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Western blotting
Le proteine estratte erano determinate utilizzando uno specifico kit cromogenico (Western
Breeze, Invitrogen). Le proteine (80 µg) erano risospese in un gel di poliacrilamide Bis-Tris-HCl
(4-12%), separate mediante elettroferesi (SDS-PAGE), poi trasferite su membrane PVDF. Gli
immunoblots erano eseguiti usando gli anticorpi policlonali per EP2, EP4, Gαq, Gαs e Gαo diluiti
(1:200) con un kit per diluire l’anticorpo primario. Per determinare gli anticorpi legati, era aggiunto
alle membrane il siero anti-coniglio con IgG di capra coniugato alla perossidasi, e il sistema era
incubato a temperatura ambiente per 45 min. Il peso molecolare era determinato usando specifici
marcatori.
Determinazione dell’attività dell’enzima adenilil ciclasi
L’attività adenilil ciclasica è determinata secondo il metodo di Clement-Cormier [132]. In
breve: le membrane (circa 50 µg di proteine/campione) vengono preincubate per 20 min a 0°C in
tampone Tris-HCl 75 mM, pH 7.4, contenente MgSO4 1 mM e in presenza di 3-isobutil-1-
metilxantina 10 mM, GTP 500 µM, ed EGTA 1 mM, come chelante del Ca 2+ residuo nella
preparazione delle membrane, più le sostanze test. Dove specificato, la guanosina 5’-O-tiotrifosfato
(GTPαS) è addizionata alla miscela standard di analisi in assenza di GTP. La reazione viene iniziata
con l’aggiunta di ATP 500 µM ed i campioni sono incubati per 10 minuti a 30°C. La reazione viene
bloccata mediante bollitura per 2 minuti. I campioni vengono congelati per almeno 24 ore prima del
dosaggio del cAMP. I campioni vengono scongelati e centrifugati per 10 min a 3.000 x g e 100 µl di
supernatante sono utilizzati per il dosaggio del cAMP, secondo il metodo riportato
precedentemente.
Analisi statistica
I dati erano esaminati mediante ANOVA, seguita dal test a comparazione multipla di
Bonferroni, dal post-test di comparazione di Dunnet o dal t-test di Student a due code, come
appropriato. Le differenze erano considerate significative in presenza di p