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Figura 15: Aumento esponenziale dell’amplificato delle isoforme di AC in funzione del numero di cicli d’amplificazione. Le righe tratteggiate evidenziano la fase esponenziale delle curve, che sono rappresentative e scelte tra 3 esperimenti. Negli inserti sono riportati gel rappresentativi della PCR per ogni isoforma, indicanti il progressivo aumento di intensità delle bande all’aumentare dei cicli termici. R 2 : Coefficiente di correlazione. 51
M AC6 AC9 AC3 AC5 AC7 Figura 16: Espressione dell'mRNA, nella fase esponenziale, delle isoforme di AC. La reazione di amplificazione è stata bloccata nel punto del flesso: per AC3 31 cicli, per AC5 30 cicli, per AC6 28 cicli, per AC7 28 cicli, per AC9 28 cicli. Linea M: DNA marker 100 bp. Figura 17: Analisi semiquantitativa dell’espressione del mRNA delle isoforme di AC. Nell’istogramma sono riportate le medie SEM di almeno 3 esperimenti normalizzate con il controllo 18S rRNA. p 0.001 rispetta AC9, AC3, AC5, AC7; p 0.001 rispetto AC7; ° p 0.01 rispetto AC5. (ANOVA, seguito dal test di comparazione multipla di Bonferroni). Analisi SQ-RT-PCR delle subunità delle proteine G L’analisi semiquantitativa delle proteine G è stata condotta utilizzando la stessa procedura descritta per l’unità catalitica dell’adenilil ciclasi. Nella Fig.18 sono riportate le curve esponenziali e i valori di EC50, relativamente alle sottofamiglie delle proteine G umane, Gαq, Gαs, Gαi e Gαo. Nella Fig.19 è illustrata la migrazione dei prodotti amplificati nel punto di flesso. I risultati ottenuti mostrano una differenza significativa nell’espressione dell’mRNA delle isoforme Gαq e Gαs rispetto alle isoforme Gαi, Gαo. Un’ulteriore differenza si evidenzia tra Gαi e Gαo , infatti la prima è significativamente più espressa rispetto alla seconda (Fig.20). 52
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