Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Juhász Judit, Ph.D. IIBiofizikai és Sejtbiológiai IntézetERBB2 “SHEDDING” MUTÁNST EXPRESSZÁLÓ CHO SEJTVONALELŐÁLLÍTÁSA ÉS JELLEMZÉSEAz epidermális növekedési faktor családba tartozó ErbB2 receptor tirozinkináz az emlőtumorok kialakulásában és progressziójában kitüntetett szerepettölt be. E fehérje az emlőtumorok 25-30 %-ában túlzott expressziót mutat, melya daganat rossz prognózisával társítható, ezért ígéretes terápiás célpontnaktekinthető. Számos sejtfelszíni transzmembrán fehérje esetén ismert a ligandkötőrész leválása és az extracelluláris térbe jutása („shedding”), melyért többféleproteolitikus mechanizmus is felelős lehet, köztük az emlőtumor sejtek általtermelt sejtfelszíni enzimek. Olyan kísérleti rendszert kívánunk létrehozni,melyben az ErbB EC domén leválását szelektíven, proteázok hozzáadásávalkiválthatjuk.Az ErbB fehérjék leválásának vizsgálatára egy YFP-ErbB2 fúziósfehérjét tartalmazó plazmid módosítását választottuk, melyben a „shedding”részt helyspecifikus mutagenezissel úgy módosítottuk, hogy egy, a HIV-1proteolitikus enzimére specifikus hasítási helyet vittünk be. Ezt a mutált fúziósfehérjét kódoló plazmidot ErbB2-t nem expresszáló CHO sejtvonalbatranszfektáltuk. Mivel a YFP-ErbB2 fehérje a csak a YFP-pozitív sejtek kishányadában jutott ki a membránba, extracellulárisan Alexa647-2C4 anti-ErbB2monoklonális antitesttel jelöltük a sejteket és nagy sebességű áramlásicitometriás szeparálást alkalmazva dúsítottuk a kettős pozitív, teháttranszmembrán YFP-ErbB2-t tartalmazó sejtpopulációt. Az így létrehozottsejtvonalat HIV-1 proteázzal kezeltük és áramlási citometriával mértük azintracelluláris (YFP fluoreszcencia) és extracalluláris (Alexa647-2C4fluoreszcencia) ErbB2 domének arányának változását. A YFP/Alexa647hányados növekedése kis mértékű volt, feltételezhetően azért, mert az enzimhozzáférése a specifikus hasítási helyhez sztérikusan gátolt. Ezért következőlépésben egy olyan „shedding” mutánst hoztunk létre, amelyben a hasítás amembrántól távolabbi helyen történik.Az általunk kidolgozott áramlási citometriás szelekciós módszerlehetőséget ad arra, hogy az új konstrukcióval létrehozott transzfektánsokszelekcióját és proteáz érzékenységének tesztelését gyorsabban éshatékonyabban végezhessük.Témavezető: Prof.Dr. Szöllősi János