Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Molnár Andrea Dr., Ph.D. IIDE OEC Kardiológiai Intézet, Klinikai Fiziológiai TanszékPROTEIN KINÁZ C ALFA (PKCALFA) TRANSZLOKÁCIÓ ÉSSZUBSZTRÁT-SPECIFITÁS VIZSGÁLATA HUMÁN SZÍVIZOMBANA protein kináz C (PKC) izoenzimek szerepét a szívizom kontrakciószabályozásában és az ischaemiát követő reperfúziós károsodásban egyarántfeltételezik. A PKC enzimcsaládba különböző aktivációs mechanizmusú (Ca2+és diacil-glicerol által aktivált) izoenzimek tartoznak. A PKC izoenzimekrespecifikus gátló és aktiváló szerek kifejlesztése újabb terápiás lehetőségeketnyújthat a kardiovaszkuláris betegségek kezelésében is. Kísérleteinkben humánszívizom mintákban a foszfolipid- és Ca2+ függő PKCalfa expresszióját,transzlokációját és szubsztrát specifitását vizsgáltuk. Első lépésként a PKCalfaexpresszióját és celluláris lokalizációját határoztuk meg Western blot technikafelhasználásával. Eredményeink szerint a PKCalfa fiziológiás körülményekközött elsősorban a citoszolban található. Miután a PKC aktiváció során gyakrankövetkezik be transzlokáció, vizsgáltuk a lipid aktivátor PMA és a Ca2+ hatásátis. Western blot kísérleti erdeményeink szerint a PKCalfa kötődése a kontraktilisrendszerhez kontroll körülmények között 12 ± 6% (a maximális kötődés %-ábankifejezve), 10 mikroM PMA hozzáadására 34 ± 11%, 5 mM Ca2+ jelenlétében93 ± 7%, amely PMA hozzáadására (10 mikroM PMA + 5 mM Ca2+) semváltozott jelentősen (91 ± 5%). A kötődés nyilvánvaló Ca2+ függésénekvizsgálatára meghatároztuk a Ca2+ dózis-hatás összefüggést 0-10 mM Ca2+hozzáadásával. Eredményeink szerint a félmaximális aktivációhoz szükségesCa2+ koncentráció (EC50) 172 mikroM. A kötődés Ca2+ függése felveti annaklehetőségét, hogy olyan kórállapotokban, amikor az intracellularis Ca2+ kórosanemelkedett (pl. ischaemia-reperfúzió során) az aktivált PKCalfa hatásátközvetlenül a kontraktilis fehérjék foszforilációján keresztül fejti ki. Ezértrekombináns PKCalfa felhasználásával meghatároztuk a humán szívizomkontraktilis fehérjéinek foszforilálhatóságát (kináz specifkus aktivitás: 4,3±0,9pmol/min) és autoradiográfiával azonosítottuk a szubsztrátok molekulaméreteit(OTKA F 048873).Témavezető: Dr. Tóth Attila