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SQ-RT-PCR La PCR semi quantitativa (SQ-RT-PCR) permette di quantificare indirettamente il numero di copie di DNA o RNA in un dato campione biologico [124] [125]. Essenzialmente questa tecnica prevede l’amplificazione, con primer specifici, dei diversi target esaminati; le intensità relative all’amplificato vengono poi rapportate all’intensità del segnale di uno standard o controllo interno. Poiché l’intensità del segnale è proporzionale al numero di copie del nostro target le diverse concentrazioni vengono così determinate. I campioni vengono rapportati ad un controllo interno che è un housekeeping gene [126] [127]. Un buon controllo interno, per definizione, deve avere un livello d’espressione costante, assumendo che le condizioni sperimentali non ne alterano i livelli d’espressione [128]. Nel nostro studio sono stati testati, usando primer specifici, GAPDH, -actina e 18S rRNA (Tabella VII); per prima cosa sono stati ottimizzati i cicli termici e le condizioni di amplificazione (Tabelle VIII e IX); succesivamente è stato determinato il range di cicli nel quale i geni possono essere studiati, partendo dal minimo numero necessario per visualizzare il prodotto di PCR fino al plateau che rappresenta il limite oltre al quale per ogni successivo ciclo termico non c'è un aumento dell'amplificato; in fine, per i differenti standard, è stata calcolata la varianza. Tabella VII: Sequenze dei primer specifici per i geni housekeeping e dimensioni dell’amplificato; [129]; [130]; [131]. controlli paia basi sequenza dei primers (5'→3') 18S -Actina ° GAPDH 495 463 492 F GGA CCA GAG GCA AAG CAT TTG CC R TCA ATC TCG GGT GGC TGA ACG C F GGC GAC GAG GCC CAG A R CGA TTT CCC GCT CGG C F ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC R TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA Dopo aver determinato il controllo interno migliore è stata eseguita l’analisi dei geni indagati. L’immagine del gel è stata acquisita usando “Quantity one” e l’intensità delle bande (densità ottica) è stata espressa in funzione del numero di cicli d’amplificazione costruendo, per ogni proteina d’interesse e per il controllo interno, le curve esponenziali (versione 2.0 Graph Pad Inc). 37
Dall’analisi della curva esponenziale, ottenuta da almeno sei punti, è stato ricavato il valore dell’EC50 che corrisponde al valore del flesso nella fase esponenziale. In questo punto l’espressione dei diversi geni può essere confrontata. Quindi ogni valore di densità ottica è stato normalizzato con lo standard ed i valori ottenuti sono stati confrontati tra loro mediante lo studio statistico ANOVA. In ogni esperimento sono stati utilizzati campioni ottenuti da estrazioni differenti, in modo da differenziare i livelli d’espressione, e ogni esperimento è stato ripetuto almeno 3 volte. Tabella VIII: Concentrazioni ottimali dei geni housekeeping 18S rRNA, GAPDH, -Actina. Buffer MgCl2 dNTP Primer F R Taq cDNA 1X 1.5mM 0.2mM 0.3mM 1U 1l Tabella IX: Cicli termici ottimali dei geni housekeeping 18S rRNA, GAPDH, -Actina. denaturazione annealing estensione numero di cicli al flesso 94°C 30'' 58°C 30'' 72°C 40'' 19 38
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