a biomarker in environmental pollution 

assessment. Micr. Res. Tech. 61:191-202. 

Cancio I, Ibabe A, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of 

peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in 

mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with 

the lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C 123:135-144. 

Cancio I, Cajaraville MP (2000) Cell biology of peroxisomes 

and their characteristics in aquatic organisms. Int. Rev. 

Cytol. 199:201-293. 

Chabicovsky M, Niederstätter H, Thaler R, Hödl E, Parson W, 

Rossmanith W, Dallinger R (2003) Localization and quanti- 

fication of Cd- and Cu-specific metallothionein isoform 

mRNA in cells and organs of the terrestrial gastropod Helix 

aspersa. Toxicol. Appl. Pharmacol. 190:25-36. 




Chem. 23:648-655. 

Chandran A, Sivakumar AA, Mohandass S, Aruchami M (2005) 

Effect of cadmium and zinc on antioxidant enzyme activity 

in the gastropod, Achatina fulica. Comp. Biochem. Physiol. 

C 140:422-426. 





Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of excretory 

cells in the digestive gland of the land snail Helix lucorum. 


Habeebu SSM, Liu J, Klaassen CD (1998) Cadmium-induced 

apoptosis in mouse liver. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153:48- 

58.

Hamers T, Kalis EJJ, Van den Berg JHJ, Maas LM, Schooten 

FJV, Murk AJ (2004) Applicability of the black slug Arion 

ater for monitoring exposure to polycyclic aromatic hydro- 

carbons and their subsequent bioactivation into DNA bin- 

ding metabolites. Mut. Res. 552:219-233. 

Ireland MP (1981) Uptake and distribution of cadmium in the 

terrestrial slug Arion ater (L). Comp. Biochem. Physiol. A 

73:855-858. 

Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary cal- 

cium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and his- 

tological changes in the digestive cells in the snail Achatina 

fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58:157-168. 

Laskowski R, Hopkin SP (1996) Effect of Zn, Cu, Pb, and Cd on 

fitness in snails (Helix aspersa). Ecotoxicol. Environ. Saf. 

34:59-69. 


digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellu- 

lar and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1: 213-226. 




Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) 

Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. 

Biochem. Chem. 193:265-275. 

Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986a) Copper treatment of 

the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Bioassay 

conduction and histochemical analysis. Bull. Environ. 


Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986b) Copper treatment of 

the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. 

Morphometrics and histophysiology. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 36:608-615. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of 

the digestive gland-gonad complex of the marine proso- 


Org. 9: 229-238. 




Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998a) Tissue- 

level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to 


Toxicol. 34:167-176. 


type replacement, a succesful strategy of molluscs to adapt 


to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 

18:431-435. 



molluscs. Micr. Res. Tech. 56:358-392. 

Marigómez I, Izagirre U, Lekube X (2005) Lysosomal 

enlargement in digestive cells of mussels exposed to 

cadmium, benzo[a]pyrene and their combination. Comp. 

Biochem. Physiol. C 141:188-193. 

Müller S (1984) Lindanuntersuchungen im Aquatischen und 

Terrestrischen Bereich in Bilbao (Nordostspanien). 

Lizentziatura-Tesia. Universität Karlsruhe. 93 orr. 

Orbea A, Ortiz-Zarragoitia M, Cajaraville MP (2002) Interactive 

effects of benzo(a)pyrene and cadmium and effects od 

di(2-ethylexyl) phtalate on antioxydant and peroxisomal 

enzymes and peroxisomal volume density in digestive 

gland of mussel Mytilus galloprovincialis Lmk. Biomarkers 

7:33-48. 

Okay OS, Donkin P, Peters LD, Livingstone DR (2000) The role 

of algae (Isochrysis galbana) enrichment on the 

bioaccumulation of benzo[a]pyrene and its effects on the 

blue mussel Mytilus edulis. Environ. Poll. 110:103-113. 

Piechotta G, Lacorn M, Lang T, Kammann U, Simat T, Jenke 

HS, Steinhart H (1999) Apoptosis in dab (Limanda liman- 

da) as possible new biomarker for anthropogenic stress. 


Popham JD, D'Auria M (1980) Arion ater (Mollusca: Pulmonata) 

as an indicator of terrestrial environmental pollution. Water 

Air Soil Poll. 14:115-124. 

Porcel D, Bueno JD, Almendros A (1996) Alterations in the 

digestive gland and shell of the snail Helix aspersa Muller 

(Gastropoda, Pulmonata) after prolonged starvation. 

Comp. Biochem. Physiol. A 115:11-17. 





Toxicol. 3:301-311. 

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988a) Zinc treatment 


distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 41:858-864. 

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988b) Zinc treatment 

of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Sublethal 

effects at the histological level. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 41:865-871. 

185


Runham NW, Hunter PJ (1970) Terrestrial Slugs. Hutchinson 

University Library, London 184 orr. 

Russell LK, DeHaven JI, Botts RP (1981) Toxic effects of cad- 

mium on the garden snail (Helix aspersa). Bull. Environ. 


Small GM, Burdett K, Connock MJ (1985) A sensitive spectro- 

photometric assay for peroxisomal Acyl-CoA oxidase. 

Biochem. J. 227:205-210. 






in “mussel-watch” programmes by automated image analy- 

sis of autometallographical black silver deposits (BSD) in 


150. 

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigómez I (1998) 

Autometallographical procedure for the localization of trace 

metals in molluscan tissue by lighht microscopy. J. 

Histotech. 21:123-127. 


186 





Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry of the 

digestive gland cells of Helix. Q. J. Microsc. Sci. 106:173- 

192. 

Swaileh KM, Ezzughayyar A (2000) Effects of dietary Cd and 

Cu on feecing and growth rates of the landsnail Helix 

engaddensis. Ecotox. Environ. Saf. 47:253-260. 

Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starva- 

tion on structure and function of the digestive gland of the 

mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 54:699- 

712. 

Wang WX, Rainbow PS (2005) Influence of metal exposure 

history on trace metal uptake and accumulation by marine 

invertebrates. Sci. China C. Life Sci. 48:110-117. 

Weibel ER (1979) Stereological Methods. Vol. 1. Academic 

Press. London 415 orr. 








Zubiaga AM (1986) Histofisiología dcel aparato reproductor de 

Arion subfuscus (Draparnaud, 1805) (Gastropoda, 

Stylomatophora). Doktoradutza-Tesia. UPV/EHU. 316 orr.

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa 

Zelula-moten ordezkapena bareen liseriguruinean 

eta bere eragina biomarkatzaileen 

gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko 

tokien artean lekuzaldatze-esperimentuak 

Laburpena: Zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell type replacement) estresatutako 

moluskuen liseri-guruineko epitelioan ematen den fenomeno orokorra da. Aldez aurretik laborategian 

egindako ikerlanek, CTRk biometatze-prozesu eta biomarkatzaileen neurketen gainean eragina duela 

erakutsi dute. Lan honen helburua CTR prozesua kutsadura metaliko pean kronikoki egondako bareetan 

itzulgarria ote den eta biometaketa-parametro eta esposizio- zein efektu- biomarkatzaileen gainean CTRk 

zer nolako eragina duen aztertzea da. Horretarako, Arion ater bareak, abandonatutako zink meatze batetik 

(Karrantza) eta kutsatugabeko toki batetik (Bakio) jaso ziren eta leku batetik bestera 3, 10 eta 28 egunez 

lekuzaldatu ziren. Metal-zama, absortzio atomikozko espektrofotometria (AAS) erabiliz kalkulatu zen. 

Lisosomen egitura-aldaketa, zelula-moten dentsitate bolumetrikoa, autometalografiko hauspeakinak eta 

metalotioneinen mailak esposizio- eta efektu-biomarkatzaile gisa neurtu ziren. Ikerlan honen emaitzek, 

metal-kutsadura kroniko pean egondako bareen liseri-guruinak, laborategian hainbat astez metalen pean 

jarritako bareen liseri-guruinen antzekoak direla erakutsi dute. Hala ere, kronikoki kutsatutako liseriguruinak, 

laborategian epe laburrean kutsatutakoen bareenak ez bezala, kutsadura-iturria etenez gero ez 

dira erantzunkorrak, edo behintzat, erantzuteko gaitasun murritzagoa dute. Bestalde, kutsatugabeko tokitik 

meatzera lekuzaldatutako bareek, 3 eguneko lekuzaldatze ostean jada laborategian metal pean jarritako 

bareek bezala erantzun zuten; beraz, lan honek, erabilitako prozedura analitikoak eta biomarkatzaileak 

lurzorutan noizbehinkako metal-esposizioak detektatzeko egokiak direla demostratu du. 

Gako-hitzak: lekuzaldatzea, zelula-moten ordezkapena, metalak, kutsadura kronikoa, liseri-guruina, 

bareak. 

187


Cell-type replacement in the digestive gland of slugs and its influence in 

biomarkers after transplantation between clean and metal-polluted sites 

Abstract: Cell-type raplacement (CTR) is a general phenomenon that takes place in the digestive gland 

epithelium of stressed molluscs. Previous laboratory studies have demontrated that CTR influences 

bioaccumulation processes and biomarker measurements. The aim of this work is to determine wether CTR 

is a reversible process is slugs exposed to chronic metal pollution and to investigate the influence of CTR 

in metal accumulation parametres and in effect and exposure biomarkers. For this purpouse slugs, Arion 

ater, were transplanted from an abandoned Zn mine (Karrantza) to a non-polluted site (Bakio) and the other 

way round for 3, 10 and 28 days. Metal burdens were measured by atomic absorption spectrophotomtry 

(AAS). Lysosomal structural changes, volume density of cell-types, autometallographical deposits and 

metallothionein levels were calculated as exposure and effect biomarkers. The results of this study, showed 

that the digestive gland of slugs chronically exposed to metal pollution is similar to the digestive gland of 

slugs exposed to metals for some weeks under laboratory conditions. However, chronically polluted 

digestive glands, are not responsible, or at least, are less responsible than short-term exposed ones when 

the pollution source disappears. On the other hand, slugs tranplanted from the reference site to the mine 

respond simmilarly to slugs exposed to metals in the laboratory after 3 days of transplantation, which 

indicates that the analitical procedure and biomarkers employed in this work are able to detect eventual 

metal exposures in soils. 

Key Words transplant, cell-type replacement, metals, chronic pollution, digestive gland, slugs. 

Sustitución de tipos celulares en la glándula digestiva de limacos y su 

influencia sobre biomarcadores después de un transplante entre un lugar 

limpio y uno con contaminación metálica 

Resumen El recambio de tipos celulares (CTR; del inglés, cell-type replacement) es un fenómeno 

general que se da en la glándula digestiva de moluscos en situaciones de estrés. Experimentos previos 

realizados en el laboratorio, demostraron que CTR influye sobre las medidas de los procesos de 

bioacumulación y biomarcadores. El objetivo del presente estudio es investigar si CTR es un proceso 

reversible en limacos crónicamente expuestos a contaminación metálica y determinar su influencia sobre 

los parámetros de acumulación y biomarcadores de exposición y efecto. Para ello, se recogieron limacos 

Arion ater en una mina de zinc abandonada (Karrantza) y en un lugar sin contaminar (Bakio) y se 

transplantaron de un lugar a otro durante 3, 10 y 28 días. La carga de metal se calculó mediante 

espectrofotometría de absorción atómica (AAS). Como biomarcadores de exposición y efecto se 

estudiaron los cambios estructurales de lisosomas, la densidad volumétrica de tipos celulares, los 

depósitos autometalográficos y los niveles de metalotioneinas. Los resultados demuestran que los limacos 

crónicamente expuestos a metales presentan una glándula digestiva similar a la de los limacos expuestos 

en el laboratorio durante semanas a metales. Sin embargo, al contrario de lo que ocurre en la glándula 

digestiva de limacos expuestos a metales por un corto período de tiempo, cuando termina la exposición la 

glándula digestiva de limacos crónicamente expuestos a metales no responden o presentan una capacidad 

de respuesta limitada. Por otro lado, en los limacos tranplantados del lugar sin contaminar a la mina 3 días 

son suficientes para observar respuestas similares a las obtenidas tras la exposición a metales en el 

laboratorio, indicando que el procedimiento analítico y los biomarcadores empleados en el presente trabajo 

son válidos para detectar exposiciones puntuales a metales en suelos. 

Palabras clave: transplante, sustitución de tipos celulares, metales, contaminación cronica, glándula 

digestiva, limacos. 

188

SARRERA 

Lehorreko gastropodoak metalen metatzaile 

eraginkorrak direnez eta kutsaduraren aurrean 

modu sentikor eta neurgarrian erantzuten dutenez, 

lurzoruen kutsaduraren begirale moduan erabiliak 

izan dira oso (Coughtrey & Martin, 1977; Popham 

& D'Auria, 1980; Marigómez et al., 1998a; Pihan & 

de Vaufleury, 2000; Viard et al., 2004; Snyman et 

al., 2005). Liseri-guruina, metaleen metatze-toki 

garrantzitsuena da bare eta barraskiloetan (Ireland, 

1979; 1984a; 1994; Beeby & Richmond, 1987; 

Berger & Dallinger, 1993; Marigómez et al., 1998a; 

2002), metalen prozesatze eta detoxifikazioan 

gako-funtzioak betetzen dituelarik (Kammenga et 

al., 2000). Metalak, iraizte-zelulen lipofuszina 

pikorretan (Marigómez et al., 1986a; 1996; 1998a; 

Recio et al., 1988a) eta maiztasun gutxiagoz kaltzio 

zeluletan (Schoettli & Seiler, 1977; Marigómez et 

al., 1986a) lokaliza daitezke, baina metatze- 

konpartimentu nagusia liseri-zelulen sistema endo- 

lisosomikoa dugu, non metalak metalotioneinei 

lotuta bahitzen baitira (Schoettli & Seiler, 1977; 

Ireland, 1981; 1982; 1984a; Dallinger & Wieser, 

1984; Marigómez et al., 1986a; 2002; Recio et al., 

1988a; Janssen & Dallinger, 1991;1995). 

Metal pean egoteak, iraizte-jardueraren 

emendioa sortarazi dezake liseri-zeluletan 

(Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; Recio et 

al., 1988a; 1988b), zeintzuetatik lisosoma eta 

hondakin-gorputzen barruan dauden proteinei 

lotutako metalak jariapen apokrino edo holokrino 

prozesuen bidez gorotzetara aska baitaitezke 

(Marigómez et al., 1986a; 1990a; Recio et al., 


1988a; Ireland & Marigómez, 1992). Iraizte- 

jarduera emendatu horren ondorioz, liseri- 

guruinaren epitelioaren zelula-osaketan aldaketa 

latzak sor daitezke kutsatzailepeko esposizio 

subletala pairatu ondoren (Rasmussen et al., 1983; 

Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989; 


1990b; 1996; 1998a; 1998b; Soto et al., 2002). 

Efektu horri zelula-moten ordezkapena (ingeleraz, 

Cell Type Replacement; CTR) deritzo, eta toxiko 

zein bestelako estres-iturri pean mantendutako 

molusku itsastarretan egindako lan aurrendarietan 

zelula basofilikoen dentsitate bolumetriko edo 

kopuru erlatiboaren igoera gisa neurtu da 

(Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984; 


1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996; 1998a; 

1998b). 

Liseri-guruineko epitelioaren zelula-moten 

ordezkapena, habitat eta kokapen taxonomiko 

desberdinetako molusku estresatuetan gertatzen 

den fenomeno orokorra dela dirudi. (Marigómez et 

al., 1998a). Kutsatzaile organokimiko edo 

metalikoen kontzentrazio subletal pean 

mantendutako muskuilu itsastarrek, batez ere 

zelula basofilikoz osatutako liseri-tepitelioa agertu 

dute (Rasmussen et al., 1983; Lowe & Clarke, 

1989; Cajaraville et al., 1990a; Soto & Marigómez, 

1997a; 1997b; Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). 

Modu berean, gastropodo itsastarrek zelula 

basofiliko hipertrofiatuz osatutako liseri-tubuluen 

epitelioa erakutsi dute, laborategian Cd zein 

hidrokarburo aromatikoen pean mantenduz gero 

(Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b). 

189


Lehorreko bareetan, liseri-guruinaren epitelioa 

desberdintzatutako hiru zelula-motez osaturik dago, 

esaterako: liseri-zelula (ugariena), iraizte-zelula eta 

kaltzio-zelula (zelula basofilikoa; Sumner, 1965). 

Gainerako molusku taldeetan bezala, metalez 

kutsatutako eskualdeetan bizi diren bare en liseri- 

guruinean ere, zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) 

kopuru erlatibo altuak eta hipertrofia aurkitu dira 

(Marigómez et al., 1998a), eta baita laborategian 

metalen pean mantendutakoetan ere (Marigómez 

et al., 1996; 4. Kapitulua). Halaber, metalezko 

kutsadura kronikoaren baldintzetan, iraizte-zelulen 

kopuru erlatiboa ere emenda daiteke (Marigómez et 

al., 1998a). 

190 

CTR, kutsatzaile peko esposizioari erantzunez 

zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) proliferazioaren 

ondorioa dela proposatu da (Thompson et al., 1974; 

Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984; 


1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996). Widdows et 

al.-ek (1984), aldaketa horrek liseriketa-prozesuan 

zein bioenergetikan berebiziko eragina izan 

dezakeen moldarazpen-erantzuna dela 

kontsideratu zuten. Izan ere, liseri-zelulen 

berriztapena, zelula ama moduan jokatuko luketen 

zelula basofilikoen zatiketaren bidez suertatuko 

litzatekeela orokorki onartuta zegoen (Yonge, 1926; 

Mix & Sparks, 1971; Thompson et al., 1974) eta, 

zentzu horretan, zelula basofilikoen proliferazioak, 

liseri-zelulen galerak ekarritako zelulen berriztapen 

areagotua bermatuko luke (Cajaraville et al., 

1990a). Haatik, oraintsuko ikerketek, muskuiluen 

liseri-guruinean liseri-zelulek zein zelula 

basofilikoek, ziklo zelularra norberak bere aldetik 

jarraitzen duela frogatu dute (Marigómez et al. 

1999; Zaldibar et al., 2004), eta beraz, liseri-zelulak 

zatitzeko gai direnez, beraiek ordezkatzeko zelula 

basofilikoek proliferatzea gertagaitza litzateke. Are 

gehiago, metal eta konposatu organikoen 

kutsadura peko baldintzetan epitelioaren masa- 

murrizpen netoa gertatzen da, liseri-zelulen 

galeraren ondorioz seguru asko, murrizpen horrek 

zelula basofilikoen kopuru erlatiboaren itxurazko 

gorakada ekarriz (Vega et al., 1989; Marigómez et 

al., 1990b; 1995; 1996; 1998b; Zaldibar et al., 

2002). Aitzitik, kutsadura peko baldintzetan zein 

ingurumen-kaltea eteterakoan liseri-zelulek 

proliferatzen dute, BrdU immunohistokimika bidez 

magurio eta bareen kasuan laborategiko 

esperimentuetan frogatu den moduan (Zaldibar et 

al., 2002, 4. eta 5. kapituluak). Beraz, zelula 

basofilikoen kopuru erlatiboaren emendioa, batez 

ere liseri-zelulen galeraren ondorioa dela onar 

genezake. Modu berean, iraizte- eta kaltzio-zelulen 

kopuru erlatibo altuak, abandonatutako Cu 

meatzean hainbat belaunaldiz (kutsadura kronikoa) 

bizi izan diren bareetan aurkitu ziren, liseri-zelulak 

pikor zitoplasmikoen iraizpenean oso aktiboak eta 

oso bakuolizatuak agertu zirelarik (Marigómez et 

al., 1998a). Egoera horrek liseri-zelulen etengabeko 

askatzeak azalduko luke. Ildo beretik, iraizte- 

zelulak, bizi-zikloaren azken urratsetan dauden 

liseri-zelulak izango liratekeela proposatu da, eta ez 

beste zelula-mota ezberdina (Porcel et al., 1996; 

Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Horrek, 

baraualdian eta kutsadurapean liseri- eta iraizte- 

zelulen proportzio erlatiboek jarraitzen dituzten 

jokabideak kontrajarriak izatea azalduko luke

(Porcel et al., 1996; Marigómez et al., 1998a; 

Dimitriadis & Konstantinidou, 2002; 5. Kapitulua). 

Are gehiago, zelula basofilikoen presentzia 

erlatiboaren gorakada, euren hiperplasia eta ez 

euren kopuruaren emendioaren ondorioa izango 

litzateke batik bat (Marigómez et al., 1990b; 1996; 

Chabicovsky et al., 2004; 4. Kapitulua). 

Liseri-zelula, ingurumen-kutsaduraren ebalua- 

ketarako itu-konpartimentua nagusietarikoa denez, 

kutsatzaileen pean egoteak bultzatutako liseri- 

zelulen galerak, biometaketa-parametro eta 

biomarkatzaileak neurtu direneko zelai- eta epe 

luzeko ikerketen emaitza polemikoak azalduko 

lituzke. Epe luzeko esposizio (kroniko) ostean, 

metalak ez dira liseri-epitelioan metatzen, epitelio 

horrek metatze-toki nagusia diren lisosomak 

dituzten liseri-zelula urriak baititu (Marigómez et al., 

1996; 1998a; Soto et al., 1998; 2002; Soto & 

Marigómez, 1997b). Aldez aurretik burututako 

ikerlanek, laborategian metal pean mantendutako 

muskuilu eta magurioetan neurtutako 

biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina 

duen finkatu dute (Soto & Marigómez, 1997b; Soto 

et al., 2002; 1. eta 4. Kapituluak), bareen inguruan 

dagoen informazioa, berriz, bakana da (Marigómez 

et al., 1996; 1998a; 5. Kapitulua). 

Metalen pean kronikoki egondako bareen liseri- 

guruinean CTR prozesu itzulgarria den finkatzea, 

alde batetik, eta CTRk metaleen biometaketa eta 

efektu- zein esposizio-biomarkatzaileen gainean 

nolako eragina duen ezagutzea, bestetik, ikerlan 

honen helburuak dira. Asmo horrekin, Karrantzako 

Zn-meatze abandonatu baten inguruko bareak 

(Arion ater) hartu eta Bakioko toki kutsatu gabe 


batera lekuzaldatu ziren 3, 10 eta 28 egunez, eta 

vice versa, Bakiotik Karrantzara. Gorputzeko 

metal-zamak absortzio atomikozko 

espektrofotometria (AAS) bitartez neurtu ziren. 

Bareen liseri-guruinaren epitelioa osatzen duten 3 

zelula-moten dentsitate bolumetrikoa estereologia 

erabiliz kalkulatu zen (Vv DIG , Vv EXC , Vv CAL ) 

hematoxilina-eosinaz tindatutako parafinazko 

ebakien gainean. Autometalografiaz (AMG) 

errebelatutako zilarrezko hauspeakin beltzen 

dentsitate bolumetrikoa (Vv BSD ) eta 

espektrofotometria bitartez neurtutako 

metalotioneinen (MT) maila esposizio- 

biomarkatzaile gisa erabili ziren. Efektu- 

biomarkatzaile gisa lisosomen handiagotzea 

aukeratu zen, kriostato-ebakien gainean, liseri- 

lisosomen bolumenezko, azalerazko eta 

zenbakizko dentsitateak (Vv LYS , Sv LYS eta 

Nv LYS ) eta azalera/bolumena ratioa (S/V LYS ) 

irudi-analisi bidez neurtuz gero estimatu zelarik. 







Diseinu esperimentala eta laginen prozesatzea 

50 Arion ater bare ar, Euskal Herriko 2 herri 

desberdinetan jaso ziren 2002.ko ekainaren 1ean 

(1. Ird.): (a) Karrantzako bailaran abandonatutako 

Zn-meatze zahar baten inguruan; eta (b) 

191


kutsatugabeko toki batean Bakion, meatzetik aski 

urruti dagoen landa-herria dena. Bareak toki batetik 

bestera 3, 10 eta 28 egunez lekuzaldatu ziren, eta 

baldintza naturaletan mantendu ziren lurzoruari 

atxikitako saredun kutxen bitartez. Horretaz gain, 

bai Bakion zein Karrantzan lurzorua eta bareak 

lagindu ziren, transplantea egin zeneko egun 

berean (0. eguna). Bareak (10 talde 

esperimentaleko), laginketa-egunetan sakrifikatu 

ziren, eta segidan azalduko den moduan prozesatu 

ziren. Liseri-guruinaren zati bat, Carnoy likidoan 

fixatu, parafinan inkluditu eta 7 µm-ko lodierako 

ebakietan moztu zen, azterketa histologikoak eta 

analisi histokimikoak egiteko. Bigarren zati bat, 

glutaraldehidoan fixatu eta EPON erretxinan 

inkluditu zen, ebaki semifinen behaketa egiteko. 

Hirugarren zati bat, nitrogeno likidotan izoztu zen. 8 

µm-ko lodierako ebakiak, kriostatoan moztu, eta 

ondoren ß-glukuronidasa entzimaren jardueraren 

demostrazio histokimikoa egiteko prozesatu ziren. 

Liseri-guruinaren beste zati bat nitrogeno likidotan 

izoztu zen, metalotioneinen neurketa 

192 

espektrofotometrikoa burutzeko. Azkenik, geratzen 

zen liseri-guruinaren zatia, metalen analisi kimikoak 

egiteko liseriketa azidoaren bitartez prozesatu zen. 

Prozedura bakoitzaren nondik norakoak, 

zehaztasun gehiagoz jarraian azalduko dira. 


1. Irudia: Erreferentzia tokia 

(Bakio) eta antzinako meatzetokiaren 

(Karrantza) 

kokapenaren irudi eskematikoa. 

Geziek bareen 

lekuzaldatzearen nondik 

norakoak islatzen dituzte 

kutxen barruan agertutako 

egun kopuruen zehar 

Liseri-guruinak ur distilatuan garbitu, eta labean 

120ºC-tara lehortu ziren 48 orduz, pisua egonkortu 

zen arte (Ireland, 1979). Lehortutako ehunak azido 

nitriko kontzentratuan liseritu ziren. Gerora, ur 

distilatuan disolbatutako azido nitrikotan (0.1 M) 

diluitu ondoren, laginak absortzio atomikozko 

espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley, 

Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu 

ziren, aldi bereko atzealdeko zuzenketaz eta 0.3 

mg/l-ko sentikortasunaz. Merck merkatal-etxeko 


Amerikako Estatu Batuak) disoluzio estandarrak 

(zertifikatutakoak) 0.1 M azido nitrikotan diluitu ziren 

kalibrazioa burutzeko. 7 metal analizatu ziren: 

kadmioa (Cd), kromoa (Cr), kuprea (Cu), burdina

(Fe), beruna (Pb), nikela (Ni) eta zinka (Zn). 

Lurzoruaren laginak modu berean prozesatu ziren. 

Metalotioneina-mailen determinazio 

espektrofotometrikoa 

MT-mailak sulfidrilo taldeen (-SH) determinazio 

espektrofotometrikoaren bitartez estimatu ziren 

(UNEP/RAMOGE, 1999). MTen kontzentrazioa, 

laginaren -SH edukina espertrofotometro bitartez 

kuantifikatu da, Ellman erreaktiboa (5,5 ditiobis 2 

azido nitrobenzoikoa; DTNB) erabiliz. Laburki, 

liseri-guruinaren zatiak 1 g ehun emateko taldekatu 

ziren, eta motoreak gidatutako teflonezko 

homogeneizagailuan ß-merkaptoetanola, 

fenilmetanosulfonilfluorido (PMSF) eta 

leupeptinadun indargetzaile homogeneizatzai- 

learen 3 bolumenetan homogeneizatu ziren. 

Homogeneizatuak 30000x g-tan 20 min 0-4ºC-tan 

zentrifugatu ziren. Gainjalkinean zeuden pisu 

molekular baxuko proteinak etanol absolutu 

hotzean (-20ºC), eta ondoz ondoko 6000x g-ko 

zentrifugazioaren bitartez prezipitatu ziren. MTtan 

joria zen pisu molekular baxuko frakzioa 0.25 M 

NaCl, 1 N HCl eta 4 nM EDTA zuen indargetzailean 

berresekitu zen. Erreferentziazko kurba 

estandarrak, 1 mg glutation/ml 0.25 M NaCl stock 

disoluzioa erabiliz sortu ziren. MTen ebaluazio 

espektrofotometrikoa 0.43 mM DTNB 0.2 M fosfato 

indargetzailean erreaktibo gisa erabiliz egin zen, 

absorbantzia 412 nm-tan neurtuz. 


Parafinazko ebakien talde bat 

autometalografiaz tindatu zen. Autometalografia 


metalak zilarrezko hauspeakin beltz gisa 

ikustarazteko argazkilaritzan oinarritutako teknika 

da (Danscher, 1984). Ebakiak (7 µm), xilenoz 

desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko 

etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean 

(40ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak 

ondoren, eta gela ilunean, argazki-emultsio geruza 

fin eta uniforme batez estali ziren (Ilford Nuclear 


Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean 

(30 minutu) eta Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur 

distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt, 

Alemania) errebelatzaile komertziala erabiliz 

errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren, 

errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa 

zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez eta, 

azkenik, erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa- 

Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu 

zen 10 minutuz. Laginak, Kaiser gelatina 

glizerinatuan muntatu ziren. 

BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan 

irudi-analisi bitartez 


azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto 

& Marigómez, 1997a; 1997b), emaitzak BSDen 

dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (Vv BSD ). Argi- 





eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak 



193




Neurketak bare bakoitzean 5 eremutan burutu 

ziren, eta talde esperimental bakoitzean 10 bare 

erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 50 

neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-ek (1981) 

proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da, 

BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino 

txikiagoa zela kontutan hartuz, Holmes efektua 

zuzentzeko faktorea kontuan hartu zen. 

Azterketa histologikoa eta analisi histologiko 

kuantitatiboak 

Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm) 

Hematoxilina-eosinaz tindatu ziren eta EPON 

erretxinan inkluditutako ebaki semifinak (3-4 µm) 

toluidina urdinez tindatu ziren, talde desberdinetako 

bareen liseri-guruineko epitelioaren eta bertoko 

zelula-moten deskribapen morfologikoa argi- 

mikroskopioaren bitartez egiteko. 

Liseri-zelulen, iraizte-zelulen eta kaltzio-zelulen 

dentsitate bolumetrikoa kalkulatzeko (Vv DIG , 

Vv EXC , Vv CAL ) prozedura estereologikoa aplikatu 

zen. Horretarako, lagin bakoitzean azarez 

aukeratutako zelai batetan egin ziren kontaketak 

guztira talde esperimental bakoitzeko 10 kontaketa 

burutuz. Analisi estereologikoak burutzeko, Nikon 

Optiphot mikroskopioari atxikitako irudi-hodia 

erabili zen (amaierako handipena 670x). Zelulen 

Vv DIG , Vv EXC eta Vv CAL Delesse printzipioan 

oinarrituz (Weibel, 1979) kalkulatu zen. Lortutako 

datu horietan oinarrituta, zelula-mota bakoitzaren 

proportzio erlatiboa portzentaietan kalkulatu zen. 

194 

Lisosomen egitura-aldaketak 

Liseri-zelulen lisosomen ikustaraztea ß- 

glukuronidasa (ß-GUS) entzimaren jardueraren 

agerketa histokimikoa burutuz egin zen, Cajaraville 

et al.-en (1991) prozedura jarraituz. Ebakiak, egin 

berria zen ß-GUS inkubazio-medioan (28 mg 

naphtol AS-BI-ß-D-glucuronide 1.2 ml 50 mM sodio 

bikarbonatoan disolbatuta eta 100 ml-arte %2.5 

NaCl eta %15 polibinilo alkohola zuen azetato 

indargetzailean, pH 4.5) murgildu ziren 10 minutuz 

37ºC-tan, etengabe irabiatuz. Inkubazioaren 

ondoren, laginak %2.5 NaCl gatz-disoluzioan 

garbitu ziren 2 minutuz 37ºC-tan, etengabe 

irabiatuz. Laburki, ebakiak disoluzio ikustarazlean 

sartu ziren (0.1 g Fast Garnet GBC % 2.5 NaCl 

zuen 0.1 M fosfato indargetzaileko (pH 7.4) 100 ml- 

tan disolbatuak) 10 minutuz eta ilunpean. Ondoren, 

laginak %2.5 NaCl zuen Baker formol kaltzikoan 

fixatu ziren 10 minutuz 4ºC-tan, eta uretan labur 

garbitu ziren. Azkenik, laginak % 0.1 Fast Green 

disoluzio batean kontrastatu ziren bi minutuz, ur 

distilatuan hainbat aldiz garbitu, Kaiser gelatina 

glizerinatuan montatu eta azazkalen esmalteaz 

zigilatu ziren. 

Lisosomen egitura, automatizatutako irudi- 

analisi (Biological Measurement System software- 

BMS- Sevisan; Cajaraville et al., 1991) bitartez 

neurtu zen. Ebakiak, x100 handipeneko objektiboa 

erabiliz aztertu ziren Leitz argi-mikroskopioan. 5 

neurketa burutu ziren ebaki bakoitzean, hurrengo 

parametro estereologikoak kalkulatuz: lisosomen 

dentsitate bolumetrikoa (Vv LYS = V(L)/V(C)), 

dentsitate superfiziala (Sv LYS = S(L)/V(C)), 

azalera/bolumena ratioa (S/V LYS = S(L)/V(L)) eta

dentsitate numerikoa (Nv LYS = N(L)/V(L)); non V = 

bolumena, S = azalera, N = kopurua, L = lisosomak 

eta C = liseri-zelulen zitoplasma baitira. 

Estatistika 

Emaitzak estatistikoki aztertzeko SPSS/PC+ 


erabili zen. Vv LYS eta Nv LYS datuak logaritmikoki 

transformatu ziren azterketa estatistikoa egin 

aurretik, indibiduoen barne-bariantza 

batezbestekoaren menpekoa zelako. Aldagai 

esperimentalen esangarritasuna bide bateko 

bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu 

zen, eta parekatutako batezbestekoak Duncan 

testa erabiliz konparatu ziren. 

EMAITZAK 

Talde esperimental desberdinen metalen 

kontzentrazio totala (Cd + Cu + Cr + Fe + Ni + Pb + 

Zn), lurzoruan eta liseri-guruinean µM gisa neurtu 

zen, AAS bitartez. Metalen mailak, meatzeko 

lurzoruan kutsatugabeko tokikoan baino hiru aldiz 

handiagoak izan ziren (2. Ird.). Liseri-guruinean 

neurtutako metalen mailak emaitza horrekin bat 

etorri ziren, Karrantzako bareen liseri-guruinean 

Bakioko bareetan baino hiru aldiz metal gehiago 

zegoen (2. Ird.). Karrantzatik Bakiora 

lekuzaldatutako bareen liseri-guruinean, ordea, 

neurtutako metal kontzentrazioak Zn-meatzean 

neurtutakoak baino altuagoak izan ziren, gainera 

metal kontzentrazio hauek erreferentzi-tokian 

denbora gehiago egon heinean igoz joan zirelarik 

(2B Ird.). 


Oro har, lurzoruan neurtutako metal 

desberdinen kontzentrazioa, Karrantzan Bakion 

baino altuagoa izan zen, Cu eta Fe salbu (1. Taula). 

Haatik, desberdintasun esangarrienak, Zn eta Pb 

kontzentrazioetan aurkitu ziren, metal horiek metal 

kontzentrazio osoaren partaide nagusiak izanik. 

Karrantzako bareen liseri-guruinean, Pb eta Zn 

kontzentrazioak Bakiokoak baino hamar eta bost 

aldiz handiagoak izan ziren, hurrenez hurren (1. 

Taula). Bakiotik Karrantzara 3 egunez 

lekuzaldatutako bareetan, Karrantzako zelaiko 

bareen liseri-guruinean neurtutakoen Pb eta Zn 

2. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren 

inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruineko 

lurzoruetako metaleen kontzentrazioa (µM 

metaletan). (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera 

lekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira 

lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio 

estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko 



1. Taula: Erreferentzizko tokian (Bakio) eta antzinako meatzearen inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruineko 

eta lurzoruetako metalen kontzentrazioa (mg/kg). BBZ, Bakioko bareak; BB3, Bakioko bareak 3 egunez Bakion kutxetan 

sartuak; BB10, Bakioko bareak 10 egunez Bakion kutxetan sartuak; BB28, Bakioko bareak 28 egunez Bakion kutxetan sartuak; 

BUR, Bakioko bareak urrian hartuak; BL3, Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareak; LB3, Karrantzatik Bakiora 3 

egunez lekuzaldatutako bareak, LB10, Karrantzatik Bakiora 10 egunez lekuzaldatutako bareak; LB28, Karrantzatik Bakiora 28 

egunez lekuzaldatutako bareak; LLZ, Karrantzako bareak; LL3, Karrantzako bareak 3 egunez Karrantzan kutxetan sartuak; LUR, 

Karrantzako bareak urrian hartuak 

Lurra 

Bakio 

Lurra 

Mehatza 

kontzentrazioen balioetara heldu ziren (3A eta 3C 

Ird.). Karrantzatik Bakiora lekuzaldatutako bareek, 

neurtutako Pb eta Zn kontzentrazio-balioak iturriko 

bareetan neurtutako balioen antzekoak erakutsi 

zituzten (3B eta 3D Ird.). Are gehiago, Bakion 3 

egun igaro ondoren, Pb kontzentrazioak Karrantzan 

baino 3 aldiz altuagoak izan ziren (3B Ird.), eta 

196 

BBZ 

BB3 

Cu Pb Fe Cd Ni Cr Zn 

231.63 

(±38.93) 

26.18 

(±12.78) 

147.02 

(±87.3) 

166.08 

(±108.16) 

44.12 

(±6.47) 

321.75 

(±142.18) 

26.13 

(±25.61) 

29.44 

(±15.13) 

1265.43 

(±263.21) 

616.09 

(±189.72) 

599.19 

(±726.92) 

494.83 

(±260.83) 

6.59 

(±2.96) 

14.26 

(±6.42) 

5.6 

(±1.68) 

14.03 

(±11.56) 

2.58 

(±3.58) 

1.47 

(±1.13) 

5.99 

(±9.28) 

2.23 

(±4.2) 

Bakion 28 egun igaro ondoren, Zn kontzentrazioa 

Karrantzako bareetan neurtutako baino altuagoa 

izan zen (3D Ird.). 

9.66 

(±3.76) 

15.728 

(±7.76) 

9.37 

(±10.06) 

9.47 

(±11.87) 

352.70 

(±320.60) 

6981.99 

(±2375.41) 

929.64 

(±1050.32) 

498.41 

(±323.52) 

BB10* 360 23.84 882.12 9.1 1.59 9.54 596 

BB28* 290 51.78 1187.82 16.19 0 12.18 1584 

BUR 

BL3 

LB3 

LB10 

LB28 

LLZ 

LL3 

LUR 

213.77 

(±208.89) 

290.48 

(±191.7) 

81.60 

(±51.01) 

113.42 

(±79.44) 

138.75 

(±59.27) 

61.97 

(±36.42) 

14.77 

(±9.13) 

16.84 

(±5.87) 

* Ez dago erreplikarik 

16.19 

(±6.81) 

317.63 

(±317.58) 

517.62 

(±360.46) 

305.23 

(±214.53) 

285.14 

(±72.95) 

291.53 

(±301.29) 

109.99 

(±250.82) 

81.09 

(±78.03) 

495.78 

(±656.99) 

461.06 

(±230.72) 

454.79 

(±285.46) 

1662.38 

(±2220.98) 

878.46 

(±846.29) 

224.57 

(±211.81) 

251.53 

(±182.77) 

46.44 

(±38.92) 

3.53 

(±2.53) 

48.39 

(±41.93) 

11.33 

(±4.2) 

25.78 

(±16.6) 

18.65 

(±10.94) 

15.47 

(±9.73) 

24.17 

(±16.94) 

9.44 

(±8.92) 

3.39 

(±4.03) 

2.82 

(±6.69) 

5.84 

(±8.29) 

4.82 

(±7.07) 

2.51 

(±4.34) 

2.98 

(±3.23) 

1.45 

(±2.15) 

1.27 

(±1.53) 

3.72 

(±4.58) 

11.64 

(±15.66) 

5.12 

(±7.37) 

4.01 

(±7.65) 

635.04 

(±464.65) 

3348.23 

(±3090.55) 

6723.45 

(±3662.18) 

5653.01 

(±4357.54) 

5.82 (±9.3) 10157.3 

(±5875.64) 

2.28 

(±3.46) 

3.98 

(±2.72) 

4.84 

(±3.67) 

4480.9 

(±2914.12) 

2133.44 

(±761.97) 

2280.43 

(±578.12) 

Autometalografiak, metalen presentzia 

zilarrezko hauspeakin beltz (BSD) moduan erakutsi 

zuen, liseri-zelulen lisosometan, iraizte-zelulen 

lipofuszina-pikorretan eta, maila baxuagoan,

kaltzio-zelulen kaltzio-esferuletan (4. Ird.). 

Behaketa mikroskopikoa burutu ondoren, BSD, 

Karrantzako bareetan kutsatu gabeko tokian baino 

ugariagoak zirela argi agertu zen (4A eta 4B Ird.). 

Bakioko bareetan, BSD, liseri-epitelioko xafla 

basalean (zentzu histologikoan) eta liseri-zelulen 

erpinaldeko lisosoma (pikor berdeak) gutxi batzutan 

behatu ziren (4A Ird.). Kutsatutako tokiko bareetan, 

eta kutsatu gabeko tokira 3 egunez 

lekuzaldatutakoetan BSD xafla basalean urriagoak 

izan ziren arren, sistema endo-lisosomikoaren 

bolumen gehiena betetzen agertu ziren (pikor berde 


eta horiak), eta iraizte-zelulen lipofuszinetan ere 

konspikuoak gertatu ziren (4B eta 4D Ird.). 

BSDen hedapen-balioak, irudi-analisi bitartez 

Vv BSD gisa kuantifikatuak, Karrantzako bareetan 

Bakioko bareetan baino 10 aldiz handiagoak izan 

ziren. Bakiotik Karrantzara 3 egunez 

lekuzaldatutako bareetan tarteko balioak 

kuantifikatu ziren (5A Ird.). Kutsatutako tokitik 

kutsatugabekora lekuzaldatutako bareen liseri- 

guruinean, Vv BSD balioa ez zen jaitsi. Aitzitik, 3 eta 

10 egunez lekuzaldatu ondoren balio handiagoak 

suertatu ziren (5B Ird.). 

3. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruineko 

ehunetako eta lurzoruetako Pb (A eta B) eta Zn (C eta D) kontzentrazioak (µg/g ehun-pisu lehor).( A) eta (C) Kutsatu gabeko tokitik 

meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) eta (D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek 

desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p


Bi tokietan determinazio espektrofotometrikoz 

kuantifikatutako metalotioneinen (MT) 

kontzentrazioa ez zen esangarriki desberdina izan 

(6A Ird.). Era berean, Bakiotik Karrantzara 

lekuzaldatutako bareetan MT kontzentrazioa ez zen 

esangarriki aldatu. Bestalde, kutsatu gabeko tokian 

198 

3 egunez mantendutako bareetan MT 

kontzentrazioa esangarriki jaitsi zen (6B Ird.). 

ß-glukuronidasaren histokimika burutu ondoren, 

liseri-zelulen lisosomak arre-purpura koloreko 

hauspeakin modura behatu ziren (4E eta F Ird.). 

Karrantzako bareetan (4F Ird.), lisosomak 

4. Irudia: Arion ater barearen liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa (A-D) eta ß-glukuronidasa entzimajardueraren 

detekzio histokimikoa (E-F). (A) Kutsatu gabeko tokian hartutako barea; (B) Zn-meatzetik hartutako barea; (C) Kutsatu 

gabeko tokitik meatzera 10 egunez lekuzaldatutako barea; (D) Zn-meatzetik kutsatu gabeko tokira 3 egunez lekuzaldatutako barea. 

Geziek liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelulen barruan dauden metalak adierazten dituzte. Gezi-buruek liseri-azinoetako 

xafla-basalean metatutako metalak adierazten dituzte. Eskala-marra: 50 µm. (E) Kutsatu gabeko bareen liseri-guruinean 

topatutako ß-glukuronidasa entzimaren jarduera; (F) Zn-meatzeko bareen ß-glukuronidasa entzimaren jarduera. Geziek ßglukuronidasa 

jarduera adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm.

nabarmenki handiagoak izan ziren Bakiokoetan 

baino (4E Ird.). Estereologia bidez egindako analisi 

kuantitatiboek emaitza hauek baieztatu zituzten: 

Vv LYS eta Sv LYS altuagoak eta S/V LYS 

baxuagoak neurtu ziren Karrantzako laginetan 

Bakioko laginetan baino (7. Ird.). Bakiotik 

Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareetan, 

Vv LYS eta Sv LYS parametroak aldatu ez ziren 

arren, lisosomen tamainaren handiagotzea 

(S/V LYS baxua) kopuruaren txikipen 

esangarriarekin batera (Nv LYS baxua) gertatu zen. 

Kontrako lekuzaldatzea egiterakoan, lisosomek ez 

zuten inolako erantzunik eman 28 egunez (7B Ird.). 

Karrantzako liseri-guruineko azinoek, 

Bakiokoek baino epitelio meheagoa erakutsi zuten; 

gainera, argia handiagoa eta azinoen kalibrea ere 

txikiagoa izan ziren (8. Irudia). Are gehiago, 

loditutako xafla basala eta odol hodiak eratzen 

duten Leydig zelula puztuak aurkitu ziren (8. Ird.). 

Liseri-zelulak, kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak 

errez identifikatu ziren bi tokietako bareen liseri- 

guruineko epitelioan; hala ere, zelula-mota 

bakoitzaren maiztasun erlatiboa desberdina izan 

zen bi tokietan (8. eta 9. Ird.). Eskuarki, kaltzio- 

zelulen proportzio erlatiboa konstante mantendu 

zen lagin desberdinetan, liseri-zelula eta iraizte- 

zelulena esangarriki aldatu ziren bitartean. Iraizte- 

zelulak, toki kutsatuan kutsatu gabeko tokian baino 

bost aldiz ugariagoak izan ziren (%60 vs %12), eta 

liseri-zelulak, ordea, askoz urriagoak (%30 vs %80; 

9. Ird) Gainera, kutsatu gabeko tokitik toki 

kutsatura 3 egunez lekuzaldatutako bareetan 

zelula-mota desberdinen proportzioek tarteko 

balioak erakutsi zituzten; hau da, batez ere iraizte- 


zelulen emendioa gertatu zen (9A Ird.). Toki 

kutsatutik kutsatugabekora lekuzaldatutako bareen 

liseri-guruinean pareko erantzuna behatu zen, non 

kaltzio-zelulen proportzioan aldaketarik behatu ez 

zen bitartean iraizte-zelulen gutxiagotze graduala 

aurkitu baitzen (9B Ird.). Aldaketa horiek parametro 

adierazgarrietan islatzeko asmoz, Vv DIG eta 

Vv EXC /Vv DIG ratioa hautatu egin dugu (10. Ird.). 

Bakion, Vv DIG Karrantzan baino bi aldiz altuagoa 

hain zuzen, eta 3 egunez Bakiotik Karrantzara 


inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean 

neurtutako zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate 

bolumetrikoa. (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzera 

lekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokira 

lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazio 

estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko 




inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean 

neurtutako metalotioneinen (MT) kontzentrazioa. (A) 

Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) 

Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. 

Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. 

Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak 

adierazi dituzte p

sentikortasuna eta tolerantzia alda daitezke 

(Laskowski & Hopkin, 1996). Pb/Zn-z kutsatutako 

eta kutsatu gabeko tokien arteko lekuzaldatze- 

esperimentuetan oinarrituz, bareen metalekiko 

tolerantziaren berri aurretikoz argitaratu da. 


Tolerantzia hori, metalen metaketaren murrizpenaz 

fenotipikoki adierazten da; Cd moduko beste metal 

astunekiko tolerantzia, ordea, metatze-gaitasun 

areagotuaz karakterizatzen den bitartean (Greville 

& Morgan, 1991). Eskuarki, metal-kutsadura 

7. Irudia: Erreferentzia tokian 

(Bakio) eta antzinako meatzaren 

inguruan (Karrantza) hartutako 

Arion ater bare arren liseriguruinean 

neurtutako ßglukuronidasa 

jardueraren 

parametro estereologikoak. (A) 

Kutsatu gabeko tokitik meatzera 

lekuzaldatutako bareen dentsitate 

bolumetrikoa; (B) Meatzetik 

kutsatu gabeko tokira 


bolumetrikoa; (C) Kutsatu gabeko 

tokitik meatzera lekuzaldatutako 

bareen dentsitate superfiziala; (D) 

Meatzetik kutsatu gabeko tokira 

lekuzaldatutako bareen 

dentsitate superfiziala; (E) 



Azalera/Bolumena ratioa; (F) 



Azalera/Bolumena ratioa; (G) 

Kutsatu gabeko tokitik meatzera 


numerikoa; (H) Meatzetik kutsatu 

gabeko tokira lekuzaldatutako 

bareen dentsitate numerikoa. 

Segmentu bertikalek desbidazio 

estandarra adierazi dituzte. Goiko 

asteriskoek taldeen arteko 

desberdintasun esangarriak 

adierazi dituzte p


zelaian pairatzekotan, hautespen-presioak 

animalien gainean eragin esanguratsua izan 

dezake; kutsatzaileen harrera murrizteak eta iraizte 

edo eta metatze bidezko detoxifikazio-tasak 

areagotzeak, hautespenerako abantaila ekar 

lezaketelarik (Wang & Rainbow, 2005). Bare eta 

barraskiloek toki kutsatuetan bizirauteko duten 

ahalmena, metalak detoxifikatu edo gehiegizko 

esposizioa ekiditeko duten gaitasunean oinarritzen 

dela dirudi. Oro har, metalekiko erresistentzia, 

metal-ioiak (Cd, Cu, Zn) estuki bahitzen dituzten 

metalotioneinen ekoizpenarekin zein liseri- 

guruineko lisosometan eta pikor mineralizatuetan 

metal toxikoen bahiketarekin erlazionatuta dago 

(Hopkin et al., 1989; Dallinger, 1993; Marigómez et 

al., 2002; Dallinger et al., 2004). Hirigunetako 

202 

barraskilo eta meatzetako bareen kasuan 

proposatu denez, Pb- eta Zn-esposizio kronikoak 

hautespen naturalerantz darama, mekanismo 

genetiko edo eta anbientalen bitartez (Beeby & 

Richmond, 1987; Greville & Morgan, 1991). 

Fenotipo tolerante hautatuak, beste 

bereizgarrien artean, liseri-guruineko epitelioko 

zelula-moten banaketa eta presentzia erlatiboan 

islatutako desberdintasunez karakterizatuta daude 

(Marigómez et al., 1998a). Lehorreko 

gastropodoetan, metalen metaketa eta 

detoxifikaziorako toki nagusia liseri-guruina dugu, 

eta bere epitelioa 3 zelula-motez osaturik dago: 

liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelula 

(Sumner, 1965). Egoera normaletan, liseri-zelulak 

ugarienak dira, baina Cd-z kutsatutako tokietan bizi 

8. Irudia: Kutsatu gabeko tokiko (A eta C irudiak) eta Zn-meatzeko bareen (B eta D irudiak) irudi histologikoak, bai Hematoxilinaeosinaz 

(A eta B) zein toluidina urdinez (C eta D) tindatutako ebakietan. DC) liseri-zelula, EC) iraizte-zelula, eta CC) kaltzio-zelula 

adierazten dute. Eskala-marra: 50 µm (A eta B irudiak); 20 µm (C eta D irudiak).

diren bareetan kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak 

zelula-mota nagusiak bilaka daitezke (Marigómez 

et al., 1998a). Epe luzeko/kronikoak diren 

kutsatzaile-esposizioen ondorioz, zelula-moten 

osaketaren halako aldaketak, moluskuen erantzun 

orokortzat har daitezkeela dirudi (Rasmussen et al., 

1983; Widdows et al., 1984; Cajaraville et al., 

1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996; 

1998a), azken finean kutsatzaileen aurreko 

erantzuna zein erantzun horren zenbait parametro 

adierazle ere eragin ditzaketelarik (Marigómez et 

al., 1998b). 

Laborategiko baldintzetan metal-kutsadura 

pean jarritako lehorreko gastropodoen liseri- 


9. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta 

antzinako meatzaren inguruan 

(Karrantza) hartutako Arion ater bare 

arren liseri-guruinean neurtutako osaketa 

zelularra. (A) Kutsatu gabeko tokitik 

meatzera lekuzaldatutako bareak; (B) 


lekuzaldatutako bareak. 

guruinean, xafla basalak loditu, liseri-zelulak 

lehendabizi bakuolizatu eta ondoren gutxiagotu, 

kaltzio-zelulak hipertrofiatu, kaltzio- eta iraizte- 

zelulak erlatiboki ugaritu, epitelioa mehetu, eta 

odol-zelulak zein ehun konektiboko zelula 

migratzaileak liseri-azinoen inguruan metatu egiten 

dira (Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; 1998a; 

Recio et al., 1988a; 1988b; Ireland & Marigómez, 

1992). Metal-kutsadurarekiko moldarazpenaren 

“steady state” hori, metal toxikoen maila subletalen 

pean kronikoki egondako zelaiko bareen 

populazioetan ere gerta daiteke (Marigómez et al., 

1998a). Ikerlan honetan, Karrantzako bareetan 

(utzitako zink-meatzea) aldez aurretik 

203


deskribatutako liseri-guruinaren antolakuntz 

histologikoaren patroi berbera aurkitu dugu. 

Bakioko bareen liseri-azinoak liseri-zelula ugariz, 

erlatiboki urriagoak ziren iraizte-zelulez eta oso 

urriak ziren kaltzio-zelulez osaturik agertu 

zitzaizkigun. Karrantzan iraizte-zelulen dentsitate 

bolumetrikoa Bakion baino altuagoa izan zen, eta 

horretaz gain, liseri-zelulek pikor zitoplasmatikoen 

iraiztean biziki ziharduten, eta bakuolizazio 

nabarmena erakutsi zuten. Antzeko emaitzak 

laborategian Cu eta Hg pean jarritako bareetan ere 

204 

lortu ziren (Marigómez et al., 1986b; 1996), eta 

baita Cd pean eta baraurik mantendutako 

barraskiloetan ere (Porcel et al., 1996; Dimitriadis & 

Konstatinidou, 2002; Chabicovsky et al., 2004). 

Metal-esposizio zein baraualdi ostean deskribatu 

diren alterazioak antzerakoak izanik, CTR eta 

asoziaturiko aldaketa histologikoak, metalen 

ekintza toxiko zuzenaren ondorioa baino gehiago 

metal-esposizioak eragindako liseri-prozesuen 

narriaduraren ondorioa izan daitezkeela ezin da 

baztertu. Izatez, bare eta barraskiloak kutsatzaileen 

10. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseriguruinean 

neurtutako liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa eta iraizte-zelula/liseri-zelula ratioa. (A eta B) Kutsatu gabeko tokitik 

meatzera lekuzaldatutako bareak; (C eta D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek 

desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p

pean mantentzeak, elikatze-jarduera eta 

hazkuntzaren murrizpen esangarria eragin dezake 

(Russell et al., 1981; Marigómez et al., 1986c; 

Laskowski & Hopkin, 1996; 5. Kapitulua). Dena den, 

Pb eta Zn, Cu eta Cd baino toxizitate txikiagokoak 

dira Helix aspersa barraskiloentzat, eta Cu eta Hg 

baino toxizitate txikiagokoak A. ater bareentzat, 

behintzat elikatze-jarduera, hazkuntza eta 

hilkortasunari dagokienez (Marigómez et al., 1986c; 

Laskowski & Hopkin, 1996). Izan ere, bareen 

kasuan, janariango 300 µg/kg goragoko Zn 

kontzentrazioek baino ez dute eragina liseri- 

guruinaren histologian eta glukogeno-gordekinetan 

(Recio et al., 1988b). Kurioski, utzitako Cu-meatze 

baten aldameneko bareek, Cu, Zn eta Cd 

kontzentrazio tisular altuekin batera, gorputz 

osoaren eta liseri-guruinaren pisu lehorraren %50- 

eko murrizpena erakutsi zuten, leku kutsatu gabeko 

erreferentzia-bareekin konparatu zirenean 

(Marigómez et al., 1998a). Azkenik, Cu- 

(Marigómez et al., 1998a) eta Zn-meatze (ikerlan 

hau) abandonatuetako bareek, liseri-zelulen 

presentzia erlatiboaren murrizpenaren ezaugarri 

amankomuna duten arren, metal-esposizio 

kronikoaren bi egoera horietan zelula-moten 

osaketa ez da berbera. Cu-meatzeko bareetan, 

kaltzio-zelulek liseri-zelulak ordezkatzen dituzte 

(Marigómez et al., 1998a); eta Zn-meatzekoetan, 

berriz, iraizte-zelulek burutzen dute ordezkapena 

(ikerlan hau). Cu eta Zn, beranduago eztabaidatuko 

den moduan, bareen liseri-guruineko konpartimentu 

zelular desberdinetan lokalizatzen direnez, metal- 

kutsadura kronikoaren iturri desberdinen pean 

egondako bareen zelula-mota osaketaren 


dibergentzia, hori bi detoxifikazio-mekanismo 

desberdinen existentziaren ondorioa izan liteke. 

Dena dela, liseri-zelulen galera erantzun orokorra 

dela dirudi (Porcel et al., 1996; 1., 4. eta 5. 

Kapituluak), eta beraz CTRren parametro adierazle 

orokor gisa, gaur egun erabilitako Vv BAS -en ordez, 

Vv DIG erabiltzea gomendatuko genuke (4. 

Kapitulua) edo Vv EXC /Vv DIG ratioa (5. Kapitulua). 

Kutsatu gabeko tokiko (Bakio) bareen iraizte- 

zeluletako lipofuszinetan eta liseri-zeluletako 

hondakin-gorputz gutxi batzuetan AMGren bidez 

ikustarazitako metalen mailak ertain eta baxuak 

bitartean suertatu ziren. Halaber, odol-hodiaren 

inguruko ehun konektiboko geruzan BSD 

konspikuoak behatu ziren. Egoera hori 

erreferentziazko oinarri-balioak dira, eta aldez 

aurretik egindako zelai-ikerketa eta laborategiko 

esperimentuetan lortutako emaitzekin bat dator 

(Marigómez et al., 1996; 1998a). Bestalde, 

Karrantzako bareetan iraizte-zelulen lipofuszina- 

pikorrek zein liseri-zelulen lisosoma eta hondakin- 

gorputzek, eta baita kaltzio-zelulek ere, oso AMG- 

markaketa intentsoa erakutsi zuten. AMGk 

eskainitako datuen arabera, bareetan Pb 

lehendabizi liseri-zelulen lisosometan metatzen da 

(argitaratu gabe), beste metalen kasuan, Hg eta Cd 

alegia, gertatu bezala (Marigómez et al., 1996; 

1998a; 5. Kapitulua). Haatik, Zn liseri-, iraizte- eta 

kaltzio-zeluletan lokalizatu da (Schoettli & Seiler 

1977; Recio et al. 1988a; Almendros & Porcel, 

1992; Triebskorn & Köhler, 1996), esperimentu 

honetan egindako AMG bidezko behaketekin bat 

datorrena. Lotugai-multzoak zelulaz-zelula 

desberdinak dira, eta beraz metal ezberdinak 

205


zelula-mota ezberdinetan bahitzen dira (Marigómez 

et al., 2002). Are gehiago, oxigeno zein sufre 

emailekiko elkarkidetasuna duen mugaldeko 

metala den Zn-aren metatze-tokiak, espezieen 

arabera ere desberdinak izan daitezke (Marigómez 

et al., 2002). Esaterako, muskuilu eta magurioetan, 

non zelula basofilikoen fosfato-pikorrak bare eta 

barraskiloetan bezain garatuak ez baitaude, Zn-a 

nagusiki liseri-zelulen lisosometan lokalizatu da 

(Soto et al., 1998; 1. Kapitulua). Azkenik, liseri- 

azinoen lumenean askatutako pikor zitoplasmatiko 

eta lipofuszinetan BSD behatu izanak, liseri- 

guruineko zelulak metatzaile baino gehiago 

konpartimentu iraizleak direla sustatuko luke 

(Marigómez et al., 1990a; 1996; Soto et al. 1996; 

Soto & Marigómez, 1997a; 1997b). Gorotzekin 

batera metalak kanporatzeak berebiziko garrantzia 

du lehorreko gastropodoetan, zeintzuei lehorrean 

bizitzeko moldarazpenak deshidratazio-arriskua 

baitakarkie, iraizte-fluidoen kanporatzea ahalik eta 

murritzen mantentzera behartuta egonik (Riddle, 

1981). 

Vv BSD balioak Karrantzan 10 aldiz altuagoak 

dira Bakion baino, AAS bitartez lortutako datuekin 

bat datorrena, eta CTRk Vv BSD gainean eraginik 

ez duela iradoki dezakeena. Aitzitik, bareen kasuan 

liseri-zeluletan modu selektiboan metatzen diren 

Hg eta Cd moduko metalen pean luzaroan 

egondakoan bareetan, BSDen presentzia espero 

baino baxuagoa da CTR dela eta (Marigómez et al., 

1996). Ikerlan honetan, non Zn-a liseri-guruinean 

metatutako metal nagusia baita (>10 aldiz Pb 

kontzentrazio tisularraren gainetik), ez dirudi CTRk 

206 

Vv BSD eragiten duenik, AMG bitartez Zn-a zelula- 

mota guztietan lokalizatu baita. 

Metalotioneinak (MT) zeluletan metal-ioi askeen 

maila baxuak mantentzeaz arduratzen dira, eta 

beraien ekoizpena metaleen presentziaren aurrean 

induzigarria da (Dallinger, 1995; Langston et al., 

1998). Metalotioneinak, Cu, Zn, Hg eta Cd ioiei 

modu espezifikoan lotzen zaizkie eta, beraz, 

eraenketa- (Cu eta Zn metaletarako) edo 

detoxifikazio-molekulatzat (Hg edo Cd-rako) jo dira, 

moluskuetan hainbatetan erakutsi den moduan 

(Ireland, 1981; Roesijadi, 1982; Dallinger et al., 

1989; Bebianno & Langston, 1989; Dallinger, 1993; 

Berger & Dallinger, 1993). Ikerlan honetan, 

meatzeko eta kutsatu gabeko tokiko bareen liseri- 

guruinean espertrofotometrikoki kuantifikatutako 

MT- kontzentrazioak ez dira esangarriki 

desberdinak. Zn- eta Pb-esposizio kronikoa, MTen 

indukzioari asoziatuta ez legokeela pentsa daiteke, 

metal hauek fosfato moduko bestelako lotugai 

zelularrei lotuta ere egon ahal diren arren. Honekin 

lotuta, aipatu beharra dago Zn askotan kaltzio- 

zelulen fosfato kaltzikoko pikorretan lokalizatu dela 

(Taylor et al., 1990). 

Karrantzako bareen liseri-zelulen lisosomak 

Bakioko bareenak baino handiagoak izan ziren, 

behaketa zuzenen bitartez zein estereologia 

aplikatuz frogatu den bezala. Ingurumen-estresaren 

neurketa orokorra den lisosomen handiagotzea 

(Cajaraville et al., 1995), efektu aski ezaguna da 

moluskuen liseri-guruinean (Viarengo et al., 1984; 

Marigómez et al., 2005). Zehazkiago, lindanoz 

kutsatutako tokietan, lisosomen handiagotzea 

lindano kutsadura gradientearekin erlazionatu da

(Müller, 1994). Nv LYS parametroan desberdintasun 

esangarriak egon barik, tamaina handiagoko 

lisosomek (S/V balio baxuak adierazi duenez), 

Karrantzako Vv LYS balioak Bakiokoak baino 5 aldiz 

handiagoak izatea eragin dute. Efektu hori, BSD 

balio altuekin estuki lotuta egon daiteke, eta 

kronikoki mantendutako detoxifikazio-jarduera 

areagotuaren isla izan daiteke. Kutsatzaileen peko 

egoerak jarduera katalitikoen areagotzea eragiten 

du moluskuen liseri-zeluletan, zeinek lisosomen 

forma eta funtzioen aldaketak azalduko bailituzke 

(Marigómez et al., 1986a; Moore & Viarengo, 1990). 

Lisosomen handiagotzea, induzitutako autofagia 

prozesuen nabaritasuna izan daitekeela iradoki da; 

azkenean, induzitutako autofagia horrek, kinadak 

behar adina irautekotan, zelulei kaltea eta heriotza 

sortarazi diezaiekeelarik (Allen & Moore, 2005). 

Testuinguru honetan, afera interesgarri bat 

plazaratu da. Halako lisosomen handiagotzeari, 

bizialdi osoan zehar eta baita, kronikoki kutsatutako 

lekuetako bareetan, belaunaldiz-belaunaldi ere 

eutsi dakioke. Beraz, kalte eta heriotza zelularraren 

azalpena tentuz aztertu beharko genuke. 

Azkenik, muskuiluetan gertatu ez bezala (1. 

Kapitulua), ez dirudi CTRk lisosomen gainean 

eragina duenik. Arrazoia nagusiki metodologikoa 

dela dirudi. Bibalbioetan liseri-zelulak eta zelula 

basofilikoak tartekatuta agertzen dira, eta irudi- 

analisian neurketak egiten direnean neurtutako 

eremuan zelula basofilikoen zatiak erortzea ez da 

batere arraroa. Horrela, zelula basofilikoen kopurua 

altuagoa den heinean, parametro lisosomikoak 

azpiestimatuak izan daitezke sistematikoki. 

Gastropodoetan, bestalde, kaltzio-zelulak urriagoak 


dira eta taldekaturik agertzen dira; beraz, neurketa- 

eremua soilik liseri-zeluletara mugatzea errazagoa 

da, baita Vv DIG balioa %50 baino baxuago denean 

ere. 

Metal-kutsadura berriaren aurreko erantzuna 

Laborategiko ikerlanetan metalen pean egon 

izanak eragindako aldaketa gehienak 

probokatzeko, 3 eguneko esposizio-denbora 

nahikoa izan zen zelaiko baldintzetan (Marigómez 

et al., 1996); ikerlan honetan erabilitako analisi 

kimikoak eta esposizio- zein efektu- 

biomarkatzaileak, noizbehinkako metal-kutsadura 

lurzoruan detektatzeko egokiak direla erakutsiz. 

Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatu 

ondoren, liseri-guruineko Pb eta Zn kontzentrazioak 

Karrantzako meatzeko bareetan neurtutako 

kontzentrazioen mailetara heldu ziren. Bakiotik 

Karrantzara lekuzaldatu ondoren, BSDetan 

behatutako aldaketak metal-kutsadura berriaren 

aurrean ere erantzunkorrak izan ziren. Vv BSD 

balioak, Karrantzan Bakion baino 10 aldiz altuagoak 

zirenak, toki kutsatura 3 egunez lekuzaldatutako 

bareetan 3 aldiz altuagoak suertatu ziren. Metalen 

metaketa moluskuen liseri-guruinean erantzun 

azkarra dena jakina da, egun batez Cd pean 

egondako muskuiluen Vv BSD balio emendatuek 

adierazi duten legez (1. Kapitulua). Aitzitik, Bakiotik 

Karrantzara lekuzaldatutako bareetan, liseri- 

guruinaren MT kontzentrazioa ez zuen aldaketarik 

pairatu, Zn-k eta Pb-k MTen sintesirik eragiten ez 

dutenaren seinaletzat har litekeena. 

Toki kutsatura 3 egunez transplantatu ondoren, 

liseri-zelulen proportzio erlatiboa esangarriki jaitsi 

207


zen, Karrantzako Vv DC balioetara hurbilduz. 

Emaitza horiek, aldez aurretiko laborategiko 

datuekin bat datoz, non 3 eta 21 egun bitartean 

CTR eragiten baita, espezie, kutsatzaile, dosi eta 

esposizio-modu eta ingurumen-baldintzen arabera 

(1., 4. eta 5. Kapituluak). Liseri-zelulen 

proportzioaren beherapena, epe labur eta ertainez 

Hg zein Cd + keroseno nahasketaren pean 

mantentzean ere behatu da bareen liseri-guruinean 

(Marigómez et al., 1996; 5. Kapitulua). 

Epe laburreko forma eta tamainaren aldaketa 

lisosomikoak, ustekabekoak izan litezke nolabait; 

zenbait egun eta zenbait astetako tartean 

kutsatzaile pean egonez gero, behin-behineko 

aldaketak gerta baitaitezke (Marigómez & Baybay- 

Villacorta, 2003). Oro har, kutsatzaile-esposizioak 

lisosomen handiagotzea eragiten du (Viarengo et 

al., 1984; Marigómez et al., 2005), baina esposizio- 

denbora jakinetan lisosomen txikiagotzea 

handiagotzearen aurretik joan daiteke (Marigómez 

& Baybay-Villacorta, 2003). Ikerlan honetan, 

Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako 

bareetan, Vv LYS eta Sv LYS ez ziren aldatu, 

handiagotzea (S/V LYS baxua) lisosomen 

kopuruaren jaitsiera esangarriarekin batera gertatu 

baitzen (Nv LYS baxua). Ondorioz, lisosomen 

handiagotzea suertatu zen, baina seguruenik 

detoxifikatzeko iraizte-jarduera areagotu 

izanagaitik, lisosomak gutxiagotu ere egin ziren. 

Zoritxarrez, hurrengo egunetako laginak istripuz 

galdu ziren, eta beraz lisosomen kopurua 

Karrantzako bareetan erregistratu ziren balioetara 

beranduago helduko ote zitekeen ezin izan dugu 

ikusi. 

208 

Kutsadura etetearen aurreko erantzuna 

kronikoki kutsatutako bareetan 

Toki kutsatutik kutsatu gabeko tokira 

lekuzaldatutako bareetan ustekabeko emaitzak 

eskuratu ziren. 

Hasteko, kutsatu gabeko tokira lekuzaldatu 

ondoren, liseri-guruineko metalen orotariko 

kontzentrazioa aldaketarik gabe mantendu zen edo 

are altuagoa bilakatu zen, meatzeko bareetan 

erregistratukoekin alderatuz. Adibidez, Bakion 3 

egunez egon eta gero, Pb kontzentrazioa 

Karrantzan baino 3 aldiz altuagoa izan zen, eta 

Bakion 28 egunez egon ostean Zn kontzentrazioa 

jatorrizko lurzoru kutsatuan baino altuagoa ere 

suertatu zen. Halaber, Vv BSD ez zen txikiagotu. 

Aitzitik, kutsatu gabeko tokira 3-10 egunez 

transplantatu ondoren, Vv BSD jatorrizko leku 

kutsatuan baino are altuagoa bilakatu zen. 

Bederen, MT kontzentrazioak esangarriki altuagoak 

agertu ziren leku kutsatutik kutsatu gabeko tokira 10 

egunez lekuzaldatu ondoren. Bitartean, 

Karrantzatik Bakiora transplantatutako bareen 

liseri-guruineko Cu kontzentrazioak gradualki gora 

egin zuen 28 egunetan zehar, erreferentziazko 

mailetara heldu arte. Demagun metal kutsatzaileek 

lotugai zelularrei lotzeko Cu-arekin lehiatzen baitute 

bare kutsatuetan baxua den liseri-guruineko Cu- 

zama, kutsadura eten eta 10 egunetara maila 

normaletara itzuli zela; nola ahal izan ziren 

mantendu Zn eta Pb mailak jatorrizko bare 

kutsatuetan bezain altu edo are altuagoak? Zn eta 

Pb-aren kanpo-iturri bat ez bazegoen, metal horiek 

liseri-guruinera beste ehunetatik heldu behar izan

zuten. Gastropodoetan, nefrozitoek, errogozitoek 

eta hemozitoek Zn eta Pb metatzen dutena jakina 

da (Soto et al., 1996). Hemozito eta errogozito 

bidezko metalen mobilizazioa liseri-guruinerantz, 

metal toxikoen kanporatze masiborako mekanismo 

gisa proposatu da (Marigómez et al., 2002). Izatez, 

liseri-guruinaren funtzio nagusia metalen metaketa 

izan ezik metalen iraizpena dela iradoki da 

(Marigómez et al., 2002). Hori dela eta, liseri- 

guruineko Zn- eta Pb-zama altuek, metalen 

mobilizazio areagotu izana islatuko lukete, 

gorotzekin batera kanporatuak izateko organo 

honetaranzko metalen mobilizazio intentsifikatua 

adieraziko luketena. Horrekin bat, Karrantzara 

lekuzaldatutako bareen liseri-dibertikuluetako 

lumenera askatutako hondakin zelularretan 

metalen presentzia nabarmena adierazi du AMGk. 

Metalen mobilizazio areagotuak ere, kutsadura eten 

osteko liseri-guruineko Cu kontzentrazioaren 

emendioa azal lezake. Emaitza interesgarria, liseri- 

guruineko Pb kontzentrazioaren piko maximoa (3. 

eguna) Zn-arenaren (28. eguna) aurretik joan izana 

dugu, Pb errezago detoxifikatuko balitz azaldu 

litekeena, hain zuzen. Izatez, Pb kontzentrazioa 

ehunetan Zn-arena baino askoz baxuagoa da, eta 

gainera, bion konpartimentu zelularrak eta lotugaiak 

desberdinak izan daitezke (Marigómez et al., 2002). 

Metal-kontzentrazioen igoera horiek behin- 

behinekoak diren ala kronikoki kutsatutako bareek, 

metal-kutsatzailerik gabe mantenduta ere, metalak 

liseri-guruinetik kanporatu ezin dituztenez behin 

betikoak diren finkatzeko, kutsadura eten ondoko 

epe esperimental luzeagoak ezinbestekoak dira. 


Bigarrenez, CTR, aldez aurretik eztabaidatu 

bezala, kronikoki kutsatutako bareetan mantentzen 

den erantzun azkarra izan arren, Vv DIG -ren igoera 

gradualak patroi korapilotsuagoa jarrai dezakeela 

dirudi. 10 egunez kutsatu gabeko tokira 

transplantatutako bareetan Vv DIG baxuagoa da 3 

eta 28 egunez transplantatutakoetan baino eta, are 

gehiago, ez da Zn-meatzeko bareen Vv DIG -ren 

esangarriki desberdina. Liseri-guruinaren zelula- 

moten osaketa normala berreskuratzea liseri- 

zelulen proliferazio gaitasunean oinarritzen bada, 

prozesu hau erritmikoa izango litzateke, eta 

ingurugiro aldagaien eta aldagai indibidualen 

menpean egongo litzateke, muskuiluen liseri- 

guruinean deskribatu den bezala (Zaldibar et al., 

2004; 3. Kapitulua). Lehorreko gastropodoetan, 

giltzurruneko histofisiologian ziklo semilunarrak 

deskribatu dira (Capellán et al., 1990), eta beraz 

liseri-guruinean antzeko aldamoldeen presentzia 

ezin da baztertu. Horrek, Zn-meatzetik kutsatu 

gabeko tokira lekuzaldatutako bareen liseri- 

guruinean behatutako Vv DIG -ren patroi 

korapilotsua azal lezake. Are gehiago, Karrantzatik 

Bakiora 28 egunez lekuzaldatutako bareetan ere, 

Vv DIG balioek Bakion neurtutakoen desberdinak 

izaten zerraiten. Laborategian metal pean 3-4 astez 

mantendutako eta, detoxifikatzeko asmoz, 1-2 

astez kutsatzailerik gabe mantendutako bare eta 

magurioetan, detoxifikazio-denbora hori nahikoa 

izan zen liseri-guruinak kontrolen antzeko zelula- 

moten osaketa berreskuratzeko (4. eta 5. 

Kapituluak). Kutsadura kronikoaren ostean, CTR 

guztiz itzulgarria denentz ikusteko, kutsadura eten 

209


osteko denbora esperimental luzeagoak 

ezinbestekoak dira. 

Azkenik, toki kutsatutik kutsatu gabeko tokira 28 

egunez lekuzaldatutako bareen liseri-zelulen 

lisosomek ez zuten inolako erantzunik eman. 

Haatik, Cd pean jarritako eta ondoren 14 egunez ur 

garbitan arazten utzitako magurioen lisosomak 

kontrol taldearen berdintsuak bilakatu ziren (4. 

Kapitulua). Metal-kutsadura kroniko pean egondako 

bareak, berriz, ez dirudi berreskuratzeko gai direnik, 

edo behintzat 28 egun ez dirudi nahiko direnik, eta 

lisosomek handiak izaten eta metal-iraizteak 

areagoturik egoten darraite. 

Ingurumen-biojarraipenerako garrantzizko 

gogoetak 

Aldez aurretik egindako ikerlanetan, animaliak 

metal kontzentrazio desberdinen pean asteetan 

zehar mantendu dira, baina ingurumen naturaletan 

animaliak bizialdi osoan zehar metalen eragin 

kroniko pean egon daitezke, euren erantzunak 

nolakoak diren aztertzea jite oso interesgarria izanik 

(Wang & Rainbow, 2005). Ikerlan honetan lortutako 

emaitzen arabera, bareen liseri-guruinean behatu 

diren ezaugarriak, metalen eragin pean aste 

batzuetan zehar behatutako erantzunetatik oso 

desberdinak ez dira izan. (Marigómez et al., 1986a; 

1986b; 1996). Aitzitik, kronikoki kutsatutako bareen 

liseri-guruinak ez du erantzun kutsadura eten 

denean, edo behintzat erantzuteko gaitasun 

murritzagoa adierazi du (5. Kapitulua). Hortaz, 

antzekotasunak soilik azaleko ezaugarriei 

legokieke, izan ere, erantzuteko gaitasuna eta 

plastizitatea nabarmenki afektaturik geratu dira, eta 

210 

horrek organismoaren fisiologian eta baita 

biomarkatzaileen eta bestelako kutsaduraren 

esposizioaren eta efektuen neurketetan ere eragina 

izan lezake. Aspaldidanik dakigunez, aldez 

aurretiko metal-esposizioek hurrengo esposizioen 

aurrean babes-mekanismoen areagotzea eragin 

dezakete (Wang & Rainbow, 2005); baina, 

berreskuratzeko gaitasun hori laborategiko 

esposizio-esperimentuetan erregistratutakoa baino 

mugatuagoa izatearen berri ez da oraingo lan 

honetararte azaldu. Hortaz, kronikoki kutsatutako 

populazioetan espero daitekeen suspertzea 

laborategiko esperimentuetan oinarrituz 

aurresateko, kontu handiz ibili beharra dago . 

Bigarren ondorio deigarria kutsadura 

kronikoaren inguruan biomarkatzaileen erabilerak 

sor ditzaketen ondorioen oker eta mugen ingurukoa 

da. Laborategiko esperimentuetan oinarrituz, Wu et 

al.-ek (2005) kutsadura eteten denean 

biomarkatzaile batzuk (entzimen indukzioa, 

lisosomen integritatea) zeharo itzulgarriak direla eta 

beste batzuk (kalte zelularra, patologiak), ordea, 

itzulezinak edo iraunkorrak direla ondorioztatu 

zuten. Autore horiek azpimarratu zutenez, nahiz eta 

biomarkatzaile gehienak itzulgarriak izan, 

itzulezinak direnak emaitza sasipositiboak eman 

ditzakete, baldin eta ingurumen-baldintzak 

nabarmenki ez hobetzekotan behintzat. Ikerlan 

honetan, laborategian zenbait astetako 

esposizioaren ondorioz itzulgarriak diren hainbat 

erantzun biologiko (erantzun lisosomikoak, 

adibidez), kutsadura kronikoaren ostean itzulgarriak 

ez direla, edo behintzat modu azkarrean itzulgarriak 

ez direla egiaztatu da. Kutsatzaileen aurreko

erantzun lisosomikoak ordu gutxiren buruan induzi 

daitezkeena badakigunez, ikerlan honetan Bakiotik 

Karrantzara lekuzaldatu ondoren erantzun 

lisosomikoak eta metaleen metaketa 

intralisosomikoa 3 egunetan gertatu izanak 

egiaztatu duen bezala, 28 egunez Karrantzatik 

Bakiora lekuzaldatzean inolako erantzunkortasunik 

aurkitu ez izana harrigarria suertatu zaigu. Izan ere, 

moldarazpen genetikoak metalen presentzian 

bizirauteko gai ziren indibiduoak hautatu izan balitu, 

susperketa ez zitekeen inoiz gertatuko. Hala ere, 

erantzunkaiztasun hori, susperraldia luza dezakeen 

plastizitatearen galeraren ondorioa ere izan 

daiteke. Galdera horri erantzuteko asmoz, 

susperraldi luzeagoko esperimentuak martxan 

jarriko dira kronikoki kutsatutako bareak erabiliz. 

Dena den, erantzuna zein den jakin ala ez, 

biomarkatzaileak interpretatzean daukagun arazoa 

ezin dugu gainetik kendu: biomarkatzaileak ez dira 

euren maila basaletara itzultzen edo, behintzat, oso 

astiro itzultzen dira. Susperraldia, biomarkatzaile, 

kutsatzaile eta espeziearen sentikortasunaren 

arabera aldakorra dela ere deskribatu da (Wu et al. 

2005). Hala ere, gure ekarpenaren arabera, 

susperraldia kutsadurak zenbat denboraz eragin 

duen araberakoa izan daiteke. Beraz, kontu handiz 

ibili beharra dago "Slug-Watch" moduko 

biojarraipen-programetan biomarkatzaileak 

kronikoki kutsatutako populazioetan aplikatzen 

direnean: (a) biomarkatzaileen erantzuna 

motelduta/aldatuta egon daiteke kutsadurarekiko 

moldarazpenaren ondorioz (Wu et al., 2005); eta (b) 

biomarkatzaileak kutsadura kronikoaren ondorioz 

ez dira lehengoratzen, edo behintzat, ingurumen- 


baldintzak hobatzekotan, kronikoki eta noizbehinka 

edo behin-behinekoz kutsatutako populazioetan 

susperraldia desberdina da (Wu et al., 2005; 5. 

Kapitulua). Biomarkatzaileen gaineko 

interpretazioak egiteko datu gehiago ezinbestekoak 

dira. Bareetan, beste datu osagarrien artean, liseri- 

guruinaren azterketa histopatologikoek bareak 

kutsadura kroniko pean egon direnentz argitzeko 

oso tresna baliagarria eskaini diezaigukete 

(Marigómez et al., 1998a). 

BIBLIOGRAFIA 

Allen JI, Moore MN (2005) Environmental prognostics: Is the 

current use of biomarkers appropiate for environmental risk 

evaluation?. Mar. Environ. Res. 58:227-232. 

Almendros A, Porcel D (1992) Phosphatase activity in the 

hepatopancreas of Helix aspersa. Comp. Biochem. 

Physiol. A 103:455-460. 

Bebianno MJ, Langston WJ (1989) Concentration of metals 

and metallothioneins in marine invertebrates using 

differential pulse polarography. Portugaliae Electrochimica 

Acta 7:511-524. 

Beeby A, Richmond L (1987) Adaptation by an urban population 

of the snail Helix aspersa to a diet contaminated with lead. 

Environ. Pollut. 46:73-82. 

Beeby A, Richmond L (2002) Evaluation of Helix aspersa as a 

sentinel for mapping metal pollution. Ecol. Int. 1:261-270. 

Berger B, Dallinger R (1989) Accumulation of cadmium and 

copper by the terrestrial snail Arianta arbustorum L.: 

kinetics and budgets. Oecologia 79:60-65. 

Berger B, Dallinger R (1993) Terrestrial snails as quantitative 

indicators of environmental metal pollution. Environ. 

Monitor. Assess. 25:65-84. 




Org. 9:221-228. 





24. 

211


Cajaraville MP, Marigómez JA, Angulo E (1991) Automated 

measurement of lysosomal structure alterations in oocytes 

of mussels exposed to petroleum hydrocarbons. Arch. 


Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E (1992) 

Comparative effects of the water accommodated fractions 

(WAF) of three oils on mussels. 2.- Quantitative alterations 

in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem. 

Physiol C 102:113-123. 

Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1993) Correlation 

between cellular and organismic responses to oil-induced 

environmental stress in mussels. Sci. Tot. Environ. Suppl. 

1:1353-1371. 

Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez I (1995) 

Lysosomes as cellular markers of environmental pollution: 

time- and dose-dependent responses of the digestive lyso- 

somal system of mussels after petroleum hydrocarbon 

exposure. Environ. Toxicol. Water Qual. 10:1-8. 

Capellán A, Angulo E, Mateo A (1990) Histochemistry of glyco- 

gen and uric acid in the kidney sac of Cernuella virgata (da 

Costa, 1778) (Mollusca, Pulmonata): monthly and daily 

variations. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 104:147-154. 




Chem. 23:648-655. 

Coughtrey PJ, Martin MH (1977) The uptake of lead, zinc, 

cadmium, and copper by the pulmonate mollusc, Helix 

aspersa Müller, and its relevance to the monitoring of 

heavy metal contamination of the environment. Oecologia 

27:65-74. 

Dallinger R, Wieser W (1984) Patterns of accumulation, 

distribution and liberation of zinc, copper, cadmium, and 

lead in different organs of the land snail Helix pomatia L. 

Comp. Biochem. Physiol. C 79:117-124. 

Dallinger R, Janssen HH, Bauer-Hilty A, Berber B (1989) 

Characterization of an inducible cadmium-binding protein 

from hepatopancreas of metal exposed slugs (Arionidae, 

Mollusca). Comp Biochem Physiol C 92:355-360. 

Dallinger R (1993) Strategies of metal detoxification in 

terrestrial invertebrates. 245-289 orr. Non: Dallinger R 

Rainbow PS (ed) Ecotoxicology of metals in invertebrates, 

Lewis Publ., Boca Raton, FL. 

Dallinger R. (1994) Invertebrate organisms as biological 

212 

indicators of heavy metal pollution. Appl. Biochem. 

Biotechnol. 48:27-31. 

Dallinger R (1995). Mechanisms of metal incorporation into 

cells. 135-154 orr. Non: Cajaraville MP (ed.) Cell biology in 

environmental toxicology, University of the Basque Country 

Press Serv, Bilbo, Basque Country. 

Dallinger R, Chabicovsky M, Berger B (2004) Isoform-specific 

quantification of metallothionein in the terrestrial gastropod 

Helix pomatia. I. Molecular, biochemical, and 

methodological background. Environ. Toxicol. Chem. 

23:890-901. 


light and electron microscopic visualization of metals in 

biological tissues (gold, silver, metal sulphides and metal 

selenides). Histochemistry 81:331-335. 

Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of excretory 

cells in the digestive gland of the land snail Helix lucorum. 


Greville RW, Morgan AJ (1991) A comparison of (Pb, Cd and Z) 

accumulation in terrestrial slugs maintained in microcosms: 

Evidence for metal tolerance. Environ. Poll. 74:115-127. 

Hopkin SP, Hames CAC, Dray A (1989) X-ray microanalytical 

mapping of the intracellular distribution of pollutant metals. 

Eur. J. Microsc. Anal. 11:19-23. 

Ireland MP, Wootton RJ (1975) Variation in the lead, zinc and 

calcium content of Dendrobaena rubida (Oligochaeta) in a 

base metal mining area. Environ. Pollut. 10:201-208. 

Ireland MP (1979) Distribution of essential and toxic metals in 

the terrestrial gastropod Arion ater. Environ. Pollut. 20:271- 

278. 

Ireland MP (1981) Uptake and distribution of cadmium in the 

terrestrial slug Arion ater (L). Comp. Biochem. Physiol. A 

73:855-858. 

Ireland MP (1982) Sites of water, zinc and calcium uptake and 

distribution of these metals after cadmium administration in 

Arion ater (Gastropoda: Pulmonata). Comp. Biochem. 

Physiol. A 73:217-221. 

Ireland MP (1984a) Seasonal changes in zinc, manganese, 

magnesium, copper and calcium contents in the digestive 

gland of the slugs Arion ater. Comp. Biochem. Physiol. A 

74:855-858. 

Ireland MP (1984b) Effect of chronic and acute lead treatment 

in the slug Arion ater on calcium and d-aminolaevulinic acid 

dehydratase activity. Comp. Biochem. Physiol. C 79:287- 

290. 

Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary 

calcium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and

histological changes in the digestive cells in the snail 

Achatina fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58:157-168. 

Ireland MP (1994) Interaction and effects of molybdenum 

compounds on growth and mineral content of Achatina 

fulica and Arion ater (Gastropoda: Pulmonata). Comp. 

Biochem. Physiol. C 107:441-446. 

Janssen HH, Dallinger R (1991) Diversification of cadmium- 

binding proteins due to different levels of contamination in 

Arion lusitanicus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20:132- 

137. 

Kammenga JE, Dallinger R, Donker MH, Kohler HR, Simonsen 

V, Triebskorn R, Weeks JM (2000) Biomarkers in terrestrial 

invertebrates for ecotoxicological soil risk assessment. 

Rev. Environ. Contam. Toxicol. 164:93-147. 

Langston WJ, Bebianno MJ, Burt GB (1998) Metal handling 

strategies in mollouscs. 219-293 orr. Non: Langston WJ & 

Bebbiano MJ (ed). Metal metabolism in aquatic 

environments. Chapman & Hall, London. 

Laskowski R, Hopkin SP (1996) Effect of Zn, Cu, Pb, and Cd on 

fitness in snails (Helix aspersa). Ecotoxicol. Environ. Saf. 

34:59-69. 


digestive cells in mussels: quantitative alterations in 

cellular and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1: 213- 

226. 




Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986a) Copper treatment of 

the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Bioassay 

conduction and histochemical analysis. Bull. Environ. 


Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986b) Copper treatment of 

the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. 

Morphometrics and histophysiology. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 36:608-615. 

Marigómez I, Angulo E, Saez V (1986c) Feeding and growth 

responses to copper, zinc, mercury and lead in the 

terrestrial gastropod Arion ater (Linné). J. Moll. Stud. 

52:68-78. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990a) Cellular 

cadmium distribution in the common winkle, Littorina 

littorea (L.) determined by X-ray microprobe analysis and 

histochemistry. Histochemistry 94:191-199. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990b) Histopathology 

of the digestive gland-gonad complex of the marine 


prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. 

Aquat. Org. 9: 229-238. 

Marigómez I, Soto M, Angulo E (1992) Seasonal variability in 

the quantitative structure of the digestive tubules of 

Littorina littorea. Aquat. Living. Resour. 2:299-305. 

Marigómez I, Soto M, Etxeberria M, Angulo E (1993) Effects of 

size, sex, reproduction, and trematode infestation on the 

quantitative structure of digestive tubules in stressed 

winkles. Zool. Jb. Anat. 123:319-336. 

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995) 

Computer assisted 3-d reconstruction techniques may 

provide new insides into the pattern of histological 

organization of the bivalvian digestive gland. 12th Int. 

Malacol. Congr. Vigo. 

Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP (1995) Morphofunctional 

patterns of cell and tissue systems involved in metal 

handling and metabolism. 89-134 orr. Non: Cajaraville MP 

(ed.) Cell biology in environmental toxicology, University of 

the Basque Country Press Serv, Bilbo, Basque Country. 

Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level 

biomarkers of biological effect of mercury on sentinel slugs, 


Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998a) Tissue- 

level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to 


Toxicol. 34:167-176. 


type replacement, a succesful strategy of molluscs to adapt 

to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol. 

18:431-435. 

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical loca- 

lisation of proliferating cells in mussel digestive gland tis- 

sue. Histochem. J. 31:781-788. 



molluscs. Micr. Res. Tech. 56:358-392. 

Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutant-specific and 

general lysosomal responses in digestive cells of mussels 

exposed to model organic chemicals. Aquat. Toxicol. 

64:235-257. 

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L, 

Cajaraville MP (2005) Cell and tissue biomarkers in mus- 

sel, anh histopathology in hake and anchovy from Bay of 

Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring Campaign 

2003). Mar. Poll. Bull. (prentsan). 

213



214 

the pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing 


Moore MN, Viarengo A (1990) Lysosomal membrane fragility 

and catabolism of cytosolic proteins: evidence for a direct 

relationship. Experientia 43:320-323. 

Müller S (1984) Lindanuntersuchungen im Aquatischen und 

Terrestrischen Bereich in Bilbao (nordostspanien). 

Lizentziatura-Tesia. Universität Karlsruhe. 93 orr. 

Pihan F, de Vaufleury A (2000) The snail as a target organism 

for the evaluation of industrial waste dump contamination 

and the efficiency of its remediation. Ecotoxicol. Environ. 

Saf. 46:137-147. 

Popham JD, D'Auria M (1980) Arion ater (Mollusca: Pulmonata) 

as an indicator of terrestrial environmental pollution. Water 

Air Soil Poll. 14:115-124. 

Porcel D, Bueno JD, Almendros A (1996) Alterations in the 

digestive gland and shell of the snail Helix aspersa Muller 

(Gastropoda, Pulmonata) after prolonged starvation. 

Comp. Biochem. Physiol. A 115:11-17. 





Toxicol. 3:301-311. 

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988a) Zinc treatment 


distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 41:858-864. 

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988b) Zinc treatment 

of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Sublethal 

effects at the histological level. Bull. Environ. Contam. 

Toxicol. 41:865-871. 

Riddle WA (1981) Cold-hardiness in several species of land 

snail. J. Ther. Biol.13:163-167. 

Roesijadi G (1982) Uptake and incorporation of mercury into 

mercury-binding proteins of gills of Mytilus edulis as a 

function of time. Mar. Biol. 66:151-157. 

Russell LK, DeHaven JI, Botts RP (1981) Toxic effects of 

cadmium on the garden snail (Helix aspersa). Bull. 


Schoettli G, Seiler HG (1977) Uptake and localization of 

radioactive zinc in the visceral complex of the land 

pulmonate Arion rufus. Experientia 26:1212-1213. 





Soto M (1995) Simultaneous quantification of bioavailable 

metals in mollusks by means of cellular and tissue 

analysis. Implications for monitoring metal pollution in 

water quality assessment. Doktoradutza-Tesia 330 orr. 

Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I (1990) A 

planimetric study of morphological variability in the 

digestive diverticula of Littorina littorea (Linnaeus) and 

Mytilus edulis Linnaeus. J. Moll. Stud. 56:339-344. 

Soto M, Kortabitarte M, Marigómez I (1995) Bioavailable heavy 

metals in estuarine waters as assessed by metal/shell- 

weight indices in sentinel mussels Mytilus galloprovincialis. 

Mar. Ecol. Prog. Ser. 125:127-136. 

Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Marigómez I (1996) 

Autometallographic localization of protein-bound copper 

and zink in the common winkle, Litttorina littorea: a light 

microscopical study. Histochem. J. 28:689-701. 

Soto M, Marigomez I (1997a) BSD extent, an index for metal 




Soto M, Marigomez I (1997b) BSD extent, an index for metal 



autometallography. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156:141-150. 

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigomez I (1998) 

Autometallographed metal content in digestive cells of 

winkles: a cost-effective screening tool for monitoring Cu 

and Zn pollution. Aquat. Toxicol. 40:123-140. 






Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry of the 

digestive gland cells of Helix. Q. J. Microsc. Sci. 106:173- 

192. 

Taylor MG, Graves GN, Simkiss K (1990) Biotransformation of 

intracellular minerals by zinc ions in vivo and in vitro. Eur. 

J. Biochem. 192:783-789. 


starvation on structure and function of the digestive gland 

of the mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 

54:699-712.

Triebskorn R, Köhler HR (1996) The impact of heavy metals on 

the grey garden slug, Deroceras reticulatum (Muller): Metal 

storage, cellular effects and semi-quantitative evaluation of 

metal toxicity. Environ. Poll. 93:323-343. 

UNEP/RAMOGE (1999) Manual on the biomarkers recommen- 

ded for the MED POL biomonitoring programme. Athens. 

UNEP. 

Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) Quantitative 

alterations in the structure of the digestive cell of Littorina 

littorea on exposure to cadmium. Mar. Biol. 103:547-553. 

Viard B, Pihan F, Promeyrat S, Pihan JC (2004) Integrated 

assessment of heavy metal (Pb, Zn, Cd) highway pollution: 

bioaccumulation in soil, Graminaceae and land snails. 

Chemosphere 55:1349-1359. 

Viarengo A, Pertica M, Mancinelli G, Orunesu M, Zanichi G, 

Moore MN, Pipe RK (1984) Posible role of lysosomes in 

the detoxication of copper in digestive gland cells of metal 

exposed mussels. Mar. Environ. Res. 14:469-470. 

Wang WX, Rainbow PS (2005) Influence of metal exposure 

history on trace metal uptake and accumulation by marine 

invertebrates. Sci. China C. Life Sci. 48: 110-117. 


Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press, 






Wu RSS, Siu WHL, Shin PKS (2005) Induction, adaptation and 

recovery of biological responses: Implications for 

environmental monitoring. Mar. Poll. Bull. 51:623-634. 


Trans. Roy. Soc. Edin. 54: 703-718. 

Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2002) Model slug to investi- 

gatethe role of calcium cells in adaptation in chronic metal- 

pollution. SETAC Europe 12th Meeting. Viena. 




215


216

1.- Kutsatzaile organiko, ez-organiko zein bien nahasketaren pean jartzen direnean, 

Mytilus galloprovincialis muskuiluan zelula-moten ordezkapena ematen da, zelula 

basofilikoak liseri-zelulak ordezkatzen dituztelarik; dena den, ordezkapen zelularra 

emateko beharrezkoa den kontzentrazio eraginkorra kutsatzaile bakoitzarentzat 

desberdina da. 

2.- Mytilus galloprovincialis muskuiluan kutsatzaileek eragindako zelula-moten 

ordezkapena, estres-iturria eteten denean itzulgarria da; hala ere, zelula-moten 

ordezkapenaren gainean, kutsatzaileak nahasketetan agertzearen eta muskuiluak aldez 

aurretik estres-egoeran egotearen gisako faktoreek erantzun-patroian eragina eduki 

dezakete. 

3.- Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruinaren ehunean kadmioa 

detektatzeko erabili den autometalografia bitartez errebelatutako zilarrezko hauspeakin 

beltzak, liseri-zelulen lisosomen barnean espezifikoki lokalizatu dira. Lokalizazio espezifiko 

hori dela eta, zelula-moten ordezkapenak zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate 

bolumetrikoaren balioen gainean eragina dauka, metala metatzeko konpartimentuaren 

txikitzearen ondorioz. 

4.- Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruineko liseri-zeluletan irudi mitotikoak 

behatu izanak eta BrdU immunohistokimikaren emaitzek, zelulen berriztapena liseri- 

guruineko zelula helduen zatiketa autologoaren bitartez gauzatzen dela egiaztatu dute. 

Urdaileko eta liseri-guruineko unitate albeolotubularretako epitelioek, zelulen berriztapen- 

tasa ertaina eta altua bitartekoa dute. Epitelio-zelulen berriztapen hori sinkronizatuta dago, 

24 ordutan 2 ziklo osoak bete dituen aldamolde zirkamareala jarraituz. 

Ondorioak eta tesia 

5.- Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruineko epitelioaren berriztapena, 

muskuiluaren itsasaldi-erregimen eta urteko sasoiaren arabera alda daiteke. Horrela, 

mareazpiko muskuiluetan egunero 2 ziklo ikusi diren bitartean, marearteko muskuiluetan 

beti uretatik kanpo ematen den zelula proliferazioaren piko bakarra ikusi da, epitelioaren 

berriztapen-dinamika desberdina izanik. Gainera liseri-guruineko zelulek, udazkenean eta 

neguan baino proliferazio-jarduera bortitzagoa udan erakutsi dute; areagotutako 

berriztapena, seguruenik, udan ematen den metabolismo-tasa altuarekin eralzionatuta 

egonik. Muskuilu gazte eta helduek, proliferazio-maila eta berriztapen-dinamikaren 

aldamolde beretsua agertu dute, urte-sasoi zein itsasaldi-erregimen desberdinetan. 

219


6.- Kadmio pean jarritako Littorina littorea magurioan behatutako zelula-moten 

ordezkapena, liseri-zelulen galerak eta aldibereko zelula basofilikoen hipertrofiak sortua 

da; prozesu hori, muskuiluetan gertatzen den moduan, estres-iturria etetean itzulgarria 

delarik. Liseri-zelulen proliferazioa, kadmio pean mantendutako magurioetan areagotua 

agertu da, eta tendentzia hori, arazte-aldiaren ondoren mantendu da. Gainera, liseri- 

zelulen galerak eta berreskurapenak, ikerlan honetan erabilitako maila zelular eta 

tisularreko biomarkatzaileen gainean eraginik ez duela dirudi; seguruenik, magurioen 

kasuan zelula basofilikoak taldekaturik agertzen direlako eta, beraz, mikroskopioa erabiliz 

neurketak egiteko errez bazter daitezkeelako. 

7.- Kutsatzaile organiko eta ez-organikoen nahasketa pean jarritako Arion ater bareen 

liseri-guruinean zelula-moten ordezkapena gertatu da. Dena den, zelula-moten osaketa 

berriak, ez du liseri-guruinaren metaketa-gaitasunean eta erabilitako maila zelular eta 

tisularreko biomarkatzaileen gainean eraginik izan. Hiru zelula-motez osatutako bareen 

liseri-guruinean, liseri-zelulen galera netoa suertatu beharrean, liseri-zelulak iraizte-zelula 

faserantz pasatzea areagotu egin da. 

8.- Metal-kutsadura kroniko pean hainbat belaunaldiz egondako Arion ater bareetan 

liseri-guruineko epitelioa zelula-moten osaketan aldatutak gertatu dira. Hala ere, liseri- 

zelulen galerak, erabilitako zelula- eta ehun-maileko biomarkatzaileen gainean ez du 

eraginik izan, zelula-mota guztiak aztertutako metaleen (Zn, Pb) metatzaileak baitira. 

Bestalde, kronikoki kutsatutako bareen populazioak kutsatu gabeko tokira 

lekuzaldatutakoan, biomarkatzaileen erantzuna motelduta/aldatuta ageri da, seguruenik 

kutsadurarekiko moldarazpenaren ondorioz. Gainera, biomarkatzaileak, kutsadura 

kronikoaren ostean ez dira lehengoratzen; edo behintzat, ingurumen-baldintzak 

hobatzekotan susperraldiaren iraupena, kronikoki eta noizbehinka kutsatutako 

populazioetan desberdina da. 

220

TESIA 

Moluskuen liseri-guruinaren berriztapena, epitelioa osatzen duten zelulen zatiketa 

autologoa dela medio burutzen da. Muskuiluetan, berriztapen horrek itsasaldiekin eta 

fotoperiodoarekin erlazionatutako zikloak jarraitzen ditu. Dena den, itsasaldi- 

erregimenaren eta urteko sasoiaren moduko ingurumen-faktoreek zikloen gainean eragina 

dute. Ingurumenean dauden kutsatzaileek ere, liseri-epitelioa osatzen duten zelulen 

proliferazio-jarduera areago dezakete, muskuilu, magurio zein bareetan, liseri-epitelioaren 

osaketa-zelularrean aldaketak sorreraziz, liseri-zelulen kopuru erlatiboaren jaitsiera barne. 

Aldaketa horiek, laborategiko egoeretan itzulgarriak diren arren, kronikoki metalen pean 

egondako bareetan itzulgarritasun hori motelduta ageri da. Liseri-guruineko epitelioan 

gerta daitezkeen zelula-moten osaketaren aldaketak, ingurumen-toxikologian erabilitako 

biojarraipen-programetako esposizio- eta efektu-biomarkatzaileak aplikatzerakoan 

kontuan hartu beharreko fenomenoa da, zenbait kasutan biomarkatzaile desberdinen 

gainean eragina dutelako. 


221

METODOLOGI-ERANSKINA

GERTAKUNTZA HISTOLOGIKOA 

1.- Disekzionatu berri diren laginak Carnoy fixatzailean fixatu ordu batez. 

Carnoy Fixatzailea (100 ml) 

Etanol absolutua 60 ml 

Kloroformoa 30 ml 

Azido azetiko glaziala 10 ml 

2.- Laginak deshidratatu eta parafinan inkluditu. 

%80 etanola 45 min 

%100 etanola 2 x 45 min 

Metilo bentzoatoa Gau osoa 

Bentzenoa 2 x 45 min 

Parafina 4 ordu 60ºC-tan 

HEMATOXILINA-EOSINA TINDAKETA 

7 µm-ko lodierako ebakiak hurrengo protokoloa jarraituz tindatu. 

Xilola 2 x 10 min 




H 2 O distilatua 5 min 

Harris Hematoxilina 4 min 


H 2 O distilatua 10 seg 

H 2 O distilatua 10 seg 

Alkohol azidoa 10 seg 


Litio karbonatoa 10 seg 

H 2 O distilatua min 1 


%80 etanola min 1 

Eosina min 1 




Ebakiak DPX (Fluka 44581) muntai-medioan montatu. 

Metodologi-eranskina 

225


Harris Hematoxilina 

Hematoxilina 5 g 

%100 etanola 37 ml 

Potasio aluminio oxidoa 75 g 

Oxido merkurikoa 2.5 g 

H 2 O distilatua 500 ml 

Osagaiak nahastu. Nahasketa, irakite punturaino berotu eta giro tenperaturaraino hozten 

denean 5 ml azido azetiko glaziala gehitu. 

226 

Eosina 

Disoluzio ama 

Eosina (horia) 10 g 


Disoluzioa pixkanaka berotu, eta ondoren hoztu denean 


Lan disoluzioa 

Disoluzio ama 100 ml 



Alkohol azidoa 

Azido klorhidrikoa 1N 5 ml 


Litio karbonatoa 

Litio karbonatozko disoluzio saturatua H 2 O distilatuan.

MASSON-GOLDNER TRIKROMIKOA TINDAKETA 







Groat Hematoxilina 4 min 

Dabilura 5 min 

Ponceau fuzsina azidoa 5 min 

%1 azido azetiko H 2 O disoluzioa 10 seg 

Laranja G molibdikoa 5 min 


Berde argia 5 min 






Ebakiak DPX muntai-medioan montatu. 

Groat Hematoxilina (100 ml) 

Hematoxilina 0.5 g 


Azido sulfurikoa 0.8 ml 

Alunbre ferrikoa 1 g 


Ponceau fuszina azidoa (300 ml) 

Fuszina basikoa 1 g 

Ponceau 0.2 g 

Azido azetikoa 0.6 ml 


Laranja G molibdikoa (100 ml) 

Laranja G 2 g 

Azido fosfomolibdikoa 4 g 


Berde argia (100 ml) 

Berde argia 1 g 

Azido azetikoa 2 ml 



227


montatu. 

228 

AUTOMETALOGRAFIA 

A) PARAFINAZKO EBAKIAK 







Lehorketa Gau osoa 37ºC-tan 

Emultsioa 30 min 

Errebelatzailea 15 min 

Gelsitze-soluzioa 1 min 

Fixatzailea 10 min 

Ebakiak Kaiser gelatina glizerinatua (Merck 1.09242.0100) muntai-medioan 

Errebelatzailea (100 ml) 

Errebelatzailea (Tetenal ultrafilm B/W developer) 20 ml 


Gelditze-soluzioa (100 ml) 



Fixatzailea (100 ml) 

Fixatzailea (Agefix B&W fixer) 10 ml 


B) ERRETXINAZKO EBAKIAK 

B-1) EBAKI SEMIFINAK 

3-4 µm-tako lodierako ebakiak hurrengo protokoloa jarraituz tindatu ziren. 

Emultsioa 30 min 

Errebelatzailea 30-45 min 

Gelditze-soluzioa 1 min 

Fixatzailea 10 min 

Ebakiak Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu. 

Errebelatzailea (100 ml) 

Errebelatzailea (KODAK D-19) 15 g 

H 2 O distilatua 100 ml

Gelditze-soluzioa (100 ml) 



Fixatzailea (100 ml) 

Fixatzailea (Agefix B&W fixer) 10 ml 


B-2) EBAKI ULTRAFINAK 

3-4 µm-ko lodierako ebakiak aurretik azaldu bezala tindatu. Ondoren, tindatutako laginak 

berriro ere EPON erretxinan inkluditu, erretxina polimerizatu, ebaki ultrafinak eskuratu eta azetato 

uraniloz tindatu. 

IMMUNOHISTOKIMIKA 

A) PCNA IMMUNOHISTOKIMIKA (Marigómez et al., 1999) 

1.- Disekzionatutako laginak aurretik azaldu bezala prestatu. 

2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren ebakiak 

xiloletan eta etanolezko bainutan desparafinatu eta hidratatu. 

Porten silanizazioa 

Portak ur detergentea duen ur distilatuan garbitu 30 min-ordu 1. 

Uretan garbitu. 

Portak 130ºC-tan lehortu. 

Portak %2 3-aminopropiltrietoxisilano (Sigma A-3648) azetonatan 5 segunduz 

murgildu. 

Azetonan bi bainu azkarretan garbitu. 

Ur bidistilatuan garbitu. 

37ºC-tan gau osoan lehortu. 

Desparafinazioa eta hidratazioa 






3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuratzea egin daiteke. 

Horretarako ebakiak %0.5 tripsina duen TBS-tan 5 minutuz murgildu ziren. 

TBS, pH 7.6 (100 ml) 

Tris 0.605 g 

NaCl 0.877 g 



229


4.- Ebakiak PBS-an garbitu eta peroxidasa jarduera endogenoa %3 H 2 O 2 duen 

metanola 10 minutuz erabiliz blokeatu. 

PBS 

NaCl 16 g 

KCl 0.4 g 

NaH 2 PO 4 H 2 O 0.46 g 

Na 2 HPO 4 12H 2 O 6.8 g 

H 2 O distilatua 2 l 

5.- Ebakiak PBS-tan garbitu (3 x 10 min) eta %0.1 BSA duen PBS-tan ordu batez 

inkubatu. 

6.- Ondoren, ebakiak PCNA antigorputzarekin (PC10 klona) (Sigma P-8825) inkubatu 

(1:1500 diluzioa), %0.1 BSA duen PBS-tan, 4ºC-tan eta gau osoan. 

7.- Ebakiak PBS-tan garbitu (3 x 10 min) eta antigorputza abidina-biotina entzima 

konplexuaren bitartez ikustarazi Vectastain Elite ABC Kit-a (Burlingame) erabiliz. Horrela, ebakiak 

biotinilatutako arratoiaren aurkako zaldiaren antigorputz sekundarioan inkubatu (1:200 diluzioa) 30 

minutuz giro tenperaturan. Ondoren, ebakiak PBS-tan garbitu eta gero (3 x 10 min) ABC 

erreaktiboan inkubatu 25 minutuz eta giro-tenperaturan. 

8.- PBS-tan garbiketak egin ondoren, ebakien peroxidasa jarduera diaminobenzidina 

(DAB) disoluzio kromogenoa erabiliz ikustarazi. 

DAB disoluzio kromogenoa 

DAB 0.06 g 

PBS 75 ml 

H2O2 25 µl 

9.- Ebakiak Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatzen dira eta ur distilatuan 

garbitu onodoren Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu. 

B) BrdU IMMUNOHISTOKIMIKA 

B-1) Peroxidasa bidezko detekzioa. 


2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren ebakiak 


3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuratzea egin daiteke. 

Horretarako ebakiak %0,5 tripsina duen TBS-tan 5 minutuz murgildu. 

230

TBS, pH 7.6 (100 ml) 

Tris 0.605 g 

NaCl 0.877 g 


4.- Ebakiak PBS-an garbitu eta peroxidasa aktibitate endogenoa %3 H 2 O 2 duen 

metanola 10 minutuz erabiliz blokeatzen da. 

5.- Ebakiak 11.36 N HCl-an ordu batez inkubatu 37ºC-tan DNA harizpien bereizketa 

lortzeko. Ondoren sodio tetraborato indargetzailean inkubatu (2 x 5 min). 

Sodio tetraboratoa 0.1 M, pH 8.5 (100ml) 

B4O7Na2 3.814 g 

H2O distilatua 100 ml 

6.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta %0.1 BSA duen PBS-an ordu batez 

inkubatu. 

7.- Ondoren, ebakiak BrdU antigorputzarekin (Roche) (1:100 diluzioa) inkubatu %0.1 BSA 

duen PBS-an, ordu batez eta giro tenperaturan. 

8.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta antigorputza abidina-biotina entzima 

konplexuaren bitartez ikustarazi Vectastain Elite ABC Kit-a (Burlingame) erabiliz. Horrela, ebakiak 

biotinilatutako arratoiaren aurkako zaldiaren antigorputz sekundarioan inkubatu (1:200 diluzioa) 30 

minutuz giro tenperaturan. Ondoren, ebakiak PBS-an garbitu ostean (3 x 10 min), ABC 

erreaktiboan 25 minutuz inkubatu giro-tenperaturan. 

9.- PBS-an garbiketak egin ondoren, ebakien peroxidasa jarduera 3 amino 9 etilkarbazol 

(AEC) (Sigma A-6926) disoluzio kromogenoa erabiliz ikustarazi. 

AEC kromogenoaren disoluzioa 

AEC disoluzioa 200 µl 

Sodio azetatoa 0.05 M 4 ml 

H2O2 2 µl 

AEC Disoluzioa 

AEC 20 mg 

Dimetilformamida 2.5 ml 

Sodio azetatoa 0.05 M, pH 5.2 (100 ml) 

Sodio azetatoa 0.6804 g 



10.- Ebakiak, Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatu eta ur distilatuan 

garbitu eta ondoren Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu. 

231


B-2) Fosfatasa alkalino bidezko detekzioa. 


2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren, ebakiak 


3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuraketa burutu daiteke. 

Horretarako ebakiak %0.5 tripsina duen TBS-an 5 minutuz murgildu. 

TBS, pH 7.6 (100 ml) 

Tris 0.605 g 

NaCl 0.877 g 


4.- Ebakiak PBS-an garbitu. 

5.- Ebakiak 11.36 N HCl-an ordu batez inkubatu 37ºC-tan, DNA harizpien bereizketa lortzeko. 

Ondoren, sodio tetraborato indargetzailean inkubatu (2 x 5 min). 

Sodio tetraboratoa 0.1M, pH 8.5 (100ml) 

B4O7Na2 3.814 g 


6.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta %5 BSA duen PBS-an 20 minutuz inkubatu. 

7.- Ondoren, ebakiak BrdU antigorputzarekin (Roche) inkubatu (1:100 diluzioa) %1 BSA 

duen PBS-an, ordu batez eta giro-tenperaturan. 

8.- Ebakiak PBS-an garbitu (5 minutuz etangabe irabiatzen) eta antigorputza abidinabiotina-entzima 

konplexuaren bitartez ikustarazi, Sigma Mouse Extravidin Alkaline Phosphatase 

Staining Kit-a (Sigma EXTRA 2A) erabiliz. Horrela, ebakiak biotinilatutako arratoiaren aurkako 

ahuntzaren antigorputz sekundarioarekin inkubatu (1:20 diluzioa) 20 minutuz giro-tenperaturan. 

Ondoren, ebakiak PBS-an garbitu ostean (5 minutuz etengabe irabiatzen) Fosfatasa alkalinoan 

itsatsita daraman extrabidinarekin inkubatu (1:20 diluzioa) 20 minutuz eta giro-tenperaturan. 

9.- Laginak TBS-an garbitu 5 minutuz eta fosfatasa alkalino jarduera Fast Red TR/Naphtol 

tabletak sustrato gisa erabiliz ikustarazi (Sigma F-4523). 

10.- Ebakiak Mayer Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatu eta ur 

distilatuan garbitu ostean Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu. 

232

Mayer Hematoxilina (1l) 

Hematoxilina 1 g 

Alunbre potasikoa 50 g 

Sodio Iodatoa 0.2 g 

Azido Zitrikoa 1 g 

Kloral hidratoa 30 g 

H 2 O distilatua 1 l 

ß GLUKURONIDASA HISTOKIMIKA (Cajaraville et al., 1991) 

1.- Disekzionatu berri diren laginak % 2.5 NaCl eta %10 sakarosa duen fosfato indargetzailean 

(0.1 M) 15 minutuz murgildu. 

Fosfato indargetzailea 0.1 M, pH 7.4 (100ml) 

NaH 2 PO 4 H 2 O 0.256 g 

Na 2 HPO 4 12H 2 O 2.892 g 


2.- Laginak nitrogeno likidotan izoztu. 

3.- Kriostatoan eskuratutako 8 µm-ko lodierako ebakiak izozkailutik hozkailura eraman eta 

bertatik giro tenperaturara igaro bertan hainbat minutu utziz. 

4.- Ebakiak inkubazio-medioan inkubatu 37ºC-tan, eta 40 minutuz muskuilu, 20 minutuz 

magurio eta 10 minutuz bareen kasuan, hain zuzen. 

Inkubazio-medioa 

Azetato indargetzailea 285 ml 

Naftola (Sigma N-1875)) 0.081 g 

Sodio bikarbonatoa 3.468 ml 

Polibinilo alkohola 30.60 g 

Azetato indargetzailea 0.1 M, pH 4.5 (600 ml) 

NaCl 15 g 

Sodio azetatoa 7.344 g 

Azido azetikoa 3.78 ml 


Sodio bikarbonatoa (100 ml) 

NaHCO3 0.42 g 


5.- Ebakiak azetato indargetzailean 2 minutuz garbitu 37ºC-tan. 


6.- Ebakiak %0.1 Fast Garner GBC (Sigma F-6504) eta %2.5 NaCl duen fosfato 

233


indargetzailean 10 minutuz sartu. 

7.- Ebakiak, Baker formol kaltzikoan fixatu 10 minutuz. Formol kaltzikoak hotza egon 

behar du. 

Baker formol kaltzikoa (100 ml) 

Formaldehidoa (%40) 10 ml (pH = 7) 

CaCl2 3 g 

NaCl 7.5 g 


8.- Ebakiak, ur distilatuko hainbat bainu azkarretan garbitu ondoren %1 Fast Green FCF 

(Sigma F-7252) duen ur distilatuan 2 minutuz kontrastatu giro-tenperaturan. 

9.- Ebakiak, Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu. 

X IZPIEN MIKROANALISIA ETA MAPAKETA 

Erretxinan inkluditutako ebakiak, formvar/karbonoz estalitako aluminio eta titaniozko 

saretxotan bildu. Ondoren, berriro ere, eta kontrastatu gabe, karbonoz estali ziren X izpien 

mikroanalisia egiteko. 

X izpien mikronanalisia, energi dispertsiorako espektrometroa lotuta zeukan JEOL 1210 

STEM mikroskopioan burutu zen (kontaketa-denbora: 100 segundu). X izpien mapaketa Ag (Lα1 

-2.984 keV-, Lß1 -3.151 keV-), Cd (Lß1 -3.316 keV-) eta S (Kα -2.308 keV-) seinaleak batera 

lokalizatzeko burutu zen. Horretarako Link ISIS v1.04A softwarea erabili zen. Analisi hauek Cardiffeko 

Galeseko Unibertsitatean egin ziren. 

ABSORTZIO ATOMIKOZKO ESPEKTROFOTOMETRIA 

1.- Disekzionatu berri ziren laginak, ur distilatuarekin garbitu eta 120ºC-tan 48 orduz 

lehortu. 

2.- Dagoeneko guztiz lehorturik zeuden laginak pisatu. 

3.- Beharrezkoa izatekotan, beirazko hodi baten laguntzaz laginak txikitu. 

4.- Laginak azido nitriko kontzentratuan liseritu. Horretarako Erlenmeyer hodietan azido 

nitrikoa apurka isuri lagina guztiz disolbatu arte eta Erlenmeyer hodiak puxtarri batez estali 

liseriketa egokiagoa lortzeko. 

5.- Laginen liseriketa amaituta dagoela egiaztatu ondoren, azido nitrikoa 80ºC-tan 

lurrundu. 

6.- Lehor zeuden laginak azido nitriko diluituan (0.65 eta 0.1 M) berresekitu eta 4000 rpmra 

4 minutuz zentrifugatu, gainjalkina eskuratu, eta neurtu bitartean hozkailuan gorde. 

234

AZIL KoA-OXIDASA (AOX) JARDUERAREN NEURKETA (Small et al., 1985). 

1.- Bareen liseri-guruinak TVBE indargetzailean homogenizatu eta 500 g-tan zentrifugatu, 

15 minutuz eta 4ºC-tan. 

TVBE indargetzailea pH 7.6 (100 ml) 

NaHCO3 8.4 mg 

0.1M EDTA 1 ml 

%0.1 etanol 0.1 ml 

%10 Triton X-100 0.1 ml 


2.- Gainjalkinaren 100 µl (beharrezko diluzioan) hartu eta 1.9 ml inkubazio-mediora gehitu. 

Nahasketa 5 minutuz eta 25ºC-tan iluntasunean mantendu. Substratuaren (Palmitoil-KoA 

(Sigma P-9276) 3 mM) 10 µl gehitu, nahastu eta absorbantziaren aldaketa neurtu 502 nm-tan 3 

minutuz. 

Inkubazio-medioa 

0.5M potasio fosfato indargetzailea 2 ml 

DCF disoluzioa* 2 ml 

Errefrau peroxidasa 1200 mU/ml (Sigma P-8250) 1 ml 

4 M NaN 3 (Sigma S-2002) 1 ml 

%10 Triton X-100 (Sigma X-100) 2 ml 

H 2 O distilatua 100 ml arte 

*1 ml egiteko: 1.3 mg diklorofluoreszeina (DCF) (Molecular Probes D-399) 100 µl 

dimetilformamida + 900 µl 0.01 N NaOH-an disolbatu. 

Potasio fosfato indargetzailea 0.5 M pH 7.4 

KH2PO4 680 mg 


K 2 HPO 4 3H 2 O 1140 mg 


KH 2 PO 4 disoluzioa K 2 HPO 4 3H 2 O disluzioari gehitu pH 7.4 lortu arte. 

Substratu disoluzioa (3 mM palmitoil-KoA oxidasa) 

Palmitoil-KoA (Sigma, P-9276) ur distilatuan disolbatu, beharrezko kontzentrazioa 

lortu arte. 0.5 ml-tako alikuotetan izoztu eta gorde. 

3.- AOX jardueraren neurketa honela burutu: 

mUnitate/ml = (Absorbantziaren aldaketa/minutu) x (erreakzio-bolumena/lagin-bolumena) 

x (mg proteina/ml). 

mUnitate/mg proteina = (mUnitate/ml) / ( mg proteina/ml) 


235


236

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN ... - Euskara

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?