DIENAR FITRI PRATAMI.pdf - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI
PADA PRODUK BURGER SAPI YANG BEREDAR
DI WILAYAH CIPUTAT MELALUI AMPLIFIKASI DNA
MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Far)
Oleh:
DIENAR FITRI PRATAMI
NIM : 107102000215
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2011
i

LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI
NAMA : DIENAR FITRI PRATAMI
NIM : 107102000215
JUDUL : ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA PRODUK
BURGER SAPI YANG BEREDAR DI WILAYAH CIPUTAT
MELALUI AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN REAL-
TIME PCR
Pembimbing I
Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt
NIP. 1956010619851010001
Menyetujui,
Mengetahui,
Ketua Program Studi Farmasi FKIK
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt
NIP. 1956010619851010001
ii
Pembimbing II
Zilhadia, M.Si, Apt
NIP. 197308222008012007

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI
Skripsi dengan judul
ANALISIS CEMARAN DAGING BABI
PADA PRODUK BURGER SAPI YANG BEREDAR
DI WILAYAH CIPUTAT MELALUI AMPLIFIKASI DNA
MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR
Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan di hadapan tim penguji oleh
Pembimbing:
Dienar Fitri Pratami
NIM 107102000215
Menyetujui,
1. Pembimbing I Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt ........................
2. Pembimbing II Zilhadia, M.Si, Apt ........................
Penguji:
1. Ketua Penguji Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt ........................
2. Anggota Penguji I Prof. Dr. H. Chairul, M.Sc, Apt ........................
3. Anggota Penguji II Lina Elfita, M.Si, Apt ........................
4. Anggota Penguji III Ofa Suzanti B, M.Si, Apt ........................
Mengetahui,
Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tanggal lulus : 20 Desember 2011
Prof. Dr (hc). dr. M. K. Tadjudin, Sp. And
iii

LEMBAR PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR-
BENAR KARYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI
SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU
PADA LEMBAGA MANAPUN.
iv
Jakarta, Desember 2011
DIENAR FITRI PRATAMI

KATA PENGANTAR
Puji Syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan
karunia-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan
penulisan skripsi dengan judul Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk
Burger Sapi Yang Beredar Di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNA
Menggunakan Real-Time PCR. Shalawat serta salam selalu tercurah kepada
junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, para sahabat, dan pengikutnya yang
senantiasa istiqomah mengikuti sunnah-Nya.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk mencapai
gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran
dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Keberhasilan penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari
bantuan dan dorongan semua pihak. Untuk itu pada kesempatan ini,
perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-
besarnya kepada:
1. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Bapak Drs. Muhammad Yanis Musdja, M.Sc, Apt, selaku Ketua Program
studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sekaligus pembimbing 1
yang telah memberikan ilmu dan bimbingan selama penulisan skripsi ini .
3. Ibu Zilhadia M.Si, Apt, selaku pembimbing II yang telah memberikan waktu,
semangat, ilmu, dan bimbingan selama penulisan skripsi ini.
4. Kedua orang tua, Ayahanda Eko Priyono dan Ibunda Siti Kundari yang selalu
memberikan kasih sayang, doa yang tidak pernah putus di tiap tengadah
tangan dan dukungan baik moril maupun materil. Tiada apapun di dunia ini
yang dapat membalas semua kebaikan, cinta dan kasih sayang yang telah
kalian berikan.
5. Untuk adikku tersayang Danar Riko Al-Harits meskipun tidak terjun langsung
membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini, namun tawamu adalah
inspirasiku.
v

6. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan sehingga
penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
7. Kak Yopi, Pak Aris, Kak Melinda, Kak Shely, dan Kak Yos, teman belajar
yang menyenangkan dan sangat membantu penulis memahami hal-hal sulit
dalam bioteknologi.
8. Para staf dan karyawan program studi Farmasi. Staf Administrasi Farmasi
yang telah banyak membantu selama penelitian dan penyelesaian skripsi.
9. Nur Sriati, the best partner sekaligus teman seperjuangan uji DNA terimakasih
untuk tawa dan ceria yang selama ini menutupi penatnya penelitian.
10. Kepada teman-teman Farmasi angkatan 2007, terutama para Naftaleners
terimakasih untuk kebersamaan, dukungan, saran dan kritiknya. Kebersamaan
kita akan selalu terkenang di dalam hati sanubari.
11. Teman-temanku satu atap yang setia menemani cerita suka dan duka selama
penelitian, my best ai rosyi, my best choka asoka, neta, ulin, koprek dan esha.
Dan untuk my best arief rahman, terima kasih untuk dukungan yang tiada
henti.
12. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut
membantu menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.
Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis
harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.
Akhirnya dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil
penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi
mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.
vi
Jakarta, Desember 2011
Penulis

DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI ............................................................... ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI ............................................................... iii
LEMBAR PERNYATAAN ................................................................................ iv
KATA PENGANTAR .......................................................................................... v
DAFTAR ISI ........................................................................................................ vii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ x
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xi
ABSTRAK ........................................................................................................... xii
ABSTRACT ........................................................................................................ xiii
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah............................................................................ 3
1.3 Hipotesis .......................................................................................... 3
1.4 Tujuan Penelitian ............................................................................. 4
1.5 Manfaat Penelitian ........................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 5
2.1 Daging Babi ..................................................................................... 5
2.2 Organel Sel ...................................................................................... 5
2.3 Protein dan Asam Nukleat ............................................................... 7
2.4 DNA................................................................................................. 8
2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA .............................................. 8
2.4.2 Sifat Fisika DNA .................................................................. 10
2.4.3 Fungsi DNA .......................................................................... 10
2.4.4 Isolasi DNA .......................................................................... 10
2.5 DNA Mitokondria........................................................................... 12
2.6 PCR ................................................................................................. 14
2.6.1 Komponen PCR .................................................................... 15
2.6.2 Tahapan PCR ........................................................................ 19
2.7 Real-time PCR ................................................................................ 21
2.8 Elektroforesis Gel ........................................................................... 23
2.9 Daging Burger ................................................................................ 26
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................ 27
3.1 Alur Penelitian ................................................................................ 27
3.2 Waktu dan Tempat .......................................................................... 27
3.3 Alat dan Bahan ............................................................................... 28
3.3.1 Alat ....................................................................................... 28
3.3.2 Bahan .................................................................................... 28
3.4 Tahapan Penelitian ......................................................................... 29
3.5 Prosedur Kerja ................................................................................ 29
vii
Halaman

3.5.1 Pengumpulan Sampel ........................................................... 29
3.5.2 Isolasi DNA dengan DNA Purification ................................ 29
3.5.3 Elektroforesis ........................................................................ 30
3.5.4 Dokumentasi Gel .................................................................. 31
3.5.5 Amplifikasi PCR dengan real time PCR .............................. 31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 33
4.1 Hasil ................................................................................................ 33
4.1.1 Isolasi Genom ....................................................................... 33
4.1.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel .................................. 34
4.2 Pembahasan .................................................................................... 35
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 43
5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 43
5.2 Saran ............................................................................................... 43
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 44
LAMPIRAN ......................................................................................................... 49
viii

DAFTAR TABEL
Tabel 1. Perbandingan sel eukariotik dan prokariotik ......................................... 6
Tabel 2. Kisaran umum ukuran DNA ................................................................. 24
Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk sapi dan babi ............................ 28
Tabel 4. Program amplifikasi PCR ..................................................................... 32
Tabel 5. Campuran reaksi mastermix ................................................................. 55
ix

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Sel eukariotik dan prokariotik ........................................................... 6
Gambar 2. Struktur basa nitrogen purin dan pirimidin. ...................................... 8
Gambar 3. Struktur double helix DNA. .............................................................. 9
Gambar 4. Struktur mtDNA. .............................................................................. 13
Gambar 5. Siklus PCR. ...................................................................................... 21
Gambar 6. Bentuk kurva pada real-time PCR. ................................................... 22
Gambar 7. Interkalasi etidium bromida pada DNA. .......................................... 26
Gambar 8. Skema alur penelitian. ...................................................................... 27
Gambar 9. Hasil elektroforesis DNA yang diisolasi dari kontrol pembanding
dan sampel. ...................................................................................... 33
Gambar 10. Kurva Real-time PCR yang menunjukkan hasil amplifikasi
menggunakan primer spesifik sapi. ................................................. 34
Gambar 11. Kurva Real-time PCR yang menunjukkan hasil amplifikasi
menggunakan primer spesifik babi. ................................................. 34
Gambar 12. BLAST primer dan probe sapi. ........................................................ 50
Gambar 13. BLAST primer dan probe babi. ........................................................ 50
Gambar 14. Pengaturan subset editor................................................................... 57
Gambar 15. Pengaturan sample editor. ................................................................ 57
Gambar 16. Hasil abs.quant real-time PCR menggunakan primer dan probe
spesifik sapi. .................................................................................... 58
Gambar 17. Hasil abs.quant real-time PCR menggunakan primer dan probe
spesifik babi. .................................................................................... 58
Gambar 18. Satu set alat DNA Purification. ........................................................ 61
Gambar 19. Satu set alat elektroforesis. ............................................................... 61
Gambar 20. Gel Documentation. ......................................................................... 61
Gambar 21. Satu set alat real-time PCR............................................................... 61
Gambar 22. Alat-alat dispossible. ........................................................................ 62
Gambar 23. Mikro pipet. ...................................................................................... 62
Gambar 24. Timbangan analitik. .......................................................................... 62
Gambar 25. Spetrofotometer Nano Drop. ............................................................ 62
x

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA kontrol dan DNA sampel . 49
Lampiran 2. Hasil BLAST berdasarkan informasi database NCBI melalui
software Geneious 4.6.1 ................................................................ 50
Lampiran 3. Hasil alignment primer yang digunakan dengan berbagai spesies
babi melalui software Geneious 4.6.1 ........................................... 51
Lampiran 4. Membuat larutan induk primer dan probe ...................................... 54
Lampiran 5. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA ................... 55
Lampiran 6. Perhitungan temperatur annealing .................................................. 56
Lampiran 7. Pengaturan subset editor dan sample editor ................................... 57
Lampiran 8. Tampilan software Light Cycler 480® SW 1,5 .............................. 58
Lampiran 9. Tampilan report analysis PCR dengan primer spesifik babi .......... 59
Lampiran 10. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian .................................... 61
xi

ABSTRAK
JUDUL : ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA PRODUK
BURGER SAPI YANG BEREDAR DI WILAYAH CIPUTAT
MELALUI AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN REAL-
TIME PCR
Kehalalan merupakan isu yang menjadi perhatian utama industri
makanan dan diantara isu tersebut adalah cemaran daging babi pada
beberapa produk makanan. Penelitian ini dilakukan untuk
mengidentifikasi cemaran daging babi pada produk daging sapi
menggunakan real-time PCR. DNA genom babi, sapi dan enam sampel
burger sapi diisolasi dengan mesin purifikasi DNA kemudian
diamplifikasi menggunakan sepasang primer spesifik DNA babi dan
sapi pada daerah mitokondria sitokrom b. Amplifikasi dilakukan
sebanyak 40 siklus dengan suhu denaturasi 95 0 C selama 15 detik dan
annealing pada suhu 60 0 C selama 1 menit. Hasil kurva amplifikasi
real-time PCR menggunakan primer spesifik babi, menunjukkan
bahwa kontrol positif teramplifikasi dengan nilai CP 15,17 sedangkan
kontrol negatif dan enam sampel burger sapi tidak teramplifikasi.
Kata kunci: Halal, burger sapi, purifikasi DNA, real-time PCR.
xii

ABSTRACT
TITLE : ANALYSIS CONTAMINATION OF PORK IN BEEF BURGER
WHICH DISTRIBUTED IN CIPUTAT AREA THROUGH
AMPLIFICATION DNA USING REAL-TIME PCR
Halal authenticity is an issue of major concern in the food industry and
it is related to the porcine contamination at such of food productions.
This study was conducted to identify the contamination of pork in beef
meats product using real-time PCR. Genomic DNA of pork, beef and
six beef burgers samples were isolated by DNA purification machines
then amplification is worked by using pair of porcine and bovinespecific
primers which in the area of mitochondrial DNA cytochrome
b. The amplification processed 40 cycles with denaturation of 95 0 C
in 15 minutes and 1 minute of 60 0 C annealing. The result of real-time
PCR amplification curve using specific primers porcine showed that
the positive control was amplified with the value of CP 15.17 while the
negative control and 6 samples of beef burgers are unamplified.
Keyword: Halal, beef burger, DNA purification, real-time PCR.
xiii

1.1 Latar Belakang
BAB I
PENDAHULUAN
Babi merupakan hewan yang secara keseluruhan diharamkan untuk
dikonsumsi oleh umat Islam (Q.S Al-Baqarah : 173, Al-An’am : 145, Al-
Maidah : 3 dan An-Nahl : 115). Indonesia merupakan negara dengan
mayoritas masyarakat beragama Islam sehingga menjadi kewajiban negara
untuk memperhatikan kehalalan makanannya dari campuran daging babi.
Pada era perdagangan global, dimungkinkan terjadinya impor bahan
makanan dalam bentuk olahan atau mentah dari negara lain ke Indonesia
tanpa melalui pengujian. Sejumlah produk telah disertifikasi halal oleh
MUI termasuk produk pangan daging. Namun masih ditemukan beberapa
kasus pencampuran daging babi pada produk daging sapi olahan. Tujuan
pencampuran tersebut untuk menghasilkan produk akhir dengan harga
yang relatif lebih murah dibandingkan jika menggunakan bahan aslinya,
mengingat harga daging sapi terus meningkat (Margawati, 2010).
Pada September 2009 ditemukan kasus pencampuran daging babi
dalam daging sapi di pasar tradisional Ibuh, kota Payakumbuh, Sumatera
Barat (Sholeh, 2009). Kandungan daging babi juga ditemukan dalam
dendeng sapi di kota Malang dan Jawa Timur (Irawati, 2009). Selain
beredar di Kota Malang, lima produk dendeng sapi yang mengandung babi
juga beredar di Bogor, Bandung, Surabaya, dan Bali (Sucipto, 2009;
1

Muslichan, 2009). Hal tersebut tentunya sangat meresahkan penduduk
Indonesia yang sebagian besar adalah muslim.
Dewasa ini kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di
bidang biologi molekuler. Teknologi tersebut dapat diaplikasikan dan
mempermudah pengujian akan adanya kontaminasi bahan lain diluar
bahan aslinya. Seperti halnya pengujian cemaran daging babi dalam
berbagai produk daging olahan seperti daging burger dapat dideteksi
melalui amplifikasi PCR. Endang Tri Margawati (2010) telah melakukan
pengujian pencemaran campuran daging babi pada produk bakso. Begitu
juga Calvo et al, (2001) yang melakukan identifikasi daging babi pada
produk makanan olahan dan mentah melalui amplifikasi PCR.
Keberhasilan isolasi DNA dan amplifikasi PCR dari sampel daging yang
terkontaminasi daging babi juga telah dibuktikan oleh Alaraidh pada tahun
2008 di pasar Saudi. Sistem TaqMan real-time PCR dengan probe Minor
Groove Binding (MGB) juga telah digunakan pada pendeteksian
kuantifikasi DNA sapi, babi, domba, ayam, kalkun dan burung onta pada
sampel yang kompleks (Andreo et al, 2005).
Metode analisis dengan menggunakan DNA memiliki beberapa
keuntungan, yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada suatu
individu dengan informasi genetik yang identik, DNA merupakan molekul
yang stabil dalam proses ekstraksi, dan analisis DNA sangat mungkin
dikerjakan dari beberapa tipe sampel yang berbeda (Jain, 2004). Dengan
demikian upaya mendeteksi adanya campuran daging babi dalam produk
daging sapi olahan dapat dilakukan.
2

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa ada atau tidaknya
kandungan daging babi pada produk daging sapi olahan. Sampel yang
digunakan pada penelitian ini adalah burger sapi. Pengujian dilakukan
melalui amplifikasi DNA menggunakan real-time PCR. Real-time PCR
merupakan metode terkini untuk amplifikasi DNA. Pada real-time PCR
jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real-time
sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk
mengetahui produk PCR. Real-time PCR lebih dikenal sebagai
quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang akurat, sensitif dan
spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada hasil (Burns et al, 2005).
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana kondisi optimal amplifikasi DNA menggunakan primer
spesifik babi dan sapi dengan real-time PCR?
2. Apakah burger sapi yang beredar di wilayah Ciputat tercemar daging
babi?
1.3 Hipotesis
1. Real-time PCR dapat mengamplifikasi DNA menggunakan primer
spesifik babi dan sapi.
2. Burger sapi yang beredar di wilayah Ciputat ada yang tercemar daging
babi.
3

1.4 Tujuan Penelitian
1. Menentukan kondisi optimal amplifikasi DNA menggunakan primer
spesifik babi dan sapi dengan real-time PCR.
2. Mendeteksi adanya kandungan babi dalam burger sapi yang dijual di
wilayah Ciputat melalui amplifikasi DNA menggunakan real-time
PCR.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi kepada
masyarakat tentang keamanan dan kehalalan produk burger sapi yang
beredar di wilayah Ciputat. Hal ini dilakukan sebagai dharma UIN
terhadap masyarakat sekitar, sehingga masyarakat lebih berhati-hati dan
bijaksana dalam mengkonsumsi produk olahan daging seperti burger sapi.
4

2.1 Daging Babi
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan
berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuh-tumbuhan dan
merupakan hewan yang berasal dari Eurasia (Wijaya, 2009).
Daging babi merupakan daging yang sangat sulit dicerna karena
banyak mengandung lemak. Meskipun empuk dan terlihat begitu enak dan
lezat, namun daging babi sulit dicerna. Babi juga memiliki lemak
punggung yang tebal dan bersifat oxidative rancidity, sehingga secara
struktur kimia sudah tidak layak dikonsumsi. Penelitian ilmiah modern di
dua negara yaitu Cina dan Swedia menyatakan bahwa daging babi
merupakan penyebab utama kanker anus dan kolon. Babi banyak
mengandung parasit, bakteri, bahkan virus yang berbahaya sehingga
dikatakan sebagai Reservoir Penyakit (Wijaya, 2009).
2.2 Organel Sel
Sel merupakan unit terkecil yang menunjukkan semua sifat yang
dihubungkan dengan kehidupan. Suatu sel harus memperoleh energi dari
luar untuk digunakan dalam proses-proses vital seperti pertumbuhan,
perbaikan dan reproduksi. Semua reaksi kimiawi dan fisika yang terjadi
didalam sel untuk mendukung fungsi-fungsi tersebut disebut metabolisme.
Reaksi metabolik dikatalisis oleh enzim. Enzim merupakan molekul
5

protein yang dapat mempercepat terjadinya reaksi biokimiawi tanpa
diubah secara permanen maupun dikonsumsi dalam proses tersebut.
Struktur tiap enzim dikodekan oleh suatu segmen asam deoksiribonukleat
(DNA) yang disebut gen (Stansfield et al, 2006).
Organisme yang hidup saat ini dibagi dalam dua kelompok besar,
yaitu prokariot dan eukariot.
Sel Eukariotik Sel Prokariotik
Gambar 1. Sel eukariotik dan prokariotik (Raven et al, 2005)
Contoh dari prokariot adalah bakteri (dan eubactericae
archaebactericae). Dan yang termasuk eukariot adalah jamur, tumbuh-
tumbuhan dan hewan. Berikut adalah perbandingan antara prokariot dan
eukariot menurut Koolman et al, 1994 dalam bukunya yang berjudul
”Atlas Berwarna dan Teks Biokimia”:
Tabel 1. Perbandingan sel eukariotik dan prokariotik (Koolman et al,
1994)
Prokariotik Eukariotik
Bentuk organisasi :
Bersel satu Bersel satu atau banyak
6

Organel, sitoskelet, alat pembelahan sel :
Ada Ada namun rumit dan terspesialisasi
DNA :
Kecil, sirkular, tidak ada intron Besar, dalam inti sel, banyak intron
RNA : sintesis dan pematangan :
Mudah, didalam sitoplasma Rumit, didalam inti sel
Sederhana, terangkai dengan
sintesis RNA
Anaerobik atau aerobik, sangat
mampu menyesuaikan diri
2.3 Protein dan Asam Nukleat
Protein : sintesis dan pematangan :
Metabolisme :
Endositosis dan eksositosis :
Rumit, dalam sitoplasma dan
retikulum endoplasma berbintil
Kebanyakan aerobic
Tidak Ya
Protein dan asam nukleat merupakan senyawa polimer utama yang
terdapat dalam sel (Gaffar, 2007). Protein merupakan polipeptida yang
memiliki berbagai macam fungsi seperti katalisator reaksi-reaksi biokimia
dalam sel, pengangkut molekul-molekul kecil dan ion, komponen sistem
kekebalan tubuh, pengatur ekspresi genetik, penerus implus saraf dan
sebagai komponen pendukung kekuatan-regang (Yuwono, 2009).
Sedangkan asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan
informasi genetik dalam sel (Gaffar, 2007).
Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu asam
deoksiribonukleat (DNA) yang berfungsi sebagai penyimpan informasi
dan asam ribonukleat (RNA) berperan sebagai ekspresi gen dan bio-
7

2.4 DNA
sintesis protein (Koolman et al, 1994). Semua asam nukleat dibentuk dari
komponen-komponen nukleotida yang terdiri atas satu basa, satu gula dan
satu residu fosfat. DNA dan RNA dapat dibedakan dari jenis gulanya dan
pada salah satu dari basanya (Koolman et al, 1994).
2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA
DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang
tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun
nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa
pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa
nitrogen yang terdapat pada nukleotida adalah basa purin (adenine= A,
guanine= G) dan basa pirimidin (cytosine= C, thymine= T, uracil= U).
Timin terutama terdapat pada DNA sedangkan urasil hanya terdapat pada
RNA. Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi
karbon 3', gugus fosfat pada posisi karbon 5' dan basa pada posisi karbon
1' molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui
ikatan fosfodiester antara gugus 5' fosfat dengan 3' hidroksil (Gaffar,
2007).
Gambar 2. Struktur basa nitrogen purin dan pirimidin (Yuwono, 2009).
8

Pada tahun 1953, Watson dan Crick mengemukakan bahwa struktur
molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang memutar kekanan
(Gaffar, 2007). Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian
nukleotida yang tersusun secara linier. Kedua rangkaian yang saling
berikatan itu terbentuk seperti tali berpilin, sehingga molekul DNA
dikatakan sebagai double helix (heliks ganda). Untuk membentuk
rangkaian molekul DNA heliks ganda, basa nitrogen dari setiap nukleotida
dalam satu rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen dari setiap
nukleotida pada rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen. Pengikatan
basa nitrogen dari masing-masing nukleotida tersebut sangat spesifik. Basa
A dari satu nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida
lainnya, sedangkan basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A
dan T terbentuk dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan pasangan G dan C
terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh karena itu, pasangan G dan C lebih
stabil daripada pasangan A dan T (Muladno, 2010).
Gambar 3. Struktur double helix DNA (Gaffar, 2007)
9

2.4.2 Sifat Fisika DNA
DNA akan terpisah dari rantai komplemennya (denaturasi) pada
suhu mendekati titik didih dan pH ekstrim (pH < 3 atau pH > 10) dan bisa
bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ± 60 0 C (Watson et al,1988).
DNA menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et
al, 1989).
2.4.3 Fungsi DNA
DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyusun gen yang
menjadi unit fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang
disimpan dalam nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu
sumber informasi bagi sintesis semua molekul protein pada sel serta
organisme dan memberikan informasi yang diwariskan kepada anak atau
generasi berikutnya (Granner, 1995).
2.4.4 Isolasi DNA
Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik
yang sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom
eukariot berbentuk linier sedangkan kromosom prokariot berbentuk
sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid.
Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler dengan ukuran yang jauh lebih
kecil dibanding kromosom (Gaffar, 2007).
10

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-
komponen sel lain. Isolasi DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui
proses penghancuran membran sel (lisis), pemusnahan protein dan RNA,
dan pemanenan DNA (Muladno, 2010). Membran sel dilisis dengan
menambahkan bufer yang mengandung satu atau lebih deterjen, contohnya
SDS (B), NP-40, atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran
sel yang ditimbulkan akibat pengrusakan oleh detergen tersebut
dibersihkan dengan cara sentrifugasi Kemudian pada ekstrak sel tersebut
ditambahkan proteinase yang berfungsi untuk mendegragasi protein dan
RNAse yang berfungsi untuk mendegragasi RNA, sehingga tertinggal
hanyalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu
90 0 C untuk menginaktivasi enzim yang mendegradasi DNA (DNAse).
Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan
lagi dengan air (Gaffar, 2007).
Namun, isolasi DNA kini lebih mudah dengan bantuan teknologi
canggih yang disebut purifikasi DNA yang menghasilkan isolat DNA
dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah
(Saiyed, 2008). Purifikasi DNA menggunakan seperangkat mesin dengan
reagen kit pemurnian DNA yang bekerja secara otomatis, singkat dan
efisien. Pemurnian DNA dapat dilakukan dari darah, sel-sel, dan sampel
jaringan. Instrumen ini dapat memproses sampai dengan 16 sampel dalam
waktu 30-45 menit. DNA yang telah dimurnikan dapat digunakan
langsung dalam berbagai aplikasi termasuk PCR, restriksi oleh enzim
endonuklease, dan elektroforesis gel agarosa. Instrumen ini dapat
11

memproses sampel cair dan padat. Dilengkapi dengan cartridge yang
berisi lysis buffer, MagnesiI ® PMPs dan wash buffer (Promega a , 2007).
Pada mesin purifikasi DNA, sampel yang telah dilisis oleh bufer lisis,
dicuci dengan wash buffer dan dielusi dengan elution buffer menggunakan
bantuan MagnesiI ® PMPs (Promega a , 2007).
2.5 DNA Mitokondria
Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai
penghasil energi. Fungsi penting mitokondria adalah menerima substrat
untuk metabolisme energi (asam lemak, piruvat, kerangka karbon dan
asam amino) dari sitoplasma dan menghancurkan secara oksidatif bahan-
bahan tersebut menjadi CO2 dan H2O dan menghasilkan adenosin trifosfat
(ATP). Dengan demikian mitokondria disebut ”pembangkit tenaga” bagi
sel (Koolman et al, 1994).
Keseluruhan mitokondria dalam satu sel mencapai hingga 25%
volume sel. Mitokondria dikelilingi oleh dua membran yaitu membran
dalam dan membran luar. Ruang antara membran dalam dan luar disebut
ruang antar membran. Membran bagian dalam membentuk lipatan-lipatan
yang disebut kristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase. Membran
dalam juga memiliki permukaan yang besar yang mengelilingi ruang
matriks. Matriks ini mengandung DNA, RNA, ribosom, dan berbagai
enzim yang berperan dalam oksidasi zat-zat makanan. (Koolman et al,
1994).
12

Mitokondria memiliki perangkat genetik sendiri yaitu DNA
mitokondria atau sering disingkat mtDNA. Dengan bantuan DNAnya,
mitokondria mempunyai kemampuan untuk mensintesis sendiri beberapa
proteinnya. Namun bagian terbesar protein mitokondria disandi di dalam
inti sel, kemudian disintesis pada ribosom yang bebas dalam sitoplasma
dan diimpor ke dalam mitokondria (Koolman et al, 1994).
Ukuran genom mitokondria minimum untuk berfungsinya
mitokondria hewan multiseluler adalah 14000 pasang basa dari total
ukuran yang berkisar hingga 39000 pasang basa. DNA mitokondria
merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler. Ukuran DNA
mitokondria relatif sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom
intinya (Solihin, 1994).
DNA mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis
gen yang sama yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2,
URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit
I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome
b dan ATPase 6); 2 gen pengkode rRNA yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA;
dan 22 gen pengkode tRNA (Solihin, 1994).
Gambar 4. Struktur mtDNA (Andaman, 1992)
13

2.6 PCR
DNA mitokondria bersifat khusus yang diturunkan melalui induk
betina tanpa mengalami rekombinasi. Adanya sifat tersebut dapat
digunakan untuk suatu rekonstitusi historik dari genealogi matrilinier suatu
spesies maupun antar populasi yang ada. Beberapa hal yang mendukung
penggunaan mtDNA sebagai penanda dalam studi keragaman genetik dan
studi biologi populasi pada hewan yaitu (Solihin, 1994):
1. DNA mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah
kopi yang tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi
untuk berbagai keperluan analisis genom.
2. Ukuran DNA mitokondria relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat
dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh.
3. Bagian-bagian dari genom mitokondria berevolusi dengan kecepatan
yang berbeda.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik
amplifikasi asam nukleat in vitro yang paling banyak dipelajari dan
digunakan secara luas. Dalam waktu sembilan tahun sejak pertama kali
dikemukakan oleh ilmuan dari Cetus Corporation, PCR telah berkembang
menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler, antara lain
untuk transkripsi in vitro dari PCR template, PCR rekombinan, DNAse I
footprinting, sequencing dengan bantuan phage promoters, dan sebagainya
(Putra, 1999).
14

PCR digunakan untuk menggadakan jumlah molekul DNA pada
target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang
berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan
enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle.
Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida
yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum
daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target
disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian
molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase. Untuk dapat
mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs
yang mencakup dATP (nukleotida berbasa Adenin), dCTP (sitosin), dGTP
(guanin), dan dTTP (Timin) (Muladno, 2010).
2.6.1 Komponen PCR
Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR
adalah template DNA, sepasang primer oligonukleotida, DNA polymerase,
deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan larutan buffer (Muladno, 2010;
Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007):
1. Template DNA
Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang
mengandung sekuen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA
bukan merupakan faktor utama keberhasilan PCR, berapapun
panjangnya jika tidak mengandung sekuen yang diinginkan maka tidak
akan berhasil proses suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA
15

tidak terlalu panjang tapi mengandung sekuen yang diinginkan maka
PCR akan berhasil (Sulistyaningsih, 2007).
Konsentrasi DNA juga dapat mempengaruhi keberhasilan PCR.
Jika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat
menemukan target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan
meningkatkan kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu
diperhatikan kemurnian template karena akan mempengaruhi hasil
reaksi (Sulistyaningsih, 2007).
2. Primer
Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR.
Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 18-
28 nukleotida dan mempunyai 40-60% GC content. Sekuen primer
yang lebih pendek akan memicu amplifikasi produk PCR non spesifik.
Ujung 3' primer penting dalam menentukan spesifisitas dan sensitivitas
PCR. Ujung ini tidak boleh mempunyai 3 atau lebih basa G atau C,
karena dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik. Disamping
itu ujung 3' kedua primer tidak boleh komplementer satu dengan yang
lain, karena hal ini akan mengakibatkan pembentukan primer-dimer
yang akan menurunkan hasil produk yang diinginkan. Ujung 5' primer
tidak terlalu penting untuk annealing primer, sehingga memungkinkan
untuk menambahkan sekuen tertentu misalnya sisi restriksi enzim,
start codon ATG atau sekuen promoter (Sulistyaningsih, 2007).
Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 µM.
Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming
16

(penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk
non spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer,
sebaliknya bila konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi
tidak efisien sehingga hasilnya rendah (Sulistyaningsih, 2007).
3. DNA polimerase
DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi
DNA. Dalam perkembangannya, kini banyak digunakan enzim Taq
DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi sehingga
penambahan enzim tidak perlu dilakukan disetiap siklus dan proses
PCR dapat dilakukan dalam satu mesin (Gaffar, 2007).
Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim
alami yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim
rekombinan yang disintesis didalam sel bakteri Escherichia coli
(Muladno, 2010). Enzim ini masih mempunyai aktivitas eksonuklease
dari 5' ke 3' tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari 3' ke
5'. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5
unit. Kelebihan jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non
spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk
yang diinginkan (Sulistyaningsih, 2007).
4. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)
Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk
sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP,
dan dTTP. Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 µM
17

dapat menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifisitas
dan ketepatan PCR. Konsentrasi masing-masing dNTP harus seimbang
untuk meminimalkan kesalahan penggabungan. Deoxynucleotide
Triphosphate akan menurunkan Mg 2+ bebas sehingga mempengaruhi
aktivitas polimerase dan menurunkan annealing primer. Konsentrasi
dNTP yang rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non
target dan menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang
salah. Oleh karena itu spesifisitas dan ketepatan PCR meningkat pada
konsentrasi dNTP yang lebih rendah (Sulistyaningsih, 2007).
5. Larutan buffer
Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR
mengandung 10 mM Tris-HCL pH 8,3, 50 mM KCl dan 1,5 mM
MgCl2. Optimalisasi konsentrasi ion Mg 2+ merupakan hal yang
penting. Konsentrasi ion ini mempengaruhi beberapa hal yaitu
annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk PCR,
spesifisitas produk, pembentukan primer-dimer serta aktivitas dan
ketepatan enzim Taq Polymerase. PCR harus mengandung 0,5-2,5 µM
Mg 2+ dari total konsentrasi dNTP. Konsentrasi yang lebih tinggi akan
meningkatkan produk PCR tetapi menurunkan spesifisitasnya.
Konsentrasi ion ini tergantung pada konsentrasi bahan-bahan yang
mengikatnya seperti dNTP, EDTA dan fosfat (Sulistyaningsih, 2007).
18

2.6.2 Tahapan PCR
Berikut ini merupakan tahapan yang terjadi pada proses PCR
(Muladno, 2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007):
1. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka
menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi
yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa
yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan
(Gaffar, 2007). Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90-95 0 C
selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA yang
ditargetkan ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar telah
terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya,
waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95 0 C atau 15 detik
pada suhu 97 0 C (Muladno, 2010).
Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen target. Jika sekuen
target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Suhu
denaturasi yang terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama
mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq
polymerase. Waktu paruh aktivitas enzim tersebut adalah >2 jam pada
suhu 92,5 0 C, 40 menit pada 95 0 C dan 5 menit pada 97,5 0 C
(Muladno, 2010 dan Sulistyaningsih, 2007).
2. Penempelan primer
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju
daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada
19

proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer
dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya
dilakukan pada suhu 50-60 0 C. Spesifisitas PCR sangat tergantung
pada suhu melting (Tm) primer, yaitu suhu dimana separuh jumlah
primer menempel pada template. Temperatur penempelan yang
digunakan biasanya 5 0 C di bawah Tm, dimana formula untuk
menghitung Tm = 4 0 C (G+C) + 2 0 C (A+T). Semakin panjang ukuran
primer, semakin tinggi temperaturnya (Muladno, 2010). Selanjutnya,
DNA polimerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut
akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila
dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya (Gaffar, 2007). Suhu dan
lamamya waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer juga
tergantung pada komposisi basa, panjang, dan konsentrasi primer
(Sulistyaningsih, 2007).
3. Reaksi polimerisasi
Umumnya reaksi polimerisasi (extension) atau perpanjangan
rantai, terjadi pada suhu 72 0 C karena merupakan suhu optimum Taq
polymerase. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami
perpanjangan pada sisi 3'nya dengan penambahan dNTP yang
komplemen dengan template oleh DNA polimerase (Gaffar, 2007).
Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada
suhu 72 0 C diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik,
bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA
target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000 pasang
20

asa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap pemanjangan
primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR, waktu yang digunakan untuk
tahap ini diperpanjang sampai 5 menit, sehingga seluruh produk PCR
diharapkan berbentuk DNA untai ganda (Muladno, 2010).
2.7 Real-time PCR
Gambar 5. Siklus PCR (Gaffar, 2007)
Real-time PCR merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA.
Pada real-time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung
diamati secara seketika sehingga tidak memerlukan analisis dengan
elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real-time PCR lebih
dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang
sensitif, spesifik dan reproducibility sehingga mengurangi kesalahan pada
hasil (Burns et al, 2005).
Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur
peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat
dengan double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan
fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin
21

anyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent
yang dihasilkan. Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara
akurat konsentrasi DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel
tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan
fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan
tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau
atau stabil (Vaerman, 2004).
Gambar 6. Bentuk kurva pada real-time PCR (Bio-Rad, 2006)
Instrument real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu
thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi
data, dan software sebagai analisis data. Real-time PCR juga dapat
menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan menggunakan
multiwell plates (Roche b , 2008).
22

2.8 Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan
dalam media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik.
Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid.
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal,
sedangkan eletroforesis akrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan
secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk
menentukan urutan DNA atau sekuensing (Gaffar, 2007).
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan kedalam sumur-
sumur yang terdapat dalam gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif,
apabila dialiri arus listrik dengan menggunkan larutan buffer yang sesuai
maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam
medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA
terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA
yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang
berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen
DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka
ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan
hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat dibawah
lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan
membandingkannya dengan pita DNA standar (Gaffar, 2007).
Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya
(Muladno, 2010):
23

1. Ukuran molekul DNA
Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada
migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi agarosa
Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih
cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel
berkonsentrasi tinggi. Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarosa
dalam membuat gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA yang
akan dianalisis.
Tabel 2. Kisaran umum ukuran DNA (Muladno, 2010)
Konsentrasi agarosa Efisiensi pemisahan
(%)
DNA (kb)
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
3. Konformasi DNA
Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran
sama akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda.
4. Voltase yang digunakan
Dalam voltase, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan
tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan
voltase dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Ini
mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun
dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase
24

yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih
besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm.
5. Keberadaan etidium bromida di dalam gel
Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi
molekul DNA linear sebesar 15%.
6. Komposisi larutan buffer
Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran
listrik akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat.
Sementara larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan
panas, sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada
kemungkinan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.
Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang
akan masuk di antara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen
DNA akan terlihat di bawah lampu UV (Gaffar, 2007). Larutan etidium
bromida sangat berbahaya dan bersifat karsinogen. Semua larutan yang
mengandung etidium bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang
(Muladno, 2010). Untuk menghindari bahaya yang ditimbulkan oleh
etidium bromida, maka dapat menggunakan larutan SYBR safe sebagai
penggantinya. Menurut Sambrook dan Russel (2001) pewarna SYBR safe
membuat DNA berpendar di bawah sinar UV. Pita DNA yang berpendar
pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa terdapat DNA pada
setiap lajur.
25

Gambar 7. Interkalasi etidium bromida pada DNA (Nottebaum, 1999)
2.9 Daging Burger
Hamburger pertama kali muncul di Hamburg, Jerman pada abad
pertengahan. Menurut Kamus Besar Bahasa Indonesia (2005) hamburger
adalah daging cacah (biasanya daging sapi, tetapi kadang-kadang juga
daging lain) yang dibentuk bulat, kemudian dipipihkan dan digoreng
dengan mentega atau dipanggang diatas bara, biasanya dimakan sebagai isi
roti bulat, diberi selada, saus tomat, dan bumbu lainnya.
Komposisi utama burger adalah daging, umumnya mencapai 80%.
Daging burger sapi merupakan produk olahan daging sapi yang digiling
dan dihaluskan, dicampur bumbu kemudian diaduk dengan lemak hingga
tercampur rata. Syarat mutu burger murni adalah lemak sapi yang
ditambahkan tidak boleh dari 49% serta ditambah dengan bahan pengikat
dan bahan pengisi (Cory, 2009).
26

3.1 Alur Penelitian
3.2 Waktu dan Tempat
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
Pengumpulan sampel burger sapi dari enam
produsen berbeda
Isolasi DNA sampel dan DNA kontrol
Cek keberadaan DNA melalui elektroforesis
dan gel didokumentasikan
DNA terisolasi DNA tidak terisolasi
Amplifikasi DNA
menggunakan real-time PCR
Hasil analisa
Kesimpulan
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Halal Food and Drug
Analysis, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Waktu pelaksanaan dari bulan Juni
2011 hingga November 2011.
Optimasi kondisi PCR
Gambar 8. Skema alur penelitian
27

3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat
3.3.2 Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah DNA purification
[Maxwell®-Promega], pisau steril, pipet mikro [Edvotex], tips 10 µL, 100
µL, 1000 µL, tube dan mikro tube, satu set alat elektroforesis [Bio-rad],
gel documentation [ATTO], Spektrofotometer Nano Drop [ND-1000], dan
mesin real-time PCR [LightCycler® 480.0-Roche]. Alat gelas yang
digunakan adalah gelas ukur, gelas beaker [Pyrex] dan batang pengaduk.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi segar,
daging babi segar, enam produk burger sapi yang beredar di wilayah
Ciputat. Bahan lain seperti agarosa [Fermentas], buffer TBE [Fermentas],
loading dye 6x [Fermentas], etidium bromida [Bio Basic INC], ddH2O
[Roche], LC TaqMan Probe Master [Roche] yang terdiri: FastStart Taq
DNA Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM. Dan primer-probe
seperti pada tabel berikut:
Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi (Tanabe
et al, 2007)
Babi Forward 5'-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3'
Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'
Probe 5'-(FAM)-ACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3'
Sapi Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'
Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3'
Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-(BHQ1)-3'
28

3.4 Tahapan Penelitian
1. Pengumpulan sampel
2. Isolasi DNA sampel dan pembanding
3. Pembuatan gel agarosa dan elektroforesis
4. Dokumentasi gel
5. Amplifikasi DNA menggunakan real-time PCR
3.5 Prosedur Kerja
3.5.1 Pengumpulan sampel
Pengumpulan sampel dilakukan terhadap 6 sampel burger sapi
dengan produsen berbeda yang beredar di wilayah Ciputat.
3.5.2 Isolasi DNA dengan DNA Purification
Sebanyak 50 mg daging segar (baik daging babi atau daging sapi)
dan daging burger (sebagai sampel) dipotong-potong kemudian
dimasukkan kedalam sumur 1 yang tersedia pada cartridge. Setiap sampel
diletakkan pada cartridge yang berbeda (cartridge 1= daging sapi segar;
cartridge 2= daging babi segar; cartridge 3-8= masing-masing sampel
daging burger berbagai merek). Cartridge yang telah siap diletakkan pada
cartidge holder yang tersedia pada instrumen dan membuka penutup yang
ada pada cartridge, dengan posisi yang bergerigi menghadap ke arah
depan atau pintu. Lalu plunger diletakkan pada sumur 7 dan begitu juga
dengan blue elution tube pada elution tube slots dari masing masing
29

cartidge. Kemudian elution buffer dimasukkan sebanyak 300 µL pada
masing-masing blue elution tube. Protokol dan tipe sampel dipilih pada
instrumen dengan sample type: DNA, dan protocol: cells, lalu OK. Setelah
proses isolasi selesai, elution tube dipindahkan ke magnetic elution tube
rack dan elution DNA sampel dipipet ke tube 1,5 mL. Cartridge sisa pakai
dibuang beserta elution tube dan plungers.
3.5.3 Elektroforesis
1. Pembuatan buffer elektroforesis TBE 1x, 1 liter
Sebanyak 100 mL TBE 10x dilarutkan dengan sedikit akuabides
lalu ditambahkan 900 mL akuabides.
2. Pembuatan gel agarosa 1,5%
Sebanyak 0,75 gr agarosa dilarutkan dengan 50 mL TBE 1x, lalu
dipanaskan diatas hotplate sampai larutan menjadi bening dan
mendidih. Selanjutnya, larutan agarosa didiamkan 3 menit lalu
dimasukkan 0,5 µL etidium bromida dan diaduk rata menggunakan
tips. Kemudian larutan agarosa dituangkan pada gel caster dan comb
disisipkan untuk membuat sumur, dibiarkan hingga mengeras. Setelah
gel mengeras dan membentuk agar, gel diletakkan pada chamber
electrophoresis dengan posisi sumur pada muatan negatif (warna
hitam). Kemudian bufer TBE 1x dituang hingga gel terendam dalam
chamber electrophoresis namun tidak melebihi garis batas maksimum
buffer.
30

3. Loading sample
Parafilm atau plastic wrap direkatkan pada wadah mendatar
sebagai tempat melakukan pencampuran sampel yang akan
dielektroforesis. Untuk DNA kontrol digunakan 4 µL dan ditambah 2
µL loading dye. Dan untuk sampel digunakan volume sebanyak 10 µL
dan dicampur dengan 2 µL loading dye.
4. Running sample
Chamber elektroforesis yang telah tersedia ditutup rapat. Pada
power supply, kabel merah (muatan positif) dipasangkan pada lubang
merah dan kabel hitam (muatan negatif) dipasangkan pada lubang
hitam. Kemudian pada tombol ON ditekan dan waktu diatur selama 45
menit dengan voltase 95 V.
3.5.4 Dokumentasi Gel
Gel diletakkan pada GelDoc yang sudah dibungkus dengan plastic
wrap. Tekan tombol ON pada saver, printer dan transluminator. Stand by
LED dipilih untuk melihat posisi gel. Exposure time, focus dan aperture
cahaya diatur. Setelah mendapatkan gambar yang bagus, data gambar di
print untuk dijadikan dokumentasi.
3.5.5 Amplifikasi PCR (Real-time PCR)
Amplifikasi PCR dilakukan dengan campuran reaksi total PCR
(Lampiran 5) dan dibuat dalam volume 20 µL. Subset dan sample editor
31

diatur (Lampiran 7) serta program amplifikasi dibuat menggunakan
software Light Cycler 480® SW 1,5 seperti pada tabel berikut:
Tabel 4. Program amplifikasi PCR (Roche c , 2008)
Setup
Detection Format Block Type Reaction Volume
Mono Color
96 20 µL
Hydrolysis Probe
Programs
Program
Name
Cycles
Analysis
Mode
Pre-Incubation 1 None
Amplification 40 Quantification
Cooling 1 None
Temperature Targets
Target ( 0 C)
Acquistion
Mode
Hold
(hh:mm:ss)
Ramp rate
( 0 C/s)
32
Acquistion
(per 0 C)
Pre-Incubation
95 None 00:10:00 4,4 -
Amplification
95 None 00:00:15 4,4 -
60 Single 00:01:00 2,2 -
Cooling
40 None 00:00:10 1,5 -
Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi siap,
campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup
menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time
PCR. Instrumen real-time PCR akan mengamplifikasi DNA secara
otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor
dalam bentuk kurva.

4.1 Hasil
4.1.1 Isolasi Genom
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi genom dilakukan terhadap 6 sampel yang didapat dari pasar
dan swalayan di wilayah Ciputat. Hasil isolasi tersebut divisualisasikan
dengan elektroforesis yang dapat dilihat pada gambar 9 :
Gambar 9. Hasil elektroforesis DNA yang diisolasi dari kontrol
pembanding dan sampel: genom DNA sapi segar (S), genom DNA babi
segar (B), genom burger no.1 (1), genom burger no.2 (2), genom burger
no.3 (3), genom burger no.4 (4), genom burger no.5 (5), genom burger
no.6 (6).
33

4.1.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel
Amplifikasi DNA dilakukan dengan real-time PCR dengan primer-
probe spesifik (Tabel 4) dan program amplifikasi seperti pada tabel 5.
Kurva yang dihasilkan real-time PCR ditampilkan seperti berikut :
A3 daging sapi segar
Gambar 10. Kurva real-time PCR yang menunjukkan hasil amplifikasi
menggunakan primer spesifik sapi
A3 daging babi segar
Gambar 11. Kurva real-time PCR yang menunjukkan hasil amplifikasi
menggunakan primer spesifik babi
A6
A4
A5
A8
34
A7
A9
A2 daging babi segar A1
A2 daging sapi segar

4.2 Pembahasan
Pendeteksian adanya cemaran daging babi dalam produk daging
olahan seperti burger sapi dapat dilakukan dengan berbagai cara termasuk
dengan amplifikasi DNA. Pada pengujian DNA terlebih dahulu dilakukan
tahap isolasi menggunakan mesin purifikasi DNA. Isolasi DNA diawali
dengan menghancurkan membran sel menggunakan bufer lisis. Setelah sel
mengalami lisis, DNA dicuci dengan wash buffer dan dielusi dengan
elution buffer menggunakan bantuan MagnesiI ® PMPs (Promega a , 2007).
Magnesil TM Partikel Paramagnetik (PMPs) dilapisi oleh silicon dioxide
(SiO2) yang memiliki kemampuan mengikat asam nukleat pada kondisi
kaotropik atau garam yang tinggi dan akan terelusi pada kondisi garam
yang lebih rendah (Saiyed, 2007; Otto, 2006; Collis, 1999).
Wash buffer yang terdapat dalam reagen kit purifikasi DNA
mengandung etanol, isopropanol, dan guanidin tiosianat (Promega b , 2007).
Etanol dan isopropanol berfungsi untuk membersihkan DNA dari
pengotor, serta guanidin tiosianat merupakan senyawa pendenatuasi
protein (Argyros, 2000). Jika dibandingkan dengan konvensial, isolasi
DNA menggunakan mesin purifikasi DNA sangat efisien karena dapat
mengisolasi 16 sampel DNA secara bersamaan dalam waktu 45 menit
(Promega a , 2007).
Selanjutnya hasil isolasi DNA dielektroforesis dan gel hasil
elektroforesis didokumentasikan. Elektroforesis dilakukan dengan
konsentrasi agarosa 1,5% dan dijalankan dengan tegangan sebesar 95 Volt
dan 400 mA selama 45 menit. Dalam pembuatan gel agarosa, ditambahkan
35

etidium bromida yang berfungsi sebagai visualisasi gel. Etidium bromida
akan masuk di antara ikatan hidrogen pada DNA (Gambar 7), sehingga
pergerakan molekul DNA ditandai dengan berpendarnya etidium bromida
dan pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu UV (Gaffar, 2007).
Etidium bromida yang digunakan sebagai visualisasi DNA pada gel harus
dimasukkan saat gel sudah agak dingin. Jika gel masih panas, uap gel akan
bercampur dengan etidium bromida dan jika terhirup akan berbahaya
karena etidium bromida bersifat mutagenik.
DNA yang akan dielektroforesis ditambahkan loading dye yang
terdiri dari gliserol, bromphenol blue, dan xilena cyanol FF. Gliserol
berfungsi sebagai pemberat yang membuat DNA berada di bawah sumur
gel sedangkan bromphenol blue dan xilena cyanol FF berfungsi sebagai
pewarna pada gel (Carson, 2006) sehingga proses migrasi DNA saat
elektroforesis akan terlihat dan tidak melebihi batas gel.
Hasil isolasi genom (Gambar 9) menunjukkan pita genom pada
daging segar baik sapi maupun babi terlihat jelas dan tegas dibanding
dengan genom burger. Hal ini disebabkan karena daging segar masih
memiliki komponen daging yang utuh sehingga sel-selnya masih bagus
dan DNA terisolasi dengan baik. Sedangkan sampel burger menghasilkan
gambar yang smear karena tidak utuhnya genom yang terisolasi. Genom
mengalami degradasi menjadi banyak fragmen yang berbeda ukuran dan
tertahan pada gel sesuai dengan ukurannya. Hal ini mungkin disebabkan
karena genom yang rusak akibat proses pengolahan daging.
36

Selain dari hasil elektroforesis, genom hasil isolasi diukur
konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer nano drop pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pengukuran kuantitas
(konsentrasi) dan kualitas (kemurnian) didasarkan pada prinsip penyinaran
sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan
(Muladno, 2010). Konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing sampel
bervariasi antara 4,25 ng/µL sampai 54,75 ng/µL (Lampiran 1) yang
didapat dari hasil isolasi sebanyak 50 mg. Berdasarkan hasil elektroforesis
genom (Gambar 9) dan konsentrasi DNA (Lampiran 1), sampel nomer 5
yang memiliki konsentrasi paling besar yaitu 54,75 ng/µL menghasilkan
pita genom yang tebal dan jelas. Dan sampel nomer 1 dengan konsentrasi
terendah yaitu 4,25 ng/µL menghasilkan pita yang paling tipis. Begitu juga
dengan sampel lainnya yang memiliki konsentrasi lebih rendah dibanding
sampel 5 menghasilkan pita yang tipis dan smear. Namun demikian,
konsentrasi DNA yang didapat dari tiap sampel masih dapat dilanjutkan ke
tahap amplifikasi DNA menggunakan real-time PCR karena batas
konsentrasi minimal untuk melanjutkan real-time PCR adalah 0,03-0,80
pg (Andreo et al, 2005).
Perbandingan antara panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
merupakan nilai kemurnian DNA. Pita ganda DNA dapat menyerap
cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm, sedang protein akan
menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 280 nm. Sehingga
kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (A260/A280), dan nilai kemurnian
37

DNA berkisar antara 1,8-2,0 (Stephenson, 2003; Muladno, 2010;
Sambrook, et al, 1989; Fatchiyah, 2010). Nilai kemurnian yang dihasilkan
dari genom yang diperoleh memiliki nilai antara 1,2-2,5 (Lampiran 1).
Sampel yang memiliki nilai kemurnian dibawah 1,8 sebanyak tiga sampel
yang menunjukkan adanya kontaminasi protein. Sedangkan sampel yang
memiliki nilai kemurnian diatas 2,0 sebanyak empat sampel yang
menunjukkan adanya kontaminasi RNA.
Setelah proses isolasi DNA, sampel di amplifikasi menggunakan
real-time PCR. Primer dan probe yang spesifik (Tanabe et al, 2007)
dianalisa secara in silico dengan cara BLAST berdasarkan informasi
database NCBI melalui internet (Lampiran 2). Selain BLAST, primer dan
probe diuji spesifikasinya dengan cara kedua primer dan probe digunakan
untuk mengamplifikasi daging sapi segar dan daging babi segar (Gambar
10 dan Gambar 11).
Campuran reaksi total PCR (Lampiran 5) dibuat dalam volume
20 µL dengan konsentrasi tiap primer forward dan reverse 0,8 µM dan
untuk konsentrasi probe adalah 0,2 µM. Konsentrasi primer dan probe
dibuat dari larutan induk 10 µM (Lampiran 4). Konsentrasi primer untuk
PCR sebaiknya berkisar antara 0,3-1 µM dan untuk konsentrasi hydrolysis
probe berkisar antara 0,05-0,2 µM (Roche c , 2008). Konsentrasi primer
yang optimal adalah konsentrasi terendah yang dapat menghasilkan nilai
CP awal dan kurva fluoresen yang baik, begitu juga dengan probe (Roche b ,
2008).
38

Probe merupakan primer yang dilabel oleh pewarna (reporter) dan
peredam pewarna (quencher). Probe pada real-time PCR digunakan
sebagai pewarna pendeteksi adanya sinar fluoresen yang ditangkap.
Fluoresensi dari reporter akan dilepaskan ketika reporter dan quencher
secara fisik terpisah melalui hibridisasi atau aktivitas nuklease (Johansson,
2006). Format deteksi yang digunakan dalam penelitian yaitu FAM (6-
carboxy-fluorescein) sebagai reporter dan BHQ1 (Black Hole Quencher)
sebagai quencher. FAM merupakan hydrolysis probe yang memiliki
gelombang eksitasi pada 483 nm dan gelombang emisi pada 533 nm
(Roche a , 2008). Pada gelombang eksitasi, sumber cahaya akan memilih
warna spesifik yang mengoptimasi absorpsi fluoresen kemudian warna
spesifik tersebut akan dibaca oleh detektor pada gelombang emisi (Roche a ,
2008). Black Hole Quencher atau BHQ1 merupakan quencher yang
spesifik, memungkinkan identifikasi dan kuantifikasi berbagai biomolekul
(Sigma, 2004).
Selain primer dan probe, dibutuhkan juga MgCl2 untuk reaksi
PCR. Konsentrasi ion ini perlu dioptimasi karena konsentrasi ion Mg 2+
dapat mempengaruhi annealing primer, suhu pemisahan untai template
dan produk PCR, spesifisitas produk, pembentukan primer-dimer serta
aktivitas dan ketepatan enzim Taq Polymerase. Suatu reaksi PCR harus
mengandung 0,5-2,5 µM Mg 2+ dari total konsentrasi dNTP
(Sulistyaningsih, 2007). Konsentrasi MgCl2 yang digunakan pada
penelitian ini yaitu 6,4 mM yang telah dioptimasi dan sudah dalam bentuk
kit bersamaan dengan DNA Polimerase. Campuran reaksi dalam kit LC
39

480 Probes Master ini dapat bekerja dengan hampir semua kombinasi
primer (Roche c , 2008).
Uji spesifikasi primer dan probe dijalankan dengan program
amplifikasi sebanyak 40 siklus. Hasil uji terlihat pada gambar 10 dan 11
yaitu primer dan probe sapi hanya mengamplifikasi sapi segar pada CP
16,18 tetapi tidak mengamplifikasi babi (Gambar 10). Primer dan probe
babi hanya mengamplifikasi babi segar pada CP 15,17 tetapi tidak
mengamplifikasi sapi (Gambar 11). Hasil uji spesifikasi juga disertai
dengan hasil absolute quantification pada software real-time PCR
(Lampiran 8).
Kenaikan kurva pada real-time PCR menandakan terjadinya
amplifikasi DNA. Amplifikasi terjadi ketika terjadinya penempelan primer
dan probe pada DNA template. Saat terjadi penempelan primer, DNA
polimerase akan memperpanjang penempelan dNTP pada DNA template
hingga bertemu dengan probe. Aktifitas nuklease akan memecah probe
dan probe yang terpisah akan menyebabkan sinyal fluoresen reporter tidak
lagi diredam, sehingga reporter akan memancarkan sinyal fluoresen saat
tereksitasi lalu mengemisikan fluoresen dan masuk ke detektor untuk
memberikan kurva (Roche a , 2008). Dalam reaksi amplifikasi, terdapat
siklus dimana terjadinya kenaikan kurva yang disebut Crossing Points. CP
adalah jumlah siklus dimana sampel mulai terbaca diatas Arbitrary
Fluorescence Level (AFL) yang menunjukkan awal mulainya fase
pertumbuhan eksponensial (Roche a , 2008).
40

Seluruh sampel diuji menggunakan primer dan probe spesifik sapi
dan babi. Hasil amplifikasi menggunakan primer spesifik sapi (Gambar
10) terlihat adanya perbedaan kenaikan kurva dan CP pada tiap sampel.
Kontrol positif memberikan CP lebih awal yaitu pada 16,18 meskipun
dalam data konsentrasi DNA sapi segar hanya 5,55 ng/µL. Dan sampel
nomor 5 memiliki konsentrasi paling besar yaitu 54,75 ng/µL hanya
memberikan CP pada 25,16. Sedangkan sampel nomor 3 dengan
konsentrasi lebih kecil dari nomor 5 yaitu 19,44 ng/µL dapat memberikan
CP lebih awal yaitu pada 19,82. Perbedaan kenaikan kurva pada tiap
sampel dipengaruhi oleh konsentrasi DNA dalam sampel (Roche a , 2008).
Sampel dengan konsentrasi DNA yang tinggi membutuhkan siklus
amplifikasi lebih sedikit untuk mencapai CP. Begitu juga dengan
konsentrasi DNA yang rendah membutuhkan siklus amplifikasi lebih
panjang untuk mencapai CP. Namun kenyataannya, konsentrasi DNA
sampel yang besar membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang dengan
memberikan nilai CP yang besar. Hal ini disebabkan hasil isolasi DNA
sampel yang didapat bukan hanya pada DNA yang spesifik terhadap
desain primer dan probe.
DNA organisme eukariotik terdapat di dalam inti sel yang
terbentuk sebagai kromosom (Stansfield et al, 2006) dan di dalam
mitokondria atau yang biasa disebut mtDNA. Desain primer dan probe
yang digunakan dalam penelitian ini hanya spesifik pada daerah
mitokondria sitokrom b (Tanabe et al, 2007). Meskipun dengan
konsentrasi DNA yang besar namun jika tidak mengandung sekuen DNA
41

mitokondria sitokrom b, maka tidak akan terjadi amplifikasi. Pemilihan
DNA mitokondria sebagai desain primer dan probe karena DNA
mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi (Sholihin, 1994).
Jumlah kopi yang tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan
dipurifikasi untuk berbagai keperluan analisis genom. Kemudian ukuran
DNA mitokondria yang relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat dipelajari
sebagai satu kesatuan yang utuh (Sholihin, 1994).
Pada amplifikasi menggunakan primer spesifik babi (Gambar 11)
terlihat kenaikan kurva hanya pada kontrol positif yaitu daging babi segar
dengan CP 15,17. Sedangkan kontrol negatif dan seluruh sampel hanya
memberikan garis lurus. Hal tersebut menandakan tidak terjadinya
amplifikasi primer spesifik babi pada DNA sampel. Terbukti bahwa
produk burger sapi yang diuji masih sesuai dengan bahan asal yang
digunakan tanpa kontaminasi daging babi.
Pendeteksian cemaran daging babi dengan amplifikasi DNA
memang lebih efisien dibandingkan dengan teknik imunologi dan
kromatografi yang menggunakan protein atau lemak. Karena protein dan
aktifitas biologi lainnya akan berhenti setelah organisme tersebut mati
kecuali karakteristiknya yang masih tersimpan didalam sel. Protein juga
memiliki sifat termolabil sehingga untuk analisis identifikasi organisme
lebih disarankan dengan pengujian DNA (Calvo, 2001).
42

5.1 Kesimpulan
5.2 Saran
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan
sebagai berikut :
1. Amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik babi dan sapi dapat
dilakukan dengan real-time PCR sebanyak 40 siklus dengan kondisi
suhu denaturasi 95 0 C selama 15 detik dan annealing pada suhu 60 0 C
selama 1 menit.
2. Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik babi
menunjukkan bahwa kontrol positif teramplifikasi dengan nilai CP
15,17 sedangkan kontrol negatif dan enam sampel burger sapi tidak
teramplifikasi.
3. Berdasarkan kurva amplifikasi DNA menggunakan real-time PCR,
terbukti bahwa produk burger sapi yang diuji masih sesuai dengan
bahan asal yang digunakan tanpa kontaminasi daging babi.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kehalalan produk
burger sapi dengan sekuensing DNA. Dan perlu dilakukan optimasi dan
evaluasi terhadap alat real-time PCR dan mesin isolasi DNA.
43

DAFTAR PUSTAKA
Alaraidh, Ibrahim Abdullah. 2008. Improved DNA Extraction Method for Porcine
Contaminants, Detection in Imported Meat to The Saudi Market. Saudi
Journal of Biological Sciences 15 (2): 225-229.
Aljanabi, S.M., L Forget & A. Dookun, 1999. An Improoved and Rapid Protocol
for Isolation of Polysaccharide- and Polyphenol-Free Sugarcane DNA.
Plant Molecular Biology Reporter (17): 1–8.
Argyros, Frauke C.; Ghosh, Mayurika; Huang, Lili; Masubuchi, Naoko; Cave,
David R.; and Grubel, Peter. 2000. Evaluation of a PCR Primer Based on
the Isocitrate Dehydrogenase Gene for Detection of Helicobacter pylori in
Feces. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,0095-1137/00/
$04.0010 Oct. 2000, p. 3755–3758. Vol. 38, No. 10
Andaman. 1992. The Cambridge Encyclopaedia of Human Evolution.
http://www.andaman.org/related%3F/Related.htm, diakses pada 21 Juni
2011 pukul 15:24
Andreo, Mario Lopez., Laura Lugo., A Garrido-Pertierra., M. Isabel Prieto and A
Puyet. 2005. Identification and quantitation of species in complex DNA
mixtures by real-time polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry.
339(1), 73-82Bio-Rad. 2006.
Bio-Rad. 2006. Real-time PCR Application Guide. http://www.bio-rad.com,
diakses pada 20 Juli 2011 pukul 13.34
Burns, Malcolm J., Gavin J Nixon., Carole A Foy., Neil Harris. 2005.
Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods –
evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC
Biotecnology doi.10.1186/1472-6750-5-31
Brandes, Walter – Promega Corporation. High Throughput Solution for DNA
Purification Using Magnesil TM Paramagnetic Particels. Feature Article.
http://www.promega.com, diakses pada 28 Oktober 2011 pukul 19.00
Carson, Susan. 2006. Manipulation and Expression of Recombinant DNA A
Laboratory Manual Second Edition, Elsevier Academic Press, Burlington
USA.
Calvo, J.H., P. Zaragoza., R. Otsa. 2001. Technical Note: A Quick And More
Sensitive Method To Identify Pork In Processed And Unprocessed Food
By PCR Amplification Of A New Specific DNA Fragment. Spain :
Laboratorio de Gene´tica Bioquı´mica, Facultad de Veterinaria. J ANIM
SCI 2001, 79:2108-2112
44

Collis, Mathew P., Seven Valleys. 1999. Method for Purification and
Manipulation of Nucleic Acids Using Paramagnetic Particles. United
State Patent. US 006433160 B1
Cory, Magdalena. 2009. Analisis Kandungan Nitrit dan Pewarna Merah pada
Daging Burger yag dijual di Grosir Bahan Baku Burger di Kota Medan.
Skripsi. Medan : Fakultas Kesehatan Masyarakat USU
Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung :
Universitas Padjajaran
Genengnews. 2006. Consistency from a Small Integrated System-Promega’s
Maxwell 16 Automates the Purification of Biomolecular Compounds (Vol.
26, No. 20). http://www.genengnews.com. diakses pada 28 Oktober pukul
20.10
Granner, D.K. 1999.. Biokimia Harper edisi ke-24 ; alih bahasa, Andry Hartono ;
editor, Alexander H. Santoso. Jakarta : EGC Penerbit Buku Kedokteran
Irawati, Dahlia. 2009. Dendeng Sapi Dicampur Daging Babi di Malang,
http://regional.kompas.com/read/2009/04/06/1722499/Dendeng.Sapi.Dica
mpur.Daging.Babi.di.Malang, diakses tanggal 12 mei 2011, pukul 13.03.
Jain, Shally. 2004, Use Of Cytochrome B Gene Variability In Detecting Meat
Species By Multiplex PCR Assay, Department Of Veterinary Public
Health, College Of Veterinary Science & Animal Husbandry, Anand
Agricultural University, Anand.
Johansson, Mary Katherine. 2006. Choosing Reporter-Quencher Pairs for
Efficient Quenching Through Formation of Intramolecular Dimers. From:
Methods in Molecular Biology, vol. 335: Fluorescent Energy Transfer
Nucleic Acid Probe: Design and protocols. Edited by: V.V. Didenko.
Humana Press Inc., Totowa, NJ
Koolman, Jan. 1994. Atlas Berwarna dan teks Biokimia / Jan Koolman, Klaus-
Heinrich Rohm ; alih bahasa, Septelia Inawati Wanandi ; editor edisi
bahasa Indonesia, Moh. Sadikin. Jakarta : Hipokrates, 2000
Liyana, Farihah K., Shuhaimi, M., Che Man, Y.B., Sazili A.Q., Aida A.A., Raha
A.R. 2009. Porcine Specific Real-time Polymerase Chain Reaction (PCR)
for Halal Verification. Proceedings of the 3rd IMT-GT International
Symposium on Halal Science and Management 2009. Malaysia : UPM
Serdang, Selangor
Margawati, Endang Tri., Muhamad Ridwan. 2010. Pengujian Pencemaran
Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR:
Pencarian Sistem Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian
Bioteknologi, LIPI
45

Marras, Salvatore A. E., 2006. Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for
Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. Public Health Research
Institute, 225 Warren Street, Newark, New Jersey 07103 : USA.
Maryatni, Dwi. 2000. Upaya Mendeteksi Adanya Daging Babi Dalam Makanan
Jadi Melalui Uji DNA. Skripsi. Bogor : Fakultas Peternakan IPB
Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Kedua. Bogor : IPB Press
Muslichan, Baharudin Rahman. 2009. BPOM Pastikan 5 Produk Dendeng Sapi
dan Abon mengandung Babi. http://www.indosiar.com/fokus/79605
/bpom-pastikan-5-produk-dendeng-dan-abon-mengandung-babi. diakses
pada 22 juni 2011 pukul 16.58
Nottebaum, Sven. 1999. Re: Why is ethidium bromide such a toxic mutagen?.
http://www.madsci.org/posts/archives/1999-02/919869466.Mb.r.html.
diakses pada 11 Oktober 2011
Otto, Paul. 2002. Magnesil TM Paramagnetic Particle: Magnetics for DNA
Purification. Journal of the Association for Laboratory Automation
(JALA) Vol 7, Issue 3, Pages 34-37
Promega a . 2007. Technical Manual Maxwell® 16 Instrument Operating Manual.
http://www.promega.com. diakses pada 06 Juni 2011 pukul 18.08
Promega b . 2007. Technical Manual Maxwell® 16 DNA Purification Kits.
http://www.promega.com. diakses pada 06 Oktober 2011 pukul 20.08
Putra, Suhartono. 1999. Biologi Molekuler Kedokteran, editor: Suhartono Taat
Putra. Surabaya : Airlangga University Press.
Raven, P.H., Johnson, G.B., Losos, J.B., & Singer, S.R., 2005. Biology, seventh
edition, Amerika Serikat: McGRAW Hill.
Roche a . 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual.
http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 08 Juni 2011 pukul
11.05
Roche b . 2008. The LightCycler® 480 System, Unleash the Potential of Real-Time
PCR. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 07 Juni 2011
pukul 15.05
Roche c . 2008. LightCycler® 480 Probes Master. Version February 2008.
http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 07 Juni 2011 pukul
15.05
Saiyed. Z.M., C.N. Ramchand. 2007. Extraction of Genomic DNA Using
Magnetic Nanoparticle (Fe3O4) as Solid-Phase Support. American Journal
of Infectious Disease 3 (4): 225-229, 2007
46

Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A
Labolatory Manual. 2 nd edition. New York : Cold Spring Harbour
Laboratory Press. Book 1.6.1 – 6.17
Sholeh, G. Fouri. 2009. Temuan Daging Babi Tak Pengaruhi Pedagang Padang,
http://www.antaranews.com/berita/1253031494/temuan-daging-babi-takpengaruhi
pedagang-padang, diakses pada 12 mei 2011 pukul 12.45
Sigma. 2004. Significantly Improved Signal-to-Noise Ratios using Black Hole
Quencher (BHQ) Dyes. http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/15280/
Probes_with_BHQ_special_offer. pdf. diakses pada 28 Oktober pukul
21.10
Smith, Don., Douglas White. 2003. Automated Purification of Plasmid DNA using
Paramagnetic Particles. Journal of the Association for Laboratory
Automation (JALA) Vol 8, Issue 3, Pages 50-54
Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA)
dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan.
Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587
Stansfield, William D., Jaime S.Colomé., Raúl J.Cano. 2006. Shaum’s Easy
Outlines Biologi Molekuler dan Sel; alih bahasa, Varian Fahmi ; editor,
Amalia Safitri. Jakarta : Erlangga
Stephenson, Frank, H., 2003. Calculations in Molecular Biology and
Biotechnology, A Guide to Mathematics in The Laboratory, Academic
Press, California, USA.
Sucipto. 2009. Kasus Penemuan Lima Dendeng Sapi mengandung Babi.
http://halalhealt.multiply.com/journal/item/42, diakses pada tanggal 06
Mei 2011 pukul 13.42 WIB.
Sulistyaningsih, Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru
Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Jember : Laboratorium
Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember.
Susanto, Lisawati., Taniawati Supali., Srisasi Gandahusada. 2002. Penentuan
Konsentrasi Minimal Gen B1 dan Gen P30 Toxoplasma Gondii yang
masih terdeteksi dengan Reaksi Rantai Polimerase. Makara, Kesehatan,
Vol. 6, No. 2. Bagian Parasitologi FKUI : Jakarta
Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura.,
and Hiroshi Akiyama. 2007. A Real-Time Quantitative PCR Detection
Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan :
Setagaya-ku, Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007
Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR
Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles
47

Watson, James D., John tooze, & David T. Kurtz, 1988. DNA Rekombinan, alih
bahasa: Wisnu Gunarno. Jakarta : penerbit Erlangga.
Wijaya, Yoga Permana, 2009. Fakta Ilmiah tentang Keharaman Babi. Bandung.
http://yogapw.wordpress.com, diakses pada tanggal 25 April 2011 pukul
09.00 WIB
Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga
48

Lampiran 1. Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA kontrol dan DNA sampel
1) DNA kontrol
Sample ID
Sapi
Konsentrasi DNA
(ng/µL)
A260 A280
49
Kemurnian DNA
A260/A280
5.55 0.111 0.038 2.93
5.56 0.164 0.078 2.10
Rata-rata 5.55 2.51
Babi
13.17 0.263 0.108 2.43
14.06 0.281 0.112 2.52
Rata-rata 13.62 2.48
2) DNA sampel
Sample ID
Konsentrasi DNA
(ng/µL)
A260 A280
Kemurnian DNA
A260/A280
Burger no.1
4.01
4.49
0.080
0.090
0.063
0.078
1.28
1.15
Rata-rata 4.25 1.21
Burger no.2
10.98
10.59
0.220
0.212
0.099
0.091
2.22
2.33
Rata-rata 10.79 2.28
Burger no.3
18.60
20.27
0.372
0.405
0.253
0.272
1.47
1.49
Rata-rata 19.44 1.48
Burger no.4
25.77
25.82
0.515
0.516
0.276
0.279
1.87
1.85
Rata-rata 25.79 1.86
Burger no.5
54.11
55.38
1.082
1.108
0.638
0.657
1.70
1.69
Rata-rata 54.75 1.69
Burger no.6
2.73
6.23
0.055
0.125
0.021
0.055
2.58
2.28
Rata-rata 4.48 2.58

Lampiran 2. Hasil BLAST berdasarkan informasi database NCBI melalui
software Geneious 4.6.1
Gambar 12. BLAST primer dan probe sapi
Gambar 13. BLAST primer dan probe babi
50

Lampiran 3. Hasil alignment primer yang digunakan dengan berbagai spesies babi
melalui software Geneious 4.6.1
A. Hasil alignment primer nukleotida babi spesies sus scrofa cytochrome b
(GQ338965)
Primer Forward
Primer Reverse
B. Hasil alignment primer nukleotida babi spesies sus scrofa domesticus cyt b
(AB015079)
Primer Forward
Primer Reverse
C. Hasil alignment primer nukleotida babi spesies sus verrucosus cyt b
(GQ338963)
Primer Forward
Primer Reverse
51

D. Hasil alignment primer nukleotida babi spesies sus barbatus cytochrome b
(AY534297)
Primer Forward
Primer Reverse
E. Hasil alignment primer nukleotida babi spesies sus cebifrons cytochrome b
(AY920906)
Primer Forward
Primer reverse
F. Hasil alignment primer nukleotida babi spesies sus celebensis cytochrome b
(AM492665)
Primer Forward
Primer reverse
52

G. Hasil Alignment Primer nukleotida Babi spesies sus philippensis cyt b
(AY920905)
Primer Forward
Primer Reverse
53

Lampiran 4. Membuat larutan induk primer dan probe
1. Membuat larutan induk primer dan probe 100 µM
Jenis Nama oligo µg To make 100 µM
Forward 247.9 Add 371 µL ddH2O
Babi Reverse 294.6 Add 382 µL ddH2O
Probe 46.2 Add 65 µL ddH2O
Forward 293.0 Add 491 µL ddH2O
Sapi Reverse 233.7 Add 381 µL ddH2O
Probe 48.9 Add 83 µL ddH2O
2. Membuat larutan primer dan probe konsentrasi 10 µM dari larutan induk
V1 . M1 = V2 . M2
X . 100 µM = 100 µL . 10 µM
X = 1000
100
= 10 µL
Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 100 µM dan di add 90
µL TE buffer atau PCR water grade
3. Rekomendasi konsentrasi untuk primer adalah 0.3-1 µM (Roche c ), dipilih
konsentrasi 0.8 µM untuk tiap primer
V1 . M1 = V2 . M2
X . 10 µM = 20 µL . 0.8 µM
X = 16
10
= 1,6 µL
Maka, diambil 1,6 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM
4. Rekomendasi konsentrasi untuk probe adalah 0.05-1 µM (Roche c ), dipilih
konsentrasi 0.2 µM untuk tiap probe
V1 . M1 = V2 . M2
X . 10 µM = 20 µL . 0.2 µM
X = 4
10
= 0.4 µL
Maka, diambil 0.4 µL dari larutan probe konsentrasi 10 µM
54

Lampiran 5. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA
Tabel 5. Campuran reaksi mastermix
Konsentrasi Lar.induk Jumlah yang digunakan
Primer Forward 0,8 µM 10 µL 1,6 µL
Primer Reverse 0,8 µM 10 µL 1,6 µL
Probe 0,2 µM 10 µL 0,4 µL
DNA Polimerase *
(LC 480 Probe Master)
- - 10 µL
ddH2O - - 1, 4 µL
DNA template - - 5 µL
Total volume reaksi 20 µL
*Terdiri dari: - Fast Start Taq DNA Polymerase
- Buffer
- dNTP (termasuk dUTP dan dTTP)
- 6,4 mM MgCl2
55

Lampiran 6. Perhitungan temperatur annealing
Rumus Tm = 2 0 C (A+T) + 4 0 C (G+C)
Sapi = 2 0 C (2+8) + 4 0 C (2+8)
(Forward) = 2 0 C (10) + 4 0 C (10)
= 20 0 C + 40 0 C
= 60 0 C
Sapi = 2 0 C (5+8) + 4 0 C (6+5)
(Reverse) = 2 0 C (13) + 4 0 C (11)
= 26 0 C + 44 0 C
= 70 0 C
Primer sapi = 60 0 C + 70 0 C
2
= 65 0 C
60 0 C
* Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5 0 C di bawah Tm (Muladno,
2010)
56
Babi = 2 0 C (6+5) + 4 0 C (4+7)
(Forward) = 2 0 C (11) + 4 0 C (11)
= 22 0 C + 44 0 C
= 66 0 C
Babi = 2 0 C (8+7) + 4 0 C (6+3)
(Reverse) = 2 0 C (15) + 4 0 C (9)
= 30 0 C + 36 0 C
= 66 0 C
Primer babi = 66 0 C + 66 0 C
2
= 66 0 C
61 0 C

Lampiran 7. Pengaturan subset editor dan sample editor
Gambar 14. Pengaturan subset editor
Gambar 15. Pengaturan sample editor
57

Lampiran 8. Tampilan software Light Cycler 480® SW 1,5
Gambar 16. Hasil abs.quant real-time PCR menggunakan primer spesifik sapi
Gambar 17. Hasil abs.quant real-time PCR menggunakan primer spesifik babi
58

Lampiran 9. Tampilan Report Analisis PCR dengan Primer Spesifik Babi
59

Lampiran 10. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian
4
Gambar 18. Satu set alat DNA Purification: 1) Mesin DNA Purification ;
2) Plunger ; 3) Blue elution slots ; 4) Catrigde
2
1
Gambar 19. Satu set alat elektroforesis:
1) Chamber ; 2) Gel caster ;
3) Sisir ; 4) Power pac
1
3
2
1
2 3 4
Gambar 20. Gel Documentation
Gambar 21. Satu set alat real-time PCR: 1) Mesin real-time PCR ;
2) Multiwell plate ; 3) Sealing foil
2
3
61

1
Gambar 22. Alat-alat dispossible: 1) Tube dan Mikro tube ; 2) Tips ;
3) Steril blade ; 4) Glove
Gambar 23. Mikro pipet
Gambar 25. Spektrofotometer
Nano Drop
2 3 4
Gambar 24. Timbangan analitik
62