Download (8Mb) - REAL-d
Download (8Mb) - REAL-d Download (8Mb) - REAL-d
metodikája szerint. Amennyiben ez a mutáció nem igazolódott az FKRP gén teljes kódoló régióját szekvenáltuk a standard szekvenálási metodikával. 3.2.4. Immunszerológiai vizsgálatok Az egyes leukocyták arányát FACS módszerrel detektáltuk. Az antikoagulált vér leukocytáit monoclonalis egér anti-human CD4-, CD8-, CD3-, CD56, CD19-FITC antitestekkel festettük. A vörösvértestek lízisét követően a festődött leukocytákat paraformaldehyddel fixáltuk és FACS - Calibur flow cytométerrel analizáltuk. Az egyes fehérvérsejt típusok méretük és granulációjuk alapján különültek el egymástól. A különböző CD markerekkel rendelkező sejtek százalékos arányát 5000 lymphocyta értékelése alapján számítottuk. A serum IgG and autoantitestek szintjeinek meghatározása ELISA módszerrel történt. Az antinuklearis antitest (ANA) meghatározására HEp2 sejtvonal indirekt immunfluorescens assay-t használtunk. A complement factor 3 (C3) és 4 (C4) koncentrációk meghatározása nefelométerrel történt. 3.2.5. Génterápiás vizsgálatok Electroporációs (EP) vizsgálatok Beta galactosidaset (beta-gal, pCBLacZ), a teljes hosszúságú dystrophint (pCBMuDys) vagy utrophint (pCBVUtrFl) tartalmazó plazmid volt a vektorunk (3.1. Ábra), melyeket a hybrid cytomegalovirus (CMV) és β-actin promoter (CMV promoter) szabályozott. A plazmid pCBLacZ előállítása során pCMV β - nak a β-gal-t kódoló szekvenciáját távolítottuk el (Clonthech Laboratories, Paolo Alto CA, USA) Not1 emésztéssel. Ezt követően a DNS fragmentet XhoI linkerrel (New England, Biolabs) kapcsoltuk, majd a pCAGGS XhoI helyére illesztettük be. A pCAGGS egy olyan plazmid, amely CB promoterrel és SV40 poly(A) adenylációs szignállal rendelkezik. A plazmid pCBmuDYS a teljes hosszúságú rágcsáló dystrophin, a pCBVUtrFl a teljes utrophin cDNS-t tartalmazza. Mindkettőben a CB a promoter, amelyet a CMV enhancer szabályoz. Az utrophint tartalmazó plazmidban az aminoterminálishoz egy rövid nukleotid „FLAG tag” lánc kapcsolódik. A pCMVMicroDys microdystrophint tartalmaz, amelyből hiányzik a teljes rod domén, kivéve a 2 spectrin szerű repeatet és az első és utolsó „hinget”. A plazmidokat EndoFree plazmid maxi tisztító kittel (Qiagen 38
Inc, Mississagua, Canada) szabadítottuk meg az endotoxinoktól a gyártó instrukciói szerint. A végső plazmid koncentráció 1-3ug DNS/ul volt. 3.1. Ábra: Az elektroporációs kísérletek során alkalmazott plazmidok felépítése Rövidítések: AmpR : ampicillin-resistance gene for antibiotic selection in bacteria, ORI: ColE1 az amlifikációhoz a replikáció kezdete az E.Coli-ban. Signal polyA: a nyúl b-globin polyA signal, 5’- ITR: bal (5’) az adenovirus 5 typus invertált terminalis repeatje és packaging signalja, 3’-ITR: jobb (3’) az adenovirus 5 típus invertált terminalis repeatje, CB Promoter: hybrid CMV enhancer és b-actin promoter, HUMAN DYSTROPHIN: a human dystrophin teljes cDNS szekvenciája Kezelt állatok, plazmid injekciók és euthanasia: valamennyi állkísérletet a McGill Egyetem állatkíisérlet szabványait követve végeztük. Újszülött (4-6 napos) és felnőtt (6-8 hetes) normális (CD1 and C57BL/6), immunodeficiens (SCID) és mdx egereket használtunk a vizsgálatokhoz. Minden csoportban 4-8 állat volt. A m. tibialis anteriort (TA) vagy a gastrocnaemiust injektáltuk a fenti plazmidok egyikének 50 vagy 20 ul-vel (életkortól függően). Egy kohortban a plazmid injekctiót megelőzően 0,4 U/µl Hyaluronidaset (Sigma Aldrich) is injektáltunk. Egy további kohortban 100 µl PBS-ben hígított Evans Blue-t (10 mg/ml) fecskendeztünk intraperitonealisan mielőtt a plazmidot injektáltuk. Minden csoportból 4-6 állatot altattunk el 10, 30, 90, 180 és 360 nappal a kezeléseket követően. Electroporáció (EP): Az injektált izmokat transzkután EP-val kezeltük (felszíni elektród, 8 db négyszög impulzus, 175-1800 v/cm feszültség, 0, 2-20 msec közötti változó időtartam). 39
- Page 1 and 2: MTA DOKTORI ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉ
- Page 3 and 4: 4.1.2. Fenotípus variációk MERRF
- Page 5 and 6: 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK T
- Page 7 and 8: A mitochondrialis betegségek hátt
- Page 9 and 10: számos tanulmányban vizsgálták.
- Page 11 and 12: Légzési transzportlánc rendellen
- Page 13 and 14: neuronok degenerativ folyamataiban
- Page 15 and 16: 2.2. Az izomdystrophiák 2.2.1. Az
- Page 17 and 18: Az végtagöv típusú izomdystroph
- Page 19 and 20: Két autoszomalis domináns örökl
- Page 21 and 22: expressziós kazettát. A promotern
- Page 23 and 24: demyelinizációs típus. 2.) alacs
- Page 25 and 26: A Connexin 32 (GJB1) egy gap juncti
- Page 27 and 28: Roma neuropathiák Magyarországon
- Page 29 and 30: Perifériás neuropathia egyes gene
- Page 31 and 32: mérés előtt ív. adtuk be, dózi
- Page 33 and 34: Az ultravékony metszeteket uranyl
- Page 35 and 36: Linkage analízis A linkage analíz
- Page 37: mtDNS NZB heteroplasmia %-os arány
- Page 41 and 42: kontroll és mindkét m. biceps bra
- Page 43 and 44: Súlyos polyneuropathiája követke
- Page 45 and 46: 4.4. Ábra: a.) A n. suralis biopsz
- Page 47 and 48: látható, mely csak 40-es éveiben
- Page 49 and 50: Gén Nt. pozíció Nt. csere A.sav
- Page 51 and 52: volt. Szérum CK-ja enyhén emelked
- Page 53 and 54: neurológiai vizsgálata. Mindkét
- Page 55 and 56: Nem Életkor Klinikai tünetek Myop
- Page 57 and 58: A8332G nukleotid cserét is ki tudt
- Page 59 and 60: polymorphizmusként ismert (Rieder
- Page 61 and 62: A mitochondrialis betegségek nemcs
- Page 63 and 64: . a. b. c. 4.16. Ábra: a.) Az adPE
- Page 65 and 66: 4.1.6. Az mtDNS A3243G ésA8344G mu
- Page 67 and 68: ismeretlen etiológiájú stroke, p
- Page 69 and 70: Anyai Oocyta CV Polár test %NZB á
- Page 71 and 72: 4. 20. Ábra: A dystrophinopathiáh
- Page 73 and 74: annak lehetőségét, hogy a protei
- Page 75 and 76: 4. 25. Ábra: A siket dystrophinopa
- Page 77 and 78: 4.27. Ábra: Az izombiopszia elektr
- Page 79 and 80: 4.2.5. A dystrophinopathiák moleku
- Page 81 and 82: 4. A plazmid méretének hatása a
- Page 83 and 84: a b c 4.32. Ábra: Definity injekci
- Page 85 and 86: van. A mutáció valamennyi érinte
- Page 87 and 88: 1) homozygota R148X pontmutációt
Inc, Mississagua, Canada) szabadítottuk meg az endotoxinoktól a gyártó<br />
instrukciói szerint. A végső plazmid koncentráció 1-3ug DNS/ul volt.<br />
3.1. Ábra: Az elektroporációs kísérletek során alkalmazott plazmidok felépítése<br />
Rövidítések: AmpR : ampicillin-resistance gene for antibiotic selection in bacteria, ORI: ColE1 az<br />
amlifikációhoz a replikáció kezdete az E.Coli-ban. Signal polyA: a nyúl b-globin polyA signal, 5’-<br />
ITR: bal (5’) az adenovirus 5 typus invertált terminalis repeatje és packaging signalja, 3’-ITR:<br />
jobb (3’) az adenovirus 5 típus invertált terminalis repeatje, CB Promoter: hybrid CMV enhancer<br />
és b-actin promoter, HUMAN DYSTROPHIN: a human dystrophin teljes cDNS szekvenciája<br />
Kezelt állatok, plazmid injekciók és euthanasia: valamennyi állkísérletet a McGill<br />
Egyetem állatkíisérlet szabványait követve végeztük. Újszülött (4-6 napos) és<br />
felnőtt (6-8 hetes) normális (CD1 and C57BL/6), immunodeficiens (SCID) és<br />
mdx egereket használtunk a vizsgálatokhoz. Minden csoportban 4-8 állat volt. A<br />
m. tibialis anteriort (TA) vagy a gastrocnaemiust injektáltuk a fenti plazmidok<br />
egyikének 50 vagy 20 ul-vel (életkortól függően). Egy kohortban a plazmid<br />
injekctiót megelőzően 0,4 U/µl Hyaluronidaset (Sigma Aldrich) is injektáltunk.<br />
Egy további kohortban 100 µl PBS-ben hígított Evans Blue-t (10 mg/ml)<br />
fecskendeztünk intraperitonealisan mielőtt a plazmidot injektáltuk. Minden<br />
csoportból 4-6 állatot altattunk el 10, 30, 90, 180 és 360 nappal a kezeléseket<br />
követően.<br />
Electroporáció (EP): Az injektált izmokat transzkután EP-val kezeltük (felszíni<br />
elektród, 8 db négyszög impulzus, 175-1800 v/cm feszültség, 0, 2-20 msec közötti<br />
változó időtartam).<br />
39
Change language