lezione enzimi prof. taibi 23/03/2011 - Aulett@'99
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ENZIMI<br />
Il termine catalizzatore, mutuato dalla chimica, si riferisce ad una sostanza che<br />
aumenta la velocità di una reazione chimica, pur non facendo parte della equazione<br />
che la definisce e che si ritrova inalterato al termine del processo. Un enzima è un<br />
catalizzatore biologico: aumenta la velocità di una reazione, ma non provoca alcuna<br />
trasformazione che non sarebbe accaduta in sua assenza, sia pure in tempi più<br />
prolungati, cioè non sposta l’equilibrio di una reazione ma abbrevia il tempo in cui<br />
esso viene raggiunto.<br />
Ap<strong>prof</strong>ondimento<br />
Nelle reazioni chimiche, come in tutto il mondo fisico, non è possibile creare o distruggere<br />
energia. Un sistema può perdere o guadagnare energia come calore o compiere lavoro a spese<br />
dell’intorno (ambiente). Per un cambiamento di stato, la I legge della termodinamica può<br />
essere espressa dalla seguente equazione:<br />
ΔE = q – w (1)<br />
dove ΔE rappresenta la variazione di energia interna del sistema; q il flusso di calore e w il<br />
lavoro compiuto. Per piccole variazioni differenziali di ha:<br />
dE = dq – dw (2)<br />
Se il lavoro compiuto implica variazioni nel volume del sistema ad una data pressione, il<br />
termine dw diventa PdV (dove P è la pressione e V il volume) e la eq. (2) diventerà:<br />
dE = dq – PdV (3)<br />
L’energia interna di un composto è rappresentata dall’entalpia (H). In questo termine sono<br />
contenute sia l’energia derivante dalle interazioni tra le molecole sia quella intrinseca delle<br />
molecole stesse.<br />
La relazione che lega la variazione di entalpia e la variazione dell’energia interna del sistema<br />
è espressa dalla seguente equazione:<br />
Per piccole variazioni si avrà:<br />
ed anche :<br />
ΔH = ΔE – PΔV (4)<br />
dH = d(E + PV) = dE + PdV + VdP (5)<br />
dH = dq – dw + PdV + VdP (6)<br />
Per un sistema che compie esclusivamente lavoro di tipo PdV (cioè dw = PdV) si avrà:<br />
dH = dq + VdP (7)<br />
Per reazioni che avvengono a pressione e volume costanti, come la maggior parte delle<br />
reazioni biochimiche, si avrà che:<br />
dH= dq (8)<br />
Una reazione tenderà ad avvenire con più facilità tanto più negativo sarà il termine:<br />
ΔH - TΔS (9)
cioè fino a quando ΔG = 0. In queste condizioni non viene svolto lavoro termodinamico ed il<br />
sistema ha raggiunto l’equilibrio.<br />
Biochimica ed Energia<br />
Anche se nell'universo tutto tende spontaneamente verso il massimo disordine (ΔS>0)<br />
ciò non comporta la possibilità di utilizzare la variazione di entropia per potere<br />
misurare la spontaneità di un processo; ciò in quanto non é possibile misurare<br />
l'entropia dell'intero universo. Quanto affermato spiega perché non è possibile<br />
predire la spontaneità di una qualunque trasformazione soltanto dalla misurazione<br />
della variazione dell' entropia; infatti una reazione esotermica (ΔH
iochimica. Per ogni processo reale o fattibile, la variazione dell'energia libera di Gibbs<br />
(ΔG) é negativa; il sistema possiede più energia libera nello stadio iniziale che in quello<br />
finale.<br />
ΔG = Gfinale – Giniziale,<br />
Tutte le reazioni fattibili si svolgono con variazioni negative di energia libera (ΔG).<br />
Quando la variazione di energia libera é zero, la reazione o processo è all'equilibrio.<br />
Questi importanti risultati possono essere così sintetizzati:<br />
ΔG < 0 (il processo é fattibile ed esoergonico)<br />
ΔG = 0 (prevalgano condizioni di equilibrio ed il processo è isoergonico)<br />
ΔG > 0 (il processo non è fattibile ed è endoergonico)<br />
Da quanto detto si potrebbe dedurre che qualunque reazione con un valore di ΔG<br />
altamente negativo deve procedere con una velocità misurabile, ma così non è<br />
dipendendo essa dal ΔG di ogni singolo intermedio della reazione. Ciò significa che<br />
anche se il ΔG complessivo é altamente negativo la trasformazione di un substrato in<br />
un prodotto potrebbe presentare degli intermedi con ΔG positivi. Ecco perché molte<br />
trasformazioni di per se termodinamicamente favorite necessitano per avvenire, a<br />
velocità misurabili, della presenza di specifici <strong>enzimi</strong> che accelerano la reazione senza<br />
però interferire sul ΔG complessivo della trasformazione.<br />
Ne deriva che un enzima può soltanto accelerare il raggiungimento dell'equilibrio<br />
termodinamico ma non può promuovere un reazione che presenta un ΔG positivo.<br />
In una qualunque reazione di trasformazione (S → P) viene immediato pensare che<br />
maggiore è il rapporto S/P maggiore sarà la possibilità di fare avvenire la<br />
trasformazione, se tale reazione mostra ΔG negativi. Al contrario se il rapporto S/P è<br />
identico al rapporto all’equilibrio (P/S = Keq) non avverrà nessuna trasformazione e<br />
non verrà svolto alcun lavoro (ΔG = 0).<br />
Variazione di energia libera standard e costante di equilibrio<br />
La variazione di energia libera standard è correlata alla costante di equilibrio.<br />
Consideriamo la seguente chimica:<br />
A + B → C + D<br />
L'equazione seguente illustra la relazione logaritmica tra la variazione di energia<br />
libera standard e la costante di equilibrio:
ΔG 0 = -RT ln Keq<br />
dove R è detta costante dei gas o coefficiente energia-temperatura e mette appunto in<br />
relazione la temperatura con l'energia. R ha il valore di 8.314 KJ mole -1 o 1.987 Kcal<br />
mole -1 , e T è il valore della temperatura assoluta in gradi Kelvin (25 °C = 298 °K).<br />
E' necessario a tal punto definire le condizioni standard per il biochimico. Dato che la<br />
maggior parte delle reazioni biochimiche avviene in soluzioni acquose, la<br />
concentrazione dei reagenti e dei prodotti può essere assunta uguale ad 1M (1<br />
mole/litro). Il fatto che l'acqua in realtà non abbia una concentrazione 1M ma bensì<br />
55.6 M (l000g/L+18g/mole acqua) non ha comunque effetto auJIe variazioni di<br />
energia libera.<br />
Per ricapitolare, "la variazione di energia libera standard di un processo chimico è la<br />
variazione_ di energia libera di Gibbs durante la conversione dei reagenti in prodotti di<br />
tutti i componenti (eccetto l’acqua) sono presenti ad una concentrazione 1M". La<br />
concentrazione dei componenti rimane costante durante la conversione.<br />
La variazione di energia libera di molte reazioni è influenzata dal pH. Siccome la<br />
maggior parte delle reazioni biochimiche avviene in condizioni vicine alla neutralità<br />
(pH=7), questo valore di pH (H + = 1•10 -7 ) è usato per lo standard biochimico. Questo<br />
perché una concentrazione 1M di H + corrisponderebbe ad un pH ≈ 0 incompatibile<br />
con la vita. Questa convenzione è indicata dal simbolo (‘) ed indicheremo ΔG come<br />
ΔG', ΔG 0 come ΔG 0’ e Keq come K'eq.<br />
Anche in questo caso la variazione di energia libera standard sarà funzione<br />
logaritmica della costante di equilibrio:<br />
(dove RT = 2477.6 J mole -1 a 25 °C)<br />
ΔG 0’ = -RT In K'eq<br />
che se espressa in forma di logaritmo decimale sarà:<br />
ΔG 0' = -2.3 RT lg K'eq<br />
(dove 2,3 RT = 5698.4 J mole -1 a 25 °C)<br />
La relazione matematica che lega ΔG' ad una qualunque reazione deve contenere due<br />
termini: uno che contiene la concentrazione dei substrati e dei prodotti nelle varie fasi<br />
di trasformazione ed l'altro la concentrazione degli stessi all'equilibrio:<br />
ΔG' = -1,3 RT Iog K'eq + 2,3 RT log [P] a [P] b …../[S] c [S] d ...<br />
Per cui la variazione di energia libera qualunque sia la concentrazione dei reagenti e<br />
dei prodotti:<br />
ΔG' = ΔG 0’ + 5968.4 1og [P] a [P] b …../[S] c [S] d ...
Il concetto della addizionabilità dei singoli valori di ΔG' in una trasformazione<br />
complessa permette ai sistemi biologici di produrre l’energia necessaria a portare<br />
avanti tutte la reazioni chimiche necessarie per la propria crescita e sopravvivenza.<br />
L'energia non essendo sempre immediatamente utilizzabile, o se si, non utilizzabile<br />
nello stesso compartimento cellulare, deve essere immagazzinata in una qualche<br />
forma che possa essere disponibile quando necessario (glicogeno, trigliceridi,<br />
proteine) sia immediatamente disponibile (creatina-P, ATP, ed in percentuale<br />
inferiore altri nucleotidi quali UTP, CTP, GTP, NADH e NAPH).<br />
_________________________<br />
Come già descritto l’equazione che definisce la variazione di energia libera di una<br />
reazione chimica contiene due termini: uno che indica la concentrazione dei prodotti<br />
e dei reagenti in condizioni di equilibrio ed uno che indica le reali concentrazioni dei<br />
prodotti e dei reagenti in un determinato sistema.<br />
Se si considera la reazione:<br />
Varrà la seguente equazione:<br />
A + B ↔ C + D<br />
dove ΔG’ è la variazione di energia libera del sistema a pH 7.0 e ΔG 0’ esprime la<br />
variazione di energia libera nelle seguenti condizioni standard:<br />
1. concentrazione 1M di tutti i ragenti e dei prodotti;<br />
2. pressione pari ad 1 atmosfera;<br />
3. temperatura di 25 °C;<br />
4. pH 7.0.<br />
Un valore negativo di ΔG’ indica che una reazione come quella sopra scritta<br />
procederà da sinistra verso destra e, in determinate condizioni di concentrazione di<br />
reagenti e prodotti, dà una misura di quanto la reazione considerata sia lontana<br />
dall’equilibrio (Figura).<br />
Tuttavia il parametro ΔG’ non dà alcuna indicazione sulla velocità con cui la reazione<br />
si avvicina all’equilibrio.
Quando una reazione è all’equilibrio, indipendentemente dalle concentrazioni iniziali<br />
di A, B, C, D, si verificano le condizioni di minima energia in cui non è possibile alcun<br />
lavoro ulteriore, cioè:<br />
ΔG’ = 0<br />
Poiché le concentrazioni indicate si riferiscono all’equilibrio, si ha che:<br />
Come un valore di ΔG’ molto negativo non implica che una reazione proceda ad alta<br />
velocità, ma semplicemente che il rapporto esistente tra prodotto e reagenti è più<br />
basso che all’equilibrio, così un valore di ΔG°’ molto negativo, che pure indica la<br />
tendenza di una reazione a procedere verso destra, non dice nulla sulla velocità alla<br />
quale la reazione procede.<br />
Gran parte delle reazioni con ΔG°’ molto negativo non procedono a velocità<br />
apprezzabile a temperatura compatibili con la vita in assenza di un opportuno<br />
catalizzatore. Per esempio l’ossidazione completa del glucosio:<br />
glucosio + 6O2 → 6CO2 + 6H2O<br />
ha un ΔG°’ di –686 kcal/mole, conseguentemente il glucosio all’aria è piuttosto<br />
instabile in senso termodinamico. Ma il glucosio come cristallo solido in ambiente<br />
sterile ed a temperatura ambiente non produce CO2 ed H2O ad una velocità<br />
misurabile, per cui il glucosio è stabile in senso cinetico.<br />
La stabilità cinetica si spiega considerando un tipico <strong>prof</strong>ilo energetico, cioè un<br />
grafico in cui viene riportata la variazione di energia libera standard in funzione della<br />
coordinata di reazione (Figura).
Considerando una qualsiasi reazione:<br />
S → P<br />
La velocità di questa reazione dipende dal numero di molecole di S che entrano nello<br />
stato di transizione per unità di tempo. Infatti per aumentare la velocità di una<br />
reazione si può innalzare la temperatura del sistema che, aumentando il moto termico<br />
delle molecole, incrementa il numero di molecole S attivate, oppure abbassare<br />
l’energia di attivazione della reazione, cosa che si ottiene con l’intervento di un<br />
catalizzatore. Una reazione elementare, o reazione a uno stadio, è contraddistinta da<br />
una sola energia di attivazione e da un solo stato di transizione (vedi Fig. precedente),<br />
mentre in una reazione a più stadi ci sono una energia di attivazione e uno stato di<br />
transizione per ogni stadio (vedi Figura seguente).
Le cellule vivono a temperature relativamente basse (0-100 °C). A queste temperature<br />
poche reazioni, se non nessuna, avverrebbero ad una velocità sufficiente da consentire<br />
alla cellula di crescere e di riprodursi. I sistemi biologici sono in grado di<br />
sopravvivere in condizioni “blande” in senso biochimico, in quanto utilizzano<br />
catalizzatori biologici, gli <strong>enzimi</strong>, che selettivamente abbassano l’energia di<br />
attivazione delle reazioni cicliche vitali. Una reazione catalizzata da un enzima a 25<br />
°C può procedere da 10 6 a 10 15 volte più velocemente della stessa reazione non<br />
catalizzata.<br />
Come già detto, l’enzima non ha alcun effetto sulla variazione di energia libera e sulla<br />
costante di equilibrio della reazione, semplicemente aumenta la velocità con la quale<br />
la reazione raggiunge l’equilibrio.<br />
Consideriamo la seguente trasformazione:<br />
k1<br />
S ⇔ P (k1 = 10 -3 min -1 e k-1 = 10 -5 min -1 )<br />
k-1<br />
dove le due k sono rispettivamente le costanti di velocità delle reazioni S → P e P →<br />
S. All’equilibrio, la velocità della reazione (v) in un senso eguaglia quella nell’altro<br />
senso:<br />
v1 = k1[S] = v-1 = k-1[P]<br />
cioè: k1[S] = k-1[P]<br />
da cui: [P] = k1[S]/k-1<br />
poiché: Keq = [P]/[S]<br />
avremo che: Keq = k1/k-1 = 10 -3 /10 -5 = 100<br />
In presenza di un opportuno enzima sia k1 che k-1 sono aumentate nella stessa misura.<br />
Dunque Keq rimane invariata e di conseguenza anche ΔG’ e ΔG°’.
L’energia di attivazione viene abbassata nelle reazioni catalizzate.<br />
ΔG ‡ è l’energia di attivazione della molecola dello stato di transizione e ΔG° è<br />
l’energia libera totale della reazione.
Enzimi:<br />
Definizione di Enzima<br />
1. Gli <strong>enzimi</strong> sono catalizzatori sintetizzati nelle cellule;<br />
2. Chimicamente sono polimeri eterologhi di aminoacidi (proteine);<br />
3. spesso sono associati a cofattori per svolgere la loro attività catalitica.<br />
4.<br />
L’enzima può essere costituito da un solo polipeptide (monomero) o da più polipeptidi<br />
(oligomero). L’oligomero può essere costituito da monomeri (detti anche subunità)<br />
identici (portomeli) o da monomeri diversi.<br />
Gli <strong>enzimi</strong> possono essere classificati sulla base della natura chimica del cofattore a<br />
cui sono associati per essere biologicamente attivi.<br />
I cofattori o co<strong>enzimi</strong> si distinguono in:<br />
Ioni metallici (Ca 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , K + , ecc.). Fanno parte del sito attivo partecipando<br />
direttamente al meccanismo di catalisi.<br />
Co<strong>enzimi</strong> trasportatori. Molecole organiche che si legano reversibilmente con legami<br />
deboli all’apoenzima e partecipano al meccanismo di catalisi. Sono trasportatori di<br />
radicali: atomi o gruppi di atomi (es. NAD + , CoA….). Avvenuta la reazione un<br />
prodotto della reazione rimane legato al coenzima, il coenzima quindi diffonde e si<br />
lega ad un altro enzima per cedere in un’altra reazione il radicale trasportato.<br />
Gruppi prostetici. Molecole organiche legate stabilmente all’apoenzima mediante<br />
legami covalenti o molti legami deboli (es. citocromi, biotina….).<br />
I cofattori svolgono un ruolo fondamentale nella catalisi; in loro assenza l’enzima non<br />
è attivo; la reattività dei cofattori è influenzata dalla proteina, senza apoenzima essi<br />
sono inattivi per la catalisi.<br />
Esistono casi in cui ioni metallici o molecole (talvolta co<strong>enzimi</strong> stessi) sono<br />
indispensabili per l’attività di un enzima pur non partecipando direttamente al<br />
meccanismo della catalisi. Essi servono a mantenere l’enzima nella conformazione<br />
attiva e possono essere legati stabilmente o reversibilmente alla proteina, in questo<br />
ultimo caso possono agire come effettori per la regolazione dell’enzima.
PRINCIPALI COENZIMI E GRUPI PROSTETICI
Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD + ) e Nicotinamide adenin dinucleotide fosfato<br />
(NADP + )<br />
↑<br />
Nella forma ridotta è indicata solo la nicotinamide (vitamina PP) ed R rappresenta il<br />
resto della molecola. La freccia indica l’ossidrile esterificato con acido fosforico nel<br />
NADP + .<br />
I due co<strong>enzimi</strong> piridinici hanno diversa funzione: il NADH cede 1H + e 2 e - per la<br />
sintesi di ATP; Il NADPH cede 1H + e 2e - per le reazioni di riduzione nei processi di<br />
biosintesi (anabolismo).<br />
Il NADP + ed il NAD + quando vengono ridotti in una reazione, si liberano della parte<br />
proteica dell’enzima, diffondono per legarsi ad un’altra proteina enzimatica e<br />
partecipare ad una reazione di riduzione in cui cedendo 1H + e 2e - sono nuovamente<br />
riossidati; quindi diffondono per legarsi al primo enzima ed essere di nuovo ridotti.
I NAD + vengono ridotti in varie reazioni; nella glicolisi: 3-fosfogliceraldeide-<br />
deidrogenasi; nel ciclo di Krebs: isocitrico deidrogenasi, lipoil deidrogenasi, malico<br />
deidrogenasi, ecc. I NADH + H + vengono ossidati nella fosforilazione ossidativi, nella<br />
gluconeogenesi (3-fosfogliceraldeide-deidrogenasi) nella glicolisi anaerobia (LDH). I<br />
NADP + vengono ridotti nello shunt dell’esosomonofosfato, e nelle reazioni dell’enzima<br />
malico e dell’isocitrico deidrogenasi. I NADPH + H + vengono ossidati nella sintesi<br />
degli acidi grassi, sintesi dell’acido tetraidrofolico, colesterolo ecc.<br />
Coenzima A(CoA), trasportatore universale di gruppi acili.<br />
Principali vie metaboliche dove viene utilizzato il CoA: β-ossidazione degli acidi<br />
grassi, prime reazioni per la sintesi del colesterolo e corpi che tonici, sintesi dei<br />
trigliceridi e fosfolipidi, allungamento della catena alifatica dell’acido palmitico.
Struttura della Vitamina B1 e sua forma attiva fosforilata<br />
Struttura della Vitamina B2 (Riboflavina) e forme attive<br />
La riboflavina, isolata per la prima volta dal latte, deve il suo intenso colore giallo al<br />
complesso anello di isoallosazina presente nella molecola. La dose giornaliera<br />
consigliata nella dieta è di circa 1,7 mg.<br />
Le forme coenzimatiche attive della riboflavina sono due:<br />
1. FMN (riboflavina-5’-P)<br />
2. FAD (flavinadenindinucleotide)
Proprietà dell’Enzima<br />
L’enzima è un congegno chimico le cui proprietà di catalisi specifica sono ristrette ad<br />
una piccola zona della superficie della molecola, detta sito catalitico. Il sito catalitico<br />
ha le seguenti proprietà:<br />
1. Complementarietà di carica e di forma con il substrato che lega con alta<br />
affinità e specificità.<br />
2. Parte della sua struttura può essere idrofoba. In questa parte si hanno forti<br />
interazioni tra atomi carichi elettrostaticamente che non sarebbero possibili in<br />
presenza di acqua (es. gruppi carbossilici indissociati, legami salini molto<br />
forti). Essa inoltre serve a legare le parti idrofobiche (quando presenti) dei<br />
substrati.<br />
3. Possibilità di piccoli spostamenti (da 0 a 2 Å) tra i gruppi responsabili della<br />
formazione del complesso ES e/o della catalisi. Questi spostamenti sono causati<br />
da cambiamenti conformazionali dell’enzima che ha legato il substrato<br />
(induced fit) o effettori (allosterismo)). I cambiamenti conformazionali,<br />
facilmente reversibili perché richiedono poca energia fornita dall’agitazione<br />
molecolare, sono parte essenziale dei meccanismi molecolari di catalisi e di<br />
regolazione degli <strong>enzimi</strong>.<br />
4. La geometria (naturale o indotta) dei gruppi responsabili della legatura del<br />
substrato e della catalisi è tale da porre gli atomi (dei substrati e dell’enzima)<br />
che devono interagire nella distanza e nell’angolo che devono formare (effetti<br />
prossimità ed orientamento degli orbitali) e se necessario provocare una<br />
distorsione nella struttura del substrato.
GRADI DI SPECIFICITA’<br />
Un enzima ha specificità assoluta quando lega un solo substrato (es. aspartasi,<br />
glucochinasi, succinico deidrogenasi) o relativa quando può legare vari composti in<br />
genere aventi struttura chimica simile catalizzando lo stesso tipo di reazione (es.<br />
esochinasi, lipasi, esterasi, fosfatasi) o catalizzando anche reazioni diverse (es. la<br />
chimotripsina lega substrati diversi e catalizza reazioni diverse come la scissione<br />
idrolitica del legame peptidico, amidico ed estereo).<br />
L’aspartasi è un esempio di enzima dotato di specificità assoluta, di stereospecificità e<br />
di specificità geometrica.<br />
Questo enzima catalizza la trasformazione dell’acido L aspartico in acido fumarico:<br />
questo riconoscimento (stereospecificità) è solo apparentemente di difficile<br />
realizzazione, infatti, se si ammette che l’enzima prenda contatto con il substrato in<br />
almeno tre punti (es. i due gruppi COO - e il gruppo NH + 3) e tenendo presente la<br />
disposizione nello spazio di tali gruppi si comprende il perché della incapacità della<br />
aspartasi di attaccare il D-aspartato.
Specificità relativa: composti simili sono substrati dell’enzima, ma con diversa Km e<br />
Vmax. Ciò può essere causato da una diversa affinità di E verso i vari substrati e/o<br />
perché i substrati sono più o meno chimicamente idonei ad indurre la conformazione<br />
richiesta per la catalisi(Induced Fit).<br />
Le lipasi sono <strong>enzimi</strong> con specificità relativa, scindono idroliticamente il legame<br />
estereo tra il carbossile di vari acidi grassi con vari alcool. Le <br />
scindono il legame estereo tra acidi grassi a lunga catena ed il glicerolo.<br />
Le fosfatasi monoesterasi scindono idroliticamente il legame estereo dell’acido<br />
fosforico con qualsiasi molecola biologica.<br />
Legatura del substrato all’enzima e catalisi.
La legatura di E con S e la catalisi sono eventi separati e concatenati; responsabili di<br />
queste due fasi della funzione catalitica degli <strong>enzimi</strong> sono in genere catene laterali di<br />
differenti aminoacidi tutte localizzate nel sito attivo dell’enzima. La specializzazione<br />
nelle due funzioni di residui aminoacidici diversi è richiesta dal meccanismo<br />
dell’induced-fit (teoria della conformazione indotta dal ligando sul sito catalitico<br />
dell’enzima), dove i residui aminoacidici responsabili della catalisi interagiscono con<br />
il substrato solo dopo che questo si è legato al sito catalitico.<br />
Una prova della separazione delle due funzioni è data dalla inibizione competitiva<br />
(analoghi del substrato si legano all’enzima, talvolta più stabilmente del substrato<br />
stesso, ma non reagiscono perché non possono interagire in maniera opportuna con i<br />
gruppi dell’enzima responsabili della catalisi.<br />
CATALISI ENZIMATICA
I -MODI DI SCISSIONE DEI LEGAMI DA PARTE DEGLI ENZIMI-<br />
Un legame covalente tra due atomi consiste nella condivisione di una coppia di<br />
elettroni. Nella scissione di un legame, uno o entrambi gli atomi si combinano con<br />
nuovi atomi con cui condividono una coppia di elettroni.<br />
Consideriamo ad esempio la scissione del legame C-H. Il processo può avvenire<br />
soltanto in due modi:<br />
(1) Scissione omolitica (omolisi) in cui un elettrone rimane sul carbonio ed uno<br />
sull'idrogeno con formazione di due radicali; cioè di specie che presentano un<br />
elettrone spaiato distribuito sugli orbitali molecolari<br />
-C÷H → -C • + H •<br />
un altro esempio di reazione a radicali liberi, anche se completamente diversa è quella<br />
che coinvolge l'O2 e il Fe 2+ dell'eme emoglobinico<br />
Fe 2+ ÷O=O → Fe 2+ + O=O<br />
C'è una probabilità finita e piccola che avvenga la seguente reazione collaterale, con<br />
la produzione del radicale libero superossido<br />
Fe 2+ ÷O=O → Fe 3+ * O=O •-<br />
L'emoglobina risultante è detta metaemoglobina che può essere riconvertita in<br />
emoglobina ferrosa; anche lo ione superossido può essere eliminato<br />
(2) Scissione eterolitica (eterolisi), che lascia entrambi gli elettroni su un atomo; se<br />
rimangono sul carbonio si forma una specie intermedia detta carbanione più un H +<br />
−C÷H → −C •- + H +<br />
se rimangono sull'idrogeno si formano un carbocatione, che è una specie elettroncarente,<br />
e uno ione idruro<br />
−C÷H → −C + + H •-<br />
I carbocationi e gli ioni idruro sono specie intermedie in molte reazioni catalizzate<br />
dalle deidrogenasi<br />
La formazione di un carbanione è generalmente più favorita, essendo il carbonio più<br />
elettronegativo dell'idrogeno ma, nelle reazioni enzimatiche, può anche generarsi<br />
l'altro meccanismo che viene determinato dai costituenti del sito attivo.<br />
Le vie di scissione eterolitiche coinvolgono intermedi ionici che si formano nella<br />
conversione del substrato/i in prodotto/i.<br />
Una grossolana classificazione dei reagenti in base alle loro caratteristiche consiste<br />
nella loro divisione in elettron-ricchi (nucleofili) o elettron-carenti (elettrofili).<br />
I nucleofili più comuni in biologia sono quelle molecole che contengono ossigeno, zolfo<br />
e azoto, per es.:<br />
H-O-H, R-O-H, R-O - , R-S-H, R-S - , R=N-H<br />
Gli elettrofili di importanza biologica disponibili per i numerosi nucleofili, sui<br />
substrati o nei siti attivi degli <strong>enzimi</strong> sono, al contrario, pochi. Questi spesso sono<br />
cationi metallici come Cu 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Mo 6+ , Zn 2+ , protoni (H + ), oppure atomi che<br />
hanno un guscio elettronico di valenza non completamente riempito, e alcuni cofattori<br />
come i derivati delle vitamine B1 e B6.
II -MODI DI AUMENTO DELLA VELOCITA' DI SCISSIONE DEI LEGAMI-<br />
I meccanismi con i quali gli <strong>enzimi</strong> aumentano la velocità delle reazioni chimiche<br />
possono essere classificati in quattro gruppi:<br />
- Facilitazione per effetto di prossimità<br />
- Catalisi covalente<br />
- Catalisi acido-base generale<br />
- Tensione, distorsione molecolare e cambiamento di forma<br />
Effetto prossimità<br />
Questo effetto, anche detto effetto di vicinanza, sta ad indicare che la velocità di<br />
reazione tra due molecole viene innalzata se esse vengono sottratte dalla soluzione<br />
diluita e portate in vicinanza l'una con l'altra nel sito attivo dell'enzima; ciò aumenta<br />
la concentrazione effettiva dei reagenti.<br />
Catalisi covalente<br />
In questo tipo di meccanismo sono coinvolte le catene laterali di aminoacidi, che<br />
presentano un certo numero di gruppi nucleofili:<br />
R-COO - , R-NH 2 , aromatico-OH, istidile, R-OH, R-S -<br />
Questi gruppi attaccano le parti elettrofile (elettron-carenti) dei substrati per formare<br />
un legame covalente tra il substrato e l'enzima, formando così un intermedio di<br />
reazione.<br />
Questo tipo di processo è particolarmente evidente negli <strong>enzimi</strong> che trasferiscono<br />
gruppi (transferasi, classe EC 2).<br />
Nella formazione di un intermedio legato covalentemente, l'attacco da parte del<br />
nucleofilo enzimatico al substrato può produrre acilazione, fosforilazione o<br />
glicosilazione del nucleofilo.
Catalisi acido-basica generale<br />
La catalisi acido-basica altro non è che il processo di trasferimento di un protone<br />
nello stato di transizione. Di per se essa non causa formazione di legami covalenti, ma<br />
una reazione enzimatica può anche implicare ciò nella sua globalità .<br />
L’esempio di catalisi acido-basica generale sotto riportata illustra il concetto appena<br />
menzionato.<br />
Reazione globale:<br />
Meccanismo di reazione A: Una base (OH - ) accelera la formazione del semiacetale nel<br />
modo seguente:<br />
Nota: L’OH - è riciclato nella reazione e può quindi essere considerato un catalizzatore<br />
nel vero senso della parola.
Meccanismo di reazione B: La reazione avviene anche con catalisi acida, che implica<br />
la formazione di un sale di ossonio, seguita dalla reazione con l’alcool, nel modo<br />
seguente:<br />
Nell’esempio precedente, la velocità di formazione del semiacetale viene innalzata in<br />
acido forte o in base forte. In altri casi soltanto uno dei due, o la base o l’acido, può<br />
agire da catalizzatore.<br />
La catalisi acido-basica può aumentare la velocità di una reazione al massimo di 100<br />
volte, ma insieme ad altri meccanismi che operano nel sito attivo di un enzima<br />
contribuisce considerevolmente all'aumento della velocità della reazione enzimatica.<br />
La forma protonata delle catene laterali aminoacidiche di acido glutamico, istidina,<br />
acido aspartico, lisina, tirosina e cisteina possono agire da catalizzatori acidi e nella<br />
forma non protonata da catalizzatori basici. E' ovvio che il tipo di catalisi<br />
effettivamente svolta dipenderà dal pKa nell'ambiente del sito attivo e dal pH a cui<br />
agisce l'enzima.
Tensione, distorsione e cambiamenti di forma<br />
La tensione nel sistema di legami dei reagenti, ed il rilascio della tensione nel<br />
momento in cui lo stato di transizione si converte in prodotti (ad es. il taglio di una<br />
molla compressa) può provocare un aumento della velocità di reazione.<br />
Le due seguenti reazioni chimiche implicano l’idrolisi di un legame di un estere fosforico.<br />
In condizioni standard, la reazione (a) e 10 8 volte più veloce della reazione (b). Ciò si spiega col<br />
fatto che il composto ciclico in (a) ha una considerevole tensione di legame (l’energia potenziale<br />
in questa configurazione è alta), che viene rilasciata con l’apertura dell’anello durante l’idrolisi.<br />
Questo tipo di tensione non è presente nel di estere in (b).<br />
Nel caso della catalisi mediata da un enzima, non soltanto può essere distorto il<br />
substrato, ma anche l'enzima con tutte le sue catene laterali aminoacidiche. Per cui il<br />
legame di un substrato ad un enzima coinvolge un'energia di interazione, che può<br />
facilitare la catalisi. L'aumento della velocità di catalisi deve anche prevedere una<br />
destabilizzazione globale del complesso enzima-substrato ed un aumento di stabilità<br />
dello stato di transizione. La destabilizzazione del complesso ES è dovuta alla<br />
distorsione degli angoli di legame e dei legami stessi. Nella destabilizzazione potrebbe<br />
essere pure coinvolta la desolvatazione di un gruppo carico attivo in un sito<br />
idrofobico.
CINETICA ENZIMATICA<br />
La cinetica enzimatica è quella branca dell'enzimologia che studia le modalità di<br />
azione di tutti i fattori che influenzano la velocità di catalisi enzimatica.<br />
I più importanti sono:<br />
a) la concentrazione dell'enzima;<br />
b) la concentrazione del ligando (substrati, prodotti, inibitori e attivatori);<br />
Ad esempio variando le concentrazioni dei substrati e dei prodotti è possibile dedurre<br />
il meccanismo cinetico della reazione, cioè in che ordine i substrati entrano ed i<br />
prodotti escono e se questo ordine e libero o obbligato.<br />
E' possibile stabilire i tipi di complessi ES ed EP che si possono formare ed in alcuni<br />
casi ci può dare informazioni sulla stabilità degli intermedi legati covalentemente<br />
all'enzima e non dosabili con i normali metodi di chimica analitica.<br />
E' possibile determinare i valori delle costanti cinetiche e, conoscendo le normali<br />
concentrazioni intra cellulari dei substrati, avere un'idea sull'andamento fisiologico<br />
della reazione.<br />
La cinetica di una reazione ci può indicare il modo con il quale l'attività di un enzima<br />
può essere regolata in vivo.<br />
La analisi cinetica ci può condurre alla definizione di un modello per una reazione<br />
catalizzata da un'enzima e viceversa i principi di cinetica enzimatica possono essere<br />
usati per scrivere le equazioni di velocità per un modello, che può essere testato<br />
sperimentalmente.
c) il pH;<br />
d) la concentrazione ionica;<br />
e) la temperatura.<br />
La temperatura può influenzare la velocità di una reazione catalitica<br />
Per valori di temperatura sino a 20 °C normalmente l’attività dell’enzima è sfavorita<br />
dalla eccessiva rigidità della struttura, dal basso grado di ionizzazione dei gruppi<br />
catalitici del sito attivo e dalla bassa energia cinetica delle molecole di substrato. Per<br />
temperature superiori ai 40-50 °C si può evidenziare una diminuita attività biologica<br />
dovuta alla instabilità della struttura proteica ed alla eccessiva energia cinetica dei<br />
substrati. A temperature superiori si potrà verificare la completa in attivazione per<br />
denaturazione.<br />
Ogni enzima è comunque caratterizzato da un valore di temperatura ottimale di<br />
funzionamento che è dovuto alla sua struttura ed ai gruppi catalitici che<br />
caratterizzano il sito catalitico. Per calcolare il valore di temperatura ottimale può<br />
essere utilizzata l’equazione di Arrhenius
Equazione di Arrhenius ed energia di attivazione<br />
La relazione esistente tra la costante di velocità della reazione, k, e l’energia di<br />
attivazione, E, è data dalla equazione di Arrhenius<br />
k = Ae -E/RT<br />
che può essere espressa in forma logaritmica:<br />
log k = -[(E/2.3 RT) 1/T] + log A<br />
dove A è una costante per la particolare reazione.<br />
In un semplica sistema in rapido equilibrio, Vmax/[E]t= Kp (Kcat) (Kcat costante di<br />
velocità di primo ordine)<br />
Il plott di log Vmax o log Kcat vs 1/T, permette di calcolare E (energia di attivazione<br />
della tappa catalitica)<br />
Le costanti termodinamiche ΔG 0 , ΔH 0 e ΔS 0 relative al legame tra il substrato e<br />
l’enzima possono essere anch’esse calcolate una volta calcolata la costante di legame<br />
Ka (Ka=1/Ks).<br />
ΔG 0 può essere ottenuta dalla seguente equazione<br />
ΔG 0 = -RTlnKa<br />
se Ka è misurata a due o più valori di temperatura, il plot di lnKa vs 1/T, conosciuto<br />
come plot di van’t Hoff, darà una retta la cui pendenza sarà -ΔH 0 /R e la cui<br />
intercetta sull’asse delle y sarà ΔS 0 /R grazie alla relazione:
lnKa = (ΔS 0 /R) – (ΔH 0 /RT)<br />
Quando questi fattori sono analizzati propriamente è possibile chiarire notevolmente<br />
la natura della reazione catalizzata dall'enzima.<br />
In particolare, uno studio degli effetti della variazione del pH e della temperatura,<br />
sull'attività dell'enzima, ci può dare informazioni sui residui aminoacidici presenti nel<br />
sito attivo.<br />
TEORIA DEL RAPIDO EQUILIBRIO (HENRI, MICHAELIS e MENTEN)<br />
La più semplice reazione di catalisi enzimatica coinvolge un singolo substrato e da un<br />
singolo prodotto. Un sistema del genere è chiamato, secondo la nomenclatura di<br />
Cleland Uni Uni.<br />
K1 K2 K3<br />
E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P<br />
K 1 K-2 K-3<br />
dove ES e EP sono chiamati complessi centrali.<br />
Per semplicità , assumiamo che esiste un singolo complesso centrale e che la reazione<br />
inversa sia tanto bassa da non essere considerata.<br />
K1 Kp<br />
E + S ⇔ ES → P<br />
K-1<br />
In condizioni di equilibrio rapido la velocità istantanea dipende dalla concentrazione<br />
di ES:<br />
v = k p [ES]<br />
dove k p è una costante di velocità catalitica.<br />
La concentrazione totale di enzima [E t ] è distribuita tra E ed ES per cui<br />
[E t ] = [E]+[ES]<br />
Dividendo entrambi i membri dell'equazione di velocità per [E t ] avremo:<br />
v/[E t ] = k p [ES]/ [E]+[ES] (1)<br />
Trovandoci alle condizioni d'equilibrio avremo che<br />
K s =[E][S]/[ES]=k -1 /k 1 ;<br />
[ES]= [S]/K s [E]<br />
e sostituendo nella (1)<br />
da cui<br />
se v = k p [ES]<br />
quando tutto l’enzima è legato: [Et] = [ES]
avremo che : k p [E t ]= Vmax<br />
dove Vmax rappresenta la massima velocità catalitica osservabile quando tutto<br />
l’enzima è legato, e l’equazione (3) diventerà:<br />
L’equazione di Michaelis e Menten ci da la velocità istantanea o iniziale relativa alla<br />
Vmax ad una data concentrazione di substrato ed è valida se v è misurata per<br />
brevissimi intervalli di tempo cosicché [S] rimane essenzialmente costante. Questo<br />
richiede che meno del 5% di [S] venga consumato durante la reazione<br />
STATO STAZIONARIO (BRIGGS E HALDANE)<br />
K1 Kp<br />
E + S ⇔ ES → E + P<br />
K-1<br />
Se la velocità di formazione di E + P da ES e maggiore della velocità di dissociazione<br />
di ES in E+S cioè: k p >k-1<br />
allora E, S e ES non saranno in equilibrio.<br />
A tal punto se consideriamo la concentrazione di S notevolmente maggiore di E,<br />
possiamo supporre che appena E ed S saranno in presenza l'uno dell'altro,<br />
immediatamente essi reagiranno formando ES, raggiungendo uno stato stazionario<br />
(steady-state) nel quale la concentrazione di ES rimane essenzialmente costante nel<br />
tempo<br />
Curva di progressione per una reazione catalizzata dove la concentrazione del reagente<br />
iniziale (substrato) [S]0 è significativamente più grande della concentrazione dell’enzima<br />
[E]t. Non appena il rapporto [S]0/[E]t incrementa, la regione regione relativa alla<br />
condizione di stato stazionario rappresenterà una sempre maggiore frazione del tempo<br />
totale di reazione. T rappresenta l’interavallo di stato pre-stazionario.
Da quanto detto risulta immediato che allo stato stazionario le velocità di formazione<br />
e di dissociazione si equivarranno per cui avremo:<br />
k 1 [E][S]=(k -1 +k p )[ES];<br />
[ES] = k 1 [E][S] /(k -1 +k p )<br />
il rapporto tra le tre costanti di velocità può essere definita come una singola costante,<br />
K m (Michaelis).<br />
K m =(k -1 +k p )/k 1<br />
che sostituita alla relazione ottenuta nel caso dell'equilibrio rapido ci darà<br />
La K m , è una costante dinamica o di pseudo-equilibrio che esprime la relazione tra le<br />
concentrazioni reali allo stato stazionario, piuttosto che le concentrazioni<br />
all'equilibrio. Il valore di questa costante corrisponde alla concentrazione di<br />
substrato che produce una velocità semi-massimale. Infatti quando [S]=K m avremo:<br />
Significato dei parametri di Michaeli-Menten<br />
Significato della Kcat (Kp): La costante catalitica<br />
La costante catalitica è detta spesso numero di turnover dell’enzima perché<br />
rappresenta il numero massimo di molecole di substrato convertito in prodotto per<br />
sito attivo per unità di tempo, o il numero di volte che l’enzima <br />
() per unità di tempo.<br />
La Kcat è una costante di velocità di primo ordine che si riferisce alle proprietà e alle<br />
reazioni dei complessi enzima-substrato [ES], enzima-intermedio [EX] e enzimaprodotto<br />
[EP].<br />
E’ possibile definire la costante catalitica, Kcat, di un enzima come:<br />
Significato della Km:<br />
La Km è la concentrazione di substrato alla quale v = Vmax/2. La Km è una costante<br />
di dissociazione apparente che può essere trattata come la costante di dissociazione<br />
complessiva di tutte le specie legate ali <strong>enzimi</strong>.
Significato di Kcat/Km:<br />
La costante di specificità<br />
La velocità di reazione per basse concentrazioni di substrato è data da<br />
Cioè Kcat/Km è una costante di velocità apparente di secondo ordine.<br />
L’importanza di Kcat/Km è che questo termine mette in relazione la velocità di<br />
reazione con la concentrazione dell’enzima libero piuttosto che con quella totale;<br />
infatti a basse concentrazioni di substrato l’enzima è in gran parte non legato [E] <<br />
[E]o<br />
per cui<br />
In conclusione Kcat/Km è una costante di velocità apparente di secondo ordine che si<br />
riferisce alle proprietà e alle reazioni dell’enzima libero e del substrato libero.<br />
PERCHE' DETERMINARE LA Km<br />
La determinazione del valore numerico della K m è interessante per le seguenti<br />
ragioni.<br />
a) la K m ci da un' indicazione approssimativa della concentrazione intra cellulare del<br />
substrato;<br />
b) poiché K m è una costante per un dato enzima, conoscere il suo valore ci permette<br />
di comparare <strong>enzimi</strong> di differenti organismi o di diversi tessuti dello stesso<br />
organismo;<br />
c) la presenza di un ligando che induce cambiamenti nel valore della K m è un modo<br />
per regolare l'attività di un enzima. Se il valore della K m valutata in vitro è<br />
fisiologicamente troppo elevata avremo una indicazione sulla presenza di un<br />
attivatore che in vivo diminuirà il valore della K m<br />
d) conoscendo la K m possiamo ottimizzare le condizioni di dosaggio ([S]>K m )e<br />
quindi determinare la Vmax, che è una misura di [E t ];<br />
e) la costante di Michaelis indica la convenienza per un enzima ad usare un substrato<br />
piuttosto che un altro. Il substrato ottimale è quello che ha il maggiore rapporto<br />
Vmax/K m .<br />
Non applicabilità dell’equazione di Michaelis-Menten<br />
Oltre a ragioni banali quali l’incapacità sperimentale di misurare le velocità iniziali,<br />
ci sono due ragioni principali per la no applicabilità dell’equazione di Michaelis-<br />
Menten.<br />
1) Inibizione da substrato: una seconda molecola di S si lega per dare un complesso<br />
ES2, cataliticamente inattivo<br />
v=[E]0[S]Kcat/Ks + [S] +[S] 2 /K’s
All’aumentare di [S] la v diminuisce<br />
2) Attivazione del substrato: si forma un complesso ES2 che è più attivo di ES.<br />
REAZIONI REVERSIBILI<br />
-EFFETTO DELPRODOTTO SULLA VELOCITA'DI AVANZAMENTO-<br />
In generale, tutte le reazioni catalizzate da <strong>enzimi</strong> sono reversibili.<br />
K1 K2 K3<br />
E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P<br />
K 1 K-2 K-3<br />
applichiamo l'equazione di Henri-Michaelis-Menten in ambedue le direzioni della<br />
reazione<br />
Quando [P]=0<br />
e quando [S]=0<br />
la direzione della reazione dipenderà dal rapporto [P]/[S] relativa alla K eq .<br />
Una equazione che esprima la velocità netta può essere derivata facilmente<br />
considerando la teoria dell'equilibrio rapido (dove K ms =K s e K mp =K p ).
GRAFICAZIONE DEI DATI DI VELOCITA' CONTRO <br />
L'equazione di Michaelis-Menten descrive la curva ottenuta dal plot dei dati di<br />
velocità iniziale in funzione di [S].<br />
La curva descritta è un'iperbole rettangolare con un angolo di curvatura costante ed<br />
indipendente dai valori di K m e Vmax. Conseguentemente il rapporto tra le<br />
concentrazioni di substrato a due valori di Vmax è costante per tutti gli <strong>enzimi</strong> che<br />
obbediscono alla legge di Henri-Michaelis-Menten.<br />
Ad esempio il rapporto tra la concentrazione di S richiesta per una Vmax del 90% e<br />
quella per una Vmax del 10% è sempre 81
ORDINE DI REAZIONE<br />
Se esaminiamo la curva v vs [S] troviamo tre tipi di variazioni di v all'incremento di<br />
[S]. A concentrazioni molto basse di substrato [S]100Km , la velocità è essenzialmente<br />
indipendente dalla concentrazione di S (c) (cinetica di ordine zero).<br />
Essendo [S] molto maggiore di Km, il valore della costante può essere ignorata e<br />
l'equazione semplificata diventerà<br />
v = Vmax<br />
La velocità sarà costante ed indipendente dalla concentrazione di [S]. I plots di [S] e<br />
[P] contro il tempo saranno lineari.<br />
A concentrazioni intermedie di substrato , la relazione tra v ed [S] non segue ne una<br />
cinetica di primo ordine ne di ordine zero (b).
METODI GRAFICI DI DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICI<br />
Poiché la curva che si ottiene dal plot di v contro [S] è un'iperbole, risulta<br />
impossibile determinare il valore di Vmax e conseguentemente quello di Km essendo<br />
questo eguale alla concentrazione di [S] che da 1/2 Vmax. Per permettere la<br />
determinazione delle costanti cinetiche, i dati sono usualmente plottati in una delle<br />
forme lineari descritte di seguito.<br />
Plot di Lineweaver-Burk o dei doppi reciproci "1/v vs 1/[S]"<br />
Questo metodo utilizza il reciproco della equazione di Michaelis-Menten<br />
Come si può vedere in figura, le migliori misurazioni dei dati cinetici si ottengono<br />
raccogliendo i dati su un intervallo di [S] che va da circa 0,5 Km fino a circa 5 Km.<br />
Quindi, uno svantaggio dei grafici di Lineweaver-Burk è che la maggior parte delle<br />
misurazioni sperimentali di [S], sono concentrate nella parte sinistra del grafico.
Inoltre, i dati riportati sulla parte destra e che influenzano maggiormente<br />
l’andamento delle retta di regressione, sono quelli meno precisi in quanto sono<br />
relativi a valori di [S] e conseguentemente di vo molto piccoli. Questo è un problema<br />
perché il piccolo errore presente in questi dati di velocità verrà enormemente<br />
amplificato nel momento in cui il dato verrà espresso in forma di reciproco.<br />
Plot di Hanes-Woolf "[S]/v vs [S]"<br />
L’equazione di Lineweaver-Burk può essere riarrangiata per ottenere l’equazione<br />
lineare per il plot Hanes-Woolf:<br />
moltiplicando ambo i membri dell’equazione per [S] essa diventerà:
Plot di Eadie-Hofstee "v vs v/[S]"<br />
Plot di Eisenthal e Cornish-Bowden (diagramma diretto lineare)
REGOLAZIONE DELL'ATTIVITA' ENZIMATICA<br />
-INIBIZIONE ENZIMATICA-<br />
L'attività di un'enzima può essere regolata dalla presenza di composti che legandosi<br />
all'enzima lo attivano o lo inibiscono. E' importante notare che l'alterazione del<br />
comportamento cinetico non è in relazione al meccanismo molecolare per mezzo del<br />
quale l'attivatore o l'inibitore agiscono sull'enzima.<br />
Una reazione enzimatica inibita è definita come una reazione la cui velocità viene<br />
rallentata dalla presenza di sostanze chiamate inibitori.<br />
Tali sostanze possono esplicare la loro azione combinandosi sia col substrato, sia con<br />
eventuali attivatori, sia con forme diverse dell'enzima.<br />
La forma di combinazione più frequente, è quella enzima-inibitore, dove viene quindi<br />
a diminuire la quantità di enzima disponibile per la reazione.<br />
Il fenomeno dell'inibizione è di notevole importanza, poiché l'inibizione rappresenta<br />
uno dei principali sistemi di regolazione del metabolismo (inibizione a "feed-back”)<br />
ed è la base di azione di molti farmaci.<br />
TIPI DI INIBIZIONE<br />
- Inibizione da prodotto e dead-end<br />
L'inibizione da prodotto è stata già trattata a proposito delle reazioni reversibili.<br />
Una sostanza che non sia un prodotto di reazione e che si combina con l'enzima libero<br />
[EI] o legato ancora al prodotto (EQI nel caso di meccanismi non UNI UNI) non<br />
suscettibile di reagire ulteriormente , è un inibitore dead-end.<br />
Gli inibitori, come tutti gli altri fattori che influenzano la velocità di una reazione<br />
enzimatica, modificano Km e/o Vmax.<br />
Per una reazione UNI UNI che segua l'equazione di Michaelis linearizzata<br />
(Lineweaver-Burk)<br />
1/v = 1/Vmax + (1/Ka) * 1/[A]<br />
vi sono tre tipi generali di inibizione reversibile, che vengono distinti in base alla<br />
famiglia di rette che si ottiene a varie concentrazioni di inibitore in un grafico dei<br />
doppi reciproci.<br />
Essi sono:<br />
1. Inibizione competitiva<br />
2. Inibizione incompetitiva<br />
3. inibizione non competitiva<br />
Questi tre tipi di inibizione hanno in comune la formazione di un complesso dead-end<br />
[EI] o di un complesso non produttivo [EAI], od entrambi.<br />
Esistono, inoltre, altri due tipi di inibizione: L’inibizione mista e l’inibizione a<br />
feedback.
INIBIZIONE COMPETITIVA<br />
Un inibitore competitivo è una sostanza che si combina con l'enzima libero in un<br />
modo che previene il legame del substrato. Ciò significa che il substrato e l'inibitore<br />
sono reciprocamente esclusivi, in quanto spesso competono per lo stesso sito. Un<br />
inibitore competitivo può essere un analogo, non metabolizzabile, del substrato, un<br />
derivato del vero substrato, o un substrato alternativo dell'enzima, o un prodotto<br />
della reazione.<br />
Un esempio classico di inibitore competitivo è l'acido malonico che inibisce la<br />
succinico deidrogenasi, la quale catalizza la ossidazione dell'acido succinico ad acido<br />
fumarico<br />
l'acido malonico somiglia all'acido succinico quanto basta per potersi legare al sito<br />
attivo dell'enzima.<br />
Nella figura sottostante il modello 1 illustra un classico esempio di inibizione<br />
competitiva nel quale un inibitore compete con un substrato per il sito attivo. I<br />
modelli 2-4 rappresentano altri modi con i quali un inibitore ed un substrato possono<br />
risultare mutuamente esclusivi: impedimento sterico (modello 2); impedimento<br />
sterico o competizione per un sito di legame comune (modello 3); copertura<br />
(overlapping) del sito di legame (modello 4); cambiamenti conformazionali indotti<br />
dall'inibitore e dal substrato rispettivamente al sito di legame ed al sito di inibizione<br />
(modello 5).
In poche parole l’inibizione é definita competitiva quando l'inibitore compete col<br />
substrato nel legarsi al sito catalitico dell'enzima libero (competitiva pura), ovvero<br />
quando, per effetto del binding dell'inibitore, si osserva una variazione<br />
conformazionale della molecola enzimatica, con diminuita affinità per il substrato<br />
(parzialmente competitiva). Lo schema di reazione è il seguente:<br />
L’enzima totale sarà presente in tre forme:<br />
L’equazione di velocità che si deriva è la seguente:<br />
e nella forma reciproca essa diventa:<br />
Nella figura sottostante è riportata la risposta cinetica dell’enzima in assenza ed in<br />
presenza dell’inibitore:<br />
Il plot dei dati cinetici nella forma di doppi reciproci da una serie di rette con<br />
pendenza crescente al crescere della concentrazione dell’inibitore e con medesimo<br />
valore di intercetta.
La distinzione di una inibizione competitiva pura da una parzialmente competitiva è<br />
possibile perché il replot del coefficiente angolare di ciascuna retta in funzione della<br />
concentrazione di I è lineare per l'inibizione competitiva pura, mentre l'altra da un<br />
replot iperbolico.
Inibizione incompetitiva<br />
In questo tipo di inibizione l'inibitore si lega ad EA formando un complesso EAI e<br />
non si lega all'enzima libero.<br />
Lo schema di reazione è il seguente:<br />
L’enzima totale sarà presente in tre forme:<br />
L’equazione di velocità che si deriva è la seguente:<br />
che nella forma reciproca diventa:<br />
Nella figura sottostante è riportata la risposta cinetica dell’enzima in assenza ed in<br />
presenza dell’inibitore:
Il plot dei dati cinetici nella forma di doppi reciproci da una serie di rette parallele al<br />
crescere della concentrazione dell’inibitore.<br />
In questo tipo di inibizione avremo una diminuzione della Vmax poiché una quota di<br />
E verrà sottratta alla reazione formando EAI. Anche il valore di Kmapp. sarà<br />
inferiore, poiché la formazione di EAI, rendendo indisponibile una certa quantità di<br />
EA, sposta l'equilibrio della reazione verso destra<br />
Il replot dei valori di intersezione delle rette del grafico precedente contro le<br />
concentrazioni di inibitore ([I]) risulterà lineare.
Inibizione mista<br />
In questo tipo di inibizione, substrato ed inibitore si legano a siti diversi dell'enzima;<br />
il legarsi di uno dei due può influenzare oppure no la costante di dissociazione<br />
dell'altro. L'inibitore può legarsi ad E come ad EA, così come il substrato può legarsi<br />
sia ad E che ad EI, con la formazione di un complesso ternario non produttivo.<br />
Lo schema del meccanismo di reazione è il seguente:<br />
si può osservare che ad ogni concentrazione di I unaq parte dell’enzima è presente<br />
come complesso non-produttivo EAI. L’enzima totale Et, è presente in 4 forme:<br />
Quando il complesso EAI è non-produttivo l’equazione di velocità che si ricava è la<br />
seguente:<br />
che in forma di doppi reciproci diventa:<br />
α è il fattore che esprime come varia Ka quando il substrato si lega ad EI anziché ad<br />
E, o come varia Ki quando l'inibitore si lega ad EA anziché ad E. α misura quindi<br />
l'interferenza tra i due diversi binding, essendo:<br />
α = Ki'/Ki.<br />
Il plot dei dati cinetici nella forma di doppi reciproci da una serie di rette con<br />
pendenza e punto di intersezione sull’asse y crescente al crescere della concentrazione<br />
dell’inibitore (vedi figura seguente).
Il replot dei valori di intersezione e delle pendenze delle rette del grafico precedente<br />
contro le concentrazioni di inibitore ([I]) risulterà lineare.
Inibizione non competitiva<br />
Si ha quando α = 1, cioè quando A ed I non interferiscono nel loro rispettivo legarsi<br />
all'enzima. Le corrispondenti equazioni di velocità sono identiche a quelle della<br />
inibizione mista ma con α = 1.<br />
l’equazione di velocità è la seguente:<br />
Nel grafico primario le rette si incrociano sulle ascisse, poiché varia la Vmax<br />
apparente, ma non la Km.
Nei relativi grafici secondari KiS e KiI coincidono, ciascuna essendo uguale a Ki.
Inibizione a feedback<br />
Molte vie biosintetiche sono regolate mediante inibizione retro inibizione; cioè , il<br />
prodotto finale/i o uno o più prodotti che sono quasi alla fine della via metabolica<br />
controllano il flusso metabolico inibendo uno o più reazioni precedenti della via<br />
metabolica. Spesso, la massima retro inibizione è ottenuta dall'azione combinata di<br />
diversi prodotti finali. Questo impedisce che un prodotto finale di una via metabolica<br />
caratterizzata da diverse ramificazioni blocchi definitivamente la stessa impedendo<br />
all'organismo la produzione di altri prodotti finali collaterali. Nel percorso<br />
metabolico mostrato di seguito, il prodotto finale X può inibire l'enzima E5; il<br />
prodotto finale I può inibire l'enzima E9 ed ambedue I ed X insieme possono inibire<br />
E1 in modo cooperativo, concertato, cumulativo o additivo.<br />
Inibizione cooperativa (sinergica): Ognuno dei prodotti finali, I ed X, inibisce E1.<br />
L'inibizione cooperativa implica che I ed X non siano mutuamente esclusivi.<br />
Ambedue i prodotti finali possono combinarsi con E1 simultaneamente per formare<br />
un complesso EIX e/o EIXS dead-end.<br />
Inibizione concertata (multivalente): Ambedue i prodotti finali non hanno da soli<br />
particolare effetto su E1, ma in presenza l'uno dell'altro, l'attività dell'enzima è<br />
marcatamente inibita. L'inibizione concertata è un caso estremo di inibizione dove il<br />
legarsi di uno dei prodotti finali incrementa notevolmente l'affinità dell'enzima per<br />
l'altro prodotto finale.<br />
Inibizione cumulativa (parziale): Ognuno dei due prodotti finali è un inibitore<br />
parziale. Cioè , livelli saturanti di I in assenza di X e viceversa non sono in grado di<br />
portare la velocità di reazione a zero. Questo implica che EI ed EX possono legare S,<br />
ma non bene come E (inibizione parzialmente competitiva), o che EIS o EXS sono<br />
cataliticamente attivi, ma non attivi come ES (inibizione parzialmente noncompetitiva),<br />
o ambedue (inibizione parzialmente mista). La vera inibizione<br />
cumulativa si osserva quando sia I che X sono inibitori parzialmente non-competitivi.<br />
Inibizione additiva: Una vera inibizione additiva di I ed X può esplicarsi soltanto se<br />
esistono due distinti <strong>enzimi</strong> (o siti catalitici) ognuno sensibile soltanto ad uno dei due<br />
inibitori. Così, una concentrazione saturante di I o X da una inibizione parziale<br />
mentre la contemporanea presenza dei due darà una azione sinergica.
Feedback inhibition. The conversion of L-threonine to L-isoleucine is catalyzed by a<br />
sequence of five enzymes (E1 to E5). Threonine dehydratase (E1) is specifically<br />
inhibited allosterically by L-isoleucine, the end product of the sequence, but not by<br />
any of the four intermediates (A to D).<br />
Regolazione Allosterica
Regolazione per modifica covalente
Multiple regulatory phosphorylations. The enzyme glycogen synthase has at least<br />
nine separate sites in five designated regions susceptible to phosphorylation by one of<br />
the cellular protein kinases. Thus, regulation of this enzyme is a matter not of binary<br />
(on/off) switching but of finely tuned modulation of activity over a wide range in<br />
response to a variety of signals.
Regolazione attività per modifica strutturale