Génexpressziós vizsgálatok

Génkifejeződési vizsgálatokKocsy GáborMTA Mezőgazdasági KutatóintézeteNövényi Molekuláris Biológia Osztály2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A génkifejeződés• A sejtmag génekettartalmaz; (fehérjéket, RNSeketkódoló);• A gének átíródnakmRNS;• Pre-mRNS vagy hn-RNSszintetizálódik;• RNS-utófeldolgozás vagyérés;• Az RNS a citoplazmábaszállítódik;• Fehérjévé fordítódik ariboszómákon transzláció.2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

GénkifejeződésA kromatin szerkezetfellazulásaDNShn-RNSTranszkripciós kontrollutófeldolgozásTranszkripciósfaktorok:DNS kötőfehérjékjellegzetesmotívumokkalTranszport kontrollmRNS stabilitásInaktív mRNSTranszlációA fehérje poszt-transzlációsmódosulásaAktív vagyinaktív fehérje2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Az eukarióta, fehérjét kódoló génekszerkezete• Promóter: 5’ szabályozó szekvenciák• 5’ nem kódoló régió: 5’ fehérjét és RNS-tnem kódoló szekvenciák• Kódoló régió: fehérjék, rRNS és tRNSkódjai (exonok , intronok)• 3’ nem kódoló régió: fehérjét és RNS-t nemkódoló régiók• 3’ STOP jel2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Az eukarióta gének szerkezeteGénÁtíródó régióPromóter/A transzkripciómegindulásánakszabályozásáraFehérjét kódoló szakaszokTerminátor2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Az eukarióta struktúrgén szerkezete2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Promóterek• A transzkripció cisz elemei, a DNS molekulaszabályozó szakaszai, amelyekhez az RNSpolimeráz enzimek és a transzkripciósfaktorok kapcsolódnak.2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Promóterek típusai• Konstitutív promóter: nem szabályozottpromóter, amely a hozzátartozó génfolyamatos átírását biztosítja, állandó nemspecifikusgénexpressziót eredményezve.• Indukálható vagy induktív promóter:környezeti tényezők hatására aktiválódópromóterek.2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A promóterek főbb típusai2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Indukálható promóterekTetR: Tn10 kódoltaTet represszor;35S CaMV: karfiolmozaikvírusbólszármazókonstitutívpromóter;Tc: tetraciklin2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A génkifejeződés szabályozása géncsendesítésselElőször petúniában írták leAz antocianin-szintézisben szerepet játszó kalkon-szintáz génjétfejeztették ki fokozott mértékben a virág színének sötétítése céljából.Az eredmény pigmenthiány lett a koszupresszió jelensége miatt.2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A géncsendesítés kis RNS-eken alapuló mechanizmusa(endoribonuclease)(RNA-induced silencing complex)2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A környezeti és anyagcsere-változásokhatása a génkifejeződésreKörnyezeti hatásÉrzékelés (szignálpercepció)Jelátvitel (szignáltranszdukció)Anyagcsere változásokGénexpresszióregulátorgének (transzkripciós faktorok)struktúrgének2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A génkifejeződés szabályozásaKörnyezetihatásFejlődés,növekedésIndukció Módosítás LebontásTéglalapban A, B, C: cisz-elemek,Körben A, B, C: transzkripciós faktorok,Ub: UbiquitinYamaguchi-Shinozaki and Shinozaki,Trends Plant Sci, 10:88-94, 2005RNS-polimerázGén2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

A génkifejeződést szabályozó jelátviteli utakSzárazságHidegABA-független útvonalCaABA-függő útvonalABA: abszcizinsav, AREB: ABRE-kötő fehérjék, ABRE: ABA-függő elemek,CBF: C-ismétlődést kötő elem, DRE/CRT: dehidrációra válaszoló elem,DREB: DRE-kötő fehérje, ICE: CBF-kifejeződés indukálójaShinozaki és mtsai, Curr. Op Plant Biol, 6:410-417, 20032012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Módszerek a génexpresszió tanulmányozásáraNövényi kivonatokban végzett vizsgálatokegyes gének expressziójának vizsgálataNorthern analízisRT-PCRtranszkriptom-analízis – több ezer gén expressziójának egyidejű vizsgálataarraykövetkező generációs, nagy hatékonyságú módszerekIn situ vizsgálatok metszetekben vagy élő sejtekben és szövetekbenhibridizáción alapuló közvetlen módszerlátható terméken alapuló közvetett módszer2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban:Northern analízisLépések:RNS-izoláláselválasztás agarózgélenátvitel Nylon-membránrahibridizáció jelölő próbávalIdőigényes: 1 hétCa-kötő p.26S rRNACS CS(Tsp5A) CS(Ch5A)18/15°C 2/2 °C0 2 6 2 6 1 3 7 11 21h h d18/15°C 2/2 °C0 2 6 2 6 1 3 7 11 21h h d18/15°C 2/ 2 °C0 2 6 2 6 1 3 7 11 21h h dA Ca-kötő fehérje génjénekexpressziós változásaia hidegkezelés során búzábanItt 32 P-vel jelölt nukleotiddal készült hibridizációs próbát használtunkLehet nem-radioaktív próbát is használni – pl. fluoreszcens jelölés2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Normalizált mennyiségNormalizált mennyiségGénkifejeződés kivonatokban:valós idejű (real time) RT-PCRLépések:Gyors: 2 napRNS-izoláláscDNS (másolat DNS) készítése reverz transzkripcióval (RT)DNS-felszaporítás PCR-rel (polimeráz láncreakció)fluoreszcensen jelölt termék folyamatos detektálása a reakció közbenadatelemzés a beépített programmalA Ca-kötő fehérje génjének expressziós változásai a hidegkezelés során búzábanRövid távú változásokHosszú távú változások0,082.50,0620,040,0200 1 2 3 4 5 6 7-0,02-0,04óraCS-CCS-2CS(Tsp5A)-CCS(Tsp5A)-2CS(Ch5A)-CCS(Ch5A)-21.510.500 5 10 15 20 25-0.5napCSCS(Tsp5A)CS(Ch5A)2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban:array módszer – transzkriptom-elemzésArray: sorrend; a hibridizációhoz használt cDNS vagy oligonukleotid szekvenciákat sorokbarendezve viszik fel valamilyen hordozóraTranszkriptom-elemzés: az mRNS-ek és a nem kódoló RNS-ek összeségének egyidejű elemzéseFelhasználás: gének kiválasztására, az eredményeket más módszerrel (RT-PCR) meg kell erősíteniCsoportosítás:méret szerint:macroarray – hordozó 8 × 12 cm-es Nylon-membrán, 30-40 g RNS szükséges hozzá,10-15000 gén expressziójának egyidejű vizsgálatára alkalmas, radioaktív jelölésmicroarray – hordozó tárgylemez, 1-2 g RNS szükséges hozzá, 40-50000 génexpressziójának egyidejű vizsgálatára alkalmas, fluoreszcens jelölésfelvitt nukleotidszekvencia szerint:cDNS-array – baktériumokban klónozott, PCR-rel felszaporított, 400-500 nukleotidnyi EST(expressed sequenced tag – szekvenált 400-500 nukleotid hosszú cDNS, melyeket cDNSkönyvtárakbólhatároznak meg) szekvenciákat visznek fel, kevésbé specifikusoligonukleotid-array – adatbázisok szekvenciái alapján 50-60 nukleotidnyi oligonukleotidokatszintetizálnak és visznek fel, specifikusabb – 3’ végre tervezettIdőigény:RNS-izolálás, cDNS-szintézis, hibridizáció, fényképezés – 2-3 hétadatelemzés – minimum 2-3 hónap2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban:array módszer – transzkriptom-elemzésA transzkriptom-elemzés mérföldkővei:2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban:cDNS-macroarray módszerA búza 5A kromoszómájának hatása a transzkripciós mintázatra a 3 heteshidegedzés során eltérő fagytűrésű búza genotípusokbanBúza cDNS hibridizálásaárpa cDNS macroarray-hez –heterológ hibridizációCSfagyérzékenyCS(Tsp5A)mérs. fagyérzékeny19126184847658303A vizsgált 10297 egyedi gén közül 921 volt hidegfüggő,174 kifejeződésére volt hatással az 5A kromoszómaCS(Ch5A)fagytűrőN. Stein, IPK, Gatersleben, Németo., 20052012. szeptember 25.Kocsy Gábor

CSCS(Tsp5A)CS(Ch5A)CSCS(Tsp5A)CS(Ch5A)CSCS(Tsp5A)CS(Ch5A)CSCS(Tsp5A)CS(Ch5A)Génkifejeződés kivonatokban:cDNS-macroarray módszerAz 5A kromoszóma által befolyásolt és ahidegedzés elején nagy átmeneti expressziós növekedést mutató gének0 1 7 21 nap (2 °C)Glutation-S-transzferázHideg akklimatizációs fehérjeCa-kötő fehérjeSzacharóz-szintetáz 1-AmilázDehidrin 4Dehidrin 6Lektin prekurzorLEA 14A fehérjeEmbrió-specifikus fehérje-3 0 3Log 2 (gén-központosított jelerősség)CS: Chinese Spring – mérsékelten fagyérzékenyCS(Tsp5A): Chinese Spring (Triticum spelta 5A) – fagyérzékenyCS(Ch5A): Chinese Spring (Cheyenne 5A) – fagytűrő2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban:oligonukleotid-microarray módszerHomológ hibridizáció: búzachip búza cDNS-sel, 15 0000 oligonukleotidFestés: kontroll zöld, kezelt piros fluoreszcens festékElső hibridizáció: kontroll, 1 nap 2 °C; CS, Ch, CS(Ch5A), CS(Tsp5A)számos gén (antioxidánsok, Ca 2+ -kötő fehérje) esetében a cDNS-macroarray-jelazonos az eredmény2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban: Transzkriptom-elemzéskövetkező generációs, nagy hatékonyságú módszerekkelA következő generációs transzkriptom-elemzés szekvenáláson alapul.A szekvenáláson alapuló módszerek összehasonlítása:Genomi DNScDNSSanger-féle dideoxinukleotidosmódszer - drágaA génexpresszió elemzésesorozatban – direkt mérés,új szekvenciák detektálásaKövetkező generációsmódszerek – véletlen elhelyezkedőrövid szekvenciákAdott szekvencia leolvasási gyakoriságából meghatározható a megfelelő gén kifejeződéseMorozova et al. (2009), Annu. Rev. Genom.Human Genet., 10: 135-1512012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban: Transzkriptom-elemzéskövetkező generációs, nagy hatékonyságú módszerekkel2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Génkifejeződés kivonatokban: Transzkriptom-elemzéskövetkező generációs, nagy hatékonyságú módszerekkel2012. szeptember 25.Kocsy Gábor

Transzkriptom-mintázatok elemzése - > RendszerbiológiaCél: a rendelkezésre álló adattengerből értelmezhető tudás megszerzése automatizált módon,bioinformatikai eszközökkelMódszer: különböző kísérleti rendszerekből származó komplex adathalmazok megszerzése,integrálása, analizálása, az adatokból kölcsönhatási rendszerek, hálózatok létrehozásainterdiszciplinális eszközökkel.Felhasznált tudományterületek:Infraindividuális rendszerbiológia – szervezet, szövet, sejt szintű kölcsönhatások leírásaGenomika: szervezet (szövet vagy sejt) szintű DNS-szekvenciák leírásaEpigenomika: szervezet szintű, nem a genomban kódolt szabályozó folyamatok (DNS-metilálás)tanulmányozásaTranszkriptomika: szervezet szintű génexpressziós mintázatok vizsgálatInterferomika: szervezet szintű korrekciós folyamatok (RNS interferencia) leírása.Proteomika: fehérje mintázatok tanulmányozásaMetabolomika: anyagcseretermék mintázatok tanulmányozása (részterület: glikomika, lipidomika)Interaktomika: szervezet, szövet és sejt szintű kölcsönhatások leírása a molekulák köztFluxomika: molekluláris dinamikai változások leírásaSzupraindividuális rendszerbiológia - a fajjal és a magasabb rendszertani egységekkel foglalkozikBiomika: a Föld különböző éghajlatú, flórájú és faunájú területei közti kölcsönhatások leírásaHierarchikus rendszerbiológia: különböző szerveződésű szintek közti kölcsönhatások leírásamolekula – sejt – szervezet – faj – populáció – életközösség különböző fajokkalAlkalmazás: gyógyszertervezés, megelőző gyógyítás, rendszerelméletű természetvédelem2012. szeptember 25.és mezőgazdaságKocsy Gábor.

In situ génkifejeződés: hibridizáción alapulóközvetlen kimutatás metszetekbenA „leafy” (leveles, virágmerisztéma differenciálódásáért felelős) gén kifejeződése (narancssárga szín)a virágkezdeményből és az embriózsákból készült metszeteken fluoreszcens festéssel (fast red)Arabidopsisban.Takechi et al. (1999), Plant Mol Biol Rep,, 17: 43-512012. szeptember 25.Kocsy Gábor

In situ génkifejeződés: közvetlen kimutatás RT-PCR-rel metszetekben18S rRNS kifejeződése a Zinnia elegans epikotilmetszeteiben RT-PCR-rel. A PCR-reakcióhozhasznált egyik nukleotidot fluoreszcensen jelölték.A nyilak a faedényekben jelzik a génkifejeződést.Pasquet et al. (2004) Plant J, 39: 947-9592012. szeptember 25.Kocsy Gábor

In situ génkifejeződés: közvetlen kimutatás hibridizációval teljes növényben32P-tal jelzett vírus RNS kimutatása Arabidopsis levelekbenKong, Simon (1998): Arabidopsis protocols,p. 409-415, Humana Press, 9978-0-89603-391-72012. szeptember 25.Kocsy Gábor

In situ génkifejeződés: közvetett kimutatás teljes növénybenAlapja valamely jól detektálható termék képződése, pl. zöld fluoreszkáló fehérje, luciferázPélda: luciferáz gén összekapcsolása stressz által bekapcsolható promóterrel(DREB1::luc; DREB1: drought-responsive element binding factor1, stressz indukálhatótranszkripciós faktor; luc: luciferáz, luciferinből lumineszkáló terméket képez), Arabidopsistranszformálásavad típus transzformáns vad típus transzformáns vad típus transzformáns12 h 0°C-on sötétben 5 h 300 mM NaCl 3 h 100 M ABS2012. szeptember 25.Kocsy Gábor