HILIC könyv 03.qxp

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICTartalomjegyzék1. Bevezetés 72. A HILIC helye a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között. 82.1. A hidrofil kölcsönhatású kromatográfiában alkalmazott állófázisok és jellemzésük 112.2. Folyadékkromatográfiás vegyületek osztályba sorolása a HILIC használatakor 123. Szilikagél, mint HILIC állófázis 153.1. Szilikagél használata HILIC állófázisként 213.2. Polárisan módosított szilikagélek, mint HILIC állófázisok 243.3. Ioncserélők, mint HILIC állófázisok. 273.4. Zwitter-ion tartalmú HILIC állófázisok. 293.5. Egyéb állófázis típusok a HILIC-ban 384. Mozgófázisok a HILIC gyakorlatában 405. A pH kontroll és a vegyületek szerkezete közti összefüggés 445.1. Puffer választás a HILIC –ban 485.2. A pH mérés lehetőségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiában 526. A visszatartást megszabó tényezők és törvényszerűségek a HILIC-ban 547. Szerves oldószer tartalom hatása a visszatartásra 618. Grádienselúció a HILIC-ban 658.1. Általános grádienselúció a HILIC-ban 658.2. A grádienselúció és problémája a HILIC-ban. 758.3. A grádienselúciós folyadékkromatográf tesztje 79Tárgymutató 845

6Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC1. BevezetésAmikor Cvet elvégezte híres kísérletét, és felöntötte a petroléterrel kivont növényi extraktumota porított kálcium-karbonáttal megtöltött üvegcsövére, nem gondolhatta, hogy bevonul atudománytörténelembe és ezzel egyúttal a világtörténelembe is. Mózes, amikor a bibliai történetekszerint az ihatatlan vízből ihatót állított elő, szintén nem gondolhatta, hogy több mint kétezerévvel ezután, mint az ókor első kromatográfiás „szakemberének” nevezik.A kromatográfiát nagyon sok misztérium és fátyolköd lengi körül. Pedig ennek az alkalmazotttudománynak az alapjai sokkal jobban ott vannak a mindennapi életünkben, mint azt gondolnánk.Alkalmazott tudomány csak úgy lehet, hogy alapjai szilárd természeti törvényeken nyugszanak.A mindennapi életből hadd ragadjak csak ki egy példát. Amikor a kellemetlen szagokat okozóvegyületeket el akarjuk távolítani a levegőből, akkor egy olyan anyagot alkalmazunk, amely aztmegköti. Létezik hát egy áramló fázis, amely szállít egy anyagot, és van egy fázis, mely helyhezkötött. A kérdéses komponens azonban jobban szereti, szakszóval élve, affinitása nagyobb azállófázishoz, ezért azon adszorbeálódik, majd a folytonos áramban egy idő után deszorbeálódik.Miután ezek a folyamatok sokszor egymásután megismétlődnek a komponensek áthaladnak atöltetágyon.A modern megfogalmazás szerint a kromatográfiás módszerek olyan, kvázi-egyensúlyonalapuló elválasztási módszerek, amelyeknél találunk egy állófázist, amely az esetek többségébenhelyhez kötött, és egy mozgófázist, amelybe a komponenseket tartalmazó mintát bejuttatjuk. Azegyes komponensek megoszlása az álló- és a mozgófázis között eltérő, ezért eltérő sebességgelhaladnak, a szorpciós és deszorpciós sebességük különböző. Ez az eltérő vándorlási sebesség(migrációs sebesség) különbség az oka az egyes komponensek elkülönülésének. Könnyű belátni,hogy bármely hatás, amely megváltoztatja ezt a vándorlási sebességet, az egyúttal a komponensekelválasztását is befolyásolja. A folyadékkromatográfiában ebből a szempontból a változtatástmindkét fázisban elvégezhetjük. A folyadék-szilárd megoszlásban, ha a folyadékban bármilyenösszetétel változtatást végzünk, az megváltoztatja a szilárd határfelület tulajdonságát is. Folyadékkromatográfiásszempontból ez annyit jelent, hogy nagyon sok lehetőség áll rendelkezésünkre azelválasztás befolyásolására. A klasszikusnak tekinthető normál-, fordított fázisú, ioncserés és méretkizárásosmódszerek mellett a nagy polaritású és ionos vegyületeket elválasztására így fejlődött kiegy új elválasztási módszer.Ezt a módszert cukrok elválasztására már régóta alkalmazták, ezt általánossá téve a nagypolaritású és ionos vegyületekre jött létre az az új módszer, amelyet hidrofil kölcsönhatási kromatográfiának(hydrophilic interaction chromatography) vagy hidrofil kölcsönhatási folyadék kromatográfiának(hydrophilic interaction liquid chromatography) és az ebből képzett mozaik vagy betűszóután HILIC-nek nevezünk. Ennél a módszernél az elválasztást –sok esetben– több, egymás mellettlejátszódó folyamat szabja meg. Ez a módszerfejlesztésnél jól kihasználható a megfelelő elválasztáselérésére. További jellemzője ennek a módszernek, hogy a klasszikus módok is kiválthatókvele. Ez különösen fontos szempont, akkor, amikor a tömegspektrométer (MS) előtérbe került adetektálási módszereknél.A HILIC olyan módszer, amely kompatibilis a tömegspektrométerrel (MS). Ugyanez vonatkozikaz elpárologtatás utáni fényszóráson alapuló detektor alkalmazásakor (evaporative light scatteringdetector, ELSD), vagy korona kisülést felhasználó aeroszol detektornál (corona charged aerosoldetektor, CAD). Az MS, az ELSD és a CAD kompatibilitás egyben mutatja, hogy ezzel a módszerrelnemcsak az elemezhető vegyületek számát, hanem a detektálási módok használhatóságát is kiterjesztettük.Végül, de nem utolsósorban, mivel a nagy polaritású és ionos vegyületeknél, ahol szilárdadditívet kellett a mozgófázisba tenni, a fent említett detektálási módok nem voltak használhatók,ezek a módszerek a HILIC-val kiválthatók, és ezek a detektorok is használhatók.A rövid bevezetővel arra szerettük volna felhívni a figyelmet, hogy a HILIC jelentős szerepettölt be a hagyományos folyadékkromatográfiás módszerek között is.7

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC2. A HILIC helye a hagyományos folyadékkromatográfiásmódszerek között.A folyadékkromatográfiás módszereket a mozgó- és az állófázis jellege szerint csoportokbasorolhatjuk. A csoportba sorolás azért is célszerű, mert meg tudjuk adni azokat a vegyületcsoportokat,amelyek elemezését az adott módszer lehetővé teszi. Vagy megadhatjuk azt is, hogy az adottmozgó-, és állófázis milyen vegyületcsoportok elemzését nem teszi lehetővé. Az álló- és mozgófázisjellege szerinti beosztást adunk meg az 2.1. táblázatban. A 2.1. táblázatban megadott besorolástnevezzük a hagyományos folyadékkromatográfiás besorolásnak.Állófázis Mozgófázis Elnevezésaolárisabbapolárisabbapolárisabbionosapoláris, nagy pórus átmérőjűpoláris, nagy pórus átmérőjűapolárisabbpolárisabbpolárisabb + hidrofób ionpuffer, vagy ion tartalmúvíz és szerves oldószerszerves oldószerpuffernormálfázisúfolyadékkromatográfia(NP-HPLC, NPLC)fordítottfázisúfolyadékkromatográfia(RP-HPLC, RPLCfordítottfázisúionpár- folyadékkromatográfia(RP-IP-HPLC, RPIPLC)ioncserés nagyhatékonyságúkromatográfia(IEC, IE-PLC)nem vizes méretkizárásoskromatográfia (SEC),régebbi nevén gél permeációskromatográfia (GPC)vizes méretkizárásoskromatográfia,(SEC),régebbi nevén gélszűrésC-4, C-6 RP só (1-4 mol/l) HIC hidrofób kölcsönhatási LC2.1. táblázatA hagyományos folyadékromatográfiás módszerek besorolásaaz álló- és a mozgófázis fázisviszonya alapján.A fázisviszonyok, és a fázisok felületi tulajdonságainak ismerete egyben megszabja a folyadékkromatográfiásanvizsgálható vegyületeket. Alaptétel, hogy csak azok a vegyületek határozhatókmeg, melyek a mozgófázisban, a detektálás megszabta koncentrációban, kémiai átalakulás nélküloldhatók. Ahhoz, hogy a vegyületek vándorlási sebessége között különbség legyen, az kell, hogy azállófázis felületén eltérő időt töltsenek. Ehhez a komponens és az állófázis között kölcsönhatásnakkell kialakulnia. Ha a komponens és az állófázis jellege nagyban eltér, akkor nem alakulhat kiolyan kapcsolat, hogy a visszatartás nagyobb legyen, mint a holtidő kétszerese. Ez a minimálisvisszatartás, ami azért szükséges, hogy a két komponens együtt eluálódásából eredő interferenciátminimalizáljuk. Ezeket a szempontokat figyelembevéve, a 2.2. táblázatban összegeztük az egyesmódszerekkel meghatározható vegyületek jellegét.8

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICMódszer Vegyület jellege Kizáró okNP-HPLCRP-HPLCRP-IP-HPLCIE-HPLCnem vizes SECközepesen polárisapolorárisionosionosapoláris polimerionos jelleg, nincs poláriscsoport a vegyületben,nagy polaritású anyagokionos jelleg kis apolárisrésszel, nagy polaritásnem ionos vagynem ionizálhatónem ionos vagynem ionizálhatópoláris polimer ionos vagyionizálható csoporttalvizes SEC biopolimerek apoláris polimerekHIC biopolimerek kis molekula2.2. táblázatAz egyes folyadékkromatográfiás módszerek alkalmazhatósága a vegyületek jellege szerint.A 2.2 táblázatban megadtuk, hogy az egyes folyadékkromatográfiás módszerek milyen jellegűvegyületcsoportoknál használhatók, és milyen kizáró okok vannak, amelyek megakadályozzák avizsgálatot. A 2.2 táblázatban megadott folyadékkromatográfiás módszereket a könnyebb átláthatóságérdekében bontsuk két csoportba. A folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegűeknekazokat tekintjük, melyek molekulatömege a 2-4 ezret nem haladja meg. Ezeket a vegyületeketazokkal a porózus és monolit töltetű kolonnákkal vizsgálhatjuk, melyek pórusátmérője 6-15 nm(NP-HPLC, RP-HPLC, RP-IP-HPLC, IE-HPLC). A második csoportba az efölötti molekulatömegűektartoznak, amelyek vagy méretkizárásos folyadékkromatográfiával vagy nagy pórusátmérőjű töltetekkelhatározhatók meg.Ha folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagokat vesszük szemügyre és megnézzük,hogy az egyes módszereknél milyennek kell a vegyületek jellegének lenni, és milyenkizáró okok teszik lehetetlenné használatukat, akkor azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a nagypolaritású vegyületek a megadott módszerek egyikével sem vizsgálhatók. A szerves vegyületekfolyadékkromatográfiás meghatározásánál ezt a hiányzó szeletet tölti be a hidrofil kölcsönhatásúfolyadékkromatográfia (HILIC). A HILIC-nél, csakúgy, mint a NP-HPLC-nál vagy a RP-HPLC-nál,a fázisviszonyokat kell értelmezni. Ismételten hangsúlyozzuk a meghatározandó komponensekoldhatóságát a mozgófásban, és kölcsönhatásukat az állófázissal. A nagy polaritású vegyületekcsak valamilyen poláris jellegű oldószerben oldódnak, kölcsönhatásuk csak akkor lesz számottevőaz állófázissal, ha az polárisabb jellegű a mozgófázisnál.Az általánosan használt fogalmak szerint két eltérő módon poláris jellegű fázissal van dolgunk,ahol az állófázis polárisabb, mint a mozgófázis. A polárisabb állófázissal a vegyületek nagyobbkölcsönhatást alakítanak ki, mint a mozgófázissal, így véges visszatartásuk lesz. A mozgófázisoldaláról megfogalmazva, ahogy annak polaritása csökken, úgy abban a nagyon poláris komponensekvagy ionos anyagok oldhatósága is csökken, és az állófázis felületére szorulnak. Az eltérővándorlási sebesség az egyes nagyon poláris vagy ionos vegyületek között azért jön létre, mertoldhatóságuk a mozgófázisban csökken, és ezzel párhuzamosan az állófázissal való kölcsönhatásuknő. Ha a fázis viszonyok alapján a 2.1. táblázatban megadott módszerek közé helyezzükbe a HILIC-t, akkor az IE-HPLC után tehetjük (2.3. táblázat).9

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICÁllófázis Mozgófázis ElnevezéspolárisabbapolárisabbapolárisabbIonospolárisabbapoláris, nagy pórus átmérőjűpoláris, nagy pórus átmérőjűapolárisabbpolárisabbpolárisabb + hidrofób ionpuffer vagy ion tartalmú víz ésszerves oldószerkevésbé polárisszerves oldószerpuffernormálfázisúfolyadékkromatográfia(NP-HPLC, NPLC)fordítottfázisúfolyadékkromatográfia(RP-HPLC,RPLCfordítottfázisúionpár- folyadékkromatográfia(RP-IP-HPLC, RPIPLC)ioncserés nagyhatékonyságúkromatográfia (IEC, IE-PLC)hidrofil kölcsönhatásikromatográfia (HILIC)nem vizes méretkizárásoskromatográfia, (SEC),régebbi nevén gél permeációskromatográfia (GPC)vizes méretkizárásoskromatográfia (SEC),régebbi nevén gélszűrésC-4,C-6 RP Só (1-4 mol/l) HIC hidrofób kölcsönhatási LC2.3. táblázatA HILIC besorolása a hagyományos folyadékromatográfiás módszerek közéaz álló- és a mozgófázis fázisviszonya alapjánHa az NP-HPLC és a HILIC fázis viszonyait összevetjük, akkor könnyen érthetővé válik,hogy miért nem fázis polaritásokról, hanem polaritás viszonyokról beszélünk. Mind a HILIC-nál,mind a NP-HPLC-nál poláris jellegű az állófázis, és a mozgófázis ennél kevésbé poláris; csakhogy aHILIC-nál ez poláris jellegű oldószerelegyet jelent, míg a NP-HPLC-nél a mozgófázis fő komponenseapoláris jellegű.10

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICMódszer Vegyület jellege Kizáró okNP-HPLCRP-HPLCRP-IP-HPLCIE-HPLCHILICnem vizes SECközepesen polárisapolorárisionosionosnagy polaritású, ionosapoláris polimerionos jelleg, nincs poláriscsoport a vegyületben, nagypolaritású anyagokionos jelleg kis apolárisrésszel, nagy polaritásnem ionos vagynem ionizálhatónem ionos vagynem ionizálhatóapoláris, és ionosállapotba nem hozhatópoláris polimer ionos vagyionizálható csoporttalvizes SEC biopolimerek apoláris polimerekHIC biopolimerek kis molekula2.4. táblázatAz egyes folyadékkromatográfiás módszerek alkalmazhatósága a vegyületek jellege szerint,és a HILIC helye ebben a besorolásban.A HILIC alapvetően a nagy polaritású és ionos anyagok elválasztási módszere. A protonfunkcióscsoportot nem tartalmazó molekulák meghatározására, amelyek nagy polaritásúak, ez azegyetlen technika, amellyel az elválasztásuk megoldható. Ionos vagy ionos formába hozható vegyületeknéla HILIC mellett használható még a fordított fázisú ionpár kromatográfia és az ioncseréskromatográfia is. Az ionpár kromatográfiában az alkalmazott ionpárképző só formában van. Ígya bevezetőben már leírtak szerint nem kompatibilis a tömegspektrometriás (MS), az elpárologtatásutáni fényszóráson alapuló (ELSD) és a korona kisüléses aeroszol (CAD) detektor használatakor.2.1. A hidrofil kölcsönhatású kromatográfiában alkalmazott állófázisok és jellemzésükAz állófázis a folyadékkromatográfiában elsődlegesen megszabja a komponensek visszatartását.Emiatt elsőnek megnézzük, hogy milyen anyagok használhatók erre a célra. Mindenszorbensnek, melyeket HILIC állófázisnak használunk, eleget kell tennie az általános elvárásoknak.Ezek a következők:• mechanikai stabilitás• kis szemcseátmérő és kis szemcseátmérő eloszlás• mikropórus mentesség• a felületen nem lehetnek (nagyon eltérő mennyiségben) nagyban eltérő kölcsönhatásierősségű szorpciós helyekA HILIC-ban használható poláris felületeknek, ennek megfelelően, a következő lehetőségeinkvannak:• szilikagél• aluminium-oxid• zirkónium-oxid• titán-dioxid• poláris módosított szilikagélek-(amino-, nitril-, diol stb.)11

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC• anioncserélők• kationcserélők• zwitter-iont tartalmazó állófázisokAmennyiben a fenti listát áttekintjük, akkor azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az apolárisfelületű állófázisokat kivéve, szinte az összes nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiábanalkalmazott állófázis használható a HILIC-nál.2.2. Folyadékkromatográfiás vegyületek osztályba sorolása a HILIC használatakorA folyadékkromatográfiás elválasztás tervezésének első lépése az állófázis fizikai paramétereinekkiválasztása. A fizikai paraméterek alatt több, a töltetre jellemző adatot értünk. A töltetszemcseátmérője alapvetően megszabja a zónaszélesedést és ezzel az elméleti tányérszámot. Ezt ahatást részletesen tárgyaltuk a Dr. Fekete Jenő, A folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata,Edisonhose, 2006 és Dr. Fekete Jenő A folyadékkromatográfia fejlesztési irányai, Merck, 2008.című könyvekben. Itt csak a lényeges elemeket és azoknak a folyadékkromatográfiás készülékekkiválasztására gyakorolt hatását foglaljuk össze röviden.A szemcseátmérő megszabja a töltetre jellemző H min és u min értékeket. Ezek az adatok tesziklehetővé, hogy az eltérő szemcseátmérőjű tölteteket összevessük. A gyakorlatban soha nem dolgozunkezen paraméterek alkalmazásával. Az ok nagyon egyszerű, mivel a folyadékkromatográfiában azónaszélesedést a diffúziós folyamatok kontollálják és a diffúzió alapjellege, hogy lassú. A diffúziókontollált folyamatoknál az idő faktor alapvető (lásd Fick I és Fick II. törvény) a mért H min kisu min értéknél van. Ez gyakorlatban az elemzési idő jelentős mértékű növekedését eredményezné.Ezért a gyakorlati életben ettől a ponttól jobbra, nagyobb lineáris áramlási sebességeknél dolgozunk,ahol az anyagátadási ellenállás növeli a H értéket. Ezt is a diffúziós folyamatok szabják meg, amelyközül a porózus szemcsén belüli diffúziós úthossz adja a legnagyobb járulékot. Ez viszont szorosanösszefügg az állófázis szemcseátmérőjével. A szemcseátmérő megválasztása megszabja a kromatográfiáselválasztás hatékonyságát, ezért alapvető jelentőségű. Az előbbiek csak akkor igazak, ha aszemcseátmérő eloszlása egy szűk intervallumba esik.A másik, állófázisra jellemző tényező, a töltet pórusátmérője. Ezt a molekula mérete szabja meg.A ma alkalmazott folyadékkromatográfiás töltetek döntő többsége porózus szerkezetű. Ez igaz aHILIC tölteteknél is. Bármilyen típusú HILIC állófázist használunk is a visszatartás biztosításáhoza töltet fajlagos felülete alapvető. A porózus szerkezet adja a nagy fajlagos felületet és ezen keresztüla nagy visszatartást. A fajlagos felület és a visszatartás fordított arányban vannak. A pórusátmérőcsökkentése a fajlagos felület növekedését eredményezi. Ahhoz, hogy a fentiek igazak legyenek, avegyületeknek be kell diffundálni a pórusokba. A pórusátmérő csökkentésének határt szab a molekulamérete. A pórusdiffúzió a stagnáló, a mozgófázis összetételével megegyező összetételű folyadékelegybentörténik. Ebből a szempontból a diffúzió sebessége megegyezik a szemcsék közötti térbenmérttel, mindaddig, amíg a pórusfal nem gátolja azt. Ez annyit jelent, hogy a pórusnak olyanátmérőjűnek kell lenni, hogy a molekulák szabadon diffundálhassanak abban. Bármely hatásugyanis, amely a diffúzió sebességét csökkenti a pórusokban, az a zóna kiszélesedését eredményezi.Ahogy azt már hangsúlyoztuk, a fajlagos felület és a pórusátmérő között fordított arányosságáll fenn, és a nagy fajlagos felület azért szükséges, hogy nagy legyen a töltet visszatartása. Egykromatográfiás kolonnában a visszatartást az össz. fajlagos felület szabja meg. Ezt a tételt úgykell módosítanunk, hogy a vegyületek számára hozzáférhető felület. Ezzel későbbiekben foglalkozunk.12

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICÖsszegezve az előzőket:• a HILIC-nél használt töltetek nagy részénél a pórusátmérő 6-20 nm között változik, ígyaz 1000-4000-es molekulatömegig a vegyületek vizsgálhatók. Az ebbe a molekulatömegtartományba eső vegyületeket nevezzük folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegűanyagoknak. Ezeknél a tölteteknél a két vagy három helyiértékű szám előtt, amely pórusátmérőtadja meg Angströmben, nincs külön jelzés.• amennyiben a töltetek nem folyadékkromatográfiásan kis molekulatömegű anyagok elválasztásáraalkalmasak, akkor „WP” (Wide Pore), Bio mozaikszó szerepel a pórusátmérő előtt.14

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA töltetet alkotó szemcsékalakja és geometriája a fenti két összefüggés miatt érdemel figyelmet.Összehasonlítva a szabályos és szabálytalan alakú részecskék mechanikai paramétereit, azt tapasztaljuk,hogy a szabályos szemcsék sokkal jobbanellenállnaka nyomásterhelésnek,kevésbé porlódnakapróbb darabokká, és térkitöltésük is sokkal egyenletesebb, mint a szabálytalan alakú szemcséké(3.2. – 3.3. ábra).3.2. ábraSzabályos alakú szemcsék3.3ábraSzabálytalanalakú szemcsékÁramlásicsatorna szűkülés3.4. ábraA szabálytalan alakú szemcsék porlódásának mechanizmusaA kromatográfiás oszloponaz áramláscsak a szemcsék közöttt történik, haaz áramlási keresztzegzugosmetszet csökken, akkor a nyomásesés nő a kolonnán.A porozitás a szilikagél igen fontos tulajdonsága. A szilikagél gömb belül csatornákat,járatokarejt, ezáltal fajlagos felülete, és így adszorpciós kapacitása igen nagy.Azegyes gyártmányok esetében megadott átlagos pórusátmérőtág pórustartomány legjellemzőbbpórusméretét jelzi. Például egy Si 60 jelzésű szilikagél átlagos pórusátmérője 60 Å ∗ , de 6 – 400 Å-osjáratokatt is tartalmaz. A pórusméret csökkenésével növekszik a fajlagos felület, de jelentős mértékbencsökken az ún. kizárási molekulatömeg ∗∗ .Az3.1. táblázat tartalmazza példaképpen a Lichrosorb ill. a Lichrospher töltetek fizikaijellemzőit.∗∗∗A folyadékkromatográfiás gyakorlatban a pórusátmérő mértékegységee az Ängström(Å) 1Å = 0,1 nmA kizárási molekulatömeg azt jelenti, hogya molekulaátmérője nagyobb, mint a pórusátmérő és akomponens nem tud bediffundálni.16

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICLiChrosorb ®Fajlagos felület(m 2 /g)Fajlagos pórustérfogat(ml/g)Kizárási molekulatömeg(Dalton)Si 40 800 0,6 4,000Si 60 500 0,7 20,000Si 100 300 1,0 40,000LiChrospher ®Si 60 700 0.85 20,000Si 100 400 1.25 70,000100 DIOL 350 1,25 40.0003.1. táblázatKülönböző pórusméretű szilikagélek adataiA szilikagél állófázisok felületi tulajdonságai:A szilikagél felületén három eltérő tulajdonságú szilanol csoportot találunk:OH OHSiOSi3.5. ábraSzabad szilanol csoportokOSiHOOSiH3.6. ábraH-hidas kötésű szilanol csoportokA szabad szilanol csoportok egymástól 0,5 nm-nél nagyobb távolságra vannak. Ha ennél kisebb atávolság, akkor H-hidak alakulnak ki az egyes szilanol csoportok között, melyek nagyban csökkentikaz állófázis aktivitását. A szilikagél felületén kialakulhatnak ún. szilándiolok, amelyek márnem tudnak H-hidas kölcsönhatásba lépni (3.7. ábra).H OOHSi3.7. ábraSzilándiol17

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICTehát az előzőekből is látszik, hogy a szilikagél felülete energetikailag heterogén, nem mutategységes adszorpciós tulajdonságokat kromatográfiás szempontból.HOHOHOHSiSiO O O O O3.8. ábraA szilikagél kölcsönhatása vízzelA fizikailag szorbeálódott víznek a HILIC elválasztásnál nagy jelentősége van. Ez adja azt ahatárfelületi réteget, amelybe a vizsgálandó komponensek beoldódnak. A leegyszerűsített kromatográfiáskép alapján, minél nagyobb a vegyületek vízoldékonysága, annál több időt töltenekebben a határfelületi rétegben. A határfelületi rétegben a tartózkodási idő megegyezik a vegyületeknettó retenciós idejével. Az egyes vegyületek nettó retenciós ideje közti különbség a kromatográfiásrendszer szelektivitását adja meg.T n = t r -t m [3.1.]α = t n2/ t n1 [3.2.]ahol: t n a nettó retenciós idő, a t r a bruttó retenciós idő és t m a holtidő.Neue (2.1. Estimation of the extent of the water-rich layer associated with the silica surfacein hydrophilic interaction chromatography David V. McCalleya,*, Uwe D. Neue Journal ofChromatography A, 1192 (2008) 225–229) és munkatársai kimérték, hogy a szilikagél pórusainak4-13 %-a vízzel feltöltött a 70-95 % acetonitril-víz mozgófázis használatakor. Hasonló eredménytkaptak a teljesen porózus Atlantis szilikagélre és a héjszerű töltetre (Halo). A mérésekre benzolthasználtak, és feltételezték, hogy a benzol nem lép kölcsönhatásba a nagy víztartalmú határfelületiréteggel.A felületi inhomogenitást még csak fokozza a fémszennyezők jelenléte a szilikagélben.Fémionok beépülése a szilikagél szerkezetbe erős kölcsönhatási energiával rendelkező ioncserélő éskomplexképző centrumok létrejöttét jelenti, illetve még polarizáltabbá teszi az Si–OH-kötéseket.A fémionokkal és a polarizáltabb szilanol csoportokkal a molekula kölcsönhatások energiája jóvalnagyobb, mint a nem fémion környezetben lévő szilanol csoportoké, amely a kromatográfiáscsúcs kiszélesedéséhez, torzulásához vezethet. A modern szilikagél állófázisok már csak néhányppm fémszennyezést tartalmaznak. Ezeket nevezzük nagy tisztaságú vagy harmadik generációsszilikagélnek. (Silica B)A fentebb ismertetetteken kívül a szilikagél felületén lehetnek a gyártásból visszamaradtsavas, vagy bázikus karakterű szennyezések.Ezek a tényezők együttesen szabják meg az állófázis kromatográfiás tulajdonságait, nevezetesena visszatartást, a zónaszélesedést, a szelektivitást, vagyis az elválasztást.A fém-ion tartalom változása viszont megváltoztatja a felületen a szilanol csoportok molekulárisállapotát, ami befolyásolhatja a vízréteg vastagságát. Egyéb, a retenciót befolyásoló hatásitt nem várható.18

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILIC3.9. ábraA HILIC-nál használt szilikagél felületénekváltozása a pH függvényében.A 3.8. ábra azt mutatja, hogy a szilikagél erős kölcsönhatásbaa lép a vízzel. Eddigi ismereteinkszerint, több molekuláris rétegben adszorbeálódik, létrehoz egy megosztó fázist. A két fázis köztifolyadék-folyadék megoszlás mellett a szilanolcsoport molekuláris formájától függően felléphetegy másik kölcsönhatás is, amely a visszatartást, a szelektivitást és a csúcsalakot is befolyásolja.Ez a kölcsönhatás azioncserés kölcsönhatás.Ez a kölcsönhatási forma a RP-HPLC módszerben tiltott.Kérdés, hogy a HILIC módszernél vajon ki lehet-e használni az elválasztás szelektivitásánaknövelésére vagy ez itt is tiltott.A HILIC-nál is alaptétel,hogy olyan erős kölcsönhatás az ionozált szilanolcsoport és aprotonált amin között nem jöhetlétre, amelyirreverzibilis adszorbciót vagy aszimmetrikus csúcsokateredményez. A viszonyok viszont nagymértékben különböznek a RP-HPLC-hozképest. A HILIC-néla vízrétegbe történő megoszlás és az erős ioncserés (ionos) kölcsönhatás a két főretenciót megszabótényező.A 3.9. ábrán a pH függvényébenn adtuk mega szilanolcsoport molekuláris állapotát. Akis pH értékeknél a szilanolcsoportok ionizációja visszaszorított.Ekkor csak H-hidas kötés jöhetlétre a pozitív töltésűaminokkal, ez egy gyenge kölcsönhatás, amelynek a kromatográfiás eredményeszimmetrikus kromatográfiás csúcs. A másik véglet a nagy pH-n a szilanolcsoport teljes egészébenionos formában lenne, de ez a HILIC körülmények közöttt nem lehetséges, mert a szilikagél feloldódna.A közbenső pH értékeken a két molekuláris forma aránya a pH függvénye.Amennyiben a kétforma aránya összemérhető, akkor ezeknek a pH értékeknek használata is lehetséges. McCallay,aki bázisos csoportot tartalmazóvegyületekelválasztását, mind RP-HPLC, mind HILIC módszerbentanulmányozta, a kolonna túlterhelésével ellenőrizte, hogy fellépnek-e olyan erős kölcsönhatások,melyek inkompatibilitást eredményeznek.(Interneten elérhető: www.sciencedirect.com Journal of Chromatography A, 11711 (2007)46–55. Is hydrophilic interactionn chromatography with silica columns a viable alternative to reversed-McCallay azt találta, hogya kolonna terhelése a savas közegű HILIC elválasztásnál tízszeresea RP-HPLC-nél tapasztaltaknak. Ez annyit jelent, hogya HILIC megfelelőbb elválasztási módszereaz ionizálható bázisos csoportot tartalmazóvegyületeknek, mint a RP-HPLC. Különböző Silica Bphase liquid chromatography for the analysis of ionisable compounds? David V. McCalley)kolonnák azonos retenciós sorrendet adtak. A visszatartás mértékeis megegyezett a közel azonosfajlagos felületű szilikagéleknél.A határfelületiszilanolcsoportok molekuláris formája kérdéses. A Silica B alapú szilikagéleknéla szilanolcsoportokátlagos pKaértéke 5-7.Köztudott, hogy nagy szerves oldószer tartalmú köze-el.gekben a gyenge savak pKa értéke megváltozik. Általában a nagyobb értékek felé tolódikA HILICvisszatartást megalapozó elmélet szerint a határfelületenegy vízréteg jön létre. Ez aztokozhatja, hogy a szilanolcsoportok pKa értéke nem változik. Azok az értékekk lesznek mérvadók,melyeket a vizes közegben mértek ki. A pH

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICIsmételten hangsúlyozzuk, gyártók által forgalmazott HILIC szilikagél abban különbözik anormálfázisú folyadékkromatográfiában alkalmazottól, hogy acetonitrilben hozzák forgalomba.A zirkónium- és a titán-dioxidot ma még nem, vagy ritkán alkalmazzák, de elvi akadálya nincs,hogy alkalmazzuk, mint HILIC állófázist.Néhány a HILIC gyakorlatban használt szilikagélt az alábbiakban adunk meg:Betasil (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) [30], Hypersil (Thermo Scientific) [31],Inertsil (GL Science, Tokyo, Japan) [32], Kromasil (EKA Chemicals, G¨oteborg, Sweden) [33],Supelcosil LC-Si(Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) [34], Alltima (Alltech, Nicholasville, KY,USA) [35], Spheri5 Silica (Alltech) [36], and Supersphere Si (Trentec, Gerlingen, Germany) [37].Atlantis (Waters) [38–46]. Waters for HILIC mode ultrahigh-performance liquid chromatography(UPLC) [47,48]. Luna HILIC (Phenomenex) Ascentis silica ((Supelco, Bellefonte, PA, USA).3.1. Szilikagél használata HILIC állófáziskéntA rövid felsorolásból is látható, hogy mind a Silica A , mind a Silica B osztályból is használtakszilikagéleket poláris vegyületek elválasztására. Egyben ez annyit jelent, hogy bármely normálfázisúfolyadékkromatográfiában használt állófázis használható a HILIC technikában. A folyadékkromatográfiásankis molekulatömegű anyagok elválasztására a 10 nm (100 Å) ,a folyadékkromatográfiásannagy molekulatömegű anyagok elválasztására a 30 nm(300 Å) pórusátmérőjű szilikagéleket használjuk.A 3.1.1. táblázatban a LiCHrosorb sorozatra adtuk meg a pórusátmérőket és a kizárási tömegeket.Ez a szilikagél a Silica A osztályba tartozik és a Merck cég terméke. A továbbiakban ugyanenneka cégnek a Silica B kategóriába tartozó termékeit adjuk meg a specifikációjukkal együtt(3.1.2. táblázat)Töltet megnevezéseFajlagos felület(m 2 /g)Fajlagos pórustérfogat(ml/g)Kizárási molekulatömeg(Dalton)LiChrospher® Si 60 700 0.85 2 · 10 4LiChrospher® Si 100 400 1.25 7 · 10 4LiChrospher® 100 DIOL 350 1.25 4 · 10 4LiChrosorb® Si 40 800 0.6 4 · 10 3LiChrosorb® Si 60 500 0.7 2 · 10 4LiChrosorb® Si 100 300 1.0 4 · 10 43.1.2. táblázatA Merck cég által forgalmazott Silica B kategóriába tartozó termékek,amelyek a HILIC-ban állófázisként használhatók.A szilikagélek felülete energetikailag heterogén. A felületi szilanolcsoportok pKa értékét többtényező együttesen határozza meg. A HILIC-ban a szilanolcsoportok molekuláris állapota meghatározzaa kölcsönhatásukat a vizsgált vegyületekkel. Bármilyen változás a molekuláris formájukbanmegváltoztatja a kölcsönhatási lehetőségeket, ez viszont a visszatartást befolyásolja. A szakirodalomezt a jelenséget úgy interpretálja, hogy a szilikagélek használatakor az egyensúly beállása lassú.Nézzük meg, hogy ez a meglehetősen summás kijelentés mikor igaz és hogyan lehet ezt az időtcsökkenteni. Ezt a jelenséget Snyder a fordított fázisú folyadékkromatográfiában behatóan tanulmányozta.Az ott szerzett tapasztalatokat ültetjük át a HILIC-nál alkalmazott körülményekre.21

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA lassú egyensúly beállás oka jelenleg nem ismert. Snyder feltételezte, hogy a szilanolcsoportokmolekuláris formáinak változása (egyensúly beállása) a pH változtatásával gyors (3.1.3.):SiOH = SiO - +H + [3.1.3.]Emellett a protolitikus folyamat mellett lejátszódik egy másik is, amelynek eredete nem ismert (3.1.4):XH=X - +H + [3.1.4.]Ez a folyamat kinetikailag gátolt.Az eddigi ismereteink szerint az anion protonfelvétele lassú folyamat. Itt kimondottan kinetikaigátlásról van szó. Az egyensúly beállását nem segíti, hogy nagyobb térfogatáramlási sebességgeltöbb mozgófázist áramoltatunk át a kromatográfiás kolonnán. Egyedüli paraméter az idő. Snyderazt találta, hogy az általa vizsgált 19 Silica B alapú kolonnából ez az egyensúly-beállási probléma8 kolonnánál lépett fel. Ezeket a vizsgálatokat fordított fázisú kolonnákkal végezte. Ha ezek azegyensúly-beállási problémák a kémiailag módosított szilikagéleknél felléptek, akkor a módosítatlanszilikagéleknél is fel kell, hogy lépjenek. Feltételezések szerint a proton felvételi sebesség a lassúfolyamat, ezért a hatás a 2-3 pH körüli értékeknél erősebben érzékelhető. Mindaddig, amíg aXH/X - arány nem lesz állandó, addig a visszatartás is változhat. A továbbiakban meg kell néznünk,hogy milyen típusú vegyületek azok, amelyek a XH/X - arány változására érzékenyen reagálnak.Folyadékkromatográfiásan a vizsgálandó vegyületeket négy csoportba sorolhatjuk:1. Kromatográfiásan semlegesek; a és b csoport.2. Savas csoportot tartalmazók3. Bázisos csoportot tartalmazók4. Ionos csoportot tartalmazók.A négy csoport közül az 1a osztályba soroltak kivételével az összes csoportba tartozó vegyületmeghatározható HILIC-val, ha a vegyületek lgP értéke kisebb mint -0,5 vagy -1. Most sorbavesszük az egyes osztályokat és megnézzük, hogy hol reagálnak jelentősen a XH/X - aránymegváltozására.1. A kromatográfiásan 1.b osztályba azok a vegyület tartoznak, amelyek poláris csoportot tartalmaznak.A poláris csoportok molekuláris állapotát a pH változtatása nem változtatja meg.Például a HILIC-val meghatározható vegyületek közül ilyenek a polihidroxi vegyületek.Nézzük meg a cukrokat, amelyek a “legrégibb” HILIC vegyületek. A cukrok beoldódnak ahatárfelületi vízrétegbe, és H-hidas kölcsönhatást alakítanak ki a vízzel körülvett szilanolcsoporttal.Ez a H-hidas kölcsönhatás gyenge, mert a víz is erős H-hidat képez a szilanolcsoporttal.Ennek eredménye, hogy az ebbe az osztályba tartozó vegyületek csak kismértékben reagálnak az XH/X - arány megváltozására. Tehát az ebbe a csoportba tartozóvegyületeknél az egyensúly beállás lassúságából eredő probléma csak kis mértékű.2. A kromatográfiásan 2. osztályba sorolt vegyületeknél (savas csoportot tartalmazó vegyületek)a molekuláris formák arányát állandó értéken kell tartani. A vegyületek oldaláról nézveszükséges a pH kontroll. A pH megváltoztatja a XH/X - arányt. A HILIC-nál is érvényes,hogyha lehet, akkor az elválasztást az ion-visszaszorított formában végezzük. Egyes szakirodalmakezt nevezik a savas csoportot tartalmazó vegyület semleges formájának. Ekkor apKa-2=pH értékeknél kisebbeken dolgozunk. Az anionos ismeretlen felületi elem ekkorprotonálódik. A 3.1.3. és a 3.1.4. egyenlettel jellemzett egyensúlyok baloldalra tolódnak el.A 3.1.3. egyenletben megadott szilanolcsoport protonálódása gyors, ezért ami az egyensúlybeállását megszabja, az az ismeretlen anion protonálódása (3.1.4.). A savas csoport, mindaz ion visszaszorított szilanollal, mind az ismeretlen anion protonált formájával H-hidaskölcsönhatást tud kialakítani. Ennek erőssége nagyobb, mint az alkoholos hidroxiddalkialakított-é. Továbbra is igaz, hogy ezt a kölcsönhatást gyengíti, hogy a víz molekulák iskialakítanak H-hidakat a két protonált csoporttal. A protonálódás befejeződése után a retencióállandó lesz. A lassú egyensúly beállás miatti retencióváltozás a savas csoportot tartalmazó22

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICvegyületeknél már nagyobb lehet, mint a kromatográfiásan semlegeseknél (1.b). Ha a vegyületekpoláris jellegének növelése miatt a savas csoportot ionos formába akarjuk hozni, akkorcélszerű a pKa+2=pH feletti tartományban dolgozni. Ennek határt szabhat a szilikagéloldhatósága. Ha a savas csoport pKa értéke öt, akkor ez hetes pH-t jelent. Ezen a pH értékéna 3.1.3. egyenlettel megadott folyamat a jobb oldali irányba tolódik el. A szilanolcsoportokionizálódnak, ezért a felületi töltéssűrűség jelentősen megnövekszik. Ehhez képest az ismeretleneredetű protonfunkciós hely deprotonálódásából eredő töltés növekedés csak kisebbmértékben járul hozzá. Az, hogy a negatív töltések száma a szilikagél felületén idővelnövekszik, csak kis mértékben csökkenti az ionos formában lévő savas csoportot tartalmazóvegyület retencióját. Általánosan elmondható, hogy 6-os pH felett a savas csoportot tartalmazóvegyületek elválasztásánál nincs egyensúly beállási hatás.3. A kromatográfiásan 3. osztályba sorolt vegyületeknél (bázisos csoportot tartalmazó vegyületek)a molekuláris formák arányát állandó értéken kell tartani. A vegyületek oldaláról nézveszükséges a pH kontroll. A pH megváltoztatja a XH/X - arányt. A HILIC módszernél a bázisoscsoportot tartalmazó vegyületeket általában kis pH értékeken határozzuk meg. Lehetőleg apKa-2=pH értékeknél kisebbeken, mert ekkor a vegyületek teljes mértékben ionos formábanvannak. A protonálódott aminok (pozitív töltés) visszatartása függ attól, hogy a határfelületifázisban a negatív töltést hordozó helyek száma mennyi. A 3.1.3. egyenlet szerint aszilanolcsoportok gyakorlatilag protonálódtak. Az XH csoportok pKa értékei nem ismertek,csak annyi, hogy protonálódásuk lassú. Az X - csoportok számának csökkenésével aprotonált aminnal való erős kölcsönhatás lehetősége csökken, ami visszatartás csökkenésteredményez. Aminok HILIC-val történő mérésekor, kis pH értékeken, számolhatunk egyensúlybeállásiproblémákkal. Ha lehetőségünk van bázisos csoportot tartalmazó vegyületek elválasztására,pH>6 savasságú közegben, ahol a bázis ion-visszaszorított formában van, akkornem lép fel erős kölcsönhatás a szabad bázis és a felületen lévő aniononos hely között. Azanionos helyek számát a szilanolcsoportok ionizációja szabja meg, ezért nem lép fel azegyensúly beállási probléma.4. A kromatográfiásan 4. osztályba sorolt vegyületek egy része állandó töltéssel rendelkezik.Ha kis pH értéken dolgozunk, akkor mind az anionoknál, mind a kationoknál az állófázisfelületén található negatív töltés befolyásolja a visszatartást. Például a kvaterner ammóniumsóknálaz erős ioncserés kölcsönhatás szabja meg a visszatartást. Változik a negatív töltésű helyekszáma a felületen, változik a visszatartás. Az eredmény csökkenő retenció.Az anionoknál az azonos töltések közötti elektrosztatikus taszítás miatt változik a visszatartás.Minél kevesebb a felületen a negatív töltés, annál nagyobb lesz a retenció. A kationokvagy anionok elválasztásakor, amikor kis pH értékeken dolgozunk, egyensúly beállási problémávaltalálkozhatunk. pH>6 (lúgos) közegben, ahol a negatív töltést döntően a szilanolcsoportok ionizációjaeredményezi, a lassú proton felvétel nem okoz egyensúly-beállási problémát.Az egyensúly beállás lassúsága kis pH értékeken nemcsak a szilikagélnél, hanem az összesszilikagél alapú HILIC állófázisnál problémát okozhat. Először röviden összefoglaljuk a fő jellemzőitaz egyensúly beállás lassúságának, majd javaslatot teszünk, hogy a gyakorlati életben hogyanlehet hatását csökkenteni vagy teljes mértékben megszüntetni.Jellemzők:• kis pH tartományban lép fel• független a kolonnán a mozgófázis térfogatától, csak az időtől függ• savas csoportot tartalmazó vegyületeknél retenciónövekedést okoz• bázisos csoportot tartalmazóknál retenció csökkenést eredményez• anionoknál retenciónövekedést okoz• kationoknál retenció csökkenést okoz• hőmérséklet növelésével az egyensúly beállási idő jelentősen csökken.23

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA lassú egyensúly beállás acetonitrilben még jobban jelentkezik, mertgyakorlatilag nincsproton, amely a folyamathoz szükséges. A különbözőkolonnagyártó cégek ezért ajánlják, hogypár százalék vizet vagy puffert tegyünk az acetonitrilbe. A nagy szerves oldószer tartalmúmozgó-be. Ahogy a lassú egyensúly beállás jellemzőit felsoroltuk, a két legfontosabb tényező, hogy kisfázisokba csak szerves pufferkomponenseket tehetünk,mert különben kristálykiválás következikpH értékeken következik be (savas közegben), és időfolyamat. Ahhoz, hogy egyes esetekben akárórákig várjunk az egyensúly beállásra, szükséges, hogy a szilikagél vagy szilikagél alapú HILICkolonnákat pufferben tároljuk. Még szerves pufferek használatakkor is ügyelnünk kell arra, hogyne legyen túl nagy a koncentrációja, hogy a só kiválást elkerüljük!3.2.Polárisan módosítottt szilikagélek, mint HILIC állófázisokA polárisan módosított szilikagélek közül a szénhidrát analitikai alkalmazások miatt kiemeltszerepe van az aminofázisnak,a többi is alkalmazhatókülönböző elválasztási célokra. A polárisanmódosított szilikagélek általános felépítésétt a 3.2.1. ábrán adjuk meg.3.2.1. ábraPoláris csoportott tartalmazó szilánnal kémiailag módosított szilikagélA propil csoporthoz kapcsolódó aminocsoportpoláris, és savas pH-n protonfelvétel utánanioncserélő (ionos) jellegű. A propilcsoportot távtartónak neveztük el, mert a poláriscsoportközvetlenül nem kapcsolódhat a szilicium-atomhoz, mertnem lesz stabil. A propilcsoport „távolságot”tart a szilicium és az aminocsoport között. A szilicium-atomhoz kapcsolódó két metil-csoportsztérikuss gátlást jelent, hogy azújabb reaktív szilán a szomszédoss szilanolcsoportokkal reagáljon.A sztérikus gátlás miatt kb. a szilanolcsoportok fele reagál. 8 μmol/m 2 átlagosszilanol koncentrá-szilikagélfelületén. Ha a szilikagél fajlagos felülete 300 m 2 /g, akkor ez 0,9-1,2 mmol/g borítottságot jelent.cióval számolva 3-4μmol/m 2 propilamino csoport koncentráció lesz a módosítás után aA felületen több fajta kölcsönható csoport található. Reagálatlan szilanol, aminocsoport és apropil, metilcsoportok.A 3.1. fejezetben bemutattuk, hogy a szilanolcsoportok a mozgófázis pH-tól függően vagyionvisszaszorított, vagy ionizáltformában vannak. Az aminocsoport molekuláris formája,és ezzelkölcsönható képessége is pH függő.gyantaafázisCH 3N + H +Hprotonamino3.2.2. ábraAz aminocsoport protonálódásaH +NCHH 3Hamino csoportAzaminocsoport savas pH-n protonálódik és anioncserélővé alakul. Propilaminnal modellezvea folyamatot, az aminocsoport pKa értéke 10.4. A fázis felső használati pH-ja 7. Tehát pH kontrollthasználva az aminocsoport anioncserélőként működik24

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICIoncserélőkapacitásmeq/g+NHCH 3H+NHCH 3HCH 3I.II.NIIIHNCH 3H3.2.3. ábraAz aminofázis molekuláris állapota a pH függvényében.A kolonnát 7-es pH alatt lehet használni, ezért pH kontroll használvaa 3-7 tartományban anioncserélőként is működikA protonált aminocsoport H-hidas kötést alakít ki azokkal a vegyületekkel, amelyek aktívhidrogén-atomot tartalmaznak. Ugyancsak H-hidas kötést alakít ki a disszociójában visszaszorítottszilanolcsoport. Az ionizált szilanol viszont kationcserélő helyként viselkedik. A propil- és metilcsoportokapoláris (hidrofób) kölcsönhatást tudnak kialakítani a vizsgált vegyületekkel. A polárisszilanolcsoportok, a protonált aminocsoportok is hidratálódnak, és az állófázis határfelületénvízréteg alakul ki. A visszatartást és a szelektivitást több tényező együttesen szabja meg a vegyületekszerkezetétől függően:k=k v +k ic +k H +k d [3.2.1.]pK bahol: k v , k ic , k H , k d a vízréteg, az ioncsere, a H-hidas kötés és a diszperziós kölcsönhatásjáruléka a visszatartáshoz.A primér amino csoportot tartalmazó aminofázisoknál problémát jelenthet a Schiff-bázisképződés. Az irodalomban, ezt azonban eddig senkinek sem sikerült bizonyítani .Az irodalomban sok aminofázist használtak HILIC elválasztásra. Közülük adunk meg néhányat:Bondapak AX (Waters), Bondapak carbohidrate (Waters), Spherisorb NH2 (Waters),YMC-PackNH2 (Waters), Luna Amino (Phenomenex) Hypersil APS2 (Thermo Science) [61,62], Zorbax NH2(Agilent, Santa Clara,CA, USA) [63], apHera NH2 (ASTEC, Whippany, NJ, USA)[64], AlltimaAmino (Alltech) [65], PALPAK TypeN (TakaraBio,Otsu, Japan) [66], and Micropellicular [67].YMC PackPolyamine II (YMC)A következő táblázatban (3.2.1. táblázat) a Merck termék adatait adjuk meg:Állófázis jellemzőPropilamino módosított szilikagélAlak:gömbszimmetrikusSzemcseátmérő:5; 10 μmPórusátmérő:100 Å (10 nm)Pórustérfogat1,25 ml/gFajlagos felület: 350 m 2 /gSzéntartalom:4,6 % CFelületi borítottság: 4,1 μmol/m 2Hatékonyság25 000 N/m ; 20 000 N/mpH tartomány: pH 2-7,5Tárolási oldószer:n-HeptánpH3.2.1. táblázatA Merck aminofázis és jellemző paraméterei25

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA 3.2.1. táblázatban a Merck cég n-heptánbann szállítja a kolonnát, a HILIC-banviszontacetonitril–víz elegyet kell használnunk. Ehhez oldószercserét kelll végrehajtanunk. Ennekkiviteleegyszerű. A kolonnát először diklórmetánnall mossuk. A kolonna mosáshoz kb. 20-50 szeres kolonna-aceto-térfogatúdiklórmetánt használunk. Majd diklórmetános mosás után ugyanolyan térfogatúnitrillel mossuk ismét a kolonnát és ezután használhatjuk a HILIC-nál használatos oldószereket.Ezt az oldószercserétkell mindenn olyan esetben végrehajtani, amikor n-heptánban vagy n-hexánbanszállítjáka kolonnát. Ez az oldószercsere mutatja meg azt, hogy a hagyományosan a normálfázisúfolyadékkromatográfiához szállított kolonnákat hogyan kell a „HILIC”-módbaátvinni.Azaminocsoport helyett lehet nitrilcsoport is.3.2.4. ábraNitrilcsoportot artalmazó állófázis, ami HILIC töltetként használható.A nitril csoportban töltés szétválás történik; a nitrogén-atom részlegesen negatív, míg aszénatomrészlegesen pozitív lesz. A csoport dipól-dipól kölcsönhatást tud kialakítani. Ennél amódosításnál is maradnak a felületen reagálatlan szilanol csoportok. A HILIC-nél feltételezettvízburokkialakításában a nemreagált szilanolcsoportok, és a nitrilcsoportok is szerepet játsza-isnak. A felületi vízrétegbe történő beoldódás (abszorpció) mellett a dipól-dipól kölcsönhatásbefolyásolja a vegyületek visszatartását.3.2.5 ábraDiolcsoportot tartalmazó állófázis, ami HILIC töltetként használható.A hidroxilcsoportok gyenge H-hidas kölcsönhatástt alakítanak ki a vizsgált vegyülettel. A határ-veszi körül.A 3.2.2. táblázatban a Merck által forgalmazott, γ-propiolinittrillel módosított szilikagél alapúfelületenlétrejövő vízburok kialakításáhozúgy járulnak hozzá, hogy a diolcsoportot hidrátburoktermék adatait adjukmeg.26

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICTöltet jellemzője:Alak:Szemcseátmérő:Pórusátmérő:Fajlagos pórustérfogat:Szilikagél γ-propiolinitrillel módosítvagömbszimmetrikus5; 10 μm100 Å (10 nm)1,25 ml/gFajlagos felület: 350 m 2 /gSzéntartalom:6,6 % CFelületi borítottság: 3,52 μmol/m 2Hatékonyság:pH tartomány pH 2-7,5Tárolási oldószer:40 000 N/m ; 15 000 N/mn-Heptán3.2.2. táblázatMerck által forgalmazott γ-propiolinitrillel módosított szilikagél. A „HILIC”-módra történő oldószerváltás megegyezik az aminó módosított szilikagélnél leírtakkal.A 3.2.3. táblázatban a Merck által forgalmazott, diol módosított szilikagél alapú termékadatait adjuk meg.Töltet jellemzője:Alak:Szemcseátmérő:Pórusátmérő:Fajlagos pórustérfogat:Diol módosítású szilikagélgömbszimmetrikus5; 10 μm100 Å (10 nm)1,25 ml/gFajlagos felület: 350 m 2 /gSzéntartalom:8,0 % CFelületi borítottság: 3,87 μmol/m 2Hatékonyság:pH tartomány: pH 2-7,5Tárolási oldószer:45 000 N/m ; 20 000 N/mn-Heptán3.2.3. táblázatMerck által forgalmazott, diol módosított szilikagél alapú termék adatai.Elvileg bármely módosítás, amely poláris jelleget ad a felületnek HILIC töltetként használható.3.3. Ioncserélők, mint HILIC állófázisok.A HILIC-ben használhatunk ioncserélőket is állófázisként. Az ioncserélőket töltésük alapjánkét osztályba soroljuk:• Erős anioncserélők, jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltésűcsoportok vannak az elválasztás körülményei között27

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC• Kationcserélők, jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatívtöltések találhatókaz elválasztás körülményei közöttgyantaafázisvagyalapfázis+N- OHellenionAz ioncserélőket töltésük pH-függése alapján ismét kétcsoportba sorolhatjuk:• Erős anioncserélők azok, amelyekioncserélő kapacitása független a mozgófázis (eluens)pH értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammóniumm vegyületek(3.3.1. ábra).ioncserélő3.3.1. ábraErős anioncserélőgyanta (állófázis) szerkezeteAzioncserélők döntő többsége szerves polimer alapú. Ezeket az alapfázisokat az angolszakirodalom "resine"-nek, egyszerűen gyantának nevezik. Innenn ered a gyanta fázis elnevezés.Készülhetnek szervetlen oxid alapon is azesetek többségében szilikagél alapon. Attól függően,hogy polimer vagy szervetlen (szilikagél) alapon készültek az anioncserélőkmás lesz az alkal-A szerves polimer alap valóban az 1-14 pH tartománybann használható, károsodáss nélkül. A problémátviszont az okozza, hogy a HILIC módszernél használt folyadékkromatográfiás rendszer ugyanmazhatópH tartomány.Alkalmazási pH tartomány szerves polimer alapúanioncserélőnél:1-12(13)Egyes irodalmak ezt a pHtartománytt az 1-14 közé teszik. Azelőzőekben1-12-re szűkítettük.rozsdamentes acélból készül, de a kis és a nagy pH értékeken megnő a korrózió veszélye. Ez azoka a pHtartománykorlátozásának.Alkalmazási pH tartomány szilikagéll alapú anioncserélőnél:3-7Kis pH értékeknél jelentősen nő az ioncserélő csoportot tartalmazó rész hidrolízis sebessége.A nagy pH értékeken viszont előtérbe kerülaz alapszilikagél oldhatóságának növekedése.Azerős kationcserélők felületén szerves szulfonsav csoportok vannak. A csoportok vizesközegben nagymértékben disszociálnak. Így a felület negatív töltéssel rendelkezik. A szervesszulfonsav disszociációja függ a közeg szerves oldósezr tartalmától. Ha elfogadjuk a HILIC alaptételét,hogy a határfelületen egy vízréteg alakul ki, akkor a szerves szulfonsav disszociációs viszonyainális a határfelületi vízréteggel kell számolnunk.A szerves polimer alapú erős kationcserélő szerkezetét a 3.3. .2. ábrán mutatjuk be.3.3.2. ábraSzerves polimer alapú erős kationcserélő, mint HILIC állófázis.28

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICA HILIC mérési körülményei között a szerves polimer alapúerős ioncserélő ionizált formá-Aban fordul elő. Az ionos részt hidrátburokveszi körül, ez biztosítja a határfelületi vízréteget.vízbe történő beoldódás mellettt a kationcsere is hozzájárulhat a visszatartáshoz.A szerves polimeralapú erős ioncserélők mellett használhatók még a szervetlen alapúak is.Ezek közül a szilikagél alapúak, amelyeket a leggyakrabban használunk.reaktív szilanolcsoportokCH 3SiOHCH 3SiOSiOSi+OHClSiOSiOHCH 3CH 3szilikagélrészeszilárdreaktív szilánCH 3cc. H 2 SO 4SiOSiSO 3 - H +OSiOHCH 33.3.3. ábraSzilkagél alapú erős kationcserélő felülete, amelyet HILIC állófázisként használhatunk.Azioncserélő csoportot tartalmazó részborítottsága kisebb, mint a oktadecil csoportot tartalmzószilánnal történt módosításnál, több lesz a reagálatlan szilanolcsoport. A reágalatlan szilanolcsoportokis hozzájárulnak a határfelületi vízréteg kialakulásához. Kölcsönhatási szempontból a szilanol-formában van és H-hidas kölcsönhatást alakít ki, pH 7 körüli savasságú közegben nagy részükcsoportok molekuláris állapota a mozgófázis pH-tól függ. A pH 3 körül nagy részük nem disszociáltionizált formában kationcseréree alkalmas.3.4.Zwitter-ion tartalmúHILIC állófázisok.Azelőző két fejezetben (3.2 és 3.3. . fejezet), láttuk, hogy mind az anion, mind a kationfelületencserélőkhasználhatók állófázisként a hidrofil kölcsönhatási kromatográfiában(HILIC). Alévő pozitív és negatív töltések hidratációja azt eredményezi, hogy a határfelületen vízréteg alakuljonki, amely a HILIC módszer egyik jellemzője. A pozitív töltés okozta anioncsere és a negatív töltéseredményezte kationcsere önmagában is lehetőség, hogy az ionos vegyületeknél megfelelő mértékűvisszatartás jöjjön létre. Az ionos kölcsönhatáshoz a vizsgálandóvegyületnek is ionos formábankell lennie.3.4.1. ábraZwitter-iont tartalmazó HILIC állófázis29

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA 3.4.1. ábránadtuk meg a ZIC-HILIC állófázist. A hordozó vagy alapitt is kétféle lehet.Vagy szilikagélen,vagy szerves polimeren immobilizálják a szulfo-bétaintípusú kettős iont.Az alap vagy hordozó megszabja a pH tűrését az állófázisnak. A szilikagél alapnál az általánoshatár 3-7, ez a gyári specifikáció szerint 3-8 közötti pH tartományt jelenti. A gyártó ugyan nemadja meg, hogy milyen kötésen keresztül történik a zwitterion kapcsolása a felülethez, valószínűlegez Si-O-Si kötésen keresztül történik, ahogya 3.4.2. ábrán megadtuk.CHCH 33Si O Si (CH 2 )n CH 2 N (CH 2 2) 3 SO 3CH 3CH 33.4.2.ábraA zwitterion kapcsolódása a szilikagél felületéhez.A kettősion a polárisabb mozgófázis felé orientálódik, mert a végcsoport egyszervesszulfonsav, amely az alkalmazott pH értékeken ionosformában van. Az alkalmazott szilikagéljellegét nem adják meg, de ismerve a mai trendeket, ez egy Silica B kategóriába tartozó fázis,amelynek összes fémion tartalma kisebb, mint 10ppm. Az állófázis határfelületén tehátimmobilizát kettősion és nem reagált szilanolcsoportoktalálhatók. A szilanolcsoportok molekulárisállapota, mint azt a 3.1. fejezetben, a 3.1.1ábrán bemutattuk, a pH függvényében változik. Ezena pH-n a zwitterionos állófázishatárfelületen kialakult pH-t értjük. A szilikagél felületén, ennélaz állófázisnál, az immobilizált ligand és a szilanolcsoport is poláris, így a felületen kialakul avízréteg. Ennek a vízrétegnek a pH-ja dönti el a szilanolcsoportokmolekuláris formáját.Silica Bcsoportba sorolt szilikagéleknéla szilanolcsoportok pKaértéke 7 körül van. 5-ös pH alatt a szilanol-H-hidas kölcsönhatást tudnak kialakítani. Kvaterner-ammónium ionok nem tudnak H-hidas kölcsön-csoportok döntően protonált (ionvisszaszorított) formában vannak. Ezek a szilanolcsoportokhatásbanrésztvenni, tehát a szilanolcsoport és a láncban lévő szilanolcsoport kölcsönhatásátkizárhatjuk. A láncvégén lévőszulfonsavcsoport, ha hidrogén formában van, azaz ellenionjahidrogén, H-hidas kölcsönhatást tud a szilanolcsoportokkal kialakítani.pH>5 savasságú közegekben a szilanolcsoportok egy részeionizált molekuláris formábanvan. A negatív töltésű szilanolcsoport és a pozitív töltésű kvaterner-ammóniun ion erőselektroviszontasztatikuss kölcsönhatást tud kialakítani. Azionizált, negatív töltésű szulfonsav csoportvíztartalmú mozgófázis felé orientálódik.A módosításnál, a szilícium-atomot és a kvaterner-felülétammonium iont egyhosszabb alkillánc köti össze. Ezaz alkillánc védi az alap szilikagél(3.4.3. ábra), ez lehet az oka, hogy a forgalmazók a felső alkalmazási pH-t nyolcra növelték.3.4.3.ábraA ZIC-HILIion közötti elektrosztatikus kölcsönhatás van, ennek eredményeképp az alkillánc védi a felületet.felülete pH>5 savasságú közegben. Az ionizált szilanol és a kvaterner-ammónium30

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICAz alkillánc hosszát nem adták meg a forgalmazók, de 20 nm pórusátmérőből arra lehetkövetkeztetni, hogy 3-nál nagyobb. Figyelembe véve, hogy a gyakorlatban milyen zwitterionosfelületaktív anyagot használnak, akkor ez valószínűleg dodecilcsoport. A betain 12 elnevezésűfelületaktív anyag ugyanis N-dodecil-N,N-dimetil-aminó-propánszulfonsav.A gyári specifikáció elég szűkmarkú. Ezt a 3.4.1. táblázatban adjuk meg.Kolonna típusa:Átlagos szemcseátmérő:Átlagos pórusátmérő:Maximálisan alkalmazható nyomás:ZIC-HILIC5 μm200 ÅAlkalmazható pH tartomány: 3-8Maximális hőmérséklet: 70 °C40 Mpa (400 bar)Fajlagos felület: 140 m 2 /gNem alkalmazható oldószerek:3.4.1. táblázatA ZIC-HILIC specifikációja a gyártó alapján.THF, DMSO, DKM, ha PEEK a kolonnaházA 3.4.1. táblázatban megadott 20 nm-es (200 Å) átlagos pórusátmérő a módosítás előttiszilikagélre vonatkozik. Az, hogy ez milyen mértékben csökken a módosítás után, az a felületiborítottság függvénye, erre vonatkozó adatokat eddig nem adtak meg. Nem adták meg a módosításutáni fajlagos felületet sem. A 20 nm viszont elég, hogy ne csak a folyadékkromatográfiásan kisvegyületeket vizsgáljuk ezzel a kolonnával.A 3.4.1. táblázat utolsó sorában megadtuk azokat az oldószereket, amelyek a kolonna szerkezetianyagát duzzasztják. Az állófázist ugyanis poliéter-éterketon (PEEK) műanyag kolonnában isforgalomba hozzák. Tilos tehát minden olyan oldószer használata, amely ezt a műanyagot oldja,vagy duzzasztja.A szerves polimer alapú állófázist ZIC-pHILIC névvel hozzák forgalomba. A kis „p” jelzi afelhasználó számára, hogy itt szerves polimer hordozóról van szó. A szerves polimer alap pH tűrő,ami korlátozza az alkalmazott pH értéket, az a polimer-zwitterion kapcsolat.ZIC®-HILICZIC®-pHILICpH taromány: 3-8 pH taromány: 2-10Nyomás: 400 barNyomás: 200 barHőmérséklet: 70 °C Hőmérséklet: 60 °CPórusátmérő: 200 A(20nm)Fajlagos felület: 140 m 2 /gPórusátmérő: 200 A(20nm)Fajlagos felület: N/A3.4.2. táblázatA ZIC-HILIC és a ZIC-pHILIC kolonna jellemzőiHa a 3.4.2. táblázatban megadott paramétereket összevetjük, akkor jól láthatók az alkalmazásikörülmények közti különbségek. Az első a használható pH tartomány. A polimer alapúnál 2-10közötti érték (ZIC-pHILIC). A pH10 az alap polimer és a zwitterion közötti kötéshidrolízisének sebessége jelentősen megnő. A polimer alapból eredően a felső alkalmazhatónyomás 200 barra (20 Mpa) csökken. A felső alkalmazható hőmérséklet ugyancsak 10°C-kal kisebb.31

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICNincs adat a pórus átmérőről és a fajlagos felületről. A szerves polimer alap nagy valószínűséggelsztirol-divinilbenzol koopolimer. A szerves polimereknél csak akkor lehetséges a 200 baros nyomáshasználata, ha a térhálósági fok nagy. Ezeknél a nagy térhálóságú polimereknél a mikropórusokelőfordulási valószínűsége nagy. A mikropórusok minden esetben kiszélesítik a kromatográfiáscsúcsokat, ami az elméleti tányérszám csökkenését okozza.A 3.4.3. táblázatban a szilikagél alapú ZIC-HILIC kolonnák dimenzióit adtuk meg. A rendelkezésreálló kolonna méretek széles skálát mutatnak. Az analitikai mérettől a mikroméreten keresztüla kapilláris kolonnáig terjed.KatalógusszámP/NHosszmmÁtmérőmmSzemcseátmérőμmPórusátmérőÅ2712-052 50 2.1 5 2002712-055 50 4.6 5 2002712-058 50 7.5 5 2002712-102 100 2.1 5 2002712-105 100 4.6 5 2002712-108 100 7.5 5 2002712-152 150 2.1 5 2002712-155 150 4.6 5 2002712-158 150 7.5 5 2002712-252 250 2.1 5 2002712-255 250 4.6 5 2002902-030 30 0.3 3 2002912-030 30 0.3 5 2002902-150 150 0.3 3 2002902-150 150 0.3 3 2002912-150 150 0.3 5 2002902-031 30 1.0 3 2002912-030 150 1.0 5 2002902-030 30 1.0 3 2002912-030 150 1.0 5 2002912-710 5 0.3 5 2002912-750 (5 pcs) 5 0.3 5 2002912-711 5 1.0 5 2002912-711 5 1.0 5 2002712-258 250 7.5 5 2002912-751 (5 pcs) 5 1.0 5 2003.4.3. táblázatA ZIC-HILIC kolonnák választéka, amely az analitikai mérettőla mikroméreten keresztül a kapilláris kolonnáig terjed.32

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICA ZIC-HILIC kolonnák választéka az anlitikai folyadékromatográfiás elválasztásra alkalmastólindul és a nano-folyadékkromatográfiásnál ér véget. Kérdés, hogy adott folyadékkromatográfiáskészülékhez milyen méretű kolonnát válasszunk. Természetes, hogy a kisebb dimenziójú kolonnáknála mozgófázis fogyasztás csökken. Az azonos hatékonyság eléréséhez, ha a töltet minden egyébparamétere a két kolonnában megegyezik, akkor az átmérők arányának négyzetével változik afelhasznált mozgófázis térfogata.(d c1 /d c2 ) 2 F 1 =F 2 [3.4.1.]ahol: d c1 és d c2 a két kolonna átmérő, F 1 és F 2 az 1. és 2. kolonnán mért térfogat-áramlási sebesség.Ha 4,6 mm-es belsőátmérőjű kolonna helyett 2,1 mm-est használunk, akkor a felhasználtoldószer mennyiség a kisebb átmérőjűnél az első kolonnához képest csak 21 %. Az oldószermegtakarítás kb. ötszörös. A 3.4.3. táblázatban megadott 50 mm hosszúságú kolonnák közül azelső, a 2,1 mm belsőátmérőjű használatakor nagy mennyiségű oldószert spórolunk meg. A kisebbretenciós térfogat nagyobb csúcsmaximumbeli koncentrációt jelent, ami növeli az érzékenységet.Ha kromatográfiás rendszer csúcsszélesítő hatása nem teszi tönkre, amit a kolonna tud. Az ötszörkisebb retenciós térfogat azt is eredményezi, hogy a csúcsszélesség, térfogategységben kifejezve,is ötször kisebb lesz. Vegyük a 50 mm hosszú 2,1 mm belső átmérőjű kolonnát. A van Deemterösszefüggés alapján a H min 10μm, akkor az elérhető maximális elméleti tányérszám: 2000, a holttérfogat(V M ) 105 μl, felhasználva a 3.4.2. összefüggést, k=5-nél a retenciós térfogat (V R ) 630 μlV R = V M (1+k) [3.4.2.]Ekkor a σ 2 = 4 μl 2 és a maximálisan a kolonnán kívül megengedett zónaszélesedés ennek 10 %-alehet, azaz 0,4 μl 2 .2σEÖsszetevői2σ A2σ ö2σ Dcell2σ DtP A K Dσ = σ + σ + σ + σ2E2A2ö2Dcell2Dtdetektor elektronika okozta zónaszélesedésdetektorcella okozta zónaszélesedésösszekötő vezetékek okozta zónaszélesedésadagoló okozta zónaszélesedés3.4.4. ábraA kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások a ZIC-HILIC kolonna használatakor.33

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICKolonnahossz(mm)Átmérő(mm)V m(ml)σ(μl 2 )σ 2folyadék-kromatográf502,10,100,4gyors504,60,501,9gyors1002,10,20.8gyors1004,61,003, ,84gyors1502,10,31,2gyors1504,61,55,7gyors, HPLC?2502,10,52,0gyors2504,62,59,5HPLC3.4.4. táblázat5μm szemcseátmérőjű ZIC-HILIC a megengedett kolonnán kívüli zónaszélesítés és alkalmazhatófolyadékkromatográfiás készülék (k=5). A gyors folyadékkromatográf a kiskolonnán kívülitérfogatú készülékeket jelenti, HPLCa hagyományos 400 bar nyomásratervezettet,ahol detektor cellatérfogata 5-10 μl között van.A 3.4.4. táblázat adataiból látható, hogy az 5 μm szemcseátmérőjű ZIC-HILIC oszlopnál ahagyományos HPLCcsak a 250x 4,6 mm-es kolonnánál alkalmazható minden kétséget kizáróan.A 150 x 4,6 mm-es kolonnát csak akkor, ha 1-5 μl térfogatú mintákat adagolunk. A maximálisanadagolható térfogatot úgy döntjük el, hogya különböző térfogatúadagolásokhoz kiszámoljuk azelméleti tányérszámot (N) és az adagolási térfogat függvényében ábrázoljuk (3.4.5. ábra). A maximálisanadagolható mintatérfogat (V injm max) az, amikor az N értéke már 10 %-kal csökken.3.4.5.ábraA maximálisan adagolható mintatérfogat a ZIC-HILIC kolonna használatakor.A maximálisan adagolható mintatérfogat(V injmax ) az, amikor az N értéke már10 %-kal csökken.A 3.4.5. táblázatban a szerves polimer alapú ZIC-pHILIC kolonnákat adtuk meg. Itt kisebb aválaszték. Ebből a táblázatból hiányzik két oszlop; a becsült holttérfogat és a kolonnán kívülimaximálisan megengedett zónaszélesedés. Az utóbbival kezdve. Köztudott, hogy a szervess polimeralapú töltetek pórusszerkezetemiatt szélesebb kromatográfiás csúcsokat kapunk összevetve amegegyező szemcseátérőjű szilikagélekhezviszonyítva. Az a tétel,hogy a H mnkb kétszerese vagyháromszorosa a szemcseátmérőnek, a jó pórusszerkezetű szilikagélre igaz. A szerves polimer alapútöltetek pórusszerkezete gyártmányfüggő, ezért a szilikagél alapú kolonnáknál használt becslés ittnem használható. Az átlagos pórusátmérőt a gyártó megadta ugyan, de póruseloszlás,alak ésjelleg is ismeretlenek, így a holttérfogatotsem lehet ugyanazzal az összefüggéssel becsülni, mintamelyet a szilikagéll alapú ZIC-HILIC-nél használtunk.34

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICKatalógusszámHosszÁtmérő SzemcseátmérőPórusátmérőP/NmmmmmμmÅ2812-052502.1520002812-10210002.1520002812-055504.6520002812-10510004.6520003.4.5. táblázatA ZIC-pHILIC kolonnák választéka, amely az analitikai mérettőla mikroátmérőjű kolonnáig terjed.A ZIC-HILIC sorozatban ismeretes egyúj tag is, ekkor a szilikagél felületéhez olyan kettős iont(zwitter-iontcsoport. immobilizáltak, amikor a külső ion lesz a kvaterner-ion és a belső egy foszforkolin3.4.6. ábraA ZIC-cHILICC kolonna szerkezeti felépítése. Az alap szilikagél.A szilikagél felületén kettős ionokat immobilizálni az állófázis előállítóknál ma már rutinfeladat.Ezekből a módosításokból mutatunk be néhányat.CH CH 3O NHEMA-DMAESSO 3CH 3CH CH 3O NSO 3S300-ECH-DMA-PSCH 3CH 3NSO 3S300-TC-DMA-PSCH 3CH 3ONSO 3S300-MAA-SPEOOCH 3PolyDAEMA + (SiO 2 )-graftedCH 3silicaO35

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICNHNHONH 2OHis-SiO 2Si O Si OOHSi O Si OOOCLys-SiON H 22NH 2H 2NONH 2NHArg-HEMANHOCH 2CH 3ZIC-HILIC (SeQuant,NSO 3Merck)CH 3OOOO OOPOOOOP OOONNn-1 KS-polyMPCOOOHSiN N SO 3 HClSilmPSOOHSiOS N NSO 3 HSilmBsCF 3 SO 336

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICOOOOO O ONHNHNH NH NHO OOPolyCAT A (PolyLC, USA)OONH N H 3NH NHSi O Si NHOSi O Si NHOOO P CH 3O N CH 3OCH 3IAM.PC.DD (Regis Tech)Si O Si NHO3.4.6. táblázatKettős-ion immobilizálás a szilikagél felületén.Ugyancsak kettős-ion (zwitter-ion) szerkezetet mutat az Obelisc N kolonna. Az „N” megjelölésa normál fázisra utal. A fázis szerkezetét a 3.4.7. ábrán mutatjuk be.Hidrofil lánc+++++++++- - - - - - - - -3.4.7. ábraObelisc N kolonna határfelülete. A pozitív és negatív töltéseket hidrofil lánc köti össze.A pozitív és negatív töltéseket hidrofil lánc köti össze, így a fázis poláris jellegű. HILIC módban,mind a töltés körüli részeket, mind a hidrofil láncot hidrát búrok veszi körül. Így teljesül az feltétel,hogy az állófázis felületén vízréteg van, ami polárisabb a mozgófázisnál. A ZIC-HILIC-hez képestfordított töltéshelyzet az ionos vegyületeknél eltérő visszatartást és szelektivítást eredményez.37

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC3.5.Egyéb állófázis típusok a HILIC-banAlpert, aki a HILIC módszert illetve a vizes fázisúnormálfázisú kromatográfiás módszer nevétadta annak, az aminopropil-szilánt poliszukcin-imiddel módosította, ezzel egy új típusú HILICállófázissorozatnakadta meg az alapját.Azígy kialakított állófázisfelületén szulfonsav csoportok találhatók. A kémiai kötéstt savamidcsoportok biztosítják, amelyek polárisak. A határfelületi fázisban az anioncserélő csoportok és asavamidcsoportok is hidrátburokkal vannak körülvéve. A visszatartást két fő hatás szabja meg:a vízrétegbe való beoldódás és az ionos kölcsönhatás.A ciklodextrint tartalmazó szilikagélek is felhasználhatók HILIC állófázisként. Építőegységeiα-kötésben lévő glükózok (3.5.1. ábra). Különböző tagszámú ciklikus vegyületet kialakítva.Három típust alkalmaznak, α-CD, β-CD, γ-CD (3.5.2. ábra), sorrendben hat, hétilletve nyolc glükózegységből épülnek fel. A cikolodextrinekbelső része apoláris jellegű. A belső részre kerülnek aC-O-C kötések, amelyek elektrondonorok ugyan, de ezt kötés-típust tartalmazó vegyületek polaritásakicsi, a külső részenvannak a –CH 2 OH csoportok, amelyek erős H-hidas kölcsönhatást alakítanaka vízzel. A nagy acetonitril artalmú mozgófázisoknál adott, hogy a felületi fázisban vízrétegalakuljon ki.3.5.1. ábraγ-Ciklodextrin szerkezete, az üreg belső része apoláris, míg a külső részén azalkoholos hidroxilcsoportok erős H-hidas kölcsönhatást alakítanak ki a vízzel38

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILIC3.5.2. ábraA 6, 7 és 8 glükóz egységbőlfelépülő ciklodextrinekk jellemző méretei.Cilodextrinekα-CDβ-CDγ-CDBelső átmérő [nm] Külső átmérő [nm]0,571,370,781,530,951,693.5.1. táblázatCiklodextrinek adataiMagasság [nm]0,780,780,78A kettős-iont tartalmazó állófázisoknál bemutattuk, hogy a szilikagél vagy szervess polimerfelületénsokionos anyag immobilizálható,ugyanez elmondható,bármely nem ionos, de poláriscsoportra. Ezeket a poláris csoportot tartalmazó állófázisokat, amelyek apoláris karaktere elhanya-hogygolható, mind használhatjuk HILIC állófázisként. Az egyes állófázis típusoknál bemutattuk,több kölcsönhatás szabja meg a visszatartást és ezzel a szelektivitást is. Ezt azért emeljük ki ismét,mert az állófázis előállításánábekövetkező bármelyváltozás a kolonnáról-kolonnáratörténőreprodukálhatóságot megváltoztatja. Hosszú távú használat során azokra a kolonnagyártókra kelltámaszkodni, akik a sarzsról-sarzsra történő reprodukálhatóságott biztosítanii tudják. Ez különösfontos a HILIC alkalmazásánakmai fázisában, amikor kevés adat áll rendelkezésre a kolonnastabilitásról és a reprodukálhatóságról.39

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC4. Mozgófázisok a HILIC gyakorlatábanA HILIC-ban használt mozgófázisoknak is eleget kell tenni azoknak az általános feltételeknek,amelyeket akár a normál, akár a fordított fázisú folyadékkromatográfiában megköveteltünk.Ezeket most felsorolásszerűen adjuk meg.• kis viszkozitás• nagy tisztaság• szilárdanyag mentesség• gázmentesség• UV detektálásnál kis UV cut-off• kis mértékű kipárolgás• kis toxicitás• gazdaságosságAz általánosan megadott követelmények mellé jön az a HILIC megszabta követelmény,hogy kevésbé kell polárisnak lenni, mint az állófázis felületén kialakult vízrétegnek. A nemzetköziirodalomban ezt úgy adják meg, hogy apolárisabbnak kell lennie, mint az állófázis. Figyelembevéve a vízzel elegyedő, kis viszkozitású oldószereket, amelyeket önmagukban szintén polárisnaktekintünk, javasoljuk a valóságot jobban megközelítő, kevésbé poláris kifejezés használatát.A HILIC módszernél a mozgófázisnak kis mennyiségű vizet minden esetben kell tartalmaznia,mivel általánosan elfogadott, hogy az állófázis felületén kialakult vízréteg és a kevésbé polárismozgófázis közötti eltérő megoszlás eredményezi a komponensek eltérő vándorlási sebességét.A HILIC a poláris, ionos és könnyen ionizálható vegyületek meghatározási módszere. Minél ionosabbvagy polárisabb a vizsgált molekula, annál kevésbé tartózkodik a kevésbé poláris mozgófázisban.Ha növeljük a mozgófázis víztartalmát, akkor a vegyületek többet tartózkodnak abban, és így avisszatartásuk csökken (4.1.)k=n s /n m [4.1.]ahol: az n s és n m az álló-és a mozgófázisban az anyagmennyiség mólokban kifejezve.Ennek fényében a víz lesz a legerősebb mozgófázis összetevő, mert növelésével a visszatartáscsökken. Ehhez a vízhez kell a vízzel elegyedő, lehetőleg kis viszkozitású szerves oldószertadni. Amennyiben a víz mennyiségét jelentősen növeljük, gyakorlatilag a kolonnára adagolt vegyületekcsak a mozgófázisban tartózkodnak. Ennek eredménye, hogy a holtidőhöz közeli időveleluálódnak a kolonnáról. Ez egyben azt is jelenti, hogy csak egy adott értékig csökkenthetjük avíztartalmat. A vegyület szerkezetétől és az állófázis milyenségétől függően ez a víztartalom nemlehet nagyobb, mint 30-40 %. A HILIC-nál az erősebbik oldószer koncentrációja a mozgófázisbankorlátozott. 30-40 tf.% felett a poláris és/vagy ionos vegyületek a holtidőnél eluálódnak. Víztartalomoldaláról nézve a mozgófázis víztartalma 2-40 tf% között változhat.Nézzük, hogy milyen szerves oldószereket használhatunk és hogyan viszonyul a mozgófáziserőssége a vízhez. A vízhez polaritásban a metanol áll a legközelebb. Ezért a poláris és ionosvegyületek kölcsönhatása a víz után ebben a legerősebb. Így az eluenserősségi sorban a víz utána metanol következik.Az etanol is erős H-hidas kölcsönhatást tud a vegyületekkel kialakítani. Sok vegyületnél azeluenserősségi sorrendben a metanolt követi. Problémát okoz, hogy az etanol-víz elegynek nagya viszkozitása. Az etanol viszkozitása 1,2 cP, 25 °C-on. Használata ezért elenyésző.40

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICAz eluenserősségi sorban a következő oldószer az acetonitril. Az acetonitril több szempontbólis nagyon előnyös mozgófázis összetevő. A 4.1. ábrán adtuk meg azoknak a biner elegyekneka viszkozitás változását a szerves oldószertartalom függvényében, amelyeket a HILIC gyakorlatábanalkalmazunk. A HILIC-nál a 60 tf. % feletti koncentrációra kell koncentrálnunk. 60-70 tf.%között az acetonitril-víz elegy viszkozitása harmada a metol-víz elegyének. Ez két szempontból iselőnyös a kis viszkozitás szűkebb kromatográfiás csúcsokat eredményez, másrészt a Darcy törvényértelmében a nyomásesés kisebb (4.2.)φηLuΔ p =[4.2.]2d pahol:Δpd pt MηLnyomásesés a kolonnánátlagos szemcseátmérőholtidőmozgófázis viszkozitásakolonna hossza4.1. ábraViszkozitás változás a szerves oldószer-víz összetétel függvényében41

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICOldószerUV cut-off[nm]Refraktívindex (20°C)Viszkozitás[cP]Forrpont[°C]Polaritás[P’]Acetonitril 190 1,3441 0,38 81,6 5,8Dioxán 215 1,4224 1,37 101,3 4,8Etanol 210 1,3614 1,20 78,0 n.a.2-Propanol 205 1,3772 2,40 82,3 3,9Metanol 205 1,3284 0,55 64,7 5,1Tetrahidrofurán 212 1,4072 0,55 66,0 4,0Víz 190 1,3330 1,00 100,0 10,24.1.táblázatA HILIC-ban alkalmazott mozgófázisok és tulajdonságaiMűveleti szempontból ez annyit is jelent, hogy a kis viszkozitás kis áramlási ellenállástjelent (4.3), ezért a térfogatáramlási sebesség növelhető. Kérdés, hogy ez mennyire rontja le akinetikai hatékonyságot.2ptM2Δpdφ =[4.3.]ηLA 4.2. ábrán mutatjuk be hogyan befolyásolja a viszkozitás változása a kinetikai hatékonyságot.4.2. ábraAz elválasztás hatékonyságának függése a mozgófázis viszkozitásától.A 4.2. elvi ábrán látható, hogy a megnövelt térfogatáramlási sebesség, amellyel arányosan nőa mozgófázis lineáris sebessége is, a kis viszkozitású mozgófázisnál csak kis mértékű hatékonyságvesztéssel jár. A 4.2. ábrán a ΔH jelenti a kinetikai hatékonyság veszteséget a legnagyobb hatékonysághozképest (H min ). Acetonitil-víz elegy használatakor a térfogatáramlási sebességet 3-6 ml/percértékre lehet növelni, ezzel arányosan az elemzési idő csökken.A jó minőségű acetonitril UV cut-off értéke a 4.1. táblázat szerint 190 nm. Ez azért fontos,mert minél kisebb a detektálási hullámhossz, annál több vegyületet lehet az általánosan elterjedtUV detektorral mérni.Az eluenserősségi sorban a következő oldószer a terahidrofurán (THF). Viszkozitása a metanolvízés az acetonitri-víz közé esik. A nem stabilizált THF UV cut-off értéke 212 nm. Csak akkor42

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICalkalmazhatjuk, ha a vegyületeket e fölötti hullámhosszon tudjukdetektálni.A THF a polimereknagy részét duzzasztja, így hosszú távú használatkora PEEK-t is; ha a HILIC kolonnáknak ez aszerkezeti anyaga, akkor használata nem ajánlatos.Azetanol és az izopropanol viszkozitása nagy, tehát sem nyomásesési,sem zónaszélesedésioldalról nézve nem kedvező a használata.Néhány irodalom ajánljaa még az aceton használatát. Az aceton kis viszkozitású ugyan deaz UV cut-off-ja 250 nm fölött van. Ezt az UV detektáláskor figyelembe kell venni.Végezetül megadjuk a különböző binér-elegyek H-u görbéit (4.3.ábra.)4.3. ábraKülönböző binér-elegyek H-u görbéi a lineáris áramlási sebesség függvényében.Az acetonitril-víz elegy adja a legkisebb H értékeket, használatakorlegnagyobbazelválasztáss hatékonysága. Használata a HILIC-ban ajánlatos.A különböző oldószerek elúciós erőssége a következőképpen változik.szer a víz, ezt követi a metanol,majd az acetonitril végül a tetrahidrofurán.A legerősebb oldó-víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán.A szelektivitást a HILIC-ban több tényező együttesen szabja meg. Attól függően, hogy milyenállófázist használunkés az hányfajta és erősségű kölcsönhatásra képes a vegyülettel, ez lesza döntőfaktor. Egy adott állófázisnál a szelektivitás általában fordítottan változik az eluenserősséggel.Ennek megfelelően a szelektivitási sorrend:víz

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC5. A pH kontroll és a vegyületek szerkezete köztiösszefüggésA HILIC-nál, ugyanúgy, mint a RP-HPLC módszernél a pH kontrollra több szempontból isszükséges lehet. Az első szempont, hogy a vegyületek molekuláris formája vagy azok aránya azelválasztás körülményei között állandó legyen. Ha ez a feltétel nem teljesül, akkor a másodlagosegyensúlyok miatt a kromatográfiás csúcs kiszélesedik, és a visszatartás is változhat. Ha az állófázisfelületén savas vagy bázisos csoportok vannak, azokra is érvényes, hogy a molekuláris formájuknem változhat, mert az kölcsönhatás változást okoz, ami csúcsszélesedés és visszatartás változástokozhat. A molekuláris formák állandóságának tétele, mind az állófázisra, mind a mozgófázisbanfeloldott vegyületekre igaz.A pH kontroll szükségességének megítélése előtt a szerves vegyületeket kromatográfiásszempontból csoportokba kell sorolni. Hangsúlyozzuk, hogy a szerves vegyületek osztályba sorolásakizárólag a folyadékkromatográfiás szempontok alapján történik. A HILIC-nál is első eldöntendőkérdés, hogy kell pH kontroll vagy a vegyületek oldaláról nézve ez nem szükséges. Ennek a csoportosításnaka vezérlő elve tehát, hogy a mozgófázis pH-jának változtatásával megváltozik-e a vegyületekmolekuláris formája. Mindazon esetekben, amikor ez bekövetkezik, akkor pH kontroll kell, hogybiztosítani tudjuk a molekuláris formák állandóságát és ezzel összhangban a visszatartást és azónaszélesedést. Ebben a megközelítésben a mozgófázis oldaláról vizsgáljuk, azokat a követelményeket,amelyekkel az elválasztás fő paramétereit állandó értéken tudjuk tartani.Az utóbbi évek kutatásai nyilvánvalóvá tették, hogy a szilikagél alapú állófázisoknál aszilanol csoportok molekuláris formáit is állandó értéken kell tartani, ahhoz, hogy a visszatartás,a zónaszélesedés és a csúcs szimmetria ne változzon. Lehetséges olyan eset is, hogy a vegyületmolekuláris állapota pH független, de a szilikagél alapú állófázis megköveteli a pH kontrollt.HILIC szempontból a vegyületek négy csoportra oszthatók:1. kromatográfiás szempontból semleges vegyületek2. savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek3. bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek4. ionos vegyületekAz 1. osztályba tartoznak azok a nagy polaritású vegyületek, amelyek kis apoláris rész(hidrofób) rész mellett olyan poláris csoportokat tartalmaznak, amelyek a kromatográfiás körülményekközött használt pH-n nem változtatják a molekuláris formájukat. Az alkalmazott pH tartományokataz 5.1. táblázatban adtuk meg.Állófázis típuspH tartománySzilikagél 2-7Szilikagél alapúak 3-7 (8)Szerves polimer alapúak 2-105.1. táblázatKülönböző HILIC állófázisok és alkalmazási pH tartománya. Ezeken a pH értékeken belül kelldolgoznunk ahhoz, hogy az állófázis élettartama megfelelő legyen.44

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICEbbe a csoportba tartoznak a poliol vegyületek, például a szaharidok és poliszaharidok.Ezeknél a vegyületeknél nem kell pH kontrollt használni, ha az állófázis vagy a mátrix komponenseknem követelik meg.A savas funkciós csoportot tartalmazó vegyületek a pH-tól függően két molekuláris állapotbanlehetnek jelen, s ezeknek a mozgófázisban való oldhatósága eltérő. Ebből következik, hogy hapH-kontroll nélkül próbálnánk mérni, és a körülmények valami miatt megváltoznak, akkor a molekulárisformák aránya is változni fog, ami pedig a visszatartási tényező definíciójának megfelelően(k=n s /n m, az n s a mólok száma az állófázison és a n m a mólok száma a mozgófázisban) a retenciómegváltozását eredményezi.A fentiekből egyértelműen kitűnik, hogy a pH-kontroll célja biztosítani a mozgófázisban amolekuláris formák arányának állandóságát, illetve, hogy kizárólag az egyik vagy másik formalegyen jelen. HILIC-nál a nagyobb polritású vegyületek visszatartása a nagyobb. A savas csoportottartalmazó vegyületeknél fontos a pH kontroll, azért is, hogy a minimális visszatartást elérjük(k>1). Az 5.1. ábrán adtuk meg a savas csoportot tartalmazó vegyületekre az ionizáltsági diagramot.Ha vegyület ionizációja (disszociációja) elhanyagolható, akkor az ionizáltsági fok 0, ha az ionvisszaszorított forma arány elhanygolható, akkor I=1, ha pKa= pH, akkor I=0,5. A pKa értékhezképesti 2 pH egységgel való eltolás annyit jelent, hogy a molekuláris formák aránya 100/1, amiaz egyik molekuláris forma dominanciáját jelenti.ionizáltságI1I = 1ionizált sav0,5-2 +2nemdisszociáltsavI = 05.1. ábraIonizáltság változása a pH függvényében savas csoportot tartalmazó vegyületeknélA pH-ionizáltsági fok savas vegyületek esetében, a) ion visszaszorított forma, b) teljesen ionizált,c) mind két forma jelen van a mozgófázisbanAz ábrán három tartományt különböztethetünk meg:1. A pH=pK a −2 értéknél savasabb tartományban a vegyület ion visszaszorított formábanvan jelen, ezt a formát a szakirodalom semleges formának is nevezi. Pontosabb, ha a savascsoportot tartalmazó vegyület semleges formájáról beszélünk. A vegyületek apoláris jellegenagy mértékben megnő. Az esetek többségében a HILIC körülmények között a holtidő körüleluálódnak. Ezt a tarományt el kell kerülni a hatékony elválasztás érdekében.pK apH45

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC2. A pH=pK a +2 értéknél lúgosabb tartományban a molekula ionos formában van.A savascsoportot tartalmazó vegyületeknél ez jelenti legpolárisabb molekuláris formát és a legnagyobbvisszatartást. Efölött a pH érték felett a pH megváltozása nem jár a vegyület visszatartásánakváltozásával.Stabil, robusztus a rendszer, HILIC szempontjából ez jelenti a jó működést, haa szilikagél alapú állófázisok megengedik ennek a pH-nak a használatát..3. A pH= pK a ±2 tartományban a molekula mindkét formája jelen van, a visszatartás (retenció)attól függ, hogy milyen a két forma aránya. Itt több kölcsönhatás típus játszik szerepet azelválasztásban, s mivel ez zónaszélesítő hatású, a csúcs általában széles. Emellett a módszernem robosztus, hiszen kis pH változás esetén a két molekulaforma arányának megváltozásamiatt jelentős retencióváltozás következhet be.A megfelelő pH és a puffer kiválasztásához a vegyületek pKa értékét ismerni kell. Ezt vagya szakirodalomból keressük ki, vagy megmérjük, vagy intelligens programok segítségével avegyületek szerkezeti képletéből előre jelezzük (prediktáljuk).A továbbiakban egy kereskedelmi forgalomban lévő program csomagra hivatkozunk, amellyelezek az értékek meghatározhatók. A program kombinálja a lgP és pKa értékeket, hogy előre jelezze,hogyan változik meg a szerves vegyület megoszlása az oktanol és a víz közöt (5.2. ábra).Ezt a modult lgD-nek nevezik. A lgk érték szoros korrelációt mutat a lgD értékkel a pH függvényében.lgDionvisszaszorítottformapk aionosformapH5.2. ábraA lgD-pH összefüggés a Pallas intelligens szoftverrel előre jelezve.A lgD-t nevezhetjük a lgP pH függő formájának. A lgP vagy lgK ow az n-oktanol és víz közöttimegoszlást adja meg. HILIC-nál víz és egy kevésbé poláris mozgófázis közti megoszlás van. Az n-oktanol-víz és a HILIC-nhál tapasztalt fázisviszonyok inverzei egymásnak. Minél nagyobb a lgP,annál kisebb a vegyületek visszatartása a HILIC-ban. Saját tapasztalat, hogy általában, ha lgP1).A szakirodalomban, az erre témára vonatkozó, kevés számú közleményben ez az érték -0,5. Azelválasztások tervezésénél a lgP helyett a lgD használata előnyösebb, a későbbiekben ezt fogjukhasználni. A lgD megadja, hogy adott ionerősség és puffer koncentráció mellett hogyan függ azadott vegyület megoszlása az apoláris oktanol és a poláris víz között. Tekintettel arra, hogy aHILIC és az oktanol-víz hasonló megoszlási rendszert jelent, de inverzei egymásnak, ezt figyelembevéve, használhatjuk a Collender-típusú megközelítést:lgk=-algD+b [5.1]ahol: a és b rendszer állandók46

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICEz egyben annyit jelent, hogy a vízre vonatkozó lgD értékek megfelelő korrekcióval átvihetőka HILIC elválasztásra. Ezt a korrekciót tartalmazza a „a” és „b” együttható.A 3. csoportba vagy osztályba sorolt vegyületek azok, amelyek bázisos csoportot tartalmaznak.Az ionizációs viszonyokat az 5.2. ábrán adtuk meg.ionizáltság1protonált bázisI0,5-2 +2pK aszabad bázis5.3. ábraIonizáltság változása a pH függvényében bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknélpH.• A pH=pK a −2 értéknél savasabb tartományban a molekula ionos formában van jelen (a.),ez jelenti a poláris molekuláris formát, amely a mozgófázisban kevésbé jól oldódik, ennekmegfelelően visszatartása a szabad bázishoz képest nagy mértékű. A kölcsönhatási lehetőségekszáma kicsi, nincs több egyensúly egymás mellett, ezért kis zónaszélesség ésszimmetrikus csúcs várható.• A pH=pK a +2 értéknél lúgosabb tartományban ion visszaszorított formában (szabad bázis).Ez jelenti az apolárisabb molekuláris formát, amely kölcsönhatása az állófázissal kisebb,mint a protonált formáé. A nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisoknál a bázisoscsoportot tartalmazó vegyület a holtidő körül eluálódik.• A pH= pK a ±2 tartományban (c. tartomány) a molekula mindkét formája jelen van, többegyensúly lehetséges, ennek megfelelően széles csúcs és egyes esetekben aszimmetria várható.A szilikagél alapú állófázisoknál ebben a pH tartományban a szilanol csoportok egyrésze is ionizált molekuláris formában van. A negatív töltésű szilanol anion erős kölcsönhatásbalép a pozitív töltésű, protonált bázikus csoporttal. Az ioncserére alkalmas helyekszáma korlátozott, ezért ezeken a helyeken hamar túltelítés következik be, amely eredményeszéles aszimmetrikus kromatográfiás csúcs..A lgD-pH és a lgk-pH között ugyanaz a Collendar-típusú összefüggés érvényes (5.4. ábra),amelyet a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél már bemutattunk (5.2. ábra). Az 5.4. ábránbemutatott pH-lgD görbe a Pallas intelligens programmal előre jelezhető. A lgD adatok korrekciókkalfelhasználhatók az elválasztás tervezésére.47

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIClgDionvisszaszorítottformapk aionosforma5.4. ábralgD-pH összefüggés bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél.pHMa az alkalmazott mérési módszerekkel szemben alapvető követelmény, hogy robosztus legyena módszer. Ebből következik, hogy amennyiben ez lehetséges, mind a savas, mind pedig abázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek esetében az ionizált formának megfelelő pH-tkell beállítani.A 4. csoportba sorolt vegyületek a HILIC állófázisok által megengedett pH tartományban nemváltozik meg a molekuláris formájuk. Ha pH kontroll kell, akkor az az állófázis miatt szükséges.5.1. Puffer választás a HILIC –banA HILIC-ban is a puffereknek eleget kell tenni az általános követelményeknek. Ezek közül alegfontosabb, hogy a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisból ne váljanak ki. Idegen kifejezésselkompatibiliseknek kell lenniük a mozgófázissal.Mielőtt ezt a részt tovább tárgyalnánk, nézzük meg, hogy a folyadékkromatográfiás gyakorlatbanmit nevezünk puffereknek.A pufferoldatok pH-ja jól definiált, sav illetve bázis hozzáadásakor kevéssé változik. A pufferoldatokgyenge savból (vagy bázisból) és a gyenge sav (bázis) erős bázissal (savval) alkotott sójábólálló rendszerek. Folyadékkromatográfiás gyakorlatban alkalmazunk olyan anyagokat is, amelyeka fenti definíciónak nem felelnek meg viszont pH változás tompító hatásúak. Ha a pH tompítóhatást tesszük meg a puffer definiciónak, akkor ezek az anyagok is a puffer kategóriába kerülnek.A pH változást tompító oldatok egyik fő jellemzőjük a pufferkapacitás.A pufferkapacitás (ß) a pufferoldatok tompítóhatását jellemzi, definíciószerűen valamelyerős bázisnak (b) vagy erős savnak (a) az a mennyisége [mol/dm 3 ], amely a pufferoldat pH-játegy-egységgel változtatja meg:βHA= 2 , 3⋅ccsavsav⋅ c+ cahol: β HA puffer-kapacitásC sav puffer gyenge sav komponensealkalmazott gyenge sav bázissal képzett sójaC sósósó[5.1.1]Mielőtt a pH tompító hatású anyagokkal (pufferek) szemben támasztott általános követelményeketvizsgálnánk, néhány, a kiválasztásuknál fontos gyakorlati szempontot vizsgálunk meg.48

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICElőször is puffer használata savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél szükséges.Az ionos vegyületek bevitele a mozgófázisba az esetek többségében csökkenti az állófázis stabilitását.• a puffer tartalmú mozgófázisnak szilárd anyagtól mentesnek kell lennie. Mindig szűrnikell a puffer oldatot, HPLC-nél kb. 0,5μm-es ,az UPLC-nél 0,22 μm-es pórusátmérőjűmembránszűrővel.A következő kritérium a detektálással függ össze. A puffer komponenseknek is van fényelnyelése,amennyiben ez túl nagy az adott hullámhosszon, akkor lehetetlenné teszi a mérést. A fényáteresztést a tiszta puffer komponensekre adjuk meg, a gyakorlatban 0,2 mol/l feletti koncentrációbannem használjuk azokat, így a megadott értékeknél kisebb hullámhosszon is mérhetünk.Alap kritérium puffer fényelnyelésével kapcsolatban, hogy• a puffer tartalmú mozgófázis UV cut-off hullámhossza kisebb legyen, mint a mérésnélalkalmazott hullámhossz.• puffer tisztasági követelménye. Kromatográfiás minőségű, tiszta puffer még nem kapható,így mindig az elérhető legtisztább anyagot kell alkalmazni. Nem megfelelően tisztapuffert tartalmazó mozgófázis in-situ módosíthatja az állófázis felületét, illetve gradienselúciónál szellemcsúcsokat eredményezhet.A HILIC alkalmazásánál kritikus a puffer kompatibilitása a mozgófázissal. A nagyacetonitril és metanol tartalmú mozgófázisoknál a szerves alapú pufferek használata ajánlatos.Ezeknél is figyelembe kell venni az oldhatóságot, sok esetben 25 mmol/dm 3 feletti pufferkoncentrációkesetén megnő a szilárd anyag kiválás veszélye. A használható legnagyobb pufferkoncentrációt a mozgófázis szerves oldószer tartalma szabja meg. Figyelembe véve, hogy ennél amódszernél 70 tf.% feletti szerves oldószer tartalmat használunk, minél jobban közelítünk a vízmentesmozgófázishoz, annál kisebb a megengedett puffer koncentráció. Kivételként említjükmeg, hogy 70-80 tf.% szerves oldószer tartalomnál az irodalomban 200 mmol/dm 3 koncentrációtis alkalmaztak.A nagy szerves oldószer tartalom miatt a puffer típus megválasztása kritikus. A szervetlenpufferek, így a foszfát pufferek a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázisokban nem oldódnak.Más szavakkal inkompatibilisek a mozgófázissal. A pufferek közül csak a szerves komponenstartalmúak jöhetnek szóba, ezekammónium-acetát/ecetsavammónium-formát/ hangyasavammónium-citrátok/citomsavaktris/tris HCltrietilamin-foszfátA HILIC módszernél a legtöbbet használt oldószer az acetonitril. A fenti pufferek oldhatóságais korlátozott ebben sz oldószerben. Az eddigi gyakorlat szerint 25 mmol/l feletti alkalmazásukkora só kiválás veszélye megnő. A vegyületek többsége, amelyeket ebben a kategóriában találunknem tartalmaz UV-fényt elnyelő csoportot. Detektálásukhoz vagy tömegspektrométert, vagyELSD vagy koronakisülésen alapuló aeroszol detektort kell használni, ekkor az ammónium-sóformában lévő vegyületek használhatók pufferként, mert nagyobb hőmérsékleten elpárologtathatók(illékony pufferek).Tompító hatású anyagokként, azaz a folyadékkromatográfiás gyakorlatban pufferkénthasználatosak a következő anyagok:hangyasavecetsavtrifluorecetsav49

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA HILIC-ban az egyik leggyakrabban alkalmazott tompító hatású anyag (puffer) az ammónium-tarto-acetát. Az ammónium-acetát két pH tartományban használható (5.1. ábra). A 3,5-5,5 köztimányban és 8,5-10,5 köztiben. Ahogy az ábrából látható, hogy 3,5 pH alatt, az 5,5-8, ,5 közöttkicsi a pufferkapacitása. Az 5.1.1. ábrán bemutatott adatok vizes közegre vonatkoznak.5.1.1. ábraA pufferkapacitás pH és koncentrációfüggése ammónium-acetát puffer alkalmazásakorA HILIC-ban nagy szerves oldószertartalomnál dolgozunk.Ez a tompítóhatású anyagoknál(puffereknél) a pKa érték eltolódását eredményezi. Az 5.1.2. ábrán ezt az eltolódást adtuk meg.5.1.2. ábraAz ammónium-acetát pK a értékének változásaa metanolban a vízhez viszonyítvaAz5.1.2. ábrából jól látható, hogy a változás mértéke márolyan nagy, hogy sokesetbennem férünk be a pKa értékénekk eltolódásával korrigált ±1-es tartományba. A maximális puffer-1-3kapacitás a puffer komponensének pKa±1környezetében van. A vízben mért pK a értéketegységgel korrigálnii kell. Elméletileg még meg nem oldott kérdés, hogy a HILIC-nál a határfelületivízrétegben hogyanalakulnak k a pH viszonyok. Feltehetőleg ebben a vizesrétegben az ionosanyagok, így a tompítóhatásúanyagok (pufferek) feldúsulnak. Ennek eredményeképp a puffer-anyagok(pufferek) kiválasztásánál.kapacitásuk nő. Ebben az esetben a vízre vonatkozó pKa értékekett használhatjuk a tompítóhatású50

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICA puffer készítése és a pH mérés mikéntje a HILIC módszerek reprodukálásánál és adaptálásánális alapvető. Továbbiakban ezt tárgyaljuk. Elsőnek a puffer készítés lehetséges módjait vizsgáljuk.Savas vagy bázikus csoportot tartalmazó vegyületeknél elérkeztünk az egyik központi kérdéshez:milyen pH értéken dolgozzunk. Vagy meddig kell csökkenteni a pH értéket ahhoz, hogy az protonáltformáját kapjuk meg a bázisoknak. Vagy a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél meddig növelhetjüka pH-t, hogy a savaniont kapjuk meg anélkül, hogy a kolonnát tönkretennénk. A szervesvizesrendszerekben a hidrogén-ion aktivitást több tényező együttesen szabja meg, a pH, mintfogalom egy műveleti paraméter, amely mérésének megvannak az egyértelmű szabályai. A protonálódást,a deprotonálódást, és a kolonna tönkremenetelt viszont az oldatok hidrogén-ion aktivitásaszabja meg. Megállapíthatjuk, hogyha csak a puffer pH-ját mérjük, akkor a nem vizes oldatban ahidrogén-ion aktivitás nem adható meg. Így a vizes pufferoldatokra megadott kolonna stabilitásértéke nem számolható ki csak a puffer pH ismeretében. A mozgófázisban mért, de vízre kalibráltpH mérésnél már a hidrogén-ion aktivitások a megadottak alapján számolhatók, amennyiben azelektródoknál a diffúziós potenciál elhanyagolható. A pH skála értelmezésénél mindig a használtmozgófázis összetételéből, és az azt alkotó szerves oldószerből kell kiindulnunk. A pH skálát amozgófázist alkotó oldószerelegy nagy mennyiségű alkotója határozza meg. Viszonyítási alapnaka vizet vesszük: 25 ºC-on a víz önprotonálódási állandójának negatív logaritmusa 14.Azaz a pH skálát 0 és 14 között értelmezzük, metanolnál ez az érték 16,77 a pH skála ennekmegfelelően 0 és 16,77 között értelmezendő, acetonitril-víz esetén a pK a érték 34,40, tetrahidrofurán-víznél34,70.A pufferek kiválasztásánál és a vegyületek ionizáltsági állapotának megítélésénél a pKaközponti szerepet tölt be. A vízre kimért pK a értékek különösen a nagy szerves oldószer tartalomnálváltoznak meg jelentősen. Sajnálatos módon az irodalomban még nem jelentek meg adatok arról,hogy a vízre megadott 1-8 pH közötti stabilitás hogyan vihető át a szerves oldószer tartalmúmozgófázisban mért pH stabilitásra. Spekulatív módon azonban következtethetünk ezekre azadatokra. Például 70 tf.% acetonitril víz elegynél a pH skála kitolódása 3,14, így a fordított fázisústöltet felső pH ( spH ) határa 11 körül van. Ismételten fel kell hívni a figyelmet, hogy ez nem azalkalmazott puffer pH-ja! Mindezekből látszik, hogy a viszonylag egyszerű pH megadási és mérésimódszer adja a használható kolonna pH tartományáról a legkevesebb információt. A kolonnagyártók megadják a felső alkalmazási pH értéket. Nem adják meg viszont, hogy vizes vagy a szervesvizesközegre vonatkozik-e. A HILIC gyakorlatában használt nagy szerves oldószer tartalomnál ahidrogén-ion aktivitás és a vizes közegben mért pH értékek között jelentős eltérés van. Ezért, ha amegadott felső használati pH értéknél dolgozunk, kérdéses a kolonna élettartama!Gyakorlati szempontból is elérkeztünk egy lényeges szemponthoz; hogyan lehetséges úgypuffer oldatokat készítenünk, hogy azok reprodukálhatóak legyenek. Ez a kérdés ismételten visszavezethetőarra, hogy az oldatban mért hidrogén-ion aktivitás még vizes oldatban sem törvényszerűenegyezik meg a mért pH értékkel, továbbá az ion koncentráció is befolyásolja. Következmény,hogy az eltérően készített és a pH mérő által azonos értéket adó oldatok hidrogén-ion aktivitásaeltérő, és a módszer reprodukálásánál eltérő eredményt kapunk. Ezek után nézzük meg, hogyhányféleképpen készíthetjük el a puffert.1. Az ajánlott módszer, hogy az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekből tömeg szerintösszemérjük az oldatokat, és a nemzetközileg elfogadott értéket használjuk. Ez egyértelmű,mindenhol reprodukálható. Amennyiben táblázatban az adott összetételt és a hozzá tartozópH értéket nem találjuk meg, akkor a tiszta komponensekből törzsoldatot készítünk, ezekpH-ja adott és a megadott arányokban összemérjük, és mérjük a pH értéket. A tömegmérésaz egyik legpontosabb analitikai mérésünk.2. Az analitikai-kémiai számításoknál megismert közelítő képlet alapján számítást végzünk:pH=pK a +log C só /C sav51

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICa képlet alapján kiszámoljuk, hogy 0,01 mól/l savhoz mennyi bázist kell adni, hogy 4-eslegyen a pH értéke. Készítsünk ecetsav-ammóniumacetát puffert. pK a =4,76, ekkor bemérünk0,01 mol ecetsavat egy 1000 ml-es normállombikba, majd a számítás alapján hozzáadunk0,015 mol ammónium-hidroxidot, és 1 l-re egészítjük ki. A pH csak körülbelül lesz 4-es értékű,mert a bázisnál nem vettük figyelembe az aktivitásfüggést ( lásd Debey-Hückel elméletvagy Bates-Guenheim közelítés). A hidrogén-ion aktivitás függ a disszociációs állandótól,az egyéb ionoktól, és a mozgó fázisban mért valódi hidrogénion aktivitás, az önprotonálódásiállandótól.2.1. módszer: bemérjük az ecetsavat és ammónium-hidroxiddal-dal 4-es pH értékig titráljuk.Ismételten a hidrogén-ion aktivitás meghatározatlansága okoz bizonytalanságot a retencióreprodukálásában.2.2. módszer: a fenti műveletet a mozgófázisban hajtjuk végre. A mozgófázishoz hozzámérjükaz ecetsavat, és NH 4 OH oldattal titrálva állítjuk be a pH értéket. Ekkor a vízre vonatkoztatottértékhez képest megkapjuk a vízre kalibrált, de a mozgó fázisban mért pH értéket, amelyeltér a vízre vonatkoztatottól és a szerves oldószerre vonatkoztatottól is.A puffer készítésnél, tehát az első módszer ajánlott, módszer átvételnél viszont ellenőriznikell, hogy hogyan készítették.Mivel a HILIC használatakor is a helyes pH megválasztásának döntő szerepe van, továbbá amódszereket csak azonos pH mérési megoldás mellett lehet reprodukálni bemutatjuk a módszereketés rámutatunk azok különbségeire.5.2. A pH mérés lehetőségei és gyakorlata a folyadékkromatográfiábanA pufferek pH-ját az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekhez viszonyítva egyértelműen,és reprodukálhatóan lehet mérni. Kérdéses viszont, hogy mit értünk a mozgófázis pH-ján és hogyanmérjük. Három lehetőség kínálkozik:1. Mérjük a puffer pH-t és ehhez adjuk a szerves oldószert2. Kalibráljuk az üvegelektródot az elsődleges és/vagy másodlagos pufferekre, és utána a készmozgófázisban mérjük a pH-t3. A kalibrációnál az elsődleges és/vagy másodlagos puffereket a mozgófázisba mérjük be, ésa mérést is a mozgófázisban végezzük el.Az első esetben a pH alsó és felső indexében is „w” kell, hogy szerepeljen, a második esetben,az alsó indexben „w”, a felsőben „s”, a harmadik esetben mind az alsó, mind a felső indexben„s”-nek kell szerepelni. A három mérési módszer három eltérő eredményt (számot) ad. Kérdés,hogy milyen folyadékkromatográfiás szempontból lehet érdekes a „valódi” hidrogén-ion aktivitás.Az első lényeges kérdés, hogy a gyártó cégek által megadott pH tartomány a fordított fázisú töltetekremilyen módon mért értékre értendő. A másik lényeges kérdés kapcsolódik a proton funkciósvegyületek elválasztásához (a savas vagy bázikus csoportot tartalmazókra). Az ilyen típusú elválasztásoknála pH alapvető paraméter, mert a vegyületek pK a értékéhez képest kell beállítani.Ahhoz, hogy a hidrogénion aktivitás hatását megértsük, vissza kell mennünk az ionaktivitásáltalános elméletéhez, nevezetesen a Debey-Hückel közelitéshez és a Bates-Guggenheim konvencióhoz.Az előbbi a termodinamikailag nem mérhető egyedi hidrogén-ion aktivitás becslését teszilehetővé, az utóbbi ezt kiterjeszti más oldószerekre is.Az összefüggés a követező:log1/2A · Iγ H = −1/2[5.2.1.]1+a0· B · Iahol γ H az egyedi hidrogén-ion aktivitás, I az ionerősség, A és B konstansok, amelyek azoldószertől és a hőmérséklettől függenek, az a o a szolvatált ionméret.52

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICAz eredeti Bates-Guggenheim konvenció szerint az oldószer víz, és a standard állapotot iserre vonatkoztatjuk, úgyhogy a hidrogén-ion koncentrációt végtelen kicsinek vesszük, akkor az a o · Bértéke 1,5. Ha a fenti adatokat átvisszük más oldószerekre is, akkor az előbbi megközelítés szerintaz alábbi összefüggést kapjuk.s( as0wερ 1/2B) = 1,5[ ]s w[5.2.2.]ε ρahol a felső index s az adott oldószert, míg w a vizet jelenti, ε az adott oldószer és víz permittivitását,a ρ pedig a sűrűséget.Amennyiben a pH-t értelmezni akarjuk a fordított fázisú mozgófázisoknál, akkor a standardállapot nem lehet más, mint az adott oldószer, és ebben a hidrogén-ion koncentrációt végtelenkicsinek vesszük. Ez egy újabb hidrogén-ion skálát jelent. A vízre vonatkozó pH skálát szokás„abszolút” pH skálának nevezni.A két pH skála megkülönböztetésére a IUPAC (Robinson és Stoke alapján), amennyiben apH-t az abszolút értékhez akarjuk hasonlítani, vagy kifejezni vele, akkor a pH alsó indexében „w”szerepel, és a felső indexben „s”. Ha az adott közeg (oldószer) a viszonyítási alap, akkor az alsó ésa felső indexben is „s” szerepel:swss 0pH = pH − log( γ )[5.2.3.]swHamennyiben a vízre definiáljuk a standard állapotot, akkor a két skála megegyezik.Ezeket a meggondolásokat kell alkalmaznunk az összes sav-bázis egyensúlyra is, ahol apH-nak szerepe van. Ennek megfelelően a savi disszociációs állandó negatív logaritmusára is (pK a ):swpKass 0= pK − log( γ )[5.2.4.]sawHEbben az összefüggésben a hidrogénion standard állapotát vizes közegre adjuk meg, ha akoncentrációja tart a nullához; másképpen fogalmazva, ha végtelen híg oldatról van szó, akkorértéke tart a nullához. Nem szabad elfelednünk, hogy értéke függ az oldatban található egyébionoktól is. Folyadékkromatográfiás körülmények között viszont a viszonyítási alap az adottmozgófázis. Ez okozza a hidrogénion aktivitása közti eltérést!Ha a három módszerrel ugyanazt az értéket olvassuk le a pH mérőről, tudnunk kell, hogy azhárom nagyon eltérő hidrogén-ion aktivitást jelent. Ha vegyületek oldaláról nézzük az ionos és a nemionos molekuláris formák aránya nagy mértékben változik. Ez pedig a visszatartás változásával jár aHILIC-ban. Reprodukálni csak akkor lehet egy módszert, ha pH mérés ugyanazon módszerrel történik,mint, amelyet a módszer kidolgozásánál alkalmaztak.53

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC6. A visszatartástt megszabó tényezőkés törvényszerű-ségek a HILIC-banA folyadékkromatográfiás gyakorlatban, ahol a vegyületektöbbféle molekuláris formábanlehetnekjelen a mozgófázisban, biztosítani kell, hogyaz elválasztás során az arányukállandólegyen. Így van ez a HILIC-nál is. A módszer kidolgozásnál, vagy az átvett módszer megítélésénélelső feladat, annak eldöntése, hogy kell-e alkalmaznunkpH kontrollt. Ennek megítéléséhez ismernünkkell a vegyületek pKa értékeit. Azt kell mondanunk, hogya pKa ismerete nélkül nem lehet a módszer-fejlesztésnek nekikezdeni. Ezt azanyagi állandót vagy valaki már megmérte és közzé tette az irodalétezneklomban, vagy nekünk kell különböző módszerek alkalmazásával megmérni, vagy ma márolyan szakértői programok, amelyekkel a vegyületszerkezetek alapjánelőre tudjuk jelezni (prediktálni)azokat. A pKa ismeretében és azállófázis pH tűrését figyelembe véve dönthetünk arról, hogy kell-epH kontroll. Szilikagél vagy szilikagél alapúHILIC állófázisokat 2-8 vagy 3-7-es pH tartománybanhasználhatjuk. Savas csoportott tartalmazóvegyületeknél a pKa-2pH értékekk alatt a vegyületekdisszociációja elhanyagolható. Ha az állófázis felső használati pH-a8, akkor azok a savas csoportottartalmazó vegyületek, melyek pKa értéke 10, az ilyen közegben már ion visszaszorított formábanvannak. Ezeknél a savas csoportot tartalmazó vegyületeknél nem kell pH kontroll. Ha az állófázisfelső használati pH-közegben már ion visszaszorított formában vannak. Bázisos csoportot tartalmazóvegyü-7, akkor azok a savass csoportot tartalmazó vegyületek, melyek pKa értéke 9,az ilyenleteknél,ugyanezt a metódust követve csakmost az állófázisok alsó pH tűrési határait kell figye-dolgozunk, az ionizációs viszonyok úgy változnak meg, hogy savak pKa értékei a vízhez képestlembe vennünk, ez az érék 0 vagy 1. A HILIC –nál, aholnagy szerves oldószer tartalmú közegekbennőnek, a bázisos csoportot tartalmazóké viszont csökkenek. A vízre vonatkozóértékek tehát nagybiztonságot nyújtanak a pH kontroll megítélésére. Ezt mutatjuk bea 6.1. és 6. 2. ábrákon.6.1. ábraSavas csoportott tartalmazó vegyületek elválasztásaa savas pufferrel.Az 1. görbe a vizes közegben adja meg a vizsgálandóvegyületre a molekuláris formák arányát,a 3. nagy szervess oldószer artamú közegben. A 2. és 4. görbék a puffer ionizációs viszonyaitadják meg vízben és nagy szerves oldószer tartamú közegben.A 6.1. ábrán az I=0,5ionizáltsági állapot jelenti a pKa értéket. Egyértelműen látható, hogy a vegyületpKa értéke is, és például a HILIC-ban sokat használtammónium-actát/ecetsav pKa értéke is anagyobbb pH értékekk felé tolódott el. Ez abból a szempontból is fontos, mert fellép a kompenzációseffektus és az azonos eltolódás miatt megmarad a rendszer pufferkapacitása, mert benne maradunka pufferre megadottt pKa±1 tartományban. Az elválasztás tervezésénél a vízre vonatkozó adatokkalszámolhatunk. Ennek feltétele, hogy savass csoportot tartalmazó vegyületeknél savat artalmazótompító hatású (puffert) anyagot használjunk.54

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICBázisos csoportot artalmazó vegyületeknél (6.2. ábra)is hasonló viszonyokat kapunk, ha pufferbázist artalmaz. A pKa értékek eltolódása, csökkenése azonos irányba mutat, és ismétfellép akompenzációs effektussspK HA = awswpK+HA b sA jelöléseknél az s jelenti a nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázist, w a vizet.[6.1.]6.2. ábraA puffer bázikus összetevőjének és a szerves vegyületbázisos csoportjának pK a érték eltolódásaa mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. Jelölések:1. puffer vizes közegben, 2. bázikus csoportot tartalmazó vegyületvízben,3. puffer 60 v/v% szerves oldószerben, 4. bázikus csoportot tartalmazó vegyület60 v/v%szerves oldószerbenA HILIC gyakorlatában kevés a bázisos csoportot tartalmazó puffer. Sok esetben a formiátvagy acetát puffereket kell használnunk. Ebben az esetben a bázisos csoport pKa értéke a kisebbpH felé tolódik el, míg a puffer pKa –ja a nagyobbak felé (6.3.ábra). A két ellentétes irányú válto-megfe-zás azt eredményezi, hogy a kicsúszunk, abból a ph tartományból, ahol a pufferkapacitás lelő. Ilyenkor empirikus megközelítést használunk.6.3. ábraA szaggatott vonallal jelöltgörbék a vízre megadott ionizációsviszonyokat tartalmazzák,a folytonos a szerves vegyületek hozzáadása után kialakultakat.A jobb oldalon a savas puffer(formiát vagy acetát)változása, míg a baloldalon a bázisos vegyületé látható.55

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA 6.1. összefüggést felhasználva, a puffer vízben mért pKa értékét ismerjük, akkor úgy kella puffer pH-t vízre számítani, hogy az 1-2 egységgel kisebb legyen, mint bázisos csoport vízre számítottpKa értéke. Ebben az esetben a maximális pufferkapacitást biztosító pH tartományban maradunk.A molekuláris formák ismerete a HILIC elválasztásnál alapvető. Ennek oka nagyon egyszerű,mert csak nagy polaritású anyagok elválasztása oldható meg ezzel a módszerrel. Az ionogén vegyületek(savas vagy bázisos csoportot vagy csoportokat tartalmazók) molekuláris formái a pH függvénye.Az ionos forma nagy polaritású, míg az ion-visszaszorított forma sokkal apolárisabb. Az ionosforma ilyenkor HILIC-val, míg az ion visszaszorított forma a RP-HPLC módszerrel határozható meg.Bázisos csoportot tartalmazó vegyületek vízoldhatósága nagyban növelhető, ha olyan mozgófázispH-án dolgozunk, ahol protonált formában fordulnak elő. A 6.6. ábrán a dextrometorfán,diphenydramin és a pszeudóefedrin lgD-pH görbéjét adtuk meg.A 6.5. ábrán megadott lgD-pH görbék alapján megállapítható, hogy a pH, mint retenciót ésszelektivitást befolyásoló paraméternek alapvető szerepe van a HILIC módszer alkalmazásánál is.Ez előre vetíti, hogy a HILIC alkalmas nagyobb molekulatömegű és ionizálható csoportot tartalmazóanyagok elválasztására is, ha mérési körülmények között a vegyület ionos molekuláris formábahozható. Az ionos molekuláris formában a szerves vegyületek oldhatósága nagyságrendekkel megnőa vízben az ion visszaszorítotthoz képest (semleges molekuláris forma). Ezt mutatjuk be olyanvegyületeknél, melyek nagyobb molekulatömegűek, és apoláris hidrofób részt is tartalmaznak (6.4 ábra).6.4. ábra.Nagyobb molekulatömegű anyagok, amelyek jelentős apoláris (hidrofób) részt tartalmaznak, ezekis jól oldhatók ionos molekuláris állapotban.Ezeknek a vegyületeknek az elválasztása többféleképpen megoldható. A 6.5. ábrán láthatólgD-pH függvények alapján a vegyületek nagy pH értéken viszonylag apoláris jellegűek. Ez jellemzia vegyületek szabad bázis formáját vagy az ion visszaszorított molekuláris formát. A RP-HPLCmódszer alkalmazható, ha a lgD vagy lgP értéke nullánál nagyobb. Nagy pH értékeken ez a megadottvegyületekre igaz, mert mindhárom vegyületre 2-es értékű körül van a lgD. Ezzel teljesül, hogy azRP-HPLC módszerrel a vegyületek meghatározhatók. A következő kérdés, hogy vajon megfelelőennagy-e a lgD –k közötti különbség, hogy a vegyületeket el tudjuk választani. Ehhez a két legközelebbeső lgD-t kell megnéznünk (kritikus pár), ha ezek között a különbség (ΔlgD) nagyobb, mint 0,1-0,2akkor nagy valószínűséggel elválaszthatók A 6.5. ábrából megállapítható, hogy a kritikus párralgD értékek között nagyobb a különbség, mint 0,1, ezért ezek a vegyületek egy jól borított utószilanizáltC-18-as tölteten elválaszthatók nagy pH értéken. A megadott vegyületek lgD értékitöbb nagyságrenddel csökkennek (lásd 6.5. ábra) kis pH értékeken, ezzel az ionos molekulárisformában a vegyületek a víz oldhatósága jelentősen megnő. Ezzel párhuzamosan sószerű vegyületekszerves oldószerekben való oldhatósága jelentősen csökken. HILIC módszer alkalmazásakor, ha56

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICezeket a vegyületeket kolonnára adagoljuk, akkor a koncentrációjuk a poláris állófázis felületénkialakult vízrétegben nagyobb, mint a mozgófázis oldószerében. Ezzel teljesül az a feltétel, hogylegkevésbé poláris vegyületre is nagyobb lesz a visszatartás, mint 1. A HILIC módszernél többféleállófázist is használhatunk az elválasztásukra. Nézzük meg, ha egy szilikagél alapú diol fázistalkalmazunk, akkor milyen fő kölcsönhatások szabják meg a visszatartást. Vizsgálatunk most azállófázis hatásra terjed ki. Ennél az állófázisnál a poláris jellege miatt kialakul az víz réteg,amelybe az ionos molekuláris formában lévő komponensek kedvezményezetten beoldódnak. Eztnevezzük HILIC hatásnak. A szilikagél alapú diol-fázisnál a propil-csoportok apolárisak, ezért amolekulák apoláris része és az állófázis közötti apoláris (hidrofób) kölcsönhatás elkerülhetetlen.Feltételezzük, hogy a két kölcsönhatás egymástól függetlenül lép fel ekkor a visszatartás a kéthatás összege lesz:k=k hilic +k hidrofób [6.2.]ahol: k hilic és a k hidrofób a két kölcsönhatás megszabta visszatartási rész6.5. ábraA dextrometorfán, diphenydramin és a pszeudóefedrin megoszlása az apoláris n-oktán és a víz között.A pH

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA fenti, irodalomból vett példával azt kívántuk bizonyítani, hogy a lgD-pH függvényismereteis alapvető, hogy megítéljük, hogy egy-egyy vegyületcsoport HILICmódszerrel meghatározható-e.Továbbá, hogy milyen pH értékeken lesz stabil a rendszer.A lgP vagy ionogén anyagoknál a lgD-pH függvény ismerete lehetővé teszi a retenciós sorrendés elválasztás nehézségének megítélését is. A két adatsor ismerete fontos, mert a nagy vízoldhatóságalapvetőa HILIC alkalmazásakor. A nagy vízoldhatóságú anyagok sok funkciós csoportot tartal-muta-maznak és a vegyületek apoláris váza elhanyagolható.. Néhány konkrét példát a 6.6. ábrántunk be.6.6. ábraglicin (G),diglicin (DG), triglicin(TG), N-(1-deoxi-D-glükóz-1-il)-glicin (GG),N-(1-deoxi-D-glükóz-1-il))-di-glicin (GDG), N-(1-deoxi-D-glükóz-1-il)-tri-glicin (GTG)A 6.4. ábrán glicin és abból levezethető származékok láthatók. A vegyületek lgP értékeminden esetben -1-nél kisebb, ami mutatja a jó vízoldhatóságukat. A vízoldhatóság tovább növelhető,ha méréskor alkalmazott puffer pH-ján az aminocsoport protonálódikvagy a savas csoport ionizálódik.A glicin sorozat lgP értékeit a 6. .1. táblázatban adtuk meg. A retenciós sorrend követi a lgP értékeket.A legkisebb visszatartása a glicinnek (lg=-2,75) volt, míg a legnagyobb N-(deoxy-D-glukóz-1-il)-diglicinnek (lgP=-3,93).Vegyület neve:GDGGGTGGDGGTGlgP-2,75-2,95-3,22-3,33-3,44-3,936.1. táblázatA glicinsorozat lgPértékeiAhogy előzőleg hangsúlyoztuk a vízoldhatóságtovább növelhető, ha méréskor alkalmazottpuffer pH-ján az aminocsoportprotonálódikvagy a savas csoport ionizálódik. A pH függvényébena megadott vegyületek ionizációs viszonyait a 6.5. ábrán adtuk meg. A lgD csökkenésévela visszafunkcióstartás nőni fog. Ezzel a pH is egy döntő paraméter lesz, amennyiben a vegyület protoncsoportot tartalmaz.58

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICA fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszernél a lgP-t és az lgD-t közvetlen függvénykapcsolatbahoztuk a lgk –val. Megtehetjük ezt a HILIC-nél is. Az RP-HPLC módszernél alkalmazottlgP-lgk összefüggés ekkor a következőképp módosul:lgk=-algP+b [6.3.]Ismételten felhívjuk a figyelmet arra, hogy ezt a közelítést csak a nagy szerves oldószer tartalmúmozgófázisoknál lehet használni, ahol teljesül a k>1 feltétel.6.7. ábraA nagy polaritású, proton funkciós vegyületek megoszlása n-oktanol-víz között.A lgD-pH diagram segíti a pH optimálást is. Ismételten hangsúlyozzuk, hogy ezek az adatokvízre vonatkoznak. Felhasználva 6.3. összefüggést és annak analógiájára:lgk=-algD+b [6.4.]és a már bemutatott 5.7 összefüggést:swpKa=sspKa− log(swés ennek alapján a 6.1.-ben megadottat:ssHAwswHAγs0HpK = a pK + b ,)Ezek alapján a bázisos csoportot tartalmazó vegyületeknél 1-2 egységgel kisebbre vesszük avízre megadott értékeket. A transzformált értékek segítenek a kritikus pH elkerüléeésre is. Kritikusnaknevezzük, azokat a pH-kat, ahol a két vegyület lgD értéke megegyezik, mert ott a visszatartásukis nagy valószínűséggel azonos.A lgD értékek különbsége segít annak megítélésében, hogy mely vegyületek lesznek a kritikuspárok. Minél kisebb a lgD-ben a különbség, annál nagyobb a valószínűsége, hogy a két vegyületretenciós ideje közel esik. Ez a megközelítés az elválasztást a mozgófázis oldaláról nézi. Az állófázisszerepe a folyadékkromatográfiás elválasztásban döntő. A mozgófázisban meglévő kis különbségeketnagyban felerősítheti az állófázis-komponens kölcsönhatás. Ez különösen igaz a HILIC módszernél,ahol egyszerre több kölcsönhatás szabja meg a visszatartást. A mozgófázisbeli ioizációs viszonyoksegítenek abban, hogy kevesebb számú lépéssel oldjunk meg egy-egy feladatot. Nézzük meg azt avegyületsort, amelyeket a 6.8. ábrán adtunk meg.59

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC6.8.ábraHILIC-val meghatározott vegyületek szerkezeti képlete. A vegyületek között kromatográfiásansemleges, savas- és bázisos csoportot tartalmazók is vannak.A 6.8. ábrán megadott vegyületek kromatográfiásszempontból nagyon eltérő tulajdonságúak.Az általunk alkalmazott folyadékkromatográfiás beosztás szerint találunk köztük folyadékkromato-gráfiásansemleges vegyületeket, például acetamid, formamid, savas csoportot tartalmazóvegyü-hogy milyen pH-n kezdjük az elválasztásokat, és hogyan folytassuka kísérleteket, ha több vegyületleteket, oxálsav, oxamiksav és bázisos csoportot tartalmazókat, 1-aminó-benzpirén.Anélkül, hogyismernénka felsorolt vegyületek lgD-pH viselkedését nehez lenne eldönteni,együtt eluálódik. A 6.9. ábrán adtuk meg azt, hogy a pH függvényében hogyan változnakmeg azn-oktanol-víz közötti megoszlások. A lgDközötti különbségekértékelésévelátjuk, hogy melyvegyületpárok lesznek kritikusak. A sok metszéspont egyben jelzi,hogy egyikpH értékről áttérvea másikra hogyan változhatnakmeg a kritikus vegyületpárok. Mindezek figyelembevételével azelválasztás tervezése a mérnökielvárásoknak megfelelően történhet, amely jelentősen csökkenti amódszerkidolgozásra fordított időt.6.9. ábraA 6.8. ábrán megadott vegyületek és az aminó-benzpiridint tartalmazó vegyületekionizációs viszonyait megadó lgD-pH függvény.60

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC7. Szerves oldószer tartalom hatása a visszatartásraAz 5. és 6. fejezetben részletesen tárgyaltuk a pH szerepét a HILIC módszerrel meghatározhatóvegyületek elválasztásánál. Az ionogén anyagoknak olyan molekuláris formába kell lenniük,hogy oldhatóságuk a mozgófázisban a legkisebb legyen. Továbbá, a kromatográfiásan semleges(nem ionogén) vegyületeknél a lgP értékeknek - 0,5 vagy -1 alatt kell lenniük, hogy a minimálisvisszatartás értékét (k>1) biztosítani tudjuk.Ha a megadott minimális visszatartás értékét (k>1) biztosítani tudjuk, akkor a következő lépés,hogy a szerves oldószer tartalmat változtatva a legrövidebb idő alatt a legnagyobb elválasztástelérjük. A lehetséges oldószerek, amelyeket a HILIC gyakorlatában használhatunk, azok a következők:víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán.A sorrend az elúciós erősségi sorrendet adja meg. Minél nagyobb a víztartalom, annál nagyobbaz elúciós erősség és annál kisebb a vegyületek visszatartása. Megfordítva a tételt, ahogy csökkena mozgófázisok víztartalma, úgy csökken a mozgófázis poláris jellege; ezzel a poláris, ionogén ésionos vegyületek oldhatósága is csökken a mozgófázisban, és ezzel együtt nő a visszatartásuk.A legkisebb elúciós erősségű a legkevésbé poláris tetrahidrofurán (THF) lesz, a legerősebb a víz,a víznél kisebb elúciós erősséget mutat a metanol (MeOH), ennél is kisebbet az acetonitril (ACN).Ennek egyszerű a magyarázata, a megadott sorrendben növekednek a nagy polaritású anyagok ésa szerves vagy szervetlen ionok oldhatósága, ígyk=n s /n m [7.1.]ahol k a visszatartási tényező (retenciós faktor), n s az állófázisban a kolonnára adagolt mólokszáma, az n m ugyanez a mozgófázisban.Első közelítésben, amennyiben növekszik a vegyületek oldhatósága mozgófázisban az a 7.1.kifejezés szerint visszatartás csökkenést eredményez. A megoszlási hányados oldaláról közelítve avisszatartást:K=C s / C m [7.2.]ahol K megoszlási hányados, a C s és a C m az álló és a mozgófázisban a kolonnára adagoltminta koncentrációja.Amennyiben az előzőekben megadott sorrend szerint változtatjuk az oldószereket, akkor aTHF-től a vízig nő a nagy polaritású anyagok és a szerves és szervetlen ionok koncentrációja amozgófázisban (n m ). Végül:t r = t m (1+n s /n m ) [7.3.]ahol t m a holtidő.A retenciós idő csökkenését jól mutatja a 7.3. kifejezés.Az eluenserősségi sorrend megfordulása még egy nagyon jelentős változást eredményez afordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszerhez képest. A fordított fázisúfolyadékkromatográfiás (RP-HPLC, RPLC) módszernél növelve a mozgófázis szerves oldószer tartalmáta visszatartás a 7.4. egyenlet szerint csökken:lgk=A-Bϕ [7.4.]ahol ϕ a szerves oldószer koncentrációja a mozgófázisban, A állandó, B az egyenes meredekségea 7.1. ábrán61

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC7.1. ábraA visszatartási tényező változása a szerves oldószer koncentrációjának függvényébena fordított fázisú folyadékkromatográfiás(RP-HPLC, RPLC) módszernél.A nagy polaritású vegyületeknél, ahol poláris állófázist alkalmazunk,akkor a visszatartásváltozása ellentétes lesz. A különböző nagypolaritásúvegyületeknél ez a változás, általában 70-80 tf.% szerves oldószer tartalom fölött, szintén linearizálható (7.5):lgk= A’+B’ϕ[7.5.]A 7.5. kifejezésben a B’ iránytangense pozitív lesz (7.2. ábra).7.2. ábraA visszatartási tényező változása a szerves oldószer koncentrációjának függvényében,ha nagypolaritású anyagokat szerves vagyszervetlen ionokat határozunk megpoláris állófázison.Mivel a 7.2. ábrán bemutatott változás ellentétes a fordított fázisú folyadékkromatográfiás(RP-HPLC, RPLC) módszerhez képest és az állófázis oldaláról nézve a visszatartás valamilyen poláriskölcsönhatás eredményeképp jön létre, ezt a módszert Hidrophil Interaction Chromatographyvagy maköztudatban csak, mint HILIC terjedt el.A kromatográfiás módszer névadásában a poláris kölcsönhatás megjelölése egyértelmű, afolyadékkromatográfia megjelölése, viszont magyarázatot igényel. A megnevezés takarja az összesfolyadékfázisú elválasztást. A HILIC-nál azelválasztáss mechanizmusára utal, ahol a fő retenciótmegszabó folyamatot visszavezetik a folyadék-folyadék megoszlásra. Általánosan elfogadott,hogy a poláris állófázis felületén a víz kedvezményezetten szorbeálódik. Ebbea szorpcióss rétegbeoldódnak be a komponensek és ekkor egy folyadék-folyadék megoszlás jön létre a két fázis között.Ezt adtuk meg a 7.3. ábrán.62

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILIC7.3. ábraA visszatartás egyik lehetséges változata a HILICfolyadékkromatográfiás módszernél.A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között.A másik megközelítést a normálfázisú folyadékkromatográfia (NP-HPLC) oldaláról tehetjük.Az állófázisok, amelyekben a HILIC módszernél használunk, polárisak. AzNP-HPLC-nél és a visszatartástmegszabó tényezőket figyelembee véve, a NP-HPLC-bencsökken a retenció, ha a poláris modifikátorkoncentrációját növeljük az alkalmazott oldószerelegyben. HILIC-nál is, ha a víztartalmat növeljükés aHILIC módszernél azonos jellegű állófázistalkalmazunk. Mozgófázis oldaláról,a mozgófázisban, csökken a visszatartás. AN-H 2 O vagy MeOH-H 2 O elegyben a víz jelenti a polárisabboldószert. A fent leírtak alapjánvontak analógiát a HILIC és az NP-HPLC között. Elnevezték vizesfázisú normálfázisúfolyadékkromatográfiának. Ma ennek csak történelmi jelentősége van, mert aHILIC elnevezés az elterjedt.A HILIC olyanfolyadékkromatográfiás módszer, ahol polárisállófázist és vizet (pufferelt) ésazzal elegyedő szerves oldószereket használunk mozgófázisként. Jelentős visszatartást csaka nagyszerves oldószer tartalmú mozgófázisoknálkapunk, ahol a poláris anyagok oldhatóságaa jelentősmértékben csökken.A szerves vegyületek oldhatóság csökkenése a nagy szerves oldószer tartalomnál válikjelentőssé (7.4. ábra)7.4. ábraA visszatartás változásaa mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával.A vegyületek polárisjellegével a visszatartás nő. Polaritási sorrend: 3>2>1.A 7.4. ábrán látható, hogy jelentős változás 60-70 tf.% felett várható. Minél nagyobb avegyületek polaritása, annál kisebb koncentrációban kell alkalmazni a szervess oldószert.A szerves oldószerben a vegyületek oldhatóságot az oktanol-víz megoszlásból becsülhetjük,ahogy ezt az elválasztási példákon már bemutattuk. Amennyiben a megoszlási hányadost aHILIC-nél a mozgófázis és az állófázis felületén kialakult víz közti megoszlás szabja meg, akkor aretencióssorrend ellentétes lesz a lgP értékekkel. Amennyiben a retenciós sorrend ettől eltér, akkormás kölcsönhatásokis szerepet játszanak a visszatartásban.63

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICAmennyibenkihasználjuk az analógiát a normálfázisú folyadékkromtográfiával,akkor azelválasztások tervezésénél felhasználhatjuka 7.6.összefüggéstlgk= A-Slgϕ[7.6.]ahol: A mozgófázis víztartalma, ahol nincs visszatartás, S az egységnyi víz koncentrációrajutó visszatartás változás, ϕ a mozgófázis víztartalma.Grafikusan ábrázolva a 7.6. kifejezést a 7.5. ábrát kapjuk.7.5. ábraA visszatartás változása a mozgófázis víztartalmánakfüggvényében a HILIC módszer alkalmazásakor.Minélnagyobb a vízoldhatósága a vegyületnek,annál kisebbb az egyenes meredeksége.64

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC8. Grádienselúció a HILIC-banA kromatográfiás elválasztás tervezésekor, a pH kontroll eldöntése után, annak megítélése,hogy az adott feladatot izokratikusan (állandó mozgófázis összetétel) megoldható-e vagygrádienselúciót kell alkalmazni. Egy elválasztás akkor oldható meg izokratikusan, ha a legkevésbévisszatartott komponensre k>1 és legnagyobb retenciójura teljesül, hogy a k

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA hagyományos HPLC rendszernél a 2,5 μm-nél nagyobb szemcseátmérőjű töltettel megtöltöttkolonnákat használhatjuk. A kolonnák minimális hosszúsága függvénye a szemcseátmérőnek,általában a 3 μm-es vagy ennél kisebb szemcseátmérőjűeknél a maximális hossz 15 cm, a nagyobbszemcseátmérővel töltötteknél 10 cm. Ahhoz, hogy a kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások nehaladják meg a 10 %-ot, a kolonnaátmérő 3mm vagy ennél nagyobb. Ekkor lesz a folyadékkromatográfiásrendszer kolonnán kívüli zónaszélesítő hatása 10 %-nál kisebb. Ahhoz, hogy az elválasztássebessége megfelelő legyen 0,5 vagy 1 ml/min térfogatáramlási sebesség használata ajánlatos.Mivel minden folyadékkromatográfiás rendszernek van késletetési ideje, ezt a grádiensprofilbeállítássánál figyelembe kell vennünk. Erről a fejezet további részében foglal-kozunk részletesen.Ezzel a késleltetési idővel kell növelnünk a grádiensidőt a „B” oldószernél, ahhoz a kolonna végénvalóban az általunk beállított oldószer legyen a mérési ciklus végén.A következő lépés a grádiensprofil kiválasztása. A készülékek különböző grádiensprofil alkalmazásátteszik lehetővé ugyan, de a gyakorlatban a lineáris profil használata elterjedt, mert ennekelméleti háttere ismert valamilyen mélységben. A HILIC-nál használjunk lineáris grádiensprofiltaz általános grádienselúció végrehajtásakor. A lineáris grádiens arra is jó, hogy az izokratikusmódszer használatakor a körülményeket (mozgófázis összetételt) előrejelezzük. Nézzük meg, hogya HILIC módszernél, hogyan alkalmazhatjuk a fordított fázisú folyadékkromatográfiában jól beváltlineáris grádienst. Az angol elnevezése ennek a módszernek linear solvent strength gradientelution (LLS). A 6. és 7. fejezetben tárgyaltuk a HILIC-ban az oldószerek szerepét az elválasztásban.Megállapítást nyert, hogy a RP-HPLC-ban használt összefüggések a mozgófázis erősségi sorrendfigyelembe vételével használhatók a HILIC gyakorlatában is. Ahhoz, hogy az olvasónak a kereszthivatkozásokhozne kelljen visszalapozni és az általános grádiens, mint módszer könnyen érthetővéváljon a módszer kiválasztása szempontjából, a fő megállapításokat megismételjük. Kezdjük amozgófázis (eluenserősséggel) erősséggel. A RP-HPLC módszernél az oldószererősségi sorrend:H 2 OTHFAzt, hogy hogyan befolyásolják a különböző oldószerek a visszatartást, mindig arra az oldószerreadjuk meg, amely csökkenti a visszatartást, tehát a nagyobb oldószererőségűre. Ezt akonvenciót használva, a RP-HPLC módszernél:lgk=A-Bφ [8.1.1.]ahol az A és B állandók, amely az alkalmazott kolonnától és a vizsgált vegyületektől függ,a φ a szerves oldószer térfogat százaléka a mozgófázisban. Megjegyezzük, hogy a B-t sok közleményben„S”-sel jelölik, és oldószererősségi paraméternek nevezik. Sajnos az RP-HPLC-ban ennekértéke nemcsak a szerves oldószer minőségétől, hanem az alkalmazott állófázis borítottságától is függ.Ez az egyszerű összefüggés 10 tf.% szerves oldószer tartalomtól 90 tf.% szerves oldószertartalomig, az esetek többségében jól írja le az oldószererősség hatását a visszatartásra a RP-HPLCmódszernél.A HILIC-nál a legerősebb oldószer a víz lesz, és mivel a mozgófázisnak minden esetben kellvizet tartalmaznia, az összefüggéseket a víztartalomra kell vonatkoztatni. Továbbá, ahogy többszörmár hangsúlyoztuk, hogy egy adott víz koncentráció felett az összes komponens a holtidő körülfog eluálódni. Ez szűkíti az alkalmazható víztartalmát a mozgófázisnak. 40 tf% víz koncentrációalatt a komponensek visszatartása exponenciális függvény szerint változik a víztartalommal.Formailag ugyanazok az összefüggések használhatók, mind a RP-HPLC módszernél, csak a φ mosta mozgófázis víztartalmát jelenti. Ennek alapján a 3tf.% víztartalomtól a 40 tf.% víztartalomigfelírható, hogylgk=A-Bφ víz [8.1.2.]66

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICMind a RP-HPLC-nál, mind a HILIC-nál formailag ugyanazokaz összefüggések használhatóka mozgófázis erősség és a visszatartás közti összefüggés leírására. Ez az alapja, hogy a fordítottfázisú kromatográfiában a lineáris grádienselúcióra jól kidolgozott összefüggéseket használjuk aHILIC-nál is. Ezeket az összefüggéseket az elmélet iránt érdeklődők számára a könyv mellékletekébenadjuk meg. Most a gyakorlati szempontból tárgyaljuk, hogy milyen következtetéseket tudunk alineáris grádienelúció használatakor kapott kromatogramokból. A 8.1.1. ábrán három különbözőlehetőséget mutatunk be. A 8.1.1. ábrán az elválasztások megítélésénél alapvető három paramétertis megadtunk. Az első holtidő (t m ), a második a kétszeres holtidő, amikor a visszatartási faktor(retenciós faktor) értéke 1 és a harmadik a tizenegyszeres holtidő, amikor a visszatartási faktor(retenciós faktor) értéke 10. Ez a három faktor, mint sarokkövek lehetővé teszik, hogy döntésekethozzunka HILIC módszer használatáról.8.1.1.ábraAz általánosgrádienselúció alkalmazása a HILIC-nál a módszerfejlesztés segítésére.Az „A” ábrán a legkevésbé poláris komponensek visszatartása kisebb, mint egy,az állófázis nemmegfelelő, „B” ábra: erősebb „A” mozgófázissal kell indítani a grádienst,vagy gyorsabban növelni a „B” koncentrációját, „C”ábra: optimált grádiens.A 8.1.1.A ábrán megadottt kromatogramnál az 1. , a 2. és a harmadik komponens k< 1 vissza-atartási tényezőnél (retenciós faktornál) eluálódnak. A grádienselúciós módszer használatakorkromatográfiás csúcsok keskenyebbek (zónadiszperziójuk kisebb), mint az izokratikusnál,de végesszélességűek. A közeli tulajdonságú vegyületeknél, amelyek ebben a visszatartási tartománybaneluálódnak, nagy lesz az együttt eluálódás (interferencia ) veszélye. Ez annyit jelent, hogyaz adottkörülmények közöttt a HILIC nemalkalmazható.Kérdés az, hogy egyértelműen kijelenhetjük-e,hogy ebbenaz esetbena HILIC-t az adottvegyületcsoportra nem alkalmazhatjuk, mert egyik alapvető feltételünk, hogyk>1 nem teljesült.A válaszaz, hogy nem!Minden folyadékkromatográfiás, például az RP-HPLC-ban az állófázis felületi tulajdonságánakalapvetőszerepe van. Ezért kelll a módszerfejlesztést azállófázis kiválasztásával kezdeni. Ez az elvmég inkább igaz a HILIC-nál. A 3. fejezetben bemutattuk, hogy nagyon eltérő felületi tulajdonságúállófázisok használhatók a HILIC-nál. Elméleti megalapozottságaa a HILIC-nak a határfelületenkialakultvízréteg, mind elsődleges poláris kölcsönhatásihely adja, ezt viszont jelentősen módosítjákaz állófázis nyújtottaegyéb kölcsönhatási lehetőségek. Ezeket, mivel a fő hatás mellett befolyásolják avisszatartást sok esetben csak ,mint másodlagos kölcsönhatásoknak nevezzük. Az elnevezés nem67

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICteljesen fedi ezeknek a kölcsönhatásoknakk a szerepét a visszatartásban. Az ionos vegyületeknélsok esetben ezek a másodlagos kölcsönhatások adják a visszatartás döntő részét.k= =k HILIC +k másoddlagos[8.1.3]A 8.1.1.A ábrán megadott helyzetnél, támaszkodva a vegyületek szerkezetére, ki kell válasz-Eztanunk azt az állófázis típust, amelyet használva a k> >1 feltétel nagy valószínűséggel teljesül.egyben bizonyíték is arra, hogya HILIC-nél is, akár izokratikus elválasztást, akár grádienselúciósthasználunk, első lépés a módszerfejlesztésnél a vegyületek szerkezetének ismeretében a kompatibilisállófáziskiválasztása. A kompatibilitás első feltételee ugyanis, a sokat említett k>1 feltétel alegkevésbé visszatartott komponensre. HILIC-nál ez a legkevésbé poláris vegyületet jelenti.A 8.1.1.B ábrán a legkevésbé visszatartott komponens visszatartása sokkal nagyobb, mint aminimálisként megadott k>1. Ekkor két lehetséges megoldás közül választhatunk, vagy növeljükaz „A” oldószer víztartalmát, erősebb mozgófázisról indítjuk a grádienst, vagy a grádiens sebességétnöveljük. Ami annyit jelent, hogy egységnyi idő alattt nagyobb mértékben változtatjuk a víztar-komponens visszatartása nagyobb, mint 1, a legnagyobbé viszontkisebb, mint tíz. Természetesenez nem jelenti az optimált elválasztási körülményeket, hanem azt, hogy benne vagyunkaz ú.n.talmú”B”mozgófázist.A 8.1.1.C ábrán a HILIC-ban optimált elválasztást adtuk meg. A legkevésbé visszatartottkromatográfiás céltáblában. A kromatográfiás céltáblanem más, minthogy az összes komponensvisszatartása beleesik 1

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICÁltalánosan elmondható, hogyha a kromatogramm bármely részén a legkevésbé visszatartottés a legjobban visszatartott komponens visszatartása között a különbség kisebb, mint 2-3 egység(Δk

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA HILIC-nál is általános elvként használhatjuk fel, hogy a kromatográfiásan egy osztálybasorolt vegyületek visszatartás változása a víztartalom függvényében. hasonló, ezért az egyeneseknem metszik egymást, nincs retenciós sorrend változás. Ez annyit jelent,hogy az általánosgrádienselúciónál kapott sorrend megegyezik majd az izokratikuselválasztásnál.A másik lehetőség, hogya minta különböző kromatográfiás osztálybasorolt vegyületekettartalamaz. Ezek a vegyületek csakúgy, minta RP-HPLCmódszernéleltérően reagálnak a víztartalommegváltoztatására. Ezt mutatjukbe a 8.1.5. . ábrán.8.1.5. ábraFolyadékkromatográfiásan eltérő módon viselkedő komponensek, kromatográfiásannemrokon vegyületek, az izokratikus módszerre történő módszer átvitelnél, attól függően,hogy milyen mozgófázis összetételt használunk,retenciós sorrend változást kapunk.A 8.1.5. ábránbemutatott vegyületekeltérő módon reagálnak a víztartalom változtatására.Ez annyit jelent, hogy folyadékkromatográfiásan eltérő módon viselkedő komponensek.A szak-módszerre történő módszer átvitelnél, attól függően, hogy milyen mozgófázis összetételt használunk,retencióssorrend változást kapunk. A 8.1.5. ábrán megadtuk a k= 1 és k=10 határokat, amelyekenbelül bármely mozgófázis összetétel választható az izokratikus elválasztásnál. Az I., a II.és a III:irodalomekkor kromatográfiásan nem rokon vegyületekről beszél. Ilyen esetekben az izokratikushelyzetben a retenciós sorrendeklényegesen eltérnek. A módszerfejlesztés során, amikor azt próbáljukelérni, hogy a lehető legkisebb elemzési időmellett azelvárt kritériumokat teljesítsük, változtatnikell a mozgófázis összetételét. Ekkor viszont mozgófázis összetételtőll függően más retenciós sorrendetkapunk és minden változtatás után ellenőriznünk kell azt.A következő lépés, hogyaz általános grádienselúciónál kapott eredményeket átvigyük azizokratikus elválasztásra. Továbbiakban egy becslést adunk meg erről. Szeretnénk hangsúlyozni,hogy a HILIC módszer összetettsége miatt nem lehetséges egyetlen lépéssel az általánosgrádienselúciós mérésből megadni az izokratikus elválasztás mozgófázis összetételét. Ami a módszerátvitelnél fontos, hogy a kromatográfiás céltáblába betaláljunk. Ahogy az előzőekben kiemeltükmár ez a 1≤k≤10 feltételt jelenti. A szakirodalombannéha ezt a határt k=20-ig terjesztik ki. Akiterjesztés a módszerfejlesztésnél nagyobbb szabadságot jelent ugyan, de megnöveli az elemzésiidőt és izokratikus elválasztásnáll a kromatográfiás csúcsmaximum csökken, ami jelentősen megnövelia kimutatási határt, vagy más szóval csökkenti a módszer érzékenységét. A gyakorlati feladatokatmegoldófolyadékkromatográfiásszakember számára ezért a k=10-et jelentő visszatartási felsőhatártkell alapul vennünk. A módszer átvitel másik alapelve, hogy úgymond felülről közelítjük meg aproblémát. Kromatográfiás szaknyelvet lefordítva ez annyit jelent, hogy a módszer átvitelnél alegjobban visszatartott komponenst tekintjük a kritikusnak. Az első izokratikus mérésnél az acélunk, hogy enneka komponensnek a visszatartása ne legyen nagyobb, mint 10 (felső határ azelválasztásnál).70

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICA HILIC-ban kevés adat áll rendelkezésre, hogy a víztartalom változtatására milyen mértékbencsökkena retenció, és milyen módon változik a szelektivitás, ezért csak ajánlást tudunktenni avíztartalom változtatására. Abból indulunk ki, hogy a rendelkezésünnkre álló víztartalom változtatásilehetőség kb. 40 tf.% %. Ezt a tartományt kell vizsgálnunk, amikor az általános grádienselúcióalapjána kezdőmozgófázis összetétellel elvégeztük az első kísérletet. Többféle lehetőséget kaphatunk,ezeket elemezzük ki a következőkben. A 8.1.6. ábrán a szabályosan viselkedő kromatográfiásanrokon, reguláris) kromatogramját adtuk meg. Az 1. és a 2. komponensre nem teljesül a visszatartásravonatkozó minimális kitétel. A visszatartási tényezőjük (retenciósfaktoruk) kisebb, mint 1. Elsőfeladat, hogy a kétkomponens visszatartása meghaladja a minimálisan elvárt értéket. Ehhez amozgófázis elúciós erősségét csökkenteni kell. A HILIC-nál az eluenserősség szempontjából a víz,tehát ennek térfogatszázalékát kell csökkenteni.8.1.6. ábraAz általános grádienselúció alapján elvégzett első izokratikus mérés eredménye. A kritikus feltételteljesült, a legnagyobb mértékben visszatartott komponens visszatartási tényezője kisebb, mint 10.A legkevésbé visszatartott komponensé viszont nem érte el a minimum feltételekben megszabottat.Kérdés, tehát ha az általános grádienselúció alapján elvégzett első izokratikus mérés eredményeazt mutatja, hogy a kritikus feltétel teljesült, ez annyit jelent, hogy a legnagyobb mértékben vissza-viszont nem érte el a minimumm feltételekben megszabottat, akkorhogyan folytassuk a módszer-fejlesztést. A módszerfejlesztésnél mindig elsődleges a minimális feltételek teljesítése. Ezpedig atartott komponens visszatartási tényezője kisebb, mint 10. A legkevésbé visszatartott komponensévisszatartási kritériumok teljesítését jelenti, majd ezt követi a kritikus párok elválasztásánakmegoldása. Esetünkben a legkevésbé visszatartott komponens retencióját kell növelni,hogy avisszatartása meghaladja a holtidő kétszeresét (k≥1). Ennek elérésére a mozgófázis víztartalmátkell csökkenteni. Mivel a víztartalom változtatásábana lehetőségünk csak 40 tf.%-ot ölel fel, avíztartalom csökkentését 5 tf.% %-nál nagyobb mértékben nem ajánlatos elvégezni. Tételezzük fel,hogy azelő izokratikus mérésünket 10/90 tf.% víz-acetonitril mozgófázis összetételnél végeztük,akkor a következő mérést 15 tf.%víztartalomnál fogjuk elvégezni. Ha a 8.1.6. ábrán az első komponensvisszatartása eléri, vagy meghaladja k≥1 értéket, akkor következik a szelektivitás optimálása,amikor a kritikus párra el kell érnünk az R s ≥ 1,5 vagyR s ≥ 2-3 értéket. A két érték két különbözőelválasztási helyzetre vonatkozik. Ha a komponensekk a mintában közel azonos mennyiségbenvannak és érzékenységük az adott detektálási módszerree közel azonos, akkor azR s ≥ 1,5 kritériumotalkalmazhatjuk, mert ez jelenti az alapvonali elválasztást. Ha a kritikus pár koncentrációja, azonosdetektálási érzékenységnél többb nagyságrendben eltér, akkor ahhoz, hogy a nagyobbik komponensinterferenciája ne hamisítsa mega megengedett hibahatáron túl a kisebbikét azR s ≥ 2-3 kritériumotkell alkalmaznunk.A szelektivitás optimálás a könyv ennél a részénél nem képezi azt.A másik szélső esetet a 8. .1.7. ábrán mutatjuk be.71

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC8.1.7. ábraAz általános grádienselúció alapján választott izokratikus elválasztási módszer. A legnagyobbmértékben visszatartott komponensre a k> >10, akkor kiléptünk a minimális elvárásnak megfelelőfeltételekből. Ahhoz, hogy az 5. és a 6. komponens visszatartása kisebb legyen, mint 10,a mozgófázis víztartalmát növelni kell.A 8.1.7. ábrán azt mutatjuk be, amikor az általános grádienselúcióalapján választottizokratikus elválasztási módszernél a legnagyobb mértékben visszatartott komponensrea k>10.Ebben az esetben kiléptünk a minimális elvárásnak megfelelő feltételekből. Ahhoz, hogyaz 5. ésa 6. komponens visszatartása kisebb legyen, mint 10,a mozgófázis víztartalmát növelni kell. A8.1.6. ábrán megadottnak megfelelően az izokratikus elválasztásnál 15 tf.% víztartalmú acetonitrilthasználtunk. Addig kell ezután a mozgófázis víztartalmát növelni, míg a 6. komponensre is teljesüla k≤10 és igaz lesz, hogy az 1. komponensre is teljesül a k≥1 és a kritikus párnál az elválasztásR s =1,5 vagy 2-3, a komponensek jelnagyságától függően.Addig kell a mozgófázis összetételét változtatni, amíg a 8.1.8. ábrán megadott kromatogramnakmegfelelő elválasztási képet nemkapjuk.8.1.8. ábraAz általános grádienselúcióból kiinduló elválasztás optimálás és az izokratikus elválasztásikörülmények megadása. A legnagyobb mértékben visszatartott komponensree igaz, hogy k≤10,a legkisebb reteciójura, hogyk≥1 és minden egyes komponensree igaz, hogy R s ≥1,5 vagy2-3.72

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICA 8.1.8. ábrán adtuk meg az általános grádienselúcióból kiinduló elválasztás optimálását.Az elválasztási körülményeit addig kell módosítani, míg a legnagyobb mértékben visszatartottkomponensre igaz, hogy k≤10, a legkisebb retenciójúra, hogy k≥1 és minden egyes komponensreigaz, hogy R s ≥1,5 vagy 2-3. Ha az előzőkben megadott kritériumokat nem tudjuk a mozgófázisösszetételének változtatásával, akkor állófázist kell váltanunk.Az általános grádienselúciónak megvannak az előnyei, ha az állófázis az adott elválasztásramegfelelő. Ismét visszajutottunk a folyadékkromatográfia alapproblémájához. Nevezetesen, hogyhogyan válasszunk állófázist. Az általános alapelvek egyértelműek, egyrészt a visszatartásra vonatkoznak(lásd az előzőeket), másrészt a csúcsszimmetriára, A csúcsok aszimmetria faktora, vagytailing faktorának egy adott értéken belül kell lennie. A csúcsok aszimmetria faktorra, vagytailing faktorára elfogadott értékek sajnálatos módon a különböző folyadékkromatográfiás módszereketelőíró szervezeteknél nem azonos. Fogadjuk el, hogy az aszimmetria faktor értéke (A s ) 0,8 és1,8 között változhat. Ha bármelyik ezek közül nem teljesül, akkor az adott állófázis (kolonna)nem használható. Ezek kritériumok, azonban az állófázis kiválasztásánál a szükséges, de nemelégséges kritériumot jelentik. Ami minden esetben problematikus az a szelektivitás eldöntése. Hacsak a poláris határfelületi fázis és a kevésbé poláris mozgófázis közti megoszlás szabná meg amegoszlást és ennek megfelelően a szelektivitást, akkor a lgP értékek a szelektivitás előre jelzéséremegfelelő alapot adnának. A fő visszatartást adó folyadék-folyadék megoszlás mellett az egyébkölcsönhatások (másodlagos kölcsönhatások) nagymértékben befolyásolják az egyes vegyületekvisszatartását és ezzel a szelektivitást. Ezt előrejelezni, a jelenlegi ismereteink szerint, nehéz.Az általános grádienselúció alkalmazásakor problémát jelent, hogy milyen pH-át használjunk.Ahogy az 5. fejezetben bemutattuk a pH megválasztás csakúgy, mint a fordított fázisú folyadékkromatográfiábanalapvető a módszer kidolgozásánál. Ahhoz, hogy a pH megválasztásnál helyesdöntést hozzunk ismernünk kell a vegyületek pKa értékeit. Ezeknek három forrása lehet.• ismert vegyületekről van szó, amelyeknek a pKa értékeit már kimérték, irodalmi adatok• titrálásos, spektrofotometriás módszerrel kimérjük• intelligens programok segítségével, a vegyületek szerkezetének ismeretében előrejelezzük (prediktáljuk)Az általános grádienselúciónál is alapszabály, hogy a vegyületek olyan poláris formábanlegyenek, hogy azok visszatartása legalább kétszerese legyen a holtidőnek (k=1). Mivel ez ionoforvegyületek (savak és bázisok) a pH függvényében változtatják a molekuláris formáikat szükségesa molekuáris formák ismerete a mozgófázis kémhatását változtatjuk erre szolgálnak a már ismertetettlgD-pH függvények. Amit a HILIC szempontjából, leegyszerűsítve, pH függő „lgP”-nak tekintünk.Mivel a HILIC körülményei között a mozgófázisban és az állófázis határfelületi rétegében(vízrétegben) eltérő a vegyületek pKa értékei, arra kell törekedni, hogy azzal, hogy a nagy szervesoldószer tartalmú közegben és a vízben is ugyanazok legyenek a molekuláris formák arányai.Az általános grádienselúció elvégzése elött is szükséges a vegyületek lgD-pH görbéinek ismerete,hogy a HILIC-nál használt pH-t eldöntsük. Egyben alkalmas lesz arra is, hogy a kiválasztottpH értéken, becslést végezzünk arra nézve, hogy kell-e grádienselúciót alkalmaznunk az elválasztássorán. Kiemeljük azt, hogy ez egy kiindulópont, amelyet majd az első mérés alapján módosítanunkkell. A módosítást szükségszerűvé teheti, hogy a minta milyen jellegű komponensekettartalmaz. Emlékeztetőül, hogy a vegyületek ugyanabba a kromatográfiás osztályba tartoznak(kromatográfiásan hasonló, kromatográfiásan rokon, reguláris vegyületek), vagy különböző osztályba(kromatográfiásan nem hasonló, kromatográfiásan nem rokon, irreguláris vegyületek). A8.1.9. ábrán különböző savakra adtuk meg a lgD-pH függvényeket. Az ábrából egyértelműenkövetkezik, hogy a HILIC elválasztás csak nagy pH értékeken oldható meg.73

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC8.1.9. ábraKülönböző szénatomszámú savak lgD-pH függvényei.Azt, hogy egyintelligens program a lgD-pH számolásnál milyen adatokat ad meg, a n-hexánsavpéldájánmutatjuk be (8.1.10. ábra). A megoszlási adatok mellett megadja az ionizált és ion vissza-modellszorítottt forma lgP értékeit és a vegyület pKa értékeit. A megoszlási adatok számolására többlétezik, ezért a különböző számolási módszer eredményeit is feltünteti, majd tapasztalati faktoroksegítségével ezeket átlagolja.8.1.10. ábraA n-hexánsav lgD-pH adatai és megjelenítése a Pallas intelligens program segítségével.74

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILIC8.2. A grádienselúció és problémája a HILIC-ban.Az általános grádienselúció valóban egy jó eszköz arra nézve, hogy az összes vegyületetlássuk a kromatogramon. Ha nagy vegyületek közötti visszatartás különbsége az, akkor jelzés arranézve, hogy grádienselúciót kell használni. A nagy retenciós idő különbség ugyanis azt jelenti,hogy a komponensek elúciója nagyon eltérő oldószer összetételnél következik be. Mivel a vegyületekvisszatartását a fő folyadék-folyadék megoszlás mellett több másodlagos kölcsönhatás szabja meg,ezek hatását- a jelenlegi ismereteink mellett-nehéz előre jelezni. A mozgófázisban a viselkedésüketviszont lehetséges. Létezik tehát egy számítógéppel végrehajtható előtervezés, amely irányt mutathataz elválasztási lehetőségre. Nevezetesen, hogy az elválasztás megoldható-e izokratikusan vagy sem.Ezután áttekintjük, hogy milyen szabályszerűségeket kell betartani a grádienselúciónál.A 8.2.1. ábrán az irodalomban leközölt elválasztás vegyületeit adtuk meg. Ha vegyületekszerkezetét nézzük, akkor a polaritásban nagy különbségeket vélünk felfedezni. A mérnöki és atudományos gyakorlatban, azonban szeretünk mindent, amit lehet, számokkal kifejezni. Ezt alehetőséget már bemutattuk, hogy a lgD-pH függvény erre nézve nagy segítséget ad. A 8.2.2.ábrán adtuk meg ezeknek a vegyületeknek a lgD-pH függvényét. A 8.2.2. ábrából kiolvasható,higyha HILIC-át akarunk alkalmazni, akkor ez csak a kis pH értékeken lehet. Itt lesz a lgD értékeolyan, hogy az ionos formában lévő vegyületek az acetonitril-puiffer mozgófásból a poláris jellegűállófázis felületére kényszerülnek. Ha kettes vagy hármas savasságú mozgófázisban dolgozunk,akkor látható, hogy a lgD értékek között nagy lesz a különbség. Ez a különbség a legkevésbé polárisés a legpolárisabb vegyület között értendő. A szemcsés és porózus tölteteknél, ha ez a különbségmeghaladja a kettes értéket, akkor szükséges a grádienselúció. Az előzőekben taglalt példában eza helyzet. Ahhoz, hogy egyetlen lépésben az elválasztást el tudjuk végezni grádienselúciót kellalkalmaznunk. Oldószergrádiensnél meg kell adnunk, hogy mi legyen az induló és mi legyen a befejezőerős mozgófázis összetétele. Foglalkozzunk először az induló mozgófázis összetétellel. A leggyengébboldószert a szerves oldószerek jelentik a vízhez viszonyítva. Az olodószerek tárgyalásánál kifejtettük,hogy az acetonitril jelenti a számunkra kedvezőt. A HIILIC gyakorlatában akkor a leggyengébboldószert is az acetonitil jelenti. Kérdés, tehát, hogy akkor a grádienselúciót a HILIC-ban acetonitrtilbőlindítsuk? Ennek eldöntéséhez szükséges, hogy a HILIC elválasztási mechanizmusát és agrádienselúciós követelményeket áttekintsük és összeegyeztessük.75

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC8.2.1. ábraA szakirodalomból vett elválasztási példa, amikor nagyon eltérő polarításúvegyületekelválasztását oldották meg grádienselúcióval a HILIC-ban.8.2.2. ábraA szakirodalomból vett elválasztási példa, amikor nagyon eltérő polarításúvegyületekelválasztását oldották meg grádienselúcióval a HILIC-ban.76

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILICA grádienselúciós technika alkalmazásának az eldöntése a lgD-pH görbealapján.8.2.3. ábraA visszatartás egyik lehetséges változata a HILICfolyadékkromatográfiás módszernél.A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között.A HILIC-nál a tudomány mai álláspontja szerint az elválasztáss egyik sarkalatos alapjaa a határ-megoszlás, ahogy ezt a 8.2.3. ábrán bemutattuk. Szükséges tehát, hogy a mozgófázisban víz le-felületi fázisban adszorbeálódott víz és az annál kevésbé poláris mozgófázisközötti komponensgyen, mert különben ez a határfelületi réteg nem tud kialakulni. Kérdés, tehát, hogy mekkoralegyen a víztartaloma mozgófázisban.Ehhez a grádienselúció elméletéhez kell visszamennünk. A 8.2.4. ábrána gyakorlati élet-aben alkalmazott grádienselúciós folyamatot adtuk meg. A grádienselúciónál többször ismételjükfolyamatot. Alapvető, hogy minden ismétlésnél ugyanabból a helyzetből induljunk, hogymindenlépésnél ugyanolyann visszatartást, retenciótt kapjunk.B%IIIt G0IIIIV12t8.2.4.ábraGradiens elúciós technikaalkalmazása.Az I. a mérés előttiszakasz, II.az erősebb mozgó fázisösszetevő növelése,III. visszaállási szakasz az „A”mozgó fázisra, IV. beállási idő az új mérés előtt. tG = gradiensidőA gradienselúciónál felmerül az a kérdés, vajona két gradiens mérés között teljes egyenméréseket.A 8.2.4. ábrán adtukmeg a gradienselúció jellemző szakaszokat a mérés indításától. Az elsőszakaszsúlynak kell lennie, vagy minden esetben ugyanarról a helyzetbőll elegendő indítani aa mérési ciklus indítása előtti szakasz. Ekkor a két fázis között az egyensúlyy valószínűleg beáll.A II. szakaszon növeljük a mozgófázis elúciós erősségét, ez HILIC-nál a víztartalom növelésétjelenti, a III. szakaszon visszaállunk az eredeti összetételre, míg a negyedik szakasz az újabb cikluselőtti várakozó szakasz. A 8.2.4. . ábrán az első ciklust a nulladik mérésnek kell megadni, mert ekkorkell ellenőrizni a mozgófázis tisztaságát. A HILIC-nál a IV. szakaszon kell kialakulni a határfelületivízrétegnek. Amennyiben ennekkialakulásaa bizonytalan, akkor a visszatartás (retenció) isbizonymekkoratalanná válik. A határfelületi réteg kialakulásának bizonytalanságaa összefügg azzal, hogya mozgófázis víztartalma. Minél kisebb a mozgófázis víztartalma, annál hosszabb időt veszigénybe a határfelületen az egyensúlyhozközeli állapot elérése. Ha nulladiklépéstől, amelyet amozgófázis tisztaságának ellenőrzésére használunk, eltekintünk,akkor automata mintaadagolóhasználatakor, amikor egy méréssorozatonbelül vagyunk, nem szükséges az álló- és a mozgófázisközötti teljes egyensúly beállása. A feltétel, hogy mindig, a nulladiklépéstől eltekintve, ugyanolyanhelyzetből indítsuk a grádienselúciót. Sajnos a hagyományos folyadékkromatográfiás rendszereknél77

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICa késleltetési térfogat (dwell volume) nagyon eltérő is lehet. Ennek következtében ezt a HILICmódszerek átvételénél is figyelembe kell venni. A 8.2.5. ábrán adtuk meg, hogy az eltérő késletetésitérfogatú készülékekben hogyan alakulnak a mozgófázis összetételi viszonyai. Ha a legkisebbkésletetési térfogatú készülékre kidolgozott módszert át akarjuk vinni más folyadékkromatográfiáskészülékre, akkor figyelembe kell vennünk az eltérő késletetési térfogatot, amely döntően a folyadékkromatográfiáskészülékek eltérő keverési térfogatából ered.B%100t gt [perc]8.2.5. ábraA mozgófázis összetétel változása eltérő késleltetési idejű folyadékkromatográfiáskészülékek használatakor. Ha a legkisebb késleltetési térfogatú készüléknek megfelelően állítjuka grádiensidőt, akkor a többi készüléknél előbb ér véget a folyamat,mielőtt elérnénk a végső mozgófázis összetételtA késleltetési idő arányosan eltolja retenciós időket, mert kolonna elejét ezzel az idővel későbbéri el a mozgófázis. Ez a térfogat értelemszerűen nem okoz zónaszélesedést, de az elválasztásnálalapvető, hogy az elemzés leállítása előtt a kívánt erősségű oldószert elérjük (B). Az elemzési időttehát ezzel az idővel meg kell hosszabbítani. Izokratikus méréseknél is az adagolt minta térfogataés az adagolót a kolonnával összekötő vezeték térfogata megnöveli a retenciót. A jól optimáltrendszernél ez a térfogat elhanyagolható a kolonna térfogatához képest.8.2.6. ábraAz elméleti grádiens lefutás (szaggatott vonal) és a gyakorlatban kapott (folytonos vonal).A grádienselúciónál mindig figyelembe kell venni a késleltetési térfogatot. A 8.6. ábránmegadtuk az elméleti grádiens lefutást (szaggatott vonal) és a gyakorlatban kapottat (folytonosvonal). A HILIC módszerek átvételénél ezt figyelembe kell vennünk ezt. Továbbá, mivel a határfelületivízréteg az elválasztásnál alapvető szerepet játszik, a grádienst nem indíthatjuk acetonitrilből.A gyengébbik oldószernek a grádienselúciónál mindig kell vizet tartalmaznia. Kérdése, hogy milyenkoncentrációban. Elméletileg, annál jobb, minél nagyobb a koncentrációja, gyakorlatban viszont78

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICproblémát jelenthet, hogy a legkevésbé visszatartott komponens (legkevésbé poláris) visszatartásanem lesz megfelelő és a kolonna elején nem történik meg a koncentrálása. Ennek eredménye azlesz, hogy ennek a komponensnek a csúcsszélesedése nagyobb lesz, mint a többié.Az erős „B” oldószertartályba nem vizet teszünk, hanem 50-60 % szerves oldószer tartamúvizet vagy puffert. Az előzőekben már megállapítást nyert, hogy ez alatt a szerves oldószertartalomalatt a vegyületek visszatartása elhanyagolható. A 8.2.7. ábrán megadott grádinselúciós rendszernél,tehát az „A” tartályba 95/5 térfogatarányú acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)-víz (puffer), míg a „B” tartályba 50-60 tf. % acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)-víz (puffer kerül).AK I KOL DA, B – oldószerekI – injektorBgradienskésés oka: t D =t kev +t ö +t injt D – dwell time, késleltetési időt kev – keverő kiürülési idejet ö – összekötő vezetéken történő áthaladás idejet inj – injektorban töltött idő8.2.7. ábraAz „A” tartályba 95/5 térfogatarányú acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)-víz(puffer), míg a „B” tartályba 50-60 tf. % acetonitril (vagy egyéb vízzel elegyedő szerves oldószer)-víz (puffer kerül).Amennyiben puffert kell használnunk az ionogén anyagok elválasztásánál, akkor a sókiválásaz oldószernél lesz kritikus, mert csökkentve az acetonitril (szerves oldószer) tartalmat a pufferekoldhatósága nő a mozgófázisban. Ha az acetonitrilt (szerves oldószert) összekevertük a pufferrelés fél-egy óra múlva sincs kristály kiválás, akkor a sóproblémát elkerültük.Automata mintaadagoló használatakor egy mintasorozat mérésekor nem kell a teljesegyensúly beállását kivárnunk. Ez sokszor feleslegesen megnövelné az elemzési időt. Ha az elsőmérést, amelyet „0”-nak nevezünk el, arra használjuk, hogy az oldószer tisztaságot ellenőrizzük,akkor a IV. szakaszon az a fontos, hogy annak befejeztével az „A” mozgófázis áramoljon a kolonnán.A szabályos egymás utáni adagolásokkor, minden esetben ugyanolyan távol vagyunk a teljesegyensúlytól, így minden egyes adagolás után ugyanazokat a visszatartásokat kapjuk. Ha méréstvalamilyen okból megállítjuk, akkor az új sorozatot ismét a „0” megjelöléssel kell indítanunk.8.3. A grádienselúciós folyadékkromatográf tesztjeA grádienselúciós rendszerek megbízhatóságát több paraméter is befolyásolja. Az előzőfejezetben (8.2.) kiemeltük a késleltetési térfogat szerepét(dwell volume), emellett a folyadékkeverésjósága, a szelepek megbízható működésével összefüggő paraméterek mind-mind befolyásolják agrádiens ismételhetőségét és reprodukálhatóságát. Fel szeretnénk hívni a figyelmet, hogy sokesetben a grádiens ismételhetőségét és reprodukálhatóságát felcserélve használják. Minden olyanesetben, amikor ugyanazon a készüléken végezzük el a kísérleteket, annak bizonyítására, hogy haugyanazt a grádinsprofilt alkalmazzuk, akkor a retenciós idők szórása a megadott előíráson belül(specifikáción) marad, akkor ez a grádiens ismételhetőségét jelenti. Ha a kidolgozott grádienselúciósmódszert átvisszük egy megegyező késleltetési térfogatú készülékre és a retenciós időkre; és aszórására ugyanazt kapjuk, mind az előző készülékre, akkor a reprodukálhatóságot ellenőriztük.79

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA retenciós idők két grádienselúciós készüléken, azonos körülményeket alkalmazva, akkoregyeznek meg, ha a késletetési térfogataik és a folyadékkromatográfiás rendszer kolonnán kívülitérfogati megegyeznek. A 8.1.7. ábrán adtuk meg a grádienselúciós rendszert. A késleltetési térfogathárom részből tevődik össze; a keverő, a keverőt az adagolóval összekötő kapilláris, az adagolóössztérfogatából és az adagolót a kolonnával összekötő vezeték térfogatából. A hagyományosfolyadékkromatográfiás rendszernél ezek közül a térfogatok közül a keverő térfogata a legnagyobb,ehhez képest a többi elhanyagolható. Elvileg a kolonna végét a detektorcellával összekötő vezetékés a detektor térfogatoknak is meg kellene egyeznie, azonban az ezek között lévő különbségekelhanyagolhatók. Első feladat, tehát a HILIC-ban használt grádienselúciós készüléknél a késleltetésitérfogat ellenőrzése. Ehhez a folyadékkromatográfiás rendszerből a kolonnát kivesszük, és azadagolót a detektor bemenetelével egy fojtást jelentő kapillárissal kötjük össze. Ezzel küszöböljükki, hogy a nagynyomású szivattyú pulzálásából eredő detektorzajt nagymértékben csökkentsük.Vagy a nagyobb térfogat-áramlási sebességet alkalmazzunk, hogy az összekötő vezetéken megfelelőennagy legyen a nyomásesés (1-5 ml/perc). A grádienselúciós körülményeket a 8.3.1. táblázatbanadtuk meg.„A” mozgófázis 97/3 tf.% acetonitril-víz„B” mozgófázis 97/3/0,5th.% acetonitril-víz-acetonTérfogatáramlási sebesség1 ml/minDetektálási hullámhossz254 nmAdagoló hurka teljes mértékben feltöltve „A” mozgófázissal8.3.1. táblázatA késleltetési térfogat meghatározásakor alkalmazott folyadékkromatográfiás körülmények.Az adagoló hurka teljes mértékű feltöltése különösen azoknál a HPLC készülékeknél fontos,ahol a változtatható térfogatú adagolás miatt nagy mintatartó hurkot építenek be. Nem szabadelfelejteni, hogy az adagoló hurok térfogata része a késleltetési térfogatnak (dwell volume).A grádienselúciós módszernél az egyik készülékről a másikra való módszer átvitelnél fontos,hogy a teljes koncentráció intervallumban azonos sebességgel növekedjen az erősebb oldószer („B”)mennyisége az („A”)-ban. Ezt ellenőrizzük a grádiens lineritásának vizsgálatával. Ezt az ellenőrzéstis kolonna használata nélkül végezzük el. A mérési körülményeket és módszert a 8.3.2. táblázatbanadtuk meg.„A” mozgófázis 97/3 tf.% acetonitril-víz„B” mozgófázis 57/43/0,5tf.% acetonitril-víz-acetonTérfogatáramlási sebesség1 ml/minDetektálási hullámhossz254 nmAdagoló hurka teljes mértékben feltöltve „A” mozgófázissalGrádiensidő:10 perc, ehhez hozzá kell adni a késleltetési időt.8.3.2. táblázatA grádinselúciós rendszer linearitásának ellenőrzése a HILIC-nál.10 perc és ehhez adva a grádienskésés idejét, ez alatt az idő alatt jutunk el az „A” oldószerrőla „B” oldószerig. A viszonyokat a 8.3.1.ábrán mutatjuk be. Ha felfutó szakasz egyenletes, akkor agrádiens lineáris, mert az egyenes szakaszra igaz, hog y az egységnyi idő alatt ugyanannyival nőa mozgófázisban a „B” koncentrációja (ΔB tf.%/Δt=állandó). Ha a felfutó szakasz nem egyenletes,akkor ez jelzése annak, hogy a keverő nem működik jól.80

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfiaújabb fejlesztési irányai – HILIC8.3.1. ábraA grádinselúciós rendszer linearitásának ellenőrzése a HILIC-nál.Következőkben a gádienslépések ellenőrzését végezzük el. Ehhez a mérési körülményeket a8.3.2. táblázatban adtuk meg.„A” mozgófázis97/3 tf.%acetonitril-víz„B” mozgófázis57/43/0,5tf.%acetonitril-víz-acetonTérfogatáramlási sebesség1 ml/minDetektálási hullámhossz254 nmAdagoló hurka teljes mértékben feltöltve „A” mozgófázissalA „B” koncentrációját az „A”-ban 5 lépcsőzetesen növeljük és minden lépcsőközött 5 percetvárunk, amíg eljutunk a „B” oldószerig (57/43/0,5tf.%acetonitril-víz-aceton).8.3.3. táblázatA grádienselúciós készülék grádienslépéseinek ellenőrzése a HILIC-ban, mérési körülmények.A lépcsők magasságának minden egyes változtatásután meg kell egyezni. Ekkor a „B” koncent-arációjától független az oldószerváltoztatássebessége.Ha ez nemteljesül, akkor a készüléketszerviznek verifikálni kell.8.3.2. ábraA grádienselúcióss készülék grádienslépéseinek ellenőrzése a HILIC-nál.A jól működő grádienselúciós rendszernél h 1 = h 2 = h 3 = h 4 = h 5 = h 6 = h 7 = h 8 .81

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICA 8.3.2. ábraa jól működő grádienselúciós rendszernél h 1 = h 2 = h 3 = h 4 = h 5 = h 6 = h 7 = h 8 ,azaz egyenlő lépcsőmagasságokat kapunk.A hagyományos nagyhatékonyságúfolyadékkromatográfiásrendszereknél (HPLC, 400 bar,6000 PSI) a kisnyomású grádiens készülékeket alkalmaznak döntő mértékben. Itt a vezéreltszelepekkel érik el a megfelelő összetételű mozgófázist. A szelepek működését dőről-időre ellenőriznikell. Ezt szolgálja a következő teszt, amelyet a HILIC-nál kell elvégeznünk. A kisnyomású grádiens-elúciós készüléket vagy binér (két szelep) vagy kvaterner (négy szelep) rendszerként használjuk.A szelepek működési jóságánakellenőrzését a 8.3.4.táblázatban megadottak szerint végezzük el.A és B ág97/3 tf.részacetonitril/vízC és D ágTérfogatáramlási sbességDetektálási hullámhossz97/3/0,5 tf.rész acetonitril/víz/aceton1 ml/min254 nmMérésilépések:1.2.3.50/50 rész az A ágból, valamint a C ágból idő: 3 perc100 résza C ágból, idő 3 perc50/50 rész az A ágból, valamint a C ágból idő: 3 percA fentiek ismétlése: négyszer,majd az összes lehetséges kombinációra el kell végezni.8.3.4. táblázatA kisnyomású grádienselúciós készülékeknéll a szelepek korrekt működésénekellenőrzésekor használt mérési körülmények és útmutató.Azegyes szelepek ellenőrzésekor a 8.3.3. ábrán megadottakaat kapjuk.8.3.3. ábraA kisnyomású grádienselúciós készülékeknél a szelepek korrektműködésének ellenőrzésekorkapott jelsorozat. Az egyes magasságokból számoljukaz átlagot, ezzel osztjuk az egy mérésnélkapott jelet, majd ezekbőlszámoljuk a szórást, ha ez két százaléknál kisebb a szelepekműködése megfelelő.A 8.3.3. ábránlátható méréseket az összes szelep kombinációra elvégezzük és számoljuk aszórásokat. Ennél a műveletnél az egyes magasságokból számoljuk az átlagot, ezzel osztjuk azegy mérésnél kapottt jelet, majd ezekből számoljuk a szórást, ha ez két százaléknál kisebb a szelepekműködése megfelelő.82

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICA grádienselúció megbízhatóságát a rosszul működő szelepek nagyban befolyásolják. A nagynyomásúszelepet ellenőrizni tudjuk, hogy jól zár-e. angolul ezt nevezik „pressure bleed-down”tesztnek. Elvégzése a következőképp történik. A nagynyomású szivattyú nyomás-behatárolóját350 bar-ra állítjuk. A szivattyúról kijövő vezetéket lezárjuk, és megindítjuk a mozgófázis áramlását.A nyomáshatároló automatikusan leállítja a nagynyomású szivattyút, amikor a nyomás eléri a350 bar-t. Ha tíz perc eltelte után a nyomáscsökkenés nem nagyobb, mint 15%, akkor a szelepekjól működnek. Ha ennél nagyobb, akkor a szelepet tisztítani vagy cserélni kell.Az egész grádienselúciós rendszer ellenőrzését teszi lehetővé a reprodukálhatóság ellenőrzése.A reprodukálhatóság itt annyit jelent, hogy a tesztet bármely időben megismételve ugyanazokat aszórásokat kapjuk. Az analitikai szakirodalomban ezt a tesztet inkább az ismételhetőség fogalomkörébekellene sorolnunk. A szakirodalomban és a készülék gyártók körében a „reprodukálhatóság”néven vált ismertté, ezért mi is ezt a fogalmat használjuk.Tetszőleges vegyületsort kiválasztunk, azzal a feltétellel, hogy nagy legyen a vegyületekközött a polaritás különbség. Kromatográfiásan semleges vegyületeknél, ez a két egység különbségetjelent a lgP-ben, úgyhogy a legkevésbé visszatartott komponensre teljesüljön, hogy a lgP kisebblegyen, mint -0.5 vagy -1. Hatszor elvégezve a grádienselúciós mérést, a mért adatokból számoljukaz átlagértéket és a szórást. Ugyancsak a görbe alatti területekből számoljuk az átlagot és a szórást.Mindkét esetben, ha a szórás egy százalék alatt van, akkor a grádienselúciós készülék jól működik.83

TárgymutatóDr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILICÁllófázisokerős anioncserélő .....................................................................................................................................................28erős kationcserélő ....................................................................................................................................................28HILIC aminofázis .....................................................................................................................................................30HILIC szilikagél ........................................................................................................................................................15HILIC Zwitter-ionos fázis .......................................................................................................................................29kizárási molekulatömeg ...........................................................................................................................................13ZIC-cHILIC ................................................................................................................................................................35ZIC-HILIC ..................................................................................................................................................................31ZIC-pHILIC ................................................................................................................................................................31zwitterionos fázisok ................................................................................................................................................35Elúcióerősségi sorrend .......................................................................................................................................................61visszatartás-víztartalom ...........................................................................................................................................61Gradienselúcióáltalános gradienselúció .........................................................................................................................................65eredmény átvitele ....................................................................................................................................................70gradiens ismételhetősége ........................................................................................................................................80gradiens lépcsők ......................................................................................................................................................77gradiens linearitása ...................................................................................................................................................80gradiensprofil kiválasztása .......................................................................................................................................66induló gradiens (A) .................................................................................................................................................65késleltetési térfogat (dwell volume) .........................................................................................................................78lineáris erősségű gradiens ......................................................................................................................................66oldószer gradiens ......................................................................................................................................................65szelepműködés ellenőrzése .....................................................................................................................................82végső összetétel (B)...................................................................................................................................................66HILICbesorolása ................................................................................................................................................................... 9egyensúly beállása ....................................................................................................................................................21elúciós erősségi sorrend .........................................................................................................................................43eluens erősségi sorrend ..........................................................................................................................................40fogalma ....................................................................................................................................................................... 7használható állófázisok ...........................................................................................................................................11kolonna tárolása ....................................................................................................................................................2084

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICpH függés .................................................................................................................................................................19pH kontroll ...............................................................................................................................................................20polimer alapú álófázis pH tartomány ...................................................................................................................31szelektivitási sorrend ..............................................................................................................................................43szilikagél állófázis pH tartomány .........................................................................................................................21szilikagél, polárisan módosított pH tartomány .......................................................................................................24víztartalom a mozgófázisban ................................................................................................................................40vizsgálható vegyületek ...........................................................................................................................................22Zwitter-ion állófázis pH tartomány ......................................................................................................................31HPLCelválasztás tervezése ..............................................................................................................................................12ionizáció visszaszorítás ..........................................................................................................................................56ionizáció, bázisos ....................................................................................................................................................47ionizáció, pH függés .................................................................................................................................................45ionizáció, savas .......................................................................................................................................................45vegyületek besorolása .............................................................................................................................................22HPLC kolonnákanalitikai kolonnák anyaga, méretei ....................................................................................................................33kolonnán kívüli zónaszélesedés ............................................................................................................................33kritériumok a használatra ......................................................................................................................................10mikro és nano kolonnák ..........................................................................................................................................32KölcsönhatásokH-hidas .....................................................................................................................................................................17hidrofób ....................................................................................................................................................................25HILIC kölcsönhatás ................................................................................................................................................... 7ionos ..........................................................................................................................................................................19lgDgradienselúció ...........................................................................................................................................................59kritikus párok ............................................................................................................................................................59lgD-k .........................................................................................................................................................................46lgD-pH .......................................................................................................................................................................46lgPkritérium ...................................................................................................................................................................73retenciós sorred .........................................................................................................................................................58Mozgófázisokerőssége ....................................................................................................................................................................4285

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIChasználható pufferek ..............................................................................................................................................49kompatibilitása PEEK-al .........................................................................................................................................43koncentrációja ..........................................................................................................................................................78oldószerek .................................................................................................................................................................41retenció változása ...................................................................................................................................................62szelektivitsa ...............................................................................................................................................................43vízhatás .....................................................................................................................................................................61pHfogalma a HILIC-ben ................................................................................................................................................51kiválasztása ..............................................................................................................................................................52látszólagos ................................................................................................................................................................51mérése .......................................................................................................................................................................52optimálása ................................................................................................................................................................54pH skála ....................................................................................................................................................................53pKabázisos ......................................................................................................................................................................47savas ..........................................................................................................................................................................45vizes ..........................................................................................................................................................................50Puffer ..............................................................................................................................................................................48készítése ....................................................................................................................................................................51kompatibilitása ........................................................................................................................................................49pufferkapacitás ........................................................................................................................................................48szerves komponensekkel ........................................................................................................................................49tisztasági követelmények .......................................................................................................................................49RP-HPLCmeghatározható vegyületek ..................................................................................................................................... 9nem mérhető vegyületek .......................................................................................................................................... 9oldószererősség ........................................................................................................................................................66visszatartás függése a szerves oldószer tartalomtól ...........................................................................................66RP-IP-HPLCkiváltása HILIC-val ...................................................................................................................................................11meghatározható vegyületek ..................................................................................................................................... 9nem mérhető vegyületek .......................................................................................................................................... 9Szilikagélanion protonfelvétele ...............................................................................................................................................22felületi tulajdonságok .............................................................................................................................................1786

Dr. Fekete Jenő: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai – HILICfémionok beépülése.................................................................................................................................................18határfelület kialakulása ..........................................................................................................................................18ioncserés kölcsönhatás ...........................................................................................................................................19Vegyületekbázisos .......................................................................................................................................................................23kis molekulatömegűek ............................................................................................................................................13meghatározási kritériumok ....................................................................................................................................12nagy molekulatömegűek .........................................................................................................................................12savas ..........................................................................................................................................................................22semleges....................................................................................................................................................................22Visszatartási faktor függéseállófázistól ................................................................................................................................................................57lgD-től .......................................................................................................................................................................59lgP-től ........................................................................................................................................................................59pH-tól ........................................................................................................................................................................47víztartalomtól ................................................................................................................................................... 63, 66Víztartalomhatárfelületi réteg ............................................................................................................................................. 18, 77induló ........................................................................................................................................................................65végső .........................................................................................................................................................................66Víztartalom pHállófázisban ..............................................................................................................................................................23mozgófázisban .........................................................................................................................................................53Zwitterionos állófázisokkölcsönhatások ........................................................................................................................................................31szerkezete .................................................................................................................................................................30szerves polimer alapúak .........................................................................................................................................31szilikagél alapúak ....................................................................................................................................................3587

Merck HPLC állófázisokMegnevezésLiChrosorb®LiChrospher®Superspher®Purospher®Purospher STAR®Aluspher®Chromolith®ZIC®-HILICTöltetcsalád jellemzõiPorózus, irreguláris, szilikagél alapú töltet.Poláros és apoláros fázisok.5, 7, 10 μm szemcseméret.Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél alapú töltet.Poláros és apoláros fázisok.5, 10, 12 μm szemcseméret.Porózus, gömbszimmetrikus, szilikagél alapú töltet.Poláros és apoláros fázisok.4 μm szemcseméret.Porózus, gömbszimmetrikus, nagytisztaságú(fémion-mentes) szilikagél alapú töltet.Poláros és apoláros fázisok.5 μm szemcseméret.Porózus, gömbszimmetrikus, nagytisztaságú(fémion-mentes) szilikagél alapú töltet.Poláros és apoláros fázisok.2, 3, 5 μm szemcseméret.Porózus, gömbszimmetrikus, alumínium-oxidalapú töltet.Apoláros fázisok.5 μm szemcseméretPorózus, monolitikus, nagytisztaságú(fémion-mentes) szilikagél alapú töltet.Poláros és apoláros fázisok.Porózus, gömbszimmetrikus,szilikagél - vagy polimer alapú töltet.Ikerionos szerkezetû hidrofil állófázis.3.5, 5 μm szemcseméret.Merck Kft. · Magyarország 1113 Budapest, Bocskai út 134-146.Telefon: 463-8100E-mail: kemia@merck.huFax: 463-8101 szerviz@merck.huwww.merck-chemicals.hu

Felelõs kiadó:Merck Kft. · Magyarország1113 Budapest, Bocskai út 134-146.Telefon: 463-8100Fax: 463-8101Honlap: www.merck-chemicals.huE-mail: kemia@merck.huszerviz@merck.hu