Penelitian Bioteknologi dan Marka Molekuler untuk ... - Hortikultura

Penelitian Bioteknologi dan MarkaMolekuler untuk MeningkatkanDaya Saing dan Nilai TambahProduk HortikulturaRapat Kerja Puslitbang Hortikultura16 – 18 April 2012

Hortikultura:Cabang ilmu pertanian yang mempelajari budidayabuah-buahan, sayuran dan tanaman hiasPeranan:• memperbaiki gizi masyarakat• memperbesar devisanegara• memperluas kesempatan kerja• meningkatkan pendapatan petani• pemenuhan kebutuhan keindahan dan kelestarianlingkungan

Sifat hasil hortikultura:• tidak dapat disimpan lama• perlu tempat lapang (voluminous)• mudah rusak (perishable) dalam pengangkutan• melimpah pada suatu musim dan langka pada musimyang lain• fluktuasi harganya tajam(Notodimedjo, 1997)Isu tanaman hortikultura:• kualitas• produksi• kematangan• senesen

Faktor lain untuk pertimbangan:• Perubahan iklim• Preferensi konsumen• Perhatian konsumen• Regulasi

Sifat yang diinginkan:• Perbaikan rasa, tekstur dan warna…..preferensi konsumen• Lama penyimpanan/Delayed ripening…pematangan buah• Peningkatan nutrisi and manfaat kesehatan….preferensikonsumen• Better food processing…..mengurangi kehilangan hasil• Tanaman tahan OPT…kualitas

Bioteknologi untuk HortikulturaTanaman dengan sifat yang diinginkan

Bioteknologi:Aplikasi teknologi pertanian yang menggunakansistem biologi, makhluk hidup atau turunannyauntuk membuat atau memodifikasi produk untukpenggunaan tertentu(Convention on Biological Diversity)

Aplikasi Bioteknologi:1. Analisis diversitas2. Identitas individu3. Kultur jaringana. Kultur anterab. Penyelamatan embrio (Embryo rescue)4. Molecular breedinga. Marker-assisted breedingb. Transformasi genetik

Kultur Jaringan Untuk Pemuliaan‣Androgenesis (kultur anthera/serbuk sari)/gynogenesis(kultur ovary/sel telur)• Mendapatkan galur murni secara instan untukseleksi pemuliaan• Populasi haploid ganda untuk pemetaankromosom

‣Penyelamatan embryo• Persilangan Interspesieso Hambatan penyerbukan• Hambatan pra-fertilisasi• Hambatan pasca-fertilisasi penyelamatan embryo• Komoditas seperti anggrek berbiji banyak tidaksulit mendapatkan silangan interspesies• Kebanyakan komoditas berbiji sedikit• Transfer sifat ketahanan/toleransi biotik dan abiotikserta soluble solido Ketahanan terhadap Antracnose dari C. baccatumke C. annuum

Penyelamatan EmbryoJeruk non-apomicticHibrida antara apel and pearAleza et al 2010 Banno et al 2003

Aplikasi Lain Kultur Jaringan Tanaman• Penanaman planlet dalam kondisi steril• Bebas pathogen• Perbanyakan planlet dalam jumlah besar• Penyeragaman tahap pertumbuhan dankeunggulan tanaman (sinkronisasi produksi)

Sumber Daya GenetikPemuliaan berbasis pendekatanmolekularKarakterisasiEvaluasiSeleksiPengembanganteknologi:• Pemetaan;• Design marka;• Kloning gen;• Seleksi berbasismarka molekular;• Tanpa halangangenetis;• Tidak diregulasi• Rekayasa genetik;• Melalui regulasiVarietas Unggul Baru

gi|297598437|ref|NC_008394.4| Oryza sativa Japonica Group DNA, chromosome 1,complete sequence, cultivar: NipponbareCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAACCCTAAACCCTAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACAGCTGACAGTACGATAGATCCACGCGAGAGGAACCGGAGAGACAACGGGATCCAGGCGCCAGCGACGGATCCGGGCGAGAGGGGAGTGGAGATCATGGATCCGTGCGGGAGGGGAAGAAGTCGCCGAATCCGACCCTCCCATCGCCATCGACAGTAGGTCTGCGCGAGAGGGGCACCGGCGCTGGCTCTGAGCGAGATGCAACGCCGGCCGGCTTGGAGAGTAACTCAAGAGAGACAGAATGGAAGATAGAGAACAAGAGAGTGAGAGGATAAGGATATAGACCAGACCACACAATTTTCTCTTCTTTTTAACTTTGTATTAAGATCTTTTATGGAACATCTTTTATTGTTGATATCAAAATAACTGAAACTTATACTTTAATATTTTTTGAGACAAAAAGTAACAATCGTAAAAAAAAGTTCCACGAGAGTTACCCCACCACCCATGTCTCGAGCCGACCAGATCTGCCGCCCACGACCCGAGTCATCGTTGGATCCACCACCCACAACCCGCGACCGAGCTACGCCTCCTGTGGATTGATGCCACTGCCCTGAGCTTCACTGCCGGTACTGTCGCTCGCGACCCGAGCTCCGCCGCTGGTACCGTCGCCCACAACTCAAGCTGTGTTGCCACTAGAGAAAAAGGAGGCGAGAGCGAGGGCAAAACGAGGCAAGGCGTGGCGTGACATGGTGTGACTGGTTGGTCAATTAGCCGACAATGGATCCACCGCCCATGAACCGAGCCACCGTTGGATCCGCCACCCGCAGATTCGGCTGTCCCCTCTCCCTCAACTTATTCTTCCTCTCTTGATTCAACGGGAGGAGTGGCAACTGACGGCAACAGAGCTCGCCTCATGGGCGATGGAACCAGCGGCGAAGCTCGGGGCGGAGGGGTTGAGCCACATGAGGCGATGGCGACAATGAGGCGAGACATGGCGTGGCTGGCTGTTACATTTTGTTTTGATGAAAAGCATAACCATGCGGATGATATTTTTATTATAGACTAGAGATGATTATTGAATAGACATGCTCTTAACCATTTTTAACTCTAATTCCACCTACACTATGAATATTAGAAAAAAAATACAATGTATACTCTTAAGAAGTTTGCGCTATCATAGCCATCATACTCATTAAAACATTTTTCTTCACATGTTGCAACGCATGGGCATTTTGCTAGTTAGAGAATAAAAATAAATTTGTAGGTAAAACTTTTATATATGTGTTCTCGGTGACTTAAAAGCCAATGCTTAAAAATAAACTACGTTAAAAATATCTTAAAATCAATATTAAAATTAAGTTTGAAAATTTAAATTTTGGCTTTTTCTTTGACTGAATAGGCCATCTGATGGAAGCTGAATAAGCCATCCGATGGGAGCTGTGACAGTGATGAAAAGGAGAGCAGTAAGAGAGCAGTAAGAGCATCCCAGCAGCTCCTCTATCTAGGCATCCATCCGATATTTGGAGTATGGAGGAGAAAAACAGTGCTCCAGCAGAGTCTCCATCACATGCTTCATTTTTGGAGGTCCTCCAAATCTAGCCCTTCCCAAGCCAAATATGGAGGTTCTCTCTCCTCACTCCATCCTCAACTACCCACTTCCCAAGATTTTTTTTGAGTGGTGAAAGGTGAGAGGAATAGGAGTAAAAATGTGTGGTAGTTGAAAAATATTACTAAAATATAGGATGTTGGTATATGTAGGATGTAATATGAATGATCTGTTGGAGTGAAAAGTTATATAGAGTGGAAATCTTTTTAAATGGCCATCCAAATGAGAGTATGAAATTTAGATGAGCTGGTGGGGATGCTCTAAGAGAACGAGAGAAGCACAGAGCAGATAAACCACACCCACAGGCACCACCGTCCTTGTTGGTAATGAAGAAGACGAGACGACGACTTCCCCACTAGGAAACACGACGGAGGCGGAGATGATCGACGGCGGAGAGAGCTACAGAAACATCGATGCCTCCTGTCCAATCCCCCCATCCCATTCGGTAGTTGGATTGAAGACTACCGAATAAGAGAAGCAGGCAGGCAGACAAACCCTTGAACCAAGGAGTCCTCGCTGAGGAAGCTTTGGATCCACGACGCAGCTATGGCCTCCCCGCCCACCAGGCCGCCAGCCACAACCAGCTGACTAGGTAGGCTTCCTAGGTAGGGATCCCATCCCTTCGATTCCCTACTCCCTCCCCCGATTGATTTGATTTGATTTGATTTAATTCGATTGCCTGCTTTTCAGGTCGCATGCATCATCAGATTTCAATCTCCCTTCGTTCCCTGTCCCTAATCCAATACCAATAGGGAGCAATCAGCTGCTCCTCGACGGCGAGGGAGATGTCGTCGGCCGCGGGCCAAGACAACGGAGATACCGCTGGGGACTACATCAAGTGGATGTGCGGCGCCGGTGGCCGTGCGGGCGGCGCCATGGCCAACCTCCAGCGCGGCGTTGGCTCCCTCGTCCGTGACATTGGCGACCCCTGCCTCAACCCATCCCCCGTTAAGGTTCGCCTACTCCTACTCTAGCTCCATATGGATATGGATTCGATTAGCTGTCTACATTCTATGCCATCAATTTGTTTTCCATCACTTCTCATTATACATCTCCATTGCTCTCTAAATTAAGGCTTCTCTAGCTCTATCCTATATATATACTAGTACTCCGTATATGATTCTGCTTCATCACTTATTTATTCATCATCATACCGTGAAGCTGTATAAGTCCTGTTATTTGTCATTTGGCATATGTTGTATAGATAACACTTTCAGCCCAGGGACTTTCTATTGCCACTTTTATACATATACAATCAACATTTAGCATATGTATATCCTGTACCGCTCAGTTGTACTGCTGCTTTGAAGATAATGTTTGCAAAACATATGAGCTCACACACGAGGCTAGATGCTGCATAGGCTGCACAATGGGGTAGCCATTTTGATACTTCTTAATGCTATTTATGCTGGTCCAAATGTTCATTGGTAGCCTCAGGCAGAGAATTTTAGGGAGATATTATGTCAAACTCCCTGGATTCACTATGATTATACAATATTACCCATTCAATCCATTCAAATAAATTTCCAGGTCAACTCACATATTGTACTGAAAGAAGACTAATTTGCACTAATCATATCCTTTTATCCACCAGAGTATATGAGATTGTCTTCTATATGCAATTTACTTCATATCGACATTTTTCTGCAGAATTGCAAAACTGACGCCTTGTTTTCCATCTGGAATTGTGCAGGGGAGCAAAATGCTCAAACCGGAAAAATGGCACACATGTTTTGATAATGATGGAAAGGTCATAGGTTTCCGTAAAGCCCTAAAATTCATTGTCTTAGGGGTGAGTTAATTGTTTCTTTTGTGCTTCAAAAACTTGTTTTTTCATGTATTTTAGCTGTTGAAGGGTGTGGATTTTTTTTTCAGTCTTAATACATTACCTTTTAGAGCATGATGCCCCACGCGCCATTTGTGAATGTGTAAAATAGGGAAGATCAAATAGAACGTGACAACTGTTTATTTTATTACCATGATCATTGTTCTCTTTGAGAGTGTCTGCTTTGGAAATTTCAAAGAAATTAATGCATATGATTGCGTASekuen Genom• Hanya terdiri atasratusan juta huruf• Mengetahui sekuengenom saja tidak cukupuntuk memulai programpemuliaan• Beberapa pertanyaanyang harus dijawab:– Bagian mana yang dapatmembedakan satu galurdengan yang lain?– Bagian mana yangmembawa sifat unggul?

Contoh Output Genome Sequencer+C@CFFFFFGHHHHJIJJCAAHFGAD@HWI-ST429:142:817WRABXX:5:1101:12596:7058 1:N:0:GTACAGTAAAAATGCGCGCCTTGTTTATTAAAGCCAAAATTTGCGATATGCAATATTTTCATTCTAAACTCTATAATTCCATCAATTCTGGAGATGAACT+@@@FFFEDHHHHFIIJ8@FFHIHEHGIJGIIIICGHGJEHJIGGHHG@BFGEAE@EECCEEHEFHHEDDDCEBC@ADDECEDC@@@ACDC@CBCDCC:>>@HWI-ST429:142:817WRABXX:5:1101:13146:7087 1:N:0:ACTCACACTTCTTCCAGCGTTATTATCATTAATTGGTAAACGAATATTAAAAAAGAATCAAGTAGCACATACGCCAGCAAAGGCATGGCGTACATTTGC+CCCFFFFFHHHHDIGFGGIIIJJHIIIIJIJJIIIEFHFEBHIEGIIIBHHCF@C?39?AAACCCD?@HWI-ST429:142:817WRABXX:5:1101:17766:7104 1:N:0:CGAAAGTACCAGTATAATCCTCTAATTTATGAGAAGGTGTAGTTCCTTTAATTTGTTCTGGAATGGATTCAGTTGCTTCTTTTATCATTTCCTTCATTTTT• Output di atas adalah data mentah 3 fragmen DNAukuran 100 basa dari mesin HiSeq 2000• Mesin HiSeq 2000 di BB Biogen kini menghasilkan 3milyar fragmen seperti di atas setiap kali dijalankan• Milyaran fragmen ini kemudian harus disusun ulangmenjadi genom utuh, berdasarkan overlap kesamaanurutan basa masing-masing fragmen

CONTOH OVERLAP FRAGMEN DNAFragmen-fragmen 100 basa disusun berdasar kesamaan urutan DNAZoom-in satu bagian kecil contigMarka Single NucleotidePolymorphism (SNP)

Hasil Akhir (Peta Kromosom dan Genom)Peta genom yang dihasilkan biasanya tidak akan pernah 100% lengkap, karenagenom berisikan banyak sekuen berulang yang tidak mungkin dipetakanmenggunakan sequence overlap. Akibatnya peta akhir akan terdiri atas tigabagian:Seluruh sekuen DNA dan ukuran besar fragmen ini diketahuiSekuen tidak diketahui seluruhnya tapi ukuran besarnya (jumlahbasanya) diketahuiSekuen dan ukuran pastinya tidak diketahui, tapi ukurannya dapatdiperkirakan berdasarkan peta genetik (dalam centiMorgan)

Langkah Selanjutnya Setelah Mendapatkan Sekuen Genom:Anotasi GenomKromosomKoordinatbasa DNAGen (sekuen pengkode protein)

Kembali ke Pertanyaan Semula...• Bagian mana yang dapat membedakan satu galurdengan yang lain?– Sekuensing ulang galur-galur yang ingin dipelajari untukmelihat perbedaan sekuensnya– Desain marka polimorfik yang dapat mencirikan/menjadisidik jari galur-galur yang ada• Bagian mana yang membawa sifat unggul?– Pemetaan mutasi untuk melihat perubahan sekuen DNAyang membawa manfaat– Analisis QTL untuk mencari fragmen kromosom pembawasifat unggul– Association mapping untuk mencari marka/gen yangberkorelasi signifikan dengan sifat unggul

Data yang Dapat Dimanfaatkan Pemuliadari Sekuen Genom• Marka DNA yang terletak di fragmen kromosom mana pun yangdiinginkan (genom manusia memiliki 1 marka SNP tiap 100-300basa dalam kromosom, berarti minimal ada 11 juta marka SNP yangdapat digunakan)– Pola sidik jari DNA yang sangat detail dan komprehensif– Memudahkan desain marka yang langsung terletak di gen penyebabsifat yang diinginkan (marka fungsional)– Marka fungsional sangat akurat dan reliable untuk digunakan dalampemuliaan• Kemudahan mengidentifikasi dan mengkloning gen pembawa sifatunggul– Kloning gen unggul menjadi sangat mudah karena primer untukmenggandakan gen lebih mudah dibuat– Pemetaan fragmen kromosom pembawa sifat unggul akan lebihmudah mengidentifikasi gen yang mengkode sifat unggul tersebut

Teknologi Marka Molekuler• Keberhasilan pemanfaatan marka molekuler sangattergantung pada:– Eratnya pautan antara marka dan sifat yang diinginkan– Besarnya efek gen yang ditandai– Biaya penggunaan marka– Ada/tidaknya alel yang diinginkan pada populasi pemuliaan kita.• Pemulia anggur yang menggunakan marka SSR VMC7F2yang berpautan lemah dengan gen pengendali sifatseedless mendapatkan 4-6% false positive (berbiji disangkatidak berbiji) dan 11-16% false negative.• Pemetaan pautan yang lebih terperinci hingga ke sekuenDNA penyebab langsung karakter seedless menurunkantingkat error hingga 0% (Mejia et al., 2011).

Marka Ketahanan Virus pada Kentang• Potato Virus Y (PVY) menimbulkankerusakan pada umbi• Ketahanan dapat diperoleh denganmenyilangkan dengan kerabat liar• Telah diperoleh marka SCAR(RYSC3) untuk gen ketahananterhadap PVY (Kasai et al., 2000)• Biaya operasional marka ini cukupmurah dan dapat diketahuihasilnya dalam hitungan jam

Tahan(Felcher & Douches, Michigan State University)• Galur yang tidak memiliki pita berukuran 321 bp tidak memiliki gen tahan,sehingga rentan terhadap PVY• Seleksi ketahanan terhadap virus (terutama melalui inokulasi) menggangguevaluasi sifat unggul lain (misal daya hasil, serta penampilan dan kualitasumbi)• Identifikasi galur tahan dengan marka lebih efisien, karena mengurangijumlah ulangan serta plot khusus yang harus disiapkan untuk uji ketahanan

Rekayasa Genetik:Dari Tidak Mungkin Menjadi MungkinMawar biru: sering dipakai sebagai metafor sesuatu yang mustahil

Jalur Biosintesis Pigmen Bunga• Studi metabolisme padamawar menjawab misterimengapa tidak ada mawarbiru• Mawar tidak memilikienzim F3’5’H yangmensintesis delphinidin• Delphinidin menghasilkanwarna biru pada bunga• Mawar hanya mampumensintesis Pelargonidin(jingga) dan cyanidin(merah)

• Penambahan kembali genenzim yang hilang daribunga lainmemungkinkan sintesisdelphinidin pada mawar• Tingkat kebiruan bungatergantung pada aktivitasenzim yangdiintroduksikan dalammenghasilkan delphinidin• Sintesis warna jingga danmerah juga harusdimatikan• (Katsumoto et al., 2007)

• Sekuntum mawar birupernah dihargai sekitarUS$ 48 di Jepang• Perlu diingat bahwamawar bukanlahproduk pangan• Produk pangantransgenik hingga kinimasih menjadi isu yangkontroversial

Teknologi Transgenik UntukMenghasilkan Produk Non Transgenik• Permasalahan utama pemuliaan buah adalah wakturegenerasi yang sangat lama• Diperlukan waktu 3-7 tahun bagi tanaman yangdisemai dari biji untuk berbunga dan berbuah• Akibatnya pemuliaan melalui persilanganmemerlukan sedikitnya 15-20 tahun untukmenghasilkan varietas baru• Bagaimana jika siklus berbuah dapat dipersingkat?

FasTrack Breeding di USDA• Transformasi tanamanplum dengan genpembungaan dari poplar• Tanaman transgenik yangdihasilkan dapatberbunga 6-12 bulansetelah ditanam dari biji• Plum tersebut kini dapatdimuliakan sepertitanaman berumurpendek

• Sebelum tanaman dilepas, genrekombinan pembungaan cepatdihilangkan melalui persilanganatau segregasi• Tanaman akhir yang dihasilkansama sekali tidak membawa genrekombinan, sehinggadiklasifikasikan sebagai produknon transgenik• Pemuliaan dapat dipercepat dantidak perlu melewati regulasitransgenik(Scorza et al. – USDA-ARS Kearneysville)

Teknik-teknik penyisipan gen yang diinginkan ke komoditasyang dituju juga terus mengalami perkembangan pesatNanoteknologi mulai berperan dalam pemuliaan

Langkah-Langkah ProgramPemuliaan:• Penentuan komoditas• Penentuan sifat yang diinginkan• Membuat roadmap• Identifikasi teknologi yang sesuai

Kesimpulan• Bioteknologi tanaman menawarkan potensiyang menjanjikan untuk pemuliaan komoditasperishable untuk budidaya, konsumsi, danantisipasi perubahan iklim• Perlu perencanaan jangka panjang• Integrasi penelitian dan pengembangan• Infrastruktur, peneliti berkualitas, regulasi dandukungan pendanaan

Terima kasih