Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Tóth Kornélia , TTK VDE OEC ÁOK Humángenetika IntézetA CA2+ SZIGANLIZÁCIÓ ELEMEINEK VIZSGÁLATA IRÁNYÍTOTTMUTAGENEZISSEL (PCR TARGETING) STREPTOMYCESCOELICOLOR-BAN.Számos korábbi kísérlet bizonyítja, hogy a prokariótákban – ígyStreptomyces-ekben - is fontos fiziológiai szabályozó szerepet játszik azintracelluláris Ca2+ szint. Ennek ellenére ezekben az élőlényekben a Ca2+szignalizáció mechanizmusa és az abban résztvevő molekulák lényegében nemismertek. Kísérleteink célja az, hogy Streptomyces coelicolor–banmegvizsgáljuk a az eukarióta kalmodulinnal homológiát mutató Ca-kötőfehérjék fiziológiai szerepét a baktérium differenciálódási folyamatában. A S.coelicolor teljes genom szekvenciája ismert, a genom pedig cosmid könyvtárbanrendelkezésünkre áll. Egy géntermék funkciója kiderítésének egyik lehetségesmódja ha a gént mesterséges mutagenezissel null alléllá alakítjuk ésmegviszgáljuk a mutáció fenotípusos következményeit. A mutagenezis egyiklehetséges módja a gén megszakítása egy szelektálható antibiotikum rezisztenciagén beültetésével. Munkánk során a Q9RIX2 jelű Ca-kötő fehérjét kódoló génmutagenezisét végeztük el. Első lépésben a gén genomiális kópiáját tartalmazócosmidot (SCJ33) klónoztuk a l RED rekombinációs rendszert is tartalmazó E.coli-ban, majd PCR-ral elkészítettük a gén megszakításra felhasználhatóapramycin rezisztencia kazetta olyan változatát amelynek 5’ és 3’ vége azonosvolt a Q9RIX2 gén 5’ és 3’ végével. Ezt a rezisztencia kazettát elektroporáltukaz SCJ33 cosmidot tartalmazó coli törzsbe, ahol a rezisztencia kazetta a l REDrekombinációs rendszer segítségével beépült a célgén szekvenciájába, azazelkészítettük a gén megszakított null allélját. A cosmidba való beépülést PCRralellenőriztük. A megszakított allélt tartalmazó cosmidot ezután több lépésben,a coli konjugációs rendzserét felhasználva bevittük a S. coelicolorspórasejtjeibe. Ezeket a transzformált spórákat tenyésztve, a sejtek növekedésesorán a cosmidról kettős crossing overrel beépülhetnek gének a coelicolorgenomjába (homológ rekombináció) így bizonyos valószínűséggelkicserélhetjük a S. coelicolor genomiális vad allélját a megszakított mutánsallélra. Az exkonjugánsokban a gén beépülését apramycin- és kanamycinrezisztáncia szelekcióval ellenőrizhetjük. A elkészített mutánsokban ismét PCRralellenőriztük az apramycin kazetta genomba való beépülését. Végülmegvizsgáljuk a mutáns fenotípusát.Témavezető: Dr. Penyige András