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cellule HTR-8/SVneo (dati non riportati). Infine, nessun amplificato, relativo alle isoforme AC1, AC2 e AC8, è stato rilevato nelle cellule HTR-8/SVneo e nel tessuto villoso umano. M 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 B1 B 2 AC3 AC5 AC6 Figura 12: Espressione dell'mRNA per le isoforme dell’adenilil ciclasi in cellule HTR-8/SVneo e in villi coriali umani. Linea M: DNA marker 50 bp; Linea 1: cDNA di cellule HTR-8/SVneo; Linea 2: cDNA di tessuto villoso umano; Linea B1: controllo negativo RT-PCR, HTR-8/SVneo; Linea B2: controllo negativo, villi coriali umani. AC7 AC9 Valutazione dell’espressione genica delle subunità delle proteine G Mediante la stessa tecnica abbiamo esaminato anche la presenza dell’mRNA per le varie subunità delle proteine G in cellule HTR-8/SVneo e nei villi coriali umani. I risultati ottenuti dimostrano la presenza dell’mRNA di tutte le isoforme investigate, in entrambe le preparazioni: s (323 bp), i (474 bp), o (312 bp) e q (260 bp) [122] (Fig.13). M 1 2 1 2 1 2 1 2 B1 B2 Gα s Gα q Figura 13: Espressione dell'mRNA per le diverse subunità G in cellule HTR-8/SVneo e in villi coriali umani. Linea M: DNA marker 100 bp, Linea 1: cDNA di cellule HTR-8/SVneo, Linea 2: cDNA di tessuto villoso umano, Linea B1: controllo negativo RT-PCR, HTR-8/SVneo, Linea B2: controllo negativo RT-PCR, villi coriali umani. Implementazione della tecnica SQ-RT-PCR Il primo step nell’analisi semiquantitativa è l’individuazione di un gene housekeeping, un gene che è espresso in tutti i tipi cellulari sempre allo stesso livello. Per i geni controllo da noi investigati (18S, -Actina e GAPDH) sono state studiate le curve esponenziali, ed è stato estrapolato il punto di flesso (EC50), ossia il punto in cui l’amplificato è direttamente proporzionale Gα o Gα i 49
alla quantità di mRNA di partenza. Per determinare il gene controllo appropriato al nostro modello sperimentale, sono state confrontate le varianze associate ai valori dell’EC50, ottenuti dalla media di almeno 4 esperimenti, dei controlli analizzati. Come si può osservare nella Fig.14, l’amplificato per il gene 18S rRNA mostra un livello d’espressione più uniforme, cioè una varianza minore, rispetto agli altri controlli, e per questo è stato utilizzato come gene huosekeeping nei passaggi successivi dell’analisi semiquantitativa. A B 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 C B M dati normalizzati 18 s rRNA Β-Actina GAPDH 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Dispersione housekeeping 18s rRNA Β-Actina GAPDH Figura 14: A: Espressione genica, in condizioni ottimali (EC50) dei geni housekeeping 18S rRNA, -Actina e GAPDH in cellule HTR-8/SVneo. I numeri da 1 a 4 indicano 4 diversi cDNA impiegati nelle prove. La reazione di amplificazione viene bloccata al ciclo 19, 24, 24 rispettivamente (punto di flesso o EC50). Linea M: DNA marker 100 bp; Linea C: controllo negativo PCR; Linea B: controllo negativo RT-PCR. B: Dispersione dei dati normalizzati relativi ai geni housekeeping 18S rRNA, -Actina e GAPDH al punto di flesso. I valori sono ottenuti dividendo la densità ottica di ogni amplificato per il valore più basso ottenuto. Analisi SQ-RT-PCR delle isoforme di adenilil ciclasi Come per il gene controllo, per le isoforme AC3, AC5, AC6, AC7 e AC9 abbiamo costruito le rispettive curve esponenziali (Fig.15) ed estrapolato il numero dei cicli di amplificazione al flesso (EC50); i valori di densità ottica ottenuti sono stati normalizzati con il controllo interno, 18S rRNA, prima di essere confrontati. I risultati ottenuti (Fig.16) dimostrano che l’isoforma AC6 è la più espressa nella linea cellulare HTR/8 SV-neo e che la differenza di espressione tra questa isoforma e le altre investigate (AC3, AC5, AC7, AC9) è altamente significativa (p0.001); l’isoforma AC9 risulta significativamente più espressa rispetto ad AC5 e AC7, mentre AC3 risulta significativamente più espressa rispetto ad AC7 (Fig.17). 50
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