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alla quantità di mRNA di partenza. Per determinare il gene controllo appropriato al nostro modello
sperimentale, sono state confrontate le varianze associate ai valori dell’EC50, ottenuti dalla media di
almeno 4 esperimenti, dei controlli analizzati. Come si può osservare nella Fig.14, l’amplificato per
il gene 18S rRNA mostra un livello d’espressione più uniforme, cioè una varianza minore, rispetto
agli altri controlli, e per questo è stato utilizzato come gene huosekeeping nei passaggi successivi
dell’analisi semiquantitativa.
A
B
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 C B M
dati normalizzati
18 s rRNA Β-Actina GAPDH
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Dispersione housekeeping
18s rRNA
Β-Actina
GAPDH
Figura 14: A: Espressione genica, in condizioni ottimali (EC50) dei geni housekeeping 18S rRNA, -Actina e GAPDH
in cellule HTR-8/SVneo. I numeri da 1 a 4 indicano 4 diversi cDNA impiegati nelle prove. La reazione di
amplificazione viene bloccata al ciclo 19, 24, 24 rispettivamente (punto di flesso o EC50). Linea M: DNA marker 100
bp; Linea C: controllo negativo PCR; Linea B: controllo negativo RT-PCR.
B: Dispersione dei dati normalizzati relativi ai geni housekeeping 18S rRNA, -Actina e GAPDH al punto di flesso. I
valori sono ottenuti dividendo la densità ottica di ogni amplificato per il valore più basso ottenuto.
Analisi SQ-RT-PCR delle isoforme di adenilil ciclasi
Come per il gene controllo, per le isoforme AC3, AC5, AC6, AC7 e AC9 abbiamo costruito
le rispettive curve esponenziali (Fig.15) ed estrapolato il numero dei cicli di amplificazione al flesso
(EC50); i valori di densità ottica ottenuti sono stati normalizzati con il controllo interno, 18S rRNA,
prima di essere confrontati. I risultati ottenuti (Fig.16) dimostrano che l’isoforma AC6 è la più
espressa nella linea cellulare HTR/8 SV-neo e che la differenza di espressione tra questa isoforma e
le altre investigate (AC3, AC5, AC7, AC9) è altamente significativa (p0.001); l’isoforma AC9
risulta significativamente più espressa rispetto ad AC5 e AC7, mentre AC3 risulta
significativamente più espressa rispetto ad AC7 (Fig.17).
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