Identificazione molecolare di lieviti ricorrenti nella ... - FedOA
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sulla base di banche-dati genetiche, alla specie di appartenenza, così come può essere d’ausilio per discriminare, su basi genotipiche, ceppi o biotipi nell’ambito di una stessa specie. 1.17 Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) Un’importante applicazione della PCR risultata adatta a discriminare ceppi o biotipi nell’ambito della stessa specie è la RAPD-PCR (Williams et al., 1990). Questa tecnica è basata sull'impiego di piccoli primers, di sequenza arbitraria e di lunghezza in genere di dieci mer, utilizzati per amplificare porzioni random di DNA attraverso la PCR. Poiché ogni primer è costituito da un basso numero di nucleotidi, esso potrà riconoscere molti siti sull’intero DNA target. Un frammento è amplificato ogni qualvolta due di questi primers riconoscono, nel genoma, due sequenze omologhe su due filamenti, posti alla distanza massima utile per il funzionamento della Taq DNA polimerasi, e posti nella giusta direzione l'uno rispetto all'altro. Differenti sequenze geniche saranno riconosciute da primers in diversi siti e quindi, amplificati, produrranno un differente “fingerprinting” genetico, altamente specifico per un dato microrganismo. I risultati possono poi essere comparati tra i campioni per calcolare la percentuale di similarità. L'uso di un insieme di primers ci aiuta anche ad essere certi che una regione 60
sufficientemente ampia di DNA target sia stata esaminata (Ogram e Feng, 1997). La tecnica RAPD consente di identificare e tipizzare i microrganismi a livello di ceppo, nonché di analizzare dinamiche di popolazione e la dominanza di ceppi all’interno di un ecosistema (Williams et al., 1990). La RAPD presenta molti vantaggi rispetto ad altre metodiche di amplificazione, incluso il fatto che è culture-indipendent, è molto rapida, facile da applicare e non richiede una conoscenza specifica del genoma che deve essere amplificato. I primers utilizzati non sono selettivi per microrganismi specifici, gruppi di microrganismi o geni, e può quindi contribuire ad una migliore rappresentazione della comunità microbica rispetto ai più tradizionali approcci basati sull’amplificazione PCR. Come per altre tecniche PCR, la RAPD richiede piccole quantità di DNA, riducendo il tempo per il campionamento (Franklin et al., 1999). In combinazione con gli approcci più tradizionali, le tecniche basate sul DNA- fingerprinting possono permettere al mondo scientifico di muoversi oltre la loro poca abilità di classificare completamente i costituenti di una comunità, attraverso lo sviluppo di una più completa comprensione delle globali informazioni tra le popolazioni microbiche e tra popolazioni e condizioni ambientali (Franklin et al., 1999). 1.18 Analisi della sequenza dei domini D1/D2 del 26S rDNA 61
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microrganismi specifici, gruppi <strong>di</strong> microrganismi o geni, e può quin<strong>di</strong><br />
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rispetto ai più tra<strong>di</strong>zionali approcci basati sull’amplificazione PCR. Come<br />
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riducendo il tempo per il campionamento (Franklin et al., 1999). In<br />
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