Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Juhász Tamás, TTK VDE OEC Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani IntézetA HIGH DENSITY MESENCHYMÁLIS PORCOSODÓ KULTÚRÁKTRANSZFEKCIÓS LEHETŐSÉGEI. KALCINEURIN TRANZIENSTRANSZFEKCIÓJÁNAK AZ IN VITRO PORCDIFFERENCIÁCIÓRAGYAKOROLT HATÁSAIKísérleteink során csirkeembriók végtagtelepeiből izoláltkondroprogenitor sejtekből előállított primer sejtkultúrákon vizsgáltuk aporcdifferenciáció jelátviteli útvonalának egyes lépéseit. A kondrogenezismolekuláris mechanizmusának feltárásában lényeges adatokat szolgáltathatnakegyes enzimek transzfekciója is. A primer mesenchymális sejtektranszfekciójára vonatkozó irodalmi adatok hiányában, először a különbözőtranszfekciós módszerek hatékonyságát vizsgáltuk. Mivel a kalcineurin alapvetőfontosságú a porcdifferenciáció folyamán, kiterjesztettük kísérleteinketkalcineurint tranziensen expresszáló kultúrák előállítására is.GFP-t és GFP-hez konjugált kalcineurin-A alegységét tartalmazó pEGFP-C1 vektort transzformáltuk TOP10 E.coli baktériumtörzsbe. A plazmidokatQuiagen Maxi- és Minipreppel izoláltuk, majd XhoI restrikciós enzimmellinearizáltuk és PCR marker mellett azonosítottuk. A tranziens expresszióttöbbféle transzfekciós kit segítségével végeztük (Superfect, DMREI, AMAXA,Saint Mix), melynek eredményeként az AMAXA nukleofekciós módszersegítségével GFP-t expresszáló plazmidot bejuttatva a sejtekbe 93%-ostranszfekciós arányt értünk el, de a sejtek folyamatos pusztulása miatt a kísérlet3. napjára metakromáziát mutató porctelepeket nem tudtunk detektálni. A SaintMix transzfekciós kit protokollját módosítva hasonló transzfekcióshatékonyságot kaptunk és a tenyésztés 6. napján savas demetilmetilénkékkelvörös metakromáziát mutató porctelepeket is detektáltunk. Mivel a kezeletlenkontrollhoz viszonyítva a transzfektált kultúrákban csökkent metakromáziátdetektáltunk, ezért megvizsgáltuk a transzfektált sejtek életképességét ésproliferációját, valamint megszámoltuk a kultúrákból fölvált sejteket. Akalcineurinnal transzfektált kultúrákban a metakromázia fokozódást észleltünk acsak transzfekciós reagenssel kezelt kultúrákhoz viszonyítva. A porcképződésfokozódását és a kalcineurin transzfekció eredményességét RT-PCR ésimmunoblot segítségével is konkretizáltuk.Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a primer mesenchymális sejtekrendkívül érzékenyek a transzfekciós módszerekre, megfelelő körülményekközött nem-toxikus reagenseket alkalmazva nagy hatásfokkal transzfektálhatók,az overexpresszált enzimek molekuláris biológiai módszerekkel könnyenkimutathatók. Emellett sikerült kalcineurin tranziens expressziójávalporcképződés fokozódást indukálnunk.Témavezető: Dr. Zákány Róza