Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Kiss Andrea, Ph.D. IIOrvosi Vegytani IntézetMIOZIN FOSZFATÁZ SZABÁLYOZÓ ALEGYSÉG TATTRANSZDUKCIÓS DOMÉNNAL KAPCSOLT N-TERMINÁLISPEPTIDJÉNEK TRANSZDUKCIÓJA SEJTEKBEA miozin könnyű láncának (MLC20) foszforilációja fontos szerepetjátszik simaizom és nemizom sejtek kontrakciójának és motilitásánakszabályozásában. A miozin foszforilációs szintjét a könnyű láncot foszforilálókinázok és a miozin foszfatáz (MP) aktivitásának aránya határozza meg. Amiozin foszfatáz holoenzim 38 kDa protein foszfatáz 1 katalitikus alegységből(PP1c), valamint egy 110-130 kDa szabályozó alegységből (MYPT1) áll. APP1c katalitikus alegység enzimatikus aktivitását a MYPT1 szabályozza, aközöttük lévő kölcsönhatás kialakításában a MYPT N-terminálispeptidszakaszai vesznek részt.A MYPT N-terminális régiójának kölcsönhatását PP1c-vel és hatását amiozin foszfatáz aktivitására in vitro és in vivo körülmények közötttanulmányoztuk. A MYPT N-terminális peptidszakaszát (MYPT132-58), amelytartalmazza a PP1c-kötőmotívumot is, biotinnal és a HIV1 vírus transzkripciósfaktorának (Tat) fehérje transzdukciós doménjével kapcsoltuk (biotin-Tat-MYPT132-58). A Tat domén a peptid átjutását segíti a sejtmembránon, lehetővétéve ezáltal a peptid hatásának vizsgálatát in vivo.A peptid az alábbi sajátságokat mutatta: (a) csökkentette a miozinfoszfatáz aktivitását P-MLC20 szubsztráttal szemben, de nem volt hatása P-miozin szubsztrát esetén; (b) erős kölcsönhatást alakított ki PP1c-vel, ezáltalalkalmasnak bizonyult a PP1c affinitás kromatográfiás tisztítására részlegesentisztított PP1c preparátumból, valamint a PP1c sejtlizátumból való kinyerésérestreptavidin-Sepharose segítségével (pull-down); (c) PP1c-vel előinkubálvakivédte a gátló helyen (Thr695) tiofoszforilált MYPT1 PP1c-t gátló hatását. Abiotin-Tat-MYPT132-58 peptid rövid idő alatt akkumulálódott A7r5 és HepG2sejtekben, és streptavidin-Alexa Fluor 488 festéssel fluoreszcens mikroszkópiaalapján a citoplazmában és a sejtmagban lokalizáltuk. Ezzel szemben a biotin-Tat peptid jelenlétét csak a citoplazmában észleltük.Eredményeink arra utalnak, hogy a biotin-TAT-tal kapcsolt PP1c-kötőpeptidek alkalmasak lehetnek PP1c tisztítására, a PP1c sejtlizátumból valókinyerésére, valamint a PP1c sejten belüli eloszlásának és szabályozásánakvizsgálatára.Témavezető: Prof.Dr. Erdődi Ferenc