Efisiensi kolom - Prof. Dr. Anna Permanasari, M.Si.

3/17/2011EFISIENSI KOLOMPertemuan 3Bentuk-bentuk kromatogram- Linier (simetris, bentuk gaus), ideal(puncak sempit)- Tidak linier dan tidak idealC S C S C SK = C S /C m K > C K < CS /C S /C mmC mC mC m1

3/17/2011C S C S C SK = C S /C m K > CK < C S /C S /C mmC mC mIsoterm ideal isoterm konveks Isoterm KonkafC mSimetris peak tailing peak leading(overload)Faktor yang mempengaruhiefisiensi kolom• Difusi Eddy (A)• Difusi longitudinal (B/V)• Transfer massa (CV)Pers. Van Deemter:HETP = A + B/V + CV42

3/17/2011Persamaan Van Deemter:Suku Adp = diameter partikel isis kolomλ = faktor geometri (keseragaman partikel)3

3/17/20111. Faktor Difusi EddyPacking kolom tidak seragam, jalur yangdilalui analit berbeda, sampai di ujungkolom dalam waktu yang berbeda7Suku B/V (difusi longitudinal)Dg = koef difusi analit pada fasa pembawa (gas)= 10 5 D L4

3/17/20112. Faktor Difusi LongitudinalArah aliran fasa gerak berbeda denganarah aliran (gas)9Suku C.V(efek perpindahan massa)diabaikank’= faktor kapasitasd f = tebal lapisan cairan fasa diamD l = koef difusi komponen dalam fasa diamω = tetapan gasDp = diameter partikel isi kolomD g = koef difusi komponen dalam fasa gerak5

3/17/20113. Faktor Efek perpindahan massaAnalit yang ada di pusat aliran bergeraklebih cepat dibandingkan dengan analitdi dekat dinding kolom11Distribusi IdealDistribusi tidak idealFasa gerakFasa diam126

3/17/2011Grafik Van DeemterHETPH minV optimalV, LajuLaju alir operasional : 2 Vopt13Berilah penjelasan:• Makna dari grafik Van Deemter:• Suku A ?• Suku B• Suku C• Kondisi optimum ?7

3/17/2011 Mengapa kolom dapat memisahkan campurankomponen ?Karena perbedaan interaksikomponen-komponendengan kolom/fasa diamKomponen 2 keluar dari kolomDalam waktu yang berbeda-bedaWaktu retensi (tr)Berbeda-beda pula15Prinsip PemisahanPerbedaan distribusi komponendiantara fasa gerak dan fasa diamyang menyebabkan perbedaan migrasi diferensialkomponen-komponen analit dalam kolomkromatografiKemampuan kolom untuk membedakan suatukomponen dari komponen lain Selektivitas kolomdasarPerbedaan k`Faktor selektivitas,168

3/17/20111. Faktor Selektivitas ( ) KK21K adalah Koef partisi komponen1 dan 2 t'r2t'r1tr(2)tr(1) tr(0) tr(0)Untuk Pemisahan: >>117 Apakah parameter menjaminpemisahan sempurna ??I 3,2 4,5T 0 = 0,99Tr, menit :………………………………‣ menjamin pemisahan bagian ataskromatogram(puncak)‣ Tidak memperhitungkan overlap puncakpuncakParameter lain :R (resolusi)189

3/17/201112w2. Resolusi (Rs)Rs 2( t( wt12r(2)1r(2)( w1twr(1)2)tr(1)w2)W = lebar puncak19W 1/2)wRs2( t1,699( wr(2)1/ 2(1) tr(1)w)1/ 2(2)Rs ideal = 1,25(97,5% terpisah)2010

3/17/2011Cara lain menghitung Rs :memperhitungkan selektivitas efisiensi faktor kapasitas1 k` 1R ( )( )4 1k`NFaktorkapasitasFaktorselektivitasFaktorefisiensi21INSTRUMENTASIHPLC2211

3/17/2011KCKT‣ Teknik untuk pemisahan dan analisis zatyang sukar dipisahkan dan termolabil‣ Teknik untuk kontrol ketakmurnianEluatdikumpulkandetektorTempateluenpompainjektorkolomrekorderDiagram blok alat KCKT23GAMBAR HPLC2412

3/17/20111. Tempat eluen/pelarutBotol terbuat dari bahan yang bereaksidgn pelarut (gelas)Dilengkapi dgn penyaring (stainlesssteel)Pipa kecil polietileneluen harus di degassingEluen harus disaring dengan saringan252. Pompa eluenGambar PompaGunanya memompa eluen ke dalam kolomTerbuat dari stainless steel/teflonSeals terbuat dari mas atau teflon/grafitTekanan sampai 400 barMemberikan laju alir sampai 5 mL/menitTidak memberikan pulsa2613

3/17/2011Spesifikasi pompa yang baik:Repeatability (keberulangan)Presisi jangka pendek (short term precision)Noise pompa (menyebabkan pulsa) karenagerakan piston dan check valveDrift (perubahan kecepatan alir pompa3. Injektorkarena waktu alir lama)ValveInjektorSyringe injection27Syarat injektor:dapat memasukkan contoh ke dalam kolomdalam bentuk sesempit mungkin untukmenghindari pelebaran puncakMudah digunakanKeberulangan tinggiDapat bekerja meskipun ada tekanan balik4. KolomtinggiGambar kolom2814

3/17/2011Kolom yang baikbahan kolom kuat dan tidak mudah berkaratpartikel Isi kolom berdiameter kecil (5–10m), ukuranseragam, bulat, berporiEfisiensi kolom tinggi (N >>, H

3/17/2011Jenis kolom1. Kolom polar : silika, amina2. Kolom non polar : C-8, C-18silikaC-18 yang terikat silikaSiO OSiSi OO HStruktur fasa Si diam OsilikaSiSiStruktur fasa diam C-18 terikat padasilikaOOSiRR315. DetektorSyarat detektor• Tingkat noise dan drift rendah• Sensitivitas tinggi• respons cepat•Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir pelarut dantemperatur• mudah pengoperasiannya• awet Detektor dalam KCKT• detektor spektrofotometrik (UV/VIS)• detektor fluoresensi•Detektor indeksrefraksi (Optis)•Detektor elektrokimia3216

3/17/2011Berdasarkan jenis kolom dan eluen :1. Kromatografi fasa terbalik : Fasa diam lebihnonpolar dari fasa gerak2. Kromatografi fasa normal : Fasa diam lebihpolar dari fasa gerakPemeliharaan kolom1. Saring eluen dgn saringan membran2. Hindari pengaliran eluen ke dalam kolom dari arah yang sebaliknya3. Gunakan kolom pengaman (column guard)4. Simpan kolom dalam pelarut yang sesuai jika tidak digunakan (kolom polardalam metanol, kolom nonpolar dalam kloroform)5. Jangan sampai kolom jatuh6. Jangan menggunakan eluen yang terlalu asam7. Cuci kolom sesudah digunakan.8. Lakukan regenerasi kolom sesuai prosedur33Trouble shootTrouble Shoot1. Pompa berhenti/tekanantinggiAlatHasil pengukuranSaring kembali fasa gerakPeriksa saringan fasa gerakPeriksa ujung-ujung kolomperiksa klep pompa (harus dgnahlinya.)Bersihkan kolom dengan laju alirminimalganti kolomPenanggulangan2. Keberulangan injeksi rendah Cuci kolomUji keberulangan pompaPeriksa detektor3. Puncak tidak terpisah Perlambat laju alirUbah komposisi fasa gerakGanti fasa gerakGanti kolom4. Puncak terlalu lebar dan tr >> - Percepat laju alir3417

3/17/2011TIPE-TIPE PUNCAK KROMATOGRAM35TIPE-TIPE KROMATOGRAM3618

3/17/2011Soal resolusi:1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui terdiri dari senyawa A dan B,diperoleh data sbb:tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menitW(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit.Hitung Resolusi dan faktor pemisahannyaSoal efisiensi kolom:Komponen x terelusi dalam KCKT dengan data sbb:t r (x) = 21,5 menit , W = 4,1 menit, W 1/2 = 1,85 menit, t o = 0,95 menit.Hitung N , HETP, dan Faktor kapasitas, bila elusi dilakukan dalam kolom 12,5 cm37Analisis kualitatif-Agak sukar dilakukan terutama biladalam campuran-Dapat dilakukan bila pemisahan baikdan tidak ada interferensi-Dasar: membandingkan waktu retensianalit dengan standar-Kondisi elusi analit harus sesuaidengan kondisi standar- Kesulitan: sukar menemukan standar3819

3/17/2011Analisis KuantitatifTahapan kerja:*Penyiapan fasa gerak :Pelarutan, pencampuran, penyaringan, degasing*Preparasi sampel :Pemisahan dgn ekstraksiPengenceran/pelarutan ekstrakpenyaringan/degasing*Penyiapan larutan standar :Induk : larutan 1000 ppmpengenceran dengan fasa gerak.pembuatan larutan kerja:39*Pengukuran sampel*Penentuan konsentrasi sebenarnyaanalit dalam sampelPengukuran sampel:-Teknik membandingkan area standardengan area analitArea standar = A s , konsentrasi = CsArea analit = Ac , konsentrasi analit = CcAs/Ac = Cs/Cc4020

3/17/2011- Teknik kurva kalibrasiDibuat beberapa seri larutan standar, darikonsentrasi kecil sampai besar ( minimal 4 larutanstandar)Dibuat larutan sampel sedemikian sehingga area beradadalam range konsentrasi standarLarutan standar diinjeksikan mulai dari konsentrasi kecilLarutan sampel diinjeksikanPlot Area sampel dalam kurva kalibrasiArea(C vs area standar)*****C, ppmCx41Teknik analisis kuantitatif dengankalibrasi adisi standar• Untuk mendekatkan kondisi sampel dengan kondisilarutan standar• Caranya: ke dalam sejumlah larutan standar (seri)ditambahkan sejumlah yang sama sampel, kemudiandiperlakukan sesuai prosedur seperti pada cara kalibrasibiasaArea*****CxC, ppm4221

3/17/2011Parasetamol adalah obat analgesik dan antipretikyang biasanya dikemas dalam bentuk cair untukkonsumsi anak-anak. Selain parasetamol sebagaizat aktif, biasanya dalam kemasan tersebutditambahkan aditif gula dan etanol dalam jumlahsedikit selain air sebagai pelarut.OHHN – C = OCH343Bila senyawa parasetamol akan dianalisis dengan HPLC,teknik mana yang akan dipilih,a. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerakmetanol/airb. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak n-heksana/airc. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak n-heksanad. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerakkloroformDetektor apa yang dapat digunakan dalam analisis ini?Bagaimana gambaran kromatogram yang akandihasilkan ?4422

3/17/20114523