Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Molnár Gábor, Biotechnológus V, Kovács László, Mol.Biol. VDE OEC Orvosi Vegytani IntézetCANDIDA ALBICANS PPZ1 cDNS JELLEMZÉSE ÉS A GÉNEXPRESSZIÓGÁTLÁSÁRA ALKALMAS ANTISZENSZ OLIGONUKLEOTIDTESZTELÉSEA hazai egészségügyi felmérések szerint a sarjadzó gombák által okozottfertőzések száma az utóbbi két évtizedben jelentős mértékben megnövekedett. Afertőzések 60-70%-ért a C. albicans a felelős. Mivel a hagyományosgombaölőszerekkel szemben erősödő rezisztencia figyelhető meg, új típusúterápiás célpont keresését tűztük ki célul.Korábbi adataink szerint a PPZ protein foszfatáz gombaspecifikus ésesszenciális funkciókkal rendelkezik. Ezért először igazoltuk, hogy a PPZ-tkódoló CaPPZ1 gén C. albicansban is megtalálható, majd polimerázláncreakcióval az adatbázisból hozzáférhető szekvenciák alapján tervezettoligonukleotid primerek segítségével klónoztuk és jellemeztük a mintegy 2700bp-ból álló gént.A CaPPZ1 cDNS izolálása céljából C. albicans pSCGAL10-SN cDNSkönyvtárat oligonukleotid primerpárok segítségével, PCR módszerrel szűrtünk.A legnagyobb PCR reakció terméket klónoztuk és szekvenálás segítségéveligazoltuk, hogy a CaPPZ1 cDNS kódoló régiójának 1178 bp nagyságú részletéttartalmazza, azonban hiányzik belőle a kódoló régió két kisebb szakasza,valamint a nem kódoló szekvencia részletek.A cDNS hiányzó 5’- és 3’-végeinek meghatározására RACE kísérletetterveztünk. Ennek során C. albicans RNS preparátumból RT-PCR segítségévelcDNS-t állítottunk elő. A cDNS templátról génspecifikus primerekkel PCRreakcióval amplifikáltuk és klónoztuk a CaPPZ1 cDNS 5’ végének 1010 bp, a 3’végének pedig 933 bp méretű darabját. Ezek a fragmentek átfednek a márkorábban klónozott cDNS-sel, így a három részleges cDNS szakasz nukleotidsorrendjéből összeállítható a teljes hosszúságú CaPPZ1 cDNS szekvenciája.A cDNS szekvencia ismeretében egy 21 tagú kémiailag módosítottCaPPZ1 antiszensz oligonukleotidot terveztünk. Az oligonukleotid sorsánakkövetésére az 5’-véget Cy5 fluoreszcens festékkel jelöltük. Igazoltuk, hogy pH7,4-en az antiszensz oligonukleotid bejuttatható a patogén gombába. Ilyenkörülmények között csak a megnyúlt alakot mutató hifákban mutatható ki afluoreszcens festék. Az oligonukleotid felvétel egyértelmű bizonyítása céljábólkonfokális fluoreszcens mikroszkópiás felvételeket készítettünk, amelyekmegrősítették, hogy az oligonukleotid csak az aktívan osztódó megnyúltsejtekbe kerülhet be.Munkánkat az OMFB-00922/2003 pályázat támogatta.Témavezető: Prof.Dr. Dombrádi Viktor