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Figura 18: Aumento esponenziale dell’amplificato delle subunità G in funzione del numero di cicli d’amplificazione. Le righe tratteggiate evidenziano la fase esponenziale delle curve, che sono rappresentative e scelte tra 3 esperimenti. Negli inserti sono riportati gel rappresentativi della PCR per ogni subunità, indicanti il progressivo aumento di intensità delle bande all’aumentare dei cicli termici. R 2 : Coefficiente di correlazione. 53
Figura 19: Espressione dell'mRNA, nel punto di flesso, delle subunità delle proteine G nelle cellule HTR-8/SVneo. La reazione di amplificazione è stata bloccata nel punto del flesso: per Gq 29 cicli, per Gs 22 cicli, per Gi 28 cicli, per Go 28 cicli. Linea M: DNA marker 100 bp. Figura 20: Analisi semiquantitativa dell’espressione del mRNA delle subunità G. I dati rappresentano le medie SEM di almeno 3 esperimenti. I dati sono normalizzati con il controllo 18S rRNA. p 0.001 rispetto a Go, ° p 0.01 rispetto a Gi, ‘ p 0.05 rispetto a Gi, ** p < 0.05 rispetto a Go. (ANOVA, seguito dal test di comparazione multipla di Bonferroni). Espressione proteica delle subunità delle proteine G L’espressione proteica delle subunità α delle proteine G e la loro quantificazione sono state determinate mediante la tecnica western blotting, utilizzando come controllo interno -actina. La - actina e le isoforme Gαq, Gαs, Gαo e Gαi sono state determinate con anticorpi policlonali specifici riportati nella tabella IX in Materiali e Metodi. I risultati di immunoblotting riportati in Fig.21 dimostrano la presenza, sia nelle cellule HTR-8/SVneo che nei villi coriali, delle seguenti subunità : 1. Gαq con un peso apparente di 42 KDa; 2. Gαs con due bande di 42 e 46 KDa; 3. Gαi con un peso apparente di 40 KDa; Gαq Gαs Gαi Gαo M La subunità Gαo non è stata rilevata nelle cellule HTR-8/SVneo, mentre nel tessuto villoso si evidenzia una banda con peso apparente di 39 KDa, associabile a questa subunità. La Fig.22 riporta 54
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