Programfüzet (PDF) - DE OEC Tudományos Diákköri Tanács

Gyöngyösi Adrienn , TTK VDE OEC ÁOK Humángenetika IntézetFEHÉRJÉK ADP-RIBOZILÁCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA STREPTOMYCESGRISEUS-BAN.Az ADP-riboziláció egy reverzibilis poszttranszlációs fehérje módosítás,ami lehetővé teszi a célfehérjék aktivitásának szabályozását. Fontossága ellenéremég mindig kevés ismeret áll rendelkezésünkre az így szabályozottfolyamatokról. Korábbi eredményeink arra utalnak, hogy a módosítást katalizálóADP-riboziltranszferáz (ADPRTáz) enzim aktivitása és az ADP-riboziláltfehérjék mintázata korrelációt mutat a sejtek differenciálódási folyamatával.Munkánk során az ADP-ribozilált fehérjék azonosításával akarjuk tisztázni ebiokémiai reakció fiziológiai szerepét. Kísérleteinkben kidolgoztunk egy újeljárást ADP-ribozilált fehérjék tisztítására. Az ADPRTáz NAD-ot használszubsztrátként és annak ADP-ribóz részét kapcsolja a célfehérjékhez. Eddigáltalában radioaktív NAD-ot használtak a folyamat vizsgálatára, ez azonbanrendkívül drága, nehézkes és radioaktív hulladékot is termelő eljárás.Kísérleteinkben biotinilált NAD-ot alkalmaztunk a radioaktív termék helyett ésegy kétlépéses, specifikus, affinitás kromatográfiás módszert dolgoztunk ki azADP-ribozilált fehérjék tisztítására. Első lépésben kidolgoztuk az optimálisreakció körülményeket a biotinilált szubsztrát mono-ADP-ribozilációsreakcióban történő felhasználására. A reakció során keletkező biotin-ADP-ribózmódosító csoportot tartalmazó fehérjéket SDS-PAGE eljárással történőelválasztás és elektroblottolás után avidin-peroxidáz konjugátummalazonosítottuk a blotton. A következő lépésben kidolgoztuk a tisztítás lépéseit,először egy – glükozilált fehérjék tisztítására alkalmas – aminofenilboronsavagaróztöltetet használó affinitás kromatográfiás oszlopon tisztítottuk az ADPriboziláltfehérjéket, majd a második, specifikus lépésben egy SoftLink-SoftRelease Avidin Resin kromatográfiás oszlopon tisztítottuk tovább a biotin-ADP-ribóz módosító csoportot tartalmazó fehérjéket. Ez a lépés alkalmas azADP-ribozilált fehérjéknek az egyéb, glükozilált fehérjéktől való elválasztásra.Az így összegyűjtött fehérjéket két dimenziós gélben választottuk szétizoelektromos pont és molekulaméret szerint, majd a fehérjéket a gélből kivágvatripszines emésztésnek vetettük alá ás az így nyert fragmenteket MALDI-TOFanalízissel azonosítottuk. A fehérjék azonosítását azonban nehezíti, hogy a S.griseus genom még nem ismert, ezért a fragmentek aminosav szekvenciájánakmeghatározását is el kell végeznünk a fehérjék felismeréséhez.Témavezető: Dr. Penyige András