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sostanze test. La fluorescenza era determinata usando uno spectrafluor (Tecan) a 485 nm. La
percentuale di cellule migrate era ottenuta dividendo la quantità di fluorescenza rilevata nella parte
inferiore per quella totale determinata nella parte superiore al tempo zero.
Immunocitochimica
Le cellule HTR-8/SVneo erano incubate in mezzo senza siero per 24 h e cresciute su un
vetrino coprioggetti. La vitalità cellulare veniva testata mediante il Trypan Blu test, prima della
fissazione. Le cellule aderenti erano pre-fissate con paraformaldeide al 3% per 3 min, lavate in un
tampone fosfato (PBS, 0.01M, pH 7.2) e marcate con diversi anticorpi di coniglio contro i recettori
di SRIF (diluizioni di lavoro 1:500, 1:1000, 1:5000 in PBS contenente BSA allo 0.5% e sodio azide
allo 0.1%) per 1 h a temperatura ambiente, senza permeabilizzazione cellulare. In seguito alla
marcatura, le cellule erano lavate in PBS e incubate con IgG di capra anti-coniglio marcate con
FITC (diluite 1:1000 in PBS) per 1 h a temperatura ambiente. I controlli includevano marcatura con
solo l’anticorpo secondario, in assenza di quello primario. Le cellule venivano lavate in PBS e
acqua distillata, immerse in PBS/glicerolo (1:1) e osservate al microscopio (Nikon Eclipse TE
2000-S, Olanda) con una lunghezza d’onda (488 nm) corrispondente alla fluorescenza della FITC.
Le immagini erano catturate con DS-L1 Camera Control Unit (Nikon).
RT-PCR
L’RNA cellulare totale era estratto mediante l’uso di Trizol dalle cellule HTR-8/SVneo ed
era sciolto in H2O contenente dietilpirocarbonato e quantificato mediante spettrofotometria. 2 µg di
RNA totale era retrotrascritto usando 200 U di M-MLV e 1.5 µg di random primers, in 20 µl di
volume di reazione a 37° C per 1 h.
La reazione di amplificazione era effettuata usando 0.5 U di Platinum Taq DNA Polimerasi
in un volume di reazione di 25 µl contenente Tris-HCL 10 mM, pH 8.3, KCl 50mM, MgCl2 1.5
mM, dNTP 0.2 mM, 0.4 µM di ogni primer specifico per l’amplificato indagato. Nelle Tab. I II III
sono riportale le sequenze specifiche dei primer utilizzati assieme alle dimensioni dell’amplifacato.
Ogni ciclo di reazione consisteva di una denaturazione iniziale, un appaiamento e un allungamento
eseguito con l’utilizzo di un termociclatore. Per ogni cDNA indagato è stato ottimizzato il ciclo
termico in base alle proprie caratteristiche, le Tab. IV V VI riassumono le condizioni ottimali di
amplificazione. I prodotti di PCR erano separati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%
contenente bromuro di etidio 0.05%. Le quantità relative dei prodotti di amplificazione erano
determinate mediante densitometria digitale, usando il programma “Gel Doc 2001”.
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