A fehérjekutatás modern módszertana
A fehérjekutatás modern módszertana
A fehérjekutatás modern módszertana
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
A fehérjekutatás<br />
<strong>modern</strong> módszertana
A fehérjekutatás<br />
<strong>modern</strong> módszertana<br />
Szerkesztette: Ludány Andrea<br />
Medicina Könyvkiadó Zrt ● Budapest, 2011<br />
© Dr. Ludány Andrea, 2011<br />
© Szerzők, 2011
A kiadvány a következő program keretében jelent meg:<br />
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0054<br />
© Prof. Dr. Ludány Andrea, 2011<br />
Prof. Dr. Berki Tímea<br />
Prof. Dr. Kellermayer Miklós<br />
Prof. Dr. Kilár Ferenc<br />
Dr. Kiss István<br />
Prof. Dr. Komoly Sámuel<br />
Prof. Dr. Kovács L. Gábor<br />
Dr. Kőszegi Tamás<br />
Dr. Liszt Ferenc<br />
Szerzők:<br />
Prof. Dr. Ludány Andrea<br />
Dr. Magyarlaki Tamás †<br />
Dr. Márk László<br />
Dr. Mezősi Emese<br />
Dr. Nagy Tamás<br />
Dr. Tőkés-Füzesi Margit<br />
Vassné Lakatos Ágnes<br />
Prof. Dr. Wittmann István<br />
Lektorálta:<br />
Dr. Janáky Tamás egyetemi docens<br />
Szegedi Egyetem, Orvosi Kémia Intézet<br />
Dr. Szabó Antal egyetemi tanár<br />
SE I.sz.Gyermekklinika<br />
Medicina<br />
A kiadásért felel a Medicina Könyvkiadó Zrt. igazgatója<br />
Felelős szerkesztő: Benjámin Katalin<br />
Műszaki szerkesztő: Dóczi Imre<br />
Az ábrákat rajzolta: Olgyai Géza<br />
Ábrák száma: 221<br />
Azonossági szám: 3591<br />
Terjedelem: 49,5 (A/5) ív
A könyv szerzői<br />
Prof. Dr. Berki Tímea<br />
PhD, Med. Habil.<br />
egyetemi tanár<br />
PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai<br />
Intézet<br />
Prof. Dr. Kellermayer Miklós<br />
DSc<br />
egyetemi tanár<br />
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Prof. Dr. Kilár Ferenc<br />
DSc<br />
egyetemi tanár<br />
PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet<br />
Dr. Kiss István<br />
PhD<br />
egyetemi docens<br />
PTE ÁOK Népegészségtani Intézet<br />
Prof. Dr. Komoly Sámuel<br />
DSc<br />
egyetemi tanár<br />
PTE KK Neurológiai Klinika<br />
Prof. Dr. Kovács L. Gábor<br />
MTA levelező tag<br />
egyetemi tanár<br />
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Dr. Kőszegi Tamás<br />
PhD, Med. Habil.<br />
egyetemi docens<br />
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Dr. Liszt Ferenc<br />
PhD<br />
egyetemi docens<br />
PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Prof. Dr. Ludány Andrea<br />
PhD, Med. Habil.<br />
egyetemi tanár<br />
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Dr. Magyarlaki Tamás †<br />
PhD, Med. Habil.<br />
egyetemi docens<br />
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Dr. Márk László<br />
PhD, Dr. Habil.<br />
egyetemi docens<br />
PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai<br />
Intézet<br />
Dr. Mezősi Emese<br />
PhD, Med. Habil.<br />
egyetemi docens<br />
I. sz. Belgyógyászati Klinika<br />
Dr. Nagy Tamás<br />
PhD<br />
egyetemi adjunktus<br />
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Dr. Tőkés-Füzesi Margit<br />
egyetemi tanársegéd<br />
PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Vassné Lakatos Ágnes<br />
PhD<br />
egyetemi docens<br />
PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet<br />
Prof. Dr. Wittmann István<br />
PhD Med. Habil.<br />
egyetemi tanár<br />
PTE KK II.sz. Belgyógyászati Klinika<br />
és Nephrológiai Centrum
Előszó<br />
A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszerei,<br />
proteomika a klinikai kutatásban<br />
A többszerzős szerkesztett tankönyvet a Medicina<br />
Könyvkiadó adja ki elektronikus formában.<br />
2012 első negyedévétől lesz elérhető a www.tankonyvtar.hu<br />
honlapon. A szerzők valamennyien<br />
a Pécsi Tudományegyetem ismert és elismert<br />
oktatói, akik az adott területeken sikeres klinikai<br />
laboratóriumi kutatómunkát végeznek.<br />
A könyv a klinikai laboratóriumi kutatásban<br />
központi szerepet játszó fehérjevizsgálatok jelenleg<br />
használatos módszertanát tárja a hallgatók<br />
elé. Anyaga feltételez alapvető és megfelelő<br />
biokémiai/biológiai előképzettséget.<br />
A könyv 1–10. fejezete a fehérjevizsgálatok<br />
módszertanát elsősorban elméleti megközelítésben<br />
ismerteti gazdag ábraanyaggal. Fejezetről<br />
fejezetre kitér a vizsgálati minták előkészítésére,<br />
az alapvető elválasztási eljárásokra, funkcionális<br />
aspektusokra, műszeres adaptációkra, a fehérjék<br />
azonosítási lehetőségeire, valamint a mérési adatok<br />
értékelésére.<br />
Az utolsó, 11. fejezet 19 alfejezetben a korábban<br />
bemutatott módszertanok közvetlen klinikai<br />
laboratóriumi alkalmazására és diagnosztikus/<br />
terápiás hasznosulására nyújt példákat. Ezzel<br />
különböző kutatási irányokra tereli az olvasó<br />
figyelmét a klinikai patológia területén. Így pl.<br />
a véralvadástól a tumormarkerekig sor kerülhet<br />
különböző fehérje vizsgálatokra a legújabb eljárások<br />
szerint.<br />
A tankönyv anyaga – a szerzők véleménye<br />
szerint – minden bizonnyal nem csak a klinikai<br />
laboratóriumi kutatók mesterképzéséhez, hanem<br />
a terület iránt érdeklődő szakemberek számára is<br />
hasznos lehet.<br />
Pécs, 2011. november<br />
Ludány Andrea<br />
szerkesztő
Tartalom<br />
Rövidítések . .................................................................. 17<br />
1. Bevezetés (Kovács L. Gábor) . .................................................. 27<br />
A fehérje mint az élet princípiuma . .............................................. 27<br />
A fehérjék szerkezete, kémiai tulajdonságai ....................................... 27<br />
Fehérjék az élő sejtben . ....................................................... 28<br />
A fehérjék kölcsönhatásai ..................................................... 32<br />
Fehérjék mint enzimek (katalízis) ............................................... 33<br />
Fehérjék szerepe a struktúraalkotásban ........................................... 34<br />
Fehérjék szerepe a transzportfolyamatokban . ...................................... 35<br />
Sejtek és fehérjék ............................................................ 35<br />
A sejtek anabolizmusa és katabolizmusa .......................................... 35<br />
Az emberi szervezet és a fehérjék ............................................... 36<br />
A fehérjekutatás forradalma: a proteomika ........................................ 37<br />
Összefoglalás ............................................................... 37<br />
2. A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei - a minták előkészítése .......... 39<br />
Különféle minták előkészítése (Ludány Andrea) . ...................................... 39<br />
Sejtes minták előkészítése ..................................................... 40<br />
A sejtek feltárása .......................................................... 40<br />
Interferáló anyagok inaktiválása vagy eltávolítása ................................ 40<br />
A fehérjék szolubilizálása (oldatba vitele) ...................................... 41<br />
A minták tárolása . ......................................................... 42<br />
A minták előfrakcionálása az analízisekhez ....................................... 42<br />
Eljárások (protokollok) ....................................................... 45<br />
Sejt- és szöveti minták extrakciója és szolubilizációja ............................. 45<br />
Az interferáló vegyületek eltávolítása a mintákból . ............................... 47<br />
A minták előfrakcionálása . .................................................. 48<br />
Fehérjemeghatározások . .................................................... 48<br />
Irodalom .............................................................. 50<br />
Sejtes minták vizsgálómódszerei (Kőszegi Tamás) ..................................... 51<br />
Intracelluláris fehérjék kimutatása . .............................................. 51<br />
Módszertani megközelítések ................................................... 52<br />
Egyedi fehérjék kimutatása morfológiai módszerekkel ............................ 52<br />
Egyedi fehérjék kimutatása egyéb módszerekkel ................................. 53<br />
Irodalom .............................................................. 54
8 Tartalom<br />
3. Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei (Kilár Ferenc) ...................... 57<br />
Fehérjék extrakciója . ......................................................... 57<br />
Fehérjék kromatográfiája ...................................................... 57<br />
Fehérjék frakcionálása ultracentrifugával ......................................... 58<br />
Fehérjék vizsgálata elektroforézissel ............................................. 59<br />
Fehérjék kapilláris-elektroforetikus elemzése. Chip-elektroforézis ................... 59<br />
Fehérjék azonosítása és meghatározása a proteomikában ............................. 65<br />
Fehérjék bioinformatikája ..................................................... 66<br />
Irodalom .............................................................. 70<br />
4. Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban -<br />
Fehérjeelválasztási és fehérjedetektálási technikák ............................... 71<br />
(Ludány Andrea, Kőszegi Tamás)<br />
Elektroforézis mint elválasztási technika . ......................................... 71<br />
A klinikai kutatásban használatos módszerek áttekintő ismertetése ................... 71<br />
Gélelektroforetikus technikák - PAGE ...................................... 71<br />
Preparatív és analitikai PAGE-eljárások ..................................... 72<br />
Homogén és gradiens gélek ............................................... 72<br />
Natív és denaturáló PAGE-rendszerek . ...................................... 73<br />
Izoelektromos fokuszálások poliakrilamid- (PAG) és agarózgélben ................ 73<br />
Kétdimenziós elválasztások kombinációi .................................... 74<br />
Fehérjedetektálási technikák a klinikai kutatómunkában ........................... 74<br />
Izotópos jelölés . ........................................................ 75<br />
Festékkötéses jelölés .................................................... 75<br />
Ezüstözés ............................................................. 75<br />
Fluoreszcens festés . ..................................................... 75<br />
Immunreakción alapuló jelölés ............................................ 75<br />
Protokollok - A klinikai kutatásban általunk adaptált és alkalmazott elválasztási<br />
és fehérjejelölési eljárások .................................................. 76<br />
Elválasztási technikák ........................................................ 76<br />
Nem denaturáló és denaturáló PAGE gélrudakban és lapgéleken .................... 76<br />
Nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis (Ornstein és Davis szerint) ............. 76<br />
Denaturáló SDS-gélelektroforézis (Laemmli szerint) . ............................. 77<br />
Kétdimenziós PAGE denaturáló rendszerben .................................... 79<br />
Izoelektromos fokuszálás gélcsövekben ..................................... 80<br />
Második dimenzió; SDS-elektroforézis homogén vagy exponenciális gradiens<br />
poliakrilamidgélben . ................................................... 81<br />
Izoelektromos fokuszálás lapgélen - denaturáló rendszerben (az O’Farrell-technika<br />
első dimenziójának megfelelő rendszer) ..................................... 84<br />
Detektálási technikák . ........................................................ 84<br />
Gélelőkészítés autoradiográfiához . ............................................ 84<br />
Fluorográfiás detektálás (Bonner és Laskey szerint) ............................ 84<br />
Ezüstözési eljárások ....................................................... 85<br />
Fehérjék direkt ezüstözése egydimenziós SDS lapgélen (Giulian, G. G.) . ........... 85
Tartalom<br />
9<br />
Kombinált (gyors) ezüstözési eljárás leszárított festetlen, ill. festett „nedves”<br />
géllemezeken (Willoughby és Lambert) .................................... 85<br />
Ezüstözéses fehérjedetektálás ultravékony PAGE-lemezeken (Sammons) ........... 86<br />
A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása (Marshall szerint) ................... 87<br />
Fehérjék detektálása Marshall szerint, módosított ultraszenzitív<br />
ezüstözési eljárással . ................................................... 87<br />
MS-kompatibilis fehérjedetektálások poliakrilamidgélen .......................... 89<br />
MS-analízishez ajánlott CBB-festés (Wang) .................................. 89<br />
MS-kompatibilis ezüstfestés gélben (Gromova) ............................... 89<br />
Immunoblotting technikák fehérjék azonosítására ................................ 90<br />
Mini-Trans-Blot készülék használata („nedves” eljárás) ......................... 90<br />
Immunoblotting technika a fehérjék azonosítására (semi-dry blotting) . ............. 93<br />
Az immunreakció „előhívása” ............................................. 94<br />
Poliakrilamidgél-lemez szárítása zselatinnal (Popescu szerint) ...................... 98<br />
Irodalom .............................................................. 98<br />
5. Fehérjék vizsgálata biológiai funkcióik alapján (Kellermayer Miklós) . ............... 101<br />
Immunglobulinok, antitestek és a komplementrendszer ............................. 104<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 104<br />
Az immunglobulonok, az antitestek és a komplementek szerkezete,<br />
molekuláris sajátosságai . ................................................ 105<br />
Az immunglobulinok, az antitestek és a komplementrendszer funkciói . .............. 106<br />
Az immunglobulinok és az antitestek vizsgálata ................................ 107<br />
Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék, intracelluláris vázfehérjék (citoszkeleton) .......... 109<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 109<br />
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék szerkezete,<br />
molekuláris sajátosságai . ................................................ 110<br />
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék funkciói . .......... 112<br />
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék funkcióira<br />
irányuló vizsgálatok .................................................... 112<br />
Enzimek, biokatalizátorok .................................................... 112<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 113<br />
Az enzimek, biokatalizátorok molekuláris sajátosságai ........................... 113<br />
Az enzimek funkciói ...................................................... 114<br />
Az enzimek, biokatalizátorok funcióira irányuló vizsgálatok . ...................... 114<br />
Hormonok ................................................................ 115<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 115<br />
A hormonok molekuláris sajátosságai . ........................................ 115<br />
A hormonok funkciói ..................................................... 116<br />
A hormonok vizsgálata funkcióik alapján . ..................................... 116<br />
A sejtnövekedést befolyásoló fehérjék, peptidek, a sejtnövekedési faktorok,<br />
a biológiai válaszmódosítók („biological response modifiers”) ..................... 116<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 116<br />
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai válaszmódosítók” molekuláris sajátosságai . .... 116<br />
A sejtnövekedési faktorok, a “biológiai válaszmódosítók” funkciói ................. 117
10 Tartalom<br />
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai válaszmódosítók” vizsgálata funkcióik<br />
alapján .............................................................. 117<br />
Extracelluláris szerkezeti elemek . .............................................. 117<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 118<br />
Az extracelluláris, főként szerkezeti elemként funkcionáló fehérjék molekuláris<br />
sajátosságai . .......................................................... 118<br />
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék funkciói .................................. 119<br />
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék vizsgálata ................................ 119<br />
Raktárak .................................................................. 120<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 120<br />
A raktárfehérjék molekuláris sajátosságai . ..................................... 120<br />
A raktárfehérjék funkciói .................................................. 120<br />
A fehérjeraktárak funkcióira irányuló vizsgálatok ............................... 121<br />
Transzportőrök (szállítófehérjék) . .............................................. 121<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 122<br />
A transzportőrök, a szállítófehérjék molekuláris sajátosságai ...................... 122<br />
A transzporterek, a szállítófehérjék funkciói . ................................... 122<br />
A transzportfehérjék azonosítása funkcióik alapján .............................. 122<br />
Ligandumok ............................................................... 122<br />
Esszenciális táplálékok ...................................................... 123<br />
Irodalom ............................................................. 123<br />
6. Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában - Specifikus fehérjekimutatások<br />
oldatban és szilárd fázisú rendszerekben (Berki Tímea) ........................... 125<br />
Immunológiai alapok ........................................................ 126<br />
Immunológiai fogalmak ................................................... 126<br />
Antitest-előállítási módszerek . .............................................. 132<br />
Ellenanyagok, antigének jelölése ............................................ 136<br />
Konjugálási módszerek .................................................... 139<br />
Immunológiai alapú laboratóriumi módszerek csoportosítása ........................ 139<br />
Antigén-antitest reakciókon alapuló módszerek ................................. 139<br />
Precipitáción alapuló eljárások . ........................................... 140<br />
Agglutináción alapuló módszerek ......................................... 141<br />
Immunoassay . ........................................................... 142<br />
Immunoassay-típusok csoportosítása . ...................................... 142<br />
Módszerek ........................................................... 145<br />
Az immunoassay-t befolyásoló faktorok .................................... 156<br />
Az immunoassay-k fejlesztési irányai ...................................... 158<br />
Irodalom ............................................................. 159<br />
7. Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban ...... 161<br />
Automatizáció a fehérjeanalitikában (Kőszegi Tamás) ................................ 161<br />
Általános szempontok ....................................................... 161<br />
Immunprecipitáción alapuló módszerek ......................................... 161
Tartalom<br />
11<br />
Immunturbidimetriás módszerek ............................................... 162<br />
A turbidimetriás jel mérése ................................................. 163<br />
Egyéb megfontolások ..................................................... 163<br />
Nefelometria .............................................................. 164<br />
Immunkémiai analitikai technikák (immunoassay-k) ............................... 164<br />
Történeti áttekintés ....................................................... 164<br />
Az immunoassay-kben leggyakrabban alkalmazott jelölések . ...................... 165<br />
A mért jel detektálásának módjai ............................................ 167<br />
Immunoassay-k típusai a közeg kialakítása szerint . .............................. 168<br />
Immunoassay-k típusai a reakcióelv szerint .................................... 169<br />
Néhány példa a heterogén eljárások technikai megoldásaira ....................... 169<br />
Példa homogén eljárás technikai megoldására .................................. 170<br />
Az immunoassay-k kalibrációjának módjai .................................... 171<br />
Analitikai interferenciák ..................................................... 172<br />
Interferenciák kiküszöbölésének lehetőségei ................................... 173<br />
Különböző immunkémiai módszerek érzékenységének összehasonlítása ............... 174<br />
Irodalom ............................................................. 174<br />
Műszeres analitikai lehetőségek - Tömegspektrometria (Márk László) . ................... 175<br />
A tömegspektrométer elvi felépítése ............................................ 175<br />
A vákuumrendszer . ....................................................... 175<br />
Mintabevitel ............................................................ 176<br />
Ionforrások ............................................................. 176<br />
Analizátor .............................................................. 179<br />
Detektor . ............................................................... 181<br />
Fragmentálás és tandem tömegspektrometria ..................................... 182<br />
A tömegspektrum . .......................................................... 183<br />
A tömegspektrometria főbb alkalmazási területei .................................. 184<br />
Irodalom ............................................................. 185<br />
8. A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai -<br />
Dimenziók, vonatkoztatások (Liszt Ferenc) ..................................... 187<br />
Mértékegységrendszerek ..................................................... 187<br />
Az analitikai referenciarendszer és elemei ....................................... 188<br />
A fehérjemeghatározások standardizálása ........................................ 190<br />
Normálérték és referenciaérték ................................................ 193<br />
Irodalom ............................................................. 194<br />
9. A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége (Lakatos Ágnes) ......... 197<br />
Irodalom ............................................................. 201
12 Tartalom<br />
10. Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban (Nagy Tamás) . .................. 203<br />
Előzmények ............................................................... 203<br />
Sejttenyésztés . ............................................................. 203<br />
Sejttípusok . ............................................................. 203<br />
Tenyésztőedények, flaskák ................................................. 206<br />
Inkubátor ............................................................... 206<br />
Médiumok .............................................................. 207<br />
A tenyészetek kezelése .................................................... 209<br />
A tenyészet kontaminációja . ................................................ 211<br />
Fagyasztás, fagyasztásból való felolvasztás .................................... 212<br />
A tenyészet sejtjeinek osztódása, sejtszámváltozások . ............................ 213<br />
Detektálás - A sejtkultúra állapotának ellenőrzése, az állapot változtatása ............ 215<br />
Állatkísérleti modellek . ...................................................... 216<br />
Irodalom ............................................................. 219<br />
11. A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában -<br />
Az új módszertanok klinikai hasznosulása az orvosi kutatólaboratóriumban ........ 221<br />
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai (Tőkés-Füzesi Margit) .................... 221<br />
A plazmafehérjék általános áttekintése .......................................... 221<br />
Plazmafehérje-csoportok és vizsgálatuk ......................................... 222<br />
Összfehérje ............................................................. 222<br />
Albumin . ............................................................... 222<br />
A plazmafehérjék elektroforézise ............................................ 222<br />
A különböző frakciókban vándorló jelentősebb fehérjék rendellenességei<br />
betegségekben ........................................................ 224<br />
Az albuminfrakcióban található fehérje ..................................... 224<br />
Az α 1<br />
-frakcióban található fehérjék ........................................ 224<br />
Az α 2<br />
-frakcióban található fehérjék ........................................ 225<br />
A β-frakcióban található fehérjék . ......................................... 225<br />
A γ-frakcióban található fehérjék - Az immunglobulinok . ...................... 226<br />
Irodalom ............................................................. 233<br />
Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása ..................... 234<br />
(Kőszegi Tamás)<br />
A kis molekulatömegű fehérjék jellemzői ........................................ 234<br />
A kis molekulatömegű fehérjék kimutatási lehetőségei . ............................. 235<br />
Módszertani megközelítés . ................................................. 235<br />
Előzetes frakcionálást, dúsítást alkalmazó módszerek ............................ 236<br />
Ultraszűrés ........................................................... 236<br />
Méretkizárásos kromatográfia (gélszűrés) ................................... 236<br />
Acetonitriles (ACN) kicsapás . ............................................ 236<br />
Perklórsavas (PCA) módszer ............................................... 236<br />
Perklórsavas (PCA) kicsapás ............................................. 236<br />
Mennyiségi mérések . ................................................... 237<br />
Perklórsavas (PCA) kicsapás kombinálása Western blot módszerrel .............. 237
Tartalom<br />
13<br />
Egyedi fehérjék kimutatása immunanalitikai módszerrel (immunoassay) ............. 238<br />
Intracelluláris polipeptid kimutatása szövettenyészeti sejtekből .................... 239<br />
Irodalom ............................................................. 239<br />
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria - Bevezetés a flow citometriába ............. 240<br />
(Magyarlaki Tamás)<br />
Definíciók és célkitűzések .................................................... 240<br />
Műszeres áttekintés ......................................................... 240<br />
Az egyes sejtek lézeres vizsgálata .............................................. 241<br />
Multiparaméteres (többparaméteres) analízis perifériás vérsejteken (PBC) .............. 242<br />
Fluoreszcencia ............................................................. 243<br />
Irodalom ............................................................. 250<br />
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei (Berki Tímea) .......................... 251<br />
Az autoimmun betegségek jellemzői . ........................................... 251<br />
Az autoimmun betegségek típusai . ........................................... 252<br />
Az autoimmun betegségek diagnózisának kérdései .............................. 253<br />
Az autoantitest-meghatározás módszertana . ...................................... 254<br />
Antinukleáris autoantitestek a szisztémás kötőszöveti betegségek elkülönítésében . ..... 254<br />
Indirekt immunfluoreszcencia ............................................ 254<br />
ANA ELISA-szűrőteszt (screen) .......................................... 255<br />
ANA-immunoblot ..................................................... 256<br />
Multiplex autoantitest-meghatározási módszerek ............................. 257<br />
A laboratóriumi gyakorlatban mért autoantitestek . ................................. 259<br />
Az autoimmun betegségekben elsősorban meghatározott autoantitestek .............. 259<br />
A gyakorlatban vizsgált egyéb autoantitestek ................................... 260<br />
Szervspecifikus autoantitestek . .............................................. 262<br />
Irodalom ............................................................. 265<br />
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata (Berki Tímea) ................... 266<br />
Morfológiai módszerek ...................................................... 266<br />
Áramlási citometria ......................................................... 266<br />
Mikroszkópos módszerek .................................................... 270<br />
Citokinek kimutatása ........................................................ 273<br />
Az ELISPOT-módszer . .................................................... 277<br />
Irodalom ............................................................. 278<br />
A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana (Tőkés-Füzesi Margit) ............. 279<br />
A véralvadás folyamata ...................................................... 279<br />
Véralvadási tesztek ......................................................... 282<br />
Irodalom ............................................................. 286<br />
A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája (Tőkés-Füzesi Margit) ................ 287<br />
D-dimer-meghatározás . ...................................................... 287<br />
Thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája . .................................... 288<br />
Antitrombin- (AT-) defektusok .............................................. 290<br />
Protein C (PC-) defektusok ................................................. 290<br />
Protein S (PS-) defektusok ................................................. 291
14 Tartalom<br />
Aktivált Protein C (APC-) rezisztencia . ....................................... 291<br />
Protrombin 20210A polimorfizmus . .......................................... 292<br />
Antifoszfolipid-antitestek, lupus-antikoaguláns kimutatása ........................ 292<br />
Irodalom ............................................................. 293<br />
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése ............................ 294<br />
A könny vizsgálata (Ludány Andrea) . ........................................... 294<br />
A könny fiziológiai szerepe és összetétele ..................................... 294<br />
A könny fehérjéi ......................................................... 294<br />
A könnyfehérjék vizsgálata – klinikai diagnosztikai lehetőségek . ................... 296<br />
Szemészeti vonatkozások – a száraz szem szindróma .......................... 296<br />
A könnyfehérjék vizsgálata szisztémás betegségekben ......................... 297<br />
Ajánlott módszertani megközelítések a könny vizsgálatakor ....................... 298<br />
Irodalom ............................................................. 300<br />
A nyál fehérjéinek vizsgálata (Kőszegi Tamás) .................................... 301<br />
A nyál biológiai funkciói . .................................................. 301<br />
A nyál fehérje-összetétele .................................................. 301<br />
A nyálfehérjék vizsgálati módszerei .......................................... 302<br />
Funkcionális vizsgálatok . .................................................. 303<br />
Irodalom ............................................................. 304<br />
Vizeletvizsgálatok ............................................................. 305<br />
Vizeletvizsgálatok a proteinürítés tükrében (Ludány Andrea) . ........................ 305<br />
Klinikai laboratóriumi analitikai módszerek . ................................... 305<br />
Az emberi vizelet fehérjéi ............................................... 305<br />
A fehérjék mennyiségi mérése ............................................ 305<br />
A vizeletfehérjék megoszlási képének vizsgálata ............................. 306<br />
Vizeletfehérjék klinikai biokémiája és információs értékei ........................ 308<br />
Irodalom ............................................................. 310<br />
A proteinuria klinikai szempontjai (Wittmann István) . .............................. 311<br />
Fogalmak, definíciók . ..................................................... 311<br />
A proteinuria, microalbuminuria kialakulása ................................... 311<br />
A proteinuria, microalbuminuria előfordulása és jelentősége . ...................... 312<br />
Az albuminuria meghatározása .............................................. 312<br />
Meghatározás méretkizárásos kromatográfiával .............................. 312<br />
A proteinuria, microalbuminuria meghatározását befolyásoló tényezők . ........... 312<br />
Irodalom ............................................................. 313<br />
Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) -<br />
A POCT diagnosztikus értékei, a vizsgálatok hitelességének ellenőrzése (Liszt Ferenc) . ...... 314<br />
A betegellátás klinikai eredményességét javító POCT-gyakorlat lehetőségei<br />
a sürgősségi és intenzív terápiás ellátásban . .................................... 314<br />
A POCT-gyakorlat kialakításának szakmai kérdései ................................ 316<br />
A POCT-gyakorlat minőségbiztosítása .......................................... 318<br />
A POCT-diagnosztika hibaforrásai ........................................... 318<br />
Rizikó-management a POCT területén . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318<br />
A POCT-gyakorlat minőségirányítási rendszere ................................. 318<br />
Irodalom ............................................................. 319
Tartalom<br />
15<br />
Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban (Kőszegi Tamás) .............. 321<br />
A tumormarkerek jellemzői ................................................... 321<br />
A tumormarker definíciója ................................................. 321<br />
Általános szempontok ....................................................... 321<br />
Peptid-fehérje tumormarkerek ................................................. 322<br />
A fehérje természetű tumormarkerek extracelluláris térbe kerülésének<br />
mechanizmusa ........................................................ 322<br />
Tumormarkerek használata az orvosi gyakorlatban . ................................ 325<br />
Irodalom ............................................................. 327<br />
Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban<br />
(Ludány Andrea, Kőszegi Tamás) ................................................. 328<br />
Az akut myocardialis infarctus diagnózisa ....................................... 328<br />
Az akut coronaria-szindróma jelenlegi cardialis markerei ........................... 328<br />
A cardialis markerek szerepe az akut coronaria-szindróma terápiás döntéseiben .......... 332<br />
Laboratóriumi medicina és a troponinok ......................................... 332<br />
Cardialis markerek krónikus vesebetegségben és nem ischaemiás szívbetegségben ....... 333<br />
Sürgősségi cardialis markerek ................................................. 334<br />
Irodalom ............................................................. 336<br />
A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai (Komoly Sámuel) ............................. 337<br />
Irodalom ............................................................. 340<br />
A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban . ........... 341<br />
(Mezősi Emese, Kőszegi Tamás)<br />
A neuroendokrin rendszer és hormonjai ......................................... 341<br />
A neuroendokrin rendszer betegségei, a hormontermelés változásai ................... 342<br />
A fehérje- és peptidhormonok meghatározásának klinikai jelentősége és nehézségei ...... 344<br />
A peptidhormonok kutatásának eredményei .................................... 345<br />
Irodalom ............................................................. 346<br />
A csontanyagcsere fehérjemarkerei (Kőszegi Tamás) . ................................. 347<br />
A csontrendszer ............................................................ 347<br />
A csontanyagcsere .......................................................... 348<br />
Osteoblastok által termelt faktorok ........................................... 348<br />
Osteoclastok által termelt faktorok ........................................... 349<br />
A csontanyagcsere endokrin szabályozása ..................................... 349<br />
A leggyakoribb csontanyagcsere-betegségek ..................................... 350<br />
Irodalom ............................................................. 351<br />
A metabolikus szindróma és a fehérjék (Wittmann István) .............................. 353<br />
A metabolikus szindróma definíciói . ............................................ 353<br />
A metabolikus szindróma előfordulása .......................................... 354<br />
A metabolikus szindróma patogenezise . ......................................... 354<br />
Az inzulin szerepe ........................................................ 354<br />
Fehérjék az inzulin kivételével .............................................. 355<br />
Obesitasban a zsírsejtek által termelt proteinek ............................... 355<br />
Egyéb hormonok ...................................................... 357
16 Tartalom<br />
Az inzulin intracelluláris jelátvitelében szerepet játszó proteinek és működésük<br />
károsodása metabolikus szindrómában ........................................ 357<br />
Irodalom ............................................................. 359<br />
A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában ............. 361<br />
(Márk László)<br />
Irodalom ............................................................. 363<br />
A daganatok epidemiológiai biomarkerei (Kiss István) ................................ 364<br />
Irodalom ............................................................. 368<br />
Tárgymutató ................................................................ 369
Rövidítések<br />
A<br />
A2M α 2<br />
-makroglobulin<br />
AAT α 1<br />
-antitripszin<br />
ABC avidin-biotin-peroxidáz komplex<br />
ACC Amerikai Kardiológiai Kollégium<br />
ACN acetonitril<br />
ACR albumin-kreatinin hányados;<br />
albumin-creatinin ratio<br />
ACS akut coronaria szindróma<br />
ACT α 1<br />
-antikimotripszin<br />
ACTH adrenokortikotrop hormon;<br />
corticotropin; adrenocorticotropic hormone<br />
ADH antidiuretikus hormon<br />
ADP adenozin-difoszfát<br />
AF antinukleáris faktor<br />
AFP α-fötoprotein<br />
AGP savanyú glikoprotein<br />
AIDS szerzett immunhiányos szindróma;<br />
acquired immunodeficiency syndrome<br />
AIH autoimmun hepatitis<br />
α 1<br />
-AT α 1<br />
-antitripszin<br />
AMI akut myocardialis infarctus<br />
AMPK adenozin-monofoszfát-kináz<br />
AMPPD dinátrium 3-(4-metilspiro-[1,2-dioxetán-3,2′-triciklo-[3.3.1.1]dekán]-4-il) fenilfoszfát<br />
ANA antinukleáris antitest<br />
ANCA antineutrofil citoplazma elleni antitest<br />
ANNA-1 antineuronalis nukleáris antigén 1<br />
ANP A típusú natriuretikus peptid; atrialis natriuretikus peptid<br />
AP alkalikus foszfatáz<br />
APC antigénprezentáló sejt<br />
APCI légköri nyomású kémiai ionizáció; atmospheric pressure chemical ionization<br />
APCI, APPI fotoionizáció<br />
APS antifoszfolipid-szindróma<br />
APTI aktivált parciális tromboplasztin idő<br />
ARF ADP-ribozilációs faktor<br />
ARIS Apoenzim Reaktivációs Immunoassay<br />
ATCC American Type Culture Collection<br />
ATP adenozin-trifoszfát; adenosine triphosphate
18 Rövidítések<br />
B<br />
BAP<br />
BDGF<br />
BIPM<br />
B 2<br />
M<br />
BMI<br />
BMP<br />
BNP<br />
BPI<br />
BSA<br />
csontspecifikus alkalikus foszfatáz<br />
csont eredetű növekedési faktor<br />
Bureau International des Poids et Mesures<br />
β 2<br />
-mikroglobulin<br />
testtömeg-index; body mass index<br />
bone morphogenetic protein<br />
B típusú natriuretikus peptid; brain natriuretic peptide; agyi natriuretikus peptid<br />
bactericidal/permeability increasing protein<br />
marha-szérumalbumin; bovin serum albumin<br />
C<br />
CAH krónikus aktív hepatitis<br />
CBB Coomassie Brilliant Blue<br />
CCD charge-coupled device<br />
CCP ciklikus citrullinált peptid, filaggrin<br />
CD<br />
cluster of differentiation<br />
CDR komplementaritást detektáló régió<br />
CE<br />
kapilláris-elektroforézis; capillary electrophoresis<br />
CEA carcinoembryonalis antigén<br />
CEDIA Cloned Enzyme Donor Immunoassay<br />
CER cöruloplazmin<br />
CHCA, HCCA α-ciano-4-hidroxifahéjsav; α-cyano-4-hydroxycinnamic acid<br />
CI<br />
kémiai ionizáció; chemical ionization<br />
CID collision induced dissociation<br />
CIDP krónikus inflammatiós demyelinisatiós neuropathia<br />
CIEEL kémiailag indukált elektroncserélő lumineszcencia<br />
CK<br />
kreatin-kináz<br />
CK-BB kreatin-kináz BB izoenzim (agy; brain)<br />
CK-MB kreatin-kináz MB izoenzim (szív)<br />
CK-MM kreatin-kináz MM izoenzim (izom; muscle)<br />
CLIA Chemiluminescent Immunoassay<br />
CMC kritikus micelláris koncentráció<br />
CMIA kemilumineszcens mágneses immunoassay<br />
CMV citomegalovírus<br />
CNP C típusú natriuretikus peptid<br />
CP<br />
cöruloplazmin<br />
CRAB calcium, renal, anaemia, bone<br />
CREST calcinosis, Raynaud-jelenség, oesophagusmotilitás zavara, sclerodactylia,<br />
teleangiectasia<br />
CRMP5 Collapsin Response Mediator Protein<br />
CRP C-reaktív protein<br />
CT<br />
számítógépes rétegvizsgálat; komputer-tomográfia; computer tomography<br />
CV<br />
variációs koefficiens
Rövidítések<br />
19<br />
D<br />
DAB<br />
DCCT<br />
DELFIA<br />
DHB<br />
DM<br />
DMSO<br />
DNS<br />
DPD<br />
DPP-4<br />
dsDNS<br />
DTE<br />
DTT<br />
diaminobenzidin<br />
Diabetes Control and Complications Trial<br />
késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay<br />
2,5-dihidroxi-benzoesav; 2,5-dihydroxybenzoic acid<br />
diabetes mellitus<br />
dimetil-szulfoxid<br />
dezoxiribonukleinsav; deoxyribonucleotic acid; DNA<br />
dezoxi-piridinolin<br />
dipeptidil-peptidáz-4<br />
kétszálas DNS; double stranded DNA<br />
ditioeritritrol<br />
ditiotreitol<br />
E<br />
EBV Epstein-Barr-vírus<br />
ECL enhanced chemiluminescence<br />
ECLIA elektrokemilumineszcenciás immunoassay<br />
EDE párolgáson alapuló száraz szem; evaporative dry eye<br />
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav; ethilenediaminetetraacetic acid<br />
EGF epidermalis növekedési faktor; epidermal growth factor<br />
EGTA etilénglikol-tetraacetát<br />
EIA enzimimmunoassay<br />
EIHIA Enzyme Inhibitory Homogeneous Immunoassay<br />
EKG elektrokardiográfia<br />
ELISA enzyme-linked-immuno-sorbent-assay<br />
ELISPOT enzyme-linked immunosorbent spot<br />
EMIT enzyme-multiplied immunoassay technique<br />
ENA extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek<br />
eNOS endothelialis nitrogén-monoxid-szintáz<br />
EPCA early prostate cancer antigen<br />
EPO erythropoietin<br />
EQA external quality assessment; külső minőségellenőrzési rendszer<br />
ER endoplazmatikus retikulum; endoplasmic reticulum<br />
ERK extracelluláris receptor-kináz<br />
ESI elektroporlasztásos ionizáció; ElectroSpray Ionization<br />
ESI-MS elektrospray ionizációs mass spectrometry<br />
ETD electron transfer dissociation<br />
F<br />
F ab<br />
FAB<br />
FACS<br />
fragment antigen binding<br />
gyors atombombázás; fast atom bombardment<br />
fluorescence activated cell electron transfer dissociation, ETD sorting
20 Rövidítések<br />
FAD<br />
FBS<br />
F c<br />
FCM<br />
FD<br />
FGF<br />
FI<br />
FIA<br />
FIB<br />
FITC<br />
FL<br />
FLC<br />
FPIA<br />
fPSA<br />
FRET<br />
FSC<br />
FSH<br />
flavin-adenin-dinukleotid; flavin adenine dinucleotide<br />
foetal Bovine Somatotrophin)<br />
fragment crystallizable<br />
flow cytometry; áramlási citometria<br />
térdeszorpció<br />
fibroblast növekedési faktor; fibroblast growth factor<br />
térionizáció<br />
fluoreszcens immunoassay<br />
gyors ionbombázás; fast ion bombardment<br />
fluoreszcein-izotiocianát<br />
fluorescent scatter<br />
szabad könnyűlánc; free light chain<br />
fluoreszcenciapolarizációs immunoassay<br />
szabad (free) PSA<br />
fluoreszcenciarezonancia-energiatranszfer<br />
forward scattered<br />
folliculusstimuláló hormon<br />
G<br />
GAPDH<br />
GC-MS<br />
G-CSF<br />
GDF9<br />
GFP<br />
GIP<br />
GLP-1<br />
GLUT<br />
GM-CSF<br />
GOT<br />
GPC<br />
GPT<br />
glicerinaldehid-foszfát-dehidrogenáz<br />
gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria; Gas Chromatography-Mass<br />
Spectrometry<br />
granulocyte-colony stimulating factor<br />
growth differentiation factor-9<br />
green fluorescent protein<br />
glukózdependens inzulinotrop peptid<br />
glukagonszerű peptid-1<br />
glukóztranszporter<br />
granulocyte-macrophage colony stimulating factor<br />
glutamin-oxálecetsav-transzamináz; aszpartát-aminotranszferáz (AAT)<br />
gyomor parietalis sejt<br />
glutamin-piroszőlősav-transzamináz<br />
H<br />
HAMA heterogén anti-mouse (antiegér) antitest<br />
Hb<br />
hemoglobin<br />
HbCO karboxihemoglobin<br />
HBV hepatitis B vírus<br />
HCCA, CHCA α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav<br />
HCDM Human Cell Differentiation Molecules<br />
HCG, hCG humán koriogonadotropin<br />
HCV hepatitis C vírus<br />
HDGF hepatoma-derived growth factor<br />
HDL<br />
high density lipoprotein
Rövidítések<br />
21<br />
HE humán epididymisprotein<br />
HEp-2 sejt Human Epithelioma Type 2 Cells<br />
HGF hepatocyte growth factor<br />
hGH humán növekedési hormon; human growth hormone<br />
HIS kórházi számítógépes rendszer<br />
HIV humán immundeficiencia-vírus<br />
HLB hidrofil/lipofil egyensúly (balansz)<br />
HLDA Humán Leukocyta Differenciálódási Antigén<br />
Hp<br />
haptoglobin<br />
HPLC nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia; High Performance Liquid Chromatography<br />
HPT haptoglobin<br />
HRP torma- (horseradish) peroxidáz<br />
HS CRP High-Sensitive CRP<br />
HUVS hypocomplementaemiás-urticariás vasculitis szindróma<br />
HYDRAGEL agarózgél-elektroforézis<br />
I<br />
IA<br />
immunoassay<br />
IDDM idiopathiás diabetes mellitus<br />
IDF Nemzetközi Diabetes Szövetség<br />
ID-GCMS izotóphígításos gázkromatográfia/tömegspektrometria<br />
IE<br />
immunelektroforézis<br />
IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine<br />
IFE immunfixáció<br />
IFG emelkedett éhgyomri vércukorszint; impaired fasting glucose<br />
IFN interferon<br />
Ig<br />
immunglobulin<br />
IGF inzulinszerű növekedési faktor; insulin-like growth factor<br />
IGT csökkent glukóztolerancia; impaired glucose tolerance<br />
IIF<br />
indirekt immunfluoreszcencia<br />
IL-6 interleukin 6<br />
ILAC International Laboratory Accreditation Cooperation<br />
IMA ischaemia okozta módosult albumin<br />
IRS inzulinreceptor-szubsztrát<br />
ISD in source decay<br />
IUIS International Union of Immunological Societies<br />
IVD in vitro diagnosztikum<br />
IVDD In Vitro Diagnostical Directive; in vitro diagnosztikai irányelv<br />
IVF in vitro fertilizáció<br />
J<br />
JCA<br />
JCTLM<br />
juvenilis krónikus arthritis<br />
Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine
22 Rövidítések<br />
K<br />
KIR<br />
KLH<br />
központi idegrendszer<br />
Keyhole Limpet Hemocyanin (limpet: kürtcsiga)<br />
L<br />
LC<br />
LC-ESI<br />
LC-ESI-MS<br />
LCM<br />
LC-MS/MS<br />
folyadékkromatográfia; fluid chromatography<br />
folyadékkromatográfiás elektroporlasztásos ionizáció;<br />
Liquid Chromatography Electron Spray Ionization<br />
folyadékkromatográfiás elektroporlasztásos tömegspektrométer;<br />
Liquid Chromatography Electron Spray Ionization Mass Spectrometry<br />
lézer-disszekció; laser capture microdissection<br />
folyadékkromatográfiával kapcsolt tandem tömegspektrometria<br />
(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry<br />
lézerdeszorpciós ionizáció<br />
low density lipoprotein<br />
large granular lymphocyte<br />
luteinizáló hormon<br />
LDI<br />
LDL<br />
LGL<br />
LH<br />
1<br />
LIF lézerindukált fluoreszcencia<br />
2<br />
LIF leukaemiainhibitor faktor<br />
LIR<br />
LIS<br />
LKM<br />
LSIMS<br />
laboratóriumi informatikai rendszer<br />
laboratóriumi számítógépes rendszer<br />
máj-vese mikroszóma; liver-kidney microsomal<br />
folyadék szekunderion tömegspektrometria<br />
M<br />
MALDI<br />
MALDI-MS<br />
MALDI-TOF<br />
MALDI-TOF MS<br />
MAPK<br />
MB<br />
MBS<br />
MCP<br />
MCTD<br />
MEIA<br />
MetHb<br />
MFI<br />
MGUS<br />
MHC<br />
mátrix segített lézerdeszorpciós ionizáció; Matrix-Assisted Laser Desorption/<br />
Ionization<br />
mátrixszal segített lézer-deszorpciós-ionizációs mass spectrometry<br />
mátrixszal segített lézer-deszorpciós-ionizációs repülési idő tömegspektrometria<br />
mátrix segítette lézerdeszorpciós ionizációt alkalmazó repülési idő<br />
tömegspektrometria; Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization<br />
Time-of-Flight Mass Spectrometry<br />
mitogén aktiválta protein-kináz<br />
microbead; mikrogyöngy<br />
m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter<br />
monocyta kemoattraktáns protein<br />
kevert kötőszöveti betegség; mixed connective tissue disease<br />
Microparticle Enzyme Immunoassay<br />
methemoglobin<br />
mean fluorescent intensity; átlag fluoreszcencia<br />
monoklonális gammopathia nem meghatározott jelentőséggel;<br />
monoclonal gammopathies with undetermined significance<br />
major histocompatibility complex
Rövidítések<br />
23<br />
MIF<br />
miRNS<br />
MPGN<br />
MPO<br />
MR<br />
mRNS<br />
MS<br />
MSH<br />
mTOR<br />
MUP<br />
migrációt gátló faktor<br />
mikro-RNS<br />
membranoproliferativ glomerulonephritis<br />
mieloperoxidáz<br />
mágneses rezonancia képalkotás<br />
hírnök RNS; messenger RNS<br />
tömegspektrometria; mass spectrometry<br />
melanocytastimuláló hormon<br />
mammalian target of rapamycin<br />
4-metil-umbelliferon-foszfát<br />
N<br />
NACB National Academy of Clinical Biochemistry<br />
NAD + oxidált nikotinamid-adenin-dinukleotid<br />
NADH redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid<br />
NADP nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate<br />
NDAS nem differenciált autoimmun betegség<br />
NDC nem differenciált collagenosis<br />
NGF nerve growth factor<br />
NGSP National Glycohemoglobin Standardization Program<br />
NHS N-hidroxiszukcinimid<br />
NO nitrogén-monoxid<br />
NSE neuronspecifikus enoláz<br />
NSTD Non-Sjögren Tear Deficient Dry Eye<br />
NSTEMI non-ST-szegment emelkedés myocardialis infarctus<br />
NT-pro BNP N-terminális pro-B típusú natriuretikus peptid<br />
O<br />
OGP<br />
oligoklonális gammopathia<br />
P<br />
PACAP adenilát-cikláz-aktiváló polipeptid<br />
PAG poliakrilamidgél<br />
PAGE poliakrilamid-gélelektroforézis<br />
1<br />
PAP peroxidáz-antiperoxidáz<br />
2<br />
PAP prostata savi foszfatáz<br />
1<br />
PBC primer biliaris cirrhosis<br />
2<br />
PBC vérsejtek<br />
PBS pufferolt sóoldat<br />
PCA perklórsav<br />
PCR polimeráz-láncreakció; Polymerase Chain Reaction<br />
PD<br />
plazmadeszorpció
24 Rövidítések<br />
PDGF<br />
PDK<br />
PE<br />
PerCP<br />
PHA<br />
PI<br />
PIGF<br />
PKC<br />
PMA<br />
PMF<br />
PMSF<br />
POC<br />
POCT<br />
PPO<br />
PSA<br />
PSC<br />
PSS<br />
PSD<br />
PTC<br />
PTH<br />
PYD<br />
thrombocyta eredetű növekedési faktor; platelet-derived growth factor<br />
foszfoinozitiddependens protein-kináz<br />
fikoeritrin<br />
peridinin-klorofill-protein<br />
fitohemagglutinin<br />
protrombinidő<br />
placental growth factor<br />
protein-kináz C<br />
forbol-12-mirisztát-13-acetát<br />
Peptide Mass Fingerprinting<br />
fenil-metil-szulfonil-fluorid<br />
point-of-care<br />
point of care testing; point-of-care test<br />
difeniloxazol<br />
prostataspecifikus antigén<br />
primer sclerotizáló cholangitis<br />
progresszív szisztémás sclerosis<br />
post source decay<br />
procalcitonin<br />
parathormon<br />
piridinolin<br />
Q<br />
QC<br />
quality control<br />
R<br />
RA<br />
RAAS<br />
RANKL<br />
RES<br />
RF<br />
RIA<br />
RNP<br />
RNS<br />
rRNS<br />
rheumatoid arthritis<br />
renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer<br />
receptor aktivált nukleáris faktor k-B ligand<br />
reticuloendothelialis systema; reticuloendothelialis rendszer; monocyta-macrophag<br />
rendszer<br />
rheumatoid faktor<br />
radioimmunoassay<br />
ribonucleoprotein (particle)<br />
ribonukleinsav; ribonucleotic acid; RNA<br />
riboszóma RNS<br />
S<br />
SA<br />
SDS<br />
SELDI-MS<br />
mustársav<br />
nátrium-dodecil-szulfát; Sodium Dodecyl Sulphate<br />
felület segítette lézerdeszorpciós/ionizációs tömegspektrometria; Laser Desorption<br />
Ionization Mass Spectrometry
Rövidítések<br />
25<br />
SI<br />
SIMS<br />
siRNS<br />
SLE<br />
SLFIA<br />
SMA<br />
snuRNS<br />
SOD<br />
SPDE<br />
SPE<br />
srpRNS<br />
SS<br />
SSC<br />
STEMI<br />
Système International d’Unités; Mértékegységek Nemzetközi Rendszere<br />
szekunder ion tömegspektrometria<br />
short interfering RNA<br />
szisztémás lupus erythematosus<br />
Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay<br />
simaizom elleni antitestek; smooth muscle antibodies<br />
mag-RNS<br />
szuperoxid-dizmutáz<br />
szilárd fázisú dinamikus extrakció; Solid Phase Dynamic Extraction<br />
szérumfehérje elektroforézis<br />
mag-RNS<br />
Sjögren-szindróma<br />
side scatter<br />
ST szegment emelkedéssel járó akut myocardialis infarctus<br />
T<br />
TAG tumorasszociált glikoprotein<br />
TAT turn around time; leletátfordulási idő<br />
TBP tributilfoszfin<br />
TBS TRIS pufferolt sóoldat<br />
TCA triklórecetsav<br />
TDDE kis könnytartalmon alapuló száraz szem; tear-deficient dry eye<br />
TEMED N,N,N,N-tetra-metilén-diamin<br />
Tg tireoglobulin<br />
TGF-a transforming growth factor alpha<br />
TGF-b transzformáló növekedési faktor-β; transforming growth factor beta<br />
TK timidin-kináz<br />
TNF-a tumour necrosis factor alpha<br />
TnC troponin C<br />
TnI troponin I<br />
TnT troponin T<br />
TOF repülési idő (analizátor); time-of-flight<br />
TPA tripropilamin<br />
TPA szöveti (tissue) polipeptid-antigén<br />
1<br />
TPO thrombopoietin<br />
2<br />
TPO pajzsmirigy-peroxidáz<br />
tPSA total PSA<br />
TRAP tartarátrezisztens savanyú foszfatáz<br />
TRF transzferrin<br />
TRH tireotrop releasing hormon<br />
TRITC tetrametil-rodamin-izotiocianát<br />
tRNS szállító RNS; transzfer RNS<br />
TSH thyroideastimuláló hormon<br />
TSPA könnyspecifikus prealbumin; tearspecific prealbumin<br />
tTG szöveti transzglutamináz
26 Rövidítések<br />
U<br />
UAER vizelet-albuminürítés<br />
UCTD nem differenciált kötőszöveti betegség<br />
UPE<br />
vizeletfehérje elektroforézis; urine protein electrophoresis<br />
UPI<br />
vizeletfehérje immunfixáció; urine protein immunofixation<br />
UPLC igen nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia; Ultra Performance Liquid<br />
Chromatography<br />
UPLC-MS/MS ultrahatékonyságú folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometria;<br />
Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry<br />
UPR<br />
unfolded protein response<br />
UV<br />
ultraibolya; ultraviolet<br />
V<br />
VEGF<br />
VLDL<br />
vascular endothelial growth factor<br />
very high density lipoprotein<br />
W<br />
WHO<br />
World Health Organization, Nemzetközi Egészségügyi Világszervezet
1. Bevezetés<br />
Kovács L. Gábor<br />
A fehérje mint az élet princípiuma<br />
Az élő rendszernek inherens módon egységnek kell<br />
lennie, és biológiai anyagcserét kell folytatnia. Ez nem<br />
pusztán anyagok felvételét és leadását, valamint átalakítását<br />
jelenti, hanem azt is, hogy eközben a szervezet<br />
saját anyagait a rá jellemző arányokban, időben és<br />
térben előállítja, sőt akár gyarapíthatja is, miközben<br />
az anyagátalakítások kémiai energiával is ellátják. Az<br />
anyagátalakítások során a rendszer azokat az információkat<br />
is forgalmazza, amelyek a szabályozásához<br />
és önszerveződéséhez szükségesek. A sajátos módon<br />
szervezett biokémiai reakcióhálózatok egyes vagy sorozatos<br />
reakciói katalizáltak és szabályozottak. Az élő<br />
rendszernek stabilisnak kell lennie; vagyis reagálni<br />
kell tudnia környezetének ingereire, de ezenközben<br />
nem vesztheti el önazonosságát (a homeosztázis folyamata).<br />
Az élő rendszernek rendelkeznie kell olyan<br />
alrendszerekkel, amelyek a teljes rendszer keletkezése,<br />
létezése és működései számára hordoznak információkat.<br />
Ilyen az örökletes információt hordozó<br />
genetikai állomány, a sejtek közötti kommunikáció<br />
rendszere (főleg a hormonális és az idegrendszer), továbbá<br />
a sajátot az idegentől megkülönböztető önvédő<br />
rendszer (immunrendszer). Ez összetett feladatrendszer<br />
ellátásának egyik titka a fehérjékben rejlik.<br />
A fehérje (protein) kifejezés a görög „protosz”<br />
szóból ered, jelentése az „első” az elemek közt. A fehérjék<br />
az élő szervezetet felépítő biomolekulák egyik<br />
meghatározó csoportját alkotják. Szerkezetükben az<br />
unikális és az univerzális elemek sajátos egyensúlya<br />
valósul meg. Így amellett, hogy pl. egyedi enzimfunkciókat<br />
látnak el, számos közös tulajdonsággal is<br />
rendelkeznek. A fehérjék valamennyi élő sejt számára<br />
az optimális szerkezet, a jó funkció, a növekedés, a<br />
működési zavarok helyreállításának elengedhetetlen<br />
eszközei. Fontos biológiai szerepüket jellemzi, hogy<br />
minden sejtben lejátszódó folyamatban részt vesznek.<br />
Számos fehérje enzimaktivitást mutat, azaz valamilyen<br />
biokémiai folyamat katalizátoraként segíti elő<br />
a sejt életben maradását. Fehérjék rendelkezhetnek<br />
stabilizáló, szerkezeti funkcióval is. Ilyen a sejt alakjának<br />
kialakítása (aktin, mikrotubuláris sejtváz, intermedier<br />
filamentum), sejten belüli transzportfolyamatok<br />
lebonyolítása (dinein, kinezin, miozin), mozgatás<br />
(aktomiozin rendszer). Más fehérjék a sejt és környezete<br />
közötti információáramlás megvalósítása révén<br />
teszik lehetővé, hogy a sejt érzékelni tudja a külvilág<br />
ingereit és reagálni tudjon rájuk. Összegezve, a fehérjék<br />
az élet nélkülözhetetlen tényezői.<br />
A molekuláris biológia központi tétele a genetikai<br />
információ áramlását az élő szervezetekben a DNS-től<br />
az RNS-en keresztül a fehérjékig határozza meg. A<br />
legújabb technikák már alkalmasak arra, hogy az e<br />
biomolekulák közötti sokféle kölcsönhatásról és a genetikai<br />
információáramlás minden egyes lépcsőfokáról,<br />
az azokat befolyásoló specifikus körülményekről,<br />
így a környezeti hatásokról és a stresszállapotokról<br />
információt szerezzünk. Közülük megemlíthetjük a<br />
genomikát, a transzkriptomikát, a proteomikát, valamint<br />
a glikomikát és a metabolomikát.<br />
A fehérjék szerkezete, kémiai tulajdonságai<br />
A fehérjék szerkezete és kémiája. A fehérjék aminosavak<br />
lineáris polimerjeiből felépülő szerves makromolekulák.<br />
Aminosavsorrendjüket a gének nukleotidszekvenciája<br />
kódolja a genetikai kódszótárnak<br />
megfelelően. Kialakításukban 20 féle „proteinogén”<br />
(fehérjealkotó) aminosav vesz részt, melyek az amino-<br />
és karboxilcsoportjaik között kialakuló peptidkötés<br />
révén kapcsolódnak egymáshoz. Egyes polipeptidek<br />
kialakításában több ezer aminosav is részt<br />
vehet, míg azokat, melyek kevesebb (
28 1. fejezet Bevezetés<br />
fehérjére specifikus kináz enzim foszfátcsoportot helyez<br />
egy meghatározott Ser, Thr, Tyr, ritkábban His<br />
oldalláncra. A glikoziláció szintén gyakori jelenség,<br />
ebben az esetben oligoszacharid/monoszacharid láncok<br />
kapcsolódnak Asn, Ser, Thr láncokhoz. Az amidés<br />
aminocsoportot tartalmazó aminosav-oldalláncok<br />
között, transzglutamináz-reakció eredményeként, kialakulhatnak<br />
peptidkötést tartalmazó kereszthidak,<br />
mint pl. véralvadás vagy a tej megalvadása során.<br />
Az elsődleges vagy primer szerkezet a fehérje aminosavszekvenciája.<br />
A fehérjelánc szintézisekor a legutoljára<br />
beépült aminosav karboxilcsoportjához kapcsolódik<br />
a következő aminosav aminocsoportja és így<br />
tovább. Így megkülönböztetjük a fehérjelánc „elejét”,<br />
a szabad aminocsoportot tartalmazó N-terminálist,<br />
valamint a „végét”, a szabad karboxilcsoportot tartalmazó<br />
C-terminálist.<br />
A másodlagos vagy szekunder szerkezeten a peptidgerinc<br />
hidrogénkötések által stabilizált lokális<br />
(legalább négy aminosavra kiterjedő) rendezettségét<br />
értjük. Ezt a szerkezeti szintet a peptidsíkok egymáshoz<br />
képest történő elfordulásával jellemezhetjük.<br />
E szerkezeti elemek legfőbb csoportjai a jobb- vagy<br />
balmenetes hélixek, a redők, a hurkok és a kanyarok;<br />
leggyakoribb az α-hélix, az antiparallel β-redő és a<br />
β-kanyar.<br />
A harmadlagos vagy tercier szerkezet egy polipeptidlánc<br />
teljes térbeli konformációja. Ezt a konformációt<br />
mindenekelőtt a hidrofób kölcsönhatások stabilizálják.<br />
Egy peptidlánc tartalmazhat egyetlen vagy<br />
többféle másodlagos szerkezeti elemet, melyek rendezetlen<br />
szakaszokkal váltakoznak, de ismertek olyan<br />
fehérjék is, melyekből teljesen hiányoznak a rendezett<br />
szerkezetek, ezeket natívan rendezetlen fehérjéknek<br />
nevezzük.<br />
Bizonyos fehérjéket több peptidlánc alkot, melyeket<br />
ez esetben alegységeknek nevezünk (negyedleges<br />
szerkezet). A peptidláncok lehetnek azonosak vagy eltérőek,<br />
számuk általában nem haladja meg a nyolcat,<br />
de ismertek fontos kivételek: pl. egyes vírusok kapszidja<br />
hatvan polipeptidből is állhat.<br />
Egyszerű és összetett fehérjék. A fehérjéket osztályozhatjuk<br />
összetételük alapján. Az egyszerű fehérjéket<br />
csak aminosavak építik fel, hidrolízisükkor csak<br />
aminosavak képződnek. Az összetett fehérjék hidrolizátuma<br />
egyéb alkotórészt is tartalmaz. Így lehetnek<br />
metalloproteinek (fémionokat tartalmaznak, pl.<br />
az alkohol-dehidrogenáz Zn 2+ -t, a citokróm-oxidáz<br />
Cu 2+ -t), foszfoproteinek (pl. kazein), hemproteinek<br />
(pl. hemoglobin, mioglobin, citokróm-c), glikoproteinek<br />
(szénhidrátrészt tartalmaznak, pl. γ-globulin),<br />
lipoproteinek (pl. β 1<br />
-lipoprotein), flavoproteinek (pl. a<br />
szukcinát-dehidrogenáz) vagy nukleoproteinek (nukleinsavakat<br />
tartalmaznak, pl. a dohánymozaik-vírus<br />
és az atelomeráz enzim).<br />
A fehérjék osztályozása funkciójuk alapján. A fehérjék<br />
sokféle funkciót töltenek be a szervezetben,<br />
ezek közül a fontosabbak: enzimek (pl. tripszin, citokróm-c),<br />
transzportfehérjék (hemoglobin, hemocianin,<br />
szérumalbumin), védőfehérjék (lehetővé teszik,<br />
hogy a szervezet fertőzéssel vagy sérüléssel szemben<br />
védekezzék, pl. ellenanyagok, fibrinogén, trombin),<br />
toxinok (pl. kígyómérgek), hormonok (pl. inzulin,<br />
mellékvesekéreg-serkentő hormon: ACTH, növekedési<br />
hormon), struktúrfehérjék (a mozgáshoz szilárd<br />
vázat biztosítanak, és a külső védelmet szolgálják, pl.<br />
kollagén, elasztin, retikulin), motorfehérjék (a sejtszervecskék,<br />
vezikulumok sejten belüli mozgatása a<br />
feladatuk, pl. aktin, miozin, kinezin, dinein), valamint<br />
tartalékfehérjék (az embrionális fejlődés zálogai,<br />
pl. ovalbumin).<br />
Fehérjék az élő sejtben<br />
A fehérjék szintézise. A sejt DNS-állományában bázispár-kombinációk<br />
formájában tárolt információ<br />
tulajdonképpen a 20 féle aminosav valamelyikét kódolja,<br />
3 bázispáros szavakban. Egy-egy gén egy fehérje<br />
tervrajzát tartalmazza. A transzkripció során ez a<br />
leírás egy közti molekula (mRNS) formájában mobilizálódik,<br />
és a genomból a fehérjeszintézist végző riboszómákhoz<br />
kerül, amelyek az mRNS-t tervrajzként<br />
használva legyártják a fehérjéket, az aminosavakat<br />
egyenként egymás mögé kapcsolva. A transzkripció<br />
helye a sejt DNS-állományához kötött eukarióták<br />
vagy valódi sejtmagosokban a sejtmag, a prokarióták,<br />
vagy sejtmagnélküliekben a citoplazma.<br />
Transzkripció. Az RNS-szintézist az RNS-polimeráz<br />
nevű enzim katalizálja („alternatív splicing”). A szintézis<br />
kezdetén a DNS kettős hélix szerkezete felnyí-
Bevezetés<br />
29<br />
lik. Az RNS-polimeráz a DNS ún. értelmes szálához<br />
kapcsolódik, és megkezdi annak átírását. Ez az átírás<br />
a bázispárképzés szabályainak megfelelően megy<br />
végbe. A bázisok beépítéséhez ATP eredetű energia<br />
szükséges. A szintézis végén az RNS-molekula leválik<br />
a DNS-ről, és visszaáll a kettős hélix szerkezet. Ezután<br />
eukariótákban az mRNS a sejtmaghártya pórusain<br />
át a citoplazmába transzportálódik, prokariótáknál<br />
viszont már a transzkripció alatt úgynevezett riboszómák<br />
kapcsolódnak az mRNS-hez, és megkezdik<br />
a fehérjék előállítását. Egy-egy mRNS-hez egyszerre<br />
több riboszóma is kapcsolódhat, ami meggyorsítja a<br />
fehérjeszintézis folyamatát. Ezeket a képződményeket<br />
poliriboszómáknak nevezzük.<br />
Aminosavak aktiválása. Az aminosavak aktiválása<br />
energiaigényes, a szükséges mennyiséget az ATP<br />
hidrolízise fedezi. Az aminosavak aminosavaktiváló<br />
enzimhez kapcsolódnak, mely kapcsolatba lép a<br />
tRNS-molekulával, végül az aminosav kapcsolódik a<br />
tRNS aminosavkötő helyére.<br />
Transzláció. A riboszóma kisebbik alegysége kapcsolódik<br />
az mRNS 5’ végéhez, majd ezután kapcsolódik<br />
a riboszóma nagyobbik alegysége is. A transzláció<br />
során a riboszóma (multienzim-komplex) határozza<br />
meg a szintézisben részt vevő molekulák térbeli<br />
elrendeződését, együtt tartja az mRNS-t és a növekvő<br />
polipeptidláncot, és a szintézis előrehaladásával<br />
folyamatosan továbblép az mRNS-en. A transzláció<br />
apparátusa a polipeptid képzésekor az mRNS-en<br />
5’–3' irányban halad. Minden egyes aminosavnak 3-3<br />
nukleotidból álló kodonja sorakozik egymás után az<br />
mRNS-en, amelyek a tRNS-eken található 3-3 komplementer<br />
nukleotidból álló antikodonnal párosodnak.<br />
A transzláció első lépéseként az első aminosavat<br />
(a lánckezdő metionint) szállító tRNS kapcsolódik<br />
a riboszóma P- (peptidkötő) helyéhez, a következő<br />
aminosavat szállító tRNS pedig az A- (aminosavkötő)<br />
helyéhez. A P-helyen lévő metionin (majd később<br />
a polipeptid) és az A-helyre szállított aminosav<br />
között ATP-energia felhasználásával és enzimek segítségével<br />
peptidkötés alakul ki, ezután a kialakított<br />
peptidszakasz továbbítódik a peptid-kötőhelyre, a<br />
beépült aminosavat szállító tRNS szabadon leválik, a<br />
riboszóma továbblép az mRNS-en. A megfelelő kodon<br />
felismerése után az aminoacil-tRNS-ek egymás<br />
után kapcsolódnak a riboszómához, adják le az aminosavakat<br />
és így hosszabbítják a polipeptidláncot. A<br />
növekvő polipeptidlánc a riboszóma kis alegységéhez<br />
kapcsolódik.<br />
A polipeptidlánc szintézisének végét az úgynevezett<br />
„stop”-kodonok határozzák meg. Három<br />
lánczáró kodon létezik: UAA, UGA, UAG. A terminációs<br />
kodonhoz egy release-faktor kapcsolódik<br />
(peptidil-transzferáz), amely képes a P-helyen lévő<br />
utolsó tRNS és aminosav közötti kötés hidrolízisére.<br />
Ezután a tRNS és a polipeptid távozik, majd megszűnik<br />
a riboszóma és az mRNS közötti kapcsolat, végül<br />
a riboszóma alegységeire hidrolizál.<br />
A fehérjék felgombolyodása (folding). A fehérje<br />
gombolyodásának problémája, hogy a frissen szintetizált<br />
polipeptidlánc hogyan jut el abba a háromdimenziós<br />
szerkezetbe, amely biztosítja a biológiai<br />
rendszerben neki szánt funkció teljesítését. Bizonyos<br />
konformációs betegségekben félig felgombolyodott<br />
fehérjék vízben oldhatatlan aggregátumai rakódnak<br />
le a szövetekben. Az irodalomban publikált felgombolyodási<br />
vizsgálatok valójában az újragombolyodást<br />
(refoldingot) tanulmányozták. A fehérjefelgombolyodás<br />
kísérleti tanulmányozására használt általános<br />
módszer a kémiai ágensekkel való denaturáció és az<br />
ezt követő hirtelen kihígítás, aminek következményeként<br />
a denaturáló kémiai ágens koncentrációja a kritikus<br />
alá csökken, így megindul a felgombolyodás. (A<br />
nyomás-denaturáció olyan új eszközt kínált, amellyel<br />
a kémiai ágenst kiválthattuk.)<br />
A fehérjefelgombolyodási vizsgálatok egyik fontos<br />
kérdése a feltekeredési útvonalon létrejövő köztes<br />
állapotok létezése volt. Számos kísérletet, ill. modellszámolást<br />
végeztek ugyanis annak bizonyítására,<br />
hogy a fehérjék feltekeredésük során köztes állapotokon<br />
mehetnek keresztül.<br />
Posztszintetikus módosítások. A polipeptidlánc a<br />
szintézis lezárultával további átalakulásokon megy<br />
keresztül. Ilyen átalakulás során kialakul a fehérje<br />
másodlagos szerkezete, az első (metionin) vagy első<br />
néhány aminosavat enzimek eltávolíthatják, vagy a<br />
láncot elvághatják, vagy különböző funkciós csoportok<br />
kapcsolódhatnak a lánchoz (foszfátok, lipidek,<br />
szénhidrátok).
30 1. fejezet Bevezetés<br />
A fehérjék lebomlása. A fehérjelebontás, az aminosavátalakulás<br />
különösen az emlősök szervezetében<br />
igen nagy jelentőségű. A táplálékkal felvett fehérjéket<br />
hidrolitikus enzimek első lépésben aminosavakra<br />
bontják. A peptidkötést bontó enzimek a proteázok.<br />
Az aminosavak aztán különféle átalakulási folyamatokban<br />
vehetnek részt, pl. az extracelluláris térből<br />
aktív transzporttal a sejtbe jutó aminosavak felhasználódnak<br />
fehérjék, peptidek bioszintéziséhez; az<br />
aminosavak részt vesznek egyéb nitrogéntartalmú<br />
vegyületek bioszintézisében (koenzimek, purin- és<br />
pirimidinvázas vegyületek, hormonok); dekarboxilezéssel<br />
biogén aminok keletkeznek; az aminocsoport<br />
lehasadása után szénláncuk a lipid- és szénhidrát-anyagcserefolyamatokba<br />
kapcsolódhat be (a<br />
citrátkörön keresztül); a sejtek ketosavaiból transzaminálással<br />
más aminosavak keletkeznek; az aminosavak<br />
egymásba alakulásukkal endogén aminosavak<br />
(nem esszenciális) szintézisében is részt vehetnek, ill.<br />
a lehasadó ammónia és szén-dioxid karbamiddá alakulva<br />
kiürül a szervezetből.<br />
Az aminosavak dezaminálása. A legtöbb dezaminálás<br />
transzaminálási reakcióban valósul meg. Az ezt<br />
katalizáló enzim aktív centrumában piridoxál-foszfát<br />
(a B 6<br />
-vitamin származéka) van. Ennek aldehidcsoportja<br />
képes kapcsolatot létesíteni az aminosav<br />
aminocsoportjával. Ez víz hatására elbomlik, és ketosav<br />
lép ki a komplexből, míg az aktív centrumban<br />
piridox amin-foszfát marad vissza.<br />
Oxidatív dezaminálás során ammónia keletkezik.<br />
A glutaminsav oxidatív dezaminálását katalizáló dehidrogenáz<br />
enzim jelentős szerepet játszik a folyamatban.<br />
Az aminocsoport eltávolításakor a NAD +<br />
koenzim redukálódik, és egy könnyen hidrolizálódó<br />
iminosav köztiterméken keresztül α-keto-glutársav<br />
és ammónia képződik. Az ammónia karbamid formájában<br />
ürül ki a szervezetből.<br />
Nem oxidatív dezaminálás során az ammónia<br />
mellett kettős kötést tartalmazó termék is létrejön.<br />
A dezaminálás során képződő szénlánc főként a citrátkörön<br />
keresztül alakul széndioxiddá és vízzé. Az<br />
aminosavak hét fő intermedier molekulává (piruvát,<br />
α-keto-glutársav, szukcinil-KoA, fumársav, oxálecetsav,<br />
acetil-KoA, acetoacetát) bomlanak le.<br />
Az aminosavak dekarboxilezése. Az aminosavak a<br />
széndioxid kilépése után a megfelelő aminokká alakulnak.<br />
Az aminokat biogén aminoknak nevezzük,<br />
mert számos képviselőjük fontos biológiai funkciókat<br />
tölt be. Az aminosavak dekarboxilezését specifikus,<br />
piridoxál-5-foszfát koenzimmel működő dekarboxiláz<br />
enzim végzi. A hisztamin hisztidinből, a tiramin<br />
tirozinból, a triptamin triptofánból, a kadaverin a lizinből<br />
keletkezik dekarboxilezéssel. A glutaminsavból<br />
γ-amino-vajsav jön létre.<br />
Az ubikvitinrendszer. Miközben a fehérjékkel kapcsolatos<br />
kutatások nagy része azzal foglalkozott, vajon<br />
hogyan jöhetnek létre a proteinek, addig a magyar<br />
származású Avram Hershko, a haifai Technion<br />
– Israel Institute of Technology munkatársa első kutatásai<br />
óta a lebomlás iránt érdeklődik. A fehérjék lebontásáról<br />
sokáig nem sok ismeretünk volt, néhány<br />
egyszerű proteinlebontó enzimről tudtunk mindöszsze.<br />
Ilyen pl. a tripszin, mely a vékonybélben bontja<br />
le az elfogyasztott ételekből származó fehérjéket. Ma<br />
már tudjuk, hogy a sejtek az ubikvitinrendszeren keresztül<br />
bontják le hibás fehérjéiket. Az újonnan létrejött<br />
proteinek 30%-a végzi a proteaszóma megsemmisítő<br />
gépezetében, ha nem jutnak keresztül a sejt<br />
szigorú ellenőrző rendszerén. Az ubikvitinrendszer<br />
hibás működése számos betegséghez, pl. rákhoz vezet.<br />
A szisztéma megismerésének orvosi jelentősége,<br />
hogy (többek között) bizonyos daganatos, immun-,<br />
idegrendszeri betegségek gyógyíthatók lennének, ha<br />
csak a káros fehérjék jelölődnének és bomlanának le.<br />
A Nobel-díjas eredmények ahhoz is hozzájárultak,<br />
hogy jobban megértsük az immunrendszer működését.<br />
Ezekkel az új ismeretekkel lehetővé vált annak<br />
megértése is, hogy a sejtek molekuláris szinten miként<br />
kontrollálnak számos fontos biokémiai folyamatot,<br />
mint pl. a sejtciklust, a DNS-újratermelést és a<br />
génmásolást (1-1. ábra).
Bevezetés<br />
31<br />
1-1. ábra. Fehérjék lebomlása – az ubikvitin (UB) szerepe<br />
1. Az E1 enzim aktiválja az ubikvitinmolekulát<br />
2. Az E1 enzim átadja az ubikvitinmolekulát az E2 enzimnek<br />
3. Az E3 enzim már képes felismerni a lebontandó fehérjét<br />
4. Az E2 enzim közel kerül a fehérjéhez, és átadja az ubikvitint<br />
5. Ez többször is megismétlődik, így ubikvitinlánc alakul ki<br />
6. A proteaszóma felismeri az ubikvitinláncot, és feldarabolja a fehérjét
32 1. fejezet Bevezetés<br />
A fehérjék kölcsönhatásai<br />
A fehérjék szerkezetét fenntartó kölcsönhatások alapvetően<br />
négy nagyobb csoportba oszthatók:<br />
• Elektrosztatikus kölcsönhatások.<br />
• Diszperziós erők.<br />
• H-hidak.<br />
• Hidrofób kölcsönhatások.<br />
Mai értelmezésünk szerint a komplex biológiai rendszerek,<br />
pl. egy sejt alkotóelemei, sokrétű bonyolult<br />
és dinamikus kölcsönhatásban vannak egymással,<br />
és ezek a kölcsönhatások elektromágneses természetűek,<br />
elsősorban Coulomb-erőkre vezethetőek vissza.<br />
A fehérjék mindig vizes közegben működnek, és maguk<br />
is jelentős mennyiségű (20–70%), felszínükön és<br />
üregeikben kötött vizet tartalmaznak. E hidrátburok<br />
vízmolekulái integráns részét képezik a térszerkezetnek,<br />
és elengedhetetlenek a működéshez. A fehérjék<br />
különleges képessége, szerkezeti és funkcionális sokoldalúsága<br />
elsősorban annak tulajdonítható, hogy<br />
szemben a szilárd anyagokkal, amelyeket főként erős<br />
kovalens és ionos kötések tartanak egyben, és a folyadékokkal,<br />
amelyeknek részecskéi között gyenge másodlagos<br />
kötések hatnak, a fehérjékben e két kötéstípus<br />
kombinációjával találkozunk. Az aminosavak<br />
oldatát a sejt fehérjéitől az különbözteti meg, hogy<br />
a sejt működési körülményei között az aminosavak<br />
kovalens kötéssel, adott sorrendben láncba vannak<br />
rendezve. Ez a polipeptidlánc korlátozott flexibilitással<br />
rendelkezik, ami lehetővé teszi a térbeli gombolyodást,<br />
felcsavarodást, a lánc nem szomszédos<br />
oldalláncainak közelkerülését. A nem-kovalens kötések<br />
közeli molekulák és molekularészletek közöt-<br />
1-2. ábra. Sejt-sejt kapcsolatot kialakító fehérjék (pl. integrinek) aktiválódása során jellegzetes makroszkopikus szerkezetváltozás<br />
következik be<br />
(Rövidítések – EGF: epidermalis növekedési faktor; I: integrin; ICAM: intercelluláris adhéziós molekula)
Bevezetés<br />
33<br />
ti töltéskölcsönhatások következményei. Egyenként<br />
kicsiny stabilizációs energiát jelentenek. Az élettel<br />
összeegyeztethető hőmérsékleten, a hőmozgás következtében<br />
könnyen felhasadnak, de nagy számuk<br />
és együttműködő, kooperatív természetük miatt<br />
együttesen jelentős szerkezetrögzítő, stabilizáló hatást<br />
jelentenek. Az ilyen, részben kovalens, részben<br />
másodlagos kötésekkel stabilizált szerkezetek, a fehérjék<br />
sok különleges, az élettelen világban ritka tulajdonsággal<br />
rendelkeznek. Legfontosabb sajátságuk,<br />
hogy miközben jól definiált szerkezettel rendelkeznek,<br />
az óriásmolekulát alkotó atomhalmaz állandó, a<br />
hőmozgás által hajtott dinamikus fluktuációban van.<br />
Ennek folytán a térszerkezet nagyfokú flexibilitással<br />
is rendelkezik, könnyen képez komplexet egy nagyjából<br />
komplementer felülettel (egy másik, bonyolult<br />
makromolekulával), a kölcsönös adaptáció lehetősége<br />
révén (1-2. ábra).<br />
Fehérjék mint enzimek (katalízis)<br />
Az enzimek a szervezetben lejátszódó folyamatok<br />
reakciósebességét növelő anyagok. Az aktiválási energiát<br />
csökkentik, így az enzimeket biokatalizátoroknak<br />
tekinthetjük. Mint minden katalizátor, az enzimek<br />
is csak olyan folyamatok lejátszódását segítik elő,<br />
amelyek egyébként is végbemennének, de a reakció<br />
lényegesen lassabban játszódna le. Minden enzim<br />
fehérje, emiatt mindegyikre jellemző egy hőmérséklet-<br />
és pH-optimum. Az optimális pH rendszerint az<br />
5–9 tartományba esik, de pl. a gyomorban termelődő<br />
emésztőenzim, a pepszin esetében 2 körüli. Az optimális<br />
hőmérséklet általában 36–40 °C környékén van.<br />
Magasabb hőmérséklet növeli a reakciósebességet, de<br />
ha túl magas, az az enzimek denaturálódását okozza.<br />
Az enzimfehérjék térbeli szerkezete az, ami lehetővé<br />
teszi a reagáló anyagokkal való kapcsolat kialakítását,<br />
azok megkötését. A fehérjék e részét nevezzük aktív<br />
centrumnak. Az enzimek specifikusak, csak egy<br />
adott vegyület (vagy vegyületcsoport, a szubsztrát)<br />
adott reakcióját katalizálják, azét a vegyületét, amely<br />
képes a kérdéses fehérje térszerkezetéből és energetikai<br />
viszonyából adódóan az enzimhez kapcsolódni<br />
az aktív centrumon. Az inhibitorok olyan vegyületek,<br />
amelyek az aktív centrumhoz kapcsolódnak, és ezzel<br />
megakadályozzák az enzim működését, irreverzibilis<br />
gátlást okoznak. A kompetitív inhibitorok térszerkezete<br />
a szubsztrátéhoz hasonló, ezért tudnak kapcsolódni<br />
az enzimhez. Hatásuk reverzibilis, nagyobb<br />
szubsztrátkoncentrációval leszoríthatóak. Bizonyos<br />
enzimeknek aktivátorokra van szüksége a működéshez.<br />
Ilyen aktivátorok lehetnek bizonyos kationok, pl.<br />
magnézium, cink, kalcium, kobalt. Az enzimek egy<br />
része egyszerű fehérje, ami önmagában is képes katalizátorként<br />
működni (egyszerű enzimek), más részüknek<br />
viszont szüksége van valamilyen kiegészítő<br />
anyagra (összetett enzimek). Ez lehet valamilyen szerves<br />
vegyület vagy fémion (gyakori pl. a cink), vagy<br />
valamilyen nem fehérje természetű anyag, pl. vitaminszármazék<br />
(a NAD + és NADP + molekulákban).<br />
Amennyiben erősen kötődik az enzimhez, prosztetikus<br />
csoportnak nevezzük. Gyakori azonban, hogy<br />
egy organikus vegyület csak lazán kapcsolódik, és<br />
könnyen leválik a fehérjéről, ezeket a szakirodalom<br />
koenzimnek nevezi. A koenzimek, fogalmazzunk így,<br />
„praktikusabbak” az élővilágban, ugyanis a nem fehérje<br />
természetű rész többféle fehérjéhez is képes<br />
kapcsolódni, így többféle enzim alkotójává válhat (pl.<br />
a NADH-t nagyjából 700 különböző ismert enzim<br />
használja). Koenzimek: NAD + , FAD, citokrómok, liponsav<br />
stb. A teljes, működőképes enzimet holoenzimnek<br />
nevezzük, ennek a fehérjerésze az apoenzim, a<br />
kapcsolódó nem fehérje rész pedig a koenzim.<br />
A katalizált kémiai reakciók alapján is csoportosíthatók:<br />
transzferázok (kémiai csoport átvitele egyik<br />
vegyületről a másikra), oxidoreduktázok (oxigénfelvételt,<br />
hidrogén-, ill. elektronátvitelt katalizálnak),<br />
hidrolázok (hidrolitikus bontás), izomerázok (izomerképződés<br />
elősegítése), ligázok (bioszintézisek<br />
katalizálása kovalens kötések létrehozásával), liázok<br />
(nem hidrolitikus bontás). Az enzimek nem csak<br />
a zsírok, a fehérjék és a szénhidrátok lebontásában<br />
(emésztés) vesznek részt, hanem építő folyamatokban<br />
is. Az immunrendszer működésében is több szinten is<br />
szerepet játszanak: egyrészt a bőr felszínén nem csak<br />
a savköpeny igyekszik a támadó kórokozókat elpusztítani,<br />
hanem az ott lévő enzimek is károsítják azokat<br />
és toxinjaikat. Ezek a védő enzimek a testnyílásoknál<br />
is megtalálhatók (pl. a lizozim a nyálban, a könnyben,<br />
a légutakban). Másrészt a szervezetbe mégis bejutott<br />
kórokozók elpusztításában is aktív szerepük van azok<br />
burkának feloldása, „kilyuggatása” által.
34 1. fejezet Bevezetés<br />
Fehérjék szerepe a struktúraalkotásban<br />
Az eukarióta sejtben a sejtet kívülről borító plazmamembránon<br />
kívül vannak belső sejtmembránok is;<br />
melyek egy része nem kerül kapcsolatba, de egy részük<br />
érintkezhet, összeolvadhat a plazmamembránnal,<br />
ill. leválhat arról (exocitózis, endocitózis). Az<br />
egyik legfontosabb ilyen belső sejtmembránrendszer<br />
az endoplazmatikus retikulum (ER) membránrendszere<br />
a citoplazma belső, a sejtmaghoz közelebbi<br />
részében. Ez a membránrendszer közvetlen fizikai<br />
érintkezésben van a sejtmag maghártyájával; a maghártya<br />
két membránlemeze közötti tér az endoplazmatikus<br />
retikulum üregrendszerében folytatódik. Az<br />
endoplazmatikus retikulum membránjaiban található<br />
a sejt bioszintézisét végző enzimek nagy része,<br />
vagyis az ER membránjai a sejt szintetizáló rendszerét<br />
adják. Itt képződnek az új lipidmolekulák, így a<br />
membránok foszfolipidjei is. Az ER membránjaihoz<br />
kapcsolódhatnak riboszómák, melyek a citoplazmatikus<br />
fehérjeszintézis helyei. A riboszómák ide speciális<br />
helyeken és sajátos mintázatban kapcsolódnak;<br />
emiatt az ilyen ER elektronmikroszkópban szemcsés<br />
vagy durva felszínűnek tűnik. A durva felszínű ER riboszómái<br />
szintetizálják azokat a fehérjéket, amelyeket<br />
a sejt „exportra” termel, vagyis melyek végül exocitózissal<br />
ki fognak jutni a sejt külső felszínére, vagy<br />
el is hagyják a sejtet. Az ER másik típusának membránján<br />
nem találhatók riboszómák, ezért az elektronmikroszkópban<br />
sima felszínű. A sejt saját használatra<br />
szánt fehérjéit a citoplazmában szabadon található riboszómák<br />
termelik.<br />
A másik fontos belső membránrendszer eukarióta<br />
sejtben a Golgi-készülék, mely voltaképpen egymásra<br />
rétegzett lapos membránzsákokból áll. Ez a 4-5<br />
membránzsák kissé ívben meg is hajlik, az íve „szája”<br />
leginkább a sejtmag felé található, domborulata meg<br />
a plazmamembrán felé néz. Ez a membránrendszer<br />
kapcsolatban van az ER membránrendszerével olyan<br />
módon, hogy az ER kötött riboszómái által termelt<br />
fehérjék bejutnak az ER üregébe, majd ott benn megkezdik<br />
átalakulásaikat: egyes darabjaik lehasadnak,<br />
egyes aminosavaikhoz szénhidrátok vagy azok rövidebb-hosszabb<br />
láncai kapcsolódnak, majd a módosult<br />
fehérje transzportálódik az ER membránjainak<br />
széli hólyagocskáiba. Itt azután kis hólyagocskaként<br />
lefűződnek az ER-ről, bennük az exportra szánt fehérjékkel.<br />
Ezek a kis citoplazmatikus, membránnal<br />
körülvett hólyagocskák azután átalakulhatnak lizoszómává,<br />
ha a megfelelő fehérjék és enzimek vannak<br />
bennük és a belsejük megsavanyodik; ekkor a sejt<br />
anyagait, ill. a sejt által a külvilágból felvett makromolekulákat<br />
fogják lebontani. A lizoszómák tehát<br />
az eukarióta sejtekben a sejten belüli emésztés helyei.<br />
A membránnal körülvett kis citoplazmatikus<br />
hólyagocskák másik része eljut a Golgi-készülék<br />
membránjaihoz, és a sejtmaghoz közeli membránzsákokba<br />
beleolvad. Ezáltal a bennük levő fehérjék<br />
is a Golgi-készülék membránzsákjaiba kerülnek. Az<br />
azokban lévő enzimek újabb átalakításokat végeznek<br />
a fehérjéken, elsősorban újabb szénhidrátláncok kapcsolódnak<br />
hozzájuk. Ezek a glikoproteinek vagy mukoproteinek<br />
fognak kapcsolatba lépni a sejtet borító<br />
plazmamembránnal. A Golgi-készülék külső membránzsákjaiból<br />
a megváltozott fehérjék és foszfolipidek<br />
szintén kis hólyagocskákba csomagolódnak, melyeket<br />
most szekréciós vezikulának neveznek. Ezek tartalma<br />
a plazmamembránon át exocitózissal ürül ki a<br />
sejtből. A szekréciós vezikula membránja már össze<br />
tud olvadni a plazmamembránnal, az összeolvadás<br />
helyén a plazmamembrán felszakad, így a belső tartalom<br />
a sejten kívülre kerül. A szekréciós vezikula<br />
membránja teljes felszínével a plazmamembrán felületét<br />
növeli. A kijutott anyagok egy része megkötődik<br />
a plazmamembránban, ezért találunk annak külső<br />
oldalán szénhidrátláncokat hordozó gliko- és mukoproteineket,<br />
glikolipideket. A kijutott anyagok egy<br />
másik részét egyes sejtek el is engedik, így azok a sejtek<br />
közötti térbe kerülnek. A szekréciós vezikulának a<br />
plazmamembránnal való összeolvadását (fúzióját), a<br />
vezikula tartalmának kiürülését és a plazmamembrán<br />
felületének megnagyobbodását és anyagainak eme<br />
gyarapodását nevezik exocitózisnak. Ezzel az aktív,<br />
membránmozgással járó folyamattal a plazmamembránon<br />
egyébként átjutni nem tudó makromolekulák<br />
és makromolekuláris oldatok is ki tudnak jutni a sejtből.<br />
Hasonló, de ellentétes irányú folyamat az endocitózis,<br />
amellyel makromolekulák és oldataik is be tudnak<br />
jutni a sejtbe. Ekkor a felveendő makromolekula<br />
a plazmamembránon speciális receptorához kötődik,<br />
a plazmamembrán elkezd alatta gödörré mélyülni,<br />
majd hólyagocskát (vezikulát) formálva magába zárja<br />
a makromolekulákat, Ezt követően a membránnal<br />
körülvett hólyagocska leválik a plazmamembránról,<br />
és a keletkezett endoszóma vagy fagoszóma a citoplaz-
Bevezetés<br />
35<br />
mába süllyed. Ez az endocitotikus folyamat természetesen<br />
csökkenti a plazmamembrán felületét.<br />
Fehérjék szerepe<br />
a transzportfolyamatokban<br />
A membrántranszport-fehérjék (transzporterek)<br />
olyan membránfehérjék, amelyeknek szerepe van ionok,<br />
kis molekulák, makromolekulák (pl. másik fehérje)<br />
szállításában a biológiai membránokon keresztül.<br />
A fehérjék az anyagszállításban facilitált diffúzió<br />
vagy aktív transzport segítségével működhetnek közre.<br />
Ezeket összefoglalóan karriermediált transzportnak<br />
nevezzük. A facilitált diffúziót elősegítő fehérjék<br />
energia felhasználása nélkül, csak az elektrokémiai<br />
gradiensnek megfelelő irányban hatnak közre az<br />
anyagok szállításában. Az anyagszállítás magas specificitású<br />
pórusok vagy csatornák mentén megy végbe.<br />
A membrántranszport-fehérjék számos családját ismerjük<br />
élettani vagy betegségekhez kötődő szerepük<br />
révén (pl. karioferin, mitokondriális membrántranszport-proteinek,<br />
ATP-binding cassette transzporterek,<br />
CD36, neurotranszmittertranszporterek, iontranszporterek).<br />
A vezikuláris transzportproteinek<br />
transzmembrán vagy membránasszociált fehérjék.<br />
Elősegítik a vezikulák transzportját. Kiterjedt csoportjaik:<br />
archain, ARF-ek, klatrin, kaveolin, dinamin,<br />
Rab proteinek, nexinek, szinaptotagmin.<br />
Sejtek és fehérjék<br />
Minden sejt önfenntartó működésre is képes. Tápanyagait<br />
energiává tudja alakítani, speciális funkciókat<br />
képes végrehajtani, ha szükséges, meg tudja<br />
önmagát ismételni (osztódás). Őrzi magában a lehetőséget<br />
saját maga kivitelezésére és reprodukálására.<br />
A sejtek számos képességgel rendelkeznek: osztódás,<br />
anyagcsere lehetősége, beleértve a tápanyag-felhasználást,<br />
az energia átalakítását, molekulák, vegyületek<br />
létrehozását. A sejt működése függ képességeinek kihasználásától,<br />
amit a tárolt kémiai anyagok felhasználásból<br />
nyer. Ez lehet nukleinsav- és fehérjeszintézis,<br />
funkcionális sejtrészek szintézise, mint az enzimek. A<br />
tipikus emlőssejtek közel 10 000 különböző fehérjét<br />
tartalmaznak. A sejt reagál a külső és belső változásokra,<br />
mint pl. a hőmérséklet vagy a pH megváltozására.<br />
Transzportfolyamatai vannak, környezetével<br />
dinamikus kölcsönhatásban van. Minden sejt állít elő<br />
fehérjéket élete során. Ezekre vagy a sejt felépítéséhez<br />
van szükség (szerkezeti fehérjék), vagy pedig valamilyen<br />
biológiailag aktív funkciójuk van: enzimek, szállítómolekulák,<br />
ingerületátvivő anyagok. A fehérjék<br />
keletkezéséhez szükséges kódot a sejtmagban található<br />
örökítő anyag, a DNS hordozza. Innen az információt<br />
a hírvivő RNS (mRNS) szállítja el a fehérjeképződés<br />
helyére, a sejtmagon kívülre, a riboszómákhoz.<br />
Ide fut be az összes információ és a fehérjék képződéshez<br />
szükséges alapanyagok. A hírvivő RNS belép<br />
a „fehérjegyárba”, elfoglalja dokkolóhelyét, és várja a<br />
riboszómában dolgozó enzimeket, hogy elvégezzék<br />
feladatukat.<br />
A sejtek anabolizmusa és katabolizmusa<br />
Az anyagcsere (metabolizmus), bonyolult vegyi folyamat,<br />
amely minden élő állati és emberi sejtben<br />
szakadatlanul, éjjel-nappal végbemegy. Minden élő<br />
sejt táplálkozik: anyagokat vesz fel. Az egysejtű állat<br />
ezeket közvetlenül a környezetéből veszi fel. A sejtek<br />
milliárdjai, amelyek az emberi test különféle szöveteit<br />
és szerveit alkotják, a hajszálerek véréből kapják<br />
a szükséges anyagokat oldott vagy igen finoman elosztott<br />
állapotban. Keringő vérünk két helyen, a tüdőben<br />
és a vékonybélben pótolja a sejtek milliói által<br />
elfogyasztott anyagokat: a vér a tüdőben az oxigént,<br />
a vékonybél bolyhai útján pedig a különféle anyagok<br />
hosszú sorát veszi fel. A felvett anyagok nagyjából a<br />
következőképpen csoportosíthatók: oxigén, víz, sók,<br />
szénhidrátok, egyszerű és bonyolult zsírok, zsírszerű<br />
anyagok, lipoidok, egyszerű és összetett fehérjék, ill.<br />
egyéb szerves anyagok, amelyekből igen kis mennyiségekre<br />
van szükségünk. Ide tartoznak az enzimek, a<br />
hormonok, a vitaminok stb.<br />
Anabolikus folyamatok. Építő folyamatok: a sejt a<br />
saját testét tovább építi, nő. A felvett egyszerűbb, fajidegen<br />
anyagokból a saját fajára, egyéniségére és szöveteire<br />
jellemző bonyolultabb anyagokat készít. Az<br />
állati és az emberi sejtek asszimilációs tevékenysége<br />
sokkal kisebb mértékű, mint a növényeké. A növények<br />
a föld szervetlen anyagaiból és a levegő széndioxidjából<br />
a legbonyolultabb szerves vegyületeket<br />
képesek felépíteni, miközben az állatoknak és az em-
36 1. fejezet Bevezetés<br />
bernek a bonyolult szerves vegyületeknek legalább is<br />
az építőtégláit készen kell kapnia. Ezeket kívülről, a<br />
táplálékkal veszik fel. A fehérjemolekula pl. 20 építőtéglából<br />
(aminosavak) van összerakva, melyek sorrendjének<br />
változtatásával sok millió különféle fehérje<br />
állítható elő.<br />
Katabolikus folyamatok. A katabolizmus révén a<br />
felvett anyagokat véglegesen elhasználjuk. 1 g cukor<br />
4,1 kilokalóriát, 1 g zsír átalakulása 9,3 kilokalóriát<br />
ad. Ez az átalakulás fűti testünket és biztosítja állandó<br />
hőmérsékletünket. A katabolizmus nem csak hőt<br />
termel, de minden működésünknek energiaforrása.<br />
Ha testünket kizárólag szénhidráttal és zsírral lehetne<br />
energiával ellátni, akkor csak kétféle bontási termék<br />
volna: szénsav és víz. Az állati és az emberi testet<br />
azonban nem lehet kizárólag szénhidráttal és zsírral<br />
táplálni. Fehérje is kell hogy energiaforrásként szerepeljen.<br />
Bizonyos minimális fehérjemennyiség nélkül<br />
az ember elpusztul. A fehérjemolekulában szénen,<br />
hidrogénen, oxigénen kívül nitrogén és kén is van,<br />
valamint vannak foszfort és fémionokat is tartalmazó<br />
fehérjék is. A fehérjéket a szervezetünk nem tudja<br />
tökéletesen elbontani, a különféle fehérjebontási termékek<br />
egész sora keletkezik. Ilyen az urea, a húgysav,<br />
a kén- és foszfortartalmú vegyületek stb. Ezek mind a<br />
vesén át vizelet alakjában távoznak. 1 g fehérje fűtőértéke<br />
4,1 kg kalória, vagyis ugyanannyi, mint a szénhidráté.<br />
A bontási folyamatok végtermékeitől (szénsav,<br />
víz, vizelet-alkotórészek) a szervezetnek meg kell<br />
szabadulnia. A katabolizmus, ha nem pótoljuk az<br />
elhasznált anyagokat, a testsúly fogyására vezet. Az<br />
éhező ember napról napra veszít súlyából, soványodik.<br />
Az anabolizmus és a raktározás viszont súlynövekedéssel,<br />
erősödéssel, hízással jár.<br />
Az emberi szervezet és a fehérjék<br />
A humán genom első nyers szekvenciájának közzététele<br />
több szempontból is nagyon fontos eredmény<br />
volt. Az előzetesen vizsgált kisebb genomokhoz képest<br />
a humán genom körülbelül 25-ször nagyobb és<br />
hétszer több információt tartalmaz, mint az ezt megelőzően<br />
ismert összes genom együttvéve. A legmeglepőbb<br />
eredmény talán az, hogy a gének számát az<br />
első adatok alapján 30–40 ezerre becsülték (ma inkább<br />
20–22 ezernek tartják). Ez a szám jóval kisebb<br />
a vártnál, és mindössze kétszerese, mint amennyit<br />
a muslincában meghatároztak. Hol van hát a humán<br />
funkciók komplexitásának genetikai háttere? A<br />
komplexitás titka feltehetően nem a gének számában,<br />
hanem a gének által meghatározott fehérjék összerakási<br />
módjában van elrejtve. Feltehetően a gerincesekben<br />
és különösen az emberben igen fontos szerepet<br />
játszik a DNS-ről képződő és a fehérjék szintézisét<br />
meghatározó hírvivő RNS (mRNS) alternatív vágása.<br />
Ennek eredményeként egyetlen gén többféle fehérjét<br />
is meg tud határozni. A variálható komplexitás másik<br />
aspektusa a fehérjék doménszerkezete. A domén olyan<br />
funkcionális egység a fehérje működésében, amely<br />
egy adott funkcióhoz kapcsolható. Egy adott domén<br />
többféle fehérjében is előfordulhat, ha ezeknek a fehérjéknek<br />
van azonos jellegű funkciójuk. Az emberi<br />
fehérjék esetében körülbelül 1800 domént tételeznek<br />
fel; ez a szám közel kétszerese annak, amennyit<br />
az alacsonyabbrendűekben találtak. A doménszerkezet<br />
a fehérjék közti kölcsönhatások alapját képezi.<br />
Az egymással kapcsolódó fehérjék pedig bonyolult<br />
és magas szervezettségű információs hálózatok szerkezeti<br />
alapját adják. Hozzájárul ehhez a gének exon/<br />
intron szerkezete is (az exon a fehérjét kódoló információ,<br />
az intron kivágódik az átírás során). A nyers<br />
szekvencia adatai alapján megállapították az emberi<br />
gének exonjainak (100–200 bázispár) és intronjainak<br />
(1000–4000 bázispár) átlagos hosszát, és azt, hogy<br />
egy emberi gén átlagosan 7–9 exonból áll. Mindezek<br />
alapján a ténylegesen fehérjében megjelenő információ<br />
a genom kevesebb mint 1%-a. A viszonylag kisszámú<br />
humán gén megkönnyíti a gének funkcionális<br />
azonosítását. A cél a humán gének és fehérjék teljes<br />
körű egymáshoz rendelése. Ez az eredmény feltehetően<br />
olyan mérföldkő lesz a biológiai és orvostudományok<br />
kutatásaiban, mint amilyen óriási hatást<br />
gyakorolt a kémiai periódusos rendszer elkészítése a<br />
kémiai tudományok fejlődésére. Tudjuk majd, hogy<br />
mely szerkezeti egységekből, ill. ezek milyen kombinációjából<br />
áll a testünk. Ezek közt kell keresnünk a<br />
gyógyszerek támadáspontjait és a betegségek biológiai<br />
alapjait.
Bevezetés<br />
37<br />
A fehérjekutatás forradalma: a proteomika<br />
A proteom fogalma (protein complement to a genome)<br />
az utóbbi években vált a tudományos köztudat<br />
részévé. A proteomika a proteom, vagyis az élő<br />
szervezetben előforduló összes, szerkezetében akár<br />
a legkisebb mértékben eltérő fehérje megismerésével<br />
foglalkozó tudományterület, amely a genommal<br />
kapcsolatos kutatás mintájára, annak kiegészítőjeként<br />
jött létre, de ma már a genomikától független, önálló<br />
diszciplína.<br />
A proteomika meg kívánja ismerni a fehérjék szerkezetét,<br />
biológiai funkcióját és ezek térbeli és időbeli<br />
változását. Nem csak úgy tekinti a fehérjét, mint izolált<br />
molekulát. Figyelembe veszi a fehérje és környezete<br />
közötti kölcsönhatást. Vizsgálódási körébe tartozik<br />
a fehérje eredetének meghatározása, rendszertani<br />
besorolása, a különböző forrásból származó, de azonos<br />
biológiai funkciót ellátó proteinek szerkezetének<br />
összehasonlítása, a fehérje jelenlétének vagy hiányának<br />
igazolása egészséges, ill. patológiás körülmények<br />
között. Célja – a korszerű kémiai analitika eszközeit<br />
felhasználva – az igen kis mennyiségben, ill. koncentrációban<br />
jelen lévő fehérjék kimutatása, azonosítása,<br />
szerkezetük meghatározása; a fehérjékkel kapcsolatos<br />
ismeretek taxonómiai, szerkezeti vagy funkcionális<br />
rendszerezése, a kísérleti adatok megerősítése (validálás),<br />
valamint az így képződő adathalmazok (adatbázisok)<br />
információtartalmának elemzése. Sokak<br />
nézete szerint ide sorolhatók a proteomika módszertanával<br />
foglalkozó témakörök is (pl. nagy érzékenységű<br />
tömegspektrometriás módszerek, fluoreszcencián<br />
alapuló mikroszkópos technikák stb.). Már most jól<br />
látszik, hogy a proteomika jelentősen segíti a korszerű<br />
gyógyszerkutatást és az orvostársadalmat a mainál<br />
hatékonyabb diagnosztikai eljárások és terápiás szerek<br />
kifejlesztésében.<br />
Összefoglalás<br />
Amint azt az élő szervezetek esetében láthatjuk, a fehérjék<br />
szerepe kiemelkedő, mert önszerveződő molekuláris<br />
gépezetek építhetők belőlük. Az önszerveződés<br />
alatt azt értjük, hogy az egyes fehérjealegységek<br />
képesek felismerni egymást, meghatározott módon<br />
egymáshoz kapcsolódni, és minden külső beavatkozás<br />
nélkül létrehozni az adott szupramolekuláris<br />
struktúrát. Az élő szervezetekben található molekuláris<br />
gépezetek rendkívül változatos funkciók ellátására<br />
képesek. Találhatók közöttük molekuláris vegyi<br />
üzemek, energiaátalakítók, molekuláris motorok,<br />
biológiai jelfelismerők és jelátalakítók, információfeldolgozó<br />
rendszerek, multifunkcionális gépezetek és<br />
programvezérelt összeszerelő „gépsorok”. A bemutatott<br />
példák alapján láthatjuk, hogy a 4,5 milliárd éves<br />
földi evolúció eredményeként az élő rendszerekben<br />
található fehérjék fantasztikus dolgokra, rendkívül<br />
szerteágazó feladatok ellátására képesek. A természetes<br />
fehérjék szerkezetének vizsgálata során felismert<br />
összefüggések, törvényszerűségek, szerveződési elvek<br />
sokat segítenek abban, hogy egy fehérje szerkezetében<br />
vagy tulajdonságaiban célzott módosításokat<br />
idézhessünk elő. Könyvünkben áttekintést szeretnénk<br />
adni e szerteágazó funkciókról, különösen a sejt<br />
funkciójának szabályozásában betöltött szerepükről<br />
és egyre sokasodó diagnosztikai felhasználhatóságukról.
2. A fehérjevizsgálatok általános és alapvető<br />
módszerei – a minták előkészítése<br />
Különféle minták előkészítése<br />
Ludány Andrea<br />
Klinikai kutatólaboratóriumokban a biológiai minták<br />
sokféleségével kell szembesülnünk. Gondolnunk kell<br />
egyrészt az experimentális munkákra: így az állatkísérletekből<br />
nyert sejt-, szövet- és szervmintákra, sejtkultúrákra,<br />
másrészt pedig a klinikai, azaz betegekből<br />
nyert mintákra is, amikor rendszerint célzottan diagnosztikus<br />
markereket (pl. fehérjemolekulákat) keresünk.<br />
Napjainkban a fehérjeanalitika <strong>modern</strong> módszerei<br />
képesek tükrözni a biológiai minták fehérje-öszszetételének<br />
sokféleségét és változékonyságát (diverzitását).<br />
Azok a fehérjetérképek pl., melyeket 1975<br />
óta a nagyfelbontású kétdimenziós poliakrilamid<br />
gélelektroforézis technikával [11] kaptunk – ha érzékeny<br />
detektálási eljárással párosítottuk – kezdetben<br />
akár „zavart” is, a bőség zavarát is okozhatták. Valóban<br />
nehezítette az értékelést a fehérjék „túl nagy”<br />
száma (akár 3000 is) egyetlen nagy gélen. Több mint<br />
szükséges, mondhattuk. Másrészről viszont ennél az<br />
érzékeny technikánál szembesülhettünk azzal, hogy<br />
a helyes mintavétel, a standardizált mintakezelés elengedhetetlen<br />
az adott kérdés megválaszolásában, az<br />
eredmények reprodukálhatóságában. A kérdés megfelelő<br />
kiválasztásával és alkalmas mintakezeléssel az<br />
értékelés könnyebbé válhat.<br />
E fejezetrészben a következő vizsgálatok minta-előkészítéséről<br />
lesz szó:<br />
• Proteinek in vitro vizsgálatai.<br />
• Sejtmentes, teljes sejt, teljes szerv.<br />
• Fehérjekimutatások, mennyiségi meghatározások.<br />
Általánosságban megállapíthatjuk, hogy különböző<br />
mintatípusoknál a következő sajátságokat kell szem<br />
előtt tartanunk:<br />
• Sejtek, sejtkultúrák – szinkronizálás, kontrollált<br />
körülmények.<br />
• Szövetek – sejtösszetételükben heterogének.<br />
• Organellumok – a kinyerési módszer meghatározó.<br />
• Biológiai folyadékok – dinamikusan változóak.<br />
Az in vitro fehérjeanalíziseknél gyakran szembesülünk<br />
a következő fogalmakkal is:<br />
• A fehérjék oldékonysága (szolubilizálása).<br />
• Fehérjeprecipitáció (mint tisztítási, előfrakcionálási<br />
eljárás).<br />
• A minta integritása (a proteindegradáció veszélye).<br />
Célunk mindenképpen az lesz, hogy az in vitro vizsgálatokhoz<br />
minél egyszerűbb és hatékonyabb fehérjekivonási<br />
módszereket alkalmazzunk. Egyszerűségét<br />
és reprodukálhatóságát tekintve ilyen lenne pl. egy<br />
egylépcsős extrakciós módszer, melyet valamennyi<br />
mintára egyöntetűen alkalmazhatnánk. Természetesen<br />
ilyen univerzális módszer nem létezik. Ellenkezőleg,<br />
az irodalomban közölt ún.„standard” protokollok<br />
száma igen nagy, melyeket vagy mintatípusokra<br />
fejlesztettek ki és tovább „optimalizáltak” (pl. mikrobiológiai<br />
minták vagy emlősszövetek), vagy célzottan<br />
kérdéses fehérjék/fehérjecsoportok vizsgálatára ajánlanak<br />
(mint pl. az oldékony „citoszol”-fehérjék vagy<br />
az inszolubilis citoszkeletális sejtkomponensek).<br />
A minták előkészítése és a fehérjék oldatba vitele. A kiválasztott<br />
protokollunknál mindenképpen két vezérlő<br />
elvet helyes betartani:<br />
• A minta előkészítése (kezelése) olyan egyszerű<br />
legyen, amennyire csak lehetséges (a jó reprodukálhatóság<br />
érdekében).<br />
• Minimálisra kell csökkenteni a fehérjék in vitro<br />
módosulásait/károsodását, azaz lehetőleg meg<br />
kell tartani eredeti tulajdonságaikat.
40 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
Sejtes minták előkészítése<br />
A sejtes minták előkészítése röviden a következőkben<br />
foglalható össze:<br />
• Sejtfeltárás.<br />
• Az interferáló anyagok inaktiválása, ill. eltávolítása.<br />
• A fehérjék ezt követő szolubilizálása (oldatba<br />
vitele).<br />
A sejtek feltárása<br />
A sejtek feltárása fizikai (mechanikai) vagy kémiai<br />
(biokémiai) úton egyaránt elérhető. Ismerünk ultrahangos<br />
kezelést, ozmotikus „sejtoldást”, fagyasztás<br />
és olvasztás ciklikus ismétlését, detergens (tenzid-)<br />
kezelést, a sejtfal enzimes oldását, nagy nyomásos<br />
préseléses eljárásokat, különböző mechanikus homogenizálásokat:<br />
közelebbről forgó késes, üveg- vagy<br />
teflondugattyús és áramlásos feltárásokat. Ezek a<br />
módszerek alkalmanként egyenként is, de kombinációikban<br />
is használhatók. Mindegyiknek van előnye<br />
és hátránya is. A kezelendő minta típusa határozza<br />
meg kiválasztásukat. Típusosan pl. a baktériumok<br />
vagy növényi szövetek keményebb bánásmódot követelnek<br />
a sejtfeltáráshoz extrémen ellenálló sejtfaluk<br />
miatt, míg az emlősszövetek jóval kíméletesebb<br />
módszert igényelnek. Jóval „gyengédebb” sejtfeltárási<br />
procedúra (pl. enzimes lízis) szükséges az intakt organellumok<br />
kinyeréséhez (pl. mitokondriumok), főleg<br />
ha ezt követően proteomikai vizsgálatot akarunk<br />
végezni.<br />
Interferáló anyagok inaktiválása<br />
vagy eltávolítása<br />
A sejt lizálása alatt (és után) interferáló vegyületek<br />
szabadulnak ki a sejtekből (pl. proteolitikus enzimek,<br />
sók, lipidek, poliszacharidok, nukleinsavak és/vagy<br />
növényi fenolok). Ezeket szükséges lehet hatástalanítani<br />
vagy eltávolítani. A legjelentősebb zavaró tényező<br />
a sók és a fehérjék degradációja (proteolízis).<br />
Proteázok. A proteázok működését mindenkor gátolni<br />
kell, hogy megelőzzük a vizsgált fehérje degradációját,<br />
mely járulékos fehérjefrakciókat eredményezhet,<br />
és a nagy molekulatömegű (Mr) fehérjék<br />
mennyiségének csökkenéséhez vezet. Elméletileg<br />
egyszerűen proteázgátlók adásával célhoz tudnánk<br />
érni, de a fehérjék töltésmódosulatai miatt ilyenkor is<br />
keletkezhetnek műtermékek.<br />
Másik megoldás lenne pl. a forralás SDS-tartalmú<br />
mintapufferben, de a proteázok inaktiválása alacsony<br />
pH-n is szóba jöhetne (lásd jéghideg triklórecetsavas –<br />
TCA-s – fehérjekicsapás).<br />
Sajnos igaz, hogy nem könnyű valamennyi fehérjebontó<br />
enzimet egyidejűleg és teljesen hatástalanítani.<br />
Az ismertetett megoldások közül a TCA-s kicsapás<br />
valóban minimalizálja a fehérjék degradációját, egyidejűleg<br />
eltávolítja az interferáló vegyületeket, végül<br />
a csapadékban a teljes sejtlizátum alkalikus fehérjéi<br />
fel is dúsulhatnak (pl. riboszómafehérjék, [3, 4]).<br />
Számolni kell azonban azzal a fehérjeveszteséggel,<br />
amit az inkomplett precipitáció és az újraoldás eredményez.<br />
Ha a TCA-kezelt és nem kezelt sejtminták<br />
fehérjetérképeit összevetjük, a különbségek szembeötlők.<br />
Sóval szennyeződés. A sejtminták sókkal történő<br />
szennyeződése lehet a másik igen gyakori probléma.<br />
Ismert, hogy az ionok (sók) jelenléte lerontja az elektroforetikus<br />
és az izoelektromos fokuszálásos elválasztások<br />
hatékonyságát. Extrém nagy sókoncentráció-értékeknél<br />
(>100 mM) a minta fehérjéi akár ki is<br />
csapódhatnak. A sók eltávolításának klasszikus módjaként<br />
a dialízis kínálkozik, de elérhetjük a médium<br />
(puffer) cseréjét ultrafiltrációs kamrában is (nitrogéntúlnyomás<br />
alatt), és sótlaníthatjuk fehérjemintáinkat<br />
akár elektroforézissel is. Ilyenkor kezdeti alacsony feszültségen<br />
(100 V) „kivándoroltatjuk” a rendszerből<br />
az ionokat. (Számos protokollnál példát találhatunk<br />
erre az irodalomban.)<br />
A dialízishez a kereskedelmi forgalomban kapható<br />
membránok garantált pórusmérettel rendelkeznek.<br />
Megfelelő kezeléssel és duzzasztással aktiválhatók,<br />
és akár ismételten újra használhatók. Ha a mintánk<br />
a dialízist követően sűrítésre, azaz koncentrálásra kerül,<br />
ajánlatos olyan illékony pufferelegyet alkalmazni<br />
a sómentesítéshez (pl. ammónium-bikarbonátot),<br />
amely később pl. a liofilizáláskor akadálytalanul eltávolítható.<br />
Lipidek. A lipidek mint interferáló molekulák eltávolítására<br />
– különösen az olyan lipidekben gazdag<br />
biológiai mintánál, mint az agyszövet – organikus
Különféle minták előkészítése<br />
41<br />
oldószeres extrakció is szóba jöhet. A hideg alkoholos<br />
vagy acetonos extrakcióknál azonban jelentős fehérjevesztést<br />
észleltek: egyrészt bizonyos fehérjék szolvensbe<br />
kikerülése miatt, másrészt a delipidált anyag<br />
nem teljes újraoldódása miatt. Alternatív megoldásként<br />
a feltárt szövet vagy biológiai minta lipidmentesítését<br />
ultracentrifugálással lehet elvégezni, amikor<br />
is a flotálódott, azaz a nem ülepedő lipidréteg a minta<br />
felszínéről egyszerűen eltávolítható (pl. „Air-fuge”<br />
centrifugák használata a rutin klinikai laboratóriumokban<br />
a szérumminták delipidálásához).<br />
Poliszacharidok és nukleinsavak. A poliszacharidok<br />
(különösen, ha töltéssel rendelkeznek) és a nukleinsavak<br />
kölcsönhatásba lépnek a fehérjékkel, és ezek az<br />
összetett makromolekulák az oldatok viszkozitását<br />
jelentősen megnövelve zavarhatják a fehérjevizsgálatokat<br />
(gélpórusok eltömítése stb.). Hacsak nem igen<br />
kis koncentrációban vannak jelen, eltávolításuk javasolt.<br />
A már említett TCA-s fehérjekicsapás – számolva<br />
a fehérjeveszteséggel – itt is szóba jöhet.<br />
A nukleinsavak esetében proteázmentes RNS-áz<br />
vagy DNS-áz kezelést, ill. bázikus poliamin addíciót<br />
(pl. spermin) és ultracentrifugálást lehet az irodalom<br />
szerint alkalmazni [13].<br />
Fenolok. A növényekben, különösen a növényi levelekben<br />
jelen lévő fenolok a fehérjékkel kölcsönhatásban<br />
zavarhatják a 2D elektroforézis gélek fehérjetérképét.<br />
Ajánlott a polifenol vegyületeket vízben<br />
nem oldódó (inszolubilis) polivinilpolipirolidonhoz<br />
(PVPP) kötni.<br />
Fehérjék. Végül a mintában nagy mennyiségben<br />
(túlsúlyban) „ballasztként” jelen lévő fehérjék zavarhatják<br />
a kisebb koncentrációban jelen lévő fehérjék<br />
vizsgálatát. Más szóval egyszerűen elfedhetik a számunkra<br />
érdekes és kérdéses fehérjefrakciókat. Közismerten<br />
ilyen az albumin, amely a plazmafehérjék<br />
60%-át képviseli a vérplazmában. Eltávolítására a<br />
kereskedelemben albuminmentesítő kitek kaphatók.<br />
Használatuk azért int óvatosságra, mert a nem specifikus<br />
kötésen alapuló módszer más fehérjéket is eltávolíthat<br />
a mintánkból [15]. Magunknak egyébként<br />
a blue-dextránnal volt kétségtelenül pozitív tapasztalatunk,<br />
amelynek hatása az albumin festékkötési affinitásán<br />
alapszik.<br />
A fehérjék szolubilizálása (oldatba vitele)<br />
A sejtfeltárást és az interferáló anyagok eltávolítását<br />
követően a mintafehérjék híg pufferoldatban szolubilizálhatók.<br />
A fehérjefunkciók megtartása kíméletes<br />
eljárást feltételez, általában enyhén alkalikus közegben,<br />
az intakt fehérjekomplexek szolubilizálása mellett.<br />
Az individuális polipeptidláncok vizsgálatához a<br />
fehérjéket denaturálják, az intra- és intermolekuláris<br />
kölcsönhatásokat minimalizálják, miközben az eredeti<br />
töltésviszonyokat igyekeznek megtartani.<br />
A nem denaturáló pufferhez denzitásnövelés céljából<br />
glicerint vagy szacharózt adhatunk, és nem ionos<br />
detergensekkel növeljük az oldékonyságot és a<br />
fehérjemolekulák diszpergálását. A kalcium- és magnéziumdependens<br />
proteázok hatásának tompítására<br />
EDTA vagy EGTA jelenléte szolgál.<br />
A denaturáló szolubilizáló rendszerek kaotróp<br />
anyagokat (urea és/vagy tiourea) tartalmaznak, redukálószerekkel<br />
(ditiotreitol és/vagy b-merkaptoetanol)<br />
adjuválhatók, valamint különböző ionos és nem ionos<br />
detergensekkel egészülnek ki.<br />
Kaotróp anyagok. A kaotróp anyagok, pl. az urea hatékony<br />
szer a hidrogénhidak felbontására, és a fehérjék<br />
kitekeredéséhez (unfolding), végül is denaturációhoz<br />
vezet. A tiourea még hatékonyabb a hidrofób<br />
interakciók megszüntetésére, de szemben az ureával,<br />
nehezen oldódik vízben. A legjobb megoldás az extrém<br />
hidrofób fehérjék oldására az a kompromisszum,<br />
hogy 5–7 M ureát és 2 M tioureát kombinálnak megfelelő<br />
detergenssel az oldatban. Ureás oldatban a fehérjék<br />
karbamilációjára mindig gondolnunk kell. Ennek<br />
elkerülésére az oldat hőmérsékletét 37 °C fölé nem<br />
szabad emelni. A karbamiláció mértéke az általában<br />
ajánlott 24 órás periódus alatt – mely a legtöbb szolubilizációs<br />
protokoll időtartama – elhanyagolható. Az<br />
elektroforézis során az urea bomlástermékei eltávoznak<br />
a rendszerből.<br />
Detergensek (felületaktív anyagok). Ionos és nem<br />
ionos detergensek széles körben elterjedtek a fehérjeanalitikában.<br />
Hatásuk a hidrofób kölcsönhatások megszüntetésében,<br />
az aggregáció és precipitáció okozta fehérjeveszteségek<br />
prevenciójában jelentkezik.<br />
Az anionos detergensek között az SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát)<br />
tartják az egyik leghatékonyabb
42 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
szolubilizáló ágensnek, különösen ha az oldatot felforraljuk.<br />
A nem ionos detergensek közül az NP-40-et<br />
és a Triton X-100-at kell megemlítenünk, melyek<br />
igaz, elmaradnak az SDS hatékonyságától, de számos<br />
más előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. Az extrém<br />
hidrofób fehérjék vizsgálatához (pl. membránkomponensek)<br />
az ikerionos detergensek, mint a CHAPS<br />
vagy a szulfobetainok (SB 3-10, ASB 14) ajánlottak<br />
[10, 14]. E felületaktív anyagok használata különösen<br />
a korábban említett kaotróp ágensekkel (urea, tiourea)<br />
párosítva jár sikerrel.<br />
A detergensek esetében is igaz, hogy univerzális<br />
recept nem adható meg valamennyi biológiai mintára.<br />
Esetenként empirikusan kell az optimális módszert<br />
kidolgoznunk a detergensek kölönböző fajtáinak<br />
kombinációját párosítva egyéb adjuvánsokkal,<br />
pufferekkel, akár organikus oldószerekkel.<br />
A megfelelő detergens kiválasztásakor figyelembe<br />
kell vennünk a kritikus micelláris koncentrációt<br />
(CMC), a nem ionos detergensek jellemzésére<br />
használt lipofil/hidrofil balansz/egyensúlyi adatot<br />
(HLB-érték: 1–20) és a detergenshatást befolyásoló<br />
egyéb faktorokat (hőmérséklet/CMT érték, ellenionok,<br />
sók, szennyeződések, kaotróp anyagok stb.).<br />
A fogalmak tisztázására egyrészt kémia, biokémia<br />
tankönyvek szolgálhatnak, a detergensek számszerűsített<br />
jellemzőinek pedig vegyszerkatalógusokban<br />
ajánlott utánanézni.<br />
Redukálószerek. A minta-előkészítés folyamatában<br />
kritikus lépést jelenthet a redukció és a diszulfidkötések<br />
újraképződésének megakadályozása. A redukcióval<br />
a molekulán belüli és a molekulák közötti diszulfidhidak<br />
felszakítása és a fehérjék teljes „kitekeredése”<br />
(unfoldingja) érhető el. A leggyakrabban használt redukálószerek<br />
– a ditiotreitol (DTT) és a ditioeritriol<br />
(DTE) – vízben jól oldódnak, így nagy feleslegben<br />
alkalmazhatók. Hátrányuk, hogy nem minden fehérjénél<br />
hatékonyak, így a nagy ciszteintartalmú gyapjúkeratin<br />
esetében helyettük a kevésbé oldékony és toxikus<br />
tributilfoszfint (TBP) ajánlják.<br />
A vizsgálandó fehérjék koncentrációja. Fehérjeminták<br />
analíziséhez 5–10 mg/ml fehérjekoncentráció az<br />
ideális. Túl csekély koncentrációnál (< 0,1 mg/ml) a<br />
minta fehérjetartalma hozzátapad a kémcső, pipetta<br />
vagy laboratóriumi edény falához, tovább növelve a<br />
nem kívánt veszteséget. Híg fehérjeoldatoknál – ha<br />
2-1. ábra. Kötött és szabad anyagok elválasztása ultraszűréssel.<br />
Az Amicon ultrafiltrációs elválasztás vázlatos ábrázolása.<br />
A technika a minta-előkészítés tekintetében az<br />
egyik legkíméletesebb eljárás<br />
nagy a sókoncentráció – „sótalanítás” szükséges, amit<br />
a fehérjék koncentrálásával kapcsolhatunk össze. Ultraszűréssel<br />
a fehérjéket károsodás nélkül egyidejűleg<br />
lehet sómentesíteni és dúsítani is (2-1. ábra).<br />
A fizikai-kémiai fehérjekicsapásos eljárások (szerves<br />
oldószerekkel, pl. alkohollal, savas, pl. TCA-s,<br />
hőkezeléssel stb.) célravezetők lehetnek, de mindig<br />
felvetődik a natív fehérjék károsodásának veszélye.<br />
Illékony pufferoldatokkal (ammónium-bikarbonát)<br />
végzett dialízis liofilezéssel (fagyasztva szárítással)<br />
párosítva is ajánlott megoldás. Kis pórusátmérőjű<br />
ultraszűrő membránok alkalmazásával a fehérjeoldat<br />
szintén koncentrálható, ill. különböző áteresztőképességű<br />
(cut-off) membránok segítségével akár frakcionálható<br />
is.<br />
A minták tárolása<br />
Rövid ideig – néhány órás vagy éjszakán át való várakozásnál<br />
– elegendő a mintákat hűtőben 4 °C-on tartani.<br />
Hosszabb időre a minták fagyasztóban (–70 °C),<br />
száraz jégben (–78 °C) vagy folyékony nitrogénben<br />
(–196 °C) tárolhatók.<br />
Ismételt fagyasztás és olvasztás mindig kerülendő.<br />
Többszöri felhasználáshoz a mintát célszerű<br />
100–200 µl-es adagokban szétosztva tárolni.<br />
A minták előfrakcionálása az analízisekhez<br />
Tekintettel a biológiai minták fehérjetartalmának<br />
összetettségére és dinamikus változékonyságára, előfrakcionálási<br />
lépés(ek) közbeiktatása gyakran ajánlott.<br />
Ezzel a lépéssel a közvetlen analízisre kerülő
Különféle minták előkészítése<br />
43<br />
szubfrakciók komplexitása mérséklődik, és a vele járó<br />
dúsulással a diszkrét fehérjefrakciók is detektálhatóvá<br />
válnak.<br />
Néhány példa a minta típusától és a vizsgálatok<br />
céljától függő előfrakcionálásra:<br />
• Specifikus sejtek izolálása szövetből pl. FACS<br />
technikával (fluorescence activated cell sorting)<br />
vagy lézer-mikrodisszekcióval (LCM laser capture<br />
microdissection).<br />
• Sejtkompartmentek és/vagy organellumok izolálása<br />
pl. szacharóz-gradiens centrifugálással.<br />
• Szelektív fehérjecsoportok kicsapása (pl. riboszómafehérjék<br />
TCA/aceton kezelése).<br />
• Lépcsőzetes extrakciós eljárások növekvő oldékonyság<br />
alapján (vizes pufferek, organikus oldószerek,<br />
detergens alapú extrakciós oldatok).<br />
• Kromatográfiás vagy elektroforetikus elválasztási<br />
módszerek (gélszűréses, ioncserés oszlopkromatográfia,<br />
affinitásos tisztítási eljárások,<br />
preparatív izoelektromos fokuszálás stb.) (2-2.,<br />
2-3. ábra).<br />
Mindig nagy probléma a rendszerint rendkívül heterogén<br />
emlősszövetből (pl. rákbetegség esetén) a további<br />
vizsgálatra kerülő célsejteket megfelelő menynyiségben<br />
kinyerni. Nagyszámú metszet készítésével<br />
az LCM (lézer-mikrodisszekció) technika révén tiszta<br />
sejtpopulációhoz lehet jutni, mely tovább analizálható<br />
2D elektroforetikus eljárással. Az LMC hátránya<br />
munka- és időigényessége. Másik lehetőség a FACS<br />
(fluorescent activated cell sorting) technika, mely antitestkötés<br />
alapján nyeri ki a specifikus célsejteket, azaz<br />
a kívánt szöveti szubpopulációt [12]. A sejtszeparálási<br />
eljárások közül a vér alakos elemei vizsgálatában a<br />
Fikoll-gradiens és centrifugálás együttes alkalmazása<br />
látszik a legkönnyebben elérhetőnek.<br />
Az organellumok (pl. mitokondriumok) izolálására<br />
leghatékonyabb módszer a növekvő sűrűségű<br />
cukoroldatban való ún. gradiens-centrifugálás. Az eljárás<br />
egyik hagyományos változatának tekinthető a<br />
differenciálcentrifugálás [7]. Ilyenkor pufferolt cukoroldatban<br />
egy- és kétértékű kationok jelenlétében a kíméletesen<br />
homogenizált szövetmintát lépcsőzetesen<br />
kiülepítjük, és a sejtorganellumokat, azaz a sejtmagot,<br />
a mitokondriumokat, a mikroszóma- és a citoszolfrakciókat<br />
elválasztjuk.<br />
Szemben a humán és az állati sejtekkel, ahol a sejtfelszíni<br />
struktúrák könnyen megbonthatók, a mikroorganizmusok<br />
esetében a rendkívül ellenálló sejtfal<br />
miatt bonyolultabb eljáráshoz kell folyamodni,<br />
2-2. ábra. Cinkkötő fehérjék gélkromatográfiás előfrakcionálása<br />
(Sephadex G-75, minta: patkánymájsejt-citoszol)<br />
2.-3. ábra. Gélszűréses frakciók (Sephadex G-75 I., II., III.,<br />
1D elektroforetikus) nem denaturáló PAGE képe. A nem<br />
denaturáló alkalikus gélek az előző ábra frakcióinak elektroforetikus<br />
fehérjemegoszlását hasonlítják össze (a detektáláshoz<br />
amidofekete-festést használtak, 100 µg/gélrúd<br />
proteinmennyiségekkel)
44 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
ugyanakkor a kinyert organellumok épségét is óvni<br />
kell. Élesztősejtek mitokondriumainak izolálásához<br />
a sejtfal poliszacharidbontó enzimes kezelését követően<br />
a sejttartalmat hipotóniás oldattal és/vagy kíméletes<br />
mechanikus úton nyerik ki [9, 18].<br />
A teljes sejtlizátumok analízise nem vezet eredményre<br />
az egyes fehérjék célzott vizsgálatakor. Az<br />
analitikai eljárás kapacitása, felbontóképessége limitálja<br />
a vizsgálandó protein mennyiségét. Ennek<br />
áthidalására ajánlott a fejezetünkben már többször<br />
említett precipitációs (TCA/aceton) eljárás, amelynek<br />
számos előnyét hangsúlyoztuk. Az alkalikus fehérjék<br />
dúsítása, azaz az analizálandó proteinek mennyiségének<br />
növelése ebben az esetben együtt jár a nem kívánt<br />
proteolitikus hatások kiküszöbölésével és az interferáló<br />
vegyületek eltávolításával.<br />
A sejtek és a szövetek lépcsőzetes extrakciója elérhető<br />
a fehérjék oldékonysága alapján. Végső soron<br />
ide tartoznak a lépcsőzetes kisózási eljárások (ammónium-szulfát),<br />
organikus oldószerként az alkoholos<br />
frakcionált kicsapások (Cohn-frakcionálás/albumin),<br />
ureakezelések (pl. szérum alkalikus foszfatáz<br />
izoenzim vizsgálatok) a hidrofób fehérjék vizsgálatában<br />
(membránfehérjék), de a hőkezelések is a hőstabil<br />
és hőrezisztens fehérjecsoportok szeparálására (pl.<br />
tropomiozinkinyerés vérlemezkékből).<br />
Itt kell megemlítenünk a nem ionos detergensek<br />
használatát a sejtfrakcionálásban. A detergensrezisztens<br />
sejtfrakció a citoszkeleton felfedezéséhez<br />
vezetett. Számos sejtfunkció vizsgálata a detergens<br />
szolubilis, az ún. lazán kötött fehérjék és a citoszkeletonfehérjék<br />
dinamikusan változó kölcsönhatásához<br />
kapcsolódik.<br />
A különböző kromatográfiás eljárások hatékony<br />
eszközei lehetnek az előfrakcionálásnak. A frakciók<br />
közötti keresztszennyeződések itt kevésbé érvényesülnek,<br />
mint általában az említett extrakciós módszerekben.<br />
Megfelelő detektálások kombinációival,<br />
kíméletes körülmények között értékes, a további<br />
analízisekre minőségben és mennyiségben optimális<br />
mintákat kaphatunk.<br />
A gélszűrés elvén (azaz a molekulaméreten) alapuló,<br />
valamint az ioncserélő kromatográfiás elválasztásokat<br />
kihasználó (kation- és anioncserélő oszlopok)<br />
és az affinitásos (ligandkötésen alapuló) elválasztási<br />
technikák a preparatív laboratóriumi munkák során<br />
egyaránt felhasználásra kerülhetnek. A nem denaturáló<br />
rendszerek különösen előnyösek lehetnek<br />
a fehérjék biológiai aktivitásának megőrzésében.<br />
Dextrán-, akril-, agaróz-, poliakrilamidgél alapú elválasztási<br />
rendszerek egyaránt ismertek. A fehérjefrakciók<br />
elválasztásának követésére alkalmas módszerek<br />
a spektrofotometria, az enzimaktivitás mérése,<br />
az izotópaktivitás, valamint a kemilumineszcenciás<br />
detektálás (lásd 2-2., 2-3. ábra).<br />
További lehetőség fehérjék csoportjainak izolálására<br />
és dúsítására az egy- és kétdimenziós elektroforézis<br />
technikák. Fehérjekomplexek vizsgálatában alkalmaztuk<br />
magunk is, a következők szerint:<br />
• Cink/fehérje komplexeket vizsgáltunk. Az előzetes<br />
feltáró/elválasztó eljárásokhoz (homogenizálás,<br />
centrifugálás, dialízis, ultraszűrés, gélszűrés)<br />
csatoltan végül – mintegy befejező<br />
lépésként – nem denaturáló gélben végeztük a<br />
natív fehérjekomplexek elegyének vizsgálatát. E<br />
frakciókban a komplexek funkciója rendszerint<br />
megtartott. Ha viszont 2D elektroforézissel folytattuk<br />
az elválasztást denaturáló jellegű lapgélen,<br />
az első dimenziós natív fehérjekomplexek<br />
összetételéről (pl. alegységeiről) kaphattunk<br />
információt.<br />
• Nagyobb fehérjefelbontást akkor értünk el mintáinkban,<br />
ha az első dimenziós frakcionálásra<br />
izoelektromos fokuszálással és denaturáló rendszerben<br />
került sor. Széles, 1–11 pH-tartományban<br />
ún. preparatív IEF gélben előfrakcionáltunk.<br />
Majd befejezésül az O’Farrell által bevezetett<br />
és jól ismert nagy feloldású kétdimenziós<br />
poliakrilamid gélelektroforézissel fehérjetérképet<br />
készítettünk. A térkép készítésekor – analitikai<br />
célból – már nem széles, hanem keskeny<br />
pH-tartományt használtunk a nagyobb felbontás<br />
elérésére. Immunkémiai detektálást alkalmazva<br />
vagy tömegspektrometriás (MS) mérésekkel<br />
kombinálva (MS-kompatibilis jelöléssel!)<br />
a fehérjefrakciók azonosításához juthatunk<br />
(lásd proteomika).<br />
Összefoglalásként megállapítható, hogy az előfrakcionálási<br />
eljárások sok előnnyel rendelkeznek, melyek<br />
közül a fehérjék dúsítása és a diszkrét fehérjefrakciók<br />
megjelenítése kiemelendő. Hátrányuk lehet viszont<br />
az individuális frakciók keresztszennyeződése,<br />
a munka- és időigényesség, amit tovább növel az a<br />
tény, hogy a kromatográfiás és a hígítási folyamatok<br />
miatt rendszerint mintakoncentrálás szükséges. Vé-
Különféle minták előkészítése<br />
45<br />
gül megjegyezzük, hogy az egyedi mintakezelések<br />
miatt csak néhány minta egyidejű párhuzamos kezelése<br />
lehetséges.<br />
Eljárások (protokollok) [6]<br />
Sejt- és szöveti minták extrakciója<br />
és szolubilizációja<br />
Fejezetünk további részében néhány konkrét eljárást<br />
ismertetünk kivonatosan, rövid összefoglalások formájában.<br />
Az összeállítás választási lehetőséget kínál<br />
az igen különböző biológiai minták analízisében. A<br />
rövid leírások mikroorganizmusok, növényi magvak<br />
és emlősszövetek extrakciós és szolubilizációs kezeléseiről<br />
egyaránt szólnak. A procedúra általában a<br />
sejtek és a szövetek mechanikus roncsolásával (feltárásával)<br />
kezdődik, és ez alatt vagy ezt követően a<br />
sejteket lizálják, majd az interferáló anyagokat vagy<br />
közömbösítik, vagy eltávolítják. A proteineket ureaés<br />
detergenstartalmú lízispufferben oldják ultrahangkezelés<br />
mellett. Az ajánlott mintamennyiség 5 × 10 8<br />
sejtszám, 50 mg máj- vagy szívszövet, az optimális<br />
fehérjekoncentráció 5–10 mg/ml.<br />
A fehérjék szolubilizációját követően az ureatartalmú<br />
extraktumokat 10 000 g-vel 15 °C-on egy órán át<br />
centrifugálják az oldhatatlan sejttörmelékek kiülepítésére.<br />
Az SDS-tartalmú minták mind alacsony, mind<br />
magasabb hőmérsékleten (4–37 °C között) centrifugálhatók.<br />
Az IEF-szeparálás előtt a fehérjekivonatot<br />
célszerű a detergenstől megszabadítani (pl. a fehérjék<br />
kicsapásával).<br />
A proteinkivonatok közvetlenül használhatók,<br />
vagy több hónapig –70 °C-on tárolhatók. A 2D-PA-<br />
GE-elektroforézisekhez analitikai céllal 50–100 µg<br />
protein, preparatív munkáknál 0,5–1,0 mg is futtatható.<br />
Reagensek, mintapufferek<br />
• Ureatartalmú lízispuffer denaturáló IEF-hez: 9,5<br />
M urea, 1% ditiotreitol, 2% nem ionos detergens,<br />
2% Ampholine (pH 3–10), 10 mM proteázgátló.<br />
• Tiourea/urea lízispuffer rezisztens fehérjék denaturáló<br />
kezelésére: 2 M tiourea, 7 M urea, 4%<br />
CHAPS (ikerionos detergens), 1% redukálószer,<br />
2% Ampholine (pH 3–10), 10 mM proteázgátló.<br />
• SDS-tartalmú mintapuffer: 1% SDS, 100 mM<br />
TRIS-HCl puffer (pH 9,5).<br />
• Precipitáló reagens: 20% TCA + 0,2% ditiotreitol<br />
jéghideg acetonban (–20 °C).<br />
• Precipitátum mosáshoz: 0,2% ditiotreitol jéghideg<br />
acetonban (–20 °C).<br />
• Pufferolt sóoldat (PBS): 0,9%-os NaCl-oldat 10<br />
mM foszfátpufferben (pH 7,4).<br />
Fontos megjegyzések: Az ureatartalmú oldatokat nem<br />
szabad hőkezelni a fehérjék karbamilációja miatt. Az<br />
Ampholine-tartalmú lízispufferek „romlandók”, elkészítésüket<br />
követően 1 ml-es adagokban mélyhűtve,<br />
fagyasztva tárolandók (–70 °C).<br />
Mikroorganizmusok. A mikrobiológiai sejtkultúrák,<br />
mint a baktériumok vagy a gombák tenyésztése optimalizálást<br />
és standardizálást igényel. Mivel a növekedési<br />
fázis nagymértékben függ a sejtek biokémiai<br />
állapotától, a minták összegyűjtését előre kigondoltan<br />
és standardizáltan kell elvégezni. A sejtek proteázokat<br />
és más extracelluláris enzimeket választanak<br />
ki a szövetkultúra médiumába, és ezek a molekulák<br />
interferálnak az extrakcióval. Ezen anyagoktól meg<br />
kell szabadulni, mert károsítják a vizsgálandó fehérjéket,<br />
csökkentve a kinyerés hatásfokát. A kultúrát<br />
ezért izotóniás pufferoldattal (pl. PBS) vagy szacharózoldattal<br />
kell átmosni. Hogy stresszhatást ne okozzunk,<br />
a mosópuffernek azonos hőmérsékletűnek és<br />
pH-értékűnek kell lennie, mint a médium [2]. A mosási<br />
lépés ugyanolyan körülményeket biztosít a sejtek<br />
számára, mint amelyek a mintagyűjtést megelőzően<br />
voltak a kultúrában.<br />
A sejtfallal körülvett sejtek, pl. a gombák ozmotikusan<br />
sokkal eredményesen nem extrahálhatók. Az<br />
ilyen sejteknél erőteljes roncsolásra van szükség: ez<br />
vagy mechanikusan, pl. üveggyöngyös rázással, urea/<br />
tiourea tartalmú lízispufferben (jégfürdőben) való<br />
ultrahangos kezeléssel vagy SDS jelenlétében melegítéssel<br />
érhető el. Ha szükséges, proteázmentes DNS-áz<br />
és RNS-áz adható a nukleinsavak emésztésére.<br />
A bakteriális fehérjék szolubilizációja. A sejtek öszszegyűjtésére<br />
előre meghatározott növekedési fázisban<br />
és tenyésztési körülmények között kerül sor.<br />
Hacsak lehet, kémiailag jól defineált médium a kísérleteknél<br />
előnyös lehet. Nagy optikai denzitás esetén<br />
számításba kell venni, hogy ilyenkor sok halott sejt
46 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
kerülhet az analízisbe. Mintagyűjtésre ezért a korai<br />
logaritmusos növekedési fázis ajánlott, mert akkor<br />
még túlnyomórészt élő sejtek kerülnek feldolgozásra.<br />
1. A sejtek centrifugálása 3 percig 10 000 g-vel végezhető.<br />
Ez az ülepítés a legtöbb baktériumtípus<br />
számára elegendő. Az indítás meghatározott térfogattal<br />
kezdődik: pl. 10 ml 0,5 optikai denzitású kultúra.<br />
Az üledéknek ebben az esetben jól láthatónak<br />
kell lennie. Azonos térfogatú előmelegített PBS-sel<br />
reszuszpendálás következik, majd ismételt centrifugálás.<br />
A kívánt tisztaságú és interferáló molekuláktól<br />
mentes vizsálati minta nyeréséhez többszöri<br />
mosás és centrifugálás szükséges.<br />
Megjegyzés: Ha az extracelluláris proteolitikus<br />
enzimek eltávolítása mégsem teljes, a fehérjetérképen<br />
a nagy molekulatömegű fehérjék eltűnnek;<br />
míg horizontális csíkok vagy fehérjeprecipitátumok<br />
megjelenése a minta nagy sókoncentrációjára<br />
utal.<br />
2. Az üledéket 0,2 ml SDS-tartalmú szolubilizáló lízispufferben<br />
szuszpendáljuk. A puffer vagy jéghideg<br />
legyen, vagy aktív proteázok esetén 95 °C-ra<br />
hevítés szükséges.<br />
3. Következik a minta ultrahangos homogenizálása.<br />
4. A roncsolt és feltárt sejteket mikrocentrifugában<br />
14 000 g-vel 30 percig 4 °C-on ülepítjük.<br />
5. A felülúszót óvatosan leszívjuk, majd 50-50 µl-es<br />
adagokban –70 °C-on tároljuk. Az extraktumok<br />
felengedés és ismételt fagyasztás nélkül egy évig<br />
stabilak.<br />
6. Izoelektromos fokuszáláshoz az SDS-sel kezelt fehérjemintákat<br />
150 µl tiourea/urea lízispufferrel hígítjuk<br />
a detergens leszorítására.<br />
Emlősszövetminták. Az emlősszöveti mintákat (állati<br />
szövetek, szöveti biopsziák stb.) kivétel után azonnal<br />
le kell fagyasztani (pl. folyékony nitrogén alatt<br />
–196 °C-on). Kisebb minták fagyasztás/felolvasztás<br />
eljárással, nagyobb szövetdarabok késes homogenizálás<br />
után lízispufferben való szolubilizálással tárhatók<br />
fel.<br />
Egérmájfehérjék szolubilizálása:<br />
1. A lefagyasztott májszövetet erőteljes hűtés mellett<br />
homogenizáljuk proteinázgátló jelenlétében.<br />
2. A homogenizálást követően 60 mg anyagot azonna1<br />
1,0 ml lízispuffert tartalmazó mikrocentrifugacsőbe<br />
mérünk.<br />
3. A hatékony sejtlízis érdekében 5 × 2 másodperces<br />
(10 mp szünetekkel) ultrahangkezelést végzünk.<br />
30 perc szobahőmérsékleten való inkubációt követően<br />
40 000 g-vel 60 percig 15 °C-on centrifugálunk.<br />
4. A szupernatánst –70 °C-on tároljuk. Az extraktum<br />
fehérjekoncentrációja ideális esetben 5–10 mg/ml<br />
legyen.<br />
Megjegyzés: A teljes máj eltávolítása esetén a<br />
további analízisek szempontjából ajánlott a teljes<br />
szerv perfúziója vértelenítés céljából. Pufferolt szacharózoldat<br />
a portalis vénán keresztül általunk is<br />
kipróbált előnyös beavatkozás lehet.<br />
Alkalikus fehérjék dúsítása egérmájszövetben TCA/<br />
aceton kicsapással:<br />
1. Mélyhűtött egérmáj-homogenizátum a kiindulási<br />
anyag.<br />
2. 100 mg alapanyagot egy előhűtött (–20 °C), 25 ml<br />
acetonban oldott 20% TCA-t (triklórecetsavat) és<br />
0,2% ditiotreitolt (DTT) tartalmazó centrifugacsőben<br />
felszuszpendálunk.<br />
3. A centrifugacsövet –20 °C-on tartjuk a fehérjék<br />
komplett kicsapása érdekében. 40 000 g-vel 60 percig<br />
–10 °C-on centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük.<br />
Az üledéket 20 ml 0,2% DTT-t tartalmazó jéghideg<br />
acetonban reszuszpendáljuk.<br />
4. Ismételt centrifugálás következik, majd az üledéket<br />
vákuum alatt szárítjuk. A mintákat ismételt vortex-kezeléssel/vagy<br />
ultrahanggal oldjuk megfelelő<br />
térfogatú (2-3 ml) lízispufferben. A fehérjeoldat<br />
koncentrációja 5–10 mg/ml tartományban legyen.<br />
Kis mennyiségekben szétosztva –70 °C-on tároljuk.<br />
Megjegyzés: A fehérjeüledéket vákuumos szárítás<br />
nélkül direkt oldhatjuk a lízispufferben.<br />
Növény minták<br />
A száraz növényi magvakat, amelyekben a proteázok<br />
rendszerint nem aktívak, egyszerűen összetörjük.<br />
A növényi szövetet ezt követően lízispufferben oldjuk,<br />
centrifugáljuk és szétosztjuk [16, 17].<br />
Megjegyzés: Specifikus fehérjefrakciók kivonása<br />
érdekében ezeknél a mintáknál is végezhetünk előfrakcionálást<br />
az analízisek előtt. Ilyen pl. a vízben oldódó<br />
fehérjék (albumin) kivonása, vagy az alkoholban<br />
oldható fehérjék (gliadinok) elválasztása.<br />
Növények levelei nem csak fehérjebontó enzime-
Különféle minták előkészítése<br />
47<br />
ket, hanem fenolokat is tartalmaznak igen nagy koncentrációban,<br />
amelyek proteineket adszorbeálnak,<br />
és csíkozottságot okoznak a kétdimenziós (2D) géltérképeken.<br />
Ezt a zavaró hatást elkerülendő, itt is a<br />
májszövetnél leírtakhoz hasonlóan járunk el. A sejteket<br />
egy mozsárban szétroncsoljuk, a fehérjéket 20%<br />
TCA-t tartalmazó jéghideg acetonban kicsapjuk. Az<br />
üledéket kétszer –20 °C-os acetonnal mossuk a növényi<br />
fenolok eltávolítására, a végső üledéket szárítjuk<br />
és lízispufferben oldjuk.<br />
Az interferáló vegyületek eltávolítása<br />
a mintákból<br />
A mintaelőkészítés során számos zavaró komponens<br />
kerülhet az analizálandó mintába, melyektől meg kell<br />
szabadulni. Ezek lehetnek módosult fehérjék, fehérje<br />
és nem fehérje természetű szennyezések, sejtes elemek,<br />
nukleinsavak stb. Ha pl. a proteomikai vizsgálat<br />
alapját képező fehérjetérképeket szándékozunk készíteni,<br />
a 2D gélben látható műtermékek, zavaró festődő<br />
sávozottság, elmosódott frakcionálás teszi néha lehetetlenné<br />
az értékelést.<br />
A leggyakoribb interferáló mintaösszetevők és az<br />
eltávolításukra javasolt leginkább használatos egyszerű<br />
módszerek a következők lehetnek:<br />
• Töltéssel rendelkező molekulák. Ezek lehetnek<br />
sók (pl. NaCl, KCl), puffer komponensek (pl.<br />
TRIS, PBS) és töltéssel rendelkező egyéb molekulák,<br />
mint pl. nukleotidok. Az izoelektromos<br />
fokuszálások szerény felbontásának ez az egyik<br />
leggyakoribb oka. A sók és a töltéssel rendelkező<br />
molekulák ugyanis megnyújtják a fokuszálási<br />
időt, azaz a fehérjék csak akkor érik el az izoelektromos<br />
pontjukat, ha az ion elhagyja a hordozót.<br />
A töltéssel bíró molekulákat dialízissel<br />
vagy gélszűréssel lehet eltávolítani.<br />
• SDS. A fehérjék az SDS-molekulákkal komplexet<br />
alkothatnak. A keletkezett komplex többszörösen<br />
negatív töltésű, ezért a pozitív elektród<br />
felé vándorol. Acetonos precipitáció segít az<br />
SDS-koncentráció csökkentésében. Ha az SDSkoncentráció,<br />
amit a minta előkészítéséhez<br />
használtunk, nem túl nagy (0,25–0,50%), nem<br />
ionos detergenssel (pl. NP-40) 5:1–8:1 arányban<br />
hígítva a hatását minimalizálni lehet.<br />
2-4. ábra. Szérumproteinek (2D PAGE – O’Farrell-technika). SwissProt adatbázisból átvett kép a frakciógazdagság demonstrálására
48 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
• DNS. A DNS negatívan töltött; fehérjékhez<br />
kötődve műterméket eredményez, és mint nagy<br />
molekula, a szeparáló gél pórusait eltömíti. Ha<br />
ezüstözéssel detektáljuk a fehérjéket, a DNS<br />
szintén festődik, növeli a háttér festődését. A<br />
DNS a mintából enzimes kezeléssel (DNS-áz)<br />
vagy ultrahanggal vonható ki.<br />
• Részecskék a mintában. Nagy fordulatszámú<br />
centrifugálással ülepíthetők ki.<br />
• Szérumfehérjék. A szérumfehérjék, mint az<br />
albumin és az immunglobulinok (IgG), a teljes<br />
fehérjetartalomnak mintegy 75%-át teszik ki. A<br />
két nagy mennyiségű fehérje eltávolítása megkönnyíti<br />
a kisebb szérumfehérje-frakciók detektálhatóságát.<br />
Módszertanilag affinitásos kromatográfiás<br />
eljárással, pl.Blue Dextran révén érhető<br />
el e szérumfehérjék eltávolítása. Kerekedelmi<br />
forgalomban beszerezhetők olyan antitesteket<br />
tartalmazó kitek, amelyek tetszés szerint a 6, 12,<br />
20 legnagyobb mennyiségű szérumfehérjét<br />
képesek eltávolítani (2-4., 2-5. ábra).<br />
Megjegyzés: A dialízis, a gélszűrés, az affinitásos kromatográfiás<br />
szeparálások, valamint a fehérjekicsapásos<br />
eljárások részletei a megfelelő irodalomban fellelhetők.<br />
A minták előfrakcionálása<br />
A prefrakcionálás a rendkívül összetett fehérjeminta<br />
analízisek előtti, kisebb frakciókra való elválasztását<br />
jelenti. Célja a minta komplexitásának csökkentése.<br />
Segítségével dúsítani lehet az érdeklődésünk középpontjában<br />
szereplő fehérjefrakciót.<br />
• Folyadék fázisú izoelektromos fokuszálás. Lényege,<br />
hogy izoelektromos pontjuk alapján pH-tartományokba<br />
frakcionáljuk a sejtlizátumot.<br />
• Szubcelluláris frakcionálás. A sejthomogenizátumok<br />
szubcelluláris frakciókra választhatók<br />
differenciál-centrifugálással (magok, mitochondriumok,<br />
mikroszómák, detergensrezisztens<br />
sejtalkotók stb.)<br />
• Konvencionális kromatográfiás technikák. Itt<br />
utalunk ismételten a gélszűréses, ioncserés és<br />
affinitás kromatográfiákra.<br />
Fehérjemeghatározások<br />
A fehérjekoncentráció pontos meghatározása elengedhetetlen<br />
a fehérjevizsgálatokban. Mind a preparatív,<br />
mind az analitikai eljárások fontos vonatkoztatási<br />
alapja. Fehérjemintázatok összehasonlító értékelése<br />
csak azonos mennyiségekkel végezhető. A kísérleti<br />
2-5. ábra. Humán plazmafehérjék 2D PAGE térképe (az értékelést az albumin- és IgG-mentesítés – mint ajánlott előtisztítás<br />
– lényegesen megkönnyíti)
Különféle minták előkészítése<br />
49<br />
minták speciális egyedi fehérjéit nem koncentrációban<br />
adjuk meg, hanem össz-fehérjetartalomra fejezzük<br />
ki. Ha térfogati adatokkal nem rendelkezünk,<br />
rendszerint fehérjére számolunk.<br />
Az irodalomban számos érzékeny fehérjemennyiség-mérési<br />
módszer ismeretes. Megjegyzendő, hogy<br />
a mintánk tartalmazhat olykor olyan komponenst,<br />
amely interferál az adott meghatározással (urea, detergens,<br />
redukálószer stb.). Olyan módszert kell kiválasztani,<br />
amely nem érzékeny ezekre az anyagokra.<br />
Fehérjekoncentráció-mérési módszerek<br />
Direkt fotometria. A direkt fotometriás eljárások közül<br />
ismert a 205 nm-en, valamint a 280 nm-en való<br />
mérés. Az előbbi a peptidkötések meglétén, az utóbbi<br />
az aromás aminosavak jelenlétén alapszik. Előnyük,<br />
hogy a minta nem „használódik” el, további vizsgálatokhoz<br />
rendelkezésre áll. Leginkább kromatográfiás<br />
elválasztások frakciókövetésére használatosak. Hátrányuk,<br />
hogy érzékenységük elmarad pl. a Folin-féle<br />
vagy a különböző festékkötéses módszerekétől, és<br />
mennyiségi referenciájuk (kalibráció és standardizálás)<br />
sem megoldott.<br />
Biuret reagens. A peptidkötést detektáló alkáliás réz<br />
reagens, a keletkező színreakcióban követi a Lambert–Beer-törvényt.<br />
Klasszikus, a rutin laboratóriumokban<br />
használatos spektrofotometriás mennyiségi<br />
fehérjemeghatározás.<br />
A reakció elve a következő: A réz(II)ionok a peptidkötés<br />
4-4 N-atomjával alkalikus közegben vörösibolya<br />
komplexet képeznek, amelyet 546 nm hullámhosszon<br />
fotometriásan mérnek. A biuret reagens<br />
(kereskedelmi forgalomban kapható, rutin laboratóriumi<br />
reagens) rézszulfátot, kálium-nátrium-tartarátot,<br />
kálium-jodidot és nátrium-hidroxidot tartalmaz.<br />
A tartarát köti komplexbe a réz(II)iont, amely<br />
alkalikus pH-nál mint réz(II)hidroxid kiválna, a jodid<br />
megakadályozza a réz(II)ion autoredukcióját.<br />
A színintenzitás a peptidkötések számával arányos.<br />
150–1000 μg/mL proteinkoncentráció tartományban<br />
alkalmazható.<br />
Lowry-féle fehérjemeghatározás. Kis fehérjekoncentrációnál<br />
használatos módszer a tudományos laboratóriumokban.<br />
Valójában a biuretmódszer Lowry<br />
által módosított változata ez a fehérjemeghatározás,<br />
amelynél a réz-peptid komplexek a rákövetkezően<br />
hozzáadott Folin-reagenssel (foszfomolibdát/foszfovolframát)<br />
molibdénkékké redukálódnak.<br />
Használatos reagensek:<br />
1. 2%-os Na-karbonát (2 g 0,1-szer normál NaOH<br />
100 ml-ében oldva).<br />
2. 1%-os CuSO 4<br />
× 5H 2<br />
O (1 g 100 ml vízben).<br />
3. 2%-os Na-tartarát (2 g 100 ml vízben).<br />
4. Munkaoldat: Alkalikus rézoldat; (98 ml 1-es oldat<br />
+ 1 ml 3-as oldat + l ml 2-es oldat – a sorrend betartása<br />
ajánlatos).<br />
5. Folin-reagens (gyári készítmény).(Folin & Ciocalteu’s<br />
phenol reagent suitable for determination of<br />
total protein by Lowry method).<br />
A meghatározás menete:<br />
0,2 ml minta<br />
l ml alkalikus rézoldat (4-es oldatkeverék, frissen készül)<br />
15 perc várakozás<br />
1 ml víz<br />
0,1 ml 1:1 hígítású Folin-reagens (vizes hígítás)<br />
30 perc várakozás után fotometrálás 500 nm-nél<br />
Megjegyzés: Triton-X detergenst tartalmazó minták<br />
esetén az 1 ml víz helyett 1 ml 10%-os SDS-t kell<br />
bemérni. Az ionos detergens jelenlétében megszűnik<br />
a minták zavarossága.<br />
Standard: ismert fehérjekoncentrációjú standard oldat<br />
100–600 μg/ml tartományban (pl. BSA, marha-szérumalbumin)<br />
hasonlóan kezelve alkalmas a<br />
kalibrációs egyenes felvételére [8].<br />
Fehérjemeghatározás mikrobiuret-módszerrel (Benedikt-módszer).<br />
Mivel a Lowry-módszer részben<br />
az aromás aminosavak – mint a tirozin és a triptofán<br />
– jelenlétén alapszik, ezért ha ezek alig vagy egyáltalán<br />
nem fordulnak elő a fehérjében, a proteinoldat fehérjemeghatározására<br />
ez a Benedikt-módszer látszik<br />
alkalmasnak. A meghatározás a peptidkötések számán<br />
alapszik. Érzékenység: 0,25–5 g/L protein.<br />
Reagensek:<br />
1. 17,3 g trinátrium-citrát × 2 H 2<br />
O + 10 g vízmentes<br />
Na-karbonát kevés vízben oldva.<br />
2. 1,73 g CuSO 4<br />
× 5 H 2<br />
O oldva 10 ml vízben, és az oldathoz<br />
az 1. oldatot hozzáadni<br />
3. A keveréket 100 ml-re vízzel feltölteni (Benedikt-reagens).
50 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
Procedúra: 1 ml 3%-os NaOH, 50 µl Benedikt-reagens<br />
és 100 μl proteinoldat.<br />
Fotometrálás: 330 nm-nél.<br />
Fehérjemeghatározás Bradford szerint, mikromódszerrel.<br />
Festékkötésen alapuló eljárás (1–1,400<br />
μg/ml protein). Ez a módszer a fehérjék és a Coomassie<br />
Brilliant Blue G festék kötődésén alapszik. A<br />
fehérjeminta a festékreagenssel összekeverve, rövid<br />
ideig tartó, szobahőmérsékleten való inkubációt követően<br />
595 nm-en fotometrálható. Nagy érzékenysége<br />
miatt a meghatározáshoz a biológiai mintákat<br />
rendszerint hígítani kell. (A humán könnymintáknál<br />
pl. 20–40-szeres hígítást alkalmaztunk.)<br />
A Bradford-reagens összetétele:<br />
• – 10 mg Comassie Brilliant Blue (CBB) G-250<br />
• – 5 ml 95% etanol<br />
• – 10 ml 85% foszforsav<br />
• – 85 ml desztillált víz<br />
15 μl mintához 200 μl Bradford-reagenst adunk. (A<br />
térfogatok természetesen arányosan növelhetők: pl.<br />
150 μl mintához 2000 μl Bradford-reagens.)<br />
5 perc inkubációt követően 595 nm hullámhoszszon<br />
vakkal szemben fotometrálunk.<br />
Standardként 1 mg/ml pl. BSA törzsoldatból készült<br />
hígítási sort (25–400 μg/ml) használhatunk, az<br />
eredményeket grafikusan ábrázoljuk. A fehérjekoncentrációkat<br />
a hígítások figyelembevételével az eredeti<br />
mintára visszaszámoljuk (g/l).<br />
Irodalom<br />
[1] Bradford, M. M.: A rapid and sensitive method for<br />
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing<br />
the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.<br />
72:248–254, 1976.<br />
[2] Drews, O., Weiss, W., Reil, G. et al.: High pressure<br />
effects step-wise altered protein expression in Lactobacillus<br />
sanfrasciscensis. Proteomics 2:765–774, 2002.<br />
[3] Görg, A., Obermaier, C., Bogouth, G. et al.: Recent<br />
developments in 2D gel electrophoresis with immobilized<br />
pH gradients: Wide pH gradients up to pH 12,<br />
longer separation distances and simplified procedures.<br />
Electrophoresis 20:712–717, 1999.<br />
[4] Görg, A., Bogouth, G., Harder, A. et al.: The current<br />
state of two-dimensional electrophoresis with immobilized<br />
pH gradients. Electrophoresis 21:1037–1053,<br />
2000.<br />
[5] Görg, A., Weiss, W., Dunn, M. J.: Current two-dimensional<br />
electrophoresis technology for proteomics. Proteomics<br />
4:3665–3685, 2004. (Review)<br />
[6] Görg, A., Lück, C., Weiss, W.: Sample prefractionation<br />
in granulated Sephadex-IEF gel. Meth. Mol. Biol.<br />
424:277–286, 2007.<br />
[7] Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I.: Organelle Proteomics:<br />
implications for subcellular fractionation in<br />
proteomics. Circ. Res. 92:962–968, 2003.<br />
[8] Lowry, O. H. et al.: Protein measurement with the Folin<br />
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265–275, 1951.<br />
[9] Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N.: Purification<br />
of S. cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and<br />
cytosolic contaminant. Anal. Biochem. 287:339–342,<br />
2000.<br />
[10] Molloy, M. P.: Two-dimensional electrophoresis of<br />
membrane proteins using immobilized pH gradients.<br />
Anal. Biochem. 280:1–10, 2000.<br />
[11] O’Farrell, P. H.: High Resolution Two-Dimensional<br />
Electrophoresis of Proteins. J. Biol. Chem. 250:4007–<br />
4021, 1975.<br />
[12] Orfao, A., Ruiz-Arguelles, A.: General concept<br />
about cell sorting techniques. Clin. Biochem. 29:5–9,<br />
1996.<br />
[13] Rabilloud, T.: Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis.<br />
An outline. Methods Mol. Biol. 112:9–19,<br />
1999.<br />
[14] Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T.: Membrane<br />
proteins and proteomics: Un amour impossible? Electrophoresis<br />
21:1054–1070, 2000.<br />
[15] Simpson, R. J.: International proteomics initiatives:<br />
technological challenges. European Pharmaceutical Review<br />
1:25–36, 2004.<br />
[16] Weiss, W., Postel, W., Görg, A.: Application of<br />
sequential extraction procedures and glycoprotein<br />
blotting for the characterization of the 2-D polypeptide<br />
patterns of barley seed proteins. Electrophoresis<br />
13:770–773, 1992.<br />
[17] Weiss, W.,Vogelmeier, C., Görg, A.: Electrophoretic<br />
characterization of wheat grain allergens from different<br />
cultivars involved in baker’s asthma. Electrophoresis<br />
14:805–816, 1993.<br />
[18] Zinser, E., Daum, G.: Isolation and biochemical characterization<br />
of organelles from the yeast Saccharomices<br />
cerevisiae. Yeast 11: 493–536, 1995.
Különféle minták előkészítése<br />
51<br />
Sejtes minták vizsgálómódszerei<br />
Kőszegi Tamás<br />
Intracelluláris fehérjék kimutatása<br />
Sejtkultúrák. A sejtek in vitro tenyésztése több mint<br />
50 éves múltra tekint vissza. A különböző tápfolyadékok,<br />
tenyésztési körülmények optimalizálását jórészt<br />
tapasztalati úton végezték és végzik ma is. Fontos<br />
körülmény, hogy a sejtek rendszerint akkor képesek<br />
szaporodásra, osztódásra, ha a tápoldat tartalmazza<br />
a tápanyagok mellett a sejtosztódáshoz szükséges növekedési<br />
faktorokat is. Ezt egyszerűen úgy érjük el,<br />
hogy a tenyésztő médiumhoz 10%-ban embrionális<br />
marhaszérumot keverünk.<br />
Bármilyen legyen is az alkalmazott sejttípus vagy<br />
tápoldat, a siker meghatározó tényezője a steril körülmények<br />
betartása. Ez egyben analitikai előnyt is jelent,<br />
hiszen a minta nem tartalmazhat idegen organizmusokat<br />
(baktériumok, mikrogombák). Ugyanakkor a<br />
tenyésztő médium – elsősorban a savótartalma miatt<br />
– egyéb fehérjékben is gazdag, ami hátrányt jelent. A<br />
szövettenyésztés hőskorában nem álltak rendelkezésre<br />
ún. sejtvonalak, amelyek ma már a kereskedelemben<br />
beszerezhetők és garantált tulajdonságokkal rendelkeznek.<br />
Az első sejtkultúrákat műtéti mintákból,<br />
biopsziás anyagokból készítették. Ezeket ma primer<br />
kultúrának nevezzük. A primer kultúrát a steril körülmények<br />
közt kimetszett élő szövetekből különböző<br />
eljárásokkal lehet kinyerni, pl. finom szitán való<br />
préseléssel vagy óvatos tripszines emésztéssel, de e<br />
módszerek részletes bemutatása nem célja a jelen fejezetnek.<br />
Az így kapott sejtek megfelelő tápfolyadékba<br />
téve néhány osztódási cikluson mennek keresztül,<br />
majd előbb-utóbb elpusztulnak. A perifériás vérből is<br />
lehet sejteket izolálni, erre legegyszerűbb módszer a<br />
szeparálás sűrűség alapján (gradiens-centrifugálás).<br />
Amennyiben nem malignusan transzformált sejtekről<br />
van szó, a primer kultúrák élettartama mindenképp<br />
véges. Néha azonban történnek finom genetikai<br />
változások a tenyésztés során, és az így kialakult sejtek<br />
– még nem daganatsejtek – korlátlan ideig fenntarthatók.<br />
Ezeket a sejtvonalakat szokás immortalizált<br />
sejkultúrának nevezni. A harmadik, legkönnyebben<br />
tenyészthető típus a valódi daganatsejt-kultúra.<br />
A szövettenyésztés második titka a rendszeres<br />
tápanyag-utánpótlás, az ún. passzálás. Ilyenkor lecseréljük<br />
a már kihasznált tápfolyadékot a tenyésztőedényből,<br />
és a sejtek egy kis hányadát kinyerve, új<br />
médiumba és rendszerint új edénybe tesszük azokat.<br />
Az inkubálást emlőssejtek esetében stabil 5% szén-dioxid-koncentrációt<br />
fenntartó, 37 °C-os termosztátban<br />
végzik.<br />
Az emlőssejteken kívül lehetséges különböző növényi<br />
kultúrákat is létrehozni és fenntartani. Itt olyan<br />
szöveteket kell választani, amelyek megtartják osztódóképességüket,<br />
és akár pluripotensek is lehetnek (pl.<br />
gyökércsúcsszövet, rügyek merisztémaszövetei stb.).<br />
A növényi kultúráknál az optimális körülményekhez<br />
a periodikus megvilágítás is hozzátartozik.<br />
Természetesen mikrobiológiai módszerekkel baktériumok<br />
és mikro-gombák is tenyészthetők, ennek<br />
részleteire nem térünk ki.<br />
Az emlős sejtkultúrák típusai. Alapvetően kétféle típust<br />
különböztetünk meg:<br />
• A tenyésztőedény falához kitapadó (anchorage<br />
= horgony függő) sejteket.<br />
• Szuszpenzióban növő sejteket.<br />
Nagyon fontos különbség a kétféle sejttípus között,<br />
hogy a kitapadó sejtek csak akkor képesek normális<br />
életfunkciókra és szaporodásra, ha a tenyésztőedény<br />
fala alkalmas azok megtapadására. Hidrofób felületeken<br />
ezek a sejtek nem szaporíthatók, szuszpenziót<br />
alkotva legömbölyödött alakot vesznek fel és leáll az<br />
osztódásukhoz szükséges fehérje- és nukleinsavszintézis.<br />
A passzáláshoz először a használt tápfolyadék<br />
eltávolítása után a kitapadt sejtek kíméletes leválasztása<br />
(tripszines-citrátos oldattal) szükséges, majd felszuszpendálás<br />
után a kitapadó felülettől megfosztott,<br />
lekerekedett sejtek egy részét új edénybe és friss tápfolyadékba<br />
tesszük.<br />
A szuszpenzióban növő sejtek (pl. lymphoblastok)<br />
tenyésztése rendkívül egyszerű, itt a passzáláshoz<br />
lecentrifugáljuk a mintát és annak egy kis részét új<br />
edényben, friss tápoldatban reszuszpendáljuk.<br />
Vizsgálati lehetőségek, modellek<br />
Kitapadó sejtek. Általában a sejteket tenyésztőflaskákban,<br />
egyrétegű (monolayer) formában előtenyésztjük<br />
úgy, hogy a fedettség kb. 80%-os legyen. Ez<br />
nagyon fontos – különösen akkor, ha daganatsejtekkel<br />
dolgozunk –, mert a daganatsejtek szeretnek egy-
52 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
más „tetejére” is nőni, így elveszítik az egysejt-réteg<br />
jelleget. A monolayer formának technikai jelentősége<br />
is van: a kezelő oldatoknak minden sejtet egyszerre,<br />
azonos valószínűséggel kell elérnie. Az előtenyésztett<br />
kultúrát 80%-os fedettségnél leválasztjuk az edény<br />
faláról és friss tápfolyadékban reszuszpendáljuk. A<br />
kísérletekhez leggyakrabban szövettenyésztő lemezeket<br />
használunk, ezek lehetnek 6, 24 vagy 96 lyukú,<br />
szabvány méretű lemezek, tetővel ellátva. A lyukakba<br />
tehetünk beleillő kerek műanyag vagy üveglapkát<br />
is („betétes tenyészet”), ekkor a sejtek ránőnek a betétre,<br />
és később egy mozdulattal kivehetők onnan. A<br />
lyukakat friss tápfolyadékban lévő sejtszuszpenzióból<br />
töltik meg steril pipettázással, minden lyukba azonos<br />
térfogatot mérve. Ennél a fázisnál nagyon kell vigyázni,<br />
hogy a sejtszuszpenzió homogén legyen, hogy<br />
minden lyukba közel azonos számú sejt kerüljön.<br />
Általában egynapos előtenyésztést végzünk, hogy<br />
a sejtek kitapadhassanak és folytathassák normális<br />
életműködésüket. A sejtek kezelhetők úgy, hogy<br />
a vizsgálni kívánt anyagot egyenként a lyukakba pipettázzuk,<br />
de úgy is, hogy a tápfolyadékot steril tűvel,<br />
vákuummal eltávolítjuk és a kezelő oldatot már tartalmazó<br />
új tápfolyadékra cseréljük.<br />
A kitapadó sejtek előnye, hogy a kezelés során –<br />
amennyiben nem pusztulnak el – mindvégig lehorgonyozódva<br />
maradnak, így mosásuk, előkészítésük a<br />
további vizsgálatokhoz egyszerű. Betétes tenyészeteket<br />
használva a kiemelt lemezeket morfológiai, mikroszkópos<br />
célokra is könnyen alkalmazhatjuk.<br />
Sejtszuszpenziók. A szuszpenzióban növő sejteket<br />
módszertanilag máshogyan kell megközelíteni, mint<br />
a kitapadókat. Jóllehet a passzálásuk egyszerű, de a<br />
kezelések, mosások centrifugálást igényelnek. A centrifugálás<br />
során vigyázni kell, nehogy túl nagy fordulatszámot<br />
használjunk, mert ekkor a sejtek sérülhetnek<br />
vagy aktiválódhatnak, ugyanakkor túl alacsony<br />
fordulatszámon nem ülepednek ki teljesen és egy<br />
részüket elveszíthetjük. További problémát jelenthet<br />
a sejtek aggregációja (a daganatsejtek szeretnek kis<br />
csoportokban, kolóniákban nőni), ezért a kísérletekhez<br />
óvatos szuszpendálást kell alkalmazni, legjobb az<br />
1 ml-es pipettaheggyel fel-le szívás.<br />
Sejtes modellek használata. A sejtkultúrákat sokféle<br />
módon, sokféle kérdés megválaszolására használhatjuk.<br />
Az egyik gyakori vizsgálattípus izolált molekulák<br />
(toxinok, gyógyszerek, gyógyszermolekula-jelöltek,<br />
természetes gyógyhatású anyagok stb.) hatásának<br />
analízise. Elsősorban toxicitásvizsgálatról van szó,<br />
ahol a célsejtek életképességének mérése a döntő, ill.<br />
az esetleges toxikus hatás molekuláris mechanizmusának<br />
felderítése (apoptózis, nekrózis). Mind több<br />
tanulmány foglalkozik a sejten belüli jelátviteli folyamatokkal,<br />
azok fehérjemediátoraival. A tiszta, sejtes<br />
modellek erre is nagyon alkalmasak, hogy csak néhány<br />
példát említsünk.<br />
Módszertani megközelítések<br />
Egyedi fehérjék kimutatása morfológiai<br />
módszerekkel<br />
Immunfluoreszcencia. A sejt felszínén vagy a sejten<br />
belül található fehérjemolekulák láthatóvá tételére<br />
alkalmas módszer. Lehetőség van direkt és indirekt<br />
kimutatásra. A direkt eljárásban egyetlen specifikus<br />
antitestet használunk a keresett fehérje kimutatására,<br />
mely kovalensen kötött fluoreszcenciás jelölőt<br />
hordoz. Ez a módszer egyszerű, széles körben alkalmazzák<br />
nem mikroszkópos megfigyelésre is, pl. flow<br />
citometriában. Az indirekt módszer „szendvics”-elven<br />
alapuló, két antitestet használó eljárás, ahol az első<br />
antitest alakítja ki a keresett molekulával a specifikus<br />
kötést, a második antitest pedig a már lekötődött első<br />
antitest ellen termeltetett immunglobulin, mely fluoreszcens<br />
jelölőt hordoz (2-6. ábra).<br />
A morfológiai vizsgálathoz fluoreszcens mikroszkóp<br />
szükséges. Ennek optikája különleges, az ultraibolya<br />
fényt is átengedő üvegből készül, a megvilágító<br />
fényforrás pedig nagy energiájú UV-sugarakat is kibocsát<br />
(higanylámpa, xenonlámpa). A mikroszkóp<br />
felépítésében gyakori a fordított elrendezés: az objektív<br />
a tárgyat alulról látja (fordított, inverz mikro-<br />
2-6. ábra. Transzmembrán sejtfehérje kimutatása immunfluoreszcenciás<br />
módszerrel
Különféle minták előkészítése<br />
53<br />
szkóp). Ez a geometria azért terjedt el, mert a mintát<br />
gerjesztő fény az objektíven keresztül halad át,<br />
és nem kerül bele az okulárrendszerbe, minimálisra<br />
csökkentve a gerjesztő fény zavaró hatását. A mintából<br />
a fényemisszió a tér minden irányában terjed, így<br />
a hasznos jel szintén az objektíven halad át visszafelé<br />
az okulárokba. Mind a gerjesztő fény útjában, mind<br />
a megfigyelési oldalon a fénysugarak megfelelő hullámhosszúságú<br />
szűrőkön haladnak keresztül, tovább<br />
növelve a jel/zaj viszonyt.<br />
Az egyik leggyakrabban alkalmazott immunfluoreszcenciás<br />
vizsgálat a sejtváz (citoszkeleton) fehérjéinek<br />
vizualizációja megfelelő antitestek használatával,<br />
lehetőség van külön az aktin, a tubulin és a köztes<br />
(intermediate) filamentumok kimutatására. Amenynyiben<br />
különböző hullámhosszon emittáló jelölőket<br />
használunk, akkor egyszerre kettő vagy mind a három<br />
citoszkeletonrendszert láthatóvá tudjuk tenni<br />
ugyanabban a sejtben, a mikroszkópban változtatva<br />
a gerjesztés hullámhosszát és az emissziós oldalon a<br />
szűrőket. Az egyes hullámhosszakon kapott képeket<br />
lefényképezzük, és azután a digitalizált képeket számítógép<br />
segítségével egymásra vetítjük.<br />
A citoszkeleton aktin komponense, a mikrofilamentáris<br />
rendszer antitest nélkül, más specifikus<br />
molekuláris interakcióval is detektálható. Ehhez a<br />
gyilkos galóca (Amanita phalloides) falloidin toxinjának<br />
használata terjedt el széles körben. Fluoreszcens<br />
festékkel kovalensen jelzett falloidint használnak<br />
leginkább erre a célra, mely irreverzibilisen kötődik<br />
a fibrilláris (F) aktinhoz. Jelölőként leggyakrabban<br />
fluo reszcein-izotiocianátot (FITC, zöld színű emiszszió)<br />
és tetrametil-rodamin-izotiocianátot (TRITC,<br />
piros) alkalmaznak. A fluoreszcein igen intenzív<br />
emissziót mutat, de hátránya az UV-gerjesztés hatására<br />
gyorsan bekövetkező halványulás (fading). Ma<br />
már széles körben hozzáférhetőek a kioltásra nem<br />
vagy alig érzékeny fluoreszkáló molekulák is, pl. az<br />
AlexaFluor-származékok.<br />
Aktinfilamentumok kimutatása indirekt immunfluoreszcenciával<br />
és jelölt falloidinnel. Ezen a példán keresztül<br />
kívánjuk bemutatni az egyedi fehérjemolekulák<br />
mikroszkópos detektálásának általánosan bevált<br />
receptjét. Nagyon fontos, hogy a sejtek jó minőségű<br />
üveglemezre legyenek tenyésztve, a műanyag optikailag<br />
nem megfelelő. Nem szabad túl sok sejtet tartalmazó<br />
kultúrát vizsgálni, legjobb a kb. 30%-os fedettség.<br />
Általánosságban a következő lépésekből áll<br />
a folyamat, amelyet a következőkben részletezünk<br />
is: sejtek mosása, fixálás, blokkolás, permeabilizálás<br />
(átjárhatóvá tevés), jelölés specifikus antitesttel vagy<br />
más módon, mosás, második antitest hozzáadása,<br />
mosás, beágyazás, mikroszkópos megfigyelés. Falloidin<br />
esetében a jelölést egy lépésben végzik, a második<br />
inkubációt elhagyjuk.<br />
• Fixálás. A hideg pufferelt sóoldattal (PBS)<br />
mosott monolayer sejteket vagy –20 °C-ra<br />
hűtött acetonnal, vagy metanolmentes pufferelt<br />
formaldehidoldattal (2,0–4,0%-os) fixáljuk 10<br />
percig. Az aceton a fixáláson kívül a sejteket<br />
permeabilizálja is, ezért ebben az esetben ez a<br />
lépés a továbbiakban elhagyható.<br />
• Blokkolás. Az intracelluláris nem specifikus<br />
kötődések kivédésére szokás a sejteket PBS-ben<br />
oldott 1%-os albuminoldattal kezelni szobahőmérsékleten<br />
1 órát.<br />
• Permeabilizálás. A formaldehidben fixált, blokkolt<br />
sejteket alaposan, többször mossuk PBSben,<br />
majd 0,1% Triton-X 100-at (nem ionos<br />
detergens) tartalmazó PBS-oldatba tesszük a<br />
mintát szobahőmérsékleten, 15 percre.<br />
Amennyiben detergenst alkalmazunk, akkor<br />
minden további lépésben az oldatoknak tartalmazniuk<br />
kell a detergenst.<br />
• Inkubálás az 1. antitesttel. Ehhez a lépéshez célszerű<br />
a sejteket az üveglemezen „bekeríteni”, pl.<br />
körömlakkal vagy speciális, levegőn megdermedő<br />
anyaggal, ily módon akadályozva meg, hogy<br />
a drága antitest a mintáról lefolyjon. Az inkubációt<br />
szobahőmérsékleten végezzük 60 percig a<br />
blokkolóoldattal hígított antitesttel. A mintát<br />
nedves kamrába téve óvjuk a beszáradástól. Az<br />
antitest optimalizálásához célszerű kikísérletezni<br />
a legmegfelelőbb hígítást. Detergenst tartalmazó<br />
oldatnál különösen vigyázni kell, hogy az<br />
nehogy lecsússzon a mintáról.<br />
• Mosás és inkubálás a 2. antitesttel. A sejteket<br />
többször mossuk PBS-sel, majd befedjük a jelzett<br />
2. antitest megfelelő hígítású oldatával, és az<br />
előző pont szerint inkubálunk. A mintát ne érje<br />
fény!<br />
• Mosás, beágyazás. A sejteket újra többször mossuk<br />
PBS-sel, majd az utolsó mosás után a mintát<br />
rövid ideig desztillált vízbe mártjuk a sók eltávolítása<br />
érdekében. A sejtes oldallal lefelé a
54 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése<br />
lemezt tiszta tárgylemezre cseppentett speciális<br />
„anti-fading” készítményre helyezzük (pl.<br />
VectaShield), ami a fluoreszcens jel halványulását<br />
késlelteti.<br />
• Mikroszkópos megfigyelés. Először normális<br />
megvilágítással vagy fáziskontrasztos módszerrel<br />
ellenőrizzük a készítményt. Ezután megfelelő<br />
hullámhosszúságú gerjesztő és analizáló szűrők<br />
alkalmazásával először kis nagyítással tanulmányozzuk<br />
a sejteket, vigyázva arra, hogy a<br />
megfigyelt látóteret ne érje túl sokáig a gerjesztő<br />
fény. Immerziós nagyításra is van lehetőség,<br />
ekkor speciális, fluoreszcenciás minőségű<br />
immerziós olajat kell alkalmaznunk.<br />
• Dokumentáció. Hagyományos analóg fényképezésnél<br />
lehetőleg 400 ASA érzékenységű filmet<br />
használjunk, a legjobb a színes diapozitív film<br />
(napjainkban kevesen használják és nehezen<br />
hozzáférhető, de jobb felbontást ad a digitális<br />
technikánál). A digitális technika ma már széles<br />
körben rendelkezésre áll különböző, hűtött<br />
CCD chipet tartalmazó nagy érzékenységű<br />
kamerával és analizáló szoftverrel.<br />
• Általános megjegyzések. Nagyon fontos, hogy a<br />
minta nem száradhat ki az egész procedúra<br />
során, mert álpozitív jelölést kaphatunk. Mindig<br />
legyen negatív kontroll, ami olyan mintát jelent,<br />
amit csak a 2. antitesttel inkubáltunk (ennek<br />
negatívnak kell lennie).<br />
A 2-7. és 2-8. ábrán indirekt immunfluoreszcens és<br />
falloidines módszerrel vizualizált aktinfilamenteket<br />
mutatunk. A két képen jól megfigyelhető az eltérő<br />
sejttípusok eltérő mikrofilamentum struktúrája.<br />
Egyedi fehérjék kimutatása egyéb<br />
módszerekkel<br />
Western blot. További lehetőség az intracelluláris fehérjék<br />
egyedi kimutatására a sejtek feltárása után az<br />
SDS-PAGE-vel szétválasztott mintáknál western blot<br />
alkalmazása. A módszer részleteiről már szó esett<br />
ebben a fejezetben, itt csak annyit jegyeznénk meg,<br />
hogy ezt a vizsgálatot gyakran alkalmazzák egy bizonyos<br />
fehérje expressziójának követésére. Mivel a<br />
leggyakrabban használt kemilumineszcenciás detektálás<br />
közel kvantitatív mérést tesz lehetővé, ezért<br />
a különböző mintákban a kérdéses fehérje átírásáról<br />
mennyiségi információt is kaphatunk. Ehhez szükség<br />
van egy referensként használt fehérje detektálására<br />
is, melynek mennyisége független az alkalmazott<br />
kezelésektől. Erre a célra leggyakrabban a b-aktint és<br />
a GAPDH-t (glicerinaldehid-foszfát-dehidrogenáz)<br />
használják. A vizsgálni kívánt molekula lumineszcenciás<br />
jelét a referens molekula jeléhez viszonyítva<br />
nyomon követhetővé válik a kérdéses fehérje expreszsziójának<br />
változása.<br />
2-7. ábra. Humán embrionális fibroblastsejtek aktinfilamentjeinek<br />
detektálása nyúlban termeltetett antiaktin<br />
primer antitesttel és FITC-vel jelzett antinyúl-IgG másodlagos<br />
antitesttel (200×) (Fujifilm 400 ASA, Contax fényképezőgép)<br />
2-8. ábra. MDCK (kutya-vesetubulus tenyészet) aktinfilamentjeinek<br />
festése AlexaFluorral jelzett falloidinnel (400×)<br />
(Olympus Cell^D CCD kamera és képelemző szoftver)
Különféle minták előkészítése<br />
55<br />
Immunkémiai módszerek. A kép nem lenne teljes<br />
anélkül, hogy az érzékeny immunoassay- (lásd 7. Automatizáció<br />
a fehérjeanalitikában) palettát meg ne<br />
említenénk. Itt lehetőség van nem denaturáló módszerekkel<br />
feltárt sejtekből (sejtlizátumokból) vagy<br />
a tenyésztőmédiumból egyedi fehérjék, peptidek<br />
mennyiségi meghatározására. A vonatkoztatási alap<br />
a tápfolyadékban a szérumhoz hasonlóan a térfogat<br />
(pl. nmol/l), a sejtlizátumokból pedig általában a sejtek/minták<br />
összfehérje-tartalma. A 2-9. ábrán bemutatott<br />
kísérletünkben HepG-2 (transzformált májsejtkultúra)<br />
sejteket endotoxinhatásnak tettünk ki 24<br />
órán keresztül (endotoxint tartalmazó tápfolyadékban<br />
tenyésztettük őket), majd eltávolítva a médiumot<br />
a sejteket nem-ionos detergenssel lizáltuk. A lizátumokból<br />
kemilumineszcenciás immunoassay-vel prokalcitoninméréseket<br />
végeztünk, a prokalcitoninértékeket<br />
a sejtek fehérjetartalmára vonatkoztattuk.<br />
2-9. ábra. Endotoxinexpozícióra bekövetkező prokalcitoninválasz<br />
kimutatása HepG-2 sejtek lizátumaiban<br />
Irodalom<br />
Érdekességként megjegyezzük, hogy a sejtekben a<br />
prokalcitonin mennyisége az endotoxinnal fordított<br />
arányosságot mutatott. Hasonló modelleket alkalmazva,<br />
a patofiziológiás történéseket utánozva számos<br />
biológiailag aktív molekula viselkedése tanulmányozható.<br />
http://www.protocol-online.org/prot/Immunology/Immunofluorescence/<br />
http://web.mit.edu/ki/facilities/microscopy/immunofluorescence-protocol.pdf<br />
http://www.protocol-online.org/prot/Cell_Biology/Cell_<br />
Culture/<br />
http://www.molecularstation.com/protocol-links/Cell-Biology-Cell-Culture/<br />
http://www.mnstate.edu/provost/cellcultureprotocol.pdf<br />
http://www.andor.com/learning/applications/Immunofluorescence/<br />
http://www.google.hu/search?q=cell+culture+protocols&hl=hu&client=firefox-a&hs=MaV&rls=org.<br />
mozilla:en-US:official&channel=s&prmd=ivns&ei=SrU2TZDnN435sgbzptWfAQ&start=10&sa=N<br />
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/<br />
mb2/part1/actin.htm<br />
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Productsand-Services/Applications/Cell-and-Tissue-Analysis/<br />
Cellular-Imaging/Fluorescence-Microscopy-and-Immunofluorescence-IF/Phalloidin-and-Phalloidin-Conjugates-For-Staining-Actin.html
3. Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai<br />
módszerei<br />
Kilár Ferenc<br />
A fehérjék analitikai elemzésére alkalmas módszerek<br />
elsősorban tisztított fehérjék vizsgálatát jelentik, de<br />
növekszik az olyan módszereknek a száma, amelyek a<br />
keverékekben, mátrixokban jelen lévő fehérjék vizsgálatára<br />
alkalmasak.<br />
A fehérjék vizsgálatának célja tisztítás, elválasztás,<br />
a kölcsönhatások vizsgálata, a jellemző paraméterek<br />
meghatározása, biológiai funkciók elemzése, a térszerkezet<br />
meghatározása, konformációs, denaturációs<br />
tulajdonságok jellemzése. Mindez a bioanalitika<br />
tárgykörébe tartozik. A bioanalitikai módszerek felölelik<br />
az elválasztástechnikák, a szerkezetanalízis, a<br />
bioinformatika, a biológiai fizikai kémia majdnem<br />
teljes eszköztárát.<br />
E fejezet – amellett, hogy érinti a fehérjék vizsgálatára<br />
alkalmas módszerek céljait és főbb kérdéseit, valamint<br />
előjelzi a további fejezetek tartalmát – néhány<br />
bioanalitikai területet tárgyal részletesebben.<br />
Fehérjék extrakciója<br />
A fehérjék extrakciójának még ma is a legszélesebb<br />
körben alkalmazott módja az oldószeres kinyerés és<br />
az ezt követő, csapadékképzésen alapuló, esetenként<br />
lépcsőzetes kicsapással végrehajtott frakcionálás.<br />
akár a 100 000 Da molekulatömeg értékig egymástól<br />
elválasztani és frakcionálni. A módszer preparatív<br />
felhasználása mellett fehérjék molekulatömegének<br />
analitikai megbecsülésére is alkalmas (3-1. ábra). A<br />
gélszűrés hátrányai közé tartozik az, hogy két fehérje<br />
elkülönítésének feltétele molekulatömegükben legalább<br />
10%-os különbség megléte, valamint az, hogy<br />
a frakciók gyűjtése során az oldat hígul, ezért töményítési<br />
eljárásokat (pl. szelektív membránokon való<br />
„ultraszűrés”) vagy pl. liofilizálást kell alkalmazni a<br />
megfelelő fehérjepreparátum elkészítéséhez.<br />
A fehérjék különböző tulajdonságain alapuló kromatográfiás<br />
elválasztások közül az ioncserés kromatográfiával<br />
egy adott pH-n a töltéskülönbség alapján<br />
lehet fehérjéket elválasztani. Ennek hátrányai közül<br />
meg kell említeni, hogy az elúcióhoz alkalmazott<br />
esetlegesen nagy ionerősségű oldószer a molekulák<br />
denaturációját okozhatja.<br />
Az affinitáskromatográfia alkalmazásával lehet a<br />
legtisztább preparátumokat előállítani. Ennek formája<br />
a fehérjékkel specifikusan kölcsönhatás kialakítására<br />
alkalmas oszlopok használata. Glikoproteinek tisz-<br />
Fehérjék kromatográfiája<br />
A fehérjetisztítás másik legfontosabb területe annak<br />
elválasztástechnikai alkalmazása, azok közül is<br />
a kromatográfia. A kromatográfiás eljárások széles<br />
felhasználási köréből a fehérjék kinyerésére alkalmas<br />
gélszűrés (méretkizárásos kromatográfia, gélkromatográfia)<br />
a legfontosabb módszer, amellyel preparatív<br />
módon, nagy mennyiségben lehet tisztított preparátumot<br />
előállítani. A gélszűrés során különböző pórusméretű<br />
gélmátrixon megfelelően lehet a fehérjéket<br />
3-1. ábra. Ismeretlen fehérje molekulatömegének becslésére<br />
alkalmazható kalibrációs egyenes gélszűréssel való<br />
elemzésben
58 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
títására alkalmazható a lektinkromatográfia, fémkötő<br />
fehérjék elválasztására immobilizált fémionokat tartalmazó<br />
oszlopok, de a legszélesebb körben használható<br />
módszer az immobilizált, specifikus ellenanyagokat<br />
alkalmazó „immunaffinitás-kromatográfia”.<br />
A különböző kötött ligandumokat alkalmazó ligandumreceptor-kromatográfia<br />
akár 1000-szeres fehérjetisztítási<br />
hatékonyságot képes elérni 10–50%-os<br />
visszanyeréssel. A specifikus ligandumok egy ”spacer”-en<br />
keresztül kapcsolódnak az agaróz- vagy poliakrilamidmátrixhoz<br />
(3-2. ábra). Amennyiben a ligandum<br />
reaktív, a fehérjék szelektíven kötődnek az<br />
oszlophoz. A kötött fehérjék eltávolítása az eluensben<br />
oldott azonos vagy attól különböző, más ligandummal<br />
végrehajtott extenzív mosással érhető el.<br />
Specifikus fehérjetisztítás lehetséges ún. affinitáscímkék,<br />
„tag”-ek segítségével. Egy adott fehérjéhez<br />
kovalensen kötött pl. hisztidin-„tag” („His-tag”),<br />
„címke” nagy affinitással rendelkezik nikkel- és kobaltionokkal<br />
szemben, vagyis az ilyen immobilizált<br />
fémionokat tartalmazó oszlopon azokat a fehérjéket,<br />
amelyek ilyen címkékkel rendelkeznek, nagy specificitással<br />
lehet elválasztani. A His-tag-et elsősorban<br />
rekombináns technikák alkalmazásakor használják,<br />
az így előállított fehérjékről a „címkét” proteolitikus<br />
hasítással el lehet távolítani.<br />
Fehérjék frakcionálása ultracentrifugával<br />
A fehérjéket ultracentrifugálással is el lehet választani<br />
a vizsgálatokhoz. Az analitikai és a preparatív ultracentrifugálási<br />
technikák közül ma már elsősorban a<br />
gradienscentrifugálást alkalmazzák, amelyhez szacharóz-<br />
vagy glicerin-koncentrációgradienst, ill. kolloid<br />
szilikagél-részecskéket tartalmazó ún. Percoll-gradienst<br />
használnak. Megfelelően hosszú centrifugálást<br />
követően a különböző molekulatömegű fehérjék<br />
(kolloidrészecskék) a sűrűségüknek megfelelő zónában<br />
helyezkednek el, és a centrifugálás után frakciókba<br />
gyűjthetők. Bár a felbontás (molekulatömeg<br />
szerinti elválasztás) nem nagy, alkalmazása bizonyos<br />
esetekben hasznos.<br />
3-2. ábra. Ligandum kötése mátrixokhoz<br />
a) A ligandum az aminocsoportján keresztül kötődik az N-hidroxi-szukcinimid-észterrel aktívált mátrixhoz<br />
b) Karboxilcsoporttal rendelkező ligandum kötése karbodiimid-aktiválás után a mátrix aminocsoportjához
Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
59<br />
Fehérjék vizsgálata elektroforézissel<br />
A pH-tól függő töltéssel rendelkező, amfoter tulajdonságú<br />
fehérjék analízisére leggyakrabban alkalmazott<br />
elválasztástechnika az elektroforézis. Az<br />
elektroforézis – bár korlátozott mértékben alkalmas<br />
preparatív elválasztásra – elsősorban analitikai módszer,<br />
amellyel ugyanakkor számos vizsgálatot el lehet<br />
végezni. A fehérje-összetétel meghatározása mellett<br />
egyértelműen alkalmazható tisztaságvizsgálatra, de<br />
más molekulákkal (kis molekulák és makromolekulák)<br />
történő kölcsönhatások vizsgálatára, az amfoter<br />
tulajdonságaikat jellemző paraméterek (izoelektromos<br />
pont) meghatározására, konformációs stabilitásuk<br />
(denaturációs tulajdonságuk) jellemzésére.<br />
Az elektroforézis technikának az Arne Tiselius által<br />
a harmincas években leírt módszere az elektromos<br />
térben vándorló ionokat oldatban, hordozó nélkül írta<br />
le, amelynek során fehérjéket és fehérjekeverékeket<br />
(pl. szérum) választott el elektroforézissel. A vándorló<br />
komponensek határfelületét (a zóna vándorlását)<br />
törésmutató-detektorral követte nyomon (moving<br />
boundary electrophoresis). Az azóta eltelt időszak alatt<br />
az elektroforetikus technikák két lényeges formában<br />
jelentek meg. Az eredeti Tiselius-készülék „szabad oldat”-ban<br />
nem volt alkalmas nagyszámú minta elemzésére,<br />
a detektálás módja is gondot jelentett. Ezért a<br />
technika akkor kezdett teret hódítani, amikor gélmátrixokat<br />
(Hjertén – agaróz, 1955, Ornstein és Davis,<br />
valamint Raymond és Weintraub – poliakrilamid,<br />
1959) kezdtek alkalmazni.<br />
A csak makromolekulák (fehérjék és nukleinsavak)<br />
vizsgálatára alkalmas gélelektroforetikus módszerek<br />
a mai napig fontos szerepet játszanak. Elsősorban<br />
fehérjék molekulatömegének meghatározására használatosak,<br />
ugyanakkor a proteomikai kutatások előtérbe<br />
kerülésével, a tömegspektrometriával kapcsolva<br />
egyértelműen helyük van a mai elemzésekben is.<br />
A hatvanas-hetvenes évek során azonban egy „új”<br />
elektroforetikus módszer hódította vissza Tiselius<br />
eredeti módszerének érdemeit. Az oldatban, de most<br />
már vékony (üveg)csövekben, kapillárisokban, érzékeny<br />
detektálási technikákkal kombinált módszerek<br />
egy új, nagyon sok lehetőséget kínáló elektroforetikus<br />
elemzőrendszert alkotnak, a kapilláris-elektroforetikus<br />
technikákat.<br />
Az egyes elemző-detektáló technikák részletesebb<br />
tárgyalása előtt azonban fontos az elektromos térben<br />
végrehajtható elemzések összefoglalása. A 3-1. táblázat<br />
az elválasztási módok fajtáit, a végrehajtás körülményeit,<br />
az elválasztási elveket és a vizsgált komponenseket<br />
összegzi.<br />
A 3.1. táblázaton leírt módszerek többsége tehát<br />
gél- és oldatrendszerekben is végrehajtható. A táblázat<br />
elektroforetikus technikái ugyanakkor egymással<br />
vagy más technikákkal kapcsolhatók. Többek között<br />
így jött létre a 2D-PAGE, vagyis a „kétdimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis”.<br />
A gélmátrixban végrehajtott, fehérjék analízisére<br />
alkalmazható egy- és kétdimenziós elektroforetikus<br />
elválasztások elméleti és gyakorlati leírása a 4. fejezetben<br />
található. E fejezetben a fehérjék kapilláris-elektroforetikus<br />
elemzésére használatos legfontosabb<br />
technikák leírását adjuk meg.<br />
Fehérjék kapilláris-elektroforetikus<br />
elemzése. Chip-elektroforézis<br />
A kapillárisméretben végzett, elektromigráción alapuló<br />
elválasztás egyike a leggyorsabban fejlődő elválasztási<br />
módszereknek. Az elektroforetikus elválasztási<br />
módszerek azon alapulnak, hogy elektromos<br />
térben az oldott anyagok különböző sebességgel<br />
vándorolnak. A kapilláris-elektroforézisnél (capillary<br />
electrophoresis, CE) az elektroforézis egy vékony,<br />
általában 25–75 µm belső átmérőjű, pufferoldattal<br />
töltött kapillárisban történik. A kapilláris alkalmazásának<br />
számos előnye van, így pl. az, hogy a kapilláris<br />
nagy elektromos ellenállásánál fogva a rendkívül<br />
nagy térerő (100–500 V/cm) alkalmazását csekély<br />
hőfejlődés mellett teszi lehetővé. A fejlődött hő<br />
(joule-hő) a kapilláris nagy felület/térfogat aránya<br />
miatt jól eloszlik. A nagy elektromos térerő használata<br />
rövid mérési időt, valamint nagy elválasztási hatékonyságot<br />
és felbontást biztosít. A kapilláris-elektroforézis<br />
minimális mintamennyiséget (1–10 nl)<br />
igényel, könnyen automatizálható. A módszer egyik<br />
legnagyobb előnye a lehetséges alkalmazások rendkívül<br />
széles köre. Míg a kapilláris-elektroforézist eleinte<br />
csak biológiai makromolekulák vizsgálatához használták,<br />
ma már aminosavak, királis vegyületek, vitaminok,<br />
peszticidek, szervetlen ionok, szerves savak,<br />
peptidek és fehérjék, szénhidrátok, oligonukleotidok<br />
és DNS-részek, de még egész sejtek és vírusok elválasztásához<br />
és meghatározásához is alkalmazzák. A<br />
kapilláris-elektroforetikus módszerek gyorsaságuk-
60 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
nak, automatizálhatóságuknak, jó felbontásuknak<br />
(10 6 elméleti tányérszám/m) és kis anyagigényüknek<br />
köszönhetően nagyon gyorsan elterjedtek.<br />
A kapilláris-elektroforézis ma már a mikrofluidika,<br />
azaz a miniatürizált, folyadékban végrehajtott elemzések<br />
területén fejlődik a legnagyobb mértékben. A<br />
genomika, a proteomika és a metabolomika rohamosan<br />
növekvő igényeinek és a technikában megfigyelhető<br />
általános fejlődési tendenciáknak megfelelően<br />
a miniatürizálás az elválasztástechnikák körében is<br />
egyre inkább tért hódít, mivel egyre kisebb térfogatú,<br />
ugyanakkor nagyszámú minta kis helyen végzett<br />
gyors analízisét teszi lehetővé. E módszereknek meg<br />
kell felelniük korunk és természetesen a vizsgált biológiai<br />
rendszer kívánalmainak, úgymint kis menynyiségű<br />
minták (mikro- és nanoliter térfogat) gyors<br />
analízise (másodperces elválasztási idő), nagy felbontóképesség<br />
és olyan enyhe elválasztási körülmények,<br />
amelyek lehetővé teszik a szeparált komponensek további<br />
azonosítását, többnyire tömegspektrometriával<br />
vagy mikroszekvenálással. A detektálási érzékenységnek<br />
bizonyos esetekben el kell érnie az egy mo-<br />
3-1. táblázat. Elektroforetikus technikák jellemzése<br />
Elnevezés<br />
Kísérleti körülmények<br />
Az elválasztás elve (az<br />
elektroforetikus vándorlást<br />
befolyásoló körülmény vagy<br />
tulajdonság)<br />
Vizsgált komponensek<br />
(natív) zóna-elektroforézis<br />
pufferelt elektrolitoldat (háttérelektrolit)<br />
oldatban vagy<br />
gélmátrixban<br />
a vándorlás a komponens<br />
töltés/tömeg arányától függ<br />
oldatban vagy gélben:<br />
egyszerű szervetlen<br />
ionok, kismolekulák,<br />
makromolekulák<br />
csak oldatban: kolloid<br />
részecskék, sejtalkotórészek,<br />
sejtek<br />
(denaturáló) zóna-gélelektroforézis<br />
gélmátrix (vagy agaróz, vagy<br />
poliakrilamid, vagy lineáris<br />
poliakrilamidláncok kolloid<br />
oldata)<br />
molekulaméret (molekulatömeg)<br />
szerinti vándorlás<br />
fehérjék (magas pH-n<br />
SDS jelenlétében) és<br />
nukleinsavak<br />
izoelektromos fókuszálás<br />
oldatban vagy gélmátrixban,<br />
a rendszerben az anolit és katolit<br />
között amfolitok segítségével<br />
létrehozott pH-gradiens<br />
amfoter vegyületek izoelektromos<br />
pontja alapján való<br />
fókuszálódás<br />
oldatban vagy gélben:<br />
amfoter tulajdonságú<br />
kis- és makromolekulák<br />
csak oldatban: kolloid<br />
részecskék, sejtek<br />
micelláris elektrokinetikus<br />
kromatográfia<br />
oldatban vagy gélmátrixban,<br />
egy nagy és egy kis elektroforetikus<br />
mobilitású anionokat<br />
vagy kationokat tartalmazó<br />
rendszer<br />
elektroforetikus mobilitás<br />
egyszerű szervetlen<br />
ionok, kismolekulák,<br />
makromolekulák<br />
elektrokromatográfia<br />
kromatográfiás állófázist vagy<br />
ún. „monolit”-ot tartalmazó<br />
kapillárisban pufferelt vagy<br />
nem pufferelt háttérelektrolit<br />
jelenlétében<br />
elektroendozmózis jelenlétében<br />
vándorló komponensek,<br />
amelyek a kromatográfiás<br />
állófázissal tulajdonságaiknak<br />
megfelelően kölcsönhatásba<br />
lépnek<br />
kis- és makromolekulák<br />
affinitás- (immun-)elektroforézis<br />
oldatban vagy gélmátrixban,<br />
specifikus kölcsönhatásra<br />
képes komponens jelenlétében<br />
vándorló vizsgált anyagok<br />
a szabad és a kölcsönhatással<br />
komplexbe került komponensek<br />
vándorlási sebességeinek<br />
különbözősége<br />
kis- és makromolekulák
Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
61<br />
3-3. ábra. Egy kapilláris-elektroforézishez használható<br />
mikrochip, amelyen az elválasztó csatornákon kívül reagenstartályok,<br />
elektródok és pufferek elhelyezésére szolgáló<br />
nyílások, kialakított lyukak (well) találhatók<br />
lekula kimutathatósági határt. E <strong>modern</strong> elválasztási<br />
módszereket főleg a rendszer biológia részterületein<br />
használhatják, de ezen túl természetesen alkalmazást<br />
találnak biomarkerek felfedezésekor, metabolizmusutak<br />
analízisében és gyógyszercéltermékek validálási<br />
eljárása során is.<br />
A kémiai chipek előállítása a számítógépchipek<br />
gyártása során alkalmazott technikákat (fotolitográfia,<br />
kémiai maratás stb.) alkalmazza. A miniatürizálás<br />
számos előnnyel jár különösen azon alkalmazások<br />
esetében, ahol nagyszámú minta gyors elemzése<br />
szükséges, ami a rendszer biológia korszakában alapvető<br />
fontosságú. Az analízist kisméretű üveg- vagy<br />
műanyag lapba maratott csatornákban végzik (3-3.<br />
ábra), és a néhány cm hosszúságú kapillárisokban a<br />
nanoliternyi mennyiségű minták elemzése csupán<br />
másodperceket, esetleg perceket vesz igénybe.<br />
A miniatürizálás előnyei közé tartozik a kis reagensigény,<br />
a csökkentett oldószer-felhasználás és<br />
akár egymást követő kémiai és biokémiai reakciók,<br />
valamint elválasztási lépések integrálása egyetlen<br />
mikrochipben (lab-on-a-chip). A módszer magában<br />
hordozza a multiplex, integrált rendszerek kialakításának<br />
lehetőségét is. Sokcsatornás chipek alkalmazásával<br />
akár több száz minta párhuzamos vizsgálata<br />
válik lehetővé (96, 384 stb.), és mivel ez az új módszer<br />
könnyen automatizálható, mindez jelentős munka-,<br />
idő-, anyag- és költségmegtakarítást jelent.<br />
Az elektroforézis-mikrochip elkészítésének első lépése<br />
a csatornahálózat és a reagenstartó edények elrendezésének<br />
megtervezése annak tudatában, hogy<br />
mit várunk el a kémiai chiptől. A következő lépés<br />
a terv megfelelő chipalapanyagra való átvitele felhasználva<br />
a számítógépes mikrochipek gyártásánál<br />
bevezetett és ma már nagyiparilag is alkalmazott<br />
módszereket. Ezzel a technikával akár több ezres<br />
nagyságrendben is előállíthatók elektroforézis-chipek.<br />
Megfelelő detektorok alkalmazásával femto- és<br />
attomol mennyiségű minta detektálása lehetséges,<br />
és az így kialakított mikrochipek 10-, sőt 100-szoros<br />
analízissebességet biztosítanak a konvencionális elválasztási<br />
módszerekhez képest. Különösen előnyös,<br />
hogy a már beállított folyadékkromatográfiás vagy<br />
kapilláris-elektroforézis módszerek egyszerűen átültethetők<br />
mikrochip formátumra.<br />
Elektroforézis-mikrochipeket mikromegmunkálással<br />
készíthetünk üvegből, kvarcból és különböző<br />
műanyagokból, úgymint polimetil-metakrilát, teflon,<br />
polikarbonát stb. A kémiai chip alapanyag kiválasztásánál<br />
megfontolandó, hogy miniatürizált<br />
körülmények között e nagy felület anyagi minősége<br />
fontos szerepet játszhat. Ez különösen lényeges lehet<br />
fehérjék elektroforézise, ill. kémiai reakciók (polimeráz-láncreakció,<br />
restrikciós emésztés) során, amikor<br />
a negatív töltésű üvegfelszín esetleg gátló tényezőként<br />
szerepelhet (pl. nem specifikus kötődés). Műanyagokat<br />
alkalmazva a kedvezőtlen hatásokkal kevésbé<br />
kell számolni, emellett a műanyagból készült kémiai<br />
chipek olcsók, nem törékenyek és könnyen megmunkálhatók.<br />
A chipekben kialakított munkacsatornákban egyszerű<br />
pufferoldatoktól a bonyolult géleken keresztül a<br />
monolitikus elektrokromatográfiás állófázisokig bármilyen<br />
elválasztórendszert alkalmazhatunk. A csatornák<br />
a mikrochip felszínén lévő nyílásokban végződnek,<br />
amelyek az oldatok (minta, puffer, szeparáló<br />
mátrix) betöltésére szolgálnak (lásd 3-3. ábra). Az<br />
ide csatlakozó elektródok segítségével az egyes csatornákban<br />
különböző nagyságú és polaritású elektromos<br />
mezők alakíthatók ki, amelyek alkalmasak a<br />
mikrochipben lévő anyagok mozgatására és a mintakomponensek<br />
elektroforetikus elválasztására.
62 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
A detektálás a mikrochipeken főképpen lézer indukálta<br />
fluoreszcencia (LIF) segítségével biztosítható,<br />
de emellett más, hagyományos fotometriai (pl. ultraibolya<br />
fényelnyelés) vagy elektrokémiai (vezetőképesség-mérés,<br />
amperometria), valamint tömegspektrometriai<br />
technikák is alkalmazhatók.<br />
A leggyakrabban használt egyszerű mikrochipalkalmazások<br />
mellett (DNS-fragmentum-analízis,<br />
fehérjék SDS-gélelektroforézise, komplex szénhidrátok<br />
elválasztása stb.) olyan integrált rendszereket is<br />
kidolgozhatunk, melyek korábban a konvencionális<br />
módszerek alkalmazásával elképzelhetetlenek voltak.<br />
A kapilláris-elektroforetikus eljárások lefedik az<br />
összes elektroforetikus elválasztási módszert, azaz zónaelektroforézis,<br />
izoelektromos fókuszálás, izotachoforézis,<br />
gélelektroforézis, micelláris elektrokinetikus<br />
3-4. ábra. Peptidek zónaelektroforézise. (Kísérleti körülmények:<br />
kapilláris 50 μm × 24 cm, feszültség 10 kV, hőmérséklet<br />
25 °C, háttérelektrolit: 50 mM foszfátpuffer, pH<br />
2,5, detektálás: 200 nm.) A peptidek a negatív pólus felé<br />
vándoroltak<br />
kromatográfia és elektrokromatográfia. Mindegyik<br />
módszer alkalmas fehérjék analízisére és elválasztására,<br />
mégis a fehérjeanalízisekben elsősorban zónaelektroforézist,<br />
izoelektromos fókuszálást, gélelektroforézist<br />
és micelláris elektrokinetikus kromatográfiát<br />
használnak.<br />
Zónaelektroforézis kapillárisban. A legegyszerűbb<br />
zónaelektroforézis a leggyakrabban alkalmazott fehérjeanalitikai<br />
módszer a kapilláris-elektroforézis<br />
technikák közül. A natív körülmények között, a pufferelt<br />
közeg pH-ját erősen figyelembe vevő elektroforézis<br />
aminosavak, peptidek, de akár komplex fehérjekeverékek<br />
nagy felbontású elválasztására képes. Az<br />
üvegkapillárisban 2,5-ös pH-jú foszfátpufferben végrehajtott<br />
peptidanalízis a kapilláris-elektroforetikus<br />
elválasztások fontos standard módszere (3-4. ábra). A<br />
„szabad” oldatban végzett elektroforézis nem a molekulatömeg<br />
alapján választ el.<br />
A szérumelektroforézist natív körülmények között<br />
végrehajtva a klinikai-kémiai diagnosztikában alkalmazható<br />
eredményeket kapunk (3-5. ábra).<br />
Gélelektroforézis molekulatömeg-meghatározásra<br />
mikrochipanalízisekben. Az SDS-PAGE (dodecil-szulfát<br />
poliakrilamid gél elektroforézis) kapilláris<br />
formában is megvalósítható, és ez a technika a legjobban<br />
elterjedt miniatürizált kapilláris-elektroforézis<br />
technikák egyike. A kapillárisban (mikrochip-kapillárisban)<br />
végzett gélelektroforézishez lineáris<br />
(nem térhálós) gélt használnak, mert a térhálós (keresztkötött)<br />
poliakrilamid gél a kapilláris-elektroforézis<br />
körülményei között csak néhány fehérjeminta<br />
analízisére alkalmas és az elkészítés módja alapján<br />
a kapillárisból nem távolítható el (nem cserélhető),<br />
s így csak korlátozott mértékben automatizálható.<br />
A dinamikus molekulaszűrésnek (dynamic molecular<br />
sieving) megfelelő körülményeket dextrán, polietilén-oxid<br />
vagy lineáris poliakrilamidláncok biztosítják.<br />
A fehérjékhez tapadó dodecil-szulfát-láncok<br />
minden saját töltést elfedő, nagy negatív töltése miatt<br />
a fehérje-dodecil-szulfát komplexek szabad oldatban<br />
azonos töltés/tömeg arányuk miatt azonos sebességel<br />
vándorolnának, de a lineáris polimer-láncok jelenlétében<br />
– amelyek úgy viselkednek a gyakorlatban,<br />
mint egy térhálós polimer – a komplexek molekulatömegüknek<br />
(méretüknek) megfelelően vándorolnak<br />
az elektromos térben.
Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
63<br />
3-5. ábra. Szérumelektroforézis<br />
natív körülmények között.<br />
(Kísérleti körülmények: kapilláris<br />
50 μm × 44 cm, feszültség<br />
15 kV, hőmérséklet 25 °C, háttérelektrolit:<br />
30 mM borátpuffer,<br />
pH 10, detektálás: 215 nm)<br />
A molekulatömeg a kalibrációs molekulatömegmeg<br />
határozás segítségével (3-6. ábra a, b) meghatározható.<br />
A fehérjék mennyiségének a biológiai folyamatok<br />
függvényében történő változása nagyon érzékenyen<br />
követhető nyomon a mikrochipanalízisekkel. A csökkentett<br />
vasmennyiséget tartalmazó táptalajon tenyésztett<br />
baktériumok külső membránfehérjéinek menynyiségi<br />
változása az elektroforetikus fehérjeprofilban<br />
érzékenyen tükröződik. A 3-7. ábra mutatja a Pseudomonas<br />
aeruginosa NIH Hungary 170 000 baktériumtörzs<br />
külső membránfehérjéinek profilját teljes táptalajon,<br />
ill. vasat nem tartalmazó táptalajon való tenyésztés<br />
során. A vasmentes körülmény legalább egy fehérje<br />
(92 kDa, 31 s) nagymértékű termelődését idézte elő.<br />
Izoelektromos fókuszálás fehérjék jellemzésére. Az<br />
izoelektromos fókuszálás az elektroforetikus technikák<br />
közül az egyik legnagyobb felbontással képes amfoter<br />
jellegű komponenseket, esetünkben fehérjéket jellemezni.<br />
Az akár egy aminosav különbség következtében<br />
előforduló izoformák elválasztása az izoelektromos<br />
pont alapján nagy érzékenységgel lehetséges. Az<br />
izoelektromos fókuszálást önállóan vagy egy másik<br />
technikával kapcsoltan is fel lehet használni. A technika<br />
speciálisan igényli olyan nagy elektroforetikus<br />
mozgékonyságú, amfoter komponensek, amfolitok<br />
alkalmazását, amellyel az elválasztás során (előtt) egy<br />
alkalmas pH-gradiens alakítható ki. Az amfolitok poliamino-polikarboxi-savak,<br />
amelyek egy alacsony és<br />
egy magas pH-jú elektrolitoldat között, elektromos tér<br />
3-6. ábra. Elektroforézis (kísérleti körülmények: készülék: Bioanalyzer 2100, Agilent, Germany; Protein 80 mikrochip)<br />
a) Standard fehérjekeverék mikrochipen végrehajtott elektroforézise<br />
b) A „markerek” és az ismert molekulatömegű fehérjék segítségével a vándorlási idő meghatározásával az ismeretlen fehérjék<br />
molekulatömege meghatározható
64 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
3-7. ábra. Baktérium külső membránfehérje-profiljában bekövetkező változások<br />
nyomon követése gélelektroforézissel microchipen. A Pseudomonas aeruginosa<br />
NIH Hungary 170 000 törzs normális táptalajon való tenyésztése során (folytonos<br />
vonal) kilenc fő komponens látható, míg a vasat nem tartalmazó táptalajon (szaggatott<br />
vonal) egy fehérje (10-es) fokozott termelődése volt észlelhető. [A kísérletek<br />
a Bioanalyzer 2000 (Agilent) készüléken, a Protein 200 Labchip Kit felhasználásával<br />
készültek. A fluoreszcens festékkel megjelölt fehérjék vándorlását lineáris polimer<br />
jelenlétében LIF (lézerindukált fluoreszcencia) detektorral követték.]<br />
hatására mobilitásuknak (izoelektromos<br />
pontjuknak) megfelelően<br />
sorba állnak, és nagy pufferkapacitásuknak<br />
megfelelően<br />
a kialakuló pH-gradiensben az<br />
amfoter fehérjék fókuszálódását<br />
idézik elő. A fókuszálási lépés<br />
során 1000–3000-szeresre töményedő<br />
fehérjezónák detektálása<br />
vagy az egész pH-gradiens „lefényképezésével”,<br />
vagy egy stacionáris<br />
detektor irányában végzett<br />
megfelelő mobilizálási lépés<br />
segítségével lehetséges.<br />
Az izoelektromos fókuszálás<br />
gélben az egész pH-gradiens<br />
egyidejű megfestésével zajlik,<br />
de a kapilláris- vagy chipformátumban,<br />
oldatban végrehajtott<br />
izoelektromos fókuszálás során<br />
általában stacionárius detektorokat<br />
(akár tömegspektrométert)<br />
alkalmaznak.<br />
3-8. ábra. Monoklonális ellenanyag minták izoelektromos fókuszálása standardizált körülmények között (az ábra a fókuszált<br />
zónáknak csak a mobilizálási lépés során történő vándorlási profilját mutatja) (Kísérleti körülmények: 1,8 v% Pharmalyte<br />
pI 3–10 amfolitkeverék által kialakított pH-gradiens, kétlépéses izoelektromos fókuszálás, feszültség a fókuszálás<br />
során 15 kV, mobilizálás 350 mM ecetsavval 30 kV feszültségen, peptidmarkerek koncentrációja: 10 mM, fehérjekoncentráció:<br />
210 mg/ml, detektálás 280 nm-en, mintafelvitel az egész kapilláris hosszában)
Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
65<br />
Az amfoter komponensek izoelektromos pontját<br />
a vándorlás során csak standardok (marker peptidek<br />
vagy fehérjék) segítségével, kalibráció után lehet<br />
meghatározni. Bár a technika gél formátumban<br />
már hosszú idő óta elsősorban a 2D-PAGE technika<br />
alkotórésze, a standardizálás problémái miatt csak<br />
az utóbbi időben sikerült megfelelő, reprodukálható<br />
körülményeket kialakítani kapilláris-elektroforézis<br />
készülékekben. A 3-8. ábra egy standardizált, reprodukált<br />
körülmények között végrehajtott fehérjeanalízist<br />
mutat. A monoklonális ellenanyagok előállítása<br />
során keletkező izoformák kapilláris izoelektromos<br />
fókuszálásával sikeresen lehet a főkomponensek mellett<br />
a kis mennyiségben jelen lévő bázikus és savas<br />
izoformák izoelektromos pontjait reprodukálhatóan<br />
meghatározni.<br />
Az izoelektromos fókuszálás fókuszálási és mobilizálási<br />
lépéseit egy lépésben is meg lehet valósítani<br />
a kapilláris-elektroforetikus eljárások során, az elsősorban<br />
üvegkapillárisokban fellépő elektroendozmózis<br />
jelenségének felhasználásával. A mintát ez esetben<br />
csak a kapilláris egy rövidebb szakaszában viszik fel,<br />
és lehetséges az amfolitok és az elválasztandó komponensek<br />
egymás utáni injektálása is. A nagy felbontású<br />
elválasztás során a komponensek egy időben vándorolnak<br />
a detektor irányába, amely vándorlás során a<br />
3-9. ábra. Hemoglobinvariánsok és -komponensek detektálása<br />
kapilláris izoelektromos fókuszálással egy diabeteses<br />
betegből származó mintában (Az egy lépésben végrehajtott<br />
izoelektromos fókuszálás kísérleti körülményei: feszültség<br />
20 kV, kapilláris 50 μm × 60 cm, katolit: 20 mM<br />
NaOH, anolit: 10 mM foszforsav, injektálási paraméterek:<br />
1. 2% Pharmalyte 6,7–7,7 – 3000 mbar·s; 2. 1 mg/ml hemoglobinminta<br />
– 500 mbar·s; 3. 2% Pharmalyte 3–10 – 1500<br />
mbar·s.) A magas glikált HbA 1c<br />
-szint a diabetesre jellemző.<br />
fókuszálódás is lezajlik. A 3-9. ábra hemoglobinvariánsok<br />
izoelektromos fókuszálással való minőségi és<br />
mennyiségi meghatározását mutatja egy diabeteses<br />
betegből származó mintában.<br />
Fehérjék azonosítása és meghatározása<br />
a proteomikában<br />
A genomika célja egy élő szervezet teljes genomjának<br />
a feltérképezése. A genetikai állományban rejlő információ<br />
megismerésének célja az adott gén által expresszált<br />
polipeptidek meghatározása. A génexpreszszió<br />
tanulmányozható mRNS- vagy fehérjeszinten,<br />
de tekintettel arra, hogy az mRNS mennyisége nincs<br />
összefüggésben a megfelelő fehérje mennyiségével,<br />
ezért a génexpresszió vizsgálatának pontosabb módja<br />
az expresszált fehérje meghatározása.<br />
A proteomika kifejezést először 1995-ben használták<br />
egy sejt, szövet vagy szerv összes fehérjéjének<br />
kvalitatív és kvantitatív meghatározására. A proteom<br />
a genom által kifejezett teljes fehérjeállomány (PRO-<br />
TEins expressed by the genOM).<br />
A megfelelő felbontású elválasztástechnika kialakulásával,<br />
a kétdimenziós gélelektroforézis segítségével<br />
lehetővé vált (először radioaktívan jelzett)<br />
fehérjék tanulmányozása. A technika nagy felbontóképessége<br />
néhány ezer fehérje elválasztását is lehetővé<br />
teszi egyetlenegy gélben. A gélen elválasztott kis<br />
mennyiség megfelelő érzékenységű fehérjeazonosítási<br />
technikáknak, úgymint pl. elektrospray ionizációs<br />
(ESI) és mátrixszal segített lézer deszorpciós-ionizációs<br />
(MALDI) tömegspektrometriának az alkalmazását<br />
igényli.<br />
A proteomikai módszereknek ma már több csoportját<br />
különböztetjük meg: expressziós proteomika,<br />
funkcionális proteomika, fehérje-fehérje kölcsönhatás,<br />
strukturális (szerkezeti) proteomika, fehérje<br />
poszttranszlációs módosítások vizsgálata. Az expreszsziós<br />
proteomika egy adott minta különböző körülmények<br />
között expresszálódott fehérjéinek mennyiségi<br />
összehasonlítására szolgál. Az eljárás során lehetőség<br />
nyílik up- vagy down-regulált fehérjék meghatározására.<br />
A funkcionális proteomika a fehérjék szerepének<br />
meghatározását vizsgálja különböző életfolyamatokban<br />
és változó környezeti körülmények között. A<br />
szerkezeti (strukturális) proteomika célja egy fehérje-
66 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
komplex vagy egy adott sejtszerv összes fehérjéjének<br />
azonosítása és szerkezetének meghatározása. A fehérjék<br />
poszttranszlációs módosításainak tanulmányozása<br />
során többek között a fehérjék közötti jelátvitelben<br />
kiemelkedő fontosságú foszforilációnak vagy pl.<br />
a fehérjék egymás közötti kölcsönhatásaiban, ill. az<br />
enzimatikus aktivitást meghatározó glikolizációnak a<br />
szerepét vizsgálják.<br />
A fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatának<br />
fontos szerepe van pl. az anyagcsere-folyamatok megismerésében.<br />
A metabolizmusban részt vevő enzimek<br />
specificitásukat nemegyszer fehérjekomplexek formájában<br />
érik el, más enzimekkel vagy alegységekkel<br />
összekapcsolódva. E fehérjekomplexek összetételének,<br />
szerkezetének tanulmányozása az anyagcsereutak<br />
mélyebb megértését eredményezheti.<br />
A fehérjék szeparálása és azonosítása alapján a proteomikai<br />
vizsgálatok a következő csoportokba sorolhatók:<br />
• A natív, tisztított vagy elválasztástechnikával<br />
(pl. kapilláris-elektroforézissel) elválasztott<br />
fehérjék tömegspektrometriás analízise.<br />
• A kétdimenziós gélelektroforézissel elválasztott<br />
fehérjék azonosítása enzimatikus emésztés után<br />
tömegspektrometriával.<br />
• A fehérjékből enzimatikus emésztéssel előállított<br />
peptidkeverék elemzése és feldolgozása<br />
folyadékkromatográfiával (LC) vagy kapilláris-elektroforézissel<br />
(CE), amelyet aztán tömegspektrometriás<br />
azonosítás követ.<br />
• Mikroarray-technikák.<br />
A tömegspektrometriának (a módszer részletes tárgyalása<br />
a 7. fejezetben található) számos alkalmazási<br />
lehetősége ismert a fehérjekémiában, úgymint: peptidek<br />
és fehérjék tömegmeghatározása; izolált fehérjék<br />
(HPLC, PAGE) primer szerkezetének felderítése;<br />
poszttranszlációs módosítások (acilezés, formilezés,<br />
amidálás, foszforilezés, szulfatálás, glikozilezés) detektálása,<br />
azonosítása és lokalizálása; fehérjebontási<br />
termékek, metabolitok azonosítása; fehérje–ligandum<br />
kötődések vizsgálata; enzimek aktív helyeinek<br />
felderítése; diszulfidhidak helyeinek feltérképezése.<br />
A proteomikai vizsgálatokban az elválasztott fehérjék<br />
azonosítására, szekvenciájuk meghatározására az<br />
elektrospray-tömegspektrometria (ESI-MS) és mátrixszal<br />
segített lézer deszorpciós-ionizációs repülési<br />
idő tömegspektrometria (MALDI-TOF) technikát<br />
3-10. ábra. A 2D-PAGE segítségével, elektroforetikusan elválasztott<br />
fehérjék azonosításának lehetséges módjai<br />
alkalmazzák, kapcsolva esetleg más, tandem tömegspektrometriás<br />
(MS/MS) szekvenálási módszerekkel.<br />
Az egyik lehetőség a „peptide mass mapping”,<br />
amelynek lényege, hogy a meghatározni kívánt fehérjét<br />
specifikus enzimmel (általában tripszinnel) vagy<br />
kémiai reagenssel fragmenseire bontják, redukálják,<br />
alkilálják, majd közvetlenül (nano-ESI vagy MAL-<br />
DI) vagy HPLC-vel való elválasztás után (LC-MS)<br />
tömegspektrométerrel meghatározzák az egyes peptidek<br />
tömegét. Ezek a peptidtömegek szolgálnak bemeneti<br />
adatként a számítógépes adatbázis-kiértékelő<br />
programban, amely az adatbázisban lévő fehérjék<br />
összes lehetséges fragmentálási reakciónak megfelelően<br />
összeveti a lehetséges fragmensadatokat a kísérletekkel<br />
meghatározott tömegadatokkal. Már 3-4<br />
peptidtömeg elég lehet egy fehérje azonosítására, és<br />
lehetőség szerint a szekvencialefedettség minimum<br />
15% legyen. A tandem tömegspektrometriás eljárások<br />
segítségével tovább pontosíthatjuk az azonosítást.<br />
A tömegspektrometriás „peptide mass mapping”<br />
gyorsasága és nagy érzékenysége miatt ma már nagyon<br />
elterjedt módszer fehérjék 2D gélből való azonosítására<br />
(3-10. ábra).<br />
Fehérjék bioinformatikája<br />
Korunkban a komplex biológiai minták vizsgálatánál<br />
elengedhetetlen az olyan <strong>modern</strong> bioanalitikai<br />
módszerek alkalmazása, mint a genomtérképezés<br />
és szekvenálás, proteomanalízis és -szekvenálás, va-
Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
67<br />
lamint metabolomanalízis és azonosítás. A kapott<br />
adatokat bioinformatikai módszerek segítségével hasonlítjuk<br />
össze a már meglévő adatbázisokkal. Korábban<br />
a kémiai szintézissel előállított molekulákat<br />
egyszerűen próba szerencse alapon vizsgálták. Ma a<br />
nagy mennyiségben rendelkezésre álló kombinatorikus<br />
kémiai könyvtárak lehetővé teszik, hogy milliószámra<br />
vizsgáljunk újabb és újabb vegyületeket. Így<br />
a génszekvenciák és géntermékek ismeretében egyre<br />
inkább áttérünk a biológiai fekete doboz vizsgálatáról<br />
a rendszerbiológiai megközelítésre. A <strong>modern</strong> orvostudományi<br />
kutatások ennek kapcsán genomikai adatbázisokból<br />
kiindulva a transzkriptom, a proteom és a<br />
metabolom feltérképezésén keresztül érnek el újabb<br />
és újabb eredményeket.<br />
A biológiai feladatokkal rendelkező, nagyszámú<br />
alkotóelemből álló rendszerek elemzésére számítógépes<br />
módszerek kidolgozása és alkalmazása vált<br />
szükségessé. A bioinformatika tágabb értelemben a<br />
számítógép segítségével folytatott és a biológiához<br />
kapcsolódó elemző folyamatokat, szűkebb értelemben<br />
a biológiai szekvenciaadatok, ill. a 3D szerkezeti<br />
információk kezelését és elemzését takarja. A bioinformatika<br />
olyan információmenedzselési rendszer a<br />
molekuláris biológia számára, amelynek sok gyakorlati<br />
alkalmazása van. A bioinformatikai ismeretek<br />
terjedésével csökkenhet a tényleges kísérletek elvégzésének<br />
lehetősége, mert a folyamatokat különböző<br />
módokon szimulálhatjuk.<br />
A bioinformatikai ismeretekhez adatbázisokra van<br />
szükség. A feladat többcélú:<br />
• Adatbázisok létrehozása és karbantartása, az<br />
adatok megszervezése, rendezése és az információhoz<br />
való hozzáférésnek, valamint a kiegészítés<br />
lehetőségének biztosítása.<br />
• Eszközök, módszerek kifejlesztése az adatok<br />
elemzésére.<br />
3-2. táblázat. A bioinformatikai adathalmaz jellemzése<br />
Adatforrás Az adathalmaz nagysága Bioinformatikai célok<br />
DNS-szekvenciák<br />
fehérjeszekvenciák<br />
makromolekuláris<br />
szerkezetek<br />
genomok<br />
12 millió szekvencia,<br />
13 milliárd bázis<br />
400 000 szekvencia<br />
(egyenként kb. 300<br />
aminosav)<br />
15 000 szerkezet<br />
(egyenként kb.<br />
1000 atom koordinátái)<br />
300 teljes genom<br />
(egyenként 1,6 millió-<br />
3 milliárd bázis)<br />
génexpressziós adatok legnagyobb: kb. 20<br />
időpont az élesztő kb.<br />
6000 génjénél<br />
egyéb: anyagcsere-útvonalak<br />
a kódoló és nem kódoló régiók elkülönítése<br />
az intronok és az exonok azonosítása<br />
a géntermékek predikciója<br />
igazságügyi elemzések<br />
szekvencia-összehasonlítási algoritmusok<br />
többszörös szekvenciaillesztő algoritmusok<br />
konzerválódott szekvenciamotívumok azonosítása<br />
másodlagos és harmadlagos szerkezet jóslása<br />
3D szerkezeteket illesztő algoritmusok<br />
fehérjegeometriai mérések<br />
felszín, térfogat és alak számítása<br />
intermolekuláris kölcsönhatások<br />
molekulaszimulációk (energiafüggvény, molekuláris<br />
mozgások, dokkolás)<br />
az ismétlődések jellemzése<br />
szerkezetek hozzárendelése génekhez<br />
filogenetikai analízis<br />
genomi méretű felmérések (fehérjetartalom jellemzése,<br />
anyagcsere-útvonalak), kapcsoltság elemzése egyes betegségek<br />
és gének összefüggésének vizsgálatához<br />
az expressziós mintázatok korrelációjának vizsgálata<br />
az expressziós adatok összekapcsolása a szekvencia-, szerkezeti<br />
és biokémiai adatokkal<br />
reakcióútvonal-szimulációk
68 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
• Az eszközök és módszerek alkalmazása az adatok<br />
elemzésére, és az eredmények értelmezése a<br />
biológia szempontjából.<br />
A biológiai információ méretét, forrását és elemzési<br />
módszereit a 3-2. táblázat összegzi. Amint az a táblázatból<br />
is látható, a bioinformatikai módszerek a<br />
genetikai kód és a fehérjeszekvenciák óriási tömegű<br />
adatának kezelését végzik, egymással való összefüggéseit<br />
keresik. Ennek célja a szekvenciákban kódolt<br />
információ megfejtése a térszerkezetek, a funkciók és<br />
az evolúciós összefüggések leírásához. Ehhez páronkénti<br />
szekvencia-összerendezés, többszörös szekvencia-összerendezés,<br />
filogenetikai analízis, nukleotidszekvenciák<br />
analízise, fehérjeszekvenciák analízise,<br />
fehérjeszerkezetek elemzése, fehérjék térszerkezetének<br />
jóslása útján lehet eljutni.<br />
Az adatok kezelésére elsősorban a biológiai hasonlóságok<br />
alapján való csoportosítás alkalmas; pl. a<br />
genomban található ismétlődő szekvenciarészletek,<br />
a funkció (pl. enzimhatás) vagy az anyagcsere-útvonalak<br />
szerint csoportosítható gének, a hasonló a szekvenciájú<br />
különböző fehérjék vagy a véges számú alapvető<br />
fehérjeszerkezet (becslések 1000 és 10 000 közé<br />
teszik) összehasonlítása lehetséges.<br />
Mindezek alapján a feladat a mintázatfelismerés<br />
és a predikció megfelelő alkalmazása. A mintázatfelismerés<br />
célja a hasonlóságok megtalálása, a funkcióra/szerkezetre<br />
jellemző, konzerválódott sajátosságok<br />
felismerése a hasonló funkciójú/szerkezetű<br />
fehérjék vizsgálata alapján, amelyet aztán felhasználhatunk<br />
új szekvenciák funkciójának/szerkezetének<br />
azonosítására. A predikció a funkció vagy a<br />
térszerkezet megjóslása (hasonlóság alapján vagy<br />
másképpen). A bioinformatika egyik fő célja a szekvenciából<br />
megjósolni a térszerkezetet. Tudjuk, hogy<br />
az aminosavsorrend meghatározza a térszerkezetet,<br />
de még ma sem értjük, hogyan. Jelenleg csak a másodlagos<br />
szerkezet jóslása lehetséges, korlátozott<br />
megbízhatósággal.<br />
A bioinformatikai eljárásokban alkalmazott néhány<br />
fogalom a következőképpen írható le. A fehérjék homológiájának<br />
és analógiájának kérdése evolúciós eredetük<br />
szempontjából tárgyalható. Elfogadott állítás,<br />
hogy a szekvenciák esetében megjelenő homológia<br />
megfelel a közös evolúciós eredetnek. Két szekvencia<br />
vagy homológ, vagy nem, amit nem lehet százalékosan<br />
kifejezni (a homológiának nincs mértéke). A két<br />
fehérje közötti analógia azt jelenti, hogy szerkezetük<br />
hasonló, de nincs közöttük szekvenciális hasonlóság,<br />
vagy azonosak a katalitikus csoportjaik, de térszerkezetük<br />
különböző. Az analógia olyan hasonlóság,<br />
amelynek nincs közös evolúciós eredete, valószínűleg<br />
az ún. konvergens evolúció állhat a háttérben; pl. a<br />
szubtilizin és a kimotripszin mindegyike szerin-pro-<br />
a<br />
b<br />
3-11. ábra. Vegyületek térszerkezete<br />
a) Szubtilizin, b) Kimotripszin
Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
69<br />
teáz, azonos His/Asp/Ser katalitikus triáddal, de térszerkezetük<br />
teljesen eltérő (3-11. ábra a, b).<br />
A homológia két típusa az ortológia és a paralógia.<br />
Két gén ortológ, ha két különböző fajban találhatók,<br />
és egy közös ősgénből származnak, amely a<br />
két faj közös ősében volt jelen. A gének ugyanazt a<br />
funkciót szolgálják a két fajban (pl.: a tejsav-dehidrogenáz<br />
az emberben és az egérben). Két gén paralóg,<br />
ha ugyanabban az organizmusban találhatók, és egy<br />
közös ősgénből génduplikáció és azt követő divergens<br />
evolúció útján alakultak ki. Többnyire különböző, de<br />
egymással összefüggésben lévő funkciójuk van (pl. a<br />
hisztidinbioszintézis enzimeinek génjei emberben,<br />
amelyek nagyon hasonló szerkezetűek, de más-más<br />
reakciót katalizálnak).<br />
A bioinformatikai módszerek egyik dimenziója a fizikai<br />
megközelítés, amely szerint veszünk egy fehérjét,<br />
és azt igyekszünk minél mélyebben megérteni (génszekvencia–fehérjeszekvencia–térszerkezet–geometria–kötőhelyek–gyógyszertervezés).<br />
A másik dimenzióban<br />
az informatika segítségével összehasonlításra<br />
kerül sor (páronkénti, majd többszörös szekvenciaillesztés,<br />
szekvenciamintázatok azonosítása, filogenetikai<br />
elemzés, teljes genom elemzése stb).<br />
Az ismert fehérjeszekvenciák és az ismert térszerkezetek<br />
számának növekedése nagymértékű, a szekvenciaadatok<br />
száma az utóbbi években évente folyamatosan<br />
megduplázódik, emiatt a nagy információs<br />
deficit miatt nagy szerepe van a bioinformatikának.<br />
A genomprojektek következtében óriási mennyiségű<br />
genetikai információ áll rendelkezésre, amelyet a<br />
fehérjék vizsgálatára fel lehet használni.<br />
A legfontosabb eljárás a bioinformatikában a szekvenciaanalízis,<br />
amelynek során egy új (ismeretlen<br />
szerkezetű/funkciójú fehérjéhez tartozó) szekvenciához<br />
próbálunk hasonlót találni a már ismert szerkezetű/funkciójú<br />
fehérjék szekvenciái között. Ebben a<br />
szekvenciák összerendezése (vagy -illesztése) (alignment)<br />
segít. A szekvenciaazonosságot ebben az öszszerendezésben<br />
az azonos aminosavpárok százalékos<br />
arányával fejezzük ki. A szekvenciaazonosság csökkenésével<br />
a funkció/szerkezet átvihetősége csökken.<br />
A szekvenciaanalízis során számos probléma merülhet<br />
fel. Az ortológia és a paralógia bonyolult viszonyai<br />
új szekvenciák vizsgálatánál megnehezítik annak<br />
eldöntését, hogy a funkcionális információ mennyire<br />
vihető át az új fehérjére (a talált hasonló szekvencia<br />
lehet az ortológ paralógja egy másik organizmusban).<br />
Emiatt az automatikus funkció-hozzárendelés<br />
sok esetben hibás lehet. A szekvenciahasonlóság<br />
sokszor csak a szekvencia egy részére vonatkozik, pl.<br />
moduláris fehérjék esetében. A moduláris fehérjékben<br />
modulok, olyan fehérjedomének találhatók, amelyek<br />
cserélhető építőkőként szerepelnek. Ezek nem csak<br />
génduplikációval, hanem shuffling révén is terjednek,<br />
3-3. táblázat. A szekvenciaazonosság mértékének jellemzése<br />
Szekvenciaazonosság (%) Zóna Megjegyzés<br />
50-100 biztosra vehető a homológia és a nagyfokú szerkezeti hasonlóság<br />
erősen valószínűsíthető az azonos vagy rokon funkció<br />
20-50 biztosra vehető a homológia és a jelentős szerkezeti hasonlóság<br />
a funkció feltételezhetően azonos vagy rokon<br />
20 körül alkonyzóna<br />
(twilight zone)<br />
0-10 éjfélzóna<br />
(midnight zone)<br />
kétségessé válik a homológia és a szerkezeti hasonlóság<br />
ekkora hasonlóság véletlenül is kialakulhat, egymással nem rokon<br />
fehérjék között is<br />
kifinomult módszerek szükségesek a homológia detektálásához<br />
a szekvencia sokszor nem elég, térszerkezeti információ is szükségessé<br />
válik a rokonság mértékének eldöntéséhez<br />
esetleg fennállhat funkcionális és szerkezeti hasonlóság a két fehérje<br />
között, de ezt a szekvencia alapján nem lehet eldönten<br />
az esetleges rokonságot csak más információk alapján (elsősorban<br />
térszerkezet) lehet megállapítani
70 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei<br />
a<br />
b<br />
3-12. ábra. Vegyületek térszerkezete<br />
a) a-laktalbumin, b) Lizozim<br />
funkciójuk változhat attól függően, milyen fehérje részét<br />
képezik. Sajnos az evolúció nagyon változatosan<br />
használja fel a modulokat, ezért az új szekvenciák kb.<br />
egyharmadának egyáltalán nem lehet a funkciójára<br />
következtetni az ismert funkciójú fehérjék szekvenciái<br />
alapján. S végül a nagy szekvencia- és szerkezeti<br />
hasonlóság sem jelent mindig funkcionális azonosságot<br />
vagy rokonságot. A 3-12. a, b ábra az 50% szekvenciaazonosságú,<br />
lényegében azonos térszerkezettel<br />
rendelkező a-laktalbumint és lizozimot mutatja,<br />
ugyanakkor a két fehérjének teljesen más a funkciója.<br />
A lizozim a baktériumok sejtfalát emészti, míg az<br />
a-laktalbumin a laktóz-szintáz szabályozófehérjéje.<br />
Összefoglalva a bioinformatikai programok, eljárások,<br />
algoritmusok nem végleges, biztos válaszokat<br />
adnak, csak segítenek leszűkíteni a lehetőségek körét<br />
és kísérleteket tervezni a kérdések eldöntésére. A valódi<br />
válaszokat a biológiai háttérismeretek fényében<br />
találhatjuk meg.<br />
Irodalom<br />
Gáspár A.: Kapilláris zónaelektroforézis. (Jegyzet) Debreceni<br />
Egyetem, Debrecen, 2000.<br />
Righetti, P. G. (ed.): Capillary Electrophoresis in Analytical<br />
Biotechnology. CRC, Boca Raton, 1996.<br />
Kilár, F., Végvári, A., Mód, A.: New setup for capillary<br />
isoelectric focusing in uncoated capillaries. J. Chromatogr.<br />
813:349–360, 1998.<br />
Kustos, I, Andrasfalvy, M, Kustos I. et al.: Effect of iron<br />
restriction on outer membrane protein composition of<br />
Pseudomonas strains studied by conventional and microchip<br />
electrophoresis. Electrophoresis 26:3789–3795,<br />
2005.<br />
Scott Mack, Cruzado-Park, Ingrid, Chapman, J. et<br />
al.: A systematic study in CIEF: Defining and optimizing<br />
experimental parameters critical to method reproducibility<br />
and robustness, Electrophoresis 30:4049–<br />
4058, 2009.<br />
Zvelebil, Marketa, Baum, J. O.: Understanding bioinformatics.<br />
Garland Science, New York, 2008.<br />
Bioinformatikai webhelyek, EMBL, SRS, NCBI (Medline,<br />
Genbank, stb.), Expasy, Swissprot, Amos, CCP11 projekt
4. Az analitikai kémia módszerei<br />
a fehérjekutatásban – Fehérjeelválasztási<br />
és fehérjedetektálási technikák<br />
Ludány Andrea, Kőszegi Tamás<br />
Elektroforézis mint elválasztási technika<br />
A klinikai kutatásban használatos<br />
módszerek áttekintő ismertetése<br />
Az elektroforetikus eljárások alkalmasak a fehérjék<br />
mint töltéssel rendelkező ún. amfotér molekulák szeparálására.<br />
A fehérjemolekulák elektromos térben<br />
vándorlásra képesek. A különböző molekulák aktuális<br />
ionizáltsági állapota a vezetőképességet biztosító<br />
médium, rendszerint egy pufferoldat adott pH-jától<br />
függ. Minél távolabbi az amfotér fehérjemolekula<br />
izoelektromos pontja ettől az értéktől, annál nagyobb<br />
a vándorlási sebessége az ellenkező pólus felé. A vándorlási<br />
sebességet nem csak a töltés, hanem a molekula<br />
mérete is befolyásolja (fordított arányban). Az<br />
elválasztandó fehérjék és a hordozó anyagának kölcsönhatásai<br />
miatt ez utóbbiak szerkezete is hatással<br />
van a vándorlási sebességre. A különböző töltéssel<br />
és mérettel rendelkező fehérje-összetevők adott vándorlási<br />
idő elteltével a vizsgálandó mintára jellemző<br />
elektroforetikus megoszlási képet eredményeznek.<br />
A hordozók szerint megkülönböztetünk papír-,<br />
keményítő gél-, nitrocellulóz membrán, agar/agaróz<br />
gél, poliakrilamidgél-elektroforézist. A felsorolás egymásutánisága<br />
utal a történeti sorrendiségre is. Ezek<br />
egyik része elsősorban rutin klinikai kémiai eljárásként<br />
nyert teret, míg mások – így a poliakril amidgél<br />
(PAG) alapú elválasztás – a kutatásokban kaptak elsődlegesen<br />
szerepet.<br />
Formailag a hordozók szilárdságuktól függően<br />
vagy önállóan (áthidalásokkal kiegészítve) képesek<br />
a minta közegét biztosítani, vagy támasztékot (üveg,<br />
műanyag lemez, cső, kapilláris) igényelnek a funkciójukhoz.<br />
A készülékek tartozékai:<br />
• az „elektroforézis-futtatókád”, ami manapság<br />
már a legkülönbözőbb alakot veheti fel, és nem<br />
is hasonlít kádhoz. Inkább hídnak mondanánk,<br />
amely a két elektromos pólus között feszül ki, és<br />
a hordozókkal együtt a vándorlási teret biztosítja.<br />
• Mindenképpen része a rendszernek a két elektród,<br />
amely az egymástól elválasztott puffertankokba<br />
merül, valamint az áramforráshoz kapcsolódik.<br />
• Az áramforrások egyenáramot szolgáltatnak.<br />
Pulzáló vagy folyamatos áramerősséget, ill.<br />
feszültséget képesek szabályozni.<br />
Gélelektroforetikus technikák – PAGE<br />
Az elválasztási technikák közül legflexibilisebbek a<br />
poliakrilamidgél (PAGE) alapú eljárások. Ennek oka,<br />
hogy itt a gélkoncentráció tetszőleges tartományban<br />
alakítható ki, és jól is reprodukálható. A polimerizáció<br />
két alapkomponense az akrilamid-monomer és a<br />
metilén-bisz-akrilamid keresztkötő reagens. A polimerizációnak<br />
két útja lehet:<br />
• Fotopolimerizáció (riboflavin + UV-kezelés).<br />
• Kémiai polimerizáció (ammónium-perszulfát).<br />
Az utóbbi használata elterjedtebb, jóllehet oxidációs<br />
hatása nem egészen közömbös az érzékeny molekulakomplexeknél.<br />
A fotopolimerizációt korábban a nem<br />
denaturáló IEF-nél írták le, de ma már ehhez is a kémiai<br />
polimerizációt használják.<br />
Csöves és lapgél módszerek egyaránt ismertek.<br />
Mindkét módszerrel kivitelezhetők többszörös és<br />
szinkron mintaanalízisek.
72 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
Preparatív és analitikai PAGE-eljárások<br />
A poliakrilamidgél-elektroforézisek vertikálisan<br />
(függő/álló helyzetben), pl. rudakban (üvegcsövekben)<br />
és lapgélekben (üveglemezek között kiöntött kazettákban),<br />
valamint horizontálisan fektetett lemezen<br />
is végezhetők.<br />
A vertikális rendszerek rendszerint vastagabbak,<br />
több gél egymás melletti futtatására is alkalmasak, a<br />
pufferoldattal közvetlen kontaktusban vannak, nagyobb<br />
mintamennyiséget képesek felvenni. Kezelésük<br />
egyszerűbb, nem kíván különösebb óvatosságot.<br />
Magától értetődően ezek alkalmasabbak a mikropreparatív<br />
módszerekre is (4-1., 4-2. ábra).<br />
A planáris horizontális gélek igen vékony gélfilmet<br />
alkotnak, izoelektromos fokuszálásra is ideálisak.<br />
Nem szükséges üveglap a gél kialakításához. Ehhez a<br />
rendszerhez lehet leginkább hozzájutni a kereskedelmi<br />
forgalomban, kész változatban is. Izoelektromos<br />
fokuszálásra különösen ajánlottak a non ekvilibrium<br />
pH-gradiensek futtatásához.<br />
Amint említettük, kereskedelmi kiszerelésben ún.<br />
kész gélek kaphatók, de házilag készített változatok<br />
is használatosak. Jóllehet a saját készítésű rendszerek<br />
munka- és időigényesek, de ezeket lehet leginkább<br />
kutatási célokra a vizsgálandó mintákhoz kívánság<br />
szerint megfelelően igazítani.<br />
Homogén és gradiens gélek<br />
A gél koncentrációja szerint lehet lágy vagy tömör gél.<br />
A polimerizált gél pórusmérete a monomerkoncentráció<br />
függvénye. Munkánk tervezésekor a vizsgálandó<br />
fehérjeelegy összetétele és a célfehérje molekulamérete<br />
szerint állítható össze a szeparálógél<br />
szerkezete. Az egyébként kémiailag inert gélhálózat<br />
„lágyabb” gélnél (5–10%-os AA-koncentráció) a nagyobb<br />
fehérjemolekuláknak kedvez, míg kis molekulatömegű<br />
fehérjékhez rigidebb gél (13–15%) ajánlott.<br />
Tudnunk kell, hogy a polimerizáció hőmérsékletfüggő,<br />
és a reakció folyamán hőfejlődés észlelhető. Az<br />
inkomplett polimerizáció megelőzésére 20 °C fölött<br />
kell a környező hőmérsékletet tartani. A gél oxigénelnyelésének<br />
minimalizálására a gél kiöntésekor annak<br />
felszínét vákuumal „gáztalanítjuk” és folyadékkal<br />
felülrétegezve a külső légtértől lezárjuk. (Így egyúttal<br />
egyenletes polimerizációs felszínt nyerhetünk.)<br />
Az elválasztóképesség növelésére fejlesztették ki az<br />
ún. diszkontinuus (homogén) és a gradiens géleket.<br />
• A diszkontinuus gél [13] nevét onnan kapta,<br />
hogy két egymás fölött képzett gélmezőt tartalmaz.<br />
Ebből már következik, hogy a vertikális<br />
szisztémák épülnek ily módon fel. A fölső ún.<br />
–<br />
+<br />
4-1. ábra. Preparatív lap-gélelektroforézis (Nem denaturáló<br />
alkalikus gél – PAGE – preparatív elektroforézis; minta:<br />
szérumfehérjék, amidofekete festés; a festés kizárólag demonstráció<br />
céljából készült)<br />
a<br />
4-2. ábra. Analitikai poliakrilamid-gélelektroforézis (festés:<br />
amidofekete)<br />
(Nem denaturáló alkalikus gél – PAGE: 5–15% gradiens<br />
gél; minta: humán szérumalbumin „mentesítése”)<br />
a) Kezeletlen minta<br />
b) Kezelt minta<br />
b
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
73<br />
gyűjtő- (stacking) gél feladata valamennyi gélbe<br />
vándorló fehérjemolekula összegyűjtése a lényegi<br />
szeparálódás előtt. A pórusmérete nagy, ezért<br />
nem akadályozza az extrém nagy molekulák<br />
gélbe hatolását sem. Az alsó szeparálógél koncentrációját<br />
a várható molekulaméretű fehérjeelegy<br />
ideális elválasztásához állítjuk be.<br />
• Gradiens gél elkészítésénél az ioncserés kromatográfiás<br />
eljárások puffer/só oldatainak hígításaihoz<br />
(gradienseihez) hasonlóan lineárisan<br />
vagy exponenciálisan folyamatosan változó gélkoncentrációt<br />
alakítunk ki a vertikális lemez<br />
kazettarendszerében.<br />
A munkafolyamat, csak röviden, a lényeget kiemelve:<br />
A lezárt keverőtankból folyamatosan rétegezve folyatjuk<br />
a monomerkeveréket a feltöltendő kazettába. Az<br />
elfolyás egy tároló (rezervoár) magas koncentráció jú<br />
tankból azonos sebességgel pótlódik. Az ily módon<br />
létrehozott koncentrációváltozás exponenciális öszszefüggést<br />
mutat (lásd később, a Protokollok című<br />
fejezetrészben). Különösen jó eredményt lehet elérni<br />
az O’Farrell-féle kétdimenziós fehérjetérképezésnél.<br />
Natív és denaturáló PAGE-rendszerek<br />
Natív fehérjekomplexek vizsgálata. Már a minták<br />
előkészítésével kezdődik a két eljárás megkülönböztetése.<br />
A mintafeltárás, a szolubilizálás és a tisztítási<br />
lépés során végig szem előtt kell tartani a biológiailag<br />
aktív fehérjekomplexek védelmét, aktívitásuk megőrzését.<br />
Proteolízisgátlás, oxidatív károsító effektusok<br />
kivédése, fehérjeaggregáció elkerülése, fiziko-kémiai<br />
ágensek hatásának megakadályozása egyaránt szerepet<br />
kap a minták előkészítésében. Előtisztításként pl.<br />
a gélszűréses eljárások jönnek leginkább számításba.<br />
A legismertebb PAGE-technika, melyet magunknak<br />
is alkalmunk volt számos esetben sikeresen alkalmazni,<br />
a nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis.<br />
A mintákat gélrudakban, de lapgélben is elektroforetizálhattuk.<br />
A biológiai funkciót a gélrudak szegmentjeiben<br />
(a kiszemelt frakciók magasságában) akár<br />
biokémiai módszerekkel kontrollálhattuk.<br />
Említést érdemel a rutin klinikai vizsgálatok sorában<br />
a mostanra kifejlesztett és automatizálásra alkalmas<br />
agarózgél-elektroforézis (HYDRAGEL), amely<br />
szintén nem denaturáló rendszernek tekinthető. Igazolja<br />
ezt a különböző izoenzimdetektálási technika,<br />
melyeket számos mintánál diagnosztikusan is felhasználunk.<br />
Denaturáló PAGE-rendszerek. Denaturáló elektroforetikus<br />
eljárásokat különböző biológiai mintákra<br />
célirányosan dolgoztak ki az ismert kutatócsoportok.<br />
• Savanyú urea gél elektroforézis. Az eljárást<br />
ismert, nagyon hidrofób és bázikus fehérjék<br />
urea jelenlétében való PAGE-szeparálására fejlesztették<br />
ki. A magfehérjék, köztük a hiszton<br />
típusúak, térképezését ezzel az ureatartalmú,<br />
savanyú típusú (ecetsavas) szeparálási móddal<br />
indítottuk.<br />
• Laemmli-féle SDS gél elektroforézis. Ez a legismertebb<br />
denaturáló PAGE módszer. Nem lehet<br />
olyan fehérjeanalitikával foglalkozó közleménynyel<br />
találkozni, mely ne használná vagy ne idézné<br />
ezt a szellemes és sikeres frakcionálást. Az<br />
SDS-sel borított szolubilizált fehérjemolekulák<br />
az ionos detergenssel bevonva elvesztik eredeti<br />
töltésüket, és elsődlegesen molekulatömegük<br />
szerint vándorolnak a gélben. A kicsik gyorsabban,<br />
a nagyobbak egyre lassabban mobilizálódnak.<br />
Fontos tudni – és ez a kísérő molekula<br />
markerek vándorlási sebességéből is kiderül –,<br />
hogy nem lineáris, hanem logaritmusos az<br />
összefüggés a két tulajdonság (molekulaméret<br />
és sebesség) között.<br />
Izoelektromos fokuszálások<br />
poliakrilamid- (PAG-) és agarózgélben<br />
A fejezetben megemlített egydimenziós PAGE részletezésén<br />
túl az izoelektromos fokuszálás mint elválasztási<br />
technika itt kiemelést érdemel, jóllehet elvileg<br />
lényegesen különbözik az előzőktől.<br />
Az izoelektromos fokuszálás töltéssel rendelkező molekulák<br />
szeparálása izoelektromos pontjuk szerint. A<br />
savba merülő pozitív pólus (anód) és a lúgba merülő<br />
negatív pólus (katód) között létrehozott mesterséges,<br />
pH-gradienst „szállító” (carrier) amfolit molekulák<br />
hozzák létre. Ezek szintetikus oligoamino/oligokarboxil<br />
savak keveréke, alacsony molekulatömeggel és<br />
eltérő izoelektromos ponttal. Az áram rákapcsolásával<br />
az egyébként nagy diffúziós sajátságú amfolitok<br />
közül az alacsony pI-értékűek az anód felé, a magas<br />
pI-értékkel bírók a katód felé mozdulnak, és pufferolt
74 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
pH-gradienst hoznak létre. Az egyes amfolitok addig<br />
vándorolnak, amíg el nem érik az izoelektromos<br />
pontjuknak megfelelő pH-értéket, majd ott maradnak.<br />
(Az izoelektromos pontjukon túlhaladva ugyanis<br />
megfordul vándorlási irányuk, kilépni a hordozóból<br />
ezért nem tudnak.) Az így elkészült pH-„grádics”<br />
most már készen várja a hasonló amfotér tulajdonságú<br />
fehérjemolekulákat a minta felvitele után. Az amfolitok<br />
nagy pufferkapacitással rendelkeznek, és nincs<br />
biológiai hatásuk.<br />
Az izoelektromos fokuszálás különböző hordozókban<br />
mehet végbe (agaróz-, PAG-, szacharózoszlop,<br />
immobilizált réteg stb.). Ismerünk natív és denaturáló<br />
fokuszáló rendszereket.<br />
Izoelektromos fokuszálás immobilizált pH-gradiens<br />
gélben (IPG). Bevezetésre került az immobilizált<br />
pH-gradiens (IPG) fogalma, amely az izoelektromos<br />
fokuszálásban új távlatokat nyitott. Számos méretben<br />
és különböző pH-tartományban kereskedelmi forgalomban<br />
megvásárolható.<br />
Az immobilizált pH-gradiens olyan akrilamidszármazékokból<br />
épül fel, amelyek pufferoló csoportokkal<br />
az immobilinokkal együtt kopolimerizálódtak az akrilamidgélben.<br />
Előnye, hogy stabil és reprodukáható<br />
gradienst lehet létrehozni, igen nagy felbontóképességgel<br />
(a finom pH-érték-különbségek miatt). Megfelelő<br />
tápegységet (magas feszültség) és horizontális<br />
szeparálásra alkalmas felszerelést (tankot) igényel.<br />
Alkalmazása forradalmasította a 2D-elektroforéziseket.<br />
Kétdimenziós elválasztások kombinációi<br />
Az elválasztások felbontóképessége a kétdimenziós<br />
módszerek bevezetésével természetesen tovább növelhető.<br />
A gradiens-gél-elektroforézisek csak a második<br />
dimenzióban kaphattak teret, de az első dimenziós<br />
elektroforézisek/izoelektromos fokuszálások<br />
színes változatai kínálják a különböző kombinációs<br />
lehetőségeket. Fejezetünkben ezekről részletesebb<br />
módszertani ismertetőt adunk.<br />
• Nem denaturáló alkalikus gél + SDS elektroforézis<br />
(4-3. ábra, 4-4. ábra).<br />
• Savanyú urea gél + SDS-gélelektroforézis<br />
• Denaturáló IEF + SDS gradiens vagy homogén<br />
gélelektroforézis.<br />
Fehérjedetektálási technikák<br />
a klinikai kutatómunkában<br />
A fejezet az elektroforetikusan elválasztott fehérjefrakciók<br />
megjelenítési módjait taglalja. A detektálási<br />
módok fajlagosságukban és érzékenységükben jelentősen<br />
különbözők lehetnek. A minták analízisénél a<br />
helyesen kiválasztott és alkalmazásra kerülő jelöléssel<br />
keressük a választ feltett kérdéseinkre.<br />
4-3. ábra. 2D PAGE alkalmazása albumin/biszalbumin<br />
frakciók vizsgálatára (festés: CBB; nem denaturáló 1. dimenzió<br />
+ SDS lapgél 2. dimenzió)<br />
1. Humán szérumalbumin<br />
2. Biszalbumin<br />
4-4. ábra. 2D PAGE alkalmazása szérumglobulinok megjelenítésére<br />
(Nem denaturáló 1. dimenzió + SDS lapgél 2.<br />
dimenzió; minta: albumin-„mentesített” humán szérum,<br />
festés: CBB)
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
75<br />
Izotópos jelölés<br />
Izotópjelölési módok rendszerint élő sejtekre alkalmazhatók.<br />
Kellő érzékenységű detektálási lehetőséget<br />
kínálnak, és mennyiségi értékelésre is alkalmasak.<br />
Leggyakrabban baktériumok és sejtek/szövetek kultúráiban,<br />
de kísérleti állatoknál is használatos módszer.<br />
A fémek (pl. Zn és Cd) izotópjainak beépülését<br />
a fehérjekomplexeikben nem magában a hordozó<br />
gélekben, hanem az eltávolított/kimetszett frakciók<br />
aktivitásának mérésével in vitro igazoljuk. A lágy<br />
b-sugárzó izotópok (H, C, P, S) jelenlétében optimális<br />
jelölési effektust érhetünk el a minták elektroforetikus<br />
szeparálását követően magában a gélben is. A<br />
detektálás megfelelő fényátalakító (szcintillációs) kezeléssel<br />
autoradiográfiásan, helyesebben fluorográfiásan<br />
kivitelezhető és dokumentálható.<br />
Festékkötéses jelölés<br />
Festékkötésen alapuló eljárások mind agaróz-, mind<br />
poliakrilamidgélre széles körben elterjedtek. Általános<br />
fehérjefestésként a leginkább ismert az amidofekete<br />
és a Coomassie Brilliant Blue (R250 és G250) festés.<br />
Az utóbbi festék csaknem valamennyi fehérjéhez<br />
és peptidhez mennyiségileg is értékelhetően kapcsolódik,<br />
érzékenysége 0,1 µg.<br />
Alternatívaként negatív festés érhető el az imidazol-cink<br />
(Hardy és mtsai, 1996) technikával, mely<br />
az előbbieknél jóval érzékenyebb. A detektálási limit<br />
15 ng-nál van. Ennél a módszernél a köztes terek festődnek<br />
és nem a proteinek, ami a további kinyerések<br />
számára és egy tervezett tömegspektrometriás fehérjeazonosításnál<br />
előnyt jelent.<br />
Ezüstözés<br />
Ezüstözési eljárásoknál direkt és kombinált jelölési<br />
módok különböztethetők meg. A direkt ezüstözés a<br />
fehérjemolekulákat közvetlenül jelöli, míg a kombinált<br />
eljárások egy megelőző fehérjefestéssel párosulnak.<br />
A nagyszámú (több mint 50) közölt eljárásnál<br />
mind ezüst-nitrátos, mind ezüst-diaminos változatok<br />
szerepelnek. A legérzékenyebb detektálás akár 0,2 ng<br />
fehérjét tartalmazó foltot is képes megjeleníteni. A<br />
változatok nem mindegyike alkalmas viszont proteomikai<br />
vizsgálatokra, mert nem MS-kompatibilisek.<br />
A módszerek rendszerint többlépcsősek, a reagensek<br />
(víz) tisztasága és a rendszer keratinszennyeződéstől<br />
óvása elengedhetetlen a sikeres vizsgálatok érdekében.<br />
Fluoreszcens festés<br />
A fluoreszcens festési eljárások kevésbé érzékenyek<br />
(2–8 ng limittel), mint az ezüstözési technikák. Menynyiségi<br />
méréshez viszont széles lineáris tartománnyal<br />
rendelkeznek, és MS-kompatibilisek is. A kereskedelmi<br />
forgalomban kapható festékek sajnos igen drágák,<br />
és az értékeléshez scanner vagy CCD-kamera szükséges.<br />
A detektálórendszernek megfelelő hullámhosszú<br />
fényforrással és szűrőkkel kell rendelkeznie, hogy különböző<br />
festékeket alkalmazhassunk.<br />
Immunreakción alapuló jelölés<br />
Immunreakción alapuló azonosítások agarózban és<br />
PAGE-szeparálás és transzfer után blotting membránfelszínen<br />
(Western blotting).<br />
Agarózban mind elektroforetikus szeparálással kombinálva,<br />
mind a nélkül a rendkívül fajlagos antigén–<br />
antitest találkozás lejátszható. Az agarózgél pórusai<br />
megengedik a makromolekulák diffúzióját is, és a<br />
két immunkomponens között a megfelelő arányban<br />
létrejövő „találkozás” látható, festéssel jól detektálható<br />
precipitációt eredményez. Ezek a fajta vizsgálatok<br />
egyébként kontrollok használata mellett akár szemikvantitatív<br />
értékelést is lehetővé tesznek a klinikai/<br />
biológiai laboratóriumokban.<br />
A Western blotting ma már a legtöbb laboratóriumban<br />
elsajátított rutin eljárásnak számít. Mi magunknak<br />
is módunk volt mindkét alapvető blottolási módszert<br />
kipróbálni. Az ún. nedves módszer vertikális<br />
(függőleges) kazettában és pufferoldatba merülő<br />
elektroforetikus fehérjetranszfert jelent. A félszáraz<br />
módszernél a transzfer horizontális grafitlemezek<br />
között történik, csak nedvesített szűrőpapírrétegek<br />
áramvezetésével.<br />
A blotting lépései egész röviden a következők:<br />
• Elektroforézis (pl. PAGE).<br />
• Elektroforetikus transzfer nitrocellulózmembránra.
76 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
• A membrán blokkolása (a szabad kötőhelyek<br />
lefedése immunológiailag inert makromolekulával).<br />
• Primer antitestkezelés és mosás.<br />
• Szekunder (jelölt) antitestkezelés és mosás.<br />
• A jelölőreakció lejátszása (előhívás).<br />
Az előhívás a jelölőreakciónak megfelelően végzendő<br />
(pl. peroxidáz alapú reakciók változatai: diaminobenzidin<br />
– DAB – vagy NiDAB és ezüstözés).<br />
A mennyiségi mérésre is alkalmas, igen érzékeny<br />
kemilumineszcens reakciók műszeres értékelése a fehérjefrakciók<br />
azonosításán túl új távlatokat nyitott a<br />
kutatásnak (piko- és femtomol koncentrációkról van<br />
szó). Nem utolsósorban megfelelő készülékeket használva<br />
a minták dokumentációja is megoldott.<br />
Protokollok – A klinikai kutatásban<br />
általunk adaptált és alkalmazott elválasztási<br />
és fehérjejelölési eljárások<br />
Fejezetünk következő részében olyan szeparálási/<br />
elektroforetikus (túlnyomórészt PAGE) technikákat<br />
és detektálási eljárásokat közlünk, amelyek a tervezett<br />
proteomikai vizsgálatok alapját képezhetik. A leírások<br />
különös információs értéke abban rejlik, hogy<br />
valamennyi módszer általunk kidolgozott, ma is sikeresen<br />
alkalmazható és többszörösen kipróbálásra<br />
került klinikai kutatásunkban.<br />
Hangsúlyoznunk kell, hogy az esetek túlnyomó részében<br />
az ismertetett eljárások leginkább azért tűnnek<br />
hagyományosnak, mert mellőzik a kereskedelmi<br />
forgalomban kapható ún. kész reagens összeállításokat.<br />
Ezt elsősorban nem financiális ok, hanem mindenkori<br />
kutatási célunk változó igényei indokolták.<br />
Elválasztási technikák<br />
Nem denaturáló és denaturáló PAGE<br />
gélrudakban és lapgéleken<br />
Nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis<br />
(Ornstein és Davis szerint)<br />
Az egydimenziós poliakrilamidgél-elektroforézis<br />
nem denaturáló közegben különösen alkalmas biológiai<br />
fehérjekomplexek elválasztására és a funkcionálisan<br />
megtartott fehérjék in situ gélben való detektálására.<br />
Mind gélrudakban, mind vertikális géllapon<br />
elvégezhető (4-5. ábra a, b).<br />
Oldatok:<br />
1. Pufferoldat a gélelegyhez (A):<br />
36,3 g TRIS és kb. 48 ml 1M sósav elegye, 8,9<br />
pH-t eredményez.<br />
Az oldatot 0,46 mL TEMED (N,N,N , ,N-tetra-metilén-diamin)<br />
hozzámérése után 100 mL-re<br />
egészítjük ki desztillált vízzel.<br />
a<br />
b<br />
4-5. ábra. Nem denaturáló PAGE<br />
a) Sephadex G-75 gélkromatográfiás<br />
cink-fehérje frakciók „fehérjeképe”<br />
(festés: amidofekete)<br />
b) Sephadex G-75 kromatográfiás<br />
frakció összehasonlító vizsgálata:<br />
Zn 65 -aktivitások a nem denaturáló<br />
PAGE-szegmentekben)
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
77<br />
2. Akrilamid-keverék (B):<br />
45 g akrilamidot és 1,2 g metilén-bisz-akrilamidot<br />
oldás után 100 mL-re egészítünk ki desztillált<br />
vízzel.<br />
3. Ammónium-perszulfát-oldat (C):<br />
28 mg ammónium-perszulfátot 20 mL desztillált<br />
vízben oldunk. Az oldat a gélkészítés előtt közvetlenül,<br />
mindenkor frissen készítendő!<br />
4. Mintapuffer az alkalikus gél elektroforézishez:<br />
14,25 g TRIS-t vízben oldás után 1M H 3<br />
PO 4<br />
-gyel<br />
(kb. 64 mL) 6,9 pH-ra hozunk elektromos pH-mérővel<br />
kontrollálva, majd 1000 mL-re egészítjük ki<br />
desztillált vízzel. A pufferoldat 5-szörös töménységű<br />
törzsoldatot képez, ezért a használathoz<br />
desztillált vízzel 5-szörösére hígítjuk. A hígított<br />
mintapuffer a denzitás növelésére, a minták felülrétegzésének<br />
megkönnyítésére 10% glicerint is tartalmaz.<br />
5. Futtatópuffer:<br />
12 g TRIS-t és 57,6 g glicint oldás után 1000<br />
mL-re egészítünk ki desztillált vízzel. A pufferoldat<br />
pH-ja 8,3. A használatos puffert az említett oldat<br />
10-szeres hígításával készítjük.<br />
A gélek elkészítése:<br />
8 mL gélkeverékhez az AA-koncentrációtól függően<br />
a 4-1. táblázatban szereplő adatok alapján mérjük<br />
össze a komponenseket. Ha nagyobb gélmennyiség<br />
szükséges, ezek többszöröseit alkalmazzuk. (A szükséges<br />
mennyiség a lapgélek, ill. a gélcsövek méretéből<br />
és számából adódik.)<br />
A gélelegy összekeverése és vákuum alatti gáztalanítása<br />
után az üvegcsöveket megtöltjük. Majd felülrétegzése<br />
következik 50-50 μL desztillált vízzel.<br />
4-1. táblázat. Alkalikus gél keverék készítése nem denaturáló<br />
alkalikus gél elektroforézishez<br />
Kívánt gélkoncentráció 5% 7,5% 10%<br />
A oldat 1 mL 1 mL 1 mL<br />
B oldat 0,87 mL 1,3 mL 1,78 mL<br />
H 2<br />
O 2,11 mL 1,70 mL 1,22 mL<br />
C oldat 4 mL 4 mL 4 mL<br />
Minta-előkészítés alkalikus gélhez:<br />
A fehérjetartalmú mintákat mintapufferben oldjuk.<br />
A minták gélre való felvitele után azt óvatosan felülrétegezzük<br />
a futtatópufferrel. Alkalikus közegben a fehérjék<br />
anionként az anód felé vándorolnak, így a pozitív<br />
pólus (anód) alul helyezkedik el a kádrendszerben.<br />
Elektroforézis:<br />
2 mA/cső konstans áramerősség mellett elektroforetizálunk.<br />
Jelzőfestékként brómfenolkéket tehetünk<br />
a mintákhoz. Az elektroforézis az alatt megy végbe,<br />
amíg a szabad festék a gélcső alsó részét eléri.<br />
Festés:<br />
Az üvegcsövekből eltávolított géleket 1%-os amidofekete<br />
oldatával festhetjük.<br />
A festékoldat összetétele: 10 g amidofekete, 70 mL<br />
jégecet, 100 mL metanol; desztillált vízzel 1 literre<br />
egészítjük. A festés időtartama 1 óra.<br />
Differenciálás:<br />
7% ecetsav, 10% metanol vizes oldatában, a differenciálóoldat<br />
többszöri váltogatásával.<br />
Denaturáló SDS-gélelektroforézis<br />
(Laemmli szerint)<br />
Egydimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis SDS-t<br />
és b-merkaptoetanolt tartalmazó denaturáló közegben.<br />
A fehérjék molekulatömegük szerint vándorolnak.<br />
A gélcső vagy a lapgél ún. „disc” (nem folytonos)<br />
elektroforézist képez, ugyanis felső gyűjtőgélt és alsó<br />
szeparálógélt tartalmaz az élesebb elválasztás céljából<br />
(4-6. ábra a, b).<br />
Oldatok:<br />
1. Akrilamidelegy (A):<br />
30% akrilamidot és 0,8% metilén-bisz-akrilamidot<br />
tartalmaz:<br />
30 g akrilamid<br />
0,8 g bisz-akrilamid oldása után 100 mL-re egészítjük<br />
ki desztillált vízzel.<br />
2. TRIS-puffer az alsó gélelegyhez (pH 8,8) (B):<br />
18,17 g TRIS-t vízben oldunk. pH-ját 6M sósavval<br />
elektromos pH-mérő kontrolljával 8,8-re állítjuk<br />
(kb. 20–25 mL).
78 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
4 mL 10%-os vizes SDS-oldatot adunk hozzá,<br />
majd desztillált vízzel 100 mL-re egészítjük ki.<br />
3. TRIS-puffer a felső gélelegyhez (pH 6,8) (C):<br />
6,06 g TRIS-t oldás után 6N sósavval 6,8-es pH<br />
ra hozunk.<br />
4 ml 10%-os SDS hozzámérése után desztillált<br />
vízzel 100 mL-re egészítjük ki.<br />
4. Pufferoldat az elektroforézishez (D):<br />
4-szeres töménységű TRIS-glicin törzsoldat (pH<br />
8,3).<br />
12 g TRIS-t + 57,6 g glicint oldás után desztillált<br />
vízzel 1000 mL-re egészítünk ki.<br />
5. Mintapuffer (E):<br />
– 10 mL glicerin<br />
– 5 mL b-merkaptoetanol<br />
– 30 mL 10%-os SDS<br />
12,5 mL felső gél TRIS-puffer elegyét desztillált<br />
vízzel 100 mL-re egészítjük ki.<br />
6. Ammónium-perszulfát-oldat (AP) (F):<br />
200 mg ammónium-perszulfátot 2 mL desztillált<br />
vízben oldunk. A gélkészítés előtt mindenkor<br />
frissen készül!<br />
A gélek elkészítése:<br />
Megfelelően tisztított üveglemezeket (esetleg üvegcsöveket)<br />
függőleges helyzetben a gélkiöntő állványba<br />
erősítünk. A gélkiöntéséhez a kívánt gélkoncentrációtól<br />
függően a 4-2. táblázat szerint oldatkeveréket<br />
készítünk. A táblázatban megadott mennyiség két 9<br />
× 12 cm-es szeparálógélhez (0,75 mm vastagságnál)<br />
elegendő.<br />
4-2. táblázat. Gélkészítés denaturáló Laemmli szerinti<br />
SDS-gélelektroforézishez<br />
Alsó (futtató/szeparáló) gél<br />
Kívánt gélkoncentráció 10% 12,5% 15%<br />
H 2<br />
O 4,2 mL 3,45 mL 2,5 mL<br />
A oldat 3,4 mL 4,15 mL 5,0 mL<br />
B oldat 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL<br />
F oldat 30 µL 30 µL 30 µL<br />
TEMED 5 µL 5 µL 5 µL<br />
Felső (gyűjtő/koncentráló) gél<br />
Az alsó gél koncentrációjától függetlenül<br />
azonos gélelegyet készítünk<br />
H 2<br />
O<br />
A oldat<br />
C oldat<br />
F oldat<br />
TEMED<br />
2,9 mL<br />
0,83 mL<br />
1,25 mL<br />
15 μL<br />
5 μL<br />
a<br />
4-6. ábra. SDS-lapgél<br />
a) Detektálás: Coomassie Brilliant Blue (CBB) R250 (minta: 6 klinikai beteg széruma, M: marker)<br />
b) Detektálás: CBB + kombinált ezüstözés (minta: 6 klinikai beteg széruma, M: marker)<br />
b
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
79<br />
A gélelegy összekeverése után a cellákat megtöltjük.<br />
Felülrétegzését 0,1%-os SDS-oldattal végezzük.<br />
A „kondenzvíz” kiitatása után 2–2,5 mL-t rétegezünk<br />
az alsó gél fölé. A fésűk behelyezése buborékmentes<br />
legyen.<br />
A minták előkészítése az elektroforézishez:<br />
1. A fehérjemintát ún. mintapufferben oldjuk (E oldat).<br />
2. 2-3 percig 100 °C-on forraljuk.<br />
3. 0,1%-os brómfenolkékoldatból 5 μL-t adunk a molekulatömeg-jelölő<br />
fehérjékhez, majd a mintákat a<br />
gélekre visszük (10–20 µL térfogatban).<br />
4. A felülrétegezésre futtatópuffert használunk (lásd a<br />
következő pontban).<br />
Futtatópuffer:<br />
125 mL D oldatot (4-szeres töménységű) és 5 mL<br />
10%-os SDS-oldatot 500 ml-re egészítünk ki desztillált<br />
vízzel.<br />
Elektroforézis<br />
Az SDS-sel fedett fehérjemolekulák anionként az<br />
anód felé vándorolnak. Az elektroforéziskészülék alsó<br />
tankjába merül a pozitív pólus (anód).<br />
A minicellánál konstans, 150 V feszültséggel elektroforetizálunk,<br />
míg a brómfenolkék jelzőfesték éppen<br />
az alsó gél végéig vándorol (ez kb. 45 perc).<br />
Festés (4-7. ábra a, b):<br />
Coomassie Brilliant Blue-val, 2 óra hosszán át a<br />
következő összetételű festékoldatban:<br />
– 1 g CBB (Coomassie Brilliant Blue) R-250<br />
– 450 mL víz<br />
– 450 mL metanol<br />
– 100 mL jégecet<br />
Differenciálás:<br />
Differenciálóoldat:<br />
– 100 mL ecetsav<br />
– 450 mL metanol<br />
– 450 mL víz<br />
Ezeket elegyítjük, ebben differenciáljuk, az oldat<br />
többszörös cseréjével.<br />
Kétdimenziós PAGE denaturáló<br />
rendszerben<br />
Nagy felbontású kétdimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis<br />
technika (O’Farrell). Denaturáló<br />
jellegű kétdimenziós poliakrilamidgél-elektroforézis.<br />
Az első dimenzió izoelektromos fokuszálás urea és<br />
redukáló ágens (b-merkapto-etanol, ditiotreitol vagy<br />
ditioeritrol) jelenlétében. Adaptáló kezelést követően<br />
az izoelektromos fokuszált gélcsöveket – vagy<br />
az immobilizált pH-gradiensen elválasztott fehérjéket<br />
– SDS-elektroforézisnek vetjük alá, homogén<br />
gélkoncentrációjú vagy exponenciális gradiens gélkoncentrációjú<br />
poliakrilamidgélben. Míg az első dimenzió<br />
során a peptidláncok izoelektromos pontjuk<br />
szerint, a második dimenzió során molekulatömegük<br />
szerint vándorolnak a poliakrilamidgélben.<br />
a<br />
4-7. ábra. Lizált mosott vörösvértestek fehérjéi (M: marker)<br />
a) CBB R250 festéssel SDS-lapgélen<br />
b) CBB + kombinált ezüstözéssel<br />
b
80 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
Izoelektromos fokuszálás gélcsövekben<br />
Az izoelektromos fokuszálás oldatai:<br />
A. Lízispuffer a minták szolubilizálásához.<br />
Az oldat összetétele:<br />
– 9,5 M urea (5,7 g)<br />
– 2% Nonidet P-40 detergens (tömeg/térfogat%)<br />
– 5% b-merkaptoetanol (térfogat%/térfogat%)<br />
– 1,6% pH 5–8-as Amfolit/Servalit (0,4 mL)<br />
– 0,4% pH 3–10-es Amfolit/Servalit (0,1 mL)<br />
A zárójelben feltüntetett adatok 10 mL mintapufferre<br />
vonatkoznak. Az amfolit cégenként változó<br />
névvel kereskedelmi forgalomban kapható. Az<br />
A oldat 1 ml-es adagokban –20 o C-on tárolandó.<br />
A lízispuffer az ureát a fehérjék oldatban tartásához<br />
telített oldatban tartalmazza. A detergensek<br />
a szolubilizáláshoz természetesen kizárólag nem<br />
ionos vagy ikerionos detergensek lehetnek (pl. NP-<br />
40 vagy Triton X-100) az izoelektromos fokuszálás<br />
miatt.<br />
D. Akrilamid törzsoldat izoelektromos fokuszáláshoz:<br />
30%-os<br />
28,38%-os akrilamid és 1,62%-os metilén-biszakrilamid<br />
vizes oldata.<br />
10 mL elkészítése javasolt, 4 °C-on tárolandó.<br />
E. Nonidet P-40 (vagy Triton X-100) detergens törzsoldata:<br />
10 tömeg/térfogat%-os.<br />
10 mL oldatot készítünk, és 4 °C-on tároljuk.<br />
G. Ammónium-perszulfát 10 tömeg/térfogat%-os vizes<br />
oldata. (1 mL elkészítése javasolt; frissen készül.)<br />
H . 8 M-os urea vizes oldata. Az ureából ún. „ultrapure”<br />
tisztaságú készítmény ajánlott. 4,8 g ureát<br />
vízben oldunk, majd 10 mL-re egészítjük ki. Tárolása<br />
–20 °C-on javasolt.<br />
I. Izoelektromos fokuszáláshoz anódoldat: 0,01 M-s<br />
H 3<br />
PO 4<br />
.<br />
85%-os H 3<br />
PO 4<br />
(analitikai tisztaságú) 0,67 mL-ét<br />
hígítjuk 1 literre desztillált vízzel. Az anódoldat az<br />
izoelektromos fokuszálás során a vertikális kamrarendszerben<br />
alul helyezkedik el, és mint a nevéből<br />
is kiderül, a pozitív pólus merül bele.<br />
J. Katódoldat: 0,02 M-s NaOH; 1,6 g NaOH granulált<br />
készítményt oldunk 2 liter desztillált vízben.<br />
Mind az anód-, mind a katódoldat 20 °C-on tárolható.<br />
K. Felülrétegző oldat: 8 M ureát és 1% Amfolit/Servalit<br />
keveréket tartalmaz.<br />
– 0,8% pH 5–8-as Amfolit/Servalit (0,2 mL).<br />
– 0,2% pH 3–10-es Amfolit/Servalit (0,05 mL).<br />
4,8 g ureát oldás után az Amfolittal összekeverünk,<br />
és desztillált vízzel 10 mL-re egészítjük ki. 1<br />
mL-es adagokban –20 °C-on fagyasztva tároljuk.<br />
A gélcsövek elkészítése és előfokuszálás<br />
10 ml gélkeverékhez az alábbi mennyiségek szükségesek:<br />
– 1,5 g ultra-pure urea<br />
– 1,33 ml akrilamid törzsoldat (D)<br />
– 2 mL NP-40 törzsoldat (E)<br />
– 1,97 mL víz<br />
– 0,4 mL pH 5–8-as Amfolit<br />
– 0,1 mL pH 3–10-es Amfolit<br />
A keverék igen kevés vízben oldandó az urea nagy<br />
térfogata miatt!<br />
A receptben feltüntetett vízmennyiség elegendő a<br />
10 mL-es össztérfogathoz.<br />
Teljes oldódás után<br />
– 10 μL 10%-os ammónium-perszulfát (G)<br />
– 7 μL TEMED hozzámérése biztosítja a polimerizációt.<br />
A polimerizálatlan gélelegyet igen vékony hosszú<br />
üvegcsövekbe töltjük (mi 20 cm-re vágott 1 mL-es<br />
botpipettákat használunk erre a célra). Felülrétegzését<br />
50-50 μL 8 M ureaoldattal (H) végezzük.<br />
1-2 óra állás után a már megpolimerizált gélekről<br />
a H oldatot 50-50 μL lízispufferrel (A) cseréljük le. A<br />
lízispuffer fölé 20-20 μL desztillált vizet rétegzünk a<br />
bekoncentrálódás, ill. az ureakiválás megelőzésére.<br />
Újabb 1-2 óra állás után friss lízispufferrel (A) előzetes<br />
izoelektromos fokuszálást végzünk. Ennek célja<br />
az Amfolit pH-gradiensének kialakítása a minták felvitelének<br />
időpontjára.<br />
Az egydimenziós elektroforézis kamrarendszerbe,<br />
vertikális helyzetben felerősítjük az Amfolit-tartalmú<br />
gélcsöveket. Az alsó puffertankba kerül a sav, míg a
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
81<br />
felső puffertankba a lúg. A savba merül a pozitív, a<br />
lúgba pedig a negatív pólus.<br />
Konstans feszültség mellett az alábbiak szerint izoelektromos<br />
fokuszálást végzünk ennél a lépésnél:<br />
– 200 V/15 perc<br />
– 300 V/30 perc<br />
– 400 V/30 perc<br />
Az előfokuszálást követően a készüléket kikapcsoljuk,<br />
a katódoldatot elöntjük, majd a csövek felső részét<br />
a lúgtól szűrőpapír csíkokkal leitatjuk.<br />
A minták felvitele és izoelektromos fokuszálása<br />
A fehérjetartalmú mintákat A oldatban oldjuk, ill.<br />
szükséglet szerint a kívánt fehérjekoncentrációnak<br />
megfelelően hígítjuk. 20–100 μl térfogatban ajánlott<br />
a minták gélre rétegzése, melyet K oldattal való felülrétegzés<br />
követ. 50-50 μl K oldat védi meg a mintákat<br />
a közvetlen lúghatástól.<br />
Friss NaOH-oldattal feltöltjük a csöveket és a fölső<br />
pufferkamrát. Az izoelektromos fokuszálás 12 órán<br />
át konstans feszültség mellett 400 V-on megy végbe.<br />
Az elválasztott frakciók élesítése végett befejezés előtt<br />
800 V-on 1 órán át fokuszálunk.<br />
Az üvegcsövekből eltávolított géleket a szükségletnek<br />
megfelelőn detektáljuk (festés, izotópaktivitás-mérés,<br />
pH-mérés stb.), vagy a második dimenziós<br />
elválasztáshoz adaptáló kezelésnek vetjük alá.<br />
Az izoelektromosan fokuszált gélcsíkok festése<br />
Ha a minta nem kerül második dimenziós elválasztásra,<br />
a gélcsíkok fehérjefrakcióit megfesthetjük. A<br />
festés során nem csak az elválasztott fehérjefrakciók<br />
detektálására, hanem azok fixálására és a szintén festődő,<br />
tehát zavaró Amfolit eltávolítására is szükség<br />
van. Mindezek elérésére a gélrudakat a következő kezelésnek<br />
vetjük alá:<br />
1. 50% triklórecetsav és 0,1% Coomassie-Brilliant-Blue<br />
tartalmú vizes oldatban 1 órát kezeljük a<br />
géleket.<br />
2. Tovább festjük, majd differenciáljuk ORTEC szerint<br />
65 o C-on, az ún. gyorsfestési eljárással.<br />
• Festés az alábbi festékoldatban 1 órán át 65<br />
o<br />
C-on.<br />
– 45 rész etanol<br />
– 45 rész 0,2%-os CBB vizes oldata<br />
– 10 rész ecetsav<br />
• Differenciálás és rehidrálás:<br />
– 25 rész etanol<br />
– 10 rész ecetsav<br />
– 65 rész víz elegyében kétszer 60 percig 65<br />
o<br />
C-on.<br />
A metakromáziásan festődő fehérjefrakciók<br />
előhívására és a gélek tárolására 10%-os ecetsavat<br />
használunk.<br />
Második dimenzió; SDS-elektroforézis<br />
homogén vagy exponenciális gradiens<br />
poliakrilamidgélben<br />
Oldatok:<br />
L. 0,4%-os SDS-tartalmú alsó gél puffer: 1,5 M-s<br />
TRIS-sósav, pH 8,8.<br />
36,34 g TRIS-t vízben oldunk, 2 M sósavval<br />
pH-mérő kontrolljával 8,8 pH-ra titráljuk, majd<br />
0,8 g SDS-t oldunk az elegyben. 200 ml-re desztillált<br />
vízzel feltöltjük. 4 °C-on tárolandó.<br />
M. Felső gél puffer: 0,4% SDS-tartalmú, 0,5 M-s<br />
TRIS-sósav, pH 6,8.<br />
6,05 g TRIS-t oldunk desztillált vízben, 2 N sósavval,<br />
6,8 pH-ig titrálunk, majd 0,4 g SDS-t oldunk<br />
hozzá, és 100 ml-re desztillált vízzel feltöltjük.<br />
4 °C-on tárolandó.<br />
Megjegyzendő, hogy ugyanez a puffer készül az<br />
O oldathoz is, de SDS nélkül.<br />
N. 30%-os akrilamid-törzsoldat SDS-gélhez;<br />
29,2 g akrilamidot és 0,8 g metilén-biszakrilamidot<br />
desztillált vízben oldunk és 100 ml-re jelig<br />
hígítjuk. 4 °C-on tárolandó.<br />
O. SDS mintapuffer; 10% glicerint, 5% b-merkaptoetanolt,<br />
valamint 2,3% SDS-t tartalmazó 0,0625<br />
M-s TRIS-sósav puffer (pH 6,8).<br />
Az SDS nélküli M oldatból 12,5 ml-t veszünk,<br />
10 ml glicerint, 5 ml b-merkaptoetanolt, valamint<br />
2,3 g SDS-t adva hozzá desztillált vízben feloldjuk,<br />
és 100 ml-re egészítjük ki. 4 °C-on tárolandó.<br />
P. 1% agaróztartalmú O oldat az első dimenziós gélcsíkok<br />
beágyazásához; 10 ml-t készítünk:<br />
100 mg agarózt oldunk 10 ml O oldatban melegítéssel.<br />
A gélbeágyazás előtt, frissen készítjük.
82 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
Q. Futtatópuffer SDS-elektroforézishez<br />
0,025 M TRIS, 0,192 M glicin-, valamint 0,1%<br />
SDS-tartalmú oldat.<br />
10-szeres töménységű törzsoldat készítése javasolt,<br />
amely 20 °C-on tárolható.<br />
l liter törzsoldathoz az alábbi mennyiségeket<br />
mérjük ki:<br />
30,28 g TRIS-t, 139,27 g glicint, 10 g SDS-t oldunk<br />
desztillált vízben, és 1 literre feltöltjük. A<br />
törzsoldat 10-szeres vizes hígításából készül a mindenkori<br />
futtatópuffer.<br />
R. 50% triklórecetsavat, valamint 0,1% Coomassie<br />
Brillant Blue-t tartalmazó vizes festékoldat a géllemezek<br />
festéséhez. 1000 g triklórecetsavat 1 liter<br />
vízben oldunk és 1 g CBB-t (melyet megelőzően<br />
desztillált vízben oldunk) adunk hozzá.<br />
S. Dehidrálófolyadék a megfestett és fixált géllemezek<br />
kezeléséhez: 50% etanolt, 7% jégecetet, valamint<br />
0,005% CBB-t tartalmazó oldat.<br />
T. 7% ecetsavtartalmú rehidráló, differenciáló oldat.<br />
A második dimenziós géllemez elkészítése (4-8.<br />
ábra a, b).<br />
Általában az elektroforézist megelőző napon<br />
készítjük el a futtatógélt. Használható homogén<br />
koncentrációjú géllap, de készíthetünk ún. exponenciális<br />
konvex gradiensgélt is. Ez utóbbi felel<br />
meg az eredeti O’Farrell elválasztási technikának.<br />
A rendelkezésünkre álló oldatokból 5–22,5%-os<br />
akrilamidgél-koncentráció alakítható ki.<br />
100 × 140 × 2 mm 1-1 lemez mérete, 2 lemezt<br />
elektroforetizálunk egyszerre. A szükséges gélkeverék<br />
60 ml össztérfogatú.<br />
A gél kialakításánál a következő térfogatarányokat<br />
kell betartani:<br />
0,25 térfogat alsó gél puffer (L).<br />
A gélkoncentrációtól függően 0,75 térfogatot<br />
képvisel az akrilamid-törzsoldat (N) és a hígító víz<br />
együttes mennyisége.<br />
A polimerizációhoz 0,0033 térfogat 10%-os ammónium-perszulfát-oldat<br />
(G), valamint 0,0005<br />
térfogat TEMED szükséges.<br />
Gradiensgélnél a nagy gélkoncentrációjú komponens<br />
hígítójaként víz helyett 75%-os glicerint<br />
tartalmaz, és a G oldat térfogataránya 0,00145-re<br />
csökkentett.<br />
Homogén gélkoncentráció kialakítása lemezben<br />
Példa homogén 12,5%-os géllemez kiöntéséhez (60<br />
ml össztérfogat esetén).<br />
– 15 ml L oldat<br />
– 25 ml N oldat<br />
– 20 ml víz<br />
– 200 μl G oldat<br />
– 30 μl TEMED<br />
Összekeverés után az összeállított második dimenziós<br />
géltartályokat megtöltjük ezzel az eleggyel, majd kb. 1<br />
ml desztillált vízzel felülrétegezzük. 1 óra elteltével a<br />
polimerizáció végbemegy, majd 4-szeresre hígított L<br />
oldattal cseréljük le a felülrétegező vizet. Az így előkészített<br />
alsó, ún. futtató/szeparáló gél másnapig eláll.<br />
4-8. ábra. Gélek kiöntése<br />
a) Gradiens gélek kiöntése<br />
b) Homogén gélek kiöntése<br />
c) A konvex gradiens gél készítési elve<br />
Konvex gradiens gél kialakítása<br />
Exponenciálisan növekvő konvex gradiens gélkoncentráció<br />
kialakítása azért ajánlott, hogy a második<br />
dimenziós géllapon a molekulatömeggel lineáris vándorlási<br />
sebességet érjünk el a fehérjéknél a géllapon.<br />
A különböző molekulatömegű fehérjék így egyenletesen<br />
oszlanak el a géllemezben. A gélkialakítás az<br />
egyre fokozódó koncentrációjú gél alárétegzésével ér-
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
83<br />
hető el, ez legegyszerűbben a tankok alulról való feltöltésével<br />
érhető el keveredés nélkül. Az egyre változó<br />
gélkoncentráció konstans térfogatú keverőtank és változó<br />
térfogatú feltöltő-, rezervoártank összekapcsolásával<br />
alakítható ki (lásd a 4-8. b ábrát).<br />
A konstans térfogatú keverőtankból töltjük fel a<br />
géllemezeket. Az alacsony gélkoncentrációjú komponenssel<br />
levegőmentesre feltöltjük a keverőtankot,<br />
és egyrészt a géllemezekhez, másrészt a rezervoártankhoz<br />
csatlakoztatjuk. A rezervoártankból befolyó<br />
magasabb gélkoncentrációjú oldat áramlási sebessége<br />
megegyezik a géllapok feltöltési sebességével, így a<br />
keverőtank térfogata a feltöltés során változatlan marad.<br />
A keverőkamrában a gélkoncentráció folyamatosan<br />
változik a következő egyenlet szerint:<br />
C = C 2<br />
-(C 2<br />
-C 1<br />
) exp -K<br />
ahol<br />
C: a keverőtankból eltávozó folyadék koncentrációja<br />
a kérdéses időpontban, ill. volumennél.<br />
C 1<br />
: a keverőkamra kezdeti gélkoncentrációja.<br />
C 2<br />
: a rezervoártankban lévő, tehát a keverőtankba bemenő<br />
folyadék gélkoncentrációja.<br />
K: a keverőtankból eltávozott folyadék térfogataránya<br />
a keverőtankban lévő fix volumenhez képest a kérdéses<br />
időpontban (K = v /V).<br />
Példák exponenciális konvex gradiens gél kialakítására:<br />
A lemezek kiöntéséhez az említett méretek mellett<br />
60 ml gélre van szükség. 60 ml konstans keverőtank-térfogat<br />
mellett az alacsony gélkoncentrációból<br />
60 ml-t, a magasabb gélkoncentrációból (a lemezekhez<br />
szükséges gélmennyiség szabályozza) szintén 60<br />
ml-t készítünk.<br />
1. példa<br />
60 ml 5%-os gélhez<br />
(keverőtankban)<br />
15 ml L 15 ml L<br />
10 ml N 30 ml N<br />
60 ml 15%-os gélhez<br />
(rezervoár tankban)<br />
35 ml víz 15 ml 75%-os glicerin<br />
200 μl AP (G) 90 μl AP (G)<br />
30 μl TEMED 30 μl TEMED<br />
E gélkeverék elkészítése után a 60 ml elfolyási pontnál<br />
az említett egyenlet szerint a következő gélkoncentráció<br />
érhető el:<br />
15–(15–5) e –60/60 = 11,4%,<br />
tehát a géllemezek feltöltésével 5–11,4%-os gradiens<br />
gél keletkezik.<br />
2. példa<br />
60 ml 8%-os gélhez<br />
(keverőtankban)<br />
15 ml L 15 ml L<br />
16 ml N 40 ml N<br />
60 ml 20%-os gélhez<br />
(rezervoártankban)<br />
29 ml víz 5 ml 75%-os glicerin<br />
200 μl AP (F) 200 μl AP (G)<br />
30 μl TEMED 30 μl TEMED<br />
20–(20–8) e –60/60 = 15,7%,<br />
tehát 8–15,7%-os gélt fogunk kapni.<br />
A felülrétegezést hasonló módon végzik, mint a homogén<br />
géllemezeknél. Mindkét géllemeztípusra másnap<br />
ún. hordozógélt öntünk ki. Ennek célja, hogy a<br />
gélcsövekből kimozduló fehérjék az elektroforézis során<br />
ebben felgyűljenek és azonos startpozícióban lépjenek<br />
be a futtatógélbe.<br />
A gyűjtőgél elkészítése<br />
4,75% akrilamidot, 0,1% SDS-t és 0,125 M-s<br />
TRIS-sósav puffert tartalmaz (pH 6,8):<br />
– 0,25 térfogat felső gél puffer (M)<br />
– 0,15 térfogat akrilamid törzs (N)<br />
– 0,6 térfogat víz<br />
– 0,03 térfogat AP (G)<br />
– 0,001 térfogat TEMED<br />
10 ml gél-elegy elkészítése elegendő<br />
Miután a futtatógélről a rétegezőfolyadékot eltávolítottuk,<br />
ezt a gélelegyet rátöltjük. A polimerizáció 30<br />
perc körül következik be. A hordozógélt 4-szeresre<br />
hígított M oldattal ajánlatos felülrétegezni.<br />
Az első dimenziós gélcsíkokat időközben az izoelektromos<br />
fokuszálás befejeztével adaptáljuk, ill. ekvilibráljuk<br />
(redukció, SDS stb.) a második dimenziós<br />
elválasztás körülményeihez. Ehhez a gélcsíkokat 5-5
84 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
ml O oldatban tartjuk 2-3 órán keresztül szobahőmérsékleten.<br />
Az így ekvilibrált gélek második dimenziós<br />
géllemezre való beágyazása következik.<br />
A gélcsíkok beágyazása a második dimenziós géllemezre<br />
80 °C-ra hevített O oldatot öntünk (kb. 5 ml) a<br />
hordozógél tetejére. Az ekvilibrált gélcsíkokat ebbe<br />
fektetjük. Az agaróz rövid időn belüli megdermedése<br />
után a második dimenziós géllemezeket 10-szeresre<br />
hígított futtatópuffert (Q) tartalmazó elektroforézistankba<br />
helyezzük. A második dimenziós elektroforézist<br />
20 mA/géllemez konstans áramerősség mellett<br />
végezzük. A felső tankba oldott kis mennyiségű<br />
brómfenolkék vándorlási sebessége jelzi az elektroforézis<br />
befejeztét.<br />
A géllemezek megfesthetők, ill. festés nélkül megfelelő<br />
kezeléssel autoradiográfiás értékeléshez felhasználhatók.<br />
A géllemezek festése<br />
Két órán át R oldatban festünk. Ezt követően 24<br />
órát S oldatban dehidrálunk. Végül T oldatban hívjuk<br />
elő, differenciáljuk és tároljuk a megfestett fehérjefrakciókat<br />
(4-9. ábra).<br />
Megjegyzés: autoradiográfiás detektáláshoz a megfestett<br />
géllemezek is felhasználhatók.<br />
Ehhez a fluorográfiás detektálás megfelelő előkészítése,<br />
valamint a gélek szárítása szükséges (lásd később).<br />
Röntgenfilmre, –20 °C-on exponáljuk.<br />
Izoelektromos fokuszálás lapgélen –<br />
denaturáló rendszerben<br />
(az O’Farrell-technika első dimenziójának<br />
megfelelő rendszer)<br />
A gél összetétele (15 ml-hez):<br />
– 5% akrilamid – 2,5 ml (törzs: 2,838g AA + 0,085g<br />
Bis AA ad 10 ml desztillált víz)<br />
– 9 M urea – 8,1g<br />
– 1% Ampholine pH 3–10 – 0,15 ml<br />
– 4% Ampholine pH 5–8 – 0,6 ml<br />
– 2% Triton X-100 v. NP-40 – 0,3 ml<br />
ad 15 ml desztillált víz<br />
15 ml készül 25 ml 10%-os ammónium-perszulfáttal<br />
és 25 ml TEMED-del!<br />
Mintapufferben oldott fehérjék:<br />
Az összetétel megfelel az O’Farrell-technika A oldatának:<br />
– 9 M urea<br />
– 1% Ampholine pH 3–10<br />
– 4% Ampholine pH 5–8<br />
– 2% Triton X-100<br />
– 5% b-merkaptoetanol<br />
Fokuszálás a katódos mintafelvitelt követően:<br />
5 W konstans áram 4 órán át (teljesítményreguláció!)<br />
8 W konstans áram 2 órán át.<br />
Anódoldat (+) 10 mM H 3<br />
PO 4<br />
– alul (vertikális<br />
rendszer esetén).<br />
Katódoldat (–) 20 mM NaOH – felül.<br />
Fixálás – 20–50%-os TCA-ban festékkel vagy festék<br />
nélkül.<br />
A továbbiakban az O’Farrell-technika szerint kell<br />
eljárni.<br />
Detektálási technikák<br />
Gélelőkészítés autoradiográfiához<br />
Fluorográfiás detektálás<br />
(Bonner és Laskey szerint)<br />
4-9. ábra. 2D PAGE O’Farrell szerint (minta: 400 µg protein,<br />
humán thrombocytafehérjék; CBB-festés)<br />
14<br />
C, 3 H vagy 35 S izotópot tartalmazó minták poliakrilamidgélben<br />
való detektálásához mind fixálatlan,<br />
mind fixált, mind festett gélek alkalmasak.
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
85<br />
A detektálás folyamata:<br />
1. A géllemezeket 20-szoros térfogatuknak megfelelő<br />
dimetilszulfoxidba merítjük 30 percig.<br />
2. Ismételt dimetilszulfoxidos kezelés következik friss<br />
reagensben (30 perc).<br />
3. Az előző két lépéssel vízmentesített, impregnált géleket<br />
4-szeres térfogat szcintillációs oldatba merítjük:<br />
20%-os (súly/súly) PPO-t (2,5-difeniloxazolt)<br />
tartalmazó dimetilszulfoxid (DMSO). A kezelés 3<br />
órán át tart.<br />
4. 20-szoros térfogat desztillált vízben a PPO-t a gélben<br />
kicsapjuk (1 órás kezelés).<br />
5. A géleket desztillált vízzel leöblítjük a felesleges<br />
csapadéktól, majd nedves celofánba burkolva a gélszárító<br />
készülékbe fektetjük.<br />
6. Szobahőmérsékleten vákuum alatt szárítjuk.<br />
7. A megszárított poliakrilamidlemezeket RP Royal<br />
„X-Omat” filmen (vagy ezzel megegyező röntgenfilmen)<br />
–70 °C-on exponáljuk. (Az idő az előzőleg<br />
tesztelt radioaktivitás mértékétől függ.)<br />
8. Az előhíváshoz KODAK hívót, ill. fixálót használunk.<br />
Ezüstözési eljárások<br />
Fehérjék direkt ezüstözése egydimenziós<br />
SDS lapgélen [6]<br />
Oldatok:<br />
A. Savas alkoholos fixálóoldat – 150 ml/gél.<br />
– 50%-os etanol, 10%-os ecetsav:<br />
– 500 ml abszolút etanol.<br />
– 100 ml cc. ecetsav, desztillált vízzel 1000 ml-re<br />
kiegészítve.<br />
B. Glutáraldehid „cross linking” oldat – 150 ml/gél.<br />
– 10%-os oldat: frissen készül használat előtt!<br />
– 100 ml 25%-os glutáraldehid<br />
– 150 ml desztillált víz<br />
C. Ammóniás ezüstfestő oldat – 150 ml/gél.<br />
Törzsoldatai – előre elkészíthetők (4 o C).<br />
1. 90 mM NaOH: 3,6 g NaOH ad 1000 ml desztillált<br />
víz<br />
2. 14,8 M NH 4<br />
OH – cc. ammóniaoldat, gyógyszertári<br />
kiszerelésben<br />
3. 1,14 M AgNO 3<br />
-oldat: 19,38 g ad 100 ml desztillált<br />
víz (sötét üvegben tartandó)<br />
Munkaoldat – felhasználás előtt kell elkészíteni:<br />
– 31,5 ml 90 mM NaOH<br />
– 2,5 ml 14,8 M NH 4<br />
OH<br />
– 4 ml 1,14 M AgNO 3<br />
+ 110 ml desztillált víz<br />
D. Citromsav – formaldehid hívó – 500 ml/gél<br />
Törzsoldatai:<br />
1. 47,6 mM citromsav: 9,14 g citromsav (vízmentes)<br />
vagy 10 g citromsav (egy kristályvizes) ad<br />
1000 ml desztillált víz<br />
2. 37% formaldehidoldat (9 rész) + 10% metanol (1<br />
rész), 100 ml készül.<br />
Munkaoldat – felhasználás előtt összeönteni<br />
– 2,5 ml 47,6 mM citromsav<br />
– 250 µl (!) formaldehid/metanol<br />
+ 500 ml desztillált víz<br />
Eljárás<br />
Az ezüstözést csak vékony (max. 1 mm) gélen lehet<br />
végezni. Valamennyi edény 3-szor desztillált vízzel<br />
tisztítandó, és a reagensek is azzal készülnek!<br />
1. Fixálás 150 ml A oldatban, 30 percig, mozgatva (tárolásra<br />
is alkalmas médium).<br />
2. Keresztkötés 150 ml B oldatban.<br />
3. Mosás 3-szor desztillált vízzel (2-3 liter, átfolyó<br />
rendszerben).<br />
4. Kezelés C oldat 150 ml-ével, mozgatva (3–5 percig,<br />
gélvastagságtól függően).<br />
5. Mosás 2-szer 500-500 ml váltott vízben 1-1 percig.<br />
6. Másik edényben előhívás 500 ml frissen készült D<br />
oldatban. Hívási idő a felvitt fehérjemennyiségtől<br />
függ: 2–7 perc.<br />
7. Mosás másik edényben, többször váltott desztillált<br />
vízzel. Legalább 3 literrel, órákig!<br />
Kevés mosás magas hátteret okoz!<br />
Kombinált (gyors) ezüstözési eljárás<br />
leszárított festetlen, ill. festett „nedves”<br />
géllemezeken (Willoughby és Lambert [19])<br />
Gélszárítás és a festetlen gélek előkészítése:<br />
1. 30 perces fixálás 20%-os TCA-ban.<br />
2. 2 × 5 perc metanol : cc. ecetsav : víz = 45:10:45<br />
elegyben.<br />
3. 4 × 2 perc vizes mosás.<br />
4. 2 perc 0,75%-os glicerines áztatás.<br />
5. Szárítás.
86 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
Oldatok gyors ezüstözéséhez:<br />
A. 25 g Na 2<br />
CO 3<br />
(10 kristályvizesből 67,5 g!) 500 ml<br />
desztillált vízben oldva.<br />
B. oldat:<br />
– 1 g NH 4<br />
NO 3<br />
– 1 g AgNO 3<br />
– 5 g szilikovolframát<br />
– 7 ml formaldehidet (37%-os) vízben 500 ml-re<br />
oldani.<br />
C. Rögzítőoldat:<br />
– 0,05 mol/l glicin<br />
–3,75 g glicin<br />
ad 1000 ml víz<br />
Valamennyi oldat készítésekor nagy tisztaságú 3-szor<br />
desztillált víz használandó.<br />
Eljárás:<br />
1. Közvetlenül a felhasználás előtt készült 35 ml A és<br />
65 ml B oldat elegyében a kívánt intenzitásig ezüsthívást<br />
végzünk.<br />
2. Rövid, 2-szer váltott vizes mosás.<br />
3. Rögzítés: C oldatban. A kivált ezüstöt a gélfelszínről<br />
„letörölni”, majd újabb C oldatban dokumentálásig<br />
tárolni.<br />
Megjegyzés: Az előkészítés (szárítás) csak festetlen gélek<br />
esetén szükséges. Az ezüstözés CBB-festések után<br />
is alkalmazható. (Kolloidos festések, CBB-R250 vagy<br />
formalinos CBB G-250 eljárásokat követően.) Ajánlott<br />
minden olyan esetben, amikor a festett gél intenzitása<br />
nem elegendő (SDS-elektroforézis vagy IEF<br />
poliakrilamidgélben, de agaróz hordozóra is).<br />
Az ecetsavban tárolt, festett géleket az ezüstözés<br />
előtt vízben kell rövid ideig áztatni (4-10. ábra a, b)!<br />
Ezüstözéses fehérjedetektálás ultravékony<br />
PAGE-lemezeken (Sammons [16])<br />
Bármelyik fajta poliakrilamidgél-elektroforézis után,<br />
ha azt 1 mm körüli vastagságú lemezgélen végezzük,<br />
a fehérjedetektálás nagy érzékenységű ezüstözéssel<br />
lehetővé válik.<br />
Szétszedhető cellában 0,8 mm vastag SDS 6–12%<br />
poliakrilamid gradiens gélt állítunk elő, a szokásos<br />
módon elektroforetizálunk, majd a fehérje-előhívást<br />
ezüstözéssel végezzük.<br />
Szükséges oldatok (készítésükhöz ioncserélt vizet<br />
használunk):<br />
1. Fixálóoldat: 50% etilalkohol, 10% ecetsavtartalmú<br />
vizes oldat.<br />
2. Mosóoldat I.: 25% etilalkohol, 10% ecetsavtartalmú<br />
vizes oldat.<br />
3. Mosóoldat II.: 10% etilalkohol, 0,5% ecetsavtartalmú<br />
vizes oldat.<br />
4. Ekvilibrálóoldat: 1,9 g/l ezüst-nitrát-tartalmú vizes<br />
oldat. 1,9 g AgNO 3<br />
-t feloldunk desztillált vízben,<br />
és 100 ml-re egészítjük ki. Használat előtt 10-szeres<br />
hígítást készítünk a szükséges mennyiségben.<br />
5. Redukálóoldat: 30 g/l nátrium-hidroxid-tartalmú<br />
a<br />
b<br />
4-10. ábra. Két ezüstözési eljárás összehasonlítása (egyedi könnyminták, SDS-PAGE)<br />
a) Kombinált ezüstözés (CBB festés + ezüst; pásztánként 1,3 mg protein, Willoughby-féle ezüstözés)<br />
b) Direkt ezüstözés (pásztánként 1,3 mg protein, Giulian-féle ezüstözés)
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
87<br />
oldatban közvetlenül a használat előtt 37%-os formaldehidet<br />
(7,5 ml/l), ill. nátrium-borohidridet<br />
(80 mg/l) oldunk.<br />
6. Színstabilizáló oldat: 7,5 g/l töménységű nátrium-karbonát.<br />
A festés menete:<br />
Az elektroforézis után az óvatosan eltávolított géleket<br />
(kézzel ne fogjuk meg) műanyag dobozban legalább<br />
2 óráig fixáljuk. Az oldatot lecseréljük, és legalább<br />
2 óra hosszat, de inkább egy éjszakán át tovább<br />
fixáljuk. A gélt az I. mosóoldattal, kétszeri váltással<br />
egy óra hosszat, majd a II. mosóoldattal szintén kétszeri<br />
váltással egy óra hosszat mossuk. (Ha a festést<br />
nem tudjuk befejezni, ennél a lépésnél abbahagyhatjuk,<br />
ebben az oldatban a gél tárolható.)<br />
A további lépéseket külön edényekben kell végezni!<br />
A gélt lassú rázás közben 2 óra hosszat az ekvilibrálóoldatban<br />
inkubáljuk, majd ioncserélt vízzel a<br />
felületre tapadt ezüstöt rövid mosással eltávolítjuk<br />
(10–20 s). Utána a gélt a redukálóoldatba merítjük,<br />
amelyet közvetlenül a használat előtt készítünk el.<br />
A fehérjefoltok néhány perc után halványsárga háttérben<br />
kezdenek előtűnni. Az első elszíneződött redukálóoldatot<br />
kb. 1 perc elteltével elöntjük és frissel<br />
pótoljuk. A redukálóoldatban a kívánt színintenzitás<br />
eléréséig hagyjuk a gélt (kb. 10–15 perc), majd a színstabilizálóba<br />
tesszük azokat. 1 órás inkubálás után a<br />
színstabilizálót cseréljük, majd a gélt ebben az oldatban<br />
tárolhatjuk. A szín ebben az oldatban napokon<br />
keresztül stabil.<br />
A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása<br />
(Marshall szerint [12])<br />
A minták fehérjedúsítása<br />
A kétdimenziós elektroforézisek esetén gyakran<br />
nem elég koncentrált a vizsgálandó minta sem az első<br />
dimenziós felvitelhez (IEF), sem a második dimenziós<br />
detektáláshoz. Az itt ismertetésre kerülő Marshall-féle<br />
ultraszenzitív ezüstözési eljárás egy közbeiktatott<br />
dúsítási eljárással nagyságrendileg növelheti a<br />
mintafehérjék detektálásának érzékenységét a második<br />
dimenziós lapgélen.<br />
Az eljárás elve: az előkészítés során a minták fehérjetartalmát<br />
CBB R-250 alkoholos savas festékreagens<br />
segítségével kicsapjuk, SDS-oldat hozzáadásával növeljük<br />
a precipitációs tartományt, majd a fehérje-festék<br />
komplexet centrifugálva üledékként nyerjük vizsgálandó<br />
mintáinkat. A felesleges festéket acetonos<br />
mosással távolítjuk el. A módszert vizeletfehérjék 2D<br />
vizsgálatához írták le először.<br />
Munkaoldatok:<br />
Coomassie Brilliant Blue R-250 festékreagens (a<br />
precipitációhoz):<br />
– CBB 0,05 g/40 ml vízben<br />
– etanol 25 ml<br />
– 85% foszforsav 30 ml<br />
majd desztillált vízzel kiegészítjük 100 ml-re<br />
+ 10% SDS-oldat<br />
Eljárás:<br />
A Bradford-módszer alapján megelőzően meghatározott<br />
fehérjekoncentrációjú mintákat két csoportra<br />
osztjuk:<br />
• A 0,1–1,0 g/l fehérjetartalmú minták 1 ml-éhez<br />
0,25 ml festékreagenst és 3 μl SDS-t adunk<br />
• Az 1,0 g/l-nél magasabb fehérjetartalmú vizeletek<br />
0,25 ml-éhez 1 ml festékreagenst és 5 μl<br />
SDS-oldatot mérünk.<br />
Ezután centrifugálás következik: 13 500 rpm 5 percig<br />
Eppendorf típusú centrifugában, ill. nagy mennyiségű<br />
minta esetén Du Pont Sorvall RC5 típusú centrifugában.<br />
A felülúszót leöntve az üledéket 1 ml acetonnal felszuszpendáltuk,<br />
majd ezt követően újra centrifugálás<br />
következik. Célunk a felesleges kezelőoldat kimosása.<br />
A felülúszót leöntve a végső pelletet lízispufferbe<br />
vesszük fel (lásd 2D elfo). A végső fehérjekoncentrációt<br />
2 mg/ml-nek állítjuk be.<br />
Fehérjék detektálása Marshall szerint<br />
módosított ultraszenzitív ezüstözési<br />
eljárással [10]<br />
A módszer lényege, hogy a fixált géleket az ezüstözés<br />
során „túlhívjuk”, majd differenciálással (destaining)<br />
a feleslegben kivált ezüstöt eltávolítjuk. Ily módon a<br />
jel/zaj arány mintától függő optimális beállítása érhető<br />
el (4-11., 4-12. ábra).<br />
Ezüstözés<br />
Felhasznált oldatok:<br />
Savas, alkoholos fixálóoldat (500 ml/gél):
88 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
– metanol 500 ml<br />
– ecetsav 100 ml<br />
tridesztillált vízzel 1000 ml-re kiegészítve<br />
Formaldehidoldat (500 ml/gél):<br />
– 37% formaldehid 2,7 ml<br />
– tridesztillált vízzel 1000 ml-re kiegészítve<br />
Diaminos ezüstfestő oldat (400 ml/gél, mindig frissen<br />
készül használat előtt):<br />
– 40% metil-amin 8 ml<br />
– 0,36% NaOH-oldat 40 ml<br />
– 20% AgNO 3<br />
12 ml<br />
– tridesztillált víz 340 ml<br />
Hívóoldat (500 ml/ gél, többször cserélve):<br />
– 1% citromsav 15 ml<br />
– 37% formaldehidoldat 1,62 ml<br />
– tridesztillált víz 3 l<br />
Festési procedúra:<br />
1. Fixálás egy éjszakán át 200 ml savas, alkoholos fixálóoldatban.<br />
2. Mosás 2 × 200 ml tridesztillált vízben 10, majd 20<br />
percig.<br />
3. Inkubálás 200 ml formaldehidoldatban 60 °C-on<br />
30 percig.<br />
4. Mosás, hűtés 200 ml vízben 10 percig.<br />
5. Kezelés diaminoldattal, mozgatva, 10 percig.<br />
6. Mosás kétszer, 200-200 ml váltott tridesztillált vízben,<br />
1-1 percig.<br />
7. Előhívás 200 ml frissen készített hívóoldattal 5 percenként<br />
cserélve az oldatot, maximum 30 percig,<br />
amíg a gél felszínén az egyenletes ezüsttükörréteg<br />
megjelenik. (A túlhívás a metodikához tartozik,<br />
így érünk el minél nagyobb jelölési effektust.)<br />
8. Mosás kétszer 200-200 ml vízben 10, ill. 20 percen<br />
keresztül.<br />
9. Tárolás tridesztillált vízben legalább egy éjszakán<br />
át.<br />
Destaining<br />
A kezelés célja a megfelelő háttér elérése úgy,<br />
hogy minél több fehérjefrakció látható maradjon.<br />
A destaininghez felhasználandó oldatok (elkészítve<br />
Switzer és munkatársai szerint):<br />
A oldat:<br />
– NaCl 11,1 g<br />
– CuSO 4<br />
11,1 g<br />
(17,3 g CuSO 4<br />
. 5H 2<br />
O)<br />
– tridesztillált víz 285 ml<br />
– NH 4<br />
OH, amíg a feltisztuló oldat sötétkék lesz<br />
B oldat:<br />
– Na-tioszulfát-pentahidrát 44 g<br />
– tridesztillált víz 70 ml<br />
C oldat:<br />
– Hypo (kereskedelmi) 5 ml (12,5 ml)<br />
– tridesztillált víz 195 ml (488 ml)<br />
Destaining kezelés<br />
1. Az A és B oldatot 1:1 arányban összekeverjük, a<br />
10%-os gél esetében tapasztalataink szerint 3-szoros,<br />
a 12,5%-os gél esetében 4-szeres mennyiségű<br />
vizet adunk hozzá.<br />
2. A gélt 1–4 percre az így elkészült oldatba (200 ml/<br />
gél) helyezzük, az aranysárga színű háttér eléréséig.<br />
4-11. ábra. 2D PAGE Marshall-ezüstözés lapgélen (75 µg<br />
protein; minta: humán könny)<br />
4-12. ábra. Marshall-ezüstözés 2D O’Farrell-gélen (minta:<br />
H50 sejtkultúra)
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
89<br />
3. Mosás kétszer 200-200 ml váltott tridesztillált vízben<br />
1-1 percig.<br />
4. Destaining leállítása 200 ml C (Hypo) oldattal 30<br />
percig.<br />
5. Mosás 200 ml desztillált vízben 10, 20, ill. 30 percen<br />
át.<br />
6. Tárolás tridesztillált vízben<br />
A gélek kezelésekor minden esetben kesztyűt használtunk.<br />
Dokumentáció<br />
A gélfotókat alsó megvilágításból (transzparencia),<br />
Fujicolor 100 ASA filmre készítettük.<br />
MS-kompatibilis fehérjedetektálások<br />
poliakrilamidgélen<br />
MS-analízishez ajánlott CBB-festés<br />
(Wang [20])<br />
Az eljárás a következő<br />
1. Elektroforézis után a gélt 20 térfogat fixálóoldatba<br />
merítjük és fixáljuk 1 órát<br />
fixálóoldat:<br />
– 10% (v/v) ecetsav<br />
– 10% v/v metanol<br />
– 40% v/v etanol<br />
2. Ezt követően a gélt érzékenyítőoldatba merítjük és<br />
további két órát mozgatva keverjük (rázzuk).<br />
érzékenyítőoldat:<br />
– 1% v/v ecetsav<br />
– 10% ammónium-szulfát<br />
3. 20 térfogat festőoldatba helyezzük legkevesebb 4<br />
órára vagy egy éjszakára.<br />
festőoldat:<br />
– 5% v/v ecetsav<br />
– 45% v/v etanol<br />
– 0,125% v/v CBB R250<br />
4. A festés után a gélt 1 órára keverés mellett az I. differenciálóba<br />
tesszük.<br />
I. differenciáló:<br />
– 5% v/v ecetsav<br />
– 40% v/v etanol<br />
5. Ezt követően a II. differenciálóba helyezzük, amíg<br />
a háttér tiszta lesz.<br />
II. differenciáló:<br />
– 3% v/v ecetsav<br />
– 30% v/v etanol<br />
6. Végül a gélt 5% w/v ecetsavban hónapokig tárolhatjuk.<br />
MS-kompatibilis ezüstfestés gélben<br />
(Gromova [7])<br />
A módszer az ezüst-nitrát-festési procedúra (Shevchenko<br />
et al., 1996; Yan et al., 2000) módosítása,<br />
amely alkalmas fehérjék megjelenítésére, gélben való<br />
emésztést követő MS-analízishez.<br />
Nagy érzékenységű és alacsony hátterű eredményhez<br />
fontos az inkubációs idők szoros betartása. Valamennyi<br />
oldathoz és mosáshoz „ultra pure” víz szükséges.<br />
Az eljárás menete (Az eredeti cikk tükörfordításával)<br />
Oldatok<br />
1. Fixálóoldat: 50% etanol, 12% ecetsav, 0,05% formalin.<br />
1 literhez: 120 ml jégecetet adjunk 500 ml 96%-<br />
os etanolhoz, valamint további 500 µl 35% formaldehidet.<br />
(A kereskedelmi formaldehid 35%-os!)<br />
Egészítsük ki egy literre. Szobahőmérsékleten tárolható.<br />
2. Mosás: 20% etanol.<br />
1 literhez: adjunk 200 ml 96%-os etanolt 800 ml<br />
deionizált vízhez. Szobahőmérsékleten tárolható.<br />
3. Érzékenyítőoldat: 0,02% (w/v) nátrium-tioszulfát<br />
(Na 2<br />
S 2<br />
O 3<br />
).<br />
1 literhez: adjunk 200 mg vízmentes nátrium-tioszulfáthoz<br />
kis vizet, oldódás után egészítsük<br />
ki a végső térfogatra.<br />
4. Festés: 0,2% (w/v) ezüst-nitrát (AgNO 3<br />
), 0,076%<br />
formalin. Frissen készítendő!<br />
1 literhez: 2 g ezüst-nitrátot oldunk kevés vízben,<br />
majd 760 µl 35%-os fomaldehidet adunk hozzá.<br />
Oldódás után kiegészítjük a végső térfogatra ionmentes<br />
vízzel. Használat előtt lehűtjük az oldatot<br />
4 °C-ra.<br />
5. Hívó: 6% (w/v) nátrium-karbonát (Na 2<br />
CO 3<br />
),<br />
0,0004% (w/v) nátrium-tioszulfát (Na 2<br />
S 2<br />
O 3<br />
),<br />
0,05% formalin.<br />
1 literhez: 60 g nátrium-karbonátot kevés vízben<br />
oldunk. 4 mg vízmentes nátrium-tioszulfátot külön<br />
kevés vízben oldunk. Keverjük össze a két oldatot,<br />
adjunk hozzá 500 µl 35% formaldehidet és egészítsük<br />
ki egy literre. Szobahőmérsékleten tárolható.
90 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
6. Leállítóoldat: 12% ecetsav.<br />
1 literhez: adjunk 120 ml jégecetet 500 ml ionmentes<br />
vízhez. Keverjük össze és egészítsük ki egy<br />
literre. Szobahőmérsékleten tárolandó.<br />
A festés menete<br />
A festési eljárás teljes időtartama alatt talkummentes<br />
gumikesztyű viselete ajánlott. Mossuk le a kesztyűt<br />
vízzel a festési eljárás előtt és alatt. A gélfixálást<br />
és a mosási lépéseket olyan festőtartályban végezzük<br />
(polipropilén ajánlott), amelyet kizárólag csak ezüstfestésre<br />
használunk. A tartály mérete legyen elég nagy<br />
ahhoz, hogy a rázás alatt a gél szabadon mozoghasson.<br />
Minden lépéshez elegendő folyadékmennyiséget<br />
kell használni, hogy az teljesen befedje a gélt. Zárjuk<br />
le a műanyag tartályt egy fedővel, és helyezzük egymásra,<br />
megvédve a párolgástól. Valamennyi lépést<br />
szobahőmérsékleten, tartályonként egy géllel végezzük,<br />
és a rázóasztalon alacsony sebességgel mozgatjuk.<br />
A kezelés során ne érintsük a gélt kesztyű nélkül<br />
vagy fémtárggyal. Műanyag pipettaheggyel vagy hagyományos<br />
üvegpipettával kezelhetjük a géleket.<br />
1. Az elektroforézist követően távolítsuk el a gélt a<br />
kazettából és helyezzük a fixálóoldatot tartalmazó<br />
tartályba. Áztassuk a gélt ebben az oldatban<br />
kb. 2 órát. A fixálás megakadályozza a protein kiáramlását<br />
a gélmátrixból, és el fogja távolítani az<br />
interferáló ionokat és a detergenst a gélből. A fixálás<br />
éjszakán át is végezhető. Ez növeli a festés érzékenységét<br />
és csökkenti a hátteret.<br />
2. Öntsük le a fixálóoldatot, és mossuk a gélt 20% etanolban<br />
20 percig. Váltsuk az oldatot háromszor,<br />
hogy eltávolítsuk a maradék detergenst, az ionokat<br />
és a fixáló savakat a gélből.<br />
Megjegyzés: Víz helyett etanolos oldat használatát<br />
ajánljuk a mosáshoz, ezzel megelőzve a gél duzzadását.<br />
Ha mégis vizes mosást végeznek, akkor<br />
20%-os etanol 20 perces inkubációjával a gélnagyság<br />
megőrizhető.<br />
3. Az etanolos oldat elöntése után adjunk a gélhez elegendő<br />
térfogatú érzékenyítőoldatot. Az inkubálás<br />
erős rotáció mellett 2 percig tart. Ez növelni fogja<br />
az érzékenységet és a festés kontrasztosságát.<br />
4. Öntsük el az érzékenyítőoldatot és mossuk a gélt<br />
kétszer 1-1 percig ionmentes vízzel. Öntsük el a vizet.<br />
5. Adjunk a gélhez hideg ezüst festőoldatot, és rázzuk<br />
20 percig, hogy az ezüstionok rákötődjenek a fehérjékre.<br />
Megjegyzés: Ne öntsük a festőoldatot közvetlenül<br />
a gélre, mert ez egyenlőtlen hátteret eredményezhet.<br />
Adjuk az oldatot pl. a tartály sarkába.<br />
6. A komplett festés befejeződésével öntsük le a festőoldatot,<br />
és öblítsük le a gélt nagy mennyiségű<br />
ionmentes vízzel 20–60 másodpercig, hogy a felesleges,<br />
azaz a kötetlen ezüstionokat eltávolítsuk.<br />
Ismételjük meg a mosást még egyszer.<br />
Megjegyzés: ha a gél mosása tovább tart, mint<br />
egy perc, eltávolíthatja az ezüstionokat a gélből is,<br />
és ez magától értetődően csökkent érzékenységet<br />
eredményez.<br />
7. Öblítsük le a gélt hirtelen a hívóoldattal. Öntsük el<br />
az oldatot.<br />
8. Adjunk hozzá egy új adag hívóoldatot, és hívjuk elő<br />
a fehérjeképet a gél 300 ml hívóban való 2–5 perces<br />
inkubációjával. A reakció azonnal leállítható, ha a<br />
kívánt intenzitást elérik a frakciók.<br />
9. Állítsuk le a redukciót 50 ml ún.„termináló”-oldatnak<br />
a gélhez öntésével, mikor a gél még a hívóban<br />
van. Erőteljes rázás következik 10 percig. Ha az oldat<br />
buborékolása megszűnik, a hívás leállítódott.<br />
10. A nedves gélek 4 °C-on 12%-os ecetsavban, műanyag<br />
zsákban eltarthatók. (Vagy 20%-os etanolos<br />
kezelés után vákuumban leszáríthatók.)<br />
Immunoblotting technikák fehérjék<br />
azonosítására<br />
Létezik nedves és félszáraz transzferálás<br />
Mini-Trans-Blot készülék használata<br />
(„nedves” eljárás)<br />
A „blotting” általános menete/Fehérje-„blotting”<br />
(immunológiai detektálással)<br />
• Elektroforézis (pl. SDS PAGE Laemmli-féle<br />
vagy 2D O’Farrell-féle).<br />
• Ekvilibráció transzfer előtt (15 perc–1 óra).<br />
• Elektroforetikus transzfer (gélről nitrocellulózmembránra,<br />
több órán át).<br />
• A le nem kötött membránhelyek blokkolása (1<br />
óra).<br />
• Inkubáció a primer antitesttel (egy éjszakán át,<br />
4 °C).
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
91<br />
• Az el nem reagált anyag kimosása a membránból<br />
(5 × 10 perc).<br />
• Inkubáció a szekunder antitesttel (1 óra szobahőmérsékleten).<br />
• A fölösleges és nem specifikus reagens kimosása<br />
a membránból (4 × 10 perc).<br />
• Detektálás (reakció-előhívás) (5 percen belül).<br />
Használatos felszerelés<br />
Elektroforézishez: Mini Protean II. Dual Slab Cell<br />
vagy Bio Rad Dual Vertical Slab Gel Electrophoretic<br />
Apparate (Model 220).<br />
Elektroforetikus transzferhez: Mini Trans-Blot<br />
Electrophoretic Transfer Cell; tápegység – pl. Büchler<br />
Instrument.<br />
Használatos oldatok és reagensek<br />
1. Transzferpuffer pH 8,1–8,3 (transzfer előtti ekvilibráláshoz<br />
és elektroforetikus transzferhez használatos).<br />
– 25 mM TRIS: 3,03 g TRIS; 1000 ml-re desztillált/<br />
deionizált vízzel feltöltve<br />
– 192 mM glicin: 14,4 g glicin<br />
– 20% metanol (v/v): 200 ml metanol<br />
Hűtőszekrényben kell tartani. Használatkor<br />
fontos, hogy 4 °C-os legyen indításkor. Sem savat,<br />
sem lúgot nem szabad hozzáadni a pH-állításhoz.<br />
Analitikai tisztaságú metanol használata ajánlott.<br />
2. Ponceau S festés (az immunológiai detektálást megengedi)<br />
a transzfer effektivitásának ellenőrzésére.<br />
Festékoldat:<br />
– 0,25% Ponceau S 0,25 g<br />
– 40% metanol 40 ml<br />
– 15% ecetsav 15 ml<br />
kiegészítés 100 ml-re desztillált vízzel<br />
Differenciálás: desztillált vízzel (20 perc után<br />
látható fakulás)<br />
3. TBS –TRIS pufferolt sóoldat pH 7,5 (alapoldat és<br />
mosóoldat a detektálás előtt)<br />
– 50 mM TRIS: 6,05 g<br />
– 150 mM NaCl: 8,78 g<br />
pH-beállítás HCl-lel 7,5-re<br />
ad 1 liter desztillált vízzel (tárolás 4 °C-on)<br />
Az egyszerűség kedvéért 2 literre való anyagot<br />
oldunk, és a pH-t beállítjuk, de 1 literre töltjük csak<br />
fel (2-szeres töménységű TBS-oldatot használva!).<br />
500 ml-re felezzük, és úgy töltjük fel egyik felét<br />
újra 1 literre. A másik részt a zselatinos oldathoz<br />
használjuk.<br />
4. Zselatinos TBS-oldat (kezelőoldat immundetektálásnál<br />
és hígítóoldat a szekunder antitesthez)<br />
– 0,25% zselatin 2,5 g<br />
– TBS-ben 1 liter<br />
2,5 g zselatint melegítéssel 100 ml desztillált<br />
vízben oldunk. A feloldódott zselatint az 500 ml<br />
2-szeres töménységű TBS-hez öntjük, desztillált<br />
vízzel 1000 ml-re kiegészítjük. 4 °C-on tároljuk.<br />
5. Blokkolóoldat – zselatinos TBS + BSA<br />
1% BSA (bovine serum albumin, liofilizátum)<br />
1 g BSA-t oldunk 100 ml 4-es oldatban (4 °C).<br />
6. Zselatinos TBS + azid (hígítóoldat a primer antitesthez)<br />
0,02% nátrium-azid (20 mg = 0,02 g)<br />
100 ml zselatinos TBS (4-es) oldatban (4 °C)<br />
Tudni kell, hogy az azid a peroxidázreakció potens<br />
inhibitora!<br />
7. Szubsztrátoldat a peroxidázreakcióhoz (frissen készül,<br />
1-2 órával a detektálás előtt)<br />
– 20 mg DAB (diaminobenzidin tetra HCl, Serva)<br />
– 100 ml TBS-ben oldani, fénytől védeni kell.<br />
Csiszolt dugós Ehrlenmayer-lombikot alufóliával<br />
burkolni, keverés mellett oldani. Nem szabad<br />
melegíteni. 1 óra alatt maradéktalanul oldódik.<br />
Szűrés nem szükséges: a kezelt szűrőpapír a festéket<br />
„kiránthatja” az oldatból, amint azt észleltük.<br />
A reakció 100 μl 30%-os H 2<br />
O 2<br />
-oldat hozzáadásával<br />
indul. A reakciót 2 × 50 ml TBS-oldattal való mosással<br />
állítjuk le. Látható reakció 5 percen belül.<br />
A blotting kivitelezése<br />
A blottingegység összeállítása<br />
Elektroforetikus transzfer<br />
• Vizsgálati „anyag”. AA géllemez, Laemmli-féle<br />
SDS-elektroforézist vagy 2D O’Farrell-féle nagy<br />
felbontású elektroforézist követően. A Mini-<br />
Trans-Blot blottoló apparátushoz a maximális<br />
gélnagyság 7,5 × 10 cm. A géllemezt középen
92 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
elfelezve a kérdéses mező blottolható a „nagy”<br />
géllemezből is. A „mini” gél nagysága megfelel a<br />
blottolóegységnek.<br />
• Előkészület a transzferhez. Szükséges eszközök<br />
összekészítése: puffertank, elektródrész, 2 géltartó<br />
kazetta, 3 üvegkád, 4 °C-ra hűtött transzferpuffer<br />
(2 liter), tápegység (Büchler), nitrocellulózmembrán,<br />
mágneses keverő: azaz<br />
„Kerge-Ferke”.<br />
A gélek és a membránok ekvilibrálása. A géllapokat<br />
egy transzferpuffert tartalmazó üvegkádba helyezzük<br />
(kb. 500 ml), és a gél vastagságától függően 15<br />
perctől 60 percig ekvilibráljuk. Az ekvilibrálás célja<br />
az SDS-elektroforézis médiumának eltávolítása. (A<br />
transzfer alatti hőképződés csökkentésére). A gél méreteit<br />
az inkubáció letelte előtt meghatározzuk. Maximális<br />
nagysága 7,5 × 10 cm lehet. A kb. 2 mm vastag<br />
O’Farrell-géllemezt 1 órát áztatjuk. A lemez nagyságának<br />
megfelelő membránt éles szikével vagy pengével<br />
felvágjuk (7,5 × 10 cm). A felvágott membránokat<br />
tiszta edényben 15–30 perc időtartamban transzferpufferrel<br />
ekvilibráljuk.<br />
Szűrőpapír. Schleicher–Schüll- vagy Whatmann-szűrőpapírból<br />
a gél vastagságától függő számban 7,7 ×<br />
10,2 cm-es darabokat vágunk: gélenként 4–6 darabot,<br />
O’Farrell-gélhez 2 × 2 réteget (összesen 2 gélhez<br />
8 db-ot).<br />
Szivacs. A szivacsokat transzferpufferrel telítjük.<br />
Üvegkádba transzferpuffert öntünk; a szivacsokat és<br />
a szűrőpapírokat ebben telítjük pufferrel.<br />
Géltartó kazetta. A két géltartó kazettát a harmadik<br />
üvegkádba helyezzük. A kazetták szürke része fekszik<br />
az edény alján. A kinyitott kazetta átlátszó része<br />
az edény oldalának támaszkodik. A kazettába helyezzük<br />
a transzferpufferrel telített „szendvics”-rétegeket,<br />
pontosan egymásra centrálva, minden réteg után<br />
transzferpufferrel meglocsolva, buborékmentesen a<br />
következőképpen:<br />
– szivacs (8 × 11 cm)<br />
– 2 vagy 3 réteg szűrőpapír (7,7 × 10,2 cm)<br />
– géllemez (7,5 × 10 cm)<br />
– nitrocellulózmembrán (az orientáció bejelölve,<br />
pl. a lemez sarkának lemetszésével; 7,5 × 10 cm).<br />
A membrán/gél adhéziós kontaktusának biztosítására<br />
egy kémcsővel, nyomással és görgetéssel érjük el a<br />
megfelelő érintkezést.<br />
– 2-3 réteg szűrőpapír (7,7 × 10,2 cm)<br />
– szivacs<br />
A kazettát óvatosan zárjuk, a műanyag kallantyú oldalra<br />
fordításával és visszacsúsztatásával.<br />
Puffertank. A puffertankot kb. 400 ml transzferpufferrel<br />
töltjük. Az elektródegységet behelyezzük. Kb.<br />
2–2,5 cm-es keverőpálcát engedünk az aljára. A géltartó<br />
kazettákat az elektródrészbe csúsztatjuk. Szürke<br />
oldaluk néz az elektródpanel szürke oldalára mindkét<br />
kazetta esetén. A tankot mágneses keverőre állítjuk.<br />
A keverőt bekapcsoljuk. Ha hűtőegységet nem<br />
használunk (éjszakán át végzett transzfer, alacsony<br />
feszültség) további kb. 450 ml transzferpufferrel teljesen<br />
megtölthető a tank.<br />
Ügyeljünk a túlfolyás elkerülésére.<br />
Elektroforetikus transzfer. A tető ráhelyezésével és az<br />
elektródok csatlakoztatásával a tápegységhez, hideg<br />
(4 °C) pufferrel indul. Ügyelni kell a színazonosságra<br />
a csatlakozásnál. Piros a piroshoz, fekete a feketéhez,<br />
mind a tetőnél, mind a tápegység kimenőinél.<br />
Az ily módon összeállított blottinggységben a fehérjék<br />
a gélből az anód felé vándorolva (anód: a kazetta<br />
átlátszó része, az elektród piros jelölése) a membránhoz<br />
kötődnek.<br />
Elektroforetikus transzfer. Konstans feszültségállásnál<br />
(volt-regulálás) a tápegységen a 0–200 V és 0–200<br />
mA tartomány kiválasztása után az áramot bekapcsoljuk,<br />
és 30 V-ra állítjuk a feszültséget. A transzfer<br />
20 órát vesz igénybe. (O’Farrell-géleknél – kb. 2<br />
× 2 mm-es gélvastagságnál – induláskor fokozatosan<br />
csökken 200 mA-ről 100 mA-re a vezetés, és ez az érték<br />
másnapig megmarad.) A transzfer befejezése után<br />
az áramot kikapcsoljuk, a kazettákat kiemeljük, majd<br />
a membránokat tetszés szerint festjük.<br />
Festés immundetektálás előtt. Ponceau S-festéssel,<br />
desztillált vizes öblítéssel végezzük. A membránokat<br />
a gélről leemelve, a géllel érintkező oldalukkal fölfelé,<br />
óvatosan festékkel töltött tiszta edénybe helyezzük.<br />
(A további kezelés is végbemehet ebben az edényben).<br />
A membránok fotografálását azonnal el kell végezni<br />
a fakulás miatt.
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
93<br />
Immundetektálás. Lényege, hogy a gélről a membránra<br />
átkerült és rákötött fehérjék közül specifikus<br />
antitest (primer antitest) segítségével keressük és azonosítjuk<br />
a kérdéses fehérjét.<br />
Antigén-antitest találkozás esetén a specifikus reakció<br />
kimutathatóságának érzékenységét nagymértékben<br />
növelhetjük egy második antitesttel, amelyet<br />
valamilyen módon korábban jelöltünk. Ez a jelölés<br />
fogja „indikátorként” igazolni a kérdéses fehérje és a<br />
primer antitest kapcsolódását. Esetünkben egy olyan<br />
alkalmazást ismertetünk, ahol a szekunder antitest<br />
enzimmel, nevezetesen peroxidázzal jelölt. Szubsztrát<br />
jelenlétében az immobilizált enzim látható reakciót<br />
katalizál (ELISA-módszer), és a termék a keletkezés<br />
helyén marad. [A nitrocellulózon lejátszódó immunreakciónak<br />
nagy előnye, hogy az antigén (transzblottolt)<br />
fehérjemembránhoz kötődése, tehát fix helyzete<br />
miatt nincs szükség ún. immunprecipitációra, vagyis<br />
optimális antigén-antitest arányra a kimutatáshoz].<br />
Az eljárás menete. Az elektroforetikusan blottolt<br />
(festett vagy festetlen) nitrocellulózmembránt a géllel<br />
érintkező felszínével fölfelé reakcióedénybe helyezzük.<br />
Előnyös a fedeles kis „ételdobozok” használata.<br />
1. Blokkolás. A le nem kötött membránkötő helyek<br />
blokkolása az immunreakció szempontjából indiferens<br />
fehérjével.<br />
20 ml blokkolóoldattal (5-ös oldat).<br />
Rázás 1 órán át szobahőmérsékleten, majd leöntés.<br />
2. Primer antitestreakció. Az antitest a megadott adatok<br />
szerinti mértékben hígítandó zselatinos + azidos<br />
TBS-sel 6-os oldat); példaként a tropomiozinra<br />
irányuló vizsgálatunkat mutatjuk be:<br />
Tropomiozinnál pl. 160-szoros hígítás ajánlott<br />
(125 μl + 20 ml hígítóoldat) (Sigma: csírkezúza-tropomiozin<br />
ellen termelt nyúlimmunsavó).<br />
Egy éjszakán át 4 °C-on tartva (37 °C 1 óra, 25<br />
°C 2-3 óra).<br />
Az antitestoldat visszatöltése további használatra<br />
(4 °C-on tartva).<br />
3. Az el nem reagált anyag kimosása a membránból.<br />
50 ml zselatinos TBS-sel (4-es oldat) 10 percig.<br />
(Ezt a lépést 5 × 50 ml-re 5 × 10 percig ajánlatos<br />
végezni, szobahőmérsékleten, rázogatva).<br />
4. Inkubáció a szekunder antitesttel; pl. peroxidázkonjugált<br />
nyúl-IgG-ellenes kecskeszérumot használva,<br />
a tartósítószer nem azid, hanem tiomerzál.<br />
Az antitest hígítása zselatinos TBS-sel (4-es oldat)<br />
1:1000 arányban (20 μl + 20 ml hígító).<br />
20 ml hígított szekunder antitestet öntünk a<br />
membránra. Inkubáció szobahőmérsékleten legalább<br />
1 órás rázás mellett.<br />
5. A fölösleges és nem specifikus reagens kimosása a<br />
membránból:<br />
1 × 50 ml zselatinos TBS (4-es oldat) 10 perc<br />
4 × 50 ml TBS (3-as oldat) 4 × 10 perces rázással,<br />
szobahőmérsékleten.<br />
6. Detektálás: enzimreakció (tiszta edényben):<br />
50-50 ml szubsztrátoldat lemezenként (7-es oldat),<br />
a membrán belecsúsztatása „színével” fölfelé,<br />
2-2 csepp (kb. 50-50 μl) 30%-os H 2<br />
O 2<br />
-oldat rázás<br />
mellett.<br />
Színreakció előhívása 5 percen belül. Mosás 2 ×<br />
50 ml TBS-sel, fotografálás, szárítás nedves szűrőpapír<br />
között szobahőmérsékleten, fénytől védve.<br />
Megjegyzés:<br />
A szárított membránok könyv lapjai között tárolhatók.<br />
További felhasználás lehetséges. Új reakció 2-3-<br />
szor lejátszható, ha megfelelő detergens kezeléssel<br />
az antitesteket az elektroforetikusan blottolt fehérjékről<br />
eltávolítjuk. Ily módon az ismételt reakciónál<br />
különböző primer antitestek próbálhatók ki.<br />
Immunoblotting technika a fehérjék<br />
azonosítására (semi-dry blotting)<br />
A fehérjefrakciók immunkémiai detektálására szolgál.<br />
Az immundetektáláshoz pásztánként (mintánként)<br />
3–5 mg proteint elektroforetizálunk.<br />
Oldatok<br />
Blokkolóoldatok: a szabad kötőhelyek blokkolására<br />
– 3 és 5%-os tejes zselatinos TBS-oldat<br />
– 3, ill. 5 g tejpor<br />
100 ml zselatinos TBS-ben<br />
vagy<br />
– 1%-os BSA (bovin szérumalbumin, liofilizátum)<br />
– 1 g BSA<br />
100 ml zselatinos TBS-ben<br />
Alternatív puffer pH 8,1–8,3: a transzfer előtti ekvilibráláshoz<br />
és az elektroforetikus transzferhez használatos:
94 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
– 48 mM TRIS 5,8 g<br />
– 39 mM glicin 2,9 g<br />
oldás után 1,3 mM SDS 3,7 ml 10%-os oldata<br />
ad 800 ml desztillált víz<br />
– 20% metanol 200 ml<br />
Hűtőszekrényben tároljuk, használatkor 4 °C-os<br />
legyen.<br />
TBS (TRIS-pufferolt sóoldat), pH 7,5 (alapoldat és<br />
mosóoldat a detektálás előtt)<br />
– 50 mM TRIS 6,05 g<br />
– 150 mM NaCl 8,78 g<br />
pH beállítása HCl-lel 7,5-re, és 1000 ml-re vízzel<br />
kiegészíteni.<br />
Zselatinos TBS (kezelőoldat immunreakciónál és hígítóoldat<br />
az antitesthez)<br />
– 0,25% zselatin 2,5 g<br />
ezt melegítéssel oldjuk 100 ml vízben<br />
– + 2-szeres töménységű TBS-ből 500 ml<br />
a fentieket desztillált vízzel kiegészítjük 1000 ml-re.<br />
Elektroforetikus transzfer<br />
Az egydimenziós géllap transzferálásának menete<br />
nitrocellulózmembránra: A semi-dry NovaBlot<br />
(Pharmacia) készülék grafitlapjainak benedvesítése<br />
után az alternatív pufferbe mártott szűrőpapírokat<br />
egymásra tesszük, föléjük helyezzük a vízzel benedvesített<br />
membránt, majd az alternatív pufferben ekvilibrált<br />
gélt, majd ismét a nedves szűrőpapírokat.<br />
A transzferálást 150 mA áramerősségen 20 percen<br />
keresztül végezzük.<br />
A membrán blokkolása:<br />
A blokkoláshoz a membránt egy éjszakán át 4 °Con,<br />
tejben vagy BSA pufferoldatban tartjuk.<br />
Immunreakció:<br />
Vizsgálataink során többféle fehérjét detektáltunk<br />
(vírusfehérjék, hősokkprotein, aktin, aktomiozin, lizozim,<br />
szekretoros IgA, laktoferrin, orozomukoid,<br />
XIII. faktor, fibrinogén stb.).<br />
A jel-zaj arány optimalizálásához fehérjénként különböző<br />
médiumokat fejlesztettünk ki. Az immunreakcióhoz<br />
használt különböző médiumok lehetnek:<br />
• A oldat: 5% tej- (non fat dry milk) tartalmú TBS.<br />
• B oldat: 0,05% Tween 20 TBS-ben.<br />
• C oldat: TBS.<br />
• D oldat: 0,5%Tween 20 zselatinos TBS-ben.<br />
• E oldat 0,05% Tween 20 zselatinos TBS-ben.<br />
• F oldat: zselatinos TBS.<br />
A primer antitestreakció egy órán át 37 °C-on termosztátban<br />
ment végbe, folyamatos rázás mellett.<br />
Az immunreakció közege minden esetben a vizsgált fehérjére<br />
lett kifejlesztve. Az immunreakció részleteit a<br />
4-3. táblázaton foglaltuk össze. HRP-konjugátumokat<br />
használtunk a jelölésre. A táblázat ennek változatait<br />
mutatja be, a teljesség igénye nélkül.<br />
Az immunreakció „előhívása”<br />
A peroxidázreakció előhívásához két különböző eljárást<br />
is alkalmaztunk:<br />
Ni-DAB-reakció ezüstintenzifikálással (Gallyas et<br />
al., 2003)<br />
Ni-DAB-reakció:<br />
Az előhívás enzimreakción alapul: a szekunder antitesthez<br />
kötött peroxidáz enzim szubsztrátja a H 2<br />
O 2<br />
.<br />
A reakció hatására a DAB elszíneződik, és a színreakciót<br />
a NiSO 4<br />
erősíti fel.<br />
Előhívóoldat: Ni-DAB-reagens<br />
– 20 mg DAB (3,3-diamino-benzidin-tetrahidroklorid)<br />
– 56 mg nikkel-szulfát (NiSO 4<br />
× 7H 2<br />
O)<br />
Mindkettőt külön-külön feloldjuk 50-50 ml<br />
TBS-ben.<br />
Az oldódás után összeöntjük, és a Ni-DAB-oldatba<br />
50 μl 30%-os H 2<br />
O 2<br />
-t teszünk. Az így frissen készült<br />
előhívóoldatba helyezzük a membránt, és megvárjuk,<br />
amíg a színreakció kifejlődik. A színreakció leállításához<br />
a membránt 1%-os nátrium-acetát-oldatba<br />
tesszük néhány percre.<br />
Ezüstintenzifikálás:<br />
A Ni-DAB-os immundetektálást követően az ezüsterősítést<br />
a következő elegyben végezzük [Na-volframátot<br />
és C-vitamint (gyógyszertári ampulla) tartalmazó<br />
oldat].<br />
Oldatok:<br />
– 60 ml A oldat (pufferolt detergenssel stabilizált<br />
Ag-kolloid-oldat).<br />
– 7,5 ml B oldat: 5% Na-volframát-dihidrát.<br />
– 7,5 ml C oldat: 0,2% aszkorbinsav vizes oldata.
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
95<br />
4-3. táblázat. Fehérje detektálása immunreakcióval *<br />
Módszer 1. 2. 3.<br />
blokkolás A oldat 3% tejes zselatinos TBS 1% BSA zselatinos TBS<br />
mosás - C oldat C oldat<br />
primer antitest<br />
poliklonális antipatkány IgA<br />
(kecske)<br />
1:50 hígítás A oldatban<br />
poliklonális anti-tojásfehérje<br />
lizozim (nyúl)<br />
1:50 hígítás D oldatban<br />
antihumán laktoferrin (nyúl)<br />
1:50 hígítás F oldatban<br />
mosás 4 × 5 perc B oldat 5 × 10 perc D oldat 5 × 10 perc E oldat<br />
szekunder antitest:<br />
mosás<br />
antikecske immunglobulin<br />
(nyúl)<br />
1:1000 hígítás A oldatban<br />
3 × 10 perc B oldat<br />
10 perc C oldat<br />
antinyúl immunglobulin (disznó)<br />
1:1000 hígítás F oldatban<br />
10 perc D oldat<br />
3 × 10 perc C oldat<br />
antinyúl immunglobulin<br />
(disznó)<br />
1:1000 hígítás F oldatban<br />
3 × 10 perc E oldat<br />
10 perc C oldat<br />
*<br />
Az immunreakció közege minden esetben a vizsgált fehérjékre lett kifejlesztve. HRP konjugátumokat használtunk a jelölésre.<br />
A táblázat ennek változatait mutatja be, a teljesség igénye nélkül.<br />
Közvetlenül használat előtt készítjük el a három<br />
komponens keverékét az előbbi arányban. Az előhívás<br />
során a kívánt intenzitás eléréséig tart a kezelés.<br />
Az ezüstözési reakció leállításához 1%-os ecetsavoldatot<br />
használunk.<br />
Az előhívott membránt üveglapon szárítjuk tridesztillált<br />
vízzel átitatott szűrőpapír között. A megszáradt<br />
membránok száraz körülmények között, szobahőmérsékleten,<br />
fénytől védve archiválhatók (4-13.<br />
ábra).<br />
Kemilumineszcencia (ECL, enhanced chemiluminescence).<br />
A kemilumineszcencia az a fénykibocsátás,<br />
amely a kémiai reakció során felszabaduló<br />
energiá ból keletkezik. Leggyakrabban peroxidáz enzimmel<br />
konjugált második antitestet használtunk a<br />
detektáláshoz, amely ECL esetében a következő reakciósémán<br />
alapul:<br />
A fényjel gyorsan csökken (flash típusú kemilumineszcencia),<br />
ezért ún. erősítőt is használunk.<br />
Az immunoblott ECL detektálását a 4-14. és 4-15.<br />
ábrán mutatjuk be: a membránhoz kötött, detektálni<br />
kívánt fehérjéhez először hozzákapcsolódik a primer<br />
antitest, majd a torma-peroxidáz-konjugátummal jelölt<br />
szekunder antitest. Erősítő ágensként parajodofenolt<br />
alkalmaztunk, ezután a H 2<br />
O 2<br />
- és luminoltartalmú<br />
reagens hozzáadásával fénykibocsátás történik,<br />
amelyet detektálunk.<br />
A parajodofenol mint jól bevált erősítő hatására a<br />
kemilumineszcencia-intenzitás percekig stabil ma-<br />
luminol + H 2<br />
O 2<br />
+ peroxidáz = luminol * + fény<br />
4-13. ábra. Western blotting. Gallyas-féle immundetektálás<br />
(minta: humán könyminták, laktoferrin; detektálás: Ni-<br />
DAB + ezüst)<br />
4-14. ábra. Western blotting; az ECL-detektálás elve
96 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
rad, a csökkenés lassan megy végbe. Az oldat pH-jának<br />
növelése is nagyobb jelet eredményez.<br />
Általunk kipróbált és ajánlott ECL-reagensek:<br />
• Kereskedelmi forgalomba kapható gyári kit:<br />
SuperSignal West Pico Chemiluminescent<br />
Substrate (Pierce Biotechnology Inc.) 34077; 50<br />
ml Luminol/Enhancer + 50 ml Stable Peroxide<br />
(szubsztrát)<br />
A reagens szobahőmérsékleten tartandó, kb.<br />
1 évig stabil, a gyári ajánlás szerint 800 cm 2 felületre<br />
elegendő.<br />
A kereskedelmi forgalomban ma már akár<br />
1000-szer érzékenyebb reagens is elérhető. Mi<br />
könnyfehérjék identifikálásában használtuk.<br />
• „Házilag”, laboratóriumunkban készült reagenselegy:<br />
– Luminololdat (10 ml):<br />
4-15. ábra. Western blotting; lizozim ECL-detektálása<br />
0,1 M TRIS-HCl puffer, pH 9,35 100 ml-ében<br />
78 mg luminol + 95 mg parajodofenol együtt<br />
oldva.<br />
– Szubsztrát: 10 μl H 2<br />
O 2<br />
Az eljárás részletezése:<br />
1. A gyári reagenseknél a két komponenst (luminol<br />
és szubsztrát) 1:1 arányban elegyítjük, a szükséges<br />
mennyiségnek megfelelően. Az összekevert reagens<br />
szobahőmérsékleten órákig stabil marad. Óvjuk<br />
az oldatot erős fénytől.<br />
2. Az ECL-reagenssel való előhívás két módja ismeretes:<br />
• Folyadékfilmmel, amely a takarékos változat.<br />
• A membránt éles felével fölfelé reagensbe merítjük.<br />
Ez utóbbi érzékenyebb és stabilabb detektálást<br />
eredményez.<br />
3. Fényszegény környezetben inkubáljuk 5 percig.<br />
4. Az értékelés esetünkben KODAK Image Station<br />
2000R készülékkel végeztük, de ez készülék hiányában<br />
röntgenfilm-expozícióval is helyettesíthető.<br />
A KODAK Image Station 2000R készülék:<br />
CCD (charge-coupled device) technikát alkalmaz:<br />
lényege, hogy a detektorba érkező fotonok egyenként,<br />
közvetlenül számolhatók, így ez a módszer kvantitatív<br />
értékelésre is alkalmas.<br />
4-16. ábra. MS-kompatibilis<br />
detektálást<br />
követő könnyfehérje-azonosítás<br />
(MALDI TOF)
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
97<br />
A CCD-kamerás felvétel a berendezés<br />
saját szoftverével értékelhető. Ez<br />
lehetőséget ad mind automata, mind<br />
kézi vezérlésű elemzésre. Az alapparaméterek<br />
egy adott területről a következők<br />
lehetnek:<br />
– átlagos fényintenzitás<br />
– az összes képpont szummált (öszszegzett)<br />
jele<br />
– nettó intenzitás (az összes képpont<br />
szummált jele – a háttér intenzitás)<br />
– a terület nagysága, alakja stb.<br />
A berendezés ugyanakkor alkalmas<br />
a kép valós idejű követésére, azaz kinetikus<br />
mérésre és a jel/zaj viszony<br />
optimalizálására is. Hagyományos festett<br />
gélek (4-16. ábra) és fluoreszcenciásan<br />
jelzett gélek fotózása (4-17. ábra)<br />
és kiértékelése szintén (2 × 2 cm-től 20<br />
× 20 cm nagyságig) lehetséges ezzel a<br />
technikával (4-18. ábra).<br />
4-17. ábra. 2D DIGE analízis (fluoreszcens jelöléssel).<br />
A szeparálás itt is az O’Farrell-technikán alapszik<br />
4-18. ábra. Fehérjejelölési módok a blottingot követően (összefoglalás)
98 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
Dokumentáció. A gélfotókat alsó megvilágításból<br />
(transzparencia), Fuji Velvia 50 ASA filmre készítettük,<br />
ill. számítógépes, digitális technikával rögzítettük.<br />
Poliakrilamidgél-lemez szárítása<br />
zselatinnal (Popescu szerint [15])<br />
A módszer vékony és nagy poliakrilamid-koncentrációjú<br />
gradiens lemezek szárítására alkalmas. 0,8 mm<br />
vastagságú, 17–25%-os koncentrációjú lemezgélek<br />
töredezés nélkül leszáríthatók.<br />
1. A festett géleket differenciálás, a festetlen géleket<br />
40%-os etanolban való 1-2 órás fixálás után 7,5%<br />
ecetsavat és 1,5% glicerint tartalmazó oldatban áztatjuk<br />
2 órán át, szobahőmérsékleten.<br />
2. Az így előkészített géllemezt vízszintezett plexilapra<br />
helyezzük. A gél és a plexilap közé szorult buborékokat<br />
óvatosan eltávolítjuk. A gél felszínéről és<br />
széleiről a felesleges folyadékot felitatjuk.<br />
3. Háztartási zselatin 5%-os vizes oldatát (+ 0,02%<br />
Na-azid) még forró állapotban, 1-2 mm castagságban<br />
a gélfelszínre rétegezzük, vigyázva arra, hogy<br />
az a széleken ne csorduljon le. 1-2 óra múlva, amikor<br />
a zselatin már elég viszkózus, de még nem gél<br />
állapotú, a lemezszélekre pipettával újabb zselatinréteget<br />
húzunk úgy, hogy az kb. 1,0–1,5 cm szélességben<br />
ráterjedjen a plexilapra is.<br />
Így a géllemezt borító zselatinréteg középütt vékonyabb,<br />
mint a széleken. Ez az előfeltétele a deformálódás<br />
nélküli száradásnak.<br />
A lemez szobahőmérsékleten 36–48 óra alatt leszárad.<br />
Teljes száradás után a plexilapról film formájában<br />
lehúzható.<br />
Ajánlatos a gélfilmet sima felszínek között tárolni.<br />
Irodalom<br />
A módszertanok eredeti forrásai szerint<br />
[1] Bonner, W. M., Laskey, R. A.: A film detection method<br />
for tritium-labelled proteins and nucleic acids in<br />
polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46: 83–88, 1974.<br />
[2] Burnette, W. N.: „Western Blotting”: electrophoretic<br />
transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide<br />
gels to unmodified nitrocellulose and radiographic<br />
detectation with antibody and radioiodinated<br />
protein A. Anal. Biochem. 112:195–203, 1981.<br />
[3] Davis, B. J.: Disc Electrophoresis. 2. Method and application<br />
to human serum proteins. Ann. New York Acad.<br />
Sci. 121:404–427, 1964.<br />
[4] O’Farrell, P. H.: High resolution two-dimensional<br />
electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250:4007–<br />
4021, 1975.<br />
[5] Gershoni, J. M., Palade, G.E.: Protein blotting: principles<br />
and applications. Anal. Biochem. 131:1–45, 1983.<br />
[6] Giulian, G. G. et al.: Improved methodology for analysis<br />
and quantitation of proteins on one-dimensional silver<br />
stained slab gels. Anal. Biochem. 128:277–287, 1983.<br />
[7] Gromova, I. Celis, J. E.: Protein detection in gels by silver<br />
staining: A procedure compatible with mass-spectrometry.<br />
In: Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T. et al. (eds):<br />
Cell Biology: Laboratory Handbook. 3 rd Ed. Academic<br />
Press, Elsevier, 2006.<br />
[8] Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during<br />
assembly of the head bacteriopghage T4. Nature<br />
227:680–685, 1970.<br />
[9] Ludány, A., Gallyas, F., Gaszner, B. et al.: Skimmed<br />
milk blocking improves silver post-intensification of<br />
peroxidase-diamino-benzidine staining on nitrocellulose<br />
membrane in immunoblotting. Electrophoresis<br />
14:78–80, 1993.<br />
[10] Marshall, T.: Detection of protein in polyacrylamide<br />
gels using an improved silver stain. Anal. Biochem.<br />
136:340–346, 1984.<br />
[11] Marshall, T., Williams, K. M.: Sodium dodecyl<br />
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of urine:<br />
concentration of urinary proteins by precipitation with<br />
Coomassie Blue. Clin. Chem. 39/11:2314–2318, 1993.<br />
[12] Marshall, T., Williams, K.: Two-dimensional<br />
electrophoresis of human urinary proteins following<br />
concentration by dye precipitation. Electrophoresis<br />
17:1265–1272, 1996.<br />
[13] Ornstein, L.: Disc Electrophoresis, 1. Background<br />
and Theory. Ann. New York Acad. Sci. 121:321–<br />
349,1964.<br />
[14] Otey, C. A., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C.: A procedure<br />
for the immunoblotting of proteins separated<br />
on isoelectric focusing gels. Anal. Biochem. 157:71–76,<br />
1986.<br />
[15] Popescu, O.: A simple method for drying polyacrylamide<br />
slab gels using glycerol and gelatin. Electrophoresis<br />
4:432–433, 1983.<br />
[16] Sammons, D. W. et al.: Ultrasensitive silver-based<br />
color staining of polypeptides in polyacrylamide gels.<br />
Electrophoresis 2:135–141, 1981.<br />
[17] Towbin, H. et al.: Electrophoretic transfer of proteins<br />
from polyacrilamide gels to nitro-cellulose sheets: procedure<br />
and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci.<br />
76:4350–4354, 1979.
Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák<br />
99<br />
[18] Westermeier, R.: Electrophoresis in Practice. 4 th Ed.<br />
Wiley-VCH Verlag GmbH Co. KgaA, Weinheim, 2005.<br />
(Ajánlott összefoglaló munka)<br />
[19] Willoughby, E. W., Lambert, A.: A sensitive silver<br />
stain for protein in agarose gel. Anal. Biochem.<br />
130:353–358, 1983.<br />
[20] Wang, Xuchu et al.: A modified CBB staining method<br />
at nanogram sensitivity compatible with proteomic<br />
analysis. Biotechnol. Lett. 29:1599–1603, 2007.<br />
A gradiens gél kialakításához<br />
[21] Work, E. (eds): Laboratory techniques in biochemistry<br />
and molecular biology. Vol. 2. North-Holland publishing<br />
Company, Amsterdam–London, 1970.
5. Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók<br />
alapján<br />
Kellermayer Miklós<br />
Minden fejezetben, mint a legalapvetőbb, a leglényegesebb<br />
kiindulási pontot, a név, a fogalom eredetét,<br />
tartalmát célszerű újra meg újra elismételni. A protein,<br />
fehérje (görögül πρωτεϊνη – első számú alkotóelem)<br />
név, fogalom 1838-ban született. Jöns Jakob<br />
Berzelius írta le először az 1838. július 10-i keltezésű,<br />
Gerhardus Johannes Mildernek címzett levelében.<br />
Arra a kérdésre, hogy mi a fehérje, három<br />
meghatározás, három definíció van:<br />
1. Az eredet szerinti meghatározás: A fehérjék az élő<br />
sejtek termékei (produktumai).<br />
2. A molekuláris anatómiai meghatározás: A fehérjék<br />
módosult aminosavpolimerek.<br />
3. A funkcionális meghatározás: A fehérjék olyan<br />
molekulák, amelyeknek sajátos biológiai funkcióik<br />
vannak.<br />
Az első meghatározás kifejtése<br />
Az eredet szerinti meghatározás azért olyan fontos,<br />
mert magára a lényegre, az anyag élővé szerveződésére<br />
mutat rá. Élettelen anyagból, még a sejteket felépítő<br />
makromolekulákból sem tudott élőlényt, élő sejtet<br />
eddig soha senki létrehozni! Tehát az élet maga a folytonosság!<br />
Az első egyetlen élő sejttől, a legősibb őssejttől,<br />
Darwin elnevezésében a „progenitortól” eltelt<br />
3,5–4 milliárd éves folytonosság. Ez egyben a fehérje-újdonképződés,<br />
a fehérjeszintézis folytonosságát is<br />
jelenti. Így a „mi az élet” kérdésre az egyik lehetséges<br />
válasz, hogy az élet = folytonos fehérje-újdonképződés!<br />
Azt, hogy mennyire lényegi megállapítás ez, bizonyítja<br />
a peptidkémia, a szintetikus peptidgyártás mérethatára.<br />
Ugyanakkor 20 perc alatt (ennyi a megkettőződési,<br />
a generációs ideje) a székletünkben tenyésző,<br />
1-2 µm nagyságú prokarióta Escherichia coli bacilus<br />
több száz, akár ezer aminosavból álló fehérjékből<br />
több mint 1000 félét gyárt. Ez maga a csoda, az élet<br />
csodája! Az élő sejtek fehérjegyártásáról nagyon sokat<br />
tanítunk, de a hogyanról(?), magáról a mechanizmusról<br />
azonban sajnos nagyon keveset, majdnem<br />
semmit sem tudunk!<br />
A második meghatározás kifejtése<br />
A második, a molekuláris anatómiai meghatározás<br />
szerint a fehérjék módosult aminosavpolimerek. Az<br />
egyes részletek megismeréséből, az adatokból elméleti<br />
kiegészítésekkel valamiféle „egyezség” született a<br />
polimerképződésre és a polimerek módosítására is.<br />
Ezt az „egyezséget” – a polimer képződésére és módosítására,<br />
vagyis magára a fehérjék gyártására megszerkesztett<br />
és általánosan elfogadott leírást – sajnos<br />
ténynek kezeljük, tudásnak, tudománynak tartjuk.<br />
Így került be a tankönyvekbe, így kell megtanulni, így<br />
kell tudni a felnövekvő fiataloknak középiskolás és<br />
egyetemi szinten egyaránt.<br />
Az emberi szervezetet felépítő 10 14 élő sejtben 20<br />
aminosav polimerizációjából keletkeznek a fehérjék.<br />
A 20-ból 11-et a sejtek szintetizálni tudnak, míg kilencet<br />
– ezeket esszenciális aminosavaknak nevezzük<br />
– kívülről, a táplálékból kell megkapni. Vagyis a fehérjéink<br />
felépítéséhez szükséges építőelemek (aminosavak)<br />
majdnem felét csak más élőlények tudják<br />
számunkra előállítani. A fehérjéinkben α-aminosavak<br />
vannak, amelyek optikailag aktív molekulák. Az első<br />
(α helyzetű) szénatomhoz kapcsolódó amino- és karboxilcsoportok<br />
elhelyezkedése határozza meg az optikai<br />
aktivitást, a polarizációs fény elforgatását, amely<br />
lehet jobbra és balra forgatás. A fehérjéinkben csak az<br />
egyik, csak a balra forgató, l-aminosavak fordulnak<br />
elő. Az aminosavak amfotérek, ikerinonos szerkezetűek,<br />
azaz disszociáló amino- és karboxilcsoportokat<br />
tartalmaznak. Ebből a tulajdonságukból és abból,<br />
hogy egyes aminosavak még egy karboxil- és mások<br />
még egy aminocsoportot is tartalmazhatnak, a polimerük,<br />
a peptidlánc olyan amfotér, ikerionos természetű<br />
molekula, amelynek pH 7 vagy a pH 7-től eltérő<br />
saját izoelektromos pontja van, azaz olyan pontja,<br />
ahol semleges, ahol nincs töltése a molekulának. Az<br />
egyes aminosavak peptidkötéssel kapcsolódnak egymáshoz<br />
és képeznek láncot. A peptidkötés egy karboxil-<br />
és egy aminocsoport között egy vízmolekula<br />
kilépésével jön létre.
102 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
Az aminosavak lánccá, polipeptiddé fűzése az élő<br />
sejteken belül speciális „szerelőműhelyekben”, a riboszómákban<br />
folyik. A hogyan(?), vagyis a mechanizmus<br />
itt sem teljesen ismert! A leírás szerint, amelyet<br />
viszont a diákoknak meg kell tanulni, a fehérjék létrehozásában<br />
számos RNS-molekulacsalád vesz részt.<br />
Számos RNS „irányítja” a riboszómákban végbemenő<br />
polipeptidlánc-szintézist. Az rRNS-molekulák (a riboszomális<br />
RNS) a riboszómák szerkezeti felépítésének<br />
fontos alkotói. A tRNS molekulák (a transzfer<br />
RNS) az aminosavak „kiválasztását”, „kínálatának”<br />
biztosítását végzik. Az aminosavak sorrendjét, az<br />
aminosavszekvenciát, amelyett a fehérjeláncok elsődleges<br />
szerkezetének nevezünk, az mRNS-molekulák<br />
(a messenger – hírvivő – RNS-ek) határozzák meg<br />
a kodonjaik, bázis-„hármasaik” által. A kodonok, az<br />
aminosavak sorrendjét meghatározó bázishármasok<br />
a génekből az mRNS-molekulákba való átírásért felelős<br />
DNS-ből, DNS-bázishármasokból származnak. A<br />
négyféle bázist, az A–T (U) és G–C bázist figyelembe<br />
véve elméletileg 4 3 = 64 kodon (bázistriplet) létezne.<br />
Valójában 61 „élő” kodonról tudunk, ami azt jelenti,<br />
hogy több kodon van, mint aminosav. Így lehet, hogy<br />
van olyan, amelyet csak egy, és van olyan, vannak<br />
olyanok, amelyeket több bázistriplet határoz meg. Valóban<br />
van olyan aminosav, pl. a metionin, amelynek<br />
csak egy meghatározó kodonja van (AUG), és vannak<br />
olyanok, pl. a leucin és az arginin, amelyeknek 6-6<br />
meghatározó kodonjuk van. Az mRNS-, az rRNS- és<br />
a tRNS-molekulákon kívül az átírás (transzkripció)<br />
és a polipeptidlánc-szintézis (transzláció) véghezviteléhez<br />
további RNS-molekulák, mint a kis molekulatömegű<br />
mag-RNS-ek (snuRNS és srpRNS), valamint<br />
mikro-RNS-ek (miRNS) vesznek részt. Mindazonáltal<br />
magát a munkát, a fehérjeláncok szintézisét egy<br />
sereg fehérje vezérli és hajtja végre.<br />
Így a molekuláris anatómiai definíció már az aminosavpolimerek<br />
keletkezésénél „átfed” a 3. definícióval,<br />
vagyis azzal, hogy a fehérjék speciális biológiai<br />
funkciókat végző molekulák. Az átfedés a molekuláris<br />
definíció második részénél, a módosulások többségénél<br />
is tetten érhető. Az újdonképződött polipeptidlánc<br />
első módosulásánál, vagyis akkor, amikor a<br />
lánc megcsavarodik, amikor Linus Pauling szerint<br />
az α-hélix kialakul, nem szükségeltetik egy másik fehérje<br />
vagy fehérjék. Viszont a peptidlánc kinyújtott<br />
állapotban tartása, az ún. elongáció is más fehérjéket<br />
igényel. Általános elvként fogadható el, hogy az<br />
élő sejten belüli történések közül egyetlenegyre se<br />
lehet bizonyossággal kimondani, hogy más fehérjéktől<br />
független. A fehérjelánc felcsavarodását, az α-hélix<br />
kialakulását a folyamat felfedezői, Linus Pauling<br />
és Robert Corey is és azóta a tudomány is spontán<br />
folyamatnak, az aminosavak peptidkötéssel történő<br />
lánccá formálása „kötelező” következményének tartják.<br />
Az α-hélix-konfigurációt a CO- és NH-csoportok<br />
közt kialakult hidrogénhidak stabilizálják úgy, hogy<br />
a hélix tengelyében a szomszédos aminosavak 1,5 Å<br />
távolságban vannak egymástól, és egy teljes fordulathoz<br />
3,6 aminosav szükségeltetik. Tehát 3,6 aminosavanként<br />
ismétlődnek a fordulatok az α-hélix-ben.<br />
Ezt a konfigurációt nevezzük a fehérjék, a polipeptidláncok<br />
másodlagos szerkezetének. Linus Pauling<br />
és Robert Corey az α-hélixen kívül még egy másik<br />
standard konfigurációt is felfedezett, amelyet b-redőzött<br />
rétegnek neveztek el. Ez a konfiguráció eltér az<br />
α-konfigurációtól már csak azért is, mert ebben a két<br />
szomszédos aminosav közti távolság nagyobb, az 1,5<br />
Å-mel szemben 3,5 Å. A másik lényeges különbség,<br />
hogy a b-redőzött rétegben a hidrogénhidak két egymás<br />
melletti peptidláncot kapcsolnak egybe, míg az<br />
α-hélixben a hidrogénhidak a láncon belül vannak.<br />
Ami még lényeges, hogy mindkettő , az α és a b konfiguráció<br />
együtt jelenti a fehérjék másodlagos szerkezetét,<br />
és mindkettőt a fehérjelánc saját belső tulajdonsága<br />
eredményének lehet felfogni.<br />
A fehérjeláncok harmadlagos szerkezete, amely<br />
szintén a módosulások része, az egymástól távol eső<br />
aminosavak közti kötések, pl. diszulfidkötések által<br />
jön létre.<br />
A negyedleges szerkezet, amikor több fehérjelánc<br />
kapcsolódik egymáshoz. Az egymáshoz kapcsolódó<br />
fehérjéket általában a fehérjekomplex alegységeinek<br />
nevezzük. A módosulások külön csoportját képezik<br />
a szabályozott hasítások. Különösen az élő sejtekből<br />
kikerült peptidhormonok, a peptid növekedési faktorok,<br />
közös néven „biológiai válaszmódosítók” (biological<br />
response modifiers) keletkeznek így. Még a sejteken<br />
belül vagy a sejtek felszínén specifikus proteáz<br />
enzimek hatására képződnek a speciális funkciókat<br />
végző, kicsi, aktív molekulák. A módosulások harmadik<br />
nagy csoportja, amikor bizonyos nem fehérje<br />
természetű molekulák reakciókba lépnek a peptidláncokkal,<br />
majd hozzájuk kapcsolódnak. Ilyen pl. a<br />
glikoproteinek nagy csoportja, amikor is a szénhidrátok<br />
csoportjába tartozó molekulák kovalensen a pep-
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
103<br />
tidláncokhoz kapcsolódnak. A módosulások újabb<br />
külön csoportját képezik azok a kapcsolatok, amikor<br />
anorganikus elemek kötődnek a fehérjékhez. Ezek általában<br />
metalloproteinek.<br />
A molekuláris anatómiai definíció, vagyis az, hogy<br />
a fehérjék módosult aminosavpolimerek, lehetővé<br />
tette számunkra, hogy bizonyos fokig megismerjük,<br />
megértsük a lehetséges mechanizmusokat, amelyek<br />
az élő rendszerekben a fehérjék felfoghatatlan sokaságát<br />
eredményezik. A kodonok száma és a 20 aminosav<br />
együtt a lánc méreteinek változhatóságával már a<br />
primer szerkezetük alapján végtelen nagy számú peptidlánc<br />
szintézisét adja. A módosulások sokfélesége<br />
még tovább biztosítja, hogy a ma élő élőlényekben,<br />
különösen az emberi szervezetben végtelenül nagy<br />
számú fehérje képződhessék, és valóban képződik is.<br />
A harmadik meghatározás kifejtése<br />
A fehérjék meghatározott, sajátságos biológiai<br />
funkciókkal rendelkező molekulák. Mivel ez a meghatározás<br />
adja ennek a fejezetnek az alapját, érdemes<br />
alaposabban megvizsgálnunk. Már az előző két meghatározás<br />
is sejteti, hogy a fehérjéknek bizonyosan<br />
vannak olyan funkciói, amelyeket közvetlenül még<br />
nem tudunk vagy egyáltalán nem tudhatunk vizsgálni,<br />
csak következtetni tudunk rájuk az „eredményből”.<br />
Később olyan vizsgálati módszereket is tárgyalunk<br />
majd, amelyeket magában az érintetlen élő sejtekben<br />
tudunk elvégezni, de „a fehérjék vizsgálata biológiai<br />
funkcióik alapján” – ami a fejezet címe – mégis azt jelenti,<br />
hogy az élő sejtekből fiziológiásan kikerült vagy<br />
az élő sejtek elpusztítása után kivett fehérjéket vizsgálunk.<br />
Az, hogy vannak olyan fehérjékhez kapcsolt<br />
biológiai, sejtélettani funkciók, amelyek csak az élő<br />
sejteken belül zajlanak, és nincs módszerünk, amelylyel<br />
ezek közvetlenül vizsgálhatók lennének, könnyen<br />
elfogadható. Az a feltételezés, hogy egy fehérje az élő<br />
sejten belül más funkciót is betölt, mint amit a sejtekből<br />
kivéve bizonyíthatunk róla, ma már elfogadott.<br />
Elfogadott, mert több bizonyíték is van arra, hogy pl.<br />
az mRNS védelmét az élő sejtekben bőségben előforduló<br />
RNS-bontó enzimektől (RN-áz molekuláktól)<br />
bizonyos glikolikus enzimek is végzik.<br />
A harmadik állítás, hogy az élő sejten belül a fehérjéknek<br />
van egy lényegi funkciójuk, ami nem más,<br />
mint maga az élő állapot (a „living state”) biztosítása(!),<br />
ma még nincs széles körben elfogadva. Mintha<br />
az élettudomány félne a „vis vitalis” elmélet viszszacsempészésétől.<br />
Ugyanakkor sokkal több adat,<br />
közvetlen megfigyelés szól amellett, hogy van „living<br />
state”, hogy van a fehérjéknek „dinamikus élő állapota”,<br />
mint ellene. Ezért helyes, ha minden fiatal úgy tekint<br />
a fehérjékre, mint az élő sejtek azon alkotóelemére,<br />
amelynek nem 2, hanem 3 állapota van:<br />
• Élő állapot (living state).<br />
• Natív állapot, ami az élő sejtekből kikerült vagy<br />
általunk kivett fehérjék állapotát jelöli.<br />
• Denaturált állapot. Ezt a denaturált állapotot<br />
hővel, savval, lúggal laboratóriumban könnyen<br />
elő lehet idézni. Ekkor a fehérjék elveszítik a<br />
biológiai funkciójukat.<br />
*<br />
Lezárva a „mi a fehérje(?)” kérdésre adható 3 választ,<br />
körvonalazódik, hogy ez a „A fehérjék vizsgálata biológiai<br />
funkcióik alapján” című fejezet elsődlegesen az<br />
élő sejtekből kivett vagy fiziológiásan kikerült fehérjék<br />
biológiai funkciói alapján való vizsgálatáról fog<br />
szólni, és csak röviden utalunk majd olyan kutatási<br />
irányokra, amelyek közvetlenül az élő sejteken belül<br />
vizsgálják, regisztrálják a fehérjefunkciókat.<br />
Az emberi test 10 14 élő sejt „társadalma”. Az általuk<br />
termelt 9–12 kg teljes fehérjeállomány funkcióik<br />
alapján 10 csoportba lett felosztva, és a következőkben<br />
e csoportokat ismertetjük:<br />
• Immunglobulinok, antitestek és a komplementrendszer.<br />
• Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék, intracelluláris<br />
vázfehérjék (citoszkeleton).<br />
• Enzimek, biokatalizátorok.<br />
• Hormonok.<br />
• Sejtnövekedést befolyásolók, sejtnövekedési<br />
faktorok, „biológiai válasz módosítók” (biological<br />
response modifiers).<br />
• Extracelluláris szerkezeti elemek.<br />
• Raktárak.<br />
• Transzportőrök (szállítófehérjék).<br />
• Ligandumok.<br />
• Esszenciális táplálékok.<br />
Az egyes fehérjecsoportok ismertetésének menete:<br />
rövid történeti áttekintéssel kezdődik, majd következik<br />
a leírás, molekuláris sajátosságaik ismertetése, ezután<br />
funkcióik bemutatása, végül a funkcióik alapján<br />
végezhető vizsgálatuk bemutatása következik.
104 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
Immunglobulinok, antitestek<br />
és a komplementrendszer<br />
Történeti áttekintés<br />
Az antitestek, az immunglobulinok és a komplementrendszer<br />
felfedezésének, elnevezésének története természetesen<br />
bele van ágyazva az egész immunológia<br />
történetébe. Lehetne és talán kellene is Edward<br />
Anthony Jenner (1749–1823) munkásságával kezdeni,<br />
hiszen méltán nevezik őt az „immunológia atyjának.”<br />
Minden kétséget kizáróan ő volt az első, aki<br />
tudatosan immunizált, védőoltást (vakcinációt) alkalmazott.<br />
Híressé vált a kertészének 8 éves fia, James<br />
Phipps, akit 1796. május 14-én beoltott egy fejőlány,<br />
Sarah Nelmes kezén lévő tehénhimlőhólyagból vett<br />
folyadékkal. A fiú bizonyítottan védetté vált a himlő<br />
ellen. Sok más óriást, köztük Louis Pasteurt (1822–<br />
1895), Robert Kochot (1843–1910), Ilja Iljics<br />
Mecsnyikovot (1845–1916) kellene feltétlenül említeni<br />
és felfedezéseiket ismertetni, a kitűzött konkrét<br />
cél, az antitestek felfedezésének története szempontjából<br />
mégis mindenekelőtt Paul Ehrlichet (1854–<br />
1915), az ő munkásságát kell részletesebben ismertetni.<br />
Igazi kutató volt, akinek orvosdoktori diplomája<br />
is volt! Először patológus, és a hisztológiai festések<br />
érdeklik. Harminckét éves, amikor Koch Robert<br />
Berlinbe, a Charite-re hívja. Együtt dolgozott ekkor<br />
Adolf von Behringgel, a diphtheriaellenes szérum<br />
kifejlesztésén. Ekkor használja először az antitest<br />
(„antikörper”) fogalmat, és alkotja meg a humorális<br />
immunitás tanát, az „oldallánc-teóriát”, miszerint a<br />
toxinok, mint „kulcs a zárban” kapcsolódnak a kritikus<br />
sejtek felszínéhez. Ez a kötődés indukálja a speciális<br />
antitest termelését. Mecsnyikovval közösen<br />
kapott 1908-ban orvosi-élettani Nobel-díjat. Ezt követően<br />
Dr. Hata Sahachiróval, tanítványával kifejlesztették<br />
a syphilis elleni hatékony gyógyszert, a<br />
Salvarsant. Fontos tudni, hogy jóllehet az antitest (antikörper)<br />
elnevezés Ehrlichtől származik, az első<br />
rendszeres kutatásokat az antitestekkel, ill. az ún. humorális<br />
immunitással kapcsolatban Emil Adolf von<br />
Behring (1854–1917) és Kitasato Schibasaburo<br />
(1853–1931) végezte. Kimutatták, hogy passzív immunizálás<br />
(védettség) érhető el a kórokozóval fertőzött<br />
állati vér szérumának befecskendezésével. Emil<br />
Adolf von Behring kapta az első orvosi-élettani<br />
Nobel-díjat éppen az antitestekkel kapcsolatos kutatásaiért<br />
1901-ben, azaz 8 évvel korábban, mint a névadó<br />
Paul Ehrlich. Tudománytörténeti szempontból<br />
érdekes, hogy amíg az antitest (antikörper) fogalmat<br />
minden bizonnyal Paul Ehrlich alkotta, használta<br />
először, az antigén fogalmat, elnevezést viszont a magyar<br />
Detre (Deutsch) László (1874–1939) mikrobiológus.<br />
Nagyon fontos, hogy egy ilyen kiváló tudósról,<br />
mint amilyen Detre László volt, mindenki, aki<br />
az orvostudomány és az egészségtudomány terén szerez<br />
felsőfokú képzettséget, alapos ismeretekkel rendelkezzék.<br />
Nagysurányban (ma Szlovákia) született<br />
1874-ben, 1895-ben avatták orvosdoktorrá Budapesten.<br />
A Kórbonctani Intézetben lett asszisztens, majd<br />
Bécsben Landsteiner mellett, valamint Párizsban, a<br />
Pasteur Intézetben, Mecsnyikov laboratóriumában<br />
dolgozott. Itt a Pasteur Intézetben a typhus elleni immunitást<br />
tanulmányozva dolgozta ki a specifikus ellenanyagok<br />
keletkezésének „antigén-teóriáját”, amely<br />
szerint a fertőzéssel szembeni immunitás sajátos antigéningerre<br />
jön létre. Az „antigén-teóriát” a tudomány<br />
általánosan elfogadta, nevét azonban nem emlegetik<br />
méltóan. Az első magyar szérumintézetet, a Jenner–<br />
Pasteur Intézetet is ő alapította és vezette. Az első magyar<br />
nyelvű immunológiai összefoglaló munkát, „A<br />
gyakorlati immunizálás tana” címmel 1906-ban szintén<br />
ő írta. 1939-ben Washingtonban (USA) halt meg.<br />
Az 1900-as évek elején sok tudós volt már meggyőződve<br />
arról, hogy az állatok és így az ember vérében<br />
is szabad antitestek sokasága kering. Almroth<br />
Wright (1861–1947) feltételezte és bizonyította,<br />
hogy a specifikus antitestek kötődnek a kiváltó baktériumok<br />
felszínéhez, amely a fagocitózisukat és ezáltal<br />
az elpusztításukat eredményezi. Ezt a folyamatot ő nevezte<br />
el opszonizációnak. Michael Heidelberger<br />
(1888–1991) és Oswald Avery (1877–1955) figyelte<br />
meg először, hogy az antigén kicsapható antitesttel,<br />
és azt is, hogy az antitest fehérje. Astrid Fagreaus<br />
1948-ben fedezi fel, hogy a B-sejtekből képződő plazmasejtek<br />
termelik az antitesteket, az immunglobulinokat.<br />
Az antitestek (immunglobulinok) könnyűláncát<br />
Gerald Edelman és Joseph Gally fedezte fel a<br />
hatvanas évek elején. Gerald Edelman és Rodney<br />
Robert Porter megosztva kapta az orvosi-élettani<br />
Nobel-díjat 1972-ben az antitestek, elsődlegesen az<br />
IgG- és IgM-molekulák szerkezetének kutatásáért.<br />
Az IgA felfedezése Thomas Tomasi, az IgD-é Dawid<br />
Rowe és John Fahey, az IgE-é Kikishige Ishizaka<br />
és Teruki Ishizaka nevéhez kapcsolható. Az
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
105<br />
immunglobulinok termelésének celluláris hátterének<br />
kutatásáért, az immuntoleranca felismeréséért,<br />
pontosabban a klónelméletért az orvosi-élettani Nobel-díjat<br />
1960-ban Frank Macfarlane Burnet<br />
(1915–1985) és Peter Brian Medawar (1915–1987)<br />
kapta. Az immunglobulin-termelés genetikai hátterének<br />
kutatásáért, a variabilitás hátterében lévő génátrendeződés<br />
felfedezéséért Susumu Tonegawa kapott<br />
orvosi-élettani Nobel-díjat 1987-ben. Arra a kérdésre,<br />
hogy melyik a legmeghatározóbb felfedezés és ki<br />
a legjelentősebb felfedező az immunológia terén, lehetetlen<br />
válaszolni! Ma azt kell mondanunk, hogy az<br />
antitestek kutatási, diagnosztikai és terápiás hasznosítása<br />
szempontjából van első, van legkiemelkedőbb<br />
technikai vívmány! Ez – minden kétséget kizáróan<br />
– a monoklonális immunglobulin (antitest) termelés<br />
technikájának kimunkálása, amelyért Niels K. Jerne,<br />
Georges J.F. Köhler és César Milstein kapta<br />
meg az orvosi-élettani Nobel-díjat 1984-ben.<br />
Ami a komplementrendszer felfedezésének rövid<br />
történeti áttekintését illeti, Hans Ernst August<br />
Buchner (1850–1902) német orvos, bakteriológus<br />
volt az első, aki felfedezett egy anyagot a vérszérumban,<br />
amely képes volt baktériumokat elpusztítani.<br />
Ezt az anyagot alexinnek nevezte el, ennek adta később<br />
Paul Ehrlich a „complement” nevet. Jules<br />
Burdet (1870–1961) bizonyította be először, hogy<br />
a vérszérumban lévő, a baktériumokat elölni képes<br />
anyag kétkomponensű. Van egy hőrezisztens és<br />
egy hőérzékeny része. A hőérzékeny frakció az, amit<br />
Ehrlich komplementnek nevezett el. Jackie Stanley<br />
és munkatársai szereztek kiemelkedő érdemeket<br />
a komplementfunkció pontosabb megismerésében,<br />
eszerint a komplementrendszer a specifikus antitestekkel<br />
együtt funkcionál, közösen fejtik ki hatásukat,<br />
de van amikor a komplement egyedül, nem specifikus<br />
módon is hat.<br />
Az immunglobulonok, az antitestek<br />
és a komplementek szerkezete, molekuláris<br />
sajátosságai<br />
Az immunglobulinok szerkezeti sajátosságainak teljes<br />
ismertetése messze meghaladja ennek a könyvnek<br />
a követelményeit és ennek a fejeznek a terjedelmét. Itt<br />
csak a lényegi sajátosságok ismertetésére kerülhet sor.<br />
Az egyik legfőbb közös tulajdonságuk, hogy glikoproteinek.<br />
Előfordulásuk és fizikai állapotuk alapján két<br />
fő csoportba sorolhatók:<br />
• Szabad, oldat fázisban lévő immunglobulinok<br />
(antitestek), amelyek legfőképpen a vérplazmában<br />
és sokkal kisebb mennyiségben, koncentrációban<br />
a különböző testnedvekben, pl. nyálban,<br />
hörgőváladékban stb. vannak jelen.<br />
• Kötött formában bizonyos B-lymphocyta-sejtek<br />
perifériás zónájában, amelyeket ezért felszíni<br />
(sIg) vagy membrán-immunglobulinnak (mIg)<br />
neveznek.<br />
Az alapszerkezet két nehézláncból és két könnyűláncból<br />
diszulfidhidakkal összekapcsolt Y alakú molekula.<br />
Ez a molekula, jóllehet 4 polipeptidláncból összekapcsolt<br />
komplex, mégis monomer (Ig-monomer) a<br />
5-1. táblázat. Az emberi immunglobulinok fizikai-kémiai tulajdonságai<br />
Immunglobulin IgG 1<br />
IgG 2<br />
IgG 3<br />
IgG 4<br />
IgM IgA 1<br />
IgA 2<br />
sIgA IgD IgE<br />
nehézlánc γ 1<br />
γ 2<br />
γ 3<br />
γ 4<br />
μ α 1<br />
α 2<br />
α 1<br />
vagy<br />
α 2<br />
δ ε<br />
nehézláncdomének száma 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5<br />
nehézlánc-molekulatömeg<br />
(kilodalton)<br />
51 51 60 51 65 56 52 52-56 69,7 72,5<br />
molekulatömeg (kilodalton) 146 146 170 146 970 160 160 385 184 188<br />
átlagos szérumkoncentráció (g/l) 9 3 1 0,5 1,5 3,0 0,5 0,05 0,03 0,00005<br />
szénhidrát (%) 2-3 2-3 2-3 2-3 12 7-11 7-11 7-11 9-14 12<br />
(Forrás: Petrányi, Benzúr, Falus: Klinikai Immunológia. 38. old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1988.)
106 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
neve. Az emberi szervezetben fellelhető immunglobulinokban<br />
ötféle nehézlánc (μ, δ, γ, α, ε) és kétféle<br />
könnyűlánc (κ, λ) fordul elő. A nehézláncokban az<br />
aminosavak száma 450–550 között, míg a könnyűláncokban<br />
210–220 között változik. Mivel az emberi<br />
szervezet fehérjéit felépítő 20 aminosav átlagos molekulatömege<br />
100 körül van, az aminosavak számából,<br />
ha megszorozzuk 100-zal, jó megközelítéssel megkaphatjuk<br />
az egyes láncok, sőt az egész immunglobulin-molekula<br />
(Ig-monomer) nagyságát, molekulatömegét<br />
is (5-1. táblázat).<br />
Az összes immunglobulint (antitestet) osztályokba<br />
vagy más néven izotípusokba soroljuk. Az emberi<br />
szervezetben, együtt az összes placentaris emlőssel,<br />
a nehézláncok eltéréséből fakadóan 5 izotípus (osztály)<br />
van, amelyeket nagybetűkkel, ábécésorrendben<br />
a következőképpen jelölünk: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.<br />
Az IgD, IgE és IgG csak monomer formában fordul<br />
elő, az IgA lehet monomer vagy dimer. Az IgM, amely<br />
messze a legnagyobb méretű immunglobulin, pentamer,<br />
azaz 5 monomer egymásba kapcsolódása által<br />
képződött molekulakomplex. Az IgM lehet kötött<br />
formában az effektor B-lymphocyta sejtek felszínén<br />
vagy szabadon a vérplazmában. Azok az immunglobulinok,<br />
amelyek sejtek felszínéhez kötöttek, mint pl.<br />
az IgM és az IgD, tartalmaznak ún. „transzmembrán”<br />
régiót. Azokban viszont, amelyek csak szabadon, oldott<br />
állapotban vannak jelen a vérplazmában vagy a<br />
különböző testnedvekben, nincs „transzmembrán”<br />
régió. Az 5 immunglobulin-osztályon belül az IgG<br />
immunglobulinokat 4 alosztályba (IgG 1–4<br />
), az IgA<br />
immunglobulinokat 2 alosztályba soroljuk. Mivel az<br />
IgA monomer és dimer formában is előfordul (főként<br />
a testnedvekben), háromféle IgA van. Így a teljes immunglobulin<br />
(osztály–alosztály) szám 10(!) (lásd 5-1.<br />
táblázat).<br />
Az immunglobulinok alapegysége, a két nehéz- és<br />
két könnyűláncból felépült immunglobulin-monomer<br />
(Ig-monomer) két fő részből áll, az F ab<br />
(fragment<br />
antigen binding) és az F c<br />
(fragment crystallizable)<br />
régió ból. Az F ab<br />
- és F c<br />
-régió közti szakasz (kapocsvagy<br />
csukló- (hinge-) régió) bizonyos proteázokkal<br />
(pl. papain) széthasítható, és így külön-külön részletesebben<br />
tanulmányozhatók.<br />
Az Ig-monomerek felépítését úgy is vizsgálhatjuk,<br />
hogy külön a nehézláncokat és külön a könnyűláncokat<br />
osztjuk régiókra szerkezetük és funkciójuk alapján.<br />
Így a nehézláncokban is és a könnyűláncokban is<br />
megkülönböztethetünk konstans (állandó) és variábilis<br />
(változó) régiókat. A nehézláncokban a konstans<br />
régió azonos az összes idiotípusú (osztályú) antitestben.<br />
Ami a könnyűláncokat illeti, a két lánctípus (κ és<br />
λ) úgy fordul elő, hogy egy antitestben vagy az egyik,<br />
vagy a másik van jelen, azaz egy monomerben mind<br />
a kettő mindig azonos.<br />
A komplementrendszer (complement system) molekuláris<br />
sajátosságai általánosságban úgy jellemezhetők<br />
mint proteázkaszkád, amely az immunreakció,<br />
az antigén-antitest kapcsolódás hatására aktiválódik.<br />
Különös jelentősége van fertőző ágensek (baktériumok,<br />
vírusok) elpusztításában. A komplementrendszer<br />
tagjai különböző nagyságú, molekulatömegű<br />
fehérjék. Elsődlegesen a máj termeli ezeket, de más<br />
sejtekben is, pl. macrophagokban, monocytákban,<br />
a gyomor-bél és az urogenitalis traktus epithelialis<br />
sejtjeiben is termelődnek. Stimulus nélkül nyugalmi<br />
(proprotein) állapotban keringenek a vérben. Mai ismereteink<br />
szerint több mint 25 fehérje alkotja a teljes<br />
rendszert. Az aktiválásnak 3 útját különböztetjük<br />
meg:<br />
• Klasszikus út.<br />
• Alternatív út.<br />
• Mannózkötő lektinindukált út.<br />
Mivel a komplementrendszer valójában proteolitikus<br />
rendszer, az enzimek között lenne/lehetne a helye.<br />
Azért került mégis ide, az immunglobulinokhoz,<br />
mert a szervezetet külső hatásoktól, elsődlegesen fertőzésektől<br />
védő mechanizmushoz tartozik.<br />
Az immunglobulinok, az antitestek<br />
és a komplementrendszer funkciói<br />
Az antigénstimulusra aktivált B-sejtek, a B-lymphocyták<br />
antitesttermelő plazmasejtté vagy memóriasejtté<br />
differenciálódnak. Az utóbbiak „emlékeznek” az<br />
antigénre, így a következő találkozáskor gyorsabb és<br />
intenzívebb védekezésre lesz képes az egész szervezet.<br />
A termelőkből, a plazmasejtekből, a szintézis helyéről<br />
kikerült antitestek szabadon úsznak a véráramban, az<br />
oldott antitestek a „humorális immunitás” (védekezés)<br />
legmeghatározóbb szereplői.
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
107<br />
5-2. táblázat. Az emberi immunglobulinok funkcionális tulajdonságai<br />
Immunglobulin IgG 1<br />
IgG 2<br />
IgG 3<br />
IgG 4<br />
IgM IgA IgD IgE<br />
komplementaktiválás (klasszikus út) + + + +++ - +++ - - -<br />
átjut a placentán + + + - - - -<br />
monocytához kötődik + - + - - - - +<br />
granulocytához kötődik + - + + - + - -<br />
hízósejthez kötődik - - - - - - +++<br />
lymphocytához kötődik + + + + + + - +<br />
thrombocytához kötődik + + + + - - - ?<br />
(Forrás: Petrányi, Benzúr, Falus: Klinikai Immunológia. 46. old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1988.)<br />
Az antitestek 3 módon vesznek részt a szervezet<br />
védekezésében:<br />
1.) Kötődnek a fertőző ágensekhez megakadályozzva<br />
belépésüket és elszaporodásukat a szervezetben.<br />
2.) Stimulálják a macrophag, a fagocita és más<br />
sejteket a patogénnek eltávolítására 3.) Beindítják a<br />
patogén destrukcióját, lebontását elvégző rendszereket,<br />
pl. a komplementrendszert. Az egyes immunglobulinokra<br />
lebontva az antitestek funkciói az 5-2.<br />
táblázatban vannak összefoglalva.<br />
A komplementrendszer konkrét funkciója többrétű.<br />
Először is meg kell említeni az „opszonizációt”,<br />
ami elősegíti az antigén, a patogén kórokozó fagocitózisát.<br />
A kemotaxis az a mechanizmus, amely a macrophagok<br />
és a neutrophil leukocyták mozgósítását<br />
stimulálja. A lízis maga a kórokozók feloldását, szétroncsolását<br />
jelenti. A komplement vírusok molekuláris<br />
struktúráját képes megváltoztatni, és így az antigenitás<br />
megváltoztatásával a védekezést hatékonyabbá<br />
teheti.<br />
Az immunglobulinok és az antitestek<br />
vizsgálata<br />
Az immunglobulinok és az antitestek funkcióira irányuló<br />
vizsgálatok (A típusú). Az egész terület részletes<br />
leírása több kézikönyv terjedelmű lenne. Az antitestek<br />
funkcióira irányuló vizsgálatok ma egy külön<br />
tudományterületet, magát az immunológiát jelentik.<br />
Az immunológia ma már teljes önálló tudományterület,<br />
amelynek kutatási, diagnosztikai és terápiás oldala<br />
egyaránt van. Azok a vizsgálatok, ahol antitesteket<br />
különböző molekulák azonosítására, vérben, szövetnedvekben,<br />
sejtekben, sejtek felszínén az antigén kimutatására,<br />
mennyiségi meghatározására használunk,<br />
több kutatási területetet, több orvosi diszciplínát érint.<br />
Ezek: laboratóriumi medicina, patológia, mikrobiológia.<br />
Ma, a monoklonális antitesttechnika bevezetése<br />
óta, mindhárom diszciplina kutatási és diagnosztikai<br />
tevékenységében az antigénmolekulák felismerése,<br />
meghatározása – az immuntechnológia elvének alkalmazása<br />
által – egyike a legfontosabb módszereknek.<br />
Mindebből következik, hogy itt, ebben a fejezetben<br />
csak röviden, az elvek rövid ismertetésével lehet az antitestekre<br />
funkcióik alapján irányuló vizsgálatokról (A<br />
típusú vizsgálatok) szólni, illetve azokról a vizsgálatokról,<br />
ahol célzatosan termelt monoklonális antitesteket<br />
használnak az antigénmolekulák azonosítására, mérésére<br />
(B típusú vizsgálatok).<br />
• Az antitestek vizsgálatánál elsőként az egyes<br />
osztályokba tartozó immunglobulinok mennyiségi<br />
meghatározását említhetjük (A1-es vizsgálat).<br />
Ezekhez a mérésekhez az osztályokba tartozást<br />
meghatározó nehézlánc konstans régiója<br />
ellen termelt ellenanyagot használunk. Maga a<br />
meghatározás valamelyik immunkémiai módszer.<br />
A mérési eredmény a humorális immunstátus<br />
állapotáról adhat általános, nem specifikus<br />
információt. Bizonyos betegségekben, pl.<br />
egyes májbetegségekben diagnosztikai értékű is<br />
lehet, ill. a betegség súlyosságáról is informálhat<br />
az IgA, IgM, IgG immunglobulin-osztály menynyiségi<br />
meghatározása.
108 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
• Immunszerológia vagy egyszerűen csak szerológia<br />
(serology; A2-es vizsgálat). A szerológia az<br />
immunológia tudományágának egyik részterülete.<br />
Összefoglaló neve azoknak a vizsgálatoknak,<br />
ahol diagnosztikai céllal (lehet kutatási<br />
céllal is) az antigén-antitest kapcsolódást, az<br />
antitesteket, az antigén-antitest komplexumokat<br />
határozzák meg. Konkrétan a szerológia keretében<br />
azt vizsgáljuk, hogy van-e speciális ellenanyag,<br />
antitest és immunkomplex jelen a vérplazmában<br />
vagy bármely testfolyadékban egy<br />
speciális antigén ellen. Az antigén lehet bármely<br />
kórokozó, vírus, baktérium, gomba, parazita<br />
stb., de lehet csupán idegen fehérje- vagy nem<br />
fehérje molekula is. Bizonyos patológiás állapotokban,<br />
pl. az autoimmun betegségekben saját<br />
molekulák, fehérjék és nem fehérje molekulák is<br />
lehetnek antigének, amelyek ellen ellenanyagok<br />
(antitestek, immunglobulinok) termelődnek.<br />
Az immunreakció, vagyis az antigén-antitest kapcsolódás<br />
felismerése, kimutathatósága, bizonyíthatósága<br />
módszertani értelemben elsődlegesen attól függ,<br />
hogy az antigén alakos (korpuszkuláris) elemen<br />
van-e, vagyis szuszpenzió formában van-e jelen a<br />
kérdéses mintában, vagy oldottan, valódi oldat fázisban.<br />
Az alakos elem természetesen lehet sejt vagy<br />
más, mint pl. latexszemcse, amelyre az antigén rá van<br />
kötve. Az antitest az antigént magán viselő (prezentáló)<br />
alakos elemeket képes egymáshoz kapcsolni, azaz<br />
a szuszpendált (lebegő) állapotból csapadékká formálni.<br />
Ezt az átalakulást agglutinációnak nevezzük.<br />
Amikor valódi oldat fázisban lévő antigént kapcsolnak<br />
az antitest molekulák csapadékká, precipitációról<br />
beszélünk! Direkt agglutinációról, precipitációról<br />
vagy egyáltalán immunreakcióról beszélünk, amikor<br />
egyetlen antitest vesz részt a reakcióban, ez általában<br />
az IgM antitestek esetében van így. Indirekt a reakció,<br />
amikor második antitest hatására következik be az<br />
agglutináció, precipitáció vagy csak az immunreakció<br />
detektálása. Az agglutináció aktív, ha az antigén eleve<br />
rajta vagy benne van a sejt perifériás zónájában, a<br />
membránjában vagy más alakos elem felszíni rétegében.<br />
Passzív agglutinációról akkor beszélünk, ha valamilyen<br />
alakos elemhez (pl. latexszemcse) mi magunk<br />
kötjük az antigént. Az agglutinációt és a precipitációt<br />
különböző tényezők befolyásolják. Így a hőmérséklet,<br />
a pH, az inkubációs idő, az antigén-antistest arány, az<br />
ionerősség, a különböző felületaktív (detergens természetű)<br />
molekulák jelenléte stb. Az antigén-antitest<br />
arányban van „kritikus arány”. Ez az az arány, amikor<br />
az agglutináció, ill. a precipitáció bekövetkezik.<br />
A „kritikus arány” bizonyára a víz miatt van, hiszen a<br />
víznek, a fehérjék vízburkának meghatározó szerepe<br />
van az antigén-antitest kapcsolódásban. Sajnos azonban<br />
a részletek itt sem pontosan ismertek.<br />
Az agglutináción alapuló tesztek, vizsgálatok – teljesség<br />
nélkül – a következők:<br />
• Vércsoport-szerológia.<br />
• Bakteriális antigén-antitest vizsgálatok.<br />
• Autoantitestek kimutatása.<br />
• Különféle hemagglutinációs tesztek.<br />
• Coombs-teszt.<br />
• Latexszemcsékhez kötött antigének és antitestek<br />
alkalmazása stb.<br />
A precipitáción alapuló szerológiai tesztek is sokfélék.<br />
Részletes leírásuk a módszertani részben található<br />
meg. Itt csak rövid felsorolásukra kerülhet sor:<br />
• Mancini-technika.<br />
• Ouchterlony-módszer.<br />
• Immunelektroforézis.<br />
• Immunfixáció.<br />
• Rakéta-immunelfo stb.<br />
A szuszpendált (lebegő) állapotban maradó immunkomplexek<br />
direkt vizsgálata általánosságban a nefelometria<br />
(fényszórás) elvének alkalmazásával<br />
lehetséges. Külön érdemes megemlíteni a „lézer-nefelometriát”<br />
és a turbidimetriát. A fluoreszcens polarizáció<br />
elvén alapuló technikák is a lebegő immunkomplexek<br />
közvetlen vizsgálatát jelentik. Fontos<br />
megjegyezni, hogy ezek a módszerek, ezek a technikák,<br />
ahol a lebegő, szuszpenzióban maradó antigén-antitest<br />
komplexek direkt vizsgálatára kerül sor,<br />
nem kizárólagos szerológia (A2) módszerek, hanem<br />
széles körben alkalmazhatók és alkalmazzák őket a<br />
speciálisan termelt monoklonális immunglobulinokat<br />
felhasználó (B típusú) vizsgálatokhoz is.<br />
A szerológiai vizsgálatokhoz (A2) kell sorolni azokat<br />
az immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálatokat<br />
is, ahol direkt vagy indirekt módszerrel mik-
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
109<br />
roszkópos preparátumokon vizsgáljuk az antitestek<br />
specifikus kötődését bizonyos sejtorganellumokban<br />
lévő antigénekhez.<br />
Az antitestek molekulafelismerő funkcióit felhasználó<br />
vizsgálatok (B típusú). Mint előbb már említettük,<br />
részben ide tartoznak a szuszpendált állapotban<br />
maradó immunkomplexeket vizsgáló nefelometria,<br />
turbidimetria, és a fluoreszcens polarizáción alapuló<br />
eljárások alkalmazhatók a speciálisan termelt monoklonális<br />
immunglobulinokat felhasználó (B típusú)<br />
vizsgálatokhoz is.<br />
A különböző ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay)<br />
technikák, a RIA (radioimmunoassay)<br />
módszerek, a magas érzékenységű „immunochemiluminescence”<br />
technikák döntően nem a szerológiai<br />
módszertani arzenálhoz tartoznak, vagyis már szorosan<br />
nem az immunológia területének, hanem sokkal<br />
nagyobb arányban az általános laboratóriumi diagnosztikának,<br />
a klinikai biokémiának a módszerei. Hiszen<br />
céljuk nem a vérben fellelhető speciális antitestek<br />
kimutatása, meghatározása, hanem az antigének, a kis<br />
koncentrációban jelen lévő peptidek, hormonok, szerves<br />
molekulák pontos mérése a feladat. Így e technikai<br />
eljárásokat az immunmódszerek B típusánál alkalmazzák,<br />
vagyis ott, ahol a vizsgálatot végző termel magas<br />
specificitású monoklonális ellenanyagot, antitesteket<br />
pontosan azzal a céllal, hogy nagy érzékenységgel és<br />
specificitással tudja az antigént meghatározni, akár<br />
diagnosztikai, akár kutatási célra.<br />
Külön csoportba tartoznak az ún. blott, immunoblott<br />
technikák. Közülük ki kell emelni a kétdimenziós<br />
poliakrilamid-gélelektroforetikus elválasztást követő<br />
immunoblottot. A lényeg, hogy a nagyfelbontású kétdimenziós<br />
poliakrilamid-gélelektroforézis gyakorlatilag<br />
individuális fehérjék elválasztását teszi lehetővé.<br />
Ha az elválasztott egyedi fehérjéket harmadik dimenziós<br />
elektroforézissel nitrocellulózmembrán felszínére<br />
viszik, a speciális monoklonális ellenanyaggal az<br />
egyes fehérjék közvetlen detektálása végezhető el.<br />
*<br />
A komplementrendszer funkcionális vizsgálata valójában<br />
a szerológia tárgykörébe, s így az immunológia<br />
területére tartozik. Részletesebb ismertetésére a<br />
könyv más fejezetében kerül sor.<br />
Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék,<br />
intracelluláris vázfehérjék (citoszkeleton)<br />
Történeti áttekintés<br />
Az ember ősidőktől észlelte, tudta, hogy önmaga és<br />
minden más élőlény is, különösen az állatok – szemben<br />
az élettelen anyagi világ szereplőivel – mozognak.<br />
Olyannyira, hogy a mozgás maga az élet meghatározója<br />
lett(!) Él, ami önmagában, önmagától mozog! A<br />
legelső mikroszkópos megfigyelések, amelyeket Antoni<br />
van Leeuwenhoek (1632–1723) végzett, azt<br />
bizonyították, hogy körülöttünk a vizekben és bennünk<br />
parányi, szabad szemmel nem látható, önmaguktól,<br />
önmagukban mozgó létezők, élőlények (protozoonok,<br />
spermiumok, baktériumok stb.) vannak.<br />
Azt is korán felismerték az emberek, hogy a nagyobb<br />
(soksejtű) élőlényeknek, az állatoknak és természetesen<br />
önmagának, az embernek mozgásához külön<br />
szerve van. Ez az izomzat, ami egyben mint hús a legfőbb<br />
tápláléka is az embernek.<br />
Arra a kérdésre azonban a válasz, hogy pontosan<br />
milyen anyag/anyagok és milyen mechanizmus felelős<br />
az izomzat működéséért, az izomzat vezérelte<br />
mozgásokért, a negyvenes évekig gyakorlatilag teljesen<br />
ismeretlen volt. Nagy büszkeséggel kell minden<br />
magyar embernek, minden magyar diáknak fogadnia<br />
azt a tényt, hogy az izomműködésért felelős<br />
anyag, molekulák és a mechanizmus átfogó kutatását<br />
először magyar kutatócsoport kezdte el és ért el kimagasló<br />
eredményeket. 1940–1945 között Szegeden.<br />
Szent-Györgyi Albert – miután a C-vitaminnal<br />
kapcsolatos kutatásaiért 1937-ben megkapta az élettani-orvosi<br />
Nobel-díjat –, munkatársaival együtt új<br />
területre, az izomkutatásra tért át. Bízvást lehet állítani,<br />
hogy 1938-1945 között Szeged, pontosabban<br />
Szent-Györgyi Albert intézete a Szegedi Tudományegyetemen<br />
volt a világ izombiokémiai kutatásának<br />
legjelentősebb központja [1]. Igaz, a miozin<br />
felfedezése sokkal korábbra, 1864-re tehető, és Wilhelm<br />
Kühne nevéhez köthető [2], és az is igaz, hogy<br />
a bizonyítékot arra, hogy a miozin ATP-áz funkcióval<br />
rendelkezik, nem ők, hanem Engelhardt és Lyubimova<br />
fedezte fel [3], Szent-Györgyi Albertnek és<br />
munkatársainak munkája, eredeményei örökérvényű<br />
mérföldkövek az izom, az izom biokémiája, a kontraktilis<br />
fehérjék kutatása, megismerése szempontjá-
110 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
ból. Az aktomiozin izolálása, majd a miozin mellett a<br />
kontrakcióért felelős másik fehérje, az aktin felfedezése,<br />
sőt a névadás maga Szent – Györgyi Albertnek<br />
és munkacsoportjának, az aktinkutatás tekintetében<br />
kiemelten Straub F. Brúnónak tulajdonítható. Ők<br />
fedezték fel azt is, hogy az aktin monomer, a G-aktin,<br />
a közeg ionerősségétől függően polimerré, F-aktinná<br />
alakul.<br />
Az izomkutatás a II. világháború után Szegeden<br />
ugyan megszakadt, de a világ számos kutatóintézetében,<br />
laboratóriumában tovább folytatódott és ma<br />
is nagy intenzítással folyik. A kutatások egyszerre<br />
terjednek ki a szervek, a szövetek (harántcsíkolt,<br />
sima- és szívizom), a molekulák és a mechanizmusok<br />
megismerésére. A miozin–aktin–ATP rendszer<br />
megismerése mellett az ionizált kalciumot reguláló<br />
troponinok, a tropomiozin megismerése, a 200-at<br />
meghaladó aktinkötő fehérje (aktin-binding proteins)<br />
leírása, a mioglobin és az elaszticitás biztosításáért<br />
felelős óriási fehérjemolekula, a titin felfedezése<br />
a legjelentősebb. Külön ki kell emelni azt a lényegi<br />
felismerést is, hogy aktin nem csak az izomsejtekben,<br />
hanem minden élő sejtben jelen van! Az izom-öszszehúzódás,<br />
az izomkontrakció mechanizmusára, bár<br />
más elméletek is léteznek, bizonyos módosításokkal<br />
a Huxley, Nidergerke és Hanson által kidolgozott<br />
csúszó filamentum modell a legelfogadottabb [4].<br />
Az élő sejtek belső vázfehérjerendszerének kutatása,<br />
sőt diagnosztikai célú vizsgálata az elmúlt 50 évben<br />
a fehérjebiokémia, a fehérjeanalitika egyik jelentős<br />
területévé lett. Az élő sejtek belső fehérjevázát, a<br />
citoszkeletont három fehérjecsoport építi fel:<br />
• Mikrotubuláris rendszer.<br />
• Intermedier filamentumrendszer (közti; 100<br />
Å-ös).<br />
• Aktinfilamenentumok, a mikrofilamentumok<br />
rendszere.<br />
Nem-ionos detergensekkel kezelve egyrétegű (monolayer)<br />
sejtkultúrák sejtjein a vázfehérjerendszer egyes<br />
alkotóelemei ellen termelt ellenanyagokat használva,<br />
indirekt immunfluoreszencia technikával a háromdimenziós<br />
vázrendszer jól detektálható. Mivel detergenskezelés,<br />
vagyis a monomerek eltávolítása után<br />
lehet a filamentumokat jól látni, a sejtvázat detergensrezisztens<br />
citoszkeletonnak szokás nevezni. Az igazság<br />
érdekében meg kell említeni, hogy a sejtmagokat a<br />
környezethez kipányvázó detergensrezisztens citoszkeletont<br />
mi láttuk és írtuk le elsőként a világon Pécsett<br />
[5]. A kontraktilis fehérjék kutatásának legújabb<br />
és leggyorsabban bővülő területe a „molekuláris motorok“,<br />
a „motorproteins“ kutatása, vizsgálata.<br />
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék<br />
és a citoszkeletonfehérjék szerkezete,<br />
molekuláris sajátosságai<br />
A kontraktilis és a motorfehérjéket ma egységes rendszerben<br />
lehet és érdemes vizsgálat alá venni: a molekuláris<br />
motoroknak több típusát különítik el:<br />
• Aktin alapú motorok.<br />
• Mikrotubuláris filamentum alapú motorok.<br />
• DNS alapú motorok.<br />
• Rotációs motorok, baktériumokban.<br />
• Mechanoenzimek.<br />
Aktin alapú motorok<br />
Az aktin alapú motorok a miozinmolekulákkal képeznek<br />
működő molekuláris motorokat. Az aktin,<br />
ahogyan vizsgálni tudjuk, 42 000 dalton (42 kDa)<br />
molekulatömegű globuláris fehérje (G-aktin). Fiziológiás<br />
ionerősség mellett in vitro is polimerré, F-aktinná<br />
alakítható.<br />
Ma az aktint tekintjük az egyik legősibb, leggyakrabban<br />
előforduló és legtömegesebb fehérjének az<br />
egész élővilágban. Gyakorlatilag minden élő sejtben<br />
előfordul, és a sejt össz-fehérjetartalmának 15%-át<br />
vagy még nagyobb hányadát teszi ki. Jelenlegi tudásunk<br />
szerint minden sejtben monomer (G-aktin) és<br />
polimer (F-aktin) formában is jelen van. Az F-aktin<br />
a nem izomsejtekben mikrofilamentum formában, az<br />
izomrostokban vékony, 9 nm (90 Å) filamentum formában<br />
van jelen. Az aktinkötő fehérjék (actin-binding<br />
proteins, ABP) száma rohamosan növekszik. A<br />
Wikipedia (free encyclopedia) 2010. november 8-i<br />
közlésében az ábécé betűi alatt több mint 280 speciális<br />
aktinkötő fehérje van felsorolva. Az izom funkciója,<br />
a kontrakció, az aktin alapú motorfehérje munkája<br />
szempontjából a miozin a legjelentősebb az aktinkötő<br />
fehérjék közül. Ezért itt részletesen csak a miozin<br />
molekuláris sajátosságait ismertetjük. Csak felsorolásszinten<br />
azért érdemes néhány egyéb, ismertebb<br />
aktinkötő fehérjét megemlíteni: aldoláz, angiogenin,<br />
annexin, brevin (gelzolin), kalpain, kaldezmon, disztrofin,<br />
endosszin, fondrin, fimbrin, glikogenin, gluko-
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
111<br />
kináz, hexokináz, hsp 70, integrin, inzertin, kaptin,<br />
miopodin, myelin basic protein, nebulin, neurokalcin,<br />
plasztin, p53, protein-kináz C, porin, rapszin,<br />
szinaptopodin, szpektrin, titin, tau, utrofin, vinkulin,<br />
villin, WASp, cipper protein stb.<br />
Ahogy a kontraktilis fehérjék történeti leírásánál<br />
korábban említettük, a miozin (myosin) volt az első<br />
fehérje, amelyet az izom kontraktilis apparátusából<br />
izoláltak, megismertek [6]. A harántcsíkolt izomból<br />
izolálható miozin, amely az izom alegységében, a<br />
miofibrillumban vastag (15 nm, 150 Å) filamentum<br />
formában van jelen, 520 kDa nagyságú fehérjekomplexum.<br />
Ma a miozinról azt kell tudni, hogy nem egységes<br />
összetett fehérje, hanem nagyon sokféle miozin<br />
van. Az alegységek felépítettsége, aminosavszekvenciája<br />
alapján több mint 100 féle miozint különböztetünk<br />
meg. E nagyszámú miozint nehézláncaik<br />
aminosav-összetétele alapján családokba osztjuk.<br />
Jelenleg 18 miozincsaládot különböztetünk meg, és<br />
azokat, római számmal jelöljük. Azt, amelyet elsőként<br />
haráncsíkolt vázizomból izoláltak (a 520 kDa nagyságú<br />
miozin), a II. családba sorolták be, és a miozin II.,<br />
ill. konvencionális miozin nevet kapta. Ennek a besorolásnak<br />
az a „logikája“, magyarázata, hogy a harántcsíkolt<br />
izomból izolált miozinnak két „fejrésze“ van,<br />
miközben a nem izomsejtekből izoláltnak egy. Ebből<br />
következett, hogy a nem izomsejtekből izolált „egyfejű“<br />
miozin került az I. osztályba miozin I., „nem konvencionális“<br />
miozin néven. A miozinokat alapvetően<br />
3 részre osztjuk: fej, nyak, farok. A fejrész tartalmazza<br />
az ATP-kötő helyet, az ATP-áz centrumot és az aktinkötő<br />
helyet. A nyaki rész a flexibilitást adja. Különböző<br />
könnyűláncok kapcsolódnak ide, ill. itt van a<br />
kalmodulin (Ca 2+ -regulátor) fehérje kapcsolódási helye<br />
is. A farki rész molekuláris összetételének eltérései<br />
miatt térnek el az egyes miozin-molekulacsaládok. A<br />
miozin II., a konvencionális miozin, amely időben és<br />
mélységében a legismertebb, két (220 kDa) nehézláncot<br />
(egyenként 2000 aminosavat) és négy könynyű-<br />
(20 kDa) láncot tartalmaz, így 520 000 dalton<br />
(520 kDa) nagyságú. Az aktin alapú motorok, mint<br />
általában a molekuláris motorok, közvetlenül in vitro<br />
kísérleti körülmények között vizsgálhatók. Történetileg<br />
először aktinfilamantumokon miozinnal fedett<br />
gyöngyök mozgását követték. Manapság inkább miozinnal<br />
fedett tárgylemezen aktinfilamentumok (F-aktin)<br />
mozgását tanulmányozzák.<br />
Mikrotubuláris alapú motorok<br />
A mikrotubuláris rendszer a citoszkeleton fontos<br />
összetevője. Rajta mint „sínpályán” kétféle motorfehérje<br />
mozgását írták le az élő sejteken belül és in vitro<br />
kísérleti feltételek között. Ezek a dineinek és a kinezinek.<br />
Magáról a „sínpályáról”, a tubuláris rendszerről,<br />
annak molekuláris sajátosságairól azt kell tudni, hogy<br />
két közel azonos, 50 kDa nagyságú alegységből, α- és<br />
b-tubulinból felépült, 25–30 nm átmérőjű csavarodott<br />
csőrendszer.<br />
A dineinmotorok felelősek a ciliumok és a flagellumok<br />
mozgásáért. A dinein (dynein) fehérjecsalád<br />
összetételében és szerkezetében eltér a miozinoktól.<br />
1000–2000 kDa nagyságú óriás molekulakomplex,<br />
ATP-áz funkcióval rendelkezik, azaz az ATP-vel közölt<br />
energiát használja a mikrotubuláris kábelén,<br />
„sínpályáján” való mozgáshoz, ami a ciliumok és a<br />
flagellumok mozgását biztosítja.<br />
Az elmúlt évtizedekben vált ismertté, hogy a mikrotubuláris<br />
rendszernek fontos szerepe van minden<br />
eukarióta sejtben a vezikulumok és a különböző organellumok<br />
mozgásában, és ezeket a mozgásokat a<br />
kinezinmotorok vezérlik. Különösen jelentős a vezikulumok<br />
transzportja a neuronokban, ahol akár egy<br />
méter távolságot is meg kell tenni a transzport során.<br />
Az in vitro technikák alkalmazásával sikerült a vezikulák<br />
és a sejtorganellumok mozgatásáért felelős kinezin<br />
motorfehérje-családot mélyebben megismerni.<br />
A kinezinmolekula két 110 kDa nagyságú nagyobb és<br />
két 70 kDa nagyságú kisebb fehérjéből áll. Alakját tekintve<br />
hosszúkás, hossza 110 nm. Van mikrotubuláris<br />
kötő- és organellum-, ill. vezikulum kötőhelye, és<br />
mint a motorfehérjék általában, ATP-áz aktivitással<br />
rendelkezik.<br />
DNS alapú motorok<br />
A DNS alapú mechanoenzimek mint motorfehérjék<br />
kutatása, motorként való elfogadása teljesen új.<br />
Maguk a polimerázok, az izomerázok, a girázok mechanikai<br />
munkát végeznek. A puszta tényt ismerte a<br />
tudomány korábban is, de hogy maga a mechanika, a<br />
működő erő közvetlenül analizálható, valóban teljesen<br />
új. Az új technikák tették, teszik ezt lehetővé.<br />
Rotációs motorok<br />
A rotációs motorok a prokariótákban, a baktériumokban<br />
működő motorok. A baktériumok ostoraik-
112 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
kal (flagellum) mozognak. A flagellumokban a filamentumok<br />
53 kDa nagyságú flagellin alegységekből<br />
épülnek fel. A baktériumok ostoraiban működő motor<br />
teljesen eltér az eukarióták flagellumaiban vagy<br />
ciliumaiban működő motoroktól (lásd a spermiumok<br />
vagy a bronchialis csillók mozgását). Először<br />
is az energiát nem ATP, nem ATP-áz enzim aktivitás<br />
adja. Nem belső része a sejteknek, hanem „extracelluláris”<br />
képződmény. A motor hatékonyságára<br />
jellemző, hogy a baktériumsejt energiájának csupán<br />
1%-át használja ostorának mozgatására. A baktérium<br />
haladási sebessége viszont meglehetősen nagy, 25<br />
μm/s. Méretére vetítve és az emberrel összehasonlítva<br />
a baktérium mozgásával azonos sebesség azt jelentené,<br />
hogy a 100 m-es síkfutást az embernek 5,5 másodperc<br />
(s) alatt kellene teljesítenie. A baktériumok<br />
ostoraiban „protonvezérelt” motor végzi a munkát. A<br />
protongradiens, a protonáram rotációs mozgássá változik.<br />
A hogyanra(?) biztos ismeretünk nincs, de több<br />
elméletet is kialakítottak.<br />
Mechanoenzimek családja<br />
Az ötödik motorfehérje-féleség. Elsődlegesen a<br />
szintézisnél, a riboszómákban írták le az ilyen motorfehérje-működést.<br />
Teljesen új, de kétségbevonhatatlanul<br />
igaz, és még sok újabb és újabb ismeretet ígérő<br />
gondolkodást kíván a fehérjeszintézist, a transzlációt<br />
mechanikai eseménynek is tekinteni. Ugyancsak helyes<br />
mechanikai eseményként felismerni, vizsgálni a<br />
DNS és az RNS enzimatikus hasítását, pl. a restrikciós<br />
endonukleázok hatásmechanizmusánál, de valamennyi<br />
proteolitikus hasításánál is. Új világ tehát a<br />
molekuláris mechanika, a molekuláris motorok kutatása<br />
és új szemléletet is igényel tőlünk is az élő sejtet<br />
nem csak kémiai és fizikai rendszernek, hanem dinamikusan<br />
működő mechanikai(!) molekuláris gépezetnek<br />
is tekinteni.<br />
tárgyalni. A motorfunkció, a mechanika mikéntjére<br />
sok elképzelés van. Ezeknek ismertetésére azért sem<br />
kerül itt sor, mert ma még nyilvánvalóan bizonytalan<br />
és terjedelmes is. Maga az energia, az ATP-áz, a makroerg<br />
foszfát emlegetése is ismeretnek hangzik, holott<br />
a puszta szavak évtizedek óta nem visznek közelebb<br />
a mechanizmus mélyebb megismeréséhez. Tehát úgy<br />
helyes elfogadni, hogy a funkció leírására az előző két<br />
alfejezetben már sor került, hiszen tényszerűen jelenleg<br />
többet állítani nem lehet.<br />
A kontraktilis fehérjék,<br />
a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék<br />
funkcióira irányuló vizsgálatok<br />
A soksejtű élőlények, elsődlegesen az állatok és természetesen<br />
az emberek mozgásának szerv szintű<br />
vizsgálata több tudományterületet érint. Ezek a<br />
vizsgálatok kiterjednek a vázizom funkciójának, teljesítőképességének<br />
vizsgálatára. A szívműködés, a<br />
szívizom-kontrakció vizsgálata a kardiológia tárgykörébe<br />
tartozik. Azoknak a szerveknek a vizsgálata,<br />
amelyekben a mozgást simaizomsejtek összehangolt<br />
működése adja, a fiziológia és az orvoslás különböző<br />
ágazataihoz tartozik.<br />
Az egyes sejtek mechanikájának vizsgálata nyilvánvalóan<br />
olyan speciális mikroszkópos technikához<br />
kötött, ahol az élő sejtek közvetlenül és folytonosan<br />
tanulmányozhatók. Ilyen a fáziskontraszt-mikroszkópia,<br />
az interferenciamikroszkópia, a fluoreszcens<br />
mikroszkópia és a konfokális mikroszkópia is.<br />
Az izolált fehérjék mechanikájának közvetlen vizsgálata<br />
teljesen új világ. Kimondottan a kutatás világa!<br />
Lézer alapú és fluoreszcens technikai eljárások szellemes,<br />
sokszor egyéni ötvözete adja itt a módszertani<br />
arzenált.<br />
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék<br />
és a citoszkeletonfehérjék funkciói<br />
A történeti részben és a molekuláris sajátosságok leírásánál<br />
is azt kellett, azt lehetett észrevenni, hogy a<br />
fehérjekutatás teljesen új területéről van itt szó. Új<br />
szemlélet, új kutatási módszerek. Éppen ezért se a<br />
történeti leírást, se a molekuláris sajátosságokat nem<br />
lehetett a funkció leírása, a funkcióra utalás nélkül<br />
Enzimek, biokatalizátorok<br />
Az enzimekkel foglalkozó tudományterületet enzimológiának<br />
nevezzük. Az enzim másik, szinonim,<br />
alternatív neve „biokatalizátor”. Molekuláris természetüket<br />
tekintve az enzimek fehérjék. Ezen állítás<br />
igazságtartalmán semmit sem változtat az, hogy bizonyos<br />
kísérletekben az RNS-ek enzim sajátosságát<br />
ismerték fel. Ennek alapján az enzimaktivitást mu-
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
113<br />
tató RNS-eket ribozimnak nevezték el. A „biokatalizátor”<br />
elnevezés jól kifejezi, hogy az enzimek kémiai<br />
reakció kat befolyásolnak, serkentenek, gátolnak vagy<br />
maguk hajtanak végre. Amikor igaz állításnak fogadjuk<br />
el, hogy minden enzim fehérje, érdemes megvizsgálni<br />
az állítás fordítottját is. Azt, hogy igaz lehet-e,<br />
hogy minden fehérje enzim? Látva a sokféle fehérje<br />
sokféle funkcióját, elsőre a válasz egyértelműen nem!<br />
Nem minden fehérje enzim – állítanánk, azonban jól<br />
kell tudnunk, hogy egy fehérje a léte során többféle<br />
funkciót is betölthet, különösen, amikor darabolódik.<br />
Más a funkciója egészben, mint darabolódás után.<br />
Ismert, hogy szintéziskor minden kialakuló peptidlánchoz<br />
ATP kapcsolódik. Ez jól bizonyított az ún.<br />
elongációs fázisban. Az új peptidlánchoz kapcsolódó<br />
ATP „sorsa” háromféle lehet:<br />
• Hasítatlanul lekerül a láncról.<br />
• Elhasítódik és a foszfát a láncon kötve marad.<br />
• Elhasítódik és az ADP marad a fehérjéhez<br />
kötve.<br />
Bármelyik történik is, maga a fehérjelánc részt vesz a<br />
reakcióban, vagyis valamilyen módon katalizálja azt.<br />
Ebből a tényből fakad, hogy a léte során legalább egyszer,<br />
a kezdetnél minden fehérje enzimként is viselkedik.<br />
Tehát helyes úgy tekintenünk minden fehérjére,<br />
hogy általános tulajdonságuk, ATP-kötő képességük<br />
miatt, mindegyik képes enzimként is viselkedni.<br />
Történeti áttekintés<br />
Minden kétséget kizáróan Louis Pasteur (1822-<br />
1895) francia mikrobiológus és kémikus volt az első,<br />
aki a cukor alkohollá erjesztését tanulmányozva bebizonyította,<br />
hogy az élesztőgombákból származó<br />
anyag, amit fermentnek nevezett, felelős a fermentációért.<br />
Wilhelm Kühne (1837–1900) német élettanász<br />
volt az első, aki az enzim elnevezést („élesztőből”<br />
– görögül ένζυμο) használta. Eduard Buchner<br />
(1860–1917) bizonyította és közölte elsőként (1897),<br />
hogy az élesztősejtek jelenlétére nincs szükség, hogy<br />
a sejtekből származó anyag, amelyet „sucrose zymase”-nak”<br />
nevezett, végrehajtsa a cukor → alkohol átalakítást.<br />
E felfedezéséért, nevezetesen azért, hogy<br />
elsőként írta le a sejtmentes fermentációt, kémiai<br />
Nobel-díjat kapott 1907-ben. Ezt követően a XX.<br />
századot a biokémia, az élővilág kemizmusát feltáró<br />
tudomány századának szokták tekinteni, ami viszont<br />
elsődlegesen az enzimeknek, a biokatalizátor<br />
fehérjéknek a kutatását, megismerését, felfedezését<br />
jelentette. Az elnevezés, az enzimek nómenklatúrája<br />
egyszerűen a szubsztrátmolekula neve, amelynek<br />
valamilyen átalakulását segíti elő, serkenti, az „áz”<br />
képzővel kiegészítve.<br />
Az enzimek, biokatalizátorok molekuláris<br />
sajátosságai<br />
Az a meghatározás, hogy az enzimek fehérjék, egyértelműen<br />
meghatározza molekuláris sajátosságaikat.<br />
Egyszóval az enzimek sokfélék (heterogének). Valóban<br />
a legegyszerűbb fehérjétől, 50–100 aminosavból<br />
felépült peptidtől (lásd bizonyos proteázok és a restrikciós<br />
endonukleázok) a sok-sok alegységből felépült<br />
és nem fehérje alkotókat (pl. nyomelemeket)<br />
is tartalmazó, többszázezres molekulatömegű óriás<br />
molekulakomplexekig, mind, mind előfordulnak az<br />
élővilágban. Viszont érdemes az enzimeket, mint<br />
ahogy az összes fehérjét, termelődésük logikai rendjében<br />
megvizsgálni. Különösen érdemes ezt a logikai<br />
rendet követni a diagnosztikus célú enzimológiában.<br />
Mint minden fehérjét, az enzimeket is, élő sejtek termelik.<br />
Tehát az enzimek az élő sejt produktumai. A<br />
második fontos logikai állítás, tény, hogy az élő sejt az<br />
enzimeket is, mint minden fehérjét, két célból termeli.<br />
Saját használatra, saját alkotóelemének vagy „exportra”,<br />
azaz sejten kívüli felhasználás céljából termeli.<br />
Mivel a diagnosztikai célú vizsgálatokhoz a minta<br />
általában a vérszérum vagy a vérplazma, fontos tudni,<br />
hogy a vizsgálni kívánt enzim vagy bármely fehérje<br />
a két lehetőség közül hova tartozik. Azért termelődött-e,<br />
hogy magának a sejtnek alkotórésze legyen,<br />
vagy azért, hogy a sejten kívül végezzen katalitikus<br />
vagy bármilyen más funkciót? A sejtalkotók ugyanis<br />
csak a sejtek elhalása vagy haldoklása, áteresztővé<br />
válása idején jutnak az extracelluláris teret jelentő<br />
vérplazmába, a külső hasznosulásra termelt fehérjék<br />
viszont fiziológiai úton választódnak ki (szecernálódnak)<br />
a termelő sejtekből. A vérplazmában vagy a<br />
vérszérumban mért aktivitásuk vagy koncentrációjuk<br />
jól értékelhető információt ad a termelő sejtek állapotáról.<br />
Azok az enzimek és más fehérjék, amelyek<br />
amúgy sejtalkotók, magasabb aktivitással, magasabb<br />
koncentrációban lesznek jelen a plazmában, amikor a
114 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
termelő sejteknek fokozott a károsodottsága, fokozott<br />
az elhalási rátája, míg a külső használatra termelteké<br />
ilyenkor alacsonyabb.<br />
Az enzimek funkciói<br />
A pontosabb eligazodás érdekében a funkciók alapján<br />
a beláthatatlanul sok enzimet 6 osztályba soroljuk.<br />
Az osztályokon belül vannak csoportok, majd<br />
maguk az egyes enzimek.<br />
Az egyes enzimosztályokat az 5-3. táblázat tartalmazza.<br />
Már a XX. század kezdetén kimutatták, hogy az<br />
enzimreakciók nem egyszerű másodrendű reakciók.<br />
Több megfigyelésből azt a következtetést vonták<br />
le, hogy az enzim komplexet kell hogy képezzen a<br />
szubsztrátjával mielőtt átalakítja. A legegyszerűbb,<br />
két egymást követő lépésből álló enzimfolyamat feltételezett<br />
mechanizmusát és kinetikáját Michaelis<br />
és Menten írta le 1913-ban. Az igazsághoz hozzátartozik,<br />
hogy Victor Henri (1849–1933) volt az első,<br />
aki 1902-ben kidolgozott egy kvantitatív enzimkinetikai<br />
elméletet, a teljes bizonyosságot azonban a német<br />
kémikus, Leonor Michaelis (1875–1949) és az<br />
ő fiatal kanadai munkatársa, Maud Leonora Menten<br />
(1879–1960) adták. Éppen ezért helyesebb Henri–Michaelis–Menten<br />
enzimkinetikának, mint csak<br />
Michaelis–Menten kinetikának nevezni. Ezen elmélet<br />
szerint a legegyszerűbb enzimreakció a következő<br />
egyenlettel írható le:<br />
k 1<br />
k 2<br />
E+S ES E+P<br />
k –1<br />
–<br />
E az enzimet, S a szubsztrátot, P az enzimreakció<br />
termékét (a produktumot) jelenti. A nyilakhoz írt<br />
sebességi állandók indexébe írt szám a reakciólépés<br />
számát, előjele a reakció irányát jelöli. Általánosságban<br />
az enzimek, a biokatalizátorok funkciójáról nem<br />
csupán azt a tényt kell tudni, hogy kémiai reakciókat<br />
katalizálnak, gyorsítanak fel, hanem a gyorsítás<br />
mértékét is. Ez elképesztően, megdöbbentően nagy,<br />
a spontán átalakulás sebességének 10 9 –10 12 -szerese is<br />
lehet. (Illusztrálásképpen csak egy példa egy közleményből:<br />
az orotidin-5’-monofoszfát nem katalizált,<br />
spontán dekarboxilációjának féléletideje 78 millió év<br />
lenne, ha viszont az orotidin-5’-foszfát-dekarboxiláz<br />
jelen van, a reakció 25 ms alatt végbemegy [7]).<br />
Az enzimek, biokatalizátorok funcióira<br />
irányuló vizsgálatok<br />
Az enzimek funkcióinak, az enzimreakcióknak az elsődleges<br />
vizsgáló-, mérőeszköze a spektrofotométer.<br />
Pontosabban a fényelnyelésváltozást (∆ extinkciót)<br />
mérni képes speciális spektrofotométer. A XX. század<br />
a biokémia óriási fejlődésének századaként fogadható<br />
el. Ez egyben azt is jelenti, hogy a XX. század<br />
az enzimológia fejlődésének százada is, ami egyben<br />
a spektrofotometria fejlődését, széles körű alkalmazását<br />
is magában foglalja. Az enzimaktivitás, vagyis<br />
a szubsztrátátalakítás sebességének mérhetőségénél<br />
már a kezdetektől azzal az alapvető problémával találkoztak,<br />
hogy a szubsztrátátalakulás a spektrofotometria<br />
módszerével – az esetek döntő többségében – közvetlenül<br />
nem analizálható, nem monitorozható, nem<br />
5-3. táblázat. Enzimosztályok<br />
Sorszám Elnevezés Funkció<br />
I. oxidoreduktázok elektron, ill. H + átvitele<br />
II. transzferázok csoportátvitel egy szubsztrátról egy másikra<br />
III. hidrolázok vízbevitellel kovalens kötések hasítása<br />
IV. liázok a szubsztrátmolekulát úgy hasítják ketté, hogy az egyik termékben kettős kötés<br />
alakul ki,<br />
vagy visszafelé: kettős kötésre való addíció játszódik le<br />
V. izomerázok különböző típusú izomerizációt katalizálnak<br />
VI. ligázok energiaigényes szintéziseket katalizálnak
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
115<br />
mérhető. Viszont fokozatosan ismertté vált, hogy az<br />
enzimreakciók igen nagy részében kapcsolódó faktorok<br />
(kofaktorok) átalakulására kerül sor, ill. kapcsolódó<br />
enzimreakciók (koenzimreakciók) zajlanak. A<br />
kapcsolódó enzimreakciók viszont sok esetben olyan<br />
végterméket eredményeznek, amely kiválóan mérhető<br />
spektrofotometriásan. Technikailag az enzimdiagnosztika,<br />
amely a laboratóriumi diagnosztika<br />
jelentős területe, a kapcsolt vagy indikátor enzimreakciók<br />
termékeinek spektrofotometriás analízisére<br />
épült, épül. A követelmény tehát az, hogy a kapcsolt<br />
indikátorreakció végterméke vízben oldható, stabil,<br />
jól fotometrálható (határozott elnyelési maximuma<br />
legyen, lehetőség szerint a látható fénytartományban)<br />
és a keletkezett végtermék mennyisége szigorúan arányos<br />
legyen a szubsztrátátalakulással. A diagnosztikus<br />
enzimológiában a méréseknél azt is figyelembe<br />
kell venni, hogy vannak enzimaktivitást befolyásoló<br />
tényezők. Ezek: a hidrogénion-koncentráció (pH), az<br />
ionerősség, az ionösszetétel, a hőmérséklet és a különböző<br />
specifikus és kevésbé specifikus aktivátorok<br />
és gátlók arzenálja. Az enzimdiagnosztika standardizálására<br />
nemzetközi egyezségek léteznek. Manapság<br />
a megválasztott hőmérséklet, a módszer és más kondíciók<br />
tekintetében egységes előírások vannak.<br />
Külön kell említést tenni az enzimhisztokémia<br />
alapelvéről. Itt is kapcsolt indikátorreakciót alkalmazunk,<br />
de itt az az alapkövetelmény, hogy a látható<br />
fénytartományban elnyelő (színes) végtermék vízben<br />
oldhatatlan legyen. Maradjon ott, ahol az enzim van.<br />
Ezt az elvet alkalmazzuk az elektroforézissel elválasztott<br />
(membránban vagy gélben) izoenzimek detektálásához.<br />
Végül az enzimek analitikai vizsgálata után „szubsztrátfelismerő”<br />
képességük méréstechnikai alkalmazásáról<br />
kell szólni. Ennek kiemelkedő jelentősége van a laboratóriumi<br />
diagnosztikában. Bizonyos kisebb méretű<br />
szerves molekulák specifikus és érzékeny meghatározása<br />
csak az enzimfehérje szubsztrátfelismerő sajátosságával<br />
lehetséges. A vércukor-meghatározást pl. az<br />
enzim-szubsztrátfelismerés alkalmazása nélkül, csak<br />
kémiai reakcióval sokkal kisebb érzékenységgel és<br />
pontossággal lehet kivitelezni. Ilyen enzim szubsztrátfelismerésére<br />
épített reakciót alkalmazunk a laboratóriumi<br />
diagnosztikában a glükózon kívül számos<br />
molekula, pl. koleszterin, triglicerid, karbamid, kreatinin,<br />
húgysav stb. mérésekor.<br />
Hormonok<br />
A hormonok definíciója nem könnyű. Egy bizonyos,<br />
hogy külön óriási tudományterület, ma is gyorsan<br />
fejlődő tudományterület, az endokrinológia tárgykörébe<br />
tartozik. Itt, a biológiai funkcióik alapján való<br />
fehérjevizsgálatok általános fejezetében, annyit le kell<br />
szögezni, hogy nem minden hormon peptid vagy fehérje.<br />
Ebből az következik, hogy a hormonfogalom<br />
nem analitikai, hanem fiziológiai fogalom. Közös<br />
neve azoknak a molekuláknak, amelyek a szervezetben<br />
képződnek és más sejtek, sejtcsoportok, szövetek,<br />
szervek működését befolyásolják. A termelésük<br />
speciálisan differenciálódott sejtekben, általában mirigyekben,<br />
a belső elválasztású (endokrin) mirigyekben<br />
megy végbe.<br />
Történeti áttekintés<br />
A hormon fogalmat William Maddock Baylis<br />
(1860–1924) angol fiziológus és Ernest Henry<br />
Starling (1866–1927), szintén angol fiziológus alkotta<br />
és használta először1904-ben. Ők fedezték fel<br />
együtt a szekretin hormont és szerepét a bélperisztaltikában.<br />
A hormon név görög szó és „sarkantyúz” a<br />
jelentése. Mára általános neve lett azoknak a molekuláknak,<br />
amelyekkel az endokrinológia foglalkozik.<br />
Így a részletes történeti ismeretek azok számára, akik<br />
mélyebb ismeretekre vágynak az endokrinológiai kézikönyvekben<br />
lelhetők fel.<br />
A hormonok molekuláris sajátosságai<br />
A hormonok a szervezeten belül a véráram útján<br />
közvetített molekulák, amelyek a „célsejtekhez”, a<br />
„célszervekhez” eljutva ott fejtik ki hatásukat. A hormonok<br />
tárgyalásánál találkozunk azzal a molekuláris<br />
szerveződéssel, úgy is fogalmazhatunk, hogy fehérjemolekulák<br />
szerveződésével, amely biztosítja a sejt<br />
felszínén, hogy a hormont a számára elérhető helyen<br />
„fogadják”. Idegen szóval ezt a fogadó fehérjét vagy fehérjekomplexet<br />
receptornak(!) nevezzük. Amíg a hormon<br />
maga nem mindig fehérje, sőt az esetek jelentős<br />
többségében nem az (lásd szteránvázas molekulák,<br />
kortizol, ösztrogén, tesztoszteron stb.), a receptor<br />
mindig fehérje. Ebből következik, hogy a hormonok<br />
vizsgálatán kívül a receptorok vizsgálata is tárgya az
116 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
endokrin kutatásnak és az endokrin diagnosztikának<br />
is. A hormonok molekuláris sajátosságukat illetően<br />
három csoportba sorolhatók:<br />
• Módosult aminosavak (pl. tiroxin, adrenalin).<br />
• Peptidek, polipeptidek, fehérjék (pl. tireotrop<br />
releasing hormon: TRH, kortikotropin: ACTH,<br />
prolaktin).<br />
• Szteroid hormonok.<br />
A hormonok funkciói<br />
Az összes számba vehető, ismert hormon funkcióját<br />
itt felsorolni lehetetlen, és azért sem illenek ide, mert<br />
jelentős hányaduk nem fehérje. A peptid- és fehérjehormonok<br />
funkcióit kiemelten ismertetni szintén<br />
nem célszerű, mert egy sajátos tudományterület, az<br />
endokrinológia tárgykörébe tartoznak és funkcióikat<br />
megérteni, megismerni csak az összefüggések ismeretében<br />
lehet.<br />
A hormonok vizsgálata funkcióik alapján<br />
Kezdetben a hormonokat valóban funkcióik alapján<br />
vizsgálták. Sok esetben maga a hormon még ismeretlen<br />
volt, mégis vizsgálatokat végeztek túléltetett<br />
szervekkel vagy állatokon, pl. békákon. Manapság<br />
azonban hormonok közvetlen meghatározását végzik<br />
kutatási célú vizsgálatoknál, de az egész endokrin<br />
diagnosztika terén is. Ma általában még a nem peptid,<br />
nem fehérje hormonok meghatározására is elsődlegesen<br />
monoklonális ellenanyagokat felhasználó immunológiai<br />
módszereket használnak. Természetesen<br />
a különböző kromatográfiás eljárások, közülük első<br />
helyen a folyadékkromatográfia (HPLC) is a hormonanalitika<br />
módszertani arzenáljához tartozik. Lehetséges<br />
azonban, hogy a jövőben a tömegspektrometria<br />
lesz a hormondiagnosztika elsőszámú módszere.<br />
A sejtnövekedést befolyásoló fehérjék,<br />
peptidek, a sejtnövekedési faktorok,<br />
a biológiai válaszmódosítók<br />
(„biological response modifiers”)<br />
Mára ez a csoport óriásira duzzadt fehérje-, peptidcsoportot<br />
jelent. Kétségtelenül ez a fehérjecsoport átfedésbe<br />
került a hormonokkal, pl. az inzulint felismerése,<br />
izolálása, szekvenálása és terápiás felhasználása<br />
óta több évtizeden át a hormonok közé sorolták, manapság<br />
viszont egyre több alkalommal sejtnövekedési<br />
faktorként említik.<br />
Történeti áttekintés<br />
A biológiai válaszmódosító anyagok (biological response<br />
modifiers) összefoglaló elnevezés bevezetése a<br />
hetvenes évek közepére tehető, ez fejezi ki leginkább<br />
az ide sorolt kis molekulatömegű fehérjék, peptidek<br />
szerepét. A sejtnövekedési faktor elnevezés ettől eltérő<br />
anyagokra vonatkozik, kutatásuk a sejtbiológia újabb,<br />
gyorsan bővülő területét adja. Így ma az összefoglaló<br />
elnevezés helyett az egyes molekulák külön vizsgálata<br />
és csoportosítása a gyakorlat, mint pl. citokinek, limfokinek,<br />
interleukinek, interferonok, transzformáló<br />
faktorok stb. Stimulálóan hatott a sejtnövekedési faktor<br />
kutatásra, hogy 1986-ban az élettani-orvosi Nobel-díjat<br />
Stanley Cohen és Rita Levi-Montalcini<br />
kapta sejtnövekedési faktor kutatásért. Mivel jelenleg<br />
az inzulint, az 51 aminosavból álló kettős láncú peptidet<br />
is a sejtnövekedési faktorok közé sorolják, itt említendő,<br />
hogy ez volt az első fehérje, peptid, amit szekvenáltak,<br />
és aki ezt tette nem más, mint a kétszeres<br />
Nobel-díjas Frederick Sanger (1918–). Az inzulin<br />
szekvenálásáért 1958-ban, a DNS-szekvenálás módszeréért<br />
1980-ban kapott Nobel-díjat.<br />
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai<br />
válaszmódosítók” molekuláris sajátosságai<br />
A közös tulajdonságuk, hogy peptidek, kis molekulatömegű<br />
fehérjék. Sejteket ismernek fel, vagyis szerepet<br />
játszanak a sejtek differenciálódásában. Itt is<br />
lehet beszélni speciális kötőhelyekről, kötőfehérjékről,<br />
fehérjekomplexekről, vagyis receptorokról. Annak<br />
demonstrálására, hogy milyen szerteágazó molekulacsaládról<br />
van szó és mennyire az érdeklődés<br />
középpontjában vannak diagnosztikai, sőt terápiás<br />
felhasználási lehetőségeik miatt, az emberi szervezetben<br />
fellelhető biológiai válaszmódosító peptidek,<br />
sejtnövekedési faktorok nem teljes, angol nyelvű felsorolását<br />
illesztjük ide be:<br />
• Epidermal growth factor (EGF)<br />
• Erythropoietin (EPO)
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
117<br />
• Fibroblast growth factor (FGF)<br />
• Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF)<br />
• Granulocyte-macrophage colony stimulating<br />
factor (GM-CSF)<br />
• Growth differentiation factor-9 (GDF9)<br />
• Hepatocyte growth factor (HGF)<br />
• Hepatoma-derived growth factor (HDGF)<br />
• Insulin-like growth factor (IGF)<br />
• migration-stimulating factor<br />
• Myostatin (GDF-8)<br />
• Nerve growth factor (NGF) and other neurotrophins<br />
• Platelet-derived growth factor (PDGF)<br />
• Thrombopoietin (TPO)<br />
• Transforming growth factor alpha (TGF-a)<br />
• Transforming growth factor beta (TGF-b)<br />
• Tumour necrosis factor alpha (TNF-a)<br />
• Vascular endothelial growth factor (VEGF)<br />
• Wnt Signaling Pathway<br />
• placental growth factor (PIGF)<br />
• Foetal Bovine Somatotrophin (FBS)<br />
• IL-l- Cofactor for IL-3 and IL-6. Activates T<br />
cells<br />
• IL-2- T-cell growth factor. Stimulates IL-l synthesis.<br />
Activates B-cells and NK cells<br />
• IL-3- Stimulates production of all non-lymphoid<br />
cells<br />
• IL-4- Growth factor for activated B cells, resting<br />
T cells and mast cells<br />
• IL-5- Induces differentiation of activated B cells<br />
and eosinophils<br />
• IL-6- Stimulates Ig synthesis. Growth factor for<br />
plasma cells<br />
• IL-7- Growth factor for pre-B cells<br />
• Adrenomedullin (AM)<br />
• Autocrine motility factor<br />
• Bone morphogenetic proteins (BMPs)<br />
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai<br />
válaszmódosítók” funkciói<br />
Általában a funkció a névből kikövetkeztethető.<br />
Részletezésükre itt nem kerülhet sor, de nem is lenne<br />
célszerű.<br />
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai<br />
válaszmódosítók” vizsgálata funkcióik<br />
alapján<br />
Vérplazmabeli, ill. szövetváladékbeli koncentrációjuk<br />
meghatározását szinte kizárólag monoklonális ellenanyagok<br />
felhasználásával végzik.<br />
Extracelluláris szerkezeti elemek<br />
Az emberi szervezetben fellelhető összes fehérjét<br />
funkcióik alapján 10 csoportba soroltuk. Minden<br />
csoportnál el lehetett volna mondani, hogy nagyon<br />
sokféle fehérje tartozik oda, és éppen a funkcióik lényegének<br />
ismerete, a mechanizmus, ahogy hatásukat<br />
az élő szervezeten belül kifejtik, mélységében kevéssé<br />
vagy egyáltalán nem ismert. Mégis a sokszínűsége<br />
miatt és a hatásmechanizmus lényegi ismerete tekintetében<br />
is ez a fehérjecsoport, amely főként szerkezeti<br />
elemként a sejtek felszínén a termelő sejtektől különböző<br />
távolságban, az extracelluláris térben funkcionáló<br />
fehérjéket fogja össze, a legösszetettebb, funkció juk<br />
mechanizmusát illetően a legkevésbé ismert. A soksejtű<br />
élőlényekben, így természetesen az emberi szervezetben<br />
is az extracelluláris térben főként szerkezeti<br />
elemként funkcionáló fehérjéket a kötőszövet fehérjeállományaként<br />
kellene, lehetne tárgyalni. Döntően ezt<br />
is fogjuk követni, de itt kell, itt lehet arra utalni, hogy<br />
a sejtek „társadalom”-formálódása, a sejtdifferenciálódás<br />
szempontjából a fő meghatározó a sejtekből kinyúló<br />
fehérjék szövedéke, az ún. extracelluláris fehérje<br />
mátrix. A sejtek differenciálódását meghatározó „hely”<br />
(Hans Spemann definíciója, amiért 1935-ben az orvosi-élettani<br />
Nobel-díjat kapta), újabb nevén „niche”<br />
ugyanis csak a sejtekből kinyúló fehérjék összessége,<br />
az ún. „extracelluláris mátrix” lehet. Ma, amikor az őssejt<br />
(stem cell) terápia ennyire az érdeklődés előterébe<br />
került, a „hely” ismerete, amelyet az adott helyen élő<br />
sejtek felszínén lévő, a sejtekből kinyúló extracelluláris<br />
fehérjék „differenciációs szignálja” jelent, szintén<br />
sok-sok további, mélyebb kutatómunkát követel. A<br />
kötőszövetrost fehérjéinek és alapállományának rövid<br />
ismertetésén kívül a fibrinogén-fibrin átalakulás<br />
is ide kerül, már csak azért is, mert a szövettudomány<br />
(hisztológia) világában a vért is a kötőszövethez sorol-
118 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
ják, mint „folyékony kötőszövet”-et. Végül a mucin, a<br />
nyákfehérjék csoportja is itt kerül említésre, mint az<br />
extracelluláris térben, bizonyos hámsejtek felszínén elhelyezkedő,<br />
általuk termelt, többrétű funkciót betöltő<br />
tömeges fehérje.<br />
Történeti áttekintés<br />
Egy ilyen szerteágazó fehérjecsoporthoz tartozó tudásunk,<br />
ismereteink teljes történeti áttekintése lehetetlen,<br />
csak külön-külön lehetne ezeket ismertetni.<br />
Csak példaként vegyük a kollagénrostokhoz tartozó<br />
ismereteink történetét. A neve görög eredetű, kolla<br />
= ragasztó. Már az egyiptomiak 4000 évvel ezelőtt is<br />
állítottak elő maguknak „zselatint”, ragasztót állatok<br />
bőrének megfőzésével! Ezt tették az amerikai indiánok<br />
is, úgy 1500 évvel ezelőtt. A kollagénrostok szerkezetkutatása<br />
azonban csak a harmincas-negyvenes<br />
években kezdődött. Először a polarizációs mikroszkóp,<br />
majd az elektronmikroszkóp és manapság az<br />
atomerőmikroszkóp mint a leg<strong>modern</strong>ebb szerkezetkutatási<br />
eszköz használatos a különböző rostok<br />
finomszerkezetének mélyebb megismerésére. A rostok<br />
és az alapállomány kémiai összetételére irányuló<br />
kutatások az egész XX. századon át mind a mai napig<br />
egyre fokozódó intenzitással folytak, folynak.<br />
Az extracelluláris, főként szerkezeti<br />
elemként funkcionáló fehérjék molekuláris<br />
sajátosságai<br />
Fehérjerostok<br />
Általánosságban a kötőszövetben, az extracelluláris<br />
térben háromféle fehérjerostot különítünk el:<br />
• Kollagénrostok.<br />
• Elasztikus rostok.<br />
• Rácsrostok.<br />
Kollagénrostok<br />
Mára az emberi szervezetben 29 fajta kollagénrostot<br />
különítünk el. A testünket felépítő 9–12 kg<br />
teljes fehérjetartalom 25–35%-a kollagén. A 29 rostféleségből,<br />
az I. típusú kollagén teszi ki az összkollagén<br />
90%-át, tehát messze ebből van a legtöbb. Ezért<br />
a kollagénrostok élő szervezeten belüli „gyártásának”<br />
menetét képződésének rövid áttekintésével célszerű<br />
bemutatni. A kollagén „gyártásának” két fázisa van:<br />
sejten belüli (a különböző fibroblastokban) és sejten<br />
kívüli fázis.<br />
• Sejten (fibroblaston) belüli folyamat:<br />
1. A transzláció során a riboszómákon két peptidlánc,<br />
az α 1<br />
és α 2<br />
lánc szintetizálódik. Ezeket a<br />
peptidláncokat nevezzük preprokollagénnek.<br />
2. Az ún. szignálpeptid lehasítása után kialakulnak<br />
az ún. pro-a-láncok.<br />
3. A lizin és prolin aminosav a láncon belül hidroxilálódik.<br />
Ez a lépés C-vitamin-függő.<br />
4. A következő lépés a hidroxilizin glikozilációja.<br />
5. Két α 1<br />
-láncból és egy α 2<br />
-láncból egy hármas, helikális<br />
szerkezetű egység alakul ki.<br />
6. A hármas helikális prokollagén a Golgi-apparátusban<br />
további láncokkal „csomaggá” alakul,<br />
amely exocitózis mechanizmus révén kijut a<br />
sejtből.<br />
• Sejten kívüli átalakulások:<br />
1. A prokollagén-peptidáz enzim hatására az ún.<br />
regisztrációs peptidek lehasítása után tropokollagén<br />
jön létre.<br />
2. Több tropokollagénmolekula a lizil-oxidáz enzim<br />
hatására, amely a hidroxilizin- és lizinmolekulákat<br />
kapcsolja össze, kialakítja a kollagénfibrillumokat,<br />
majd ezek kollagénrostokká állnak<br />
össze.<br />
3. A kollagénrostok a sejtekhez, a sejtek felszínéhez<br />
számos fehérjével vannak összekapcsolva. Ilyen<br />
pl. a fibronektin és az integrin.<br />
A különböző kötőszöveteken belül a háromféle rostot,<br />
(a kollagén-, az elasztikus és a rácsrostokat) sajátos<br />
alapállomány, a „ground substance” veszi körül. Ez az<br />
alapállomány a legfőbb összetevője alapján proteoglikán<br />
állománynak, más szóval mukoproteinállománynak<br />
nevezhető. Benne módosult poliszacharidok,<br />
glükózaminoglikán-molekulák kovalens kötésekkel<br />
kapcsolódnak a vázfehérjékhez, gyakorlatilag a rostokhoz.<br />
Az alapállomány felépítésében főbb szerepet<br />
játszó módosult poliszacharidok, glükózaminoglikánok<br />
a következők: hialuronsav, dermatán-szulfát,<br />
kondroitin-szulfát, heparin, heparán-szulfát és keratán-szulfát.<br />
Elasztikus rostok<br />
Ezek fehérjealegysége az elasztin, az elaunin és<br />
az oxitalan fehérje. A fibroblastokban és bizonyos<br />
mértékben a simaizomsejtekben termelődnek. Mint
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
119<br />
ahogy a kollagénrostok képződésének, úgyanúgy az<br />
elasztikus rostokénak is van sejten belüli és sejten kívüli<br />
fázisa. A képződés első fázisa a sejten belül zajlik<br />
az elasztin mikrofibrillinumok kialakításáig, amelyben<br />
több fehérje is részt vesz, mint pl. a fibrillin, a<br />
fibulin és az elasztinreceptor fehérje. Az amorf elasztinból<br />
a sejteken kívül keresztkötések sokaságának<br />
kialakulása után jön létre az elasztinváz, az elasztikus<br />
rostok struktúrája. Az elasztikus rostok szinte minden<br />
szervben, minden kötőszöveti állományban előfordulnak.<br />
Ezek a rugalmasság biztosítékai.<br />
Rácsrostok<br />
A rácsrostok kollagénrostok. Úgy is lehet mondani,<br />
hogy a sejtek közelében, felszínén fellelhető finom<br />
kollagénrostok hálózata.<br />
Fibrinogén–fibrin<br />
A fibrinogén-fibrin fehérjerendszer külön sajátos<br />
helyet foglal el az extracelluláris szerkezeti elemként<br />
funkcionáló fehérjék csoportjában. A fibrinogén<br />
nagy molekulatömegű (340 kDa) glikoprotein ,<br />
amely három pár fehérjeláncból (α, b, γ) épül fel, és<br />
a májsejtekben (hepatocyták), ill. a megakaryocytákban<br />
termelődik. Normál tartománya a vérplazmában<br />
meglehetősen széles, 1,5–4,0 g/l, amely függ a választott<br />
módszertől (leggyakrabban a Clauss-módszer).<br />
A szervezetet érő különböző hatásokra, pl. fertőzésekben<br />
a fibrinogén plazmakoncentrációja nagymértékben<br />
emelkedni tud. Ezért az akut fázis fehérjék<br />
csoportjába lett besorolva. A protrombinból keletkező<br />
aktív szérumproteáz, a trombin hatására peptidek<br />
hasadnak le a fibrinogénről, majd a maradék többlépcsős<br />
polimerizáció és keresztkötések után fibrinhálóvá<br />
alakul. A fibrin a megsebzett erek mechanikai<br />
„eltömeszelésének” hatékony váza. A fibrinháló fizikai<br />
állapotváltozásában, kontrakciójában a hálóba bekerült,<br />
felnyílt vérlemezkéknek (thrombocytáknak)<br />
fontos szerepük van.<br />
Mucin<br />
A mucinok az extracelluláris térben szerkezeti<br />
elemként funkcionáló fehérjék csoportjában sajátos<br />
helyet töltenek be. Az epithelialis sejtek termelik.<br />
Óriás méretűek és nagyon sok szénhidrát-molekulát<br />
tartalmaznak. A mucinok különböző konzisztenciájú<br />
gélt képeznek az őket termelő epithelialis sejtek felszínén.<br />
A mucin alapszerkezetét adó peptidláncok<br />
mindkét végüknél, azaz a C- és az N-terminálisnál<br />
is glikoziláltak. Gazdagok cisztein aminosavban, ami<br />
lehetővé teszi, hogy a mucin monomerek diszulfidhidakkal<br />
egymáshoz kapcsolódjanak. A mucin monomerek<br />
középső része gazdag szerin és treonin<br />
aminosavban. Ide bőségesen O-kötött és N-kötött<br />
oligoszacharidok halmozódnak fel. Tehát a mucin<br />
monomerek génjei az epithelialis sejtek szintetikus<br />
apparátusával olyan peptideket termelnek, amelyek a<br />
poszttranszlációs módosulások során extrém módon<br />
glikozilálódnak, extrém módon kötnek meg szénhidrát<br />
monomereket, oligomereket és polimereket.<br />
A nagymennyiségű szénhidrát rendkívüli méretűre<br />
emeli ezeknek a mucin molekulakomplexeknek a vízkötő<br />
képességét. A szénhidrátok egyben megvédik a<br />
peptidláncokat a proteolitikus degradációtól. Az epithelialis<br />
sejtekből óriás mucinaggregátumok kerülnek<br />
ki a sejtek felszínére, amelyek molekulatömege<br />
1–10 millió Da.<br />
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék<br />
funkciói<br />
A kötőszövet – mint a szervezetünket felépítő negyedik<br />
szövetféleség – nagyon sokrétű elhelyezkedésében<br />
és funkciójában egyaránt. Általános funkciója<br />
a szervek elkülönítése, funkciójuk összehangolása.<br />
A kötőszövet sejtjei sajátos fehérjéket termelnek és<br />
juttatnak ki az extracelluláris térbe, amelyek ott egyrészt<br />
rosttá, másrészt sajátos alapállománnyá formálódnak.<br />
Az egyes szövetekben a rostok és a speciális<br />
alapállomány sokrétű funkcióinak puszta felsorolása<br />
is meghaladja ennek a fejeznek a keretét, és helyesebb<br />
is róluk a szervek funkcióit tárgyaló élettan tantárgy<br />
keretében tanulni.<br />
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék<br />
vizsgálata<br />
Az extracelluláris fehérjerostok és az alapállomány<br />
vizsgálata a hisztológia, ill. hisztopatológia körébe tartozik,<br />
vagyis különböző mikroszkópos technikákkal<br />
végzik. Kétségtelen, hogy a polarizációs mikroszkópos<br />
technika jelentős szerepet játszott a rostfehérjék<br />
szerkezeti kutatásában. Feltétlenül meg kell említeni,<br />
hogy a festésekkel kombinált polarizációs mikroszkó-
120 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
pos módszerek kidolgozásában és általuk a rostszerkezet-kutatásban<br />
Pécsett Romhányi Györgynek és<br />
munkatársainak kiemelkedő szerepe volt. A mucinok<br />
vizsgálata is a hisztológia, ill. hisztopatológia körébe<br />
tartozik, csupán a fibrinogén plazmakoncentrációjának<br />
meghatározása és a fibrinogén-fibrin átalakulás<br />
folyamatos követése, a trombelasztográfia tartozik a<br />
klinikai biokémia, a laboratóriumi medicina tárgykörébe.<br />
Raktárak<br />
A fehérjék mint raktárak bizonyára sokkal szélesebb<br />
és mélyebb szerepet töltenek be az élőlényekben és<br />
természetesen az emberi szervezetben is, mint amit<br />
eddig megismertünk e szerepükről. Bizonyosan van<br />
raktáruk a szénhidrátoknak, a zsíroknak, az aminosavaknak<br />
és a különböző anorganikus elemeknek. A<br />
raktárak pedig nem lehetnek mások, mint fehérjék,<br />
fehérjerendszerek. Itt csak egy raktárfehérje, a vasat<br />
(Fe 3+ ) az élő sejteken belül raktározó ferritin tárgyalására<br />
kerül sor. Ez az a raktározó fehérje, amit a jelek<br />
szerint eddig legjobban megismertünk. Ugyanakkor<br />
csak végiggondolásra utalok a kalcium (Ca) sokrétű,<br />
bonyolult raktározására, a csontokra. Az emberi testben<br />
jó megközelítéssel átlagosan 1 kg kalcium (Ca)<br />
van, amelynek döntő hányada, 99%-a a csontokban<br />
van dinamikusan „raktározva”. Ez a „raktár” extracelluláris,<br />
mégis a sejtek – osteoblastok, osteoclastok,<br />
osteocyták – vezérlik a Ca 2+ felhalmozását vagy kiszabadulását<br />
kis peptidek (parathormon, kalcitonin,<br />
oszteokalcin) „parancsára” a mátrixfehérjék „közreműködésével”.<br />
A kalciumraktárt részletesen nem ismertetjük<br />
itt, már csak azért sem, mert „csontmetabolizmus”<br />
címen az élettan és a kórélettan egy-egy<br />
fejezetéhez tartozik.<br />
Történeti áttekintés<br />
Azok számára, akik a ferritinnnel kapcsolatos kutatási<br />
eredményekről, a felismerések időrendi sorrendjéről<br />
és a felfedezőkről alaposabb ismeretekre vágynak,<br />
az itt idézett összefoglaló közleményben találnak<br />
részleteket [8].<br />
A raktárfehérjék molekuláris sajátosságai<br />
Mivel itt most a raktárfehérjék egyetlen fehérje, a ferritin<br />
példáján kerülnek bemutatásra, csak ennek a<br />
molekuláris sajátosságait ismertetjük röviden. A ferritin<br />
nagy, 450 kDa molekulatömegű összetett globuláris<br />
fehérje. A ma létező összes élő szervezetben, a<br />
prokarióta egysejtűekben, baktériumokban épp úgy,<br />
mint a soksejtű növények és állatok sejtjeiben szintetizálódik,<br />
jelen van. Minden molekula 24 alegységből,<br />
21 kDa nehézláncú vagy/és 19 kDa könnyűláncú<br />
peptidből épül fel. A 24 peptidlánc gömbszerű struktúrát<br />
képez, amelynek belsejében üregek, csatornák<br />
vannak a foszfátionokkal és a hidroxidionokkal kristályt<br />
képező Fe 3+ -ionok számára. Egy ferritinkomplex<br />
4500 (Fe 3+ )-iont képes dinamikusan tárolni. A vas<br />
nélküli ferritinmolekulát apoferritinnek nevezzük.<br />
Az emberi vérplazmában, ill. vérszérumban is van<br />
ferritin, amely kevés vasat (a maximális telítettség<br />
10–12%-át) tartalmaz, és főleg könnyűláncokból épül<br />
fel.<br />
A raktárfehérjék funkciói<br />
Nyilvánvalóan minden raktárfehérjének az a funkciója,<br />
hogy amit raktároz, szükség esetén funkcionális<br />
felhasználásra kerüljön. Ebből következik, hogy a<br />
„raktárból” a felhasználás helyére juttatáshoz „szállítómechanizmusra”<br />
van szükség. Ennek az állításnak<br />
különösen igaznak kell lenni olyan elemek, atomok,<br />
molekulák esetében, amelyek szabadon toxikusak,<br />
mérgezők. A vas ilyen! A szabad vasion Fe 3+ vagy Fe 2+<br />
formában toxikus az életfolyamatokra. Nincs is szabad<br />
vas az élőlényekben. Az emberi testben, szervezetben<br />
sincs, se a sejteken belül, se az extracelluláris<br />
térben. Így természetesen a vérplazmában sem. A<br />
raktárak és a felhasználás helye közt a transzportot,<br />
a szállítást csak fehérjék végezhetik és végzik is. Ebből<br />
fakad, hogy a raktározás és a transzport, a szállítás<br />
összekapcsolt. A raktár és a szállítófehérjék tehát<br />
egymásra utaltak, közös rendszert képeznek. A vasanyagcsere<br />
jó bizonyíték erre. Úgy számolunk, hogy<br />
a 70 kg-os emberi testben 4 g anorganikus vas van. A<br />
szervezetünkben lévő összes vasnak 65–70%-a a vörösvérsejtekben,<br />
a hemoglobinban van. Mintegy 25%
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
121<br />
a vasraktárakban, vagyis a ferritin molekulakomplexekben,<br />
5–10% a többi hemfehérjében (pl. mioglobin<br />
és a citokróm fehérjékben) van. A „hivatalos” vasszállító<br />
fehérjéhez, a transzferrinhez kötötten csak a teljes<br />
vas 0,1–0,2%-a van. Ami a raktárakat, a ferritin fehérjekomplexet<br />
illeti, azt kell világosan tudnunk, hogy a<br />
testünket felépítő összes sejtünkben, tehát mind a 10 14<br />
sejtben, sőt a saját sejtjeinkkel szimbiózisban élő, hasonló<br />
számú (10 14 ) prokarióta sejtben, a belünkben, a<br />
nyálkahártyáinkon élő baktériumsejtekben is szintetizálódik,<br />
jelen van a ferritin, a dinamikus vasraktár.<br />
A vas sejtfelszíni „fogadására” és sejten belüli transzportjára<br />
sajátos fehérjék vannak, mint a vas-reduktáz,<br />
a kétértékű fém transzporter, a ferroportin és a kis<br />
molekulatömegű hepcidin. Még azt kell tudni, hogy<br />
a vékonybél nyálkahártyasejtjeiben lévő ferritin a sejten<br />
belüli „fogadó” és szállítófehérjékkel „védőzsiliprendszerként”<br />
és „továbbpostázóként” működik. A<br />
szükségletnek megfelelően „enged be” a szervezetbe<br />
vasat. Ugyan minden sejtünkben van ferritin vasraktár,<br />
mégis bizonyos sejtekben, mint pl. a májsejtek,<br />
a lép és a csontvelő bizonyos sejtjeiben messze több<br />
ferritin van, mint a többi sejtben. Ezért úgy szoktuk<br />
tekinteni, hogy a máj, a lép és a csontvelő a vasraktározás<br />
fő szervei. Abban az esetben, amikor a ferritin<br />
túlhalmozódik, aggregálódhat, és bizonyos macrophag<br />
sejtekben felhalmozódhat. Ezt a felhalmozódott<br />
fehérje-vas aggregátumot hemosziderinnek nevezzük.<br />
Az ilyen aggregátumból, tehát a hemosziderinből a<br />
vas felszabadulása nehéz, vagyis a hemosziderinné<br />
aggregálódott ferritin elveszti dinamikus „vaskínáló”<br />
képességét. Egy bizonyos örökletes betegségben, a<br />
haemochromatosisban kóros mértékben szaporodik<br />
fel a hemosziderin.<br />
A fehérjeraktárak funkcióira irányuló<br />
vizsgálatok<br />
A ferritin, a 24 peptidláncból (főleg könnyűláncból:<br />
L) felépült 450 kDa nagyságú óriás molekulakomplex<br />
szabadon jelen van a vérplazmában. Igaz, ebben az<br />
„úszó” vasraktárban az „apoferritin” nincs telepakolva.<br />
A lehetséges 4500 vas (Fe 3+ ) atom helyett kevesebb<br />
mint 10–12% van a plazmaferritinben. Monoklonális<br />
ellenanyagot használva a plazma ferritinkoncentrációját<br />
nagyon pontosan mérni tudjuk. A koncentrációtartomány<br />
széles, férfiakat és nőket közösen véve:<br />
15–300 μg/l. 50 μg/l alatti érték figyelmet érdemel,<br />
hiszen jól jelzi a vasraktárak állapotát. Csökkent értékeket<br />
mérünk vashiányos anémia esetén, de alultápláltság,<br />
hypothyreosis, C-vitamin-hiány esetén és<br />
fertőző betegségek után is. Emelkedett értékeket találunk<br />
viszont haemochromatosisban és porphyriákban,<br />
de mivel a ferritin akut fázis fehérje is, megtévesztően<br />
emelkedett értékeket lehet mérni fertőzések,<br />
különböző betegségek akut fázisában is.<br />
Transzportőrök (szállítófehérjék)<br />
Rendkívül nagy fehérjecsalád ez is! Érdemes és kell is,<br />
hogy két csoportra osszuk:<br />
• Sejten belüli szállítófehérjék.<br />
• Sejten kívüli szállítók.<br />
Ugyanakkor aszerint is célszerű két csoportra osztani,<br />
hogy fehérjét szállítanak-e vagy mást. A sejten belüli<br />
„fehérjeszállítás” koncepciója és kutatása új keletű,<br />
alig néhány évtizedre tehető. Külön neve van a fehérjeszállító<br />
fehérjéknek, ezek a „chaperonok”. A chaperon<br />
francia eredetű, angolba is átvett szó, jelentése<br />
„gardedám”, vagyis az a személy, aki a fiatal lányokat<br />
régen a bálba elkísérte. Az élő sejten belül ugyanis<br />
nagy kérdés, hogy a szintézis helyéről a peptidláncok<br />
hogyan kerülnek az „összeszerelő műhelyekbe”, ill.<br />
az egyes organellumokba, a funkció helyére, az egyes<br />
kompartmentekbe. A citoszol elnevezés azt sugallja,<br />
hogy a képződött peptidek szabadon diffundálnak,<br />
„keresgélik” a párjukat vagy a helyüket. Ez nincs így!<br />
Nincs rá idő se! Tehát az alapgondolat bizonyosságot<br />
eredményezett, nagy családja van a sejten belül<br />
az olyan fehérjéknek, amelyek „karonfogva elkísérik”,<br />
vagy „elcipelik” nagy gyorsasággal a peptideket, a fehérjéket<br />
ahová kell. Ezek tehát a chaperonok. Közéjük<br />
tartoznak pl. a különböző „hősokkfehérjék”. A sejten<br />
belüli transzportfehérjék koncepcionálisan olyanok<br />
is lehetnek, amelyek valamit transzportálnak, de nem<br />
mozdulnak el a helyükről. Ilyenek az elektront (e – )<br />
transzportáló citokrómok. Az előző részben utaltunk<br />
arra, hogy a raktárfehérjék és a szállítófehérjék funkcionálisan<br />
általában össze vannak kapcsolva. Ugyanez<br />
elmondható a szállítófehérjék és a következő csoportba<br />
sorolt ligandumfehérjék összekapcsoltságáról
122 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
is. A globin pl. ligandumfehérje, a „hem” a liganduma.<br />
Viszont szállító, az egyik legfontosabb szállító a<br />
szervezetünkben, hiszen a minden sejtünk számára<br />
nélkülözhetetlen oxigént szállítja.<br />
Történeti áttekintés<br />
A szállítófehérjékről, a kutatásukról, a hozzájuk tartozó<br />
felfedezésekről időrendi sorrendben számot adni<br />
teljességgel lehetetlen. Ha egyet, pl. az extracelluláris<br />
tér, a vérplazma fontos szállítórendszerét, a lipoproteineket<br />
kiválasztjuk, annyit leszögezhetünk, hogy<br />
felfedezésük, leírásuk az ultracentrifuga kifejlesztéséhez,<br />
alkalmazásához kapcsolt. Így Theodor Svedberg<br />
(1884–1971) munkásságának meghatározó<br />
szerepe volt benne, aki kémiai Nobel-díjat is kapott<br />
1926-ban a makromolekulák, molekulakomplexek<br />
kutatásáért, az ultracentrifuga kifejlesztéséért. Azt<br />
is lehetetlen lenne kinyomozni, hogy az albuminról<br />
ki bizonyította be először, hogy a vérünk univerzális<br />
„szállítómunkása”. Szállítja a toxikus, még nem konjugált<br />
bilirubint, a zsírsavakat, a rengeteg gyógyszert,<br />
idegen molekulát, de, hogy ki, mikor bizonyította be<br />
ezeket, nemigen tudjuk és nehéz is lenne, de felesleges<br />
is kinyomozni.<br />
A transzportőrök, a szállítófehérjék<br />
molekuláris sajátosságai<br />
A transzportfehérjék általánosan globuláris fehérjék,<br />
fehérjekomplexek, amelyek külső felszínén „vízszeretők”,<br />
hidrofilek, míg a belsejükben hidrofób „üregek”<br />
lehetnek.<br />
Molekuláris felépítettségét, sajátosságát tekintve<br />
egyértelműen különös molekula a hemoglobin és<br />
az izmokban az oxigén „helyre” szállítását biztosító<br />
mio globin. A mioglobinban egy globin (151 aminosavból<br />
álló fehérje) és egy hem van. A hemoglobinban<br />
4 globin és négy hem, 4 oxigénmolekula (O 2<br />
)<br />
szállítására. A hemoglobin molekulatömege tehát<br />
64 500 dalton.<br />
A már említett lipoproteinek felépítése is rendkívül<br />
bonyolult, rendkívül összetett. A lipoproteineket<br />
felépítő fehérjéket közös néven apolipoproteineknek<br />
nevezzük. Számuk ma már meghaladja a százat. Az<br />
egyes apolipoproteineket lehet az ellenük termelt monoklonális<br />
ellenanyagokkal vizsgálni.<br />
Az anorganikus elemek, pl. a Ca 2+ és a Mg 2+ nem<br />
specifikus szállítója az albumin, melynek „szállítókedve”<br />
érzékenyen függ a plazma-pH-tól. Ha emelkedik<br />
a pH, vagyis alkalózis felé tolódik el, növekszik<br />
az albumin Ca 2+ -kötő képessége, ami izomgörcsöt,<br />
tetaniát is eredményezhet. A kisebb koncentrációban<br />
jelen lévő szervetlen elemeknek, a ritkafémeknek<br />
speciális szállítójuk van. Ilyen speciális szállító pl. a<br />
70 kDa nagyságú transzferrin a vas vagy a cöruloplazmin<br />
a réz szállítására stb.<br />
A transzporterek, a szállítófehérjék<br />
funkciói<br />
Nyilvánvaló, hogy a funkciójuk a szállítás. Külön<br />
részletezésre itt semmi indok nincs. Egy biztos, szerteágazó<br />
funkció, és sok kutatásra váró feladat van itt.<br />
A transzportfehérjék azonosítása<br />
funkcióik alapján<br />
A fehérje által szállított atom vagy molekula alkalmas<br />
és a gyakorlatban valóban fel is használt magának a<br />
szállítófehérjének azonosítására. Különösen jól alkalmazható<br />
ez a fehérjék elektroforetikus elválasztása<br />
után, ha az elektroforetikus szeparálás során a fehérjéről<br />
nem válik le, amit szállít. Ekkor a szállított anyag<br />
detektálása a szállítófehérjét is jelöli. Erre nagyon jó<br />
példa a lipoidelektroforézis. A szérumfehérjék elektroforetikus<br />
elválasztása után lipoidfestést alkalmazunk,<br />
és a lipoproteineket 4 frakcióban ismerhetjük<br />
fel: α (HDL), b, pre-β (LDL ÉS VLDL) és kilomikron.<br />
Ezek relatív „mennyiségi” összevetése hasznos diagnosztikai<br />
szempontból.<br />
Ligandumok<br />
Fehérjeligandumok, ligandumfehérjék egyet jelentenek:<br />
fehérjéket, amelyekhez valami kapcsolódik.<br />
Ebből adódik, hogy nincs messze az igazságtól az az<br />
állítás, hogy az élő sejtekből kivett vagy fiziológiás<br />
úton kijutott fehérjék többsége nem csak egyszerű<br />
polimerje az aminosavaknak, hanem módosultak,<br />
valami kapcsolódik hozzájuk, tehát ligandumfehérjék.<br />
A peptidszintézis, a transzláció utáni módosulásokat<br />
közös néven poszttranszlációs módosulásoknak
Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján<br />
123<br />
nevezzük. Ezek többségében valami kapcsolódik a<br />
peptidlánchoz. Ligandum (kapcsolt anyag) lesz része<br />
a fehérjéknek. Így pl., ha cukormolekulák, monoszacharidok<br />
kapcsolódnak abból a célból(?), hogy vízben<br />
jobban oldottak legyenek, mint ahogy a vérplazmába<br />
került fehérjék esetében így van, a ligandumfehérjéknek<br />
glikoprotein lesz a nevük. Ha fémek kapcsolódnak,<br />
akkor metalloproteinek, ha lipoidok, akkor lipoproteinek.<br />
Ligandumfehérje a K-vitamin-dependens<br />
módon γ-karboxileződött protrombinmolekula is. A<br />
fehérjékhez atomok, molekulák kapcsolódása azonban<br />
nem csak sejten belül, intracellulárisan következhet<br />
be, hanem sejten kívül is. Különböző fehérjékhez,<br />
„receptorfehérjékhez” bizonyos molekulák, potenciális<br />
gyógyszermolekulák kapcsolódásának kutatása<br />
az egész világon fejlett módszerekkel, fejlett számítógépes<br />
technikákkal intenzíven folyik. Néhány módszer,<br />
amelyet ma a ligandumkutatásban alkalmaznak:<br />
Raman-spektroszkópia, fluoreszcens spektroszkópia,<br />
cirkuláris dikroizmus, magmágneses rezonancia<br />
spektroszkópia, tömegspektrometria, atomerő-mikroszkópia,<br />
kettős polarizációs interferometria, a paramágnesesség<br />
vizsgálata stb.<br />
Esszenciális táplálékok<br />
Ezek a fehérjék csak azért kerültek ide, a felsorolás<br />
végére, hogy alázatra figyelmeztessenek. Az emberi<br />
test fehérjéi 20 aminosavból épülnek fel. Ebből kilencet<br />
a testünket felépítő 10 14 saját sejtünk nem tud előállítani.<br />
A táplálékokkal kell megkapnunk. Ha csak<br />
egyszerűen kimondjuk, hogy 9 esszenciális aminosav<br />
van, nem fogjuk fel eléggé az újabb bizonyítékokat<br />
arra, hogy az életünk más élőlényektől függ. A fáktól,<br />
a zöld növényektől függ, hogy van-e oxigén, védő<br />
ózonpajzs a Föld körül, van-e tiszta levegő és tiszta<br />
vizünk. Itt azt is fel kell fognunk, hogy az, hogy az<br />
életünket jelentő fehérjéink legyenek, más élőlények<br />
lététől függ. Minden tanulás végén alázattal azt kell<br />
megértenünk és elfogadnunk, hogy tisztelnünk, védenünk<br />
kell az élővilágot.<br />
Irodalom<br />
[1] Szent-Györgyi, A. (ed.): Studies from Insitute of Medical<br />
Chemistry, Univ. Szeged. Vol. 1., S. Karger, AG.,<br />
Basel, 1942.<br />
[2] Kühne, W.: Untersuchungen über das Protolazma und<br />
die Contractilitat. W. Engelman, Leipzig, 1864.<br />
[3] Engelhardt, W. A., Lyubimova, M .N.: Myosin and<br />
adenosin triphosphatase. Nature 144:668–669, 1939.<br />
[4] Huxley, A. F., Nidergerke, R., Huxley, H., Hanson,<br />
J.: Sliding filament hypothesis. Nature 173:4412, May,<br />
1954.<br />
[5] Kellermayer, M., Jobst, K.: Cytoplasmic protein network<br />
in HeLa cells. Histochemistry 44:193–195, 1975.<br />
[6] Kühne, W.: Untersuchurigen über das Protoplasma<br />
und die Contactitat. W. Engelmann, Leipzig, 1864.<br />
[7] Radzicka, A., Wolfenden, R.: Science 6:267, 931,<br />
1995.<br />
[8]. Theil, E.: Ferritin: Structure, gene regulation, and cellular<br />
function in animals, plants and microorganisms.<br />
Annual Review of Biochemistry 56:289–315, 1987.
6. Immunkémiai eljárások a fehérjék<br />
azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások<br />
oldatban és szilárd fázisú<br />
rendszerekben<br />
Berki Tímea<br />
Hogyan tudunk egy bonyolult, összetett, akár több<br />
ezer komponenst tartalmazó biológiai mintából egy<br />
nagyon kis koncentrációjú anyagot meghatározni (pl.<br />
vérmintából pajzsmirigyhormont vagy egy sejt lizátumából<br />
egy fehérjét stb.)?<br />
Erre kétféle megközelítés áll rendelkezésére:<br />
• Valamilyen nagy hatékonyságú elválasztástechnikai<br />
módszerrel (pl. HPLC, GC, MS) a mintát<br />
komponenseire bontjuk, és a meghatározandó<br />
komponenst mérjük.<br />
• Szelektíven kiválasztjuk az adott komponenst a<br />
mintából, majd mérjük (pl. immunoassay).<br />
Az immunanalitikai módszerekkel egy speciális reakciót,<br />
az élő szervezetekben is lejátszódó, rendkívül<br />
szelektív antigén-antitest reakciót használnak ki arra,<br />
hogy a mintából a meghatározandó anyagot kiválasszák,<br />
majd valamilyen analitikai módszerrel (pl.<br />
spektrofotometriásan, fluoreszcenciaméréssel, radioaktív<br />
izotópos méréssel) detektálják.<br />
Immunkémiai eljárások tágabb értelemben azok a laboratóriumi<br />
fehérjeazonosítási módszerek, amelyekben<br />
két ligandum, az antigén (haptén) és az antitest<br />
specifikus kapcsolódása révén határozzuk meg az<br />
analit (antigén vagy antitest) mennyiségét. Ebben az<br />
esetben a vizsgálandó molekula annak ellenére, hogy<br />
immunológiai módszerrel határozzuk meg, nem feltétlenül<br />
az immunválasz valamely eleme, hanem lehet<br />
akár a vas- vagy a csontanyagcsere markere, akár<br />
tumormarker, akár egy sejt alkotórésze is. Szűkebb<br />
értelemben immunszerológiai módszerekkel az immunválasz<br />
normális és kóros komponenseit (antitestek<br />
osztályai, akut fázis fehérjék, komplementkomponensek,<br />
autoantitestek stb.) tudjuk tanulmányozni.<br />
Ezeknek az immunoassay-nek nevezett eljárásoknak<br />
a nagyfokú fajlagossága az antitestek nagy epitópspecificitásán<br />
és affinitásán alapul. Felhasználásukkal<br />
mérhető akár antigén, akár antitest mennyisége egy<br />
mintából. Az immunológiai elven működő laboratóriumi<br />
mérési technikákat forradalmasította az ellenanyagok<br />
előállítási módszerének fejlődése: az egyre<br />
tisztább poliklonális ellenanyagok mellett a monoklonális<br />
ellenanyagok előállításának és alkalmazásának<br />
elterjedése.<br />
Az immunológiai mérőmódszerek érzékenységét<br />
nem csak az alkalmazott antitest típusa (poliklonális<br />
vagy monoklonális antitest) szabja meg, hanem<br />
az a mérőrendszer is, amelyben az antigén-antitest<br />
reakciót detektáljuk. Így az immunológiai elven alapuló<br />
tesztek érzékenységének széles skálája 0,1 pikogrammtól<br />
mg-ig terjedő analit jelenlétének kimutatását<br />
teszi lehetővé (6-1. táblázat). Az analit<br />
koncentrációjának meghatározását ismert kalibráló<br />
mintasorral kapott illesztőgörbéről való leolvasással<br />
végezzük.<br />
6-1. táblázat. Az immunoassay-k érzékenysége<br />
Eljárás<br />
immunfluoreszcencia<br />
enzim-immunoassay<br />
(ELISA)<br />
lumineszcencia<br />
radioimmunoassay<br />
(RIA, Farr)<br />
immunoblott<br />
Kimutatható legkisebb<br />
ellenanyag-koncentráció<br />
1–100 ng<br />
0,2–100 pg<br />
0,1–100 pg<br />
0,1–100 pg<br />
0,2–100 pg
126 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
Az egyes testfolyadékok (plazma, szérum, liquor,<br />
vizelet) fehérjetartalmának mennyiségi és minőségi<br />
meghatározása fontos eszköz bizonyos betegségek<br />
diagnózisához, a terápia hatékonyságának nyomon<br />
követéséhez vagy a betegség aktivitásának megítéléséhez.<br />
A szérum-, liquor- és vizeletfehérjék analízisénél<br />
alkalmazott kvantitatív és kvalitatív módszerek igen<br />
jelentős fejlődésen mentek keresztül az utóbbi néhány<br />
évben, különösen a gyakorlati alkalmazás és az érzékenység<br />
tekintetében. Ez az alkalmazott ellenanyagok<br />
minősége mellett a jelölő- és mérőrendszerek, műszerek<br />
egyre tökéletesedő voltának köszönhető.<br />
Az immunkémia tárgykörébe tartozó vizsgálatok<br />
profilja széles körű, mivel plazmaproteinek (akut fázis<br />
fehérjék, immunglobulinok, cisztatin C), hematológiai<br />
paraméterek (transzferrin, szolubilis transzferrin<br />
receptor, ferritin, B 12<br />
-vitamin, folsav), cardialis<br />
markerek (mioglobin, troponin T), sepsismarkerek<br />
(prokalcitonin, citokinek), valamint a szénhidrát-deficiens<br />
transzferrin meghatározása egyaránt ide tartozik.<br />
Ugyancsak ezzel a módszerrel detektáljuk azokat<br />
a molekulákat is, amelyeket a szervezet termel, de<br />
normális esetben nem fordulnak elő a plazmában (pl.<br />
tumorantigének), vagy azon molekulákat, amelyek<br />
normális esetben nincsenek a szérumban (pl. drogok,<br />
gyógyszerek).<br />
A rutin diagnosztika mellett a kutatólaboratóriumok<br />
módszertanához is hozzátartozik az immunoassay<br />
típusú vizsgálatok széles köre, amely igen érzékeny,<br />
specifikus és ezért sokféle fehérjét tartalmazó,<br />
kis mennyiségű mintából tud egyetlen molekula<br />
jelenlétére információt adni. Így a sejtalkotórészek,<br />
sejtfelszíni antigének, sejtek által termelt citokinek,<br />
ellenanyagok mennyiségi meghatározását fehérjeszinten<br />
immunanalitikai módszerekkel végzik.<br />
A vizsgálatokat a közös módszertan foglalja egységbe.<br />
Immunológiai alapok<br />
Immunológiai fogalmak<br />
Az ellenanyagok vagy antitestek a specifikus humorális<br />
immunválasz antigén által kiváltott aktivációjának<br />
eredményeként termelődnek az antigénfelismerő<br />
B-sejtekből differenciálódó plazmasejtekben. A specifikus<br />
immunválaszban az antigén ismétlődő megjelenésekor<br />
(immunizálás) egyre nagyobb affinitású<br />
és nagyobb mennyiségű antitest termelődik. Ezek<br />
az antitestek a testfolyadékokban, így a szérumban<br />
is mérhetők, abból különböző tisztítási eljárással kinyerhetők.<br />
A specifikus immunválasznak 3 fő szakaszát különböztetjük<br />
meg:<br />
1. A lymphocyták antigénfelismerése.<br />
2. Az antigénspecifikus T- és B-sejtek differenciálódása<br />
és klonális osztódása.<br />
3. Effektor és memóriasejtek és molekulák képződése,<br />
antigéneltakarítás.<br />
Az emlősszervezetben a B-lymphocyták antigénreceptoruk<br />
(BcR) révén bármely kémiai természetű,<br />
idegen molekulát (natív antigént) képesek felismerni<br />
és megkötni. A felismert antigén kémiai természetétől,<br />
bejutása helyétől, mennyiségétől, valamint<br />
a gazdaszervezet állapotától függően vagy támadó<br />
jellegű immunválaszt, vagy toleranciát vált ki. A fehérje<br />
természetű antigének nagyrészt ún. T-sejt-függő<br />
(T-dependens) immunválaszt váltanak ki, ami<br />
azt jelenti, hogy az antigénmolekula egyes szakaszait<br />
nem csak B-sejtek, hanem T helper (Th-) sejtek is<br />
felismerik. Ehhez a folyamathoz a fehérjemolekulák<br />
antigénbemutató (APC) sejtek általi felvétele, feldolgozása<br />
és MHC-II-vel való bemutatása is szükséges a<br />
Th-sejtek számára. Az antigénspecifikus Th-sejtek és<br />
B-lymphocyták együttes aktivációja és kölcsönhatása<br />
eredményezi a B-lymphocytákban zajló izotípusváltást<br />
és affinitásérést (6-1. ábra), amelynek eredményeként<br />
nagy affinitású IgG, IgA vagy IgE izotípusú<br />
ellenanyagok termelődnek. In vitro laboratóriumi<br />
mérőmódszerekhez a leginkább ideális, ha IgG izotípusú<br />
ellenanyag keletkezik az immunválasz során.<br />
Antigén, epitóp<br />
Az antigén fogalom Detre László magyar mikrobiológus<br />
nevéhez fűződik, aki „antitestgenerátornak”<br />
nevezte azokat a molekulákat, amelyek immunválaszt<br />
váltanak ki. Detre a Pasteur Intézetben a typhus elleni<br />
immunitást tanulmányozva dolgozta ki a specifikus<br />
ellenanyagok keletkezésének antigénteóriáját,<br />
az igazságügyi orvostanban elsőként alkalmazott<br />
immunbiológiai (szerológiai) eljárást, leírta az immunszuppressziónak<br />
nevezett jelenséget, valamint a<br />
szérumdiagnosztikában nagy jelentőségű zónajelenséget.
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
127<br />
6-1. ábra. A humorális B-sejtes immunválasz lépései<br />
Mai, korszerűbb megfogalmazás szerint antigén az<br />
a molekula, amelyet az adaptív immunrendszer specifikusan<br />
felismer, és ellene vagy támadó jellegű immunválasz,<br />
vagy tolerancia kialakulását eredményezi.<br />
Szorosabb értelemben azok az anyagok, amelyek<br />
immunválaszt váltanak ki, az immunogének, míg az<br />
antigének olyan anyagok, amelyek specifikus antitestekhez<br />
kötődnek. Az immunogén választ kiváltó<br />
antigént komplett vagy teljes antigénnek nevezzük. Az<br />
antigénmolekula azon kisebb szakaszát, amely közvetlen<br />
kapcsolatot létesít a T- vagy B-lymphocyták<br />
antigénreceptorával, epitópnak vagy antigéndeterminánsnak<br />
nevezzük (6-2. ábra).<br />
Minél nagyobb és minél változatosabb egy molekula,<br />
annál több fajta epitóp helyezkedik el rajta, így<br />
annál több B-lymphocyta aktivációját eredményezi<br />
6-2. ábra. Az antitest felismeri a komplex antigén epitópjait<br />
(antigéndeterminánsait)<br />
és annál több fajta (poliklonális) antitest termelődik<br />
ellene. Megkülönböztetünk lineáris epitópokat, amelyek<br />
a fehérje harmadlagos szerkezetének felbontása<br />
után is változatlanok maradnak és az ellenük termelődött<br />
antitestet továbbra is kötik. A konformációs<br />
epitópok – a fehérjék harmadlagos szerkezetéből<br />
adódóan – egymástól távoli aminosavak által alkotott<br />
felszínen jönnek létre, amelyet a fehérje denaturálása<br />
tönkretesz, vagyis az antitest kötődése nem jön létre.<br />
A neo-antigének a fehérjék harmadlagos szerkezetének<br />
felbontása után felszínre kerülő epitópok, amelyek<br />
ellen a natív formában nem generál antitestet az<br />
immunrendszer (6-3. ábra).<br />
A B-lymphocyták felismernek olyan kis molekulákat<br />
is (szteroidhormon, antibiotikum, szervetlen<br />
vagy szerves kis molekulák stb.), amelyek önmagukban<br />
nem váltanak ki immunválaszt, csak ha hordozó<br />
fehérjéhez kapcsolódva jelennek meg. Ezeket inkomplett<br />
antigénnek vagy hapténnek nevezzük.<br />
Antitest szerkezet, izotípus, funkció<br />
Az immunglobulinok a plazmasejtek által termelt<br />
glikoproteinek, szerkezetüket tekintve globulinok (a<br />
fehérjeelektroforézis γ-régiójában találhatók). Az N-,<br />
ritkábban az O-terminális (IgA 1<br />
és IgD) aminosavmaradványokhoz<br />
kacsolódó cukor oldalláncok (glikoziláció)<br />
főként a molekula in vivo effektor funkciói<br />
(FcR-kötés, komplementaktiválás) szempontjából<br />
nélkülözhetetlenek.
128 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-3. ábra. Az epitópok (antigéndeterminánsok) fajtái<br />
a) Konformációs determináns<br />
b) Lineáris determináns<br />
c) Neoantigéndetermináns (proteolízissel képződik)<br />
6-4. ábra. Az immunglobulin-molekula doménes szerkezete<br />
Szerkezet. Az Y alakú, monomer immunglobulint<br />
4 polipeptidlánc alkotja, 2 identikus nehéz- és 2 egyező<br />
könnyűlánc, amelyeket diszulfidhidak kapcsolnak<br />
össze. A globuláris szerkezetű polipeptidláncok alapelemeit,<br />
a 110 aminosav hosszúságú doméneket szintén<br />
diszulfidhidak kötik össze (6-4. ábra). A könnyűláncok<br />
2-2 doménből épülnek fel, egy variábilis (V) és<br />
egy konstans (C) doménből. A nehézláncokat egy V<br />
és 3-4 C domén alkotja. A könnyű- és nehézláncok V<br />
doménjei együtt hozzák létre a molekula N-terminális<br />
végén az antigénkötő helyet, vagyis a molekula specificitását.<br />
Mind a nehéz-, mind a könnyűlánc variábilis<br />
doménjének aminosavszekvenciájában<br />
3-3 hipervariábilis szakasz alkotja<br />
az antigénkötő „komplementaritást<br />
determináló régiót” (CDR) (lásd 6-4.<br />
ábra). E molekulaszakaszok aminosav-variabilitása<br />
ellenanyagonként<br />
eltér, így valósul meg az a sokféleség,<br />
amely lehetővé teszi szinte valamenynyi<br />
létező molekula felismerését. A<br />
CDR régióban bekövetkező spontán<br />
mutációk okozzák a memória típusú<br />
immunválaszban tapasztalható affinitásérés<br />
folyamatát. Ez azt jelenti,<br />
hogy az antigénspecifikus aktiválódó<br />
és osztódó B-lymphocytákban az immunglobulin<br />
nehéz-és könnyűlánc V<br />
régióinak CDR szakaszai mutációk<br />
miatt változnak, így az ellenanyag af-
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
129<br />
finitása is változik. A B-sejtek abban az esetben élnek<br />
túl és termelnek további immunglobulinokat, ha ez a<br />
mutáció az ellenanyag nagyobb affinitású kötőhelyét<br />
eredményezi. Ismételt immunizálás folyamán az ellenanyagok<br />
átlagos affinitása nő (affinitásérés).<br />
Régebbi szerkezeti leírások a monomer immunglobulin-molekulát<br />
a papain enzimmel való hasítás<br />
során kapott két Fab- (fragment antigen binding)<br />
fragmensre és egy Fc- (fragment crystallizable) fragmensre<br />
bontják (6-5. ábra). Egy másik enzim, a pepszin<br />
a kapocsrégió alatt hasítja a molekulát, így egy<br />
F(ab)2-fragmens és egy Fc-fragmens keletkezik. A<br />
nehézlánc konstans domének az effektor funkciók<br />
létrehozásáért felelősek.<br />
Az egy B-lymphocyta által termelt ellenanyagok a<br />
nehézlánc vonatkozásában különbözhetnek egymástól,<br />
ill. előfordul, hogy ugyanakkor több osztályba<br />
tartozó immunglobulint is termel a sejt. Mindazonáltal<br />
ezek az immunglobulinok antigénkötő képességük<br />
szempontjából megegyeznek, amit a variábilis<br />
6-5. ábra. Az immunglobulin-molekula harmadlagos szerkezete<br />
régió kódol (6-6. ábra). Ahhoz, hogy az óriási számú<br />
különböző specificitású antitest megjelenjen a szervezetben<br />
és védje azt a számtalan idegen anyaggal<br />
szemben, szervezetünk sok millió, egymástól eltérő<br />
B-lymphocytát állít elő. Amennyiben egy olyan rendszer<br />
biztosítaná ezt a sokszínűséget, amelyben minden<br />
egyes eltérő variábilis szakaszt egy önálló gén kódolna,<br />
akkor a teljes genom sem lenne elég erre a célra. Ezzel<br />
szemben, amint azt Susumu Tonegawa 1976-ban<br />
kimutatta, a B-lymphocyták genomjának egyes részeiben<br />
olyan szerkezeti változások (génrekombinációs<br />
folyamatok) zajlanak le, amelyek az immunglobulinok<br />
változékonyságát biztosítják. Tonegawa ezért a felfedezéséért<br />
orvosi Nobel-díjat kapott 1987-ben.<br />
Immunglobulin-izotípusok<br />
Emlősök esetén az immunglobulinoknak a nehézlánc<br />
konstans doménjei alapján öt típusa (izotípusa) van:<br />
γ, α, μ, δ és ε. Ezek alapján az immunglobulinokat öt<br />
osztályba vagy izotípusba sorolhatjuk: IgG, IgA, IgM,<br />
IgD és IgE. Az IgG és IgA (6-7. ábra) molekulákat<br />
még tovább sorolhatjuk alosztályokba: IgG 1<br />
, IgG 2a<br />
,<br />
IgG 2b<br />
, IgG 3<br />
, IgG 4<br />
, valamint IgA 1<br />
és IgA 2<br />
. A könnyűláncnak<br />
csak két izotípusa ismert: k és l, amelyek<br />
emberben hasonlóak egymáshoz, de minden egyes<br />
immunglobulinban csak egyikük fordul elő. Minden<br />
immunglobulin-izotípus más-más biológiai funkciókat<br />
lát el (6-2. táblázat).<br />
IgM<br />
Az IgM monomer formában az érett, de még antigénnel<br />
nem találkozott, „naiv” B-lymphocyták antigénreceptora<br />
(az IgD mellett), a primer immunválaszban<br />
elsőként termelődő immunglobulin. A<br />
6-6. ábra. Antigénfelismerés. Minden antitest (ellenanyag)<br />
specifikus antigént (epitópot) ismer fel, a kapcsolódás a<br />
kulcs–zár viszonyhoz hasonló<br />
6-7. ábra. Az immunglobulin-osztályok szerkezete; nehézlánctípusok
130 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-2. táblázat. Az immunglobulin-alosztályok szerkezeti és funkcionális eltérései *<br />
Jellemző<br />
Osztály-Alosztály<br />
IgM IgG 1<br />
IgG 2<br />
IgG 3<br />
IgG 4<br />
IgA 1-2<br />
IgE IgD<br />
forma pentamer monomer monomer monomer monomer dimer monomer monomer<br />
IgE<br />
Monomer immunglobulin-molekula, amely a többi<br />
immunglobulintól eltérően 4 nehézlánc konstans<br />
doménből épül fel, amely jelentős mértékben gliko-<br />
szérumkoncentráció<br />
(mg/ml)<br />
komplementaktiváció<br />
placentatranszfer<br />
Fc-receptorkötés<br />
megjelenés<br />
szekrétumokban<br />
1,5 9 3 1 0,5 3,5 0,00005 0,03<br />
+++ +++ + +++ - - - -<br />
- + + + + - - -<br />
- + - + - - - -<br />
mucus<br />
stb.<br />
tej tej tej tej mucus<br />
stb.<br />
*<br />
A - hiányt, a + valamely tulajdonság vagy aktivitás meglétét, többszörözéssel annak mértékét jelöli.<br />
- -<br />
plazmasejtek által termelt, szekretált forma pentamer<br />
szerkezetű, ahol az 5 monomer IgM-et egy J (joining)<br />
lánc kapcsolja össze. A polimerszerkezet miatt a molekula<br />
igen nagy méretű, molekulatömege közel 900<br />
kDa, ezért kapta az „M” (makro) jelölést. Főleg a vérszérumban<br />
fordul elő, mert nehezen jut át az érfalon<br />
a szövetközti térbe. Ugyanakkor a poli-FcReceptor<br />
(pFcR) segítségével transzportálódik a nyálkahártyák<br />
felszínére. Miután a pentamer molekulát 10 antigénkötő<br />
helye több antigén keresztkötésére teszi alkalmassá,<br />
jó precipitáló és agglutináló antitest. Polimer<br />
szerkezete miatt nagy aviditással köti az antigéneket,<br />
és ugyancsak hatékony a komplementrendszer aktiválásában<br />
is.<br />
IgD<br />
Az IgM mellett a naiv B-lymphocyták antigénreceptora.<br />
Szekretált formában, nyomokban fordul elő,<br />
funkciója nem ismert.<br />
IgG<br />
A memória B-sejtek antigénreceptora, a másodlagos<br />
immunválaszban termelődő, legnagyobb menynyiségű<br />
immunglobulin-osztály. Mind a szérumban,<br />
mind a szövetközti térben megtalálható. Az anyai IgG<br />
transzportfolyamatok révén a placentán átjut a magzatba,<br />
az újszülött immunvédekezését biztosítja, amíg<br />
kb. 6 hónap alatt a saját immunrendszere át nem veszi<br />
ezt a feladatot. Az IgG számos patogén ellen termelődik,<br />
így vírusokat, baktériumokat, gombákat,<br />
azok toxinjait neutralizálja, a komplementrendszer<br />
aktiválásával (klasszikus út) azokat elpusztítja, vagy<br />
a kórokozók opszonizációjával azok fagocitózisát is<br />
elősegíti. Az egyes IgG alosztályok effektor funkciói<br />
eltérőek (1ásd 6-2. táblázat).<br />
IgA<br />
Elsősorban a nyálkahártyák védelmét szolgáló immunglobulin.<br />
Monomer formában a vérben és a szövetnedvekben<br />
fordul elő, a dimer formát egy J-lánc<br />
kapcsolja össze, nyálkahártyafelszínre való transzportját<br />
a pFcR biztosítja. A dimer IgA-val együtt lehasad<br />
a receptor extracelluláris része is, és mint szekretoros<br />
komponens védi a molekulát a proteolitíkus enzimektől.<br />
Az IgA számos patogén ellen termelődik, így<br />
vírusokat, baktériumokat, gombákat, azok toxinjait<br />
neutralizálja, az alternatív komplementaktivációs út<br />
elindítója, ugyanakkor viszont a kórokozók opszonizációját<br />
és fagocítózisát csak kismértékben segíti elő.
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
131<br />
zilálódik, molekulatömege 190 kDa. Az IgE molekula<br />
termelődését követően nagy affinitással kötődik a<br />
basophil granulocyták, a hízósejtek és az eosinophil<br />
granulocyták Fce-receptorához, vérbeli koncentrációja<br />
rendkívül alacsony. Az IgE-nek alapvető szerepe<br />
van az azonnali túlérzékenységi reakcióban és a paraziták<br />
(férgek) elleni immunitás kialakításában. Nem<br />
aktiválja a komplementrendszert, hőre érzékeny.<br />
Az immunglobulinok koncentrációjának megközelítő<br />
mennyiségi meghatározását fehérjeelektroforézissel<br />
végzik (6-8. ábra). Ezzel a módszerrel a<br />
vérplazmafehérjéket albuminra, α 1<br />
-, α 2<br />
,- β 1<br />
-, β 2<br />
- és<br />
γ-globulinra választják szét, töltésüknek és méretüknek<br />
megfelelően. Az immunglobulinok a g régióban<br />
vannak. Myeloma és néhány más betegség esetén egy<br />
adott immunglobulin rendkívül nagy koncentrációban<br />
van jelen, amely monoklonálisnak tekinthető, és<br />
elektroforézissel egy éles sávot ad.<br />
Az immunglobulin-izotípus meghatározás minőségi<br />
vizsgálata végezhető immundiffúzóval, immunelektroforézissel<br />
vagy immunfixációval, mennyiségi<br />
mérésük nefelometriával, turbidimetriával vagy ELI-<br />
SA módszerrel.<br />
Ellenanyag-affinitás, aviditás<br />
Az antigén-ellenanyag komplexben a két molekulát<br />
nem-kovalens kötések tartják össze. Ilyenek:<br />
Coulomb-erők, hidrogénhidak, elektrosztatikus<br />
erők, van der Waals-erők, hidrofób kapcsolatok. Az<br />
antigén-antitest kapcsolódás legegyszerűbb formája,<br />
amikor univalens ligandum (haptén) reverzibilisen<br />
kapcsolódik az immunglobulin antigénkötő helyéhez.<br />
Az egy immunglobulin-molekulához a telítettség<br />
állapotában kapcsolódó ligandumok száma fejezi<br />
ki az ellenanyag valenciáját (6-9. ábra).<br />
Az antigénkötő hely és a ligandum kapcsolódása<br />
reverzibilis, a kölcsönhatás során az antigén koncentrációjától<br />
és a kötés erősségétől függő dinamikus<br />
egyensúlyi állapot alakul ki.<br />
Az ellenanyagot Ab-vel (antibody), az antigént<br />
Ag-vel jelölve:<br />
2Ag + Ab ↔ Ag 2<br />
– Ab<br />
6-8. ábra. A fő szérumfehérje-frakciók és az azokhoz tartozó<br />
fehérjék<br />
(Rövidítések, sorrendben – Gc: D-vitamin-kötő globulin;<br />
AT 3<br />
: antitrombin III; pl: plazminogén; aLp: a-lipoprotein;<br />
Hpt: haptoglobin; C1q: C1 komplementfaktor q része;<br />
CRP: C-reaktív protein; a 1<br />
-Ac: a 1<br />
-kimotripszin; a 1<br />
-At:<br />
a 1<br />
-antitripszin; a 2<br />
-M: a 2<br />
-makroglobulin; Tf: transzferrin;<br />
C3: C3 komplementfaktor; Fibr: fibrinogén; pre-A: prealbumin;<br />
a 1<br />
-Ag: a 1<br />
-sav-glikoprotein; b-Lp: b-lipoprotein;<br />
IaTI: inter-a-tripszininhibitor; C4: C4 komplementfaktor;<br />
IgM: M immunglobulin; C1-inh: C1-inhibitor; C5:<br />
C5 komplementfaktor; C1s: C1 komplementfaktor s része;<br />
Hpx: hemopexin; IgA: A immunglobulin; IgD(E): D (E)<br />
immunglobulin; Cer: cöruloplazmin; Fn: fibronektin; IgG:<br />
G immunglobulin; C1r: C1 komplementfaktor r része; FB:<br />
B faktor)<br />
6-9. ábra. Az immunglobulin-valencia és -aviditás viszonya
132 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
Hagyományosan azonban a következő sémával jelölik<br />
a reakciót, vagyis a két egyforma kötőhely közül<br />
csak az egyikre vonatkozóan:<br />
Ag + Ab ↔ Ag – Ab<br />
Ez annyiban jogos, hogy a két kötőhely általában egymástól<br />
függetlenül és egyforma egyensúlyi állandóval<br />
reagál. A reakció egyensúlyi állandója:<br />
[Ag-Ab]<br />
K eq<br />
=<br />
[Ag] [Ab]<br />
Az egyensúlyi állandó széles határok közöttt változik<br />
a különböző antigén-antitest párok esetén. Sok esetben<br />
K eq<br />
> 10 8 ~ 10 10 , ami azt jelenti, hogy a képződő<br />
komplexek nagyon stabilak, ill., hogy a reakció nagyon<br />
híg oldatban is a komplexképződés irányába<br />
történik.<br />
A kapcsolódás erősségének mértéke az ellenanyag<br />
affinitása (6-10. ábra), amelyet azzal az antigénkoncentrációval<br />
jellemezhetünk, amely a rendszerben<br />
6-10. ábra. Az antigén-antitest reakció affinitása. Az antitest<br />
(Ab) affinitása kifejezi azt, hogy miyen erővel képes<br />
kötődni az antigénhez (Ag). Ezt az antigén-antitest komplex<br />
(Ag-Ab) képződésének egyensúlyi állandójával (K eq<br />
)<br />
írhatjuk le<br />
6-12. ábra. A komplex antigén poliklonális immunválaszt<br />
vált ki, ami eltérő specificitású ellenanyagok termelődéséhez<br />
vezet<br />
lévő antigénkötő helyek felének telítéséhez szükséges.<br />
Az antigénnek ez a mol-ban kifejezett koncentrációja<br />
a disszociációs konstans (Kd). A kisebb Kd-érték<br />
nagyobb affinitást jelent, ami ellenanyagok esetében<br />
10 –7 -10 –11 mol/l között változhat. Egy adott polivalens<br />
antigénnel reagáló immunsavó (poliklonális antitestek)<br />
számos egyedi affinitású antitestet tartalmaz,<br />
amelyek összessége az aviditás (6-11. ábra).<br />
Poliklonális ellenanyagválasznál gyakran tapasztalható,<br />
hogy az ellenanyag-termelést indukáló<br />
antigénnel szerkezeti hasonlóságot mutató más<br />
molekulák, amelyek azonos epitópokat hordoznak,<br />
kisebb-nagyobb mértékben reagálhatnak a termelődött<br />
ellenanyaggal. Ilyenkor keresztreakcióról beszélünk.<br />
Mivel az antigének általában polivalensek,<br />
vagyis több különböző epitópot tartalmaznak, számos,<br />
különböző affinitású ellenanyag termelődését<br />
váltják ki (6-12. ábra).<br />
Antitest-előállítási módszerek<br />
6-11. ábra. Az antigén–antitest reakció aviditása. Az aviditás<br />
a több kötőhellyel rendelkező antigének és több kötőhellyel<br />
rendelkező antitestek között kialakuló kötések<br />
együttes erősségére utal (az affinitás egyetlen antitest és<br />
antigén között kialakult kötéserősség)<br />
Immunizálás<br />
Immunanalitikai célra leginkább IgG osztályú ellenanyag<br />
előállítása a cél. Ehhez a megfelelő antigén<br />
kiválasztásán kívül a bejutás helye, módja és a kísérleti<br />
állat megfelelő kiválasztása is nélkülözhetetlen.<br />
Immunogenitás szempontjából az antigéneket osztályozhatjuk<br />
kémiai természetük (fehérje > polipeptid<br />
> poliszacharid > lipid > nukleinsav), méretük, bio-
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
133<br />
lógiai tulajdonságaik szerint. Megfelelő nagyméretű<br />
antigének (pl. vírusok, baktériumok, sejtek, fehérjék,<br />
polipeptidek, poliszacharidok) önmagukban is<br />
immunogének, míg kisebb molekulák csak polimer<br />
formájában vagy hordozóhoz kapcsoltan váltanak ki<br />
immunválaszt. Fehérjehordozóként leggyakrabban<br />
KLH-t (Keyhole Limpet Hemocyanin: extrém nagy<br />
méretű, vegyes összetételű, glikozilált, réziontartalmú<br />
protein, piros kürtcsigákból nyerik ki), borjú szérumalbumint<br />
(BSA), vagy tireoglobulint (Tg) használunk,<br />
amelyek jó immunogének és megfelelő számban<br />
tartalmaznak haptének kapcsolódására alkalmas<br />
oldalláncokat (–NH 2<br />
, –SH, fenol, imidazol). A poliszacharidok<br />
fehérje hordozó nélkül T-sejttől független<br />
immunválaszt váltanak ki, amelyet alacsony affinitású,<br />
IgM ellenanyagok túlsúlya jellemez.<br />
Az oltóanyagot leggyakrabban a bőrbe (intradermalis),<br />
a bőr alá (subcutan), izomba (intramuscularis),<br />
a hasüregbe (intraperitonealis), ritkábban intravenásan<br />
adjuk be a kísérleti állatnak. Az optimális<br />
immunválasz kiváltásához szükséges antigén menynyisége,<br />
a beadás módja, az ismételt oltások gyakorisága<br />
fajonként jelentősen eltér.<br />
A létrejövő immunválasz minőségi és mennyiségi<br />
jellemzőit jelentősen befolyásolják az antigénnel beadott<br />
segédanyagok, az ún. adjuvánsok, amelyek a válasz<br />
specificitását nem befolyásolják. Szerepük az antigén<br />
felszívódásának, bomlásának lassítása (olajok,<br />
alumíniumgélek alkalmazásával), a nem specifikus<br />
gyulladásos reakció kialakulásának elősegítése (elölt,<br />
nem virulens kórokozókkal) és ezzel az antigénbemutatás<br />
hatékonyságának növelése. A leggyakrabban<br />
alkalmazott kórokozók közül egérben a Bordetella<br />
pertussis IgG 1<br />
és IgE, a Mycobacterium tuberculosis<br />
IgG 2a<br />
-termelését váltja ki.<br />
Poliklonális antitest<br />
A hagyományos in vivo immunizálással előállított<br />
ellenanyagok poliklonális jellegűek, vagyis több<br />
B-sejt-klón termékei, ezért a szérumból izolálható ellenanyagok<br />
sok szempontból heterogének (6-13. ábra).<br />
Az olyan minőségi paraméterek, mint epitópspecificitás,<br />
affinitás, izotípusmegoszlás határozzák meg alkalmazhatóságukat<br />
és titerüket egy adott rendszerben. Az<br />
antitesttiter azt a szérumhígítást jelenti, amely az adott<br />
mérési rendszerben még pozitív eredményt ad.<br />
A poliklonális ellenanyag ezen heterogenitása<br />
egyben az ellenanyag mint reagens előnye is, mert<br />
6-13. ábra. A poliklonális antitest az antigén több epitópját<br />
ismeri fel<br />
ugyanannak az antigénnek különböző determinánsait<br />
ismerik fel, így keresztkötésen, mint pl. precipitáción,<br />
agglutináción, ill. az Fc-függő funkciókon alapuló<br />
módszerekben (komplementaktiváció) jól alkalmazhatók.<br />
További előnyük viszonylag olcsó előállíthatóságuk,<br />
bár ha figyelembe vesszük a szükséges nagy<br />
tisztaságú antigén előállítási költségeit és a kiválasztott<br />
állatfaj költségeit, az egyes állatokból nyert szérumok<br />
ismételt minőségi vizsgálatait, hosszú távon<br />
nem biztos, hogy olcsóbb a híbridóma technikával<br />
előállított monoklonális ellenanyagok termelésénél.<br />
A poliklonális reagensek hátránya továbbá, hogy rokon<br />
szerkezetű antigénekkel gyakori a keresztreakció,<br />
amit jelentős titerveszteség árán, affinitás-előtisztítással<br />
lehet kiküszöbölni.<br />
Poliklonális ellenanyag előállításakor célszerű párhuzamosan<br />
több állatot immunizálni és az antigénspecifikus<br />
ellenanyagok megjelenését egyedenként<br />
követni minden oltás után. Az ellenanyagtiter változását<br />
célszerű az oltások előtt vett ún. preimmun<br />
szérumhoz hasonlítani abban a tesztrendszerben,<br />
amelyben majd az ellenanyagot alkalmazni szeretnénk.<br />
A hiperimmun savó előállításához célszerű az<br />
oltások között 3-4 hetet várni és az újraoltásokat az<br />
első oltásnál kisebb antigénmennyiséggel végezni, az<br />
affinitásérés így növelhető. Hapténekkel való immunizálásnál<br />
a teszteléshez és az immunizáláshoz célszerű<br />
a haptén molekulát más-más fehérje hordozóhoz<br />
kapcsoltan alkalmazni.<br />
Monoklonális ellenanyag előállítása<br />
Felfedezések. A hetvenes években, a myelomák<br />
felfedezése és leírása kapcsán már sikerült megállapítani,<br />
hogy ezek a sejtek egységes típusú ellenanyagot<br />
termelnek, amelyet paraproteinnnek nevezünk.
134 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
1973-ban Jerrold Schwaber ember-egér hibrid<br />
monoklonális antitest előállítási eljárást írt le, majd<br />
1975-ben César Milstein, Georges Köhler és<br />
Niels Jerne tette először közzé a monoklonális antitestek<br />
létrehozásának elvét. 1984-ben orvosi Nobel-díjat<br />
kaptak érte.<br />
Az eljárás sejtfúzión alapul, megpróbáltak egy ellenanyagot<br />
termelő B-sejtet egy myeloma-sejtvonallal<br />
egyesíteni, ez a hibridóma technológia (6-14. ábra).<br />
A fúzió célja a kétféle sejt tulajdonságainak egyesítése<br />
volt. Az adott tulajdonságú antitestet termelő B-sejtet<br />
hiába izoláljuk, sejttenyészetben nem osztódik. A<br />
myelomasejtek viszont korlátlanul osztódnak (immortalitás).<br />
Egyesítésükkel tehát egy bizonyos antitestet<br />
termelő és korlátlanul, gyorsan szaporodó, stabil<br />
sejtvonalat kaphatunk. A monoklonális antitestek<br />
termelése során egy specifikus antigénnel ismételten<br />
oltanak beltenyésztett egereket (ma már patkányt és<br />
nyulat is), így a többlépcsős immunizálással a kívánt<br />
antitestet termelő B-sejtek száma nagymértékben növelhető.<br />
Ezek feldúsulási helye a lépben és a nyirokcsomókban<br />
van. A lépből izolált lymphocytákat in<br />
vitro fuzionáltatják egy folyamatos Sp-2/0-Ag14 egér<br />
myeloma-sejtvonallal. Fontos, hogy ez a sejtvonal<br />
ugyanabból a fajból származzék, mint az immunizált<br />
állat, stabil, könnyen fenntartható, gyors szaporodóképességgel<br />
rendelkezzék, továbbá önmagában<br />
ne termeljen ellenanyagot, és rendelkezzék egy olyan<br />
enzimhiánnyal (HGPRT, hipoxantin-timidin-foszforibozil-transzferáz<br />
és TK, timidin-kináz), amelynek<br />
kihasználásával könnyen elkülöníthetők a B-sejt–<br />
myeloma hibridektől.<br />
A sejtfúziót legegyszerűbben polietilén-glikol<br />
(PEG) segítségével lehet létrehozni, amely reverzibilisen<br />
megbontja a sejtek vízburkát, így a szorosan egymás<br />
közelébe került sejtek lipidmembránjai összeolvadhatnak.<br />
A véletlenszerű sejtfúzió után a kevert<br />
sejteket szelektálni kell, HAT médium (hipoxantin,<br />
aminopterin, timidin) segítségével, amelynek jelenlétében<br />
a myelomasejtek szaporodása leáll, csak a hibrid<br />
sejtek tudnak túlélni. A sejteket 96 lyukú steril szövettenyésztő<br />
lemezeken tenyésztjük, és kb. 7–10 nappal<br />
a fúzió után a sejtek felülúszóit teszteljük antigénspecifikus<br />
antitesttermelésre egy megfelelően gyors, sok<br />
minta vizsgálatára alkalmas módszerrel (pl. ELISA,<br />
áramlási citometria stb.). Az antitesttermelő, túlélő<br />
sejtek szétválogatását a klónszelekció módszerével végezzük,<br />
amikor a sejttenyészetet 96 lyukú lemezekre<br />
tesszük ki olyan hígítással, hogy elvileg minden lyukba<br />
1 sejt kerüljön. A hibrid sejtek növekedését invert<br />
mikroszkópos vizsgálattal tudjuk ellenőrizni. Mivel<br />
ez véletlenszerű esemény, a pozitív, antitestet termelő<br />
sejtvonalakat ismételt klónszelekciónak (stabilizálás)<br />
tesszük ki mindaddig, amíg a klónozás összes sejt-<br />
6-14. ábra. Monoklonális ellenanyag (antitest) előállítása hibridómatechnikával
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
135<br />
vonala a kívánt antitestet termeli. A kiválasztott klón<br />
sejtjeit ezután egyre nagyobb tenyésztőedénybe helyezve<br />
felszaporítjuk, egy részüket dimetil-szulfoxid-<br />
(DMSO-) tartalmú tápfolyadékban lefagyasztva tároljuk,<br />
másik részüket antitesttermelésre használjuk<br />
fel. A felülúszóból nyert antitestet tovább jellemezzük<br />
izotípus, affinitás, keresztreakciók, egyes módszerekben<br />
való alkalmazhatóság, tisztíthatóság szempontjából<br />
(http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/monoclonalantibodies.html).<br />
A monoklonális ellenanyagok előnyei immunanalitikai<br />
módszerekben. A monoklonális ellenanyagok<br />
nagyfokú specificitásuk miatt alkalmasak molekulák<br />
epitópról epitópra való analízisére. Ugyanakkor<br />
a monoklonális ellenanyag – szemben a poliklonális<br />
ellenanyagokkal – nem alkalmas az egész molekula<br />
felismerésére (6-15. ábra). Előfordulhat, hogy egy<br />
monoklonális ellenanyag többféle antigén azonos<br />
epitópjait ismeri fel: ezt keresztreaktivitásnak nevezzük.<br />
Ennek a keresztreakciónak az oka lehet közös<br />
aminosavszekvencia, szénhidrát- vagy lipidoldallánc<br />
a különböző molekulákban. Az anti-CA 19-9 antitest<br />
olyan közös szénhidrátepitópot ismer fel, amely mint<br />
6-15. ábra. Ellenanyagok összehasonlítása<br />
a) Monoklonális ellenanyag: azonos specificitású ellenanyag-molekulák;<br />
egyetlen B-sejtből származó sejtvonal<br />
(sejtklón) termeli ezeket; egyetlen epitóp felismerésére képesek<br />
b) Poliklonális ellenanyag: eltérő specificitású több ellenanyag<br />
keveréke; több B-sejt-klón termékei; egy adott antigén<br />
eltérő epitópjait ismerik fel<br />
6-16. ábra. A monoklonális antitest az antigén egyetlen<br />
epitópját ismeri fel<br />
tumormarker különböző méretű és formájú molekulák<br />
mérésére alkalmas. Ugyanakkor a nagyfokú specificitás<br />
miatt a különböző monoklonális antitestekkel<br />
különbség tehető izoenzimek, fehérjeizotípusok,<br />
molekulák konformációs eltérései között. A monoklonális<br />
ellenanyagok előnye, hogy a stabil sejtklónból<br />
gyakorlatilag korlátlan mennyiségben lehet ugyanazon<br />
minőségű, egy epitóp felismerésére alkalmas,<br />
azonos izotípusú, ritkán keresztreagáló antitestet előállítani<br />
(6-16. ábra). Ezért a monoklonális ellenanyag<br />
technológia rendkívül hasznos és csaknem ideális<br />
reagenseket biztosít a klinikai laboratóriumnak az<br />
immunoassay tesztrendszerekben.<br />
A monoklonális ellenanyagok immunanalitikai<br />
felhasználásának előnyei:<br />
• A monoklonális ellenanyagok jól definiálható<br />
reagensek.<br />
• Korlátlan mennyiségben előállítható, homogén,<br />
állandó affinitású és specificitású reagensek.<br />
• Monoklonális ellenanyag előállítható nem tisztított<br />
antigénnel végzett immunizálással is.<br />
A monoklonális ellenanyagok felhasználásának korlátai:<br />
• Elégtelen precipitációs és agglutinációs reaktivitásúak,<br />
mert egyetlen monoklonális ellenanyag<br />
nem vagy csak mérsékelten tud nagy immunkomplex-kialakulást<br />
eredményezni.<br />
• Nagy, heterogén epitópokkal rendelkező antigént<br />
nehezebb egyetlen epitópjára specifikus<br />
monoklonális ellenanyaggal immunkémiailag<br />
jellemezni.<br />
Antitest előállítása rekombináns technológiával<br />
Elsőként Skerra és Pluckthun (1988) állította<br />
elő rekombináns technikával egy specifikus antitest<br />
Fv-fragmensének variábilis doménjeit E. coliban expresszáltatva.<br />
Ez a technológia tette lehetővé enzimmel<br />
fuzionáltatott kiméra antitestek előállítását. A „phage<br />
display” technológia (Winter, 1994) segítségével antitestfragmenseket<br />
állítanak elő előre meghatározott<br />
kötőspecificitással, immunizálás nélkül. Ehhez egy<br />
random antitest variábilis régió (V) gén-könyvtár<br />
(génrepertoire) kerül megalkotásra elsőként in vitro,<br />
amelyet bakteriofágban expresszáltatnak (6-17.<br />
ábra). Ebből a fágkönyvtárból az antigén segítségével<br />
ki lehet válogatni a megfelelő V-géneket expresszáló<br />
fágot, azt föl lehet szaporítani és baktériumban meg-
136 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-17. ábra. A fág-display technika ellenanyag előállítására<br />
termeltetni. A kiválasztott antitest affinitása mutációkkal<br />
tovább növelhető. Ezzel a módszerrel nagy aviditású<br />
ellenanyagokat lehet előállítani laboratóriumi<br />
felhasználásra.<br />
Ellenanyagok tisztítása<br />
Különböző mértékben tisztított ellenanyagra számos<br />
módszer alkalmazásakor szükség van. A jó hiperimmun<br />
szérumok antigénspecifikus poliklonális<br />
ellenanyag tartalma általában 0,1–1 mg/ml. Az in vitro<br />
tenyésztett hybridomák által termelt monoklonális<br />
ellenanyagok koncentrációja pedig nem több mint<br />
10–20 mg/ml.<br />
Ezeket a g-globulinok családjába tartozó fehérjéket<br />
az egyéb szérumkomponensektől, ill. a tápfolyadék<br />
egyéb elemeitől a molekula fizikai-kémiai tulajdonságai<br />
alapján kidolgozott biokémiai módszerekkel (sóval<br />
kicsapás, ioncserélő kromatográfia, gélszűrés stb.)<br />
vagy affinitáskromatográfia segítségével választhatjuk<br />
el. Ez utóbbi módszer alapja az, hogy a különböző osztályba<br />
tartozó ellenanyagok bizonyos molekulákhoz,<br />
pl. növényi lektinekhez (Mannose Binding lektin)<br />
vagy bakteriális fehérjékhez (Staphylococcus Protein<br />
A, Streptococcus Protein G, Peptostreptococcus Protein<br />
L) szelektíven kötődnek (6-3. táblázat). Ezeket a<br />
molekulákat immobilizálva (pl. Sepharose-gyöngyhöz<br />
kötve), oszlopkromatográfiával szelektíven tisztíthatók<br />
a megfelelő osztályba tartozó immunglobulinok<br />
(6-18. ábra). Ha a Sepharose-gyöngyökhöz<br />
antigént kötünk kovalensen, az immunszérumból<br />
vagy felülúszóból az antigénspecifikus ellenanyagok<br />
szelektíven izolálhatók. Az oszlop molekuláihoz kötődő<br />
antitesteket megfelelő alacsony pH-jú és ionerősségű<br />
pufferrel tudjuk eluálni. Ugyanígy fordítva<br />
is, megfelelő tisztaságú antitestet immobilizálva Sepharose-gyöngyökhöz,<br />
kis mennyiségű antigént tudunk<br />
kevert oldatból tisztítani affinitáskromatográfia<br />
segítségével (6-19. ábra).<br />
Ellenanyagok, antigének jelölése<br />
Mivel az antigén-ellenanyag immunkomplex létrejötte<br />
nem okoz minden esetben mérhető változást, ezért<br />
az immunanalitikai mérésekhez legtöbbször szükségünk<br />
van egy jelölő molekulára, amely a teszt típusától<br />
függően lehet akár az antigén, akár az ellenanyag<br />
egy jelölt változata. A jelölés annyit jelent, hogy a<br />
molekulához általában kovalensen hozzákötünk egy<br />
analitikailag jól mérhető részt. Fontos, hogy a jelölő<br />
anyag lehetőleg minél kevésbé változtassa meg az immunreagens<br />
kötődési tulajdonságait. A jelölő molekula<br />
lehet radioaktív izotóp, enzim, fluoreszcens molekula,<br />
kemilumineszcens molekula vagy mágneses<br />
nanopartikulum.
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
137<br />
6-18. ábra. Ellenanyag tisztítása Protein-G Sepharose affinitáskromatográfiával<br />
Radioizotópos jelölés<br />
Ez volt az első jelölési technika, amit az ötvenes<br />
évektől alkalmaztak az immunoassay-knél (RIA,<br />
IRMA). Az izotóp beépítése gyakorlatilag nem változtatja<br />
meg az antigén vagy ellenanyag kötődési tulajdonságait.<br />
Máig ez az egyik legérzékenyebb eljárás,<br />
de mivel drága, és különleges kezelést igényel a radioaktív<br />
izotópok miatt, mára már visszaszorult. A módszer<br />
egyik kidolgozója Rosalyn Sussman Yalow<br />
1977-ben Nobel díjat kapott az inzulin radioimmunoassay-vel<br />
való meghatározásáért.<br />
• Jelölő izotópok:<br />
– 125 I, 131 I (g-sugárzók).<br />
– 3 H, 14 C (lágy b-sugárzók)<br />
• Az eljárás hátrányai:<br />
– A hulladékok elhelyezése gond.<br />
– Korlátozott felhasználási idő.<br />
– Veszélyes anyagokat kell tárolni.<br />
– Költséges mérőberendezés szükséges.<br />
– Állandó szervezett ellenőrzésre, a dolgozók és<br />
a munkahely egészségügyi felügyeletére van<br />
szükség.<br />
6-19. ábra. Antigén tisztítása affnitáskromatográfiával<br />
• A g-sugárzó izotópos jelzés jellemzői:<br />
– Jól kidolgozott, gyors, olcsó jelölés.<br />
– Érzékeny módszer (10 –8 –10 –12 mol/l tartomány).<br />
– Viszonylag rövid felezési idő ( 125 I: 60 nap, 131 I:<br />
8 nap).
138 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-3. táblázat. Különböző fajok ellenanyagainak affinitása<br />
protein A-hoz és protein G-hez<br />
Ellenanyag<br />
Faj Protein A Protein G<br />
humán IgG 1<br />
++++ ++++<br />
humán IgG 2<br />
++++ ++++<br />
humán IgG 3<br />
- ++++<br />
humán IgG 4<br />
++++ ++++<br />
humán IgA ++ -<br />
humán IgD ++ -<br />
humán IgE ++ -<br />
humán IgM ++ -<br />
egér IgG 1<br />
+ ++<br />
egér IgG 2a<br />
++++ ++++<br />
egér IgG 2b<br />
+++ +++<br />
egér IgG 3<br />
++ +++<br />
egér IgM + / - -<br />
patkány IgG 1<br />
- +<br />
patkány IgG 2a<br />
- ++++<br />
patkány IgG 2b<br />
- ++<br />
patkány IgG 2c<br />
+ ++<br />
patkány IgM + /- -<br />
nyúl IgG ++++ +++<br />
hörcsög IgG + ++<br />
tengerimalac IgG ++++ ++<br />
szarvasmarha IgG ++ ++++<br />
birka IgG + / - ++<br />
kecske IgG + / - ++<br />
sertés IgG +++ +++<br />
csirke IgG - +<br />
Fragmensek<br />
humán Fab + +<br />
humán F(ab’) 2<br />
+ +<br />
humán scFv + -<br />
humán Fc ++ ++<br />
humán k - -<br />
humán l - -<br />
– „Lebomlási katasztrófa” – a kémiai szerkezet<br />
is nagymértékben sérül.<br />
– Kiváló minőségű számláló szükséges.<br />
• A b-sugárzó izotópos jelzés jellemzői:<br />
– Jól kidolgozott jelöléstechnika.<br />
– Érzékeny módszer (10 –8 –10 –12 mol/l tartomány).<br />
– Hosszú felezési idő ( 3 H: 12,3 év, 14 C: 5760 év).<br />
– Bonyolult és igen drága számlálóberendezést<br />
igényel.<br />
– Bonyolult és környezetszennyező vegyszeres<br />
előkészítés.<br />
– Kereskedelemi forgalomban nemigen kapható.<br />
Enzimjelölés<br />
A hetvenes években kifejlesztett technika, kevésbé<br />
érzékeny, mint a radioizotópos technika, de sokkal<br />
stabilabb jelölés, nem sugárveszélyes, nem igényel<br />
speciális egészségügyi ellenőrzést, tárolási feltételeket,<br />
ezért jobban elterjedt. Alkalmazásánál az enzimet<br />
nem közvetlenül detektáljuk, hanem annak<br />
kromogén vagy fluorogén szubsztrátját, amelyből az<br />
enzimkatalízis hatására színes termék képződik. A<br />
színreakció egyszerű fotométerrel detektálható, az<br />
abszorbanciaváltozás arányos az enzimaktivitással,<br />
amelynek mértékéből meghatározható a szilárd fázishoz<br />
kötött antigén vagy antitest mennyisége. Az<br />
enzimjelölést alkalmazó immunoassay-k legelterjedtebb<br />
formája az ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent<br />
Assay) technika, ahol egy speciális, 96 lyukú<br />
műanyag lemez mélyedéseiben (mikrotiter-tálca)<br />
végzik az immunreakciót, a lemez mélyedései (angolul<br />
well) szolgálnak küvettaként is a fotometriás mérésnél.<br />
A használt jelölő enzim leggyakrabban alkalikus<br />
foszfatáz és peroxidáz, ritkábban b-galaktozidáz<br />
vagy glükóz-oxidáz.<br />
Fluoreszcens jelölés<br />
Az ehhez alkalmazott jelölő anyagok (festékek)<br />
nagyenergiájú (kis hullámhosszú) fénnyel megvilágítva<br />
más, alacsonyabb frekvenciájú fényt bocsátanak<br />
ki. Ezt a jelenséget fluoreszcenciának nevezik. Néhány<br />
mintának önmagában is van fluoreszcens tulajdonsága,<br />
az alkotó vegyületektől függően, ezt autofluoreszcenciának<br />
nevezik.
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
139<br />
Probléma: biológiai mintákban fluoreszcens anyagok<br />
(pl. fehérjék, bilirubin, egyes vitaminok) interferálhatnak,<br />
ami háttér-fluoreszcencia, autofluoreszcencia<br />
formájában jelentkezik.<br />
Előnyei:<br />
• Az enzimjelöléssel szemben nagyobb érzékenység,<br />
kisebb mérési tartomány (10 –14 mol/l vs.<br />
10 –8 mol/l).<br />
• Nagyon érzékeny és segítségével kis molekulák<br />
is kimutathatók, ezért elterjedt a <strong>modern</strong> biológiai<br />
kutatásokban<br />
Sok különféle fluoreszcens jelölőfesték létezik, pl.<br />
fluoreszcein, rodamin B, lantanida kelátkomplexek,<br />
umbelliferonszármazékok.<br />
Kemilumineszcencia<br />
A gerjesztés kémiai reakcióban történik. A gerjesztett<br />
állapotú termék molekula-fénykibocsátással<br />
tér vissza alapállapotba. Általában oxidációs reakciókban<br />
fordul elő, amikor egy molekulát erős oxidálószerrel<br />
(pl. hidrogén-peroxiddal) lúgos közegben<br />
oxidálunk.<br />
Biolumineszcencia<br />
A kemilumineszcencia sajátos esete, amikor a kémiai<br />
reakciót enzim katalizálja. Ilyen a szentjánosbogárban<br />
lejátszódó reakció, amelyet a luciferáz enzim<br />
katalizál:<br />
luciferin + oxigén = oxiluciferin + foton<br />
Jellemzői:<br />
• Érzékenyebb, mint a fluoreszcens módszerek,<br />
jelenleg az egyik legérzékenyebb jelölés.<br />
• Probléma, hogy a szennyeződések és a biológiai<br />
mátrix zavarhatja a mért jelet.<br />
• Jelölő anyagok: luminol, izoluminol, akridínium-észterek<br />
stb.<br />
Konjugálási módszerek<br />
A kiválasztott immunoassay sikeres működése nagymértékben<br />
függ attól, hogy a jelölő molekula (enzim,<br />
fluorofor stb.) kapcsolódása ne változtassa meg az antigén/antitest<br />
biológiai tulajdonságait (konformáció,<br />
affinitás, antigenitás stb).<br />
Glutáraldehiddel való konjugálás esetén (Avrameas,<br />
1978) a glutáraldehid aldehidcsoportjai kapcsolódnak<br />
a fehérjék aminocsoportjaihoz. Ez magas<br />
pH-n lezajló, kevert reakció, amely különböző formátumú<br />
konjugátumokat eredményez, mivel több aktív<br />
csoport kapcsolódik össze.<br />
A perjodátos módszer (Nakane, 1966) az antitestek<br />
peroxidáz enzimmel való jelölésére terjedt el, mivel<br />
szénhidrátot tartalmaz a molekula.<br />
E módszerek nem alkalmasak a molekulák térbeli<br />
konfigurációjának megtartására, ezért újabb konjugálási<br />
eljárásokat fejlesztettek ki bivalens reagensek<br />
felhasználásával, mint az m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter<br />
(MBS), ahol annak aktivált<br />
észter- és maleimidcsoportjai reagálnak –NH 2<br />
és<br />
–SH csoportokkal egyaránt, összekapcsolva azokat.<br />
N-hidroxiszukcinimid (NHS) felhasználásával a molekulák<br />
karboxicsoportjait is használhatjuk jelölésre,<br />
ami a fehérjék –NH 2<br />
csoportjaihoz kapcsol. Ez a<br />
módszer felhasználható fehérjék szilárd fázisú hordozóhoz<br />
kapcsolására is.<br />
Immunológiai alapú laboratóriumi<br />
módszerek csoportosítása<br />
• Elválasztás-technikai mérőmódszerek: affinitás-kromatográfia,<br />
immundiffúzió, immunelektroforézis.<br />
Ezek a 4. fejezetben már részletezésre<br />
kerültek.<br />
• Optikai mérőmódszerek: turbidimetria, nefelometria<br />
• Immunanalitika: immunoassay<br />
Antigén-antitest reakciókon alapuló<br />
módszerek<br />
Az antigén- és ellenanyag-molekula kölcsönhatása<br />
az antigénkötő hely és a megfelelő epitóp kapcsolódásán<br />
alapul, amelyet elsődleges kölcsönhatásnak<br />
nevezünk. Bivalens vagy polivalens antigének két<br />
vagy több antitest összekapcsolódását eredményezhetik,<br />
ami az Fc-részek interakciójához vezethet. Az<br />
így kialakuló másodlagos kölcsönhatások az antigén-antitest<br />
között kialakuló térhálószerkezet, vagyis<br />
immunkomplex keletkezéséhez vezetnek. Ezek általában<br />
az oldatból kiválva az antigén természetétől
140 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
függően precipitálódnak vagy agglutinálódnak. Az in<br />
vitro immunkomplex-képződés számos immunológiai<br />
módszer alapja, így a laboratóriumi gyakorlatban<br />
igen elterjedt.<br />
Precipitáción alapuló eljárások<br />
6-20. ábra. Heidelberg-görbe. Az antigén-antitest reakcióban<br />
képződő immunkomplex keletkezésének jellemzői<br />
Egy oldott polivalens antigénmolekula és az ellenanyag<br />
kölcsönhatása precipitátum képződéséhez vezethet,<br />
ha a két komponens megfelelő arányban van<br />
jelen. A reakcióban a komponensek optimális kapcsolódásához<br />
azok megfelelő aránya, a közegben<br />
fennálló megfelelő pH, ionerősség és hőmérséklet<br />
szükséges, valamint fontos az ellenanyag affinitása és<br />
aviditása is. A végleges térháló kialakulása optimális<br />
tényezők jelenlétében is hosszabb ideig tart (30–120<br />
perc). Azonos antigénmennyiséghez növekvő ellenanyag-mennyiséget<br />
adva, vagy fordítva, állandó antitestkoncentrációhoz<br />
növekvő antigénmennyiséget<br />
adva ún. precipitációs görbét írhatunk le, ez jellegzetesen<br />
Gauss-görbe alakú (6-20. ábra), és Heidelberg<br />
írta le 1935-ben. A jellegzetesen 3 szakaszra osztható<br />
függvény segítségével mennyiségileg meghatározható<br />
az antigén : antitest arány. A görbe első szakaszára<br />
jellemző az antitesttúlsúly, amikor a precipitátumtól<br />
elválasztott felülúszóban szabad antitest mutatható<br />
ki. Tovább növelve a hozzáadott antigén mennyiségét<br />
egyre több és nagyobb térháló képződik, elérve az ún.<br />
ekvivalenciazónát, ahol szabad antigén és szabad antitest<br />
nem található. A görbe harmadik szakaszában<br />
antigéntúlsúly jön létre, amikor a precipitátum menynyisége<br />
újra csökken. Valamely analit meghatározásához<br />
optimalizálni kell azt az antitestkoncentrációt,<br />
amellyel az ekvivalenciazónában tudunk mérni egy<br />
molekulát dinamikus határok között.<br />
Immunprecipitátumokat oldatban a nefelometria<br />
és turbidimetria segítségével, gélben immundiffúziós<br />
eljárások segítségével tudunk festés után vagy UV<br />
fényben meghatározni. A módszer előnye a specificitás<br />
és az egyszerűség, hátránya a viszonylag alacsony<br />
szenzitivitás, amely 0,1–0,5 mg/dL között mozog. Ez<br />
a szenzitivitás ugyanakkor elégséges a fő szérumkomponensek<br />
mennyiségi meghatározásához.<br />
Precipitációs módszerek:<br />
• Kvalitatív precipitációs módszerek<br />
– Egyszerű immundiffúzió (Williams, 1970).<br />
– Kettős immundiffúzió (Garvey, 1977).<br />
– Kétdimenziós immundiffúzió (Williams,<br />
1970).<br />
– Elektroimmunodiffúzió (Ritzmann, 1975.<br />
– Immunoelektroforézis (Rose, 1973).<br />
• 2. Szemikvantitatív precipitációs módszerek<br />
– Egyszerű, radiális immundiffúzió (Fahey,<br />
1965; Mancini, 1965).<br />
– Egydimenziós elektroimmundiffúzió (Axelsen,<br />
1975) („rocket”-elektroforézis).<br />
• 3. Kvantitatív precipitációs módszerek<br />
– Nefelometria (Ritchie, 1978).<br />
– Turbidimetria.<br />
Nefelometria és turbidimetria<br />
E mérőmódszereket nagyobb partikulumok koncentrációjának<br />
mérésére használjuk (mint antigén-antitest<br />
komplex, micropartikulumok stb.),<br />
amelyeket méretük miatt nem tudunk abszorpciós<br />
spektfotometriával vizsgálni. A nefelometria elve,<br />
hogy a mintán áthaladó fény különböző irányban<br />
történő szóródását mérjük, a kapott gyenge optikai<br />
jel felerősítésével. Ezzel ellentétben a turbidimetriánál<br />
a mintán áthaladó fény elnyelődését detektáljuk,<br />
vagyis a fényintenzitás-csökkenést.<br />
Tehát a nefelometria és a turbidimetria egy szuszpenzióban<br />
keletkezett részecskék okozta fénysugárzás<br />
szóródásának mérésén alapul (6-21., 6-22., 6-23.<br />
ábra). Amikor egy párhuzamos fénysugár a szuszpenzióban<br />
egy részecskéhez ér, a fény egy része elnye-
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
141<br />
lődik vagy reflektálódik, szóródik, a nagyobbik része<br />
viszont áthalad a mintán. Egy adott oldat részecskéinek<br />
fényszórását mérjük a nefelometriában. A fény<br />
hullámhosszától függően 3 különböző fényszóródás<br />
jöhet létre:<br />
• Ha a fény hullámhossza (λ) sokkal nagyobb,<br />
mint a részecske átmérője, akkor a fény szóródása<br />
szimmetrikus a részecske körül. A legkisebb<br />
fényszóródás a beeső fénysugárra 90°-os<br />
szögben mérhető.<br />
• Ha a fény hullámhossza jóval kisebb a részecske<br />
átmérőjénél, a fény előrefelé szóródása romlik a<br />
hátrafelé szóródásnak köszönhetően (Mieteória).<br />
• Ha a hullámhossz nagyrészt megegyezik a<br />
részecske méretével, nagyobb az előrefelé történő<br />
fényszóródás, mint más irányokba, amit a<br />
Rayleigh–Debye teória ír le.<br />
6-21. ábra. A nefelometria mérési elve<br />
6-23. ábra. A nefelometria és a turbidimetria optikai részei<br />
Mivel az antigén-antitest komplexek átmérője a 250–<br />
1500 nm tartományba esik, a nefelometriában használt<br />
320–650 nm-es fénysugár főként előrefelé szóródik<br />
(Rayleigh–Debye típus).<br />
Nefelométer<br />
Egy tipikus nefelométer részei: fényforrás, kollimátor,<br />
monokromátor, mintatartó küvetta, szórt<br />
fény csapda és fotodetektor. A részecskék által szórt<br />
fényt tipikusan a küvettából kijövő fényre 15–90°-os<br />
szögben detektáljuk. A megvilágító lézerfény általában<br />
kisteljesítményű hélium-neon lézerből származik,<br />
amely koherens, monokromatikus (632,8 nm<br />
hullámhosszúságú) és polarizált. A biológiai anyagok<br />
önmagukban ezen a hullámhosszon nem mutatnak<br />
elnyelődést. A nefelometria a turbidimetriánál jóval<br />
érzékenyebb módszer, mivel nem a fényszórással arányos<br />
fényintenzitás-csökkenés mérését, hanem magának<br />
a szórt fénynek a mérését jelenti.<br />
Turbidimetria<br />
Valamely részecske képződése következtében egy<br />
áthaladó fénynyaláb intenzitásának csökkenését méri<br />
a turbidimetria. A szuszpenzióban abszorbeált fény<br />
arányos a minta koncentrációjával és a részecskemérettel.<br />
A nagy érzékenységű fotodetektorok alkalmazásával<br />
a látható fény kis intenzitásváltozásai is detektálhatók,<br />
így a módszer érzékenysége megközelíti a<br />
nefelometriáét.<br />
Agglutináción alapuló módszerek<br />
6-22. ábra. A nefelometria elve<br />
1. bejövő fény; 2. nyílás; 3. reakciós lombik; 4. fénydetektor<br />
A folyamat abban különbözik a precipitációtól, hogy<br />
az antigén vagy antitest nem oldott állapotban, hanem<br />
részecskék (sejtek, vörösvérsejtek, baktériumok<br />
vagy partikulumok) felszínéhez kötve helyezkedik el.
142 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
Így az antigénnel kapcsolódó ellenanyag méretében<br />
és valenciájában is különbség van: általában az IgM<br />
izotípusú ellenanyagok agglutinálnak jól. A dimer<br />
szerkezetű IgA szintén jobb agglutinin, mint az IgG.<br />
Az agglutináció úgy jön létre, hogy a két vagy több<br />
valenciával rendelkező antitest egyik antigénkötő<br />
helye az egyik, a másik antigénkötő helye egy másik<br />
részecske felszínén elhelyezkedő epitóphoz kapcsolódik.<br />
Az agglutináció mértéke ugyanolyan függvénynyel<br />
jellemezhető, mint a precipitáció.<br />
Agglutinációval meghatározhatunk egy mintából<br />
antitestmennyiséget, ha az antigén van a hordozó<br />
felszínéhez kapcsolva (passzív vagy direkt agglutináció).<br />
Reverz agglutinációról beszélünk, ha a megfelelő<br />
antitest van a partikulumhoz hozzákötve, és segítségével<br />
szolubilis antigént mérünk egy mintából. Kis<br />
molekulák, amelyek csak egy kötőhelyet tartalmaznak,<br />
mint a haptének (gyógyszerek, drogok, hormonok<br />
stb.), nem tudnak keresztkötéseket létesíteni, így<br />
nem agglutinálnak. Ezt úgy lehet áthidalni, hogy a<br />
haptént immobilizáljuk a hordozóhoz, és egy agglutinációt<br />
gátló kompetíciós assay segítségével mérjük<br />
a mintában lévő haptén mennyiségét. Ezt használják<br />
ki a terhességi gyorstesztek, ahol ily módon vizeletből<br />
tudunk humán koriogonadotropint (hCG) meghatározni.<br />
Passzív agglutináció – hordozó felszínek<br />
Vörösvérsejtek, zselatinpartikulumok, liposzómák<br />
és különböző latexpartikulumok alkalmasak hordozó<br />
felszínnek. Az agglutinációban használt hordozó<br />
részecske mérete 7–0,01 μm között változik, fontos a<br />
töltése, a hidrofobicitás és a stabilitása. E nagy méretkülönbség<br />
miatt a felszínükön lejátszódó antigén-antitest<br />
reakciót nem lehet egyetlen mechanizmussal<br />
leírni. A 3–5 μm-nél nagyobb partikulumokra a<br />
Brown-mozgás jellemző, és szobahőmérsékleten nem<br />
zavarja a diffúzió. Ugyanakkor a kis latex-mikropartikulumoknál<br />
a kolloid koagulációs reakciót figyelembe<br />
kell venni. A multivalens IgM antitest 750-szer<br />
jobb agglutináló ágens, mint a bivalens IgG, mert a<br />
részecskék közti távolság 120 nm-nél kisebb kell hogy<br />
legyen az antitest hossza miatt.<br />
Hemagglutináció<br />
A vörösvérsejtet mint passzív hordozót előszeretettel<br />
alkalmazzák agglutinációs tesztekhez, mivel a<br />
reakciót egyszerű végrehajtani és nem igényel speciális<br />
felszereltséget. Főleg a fejlődő országokban terjedt<br />
el számos infekciót jelző antitestet meghatározó<br />
passzív agglutinációs eljárás, mint a Treponema pallidum,<br />
a hepatitis B vírus (HBV), a hepatitis C (HCV),<br />
a humán immundeficienciavírus (HIV-l, HIV-2) elleni<br />
antitest szerológia. Reverz agglutinációs tesztet<br />
használnak a HBV surface (felületi) antigénje, az<br />
α-fötoprotein (AFP), a humán hemoglobin székletmintából<br />
való meghatározásához. Az ilyen antigénmeghatározó<br />
gyári teszteknek a szenzitivitása közel<br />
50 ng/mL antigén (analit).<br />
Zselatinrészecske agglutinációja<br />
A hidrofil felszínű speciális, kb. 3 μm átmérőjű<br />
zselatinrészecskék előnye, hogy nincs saját antigenitásuk,<br />
viszont nagyobb a szenzitivitásuk, mint a<br />
vörösvérsejteknek, és a teszt elvégzése nem igényel<br />
pontos hőmérséklet kontrollt. Infekciós szerológiai<br />
vizsgálatoknál érzékenysége megközelíti az ELISA<br />
érzékenységét.<br />
Latexagglutináció<br />
Leginkább a terhességi gyorstesztekben terjedt el,<br />
de használják plazmafehérjék detektálására is. A latex<br />
mint szilárd fázis jó kinetikai tulajdonságú. Rövidebb<br />
immunreakciós idővel kell számolni. Kvantitatív<br />
tesztként adaptálták turbidimetriára és nefelometriára<br />
is, ahol az 1 μm-nél kisebb részecskék fényszóródást<br />
okoznak. A teszt érzékenysége tized ng/mL, míg<br />
a precipitáción alapuló immunkomplexet mérő turbidimetriás<br />
módszereké kevesebb mint 0,5 μg/mL.<br />
Ma már működnek latexpartikulum alapú automata<br />
rendszerek, amelyekkel óránként közel 200 tesztet<br />
végezhetünk el ng/mL érzékenységgel. A részecske<br />
alapú immunoassay-k előnye, hogy egyszerűek, mert<br />
nem igényelik a kötött és a szabad reaktánsok szeparálását.<br />
Immunoassay<br />
Immunoassay-típusok csoportosítása<br />
Csoportosítás a jelölő molekula szerint<br />
Minden immunoassay-ben szükség van jelölt molekulára,<br />
hogy a mintában jelen lévő antigén vagy<br />
antitest mennyiségét meg tudjuk mérni. A jelölő molekula<br />
részt vesz az immunreakcióban, így a létrejövő<br />
szignálváltozást mérhetjük a mintában. A módszer tí-
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
143<br />
6-24. ábra. Immunoassay-formátumok a jelölés helye szerint<br />
a) Indirekt immunoassay-ben és szendvicsformátumban<br />
jelölt antitestet alkalmaznak<br />
b) Kompetíciós formátumú immunoassay-ben jelölt antigént<br />
alkalmaznak<br />
6-25. ábra. RIA; radioaktív jelölést használnak<br />
pusa szerint akár az antigént, akár az ellenanyagot is<br />
jelölhetjü, mint reaktánst (6-24. ábra).<br />
Yalow és Berson 1959-ben fejlesztette ki és tette<br />
közzé a radioimmunoassay (RIA) módszert, amelyben<br />
radioizotópos jelölést használtak. Ez áttörést jelentett<br />
nyomokban jelen lévő molekulák (analitok)<br />
mennyiségi meghatározásában, és nagymértékben<br />
hozzájárult az alapkutatás és a klinikai laboratóriumi<br />
módszerek fejlődéséhez. Így pl. az inzulinbioassay-t<br />
helyettesítette az inzulin mennyiségi meghatározása<br />
RIA-val. A szolid fázisú RIA-ban lehetőség van az<br />
izotóppal jelzett kötött és szabad molekulák egyszerű<br />
elkülönítésére. A radioizotópos módszer veszélyessége<br />
miatt azonban egyre inkább előtérbe kerülnek<br />
a nem izotópos immunoassay-k, amelyek enzimet,<br />
fluorokrómot vagy más jelölő anyagot használnak az<br />
antigén-ellenanyag reakció kimutatására (6-25. ábra).<br />
Az enzimimmunoassay (EIA) a korai hetvenes<br />
években került kifejlesztésre (Engvall, 1971; Van<br />
Weeman, 1971), és hamarosan nagy népszerűségre<br />
tett szert. A jelölő enzim katalitikus aktivitásának<br />
turnovere szerint felerősíti a jelet. Az egyre újabb, érzékenyebb<br />
és jobb kromogének, fluorofórok és kemilumineszcens<br />
molekulák megjelenésével a rendelkezésre<br />
álló szubsztrátok köre lehetővé tette a módszer<br />
szenzitivitásának növelését. A kiválasztott szubsztráttól<br />
függően beszélünk fluoreszcens enzimimmunoassay-ről<br />
vagy kemilumineszcens enzimimmunoassay-ről<br />
(Thorpe, 1984).<br />
A fluoreszcens immunoassay-k (FIA) fluorofórokat<br />
használnak jelölő molekulának. A fluorofórokat megfelelő<br />
hullámhosszúságú fényenergiával kell aktiválni<br />
(excitáció), hogy mérhető fényemissziót adjanak. A<br />
FIA szenzitivitása kissé alacsonyabb az EIA-énál a biológiai<br />
minták jelentős háttér-fluoreszcenciája miatt.<br />
A 100 ns tartamú késleltetett fluoreszcencia emissziós<br />
fluorofórok az időeltolódásos FIA-ban használhatók.<br />
Az új típusú fluorofórok bevezetése nagymértékben<br />
javított a FIA érzékenységi tartományán, mivel olyan<br />
hullámhosszon működnek, ahol eltűnt a háttérzaj. A<br />
fejlett műszeres háttér bevezetése oly mértékben növelte<br />
a FIA érzékenységét, hogy extrém kis koncentrációk<br />
is mérhetőek vele (10 –15 mol/l).<br />
Kemilumineszcens immunoassay-ben mesterséges<br />
vagy a természetben előforduló (aequorin) kemilumineszcens<br />
jelölő molekulát használunk. A kemilumineszcens<br />
molekula nem fény-, hanem fizikai (pl.<br />
elektromos) gerjesztő energiát igényel ahhoz, hogy<br />
fényemisszót generáljon. Az oxidoredukciós elven<br />
alapuló reakcióban nincs lehetőség amplifikálásra,<br />
mivel egy foton generálódik a molekula alapállapotba<br />
történő visszatérésekor. Számos új, egyre jobb molekula<br />
került felhasználásra az elektrokemilumineszcens<br />
immunoassay-ben. A tribifenilek fémkelátjai folyamatosan<br />
emittálnak fényt egy oxidoredukciós reakcióban<br />
elektródok felszíné. (Blackburn, 1991).<br />
Az eddig említett különböző eljárásoknál a módszer<br />
érzékenységét nagymértékben meghatározza<br />
a reaktánsok asszociációs konstansa (affinitás vagy<br />
aviditás), a jelölő molekula jelintenzitása és a jel : zaj<br />
arány is.<br />
A 125 I izotópok esetében 7 millió molekula generál<br />
1 foton/s jelet, míg enzimek kemilumineszcens<br />
szubsztrátjait alkalmazva 6 nagyságrenddel lehet növelni<br />
a teszt érzékenységét. Ez az enzimek katalitikus<br />
aktivitása miatti amplifikációnak köszönhető.<br />
A mérés elve szerinti csoportosítás<br />
Az immunoassay-technológiák különböző formátumaiban<br />
az antigén-ellenanyag komplex különbözőképpen<br />
kerül elválasztásra a szabad (jelölt) reaktáns-
144 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
tól. Ezek alapján e módszerek 4 kategóriára oszthatók:<br />
nem-kompetitív és kompetitív immunoassay-k, valamint<br />
homogén és heterogén immunoassay-k.<br />
Kompetitív immunoassay-forma<br />
Ebben az immunoassay-formátumban a mintában<br />
lévő mérendő molekula, vagyis a jelöletlen analit<br />
(legtöbbször az antigén) verseng a jelölt antigénnel az<br />
antitest kötőhelyeiért. A jelöletlen antigén elfoglalja<br />
az antitest kötőhelyeit, így az utólag a mintához adott<br />
jelölt antigén nem tud az antitesthez kapcsolódni. Így<br />
a kompetitív immunoassay-ben a mért kisebb jel azt<br />
jelenti, hogy több jelöletlen antigén van a mintában.<br />
A kompetitív formában tehát az antigén mennyisége<br />
fordított arányosságot mutat a mért jellel (6-26. ábra).<br />
Az egylépéses kompetitív formában mind a jelölt<br />
antigén, mind a mintában lévő antigén egyszerre vetélkednek<br />
a kismennyiségű antitest kötőhelyiért.<br />
A kétlépéses kompetíciós formában az antitest<br />
mennyisége többletben van az antigén koncentrációjához<br />
képest. Az antitestet mint reagenst először a<br />
vizsgálati mintában lévő antigénnel inkubáljuk, majd<br />
a második lépésben adjuk hozzá a jelölt antigént. A<br />
kétlépéses kompetitív assay forma nagyságrendekkel<br />
nagyobb szenzitivitású, mint az egylépéses forma.<br />
Nem kompetitív (szendvics) módszer<br />
A nem kompetitív tesztformátumok nyújtják általában<br />
a legnagyobb szenzitivitást, specificitást;<br />
és leginkább olyan kritikus paraméterek mérésére<br />
használjuk, mint a cardialis és a hepatitismarkerek.<br />
Ezt a nagyérzékenységű formátumot „szendvics”-assay-nek<br />
nevezzük, mert a mérendő molekula (analit)<br />
két specifikus antitest (reagens) közé kötődik be (6-<br />
27. ábra). Ezt a formátumot is alkalmazhatjuk egyvagy<br />
kétlépéses formában is. A kétlépéses formában<br />
egy mosási lépéssel elkülönítjük az összekapcsolódott<br />
szendvicskomplexet a fölöslegben maradt jelölt reagenstől,<br />
ill. más zavaró molekuláktól. Ez a kétlépéses<br />
nem kompetitív formátum biztosítja a legnagyobb<br />
specificitást és szenzitivitást az itt tárgyalt teszttípusok<br />
közül. A nem kompetitív módszernél a jelölt reagens<br />
(általában antitest) mennyisége egyenesen arányos<br />
a mintában lévő antigén mennyiségével. Ezt egy<br />
dózis–hatás görbén ábrázolhatjuk, ahol az x tengelyen<br />
az antigén koncentrációját, az y tengelyen a hatást ábrázoljuk,<br />
amely jelen esetben a mért jel erőssége. Így<br />
minél több antigén van jelen, annál több jelölt antitest<br />
kötődik hozzá, ami egyenes arányosságot jelent.<br />
Homogén és heterogén immunoassay-módszerek<br />
Azokat az immunoassay módszereket, amelyekben<br />
a kötött antigén-antitest komplex szeparálása szükséges<br />
a szabad jelölt reagenstől, heterogén immunoassay-nek<br />
nevezzük. Azokat a módszereket, amelyekben<br />
nem szükséges szeparálási lépést közbeiktatni,<br />
homogén immunoassay-nek hívjuk (6-28. ábra). Ho-<br />
Ab 1 Ab 2<br />
Ag<br />
6-26. ábra. Kompetíciós assay<br />
a) Fordított arány a jel és az analit koncentrációja között<br />
b) Egylépéses kompetíciós immunoassay<br />
c) Kétlépéses kompetíciós immunoassay<br />
6-27. ábra. Nem kompetitív szendvics-assay<br />
a) Egyenes arány a jel és az antigén koncentrációja között<br />
b) Szendvicsassay; az antitestek az antigén két epitópját<br />
ismerik fel (Ab 1 = befogó antitest, Ab 2 = jelölt antitest,<br />
Ag = antigén)
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
145<br />
mogén módszereket alkalmazunk kis molekulák,<br />
mint gyógyszerek, drogmaradványok kimutatására,<br />
pl. EMIT alkalmazásakor. Mivel a homogén módszereknél<br />
nincs szükség az antitest jelölt antigénkomplex<br />
(Ab-Ag*) elkülönítésére a szabad jelölt antigéntől<br />
(Ag*), ezek a technikák sokkal egyszerűbbek és gyorsabb<br />
a kivitelezésük, mint a heterogén módszereké,<br />
amelyekben a két komponens elkülönítésére gyakran<br />
egy szilárd fázisú hordozót alkalmazunk, pl. a mágneses<br />
partikulumokat vagy műanyag gyöngyöket.<br />
A szilárd fázis (hordozó) jellemzői heterogén immunoassay-kben.<br />
Minden heterogén immunoassay-ben<br />
legalább egy szeparálási lépést szükséges beiktatni,<br />
amelyben a szilárd fázishoz kötött immunkomplexet<br />
elkülönítjük a szabadon maradt jelölt reaktánstól.<br />
Az antigén vagy antitest szolid fázishoz kapcsolására<br />
alkalmas a kovalens kötés vagy egyszerű fizikai abszorpció,<br />
nem kovalens interakciók. Szilárd fázisként<br />
alkalmazhatunk agaróz- vagy poliakrilamidgél-partikulumokat,<br />
műanyag mikrogyöngyöket (beads),<br />
polisztirén, ill. polipropilén csöveket, mikrotitráló<br />
lemezeket vagy vas-oxiddal fedett partikulumokat,<br />
amelyeket mágneses térben szeparálhatunk.<br />
A műanyag csövek vagy mikrotitráló lemez mélyedéseiben<br />
a nagy felület miatt az immunreakció gyorsítására<br />
célszerű a reakcióelegyet rázni.<br />
A pro zóna vagy „hook”-effektus, amelyet az analit<br />
magas koncentrációja okozhat, akkor áll elő, ha az<br />
egylépéses módszerben kevés az alkalmazott szilárd<br />
fázishoz kötött vagy jelölt antitest. Mikrotiterlemezen<br />
vagy -csíkon gyakran tapasztalható ún. „széli effektus”,<br />
ami az immunreakció kimutatására használt enzim<br />
hőmérsékletfüggő működésének köszönhető. A<br />
lemez széle és közepe között akár 2 °C hőmérsékleti<br />
különbség is lehet. A szilárd fázis alakja és mérete<br />
is fontos tényező az antigén- vagy antitest befogó<br />
képesség és az immunreakció kinetikája szempontjából.<br />
Szférikus, 3 mm nagyságú, kis mágneses vagy<br />
latexpartikulumok a legideálisabb szilárd hordozófelszínek,<br />
amelyek a legjobb reakcióidőt biztosítják.<br />
Módszerek<br />
Radioimmunoassay (RIA)<br />
Az immunoassay-k gyakorlati felhasználása a hatvanas<br />
években kezdődött a radioimmunoassay (RIA)<br />
elvének alkalmazásával, amely forradalmasította a<br />
kutatást és számos területen a klinikai gyakorlatot is,<br />
pl. az endokrinológiában, a véradásban, az allergiadiagnosztikában.<br />
A RIA radioaktív izotópot használ<br />
jelölő molekulaként, és a mért radioaktivitás arányos<br />
a mintában lévő analit mennyiségével. Két fő RIA-típust<br />
alkalmazunk, a kompetitív és a nem kompetitív<br />
heterogén formátumot, amelyek mosási lépést igényelnek<br />
a kötött és szabad jelölt molekulák elkülönítésére.<br />
A nem kompetitív szendvics formában a jel<br />
egyenesen arányos a mintában lévő antigén mennyiségével,<br />
a kompetitív formában viszont a mintában<br />
lévő antigén fordítottan arányos a jelintenzitással (6-<br />
29., 6-30., 6-31. ábra). RIA-t ma is használnak nagy<br />
szenzitivitása miatt, különösen nagyon kis mennyiségű<br />
analit meghatározására. Nagy affinitású antitestet<br />
használva (K 0<br />
= 10 8 –10 11 M −1 ) néhány pg-nyi (10 −12<br />
g) antigén is kimutatható a mintából. Ugyanakkor a<br />
6-28. ábra. Homogén és<br />
heterogén immunoassay
146 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-29. ábra. Kompetitív RIA; második antitestet használnak a kötött és a szabad frakció elválasztására (jelölés 125 jóddal)<br />
radioaktív anyag bonyolult kezelése, tárolása miatt<br />
a klinikai laboratóriumok ma már kevésbé gyakran<br />
alkalmazzák, mint a különböző típusú enzimimmunoassay-ket<br />
(EIA).<br />
A radioaktív sugárzást, mint a 125 jód-izotóp g-sugárzását<br />
beütés/perc (counts per minute, CPM)<br />
egységekben mérjük g-szcintillációs számláló segítségével.<br />
A kiválasztott radioaktív jelölő molekula<br />
meglehetősen befolyásolja a vizsgálat menetét. A legnépszerűbb<br />
125 jód-izotóp esetén a beütésszám detektálása<br />
viszonylag rövid ideig tart, de rövid féléletideje<br />
miatt a jelölt anyagnak rövid a felhasználhatósági ide-<br />
6-30. ábra. Kompetitív RIA; az elsődleges antitest szilárd fázishoz van kötve (jelölés 125 jóddal)
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
147<br />
6-31. ábra. Szendvics-RIA; immunoradiometrikus assay, a befogó antitest a szilárd fázishoz van kötve (jelölés 125 jóddal)<br />
je. Ugyanakkor a trícium- ( 3 H-) jelölésnél hosszabb<br />
mérési idő szükséges, ami megnöveli a vizsgálat kivitelezésének<br />
időtartamát. Ma a legtöbb RIA-ban 125 jód<br />
jelölést használnak, egyrészt az egyszerű kapcsolási<br />
technika miatt, másrészt nem változtatja meg a reaktáns<br />
biológiai aktivitását. A legáltalánosabban kloramin-T<br />
(Hunter, 1962) módszert használják, mely a<br />
fehérjék tirozincsoportjaihoz köti a jódizotópot. Az<br />
enzimekkel ellentétben az izotópjelölés nem zavarja<br />
még a kis molekulák (haptének) antigenitását sem,<br />
mert nem okoz sztérikus gátlást.<br />
A kompetitív RIA-módszer elve (6-32., 6-33. ábra).<br />
• Összemérjük a következőket:<br />
– A 125 I vagy 131 I-el jelzett radioaktív antigént<br />
(„meleg” antigén)<br />
– Az antigénre specifikus antitestet szolid fázishoz<br />
kapcsoltan<br />
• Ismert mennyiségű, jelöletlen („cold”) antigént<br />
adunk a mintákhoz (standard sor), amely vetélkedik<br />
az antitest kötőhelyeiért.<br />
• Növekvő koncentrációjú jelöletlen antigén<br />
növekvő mennyiségű radioaktív antigént szorít<br />
le az antitest kötőhelyeiről.<br />
• Az antitesthez kötött antigént elválasztjuk a szabad<br />
antigéntől, és az immunkomplex radioaktivitását<br />
mérjük.<br />
• Ezen eredményekből a készülék komputerprogramja<br />
kalibrációs görbét szerkeszt.<br />
• Az ismeretlen mintákat párhuzamosan mérjük.<br />
• A minták antigénkoncentrációját a program a<br />
kalibrációs görbére illesztve meghatározza (lásd<br />
6-29. ábra).<br />
A szendvics RIA-módszer elve<br />
Az immunoradiometrikus assay (IRMA) a szendvics<br />
formátumot használja antigénmérésre (lásd 6-31.<br />
ábra). Ez a módszer a nagy specificitású monoklonális<br />
ellenanyagok előállítása óta vált népszerűvé olyan<br />
molekulák mérésére, amelyek legalább két epitóppal<br />
rendelkeznek. A szendvics formátumban antitestfölösleget<br />
alkalmazunk és az érzékenysége nagyobb,<br />
mint a kompetíciós módszereké. A szilárd fázishoz<br />
kötött első ellenanyag (capture antibody) mint be-
148 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
fogó ellenanyag a mintából megköti az antigént. Ezt<br />
követően mosási lépés után adjuk a mintához a második,<br />
jelölt antitestet, amely kapcsolódik a szilárd<br />
fázishoz kötődött antigénhez. A szabad, jelölt reaktáns<br />
mosási lépéssel való eltávolítása után mérjük az<br />
immunkomplex radioaktivitását. A mérés során nem<br />
jöhet létre interferencia, mivel a két monoklonális<br />
antitest az antigén két különböző epitópját ismeri fel.<br />
6-32. ábra. ELISA-formátumok (http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html)<br />
6-33. ábra. ELISA-formátumok<br />
a) Szendvics-ELISA<br />
b) Kompetitív ELISA
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
149<br />
Ezért a két antitestet egyszerre is össze lehet keverni<br />
a mintával és egy mosási lépés után mérni a szilárd<br />
hordozóhoz kötődött immunkomplex radioaktivitását.<br />
A szendvics-assay formátum érzékenysége nagy.<br />
Példaként a thyroideastimuláló hormon (TSH) immunoradiometrikus<br />
meghatározásának szenzitivitása<br />
a 0,07 μU/mL alatt van, míg a konvencionális,<br />
radioaktív antigént alkalmazó assay érzékenysége 0,7<br />
μU/mL.<br />
A kötött és szabad jelölt molekula eltávolításának<br />
lehetőségei:<br />
• Egy második antitesttel precipitálni az antigén-antitest<br />
komplexet. Ha pl. az első ellenanyagot<br />
egérben termelték, akkor egy anti-egér IgG<br />
hozzáadásával (lásd 6-29. ábra).<br />
• Az antigénspecifikus antitestet a tesztcső falához<br />
kötjük.<br />
• Az antigénspecifikus antitestet egy részecskéhez<br />
kötjük, pl. Sephadex gyöngyhöz. Ebben az esetben<br />
a tesztcső centrifugálásával különítjük el a<br />
kötött (pellet) és szabad (felülúszó) jelölt molekulát.<br />
Enzimimmunoassay (EIA)<br />
Az enzimjelölést alkalmazó kvantitatív immunoassay-k<br />
a radioizotópos módszerek alternatíváiként kerültek<br />
kifejlesztésre a hetvenes évek elején (Engvall,<br />
1971; Van Weeman, 1971). A legelterjedtebb közülük<br />
az enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA),<br />
az EIA és az enzyme-multiplied immunoassay technique<br />
(EMIT). A heterogén EIA-k alapvetően hasonlítanak<br />
a RIA-hoz, azzal a különbséggel, hogy enzimjelölést<br />
alkalmazunk.<br />
Az enzimjelölés lehetővé teszi a homogén EIA-k<br />
kifejlesztését, elhagyva az amúgy szükséges mosási<br />
lépéseket. Az egyre innovatívabb EIA formátumok<br />
kifejlesztése különböző szenzitivitású, pontosságú,<br />
bonyolultságú és különböző ideig tartó módszerekhez<br />
vezetett (lásd 6-32. ábra).<br />
Heterogén EIA<br />
A radioaktív detektáláshoz képest itt szükséges egy<br />
másodlagos reakciót elvégezni, hogy az enzim katalitikus<br />
reakcióját láthatóvá tegyük. Az enzim szubsztrátjainak<br />
egyre bővülő köre lehetővé tesz fotometriás,<br />
fluorimetriás és kemilumineszcens detektálási módot.<br />
Szilárd fázist használunk a kötött és szabad konjugátumok<br />
elkülönítésére, ez lehet mikrotitráló lemez<br />
mélyedése, műanyag beadek vagy csövek felszíne,<br />
mágneses partikulumok vagy latexfilterek. A különféle<br />
heterogén EIA-kban leggyakrabban alkalmazott<br />
enzimek: peroxidáz (PO), alkalikus foszfatáz, β-galaktozidáz,<br />
glükóz-oxidáz, ureáz és kataláz. Az enzimmel<br />
elérhető érzékenységet az enzim turnovere és<br />
a jel mérési módszere határozza meg, közülük a kemiluminometriás<br />
detektálás a legérzékenyebb.<br />
A heterogén EIA formátuma hasonlít a RIA-ra,<br />
ugyanúgy lehet kompetitív és nem kompetitív forma.<br />
A kompetitív módszer (analittúlsúly) antigén-enzim<br />
konjugátumot használ, míg a nem kompetitív teszt<br />
(reaktánsfelesleg) lehet kétoldalú immunometrikus<br />
szendvics assay és indirekt módszer antitestmérésre<br />
(lásd 6-33. ábra). Az immunometriás szendvics<br />
tesztformátum nagyon elterjedt olyan antigének<br />
meghatározására, mint hormonok, tumormarkerek,<br />
plazmaproteinek és fertőző ágensek. Indirekt mérési<br />
módszert fejlesztettek antitestmérésekre, mint az<br />
infekciós szerológia (pl. anti-HIV, HBV, HCV IgG-<br />
/A/M)) és az autoantitest-meghatározás.<br />
Színreakción alapuló (kolorimetrikus) EIA<br />
Ebben az assay-formátumban az enzimreakciót<br />
kromogén szubsztrát hozzáadásával végezzük, amely<br />
az enzim katalitikus reakció eredményeként színes<br />
termékké alakul. A kromogén színreakcióját, azaz op-<br />
6-34. ábra. Indirekt szendvics-ELISA<br />
Lépések:<br />
1. A lemezt a befogó antitesttel érzékenyítik<br />
2. A mintában lévő antigén kötődik a befogó antitesthez<br />
3. A detektáló antitest kötődik az antigén egy másik epitópjához<br />
4. Enzimmel jelölt másodlagos antitest kötődik a detektáló<br />
antitesthez<br />
5. Szubsztrát hozzáadása színreakciót eredményez
150 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-35. ábra. ELISPOT<br />
1. Antihumán IFNy-val bevont nitrocellulózfilter a vályú alján<br />
2. IFNy-t termelő stimulált sejtek<br />
3. A szekretált IFNy a befogó antitesthez kötődik<br />
4. A spotokat precipitáló szubsztráttal előhívják<br />
5. AP/HRPO enzimmel konjugált riporter antitesttel detektálják a lekötődött IFNy-t<br />
6. A sejteket és a nem kötődő fehérjéket lemossák<br />
tikai denzitását (OD) spektrofotométerrel detektáljuk<br />
(lásd 6-33. ábra; 6-34. ábra). Különböző készülékek<br />
állnak rendelkezésre a színreakció mérésére, csövekben<br />
vagy mikrotitráló lemezek mélyedéseiben a manuális<br />
módozattól a teljes automatizáltságig. Ha az<br />
enzimmel jelzett immunreakciót nitrocellulóz- vagy<br />
egyéb membránon (ELISPOT, Dot blot, Western<br />
blot) végezzük (6-35. ábra), oldhatatlan szubsztrátot<br />
használunk (6-4. táblázat). A terhességi gyorstesztek<br />
ezen az elven alapulnak, mert a szilárd hordozóra az<br />
enzimreakció eredményeként lerakódó színes termék<br />
szemmel is leolvasható.<br />
Elvben a fényabszorbancia mérése a 0 és 3,0 A<br />
közötti tartományban mozoghat, ezért azon analitoknak<br />
a meghatározása, amelyek széles dinamikus<br />
tartományban vannak jelen, problémás lehet annak<br />
ellenére, hogy fölöslegben alkalmazzuk a konjugátumot<br />
és nagy kötőkapacitású hordozót alkalmazunk a<br />
szendvics EIA-hoz. Ishikawa (1989) kifejlesztett egy<br />
ultraszenzitív EIA-t, amely képes 3 fmol specifikus<br />
IgG antitest mérésére. Ahhoz, hogy ezt a szenzitivitást<br />
elérje, számos bonyolult lépés szükséges, mint<br />
pl. az immunkomplex áthelyezése egyik hordozóról a<br />
másikra, hogy csökkentse a háttér jelet.<br />
Fluoreszcens EIA<br />
Az előzőktől abban különbözik, hogy az enzim egy<br />
fluoreszcens szubsztrátot bont, amely ennek eredményeként<br />
fluorofórrá alakul. A fluorofór megfelelő<br />
hullámhosszúságú fénnyel való gerjesztéssel karakterisztikus<br />
hullámhosszúságú fényt emittál. A mintában<br />
előforduló autofluoreszcencia növelheti a háttér<br />
jelet és csökkenti az assay szenzitivitását. Ugyanakkor<br />
a fotometriás EIA-hoz képest a fluoreszcens assay egy<br />
nagyságrenddel nagyobb jelintenzitást generál.<br />
Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA).<br />
Olyan szendvics immunoassay, amelyben az antigén-antitest<br />
komplexet szilárd hordozóhoz, ún.<br />
mikropartikulumokhoz kötjük, immobilizáljuk. A<br />
MEIA-t automatákon alkalmazzák nagy fehérjemolekulák<br />
mérésére, mint cardialis markerek, fertilitás,<br />
tumormarkerek, metabolikus fehérjék, hepatitis és<br />
pajzsmirigyfehérjék vizsgálatára (6-36., 6-37. ábra).<br />
A MEIA komponenseit egy speciális pufferben<br />
szuszpendálják:<br />
• Mikropartikulum-antitest szilárd fázis: latexgyöngyök<br />
antigénspecifikus antitesttel (befogó<br />
antitest) fedve.<br />
• Antitest-enzim konjugátum: alkalikus foszfatáz-Ig<br />
konjugátum (jelölő antitest).
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
151<br />
6-4. táblázat. Az alkalikus foszfatáz és a peroxidáz enzim tulajdonságai<br />
Enzim Szubsztrátrendszer Színreakció<br />
alkalikus<br />
foszfatáz<br />
peroxidáz<br />
Végtermék<br />
oldhatósága<br />
p-nitrofenil-foszfát (pNPP) oldható ELISA<br />
5-bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát/<br />
nitro-kék tetrazolium (BICP/NBT)<br />
gyors vörös (Fast Red)/naftanol-<br />
AS-TR-foszfát<br />
2,2’-azino-bisz(3-etilbenztiazolin-<br />
6-szulfonsav) (ABTS)<br />
o-feniléndiamin<br />
(OPD)<br />
3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin<br />
(TMB)<br />
oldhatatlan<br />
oldhatatlan<br />
oldható<br />
oldható<br />
oldható<br />
Alkalmazás<br />
immunoblotting,<br />
immunhisztológia<br />
immunoblotting,<br />
immunhisztológia<br />
ELISA<br />
ELISA<br />
ELISA<br />
o-dianizidin oldható ELISA<br />
5-aminoszalicilsav<br />
(SAS)<br />
3,3’-diaminobenzidin<br />
(DAB)<br />
3-amino-9-etilkarbazol<br />
(AEC)<br />
4-kloro-1-naftanol<br />
(4CIN)<br />
oldható<br />
oldhatatlan<br />
oldhatatlan<br />
oldhatatlan<br />
ELISA<br />
immunoblotting,<br />
immunhisztológia<br />
immunoblotting,<br />
immunhisztológia<br />
immunoblotting,<br />
immunhisztológia<br />
• Enzimszubsztrát: fluoreszcens 4-metil-umbelliferon-foszfát<br />
(MUP).<br />
6-36. ábra. Mikropartikulum enzim immunoassay (MEIA);<br />
heterogén szendvicsformátum, amelyben az immunkomplexek<br />
mikrogyöngyökön jönnek létre (MUP: 4-metil-umbelliferon-foszfát)<br />
Kemilumineszcens EIA<br />
A kemilumineszcens enzimreakció fényt generál,<br />
a biolumineszcenciához hasonlóan, és természetes<br />
szubsztrátokat használ, mint a luciferin-adenozin-trifoszfát.<br />
Az elmúlt 20 évben számos kemilumineszcens<br />
enzimszubsztrátrendszer került kifejlesztésre.<br />
A mai nagy érzékenységű rendszerek vagy valamely<br />
luminolderivátumot használnak a peroxidázhoz erősítéssel,<br />
vagy dioxetánszármazékokat az alkalikus<br />
foszfatáz enzimhez. A luminolanalógok enzimatikus<br />
oxidációja peroxidáz enzim és H 2<br />
O 2<br />
jelenlétében<br />
régóta alkalmazott módszer a rutin laboratóriumi<br />
diagnosztikában. A fenolderivátumok vagy aromás<br />
vegyületek alkalmazása mint erősítő tovább javította<br />
az assay szenzitivitását. A luminol-peroxidáz p-iodofenol<br />
mint erősítő jelenlétében a fénykibocsátás<br />
kb. 2800-szorosára növelhető egy optimalizált reak-
152 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-37. ábra. Mikropartikulum enzim immunoassay (MEIA) (MUP: 4-metil-umbelliferon-foszfát)<br />
Lépések:<br />
1. Antitesttel fedett mikropartikulum + minta keveréke együtt inkubálva<br />
2. A reakciókeveréket üvegszálmátrixra helyezik, majd mossák<br />
3. Alkalikus foszfatázzal jelölt antigénspecifikus antitest hozzáadása, kötődése<br />
4. MUP hozzáadása; a fluoreszcens termék metilumbilliferon (MU) mérése<br />
cióelegyben. Ez az assay alkalmas 0,04 μU/mL TSH<br />
meghatározására szérumban. Ugyanakkor az oxidációs<br />
reakciókkal számos faktor interferál, ami növeli<br />
a nem specifikus háttér zajt.<br />
Bronstein 1989-ben kifejlesztette az alkalikus<br />
foszfatáz enzimnek egy kemilumineszcens szubsztrátját,<br />
az AMPPD-t (dinátrium 3-(4-metilspiro-[1,2-dioxetán-3,2′-triciklo-[3.3.1.1]dekán]-4-il)<br />
fenilfoszfát), egy adamantil-dioxetán-származékot.<br />
Ennél nincs szükség egyéb hozzáadott oxidáló molekulára<br />
a kemilumineszcens fény emittálásához.<br />
Az AMPPD egy új, komplett szubsztrát, mert az<br />
adamantilcsoport stabilizálja a molekulát, a dioxetánkötés<br />
szolgál energiaforrásul, a foszforilészter az<br />
enzimbontás helye, és a fenilcsoport adja a kemilumineszcenciát,<br />
mind együtt vannak a molekulában.<br />
A foszfoészterkötés enzimatikus bontása elindítja a<br />
kémiailag indukált elektroncserélő lumineszcenciát<br />
(CIEEL). 477 nm-es hullámhossz maximummal kemilumineszcencia<br />
detektálható néhány perctől néhány<br />
óráig tartó időtartamban a szubsztrát koncentrációjától<br />
függően. E technika érzékenysége kisebb<br />
mint 10 -21 mol. Ezt a reakciót alkalmazzák teljesen<br />
automata műszereken is nagy érzékenysége és gyorsasága<br />
miatt.<br />
A kemilumineszcens mágneses immunoassay-hez<br />
(CMIA) szilárd fázisként 0,3 μm vaspartikulumokat<br />
alkalmazva nő a felszín és csökken a reakcióidő is kb.<br />
30 percre. A kemilumineszcens jel és az analit koncentrációjának<br />
összefüggése lineáris, kb. hét nagyságrend<br />
dinamikus tartományban. Egy AFP-meghatározó<br />
tesztben a CL-EIA érzékenysége kb. 10-szer<br />
nagyobb volt, mint a konvencionális RIA érzékenysége,<br />
30 pg/mL 30 pereces assay időtartammal.<br />
Homogén EIA<br />
Az enzimjelölés lehetővé teszi a hosszadalmas mérési<br />
módszerek egyszerűsítését, a mosási lépések kihagyásával<br />
a homogén típusú formátum alkalmazását,<br />
mert az enzimaktivitást könnyen lehet változtatni<br />
az antigén-antitest reakció környezeti tényezőinek<br />
módosításával. A homogén formátum ugyan kevésbé<br />
érzékeny, mint a RIA vagy a heterogén formátumok,<br />
de a komplex immunkémiai reagensek ellenére<br />
gyors, egyszerű és a szokásos készülékekre adaptálható.<br />
Minden ilyen technikánál az antigén-antitest<br />
kapcsolódása módosítja az enzimaktivitást a szubsztrát<br />
jelenlétében, amely arányos az immunreakcióval.<br />
A homogén EIA-k is feloszthatók kompetitív és nem<br />
kompetitív technikákra. A kompetitív formában az<br />
antigént jelzik vagy az enzimmel, vagy a szubsztráttal,<br />
vagy az enzim egy prosztetikus csoportjával. Ezzel<br />
ellentétben a nem kompetitív formában az antitest a<br />
jelölt molekula.<br />
A következő homogén assay-formátumok a leggyakoribbak:<br />
Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique (EMIT).<br />
Ez volt az első kifejlesztett homogén EIA. Ebben az<br />
esetben enzimmel jelölt haptént adunk a rendszerhez,<br />
mely ha a hapténspecifikus antitesthez kapcsolódik,<br />
a kötés gátolja az enzim aktivitását, mert meggátolja<br />
az ehhez szükséges konformációváltozást. Szabad
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
153<br />
haptén a standardban vagy az ismeretlen mintában<br />
vetélkedik a kötőhelyért, és leszorítja a jelölt haptén<br />
kötődését, így feloldva az enzimaktivitás gátlását. Így<br />
az enzimaktivitás egyenesen arányos a mintában lévő<br />
haptén koncentrációjával. Ez alól az elv alól kivétel a<br />
tiroxin-EMIT, ahol az antitesthez kötődés nem gátolja,<br />
hanem aktiválja az enzimet. Ezekkel a tesztekkel<br />
általában kis molekulákat, mint pl. gyógyszereket<br />
mérünk mg/L koncentrációtartományban, kivétel a<br />
digoxin-assay, amelynek érzékenysége a 0,8–2 μg/L<br />
tartományban van.<br />
Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay (SLFIA).<br />
Antigénhez kapcsolt umbelliferil-β-galaktozidot<br />
használ szubsztrátként, amelyet a β-galaktozidáz<br />
enzim bont fluoreszcens umbelliferonra. Ha a jelölt<br />
antigén a specifikus antitesthez kötődik, a β-galaktozidáz<br />
nem fér a szubsztráthoz, és azt nem tudja fluoreszcens<br />
termékké alakítani. A mintában lévő szabad<br />
antigén (analit) vetélkedik a kötőhelyekért, leszorítja<br />
a jelölt antigént, amelyet az enzim bontani tud. Így a<br />
mintában lévő antigén koncentrációja arányos a fluoreszcenciaintenzitással.<br />
Az SLFIA nem csak gyógyszerek,<br />
haptének mérésére alkalmas, hanem fehérjemolekulák<br />
detektálására is. A hátránya, hogy nincs<br />
lehetőség amplifikációra, ezért érzékenysége 10 −9 –<br />
10 −10 mol tartományba esik.<br />
Apoenzim Reaktivációs Immunoassay (ARIS). A glükóz-oxidáz<br />
apoenzim egy prosztetikus csoportjával,<br />
a flavin-adenin-dinukleotiddal (FAD) konjugált antigént<br />
használ. A mintában lévő antigén vetélkedik a<br />
mintához adott konstans mennyiségű, jelölt antigénnel<br />
az antitest kötőhelyeiért. Egyensúlyi helyzetben a szabadon<br />
maradt jelölt antigén arányos a mintában lévő<br />
antigénnel. Az apoenzimet csak a szabadon maradt jelölt<br />
antigén tudja aktiválni, így az enzimaktivitás arányos<br />
a szabadon maradt jelölt antigénnel. A tesztbe egy<br />
erősítési lépést is betettek, növelve az érzékenységét. A<br />
módszer kis molekulák mellett alkalmas nagy fehérjék<br />
mérésére is (pl. thyroid binding globulin).<br />
Enzyme Inhibitory Homogeneous Immunoassay (EI-<br />
HIA). Enzimmel konjugált antitestet és oldhatatlan<br />
szubsztrátot használ nagy antigének (analit) mérésére.<br />
A nagy fehérje kötődése a jelölt antitesthez gátolja<br />
a szilárd fázison lévő szubsztrát enzimatikus bontását.<br />
α-amiláz enzimmel jelölt antitestet használnak<br />
pl. a ferritin vagy az AFP meghatározására. A reakció<br />
igen gyorsan, kb. 10 perc alatt éri el platóját, és ferritin<br />
esetében 10–800 ng/mL, AFP esetében –5-200<br />
ng/mL érzékenységgel mér.<br />
Cloned Enzyme Donor Immunoassay (CEDIA). A rekombináns<br />
DNS technológia óta vált lehetségessé,<br />
amikor a β-galaktozidáz enzimet mint fehérjét kettévágták<br />
egy nagy polipeptidre (ez az enzimakceptor)<br />
és egy kisebb polipeptidre (enzimdonor). Az akceptor<br />
és donor enzim összekapcsolódása hozza létre<br />
az enzimatikusan aktív tetramert. Az eljárásban az<br />
antigénhez konjugálják az enzimdonort, és az antigénspecifikus<br />
antitest akadályozza meg az enzim aktív<br />
formába történő spontán összekapcsolódását. A<br />
beteg mintájában lévő antigén vetélkedik az antitest<br />
kötőhelyeiért az enzimdonorral konjugált antigénnel.<br />
Minél több a mintában a szabad antigén, annál jobban<br />
leszorítja a jelölt antigént a kötésből, annál több<br />
enzim jön létre és okoz színreakciót. Ez a rendszer<br />
alkalmas kémiai automatában végzett mérésre is.<br />
Fluoreszcens Immunoassay (FIA)<br />
Ma már a minta háttér-fluoreszcenciáját kiküszöbölő<br />
eljárások állnak rendelkezésre új szubsztrátok<br />
bevezetésével és új mérőműszerek használatával. Így<br />
a FIA ma már elterjedt hormonok, fehérjék, polipeptidek<br />
10 –15 mol/L koncentrációjú antigén meghatározására.<br />
Fontos a megfelelő fluorokróm kiválasztása (6-5.<br />
táblázat). Az ismert fluoreszcein izothiocianát esetében<br />
1 ns az excitáció és emisszió közti időtartam, miközben<br />
a ma használatos késleltetett fluoreszcenciájú<br />
molekulák (pl. europium) néhány száz ns késéssel<br />
fluoreszkálnak. Ezért alkalmasak rövid időtartamú<br />
megvilágítás után késleltetett fluoreszcenciára, amikor<br />
már a minta komponenseinek autofluoreszcenciája<br />
rég lezajlott.<br />
A különböző FIA formátumok hasonlóak az előzőkhöz,<br />
lehetnek heterogének vagy homogének, ligand-<br />
vagy antitestjelöltek, kompetitívek vagy nem<br />
kompetitívek és szilárd fázisúak vagy nem.<br />
Heterogén FIA<br />
Egy mosási lépést közbeiktatva elkülönítjük a kötött<br />
és szabad fluoreszcensen jelzett molekulákat. Ezzel eltávolítjuk<br />
a mintában lévő fluoreszcens tulajdonságú<br />
zavaró komponenseket (autofluoreszcencia) is.
154 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-5. táblázat. Néhány fontosabb fluoreszcens jelölőmolekula<br />
Fluoreszcens festék Fluoreszcens emissziós szín Emissziós maximun (Em-Max; nm)<br />
BD Horizon TM V450 kék 448<br />
Pacific Blue TM kék 452<br />
Alexa Fluor ® 448 zöld 519<br />
FITC zöld 519<br />
PE sárga 578<br />
PE-Texas Red ® narancsszín 615<br />
Texas Red ® narancsszín 615<br />
APC vörös 660<br />
Alexa Fluor ® 647 vörös 668<br />
PE-Cy TM 5 vörös 667<br />
PerCP vörös 678<br />
PerCP-Cy TM 5.5 távoli vörös 695<br />
Alexa Fluor ® 700 távoli vörös 719<br />
PE-Cy TM 7 infravörös 785<br />
APC-Cy7 infravörös 785<br />
BD APC-H7 infravörös 785<br />
Fluoroimmunometrikus módszer. Az analit folyadékfázisban<br />
reagál a fölöslegben hozzáadott jelölt antitesttel.<br />
A fölöslegben maradt jelölt antitestet eltávolítjuk<br />
egy szilárd fázishoz kötött antigénhez kacsolással.<br />
A szolid fázisú mátrixot mossuk, és mérjük a fluoreszcencia<br />
intenzitását, amely fordított arányban áll<br />
az analit koncentrációjával. Ezt a módszert használják<br />
mikroorganizmusok elleni antitest koncentrációjának<br />
mérésére, autoantitestdetektálásra és szérumfehérjék,<br />
hormonok meghatározására is.<br />
Radiális megosztású immunofluorometrikus assay.<br />
Radiális kromatográfiát alkalmaznak, és a reakció<br />
üvegszál filterpapíron megy végbe.<br />
6-38. ábra. Fluoreszcens polarizációs immunoassay (FPIA)<br />
a) Az assay folyamata<br />
b) A fluoreszcens konjugátum fluoreszcenciája<br />
c) A nagy antigén jelölt antitestkomplex lassabban mozog,<br />
nem forog, a polarizált fényt előrefelé átengedi
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
155<br />
Késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay (DELFIA).<br />
Az eljárás során speciális készüléket és fluoreszcens<br />
molekulát használnak az eljárás érzékenységének növelésére.<br />
A 100 ns-os vagy hosszabb idejű késleltetett<br />
fluoreszcenciájú jelzőmolekula és az impulzus üzemmódban<br />
való gerjesztés alkalmazásával elkerülhető a<br />
zavaró háttér-fluoreszcencia, amely rendszerint 10 ns<br />
alatt lezajlik.<br />
Homogén FIA<br />
Nem igényel mosási lépést, viszont kevésbé érzékeny,<br />
standard készülékkel mérve kb.10 −10 M az érzékenysége.<br />
Fluoreszcens Polarizációs Assay. A fluoreszcens detektálás<br />
különleges változata a fluoreszcenciapolarizációs<br />
immunoassay (6-38. ábra). Ez a mérési módszer a<br />
fluoreszcencia jelenség egy sajátos vonásán alapszik.<br />
Ha a fluoreszcenciát egy oldatban (amelyben – az<br />
egyszerűség kedvéért tegyük fel, hogy – csak a vizsgálandó<br />
anyag képes fluoreszcenciára) síkban polarizált<br />
fénynyalábbal idézzük elő, akkor a fluoreszcens fény<br />
(amit, mint tudjuk, a gerjesztett mintamolekulák bocsátanak<br />
ki) lehet továbbra is síkban polarizált, de el<br />
is veszítheti polarizált jellegét. Ez attól függ, hogy milyen<br />
gyorsan forognak a molekulák. Ha a gerjesztés és<br />
a fénykibocsátás között eltelt időben (amely általában<br />
a ns dimenzióba esik) a molekulák térhelyzete változatlan,<br />
akkor a kibocsátott fény polarizációs síkja<br />
megegyezik az elnyelt fényével. Ellenkező esetben a<br />
molekula elfordulásának megfelelő más irányban lesz<br />
polarizált a kibocsátott fény. Mivel az egyes molekulák<br />
egymástól függetlenül forognak, ekkor a kibocsátott<br />
fény összességében már nem polarizált.<br />
A molekulák forgási sebessége nagyban függ a<br />
méretüktől. A néhány száz dalton molekulatömegű<br />
fluoreszcensen jelzett mintamolekulák olyan gyorsan<br />
forognak, hogy a fluoreszcens fény polarizációja eltűnik,<br />
vagy nagyon lecsökken. Ha viszont egy ilyen<br />
molekula egy nagy fehérjéhez, pl. ellenanyaghoz kötődik,<br />
akkor az így létrejött komplex forgási sebessége<br />
(amely nagyjából azonos magának a fehérjének a<br />
forgási sebességével) olyan kicsi, hogy a fluoreszcens<br />
fény polarizált marad. Ha tehát a kis molekulájú fluoreszcensen<br />
jelzett antigén és a nagy molekulájú ellenanyag<br />
oldatát elegyítjük, és ezután mérjük a poláros<br />
fény által kiváltott fluoreszcencia polarizációs fokát,<br />
akkor azt tapasztaljuk, hogy a reakció időbeni előrehaladásával<br />
a polarizációs fok egyre nő. Ezzel a módszerrel<br />
tehát követhető a reakció kinetikája is, majd az<br />
egyensúly beállása után a keletkezett komplex menynyiségére<br />
is következtetni lehet. Adott mennyiségű<br />
ellenanyagot és kompeticiót alkalmazva az egyensúlyi<br />
polarizációs fok és a fluoreszkáló anyag koncentrációja<br />
közti kalibrációs összefüggés kimérhető.<br />
Ennél a módszernél nincs szükség elválasztásra, ez<br />
tehát homogén eljárás. Számos egyéb homogén mérési<br />
technika ismeretes. Ezek nagy része szintén kompetitív<br />
eljárás, ahol a mérendő antigénnel a jelzett antigén<br />
versenyez az antitestek kötőhelyeiért, és a jelzett<br />
antigén szabad, ill. kötött formájának nem egyforma<br />
a jelintenzitása. Így pl. lehet, hogy a kötött formában<br />
a jelzett molekulák gyengébben fluoreszkálnak, mint a<br />
szabad formában. Mivel ilyenkor a szabad és a kötött<br />
forma egyaránt ad jelet (csak eltérő intenzitással), ezért<br />
az ilyen módszerek csak viszonylag nagy koncentráció<br />
(10 –5 –10 –6 mol/l) mérésére alkalmasak.<br />
Fluoreszcens Protection Immunoassay. A fluoreszcens<br />
jelölt antigén reagál a specifikus antitesttel. A kapcsolódás<br />
térbelileg megakadályozza egy második, a fluoreszceinre<br />
specifikus antitest odakötődését a fluorofórra.<br />
Ez az antitest, ha a fluorofórhoz kötődik, kioltja<br />
(quencheli) annak a fluoreszcenciáját. A mintában<br />
lévő antigén leszorítja a jelölt antigént a kötődésből,<br />
több olyan szabad jelölt molekula marad, amelynek<br />
fluoreszcenciáját a második antitest meggátolja.<br />
Chemiluminescent Immunoassay (CLIA)<br />
Jelölésre kemilumineszcenciát gerjesztő molekulát<br />
használunk: luminolderivátumokat, akridíniumésztereket,<br />
nitrofenil-oxalát-derivátumokat, valamint<br />
ruténium-tri-bipridil-tripropilamint (TPA) az elektrokemilumineszcenciában.<br />
A heterogén assay formátumok lényegében nem<br />
különböznek a RIA és a FIA formátumaitól. Mivel a<br />
kemilumineszcens anyag elektrokémiailag bocsát ki<br />
fényt elektródok felszínén, így alkalmazható homogén<br />
assay formátumban is.<br />
Akridíniumészter jelölésű CLIA esetén az használjuk<br />
ki, hogy az aktivált, kemilumineszcens molekulák<br />
igen gyorsan, az oxidációs reakció megindulása után<br />
5–10 s múlva nagyenergiájú villanófényt emittálnak.<br />
A villanófény típusú (flash-type) fluoreszcencia miatt<br />
ennek a detektálása növeli a módszer érzékenységét.
156 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
6-6. táblázat. A MEIA és a CMIA összehasonlítása<br />
Módszer Szilárd fázis Szeparációs lépés Jelölés Érzékelő módszer<br />
MEIA latex mikrorészecske üvegszál mátrix alkalikus foszfatáz enzim fluoreszcenciadetektor<br />
CMIA<br />
mágneses<br />
mikrorészecske<br />
mágnes<br />
kemilumineszcens<br />
vegyület<br />
kemilumineszcenciás<br />
fotosokszorozó cső<br />
Elektrokemilumineszcens Immunoassay (ECLIA). A<br />
jelölő anyag elektrokémiailag generál fényt, egy oxidoredukciós<br />
reakcióban.<br />
Az assay-protokoll a következő: antitesttel fedett<br />
mágneses mikropartikulumok szilárd fázisként a<br />
mintából megkötik az antigént, amelyet egy második,<br />
jelölt antitesttel hozunk komplexbe (6-39. ábra, 6-6.<br />
táblázat). A szabad konjugátumot mosással távolítjuk<br />
el, majd a szilárd fázisú szuszpenzió kemilumineszcenciáját<br />
mérjük elektród segítségével. Az assay érzékenysége<br />
0,2–0,4 ng/mL CEA és 0,4 ng/mL AFP esetében.<br />
Előnye, hogy nem igényel bonyolult műszert,<br />
és gyors a szignálmérés.<br />
Az immunoassay-t befolyásoló faktorok<br />
Pontosság, precizitás<br />
Ez a két elvárható követelmény egy laboratóriumi<br />
méréstől. A pontosság azt jelenti, hogy az assay képes<br />
azt az eredményt adni a laboratóriumi analitikusnak<br />
és a klinikusnak, amely a mintában lévő analit valódi<br />
mennyisége. Vagyis a laboratórium képes mintában<br />
lévő anyag valós koncentrációját kimutatni. A precizitás<br />
pedig azt jelenti, hogy az adott reagensekkel<br />
és mérőműszerrel, standard körülmények között az<br />
eredmény reprodukálható.<br />
Egy immunoassay, amely pontosan és precízen képes<br />
eredményt adni anélkül, hogy hamis pozitív eredményt<br />
mérne, klinikai szempontból specifikusnak<br />
mondható (6-40. ábra).<br />
Egy immunoassay klinikai szenzitivitása azt jelenti,<br />
hogy pontosan és reprodukálhatóan méri a legkisebb<br />
mennyiségeket is, vagyis nem ad hamis negatív<br />
eredményt.<br />
Kalibrátorok és kontrollok<br />
Megfelelő alkalmazásuk meghatározza az említett<br />
faktorokat.<br />
A kalibrátorok olyan ismert mennyiségű mérendő<br />
molekulát tartalmazó oldatok, amelyek meghatározzák<br />
a jelerősség és az analit koncentrációjának<br />
viszonyát. Kalibrációs sort alkalmazva kalibrációs<br />
(dózis–hatás) görbe írható le a készülék szoftverének<br />
segítségével, amelyben a jel korrelál a standard koncentrációjával.<br />
Az ismeretlen beteg mintájának jelintenzitását<br />
megmérve a kalibrációs görbe segítségével<br />
meghatározható a mintában lévő analit koncentrá-<br />
6-39. ábra. Kemilumineszcens mágneses immunoassay<br />
(CMIA)<br />
6-40. ábra. Az immunoassay követelményei<br />
a) Követelmények<br />
b) Megfelelő kalibrációs görbe
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
157<br />
ciója. Fontos, hogy a kalibrátorokat<br />
a gyártó utasításai szerint<br />
kezeljük, ellenkező esetben pontatlan<br />
a mérés, a beteg mintájának<br />
hamis mérését eredményezi.<br />
Ha a kalibrátorok használatra<br />
kész formában állnak rendelkezésre,<br />
megfelelő az oldószerük<br />
(szérum), kisebb a tévedési lehetőség.<br />
A kontrollok (pozitív, negatív)<br />
ismert koncentrációjú analitot<br />
tartalmazó minták, amelyeket<br />
a mérés pontosságának és reprodukálhatóságának<br />
ellenőrzésére<br />
használunk. Amennyiben<br />
a gyártó által megadott tartományban<br />
vissza tudjuk mérni azokat, ez azt jelenti,<br />
hogy a beteg mintáját is jól mértük meg. A kontrollok<br />
le- vagy fölfelé történő hamis mérése jelzi a reagensek,<br />
a kalibrátorok vagy az analízis hibáját.<br />
A mérésre ható tényezők (assay-interferencia)<br />
Azt jelenti, hogy valamely külső tényező zavarja<br />
a mérés pontosságát, legtöbbször az antigén-antitest<br />
összekapcsolódását. Az egylépéses módszereknél az<br />
interferencia általában megváltoztatja a mérés specifitását<br />
és szenzitivitását is. A kétlépéses módszerek<br />
pontosságát általában kevésbé zavarják külső tényezők<br />
(mint nem specifikus kötőfehérjék, interferáló<br />
anyagok, általános mátrixeffektus), mert a mosással<br />
ezeket eltávolítjuk.<br />
Nagydózis-visszacsapási („hook”) effektus. Nagy antigénfelesleg<br />
(prozóna-fenomén) nagydózis-visszszacsapási<br />
effektust okozhat, ami egylépéses szendvics-assay<br />
esetében fordulhat elő (6-41. ábra). Ekkor a<br />
nagy antigénkoncentráció telíti mind a befogó, mind<br />
6-41. ábra. Szendvics-assay. A mintában lévő extrém nagy<br />
antigénkoncentráció visszacsapási effektusa<br />
6-42. ábra. Az antiegér antitest (HAMA) zavaró hatásai<br />
a) A HAMA okozhat álpozitív eredményt<br />
b) HAMA okozta álnegatív eredmény<br />
a jelölő antitest összes antigénkötő helyét, meggátolva<br />
a szendvics kialakulását. Ilyen körülmények között<br />
a mért antigénmennyiség sokkal kisebb lesz, mint a<br />
minta valós antigénkoncentrációja. Ez a dózis–hatás<br />
görbén jól látható, ahol emelkedő antigén koncentráció<br />
egy adott ponton csökkenő jelintenzitást ad. Ezt a<br />
jelenséget prozóna effektusnak is hívják.<br />
Humán Anti-Mouse Antitestek (HAMA). A mintában<br />
előforduló egérantigének ellen kialakult antitestek<br />
okozzák ezt a fajta interferenciát (6-42. ábra). Ennek<br />
különféle okai lehetnek, mint pl. egér monoklonális<br />
antitest terápia, egerekkel dolgozó személyek szintén<br />
immunizálódhatnak egérantigénekkel.<br />
A beteg mintájában lévő HAMA okozhat hamis<br />
pozitív és hamis negatív reakciót egyaránt olyan<br />
tesztben, ahol egér monoklonális antitestet használnak<br />
mint reagenst.<br />
• Hamis pozitív eredmény HAMA miatt: ebben az<br />
esetben a hamis pozitivitás oka, hogy az<br />
anti-egér antitest szendvicsként összeköti a szolid<br />
fázison lévő befogó antitestet a jelölt antitesttel,<br />
vagyis úgy tűnik, mintha a mintában<br />
lévő antigén kapcsolta volna össze a komplexet.<br />
• HAMA okozta hamis negatív eredmény: két<br />
mechanizmussal jöhet létre: gátlás révén vagy a
158 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
szolid fázison lévő befogó antitestet blokkolja a<br />
HAMA, vagy a jelölő antitestet.<br />
Carryover (átszennyezés). Azt jelenti, hogy egy extrém<br />
nagy analitkoncentrációjú mintából minimális<br />
mintamennyiség átkerül egy mellette lévő csőbe<br />
(kontamináció), amelyik ezért alacsony pozitív eredményt<br />
ad. A legtöbb készülék az extrém magas minta<br />
melletti alacsony pozitív mintát jelzi, és azt újramérik.<br />
Az immunoassay-k fejlesztési irányai<br />
Multiplex immunoassay-k: fehérje-biochip, microbead-array<br />
A legújabb technológiai fejlesztések olyan irányba<br />
haladnak, hogy a minta egyszeri felhasználásával, egy<br />
méréssel 5–100 különböző analitmolekula koncentrációját<br />
tudjuk detektálni. Ezek az ún. multiplex mérési<br />
módszerek két nagy kategóriába sorolhatók az alkalmazott<br />
szilárd hordozó alapján. Az egyik esetben<br />
a microchip-technológiára adaptálták az immunoassay-t,<br />
a másikban egymástól méret vagy fluoreszcencia<br />
alapján jól elkülöníthető mikropartikulumokra.<br />
Mikrochipet alkalmazva a mérendő fehérjék menynyisége<br />
szinte határtalan, a mikrogyöngyök viszonz<br />
a rendelkezésre álló bead-fajták korlátozzák az egyszerre<br />
mérhető paraméterek számát. Ezek a miniatürizált<br />
technikák kis mennyiségű reagenst és mintát<br />
igényelnek, ezért környezetkímélők, olcsók és energiakímélők.<br />
MicroSpot Assay<br />
A microchip hordozó felszínén kis, elkülönített<br />
területekre viszik fel a különböző reagenseket az ún.<br />
micro-dot technológiával. Így 100–200 különböző<br />
reakcióhelyet tudnak létrehozni („nyomtatni”) egy<br />
3 mm átmérőjű polisztirénlemez felszínén (Ekins,<br />
1998). Minden egyes reakcióhely egy 80 μm átmérőjű<br />
terület, amelyre kevesebb mint 1 nL mennyiségű<br />
reagenst „nyomtatnak” egy automatával (6-43. ábra).<br />
Ez a módszer az Ekins által leírt „ambiens assay teóriá”-n<br />
alapul, amelyben az assay érzékenysége és mérési<br />
határa a befogó antitest telítettségének mértékétől<br />
és nem a szilárd fázis felszínének méretétől függ<br />
(6-44. ábra). Ebben az eljárásban a microspot felszínén<br />
befogott analit mennyisége olyan kicsi, hogy ez<br />
nem befolyásolja az analit koncentrációját a mintában<br />
még kis koncentrációban jelen lévő célmolekula<br />
6-44. ábra. A multiplex „ambiens assay” teória elve: a jel és<br />
a jelsűrűség aránya a mikrospoton. Növekvő méretű spoton<br />
a befogó molekulák, ha ugyanolyan sűrűségben vannak<br />
nyomtatva, nő a teljes jel. Ha viszont csökken a befogó<br />
molekulák száma, és eléri a < 0,1/K értéket, a jeldenzitás nő<br />
6-43. ábra. A protein-mikroarray lehetséges befogó molekulái
Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
159<br />
esetében sem és akkor sem, ha a kötés nagy affinitású.<br />
Ez akkor igaz, ha < 0,1/K befogó molekulát immobilizálnak,<br />
ahol K az immunreakció affinitáskonstansa.<br />
Ilyen körülmények között a mintából kifogott<br />
célmolekula mennyisége közvetlenül tükrözi annak<br />
koncentrációját. Érdekes, hogy a koncentrációmérés<br />
ilyen környezeti („ambiens”) analit körülmények között<br />
független a minta volumenétől, és a kis menynyiségű<br />
mintafelhasználás ellenére nagyon szenzitív.<br />
Ennek két oka van: egyrészt a kötés a legmagasabb<br />
célmolekula-koncentráción zajlik, másrészt a befogó<br />
antitestmolekula–antigén- (analit) komplex nagyon<br />
kis felületen található, nagy jelet okozva ott.<br />
A Roche Diagnostics cég avidinnal fedett szolid<br />
fázist használ, amelyre biotinnal jelölt befogó antitestet<br />
vagy antigént nyomtatnak. Különféle paraméterek<br />
(mint anti-HIV, anti-HBsAg, anti-hepatitis-C<br />
és rubeolaantitestek) detektálhatók egy mintából egy<br />
méréssel a microchip felszínén. Az assay-formátum<br />
egy háromlépéses fluoreszcens immunoassay, ahol a<br />
fluoreszcens jelet egy lézer szkenner detektálja.<br />
Áramlási citometriás immunoassay – multiplex<br />
microbead-assay<br />
A Luminex cég (Austin, TX) kifejlesztett egy<br />
áramlási citometriás mérési elven alapuló, multiparametrikus<br />
fluoreszcens immunoassay-t. Ebben a<br />
rendszerben két különböző fluorofór különböző koncentrációival<br />
feltöltött latexpartikulumok (latexbead)<br />
szolgálnak szolid fázisként. Ezek a partikulumok az<br />
áramlási citométeren mind külön bead-populációként<br />
jelennek meg. A több mint 60 különböző tulajdonságú<br />
partikulum mindegyike külön célmolekula<br />
mérésére szolgál, egy mintából. Egy adott microbeadből<br />
kb. 1000 darab képezi a reakciófelszínt, amelyhez<br />
vagy a befogó antitestet, vagy antigént kapcsolnak. Az<br />
analit kötődését a mikrogyöngyökhöz egy másik színű<br />
fluoreszcens molekulával jelölt antitesttel tesszük<br />
láthatóvá.<br />
A mérés kivitelezése a következő. A mintát összekeverjük<br />
a befogó antitestet tartalmazó microbeaddel<br />
és a fikoeritrinnel (PE) jelölt második antitesttel.<br />
A keveréket 10–30 perc inkubáció után mérjük egy<br />
áramlási citométeren, amely több paraméteres fluoreszcens<br />
detektálásra alkalmas. A készülék egyetlen<br />
méréssel minden gyöngycsoportból 1000-1000 partikulomot<br />
lemérve elkülöníti azokat fluoreszcens<br />
jelzésük és intenzitásuk alapján, és külön jelként detektálja<br />
az adott bead-csoportnak a jelölő fluoreszcenciaintenzitását<br />
is. Ez a jel egyenesen arányos a befogott<br />
analit mennyiségével.<br />
Ezt az elvet alkalmazzák pl. 15 féle citokin egyidejű<br />
mesésére, egy mintából (Carson, 1999), de autoantitestek<br />
vagy mikrobák elleni antitestek mérésére is alkalmas.<br />
A szimultán mérés kevésbé érzékeny, mint az<br />
individuális citokinszendvics-ELISA-k, de így is elég<br />
érzékeny, pl. 100 pg/ml IL-2-re, 10 pg/ml IL-4-re, 100<br />
pg/ml GM-CSF-re és 200 pg/ml interferon-a-ra.<br />
A multiplex technikai eljárások területén nagy fejlődés<br />
mutatkozik, de néhány megoldandó probléma<br />
még mindig maradt, így nem vonultak be a rutin diagnosztikába.<br />
Az egyik probléma, hogy a miniatürizálás<br />
nem valósul meg az assay-ben minden ponton.<br />
Így kis folyadék- és mintamennyiség kezelése nincs<br />
megoldva, ezért azok gyakran elpárolognak és zavarják<br />
a reakciót. Néhány esetben a szenzitivitást és a<br />
specificitást is vizsgálni kell. Ugyanakkor a miniatürizálás<br />
mint végső cél fontos a laboratóriumi diagnosztikában,<br />
mert költséghatékonyabb, gyorsabb, klinikailag<br />
hasznos, és nem utolsósorban kevésbé terheli<br />
a beteget.<br />
Irodalom<br />
Carson, R. T., Vignali, D. A.: Simultaneous quantitation<br />
of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.<br />
J. Immunol. Methods 227(1-2):41–52, 1999.<br />
Czirják László: Klinikai Immunológia1. kiadás. 775–<br />
857. old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2006.<br />
Debreczeni Lóránd, Kovács L. Gábor: Gyakorlati laboratóriumi<br />
medicina. 2. kiadás. Literatura Medica, 2008.<br />
Doorbar, J., Winter, G.: Isolation of a peptide antagonist<br />
to the thrombin receptor using phage display. J. Mol.<br />
Biol. 244(4):361–369, 1994.<br />
Ekins, R. P.: Multi-analyte immunoassay. J. Pharm. Biomed.<br />
Anal. 7:155–168, 1989.<br />
Engvall, E., Perlmann, P.: Enzyme-linked immunosorbent<br />
assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin<br />
G. Immunochemistry 8(9):871–874, 1971.<br />
Erdei Anna: Immunológiai Módszerek. Medicina Könyvkiadó,<br />
Budapest, 2006.<br />
Finckh, P. et al.: Microspot – an ultrasensitive microarray-based<br />
ligand assay system. Apractical application of<br />
ambient analyte assay theory. Proc. UK NEQAS Meeting<br />
3:155–165, 1998.<br />
Gergely János, Erdei Anna: Immunbiológia. Medicina<br />
Könyvkiadó, Budapest, 2004.
160 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...<br />
Hozumi, N., Tonegawa, S.: Evidence for somatic rearrangement<br />
of immunoglobulin genes coding for variable<br />
and constant regions. J. Immunol. 173(7):4260–4264,<br />
1976.<br />
Hunter, W. M., Greenwood, F. C.: Preparation of iodine-131<br />
labelled human growth hormone of high specific<br />
activity. Nature 5(194):495–496, 1962.<br />
Ishikawa, E., Hashida, S., Tanaka, K. et al.: Development<br />
and applications of ultrasensitive enzyme immunoassays<br />
for antigens and antibodies. Clin. Chim. Acta<br />
15;185(3):223–230, 1989.<br />
Joos, T. O. et al.: A microarray enzymelinked immunosorbent<br />
assay for autoimmune diagnostics. Electrophoresis<br />
21:2641–2650, 2000.<br />
Komissarenko, S. V., Avrameas, S.: Properties of immunoadsorbents<br />
prepared by antigen coupling to glutaraldehydeactivated<br />
polyacrylamide gel, BrCN-activated<br />
Sepharose and by copolymerization of antigens by glutaraldehyde<br />
.Ukr. Biokhim. Zh. 50(4):500–511, 1978.<br />
Köhler, G., Milstein, C.: Continuous cultures of fused<br />
cells secreting antibody of predefined specificity. 1975.<br />
Biotechnology 24:524–526, 1992.<br />
McPherson, Pincus: Henry’s Clinical Diagnosis and Management<br />
by Laboratory Methods. 21 st ed. W. B. Saunders<br />
Company, 2006.<br />
Nakane, P. K., Pierce, G. B. Jr.: Enzyme-labeled antibodies:<br />
preparation and application for the localization<br />
of antigens. J. Histochem. Cytochem. 14(12):929–931,<br />
1966.<br />
Rubenstein, K. E., Schneider, .S., Ullman, E. F: „Homogeneous“<br />
enzyme immunoassay. A new immunochemical<br />
technique. Biochem. Biophys. Res. Commun.<br />
26;47(4):846–851, 1972.<br />
Skerra, A., Plückthun, A.: Assembly of a functional immunoglobulin<br />
Fv fragment in Escherichia coli. Science<br />
240(4855):1038-1041, 1988.<br />
Schwaber, J., Cohen, E. P.: Human × mouse somatic cell<br />
hybrid clone secreting immunoglobulins of both parental<br />
types. Nature 244(5416):444–447, 1973.<br />
Templin, M. F., Stoll, D., Schrenk, Monika et al.: Protein<br />
microarray technology TRENDS in Biotechnology.<br />
20(4), 2002.<br />
Thorpe, R., Bird, C. R, Spitz, M.: Immunoblotting with<br />
monoclonal antibodies: loss of immunoreactivity with<br />
human immunoglobulins arises from polypeptide chain<br />
separation. J. Immunol. Methods 73(2):259–265, 1984.<br />
http://en.wikipedia.org/wiki/Monoclonal_antibodies<br />
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/<br />
content/ELISA.html<br />
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/<br />
content/pregtest.html
7. Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai<br />
laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
Automatizáció<br />
a fehérjeanalitikában<br />
Kőszegi Tamás<br />
Általános szempontok<br />
Az egyedi fehérjék kimutatására és mennyiségi meghatározására<br />
a laboratóriumi gyakorlatban jórészt<br />
specifikus molekulafelismerésen alapuló kölcsönhatások<br />
adnak lehetőséget. Leggyakrabban a mérni<br />
kívánt fehérjét arra specifikus antitesttel reagáltatják,<br />
majd az antigén-antitest reakciót valamilyen módon<br />
mérhetővé teszik. Léteznek azonban más, nem antigén-antitest<br />
alapú módszerek is, de lényegük olyan<br />
molekulák alkalmazása, melyek az adott fehérjével<br />
szoros és specifikus kölcsönhatásba lépnek (affinitásos<br />
elv).<br />
Ebben a fejezetben elsősorban az antigén-antitest<br />
elvű méréstechnikák automatizációját ismertetjük.<br />
Az egyes módszerek bemutatásának logikája a nagy<br />
koncentrációban lévő antigének mérésétől lefelé az<br />
egyre kisebb koncentrációjú analitok mérési elvének<br />
ismertetése.<br />
Az egyedi molekulák automatizált meghatározását<br />
az utóbbi évtizedek kétirányú fejlődése tette lehetővé.<br />
Egyrészt a műszeres analitika és a számítógépes<br />
vezérlés ugrásszerű tökéletesedése, másrészt az orvos-biológiában<br />
a monoklonális antitest technológia<br />
felfedezése és ipari méretű alkalmazásának kidolgozása.<br />
A kétféle fejlesztés ötvözése következtében az<br />
automatizált, nagy érzékenységű és specifikus módszerek<br />
ma már széles körben elterjedtek a rutin laboratóriumi<br />
diagnosztikában, és lehetővé teszik a fehérjék<br />
kvantitatív mérését a pg/ml vagy más kifejezéssel<br />
a nano–femtomoláris nagyságrendben.<br />
Immunprecipitáción alapuló módszerek<br />
Az egyik legrégebben alkalmazott technika, amely<br />
általában szilárd hordozón lévő gél fázist használ az<br />
antigén-antitest reakció kimutatására. A gél általában<br />
agar- vagy agaróztartalmú, a hordozó lehet üveg<br />
vagy műanyag lemez. Az antigént a gélben kiképzett<br />
lyukakba viszik fel, a specifikus antitestet a gél tartalmazza.<br />
A legegyszerűbb az ún. radiális immundiffúziós<br />
technika, ahol az antigén és az antitest diffúzió<br />
útján találkozik egymással. Gyorsabb eljárás a<br />
„rakéta”-elektroforézis és a „counter”-elektroforézis,<br />
ahol feszültségkülönbség hatására az antigén a gélben<br />
addig vándorol, amíg az antitesttel precipitátumot<br />
nem képez. Mindegyik módszernél gondos mosással<br />
el kell távolítani a gélből a ki nem csapódott fehérjéket,<br />
majd a precipitátumot fehérjefestékkel meg kell<br />
festeni. Az értékelés a precipitációs ív átmérőjének<br />
nagysága vagy az antigén diffúziójának mértéke alapján,<br />
egyszerű távolságméréssel lehetséges. Mennyiségi<br />
meghatározást standard koncentrációsorra kapott<br />
adatok alapján végezhetünk. A módszer ma már<br />
kevéssé használt, de olcsó és leolvasókészülékek (pl.<br />
CCD-kamera) segítségével automatizálható. Nagy<br />
klinikai immunológiai centrumok is alkalmazzák –<br />
főleg a radiális immundiffúziót – előre gyártott, kereskedelmi<br />
forgalomban megvásárolható agarózgélek<br />
használatával. Az eljárás inkább félautomatizáltnak<br />
tekinthető, mert a minták bemérését általában manuálisan<br />
kell végezni. Mint minden immunreakciónál,<br />
itt is figyelni kell az optimális antigén-antitest arányra,<br />
mert bármelyik túlsúlya esetén a komplex a gélből<br />
kioldódhat, fals eredményeket produkálva.
162 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
Immunturbidimetriás módszerek<br />
Az immunturbidimetriás módszerek a diffúziós eljárások<br />
továbbfejlesztett változatai. Itt a reakció csőben<br />
vagy küvettában megy végbe, a szem számára láthatatlan<br />
a képződött immunkomplex, nincs szükség<br />
festési műveletekre. Már e tényekből is következik,<br />
hogy a technika jóval érzékenyebb mennyiségi meghatározást<br />
tesz lehetővé a precipitációs eljárásokhoz<br />
képest. A módszer alapelve, hogy a fény hullámhosszával<br />
összemérhető méretű immunkomplexek<br />
keletkezzenek, melyek a rendszert megvilágító monokromatikus<br />
fényt szórják. Ez úgy lehetséges, hogy<br />
poliklonális antitestet alkalmaznak, az immunglobulinok<br />
mindkét antigénkötő helye aktív kell hogy legyen<br />
(bivalens). A fehérje antigén általában elég nagy<br />
ahhoz, hogy több epitóppal is rendelkezzék, ezért a<br />
poliklonális, bivalens antitestpopuláció képes áthidalni<br />
a molekulák közti távolságot és létrehozni a<br />
megfelelő méretű komplexet. Itt is érvényes az optimális<br />
antigén-antitest arány elve (az ekvivalenciaelv),<br />
mert ellenkező esetben az immunkomplex mérete kicsiny<br />
marad, és a rendszer nem képes a detektálására<br />
(7-1. ábra), ami az immunkomplex fényszórásán<br />
alapul. Az ábráról az is leolvasható, hogy a turbidimetriás<br />
technika relatíve nagy antigénkoncentrációt<br />
igényel az optimális detektálási körülményekhez. Ha<br />
ez a feltétel nem teljesül, akkor az ún. direkt turbidimetria<br />
érzékenységét meg kell növelni a kis koncentrációban<br />
jelen lévő antigének kimutatásához. Ezt úgy<br />
lehet elérni, hogy a specifikus antitestet standard méretű<br />
részecskékhez (általában latexgömböcskékhez)<br />
kötik. Itt is fontos körülmény, hogy az antigénnek<br />
kellően nagynak (több epitóppal rendelkezőnek) kell<br />
lennie az immunkomplexek kialakulásához. Az érzékenységnövelés<br />
a latexszemcsék fényszórásnövelő tulajdonságán<br />
alapul. A módszer sematikus áttekintése<br />
a 7-2. ábrán látható.<br />
Egy epitóppal rendelkező, kisméretű peptid antigének<br />
kimutatására a direkt turbidimetria nem alkalmas,<br />
mert nem tud keresztkötött immunkomplex<br />
létrejönni. A problémát a kompetitív elvvel lehet<br />
áthidalni. A tesztrendszerben mikrorészecskékhez<br />
vagy albuminhoz kötik standard mennyiségben a kimutatni<br />
kívánt fehérje antigént. A specifikus antitestet<br />
és a kötött antigént tartalmazó rendszerben a minta<br />
hozzáadására vetélkedés alakul ki a tesztben lévő<br />
standard mennyiségű antitest és a minta/teszt antigén<br />
között. Az immunkomplexek kialakulása és így a fény<br />
szóródása is fordítottan arányos a kimutatni kívánt<br />
analit koncentrációjával (7-3. ábra).<br />
7-1. ábra. Az antigén-antitest arány hatása az immunkomplex<br />
fényszórására (Heidelberger–Kendall-görbe)<br />
7-2. ábra. A latexerősített direkt immunturbidimetriás<br />
mérés elve<br />
7-3. ábra. A kompetitív, erősített immunturbidimetria elve
Automatizáció a fehérjeanalitikában<br />
163<br />
A turbidimetriás jel mérése<br />
A turbidimetria alapja a mintán áthaladó monokromatikus<br />
fény szóródás miatti intenzitásának csökkenése<br />
(látszólagos abszorbancia). A mérés geometriájának<br />
sematikus ábrázolása a 7-4. ábrán látható.<br />
Az optimális detektálási körülményekhez nagyon<br />
sok tényezőt kell figyelembe venni.<br />
Hullámhossz<br />
A direkt (nem erősített) méréseknél az ultraibolya<br />
tartomány (340 nm körül) a legmegfelelőbb. Mikrorészecskék<br />
alkalmazásánál a részecskeméret (és ennek<br />
megfelelően az immunkomplex mérete) döntő,<br />
a mérettel arányosan nő a hullámhossz. Általában<br />
40–60 nm méretű részecskéket alkalmaznak, amelyek<br />
önmagukban kevéssé szórják a fényt, de az immunreakció<br />
során méretük növekszik és a fényszórás<br />
lényegesen erősebbé válik. Detektálásra, megvilágító<br />
fényforrásként 340–360 nm-es fényt alkalmaznak.<br />
Hőmérséklet<br />
A hőmérséklet emelkedésével gyorsul a reakciókinetika,<br />
ugyanakkor az antigén-antitest komplex<br />
stabilitása csökken. A legtöbb készülék a mérést 37<br />
°C-on végzi.<br />
Végpontos vagy kinetikus mérés?<br />
A végpontos mérés technikailag egyszerűbb, de sok<br />
hibalehetőséget rejt magában, pl. az ekvivalenciazónától<br />
messze eső tartományt nem jelzi, így a linearitási<br />
tartományon kívül eső minták koncentrációjának<br />
mérése bizonytalanná válik.<br />
A kinetikus módszer kétféle lehet:<br />
• Adott időegységenként végzett mérés.<br />
• Folyamatos mérés.<br />
7-4. ábra. Turbidimetriás jel detektálásának elve<br />
Mindkét esetben fontos, hogy a készülék a reakció<br />
indításához képest igen rövid időn belül (< 5 s) képes<br />
legyen az első mérési pont felvételére, ez jelenti<br />
a kiindulási (vak) értéket. A kinetikus detektálással<br />
követni tudjuk az immunkomplexek kialakulásának<br />
sebességét és mérni a telítéshez szükséges időtartamot.<br />
Ezek alapján a készülék érzékeli a linearitási<br />
tartományon kívül eső antigénkoncentrációt és jelzi<br />
a felhasználónak, hogy hígítás szükséges (vagy akár<br />
automatikusan hígít és újramér). A kinetikus mérés<br />
nagyobb érzékenységet is eredményez.<br />
Részecskeszámlálásos elv<br />
Mind a direkt, mind a kompetitív módszereknél<br />
használható mérési mód. A vérsejtszámlálás elvéhez<br />
hasonlóan a mikrorészecskék meghatározott méretű<br />
nyíláson haladnak át, ahol impedanciás vagy optikai<br />
elv alapján működő rendszer (ún. ablak diszkriminátor)<br />
csak a szabad részecskéket számlája, a dimer<br />
vagy nagyobb komplexeket figyelmen kívül hagyja.<br />
Ez a detektálási technika a turbidimetriás eljárás érzékenységét<br />
jelentősen növeli.<br />
Egyéb megfontolások<br />
Az alkalmazott antitestek sajátságai<br />
A poliklonális antitestek általában jobb eredményt<br />
adnak, mint a monoklonálisak. Ennek oka a jobb<br />
komplexképző (áthidaló) sajátsággal és a nagyobb<br />
aviditással magyarázható. Az affinitáskromatográfiával<br />
tisztított antitestek jobb eredményt adnak, mint<br />
a tisztítatlan antiszérumok. A részlegesen emésztett<br />
IgG molekulák, (Fab2’) fragmentek használata előnyösebb<br />
a teljes antitestnél, és a reumatoid faktor<br />
(RF) kötő rész elvesztése miatt az RF-fel nem mutatnak<br />
interferenciát. Biotinnal jelzett antitestek és<br />
streptavidinnel borított mikrorészecskék használata<br />
növeli a rendszer érzékenységét és stabilitását.<br />
Az alkalmazott közeg sajátságai<br />
A reakciós közeg (puffer) összetétele döntően befolyásolja<br />
az antigén-antitest reakciót. Az optimális<br />
pH 6,0–8,0 között van, a puffer nem tartalmazhat ún.<br />
kaotrop anyagokat, amelyek a fehérjék konformációváltozását<br />
segítik elő (pl. perklorát, rodanid, nitrát).<br />
Előnyös a foszfát-, kalcium-, magnéziumtartalmú közeg,<br />
kerülni kell a túl alacsony és túl magas ionerősséget.
164 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
7-5. ábra. Nefelométer felépítésének elvi vázlata<br />
Nefelometria<br />
Az előzőkben leírt alapelvek lényegében alkalmazhatók<br />
a nefelometriás eljárásokra is. Az alapvető különbség<br />
a két módszer között a detektálás elvében van. Itt<br />
a valóban szóródott fényt mérjük, nem a látszólagos<br />
abszorbanciát. A fényforrás a nefelométerekben általában<br />
lézer, amellyel egy kis térrészre tudjuk a fényt<br />
fókuszálni. Az immunkomplexek méretére és számára<br />
elméletileg a 0°-os (szemből való) detektálás lenne<br />
a legalkalmasabb, de a megvilágító lézer fényforrás<br />
jelét a hasznos jeltől nagyon nehéz lenne különválasztani.<br />
Ezért a legtöbb nefelométerben 90°-os detektálást<br />
végeznek (7-5. ábra).<br />
A nefelometria a kisebb méretű immunkomplexeket<br />
érzékenyebben detektálja, mint a turbidimetria,<br />
és hígabb rendszerekben is használható, a mérési ciklusa<br />
rövidebb. A kinetikus detektálást alkalmazó készülékek<br />
a fényszórás folyamatos követésével érzékelik,<br />
ha az antigénkoncentráció kívül esik a linearitási<br />
tartományon, és a mintát ennek megfelelően automatikusan<br />
hígítják. A turbidimetriás és a nefelometriás<br />
módszerek érzékenysége az antigéntől függően kb.<br />
10 –11 mol/l koncentrációig terjed.<br />
Immunkémiai analitikai technikák<br />
(immunoassay-k)<br />
Ma a rutin laboratóriumi gyakorlatban a legérzékenyebb<br />
peptid-, fehérjekimutatási és mennyiségi meghatározási<br />
módszer az immunoassay (a módszerről a<br />
6. fejezetben is olvashatnak, itt elsősorban az automatizációra<br />
fektetjük a hangsúlyt). Érzékenységét elsősorban<br />
annak köszönheti, hogy az antigén-antitest<br />
reakció detektálásához jelzett antigént vagy antitestet<br />
használ. A jelző lehet radioaktív izotóp, fluoreszcens<br />
vagy kemilumineszcens molekula, ill. enzim. Az<br />
egyes módszerek elnevezései is innen származnak:<br />
RIA, FIA, LIA, EIA stb. Történelmileg az első sikeres<br />
eljárás a radioimmunoassay volt, amelyet a hatvanas<br />
években fejlesztettek ki, természetesen akkor<br />
még manuális úton mértek, és 1-2 napig is eltartott az<br />
analitikai művelet. A radioaktív jelölést fokozatosan<br />
kiszorította a nem izotópos eljárások sokasága, de ma<br />
is sok biológiailag aktív vegyület van, amelyet kizárólag<br />
RIA-val tudunk meghatározni.<br />
Az immunoassay-k csoportosítása<br />
Logikailag kétféle csoportosítás jön szóba:<br />
1. A reakciós közeg felépítése szerinti csoportosítás.<br />
2. Az immunreakció típusa szerinti felosztás.<br />
A közeg alapú csoportosításban kétféle assay lehetséges:<br />
• Szilárd fázisú (heterogén) assay, ahol vagy az<br />
antitest, vagy az antigén valamilyen szilárd hordozóhoz<br />
van kötve, és az immunkomplexek a<br />
szilárd fázis felületén jönnek létre.<br />
• Homogén assay, ahol az immunkomplexek<br />
oldatban maradnak, nincs szükség szilárd hordozó<br />
közegre.<br />
A reakció elve alapján lehet:<br />
• Telítési assay.<br />
• Kompetitív assay (lásd később részletesen).<br />
Történeti áttekintés<br />
A RIA módszerek a hatvanas évektől kezdtek elterjedni,<br />
nagyon sok laboratórium maga állította elő a<br />
kívánt antitestet és az izotópjelölést is házilag végezték.<br />
A hetvenes években megindult a műszerek technikai<br />
fejlődése, az automatizáció. Kifejlesztették a 96<br />
lyukú inkubációs lemezeket, az ehhez szükséges pipettorokat<br />
és mosóegységeket, ill. a lemez mélyedéseiben<br />
lévő reakcióelegy optikai denzitását (abszorbanciáját)<br />
leolvasó fotométereket. Ezzel párhuzamosan<br />
kidolgozták az enzimjelölést glutáraldehid-keresztkötés<br />
alkalmazásával. Hamarosan forgalomba kerültek<br />
az első enzimjelölést alkalmazó ELISA (Enzyme<br />
Linked Immuno Sorbent Assay) gyári tesztek, de<br />
ezeknél továbbra is több manuális lépést kellett beiktatni.<br />
Időközben a műszeres analitika teljes auto-
Automatizáció a fehérjeanalitikában<br />
165<br />
matizációjú, elsősorban RIA és ELISA készülékeket<br />
fejlesztett ki, ún. batch típusú analizátorokat, amelyek<br />
egyszerre egyféle analit nagyszámú mérésére voltak<br />
alkalmasak. A kilencvenes évektől kezdték használni<br />
a monoklonális antitesteket és a nem izotópos jelölőket,<br />
ami forradalmasította az immunoassay-n alapuló<br />
módszereket. A számítógépes vezérlést alkalmazó új<br />
műszercsalád a számos új eljárás adaptálásával már<br />
teljes automatizációt biztosított, és ún. beteg orientált<br />
elven működött. A betegorientált készülékek egy<br />
mintából többféle meghatározást képesek elvégezni<br />
a készülékbe előzetesen bevitt kérőlista alapján. Ma<br />
már a laboratóriumok önálló számítógépes rendszerrel<br />
(LIS) vannak ellátva, amely kommunikál a kórházi<br />
számítógépes rendszerrel (HIS), és a vizsgálatkérések<br />
és az eredményközlés is on line megy végbe.<br />
Az immunoassay-kben leggyakrabban<br />
alkalmazott jelölések<br />
Radioaktív izotópos jelölés<br />
Ma a leggyakrabban alkalmazott jelölő a 125 I-izotóp.<br />
A fehérjék jodinációját korábban klóramin-T segítségével<br />
végezték, az izotópot tartalmazó Na-jodidot<br />
oxidálva, az a fehérjék tirozin aminosavába épül be.<br />
Az oxidációs folyamat során a fehérje szerkezete és<br />
biológiai funkciója károsodhat, ezért ma már kevésbé<br />
agresszív módszereket alkalmaznak. Egy korszerű,<br />
oxidációs jodinálásra alkalmas vegyület szerkezete a<br />
7-6. ábrán látható.<br />
7-6. ábra. Korszerű jodinációs<br />
reagens szerkezete<br />
(1,3,4,6-tetrakloro-3a,-<br />
6a-difenil-glikoluril)<br />
Az izotópjelölés legfőbb korlátja az aránylag rövid<br />
felezési idő, ezért a kiteket ennek megfelelően időzítve<br />
kell felhasználni.<br />
Fluoreszcenciás jelölés<br />
A fluoreszcens emisszióra alkalmas vegyületek általában<br />
kettős kötéseket tartalmazó gyűrűs molekulák,<br />
de ismerünk atomi fluoreszcenciát is (lantanida<br />
elemek). Közös jellemzőjük, hogy szerkezeti sajátságuktól<br />
függő hullámhosszúságú fénnyel gerjesztve<br />
őket, a gerjesztett állapot energiatöbbletét foton formájában,<br />
szintén az adott struktúrára jellemző hullámhosszon<br />
bocsátják ki. A gerjesztett állapot élettartama<br />
(ún. fluoreszcens életidő) a legtöbb vegyület<br />
esetében néhány ns, de léteznek olyan molekulák,<br />
atomok, ahol az élettartam a ms-os időskálán írható<br />
le (pl. európium, terbium, XL 665). Néhány széles<br />
körben elterjedt fluoreszcens jelölő tulajdonságait<br />
a továbbiakban részletezzük. Megjegyezzük, hogy a<br />
fluoreszcenciára képes molekulákat nem mindig közvetlenül<br />
kötik az antitestre vagy az antigénre, hanem<br />
az immunreakció lezajlása után injektálják a rendszerhez.<br />
Itt az immunkomplexeket enzimmel jelölik,<br />
és a fényemisszió az enzimatikus aktivitás hatására<br />
jön létre.<br />
A fluoreszcein izotiocianát (FITC) reaktív izotiocianátcsoportot<br />
tartalmaz, amely enyhén lúgos közegben<br />
kovalens kötésbe lép a fehérjék szabad aminocsoportjaival<br />
(diamino-monokarbonsavak és láncvégi<br />
aminosavak). A jelölés után a feleslegben maradt szabad<br />
FITC-t a rendszerből el kell távolítani (dialízissel,<br />
kromatográfiával stb.). Az FITC előnye a jó kvantumhatásfok<br />
és az egyszerű jelölési technika, hátránya az<br />
egymáshoz közel eső gerjesztési és emissziós hullámhossz,<br />
ami a detektálást optikailag megnehezíti. A<br />
7-7. ábra. FITC szerkezeti képlete<br />
és spektrális tulajdonságai
166 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
molekula szerkezete és spektrális tulajdonságai a 7-7.<br />
ábrán láthatók.<br />
A lantanida csoport elemei, ezek közül is az európium<br />
szintén használatos a fehérjék (antitestek)<br />
jelölésére. Legérdekesebb sajátságuk, hogy a fluoreszcencia-élettartamuk<br />
hosszú, ezért alkalmasak<br />
ún. időfelbontású analízisekre. Az európium képes<br />
a gerjesztés során nyert energiatöbbletet egy megfelelő<br />
közelségben lévő másik fluoreszkáló molekulának<br />
átadni (donor–akceptor páros), és a hasznos jel<br />
a második komponens fluoreszcenciája lesz. A jelenséget<br />
fluoreszcencia rezonancia energia transzfernek<br />
(FRET) nevezzük (a részleteket lásd később).<br />
A fluoreszcens jelölők másik csoportja az ún. fluorogén<br />
vegyületek, amelyeket az előbb vázoltak szerint<br />
nem kötik antigénhez vagy antitesthez, hanem<br />
az immunreakció után injektálják az antigén-antitest<br />
komplexhez. A fluorogén vegyületek önmagukban<br />
nem mutatnak emissziót, rendszerint foszfátészter<br />
formában vannak jelen. A fényreakció indukálásához<br />
enzimjelölést (alkalikus foszfatáz) alkalmaznak,<br />
ahol az AP enzim az észterkötést hasítja, kiváltva ezzel<br />
a fluoreszcenciát. Az egyik legismertebb fluorogén<br />
molekula egy kumarinszármazék, a metil-umbelliferon-foszfát-észter.<br />
Emissziós sajátsága a 7-8. ábrán<br />
látható.<br />
Kemilumineszcenciás módszerek<br />
A kemilumineszcencia alkalmazása a fluoreszcenciával<br />
szemben számos technikai előnyt jelent.<br />
Nincs szükség gerjesztő fényre, hiszen a gerjesztett<br />
állapot kémiai reakció vagy elektrontranszfer útján<br />
jön létre, így nem kell számolnunk a gerjesztés zavaró<br />
optikai hatásaival. További előny, hogy a lumineszcenciás<br />
jel detektálásához nincs szükség optikai<br />
elemekre (monokromátor vagy fényszűrő), így a detektort<br />
(fotoelektron-sokszorozó) a mintához közel<br />
tudjuk elhelyezni, a fényveszteség minimalizálásával.<br />
A kemilumineszcenciás jelölők ugyanakkor molekuláris<br />
sajátságaik alapján időben különböző kinetikájú<br />
fényjelet produkálnak. Alapvetően háromféle jeltípussal<br />
találkozunk:<br />
• Felvillanás (flash) jel, amely általában 1 s alatt<br />
lezajlik,<br />
• „Derengés” jel, amely elsősorban enzimkatalizált<br />
reakció során jön létre, és akár több percig<br />
is stabil jelet produkál,<br />
• Időben majdnem konstans fényjel, amelyre legjobb<br />
példa a szentjánosbogárból izolált, ATPfüggő<br />
luciferin/luciferáz rendszer emissziója.<br />
Itt is érvényes az előzőkben tárgyalt elv, hogy a jelölés<br />
lehet kovalensen kötött kemilumineszcenciára alkalmas<br />
molekula vagy a fluorogén mintára enzimjelölést<br />
alkalmazó rendszerhez injektált luminogén vegyület<br />
(pl. észterkötésben).<br />
Felvillanás (flash) típusú jelölés<br />
Bevált jelölők az akridíniumészter típusú vegyületek.<br />
Kovalensen köthetők a fehérjékhez, lúgos közegben,<br />
hidrogén-peroxid jelenlétében kb. 1 s-ig tartó<br />
fényjelet produkálnak (7-9. ábra).<br />
7-8. ábra. Szabad kumarinmolekula emissziós spektruma<br />
(gerjesztés: 360 nm; kvantumhatásfok: 0,73)<br />
7-9. ábra. Akridíniumészter jelölő fénykibocsátásának<br />
mechanizmusa
Automatizáció a fehérjeanalitikában<br />
167<br />
7-10. ábra. Luminol fényemissziójának mechanizmusa<br />
A luminol régóta ismert molekula, lúgos közegben<br />
vagy peroxidvegyületek és peroxidáz enzim jelenlétében<br />
fényt emittál, az emisszió flash típusú (7-10.<br />
ábra).<br />
Erősítő komponensek hatására az emissziós kinetika<br />
megváltozik, és időben hosszú ideig stabil fényjel<br />
keletkezik. Az egyik leggyakrabban alkalmazott erősítő<br />
a p-jodofenol, a jelenséget erősített kemilumineszcenciának<br />
nevezik (ECL). A luminol alapú jelöléseknél<br />
kiterjedten alkalmazzák az ECL módszert.<br />
Elektrokemilumineszcenciás jelölés<br />
Ruténiumkomplex. A trisz(2,2’-bipiridil)ruténium-<br />
(II) vegyület alkalmas fehérjék közvetlen jelölésére. A<br />
gerjesztést itt nem kémiai reakció során felszabaduló<br />
energiatöbblet idézi elő, hanem elektromos áram<br />
(elektrokemilumineszcencia). A rendszerhez szükséges<br />
egy elektrondonor és egy speciális, elektródot<br />
tartalmazó mérőcella. Az elektrondonor szerepét a<br />
tripropilamin (TPA) veszi át, amellyel a mérőcellát a<br />
benne lévő komplexekkel együtt feltöltik. Elektromos<br />
áram hatására a TPA egy elektront ad át a ruténium 3+<br />
komplexnek, mely redukálódik ruténium 2+ -vé, gerjesztett<br />
állapotba kerül, és egy fotont emittál (620<br />
nm). A ruténiumkomplex az elektron leadásával regenerálódik,<br />
és újabb gerjesztési ciklusra lesz képes.<br />
A fényreakció mindaddig folytatódik, amíg az aktív<br />
TPA el nem fogy, így a fényjel felerősödik.<br />
Derengés (glow) típusú jelölés<br />
A dioxetán-foszfátészterek luminogén vegyületek,<br />
azaz észteráz (pl. AP) hatására kerülnek gerjesztett<br />
állapotba, vagyis enzim jelölőt használó immunkomplexek<br />
detektálására alkalmas. A reakció sémáját<br />
a 7-11. ábrán láthatjuk.<br />
A luminogén szubsztrátot az immunkomplexhez<br />
injektálva az alkalikus foszfatáz enzim hasítja a<br />
foszfátészter-kötést, amelynek eredményeképpen egy<br />
7-11. ábra. Dioxetán-foszfátészter fényemissziójának mechanizmusa<br />
[AMPPD: 3-(2’-án-4-metoxi-4-(3’’foszforiloxi)fenil-1,2-dioxetán;<br />
AMPD – : metastabil köztes termék,<br />
2–30 perc élettartammal]<br />
több perces életidejű köztes termék képződik, amelynek<br />
a bomlása során kialakul a gerjesztett állapot és<br />
a fényemisszió. A jel mindaddig közel konstans, amíg<br />
megfelelő mennyiségű szubsztrát van jelen a rendszerben.<br />
A módszer érzékenysége 10 –15 mol vagy kevesebb<br />
AP enzim molekula (vagyis immunkomplex).<br />
A mért jel detektálásának módjai<br />
A 125 I radioaktív jelölésű módszereknél g-számlálót<br />
alkalmaznak, a rövid felezésű idejű (60 nap) izotópból<br />
magas specifikus aktivitása miatt csak igen kevés<br />
szükséges a mérésekhez, és a gyors lebomlás miatt a<br />
radioaktív hulladék kezelése viszonylag egyszerű.<br />
A fényemisszió mérésén alapuló módszerek (mind<br />
fluoreszcenciás, mind kemilumineszcenciás) érzékenységét<br />
nagyban növeli az ún. egy foton számlálásos<br />
technika. Ennek lényege, hogy speciális (külön<br />
erre a célra gyártott) fotoelektron-sokszorozót alkalmazva<br />
a mintáról beérkező alacsony intenzitású jel<br />
fotonjai a detektort egyesével érik el. A fotoelektro-
168 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
mos hatás következtében minden egyes, a fotokatódot<br />
érő foton elektronlavinát indít el a csőben, amely<br />
az anód ellenállásán keresztül feszültséget indukál.<br />
Egy elemi jelenség a <strong>modern</strong> készülékekben 1 ns alatt<br />
lejátszódik, de tudnunk kell, hogy a létrejövő hasznos<br />
jel (feszültségtüske) szélessége is 1 ns körül mozog,<br />
melyet impulzus üzemű erősítővel alakítanak át<br />
a készülékbe épített számítógép számára kompatibilis<br />
formátumba. Az erősítő megkülönbözteti az egyetlen<br />
foton okozta és az egyszerre, egy csomagban érkező<br />
több foton keltette jelet, amelyet azután nem vesz figyelembe<br />
(diszkriminátor elv). Amennyiben a fényjel<br />
túl erős (vagyis a fotonok csomagokban vagy folytonosan<br />
érkeznek), lehetőség van egy optikailag semleges<br />
(szürke) szűrő alkalmazására, hogy a linearitás<br />
elve megmaradjon. A készülékek az időegység alatt<br />
beérkező fotonok számát mérik, pl. cps egységben<br />
(beütés/szekundum) vagy egy adott idő alatt beérkező<br />
összes foton mennyiségét (valójában integrálásként<br />
fogható fel).<br />
Az időfelbontású technika szintén egy foton számláláson<br />
alapul, de ehhez a módszerhez hosszú életidejű<br />
fluoreszcens jelölők és impulzus üzemű fénygerjesztés<br />
szükséges. Az első kereskedelmi forgalomba kerülő<br />
időfelbontású detektálást alkalmazó gyári kiszerelésű<br />
teszt európiumot használt. Az európium 340 nm-en<br />
gerjeszthető, és optikailag ettől távol eső, 620 nm-es<br />
emissziót ad, minimálisra csökkentve a gerjesztő<br />
fény detektorba szóródását. A gerjesztés 1 ms-ig tartó<br />
fényfelvillanások sorozatából áll, két ciklus közt 1 ms<br />
intervallummal. A mintában esetleg jelen lévő nem<br />
specifikus háttér-fluoreszcencia ns-ok alatt lecseng,<br />
ugyanakkor az európium fluoreszcencia-élettartama<br />
a ms-os időskálán van. Ezért ún. időkapuzott megfigyeléssel<br />
a gerjesztő impulzustól számítva 400–800 ms<br />
közötti emissziót mérik egymás után több ezer ciklusban,<br />
a jeleket akkumulálják. Ezáltal elérhető lesz,<br />
hogy a háttér-fluoreszcenciát teljesen kiküszöbölve<br />
csak a hasznos jel kerüljön feldolgozásra. A módszer<br />
sematikusan a 7-12. ábrán látható.<br />
E módszert ötvözhetjük a FRET elvvel is (fluoreszcenciarezonancia-energiatranszfer)<br />
ahol az antigént<br />
megcsapdázó két antitest mindegyike más módon<br />
van jelölve, donor–akceptor párost képezve. A donor<br />
lehet a korábbi példából ismert európium, az akceptor<br />
pedig pl. egy növényi eredetű bonyolult vegyület,<br />
fantázianeve XL 665. Impulzus üzemű UV lézer<br />
7-12. ábra. Időfelbontású fluoreszcenciadetektálás elve<br />
(európium jelölést alkalmazva)<br />
gerjesztéssel a donor európium a kialakult immunkomplexben<br />
megfelelő közelségben lévő akceptort<br />
gerjeszti. Az akceptor jelét szintén az ismertetett időkapuzott<br />
technikával mérik.<br />
Immunoassay-k típusai a közeg kialakítása<br />
szerint<br />
Heterogén, szilárd fázisú assay-k<br />
Ezeknél a módszereknél az immunreakció valamilyen<br />
szilárd hordozó felületén jön létre. Ez lehet<br />
egy kémcső fala vagy 96 lyukú lemez, mikro-, makrogyöngy,<br />
speciális töltettel rendelkező átfolyó rendszerű<br />
küvetták vagy mágnesezhető részecskék, számtalan<br />
megoldás ismert. A módszer lényege, hogy a<br />
reakcióban részt vevő egyik partnert (antigén vagy<br />
antitest) szorosan a hordozó fázishoz kötik, kovalensen<br />
vagy egyéb módon. A minta hozzáadása után a<br />
kialakult immunkomplexet el kell választani a felesleges<br />
molekuláktól, ezt mosással valósítják meg. Gyakran<br />
egy második inkubációra is szükség van, pl. jelölt<br />
második antitest hozzáadására, ekkor a detektálás<br />
előtt egy újabb mosási ciklus következik. A többlépé-
Automatizáció a fehérjeanalitikában<br />
169<br />
7-13. ábra. Szilárd fázisú (szendvics) immunoassay sémája,<br />
egyszerű csőben (bevont cső assay). A két antitest<br />
mindegyike monoklonális, az antigén más-más epitópjához<br />
kötődik<br />
ses technika az ún. szekvenciális eljárás. Tehát a heterogén<br />
assay-kben szükséges a kötött és szabad fázis<br />
elkülönítése. A módszert sematikusan a 7-13. ábrán<br />
mutatjuk.<br />
Homogén assay-k<br />
A homogén módszereknél együtt vannak jelen a kialakult<br />
immunkomplexek és a komplexet nem képező<br />
molekulák (pl. a reagensben feleslegben lévő szabad<br />
antitestek vagy a minta egyéb fehérjemolekulái). A kötött<br />
és szabad molekulákat szeparáció/mosás nélkül,<br />
fizikai-kémiai módszerekkel különítik el egymástól.<br />
Homogén assay a fluoreszcenciapolarizáción alapuló<br />
eljárás (FPIA), ill. a FRET-technika. Részletesebben a<br />
reakciótípusok tárgyalásánál ismertetjük őket.<br />
Immunoassay-k típusai a reakcióelv szerint<br />
Telítési assay-k<br />
Sokféle megoldás létezik, de a közös bennük, hogy<br />
akkor alkalmazzák, ha az antigén nagyméretű (pl.<br />
fehérje) és több antigéndeterminánssal rendelkezik.<br />
Mind heterogén, mind homogén rendszerben<br />
kialakítható. A 7-13. ábrán valójában egy heterogén<br />
telítési assay látható („szendvics”-eljárás). A szilárd<br />
fázist leggyakrabban monoklonális antitesttel borítják,<br />
elsődlegesen ez adja a módszer specificitását.<br />
A második, jelzett antitest lehet poliklonális, mert a<br />
szekvencialitás miatt nem vetélkedik az első kötéssel.<br />
Abban az esetben, ha a mérendő anyag maga is humán<br />
immunglobulin, akkor az antigént kell a szilárd<br />
fázishoz kötni, és az inkubáció során a mérni kívánt<br />
immunglobulin képez immunkomplexet a hordozó<br />
felületén. A második, jelzett antitest pedig valamilyen<br />
7-14. ábra. Szilárd fázisú kompetitív immunoassay elve.<br />
Az ábra a végső inkubálás utáni (mérés előtti) állapotot<br />
tükrözi, A kompetitív módszernél a jel nagysága fordítottan<br />
arányos az analit koncentrációjával. Az eljárás szintén<br />
alkalmas homogén és heterogén esszék kialakítására<br />
állatban termeltetett antihumán immunglobulin. A<br />
telítési módszereknél a jel nagysága egyenesen arányos<br />
az analit koncentrációjával, szokás az eljárást<br />
immunometrikus assay-nek is nevezni.<br />
Kompetitív assay-k<br />
Általában akkor alkalmazzák őket, amikor a kimutatni<br />
kívánt molekula tömege kicsi (pl. gyógyszerek,<br />
szteroidhormonok stb.), de autoantitesttiter-méréseknél<br />
is használatosak (pl. anti-TPO, anti-Tg). A<br />
módszer lényege, hogy a meghatározás során standard<br />
mennyiségű jelölt antigént hoznak össze a mintában<br />
lévő ismeretlen koncentrációjú antigénnel és a<br />
jelöletlen/jelölt molekulák arányától függően versengés<br />
alakul ki a specifikus antitesteken lévő kötőhelyekért.<br />
A leegyszerűsített elv a 7-14. ábrán látható.<br />
Néhány példa a heterogén eljárások<br />
technikai megoldásaira<br />
Makrogyöngy-módszer<br />
Az eljárás speciális tesztegységeket használ, melyekben<br />
egy néhány mm átmérőjű gyöngy található.<br />
A gyöngy felszínéhez kötik az antitestet vagy az anti-<br />
7-15 ábra. Makrogyöngyöt alkalmazó heterogén immunoassay<br />
egyes lépései sematikusan (1: inkubáció, 2: többszöri<br />
mosás, 3: a mosófolyadék végső eltávolítása, 4: szubsztrát injektálása<br />
után létrejövő kemilumineszcenciás fényemisszió)
170 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
gént, a készülékben található a reagens, amelyben AP<br />
enzimmel jelölt antitest van. A 7-15. ábrán láthatók a<br />
meghatározás egyes lépései.<br />
Az első lépésben a készülék a mintát és a reagenst a<br />
tesztegységbe pipettázza, majd inkubáció következik.<br />
A második lépés a többszöri mosás, az egyes ciklusok<br />
között az egység nagy sebességgel forog, a centripetális<br />
erő a folyadékfázist a felső, dupla falú részbe<br />
viszi. A kiszárított gyöngyhöz (3. lépés) egy injektor<br />
dioxetán-foszfát-észtert ad, ahol megindul az enzimkatalízis,<br />
az emittált fényjelet a 4. lépésben a fotoelektron-sokszorozó<br />
méri.<br />
Mikrogyöngy-módszer<br />
Nagyon sokféle megoldás létezik, itt egy paramágneses<br />
sajátságú gyöngyre és elektrokemilumineszcenciára<br />
épülő eljárást mutatunk be. A gyöngyök<br />
streptavidinnel borítottak, amihez biotinilált<br />
antitestet kötnek. A gyöngyök felszínén kialakulnak<br />
a mintában és a reagensben lévő antigénekből és<br />
antitestekből az immunkomplexek. A 2. antitest ruténium<br />
jelölőt hordoz (7-16. ábra). A felesleges molekulák<br />
kimosását a rendszerből szellemes módon,<br />
egy mágnes segítségével biztosítják, amely az inkubálócellában<br />
lévő mikrogyöngyöket immobilizálja. A<br />
fényemisszió elektromos gerjesztésre következik be, a<br />
módszert elektrokemilumineszcenciás immunoassaynek<br />
(ECLIA) nevezik.<br />
Enzimjelölés alkalmazása (ELISA, EIA)<br />
Heterogén assay, a reakcióhoz általában 96 mélyedést<br />
tartalmazó lemezeket használnak. A mélyedésekben<br />
található a kötött reakciópartnerek egyike, a<br />
kialakuló immunkomplexek tormaperoxidáz enzimmel<br />
jelöltek. Mosás után a mélyedésekbe a peroxidáz<br />
enzim szubsztrátját pipettázza a készülék, majd egy<br />
adott inkubációs idő után erős sav hozzáadásával a<br />
színes termék képződését leállítja. Speciális ELI-<br />
SA-fotométerrel minden egyes lyukban lévő reakcióelegy<br />
abszorbanciája leolvasásra kerül. A hagyományos<br />
színezékképzésen kívül fluoreszcenciás vagy<br />
luminometriás módszereket is kifejlesztettek.<br />
Példa homogén eljárás technikai<br />
megoldására<br />
A legelterjedtebb homogén assay a fluoreszcenciapolarizáción<br />
alapuló módszer (FPIA). Kisméretű antigének<br />
(pl. gyógyszerek) mennyiségi meghatározására<br />
alkalmas kompetitív assay. A készülék a mérés során<br />
standard mennyiségű, fluoreszcenciásan jelzett antigénhez<br />
hozzákeveri a fehérjementesített mintát és a<br />
specifikus antitestet. Az inkubáció során vetélkedés<br />
alakul ki az antitestkötésért. Nagy analitkoncentrációnál<br />
kevés jelzett molekula tud kötődni, kis értékeknél<br />
pedig sok fluoreszkáló analit kötődik az antitesthez.<br />
A fluoreszcenciapolarizáció foka a molekulák<br />
rotációs mozgási szabadságát tükrözi, ezért a szabadon<br />
maradt jelzett molekulák gyors rotációs mozgása<br />
miatt a polarizációs fok alacsony lesz. Tehát a gyors<br />
molekuláris mozgások alacsony, nullához közeli fluoreszcenciapolarizációval<br />
(p) jellemezhetők, a gátolt,<br />
lassú rotációs mozgás (pl. antitesthez kötött fluoreszcenciásan<br />
jelölt analit esetében) pedig magasabb<br />
p-értékkel. A p dimenzió nélküli szám, maximális<br />
értéke az adott fluoreszkáló molekula fizikai kémiai<br />
sajátságaitól függően megközelítheti a 0,5-ös értéket.<br />
A mérés rendkívül egyszerű: a mintát függőleges síkban<br />
polarizált gerjesztő fénnyel világítjuk meg, majd<br />
az emittált fény intenzitását a gerjesztő fénnyel pár-<br />
7-16. ábra. Heterogén szilárd fázisú immunoassay (EC-<br />
LIA-módszer) elve<br />
7-17. ábra. FPIA mérés elve. A nyilak mérete a molekulák<br />
rotációs mozgási szabadságát jelképezi (a kicsi nyíl az antitest<br />
kötésben lévő komplex lassú mozgására, a nagy nyíl a<br />
szabad, jelzett analitok gyors forgó mozgására utal)
Automatizáció a fehérjeanalitikában<br />
171<br />
huzamos, ill. azzal 90º-os szöget bezáró polarizációs<br />
szűrőn keresztül detektáljuk. A polarizációs fok a két<br />
szűrőállasra kapott intenzitás értékekből, egyszerű<br />
képlet segítségével számítható. Az elmondottak alapján<br />
amennyiben a jelzett analit az antitesthez kötődni<br />
tud, mozgása lelassul, a polarizációs fok nő. Tehát a<br />
fluoreszcenciapolarizáció értéke fordítottan arányos a<br />
mintában lévő, mérni kívánt molekulák koncentrációjával<br />
(7-17. ábra).<br />
A homogén módszer előnye az egyszerűség és a gyorsaság,<br />
mivel nincs szükség szeparációra és mosásra.<br />
Hátránya, hogy pl. az FPIA-eljárás csak kisméretű<br />
antigének mérésekor használható. A korábbiakban<br />
vázolt FRET-technika viszont már alkalmas fehérjék<br />
mennyiségi meghatározására is homogén assay-ben,<br />
pl. a prokalcitonin mérése ilyen elv alapján is lehetséges.<br />
A mennyiségi meghatározások alapvető kérdése a<br />
megfelelő standardok alkalmazása és maga a standardizálás<br />
módja. Mivel 10 –12 mol/l vagy annál is kisebb<br />
koncentrációk méréséről van szó, ezért nagyon fontos<br />
a megfelelő tisztaságú készítmények használata,<br />
ezt ma már sokszor rekombináns fehérjékkel, peptidekkel<br />
érik el. A legtöbb cég a diagnosztikai kiteknél<br />
megadja a standardok visszavezethetőségét is. A<br />
kalibrációra használható többpontos módszer (rendszerint<br />
6 standard segítségével), ill. ún. mesterkalibráció.<br />
Mindkét esetben parallel méréseket kell végezni,<br />
készüléktől függően duplikátumban vagy akár<br />
négyes parallelben. Általánosan igaz, hogy kalibrációt<br />
az immunoassay-knél 2 hetente, új gyártási számú<br />
(lot-szám) reagens használatakor, ill. a minőség-ellenőrzési<br />
szabályok szerinti, rekalibrációt igénylő hiba<br />
esetén kell végezni. Az automatizált technikáknál a<br />
legtöbb készülék vezérlő számítógépébe vonalkódos<br />
beolvasással be kell vinni az adott módszerre, kalibrátorra,<br />
reagens lot-számra jellemző kalibrációs görbe<br />
adatait, és a készülék összehasonlítja az aktuálisan<br />
mért jeleket a gyárilag definiált jelekkel. Szintén előre<br />
definiált adatok alapján a készülék vezérlőegysége jelzi,<br />
hogy sikeres volt- e a kalibráció, a megengedettnél<br />
nagyobb eltérés esetén sok műszer automatikusan le<br />
is tiltja a mérést. A manuálisabb technikáknál (pl. bevont<br />
csöves, ELISA-módszerek) a felhasználónak kell<br />
eldöntenie, hogy a kalibráció megfelelő volt- e vagy<br />
sem. Általános szempont még, hogy a kalibrátoroknak<br />
ugyanabban a közegben (mátrix) kell lenniük,<br />
mint a mintáknak.<br />
Hatpontos kalibráció<br />
Parallel mérések szükségesek, a mérési pontok átlagából<br />
a készülékek megrajzolják a kalibrációs görbét<br />
vagy kiszámolják annak egyenletét. Kompetitív eljárásnál<br />
fordított a jel–koncentráció arányosság, telítési<br />
assay-nél egyenes (7-18. ábra).<br />
Szokás a kalibrációs görbét a kötött/szabad antigén<br />
arányában is megadni, ekkor pl. egy kompetitív assay<br />
mérési pontjai a 7-19. ábrán látható módon néznek<br />
ki, bonyolult matematikai ún. 4 paraméteres illesztési<br />
algoritmus felhasználása után.<br />
A kalibrációs görbe esetenként „kiegyenesíthető”<br />
az ábrázolásmód függvényében (pl. logit-log, log-log<br />
Az immunoassay-k kalibrációjának módjai<br />
7-18. ábra. Jel–koncentráció összefüggés<br />
a) Kompetitív assay esetében<br />
b) Telítési assay esetében<br />
7-19. ábra. Kompetitív assay négyparaméteres illesztésű<br />
kalibrációs görbéje a kötött–szabad antigénhányad (% B/<br />
B 0<br />
) alapján. A vízszintes tengely logaritmikus skálájú.
172 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
stb. átszámítás/átalakítás/transzformáció). A készülékek<br />
megadják a kalibrátorok névleges értékeit és az<br />
aktuális görbe alapján visszaszámolt koncentrációkat.<br />
A visszaszámolt értékek és a névleges értékek összehasonlításával<br />
a kalibráció elfogadhatósága megítélhető.<br />
Mestergörbén alapuló kalibráció<br />
Kiterjedten alkalmazott módszer, számos előnynyel<br />
rendelkezik. A módszertől, a detektálás elvétől<br />
függően rendszerint két „igazító, korrigáló” (adjustor)<br />
standard szükséges, amely lefedi a lineáris mérési<br />
tartományt (alacsony, magas adjustor). A gyártó<br />
egy adott reagens és kalibrátor lot-számra több készüléken<br />
sok párhuzamos mérést végez 6–10 kalibrátorkoncentráció<br />
felhasználásával, a kapott átlagjelek<br />
és a koncentráció képezi az adott rendszerre nézve<br />
igaz ún. mestergörbét. A gyártó a mestergörbére kapott<br />
jelek adatait mellékeli a reagenshez vonalkód<br />
formájában, amelyet kalibrálás előtt be kell olvasni a<br />
készülékbe. Ezután következik a saját készülék illesztése<br />
a gyári ún. alapkészülékhez. Ez valójában nem<br />
tekinthető a hagyományos értelemben vett kalibrációnak,<br />
mert azt a gyár már elvégezte. Az „igazító”<br />
kalibrátorok (2–4 parallel) mérésekor kapott jelet a<br />
készülék számítógépes algoritmusa megvizsgálja és<br />
összehasonlítja a mestergörbe megfelelő mérési pontjainak<br />
jelével (pl. fotonszám). Amennyiben az azonos<br />
koncentrációra kapott, gyártó által megadott és saját<br />
magunk által mért fotonszámokat megvizsgáljuk, lineáris<br />
összefüggést találunk, függetlenül a kalibráció<br />
típusától. A 2 adjustor jeléből egyenest képezve és az<br />
egyenes egyenletét összehasonlítva a gyári adatokkal,<br />
megkapjuk az aktuális „igazító” egyenes egyenletét:<br />
y = a*x + b<br />
ahol y a gyári adat, x a saját adjustorra mért adat,<br />
a az egyenes meredekségének együtthatója, b pedig<br />
a tengelymetszet. Ideális esetben a saját egyenesünk<br />
pontosan illeszkedik a gyártó által megadott<br />
adatokra, ezért a meredekségi együttható értéke 1,0<br />
lesz. Amennyiben a saját készülékre kapott egyenes<br />
egyenlete eltér a gyártó által megadottól, az aktuális<br />
meredekséget a rendszer a mestergörbe meredekségéhez<br />
illeszti az „a” együttható korrekciójával. A még<br />
elfogadható korrekciós tartomány 0,8–1,2 között változhat.<br />
Ennél nagyobb eltérés esetében durva hibával<br />
kell számolnunk, és a hiba felderítése, kiküszöbölése<br />
után újra kell kalibrálnunk. A rendszer a tengelymetszet<br />
értékét is figyeli, ennek különösen a kompetitív<br />
assay-knél van jelentősége. Egy grafikus ábrázolású<br />
példát a mesterkalibrációra a 7-20. ábrán mutatunk.<br />
Példa egy mesterkalibrációra: TNF-α kalibrációs<br />
egyenlete. TNF Kit Lot 153, az illesztett egyenes adatai:<br />
meredekség (a) 1,068, tengelymetszet (b) 3226<br />
cps. A kalibráció megfelel az elfogadhatósági kritériumoknak.<br />
A mesterkalibráció előnye, hogy a mestergörbe<br />
minden egyes pontja (szemben a felhasználó által<br />
mindig aktuálisan végzett 6 pontos kalibrációval) a<br />
gyártó által sok-sok parallel mérés alapján nagy pontossággal<br />
jellemzi az adott adjustorra elvárható jel<br />
nagyságát. További előny a reagensmegtakarítás, a 12<br />
mérési pont helyett rendszerint csak 4 mérést kell végeznünk.<br />
Természetesen mindegyik típusú kalibráció<br />
után kétszintű, független kontrollméréssel ellenőrizzük<br />
a módszert.<br />
Analitikai interferenciák<br />
„igazító” 1<br />
„igazító” 2<br />
7-20. ábra. Mesterkalibráció: a gyártó által megadott és a<br />
saját mérés alapján kapott értékek összevetése. Az alapkészülék<br />
és a saját készülék kalibrációjának egymáshoz való<br />
viszonyítása<br />
Az interferenciák egy része a betegek mintáinak sajátságaiból<br />
is származhat. Itt azokra a zavaró tényezőkre<br />
térünk ki, amelyek in vitro képesek a valóságtól eltérő<br />
eredményeket produkálni.<br />
Hemolízis, lipaemia, sárgaság<br />
Az immunkémiai módszerek a hagyományos fotometriánál<br />
kevésbé érzékenyek ezekre a tényezőkre.
Automatizáció a fehérjeanalitikában<br />
173<br />
Minden teszt leírásában megtalálhatók azok a kritikus<br />
határértékek, amelyek felett a vizsgálatot elvégezni<br />
nem szabad.<br />
Heterofil antitestek jelenléte a mintában<br />
Az átlagpopulációban is előfordul, hogy a betegek<br />
vérszéruma ismeretlen okok miatt heterofil antitesteket<br />
tartalmaz különböző állati immunglobulinok<br />
ellen. Ez különösen állatgondozók vagy háziállatot<br />
tartók vizsgálatakor lehet probléma. Mivel a tesztek<br />
állati antitesteket tartalmaznak, ezért a beteg állati<br />
immunglobulin-ellenes ellenanyagai interferálhatnak<br />
a kitben található antitestekkel, hamisan magas vagy<br />
alacsony eredményt adva (a teszt típusától függően).<br />
Külön ki kell térnünk az antiegér-immunglobulin<br />
kérdésére.<br />
HAMA (heterofil antiegér antitest). A monoklonális<br />
immunglobulinok jó része egér eredetű, ezért<br />
az egérimmunglobulin-ellenes antitestek különösen<br />
nagy problémát okozhatnak az immunkémiai módszereknél<br />
(pl. tumormarkermérések). A jelenség gyakorisága<br />
nő, sok beteg kap egérimmunglobulin-készítményt<br />
diagnosztikai vagy terápiás céllal (pl. az ún.<br />
célzott immunterápia alkalmával). A telítési immunoassay-kben<br />
okoz problémát, szintén hamisan magas<br />
vagy alacsony eredményeket előidézve.<br />
Analitellenes autoantitestek<br />
Lehetnek a mintában a mérni kívánt analit elleni<br />
immunglobulinok is, erre jó példa az anti-Tg autoantitest.<br />
Ezért Tg-vizsgálat kérésekor érdemes az anti-Tg-titert<br />
is ellenőrizni, mert magas érték esetében<br />
a Tg-meghatározás eredménye fenntartással kezelendő.<br />
Más, saját fehérje elleni autoantitestek is előfordulhatnak,<br />
pl. CK, fehérjehormonok, troponin stb.<br />
A reumatoid faktor (RF) szerepe<br />
Titere az életkorral nő, időseknél akár 80%-os is lehet<br />
a magas RF incidenciája. Az RF sajátsága, hogy<br />
hasonlóan a heterofil antitestekhez, bármilyen állati<br />
immunglobulinhoz képes hozzákötődni, meghamisítva<br />
a mérési eredményt.<br />
7-21. ábra. „High dose hook” effektus jelenség. Extrém<br />
nagy analitkoncentrációnál gátolt a jelölt immunkomplexek<br />
kialakulása, a mért jel a valóságos koncentrációhoz<br />
tartozónál kisebb (lehet akár a referenciatartományon belül<br />
is)<br />
„High dose hook” effektus<br />
Valójában a mérni kívánt antigén extrém mennyisége<br />
idézi elő a jelenséget telítési assay-kben. A laboratóriumi<br />
szakember számára észrevehetetlen hiba,<br />
a kapott hamis eredmény gyakran a referenciatartományba<br />
esik. A jelenség in vitro jön létre a mérőrendszerben,<br />
mert az antigén extrém nagy mennyisége<br />
gátolja a szekunder jelzett antitesttel kialakítandó<br />
szendvics létrejöttét, és a mosási fázis után tévesen<br />
alacsony jelet kapunk (7-21. ábra).<br />
A jelenséget csak a beteg kezelőorvosa veszi észre,<br />
amennyiben az alacsony érték nem illik a klinikai<br />
képhez. Konzultáció után a hiba kiküszöbölhető a<br />
minta hígításával és újramérésével. Mindaddig hígítani<br />
kell a mintát, amíg az eredmény már nem mutat<br />
további koncentrációnövekedést.<br />
Interferenciák kiküszöbölésének<br />
lehetőségei<br />
Elsősorban a beteg szérumában jelen lévő antitestinterferencia<br />
csökkentésére törekszenek. Az egyik<br />
lehetséges módszer pl. az analit szempontjából semleges<br />
állati (egér) immunglobulin hozzáadása a reagensekhez<br />
(blokkolás). Csökkenthetjük az RF zavaró<br />
hatását immunglobulin-fragmentek (FAb2’) alkalmazásával<br />
is. Az ún. visszanyerési (recovery) módszerek<br />
is használhatók pl. a Tg esetében, de valójában nem<br />
váltották be a hozzájuk fűzött reményeket.<br />
Talán az egyik legegyszerűbbnek látszó eljárás az, ha<br />
interferencia gyanújakor a mintát egy másik módszerrel,<br />
másik antitesttel dolgozó laboratóriumba is<br />
elküldjük és összehasonlítjuk az eredményeket.
174 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
Különböző immunkémiai módszerek<br />
érzékenységének összehasonlítása<br />
A 7-1. táblázatban feltüntettük a klasszikus (jelölőt<br />
nem tartalmazó) és a <strong>modern</strong> immunanalitikai módszerek<br />
becsült kimutathatósági határértékeit. Az adatok<br />
csak tájékoztató jellegűek, mert fehérjék esetében<br />
sokszor nem tudjuk moláris koncentrációban megadni<br />
az analit mennyiségét, ill. a jelölőt nem alkalmazó<br />
módszereknél ma már (a korábban is leírt) sokféle<br />
érzékenységnövelő eljárást alkalmaznak a különböző<br />
gyártók.<br />
Irodalom<br />
Bangs, L. B.: New developments in particle-based immunoassays:<br />
introduction. Pure & Appl. Chem. 68(10):<br />
1873–1879, 1996.<br />
Forkman, J.: Optimal Calibration in Immunoassay and<br />
Inference on the Coefficient of Variation. Doctoral Thesis,<br />
Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala,<br />
2008.<br />
Tate, J., Ward, G.: Interferences in Immunoassay. Clin.<br />
Biochem. Rev. 25(2):105–120, 2004.<br />
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1904417/)<br />
http://www.bangslabs.com/files/bangs/docs/pdf/304.pdf<br />
http://www.slideshare.net/many87/immunological-methods-of-analysis-1<br />
http://www.cwc.nic.in/main/HP/download/35%20Emission%20Spectroscopy%20and%20Nephelometry.pdf<br />
http://www.rcpa.tv/parts/educational/immunology/<br />
RCPA3.pdf<br />
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&-<br />
pid=S0036-46652000000300008<br />
http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=<br />
1CC1AF24-9D9B-4D21-B850-688931CF7E3B<br />
http://books.google.hu/books?id=_9kEeTjyJdMC&printsec=frontcover#v=onepage&q&f=false<br />
7-1. táblázat. Immunkémiai módszerek becsült (analitikai) kimutathatósági határértékei<br />
Jelölőt nem alkalmazó módszer<br />
immunprecipitáció<br />
immunturbidimetria<br />
immunnefelometria<br />
Kimutathatósági határ (tömeg/térfogat koncentráció)<br />
> 0,1 g/l<br />
> 0,05-5 mg/l<br />
> 0,01 mg/l<br />
Jelölőt tartalmazó módszer Kimutathatósági határ (moláris koncentráció; mol/l) Alkalmazott assay típusa<br />
RIA 10 -12 -10 -13 heterogén<br />
FIA 10 -11 heterogén<br />
FPIA, FRET 10 -9 homogén<br />
LIA, ECLIA 10 -12 heterogén<br />
EIA 10 -12 heterogén
Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria<br />
175<br />
Műszeres analitikai lehetőségek –<br />
Tömegspektrometria<br />
Márk László<br />
A tömegspektrometria (mass spectrometry, MS)<br />
napjaink legáltalánosabban alkalmazott analitikai<br />
eljárása, amely alkalmas szerves és szervetlen komponensekből<br />
képződött ionok tömeg/töltés (m/z)<br />
arányának nagyhatékonyságú meghatározására. Kezdetben<br />
az eljárást tömegspektroszkópiának nevezték,<br />
hiszen az ionok egy fluoreszkáló ernyőn detektálták,<br />
azonban ez az elnevezés napjainkban nem használatos.<br />
A tömegspektrometria lényege, hogy a vizsgálandó<br />
vegyületek gáz halmazállapotú részecskéiből ionokat<br />
állít elő, majd ezeket a relatív tömegük és töltésük hányadosa<br />
szerint szétválasztja és detektálja.<br />
A tömegspektrometriás eljárások közel 100 éve<br />
járulnak hozzá a fizikai, kémiai, biológiai és orvosi<br />
kutatások rohamos fejlődéséhez. Napjainkban a<br />
tömegspektrométerek méretének és árának jelentős<br />
csökkenése nagyban elősegíti a módszerek elterjedését,<br />
így jelenleg ez az egyik legdinamikusabban<br />
fejlődő és legtöbbet alkalmazott analitikai eljárás.<br />
Rutinszerűen alkalmazható széles tömeg- és polaritástartományban<br />
különféle vegyületek tömegének<br />
és szerkezetének vizsgálatára. Intenzív a fejlesztés a<br />
különböző ionforrások területén is, amelynek eredményeként<br />
jött létre a két leggyakrabban alkalmazott<br />
technika:<br />
• Mátrixsegített lézerdeszorpció (MALDI, Matrix<br />
Assisted Laser Desorption Ionization).<br />
• Elektrosprayionizációs (ESI, ElectroSpray<br />
Ionization) technika.<br />
Ezek kifejlesztése alapvető fontosságú volt a <strong>modern</strong><br />
tömegspektrometria fejlődésében, hiszen segítségükkel<br />
lehetőség nyílt nagy molekulatömegű, nem<br />
illékony biopolimerek, peptidek, fehérjék, valamint<br />
szintetikus rendszerek szerkezetének komplex tanulmányozására.<br />
Általánosan kijelenthetjük, hogy tömegspektrométerek<br />
rendkívül kis anyagmennyiségű<br />
minták (subfemtomol) gyors, pontos, megbízható<br />
analízisére alkalmasak, és az elválasztástechnikában<br />
használatos módszerekkel (HPLC, UPLC, nanoLC,<br />
nanoUPLC, gélelektroforézis) jól kombinálható készülékek.<br />
A tömegspektrométer elvi felépítése<br />
A tömegspektrométer-készüléknek rendelkeznie kell<br />
mintabevivő rendszerrel, ionforrással, analizátorral<br />
és detektorral, valamint az ezekhez kapcsolódó<br />
számítógépes adatfeldolgozó és irányító rendszerrel<br />
(7-22. ábra). Az analizátor, a detektor és a nem légköri<br />
nyomáson működő ún. vákuumionforrások (pl.<br />
vákuum-MALDI) viszonylag jelentős vákuum (10 –4 –<br />
10 –7 mbar) mellett üzemeltethetők. A nagyvákuum az<br />
ion-molekula ütközések minimalizálását szolgálja, de<br />
hozzájárul az ionizáció és a fragmentáció hatékonyságához<br />
is. A nem kívánt kinetikai kölcsönhatások<br />
módosíthatják az ionok repülési pályáit, részben vagy<br />
teljesen kiolthatják töltésüket, és így reprodukálhatatlanná<br />
tehetik a tömegspektrumot, valamint csökkentik<br />
a műszer érzékenységét és felbontását.<br />
A vákuumrendszer<br />
Az ionforrást elhagyó töltéssel rendelkező részecskék<br />
m/z értékének pontos meghatározása csak akkor lehetséges,<br />
ha az analizátorban és a detektorban az ionok<br />
energiája – a nem kívánt ütközések miatt – nem<br />
változik meg. Ennek érdekében a tömegspektrométer<br />
e részeiből el kell távolítani a gázmolekulákat. A mo-<br />
7-22. ábra. A tömegspektrométer elvi felépítése<br />
7-23. ábra. A tömegspektrométerben uralkodó nyomásviszonyok
176 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
dern tömegspektrométerekben a nagyvákuumot két<br />
lépésben állítják elő. Elsőként egy elővákuum-szivatytyú<br />
10 –2 –10 –3 mbar vákuumot hoz létre, erre a célra<br />
általában rotációs szivattyút alkalmaznak, de használható<br />
olajmentes csavarszivattyú is. A 10 –5 –10 –7 mbar<br />
nagyvákuumot egy vagy több turbómolekuláris szivattyú<br />
biztosítja. A tömegspektrométerben kialakuló<br />
tipikus nyomásértékeket a 7-23. ábra szemlélteti. A<br />
vákuumrendszer stabilitása és megbízható működése<br />
elengedhetetlen a tömegspektrométer megfelelő üzemeléséhez,<br />
meghibásodásuk a tömegspektrométer<br />
számára végzetes lehet, mivel a nagyvákuumba hirtelen<br />
beáramló anyagok (olajgőz, vízpára) súlyosan<br />
károsítják a műszert és tartozékait. Ennek elkerülése<br />
érdekében a vákuumrendszer gondos karbantartást<br />
és folyamatos áramellátást igényel.<br />
Mintabevitel<br />
Tömegspektrometriával elméletileg bármilyen halmazállapotú<br />
sokkomponensű rendszer vizsgálható,<br />
azonban ezt nagyban befolyásolja az alkalmazott<br />
mintabeviteli és ionizációs technika. Illékony vegyületeket<br />
(pl. gázok, könnyen párolgó anyagok) közvetlenül<br />
be lehet vezetni a forrásba, ahol az ionizáció<br />
megtörténik. Ha a vegyület nem illékony, akkor először<br />
fel kell oldani, majd valamilyen alkalmas megoldással<br />
gázfázisba kell juttatni, amely előidézhető pl.<br />
elektromos erőtér vagy porlasztás és szárítógáz segítségével.<br />
Az oldószer helyes megválasztása alapvetően<br />
befolyásolja a tömegspektrum minőségét. Általánosságban<br />
kerülendő a pufferek és a nem illékony sók alkalmazása.<br />
Egyszerű, néhány komponensű minták, ill. kalibrációs<br />
standardok esetében alkalmazhatunk közvetlen<br />
adagolást, amelynek során egy automata infúziós<br />
pumpa és egy fecskendő segítségével juttatjuk a<br />
mintát tartalmazó oldatot az ionforrásba. Komplex<br />
biológiai mintáknál szinte minden esetben szükség<br />
van a komponensek előzetes elválasztására is, erre alkalmazhatunk<br />
többek között gázkromatográfot vagy<br />
HPLC-készüléket. A fejlesztések folyamán a folyadékkromatográfia<br />
és a tömegspektrometria összekapcsolása<br />
során legnagyobb megoldandó probléma a<br />
vákuum stabilitásának megőrzése volt, hiszen az ionforrásba<br />
bekerülő mintamolekulák és oldószergőzök<br />
rontják a vákuumot. Napjainkban azonban a nagy<br />
7-24. ábra. A MALDI TOF tömegspektrometriánál használatos,<br />
a minta töményítésére is alkalmas rozsdamentes<br />
acél mintatartó tálca<br />
hatékonyságú vákuum- és zsiliprendszerek használatával,<br />
ill. a mikro és a nano áramlási sebességek alkalmazásával<br />
ez a probléma kiküszöbölhető.<br />
A lézerdeszorpcióra épülő ionizációs eljárások során<br />
a mintát szilárd állapotban viszik be, ennek során<br />
a vizsgálandó mintát általában mátrix jelenlétében<br />
egy mintatartó tálcára kristályosítják. A mintatartók<br />
mérete és kialakítása igen változatos lehet, azonban<br />
a legelterjedtebb a 384 férőhelyes well-plate méretű<br />
formátum, amely könnyűvé teszi a módszerek automatizálását.<br />
A mintatartók anyaga is eltérhet, általában<br />
valamilyen kémiai szempontból ellenálló fémből<br />
készülnek, így igen elterjedtek a rozsdamentes<br />
acél, alumínium- és aranybevonattal ellátott tálcák,<br />
de léteznek egyszer használatos műanyag változatok<br />
is (7-24. ábra). Néhány klinikai (pl. lézersebészet)<br />
és gyógyszergyári alkalmazásnál elterjedőben van a<br />
közvetlen deszorpción alapuló ionizáció is, amelynek<br />
során a minta, pl. gyógyszertabletta, szövetminta<br />
közvetlenül érintkezik az ionizációt kiváltó lézerrel.<br />
Ionforrások<br />
A tömegspektrometriában szükség van a vizsgált<br />
részecskék hatékony ionizálására, mivel a részecskék<br />
készülékben való mozgatása és szétválasztása<br />
az elektromos töltésükre gyakorolt hatáson alapul.<br />
A megfelelő érzékenység eléréséhez elengedhetetlen<br />
az ionizációs paraméterek optimalizálása. Az ionizációs<br />
technika megválasztását főként a vizsgálandó<br />
molekula és az azt körülvevő mátrix határozza meg.<br />
Mivel univerzálisan alkalmazható ionizációs technika<br />
nincs, így a készülékek fejlődésében meghatározó<br />
szerepű a különböző ionforrások cseréjének gyorsasága<br />
és egyszerűsége. Ennek következtében főként az
Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria<br />
177<br />
atmoszferikus nyomású ionforrások terjedtek el, hiszen<br />
azok függetlenek a készülék vákuumrendszerétől,<br />
így cseréjük, tisztításuk, karbantartásuk gyorsan<br />
és könnyen elvégezhető. A vákuumionforrások közül<br />
a legjelentősebb a MALDI, ennek karbantartási igénye<br />
jóval kisebb a folyadékkromatográfiával kapcsolt<br />
változatokénál.<br />
A legrégibb és igen gyakran alkalmazott eljárás az<br />
elektronionizáció (EI). Ebben az esetben a minta egy<br />
fűtött katódból kilépő elektronnyalábbal találkozik,<br />
és az ütközések révén elektronok lépnek ki, így pozitív<br />
ionok jönnek létre. Az elektronok ideális gyorsító<br />
feszültsége jellemzően 70 volt. A módszer jól alkalmazható<br />
a könnyen gázfázisba vihető szerves vegyületek<br />
széles körének vizsgálatára kb. 1000 Da molekulatömegig.<br />
Előnye, hogy intenzív, stabil, könnyen<br />
reprodukálható ionáramot biztosít, és kompatibilis a<br />
legtöbb tömeganalizátorral. Hátránya azonban, hogy<br />
megfelelő eredményességgel csak a viszonylag illékony,<br />
kis molekulatömegű, stabil vegyületek vizsgálatára<br />
alkalmazható, a jelentős fragmentáció miatt a<br />
tömegspektrum bonyolult, gyakran a molekulaion<br />
nem jelentkezik. Az elektronionizáció során alkalmazott<br />
magasabb hőmérsékleten egyes anyagok bomlást<br />
szenvedhetnek az alkalmazott ionizáló energiától<br />
függő mértékben. Ez a jelenség, a forrásban történő<br />
bomlás (in source decay, ISD), megfelelően alkalmazva<br />
hasznos lehet szerkezetvizsgálatokhoz, mivel<br />
további elemzésre felhasználható, anyagi minőségre<br />
jellemző töredékionok (fragmensek) képződnek.<br />
Ennek elkerülésére alakultak ki a kíméletes (soft)<br />
ionizációs technikák, amelyek kevesebb fragmentumot<br />
hoznak létre, így a spektrum egyszerűbb, könynyebben<br />
értékelhető. A lágy ionizációs módszereket<br />
három csoportba soroljuk: részecskeütközéses technikák,<br />
párolgáson-porlasztáson alapuló módszerek<br />
és lézerdeszorpciós módszerek.<br />
• Részecske ütközésen alapuló technikák:<br />
– kémiai ionizáció (CI);<br />
– szekunder ion tömegspektrometria (SIMS);<br />
– gyors atom- és ionütköztetés (FAB, FIB);<br />
– plazmadeszorpció (PD).<br />
• Párolgáson-porlasztáson alapuló eljárások:<br />
– térdeszorpció (FD);<br />
– térionizáció (FI),<br />
– termikus porlasztásos (TS) atmoszférikus<br />
nyomáson lejátszódó kémiai ionizáció;<br />
– f otoionizáció (APCI, APPI);<br />
– elektroporlasztásos (ESI, nanoESI, DESI) ionizáció.<br />
• Lézerdeszorpciós (LDI) technikák közül a jelentősebbek:<br />
– mátrixsegített lézerdeszorpció (MALDI);<br />
– felületsegített lézerdeszorpciós ionizáció<br />
(SELDI).<br />
Kíméletes eljárást jelent a kémiai ionizáció (chemical<br />
ionization, CI), amelynek lényege, hogy először egy<br />
nagy fölöslegben jelen lévő reagens gázt ionizálunk, és<br />
az így képződött ionok a minta molekuláival reagálva<br />
azokat ionizálják. Ezt a jelenséget, amikor az ionizáció<br />
ion–molekula kölcsönhatás eredményeként jön létre,<br />
1913-ban J. J.Thomson figyelte meg hidrogéngázban.<br />
A leggyakoribb reagensgázok: metán, izobután, ammónia,<br />
klór, dinitrogén-oxid. Minthogy a kölcsönhatások<br />
valószínűsége arányos a nyomással, ezeket az<br />
ionforrásokat általában légköri nyomáson működtetik.<br />
Ennek a módszernek az előnye a kíméletes ionizáció,<br />
így kevesebb fragmens ion képződik, valamint<br />
általában megjelenik a spektrumban a pozitív vagy negatív<br />
molekulaion. Pozitív ionizáció esetén gyakori a<br />
[M+H] + protonált kvázi-molekulaion megjelenése is.<br />
A szekunder ion tömegspektrometria (SIMS) esetében<br />
a sík – általában fém – felületen elhelyezett mintát<br />
részecske- vagy ionnyalábbal bombázzuk, és a<br />
mintából kibocsátott szekunder ionokat analizáljuk.<br />
Ide tartozik a plazmadeszorpció és a folyadék szekunder<br />
ion tömegspektrometria (LSIMS).<br />
A plazmadeszorpció (PD) elve, hogy a vizsgálandó<br />
mintát vékony filmrétegre viszik fel, és e mögé, a mintával<br />
ellentétes oldalra, helyezik el az erősen α-sugárzó<br />
252 Cf radioaktív izotópot. Az izotópból kilépő nagy<br />
energiájú hasadási termékek a mintán való áthaladáskor<br />
helyi felmelegedést okoznak és mikroplazmát<br />
hoznak létre; így energiát adnak át a minta molekuláinak,<br />
amelyek ionizálódnak és deszorbeálódnak. A<br />
PDMS volt az első módszer, amelynek segítségével<br />
nagy molekulatömegű fehérjék, ill. összetett antibiotikumok<br />
vizsgálhatók voltak.<br />
A folyadék szekunderion tömegspektrometria<br />
(LSIMS) technika napjainkban is használatos elsősorban<br />
a hőre érzékeny vagy nem illékony kis és közepes<br />
molekulatömeggel rendelkező anyagok esetében.<br />
Két alapvető módszert különíthetünk el:<br />
• A gyors atombombázás (fast atom bombardment,<br />
FAB) során egy atomágyúból gyors
178 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
argon- vagy xenonnyalábot bocsátanak a mintára,<br />
amely viszkózus, kevéssé illékony folyadékban,<br />
többnyire glicerinben van oldva.<br />
• A gyors ionbombázás (fast ion bombardment,<br />
FIB) esetében céziumionokat (Cs + ) alkalmaznak.<br />
A részecskék a folyadékfelszínbe ütközve<br />
energiát adnak át a felszínnek, amely eloszlik a<br />
felületi réteg mintamátrix molekulái között,<br />
azok ionizációját eredményezve. A képződő<br />
minta- és mátrixionok kiszakadnak a felszínről,<br />
és az így létrejött szekunder ionokat analizáljuk.<br />
A folyadékfilm felületi rétege diffúziós folyamatok<br />
révén állandóan pótlódik, frissül, ennek<br />
köszönhetően az analizált felület folyamatosan<br />
regenerálódik.<br />
A FAB hőérzékeny, poláros, 300–6000 Da tömegű<br />
molekulák vizsgálatára alkalmas, a FIB pedig elsősorban<br />
nagyobb részecsketömegek esetén (akár 30 000<br />
Da). A módszer szerkezeti információkat is nyújt,<br />
mivel jellegzetes fragmensionok is képződnek. Napjainkban<br />
is folyamatos a módszer fejlesztése, többek<br />
között nagyon ígéretes eredményeket értek el fullerénionok<br />
(C 60+<br />
) ionizáló részecskeként való alkalmazásával.<br />
A térdeszorpció és a térionizáció a deszorpciós<br />
módszerek közé tartozó rokon ionizációs technikák,<br />
amelyeknek főként történelmi jelentősége van. Mindkét<br />
esetben a minta ionizációját erős elektromos tér<br />
váltja ki, a módszerek tulajdonképpen csak a mintabeviteli<br />
módban különböznek egymástól. A vizsgált<br />
részecskék szerkezetéről ugyan kevés információt<br />
szolgáltatnak, azonban tömegpontosságúk jó.<br />
A porlasztáson alapuló ionizációs eljárások különösképpen<br />
a folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrométerek<br />
esetében számítanak nélkülözhetetlen<br />
megoldásnak. A módszer elvét már a hatvanas<br />
években kigondolták, de a megvalósítás a nyolcvanas<br />
évekig váratott magára. A termikus porlasztás jelentette<br />
az első igazi előrelépést a hőre érzékeny, nem illékony<br />
anyagok MS-, ill. LC-MS-vizsgálatának területén.<br />
Elve, hogy a folyadékkromatográfiás oszlopon<br />
szétválasztott komponenseket és a mozgófázist nagy<br />
nyomással egy elektromosan melegített (100–200 ºC)<br />
fémkapillárisba juttatják, amelynek vége a tömegspektrométer<br />
ionforrásában van, így a minta és az<br />
oldószergőzök nagy sebességű ionizált spray formájában<br />
kerülnek be a tömegspektrométerbe. Ebben az<br />
esetben az ionizációt az oldószer (mozgófázis) illékony<br />
elektrolitjai valósítják meg.<br />
A leggyakrabban alkalmazott porlasztásos ionizációs<br />
forma az elekrospray (ESI, nanoESI), amelynek<br />
során a kromatográfról lejövő minta egy fém vagy<br />
fémbevonatú szilika kapillárison halad keresztül,<br />
amelyre 2–5 kV feszültséget kapcsolnak. A kapilláristól<br />
és a tőle 1-2 cm-re, nanoESI esetén néhány mm-re<br />
elhelyezett, ellentétes töltésű elektród között erős<br />
elektrosztatikus tér képződik, ennek hatására a kapillárisból<br />
kilépő folyadék kúpszerűen kicsúcsosodik<br />
(Taylor-kúp), és róla töltéssel rendelkező folyadékcseppek<br />
szakadnak le.<br />
A technika továbbfejlesztése nagyobb áramlási sebességek<br />
(100–300 μL/perc) mellett is jól alkalmazható.<br />
Itt a kapilláris körül elhelyezkedő külső csőben<br />
vezetett inert porlasztógázzal (többnyire nitrogénnel)<br />
pneumatikusan hozzuk létre a töltött aeroszolt a folyadékmintából.<br />
A folyadékcseppekből az oldószer<br />
párolgását további nagy mennyiségű, fűtött (200–300<br />
ºC) nitrogénárammal segítjük elő. A párolgás során<br />
a cseppecskék térfogata csökken, így a felületi töltéssűrűség<br />
egyre nagyobb lesz, ami végül a cseppek felbomlását<br />
(Coulomb-robbanás) okozza. A folyamat<br />
végén a mintából származó kompakt, többszörösen<br />
töltött ionokat kapunk (7-25. ábra). Az ESI elsősorban<br />
a nem illékony, poláros, bázikus csoportot hordozó<br />
molekulák vizsgálatához ideális.<br />
A porlasztásos és a kémiai ionizációs eljárások<br />
kombinációja a légköri nyomású kémiai ionizáció (atmospheric<br />
pressure chemical ionization, APCI). Az<br />
aeroszol képződését és elpárologtatását az ESI-nél ismertetett<br />
módon idézik elő, de itt nem a kapilláris,<br />
hanem a mintaárammal szemben elhelyezkedő elektród<br />
áll nagyfeszültség alatt (koronafeszültség). E körül<br />
a koronakisülések hatására az elpárolgott víz- és<br />
egyéb oldószer-molekulák ionizálódnak, és protonálják<br />
az itt áthaladó mintát is (7-26. ábra). A módszer<br />
7-25. ábra. Az elektrospray-ionforrás (ESI) vázlatos működési<br />
elve
Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria<br />
179<br />
7-26. ábra. Atmoszférikus nyomású kémiai ionforrás (APCI) vázlatos felépítése<br />
7-27. ábra. A mátrix segítette lézerdeszorpciós ionizáció<br />
elve<br />
nagy előnye, hogy lényegében bármilyen oldószer és<br />
puffer mellett használható.<br />
A lézerdeszorpciós ionizáció (LDI) lényege a mintamolekulák<br />
lézersugárral való elpárologtatása és<br />
ionizációja, azonban ilyenkor gyakran keletkeznek<br />
rövid élettartalmú fragmentionok. E problémák megoldását<br />
a nyolcvanas évek végén kifejlesztett mátrixsegített<br />
lézerdeszorpciós ionizáció (MALDI) jelentette.<br />
Ilyenkor a mintamolekulákhoz kis molekulatömegű,<br />
szerves ún. mátrixanyagot keverünk, amely elnyeli és<br />
közvetíti a lézer energiáját a vizsgálandó anyagnak, ill.<br />
ionizálja azt, miközben meggátolja a keletkezett ionok<br />
fragmentációját. A módszer egyik legkényesebb<br />
pontja az adott vizsgálathoz optimális mátrix kiválasztása,<br />
általában mustársavat (SA), α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat<br />
(HCCA, CHCA), 2,5-dihidroxi-benzoesavat<br />
(DHB) alkalmazunk. A minta-előkészítés<br />
során a mátrix és a mintaoldat keverékét (0,2–2 μl)<br />
a mintatartóra szárítjuk úgy, hogy lehetőleg homogén<br />
mikrokristályos szilárd elegyet kapjunk. A<br />
gyors lézerimpulzusok (50–100 Hz) ebből a szilárd<br />
felületből párologtatnak el anyagot, és ez az ionizált<br />
részecskefelhő kerül az analizátorba (7-27. ábra). A<br />
MALDI segítségével igen kíméletesen, de hatékonyan<br />
ionizálhatóak még nagy tömegű, bomlékony molekulák<br />
is (fehérjék, szénhidrátok, oligonukleotidok,<br />
polimerek), így igen elterjedt módszer a biológiai,<br />
orvosbiológiai kutatásokban. További előnye az óriási<br />
mintaáteresztő képessége, amely napi több ezer minta<br />
automatizált vizsgálatát is jelentheti.<br />
Analizátor<br />
Az analizátorban zajlik a képződött ionok szétválasztása<br />
a tömegük és a töltésük hányadosa (m/z) szerint.<br />
Minél kisebb az ion tömege, ill. minél nagyobb<br />
a töltése, annál nagyobb sebességre képes szert tenni<br />
egy adott elektromágneses erőtér hatására. Lényegében<br />
ezt használják ki az ionok transzportján alapuló<br />
módszerek. Az újabb, <strong>modern</strong>ebb készülékek inkább<br />
az ionok szelektív tárolása révén választják szét a részecskéket.<br />
Az analizátor jellemző paraméterei a maximális<br />
vizsgálható m/z érték, az áteresztőképesség (a<br />
detektált és a képződött ionok számának hányadosa),<br />
ill. egy adott tömegre jellemző maximális felbontóképesség<br />
(molekulatömeg/csúcsszélesség). A Fourier-transzformációs<br />
tömegspektrométerek esetében<br />
az utóbbi érték elérheti akár az egymilliót is.
180 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
7-30. ábra. A 3D ioncsapda analizátor felépítése<br />
7-28. ábra. Kettős fokuszálású szektoros analizátor elvi felépítése<br />
A legrégebbi típusok a szektoros analizátorok, ahol<br />
az ionok a haladásukra merőleges mágneses térbe<br />
jutnak. Itt az elektromágneses impulzusuk és a töltésük<br />
szerint különböző sugarú körpályákra térülnek.<br />
A mágneses térerősség értékét változtatva más és más<br />
ionok juttathatók a detektorra. Az ionnyalábot ezt<br />
követően egy elektrosztatikus analizátorban sebesség<br />
szerint fokuszálják, ahol az ionok a haladásukra<br />
merőleges elektromos térerősség mellett a kinetikus<br />
energiájuknak megfelelő körpályát követnek (7-28.<br />
ábra). A szektoros készülékeket nagy felbontás, nagy<br />
érzékenység és széles mérési tartomány jellemzi. Hátrányuk,<br />
hogy drágák, lassúak, nagy a technikai háttérigényük,<br />
napjainkban az izotóparány-méréseknél<br />
van gyakorlati jelentőségük.<br />
Az egyik legelterjedtebb analizátortípus az ún.<br />
kvadrupól (quadrupol, Q). Itt az ionok négy párhuzamos<br />
hengeres rúd között haladnak, amelyekre<br />
egyenáramot és nagyfrekvenciás váltóáramot kapcsolnak.<br />
A szemben lévő rudak azonos, a szomszédosak<br />
ellentétes polaritásúak, így közöttük oszcilláló<br />
elektromágneses tér alakul ki. A kvadrupólba bejutó<br />
különböző m/z értékkel rendelkező ionok különböző<br />
amplitúdójú kitéréseket végezve haladnak, azonban a<br />
rudak közti ideális pályát csak meghatározott m/z értékű<br />
ionok képesek tartani, a többi ion vagy elveszti<br />
a kinetikus energiáját, vagy a rudakba csapódik (7-<br />
29. ábra). A rudakra kapcsolt váltóáram frekvenciáját<br />
változtatva a kvadrupól mindig más-más m/z értékkel<br />
rendelkező ionokat enged a detektorba, így a teljes<br />
tömegtartomány végigpásztázható. A kvadrupól<br />
készülékek viszonylag egyszerűbben működtethetők,<br />
gyorsak, mennyiségi vizsgálatokra kiválóan használhatók,<br />
mivel lineáris tartományuk 5-6 nagyságrend,<br />
valamint jól kombinálhatók különféle ionforrásokkal<br />
és analizátorokkal. Hátrányuk, hogy tömegpontosságuk<br />
és felbontóképességük viszonylag alacsony.<br />
Hasonló elven működik az ioncsapda (iontrap, IT),<br />
amelynél egy gyűrű alakú és két másik elektród között<br />
jön létre az oszcilláló háromdimenziós elektromágneses<br />
tér. A bejutott ionok ebben az erőtérben<br />
haladnak egy körpályára kényszerítve, miközben a<br />
körre merőleges irányban rezgéseket végeznek (7-30.<br />
ábra). Lényeges újítás, hogy itt az ionok szétválasztására<br />
nem térben, hanem időben kerül sor; ha nö-<br />
7-29. ábra. A kvadrupól-analizátor felépítése és működési<br />
elve<br />
7-31. ábra. A lineáris (2D) ioncsapda analizátor felépítése
Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria<br />
181<br />
7-32. ábra. Az orbitrap analizátor vázlatos felépítése<br />
veljük a váltóáram amplitúdóját, akkor az ionok rezgőmozgása<br />
egyre fokozottabb lesz, és növekvő m/z<br />
sorrendben távoznak a kilépési elektród nyílásán a<br />
detektor felé (ún. tömegszelektív instabilitási üzemmód).<br />
Az ioncsapda előnye a nagyobb érzékenység és<br />
felbontóképesség, a gyorsabb működés, a szélesebb<br />
mérési tömegtartomány és a többszörös fragmentáció<br />
(MS n ) lehetősége. Hátránya a mennyiségi mérések<br />
korlátozott lehetősége (lineáris tartomány kb. 4<br />
nagyságrend). Az ioncsapdás készülékek sikerét reprezentálja,<br />
hogy számos típusuk érhető el, így vannak<br />
lineáris (2D, LTQ) és 3D ioncsapdák, ill. (7-31. ábra)<br />
ún. orbitrap analizátoros (7-32. ábra) készülékek. Ez<br />
utóbbiakra jellemző a rendkívüli tömegpontosság és<br />
felbontóképesség.<br />
Az elektrotechnika fejlődésével lehetővé vált igen<br />
kicsiny időkülönbségek pontos észlelése, ami a repülési<br />
időn (time-of-flight, TOF) alapuló elválasztás<br />
alapját képezi. A megoldás lényege, hogy az elektromosan<br />
térmentes repülési csőbe azonos időpillanatban,<br />
azonos kinetikai energiával rendelkező ionok kis<br />
csomagjai érkeznek, és a detektort az m/z arányos repülési<br />
idő után érik el (7-33. ábra). Különféle kisegítő<br />
korrekciós eszközök (pl. reflektron, iontükör) révén a<br />
7-34. ábra. Példák hibrid felépítésű tömegspektrométerekre<br />
a) Q-TOF analizátoros készülék, B)<br />
b) Q-Trap analizátorral ellátott MS<br />
TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség,<br />
széles mérési tartomány érhető el, ill. alkalmazásukkal<br />
megvalósítható többféle fragmentációs lehetőség<br />
is. Megfelelő ionforrással (MALDI) kombinálva a nagyobb<br />
biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek.<br />
A MALDI-hoz ideális a repülési idő analizátor,<br />
mivel általa kihasználható a több száz daltonos felső<br />
tömeghatár, valamint nagy felbontás és érzékenység<br />
érhető el.<br />
A felsorolt analizátortípusok bármilyen kombinációja<br />
is elképzelhető az ún. hibrid készülékekben,<br />
amelyek két vagy több analizátor összekapcsolásából<br />
jönnek létre. Leggyakrabban ezeket a hibrid készülékeket<br />
alkalmazzák a rutin vizsgálatok során, amelyek<br />
közül a legelterjedtebb kombináció a Q-TOF, a hármas<br />
kvadrupól (QqQ), az LTQ-orbitrap, a Q-IT, az<br />
IT-TOF megoldás (7-34. ábra).<br />
Detektor<br />
7-33. ábra. A repülési idő analizátor felépítése és működési<br />
elve<br />
A tömegspektrométerben haladó ionok csoportja lényegében<br />
a forrástól a detektorig tartó elektromos<br />
áramot jelent. A készülékek detektorai a hozzájuk<br />
érkező rendkívül kis ionáramot (10 –10 –10 –15 A) érzékelik,<br />
és értékével arányos analóg elektromos jelet képeznek.<br />
A pontdetektorok az időben szétválasztott, a<br />
sordetektorok pedig a térben elkülönített ionok érzékeléséhez<br />
használatosak. Alapvető követelmény, hogy
182 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
7-35. ábra. Mikrocsatornás detektor vázlatos működési<br />
elve<br />
a detektorok képesek legyenek követni az ionáramok<br />
igen gyors változásait, tehát „memóriaeffektusuk”<br />
kicsi legyen. A legelterjedtebben alkalmazott típus<br />
a mikrocsatornás detektor (7-35. ábra). A kapott kis<br />
jeleket többnyire elektron- vagy fotonsokszorozókkal<br />
felerősítik, majd számítógépes feldolgozás céljára digitalizálják.<br />
Fragmentálás és tandem<br />
tömegspektrometria<br />
Ha viszonylag kis energiával ionizáljuk a vizsgálandó<br />
anyagunkat, akkor a molekulák egészben maradnak,<br />
és a tömegükre és töltésükre jellemző ún. molekulacsúcsot<br />
[M + , M – ] kapunk. Többnyire azonban jóval<br />
nagyobb mennyiségű információ nyerhető, ill. speciális<br />
problémákra (pl. több anyag elkülönítése, szekvenálás)<br />
jobb megoldást jelent, ha a részecskéket kinetikus<br />
energia hozzáadásával pontosan szabályzott<br />
módon széttördeljük, fragmentáljuk. Ez a folyamat<br />
végbemehet az ionizációs folyamat során, ill. röviddel<br />
utána (in source és post source decay, ISD, PSD),<br />
vagy az analizátorban egy inert gázzal való ütközés<br />
révén (collision induced dissociation, CID; és electron<br />
transfer dissociation, ETD). A keletkező fragmentumok<br />
kémiai felépítése és aránya az anyaion<br />
anyagi minőségétől és az alkalmazott energiától függ,<br />
és így további tömegspektrometriás vizsgálatra felhasználhatók.<br />
Természetesen ilyenkor csak azok a<br />
fragmentumok, más szóval leányionok jönnek szóba,<br />
amelyek az eredeti töltést tovább hordozzák.<br />
Ezt a jelenséget használják ki a tandem tömegspektrometria<br />
– jelölése: MS/MS vagy MS n –esetében,<br />
amikor két egymás után kapcsolt analizátor közé<br />
egy jellemzően argon, hélium vagy nitrogén gázzal<br />
működtetett ütközési cellát (collision cell) iktatnak.<br />
Itt lehetőség van az első analizátorban szétválasztott<br />
ionok egyenkénti fragmentálására, és a leányionok<br />
szelektív vizsgálatára. Tipikus megoldás a QqQ elrendezés,<br />
ahol két kvadrupol analizátor közé kerül a<br />
cella. Az ioncsapda esetén kissé más a helyzet: itt a<br />
fragmentációt megelőző és követő folyamatok nem<br />
térben, hanem időben válnak szét egymástól egyetlen<br />
analizátorban. Fontos tudni, hogy a rutinszerűen<br />
használt készüléktípusokban a fragmentáció az<br />
ionintenzitás 1-2 nagyságrenddel való csökkenését<br />
okozza, így tényleges gyakorlati haszna az MS/MS és<br />
MS 3 méréseknek van.<br />
Mérési üzemmódok tandem tömegspektrométerrel:<br />
Egyedi ion vizsgálat (single ion recording). Az egyik<br />
analizátor egy bizonyos m/z értéknél enged át, a másik<br />
nem aktív (7-36. ábra).<br />
Pásztázás (scan). Az egyik analizátor egy bizonyos<br />
m/z tartományt pásztáz, a másik nem aktív (7-37.<br />
ábra).<br />
7-36. ábra. Az egyedi ionkiválasztás sematikus működése<br />
7-37. ábra. A teljes pásztázás elvi működése
Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria<br />
183<br />
7-38. ábra. A többszörös reakció megfigyelés elve<br />
7-41. ábra. A semleges vesztéses pásztázás elve<br />
Többszörös reakció megfigyelés (multiple reaction<br />
monitoring). Mindkét analizátor egy-egy bizonyos<br />
m/z értéknél enged át; általában egy iont és valamely<br />
fragmentumát. Több, független fragmentációs átmenet<br />
vizsgálható így (7-38. ábra).<br />
Anyaion-pásztázás (parent ion scan). Az első analizátor<br />
egy tartományt pásztáz, a második pedig egy<br />
bizonyos m/z értéknél enged át. Azokat az ionokat<br />
vizsgálhatjuk, amelyek egy bizonyos méretű töltött<br />
fragmentumot adnak (7-39. ábra).<br />
Leányion-pásztázás (daughter ion scan). Az első analizátor<br />
egy bizonyos m/z értéknél enged át, a második<br />
pedig egy tartományt pásztáz. Megvizsgálhatjuk,<br />
hogy egy bizonyos méretű ion milyen fragmentumokra<br />
esik szét (7-40. ábra).<br />
Állandó semleges vesztés (constant neutral loss).<br />
Mindkét analizátor pásztázó módban működik, de a<br />
második egy állandó m/z értékkel lejjebb. Azok az ionok<br />
vizsgálhatók, amelyek egy bizonyos méretű semleges<br />
fragmentumot képeznek (7-41. ábra).<br />
A tömegspektrum<br />
7-39. ábra. Prekurzor ion pásztázás<br />
7-40. ábra. A fragmens ion pásztázás elvi működése<br />
A tömegspektrum a tömeg/töltés (m/z) arány és az<br />
ionintenzitás függvényszerű ábrázolása. A legmagasabb<br />
csúcs a báziscsúcs, ehhez viszonyítjuk az öszszes<br />
többi komponenst. Az abszolút ionmennyiség<br />
arányos a mintában jelen lévő anyagmennyiséggel, a<br />
fragmentumok relatív ionintenzitásai pedig a molekulatípusra<br />
és az alkalmazott mérési eljárásra jellemzőek.<br />
A készülékre, így a kapott tömegspektrumra is<br />
jellemző a felbontóképesség, amely azt a R = m/Δm<br />
értéket jelenti, ahol m a tömegszám, melytől egy<br />
szomszédos csúcsot még éppen el tudunk különíteni.<br />
Ehhez meg kell adni, hogy a két csúcs közös átfedő<br />
szakasza legfeljebb milyen relatív magasságú lehet,<br />
Δm a két csúcs tömegének különbsége (ill. helyesebb<br />
m/z és Δ[m/z] értékekről beszélni). A felbontóképesség<br />
a nagyobb tömegek felé haladva általában csökken,<br />
tipikusan 15 000–100 000 értékű.
184 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban<br />
A tömegspektrometria főbb alkalmazási<br />
területei<br />
Minél többet tudunk a gének szerepéről, annál világosabbá<br />
válik a fehérjék és azok módosításainak<br />
szerepe a patológiás folyamatokban. A proteomika<br />
összetett fehérjekeverékek, valamint azok enzímatikus<br />
emésztményeinek egyidejű vizsgálatát jelenti. A<br />
proteomkutatás módszertana egyszerű: az egészséges<br />
és a beteg rendszer fehérjekészletét összehasonlítva<br />
olyan markereket fedezhetünk fel, amelyek egyértelmű<br />
diagnózis felállítását teszik lehetővé. Tehát az<br />
adott pillanatban minőségi és lehetőleg mennyiségi<br />
vizsgálatot kell végezni az adott fiziológiás állapotú<br />
sejt teljes fehérjeállományáról, és azt össze kell vetni a<br />
kísérletesen manipulált vagy beteg sejt proteomjával.<br />
A különbséget okozó fehérjék vagy fehérjetöredékek<br />
mennyiségi és minőségi analízise, pontos szekvenciájának<br />
és kovalens módosításainak meghatározása<br />
diagnosztikai célokat szolgálhat. A MALDI TOF tömegspektrometria<br />
által biztosított széles tömegtartomány<br />
miatt célszerűen két detektort alkalmazunk.<br />
A kis tömegű ionokat a nagyobb úthosszat biztosító<br />
reflektron detektorban, míg a nagyobb tömegűeket lineáris<br />
módban mérjük. A kimutatási határ rutinszerűen<br />
femtomol nagyságrendű. A készülékkel megvalósítható<br />
tandem tömegspektrometria (TOF/TOF) is,<br />
amelynek során az ionforrásból kilépő részecskéket<br />
két módon fragmentálhatjuk: közvetlenül az ionforrás<br />
után (PSD) vagy argongáz segítségével egy erre a<br />
célra kialakított ütközési cellában (CID, ETD).<br />
A valóságban a megoldás azért bonyolult, mert több<br />
tízezer fehérje vagy peptid egyszerre végzendő analíziséről<br />
van szó. Ma a legelterjedtebb módszer az, hogy<br />
valamilyen elválasztástechnikai módszerrel a több tízezer<br />
fehérje, peptid közül kiválasztják azt a nagyobb<br />
csoportot (szubproteomot), amelyben az összehasonlítani<br />
kívánt peptidek, fehérjék megtalálhatók. Erre<br />
a célra a gélelektroforézis vagy a nagy hatékonyságú<br />
folyadékkromatográfia a legalkalmasabb, ezt követően<br />
a frakciókat tisztítjuk és enzimatikusan emésztjük. Az<br />
így kapott peptidkeverékhez meghatározott arányban<br />
mátrixoldatot keverünk és az elegyet mintatartó<br />
tálcára szárítjuk. A mátrix kiválasztásánál a molekula<br />
típusát, polaritását, valamint molekulatömegét is figyelembe<br />
kell venni. Ennek megfelelően a fehérjeemésztmények<br />
(molekulatömeg < 5 kDa) elemzéséhez<br />
ideális mátrix az α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav (HCCA,<br />
CHCA). A vizsgálat során rögzítjük a peptidkeverékre<br />
jellemző tömegspektrumot, majd az értékelés során<br />
megfelelő matematikai átalakítások után az eredményeket<br />
elküldjük egy fehérjeszekvenciákat tartalmazó<br />
adatbázisba (Mascot, SwissProt, NCBInr). A keresés<br />
eredményeként megkaphatjuk az adott tömegspektrum<br />
által meghatározott fehérjét vagy fehérjéket. Ezt a<br />
meghatározási módszert Peptide Mass Fingerprintingnek<br />
(PMF) nevezzük. A gyulladásos betegségek laboratóriumi<br />
diagnosztikájában alapvető jelentősége van<br />
a sejten belüli jelátviteli utak monitorozásának. A patológiás<br />
folyamatok detektálásának leggyorsabb módja<br />
a jelátviteli utak fontosabb enzimjei, fehérjéi kovalens<br />
módosításának meghatározása, amely többek között<br />
jelenthet foszforilációt, farnezilációt, lizin oldalláncok<br />
acetilezését és fehérjék ADP-ribozilezését is. A MALDI<br />
TOF tömegspektrometria felhasználásával azonosítjuk<br />
a különböző fehérjemódosításokat, valamint azokat a<br />
fehérjéket, amelyek szerepe jelentős a folyamatok patomechanizmusában,<br />
ill., amelyek diagnosztikai értékűek<br />
lehetnek. A meghatározás során a PMF-hez hasonlóan<br />
rögzítjük az elsődleges tömegspektrumot, majd<br />
ezt követően a nagyobb intenzitású vagy diagnosztikailag<br />
jelentős peptideket PSD vagy CID fragmentációval<br />
tovább bontjuk. Így meghatározható a peptidek<br />
pontos elsődleges szerkezete és annak módosulása, valamint<br />
megismerhetővé válik eddig még nem ismert<br />
peptidek és proteinek felépítése (De Novo Sequencing).<br />
Napjaink egyik legizgalmasabb fejlesztése a MAL-<br />
DI TOF tömegspektrometria képalkotó módszerként<br />
való alkalmazása (MALDI Imaging) (7-42. ábra).<br />
Ennek során egy speciális mintatartóra 10–20 µm-es<br />
szövettani metszetet és mátrixot szárítunk. Ezt követően<br />
a mintáról előre meghatározott szisztémában és<br />
lézerintenzitással több ezer tömegspektrumot veszszünk<br />
fel, amelyeket a megfelelő szoftverfeldolgoz: az<br />
egyes m/z értékekhez tartozó intenzitások eloszlását<br />
képként jeleníti meg. A mycobacteriumok sejtmembránjában<br />
nagy mennyiségben jelen lévő mikolsavak<br />
jelenléte igen jól vizsgálható MALDI TOF tömegspektrometriával.<br />
A módszer érzékenységét jellemzi,<br />
hogy még több száz éves Mycobacterium tuberculosissal<br />
fertőzött csontminták esetében is eredményesen<br />
alkalmazható.<br />
A gyógyszergyárak számára rendkívüli jelentősségű<br />
a felhasznált vegyületek lehetséges bomlástermékeinek<br />
ismerete. A MALDI TOF tömegspektrometria<br />
segítségével a gyógyszerhatóanyagok stabilitásvizsgá-
Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria<br />
185<br />
lata is elvégezhető. Ilyenkor a minták azonos menynyiségeit<br />
speciálisan előkészített mintatartó tálcára<br />
cseppentjük, majd analizáljuk. A vizsgálatok után a<br />
hatóanyagokat tartalmazó tálcákat akár –70 °C-on tárolhatjuk,<br />
és a későbbiek folyamán mérhetjük a molekulák<br />
szerkezetében bekövetkező változásokat.<br />
A tömegspektrometria alkalmazása az orvosi laboratóriumi<br />
diagnosztikában már eddig is számos, a<br />
medicina számára nagy fontosságú anyag vizsgálatát<br />
tette lehetővé vagy éppen egyszerűbbé, pontosabbá.<br />
Az elemzés alá vont molekulák köre folyamatosan<br />
bővül, gyakran egész betegségcsoportokat lefedő tematikus<br />
panelekbe rendeződik. Nem elhanyagolható<br />
körülmény, hogy a tömegspektrometriás eljárások<br />
sok esetben gazdaságilag is a legkedvezőbb megoldást<br />
kínálják más, hagyományosabb technikákkal összehasonlítva.<br />
Természetesen arról sem szabad megfeledkezni,<br />
hogy az alapberuházás és a szervizelés<br />
költségei igen nagyok. Az MS, különösképpen megfelelő<br />
kromatográfiás elválasztással és tandem mérési<br />
módozattal kombinálva jelenleg az egyik leghatékonyabb<br />
technológia a szerves molekulák vizsgálata<br />
terén. Óriási előnye, hogy egyetlen rövid méréssel,<br />
amelyet gyakran csak egyszerű minta-előkészítés előz<br />
meg, nagyszámú vegyület elemzésére van lehetőség,<br />
továbbá ez a repertoár viszonylag könnyen és olcsón<br />
bővíthető. A jövőben várhatóan egyre több módszer<br />
fog átvándorolni az MS alkalmazások területére.<br />
A tömegspektrometria tudománya folyamatosan<br />
és nagy ütemben fejlődik. A tandem triple quadrupol<br />
készülékeknél egy-egy újabb generáció mindig jó<br />
egy nagyságrenddel nagyobb érzékenységű az előzőnél.<br />
A korábban költségesnek számító típusok, mint<br />
pl. a TOF-készülékek, egyre inkább elérhetők lesznek<br />
a klinikai laboratóriumok számára. Az állandó technikai<br />
újítások egyre bővítik az analitikai lehetőségek<br />
körét, fokozva az alkalmazások és az új igények gyarapodását.<br />
A MALDI és a SELDI (Surface Enhanced<br />
Laser Desorption Ionization) TOF módszerek<br />
napjainkban bekövetkező intenzív fejlődését óriási<br />
mintafeldolgozó képességüknek, valamint egyszerű<br />
kezelhetőségüknek köszönhetjük. Ennek megfelelően<br />
az elkövetkező néhány évben globálisan is a nagy<br />
áteresztőképességű analitika nélkülözhetetlen eszközeivé<br />
válnak.<br />
Irodalom<br />
7-42. ábra. A hypophysis adenilát-cikláz-aktiváló polipeptidjének<br />
(PACAP-38) MALDI TOF tömegspektrometriás<br />
vizsgálata<br />
a) A PACAP-38 protonált kvázimolekula ionja lineáris detektálási<br />
módban<br />
b) A PACAP-38 nátriummal képzett kvázimolekula ionja<br />
lineáris detektálási módban<br />
c) A PACAP-38 triptikus peptidjeinek azonosítása reflektron<br />
módban<br />
Gross, J.: Mass Spectrometry: A Textbook. Springer, Heidelberg.<br />
2004.<br />
Lipton, M. S., Pasa-Tolic, L.: Mass Spectrometry of Proteins<br />
and Peptides. Humana Press, New York, 2009.<br />
Talián Cs. G., Márk L., Melegh B.: Tömegspektrometria.<br />
In: Debreczeni L., Kovács L.G. (szerk.): Gyakorlati<br />
Laboratóriumi Medicina. 477–492. old. Literatura Medicina<br />
Kiadó, Budapest, 2008.<br />
Vékey, K., Telekes, A., Vértes, A. (eds): Medical Applications<br />
of Mass Spectrometry. Elsevier, Amsterdam, 2008.
8. A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai -<br />
Dimenziók, vonatkoztatások<br />
Liszt Ferenc<br />
Mértékegységrendszerek<br />
A laboratóriumi kvantitatív analitikai folyamatokban<br />
megszülető eredmények a számszerű érték mellett<br />
minden esetben mértékegységgel is rendelkeznek.<br />
A metrikus mértékegységrendszer alapjául a<br />
francia nemzetgyűlés 1791-ben fogadta el a métert<br />
és a kilogrammot. Tizennyolc állam (köztük hazánk<br />
is) 1875-ben Párizsban írta alá az első nemzetközi<br />
mértékegyezményt. Ezt követte az 1881-ben elfogadott<br />
CGS rendszer, amelyet 1939-ben felváltott a<br />
nemzetközileg is elfogadott – a méter, a kilogramm,<br />
a másodperc és az amper mértékegységen alapuló<br />
– MKSA mértékegységrendszer. 1948-ban ezt kiegészítették<br />
további három alap mértékegységgel:<br />
az erő (newton), az energia (joule) és a teljesítmény<br />
(watt) egységével.<br />
A Mértékegységek Nemzetközi Rendszere, SI (Système<br />
International d’Unités) a legújabb, nemzetközileg<br />
elfogadott mértékegységrendszer, amely néhány<br />
kiválasztott mértékegységen, ill. a tíz hatványain alapul.<br />
A mértékegységek rendszerét az alapegységek, a<br />
kiegészítő egységek és a velük leírható származtatott<br />
egységek alkotják. A mértékegységek nagyságrendjét<br />
a prefixumok (előtagok) adják meg. A jelenleg használt<br />
SI mértékegységrendszert a XI. Általános Súlyés<br />
Mértékügyi Konferencia fogadta el 1960-ban.<br />
Magyarországon 1960-tól az SI figyelembevételével<br />
készült kormányrendelet szabályozta a mértékegységek<br />
használatát. 1972-ben megjelent az MSZ 4900<br />
„Fizikai mennyiségek neve, jele és mértékegysége”<br />
című szabvány, amely teljes egészében a nemzetközi<br />
mértékegységrendszert használta, de kötelező használatát<br />
nem írta elő. 1976-ban adták ki a 8/1976.<br />
(IV.27) MT. sz. rendeletet, amely előírta az SI rendszerre<br />
való kötelező áttérést és az SI kizárólagos használatát<br />
(azaz más mértékegységek használatának tilalmát)<br />
1980. január 1-jétől tette kötelezővé. A WHO<br />
30. közgyűlésén 1977-ben a tagországok elfogadták<br />
az SI mértékegységrendszer bevezetését az egészségügyben.<br />
A Magyar Köztársaság országgyűlése az<br />
1991. évi XLV. törvény 1. mellékletében ismét meghatározta<br />
a szabványos magyar mértékegységrendszer<br />
alapjait, az 1976 óta ismertté vált tudományos eredmények<br />
figyelembevételével.<br />
Az általános laboratóriumi rutin és kutatás gyakorlatában<br />
ma alkalmazott SI mértékegységrendszernek<br />
hét alapegysége van:<br />
1. Hosszúság: m (méter).<br />
2. Tömeg: kg (kilogramm).<br />
3. Idő: s (másodperc).<br />
4. Elektromos áramerősség: a (amper).<br />
5. Termodinamikai hőmérséklet: °k (kelvin).<br />
6. Fényerősség: cd (kandela).<br />
7. Anyagmennyiség: mol (mól).<br />
A laboratóriumi gyakorlatban sokszor alkalmazunk<br />
származtatott SI mértékegységeket is:<br />
1. Térfogat: m 3 (köbméter), ill. tört része: dm 3 (köbdeciméter).<br />
2. Sűrűség: kg/m 3 (kilogramm/köbméter).<br />
3. Anyagmennyiség-koncentráció: mol/m 3 (mól/köbméter).<br />
4. Molalitás (mol/kg oldószer).<br />
Az SI rendszer bevezetése a legtöbb országban orvosi,<br />
biológiai laboratóriumban csak részben valósult meg,<br />
manapság is használnak több régebbi, nem SI mértékegységet,<br />
pl. Hgmm, °C, U/L, mol/L, kg/L.<br />
Egyéb használt mértékegységek:<br />
1. Térfogat (űrtartalom) : L (liter = 1 dm 3 = 10 -3 m 3 ).<br />
2. Hőmérséklet: °C (Celsius-fok).<br />
3. Tömegkoncentráció: g/L (gramm/liter).<br />
4. (Sejt) szám koncentráció: 1/L.<br />
5. Molaritás (anyagmennyiség-koncentráció): mol/L<br />
(mol/liter oldat).<br />
6. Katalitikus aktivitás (nem SI egység): U (nemzet-
188 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
közi enzim egység, 1 U = egy perc alatt átalakított<br />
egy mikromol szubsztrát).<br />
7. Katalitikus aktivitás (SI egység): kat (1 katal = egy<br />
s alatt átalakított egy mol szubsztrát).<br />
8. Katalitikus aktivitáskoncentráció (nem SI egység):<br />
U/L (1 nemzetközi egység/liter).<br />
9. Katalitikus aktivitáskoncentráció (SI egység): kat/L<br />
(1 katal/liter).<br />
Az analitikai referenciarendszer és elemei<br />
Egy biológiai minta adott komponensei esetében a<br />
laboratóriumi mérési eredmények valódisága akkor<br />
biztosítható teljes körűen, ha a laboratórium által<br />
működtetett mérőrendszer kalibrációja és valódiságmeghatározó<br />
eljárása dokumentáltan visszavezethető<br />
az SI rendszerig. Ezt az MSZ EN ISO/IEC 17025:2005<br />
(Vizsgáló és kalibrálólaboratóriumok felkészültségének<br />
általános követelményei) és az MSZ EN ISO<br />
15189:2007 (Orvosi laboratóriumok. A minőségre<br />
és a felkészültségre vonatkozó külön követelmények)<br />
szabvány pontosan meghatározza.<br />
A mérések valódisága a legmagasabb rangú etalonokhoz<br />
(primer referenciakalibrátor, primer referencia-mérőmódszer)<br />
való visszavezetés révén, referenciarendszerben<br />
biztosítható.<br />
A referenciarendszer összetevői:<br />
• A mérendő komponens pontos definiálása a<br />
humán mintában.<br />
• A komponenst specifikusan mérő referenciamódszer.<br />
• Primer vagy szekunder, mátrix alapú referens<br />
anyag.<br />
• Referencialaboratóriumok hálózata.<br />
A laboratóriumi medicinában és a kutatásban is több<br />
száz különböző analit koncentrációját határozzuk<br />
meg, a vizsgált komponens pontos definiálása alapvető<br />
igény.<br />
Az A típusú analitok pontosan meghatározott molekulatömegű<br />
molekulák, melyek visszavezethetők SI<br />
mértékegységre, amennyiben megfelelő mérési eljárás<br />
és kalibrátorok rendelkezésre állnak. Az A típusú<br />
analitok közé tartoznak a klasszikus klinikai kémia<br />
analitjai, elektrolitok, ásványi anyagok, anyagcseretermékek<br />
(pl. koleszterin, kreatinin, húgysav), szteroidok,<br />
vitaminok, gyógyszerek. A mérések eredményét<br />
mol/L, elfogadott SI egységben adjuk meg. Mivel az A<br />
típusú analitok megfelelően tisztított formában előállíthatók,<br />
a komponenst tartalmazó referenciaanyagok<br />
könnyen előállíthatók és a rutin mérési eljárástól<br />
független referenciaeljárás kifejleszthető. Jó példa egy<br />
referenciamérési rendszerrel vizsgált A típusú analit,<br />
a kortizol meghatározása vérszérumban. A kortizol,<br />
jól definiált molekulatömeggel bíró anyag, koncentrációja<br />
mol/L-ben kifejezhető, és gravimetriás úton<br />
megfelelően tiszta anyagból primer referenciaanyag<br />
készíthető. A referenciamérési eljárás, pl. izotóphígításos<br />
gázkromatográfia, tömegspektrometria<br />
(ID-GC/MS) közvetlenül kalibrálható erre az elsődleges<br />
referenciaanyagra. A referenciaeljárást alkalmazó,<br />
jól definiált körülmények között dolgozó referencialaboratóriumok<br />
rendelik hozzá a hiteles értékeket a<br />
másodlagos mátrix referenciaanyagokhoz. A gyártók<br />
ezeket az eredményeket alkalmazzák a rutin módszerek<br />
kalibrálásához, ami visszavezethető eredményeket<br />
biztosít a végfelhasználó rutin módszer számára<br />
(8-1. ábra).<br />
A B típusú analitok (ezek száma az A típusú analitok<br />
számát sokszorosan meghaladja) vizsgálatakor a<br />
komponens olyan heterogén molekula (legtöbbször<br />
fehérje), amelyhez nem lehet meghatározott, homogén<br />
molekuláris szerkezetet rendelni. A mérést legtöbbször<br />
valamilyen immunkémiai technikával végzik,<br />
az eredmények nem fejezhetők ki SI egységben,<br />
csak tömegegységben (g/L) vagy önkényes egységekben,<br />
ill. WHO által javasolt nemzetközi egységekben.<br />
Jó példa a nem SI rendszerben visszavezethető<br />
biológiai analitra a plazmaprolaktin. Ha ezt a komponenst<br />
mérjük, valójában a különböző mennyiségben<br />
előforduló három különböző izoformát mérjük: prolaktin-A,<br />
prolaktin-B és prolaktin-C, amelyek aránya<br />
a keverékben ismeretlen. A B típusú biológiai anali-<br />
8-1. ábra. A referenciarendszer koncepciója a gyakorlatban,<br />
a szérumkortizol-meghatározás példáján
A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
189<br />
tokat általában immunkémiai eljárásokkal mérjük,<br />
ahol különböző reagensek eltérő módon reagálnak<br />
a molekula különböző epitópjaival, egymással ugyan<br />
arányban lévő, de eltérő koncentrációértékeket eredményezve.<br />
Következésképpen, a nem SI rendszerben<br />
visszavezethető, különböző immunkémiai eljárásokkal<br />
meghatározott biológiai analitok mérési eredményei<br />
nem hasonlíthatók össze. Ezek a tények drámai<br />
következménnyel járnak az inter- és intraindividuális<br />
biológiai szórás vizsgálatok értékelésénél. Biológiai<br />
eltérések esetén a különböző immunkémiai mérési<br />
eljárásokkal kapott eredményeket nem szabad összevonni.<br />
Így a B típusú analitoknál a referenciaanyagok előállítása<br />
sokkal nagyobb nehézséget jelent. Mivel az<br />
analitok rendkívül heterogének lehetnek - összetételük<br />
a különböző humán testfolyadékokban változó<br />
-, ezért minden B típusú analit referenciaanyaga csak<br />
korlátozott mértékben lehet azonos a beteg mintájáéval.<br />
Ezek a referenciaanyagok bizonyos mértékig hasonlíthatnak<br />
a humán testfolyadékminta heterogén<br />
keverékére, de ez csak „átlagos” mértéket jelent. Továbbá<br />
a B típusú analitoknál a rutinszerűen alkalmazott<br />
eljárásoktól független referenciameghatározási<br />
eljárások jelenleg az esetek többségében hiányoznak.<br />
Így az értékek hozzárendelése a szóba jövő referenciaanyagokhoz<br />
gyakran problematikus. Ennek következtében<br />
a gyártók készítik el saját kalibrátorukat a<br />
rendelkezésre álló preparátumból, és hozzárendelik<br />
tömegmérés alapján az értékeket, ez pedig a különböző<br />
gyártók közti eltérésekhez vezethet.<br />
A klinikai laboratóriumi mérési eredmények metrológiai<br />
visszavezethetősége (visszakövethetősége)<br />
annak az elvnek a gyakorlati megvalósítása, hogy a<br />
laboratóriumi leleten feltüntetett rutin mérési eredmény<br />
pontosságát és valódiságát ismert és egyre csökkenő<br />
bizonytalanságú (azaz egyre megbízhatóbb)<br />
standardizált összehasonlítások, szabványos hiteles<br />
mérések megszakítatlan láncolata garantálja. A rutin<br />
laboratóriumi mérési eredmény ezen a szabványos,<br />
megbízható, hiteles mérési láncolaton keresztül vezetődik<br />
vissza országos vagy nemzetközi etalonokhoz,<br />
referenciaanyagokhoz és referenciamérési eljárásokhoz.<br />
A láncolat minden tagjának pontossága, valódisága<br />
ismert és garantált, ami biztosítja az eredmény<br />
pontosságát és valódiságát.<br />
Különösen fontos, hogy laboratórium ismerje a<br />
mért mintakomponens esetében a használt kalibrátor<br />
(valódiságkontroll) hibáját és a komponensre<br />
vonatkozó összes megengedett hibát. Ha ez kisebb<br />
vagy egyenlő, mint a kalibrátor kumulált hibájának<br />
és a mérési rendszer összes hibájának összege, akkor<br />
a rendszer egyáltalán nem kontrollálható és nem is<br />
alkalmas az adott komponens mérésére.<br />
A bizonyított (bizonylatolt) visszavezethetőség teszi<br />
lehetővé azt is, hogy összehasonlíthassuk adott<br />
beteg adott paraméterének különböző laboratóriumok<br />
által különböző időpontokban különböző rutin<br />
mérési módszerekkel meghatározott értékét. Ezt az<br />
biztosítja, hogy egy mintakomponens többféle mérőmódszerének<br />
kalibrátor anyagait közös referens kalibrátorral<br />
vagy referens módszerrel ellenőrzik és állítják<br />
be.<br />
Ez a mérési lánc a klinikai laboratóriumokban kezdődik,<br />
a referencialaboratóriumokon át és az in vitro<br />
diagnosztikumok előállítóinak (IVD gyártók) laboratóriumaiban<br />
folytatódik, és a nemzeti és nemzetközi<br />
laboratóriumi intézeteken át halad a nemzeti és nemzetközi<br />
metrológiai intézetekig.<br />
A leletezéshez méréstechnikai és mérési jogi aspektusból<br />
szükséges az elsődleges standarddal, azaz<br />
meggyőzően bizonyított és igazolt „kommutabilitással”<br />
(transzferabilitással, átvihetőséggel) rendelkező<br />
referens anyaggal végzett kalibrálás, a gyártó által<br />
meghatározottak szerint használt mérési módszer, a<br />
kontrollok, a minta, a laboratóriumi végfelhasználói<br />
rutin (beteg) mérés eredménye valódiságának az<br />
ellenőrizhetősége. A mérőrendszer hitelesítését és<br />
ellenőrzését a mérési feladat megvalósításához tartozó<br />
valamennyi elem, tehát a megoldás sorrendjében a<br />
kalibrálástól a minta mérési eredményéig halmozódó<br />
hibák becslésén alapuló mérési bizonytalanság, míg<br />
ellenkező irányban az etalonokra (definitív módszerre<br />
és primer referenciaanyagra) való visszavezethetőség<br />
jellemzi.<br />
Az európai In Vitro Diagnostical Directive (In Vitro<br />
Diagnosztikai Irányelv, IVDD, az Európai Parlament<br />
és Tanács 98/79/EC számú irányelve) az in vitro diagnosztikai<br />
orvosi eszközökre vonatkozik, és előírja, hogy<br />
a klinikai laboratóriumi rutin mérési eredmények megbízhatóságát<br />
méréstechnikailag biztosító kalibrátorok és<br />
valódiságkontroll anyagok értékeinek visszavezethetőnek<br />
kell lennie valamilyen elsődleges referenciamérési<br />
eljárásra vagy referens kalibrátor anyagra.<br />
A primer referenciaanyagtól és a primer referenciamódszertől<br />
kiinduló mérési láncolat végén áll a ru-
190 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
tin laboratóriumi mérési eredmény, amint azt a 8-2.<br />
ábra mutatja. A metrológiai visszavezethetőség (viszszakövethetőség)<br />
iránya az ábra nyílirányaival ellentétes,<br />
a laboratóriumi eredmény hitelességét az adja,<br />
hogy dokumentáltan visszavezethető a primer kalibrátorral<br />
kalibrált primer referencia-mérőmódszerre.<br />
A folyamat ellenkező irányban is igaz: „commutability”-nek<br />
vagy a magyarított kifejezéssel transzferabilitásnak,<br />
kommutabilitásnak nevezzük.<br />
Jelenleg elsősorban két szabvány foglalkozik az<br />
eredmények visszavezethetőségével. Az EN ISO<br />
17511:2003 a kalibrátorok és a valódiságkontroll<br />
anyagok értékeinek metrológiai visszavezethetőségével,<br />
az EN ISO 18153:2003 a kalibrátorok és a valódiságkontroll<br />
anyagok enzimkoncentráció-értékeinek<br />
metrológiai visszavezethetőségével foglalkozik. A<br />
pontosság ellenőrzését szolgáló kontrollanyagokra ez<br />
a két szabvány nem vonatkozik. Ismeretes több, részben<br />
kapcsolódó szabvány is, pl. az EN 12287:1999 a<br />
referenciaanyagokkal, az EN ISO 15197:2003 a kalibrátorok<br />
és a kontrollanyagok értékeinek metrológiai<br />
visszavezethetőségének ellenőrzésével foglalkozik.<br />
Manapság még nem minden anyag (mintakomponens)<br />
esetén hozható létre ez a mérési visszavezetési<br />
láncolat, nem minden mérendő komponensre van<br />
nemzetközileg elfogadott referenciaanyag vagy referenciamérési<br />
eljárás, és a láncolat gyakran végződik<br />
az IVD-gyártóknál.<br />
A Laboratóriumi Medicina Visszavezethetőségi<br />
Egyesített Bizottsága (JCTLM Joint Committee on<br />
Traceability in Laboratory Medicine) a gyártók törekvéseit<br />
egyesíti és irányítja az IFCC (International Federation<br />
of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine),<br />
a BIPM (Bureau International des Poids et<br />
Mesures) és az ILAC (International Laboratory Accreditation<br />
Cooperation) közös bizottságaként. Tagjai<br />
között 23 nemzetközi szervezet támogatásával működik<br />
együtt a megfelelő referens anyagok és referens<br />
mérőmódszerek kutatásában. A JCTLM iránymutatást<br />
ad arra vonatkozóan, hogy a klinikai laboratóriumok<br />
mérési eredményei nemzetközileg is összevethetők,<br />
egyenértékűek és a mérési szabványoknak<br />
megfelelően visszavezethetők legyenek.<br />
A jelenleg rendelkezésre álló referens anyagok és<br />
mérőmódszerek listáját a JCTLM állítja össze.<br />
A fehérjemeghatározások standardizálása<br />
8-2. ábra. A laboratóriumi mérési eredmények visszavezethetőségi<br />
láncolata, transzferabilitás és a mérési bizonytalanság<br />
A fehérje mennyiségi vizsgálatok eredményeinek<br />
összehangolására világszerte nagy igény jelentkezik,<br />
elsősorban a populáció mobilitásának és migrációjának<br />
következtében: az alkalmazott módszereket<br />
egységesíteni kell. Korábban számos kísérletet tettek<br />
e cél elérésére. A hatvanas években a Rowe és munkatársai<br />
által készített referenciakészítmény humán<br />
szérumimmunglobulin-mérésekhez azzal a céllal<br />
készült, hogy a különböző laboratóriumok eredményei<br />
összehasonlíthatóbbak legyenek. Korábban azt<br />
gondolták, hogy a laboratóriumok közötti nagy variabilitás<br />
annak köszönhető, hogy eltérő standard<br />
preparátumokat, antiszérumokat és elsősorban manuális<br />
módszereket alkalmaznak. A közös kalibrátor<br />
használata révén az eredmények reprodukálhatósága<br />
jelentősen javult. Ez a preparátum volt az első jelentős<br />
lépés a fehérjevizsgálatok harmonizációjában.<br />
1973-ban a WHO és az IUIS (International Union
A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
191<br />
of Immunological Societies) kezdte meg egy új standard<br />
kifejlesztését. A választott készítmény lett az US<br />
National Reference Preparation (USNRP) és a WHO<br />
referenciapreparátuma (WHO6HSP) hat humán szérumfehérjére.<br />
Önkényesen nemzetközi egységeket<br />
rendeltek az albuminhoz (ALB), az α 1<br />
-antitripszinhez<br />
(AAT), a cöruloplazminhoz (CER), az α 2<br />
-makroglobulinhoz<br />
(A2M), a transzferrinhez (TRF) és a komplement<br />
C3c-hoz, míg az immunglobulin-koncentrációk<br />
(IgA, IgG, IgM) esetében a korábbi WHO 67/86<br />
preparátum volt használatos. A hetvenes években<br />
bekövetkező jelentős változások eredményeképpen<br />
a szérumfehérjék koncentrációjának meghatározására<br />
bevezetett turbidimetriás és nefelometriás tesztek<br />
megkövetelték a nem turbid referencia anyagokhasználatát.<br />
Az IFCC a plazmafehérje-vizsgálatok egységesítése<br />
érdekében kidolgozta az IFCC 74/1 referenciaanyagot,<br />
amely az összes technikára (gél alapú és<br />
turbidimetriás vagy nefelometriás módszerre) alkalmazható<br />
volt. Szigorú protokoll szerint készített referenciaanyag<br />
volt, szöveti és leukocytaproteáz-mentes,<br />
az előállítás során kiküszöbölték a fibrinogén hatását<br />
és a liofilizálást követő denaturációt. A nyolcvanas<br />
évek a példa nélküli változások ideje volt a fehérjelaboratóriumokban.<br />
A gél alapú, 24–48 órát igénylő<br />
mennyiségi fehérjemeghatározásoktól a 3-5 órás fix<br />
idejű nefelometrián keresztül a kinetikus nefelometria<br />
vagy az automatizált, egy-két perc mérési idejű<br />
turbidimetria felé tolódtak el az analízisek. A munkaterhelés<br />
drámaian megnövekedett a monoklonális<br />
fehérjék, a B-sejtes malignitások, az immunhiányos<br />
elváltozások és a speciális fehérjemeghatározások<br />
(CRP, AAT, TRF, C3, C4, HPT) bevezetésének következtében.<br />
A diagnosztikai cégek bevezették a fehérjevizsgáló<br />
automatákat, az EQA cégek specifikus<br />
fehérjeprogramokat vezettek be a megbízható és öszszehasonlítható<br />
eredmények biztosítása érdekében. A<br />
speciális laboratóriumok helyett a vizsgálatok a rutin<br />
klinikai kémiai laboratóriumok részévé váltak és bizonyos<br />
fehérjevizsgálatokat sürgősséggel is elkezdtek<br />
használni. Ugyanakkor az EQA adatok Európában és<br />
az USA-ban néha 100%-os szórást mutattak. Ennek<br />
oka a referenciaanyagok kommutabilitásának hiánya,<br />
a különböző szekunder referenciaanyagok használata<br />
és a <strong>modern</strong> optikai mérőrendszerekre használható<br />
referenciaanyagok hiánya volt.<br />
Mindebből egyértelmű volt, hogy a laboratóriumok<br />
közötti variabilitás csökkentése érdekében<br />
nemzetközileg elfogadott referenciaanyagokra van<br />
szükség. 1989-ben az IFCC Committee on Plasma<br />
Proteins vezetésével folyamat indult egy új, 14 szérumfehérjét<br />
tartalmazó másodlagos (mátrix) referenciakészítmény<br />
preparálására, jellemzésére és kalibrálására.<br />
A preparátumhoz tisztított CRP-t is adtak. A<br />
referenciaanyag előállítása közben még szigorúbb<br />
feltételeket kellett teljesíteni, mint a korábbiak esetében:<br />
a donoroknak 12 órás éhomi vérvételt írtak elő, a<br />
lipaemiás, turbid és icterusos mintákat nem használták<br />
fel, az esetleges maradék lipideket szilícium-dioxidra<br />
adszorbeáltatták. Vizsgálták az AAT és a HPT<br />
fenotípust, és a pozitív reumatoid faktort vagy elektroforetikusan<br />
kimutatott monoklonális fehérjéket<br />
tartalmazó mintákat elvetették. Csak a hepatitis B- és<br />
C-vírus- és a HIV-mentes mintákat használták fel. A<br />
preparátumokat az European Community Bureau of<br />
Reference (BCR) hitelesítette mint hiteles anyagmintát,<br />
és CRM 470 néven tették elérhetővé 1993-1994-<br />
ben, majd később átnevezték ERM-DA470-ra.<br />
2004-ben az ERM-DA470 (eredetileg CRM 470-<br />
nek nevezett) referenciaanyag készleteinek kimerülése<br />
miatt az European Institute for Reference<br />
Materials (IRMM) vette át a feladatot egy új referenciaanyag<br />
elkészítésére. Az eljárás a sikeresnek bizonyult<br />
ERM-DA470 előállítási módja volt, ugyanakkor<br />
a fejlesztés és a gyártás egy új tétel referenciaanyagok<br />
esetében lehetőséget nyújtott bizonyos kérdések<br />
megváltozására és optimalizálására. Elhatározták a<br />
β 2<br />
-mikroglobulin (B 2<br />
M), a myeloma multiplex prognosztikus<br />
indikátorának addícióját és az α 1<br />
-antikimotripszin<br />
(ACT) kihagyását a referenciaanyagból.<br />
Előkísérletekben vizsgálták a tervezett változások,<br />
a rekombináns B 2<br />
M addíciójának és a dialízis helyett<br />
diafiltráció bevezetésének hatását. A β 2<br />
M addíciója<br />
nem befolyásolta más fehérjék stabilitását. A liofilizálás<br />
és az azt követő feloldás a CRP visszanyerésének<br />
csökkenését eredményezte, de a probléma a liofilizálás<br />
előtt kalcium hozzáadásával kiküszöbölhető volt.<br />
Ez a preparátum az ERM-DA470k/IFCC referenciaanyag<br />
nevet viseli.<br />
A referenciaanyag homogenitását, stabilitását és<br />
kommutabilitását a kilencvenes évek végétől széles<br />
körű megvalósíthatósági tanulmányokban vizsgálták.<br />
A hosszú távú stabilitás lehetséges következményeként<br />
megjelenhető mérési bizonytalanság értékét is<br />
feltüntették a hiteles értékben, ahogy azt az ISO Guide<br />
34 megköveteli.
192 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
Az ERM-DA470k/IFCC referenciaanyag hiteles értékeket<br />
közölt A 2<br />
M, α 1<br />
-savas glikoprotein (AAG), AAT,<br />
ALB, C3, C4, HPT, IgA, IgG, IgM, TRF és transztiretin<br />
(TTR) fehérjére, ill. az ERM-DA472/IFCC a CRP-re. A<br />
β 2<br />
M hiteles értékének hozzárendelése csak a közeljövőben<br />
várható. A méréseket különböző elven alapuló immunoassay-k<br />
segítségével (nefelometria, turbidimetria)<br />
végezték el, különböző tulajdonságú antitestekkel.<br />
Ezek az eljárások jelenleg szerepelnek a JCTLM referenciamódszerek<br />
listáján. A módszerek közti szórás<br />
jellemzően 2% körül, az összes esetben 4% alatt volt a<br />
12 hitelesített fehérjére vonatkozóan. Ez meglehetősen<br />
alacsony érték, figyelembe véve a különböző vizsgálati<br />
minták komplexitását és a különböző antitestek használatát.<br />
Nincs általánosan elfogadott célérték a mérési<br />
bizonytalanságra vonatkozóan a szérumfehérjék esetében,<br />
a diszkussziók e témában jelenleg is folynak.<br />
Mégis, a teljes hiba elfogadható, ha összehasonlítjuk<br />
a Westgard biológiai eltérések adatbázisával (13,5%<br />
IgA-ra és 3,9% albuminra).<br />
A visszavezethetőség érdekében jól meghatározott<br />
teljesítményű módszert kell választani, megfelelő referens<br />
vagy kalibrátoranyag használatával. A gyártó<br />
termék kalibrátor értékét hozzá kell rendelni magasabb<br />
szintű referenciaanyagok értékéhez. Más szóval<br />
a lánc hitelesített lépéseit kell létrehozni, hogy a<br />
végső eredmény jelenthető legyen. Metrológiai szempontból<br />
a visszavezethetőség határozza meg a mérési<br />
eredményt, minden lépés hozzájárul a mérési bizonytalansághoz<br />
(8-3. ábra).<br />
értéktranszfer eljárás<br />
• Módszer-optimalizálás<br />
Manapság a klinikai laboratóriumok a fehérjemennyiségi<br />
meghatározásokat leggyakrabban automatizált<br />
rendszerekkel, turbidimetria vagy nefelometria<br />
elvén alapuló módszerekkel végzik.<br />
Kisebb eltérések a mérési elvben, a műszer programozásában<br />
és a reagensben eltérő eredményekre<br />
vezethetnek, ezért a módszerek optimalizálására<br />
és szabványosítására van szükség. Az optimalizált<br />
vizsgálati módszer lehetőleg széles mérési tartoértéktranszfer<br />
eljárás<br />
értéktranszfer eljárás<br />
értéktranszfer eljárás<br />
8-3. ábra. Szérumfehérje-mérések visszavezethetőségi láncolata<br />
Az eljárás lépései:<br />
• Első lépés: a tiszta fehérjepreparátum előállítása<br />
A visszavezethetőségi láncban az első, legfontosabb<br />
pont az, hogy a plazmafehérje mért értéke<br />
tiszta fehérjekészítményre visszavezethető legyen.<br />
Ez tisztított fehérjék előállítását követeli meg, akár<br />
natív formában - emberi forrásból - vagy rekombináns<br />
fehérje formájában. Ahhoz, hogy az ilyen<br />
módon előállított elsődleges referenciakészítmények<br />
szérum alapú másodlagos referenciaanyagok<br />
értékének meghatározásához használhatók legyenek,<br />
számos feltételt kell teljesíteniük:<br />
- A tiszta fehérje teljesen hasonló legyen a szérumvagy<br />
plazmapoolban található fehérjével, mind<br />
a makroheterogenitás (pl. genetikai variánsok),<br />
mind a mikroheterogenitás (pl. különböző szénhidrát-izoformák)<br />
vonatkozásában.<br />
- A fehérje - amennyire lehetséges - natív legyen,<br />
biológiai és immunológiai identitását meg kell<br />
őrizni. Ezt csak egyetlen módon lehet elérni,<br />
óvatos és jól reprodukálható, szubfrakcionálás<br />
nélküli eljárással.<br />
- A végső preparátum tisztasága a lehető legnagyobb<br />
legyen (> 98%), ami immunkémiai és<br />
nem immunkémiai módszerekkel ellenőrizhető.<br />
- A tisztított fehérje stabil legyen legalább addig,<br />
amíg felhasználásával a másodlagos referenciaanyag<br />
kalibrációját nem végezték el.<br />
• Koncentrációmeghatározás tömegméréssel<br />
A tisztított fehérje koncentrációjának mérésére ismételt<br />
szárítás és tömegmérés után kerülhet sor,<br />
g/L koncentrációegységben. A mérés lehetőséget<br />
nyújt a fehérje részleges specifikus térfogatának<br />
meghatározására is (mL/g egységben), ez egyben a<br />
fehérje jellemzésére szolgáló paraméter is.
A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
193<br />
mányban - széles körű megbízhatósági tartománynyal<br />
kombinálva -, kevesebb ismételt méréssel képes<br />
a minták koncentrációjának meghatározására,<br />
és biztosítja az antitesttúlsúlyt.<br />
• Értéktranszfer eljárások<br />
A nyolcvanas években fejlesztették ki az eljárást 14<br />
szérumfehérje koncentrációértékének transzferére<br />
a tiszta fehérjepreparátumból a CRM 470 (most<br />
már az ERM- DA470) referenciaanyagba. A gyakorlati<br />
eljárás lényege az, hogy a fehérjepreparátum<br />
hat hígítását együtt analizáljuk a referencia- (cél-)<br />
preparátum hat hígításával. Ezzel a módszerrel a<br />
pontatlanság csökken, és a mátrixhatás jelenléte<br />
vagy hiánya közvetlenül értékelhető regressziós<br />
egyenes felvételével. Ha mátrixhatások nincsenek,<br />
a regressziós egyenes áthalad az origón, az egyenes<br />
meredeksége mindkét anyagnál azonos. A protokoll<br />
alapja egy több pontos érték hozzárendelése<br />
naponta több mérési sorozattal, legalább négy napon<br />
belüli ismétléssel. Alapvető feltétel, hogy minden<br />
mintavisszaoldást és hígítást tömegméréssel<br />
ellenőrizni kell.<br />
• Végleges hiteles érték hozzárendelés folyamata<br />
Az ERM-DA470k/IFCC referenciaanyag jellemzésében,<br />
a végleges hiteles érték hozzárendelésében<br />
20 laboratórium vett részt. Az összes laboratórium<br />
kiváló eredményeket kapott, a variációs koefficiens<br />
az összes szérumfehérje esetében jóval 4% alatt<br />
volt.<br />
• ERM-DA470 referencia anyag hatása a fehérje<br />
meghatározások harmonizálására<br />
A legújabb minőségbiztosítási programok lényegében<br />
azt mutatják, hogy a legtöbb fehérjemeghatározásnál<br />
semmilyen további csökkenés nem<br />
mutatkozott a laboratóriumok közötti variabilitásban,<br />
bizonyos esetekben az még nőtt is. Problémák<br />
jelentkeznek a legtöbb meghatározásnál abban az<br />
esetben, ha a fehérje koncentrációja nagyon kicsi<br />
vagy a fehérje analit labilis volt, ill. jelentős különbségek<br />
mutatkoznak az alkalmazott antitestek<br />
epitópfelismerésében, pl. a cöruloplazmin nagyon<br />
labilis fehérje, és a különböző antiszérumok reakcióba<br />
léphetnek a fehérjefragmenumokkal, ha a<br />
fehérje nem ép. A komplementkomponens C4, a<br />
cöruloplazminhoz hasonlóan kis koncentrációban<br />
van jelen egészséges emberek vérmintáiban, a rutin,<br />
nem érzékenyített immunoassay-k érzékenységének<br />
és pontosságának határán. Hasonlóan a<br />
fiziológiás körülmények között 2 mg/L koncentráció<br />
alatt lévő CRP-hez ebben az esetben érzékenyített<br />
nefelometriás vagy turbidimetriás módszert<br />
kell használni, ennek harmonizációja viszont igen<br />
sok kívánnivalót hagy maga után.<br />
Normálérték és referenciaérték<br />
A laboratóriumi mérési eredmények értékelésében<br />
nagy szerepe van a normálértékek vagy helyesebben<br />
a referenciaértékek ismeretének. A korábban használt<br />
normálérték vagy normál tartomány fogalom - bár<br />
manapság is sokszor használatos -, nem egyértelműen<br />
definiált fogalom. A laboratóriumi medicinában<br />
első megközelítésben a normál tartomány egy analit<br />
esetében azt a koncentrációtartományt jelenti, amelyben<br />
az egészséges, normális egyének eredményei várhatók.<br />
Ezzel a megközelítéssel ugyanakkor számos<br />
probléma van:<br />
• Nem definiált az egészséges vagy normális egyének<br />
fogalma.<br />
• A mintapopuláció kiválasztási és kizárási kritériumai<br />
nem ismertek.<br />
• A mintaadók előkészítése, a mintavétel körülményei<br />
ismeretlenek.<br />
• Az alkalmazott analítikai módszer, annak megbízhatósági<br />
kritériumai nem ismertek.<br />
• A mintaadók és az analitikai eredmények statisztikai<br />
kiértékelése ismeretlen.<br />
A biológiában, medicinában a „normális” fogalom<br />
különböző értelmezésben használatos, statisztikai<br />
valószínűség eloszlást, károsodást nem okozó hatást<br />
is érthetünk alatta. A normálérték meghatározásához<br />
szükséges mintapopuláció kiválasztása jelenti a<br />
legnagyobb nehézséget, legtöbbször egészségesnek<br />
feltételezett orvostanhallgatók, asszisztensek, ápolónők,<br />
kórházi személyzet vagy véradók jöhetnek szóba.<br />
Ugyanakkor adott paraméter, analit diagnosztikai<br />
érzékenységének, hatékonyságának és specificitásának<br />
meghatározásához szükséges bizonyos betegségben<br />
szenvedő páciensek mintájának vizsgálata is. Az<br />
egészséges és beteg közti határok nem egyértelműen<br />
definiáltak.
194 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
Amikor az irodalomból átvett normál tartománynyal<br />
kívánunk dolgozni, a következő adatokat kell<br />
megvizsgálni:<br />
• Az alkalmazott analitikai eljárást, annak elvét és<br />
analitikai megbízhatósági kritériumait.<br />
• A normális populációt, a mintaadók számát,<br />
nem és kor szerinti megoszlását.<br />
• A preanalitikai tényezőket: a befolyásoló tényezők<br />
figyelemvételét, a mintavételi körülményeket<br />
és a minták tárolási körülményeit.<br />
A vizsgált problémákra való tekintettel a nyolcvanas<br />
évek végén az IFCC kidolgozta a referenciaérték-elméletet,<br />
amelynek alapján bevezetésre került<br />
a referenciaértékek, referenciatartomány fogalma,<br />
ez jobban definiált, mint a normálérték és a normál<br />
tartomány. A laboratóriumi medicinában manapság<br />
csak a referenciaérték és a referenciatartomány fogalom<br />
használatos (8-1. táblázat).<br />
Irodalom<br />
Blirup-Jensen, S.: Protein standardization V: value transfer.<br />
A practical protocol for the assignment of serum<br />
protein values from a Reference Material to a Target<br />
Material. Clin. Chem. Lab. Med. 46(10):1470–1479,<br />
2008.<br />
Fuentes-Arderiu, X.: Biological variation of non-SI traceable<br />
biological quantities:example of proteins. Clin.<br />
Chem. Lab. Med. 44(12):1497, 2006.<br />
8-1. táblázat. A referenciaérték koncepciója és sémája<br />
referenciaegyének kiválasztása<br />
A referenciaegyének pontosan definiált kritériumok alapján választhatók ki. Fontos, hogy az egyén egészségi állapota<br />
definiált legyen, pontos beválaszthatósági, ill. kizárási körülmények meghatározásával. A kizárási kritériumok között<br />
vese, szív, tüdő és májbetegségek szerepelnek. Pontosan ismerni kell az alkalmazott gyógyszerek esetleges befolyásoló<br />
hatását a vizsgált paraméterre. Bizonyos rizikófaktorok (pl. túlsúly, magas vérnyomás) esetében az egyén szintén<br />
kizárható a mintát szolgáltató populációból.<br />
referenciapopuláció képzése a referenciaegyénekből<br />
A referenciapopuláció az összes lehetséges referenciaegyénből áll.<br />
referenciaminták kiválasztása a referenciapopulációból<br />
A referenciaminta pontos számú referenciaegyénből áll, megfelelően reprezentálja a referenciapopulációt.<br />
referenciaértéke(ke)t határozunk meg a referenciamintákból<br />
A referenciaérték a referenciaegyén mintájából az adott analit kvantitatív mérési eredménye.<br />
referenciaeloszlás a referenciaérték(ek) tekintetében figyelhető meg<br />
A referenciaeloszlás a mért értékek statisztikai eloszlását jelenti.<br />
referenciahatárok képzése a referenciaeloszlásból<br />
Statisztikai megfontolások, megadott valószínűség alapján állapítható meg a referenciaeloszlásból.<br />
↓<br />
↓<br />
↓<br />
↓<br />
↓<br />
↓<br />
referencia intervallum a referenciahatárok alapján definiálható<br />
A referenciaintervallum a referenciahatárok által bezárt értéktartomány. Legtöbbször úgy állapítjuk meg, hogy a<br />
minták 95%-ának analíziseredménye a határokon belül található. Általános szabály szerint az eredmények 2,5%-a a<br />
referenciaintervallum alatt, 2,5%-a pedig a referenciaintervallum felett található.
A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások<br />
195<br />
Klein, G.: Creation of the necessary analytical quality for<br />
generating and using reference intervals. Clin. Chem.<br />
Lab. Med. 42(7):851–857, 2004.<br />
Merlini, G.: Standardizing plasma protein measurements<br />
worldwide: a challenging enterprise. Clin. Chem. Lab.<br />
Med. 48(11):1567–1575, 2010.<br />
Myron Johnson, A.: Necessity for high-quality reference<br />
materials in the harmonization of laboratory assays.<br />
Clin. Chem. Lab. Med. 48(6):747–748, 2010.<br />
Panteghini, M.: Standardization in laboratory medicine:<br />
New challenges. Clinica Chimica Acta 355:1–12, 2005.<br />
Panteghini, M.: Traceability as a unique tool to improve<br />
standardization in laboratory medicine. Clinical Biochemistry<br />
42:236–240, 2009.<br />
Petersen, H.: Reference values: from philosophy to a<br />
tool for laboratory medicine. Clin. Chem. Lab. Med.<br />
42(7):686–691, 2004.<br />
Thienpont, L. M.: Traceability to a common standard for<br />
protein measurements by immunoassay for in-vitro<br />
diagnostic purposes. Clinica Chimica Acta 411:2058–<br />
2061, 2010.<br />
WHO International Biological Reference preparations,<br />
http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/<br />
Zegers, I.: Development and preparation of a new serum<br />
protein reference material: feasibility studies and processing.<br />
Clin. Chem. Lab. Med. 48(6):805–813, 2010.<br />
Zegers. I.: Characterisation of the new serum protein reference<br />
material ERM-DA470k/IFCC: value assignment<br />
by immunoassay. Clin. Chem. 56:1880-1888, 2010.<br />
http://physics.nist.gov/cuu/Units/prefixes.html<br />
http://web.inc.bme.hu/fpf/kemszam/alapegysegek.html<br />
http://www.bipm.org/en/committees/jc/jctlm/<br />
http://www.bipm.org/en/bipm/mou/jctlm.html<br />
http://www.bipm.org/jctlm/<br />
http://www.westgard.com/biodatabase1.Htm
9. A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése,<br />
pontossága, helyessége<br />
Lakatos Ágnes<br />
A klinikai kutatások fontos eszköze a mérés, amelynek<br />
során sokféle előkészítő eljárás után egy fizikai<br />
paramétert mérünk, amely összefüggésben van a mérendő<br />
anyag koncentrációjával. Az összefüggés lehet<br />
lineáris (pl. a Lambert-Beer-törvény szerint [1]), de<br />
nem feltétlenül az, akár fordított függvénykapcsolatot<br />
is tapasztalhatunk. Egy új paraméter mérésekor, kísérleteink<br />
legelső szakaszában az is elég információ<br />
számunkra, hogy tudjuk, melyik mintában nagyobb,<br />
melyikben kisebb a vizsgálandó anyag koncentrációja.<br />
Már ekkor is szükséges tudnunk, hogy a módszer,<br />
amelyet kidolgoztunk, megfelel-e a következőknek:<br />
1. Elég specifikus-e, vagyis az az anyag okozza-e a<br />
mért fizikai változást, amelyikre kíváncsiak vagyunk.<br />
2. Megfelelő-e a mérés precíziója, pontossága, azaz<br />
többszörös mérés esetén a kapott szórás, ill. a variációs<br />
koefficiens elég kicsi-e elvárásainkhoz képest.<br />
A precízió függ a mérendő anyag koncentrációjától,<br />
ezt az összefüggést ábrázolja a precíziós<br />
profil görbe (9-1. ábra). Az elvárásaink - biológiai<br />
minta mérése esetén - többek között attól függnek,<br />
hogy a meghatározandó anyag biológiai szórása,<br />
változatossága, változékonysága mekkora. A<br />
kémikusok szempontjából, ha mátrixhatás nélküli<br />
tiszta oldatot vizsgálnak, az analitikai módszerek<br />
pontossága az esetek többségében 0,1% vagy ennél<br />
kisebb nagyságrendben van. Ezzel szemben a<br />
biológiai méréseknél gyakran megelégszünk 10%<br />
körüli pontossággal. Fehérjénél nem ritka, hogy<br />
kóros állapotokban koncentrációja a referenciaértékhez<br />
képes sok ezerszeresre is emelkedhet. Így a<br />
mért változás nagyobb pontatlanság, kisebb precízió<br />
mellett is egyértelműen értékelhető.<br />
A mérés pontosságát egyrészt az „intraassay”<br />
(egy mérési napon belül meghatározott) szórás fejezi<br />
ki, de nagyon fontos, hogy a különböző mérési<br />
napok között mennyire tudjuk egyformán beállítani<br />
a körülményeket. Ezt az „interassay” (minden<br />
mért értéket különböző mérési napon meghatározva)<br />
szórás mutatja.<br />
3. Elég szenzitív-e a módszer, vagyis a mintában lévő<br />
mérendő analit mennyisége elég-e ahhoz, hogy<br />
mérhető fizikai választ kapjunk. Itt is változhatnak<br />
az elvárásaink, ill. a mérés érzékenységének<br />
javulásával a teszt funkciója is változhat. Ilyen volt<br />
9-1. ábra. Precíziós profil görbe
198 9. fejezet A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége<br />
pl. a TSH [2] esete. Az első generációs teszteknél<br />
a funkcionális érzékenység nem volt elég kicsi ahhoz,<br />
hogy a referenciatartomány alatti alacsony<br />
TSH-szinteket elkülönítse a referenciatartományon<br />
belüli értékektől, csak a nagyobb értékek esetében<br />
lehetett következtetéseket levonni. Amikor a<br />
tesztek fejlesztésével lehetségessé vált az alacsony<br />
értékek megítélése, megnőtt a TSH-mérés jelentősége,<br />
és elsődlegessé vált a pajzsmirigy-diagnosztikában.<br />
Hasonló változást figyelhettünk meg a CRPtesztnél,<br />
eleinte a 10 mg/l alatti koncentrációkat<br />
nem tudta a teszt megbízhatóan mérni. Az akut<br />
gyulladások kimutatására azonban így is alkalmas<br />
volt. Amikor a tesztek érzékenyebbé váltak, ill. a<br />
megbízható alsó mérési tartomány csökkent, az<br />
5-10 mg/l közötti értékekről megtudtuk, hogy jelezheti<br />
az atherosclerosis érfalban lévő mikrogyulladásait<br />
is [3].<br />
4. Fontos szempont, hogy az adott minta mátrixa<br />
mennyire befolyásolja a mérésünket. Tudnunk<br />
kell, hogy milyen biológiai minta milyen előkészítési<br />
módszerrel tehető alkalmassá a mérésre. A<br />
mátrix kérdése mindenképpen felvetődik akkor is,<br />
amikor a viszonyítási standard problémájával foglalkozunk.<br />
5. A mérési eljárás kidolgozásának fontos eleme,<br />
hogy ismerjük a mérési tartományt, azt a koncentrációtartományt,<br />
amelyen belül a koncentrációváltozás<br />
egyértelmű kapcsolatban áll a fizikai jel<br />
változásával. Immunológiai módszereknél mindig<br />
gondolnunk kell a High Dose Hook jelenségre [4],<br />
vagyis arra, hogy a reagens antitestkoncentrációjához<br />
képest nagy mérendő antigénkoncentráció<br />
esetén hamisan alacsony eredményt kaphatunk.<br />
6. Egy módszer beállítása során fontos annak a vizsgálata,<br />
hogy a mérendő minta a mérendő komponensre<br />
nézve mennyire, és milyen körülmények<br />
között stabil.<br />
Fehérjék mérésekor gyakran igazi kihívás a mért<br />
eredmény kifejezése koncentrációértékekben. Míg kis<br />
molekulájú anyagnál, ahol a kristályos anyag a rendelkezésünkre<br />
áll, vagy egyszerű gravimetriás beméréssel,<br />
vagy a mátrix zavaró hatásának kiküszöbölése<br />
érdekében alkalmazott standard addíciós módszerrel,<br />
vagy bonyolultabb esetben referenciamódszerrel<br />
mért másodlagos standard alkalmazásával egyértelműen<br />
összefüggésbe hozhatjuk a mért fizikai jelet a<br />
koncentrációval, fehérjék esetében ez sohase ilyen<br />
egyszerű. Így mindig érdemes fenntartással fogadni,<br />
még a gyári mérési tesztek esetében is az alkalmazott<br />
standardok valódi értékét és a mérési tesztek eredményeinek<br />
valódiságát. Sok esetben nem kapunk összehasonlítható<br />
eredményeket különböző, önmagukban<br />
nagyon megbízható gyári teszteket használva sem.<br />
A fehérjék mérésekor alkalmazott kontrollok eredményei<br />
is módszerfüggők, a független kontrollokra<br />
minden módszerhez más-más érték van megadva, a<br />
reagensgyártó saját kontrolljai pedig nem alkalmasak<br />
más módszerek kontrollálására.<br />
A standardizáció nehézségeinek következményeit<br />
jól példázza a fruktózamin mérés esete. A fruktózamin<br />
mérést mint a diabetes monitorozására használható<br />
redoxireakción alapuló fotometriás módszert<br />
1983-ban használták először és írták le Johnson<br />
és munkatársai [5]. Standardnak ők a glikált fehérje<br />
Amadori-termékének szerkezetét utánzó dezoxi-morfolin-fruktózt<br />
használták. Mivel egyértelmű<br />
volt, hogy a szérum fehérjéje szükséges a reakcióhoz,<br />
standard addíciót alkalmaztak. Módszerükkel a fruktózamin<br />
referenciatartománya 2,0-2,4 mmol/l volt.<br />
Az alkalmazás során kiderült, hogy a módszer legérzékenyebb<br />
része, amelyet legjobban befolyásolnak<br />
a reagens összetételének és egyéb körülményeknek a<br />
kisebb eltérései is, maga a kalibrálás (noha a kalibrálás<br />
célja a kisebb szisztémás hibák kiküszöbölése<br />
lenne) [6, 7], ezért másodlagos, természetes „fruktózamin”-tartalmú<br />
standard alkalmazását javasolták a<br />
mindennapokban. A fruktózaminmérés elterjedését<br />
végül az segítette, hogy egy gyári teszt megjelenésével<br />
párhuzamosan bevezették a 14 C-izotóppal jelzett glükózzal<br />
glikált polilizinre visszavezetetett másodlagos<br />
standard használatát [8]. Így a referenciatartomány<br />
205-285 μmol/l lett. Az így kapott értékek valószínűleg<br />
jobban tükrözik a valódi koncentrációt, mint a<br />
dezoxi-morfolin-fruktózra standardizált mérés eredményei,<br />
bár abszolút helyességében nem lehetünk<br />
biztosak, hiszen a polilizin nem ugyanaz, mint a szérumfehérjék<br />
[9].<br />
Másik standardizálási probléma ugyancsak a diabetes<br />
monitorozás területén a HbA 1c<br />
mérése [10, 11].<br />
A mérés története 1958-ig nyúlik vissza. Itt néhány<br />
évtizednyi standardizálási káosz után az ioncserés<br />
kromatográfiát választották referenciamódszernek,<br />
az eredményt pedig az összes hemoglobin százaléká-
A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége<br />
199<br />
9-2. ábra. Beteg HbA 1c<br />
-értékeinek longitudinális követése<br />
ban adták meg. A HbA 1c<br />
standardizálásának összehangolása<br />
a különböző laboratóriumok, különböző<br />
mérési módszerek között nagyon fontos, mert a betegek<br />
monitorozását sok éven át kell folytatni, és az<br />
eredmények összehasonlítása csak standardizált mérési<br />
módszerek alkalmazásával lehetséges. A standard<br />
a nemzetközi megállapodáson alapuló, ioncserés kromatográfiás<br />
módszerre visszavezethető módon megállapított<br />
koncentrációjú preparátum volt az immunológiai<br />
módszerek esetében is, 1993-tól a Diabetes<br />
Control and Complications Trial (DCCT) javaslatára.<br />
A standardizálást az NGSP (National Glycohemoglobin<br />
Standardization Program) referencialaboratóriumai<br />
felügyelték. Nem csatlakoztak az amerikai<br />
(DCCT-NGSP) rendszerhez, de ugyancsak ioncserés<br />
HPLC-t használtak referenciamódszerként Japánban<br />
(JDS) és Svédországban (MonoS) is, ezek egymástól<br />
eltérő eredményeket adtak.<br />
Napjainkban megy végbe az átállás az új standardizálásra.<br />
Ennek alapja, hogy sikerült tiszta HbA 1c<br />
-t<br />
előállítani, és ebből definitív összetételű preparátumokat,<br />
valamint egy új referencia mérési rendszert<br />
kidolgozni. Lényege, hogy az enzimatikus (endoproteináz<br />
Glu-C) hasítással előállított N-terminális hexapeptidet<br />
izolálják, és tömegspektrometriásan mérik<br />
glikált és nem glikált formáját. Az IFCC ajánlása<br />
szerint az eredményt továbbra is az összes hemoglobinhoz<br />
viszonyítva, de nem százalékban adjuk meg,<br />
hanem mmol/mol mértékegységben. Az új módszer<br />
alapján kiderült, hogy a DCCT-NGSP standardizálással<br />
kapott eredmények nagyobbak a valódi értéknél<br />
(9-2. ábra).<br />
A különféle standardizálásra kapott eredmények<br />
egymásba lineáris összefüggés szerint átszámíthatók<br />
(9-1. táblázat) [12].<br />
Méréseink minőségét különböző referenciaanyagokkal<br />
biztosíthatjuk, ill. ellenőrizhetjük:<br />
• Kalibrátorok. A fehérjék esetében szorosan egy<br />
adott készülék típushoz készült, egy vagy több<br />
koncentrációjú (egy-, ill. többpontos kalibráció).<br />
referencia anyagra/módszerre visszavezethetősége<br />
kötelező.<br />
• Valódiság kontrollok. Nem készülékhez kötött,<br />
nemzetközi szervezetek által felügyelt, referencia<br />
anyagra/módszerre kötelező visszavezethetőség.<br />
• Gyártói precízió kontrollok. Adott készüléktípusra<br />
optimalizált, gyakran a kalibrátorral azonos<br />
alapanyagból készül, visszavezethetősége nem<br />
kötelező.<br />
• Független precízió kontrollok. Nem készülékre<br />
optimalizált, elfogulatlan megítélést tesz lehetővé,<br />
visszavezethetősége nem kötelező.<br />
• Saját precízió kontrollok. Új, általunk kidolgozott<br />
mérés esetében gyakran az egyetlen lehetőség.<br />
Gyűjtött mintából mérünk minden alkalommal.<br />
A többi precízió kontrollhoz hasonló-<br />
9-1. táblázat. A HbA 1c<br />
átszámítási összefüggései<br />
IFCC egységből indulva<br />
X = HbA 1c<br />
IFCC egységben (mmol/mol)<br />
Számítás<br />
NGSP egységből indulva<br />
X = HbA 1c<br />
NGSP egységben (%)<br />
IFCC (mmol/mol) = X IFCC (mmol/mol) = 10,93 X – 23,5<br />
NGSP (%) = 0,0915X + 2,15<br />
NGSP (%) = X<br />
JDS (%) = 0,0927X + 1,73 JDS (%) = 1,013X – 0,45<br />
MonoS (%) = 0,0989X + 0,88 MonoS (%) = 1,081 X – 1,44
200 9. fejezet A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége<br />
an, bár a módszer valódiságát (bias) nem mutatja<br />
a mérés relatív szisztémás hibáját, eltérését (az<br />
előző mérésekhez viszonyítva) követni lehet<br />
vele. Nagyon fontos, hogy biztosak legyünk<br />
benne, hogy a kontrollminta tárolása nem befolyásolja<br />
a mérés eredményét.<br />
• Külső kontroll. Rutin laboratórium munkájához<br />
elengedhetetlen külső kontrollok használata,<br />
hogy tudjuk, eredményeink mennyire összehasonlíthatók<br />
más laboratóriumokéval. Több szervezet<br />
foglalkozik külső kontrollrendszerek szervezésével,<br />
minták küldésével, eredmények feldolgozásával.<br />
A külső kontrollként, „körkontrollként”<br />
használt minták minősége a valódiságkontrollok<br />
minőségének felelnek meg. Elterjedt<br />
rutin módszerek esetében ezek elérhetők. Ennek<br />
hiányában, újabb módszereknél arra kell törekednünk,<br />
hogy évente néhány mintát több, egymástól<br />
függetlenül működő laboratóriumban<br />
meghatározzunk.<br />
Kontrolljainkra mért eredményeket az ötvenes évek<br />
óta a jól ismert Levey-Jennings-grafikonon (9-3. ábra)<br />
ábrázoljuk [13]. A középértékeket és a szórás értékeit a<br />
gyári kontrolloknál a gyártó adja meg, saját kontrollnál<br />
magunknak kell számolnunk. A megadott szórás értékei<br />
logikusan a mérési eljárás precízióját fejezik ki, de<br />
elképzelhető olyan megoldás is, hogy a határértékeket<br />
a paraméter biológiai varianciájából képezik megfelelő<br />
statisztikai módszerrel („six sigma”). Jó az, ha a kettő<br />
között nincsen nagy eltérés vagy ha a mérési eljárás<br />
precíziójából számolt határértékek a kisebbek. Ilyenkor<br />
szigorúbbak vagyunk a szükségesnél. A cél mindenképpen<br />
az kell hogy legyen, hogy a mérés hibája<br />
ne befolyásolja a klinikai megítélést vagy kutatásainkban<br />
a vizsgált és a kontrollcsoport eredményei közti<br />
9-3. ábra. Levey-Jennings-grafikon<br />
különbségek értékelését. A kontrollok értékelésére a<br />
Westgard-szabályok szerinti számítás alkalmas [14].<br />
A kontrollméréseket hagyományosan „batch”, azaz<br />
sorozatmérés esetén a mérendő minták közé tesszük,<br />
és a mintával egyezően kezeljük. Ilyenkor, ha a kontrollokban<br />
hiba mutatkozik, a Westgard-szabályoknak<br />
megfelelően az egész sorozatot meg kell ismételnünk.<br />
Manapság tendencia, hogy egyrészt a rutin laboratóriumok<br />
és ezzel a mérési sorozatok egyre nagyobbak,<br />
másrészt az automaták többsége nem batch, hanem<br />
betegorientált módon mér. Ezért egyre inkább az az általános<br />
szokás, hogy a minták mérését akkor kezdjük,<br />
ha a kontrollmintákat már lemértük, eredményeit értékeltük,<br />
az esetleges hibákat kijavítottuk.<br />
A kontroll szónak van másik jelentése is. Klinikai<br />
kutatásainkban, ha kíváncsiak vagyunk, hogy a mérendő<br />
paramétert hogyan befolyásolja valamilyen<br />
állapot (betegség, gyógyszer, környezeti hatás stb.),<br />
nem elég, ha a vizsgált személyek vagy kísérleti állatok<br />
mintájából mérjük az adott paramétert jól beállított<br />
analitikai módszerrel, hanem a vizsgált csoporthoz<br />
majdnem mindenben hasonlító kontrollcsoportot<br />
is vizsgálnunk kell. Leginkább a kor és a nem eloszlására<br />
kell figyelni, a csoport létszámának pedig a vizsgált<br />
csoport létszámával összevethetőnek kell lennie.<br />
Következtetések levonására, statisztikai értékelésre<br />
csak ezek figyelembevételével alkalmas a mérési sorozat.<br />
Ettől a szabálytól legföljebb akkor lehet eltekinteni,<br />
ha széles körben elterjedt, jól leírt paramétert<br />
standardizált gyári teszttel mérünk, amelynek a referenciatartományát,<br />
annak változásait jól ismerjük.<br />
Rossz példa volt erre Schoenfeld és munkatársainak<br />
[15] kutatása, amely szerint az antihiszton<br />
antitest mennyisége monoklonális gammopathiák,<br />
myeloma multiplex betegségben is hasonló arányban<br />
emelkedett, mint autoimmun SLE vagy rheumatoid<br />
arthritis esetében. (Hiszton fehérjék ellen termelt<br />
autoantitest, autoimmun betegségekben várható a<br />
megjelenése.) Amikor követni akartuk ezeket a kísérleteket<br />
megfelelő korú kontrollcsoportot is bevonva,<br />
kiderült, hogy az antihiszton antitestek megjelenése<br />
(gyári, szemikvantitatív ELISA tesztet használva)<br />
idős korban (70 év felett) gyakori, emiatt a myeloma<br />
multiplexben talált előfordulási valószínűség nem<br />
volt nagyobb, mint a korban megfelelő kontrollcsoportban<br />
[16, 17] Ebből is látszik, hogy a megfelelő<br />
kontrollcsoport kiválasztása van olyan lényeges, mint<br />
a vizsgálati csoporté.
A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége<br />
201<br />
Az eddigiekből levonható az a következtetés, hogy<br />
a kontrollok alkalmazása (a szó mindkét értelmében)<br />
létfontosságú mind a klinikai laboratóriumi rutinmunkában,<br />
mind kutatásainkban.<br />
Irodalom<br />
[1] http://en.wikipedia.org/wiki/Beer%E2%80%93Lambert_law<br />
[2] http://hu.wikipedia.org/wiki/Pajzsmirigyserkent%-<br />
C5%91_hormon<br />
[3] http://en.wikipedia.org/wiki/Atherosclerosis<br />
[4] http://www.mercodia.se/learning-center/mercodia-elisa-technology/high-dose-hook-effect.html<br />
[5] Johnson, R. N. et al.: Fructosamine: a new approach<br />
to the estimation of serum glycosylprotein. An index of<br />
diabetic control. Clin. Chem. Acta 127: 87–95, 1983.<br />
[6] Baker, J. R. et al.: Use of protein-based standards in<br />
automated colorimetric determinations of fructosamine<br />
in serum. Clin. Chem. 31:1550–1554, 1985.<br />
[7] Lakatos Á., Jobst K.: A p-Nitro-Tetrazóliumkék koncentráció<br />
szerepe a fruktózamin Standardizálásában.<br />
Laboratóriumi Diagnosztika 16:241–243, 1989.<br />
[8] Schleicher, E. D., Vogt, B. W.: Standardization of<br />
serum fructosamine assays. Clin. Chem. 36:136–139,<br />
1990.<br />
[9] Fructosamine Cobas Teszt leírás, Roche.<br />
[10] http://en.wikipedia.org/wiki/Glycated_hemoglobin<br />
[11] Weykamp, C., John, W. G., Mosca, A.: A Review of<br />
the Challenge in Measuring Hemoglobin A 1c<br />
. J. Diabetes<br />
Sci. Technol. 3:(3), 439–445, 2009.<br />
[12] Little, R. R., Rohlfing, C. L., Wiedmeyer, H. M. et<br />
al. – NGSP Steering Committee.: The national glycohemoglobin<br />
standardization program: a five-year progress<br />
report. Clin. Chem. 47(11):1985–1992, 2001.<br />
[13] Levey, S., Jennings, E. R.: The use of control charts in<br />
the clinical laboratory. Am. J. Clin. Pathol. 66:268–275,<br />
1976.<br />
[14] Westgard, J. O., Barry, P. L., Hunt, M. R. et al.: A<br />
multi-rule Shewhart chart for quality control in clinical<br />
chemistry. Clin. Chem. 27:493–501, 1981.<br />
[15] Schoenfeld, Y., El-Roeiy, A., Ben-Yehoda, O. et al.:<br />
Detection of antihistone activity in sera of patients with<br />
monoclonal gammopathies. Clin. Immunol. Immunopath.<br />
42:250–258, 1987.<br />
[16] Lakatos, Á., Sétáló, J., Jobst, K. et al.: Relationship<br />
of serum antihistone antibody level to the patient‘s age.<br />
Acta Med. Hung. 49:91–100, 1992.<br />
[17] Jobst, K., Lakatos, Á., Sétáló, J.: Diagnostic value<br />
of the antihistone antibody (AHA) test in autoimmun<br />
diseases. Klin. Lab. 5:109–110, 1992.
10. Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai<br />
kutatásban<br />
Nagy Tamás<br />
Előzmények<br />
Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) volt az első<br />
a történelemben, aki - saját készítésű mikroszkópjával<br />
– sejteket, egysejtű élőlényeket figyelt meg, többek<br />
között baktériumokat, izomrostot, spermiumot.<br />
1839-ben Theodor Schwann és Matthias Jakob<br />
Schleiden kidolgozzák azon elméletüket, hogy a<br />
növények és az állatok sejtekből épülnek fel. A XIX.<br />
század második felében jelentős előrelépésekre került<br />
sor a sejtkultúrák fenntartásához elengedhetetlen oldatok,<br />
médiumok kifejlesztésében; Ringer, akinek<br />
neve máig ismerősen cseng minden klinikus számára<br />
(Ringer-oldat), nátrium-, kálium-, kalcium- és magnéziumion-tartalmú<br />
oldatot készített, hogy állatok<br />
izolált szívpreparátumait életben tartsa. Wilhelm<br />
Roux 1885-ben speciális tápoldatban több napig életben<br />
tartott csirkeembrióból származó idegszövetet.<br />
A sejttenyésztési technikák a múlt század negyvenes-ötvenes<br />
éveiben jelentős fejlődésen mentek keresztül;<br />
ebben az időszakban vált nyilvánvalóvá, hogy<br />
a vírusok önmagukban nem szaporodnak, tenyésztésükhöz<br />
és kimutatásukhoz élő sejtek szükségesek.<br />
Sejtkultúra segítségével dolgozták ki a pl. a poliomyelitis<br />
elleni vakcinát. Jonas Salk az ún. HeLa sejtkultúrát<br />
használta a poliomyelitisvakcina tesztelésére. A<br />
HeLa sejtvonalat nem sokkal halála előtt a Henrietta<br />
Lacks nevű méhnyakdaganatos betegből izolálták, ez<br />
az egyik legrégebbi immortalizált sejtvonal, amelyet<br />
máig széles körben használnak, és az első humán eredetű<br />
sejtvonal, amelyet sikeresen tenyésztettek [1, 2].<br />
Jelenleg a sejttenyésztés szinte minden biológiai kutatólaborban<br />
használt általános technika, általános<br />
sejtélettani folyamatok és specifikus sejttípusok vizsgálatára<br />
is kiválóan alkalmas. Az őssejtkutatások központi<br />
kérdése, hogy a sejtkultúrák környezetének, körülményeinek<br />
megváltoztatásával hogyan lehet az el<br />
nem kötelezett sejteket specifikus feladatok irányába<br />
terelni. Szintén intenzíven vizsgált terület az elkötelezett<br />
sejtek visszafordítása éretlenebb sejtté, hiszen<br />
így kiválthatnánk az embrionális őssejtek izolálását<br />
és kutatásra való felhasználását, amely eljárások máig<br />
vitatott etikai problémákat és kérdéseket vetnek fel.<br />
Egyre szofisztikáltabb technológiai újítások teszik<br />
lehetővé, hogy a primitív, immortalizált sejtek helyett<br />
olyan sejtkultúrákat és a sejtek számára olyan<br />
mátrixokat hozzanak létre, amelyek nagyfokban hasonlítanak<br />
a szervezet szerveiben, szöveteiben élő elkötelezett<br />
sejtekre. Sőt talán nem kell hangsúlyozni,<br />
mekkora a jelentősége azoknak a kutatásoknak, amelyek<br />
több sejttípus felhasználásával élő szöveteket és<br />
szerveket próbálnak létrehozni.<br />
Sejttenyésztés<br />
Sejttípusok<br />
Sejttenyésztésben használt sejtek<br />
A sejttenyésztésben használt sejteket eredetük szerint<br />
alapvetően három csoportra lehet osztani:<br />
• primer sejtek;<br />
• transzformált sejtek,<br />
• embrionális sejtek és őssejtek.<br />
Primer sejt<br />
A primer sejtek valamilyen szövetből, szervből<br />
annak homogenizálása, szerkezetének kíméletes felbontása<br />
által nyerhetők ki. Ez a folyamat lehet mechanikus<br />
(pl. lágy szövetből – pl. az idegrendszerből<br />
- a szövetet egyre csökkenő belső átmérőjű pipettán/fecskendőtűn<br />
szívjuk át), vagy igénybe vehetők<br />
emésztőenzimek (pl. kollagenáz, tripszin), amelyek a<br />
sejt-sejt, ill. a sejt-extracelluláris mátrix közötti kapcsolatokat<br />
bontják fel. A primer sejtek általában lassabban<br />
vagy egyáltalán nem osztódnak, osztódásuk<br />
néhány ciklus után megáll, és a sejtek elöregednek, elfajulnak.<br />
Ezzel szemben előnyük, hogy kezdetben az
204 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
eredeti szövetre, szervre jellemző sajátságokkal rendelkeznek,<br />
mint pl. a sejt alakjának, morfológiájának,<br />
fehérjeexpressziós profiljának, sejtfelszíni markereinek<br />
megtartása. Általában ezek a tulajdonságok az<br />
első 1-2 osztódás során a legkifejezettebbek, a később<br />
sejtek ezekből a jellegzetességekből veszíthetnek. A<br />
keretes mellékletben egy rövid módszertani leírást ismertetünk<br />
patkányszívizomsejt izolálásához.<br />
Neonatális szívizomsejt izolálása. 2–5 napos újszülött<br />
patkányokat használunk erre a célra. Az eltávolított<br />
patkányszíveket módosított MEM pufferben<br />
előbb steril szikével 1-2 mm-es darabokra<br />
vágjuk, majd kollagenáz enzimes emésztésnek<br />
vetjük alá. 3-4 × 10 perces, 37 ºC-on lejátszódó<br />
emésztési ciklus végén a sejtszuszpenziókat öszszeöntjük<br />
(poolozzuk). Centrifugálás (500 rpm,<br />
10 perc) következik előbb fötális marhaszérumban,<br />
majd ún. „overnight” médiumban reszuszpendáljuk<br />
a sejteket [(DMEM:M199 (4:1) + 15%<br />
FBS + penicillin (100 U/mL) + streptomicin (100<br />
µg/mL) + arabinóz C (10 µM)]. A sejtszuszpenziót<br />
ezután kollagénnel fedett Petri-csészékbe<br />
vagy ún. „chambered coverslip”-re öntjük. A sejtsűrűség<br />
~1*106/mL, ez elegendő ahhoz, hogy a<br />
kitapadó cardiomyocyták összefüggő hálózatot<br />
alkossanak és spontán, ritmusosan kontraháljanak.<br />
24 óra elteltével a médiumot szérummentes<br />
médiumra cseréljük (DMEM + Nutridoma supplement).<br />
Természetesen egy adott primer sejttípus sikeres izolálása<br />
és tenyésztése eltérő lehet, így a módszert minden<br />
laboratóriumnak egyedileg kell optimalizálnia.<br />
Újabban gyári izolálókiteket is lehet vásárolni, sőt<br />
primer sejtvonalak is elérhetők kereskedelmi forgalomban,<br />
ez esetben a szállító garantálja a sejtszámot<br />
és a primer kultúra fenntarthatóságának időtartamát.<br />
Transzformált sejt<br />
A transzformált sejtek lehetnek malignus szövetből<br />
származó daganatos sejtek. Az ilyen sejtek élő<br />
szervezetben mutációk során alakulnak át kontrollt<br />
vesztett, immortális sejtekké (pl. a daganatos betegekből<br />
származó minták, lásd HeLa sejtvonal, vagy<br />
állatokban mesterségesen, pl. benzpirén, aflatoxin,<br />
vírusok stb. révén előidézett daganatokból származó<br />
minták).<br />
A transzformált sejtvonalak egy másik csoportja<br />
eredetileg primer sejt volt, de mesterségesen transzformálták.<br />
Az utóbbit elő lehet idézni pl. vagy a telomeráz<br />
enzim expressziójának fokozásával, vagy<br />
vírusfertőzéssel (SV-40 vírus), vagy esetleg már malignusan<br />
transzformálódott sejtek fúziójával. Ez esetben<br />
hibridómáról beszélünk, amely mindkét „szülő”<br />
sejttípus sajátságait magán viseli: ilyen a korlátlan<br />
osztódásra való képesség, de megmarad a primer<br />
sejtre jellemző fenotípusa. A hibridómatechnológiát<br />
leggyakrabban antitestek gyártására használják: egy<br />
specifikus antitestet termelő B-sejtet fuzionálnak<br />
szintén B-sejt eredetű, de malignus myelomasejttel.<br />
A fúzió eredményeként a hibrid sejt hosszú ideig és<br />
relatíve rövid ciklusidővel képes osztódni, és szerencsés<br />
esetben megőrzi specifikus antitest termelésére<br />
való képességét is. Ezek az ún. monoklonális antitestek<br />
ma már a kutatásnak (immunhisztokémia, Western<br />
blot, immunprecipitáció stb.), de a diagnosztikának<br />
(szérumfehérjék, hormonok detektálása számos immunológiai<br />
módszerrel) is elengedhetetlen reagensei.<br />
A transzformált, immortalizált sejtek, bár a primer<br />
sejtekhez képest nagyságrendekkel tovább tenyészthetők,<br />
bizonyos idő és osztódásszám (60–80 generáció)<br />
után szintén elöregedhetnek. Ennek oka a sorozatos<br />
osztódásból adódó környezeti hatásokra kialakuló<br />
vagy random hibákból származó és egyre gyakoribbá<br />
váló DNS-replikációs hibák. Jelei: lassabb növekedés,<br />
gyakoribb apoptózis, az eredeti fenotípus eltűnése.<br />
Őssejt<br />
Az őssejtek differenciálatlan, ún. pluripotens sejtek.<br />
Ez azt jelenti, hogy egyrészt számos sejtosztódás<br />
után sem öregednek el (tehát ilyen szempontból hasonlítanak<br />
a transzformált sejtekhez), másrészt az<br />
osztódáskor keletkező „leánysejtek” elindulhatnak a<br />
differenciálódás irányába valamilyen külső inger hatására.<br />
Totipotensnek nevezzük azokat az őssejteket,<br />
amelyekből bármilyen sejttípus kialakulhat, tehát<br />
gyakorlatilag egy teljes szervezet minden szövete.<br />
A multipotens őssejtek számos, de egymással szoros<br />
rokonságot, hasonlóságot mutató sejttípussá tudnak<br />
csak alakulni, az unipotens őssejt pedig csak egyetlen<br />
típusú differenciált leánysejtet képes létrehozni, természetesen<br />
önmaga osztódási képességének fenntartása<br />
mellett.
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
205<br />
Őssejteket izolálni több módon lehetséges. Az<br />
egyik módja, hogy 50–150 sejtből álló embrióból<br />
nyernek ki őssejteket. Ez lehetséges állatból (pl. egér)<br />
vagy humán embrionális őssejteket in vitro fertilizációt<br />
(IVF) követően a beültetésre nem kerülő, megtermékenyített<br />
petesejtekből. Az utóbbi eset, vagyis<br />
humán embrió felhasználása kísérleti célokra szigorú<br />
etikai engedélyekhez kötött, és a humán embrionális<br />
őssejtkutatás jelenleg is komoly viták tárgya. Felnőtt<br />
állatokból vagy emberekből is származhat őssejt, habár<br />
számuk az összes sejthez képest felnőtt szervezetben<br />
már kicsi és ezek nagy része is csak multipotens.<br />
A gyakorlatban izolálhatnak őssejteket vérből,<br />
csontvelőből, köldökzsinórvérből, de izomszövetből,<br />
szívizomból, bőrből vagy akár fejlődő fogból is. A hematopoetikus<br />
őssejteket már régóta alkalmazzák terápiában<br />
is: a saját (autológ) vagy idegen (allogén),<br />
gyűjtött őssejteket tenyésztés után a betegbe juttatják.<br />
Kedvező esetben az őssejtek az előzetesen kemoterápiával<br />
vagy besugárzással kiirtott csontvelő helyén<br />
megtelepednek, és újra beindítják a vérképzést.<br />
Újabban sikeres kísérleteket végeztek differenciált,<br />
szomatikus sejtek őssejtállapotba való visszafordítására.<br />
2006-ban elsőként japán kutatóknak sikerült<br />
emberi, differenciált bőrsejtekből őssejteket előállítani<br />
oly módon, hogy vírus segítségével az őssejtekre<br />
jellemző transzkripciós faktorok génjeit juttatták be.<br />
Majd néhány hétre rá a sejtek az őssejtekre jellemző<br />
morfológiát kezdtek mutatni, valamint a telomeráz<br />
enzim (amely megakadályozza a kromoszómák fokozatos<br />
rövidülését osztódás során, vagyis a sejtek öregedését)<br />
aktivitása is fokozódott [3].<br />
Szuszpenziós vs. kitapadó sejtek<br />
A sejtkultúrák típusait feloszthatjuk aszerint is,<br />
hogy kitapadó vagy szuszpenziós sejtekkel dolgozunk.<br />
A szuszpenziós sejtek leggyakrabban fehérvérsejtek<br />
vagy azok transzformált változatai, közös<br />
jellemzőjük, hogy a gyakorlatban elterjedt műanyag<br />
vagy üvegfalú tenyésztőedények falához nem vagy<br />
csak nagyon lazán kötődnek, enyhe rázás elegendő<br />
a leülepedett sejtek felkavarásához. E sejtek egymáshoz<br />
való kapcsolata is rendszerint kisfokú, az osztódások<br />
során ugyan az utódsejtek közel maradhatnak<br />
egymáshoz, kisebb csoportokat létrehozva, azonban<br />
néhányszor felpipettázva azokat egyenletes, homogén,<br />
„egysejtű” sejtszuszpenziót kaphatunk. A szuszpenziós<br />
sejtkultúrák előnye, hogy könnyebb a passzálás,<br />
nem igényel tripszines kezelést, valamint ideális<br />
alanyai azon kísérleteknek, ahol a sejteket egyesével,<br />
külön-külön szeretnénk vizsgálni (flow citometria,<br />
fluorimetria). Mikroszkópos vizsgálatokhoz, mint pl.<br />
az immunhisztokémia, a szuszpenziós sejteket ún.<br />
citospin eszközzel ülepíthetjük tárgylemezre [4]. A<br />
sejtszám optimális beállításával elérhetjük, hogy se<br />
túl sűrűn, se túl ritkán ne helyezkedjenek el.<br />
A sejtvonalak nagyobb része kitapadó sejtkultúra,<br />
vagyis az edény falához, ill. egymáshoz tapadva<br />
„monolayereket”, sejtréteget képeznek. E tulajdonságukból<br />
kiindulva egy adott kultúra jellemezhető<br />
az ún. konfluenciával, vagyis hogy egy adott felület<br />
hány százalékát fedik le. A legtöbb sejttípusra<br />
jellemző valamilyen fokú kontakt inhibíció; ennek<br />
hiánya erősen differenciálatlan sejtet jelez. Kontakt<br />
inhibíció során a sejtek elfoglalva egy adott felületet,<br />
elegendő tápanyag esetén sem fognak tovább osztódni.<br />
Inhibíció hiányában a monolayer kialakítása<br />
után (vagy már közben) második, sőt további rétegeket<br />
foglalnak el.<br />
Általános szabályként alkalmazható, hogy körülbelül<br />
5-10% konfluenciát érdemes a passzálás során<br />
beállítani, majd a sejtek osztódása után 70–80%<br />
konfluenciát elérve tanácsos az újabb passzálást elvégezni.<br />
Ez azt jelenti, hogy ha pl. 24 óránként megduplázódik<br />
a sejtek száma (korlátlanul rendelkezésre<br />
álló tápanyagot feltételezve), kb. 3-4 naponta szükséges<br />
átpasszálni a sejteket. Kitapadó sejtekkel dolgozva<br />
a passzálás során először el kell távolítani a sejteket<br />
mind egymástól, mind pedig a tenyésztőedény felületéről.<br />
Ezt leggyakrabban tripszin és valamilyen<br />
Ca 2+ -elvonó (EDTA vagy EGTA) kombinációjával<br />
érhető el. Mind a Ca 2+ -megvonás, mind a sejtfelszíni<br />
fehérjék emésztése elősegíti a sejtek lekerekedését és<br />
leválását a felületről. Ezután mosást követően vehetjük<br />
fel a kívánt mennyiségű, homogén sejtszuszpenziót<br />
megfelelő mennyiségű friss médiumban. Az így<br />
kezelt sejtek általában néhány óra alatt ismét kitapadnak,<br />
és felveszik a rájuk jellemző morfológiát.<br />
A kitapadó kultúrák előnyei:<br />
• A sejtszámnövekedés könnyebben megítélhető.<br />
• Esetleges kontaminációt könnyebb kezelni.<br />
• Mikroszkópos kísérletek során nincs szükség<br />
citospinre, közvetlenül növeszthetők fedő- vagy<br />
tárgylemezen.<br />
• Nagyobb méretű citoplazma segíti az intracelluláris<br />
történések megfigyelését.
206 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
• A sejtek egymással való kölcsönhatása is vizsgálható.<br />
Sejtvonalak. Néhány gyakran használt sejtvonal (a<br />
teljesség igénye nélkül):<br />
• HeLa: humán cervixcarcinoma.<br />
• 3T3: egér fibroblast (3 naponta transzfer, 3 × 10 5<br />
sejt/20 cm 2 sűrűséggel).<br />
• Jurkat: humán T-sejt eredetű immortalizált sejtvonal.<br />
• MDCK – kutyavese epithelialis sejt (Madin<br />
Darby Canine Kidney).<br />
• RBL: patkányhízósejtek (Rat Basophilic<br />
Leukemia).<br />
• SHSY5Y: humán neuroblastoma.<br />
• Caco: humán epithelialis colorectalis adenocarcinoma.<br />
• CHO: hörcsög petefészek (Chinese Hamster<br />
Ovary).<br />
• PC12: patkány phaeochromocytoma.<br />
• Hep G2: humán hepatocellularis carcinoma.<br />
Természetesen több ezer további sejtvonal létezik, talán<br />
a legteljesebb katalógus, megvásárolható törzsekkel,<br />
az ATCC (American Type Culture Collection)<br />
honlapján található [5].<br />
Tenyésztőedények, flaskák<br />
A sejtek tenyésztéséhez ún. tenyésztőflaskákat alkalmazunk<br />
[6]. A tenyésztőflaskák helyett használhatunk<br />
steril Petri-csészét vagy akár steril, fektetett<br />
kémcsövet is, de a flaskák kiképzése biztosítja az optimális<br />
feltételeket:<br />
• Felületet biztosít kitapadó sejtek számára. A<br />
kitapadás leggyakrabban a flaska anyagához<br />
történik, de bevonhatják a felületet pl. kollagénnel<br />
vagy poli-D-lizinnel a jobb kitapadás érdekében.<br />
• A flaskát az inkubátorban elfektetve nagyobb<br />
felületen érintkezik a médium az inkubátor<br />
levegőjével, elősegítve ezzel a gázcserét.<br />
• A döntött nyak megkönnyíti a pipettázást és a<br />
fektetett tárolást.<br />
• A kupakban elhelyezett filter a gázcserét megengedi,<br />
de a pórusméretnél (0,2 μm) nagyobb<br />
részecskék, baktériumok átjutását nem.<br />
Különböző méretben kaphatók flaskák, leggyakrabban<br />
25, 75 vagy 150 cm 2 felszínű típusokat alkalmazunk.<br />
A kisebb, 25 cm 2 -es flaskát kb. 8-10 mL médiummal<br />
optimális feltölteni, a 75 cm 2 -es flaska 40-50<br />
mL, a 150 cm 2 -es flaska pedig 100-150 mL médiummal<br />
is feltölthető anélkül, hogy az az inkubátorban a<br />
fektetett flaskából kifolyna.<br />
A flaskák kívül gyakoriak a lemezek [7]. Különböző<br />
számú és méretű lyukakban (well) helyezhetjük<br />
el a sejteket tartalmazó szuszpenziót (6, 12, 24 vagy<br />
96 lyuk). Ezeket a lemezeket nem elsősorban a sejtek<br />
fenntartására vagy szaporítására használjuk, hanem<br />
olyan kísérleteknél, ahol párhuzamosan több különböző<br />
kezelés hatását vizsgáljuk. Fedőlemezeket is elhelyezhetünk<br />
bennük, amelyeken a sejtek kitapadása<br />
után pl. immunhisztokémiai vizsgálatokat végezhetünk.<br />
A fedőlemezeket 96%-os alkoholba mártva,<br />
majd Bunsen-égő lángjában leégetve sterilizálhatjuk,<br />
mielőtt a sejtszuszpenziót rápipettázzuk.<br />
Inkubátor<br />
A sejttenyésztés elengedhetetlen feltétele a hőmérséklet<br />
és a gázcsere kontrollált körülmények között<br />
tartása, ezért minden sejttenyésztéssel foglalkozó laboratóriumban<br />
megtalálható legalább egy inkubátor.<br />
Az esetek nagy részében 37 ºC-ot és normális légköri<br />
oxigén- és nitrogé tenzió mellett 5-os CO 2<br />
-tartalmat<br />
tartunk fent. Ez a CO 2<br />
- (vízben oldódva, fiziológiás<br />
pH-n HCO 3-<br />
-tá disszociál) koncentráció<br />
jóval nagyobb a légköri értéknél (~0,04%), azonban<br />
megközelíti az emberi és állati szövetekben, kapillárisokban<br />
található, aerob metabolizmus által termelt<br />
HCO 3–<br />
-koncentrációt. Az inkubátorok a hőmérsékletet<br />
és csatlakoztatott gázpalack segítségével a CO 2<br />
-ot<br />
is a beállított értéken tartják. A levegő szűrőn keresztül<br />
jut el az inkubátor légterébe. A szűrő állapotát<br />
időszakosan ellenőrizni, szükség szerint cserélni kell.<br />
Mivel az inkubátor hőmérsékletét 37 ºC-on tartjuk,<br />
a párolgás sokkal kifejezettebb, mint szobahőmérsékleten.<br />
Így az inkubátorba helyezett sejttenyészetek<br />
médiumai nagyon gyorsan bekoncentrálódnának.<br />
Ennek kivédésére az inkubátorba egy edényben vizet<br />
helyezünk (lehetőség szerint desztillált vizet, és a<br />
sterilitására is ügyelni kell, hiszen könnyen kontamináció<br />
forrása lehet), ami az adott hőfokon telített vízgőzt<br />
alakít ki, megakadályozva a médiumok túlzott<br />
párolgását.
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
207<br />
Médiumok<br />
Médiumok összetevői<br />
Míg régen általában a laboratóriumok<br />
maguk állították össze a médiumokat,<br />
manapság gyakoribb azok<br />
megrendelése biotechnológiai kereskedelmi<br />
cégektől. Kétféle formátum<br />
terjedt el: az azonnal használható oldat,<br />
ill. a tárolás szempontjából kedvezőbb<br />
por forma, ezt használat előtt<br />
megadott térfogatú vízben fel kell oldani<br />
és pH-ját beállítani.<br />
A 10-1. táblázatban egy gyakran<br />
alkalmazott és viszonylag egyszerűbb<br />
összetételű médium, az RPMI-1640<br />
összetételét ismertetjük. E médiumot<br />
gyakran alkamazzuk „igénytelen”, jól<br />
tenyészthető sejtek esetén. Az RPMI<br />
mint „minimál” tápoldat összetétele<br />
jól demonstrálja a sejtek számára<br />
alapvetően szükséges összetevőket:<br />
ionok (nátrium, kálium, kalcium,<br />
magnézium, klorid), glukóz, vitaminok,<br />
esszenciális aminosavak.<br />
Általában a megvásárolható médiumokból<br />
vagy a glutamin, vagy<br />
a nátrium-bikarbonát szándékosan<br />
hiányzik (a táblázatban pirossal jelezve),<br />
ezt utólag kell pótolni a médiumot<br />
használónak. Az utólagos<br />
adagolásra elsősorban a glutamin lebomlása<br />
miatt van szükség. Újabban<br />
a glutamint más aminosavhoz kötve<br />
(alanin), dipeptid formátumban adhatják,<br />
így a médiumban a glutamin<br />
koncentrációja lassabban csökken le,<br />
élettartama nagymértékben megnő.<br />
Ilyen médiumok vásárlásakor győződjünk<br />
meg arról, hogy az általunk<br />
használt sejttípus képes-e a dipeptidből<br />
kinyerni a glutamint.<br />
A fenolvörös pH-indikátor savas<br />
oldatban sárga, lúgosban lila színű;<br />
ezáltal a régóta használt vagy nyitva<br />
felejtett oldatokban a szén-dioxid<br />
elpárolgását, eltűnését lila színnel, a<br />
sejtek metabolizmusa miatt felszapo-<br />
10-1. táblázat. Az RPMI-1640 médium összetétele *<br />
Vegyület Mennyiség Mértékegység<br />
l-lizin-monohidroklorid 40 mg/l<br />
l-szerin 30 mg/l<br />
glicin 10 mg/l<br />
l-aszparagin, vízmentes 50 mg/l<br />
l-leucin 50 mg/l<br />
l-prolin 20 mg/l<br />
l-aszpartánsav 20 mg/l<br />
l-triptofán 5 mg/l<br />
l-glutaminsav 20 mg/l<br />
l-izoleucin 50 mg/l<br />
l-fenilalanin 15 mg/l<br />
l-hidroxi-l-prolin 20 mg/l<br />
l-valin 20 mg/l<br />
l-cisztin-dihidroklorid 65,2 mg/l<br />
l-hisztidin 15 mg/l<br />
l-metionin 15 mg/l<br />
l-arginin, kötetlen bázisos 200 mg/l<br />
l-treonin 20 mg/l<br />
l-tirozin-dinátrium, dihidrát só 28,83 mg/l<br />
l-glutamin 300 mg/l<br />
kalcium-nitrát-tetrahidrát 100 mg/l<br />
nátrium-foszfát, dibázikus, vízmentes 800 mg/l<br />
nátrium-klorid 6,000 mg/l<br />
nátrium-bikarbonát 2,000 mg/l<br />
magnézium-szulfát, vízmentes 48,84 mg/l<br />
kálium-klorid 400 mg/l<br />
folsav 1 mg/l<br />
d-biotin 0,2 mg/l<br />
mioinozitol 35 mg/l<br />
riboflavin 0,2 mg/l<br />
d-Ca-pantotenát 0,25 mg/l<br />
piridoxin-hidroklorid 1 mg/l<br />
B 12<br />
-vitamin 0,005 mg/l<br />
p-aminobenzoesav (PABA) 1 mg/l<br />
kolin-klorid 3 mg/l<br />
tiamin-hidroklorid 1 mg/l<br />
nikotinamid (nikotinsavamid) 1 mg/l<br />
fenolvörös nátriumsó 5,3 mg/l<br />
l-glutation, redukált 1 mg/l<br />
d-glukóz, vízmentes 2,000 mg/l<br />
*<br />
A piros színnel jelzett vegyületek a készen beszerzett médiumból hiányozhatnak,<br />
utólag pótlandók.
208 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
rodó savak (tejsav, szénsav) megjelenését pedig sárga<br />
színnel jelzi.<br />
Egy adott médiumon belül is számos változtatásra<br />
van lehetőség, pl. az egyik leggyakoribb, amikor glükózmentes<br />
médiumot rendelnek/állítanak elő. Mivel<br />
a médium általában 10-20 mM glukózt tartalmaz<br />
(alapesetben a sejtek bőséges tápanyagellátása élvez<br />
prioritást), fiziológiás (~5,5mM) mennyiségű glükózt<br />
igénylő kísérletekben ilyen médium nem használható,<br />
glükózmentes médium glükózkoncentrációja viszont<br />
tetszőlegesen állítható be.<br />
pH, indikátor<br />
A médium pH-ját több tényező befolyásolja: a<br />
benne oldott pufferek (foszfátok, amfotér aminosavak,<br />
bikarbonát), az inkubátor által szabályozott CO 2<br />
/<br />
HCO 3-<br />
, a szérum (albumin, fehérjék, laktát stb.) és a<br />
sejtek által termelt anyagok (bikarbonát, laktát). Médiumok<br />
elkészítésénél a bikarbonát hozzáadása után<br />
a pH-t általában 7,2–7,4 közé kell beállítani. Mivel a<br />
bikarbonát illékony, idővel a tárolás során a médium<br />
lúgos irányba változhat. Ezt a médium indikátora<br />
színváltozással jelzi is, legtöbbször ez mégsem okoz<br />
különösebb gondot, hiszen az inkubátorban a magasabb<br />
CO 2<br />
-tenzió a pH-t megfelelő szintre állítja viszsza.<br />
Szérum<br />
A táptalajok egyik legfontosabb összetevője a szérum.<br />
Ez leggyakrabban fötális marhasavó (FBS), de<br />
használható pl. lószérum, ezek keverékei vagy akár<br />
humán szérum is. A szérumra azért van szükség,<br />
mert a sejtek elsöprő többsége nem élne, nem osztódna<br />
pusztán szintetikus médiumot tartalmazó táptalajban.<br />
A szérumban többek között albumin, vastartalmú<br />
fehérjék (transzferrin), koleszterinforrás, inzulin<br />
és számos növekedési faktor található. A szérum pufferkapacitása<br />
segíti a pH-t fiziológiás tartományban<br />
tartani. Arányát általában 5-15%-ra (leggyakrabban<br />
10%-ra) állítják be. Ez elegendő ahhoz, hogy a sejtek<br />
megfelelő egyéb tápanyagok esetén exponenciális növekedésnek<br />
induljanak.<br />
Újabban megvásárolhatók ún. szérumkiegészítők<br />
is, amelyekben mesterségesen pótolják a felsorolt szérumalkotókat.<br />
Szérumkiegészítő választandó, ha egy<br />
speciális igényű sejtvonalat (pl. neuronalis eredetű<br />
sejtek) kívánunk tenyészteni. Számos különböző öszszetételű,<br />
előre gyártott szupplemens megvásárolható<br />
vagy egyedi igény esetén magunk is megpróbálkozhatunk<br />
megfelelő összeállításukkal, kiegészítésükkel.<br />
Számos esetben széruméheztetésre kerülhet sor,<br />
a médiumból kihagyjuk szérumot. Erre azért lehet<br />
szükség, mert az adott kísérletet annak jelenléte<br />
zavarja (szérumfehérjék megköthetnek bizonyos<br />
gyógyszereket, fluoreszcens festékeket, radioaktívan<br />
jelzett anyagokat). Mivel a szérum szükséges a sejtek<br />
növekedéséhez, a széruméheztetést a megfelelő sejtszám<br />
elérése után, maximálisan 24–48 óráig szokás<br />
alkalmazni. A sejtek osztódása ekkor leáll, hosszabb<br />
időtartamig fennálló széruméheztetés hatására pedig<br />
apoptózis is bekövetkezhet.<br />
Régebben gyakran alkalmaztak hőinaktiválást, mielőtt<br />
a szérumot sejttenyésztésre felhasználták volna.<br />
Ennek az az oka, hogy az 56 °C-os, 30 perces kezelés<br />
a szérum komplementfaktorait és más, pontosabban<br />
meg nem határozott sejtnövekedés-gátló faktorát<br />
is inaktiválja. Ez azonban idő- és eszközigényes,<br />
ráadásul a kezelés inaktiválhat a sejtek számára fontos<br />
faktorokat is. Amióta az FBS terjedt el az újszülött-marhasavó<br />
helyett, erre az eljárásra nemigen van<br />
szükség. Néhány differenciált sejtvonalnál azonban<br />
elképzelhető, hogy hőinaktivált szérumban jobban<br />
érzik magukat a sejtek. Ilyen esetekben továbbra is ez<br />
a választandó protokoll.<br />
Antibiotikumok<br />
A sejttenyészetek az élő szervezetből kiragadott<br />
monokultúrák, amelyek nem rendelkeznek immunitással,<br />
ezért a fertőzések, kontaminációk veszélye igen<br />
nagy. Ráadásul a használt médiumok kiváló táptalajt<br />
jelentenek a baktériumok számára is. A fertőzések<br />
elkerülése érdekében természetesen a sterilitási szabályok<br />
betartásán túl nagyon gyakran alkalmazunk<br />
a médiumokban antibiotikus védelmet. Az antibiotikumok<br />
kiválasztását és koncentrációját igyekszünk<br />
úgy beállítani, hogy effektív védelmet nyújtsanak, de<br />
ne gátolják a sejtek növekedését. A leggyakoribb alkalmazott<br />
kombináció a 100 U/mL penicillin és 100<br />
μg/mL streptomicin keveréke. Ez elegendő arra, hogy<br />
az óhatatlanul a médiumba kerülő, de kis csíraszámú<br />
baktériumokat megölje, masszív kontaminációt<br />
azonban nem képes kivédeni, hiszen nagyon gyorsan<br />
kialakul az antibiotikumrezisztencia.<br />
Komplett DMEM médium készítése<br />
Tájékoztatásul ismertetjük az egyik leggyakrabban
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
209<br />
használt médium, a DMEM elkészítését és komplettálását.<br />
• A por formában kapható (pl. Sigma©,<br />
Invitrogen©), 1 L médium készítésére elegendő<br />
médiumot (kb. 10g/L) ~900 mL desztillált vízben<br />
folyamatosan keverve feloldjuk.<br />
• A gyártó által javasolt mennyiségű NaHCO 3<br />
-ot<br />
(általában 2 g) kimérjük, és a médiumhoz<br />
adjuk. A keverés során igyekezzünk elkerülni a<br />
túlzott buborék/hab képződést.<br />
• Lehetőség szerint minél hamarabb beállítjuk a<br />
pH-t 7,3 (±0,05) értékre 1 N sósavval.<br />
• Az oldatot desztillált vízzel 1 L-re egészítjük ki.<br />
• Hozzáadunk 10% FBS-t (100 mL). Opcionális:<br />
kiönthetünk a médiumból 100 mL-t, mielőtt az<br />
FBS-t hozzátesszük, így valóban 10%-os lesz,<br />
valamint a kiöntött médiumot külön tárolva<br />
később felhasználható olyan esetekben, amikor<br />
a szérumtartalmú médium nem alkalmazható.<br />
• Hozzáadunk 10 mL, 100X antibiotikum- törzsoldatot<br />
(10 000 U/mL penicillin, 10 mg/mL<br />
streptomicin), így a végkoncentráció 100 U/mL<br />
penicillin és 100 μg/mL streptomicin lesz.<br />
• A komplett médiumot steril fülke alatt 0,22 μm<br />
pórusátmérőjű steril szűrővel, ugyancsak steril,<br />
autoklávozott üvegedénybe leszűrjük.<br />
• Amennyiben e lépések bármelyikét nem tudjuk<br />
rögtön elvégezni, érdemes a médiumot lezárni,<br />
lefedni, állás közben ugyanis a bikarbonát CO 2<br />
formájában idővel távozik a rendszerből, a<br />
pH-értékét megváltoztatva.<br />
• Az FBS-t általában 0,5 L-es kiszerelésben árulják;<br />
érdemes 50 mL-es részletekre osztani (steril<br />
edényben, csövekben), és fagyasztva tárolni. Az<br />
antibiotikum-törzsoldatból szintén érdemes<br />
legalább 100 mL-t készíteni, és 10 mL-es alikvotokban,<br />
fagyasztva tárolni.<br />
A tenyészetek kezelése<br />
Passzálás, szuszpenziós sejtek<br />
A tápanyagok fokozatos felhasználása miatt időről-időre<br />
szükséges a médiumot lecserélni a sejtekről.<br />
Ez végezhető az eredeti médium megtartásával vagy<br />
a médium teljes cseréjével. Az első esetben is törekedni<br />
kell arra, hogy az elhasznált médium aránya minél<br />
kisebb legyen, pl. 1 mL sejtszuszpenziót 9 mL friss<br />
médium oldatával hígítunk.<br />
Célszerűbb azonban a teljes médiumot lecserélni:<br />
ez esetben steril centrifugacsőbe, csövekbe töltjük a<br />
kívánt mennyiségű sejtet tartalmazó szuszpenziót,<br />
majd rövid, kis sebességű centrifugálás után (1200<br />
rpm, 2 perc) a felülúszót leöntjük (figyelve arra, hogy<br />
a nem túl erősen letapadt sejteket a cső aljáról ne keverjük<br />
fel), majd friss médiumban, néhányszori fel-le<br />
pipettázással felvesszük a sejteket.<br />
Amennyiben kitapadó sejtkultúrának csak a médiumát<br />
kívánjuk lecserélni, egyszerűen leöntjük a használt<br />
médiumot és újat pipettázunk a sejtekre. Fontos,<br />
hogy a pipettázással ne mossuk le a sejteket: irányítsuk<br />
a pipettát a flaska oldalfalára.<br />
Tripszin<br />
A kitapadó sejtkultúrák passzálásához szükség van a<br />
sejtek szuszpenzióba vitelére. Ehhez a mechanikus eltávolítás<br />
– a sejtek lekaparása valamilyen steril, nem túl<br />
éles végű eszközzel, pl. sejtkaparóval (cell scraper) [8]<br />
– is megfelelő lehet, ha nem célunk homogén, különálló<br />
sejtekből álló szuszpenzió készítése. Mivel azonban a<br />
sejtek erősen tapadhatnak egymáshoz, a mechanikus eltávolítás,<br />
majd az ezt követő kitartó pipettázás sem elegendő<br />
homogén sejtszuszpenzió létrehozására. Passzálásnál<br />
azért van erre szükség, mert a sejtek gyorsabban<br />
osztódnak, gyorsabban benövik a rendelkezésükre álló<br />
felületet, ha egyenletesen elosztjuk őket. Ellenkező esetben<br />
a nagyobb sejtcsoportok, csomók a kontakt inhibíció<br />
miatt eleve lassabban osztódnak, és egyenetlenebbül<br />
is oszlanak el a tenyésztőedény felületén.<br />
Tripszines emésztés során a tripszin a sejtek közötti<br />
fehérje-fehérje, ill. a sejt (membránfehérjék) és<br />
a tenyésztőedény felülete közötti kapcsolatokat roncsolja<br />
el.<br />
A tripszines oldat összetétele:<br />
• 0,25% (g/g) tripszin<br />
• 0,5 mM EDTA<br />
PBS-ben oldva.<br />
Az EDTA szerepe a Ca 2+ megvonása, ui. a Ca 2+ fontos<br />
kofaktor a sejtek kitapadásához. Sok esetben már<br />
az EDTA-s oldat is elegendő lehet a sejtek szuszpenzióba<br />
vitelére, PBS pedig biztosítja a fiziológiás ozmotikus<br />
koncentrációt és pH-t.<br />
A tripszines passzálás menete:<br />
• A médiumot tartalmazó üveget tegyük 37 ºC-os<br />
vízfürdőbe, vagy várjuk meg, amíg szobahőmérsékletűre<br />
melegszik.
210 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
• Az elhasznált médiumot leöntjük vagy leszívjuk<br />
a sejtekről.<br />
• 1-2 mL steril PBS-sel (vagy akár a tripszinoldattal)<br />
mossuk a sejteket, vigyázva arra, hogy a<br />
mosófolyadék pipettázásakor ne sodorjuk le a<br />
sejteket (célszerű a tenyésztőedény oldalfalára<br />
irányítani a pipettát).<br />
• A mosó leszívása után 0,5–1,5 mL (a tenyésztőedény<br />
felületétől függően) friss tripszinoldatot<br />
pipettázunk a sejtekre, és meggyőződünk arról,<br />
hogy a teljes felületet ellepi az oldat.<br />
• 37 ºC-os termosztátba helyezzük a tenyészetet<br />
2–15 percre (az időtartam függ a sejttípustól, ill.<br />
a tripszin minőségétől, az optimális időt egyénileg<br />
kell meghatározni).<br />
• Az inkubálás után a szuszpenzióba került sejteket<br />
(a flaska enyhe ütögetésével meggyorsíthatjuk<br />
a folyamatot) steril csőben lecentrifugáljuk<br />
(500 rpm, 5 perc, vagy mikrocentrifugában 10<br />
másodperc „pulse” üzemmódban), a felülúszót<br />
leöntjük, és a sejteket friss, komplett médiumba<br />
felvesszük.<br />
• Mivel a komplett médium tartalmaz szérumot,<br />
az pedig antitripszint, a tripszinezés után mosás<br />
nélkül is felvehetjük a sejteket, ügyelve arra,<br />
hogy a tripszin alaposan kihíguljon (legalább<br />
30–50-szeresre).<br />
• A szuszpenziót új, steril tenyésztőedénybe<br />
helyezzük, azt pedig a 37 °C-on termosztátba.<br />
Ügyeljünk arra, hogy flaskában a sejtszuszpenzió<br />
egyenletesen ülepedjen le (körkörös mozdulatok,<br />
a flaska szükségtelen rázását kerüljük).<br />
Fontos megjegyezni, hogy a tripszines emésztés valamilyen<br />
mértékben mindig károsítja a sejteket, ezért<br />
annak időtartamát érdemes a még szükséges minimumra<br />
csökkenteni.<br />
Sterilizálás, filtrálás<br />
Eszközök<br />
A sejttenyésztés elengedhetetlen feltétele a sterilitás<br />
megteremtése. Minden olyan eszköznek, oldatnak,<br />
edénynek, amely a sejtekkel kapcsolatba kerülhet,<br />
sterilnek kell lennie. Pipetták, műanyag tenyésztőedények,<br />
Petri-csészék, centrifugacsövek megvásárolhatók<br />
steril csomagolásban. Ezek az eszközök<br />
egyszer használatosak, ui. a gyártó g-besugárzással<br />
sterilizál, amire normális laboratóriumi körülmények<br />
között általában nincs mód, az autoklávozás hőfokát<br />
pedig nem mindegyik műanyag eszköz bírja.<br />
Az üvegeszközöket, ill. azon oldatokat, tápfolyadékokat,<br />
amelyek minősége hőkezelésre nem változik,<br />
autoklávozhatjuk: 120–130 °C, fél óra időtartamig<br />
elégséges sterilitást ad. Ügyeljünk arra, hogy az autoklávban<br />
legyen elegendő víz, ill. hogy az üvegedényeket<br />
lazán zárjuk csak, így a forró vízgőz a belső<br />
felületüket is fertőtleníti.<br />
Tápoldatok szűrése<br />
A tápfolyadékok többségét nem célszerű autoklávozni<br />
vagy egyéb hőhatásnak, kémiai hatásnak<br />
kitenni, ezért itt a választott sterilezési módszer a<br />
szűrés. Az oldatokat (természetesen előzetesen sterilizált<br />
vagy sterilen megvásárolt) filteren szűrjük át,<br />
túlnyomás vagy ellenkező oldali szívás (vákuum) segítségével<br />
[9]. A filter pórusátmérője legfeljebb 0,22<br />
μm lehet. A szintén kapható 0,4 μm pórusátmérőjű<br />
filterek csak előszűrésre alkalmasak, hiszen számos<br />
baktérium átmérője ennél kisebb. Meg kell azonban<br />
jegyezni, hogy a 0,22 μm pórusátmérőjű filter sem<br />
véd meg minden kórokozótól: a vírusokat nem szűri<br />
ki, ill. a sajnos nagyon gyakori mycoplasmát sem.<br />
„Laminár boksz”<br />
A sejttenyészetekkel való foglalkozás során különös<br />
gondot kell fordítani arra, hogy a kialakított steril<br />
körülményeket fenntartsuk. Az ún. laminár boksz<br />
olyan fülke, amely egyenletes, szűrt légáramlatot biztosít,<br />
így a fülke alatt dolgozva a nyitott edényekbe<br />
a levegőből bekerülő kontamináció esélyét csökkenti.<br />
A fülke lehet negatív vagy pozitív nyomású. A negatív<br />
nyomású a fülkét használó személyt védi elsősorban,<br />
veszélyes (pl. M. tuberculosis) anyagokkal való munka<br />
során (egyenletes légáramlás – „légfüggöny” mellett)<br />
a fülke alatti levegő a negatív nyomás miatt nem<br />
kerülhet ki közvetlenül a kinti térbe. Pozitív nyomás<br />
esetén az áramoltatott levegő egy része a nyitott fülke<br />
ajtaján kiszökik, viszont ez a pozitív nyomás a kinti<br />
levegő szálló részecskéit, a potenciális kontaminációt<br />
„kifújja”.<br />
A laminár boxok filterei (amelyek a lamináris<br />
áramlású levegőből kiszűrik a lebegő részecskéket)<br />
időszakosan cserére szorulnak. Ugyancsak ellenőrizni<br />
kell megfelelő műszer segítségével a bekapcsolt<br />
fülké belsejében a levegőben található részecskék számát.<br />
A legtöbb fülke rendelkezik beépített UV lám-
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
211<br />
pával. Bekapcsolásával ( ha a fülke zárt és a ventiláció<br />
ki van kapcsolva) a fülke belső felületét, terét lehet<br />
sterilizálni: 15 perc UV megvilágítás a munka megkezdése<br />
előtt és után elegendő.<br />
A fülke alatt végzett munka szabályai;<br />
• Minden edényt, tenyésztőflaskát, médiumot<br />
tartalmazó üveget, steril pipettahegyek dobozát<br />
csak addig nyitjuk ki, amíg dolgozunk vele,<br />
utána azonnal visszazárjuk.<br />
• Kesztyűt kell használni.<br />
• Nyitott edény felett nem nyúlunk át, mert a<br />
pipettahegyről vagy a kezünkről beszennyezhetjük<br />
a sejtkultúrát.<br />
• Az edények, flaskák kupakját fejjel lefelé tegyük<br />
le, így annak steril felülete nem ér a fülkéhez<br />
vagy más, a fülkében található tárgyhoz.<br />
• Bunsen-égő használata; bezárás előtt az edények<br />
száját, ill. a kupakokat rövid ideig (1-2 s) „leégethetjük”<br />
Bunsen-lángban – fontos, hogy Bunsenlángot<br />
csak bekapcsolt lamináris áramlás esetén<br />
használjunk, és soha ne hagyjuk felügyelet nélkül<br />
vagy a kelleténél tovább bekapcsolva!<br />
• A munka megkezdése előtt 15 percre kapcsoljuk<br />
be a fülke UV lámpáját. A munka végeztével<br />
alkoholos dezinficiálóval a munkalapot töröljük<br />
át, majd ismét kapcsoljuk be az UV-t szintén kb.<br />
15 percre.<br />
A tenyészet kontaminációja<br />
Felismerés<br />
A kontaminációt okozhatja baktérium, gomba, vírus,<br />
mycoplasma vagy akár egy másik eukarióta sejtvonal,<br />
sejttípus is.<br />
A bakteriális kontaminációt könnyű felismerni,<br />
mert a populáció növekedése jóval gyorsabb, mint<br />
a sejteké: kétóránként megduplázódhat a baktériumok<br />
száma. Ezt jelzi a médium gyors lesavanyodása<br />
(a médium pH-indikátora sárga színre vált), zavarossá<br />
válása. Sokszor az inkubátort kinyitva már jellegzetes<br />
szag fogadja a kutatót. Mikroszkóp alatt már<br />
közepes nagyítással is jól megfigyelhetők a nyüzsgő<br />
baktériumok. Antibiotikus védelem mellett a baktériumok<br />
szaporodása lassabb lehet, de amint kialakul<br />
az antibiotikumrezisztencia, felgyorsul a folyamat.<br />
Általában a tenyésztett sejtek elhalása is bekövetkezik<br />
a baktériumok hatására.<br />
Gombás kontamináció szerencsére jóval ritkább,<br />
kevésbé fulmináns, és mikroszkópban szintén könynyen<br />
felismerhető jellegzetes morfológiája alapján.<br />
A vírusfertőzések sajnos kevésbé feltűnőek, sokszor<br />
csak a sejtek látszólag indokolatlan pusztulása<br />
hívhatja fel a figyelmet rá. Hagyományos sterilezési<br />
eljárások elégtelenek a vírusok eliminálására, a vírusok<br />
a filtereken átjutnak, ill. maga a sejt hordozhatja<br />
a vírust intracellulárisan. Amennyiben nem ismert,<br />
megbízható forrásból származó sejtvonalat alkalmazunk,<br />
a saját biztonságunk érdekében is különösen<br />
ügyelnünk kell a sterilitás betartására. Primer, különösen<br />
humán eredetű sejtek tenyészetében hepatitis-,<br />
HIV-vírus is előfordulhat.<br />
A mycoplasma által okozott kontamináció sajnos<br />
nagyon elterjedt, és kivédése is nehéz, mivel intracelluláris<br />
kórokozó. A kereskedelmi forgalomban kapható<br />
szérumok is nagyon gyakran mycoplasmával<br />
fertőzöttek, ill. a garantáltan mycoplasmamentes szérumok<br />
sokkal drágábbak. A kontamináció megléte<br />
nehezen fedezhető fel, viszont kísérleti eredményünket<br />
megzavarhatja. Ilyen a mycoplasma hatása a peroxidáz/kataláz<br />
aktivitásra, ami szignifikánsan befolyásolhatja<br />
pl. egy H 2<br />
O 2<br />
-vel kiváltott oxidatív stressz<br />
kísérlet eredményeit. A mycoplasma felfedezésére<br />
számos kit áll rendelkezésre, in vivo festési technikák<br />
vagy PCR alapú detekciós eljárások egyaránt.<br />
Elsősorban primer kultúránál, de többféle, nem<br />
kellő körültekintésel kezelt, immortalizált sejtvonal<br />
tenyészetében is előfordulhat a sejttípusok keveredése.<br />
Csekély számú, akár egy-két rossz helyre került sejt<br />
is okozhat komoly problémát, hiszen már minimális<br />
előnnyel rendelkezve is néhány generációt követően<br />
túlsúlyba kerülhet, „túlnőheti” a másik sejtvonalat.<br />
Primer kultúránál leggyakoribb a fibroblastszennyezés;<br />
ez a médiumot illetően viszonylag igénytelen sejt,<br />
gyorsan osztódik.<br />
Kezelés, a sejtvonal megmentése<br />
A kontamináció elkerülésének alapja a precíz, steril<br />
munka, a fülke rendeltetésszerű használata, steril, egyszer<br />
használatos eszközök, antibiotikumok alkalmazása.<br />
Gyakori médiumcsere nem csak a sejtek tápanyagforrását<br />
hivatott szolgálni, de az óhatatlanul bejutó<br />
baktériumok megtelepedésének esélyét is csökkenti.<br />
A kontamináció felfedezése után az első dolog<br />
a még meg nem fertőzött kultúrák elkülönítése, és<br />
amennyiben lehetséges, a kontamináció forrásának
212 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
felkutatása. Ha rendelkezünk lefagyasztott, biztosan<br />
kontaminációmentes sejtekkel, a kontaminált kultúrát<br />
dobjuk ki, és olvasszuk fel a tárolt törzset.<br />
A médiumokat, törzsoldatokat, ha szemmel láthatóan<br />
kontamináltak, mindenképpen, de ha nem vagyunk<br />
biztosak benne, akkor is célszerű kiönteni és<br />
új, friss oldatokat készíteni (esetleg opció lehet a médium<br />
újbóli szűrése is). Az inkubátor dezinficiálása<br />
(és amennyiben szükséges, a filterek cseréje), a használt<br />
eszközök újbóli sterilezése, a nem steriliezhetők<br />
kidobása ugyancsak elvégzendő.<br />
Még korai fázisban és nem pótolható sejtek kontaminálódásakor<br />
megpróbálkozhatunk a kontaminációmentesítéssel.<br />
Először is a sejteket steril, biztosan<br />
kontaminációmentes médiumban kell mosni, majd -<br />
ha baktériumfertőzés történt - antibiotikus kezelést<br />
alkalmazni (ha eredetileg is alkalmaztunk antibiotikus<br />
védelmet, természetesen váltani kell más típusú,<br />
más hatásmechanizmusú antibiotikumra). Gyakori<br />
médiumcsere is hasznos lehet, esetleg több, külön kezelt<br />
kisebb csoportra osztva a sejteket növelhetjük a<br />
sikeres dekontamináció esélyét.<br />
Vírusfertőzésben nem sok lehetőségünk van,<br />
célszerű új, vírusmentes törzzsel újrakezdeni a tenyésztést,<br />
és a fertőzött sejteket kidobni. Mycoplasmafertőzés<br />
leküzdésére viszont ma már kaphatók<br />
meglehetősen hatásos kitek, amelyekkel a sejtvonal<br />
megszabadítható a mycoplasmától. Ugyanakkor sikeres<br />
mycoplasmamentesítést követően fontos a monitorozás,<br />
ill. a továbbiakban biztosan mycoplasmamentes<br />
médiumok alkalmazása.<br />
Másik sejttel, sejtvonallal történt keveredés után<br />
egyetlen választandó megoldás a fagyasztva tárolt,<br />
homogén sejtkultúra újraindítása. Ugyanakkor primer,<br />
nem osztódó sejtek esetén a fibroblastok növekedésének<br />
megakadályozására alkalmazhatunk mitózisgátló<br />
citozin-arabinozidot (Ara-C). Nem tünteti el<br />
a fibroblastokat, de megakadályozza, lassítja az osztódásukat,<br />
így a primer sejtek túlsúlya tovább megmarad.<br />
Szintén alkalmazható primer sejteknél, kisszámú<br />
sejt esetén sztereomikroszkóp alatt a morfológiai jegyek<br />
alapján elkülönítve a nem kívánt sejttípus mechanikus<br />
elpusztítása (pl. vékony steril tűvel).<br />
Fagyasztás, fagyasztásból való felolvasztás<br />
Mivel még az immortalizált sejtek sem tenyészthetők<br />
a végtelenségig, valamint a kontamináció veszélye<br />
miatt a sejtvonalakat több részre osztva, hosszú távon<br />
folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk. Egy új<br />
sejtvonalból izolálása vagy beszerzése, vásárlása után,<br />
minél hamarabb, néhány passzálás után célszerű lefagyasztani<br />
sejteket, 2-3 egymást követő passzálásból<br />
külön-külön.<br />
Fagyasztás során a lassú fokozatos fagyasztás, valamint<br />
ún. „cryopreservative” anyagok hozzáadásával[<br />
(dimetil-szulfoxid (DMSO), glicerin] gátoljuk meg a<br />
jégkristályok kialakulását és a sejtek struktúrájának<br />
sérülését.<br />
A fagyasztás menete:<br />
• Kb. 10 6 , log-fázisban lévő sejt, legalább 90% viabilitással.<br />
• Szuszpenzióba hozzuk a sejteket (kitapadó sejtek<br />
esetén tripszinezéssel, szuszpenziós kultúránál<br />
elegendő centrifugálás után friss médiumban<br />
felszuszpendálni).<br />
• Lecentrifugáljuk (1200 rpm, 2 perc), majd 1-2<br />
mL fagyasztó médiumban reszuszpendáljuk a<br />
sejteket (komplett tenyésztőmédium 5-10%<br />
DMSO-val kiegészítve; a fagyasztó médiumot a<br />
DMSO hozzáadása után szűrjük!).<br />
• 2 mL-es, steril, ún. „cryo-vial”-ba, fagyasztócsövekbe<br />
töltjük a sejtszuszpenziót (1mL/cső)<br />
[10].<br />
• –70 ºC hűtőbe helyezzük a csöveket, vagy még<br />
jobb, ha speciális fagyasztóval szabályozottan<br />
hűtjük le (controlled rate freezer [11]).<br />
• 24 óra múlva a csöveket áttesszük folyékony nitrogénes<br />
(-196 ºC) tartályba, ahol hosszú ideig<br />
tárolhatók [12].<br />
• Fontos a folyékony nitrogénes tároló nyilvántartásának<br />
naprakész vezetése, ami nagyban<br />
megkönnyíti az esetenként több száz, évekkel<br />
korábban lefagyasztott minta megtalálását.<br />
Sejtek kiolvasztása:<br />
• Készítsük elő a sejtek tenyésztéséhez szükséges<br />
médiumot és a tenyésztőflaskát.<br />
• Vegyük ki a nitrogénből a sejteket tartalmazó<br />
csövet.<br />
• Hagyjuk szobahőmérsékleten kiolvadni.<br />
• Centrifugálást követően mossuk egyszer komplett<br />
tenyésztőoldatban, majd pipettázzuk át a<br />
médiumot tartalmazó flaskába.<br />
• 24 óra múlva cseréljünk médiumot, így a lassab-
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
213<br />
ban ülepedő, ki nem tapadó, elhalt sejtektől,<br />
sejttörmeléktől megszabadulva az életképes sejtek<br />
túlsúlyba kerülnek.<br />
A tenyészet sejtjeinek osztódása,<br />
sejtszámváltozások<br />
Populáció, növekedés<br />
Médiumcsere nélkül a sejtek száma időben szigmoid<br />
görbe lefutását mutatja. Kezdetben exponenciális<br />
növekedés figyelhető meg (ezt megelőzi egy<br />
„lag”-fázis, amely a sejteknek ahhoz szükséges, hogy<br />
a tripszinnel való kezelés, az előző elhasznált, tápanyagban<br />
szegény, savas médium okozta stagnálás<br />
után ismét log-fázisba kerüljenek. A log-fázis végén a<br />
tápanyagok elfogyásával lassulás következik be, majd<br />
a sejtek osztódása teljesen leáll, sőt friss médium adásának<br />
elmulasztása esetén apoptózis és sejtszámcsökkenés<br />
következik be [13].<br />
A sejtek számára ideális körülmények között –<br />
log-fázisban - a következő sejteket figyelhetjük meg:<br />
• Élő, nyugalmi fázisban (G0) lévő sejtek (kitapadó<br />
sejtek esetén ellapult, széles citoplazmával,<br />
laza kromatinszerkezetű maggal rendelkező sejtek):<br />
>85–90%.<br />
• Osztódó sejtek (lekerekedett sejtek, keskeny<br />
citoplazma, „denz” kromatin): 1–10%.<br />
• Apoptotikus sejtek, elhalt sejtek, sejttörmelék<br />
(kisebb, kontrasztosabb részecskék, lebegnek<br />
vagy más sejtekhez tapadhatnak): < 5%.<br />
Ez az átlagos összetétel természetesen optimálistól eltérő<br />
körülmények között megváltozhat, ezért célszerű<br />
a sejtek fenntartása esetén naponta egyszer, a médium<br />
színe (pH) és a sejtsűrűség megítélése mellett<br />
mikroszkópban is ellenőrizni a sejtkultúrákat.<br />
Szinkronizáció<br />
Szinkronizálás alatt azt értjük, hogy minden sejt<br />
(de legalábbis a sejtek nagy többsége) a sejtciklus<br />
ugyanazon fázisába kerül (pl. G1, S, G2). Ennek elérésére<br />
széruméheztetést, timidint vagy egyéb kémiai<br />
ágenst alkalmaznak, amellyel a sejteket valamelyik<br />
fázisban megállítják, amíg az összes sejt ugyanazon<br />
fázishoz nem ér. A helyes módszer megválasztása<br />
sejtfüggő, és nem utolsó szempont a sejtek átlagos<br />
ciklusidejének ismerete.<br />
Az itt ismertetett protokoll szerinti szinkronizálás elvégzése<br />
a HeLa sejtekben a sejtciklus G1/S fázisban<br />
való szinkronizációját okozza, amely 1-2 sejtciklus<br />
idejéig fennmarad:<br />
• Növesszük a sejteket standard DMEM + 10%<br />
FBS médiumban kb. 40% konfluenciáig.<br />
• Adjunk a médiumhoz 2 mm végkoncentrációjú<br />
timidint (törzsoldat legyen kb. 20-szoros; 40<br />
mm oldva PBS-ben).<br />
• Inkubáljuk 37 ºC-on 19 óráig (fontos az idő<br />
betartása!).<br />
• Mossuk a sejteket 3-szor steril PBS-sel.<br />
• Adjunk friss (timidinmentes) médiumot, és<br />
újabb 9 óráig inkubáljuk a tenyészetet 37 ºC-on.<br />
• Ismét 2 mm timidint adjunk a médiumhoz és<br />
inkubáljuk 16 óráig 37 ºC-on.<br />
• A sejtek G1 fázisban vannak, új, timidinmentes<br />
médiumban szinkronizáltan fognak belépni a<br />
sejtciklus következő fázisába (S) [14].<br />
A sejtszám monitorozása<br />
Gyakorlattal rendelkező kutató a sejttenyésztő flaskán<br />
áttekintve az oldat fényszórásából vagy a felületre<br />
kitapadt, szabad szemmel is látható monolayerből is<br />
jó közelítéssel meg tudja mondani, mennyi sejt található<br />
a médiumban, vannak azonban ennél pontosabb<br />
és informatívabb mérési lehetőségek.<br />
Talán legegyszerűbb Bürker-kamra használata<br />
[15], ahol az osztott felületű tárgylemez és 0,1 μm távolságra<br />
lévő fedőlemez közé cseppentjük a sejtszuszpenziót,<br />
majd mikroszkópban leszámoljuk a sejteket.<br />
Elvégezhető festés nélkül is, de célszerű a sejtekhez<br />
1:10 arányban 2%-os tripánkék oldatot adni. Ez az<br />
ún. vitálfestés az élő sejteket nem, csak az elpusztult<br />
sejteket festi kékre, így a sejtek száma mellett azok<br />
viabilitását is megmérhetjük.<br />
A Bürker- kamránál pontosabb eredményt kaphatunk,<br />
ha sejtszámláló automatában is meg tudjuk<br />
mérni a sejteket. A rutin klinikai laboratóriumokban<br />
használt vérképes automaták ún. nyitott módban alkalmasak<br />
homogén sejtszuszpenziók mérésére, és<br />
szemben a Bürker- kamrában leszámolható néhány<br />
száz sejttel, az automata több ezer sejtet mér le pillanatok<br />
alatt. A fényszórási értékek ismeretében (forward<br />
scatter, side scatter) a sejtek méretéről, morfológiájáról<br />
is információt kaphatunk.<br />
Nagyszámú sejtet tartalmazó mintában a sejtek<br />
össztömege is informatív lehet, sőt teljes kiszárítás
214 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
előtt és után megmérve azt, a nedves és száraz súlyt is<br />
megkapjuk. Pontos tömegméréshez analitikai mérleg<br />
(0,1 mg-os érzékenység) és legalább 80-100 mg nedves<br />
súlyú sejt kell. Az utóbbi mennyiség már elegendő<br />
ahhoz, hogy elfogadható hibán belül tudjuk a sejtüledékről<br />
a felülúszót leszívni és a súlymérést nedves és<br />
száraz súly esetén is elvégezni.<br />
A sejtek alkotóinak, pl. a DNS vagy a fehérjék izolálás<br />
utáni mennyisége is egyenesen arányos a kiindulási<br />
sejtmennyiséggel. Habár a fehérjemennyiség<br />
meghatározása általában nem az elsőként választott<br />
módszer sejtnövekedés ellenőrzésére, nagyon gyakran<br />
alkalmazzuk viszonyítási alapnak egyéb sejtalkotók<br />
koncentrációjának mérésekor. Ionok, pl. a<br />
kalcium vagy a kis molekulák, metabolitok, pl. glükóz-6-foszfát<br />
koncentrációját sejtfehérjére vonatkoztatjuk<br />
(mmol/g protein vagy mg/g protein).<br />
A sejtciklus követése<br />
A mikroszkópos megfigyeléssel csak durva becsléssel<br />
állapíthatjuk meg az osztódó sejtek számát,<br />
azonban a sejtciklus egyéb fázisaiban lévő sejtek vizsgálatához<br />
festés szükséges. A propidium-jodid fluoreszcens<br />
festék, amely a kettős szálú DNS (vagy RNS)<br />
láncaiba interkalálódva fest. Az élő sejt membránján<br />
nem jut át a festék, viszont az elpusztult vagy fixált<br />
sejtekbe bejut, és a festődés mennyisége arányos lesz<br />
a sejtekben található DNS (RNS) mennyiségével. A<br />
megfestett sejteket legkönnyebben áramlási citométerrel<br />
(flow citométer) mérhetjük le, így minden<br />
(több ezer) sejt fluoreszenciáját és az azzal arányos<br />
DNS-mennyiségét külön-külön le tudjuk mérni.<br />
A propidium-jodid-festés menete:<br />
• Nagyjából 10 5 -10 6 , homogén, különálló sejtekből<br />
álló szuszpenziót készítünk, PBS-ben mossuk.<br />
• Lecentrifugáljuk (kb 8-10 s, pulzus üzemmódban),<br />
majd 50 µL kivételével a felülúszót leszívjuk.<br />
• A maradék 50 µL PBS-ben a sejteket alaposan<br />
felkeverjük, majd cseppenként 1 mL jéghideg<br />
(az eljárás elött fél órával -70 ºC-es hűtőben<br />
hűthetjük le), 96%-os alkoholt adunk a mintához.<br />
Minden csepp után vortexszel összekeverjük.<br />
Ez a felszálló sorozatú alkoholkezelés fixálja<br />
a sejteket, valamint kioldja a lipidkomponenseket,<br />
így átjárhatóvá válik a sejtmembrán a propidium-jodid<br />
számára.<br />
• A mintát 2-szer mossuk PBS-ben. Az etanolfixált<br />
sejtpellet könnyebben felkeveredik a felülúszó<br />
leszívásakor, így fokozott óvatosság szükséges<br />
e művelet elvégzésekor.<br />
• A sejteket 1 mL propidium-jodid-oldatban<br />
szuszpendáljuk fel (az oldat összetétele: PBS,<br />
0,1% Triton X-100, 20 μg/ml propidium-jodid,<br />
0,2 mg/ml RN-áz A). A Triton X-100 detergens,<br />
a festék sejtbe való bejutását segíti elő, az RN-áz<br />
A pedig a RNS molekulákat bontja le, így csak a<br />
kettős szálú DNS fog jelölődni. A propidium-jodid<br />
karcinogén, ezért megfelelő eővigyázatosság<br />
szükséges! Bőrre kerülve bő vízzel azonnal mossuk<br />
le!<br />
• 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten,<br />
sötétben,<br />
• A mintákat mosás nélkül, azonnal vizsgálhatjuk<br />
flow citométerrel, 610 nm hullámhosszú fluoreszcens<br />
detekcióval.<br />
10-1. ábra, a, b, c. Jurkat-sejtek propidium-jodid-festődése<br />
(1)
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
215<br />
Detektálás – A sejtkultúra állapotának<br />
ellenőrzése, az állapot változtatása<br />
10-2. ábra. Jurkat-sejtek propidium-jodid-festődése (1)<br />
A 10-1. a, b, c ábra és a 10-2. ábra Jurkat-sejtek propidium-jodid-festődését<br />
mutatja. A legnagyobb csúcs a<br />
G0, G1 fázisban lévő sejtek (M1), a második, kisebb<br />
csúcs a G2 fázisban lévő, dupla DNS-tartalmú, ezért<br />
nagyjából dupla mennyiségű propidium-jodiddal jelölődött<br />
sejtek számát adja meg (M3). A kettő közötti,<br />
átmeneti régió az S fázisú, DNS-replikációt folytató<br />
sejteket mutatja (M2). Ezeken a csoportokon kívül<br />
előfordulhat nagyobb mennyiségű jelölés (triploid,<br />
multiploid sejt, esetleg két vagy több sejt összetapadását<br />
a műszer 1 sejtnek érzékeli) vagy kisebb (apoptotikus<br />
vagy elhalt sejtek).<br />
Apoptózis kimutatása<br />
Az apoptózis fokának mérése egyrészt a sejttenyésztés<br />
optimális körülményeinek beállítására is<br />
kiválóan alkalmas, de még gyakrabban alkalmazzák<br />
konkrét kísérletekben a sejtek életképességének felmérésére.<br />
Az apoptózis több módon is detektálható,<br />
pl. a DNS-fragmentáció vagy a kaszpázaktivitás mérésével,<br />
továbbá a foszfatidil-szerin membrán transzlokációját<br />
kimutató Annexin-V-vel.<br />
Az utóbbi módszer esetén élő, fixálatlan sejteket<br />
rövid (15 perc) ideig propidium-jodid és fluoreszceinnel<br />
konjugált Annexin-V keverékével inkubáljuk.<br />
A propidium-jodid az elhalt sejteket festi, míg az<br />
Annexin-V minden olyan sejthez kötődik, amelyen<br />
bekövetkezett a foszfatidil-szerin membrán transzlokációja.<br />
A jelölés után flow citometriával detektálhatók<br />
a sejtek.<br />
Négy csoportot különíthetünk el:<br />
1. Élő, egészséges (kettős negatív) sejtek.<br />
2. Élő, apoptotikus (Annexin-V-pozitív, propidium-negatív)<br />
sejtek.<br />
3. Apoptózisban elhalt sejtek (kettős pozitív).<br />
4. Nekrotizált sejtek (propidium-pozitív) [16].<br />
Az immunhisztokémia, immunfluoreszcencia, Western<br />
blot, Southern blot, PCR módszer alanyai természetesen<br />
nagyon gyakran sejttenyésztésből származó<br />
sejtek, minták. Valamennyi kísérleti technikát, mérési<br />
módszert azonban lehetetlen itt részletesen tárgyalni.<br />
Ehelyütt a korábban már említetteken kívül azokat<br />
említjük meg, amelyek in vivo vizsgálják a sejteket,<br />
vagy magával a sejttenyésztés technikájával mint<br />
módszertannal összefüggésbe hozhatók.<br />
A médium összetételének változása<br />
A sejtkultúra állapotát nemcsak a sejtszám, a sejtosztódás<br />
mérésén keresztül deríthetjük ki. A médium<br />
rengeteg információt tartogat: a sejtek által elhasznált<br />
anyagok vagy a sejtek által termelt és médiumba kiválasztott<br />
anyagok vizsgálatának jelentős szerepe van.<br />
Ilyenek pl.:<br />
• glükóz, laktát, pH (a metabolizmus állapota,<br />
növekedés nyomon követése),<br />
• összetétel ellenőrzése (pH, ionok, aminosavak),<br />
• felhasznált anyagok (pl. radioaktív izotóp felvétele),<br />
• kiválasztott anyagok detektálása (laktát, export<br />
fehérjék).<br />
Különösen a sejtek által termelt fehérjék kerülnek<br />
gyakran a megfigyelés középpontjába. Ezek lehetnek<br />
– a teljesség igénye nélkül – hormonok, extracelluláris<br />
mátrixfehérjék, immunglobulinok, de a sejtelhalás<br />
termékei is: laktát-dehidrogenáz, kretin-kináz,<br />
troponin stb. Fontos megjegyezni, hogy ez esetben a<br />
szérumtartalmú médiumot szérummentesre kell cserélni,<br />
majd bizonyos idő elteltével mintát gyüjteni a<br />
fehérjék detektálásához. Túl rövid idő kis kiválasztott<br />
fehérjemennyiséggel, túl hosszú pedig a széruméheztetésből<br />
fakadó nem kívánt mellékhatásokkal jár;<br />
alapesetben 24 óra után célszerű a mintavétel.<br />
In vivo detektációs módszerek<br />
A mikroszkóp minden sejtekkel foglalkozó laboratórium<br />
elengedhetetlen kelléke. Szükséges egy invertált<br />
mikroszkóp, amelynek tárgyasztalán a tenyésztőflaska<br />
elfér, így bármikor ellenőrizhető a sejtek<br />
osztódása, kitapadása, morfológiája.<br />
Ha sejtünk fluoreszcens anyagot tartalmaz, pl.
216 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
Green fluorescent proteint (GFP-t) termel, vagy fluoreszcens<br />
festéket juttattunk a sejtekbe (pl. Fluo3 festéket,<br />
amely a Ca 2+ -hoz kötődve zölden fluoreszkál)<br />
szükség lehet fluoreszcens mikroszkópra.<br />
Fluoreszcens spektrofotometria alkalmazható; szintén<br />
élő sejteket vizsgálnak, általában sejtszuszpenzióban,<br />
de speciálisan kialakított küvettában fedőlemezre<br />
kitapadt sejteket is elhelyezhetünk. Az előbb<br />
említett Ca 2+ -festéket tartalmazó sejteket fotométerben<br />
pontosabban és nagyobb számban mérhetjük<br />
meg, mint mikroszópban.<br />
Transzfekció<br />
Transzfekciónak nevezzük azt a módszert, amikor<br />
kívülről juttatunk a sejtbe nukleinsavat. Amennyiben<br />
ezt vírussal tesszük, szokás transzdukcióról beszélni.<br />
A transzfekció, transzdukció (amennyiben szándékos)<br />
célja, hogy a sejtek fehérjeexpressziós profilját<br />
megváltoztassa (akár új fehérjék termelődnek, akár<br />
meglévők szintje nő vagy csökken), ezáltal a fenotípus<br />
megváltozzék.<br />
Mivel ezek a nukleinsavak meglehetősen nagy molekulák,<br />
a sejtmembránon való átjutást elősegíti ún.<br />
transzfekciós ágensek alkalmazása (lényegét tekintve<br />
kationos lipid, liposzómát alkotva beolvad a sejtmembránba,<br />
tartalmát a sejt belsejébe ürítve), vagy<br />
elektroporáció felhasználása, amikor elektromos tér<br />
hatásra ideiglenes pórusok, lyukak keletkeznek a<br />
membránban. Vírus általi transzdukció is szóba jöhet,<br />
amelynek előfeltétele, hogy a vírus genomjának tartalmaznia<br />
kell az adott fehérjét kódoló szekvenciát.<br />
A bejuttatni kívánt nukleinsavat leggyakrabban<br />
expressziós vektorban (módosított plazmid) kódolják.<br />
Sikeres transzfekció után a sejt termelni fogja<br />
azt a fehérjét, amelyet a vektor kódolt. Egy GFP-t<br />
kódoló szekvenciát beillesztve a vektorba (akár úgy,<br />
hogy transzlációkor az expresszálni kívánt fehérjével<br />
ún. kimérát, közös fehérjét alkosson a GFP, akár<br />
két különálló fehérjetermékként) monitorozhatjuk a<br />
transzfekció sikerességét.<br />
A transzfekció lehet átmeneti vagy állandó. Az<br />
utóbbi esetben a transzfektált szekvencia beépül a sejt<br />
saját genomjába. Általában elegendő az ideiglenes<br />
transzfekció, de ha stabil transzfekció a célunk, szükséges<br />
egy szelekciós marker beépítése is. Ilyen pl. egy<br />
toxikus anyag rezisztenciagénje. A geneticin (G418)<br />
a legtöbb sejtre toxikus hatással van, de ha transzfektáljuk<br />
a sejteket a rezisztenciagénnel (egy közös vektorban<br />
más génnel együtt), akkor csak azok a sejtek<br />
maradnak életben és szaporodnak, amelyek genetikai<br />
állományában a vektor (és benne a rezisztenciagén)<br />
stabilan megtalálható.<br />
A géncsendesítés (RNA silence) fiatal módszer, de<br />
gyorsan népszerű lett sokoldalú felhasználhatósága<br />
miatt. Egy rövid (20–25 nukleotid hosszúságú), ún.<br />
siRNS-t (short interfering RNA) juttatnak a sejtekbe,<br />
amelyek egy adott, komplementer szekvenciájú gén<br />
expresszióját csökkentik azáltal, hogy a messenger<br />
RNS-hez kötődve annak lebomlását, degradációját<br />
okozzák. Az siRNS-ekkel a sejtek természetes mechanizmusát<br />
használjuk ki: normális sejt is használ<br />
siRNS-t és mikroRNS-t, egyrészt a virális, parazitás<br />
fertőzés elleni védekezőmechanizmusban, másrészt<br />
az siRNS-ek a fehérjeexpresszió fontos szabályozó<br />
elemei [17].<br />
Állatkísérleti modellek<br />
Előzmények<br />
Természeténél fogva állatkísérlet végzése sokkal<br />
régebbre tehető, mint a sejtes modellek. Már az<br />
ókori görögöktől (Arisztotelész) és rómaiaktól<br />
is maradtak feljegyzések állatkísérletek végzéséről.<br />
Galenus a második században, mivel a római birodalomban<br />
az emberi boncolás tilos volt, majmokon<br />
és sertéseken elvégzett vizsgálatokból kiindulva és<br />
azokat az emberi szervezetre is érvényesnek tartva<br />
alapozta meg az anatómia, a patológia, a fiziológia, a<br />
neurológia tudományát. Felfedezte, hogy az erek két<br />
csoportba oszthatók: artériákra és vénákra, ugyanakkor<br />
úgy gondolta, hogy ezek két különálló rendszert<br />
alkotnak, a vénás vér a májban, az artériás a<br />
szívben termelődik. Galenus keringési rendszerről<br />
alkotott tanai egészen 1628-ig kitartottak, amikor is<br />
William Harvey bebizonyította, hogy a szív pumpaként<br />
keringteti a vért.<br />
A XII. században az arab világban Avenzoar emberi<br />
boncoláson kívül állatkísérleteket is alkalmazott<br />
a sebészeti beavatkozásai tesztelésére, mielőtt embereken<br />
végrehajtotta volna azokat. A középkorban és<br />
azt követően is gyakori kísérleti alanyok voltak az<br />
állatok, a „<strong>modern</strong>” tudomány pedig, habár számos<br />
kritika érte és éri állatvédelmi szempontból, egyelőre<br />
nem talált tökéletes helyettesítést, és továbbra is kénytelen<br />
állatokat feláldozni a kísérletek oltárán.
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
217<br />
Bevezetés<br />
Állatkísérletekre általában akkor kerül sor, ha az<br />
egyszerűbb modellek, mint pl. a sejtkultúrákon végzett<br />
kísérletek sikeres, új felfedezéseket hoztak, vagy<br />
igazoltak egy elméletet, és a kutatók szeretnék magasabb<br />
szerveződési szinten is megvizsgálni az adott<br />
problémát. Hasonlóan állatkísérleteket végeznek, ha<br />
a felvetett tudományos cél eleve nem vizsgálható sejteken,<br />
mert szöveti, szervi vagy szervrendszeri folyamatokat<br />
kívánnak vizsgálni. Ehelyütt nincs mód arra,<br />
hogy a számtalan kísérleti módszert ismertessük,<br />
ezért a továbbiakban néhány általános szempontot<br />
emelünk ki az állatokkal való tudományos munkával<br />
kapcsolatban.<br />
Mintavétel<br />
Az állatkísérletek több csoportba oszthatók:<br />
• Mintavétel nincs, az állatot „egészben” vizsgáljuk.<br />
Megfigyelhető a viselkedése, a tünetei, megismerhető<br />
afiziológiája, utódai, megvizsgálhatók<br />
képalkotó eljárással, boncolással belső szervi<br />
elváltozásai stb.<br />
• Az állat „csak” a minta forrása, pl. bizonyos sejteket<br />
izolálunk vagy bizonyos szöveteket, szerveket<br />
(pl. izolált szívperfúziós kísérletek), amelyeken<br />
azután magát a kísérletet elvégezzük.<br />
• A különböző kezelésen átesett (pl. gyógyszerkipróbálás,<br />
sebészeti beavatkozás stb.) állatokat<br />
feláldozzuk, majd mintákat gyűjtünk különböző<br />
szövetekből kísérletünk sikerességének tesztelésére.<br />
A két utóbbi esetben a minta izolálása és feldolgozása<br />
között eltelt idő és a minta tárolásának módja döntő<br />
fontosságú. Az élő szervezetből eltávolított szövetek<br />
megfelelő védelem nélkül gyorsan bomlásnak indulnak,<br />
ezért az elsődleges (természetesen az etikai előírások<br />
betartása mellett) a kísérlet megtervezésekor<br />
a minta minél gyorsabb feldolgozása. Izolálás után<br />
azonnal megfelelő hőmérsékletű és összetételű tápfolyadékban<br />
tartva megnövelhető a szövetek, sejtek<br />
élettartama. Folyékony nitrogénben való lefagyasztás<br />
és tárolás célszerű, ha a mintavétel helyén nem lehetséges<br />
az azonnali feldolgozás. Ha a mintából fehérjéket<br />
szeretnénk izolálni, proteázinhibitort adjunk<br />
a mintához, RNS izolálásához (amely, szemben a<br />
DNS-sel, különösen labilis) kaphatók RNS-stabilizáló<br />
oldatok szövetek számára (pl. Qiagen – RNAlater).<br />
Vérvétel esetén, akárcsak a humán diagnosztikában,<br />
elengedhetetlen megfelelő alvadásgátló kiválasztása<br />
és mintagyűjtés után centrifugálás az alakos elemek<br />
elválasztására.<br />
A standardizálás elvei<br />
Éppen az állati szervezetek bonyolultsága okán az<br />
állatkísérleteket sokkal nehezebben lehet kivitelezni<br />
standard körülmények között – nehezebben standardizálhatók,<br />
hiszen a biológiai variabilitás sokrétűbb<br />
(a sejtkultúrákhoz viszonyítva).<br />
Néhány szempont, amely segítheti a standard körülmények<br />
kialakítását:<br />
• Állandó páratartalom, hőmérséklet, nappal-éjszaka<br />
ciklus (12–12 óra).<br />
• Ugyanazon időszakokban adagolt, ismert menynyiségű<br />
táplálék és ivóvíz – az állatok által elfogyasztott<br />
mennyiség feljegyzése, súlygyarapodásuk<br />
regisztrálása.<br />
• Csak hím vagy csak nőstény állat alkalmazása.<br />
• Egyazon korú és hasonló súlyú állatok (a kísérleti<br />
állatok életkora döntő faktor lehet bizonyos<br />
kísérletek megtervezésekor).<br />
• Idegrendszeri, viselkedésbiológiai vagy a tanulást,<br />
a memória állapotát felmérő vizsgálatok<br />
során, de sokszor egyéb esetben is (pl. hormonok,<br />
adrenalin vagy akár vércukorszint mérésekor)<br />
az állatot ért ingerek, az egymással való<br />
összezárás megléte vagy hiánya is fontos szempont<br />
lehet.<br />
A felsorolt követelmények maximális betartása mellett<br />
is nagy valószínűséggel nagyobb lesz a kísérleti<br />
eredmények szórása, mint sejtkultúrákat vizsgálva.<br />
Kísérleti állatfajok<br />
A megfelelő állatfaj kiválasztása számos tényező<br />
eredője:<br />
• A kísérlet célja (pl. humán vonatkozás, gyógyszerkipróbálás<br />
esetén az emberrel minél közelebbi<br />
rokonságban lévő fajt érdemes választani).<br />
• A szükséges esetszám (nagy esetszámhoz szapora,<br />
gyorsan tenyészthető állat használata indokolt).<br />
• A rendelkezésre álló „facility”-állatház felszereltsége.<br />
• Az adott fajra jellemző szekvencia-adatbázis<br />
elérhetősége (manapság már szinte az összes,<br />
gyakran használt állatfaj genomja elérhető).
218 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
• Specifikus, adott fajra jellemző tulajdonságok<br />
vizsgálata.<br />
• Költségek: „cost–benefit”.<br />
A leggyakrabban használt fajok a következők:<br />
Emlősök: egér, patkány, macska, kutya, sertés, majom.<br />
Rovar: Drosophila melanogaster (ecetmuslica –<br />
klasszikus, de máig használt alanya a genetikának,<br />
egyedfejlődése mindössze 7 napig tart).<br />
Halak: zebrahal (zebradánio – gerincfejlődés, genetika).<br />
Újabban elérhetővé váltak genetikailag módosított<br />
vagy ritka mutációval rendelkező állatok is. Néhány<br />
példa:<br />
• ún. knockout egerek, amelyek valamely génje<br />
mesterségesen el lett némítva;<br />
• ZDF (Zucker Diabetic Fatty) patkányok [18]<br />
2-es típusú diabetes betegséggel rendelkeznek;<br />
• a GFP állatok [19] genetikai állományát úgy<br />
módosították, hogy a GFP fluoreszcens fehérjét<br />
termeljék a sejtjeik.<br />
Az állatkísérleti modellek előnyei<br />
• Összetettebb rendszer, emberi fiziológiára,<br />
humán kutatásokra könnyebben adaptálhatók.<br />
• Több szervet, szövetet lehet egyszerre vizsgálni.<br />
• Primer sejteket lehet izolálni különböző szövetekből.<br />
• Műtéti eljárások kidolgozása és nyomon követése.<br />
• Több szerv, szövet kölcsönhatásáak vizsgálata.<br />
• Daganatok terjedésének vizsgálata.<br />
• A keringési rendszer vizsgálata (szívizom teljesítménye,<br />
érrendszer állapota bizonyos hatásokra).<br />
• Magasabb idegi funkciók vizsgálata (tanulás,<br />
memória, viselkedés, magatartás).<br />
Az állatkísérleti modellek hátrányai<br />
• Etikai engedély köteles.<br />
• Összetett rendszer, sokkal körülményesebb<br />
standardizálni a sejtvizsgálatoknál. Nagyobb a<br />
szórás, ebből következőleg nagyobb esetszám<br />
szükséges.<br />
• „animal facility” állatház fenntartása szükséges.<br />
• Költségesebb.<br />
• Kísérlet időtartama általában hosszabb.<br />
• A kísérleti szerek, gyógyszerek hatásos dózisa<br />
nehezen számítható ki. A készítményekből jóval<br />
nagyobb mennyiség szükséges, ami megdrágítja<br />
a kísérletet. Sokszor nem adható be a kísérlet<br />
szempontjából szükséges dózis, mert az állat<br />
elpusztulna, holott az általunk vizsgálni kívánt<br />
szerv, szövet még elviselné az adott dózist.<br />
Etikai megfontolások<br />
Míg a sejtkultúrákhoz meglévő sejtvonal esetén<br />
etikai engedély általában nem szükséges (kivéve az<br />
őssejtkutatásokat), addig az állatkísérletek engedélykötelesek.<br />
Az ismertetendő magyarországi törvényi<br />
szabályozás előírja a következőket [20]:<br />
• Az állatkísérleteknek indokoltnak, tudományosan<br />
megalapozottnak kell lennie. Bizonyítani<br />
kell, hogy más módon az adott kísérlet nem<br />
végezhető el (pl. alapvető sejtélettani funkciók<br />
vizsgálatához elegendő sejtkultúra, de a keringési<br />
rendszer vizsgálata csak magasabb rendű,<br />
élő szervezet segítségével lehetséges).<br />
• Biztosítani kell, hogy a legkevesebb, még elégséges<br />
számú állatot, a lehető legkíméletesebb<br />
módon használunk fel a tudományos kísérlet<br />
során.<br />
• Alapos dokumentáció szükséges minden egyes<br />
állatról.<br />
• Az engedélyért való kérelmet a Munkahelyi<br />
Állatkísérleti Bizottsághoz (MÁB) kell benyújtani.<br />
Idézet a 1998. évi XXVIII., Az állatok védelméről<br />
és kíméletéről szóló törvényből:<br />
25. § (1)<br />
(2) Állatkísérlet kizárólag nyilvántartásba vett<br />
intézményben és engedély alapján végezhető.<br />
(4) Állatkísérlet kizárólag akkor engedélyezhető,<br />
ha annak elvégzését<br />
a) az ember, a gerinctelen és gerinces állatok<br />
vagy növények betegségének, kóros egészségi<br />
állapotának, egyéb rendellenességének elkerülése,<br />
megelőzése, felismerése és gyógyítása,<br />
valamint azok élettani állapotának feltárása,<br />
felderítése, szabályozása vagy módosítása érde-
Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban<br />
219<br />
kében gyógyszerek, élelmiszerek, egyéb adalékanyagok<br />
vagy termékek fejlesztése, termelése,<br />
minősítése, hatékonyságának és ártalmatlanságának<br />
vizsgálata,<br />
b) az emberek vagy állatok egészsége vagy<br />
jólléte érdekében a természetes környezet védelme,<br />
c) tudományos kutatás,<br />
d) oktatási és gyakorlati képzés, vagy<br />
e) igazságügyi orvostani vizsgálatok elvégzése<br />
teszi szükségessé.<br />
(5) Az engedélyezés során – a kérelmező által<br />
benyújtott dokumentáció, továbbá az állategészségügyért<br />
felelős miniszter (a továbbiakban: miniszter)<br />
által felkért szakértői testület véleménye<br />
alapján – különösen figyelembe kell venni:<br />
a) az állatkísérlet elvégzésének indokoltságát<br />
és tudományos megalapozottságát.<br />
27. § (1) Az állatkísérlet során felhasznált állatok<br />
számát a feltétlenül szükséges mértékre kell csökkenteni.<br />
Azt a vizsgálati módszert kell választani,<br />
amely előreláthatóan a legkisebb fájdalom okozásával,<br />
illetőleg legkisebb élettani, idegi vagy viselkedésbeli<br />
károsodás mellett végezhető el.<br />
(2) Az állatkísérletről és az állatot ért beavatkozásról<br />
részletes jegyzőkönyvet kell felvenni.<br />
(3) Minden kísérletet úgy kell megtervezni,<br />
hogy elkerülhető legyen a szükségtelen fájdalom,<br />
szenvedés, tartós nélkülözés, ill. maradandó károsodás<br />
okozása.<br />
6. § (1) Állatkísérlet csak az illetékes állomás által<br />
kiadott engedély alapján végezhető. A Munkahelyi<br />
Állatkísérleti Bizottság (a továbbiakban:<br />
MÁB) által jóváhagyott állatkísérlet engedélyezése<br />
iránti kérelmet a 2. számú melléklet szerint<br />
kell benyújtani az állomáshoz. Az állatkísérlet<br />
engedélyezése iránti kérelem elbírálása során az<br />
állomás az Állatvédelmi Tanácsadó Testület Állatkísérleti<br />
Tudományos Etikai Tanácsának (a továbbiakban:<br />
Etikai Tanács) véleményét kikéri. Az<br />
engedély – a rendeletben meghatározott kivételekkel<br />
– a kiadásától számított legfeljebb öt évig<br />
érvényes.<br />
Irodalom<br />
[1] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/d7/Henrietta_Lacks_%281920-1951%29.jpg<br />
[2] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/<br />
4c/HeLa_Hoechst_33258.jpg<br />
[3] Takahashi, K., Yamanaka, S.: Induction of pluripotent<br />
stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast<br />
cultures by defined factors. Cell 126(4):663–676,<br />
2006.<br />
[4] http://www.medica.co.nz/media/catalog/product/cache/<br />
2/image/265x265/5e06319eda06f020e43594a9 c230972<br />
d/f/i/file_55_26<br />
[5] www.atcc.org<br />
[6] http://www.enasco.com/prod/images/products/50/<br />
AC104062l.jpg<br />
[7] http://i00.i.aliimg.com/img/pb/383/602/312/3126023-<br />
83_941.jpg<br />
[8] http://www.hellopro.fr/images/produit-2/0/2/3/grattoir-cell-scraper-longueur-manche-180-mm-430320.jpg<br />
[9] http://www.millipore.com/images/xl/MB4163-06[681-<br />
ALL].jpg<br />
[10] http://www.usascientific.com/productimages/14209-<br />
100_300.jpg<br />
[11] http://www.cellcryogenics.com/<br />
[12] http://www.ccos.ch/userfiles/CMS/189187_lagerung_<br />
staemme_in_fluessigem_stickstoff_jpg.jpg<br />
[13] http://image.wistatutor.com/content/plant-growthmovements/growth-curve.jpeg<br />
[14] http://mousely.com/wiki_image/c/c4/Cell_cycle.png<br />
[15] http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/imagecache/preview/image005.jpg<br />
[16] http://www.biotech.uiuc.edu/images/Annexin_IMG-<br />
%202.jpg<br />
[17] http://www.retrogen.com/images/siRNA_diagram1.<br />
jpg<br />
[18] http://www.criver.com/SiteCollectionImages/Images_255x164/rm_rat_obese_black_hood1_0027_lres.<br />
jpg<br />
[19] http://www.biolreprod.org/content/78/3/425/F3.large.jpg<br />
[20] 1998. évi XXVIII. Törvény az állatok védelméről és<br />
kíméletéről<br />
[21] Paul, J.: Cell and tissue culture. 3 rd Ed. E. & S. Livingstone<br />
Ltd., Edinburgh-London, 1965.<br />
[22] Parker, R. C.: Methods of Tissue Culture. 3 rd Ed., P.<br />
Hoeber, New York, 1961.<br />
[23] http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_culture<br />
[24] http://userpages.umbc.edu/~jwolf/method5.htm
11. A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek<br />
alkalmazása a klinikai patológiában –<br />
Az új módszertanok klinikai hasznosulása<br />
az orvosi kutatólaboratóriumban<br />
A vérszérum és a vérplazma<br />
fehérjevizsgálatai<br />
Tőkés-Füzesi Margit<br />
Az érpályában keringő vér mennyisége felnőttekben<br />
4-5 liter, amely alakos elemeket és plazmát tartalmaz.<br />
Vérvétel után in vitro körülmények között ezeket<br />
centrifugálással választják el. Amennyiben vérvételkor<br />
alvadásgátlót használunk (heparin, kalciumkötő<br />
kelátképzők, EDTA, citrát), a centrifugálás után kapott<br />
vér felülúszója a plazma. A natív, alvadásában<br />
nem gátolt teljes vér felülúszója pedig a szérum.<br />
A plazmában ez idáig több mint 360 fehérjét azonosítottak.<br />
Nagy részük a májban termelődik, kivéve<br />
az immunglobulinokat, amelyeket plazmasejtek<br />
termelnek. Aminosavakból épülnek fel, poszttranszlációs<br />
módosuláson esnek át, ennek eredményeként<br />
legtöbbször kovalens kötéssel szénhidrátmolekula<br />
kapcsolódik hozzájuk (glikozilált fehérjék). Biológiai<br />
szerepük szerint két csoportba oszthatók:<br />
• Vannak olyan fehérjék, amelyek szerepüket extracellulárisan<br />
töltik be. Ezek mennyisége szervvagy<br />
szövetkárosodáskor csökken.<br />
• A fehérjék másik csoportja sejtalkotó, ezek<br />
mennyisége viszont szerv- vagy szövetkárosodás<br />
esetén általában nő.<br />
A plazmafehérjék általános áttekintése<br />
A plazmafehérjék fő funkciói<br />
1. A plazma kolloidonkotikus nyomásának fenntartása,<br />
ebben a fő szerep az albuminé.<br />
2. Transzportáló szerep, szállítófehérjék révén; a szállítandó<br />
anyagok:<br />
• metabolitok (pl. lipidek);<br />
• hormonok (pl. tiroxin);<br />
• fémionok (pl. kalcium, vas, réz);<br />
• bilirubin,<br />
• gyógyszerek, toxikus molekulák.<br />
3. Részvétel a szervezet védekezésében (immunglobulinok,<br />
komplementrendszer).<br />
4. A véralvadás és a fibrinolízis fehérjéi.<br />
5. Pufferszerep, részvétel a pH-szabályozásban.<br />
6. A plazmában sajátosan betöltött szerep pl. proteázgátlók,<br />
enzimek, növekedési faktorok stb.<br />
A plazmafehérjék vizsgálati lehetőségei:<br />
1. Mennyiségi meghatározás:<br />
• Biuretmódszer (peptidkötés reakciója rézionokkal).<br />
• Festékkötés (pl. az albumin reakciója brómkrezolzöld<br />
festékkel).<br />
• Homogén immunoassay:<br />
- nefelometria;<br />
- turbidimetria;<br />
- particle enhanced immunoassay.<br />
2. A plazmafehérjék elektroforetikus elválasztása után,<br />
különböző detektálási lehetőségekkel:<br />
• Mancini-technika.<br />
• Rocket-elektroforézis.<br />
• Immunelektroforézis.<br />
• Immunfixáció.<br />
• Lipoprotein elektroforézis.<br />
• Izoenzim vizsgálat.<br />
3. Funkció szerint: pl. enzimek fotometriás meghatározása.
222 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Plazmafehérje-csoportok és vizsgálatuk<br />
Összfehérje<br />
A szérumban található összfehérje (total protein, TP)<br />
mennyiségének meghatározására általánosan a biuret<br />
módszert használjuk. A réz(II)ionok alkalikus<br />
közegben kötődnek a peptidkötésekhez, ennek eredményeként<br />
fotometriásan jól mérhető ibolyaszínű<br />
fémkomplex vegyület keletkezik. A szín intenzitáserőssége,<br />
ill. az 540 nm-en mért fényabszorbancia<br />
egyenes arányban van a peptidkötések számával, így<br />
a fehérjekoncentrációval. A fehérjékben található<br />
aminosavak közül az aromás aminosavak UV fényben<br />
280 nm-en nyelnek el, míg a peptidkötések 220<br />
nm-en. Elméletileg ez is alkalmas a plazmában/szérumban<br />
található összfehérje mennyiségi meghatározására,<br />
azonban az albuminhoz kötött bilirubin zavarja<br />
a mérést, ezért a mindennapi gyakorlatban nem<br />
használják a módszert.<br />
A plazmában normál körülmények között 60-80<br />
g/l összfehérje található. Kóros körülmények között<br />
szintje emelkedhet vagy csökkenhet.<br />
Emelkedik az összfehérje a következő állapotokban:<br />
• Dehidráció folyamán (ilyen esetekben nő a<br />
hematokrit, a nátriumion- és az albuminszint<br />
is).<br />
• Emelkedett immunglobulin-szintézis (mono-,<br />
poliklonális eredet).<br />
Csökken az összfehérjeszint a következő állapotokban:<br />
• Zavart fehérjeszintézis (pl. malnutritio, krónikus<br />
májbetegség, malabsorptio).<br />
• Fokozott fehérjevesztés (történhet a vesén, a<br />
gyomor-bél traktuson, ill. a bőrön keresztül).<br />
• Fokozott hidráció (ez iatrogén körülmények<br />
között fordulhat elő).<br />
Albumin<br />
Az albumin meghatározására a szérumban alkalmazható<br />
a bróm-krezol-zöldet (BCG) használó festékkötéses<br />
módszer, valamint az immunológiai módszert<br />
alkalmazó turbidimetria és nefelometria. Mennyiségét<br />
tekintve a legjelentősebb plazmafehérje, szintje<br />
35-50 g/l. Az albumin 66 kDa molekulatömegű, a<br />
májban termelődő egyetlen olyan fehérje, amely nem<br />
glikozilált. Féléletideje 20 nap. A legfontosabb kötőés<br />
szállítófehérje (metabolitok, kalciumion, bilirubin,<br />
zsírsavak, foszfolipidek, aminosavak, hormonok és<br />
gyógyszerek). A kolloidonkotikus nyomás fenntartásában<br />
a legjelentősebb, ezen kívül aminosav-,,raktárt”<br />
képez a perifériás szövetek fehérjeszintéziséhez,<br />
és antioxidáns szerepe is van.<br />
Hypoalbuminaemia, azaz alacsony albuminszint<br />
alakul ki a plazmában a következő állapotokban<br />
• Csökkent szintézis (akut és krónikus májbetegségekben).<br />
• Analbuminaemia; ritka autoszomális receszíven<br />
öröklődő megbetegedés, ahol az albuminkoncentráció<br />
maximum 10%-a a normálisnak.<br />
• Megoszlási zavar: oka a fokozott kapillárispermeabilitás,<br />
amelynek eredményeként a fehérjék<br />
az extravasalis térbe jutnak (pl. égés, ascites).<br />
• Fokozott katabolizmus (pl. trauma, sebészeti<br />
beavatkozás, infekció, malignus betegség).<br />
• Fokozott vesztés során, amely történhet:<br />
- a vesén keresztül (pl. nephrosis-szindróma);<br />
- a gyomor-bél traktuson át (pl. Crohn-betegség,<br />
ulcerativ colitis);<br />
- bőrön át (pl. égés után).<br />
A plazmafehérjék elektroforézise<br />
A szérumfehérjék elektroforetikus elválasztása során<br />
a fehérjék elektromos térben töltésük és méretük<br />
alapján válnak szét. A szérumban található fehérjék<br />
izoelektromos pontja (pK) 2,4-6,4 között van, ami<br />
azt jelenti, hogy elválasztásukhoz használhatnánk 2,4<br />
pH-nál alacsonyabb savas puffert, azonban ebben a<br />
közegben a fehérjék kicsapódnának. Ezért a módszerhez<br />
lúgos pH-jú puffert alkalmazunk, amelyben a fehérjék<br />
negatív töltést mutatnak, így elektromos térben<br />
a katódtól az anód felé vándorolnak. A hordozó szilárd<br />
fázis lehet papír, cellulóz-acetát-membrán, agar-,<br />
agaróz-, poliakrilamid-gél stb. Tiselius, az elektroforézis<br />
leírója (1930) nem használt hordozót, szabad<br />
elektroforézist végzett. Elválasztás után a fehérjéket<br />
fixáljuk, majd fehérjefestékkel (Ponceau, amidofekete<br />
vagy Coomassie blue) megfestjük. Az így kapott<br />
elektroforetogramot egyrészt szemikvantitatív módon<br />
vizuálisan, másrészt különböző hullámhosszon denzitometriásan<br />
értékeljük, így a frakciók százalékos<br />
aránya pontosan megadható. Cellulóz-acetát-fólián
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai<br />
223<br />
vagy agarózgélben való elválasztás után amidofekete<br />
festéket használva 5 frakciót kapunk: albumin, α 1<br />
, α 2,<br />
β és γ frakció (11-1. ábra).<br />
A dysproteinaemiák a szérumfehérjék összetételében<br />
létrejövő kvalitatív és kvantitatív elváltozások,<br />
amelyek szorosan kapcsolódnak a különböző kórképekhez.<br />
Ezek különböző fehérjéket vagy fehérjecsoportokat<br />
érintenek (mennyiségük a betegség<br />
állapotának megfelelően nő vagy csökken), és a szérumfehérje-elektroforetogramon<br />
jól felismerhetők<br />
(11-1. táblázat). A szérumfehérje-elektroforetogramon<br />
látható leggyakoribb patológiás eltéréseket a 11-<br />
2. ábra mutatja be.<br />
11-1. ábra. Normál szérumfehérje-elektroforetogram<br />
11-1. táblázat. Dysproteinaemiák<br />
Fehérje vagy fehérjecsoport<br />
albumin<br />
akut fázis fehérjék<br />
prealbumin-transzferrin<br />
csoport<br />
immunglobulinok<br />
poliklonális<br />
gammopathia<br />
monoklonális<br />
gammopathia<br />
oligoklonális<br />
gammopathia<br />
izolált fehérjeelváltozás<br />
extrafrakciók<br />
Kvalitatív vagy kvantitatív elváltozás<br />
koncentrációja minden olyan esetben csökken, amikor a globulinok abszolút mennyisége<br />
nő, annak ellenére, hogy az összfehérjeszint általában a referenciatartományon belül<br />
marad<br />
az α 1<br />
- és α -frakcióban vándorolnak;<br />
2<br />
mennyiségük akut gyulladásban 50-300%-kal is emelkedhet, csökken viszont akut hepatitisben,<br />
krónikus aktív májbetegségben és fehérjevesztéses állapotban<br />
a prealbumin (transztiretin) az albumin előtt vándorol, 50-70%-a a retinolkötő fehérjével<br />
komplexben található; fehérje- és energiahiányos állapotban mennyiségük csökken;<br />
a transzferrin a b-frakcióban található, vashiányban mennyisége nő;<br />
a transztiretin-transzferrin fehérjecsoport mennyisége akut és krónikus gyulladásokban<br />
csökken - ún. negatív akut fázisfehérjék<br />
a γ-frakcióban, ill. bizonyos mértékben a β-frakcióban vándorolnak, a szervezet védekezésében<br />
vesznek részt;<br />
az immunglobulinszint emelkedését gammopathiának nevezzük<br />
a g-globulin-szint emelkedése a humorális immunválaszt aktiváló betegségek hatására<br />
monoklonális, éles határú M-csík (extrafrakció) a globulinrégióban;<br />
a hátterében egy plazmasejtklón által túlzott mértékben termelt immunglobulin (Ig)<br />
vagy immunglobulin-fragmentum áll<br />
egy vagy több Ig-osztály vagy -alosztály mennyiségének szelektív növekedése;<br />
a g-globulin-frakcióban egy vagy több extrafrakció található (fűrészfog-mintázat)<br />
ritkán detektálható, kivéve az albumint, az α 1<br />
-antitripszint és az IgG-t<br />
ezek a normál fehérjeképben megjelenő ,,extra” fehérjecsúcsok atípusosan a normál csúcsok<br />
között vagy azokra rátevődve jelenhetnek meg, akkor válnak láthatóvá, ha mennyiségük<br />
meghaladja a 2 g/l-t;<br />
az éles határú fehérjecsúcsok és -sávok hátterében monoklonális immunglobulinok,<br />
szabad könnyűláncok, ill. nehézláncok állnak; ezek a γ- és a β-régióban találhatók, és<br />
M-proteinnek (monoklonális) vagy régi szóhasználattal paraproteinnek nevezzük őket
224 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
n<br />
α-fetoprotein (AFP)<br />
A magzati élet során a máj által termelt fehérje, a<br />
magzati albuminnak felel meg. Születés után szintje<br />
csökken, és a 8-12 hónapos korra éri el a felnőttben is<br />
mérhető szintet (< 10 µg/l). Szerepe nem ismert. Terhességben<br />
az anya véréből, ill. az amnionfolyadékból<br />
meghatározva alkalmas velőcső-záródási rendellenességek<br />
(az AFP-szint nő), valamint Down-szindróma<br />
(az AFP-szint csökken) kiszűrésére. Felnőttkorban<br />
az AFP tumormarkerként használható nagy rizikójú<br />
betegcsoportokban, így hepatitis C- és krónikus hepatitis<br />
B-fertőzésben szenvedő betegeknél hepatocelm<br />
A A A<br />
k<br />
h<br />
m<br />
A A A<br />
11-2. ábra. Kóros szérumfehérje-elektroforetogramok<br />
A különböző frakciókban vándorló<br />
jelentősebb fehérjék rendellenességei<br />
betegségekben<br />
Az albuminfrakcióban található fehérje<br />
Lényegében az albumin, amelyet az előzőekben mutattunk<br />
be.<br />
Az α 1<br />
-frakcióban található fehérjék<br />
α 1<br />
-antitripszin (α 1<br />
-AT)<br />
Szerin-proteáz-inhibitor (serpin, α 1<br />
-proteáz-inhibitor),<br />
irreverzibilis komplexet képez az elasztázzal,<br />
a kimotripszinnel, a tripszinnel, valamint a trombinnal,<br />
és inaktiválja őket. Több mint 75 genetikai<br />
variáns ismert, ezek közül azonban csak néhány jár<br />
együtt klinikailag releváns α 1<br />
-antitripszin-hiánnyal.<br />
Az elektroforetikus mobilitás alapján is több variánst<br />
azonosítottak, F, M, S és Z betűvel jelölve ezeket.<br />
Az α 1<br />
-AT akut fázis fehérje. Plazmakoncentrációja<br />
a genotípustól függ. A Pi MM variáns, amely<br />
az europid populáció 93%-ában fordul elő, normál<br />
α 1<br />
-AT-szinttel jár együtt. A populáció kb. 7%-ában<br />
mutatható ki genetikai eltérés, amely közepesen súlyos<br />
vagy súlyos α 1<br />
-AT-hiánnyal jár együtt. Ezek közül<br />
a Pi ZZ variáns a legjelentősebb, prevalenciája<br />
1:1600 (a „Pi” rövidítés a proteáz-inhibitorra utal).<br />
Az α 1<br />
-antitripszin-hiány pulmonalis emphysemával<br />
és májbetegséggel jár együtt. Az emphysema oka,<br />
hogy az α 1<br />
-AT nem gátolja a neutrophil granulocytákból<br />
felszabaduló elasztáz működését, és ez károsítja<br />
a tüdő állományát.
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai<br />
225<br />
lularis carcinománál. Szintje magasabb lehet a gonadokból<br />
kiinduló tumorok esetén is.<br />
Az α 2<br />
-frakcióban található fehérjék<br />
Cöruloplazmin (Cp)<br />
A májban termelődő és redoxi sajátossággal rendelkező<br />
metalloprotein, amely a rézionokat szállítja.<br />
Ferroxidáz aktivitása révén befolyásolja más fémek,<br />
így a vasion státusát, antioxidáns hatást fejt ki azáltal,<br />
hogy gátolja a sejtmembránlipidek fémion katalizálta<br />
oxidációját. Akut fázis fehérje. Szintje a szérumban<br />
csökken veleszületett cöruloplazminszintézis-zavarban,<br />
Wilson-kórban, Menkes-szindrómában és táplálkozási<br />
rézhiányban. Ez utóbbi vasrefrakter hypochrom<br />
microcytás anaemia kapcsán vetődhet fel.<br />
Haptoglobin (Hp)<br />
A májban termelődik. A Hp1 és Hp2 allélokat kódoló<br />
gének három strukturálisan különböző fenotípust<br />
hoznak létre: Hp1-1, Hp2-1 és Hp2-2. Szérumkoncentrációja<br />
minden egyén esetén ezek típusától<br />
függ, ezért referenciatartománya is viszonylag széles<br />
(0,3–2,0 g/l). Akut fázis fehérje, mely a széteső vörösvértestekből<br />
felszabaduló hemoglobint köti meg.<br />
Szintje csökken hemolítikus anaemiákban, akut és<br />
krónikus májbetegségekben, valamint malabsorptiós<br />
szindrómában. Veleszületett haptoglobinhiány ritka.<br />
α 2<br />
-makroglobulin<br />
A szérumban található legnagyobb fehérje, molekulatömege<br />
820 kDa. Vesebetegségben sem jut át a<br />
glomerulusokon. Endopeptidázokat, így tripszint és<br />
kimotripszint köt meg, ezáltal inaktiválva őket. Szintje<br />
emelkedik nephrosis-szindrómában, májcirrhosisban<br />
és bizonyos kollagénbetegségekben.<br />
A β-frakcióban található fehérjék<br />
C-reaktív protein (CRP)<br />
1930-ban írták le, nevét onnan kapta, hogy kötődve<br />
a pneumococcus C poliszacharidhoz a kórokozót<br />
agglutinálja. Klasszikus akut fázis fehérje, amely a<br />
májban termelődik proinflammatorikus citokinek,<br />
így IL-6, IL-1 és TNF hatására. Akut gyulladásos folyamatokban<br />
szintje a plazmában 6-12 óra után kezd<br />
el emelkedni, csúcskoncentrációját 48 óra után éri el<br />
és 1-2 hét alatt normalizálódik. A CRP az endogén és<br />
exogén ligandok széles skálájához (mikroorganizmusok,<br />
apoptotikus sejtek, DNS) képes kapcsolódni és<br />
opszonizálni azokat, ezáltal elősegítve a fagocitózist.<br />
A laboratóriumokban meghatározott CRP-koncentráció<br />
mértékét a klinikumban széles körben<br />
használják fel, ezek a következők:<br />
• Fertőzés diagnózisának megerősítése és monitorozása<br />
pl. posztoperatív állapotokban, intenzív<br />
terápiás betegek, újszülöttek, traumás betegek<br />
kezelésekor, szülészeten korai burokrepedéskor.<br />
• Antibiotikumterápia hatásosságának megítélése.<br />
• Vírusok és baktériumok okozta lázas állapotok<br />
differenciáldiagnózisára (pl. meningitis, pneumonia).<br />
• Bizonyos autoimmun gyulladások aktivitásának<br />
megítélése (rheumatoid arthritis, vasculitis).<br />
• Akut és krónikus gyulladásos betegségek diagnózisának<br />
megerősítére (malignus betegségeket<br />
kísérő krónikus gyulladásban is emelkedik a<br />
szintje).<br />
• Atherosclerosisos betegek hs-CRP- (high sensitivity<br />
CRP) szintjének mérésével cardiovascularis<br />
rizikóbecslésre.<br />
Transzferrin<br />
A plazmában a vasat szállítja a felszívódás és a lebomlás<br />
helyéről a felhasználás helyére. A legjelentősebb<br />
,,vasfelhasználó szerv,, a csontvelő, ahol a vas a<br />
képződő vörösvértestek hemoglobinjába épül be. Egy<br />
transzferrinmolekula két vasiont képes megkötni és<br />
szállítani. Egészséges egyének transzferrinmolekulái<br />
csak 30%-ban telítettek. Szintje csökken fehérjevesztéses<br />
állapotokban, elsősorban vesebetegségekben,<br />
valamint fertőzésekben és gyulladásokban (negatív<br />
akut fázis fehérje). Vashiányos anaemiában szintje<br />
megemelkedik.<br />
b 2<br />
-mikroglobulin<br />
Kis molekulatömegű fehérje (12 kDa), amely minden<br />
magvas sejt sejtmembránjában megtalálható, az<br />
MHC I molekula β-lánca. Ennek ellenére elsősorban<br />
a myeloid és lymphoid sejtekből kerül a plazmába.<br />
Egészséges egyénekben fiziológiás sejtregeneráció<br />
esetén szintézise állandó. A veseglomerulusokban<br />
szabadon filtrálódik, a tubulussejtekben pedig viszszaszívódik.<br />
Szérumban mérhető koncenrációja a
226 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
szintézis és a kiválasztás mértékétől függ, egészségesekben<br />
egyensúlyban van. A klinikumban elsősorban<br />
lymphomák, myeloma multiplex és vesebetegségek<br />
monitorozására használják.<br />
A γ-frakcióban található fehérjék – Az immunglobulinok<br />
Immunglobulinok<br />
A B-sejtekben termelődnek és a szervezetben a humorális<br />
immunválaszban vesznek részt. Minden egyes<br />
immunglobulin-molekula négy polipeptidláncból<br />
épül fel, amelyek egymáshoz kovalens diszulfidkötésen<br />
keresztül kapcsolódnak: egy pár nehézláncból és<br />
egy pár könnyűláncból áll. A nehézláncoknak öt (γ,<br />
α, μ, δ, ε), a könnyűláncoknak pedig két típusa ismert<br />
(κ, λ). Mindkét lánctípus tartalmaz egy variábilis (V)<br />
régiót (antigénfelismerő hely), a Fab fragmentumon<br />
belül és egy konstans (C) régiót, nehézlánc esetében<br />
az Fc, könnyűlánc esetében az Fab fragmentumon<br />
belül. Az immunglobulin-osztályok legfontosabb tulajdonságait<br />
a 11-2. táblázat mutatja be.<br />
Az immunglobulin-molekulák nagyfokú változékonyságát<br />
a genetikai szinten bekövetkező nehéz- és<br />
könnyűlánc-génátrendeződés biztosítja. Sorrendben<br />
ez előbb a nehézlánc szintjén történik meg, majd a<br />
könnyűláncoknak előbb a két κ génje rendeződik át,<br />
és csak azután a λ láncé. Ezzel magyarázható a B-sejtek<br />
szintjén a 2:1 kimutatható κ:λ arány.<br />
Újszülöttek szérumában IgA és IgM csak rendkívül<br />
kis mennyiségben vagy egyáltalán nem mutatható ki.<br />
Viszont az IgG, amely elsősorban anyai eredetű (placentán<br />
keresztül jut át), nagy koncentrációban mérhető,<br />
szintje születés után azonban csökkenni kezd. Az<br />
immunglobulinok koncentrációja fokozatosan emelkedve<br />
éri el az egészséges felnőttre jellemző értéket.<br />
Az immunglobulinok szintézisének két fontos eltérése<br />
van:<br />
• Hypogammaglobulinaemiával járó csökkent<br />
szintézis.<br />
• Hypergammaglobulinaemiát eredményező túltermelődés.<br />
Az immunglobulin-termelődés csökkenésének oka lehet<br />
veleszületett vagy szerzett. Veleszületett hiányos<br />
állapotban egy vagy több immunglobulin-osztály<br />
vagy -alosztály termelődése zavart szenvedhet. Ennek<br />
eredményeként ezek a gyerekek sokkal fogékonyabbá<br />
válnak a különböző fertőzésekre. A felnőttkorban<br />
jelentkező immunglobulinszintézis-zavarok<br />
általában más betegséghez társulva jelentkeznek; így<br />
pl. lymphomák, myeloma multiplex, gyógyszerek, toxinok<br />
hatására, fehérjevesztéses állapotokban fordulnak<br />
elő.<br />
Az immunglobulinok túltermelődése lehet diffúz és<br />
diszkrét.<br />
Diffúz hypergammaglobulinaemiában egy betegség<br />
(pl. fertőző betegség, májbetegség, autoimmun betegség)<br />
váltja ki a nagyszámú B-sejt-klón által termelődő<br />
immunglobulin-szaporulatot, a prezentálódó<br />
antigének sokaságát. Ilyen esetben tehát nagyszámú<br />
különböző tulajdonsággal, primer szerkezettel és fi-<br />
11-2. táblázat. Az immunglobulin-osztályok fő tulajdonságai<br />
Tulajdonság IgG IgA IgM IgD IgE<br />
nehézlánc γ Α μ δ ε<br />
nehézlánc-alosztályok γ 1<br />
, γ 2<br />
, γ 3<br />
, γ 4<br />
, α 1<br />
, α 2<br />
μ 1<br />
, μ 2<br />
nincs nincs<br />
molsúly (kDa) ~ 150 ~ 150–400 ~ 900 ~ 175 ~190<br />
J lánc nincs Van van nincs nincs<br />
szérumkoncentráció (g/l) 8,0–18 1,1–5,0 0,6–2,2 < 0,03 < 0,02<br />
féléletidő a szérumban (nap) 21 6 10 3 2<br />
komplementaktiváció igen ritkán igen nem nem<br />
opszonizáció igen gyenge nem nem nem<br />
anaphylaxia nem nem nem nem igen
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai<br />
227<br />
zikai kémiai tulajdonsággal rendelkező specifikus antitestmolekula<br />
keletkezik, amelyek különböző vagy<br />
ugyanabba az immunglobulin-osztályba sorolhatók.<br />
A szérumfehérje-elektroforetogramon ez elmosódott<br />
széles sáv képében jelentkezik a γ-frakció területén,<br />
és poliklonális gammopathiának nevezzük. Poliklonális<br />
gammopathiával járnak együtt az akut és krónikus<br />
fertőzések és gyulladásos megbetegedések, májbetegségek,<br />
autoimmun folyamatok és a szisztémás malignus<br />
megbetegedések.<br />
Diszkrét hypergammaglobulinaemiában az antigén-,,felismerés,,<br />
szempontjából, szerkezetileg és<br />
funkcionálisan egyforma immunglobulin-molekula<br />
és/vagy töredéke termelődik nagy mennyiségben.<br />
Ezt monoklonális proteinnek (M-protein, régi elnevezése<br />
paraprotein) nevezzük, ami myeloma multiplexben,<br />
Waldenström-macroglobulinaemiában és<br />
más lymphoproliferativ betegségben fordul elő. Monoklonális<br />
szintézisük eredményeként minden egyes<br />
M-protein csak egyetlen immunglobulin-osztályba,<br />
-alosztályba, allo-típus osztályba és lánctípusba tartozik.<br />
Az M-proteinek szerkezete általában a normális<br />
immunglobulinéhoz hasonló. A szérum- és vizeletfehérje-elektroforetogramon<br />
az M-protein-molekulák<br />
egyformasága egy éles, keskeny alapú, diszkrét csík<br />
formájában jelentkezik. Denzitometriás értékelés<br />
után az extrafrakció neve M-protein, M-gradiens, ill.<br />
M-csúcs. Mobilitás szempontjából az α-frakciótól a<br />
γ-frakció végéig lehetnek jelen. Legtöbb esetben rajta<br />
kívül normál poliklonális immunglobulin is kimutatható.<br />
Azokat a betegségeket, amelyek monoklonális<br />
immunglobulin termeléssel, így M-gradiens jelenlétével<br />
járnak együtt, monoklonális gammopathiáknak<br />
vagy plazmasejt-dyscrasiáknak nevezzük. Hátterükben<br />
egy immunkompetens B-sejt ellenőrizetlen, néha<br />
tumoros szaporodása áll.<br />
Immunfixációs elektroforézissel való tipizálás után<br />
az M-protein a következőképpen jelenhet meg:<br />
• Egy osztályba és egy típusba tartozó monoklonális<br />
immunglobulin, pl. IgG k, IgA l stb.<br />
• Egy típusú monoklonális szabad könnyűlánc,<br />
pl. k vagy l (szérumban meghatározva szabad<br />
könnyűlánc, vizeletben Bence-Jones-fehérje az<br />
elnevezése).<br />
• Szabad nehéz- (H-) lánc vagy F c<br />
-rész, pl. α, γ és<br />
μ lánc vagy F c<br />
fragmens.<br />
• Különböző monoklonális immunglobulinok:<br />
bi-, tri- és multiklonális gammopathia.<br />
Malignus monoklonális gammopathiát okozó<br />
B-sejt-dyscrasiák:<br />
• Plazmasejt eredetű (myeloma multiplex, soliter<br />
csontplasmocytoma, extramedullaris myeloma).<br />
• IgM-et termelő lymphoplasmocytás sejtek<br />
(Waldenström-macroglobulinaemia).<br />
• B-sejt eredetű (krónikus lymphocytás leukaemia,<br />
hajas sejtes leukaemia).<br />
• Könnyűláncot termelő B-sejtek, amelyek amyloid<br />
formájában kicsapódhatnak.<br />
A benignus vagy premalignus monoklonális gammopathiákat<br />
MGUS (monoclonal gammopathies with<br />
undetermined significance, monoklonális gammopathiák<br />
nem meghatározott jelentőséggel) néven ismerjük.<br />
Ezekben az esetekben is jelen van az M-protein,<br />
de myelomára vagy B-sejt-malignitásra utaló tünetek<br />
nincsenek. Fontos tudni, hogy milyen tünetek megjelenésekor<br />
ajánlatos a beteget monoklonális gammopathia<br />
irányába kivizsgáltatni. A teljesség igénye<br />
nélkül ezek a következők: megmagyarázhatatlan<br />
hátfájdalom, osteolyticus gócok, osteopenia röntgenfelvételen,<br />
gyengeség, fáradékonyság, anaemia,<br />
hypercalcaemia, veseelégtelenség, Bence-Jones-fehérje<br />
ürítése, gyakori bakteriális fertőzések, megmagyarázhatatlan<br />
érző-motoros perifériás neuropathia,<br />
par aesthesia, nagyfokú súlyvesztés, elsősorban ha a<br />
beteg 50 évesnél idősebb.<br />
Az immunglobulinok vizsgálati lehetőségei<br />
Kvantitatív meghatározás:<br />
• Nefelometria.<br />
• Turbidimetria.<br />
Immunglobulin-osztályok és -alosztályok mérése:<br />
IgA (IgA 1<br />
, IgA 2<br />
), IgG (IgG 1<br />
, IgG 2<br />
, IgG 3<br />
, IgG 4<br />
), IgM.<br />
Teljes könnyűlánc-mérés: k, l (k/larány)<br />
Szabad könnyűlánc (FLC) mérés: k, l (k/larány).<br />
Kvalitatív meghatározás:<br />
• Szérumfehérje elektroforézis (SPE).<br />
• Immunelektroforézis (IE).<br />
• Immunfixáció (IFE).<br />
• Vizeletfehérje elektroforézis (UPE).<br />
• Vizeletfehérje immunfixáció (UPI).<br />
Az immunglobulin-mérési eredmények kiadásánál<br />
és interpretálásánál mindig figyelembe kell vennünk,
228 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
hogy megnövekedett szintézis esetén mono-, oligovagy<br />
poliklonális termelődésről van-e szó. Az IgG,<br />
az IgA és az IgM mennyisége a legtöbb fertőző betegségben<br />
nem emelkedik 150-200%-nál többet a<br />
referencia középértékéhez viszonyítva, kivételt képez<br />
néhány autoimmun betegség és vírusinfekció, ahol<br />
200-400%-kal is nagyobb lehet.<br />
Szelektív IgA-szint-emelkedés fordulhat elő a következő<br />
betegségekben:<br />
• légúti infekciók,<br />
• pneumonia és más tüdőmegbetegedés,<br />
• ízületek megbetegedései (rheumatoid arthritis),<br />
• a béltraktus gyulladásos megbetegedései,<br />
• alkohol indukálta májbetegség, pl. zsírmáj, cirrhosis<br />
(11-3. ábra).<br />
Szelektív IgM-szin-emelkedés fordulhat elő a következő<br />
betegségekben:<br />
• vírusinfekciók pl. hepatitis, mononucleosis,<br />
citomegalovírus-fertőzés (CMV),<br />
• malária,<br />
• trypanosomiasis,<br />
• biliaris eredetű májbetegség – primer biliaris<br />
cirrhosis (PBC) (11-4. ábra, 11-5. ábra).<br />
Monoklonális gammopathia gyanújakor a laboratóriumi<br />
kivizsgálás során mindig célszerű egy diagnosztikai<br />
algoritmust követni. Ezt az algoritmust a 11-6.<br />
ábra mutatja be. A monoklonális gammopathiák besorolása,<br />
ill. diagnosztikai kritériumai is változtak az<br />
utóbbi időben.<br />
11-3. ábra. Szelektív IgA-szintézissel járó megbetegedések (100% - IgG: 10 g/L, IgA: 2,0 g/L, IgM: 1,0 g/L)<br />
11-4. ábra. Szelektív IgM-szintézissel járó megbetegedések I. (100% - IgG: 10 g/L, IgA: 2,0 g/L, IgM: 1,0 g/L)<br />
11-5. ábra. Szelektív IgM-szintézissel<br />
járó megbetegedések II.<br />
(100% - IgG: 10 g/L, IgA: 2,0 g/L,<br />
IgM: 1,0 g/L)
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai<br />
229<br />
Nem szekretoros myeloma diagnosztikai kritériumai:<br />
1. M-protein nem mutatható ki immunfixációval a<br />
szérumban és/vagy a vizeletben.<br />
2. Csontvelő klonális plazmasejt-szaporulat > 10%<br />
vagy plasmocytoma jelenléte.<br />
3. Társuló szöveti és szervi károsodás (célszervkárosodás,<br />
beleértve a csontlaesiókat).<br />
Aszimptomás myeloma diagnosztikai kritériumai:<br />
1. M-protein > 30g/l a szérumban és/vagy a vizeletben.<br />
2. Csontvelő klonális plazmasejtszám > 10%.<br />
3. Nincs társuló szöveti és szervi károsodás (célszerv,<br />
beleértve a csontlaesiókat) és tünetei.<br />
11-6. ábra. Monoklonális gammopathia kivizsgálásának<br />
laboratóriumi algoritmusa<br />
Amennyiben a lelet negatív, de a tünetek alapján továbbra<br />
is fennáll a gyanú, ajánlott koncentrált reggeli első vizeletből<br />
vizeletfehérje-elektroforézist, ill. immunfixációt<br />
végezni az esetleges Bence-Jones-fehérje kimutatására, a<br />
szérumból pedig szabad könnyűlánc mérés végezhető<br />
A monoklonális gammopathiák új besorolása a következő:<br />
1. Monoklonális gammopathia nem meghatározott<br />
jelentőséggel (MGUS).<br />
2. Aszimptomás myeloma multiplex.<br />
3. Szimptomás myeloma multiplex.<br />
4. Nem szekretoros myeloma multiplex.<br />
5. Csont solitaer plasmocytoma.<br />
6. Extramedullaris plasmocytoma.<br />
7. Többszörös solitaer plasmocytoma.<br />
8. Plazmasejtes leukaemia.<br />
Az International Myeloma Working Group 2005-ös<br />
ajánlásai<br />
Myeloma multiplex diagnosztikai kritériumai a következők:<br />
1. M-protein jelenléte a szérumban és/vagy a vizeletben.<br />
2. A csontvelőben klonális plazmasejtek vagy plasmocytoma<br />
jelenléte.<br />
3. Társuló szöveti és szervi károsodás (célszervkárosodás,<br />
beleértve a csontlaesiókat).<br />
MGUS (monoclonal gammopathies with undetermined<br />
significance) diagnosztikai kritériumai:<br />
1. M-protein a szérumban < 30 g/l.<br />
2. Csontvelő klonális plazmasejtszám < 10% és alacsony<br />
plazmasejt-infiltráció csontvelő-biopsziával<br />
(ha készült).<br />
3. Nem igazolható más B-sejtes lymphoma.<br />
4. Nincs myeloma asszociált szervkárosodás (célszerv,<br />
beleértve a csontlaesiókat is).<br />
A célszervkárosodás kritériumai myeloma multiplexben<br />
(CRAB: calcium, renal, anaemia, bone):<br />
1. A kalciumszint emelkedése 0,25 mmol/l-rel nagyobb,<br />
mint a referenciatartomány felső határa<br />
vagy > 2,75 mmol/l.<br />
2. Veseelégtelenség: szérumkreatinin-szint > 173<br />
μmol/l.<br />
3. Anaemia: hemoglobin 20 g/l-rel kisebb, mint a referenciatartomány<br />
alsó határa vagy < 100 g/l.<br />
4. Csontlaesiók: litikus laesio vagy osteoporosis<br />
kompressziós töréssel (MR- vagy CT-vizsgálattal).<br />
5. Más: hiperviszkozitás, amyloidosis, recurráló bakteriális<br />
infekció (> 2/év).<br />
A felsorolt diagnosztikai kritériumok mellett egy laboratóriumi<br />
ajánlást is létrehoztak. Ennek alapján<br />
monoklonális gammopathia gyanúja esetén először a<br />
szérumfehérje-elektroforézis (SPE) elvégzése javasolt.<br />
Ennek kimutatási érzékenysége 1,0–2,0 g/l között van.<br />
Azonosítani lehet vele minden intakt immunglobulin<br />
termelő myelomát. Azonban nem képes azonosítani a<br />
könnyűlánc myelomások 30%-át, az amyloidosisos betegek<br />
50%-át valamint a nem szekretoros myelomáso-
230 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
kat. Következő lépésben a szérumfehérje elektroforézis<br />
mellett elvégezzük az immunfixációs elektroforézist<br />
(IFE) is. A módszer kimutatási szenzitivitása 0,15–0,5<br />
g/l között van, azonban még így sem lehet beazonosítani<br />
minden könnyűlánc myelomást, az amyloidosis<br />
30%-át, valamint a nem szekretoros myelomásokat.<br />
Harmadik lépcsőben elvégezhetjük a vizelet fehérje<br />
elektroforézist és immunfixációt Bence–Jones-fehérje<br />
kimutatásra (UPE) A teszt Bence–Jones-fehérje iránti<br />
kimutatási érzékenysége 0,01- 0,05 g/l. Ennek következtében<br />
képes 30 %-kal több könnyűlánc-myeloma<br />
és az amyloidosis nagy részének kimutatására. Negyedik<br />
lépcsőben ajánlott a szérum és vizelet szabad<br />
könnyűlánc mérés (FLC). Segítségével kiszűrhetünk<br />
minden könnyűlánc myelomás beteget. Kimutatási<br />
érzékenysége ellenére önmagában nem alkalmazható,<br />
mivel teljes immunglobulint nem mutat ki; MGUS<br />
és intakt immunglobulint termelő myelomában sincs<br />
mindig könnyűlánc termelés. A különböző laboratóriumi<br />
tesztek kimutatási érzékenységét a 11-3. táblázat<br />
mutatja be.<br />
Immunfixációs elektroforézis (IFE)<br />
Az IFE segítségével lehetővé válik az M-proteinek<br />
osztályozása és tipizálása. A fehérjéket általában agarózgélen<br />
választják el töltésüknek és nagyságuknak<br />
megfelelően (0,8% agaróz és trisz-barbitál puffer pH<br />
9,1). Ezután következik az elválasztott fehérjék immunprecipitációja<br />
(fixációja) monovalens antihumán<br />
emlős immunglobulinok segítségével. A nem<br />
precipitálódott fehérjéket mosással és leitatással eltávolítjuk.<br />
Végül a kicsapódott immunkomplexeket<br />
festéssel (pl. savanyú viola) tesszük láthatóvá. A 11-7.<br />
ábrán egy immunfixációs lemezt mutatunk be. Egy<br />
lemezre négy beteg mintáját tudjuk felvinni. A fehérjéket<br />
minden beteg esetében 6 sávban választjuk<br />
el. Az első szérumfehérje-elektroforetogram marad,<br />
mivel erre nem rétegezünk immunglobulint, elválasztás<br />
után ebben a sávban fixáljuk a fehérjéket. A<br />
következő sávok esetében a szérumfehérje-elválasztás<br />
után sorrendben IgG, IgA, IgM, k és l könnyűlánc<br />
konstans régiója ellen termelt antitestet rétegezünk.<br />
Az immunfixációs lemez értékelésekor először az<br />
elektoforetogramsávban keresünk esetleges eltérést,<br />
ami általában éles, jól körülhatárolt csík (extrafrakció/extrafrakciók)<br />
formájában jelentkezik. M-protein<br />
jelenlétében ezzel azonos magasságban a nehéz- és<br />
könnyűláncok sávjának valamelyikében az éles, jól<br />
körülhatárolt csík szintén megjelenik; pl. a 11-7. ábrán<br />
a 2-es és a 4-es számú beteg esetében IgG k tí-<br />
11-7. ábra. Immunfixációs elektroforetogramok<br />
11-3. táblázat. Különböző laboratóriumi tesztek diagnosztikus érzékenysége myeloma multiplexben<br />
Teszt<br />
Myeloma AL amyloidosis MGUS<br />
%<br />
SPE 90 50 45<br />
SPE + se-IFE 95 70 80<br />
SPE + UPE 95 75 70<br />
SPE + UPE + se- és vizelet-IFE 97 90 80<br />
FLC 96 95 65<br />
SPE + FLC 99 98 85<br />
SPE + FLC + IFE 99 99 100
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai<br />
231<br />
pusú monoklonális M-protein látható. Az M-protein<br />
γ-frakción belüli pontosabb elhelyezkedésének megadása<br />
érdekében a γ-frakciót három részre osztottuk<br />
fel. A β-frakcióhoz közel eső részt gyors γ-régiónak,<br />
a γ-frakció középső részét középső γ-régiónak, a katódhoz<br />
közel elhelyezkedő γ-frakció részt pedig lassú<br />
γ-régiónak neveztük el. Így az immunfixációs eredmény<br />
kiadásakor nem csak az M-protein típusát, hanem<br />
annak γ-frakción belüli pontos elhelyezkedését<br />
is megadjuk. A 11-7. ábra 2-es és 4-es számú betegének<br />
esetében tehát IgG k típusú M-protein mutatható<br />
ki a lassú γ-régióban a szérumfehérje-elektroforetogramon<br />
megjelenő extrafrakciónak megfelelően.<br />
Az M-protein pontos helyének megadása elsősorban<br />
csontvelő-transzplantáción átesett betegek kezelésében<br />
fontos, az esetleges recidíva minél hamarabbi<br />
kiszűrése érdekében. Poliklonális gammopathiában a<br />
különböző sávokban a precipitációs zóna diffúz, elmosódott<br />
emelkedése látható (11-8. ábra). Normál<br />
immunfixációs kép szintén elmosódott a precipitációs<br />
régióban, mennyiségi elváltozás nélkül (11-7. ábra<br />
1-es és 3-as számú beteg).<br />
A következőkben néhány tipikus példával illusztráljuk<br />
az immunfixációval osztályozott monoklonális<br />
gammopathiákat. A 11-9. ábrán IgG k (2-es és 3-as<br />
számú beteg), valamint IgG l (4-es számú beteg) típusú<br />
monoklonális M-protein látható. A 11-10. ábra<br />
egy IgA k (4-es számú beteg), valamint egy IgA l (1-es<br />
számú beteg) típusú monoklonális M-proteint mutat<br />
be. IgM k típusú monoklonális M-proteineket szemléltet<br />
a 11-11. ábra. Előfordul, hogy a kóros plazmasejtklón<br />
a komplett nehézláncból álló M-proteinen<br />
kívül szabad könnyűláncot is termel. Ilyen esetben a<br />
szabad könnyűlánc a könnyűláncok variábilis régiója<br />
ellen termelt monovalens antitestek segítségével mutatható<br />
ki. Ezek normál körülmények között, amikor<br />
a könnyűlánc a nehézlánccal összeszerelve található,<br />
az antitest számára nem hozzáférhetők. A 11-12. ábra<br />
11-9. ábra. Monoklonális gammopathia – IgG k és l típusú<br />
M-proteinek<br />
11-10. ábra. Monoklonális gammopathia – IgA k és l típusú<br />
M-proteinek<br />
11-8. ábra. Poliklonális gammopathia immunfixációs<br />
elektroforetogramja<br />
11-11. ábra. Monoklonális gammopathia – IgM k típusú<br />
M-proteinek
232 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
egy ilyen beteg immunfixációs lemezét mutatja be.<br />
Az első lemezen a β-frakcióban található extrafrakciónak<br />
megfelelően IgA l típusú M-proteint láthatunk.<br />
Ugyanakkor az α 2<br />
- és a β-frakció között lévő extrafrakcióval<br />
egy magasságban csak a l-sávban találunk<br />
csíkot, a nehézláncok sávjában nem. Felmerül a szabad<br />
l-könnyűlánc jelenlétének a lehetősége, amit a<br />
következő lemezen az L f<br />
sávjában alkalmazott szabad<br />
l-könnyűlánc-ellenes antitest használatával igazoltunk.<br />
Az immunfixációs elektroforézis eredményeinek<br />
klinikai értékelésénél mindig figyelembe kell vennünk<br />
a beteg tüneteit, egyéb laboratóriumi eredményeit<br />
és a képalkotó diagnosztika leleteit, mivel számos<br />
egyéb nem myeloma multiplexes megbetegedés<br />
is járhat együtt monoklonális gammopathiával a következők<br />
szerint:<br />
• Bőrbetegségek:<br />
- scleroderma,<br />
- pyoderma gangrenosum,<br />
- necrobioticus xanthogranuloma,<br />
- discoid lupus erythematosus,<br />
- psoriasis,<br />
- cutan lymphoma.<br />
• Immunszupresszió:<br />
- AIDS- és HIV-infekció,<br />
- vesetranszplantáció,<br />
- csontvelő-transzplantáció.<br />
• Májbetegségek:<br />
- krónikus hepatitis,<br />
- cirrhosis,<br />
- primer biliaris cirrhosis.<br />
• Különféle autoimmun és más megbetegedések:<br />
- rheumatoid arthritis,<br />
- gyulladásos szeronegatív polyarthritis,<br />
- polymyositis (IgG κ),<br />
- rheumás polymyalgia,<br />
- myasthenia gravis,<br />
- angioneuroticus oedema.<br />
A 11-13. ábrán egy csontvelő-transzplantáción átesett<br />
beteg oligoklonális M-proteineket tartalmazó immunfixációs<br />
elektroforetogramját mutatjuk be (ún.<br />
,,zebracsíkos,, mintázat). Mivel a myeloma multiplex<br />
laboratóriumi diagnózisához szervesen hozzátartozik<br />
a vizeletfehérjék elektroforézise és immunfixációja is<br />
a Bence-Jones-fehérjék kimutatására, röviden vázoljuk<br />
ez utóbbi eljárást.<br />
Vizeletfehérje immunfixációs elektroforézise<br />
Az eljárás alkalmas a proteinuria kimutatására és<br />
típusának azonosítására, valamint Bence-Jones-fehérjék<br />
és teljes immunglobulin-molekula ürítésének<br />
kimutatására. A Bence-Jones-fehérje kimutatási érzékenysége<br />
ezzel a módszerrel 0,01-0,05 g/l. A vizeletfehérje-elválasztás<br />
lúgosra pufferolt agaró gélen<br />
megy végbe. A kilenc (ebből egy vizeletfehérje-elektroforézis)<br />
sávban szétválasztott fehérjéket megfelelő<br />
antiszérummal fixáljuk. Az oldatban maradt fehérjéket<br />
leitatással, mosással eltávolítjuk. A kicsapódott<br />
fehérjéket savanyú violával festjük.<br />
A használt antiszérumok az elektroforetikus sávoknak<br />
megfelelően:<br />
1. ELP: vizeletelektroforetogram, antiszérum nélkül.<br />
2. Tubularis fehérjék: b 2<br />
-mikroglobulin, retinolkötő<br />
fehérje (RBP), α 1<br />
-mikroglobulin.<br />
11-12. ábra. Monoklonális gammopathia – IgA lambda típusú<br />
M-protein és szabad lambda könnyűlánc<br />
11-13. ábra. Csontvelő-transzplantáción átesett beteg oligoklonális<br />
M-proteinjei
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai<br />
233<br />
3. Glomerularis fehérjék: albumin, α 2<br />
-makroglobulin.<br />
4. GAM nehézlánc: trivalens szérum.<br />
5. DE nehézlánc: bivalens szérum.<br />
6. Szabad és kötött κ-könnyűlánc.<br />
7. Szabad és kötött λ-könnyűlánc.<br />
8. Szabad κ-könnyűlánc.<br />
9. Szabad λ-könnyűlánc.<br />
A proteinuria értékelése itt nem kerül részletezésre,<br />
mivel az egy másik fejezetben található. Bence-Jones-proteinuriáról<br />
akkor beszélünk, ha monoklonális<br />
csík jelenik meg a kötött és szabad könnyűláncok<br />
sávjának egyikében, míg a trivalens GAM és a bivalens<br />
DE sávban nem jelenik meg monoklonális csík.<br />
Amennyiben mégis, a beteg a komplett immunglobulin<br />
mellett szabad könnyűláncot is ürít. Ha a k- és/<br />
vagy l-sávban diffúz zónát látunk, ez poliklonális<br />
szabad könnyűláncnak felel meg, nem Bence-Jones-protein.<br />
A 11-14. ábra egy szabad l-könnyűláncot<br />
ürítő beteg vizelet immunfixációs elektroforetogramját<br />
mutatja.<br />
Irodalom<br />
11-14. ábra. Vizelet-immunfixációs elektroforetogram –<br />
Bence-Jones-proteinuria, szabad l-könnyűlánc-ürítéssel<br />
Le Carrer, D.: Serum electrophoresis immunofixation,<br />
illustrated interpretations. Editions FM-BIO, Vanves,<br />
2005.<br />
Thomas, L. (ed.): Clinical Laboratory Diagnostics. Use<br />
and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books<br />
Verlagsgesellschaft, Frankfurt am Main, 1998,<br />
Thomas, L. (ed.): Protein sin Clinical and Laboratory<br />
Medicine. Use and Assessment of Clinical Laboratory<br />
Results. TH-Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt am<br />
Main, 2008.<br />
Smith, A., Wisloff, F., Samson, D: on behalf of the UK<br />
Myeloma forum, Nordic Myloma Study Group and<br />
British Committee for Standards in Hematology: Guidelines<br />
on the diagnosis and management of multiple<br />
myeloma. British Journal of Haematology 132:410-451,<br />
2005.
234 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Kis molekulatömegű fehérjék,<br />
peptidek, peptidhormonok<br />
kimutatása<br />
Kőszegi Tamás<br />
A kis molekulatömegű fehérjék jellemzői<br />
A kis molekulatömegű fehérje fogalma<br />
Általánosságban véve az albuminnál kisebb (67<br />
kDa) tömegű fehérjéket, peptideket soroljuk ebbe a<br />
csoportba. A beosztás talán önkényes, szerepet játszik<br />
ebben az a tény is, hogy a vese filtrációs küszöbe<br />
ebbe a tartományba esik. A másik ok az lehet, hogy<br />
az albumin monoklonális homogén terméknek tekinthető<br />
– legalábbis a transzlációkor született fehérje<br />
esetében – a későbbi poszttranszlációs módosulások<br />
nélkül. Az albumin nagy mennyiségben kering<br />
a vérplazmában és szintje nagyon állandó. Ugyanez<br />
nem mondható el az albuminnál kisebb fehérjékről,<br />
peptidekről, hiszen sok biológiailag aktív molekula<br />
tartozik ebbe a csoportba és ezek vérszintje a szervezet<br />
mindenkori általános állapotától, válaszreakcióitól<br />
függ. Ez a molekulacsoport mind szerkezetét,<br />
mind funkcióját tekintve igen heterogén, és ugyanez<br />
igaz plazmakoncentrációjukra is: a néhány g/l-es<br />
koncentrációtól kezdve a ng/l értékekig terjedő tartományban<br />
találhatók a keringésben. Érthető módon<br />
minél nagyobb biológiai aktivitással rendelkezik<br />
egy molekula, annál kisebb a vérszintje és rövidebb a<br />
biológiai féléletideje. Szintézisük és a sejtből történő<br />
kikerülésük sebessége változó, azonban általánosságban<br />
itt is elmondható, hogy a gyors válaszkészséget<br />
mutató molekulák biológiai aktivitása fokozott.<br />
A kis molekulatömegű fehérjék jelentősége<br />
A molekulacsalád komponensei szerteágazó biológiai<br />
funkciót töltenek be: endokrin hormonok,<br />
sejtosztódást serkentő vagy gátló faktorok, az immunválaszt<br />
befolyásoló pro- és antiinflammatorikus<br />
citokinek, klasszikus akut fázis fehérjék és még<br />
sok egyéb biológiai funkcióval rendelkező molekula.<br />
Biológiai aktivitásuk nem mindig kedvező a szervezet<br />
számára, pl. súlyos bakteriális szepszisben a túlzott<br />
erősségű citokinválasz visszafordíthatatlan szervi<br />
károsodásokat és szeptikus shockot idézhet elő, vagy<br />
a fokozott katabolizmus következtében a sejtekből<br />
kiszabaduló fehérjék (pl. aktin monomerek) tüdőkárosodást<br />
okozhatnak, fokozva ezzel a betegség súlyosságát.<br />
A molekulacsoport fehérjéi hatásukat intracellulárisan,<br />
lokálisan és távoli célsejteken keresztül<br />
fejtik ki (autokrin, parakrin, endokrin módon). Jó<br />
néhány komponens funkcióját kevéssé vagy egyáltalán<br />
nem ismerjük. Az utóbbi évtizedben mind több<br />
elméleti kutatás és klinikai tanulmány foglalkozik a<br />
vérszérumból izolálható kis molekulatömegű peptidekkel<br />
és fehérjékkel, mert bizonyos betegségekben a<br />
betegekből nyert fehérjék spektruma az egészségesekéhez<br />
képest jellegzetes eltéréseket mutat, így vizsgálatuk<br />
ígéretes lehet pl. a daganatos folyamatok minél<br />
koraibb detektálásában.<br />
A kis molekulatömegű fehérjék csoportosítása<br />
Sokféle csoportosítás lehetséges, pl. molekulaszerkezet,<br />
méret, funkció szerint. Legkézenfekvőbbnek a<br />
11-4. táblázat. Kis molekulatömegű fehérjék biológiai szerepük szerinti csoportosítása<br />
Biológiai hatás<br />
proinflammatorikus mediátor<br />
antiinflammatorikus mediátor<br />
sepsismediátor?<br />
hidrofób molekulák transzportja, immunválasz<br />
akut fázis fehérje<br />
növekedési faktor<br />
endokrin funkció<br />
A csoport néhány jellegzetes molekulája<br />
IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-g<br />
IL-4, IL-10, IL-13<br />
prokalcitonin<br />
lipokalin molekulacsalád (a 1<br />
savanyú glikoprotein, retinolkötő<br />
fehérje stb.)<br />
a 1<br />
-antitripszin, a 1<br />
savanyú glikoprotein<br />
PDGF, EGF, FGF, VGF stb.<br />
peptidhormonok
Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása<br />
235<br />
betöltött biológiai szerep szerinti csoportosítás tűnik,<br />
de tudnunk kell, hogy a hasonló funkcióval rendelkező<br />
molekulák kémiai szerkezetükben lényeges eltéréseket<br />
mutathatnak. A legfontosabb csoportokat a<br />
11-4. táblázatban tüntettük fel.<br />
Célszerűnek látszik egy másik szempont szerinti<br />
csoportosítás is, ez a beosztás a molekulacsoport<br />
klinikai értékelését, jelző (marker) szerepét veszi figyelembe.<br />
A markermolekulák sokszor hasznos információt<br />
szolgáltatnak egy kóros állapot felismeréséről,<br />
lefolyásáról, a kezelés hatékonyságáról vagy egy<br />
szerv vagy szervrendszer funkciójáról még akkor is,<br />
ha azok biológiai szerepe kevéssé ismert. A 11-5. táblázatban<br />
a biológiai marker sajátság szerinti csoportosítást<br />
tüntettük fel.<br />
A kis molekulatömegű fehérjék „születése”<br />
Alapvetően kétféle mechanizmust kell megkülönböztetni:<br />
• Szintézis és aktiváció a sejtben és/vagy a sejten<br />
kívül.<br />
• A már kész fehérje degradációja, eliminációja<br />
során létrejött fragmensek keletkezése.<br />
A szintézis – a génátírás és a transzláció – sejten belül<br />
megy végbe, a létrejött polipeptidláncok aminosavsorrendje<br />
megfelel a kódoló génben tárolt információknak.<br />
Azonban az így megtermelt peptid, fehérje a<br />
legritkább esetben tölt be azonnal biológiai funkciót,<br />
előbb aktiválódnia kell. Az aktiválódásra a sejten belül<br />
vagy az extracelluláris térben kerül sor. Nagyon<br />
gyakran a késztermékhez képest az átírt fehérje nagyobb<br />
molekulatömegű, az aktiválódás útja ún. limitált<br />
proteolízis, kisebb fragmentumok enzimatikus<br />
lehasítása. Az aktiváció sokszor több lépésben zajlik,<br />
többszörös hasítással, pl. preproinzulin → proinzulin<br />
→ inzulin, vagy preproBNP → proBNP → NT-proBNP<br />
→ BNP. A BNP a natriuretikus peptidek családjába<br />
tartozik, az agyban és a szívben termelődik (a B az<br />
agyra -.brain - utal), de vérszintje elsődlegesen a szív<br />
bal kamra funkciójától függ. Az aktív hormon a BNP<br />
(32 aminosav), amely a pro-BNP-ből hasad le (inaktív<br />
molekula az NT-proBNP, 76 aminosav), a kiindulási<br />
preprohormon 134 aminosavat tartalmaz. Más<br />
aktivációs mechanizmusok is léteznek: foszforiláció,<br />
glikoziláció, di- vagy trimerizáció stb.<br />
A fehérjék inaktiválását és eliminációját is általában<br />
részleges proteolízis előzi meg, amely után a szérumban<br />
a degradációs termékek vagy szabadon keringenek<br />
és a vizelettel ürülnek, vagy nem specifikus<br />
(pl. albumin), ill. specifikus fehérjekötéssel (pl. szabad<br />
aktin-gelzolin) a májban vagy a RES-ben bomlanak<br />
le építőköveikre.<br />
A kis molekulatömegű fehérjék<br />
kimutatási lehetőségei<br />
Módszertani megközelítés<br />
A kimutatás irányulhat egy adott molekulatömegű<br />
csoportra vagy egy adott konkrét molekulára.<br />
Az előbbi esetben általában valamilyen elválasztásos<br />
módszert használunk, az utóbbiban a specifikusságot<br />
rendszerint a kérdéses fehérje, peptid ellen termeltetett<br />
antitest biztosítja. Az antitest alkalmazását össze<br />
lehet kötni előzetes szeparálással, pl. elektroforetikus<br />
elválasztással, és a detektálni kívánt antigént ezután<br />
jelzett antitestkomplexszel tesszük láthatóvá (Western<br />
blot, lásd 4. fejezet). Ezen kívül az antitesteket<br />
11-5. táblázat. Kis molekulatömegű fehérjék marker jelleg szerinti csoportosítása<br />
A marker információs értéke<br />
vesefunkció, filtráció<br />
sepsis korai diagnózisa, követése<br />
tumormarker<br />
lehetséges tumormarker<br />
uraemiás állapot<br />
csont-turnover<br />
A csoport néhány jellegzetes molekulája<br />
cisztatin C, b 2<br />
-mikoroglobulin<br />
prokalcitonin<br />
fehérje- és peptidhormonok<br />
5-30 kDa tömegű peptidek<br />
kis molekulatömegű fehérjék, parathormon<br />
kollagéndegradációs termékek
236 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
felhasználhatjuk immunanalitikai (elterjedt kifejezéssel<br />
immunoassay) módszerekben, ahol a specifikus<br />
detektálás egyben nagy érzékenységű mennyiségi<br />
meghatározást is lehetővé tesz. Az antitesteken kívül<br />
más, specifikus kötést, molekulaszerkezet-felismerést<br />
alkalmazó technika is ismert. Ezekben általában<br />
egy szilárd hordozón a detektálni kívánt fehérje valamilyen<br />
ligandja vagy a fehérjével kapcsolatba lépő<br />
egyéb molekula helyezkedik el, és a rendszeren átáramoltatjuk<br />
a mintát, ahol az megkötődik és kimutathatóvá<br />
válik (affinitásos elv). Jó példa erre a fehérje-chip<br />
technika, ahol egy chipen többféle affinitásos<br />
elvet is alkalmazhatunk, és több különböző fehérjét<br />
is detektálhatunk egyszerre, egy adott rendszerben. A<br />
másik érdekes új módszer a felszíni plazmonhullám<br />
rezonancia (surface plasmon resonance, SPR), ahol<br />
a szilárd fázis felületén létrejövő kötődés kinetikáját<br />
is monitorozhatjuk. A továbbiakban ismertetünk néhány<br />
példát mind az előzetes elválasztáson és/vagy<br />
előtisztításon, mind az antigén-antitest reakción alapuló<br />
kimutatási technikákra.<br />
Előzetes frakcionálást, dúsítást<br />
alkalmazó módszerek<br />
Ultraszűrés<br />
Kíméletes, nem denaturáló eljárás, ahol a mintából<br />
a nagy molekulatömegű komponenseket molekuláris<br />
szűrővel választjuk el a detektálni kívánt, általában<br />
kis koncentrációban lévő molekuláktól. Többféle<br />
eljárás használatos, de mindegyik lényege, hogy<br />
garantált pórusméretű membránon préselik át a<br />
mintát nyomáscellában, nitrogéngáz alkalmazásával<br />
vagy centrifugában a centripetális erő segítségével.<br />
Leggyakrabban 50 kDa pórusméretű membránt<br />
alkalmaznak, mert ennek segítségével a szérumban<br />
óriási mennyiségben jelen lévő albumin 95 - 98%-a<br />
eltávolítható. Léteznek 30, 20, 10, 5, 1 kDa pórusméretű<br />
membránok is, a tisztítást akár több lépcsőben<br />
is elvégezhetjük fokozatosan kisebb molekulaméretű<br />
szűrőt alkalmazva, így jól meghatározott molekulatömegű<br />
mintákat kaphatunk és analizálhatunk. A módszer<br />
előnye, hogy egyszerű, relatíve gyors, és a kinyert<br />
komponensek általában megőrzik biológiai aktivitásukat.<br />
A szűrők többször is felhasználhatók. Hátránya<br />
az eljárásnak az esetleges gyártási hibából adódóan<br />
vagy a felhasználás során létrejövő sérülés a membránon,<br />
amely a szeparálás biztonságát veszélyezteti.<br />
Ezen kívül a többszöri használat során – még az előírt<br />
tisztítási procedúrák betartásakor is – a fehérjék egy<br />
része adszorbeálódhat a membrán felületén és megváltozhat<br />
a szűrő áteresztőképessége.<br />
Méretkizárásos kromatográfia (gélszűrés)<br />
Szintén nem denaturáló eljárásként alkalmazható<br />
egyszerű módszer. A gél pórusméretének megválasztásával<br />
végezhetünk ún. sótlanítást vagy puffercserét,<br />
ill. kinyerhetjük az analizálni kívánt molekulaméret-tartományt.<br />
Az elúció monitorozását 280 nm-en<br />
való UV fotometriás detektálással végezhetjük, így a<br />
megfelelő molekulaméretű tartomány célzottan öszszegyűjthető<br />
a további analízisekhez.<br />
Acetonitriles (ACN) kicsapás<br />
Széles körben elterjedt egyszerű módszer a kis molekulatömegű<br />
fehérjék, peptidek dúsítására és a nagy<br />
mennyiségben jelen lévő nagyobb molekulatömegű<br />
szérumfehérjék eltávolítására. A szérumot 1:1 arányban<br />
elegyítik ACN-nel, majd centrifugálás után a felülúszót<br />
kinyerik és az oldószert elpárologtatják. A<br />
beszárított mintát trifluoroecetsavban veszik fel és<br />
HPLC oszlopon sótlanítják. Az így nyert eluátum<br />
közvetlenül alkalmas a peptidek tömegspektrometriás<br />
vizsgálatára.<br />
Perklórsavas (PCA) módszer<br />
Perklórsavas (PCA) kicsapás<br />
A rutin kromatográfiás módszereknél általában fehérjementesítésre<br />
használt kicsapásos eljárást Intézetünkben<br />
dolgoztuk ki a szérum savoldékony fehérjefrakciójának<br />
kinyerésére. Rendkívül egyszerű és jól<br />
reprodukálható technika, amely alkalmas a savas közegben<br />
oldódó molekulacsoport mennyiségi meghatározására<br />
és elválasztás, valamint specifikus detektálás<br />
után egyedi fehérjék azonosítására. A perklórsav<br />
a szérumalbumint majdnem 100%-ban eltávolítja, és<br />
a savas közegben az esetlegesen albuminhoz kötődő<br />
peptideket is oldatba viszi. Hátránya, hogy erősen denaturáló<br />
módszer és csak a pH
Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása<br />
237<br />
datban maradó fehérjefrakció vizsgálatára alkalmas<br />
(ez lehet előny is, hiszen valójában szelektív dúsítást<br />
jelent).<br />
A módszer kivitelezése:<br />
Reagensek:<br />
• 10 v/v %-os perklórsav vízben.<br />
• 9,13%-os kálium-hidroxid (frissen készítendő).<br />
• Kicsapás, minta nyerése:<br />
• Eppendorf-centrifugacsövekben végzik, a minta<br />
pl. vérszérum.<br />
• 500 μl szérum + 500 μl 10%-os PCA, vortexelés<br />
és inkubálás szobahőmérsékleten 10 percig.<br />
• Centrifugálás 13 000 fordulattal, 3 percig, majd<br />
300 μl felülúszó leszívása új csőbe.<br />
• 300 μl felülúszó + 200 μl 9,13%-os KOH, vortexelés,<br />
majd 10 perc állás szobahőmérsékleten,<br />
nyitott centrifugacsővel (a képződő gázok eltávolítására).<br />
• Centrifugálás 13 000 fordulattal, 3 percig, 300 μl<br />
felülúszó leszívása új csőbe – ez képezi a mintát.<br />
Az eljárással a perklórsav nagy része csapadék formájában<br />
eltávolítható és a neutralizált savoldékony frakció<br />
alkalmas mennyiségi meghatározásra és fehérjeelektroforetikus<br />
vizsgálatokra egyaránt.<br />
Mennyiségi mérések<br />
UV abszorbancia. A neutralizált mintát desztillált<br />
vízzel 10-szeresére hígítjuk, a fehérjekoncentrációra a<br />
peptidkötésre jellemző, 220 nm-en mért abszorbancia<br />
alapján következtethetünk. Standardként tisztított<br />
bovin albumint használhatunk, amelyet a mintához<br />
hasonló módon kezelt, de fehérjét nem tartalmazó<br />
közegben oldunk fel. Kvarcküvetták és kétsugaras fotométer<br />
használata kívánatos, ahol a csatornák közti<br />
különbséget levegőre korrigáljuk, a mintát levegővel<br />
szemben fotometráljuk. A javasolt albumin standard<br />
koncentráció: 20-100 mg/l-es tartomány.<br />
Az UV-fotometriás mérés kivitelezése egyszerű, de<br />
a mintában lehetnek 220 nm-en elnyelődést mutató<br />
egyéb molekulák is, pl. gyógyszerek, ezért érdemes a<br />
fehérjemeghatározást a következő módon is elvégezni:<br />
Festékkötési (Bradford-) reakció. A módszer lényege<br />
a Coomassie Brilliant Blue G 250 festék fehérjekötésén<br />
alapszik, az abszorbanciát 595 nm-en mérjük<br />
(lásd 2.. fejezet). A javasolt standard fehérjekoncentráció-tartomány<br />
szintén 20-100 mg/l.<br />
Perklórsavas (PCA) kicsapás kombinálása<br />
Western blot módszerrel<br />
A neutralizált minták alkalmasak SDS-PAGE-analízisre<br />
is. A Laemmli szerinti poliakrilamid-elválasztáshoz<br />
a savoldékony frakciókat 5-szörös töménységű<br />
mintapufferben vesszük fel a lehető legkisebb hígulás<br />
érdekében, az elválasztáshoz 15%-os gélkoncentrációt<br />
alkalmazva. A neutralizáláshoz használt kálium-hidroxid<br />
miatt a minták még elegendő káliumiont tartalmaznak<br />
ahhoz, hogy az szobahőmérsékleten az<br />
SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy részével oldhatatlan<br />
csapadékot képezzen. A problémát úgy oldhatjuk<br />
meg, hogy futtatás előtt újabb forralást végzünk, és<br />
a gélekre a kb. 50 °C-os vízfürdőn tartott mintákat<br />
melegen visszük fel. A futtatás után kombinált ezüstfestést<br />
alkalmazunk, a parallel gél fehérjéit nitrocellulózmembránra<br />
transzferáljuk.<br />
Az itt következő példában saját vizsgálatunkat mutatjuk<br />
be. Tejes blokkolást követően α 1<br />
savanyú glikoprotein<br />
(AGP-) ellenes nyúl primer antitestet és peroxidázzal<br />
jelölt antinyúl IgG-t használtunk, erősített<br />
kemilumineszcenciás (ECL) detektálást alkalmazva.<br />
A fényreakciót Kodak Image Station 2000R készülékkel<br />
fényképeztük le, amely alkalmas a kemilumineszcenciás<br />
jel mennyiségi értékelésére. A módszer<br />
részleteit lásd a 4. fejezetben. Egy reprezentatív kísérlet<br />
eredményét 11-15. és a 11-16. ábrán mutatjuk be.<br />
Az első gélen egészséges orvostanhallgatók savoldékony<br />
fehérjéinek elektroforetikus mintázata látható.<br />
A molekulatömeg-markerek alapján a 67 kDa magasságban<br />
alig láthatunk festődést, ami arra utal, hogy<br />
albumin a kicsapás során csak nyomokban maradt a<br />
11-15. ábra. Egészséges orvostanhallgatók savoldékony<br />
szérumfehérjéinek SDS-PAGE vizsgálata (ezüstfestés; baloldalt<br />
a molekulatömeg-markerek láthatók)
238 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-16. ábra. AGP kimutatása szeptikus betegek savoldékony<br />
fehérje frakciójából (ECL-detektálás; az oszlopdiagram<br />
az egyes sávok lumineszcenciaintenzitását mutatja<br />
relatív egységben; az ábra felső részén Western blot luminenszcenciaintenzitások<br />
1-9-ig)<br />
mintában. Jellegzetes, minden pásztán megtalálható<br />
csíkokat látunk a 40-60 kDa és a 20 kDa alatti tartományban.<br />
Az AGP-ellenes antitesttel sikerült a 43<br />
kDa-os markerrel azonos magasságban kemilumineszcenciás<br />
jelet detektálni. A Western blot analízist<br />
szeptikus betegek mintáiból is elvégeztük.<br />
A kemilumineszcenciás kvantitatív eljárás lehetőséget<br />
ad arra, hogy az egyes sávokban detektált<br />
fehérje antigén mennyiségeket egymással összevessük.<br />
Alkalmazhatunk belső referenciamintát is, pl.<br />
kevert szérumból nyert savoldékony frakciót, amelyet<br />
minden futtatáskor felviszünk, és a betegekre<br />
kapott ECL-intenzitásokat a referenciára kapott lumineszcenciára<br />
vonatkoztatjuk (ECL-hányados). Kísérletünkben<br />
a szeptikus betegek savoldékony frakciójának<br />
mennyisége az egészséges kontrollokra mért<br />
értékekhez képest 3-5-szörös volt. Ugyanúgy a Western<br />
blotra kapott kemilumineszcenciás jelek alapján<br />
a betegekben az α 1<br />
savanyú glikoprotein (AGP)<br />
mennyisége jelentősen megemelkedett, a mintákban<br />
az egyik legmarkánsabb sávot mutatva. A vizsgálatokkal<br />
megpróbáltunk a szervezet gyulladásos válaszreakciójára<br />
és az általános katabolizmusra jellemző<br />
mérhető, reprodukálható markert találni.<br />
Az immunoassay-kről, az automatizált módszerekről<br />
részletesen a 7. fejezetben olvashatnak. Itt egy proinflammatorikus<br />
citokin, a TNF-α meghatározásán keresztül<br />
mutatjuk be a kis molekulatömegű peptidek,<br />
fehérjék mennyiségi meghatározásának elvét és gyakorlatát.<br />
A polipeptidek rendszerint több antigéndeterminánssal<br />
rendelkeznek, ezért az ellenük termelt antitestek<br />
különböző epitópokhoz képesek kötődni. Két,<br />
egymástól eltérő helyen lévő epitópra specifikus monoklonális<br />
antitesttel a vizsgálni kívánt antigén detektálható<br />
és mennyisége is mérhető. Az eljáráshoz<br />
rendszerint szilárd fázist használnak, amelyhez az<br />
első antitestet hozzákötik. A mintával való inkubáció<br />
után mosási fázis következik, ezt egy újabb inkubáció<br />
követi, valamilyen érzékeny detektálást lehetővé tévő<br />
jelölőt hordozó (radioaktív izotóp, lumineszcens vegyület<br />
stb.) második antitesttel. Ismételt mosás után<br />
a szilárd fázis felületén kialakult „szendvicskomplex”<br />
jele mérhető, a jel nagysága arányos az antigén menynyiségével<br />
(telítési assay). Standardok alkalmazásával<br />
az antigén koncentrációja meghatározható. A módszer<br />
elvét a 11-17. ábra mutatja.<br />
Jelölőként a nem izotópos módszerek terjedtek el<br />
(fluoreszcencia, kemilumineszcencia), amelyek érzékenysége<br />
hasonló az izotópot alkalmazó módszerekéhez.<br />
Mint minden laboratóriumi vizsgálatnál, az<br />
immunoassay-knél is szükséges a minőség-ellenőrzés,<br />
ismert koncentrációjú kontrollok rendszeres mérésével.<br />
Az ábrán bemutatjuk a TNF-α automatizált<br />
11-17. ábra. Szilárd fázisú telítési immunoassay elve<br />
Egyedi fehérjék kimutatása immunanalitikai<br />
módszerrel (immunoassay)<br />
11-18. ábra. TNF-α kontrollkártyája, az adatok a célérték<br />
százalékában vannak feltüntetve. Immuno kemilumineszcenciás<br />
automatizált módszer
Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása<br />
239<br />
meghatározásának kontrollkártyáját. Az adatok azt<br />
mutatják, hogy a TNF-α a pg/ml-es tartományban<br />
megbízhatóan mérhető: a sorozatok közti pontatlanság<br />
variációs koefficiense 6,6%, az átlagos eltérés a<br />
célértéktől +7,2% (11-18. ábra).<br />
Intracelluláris polipeptid kimutatása<br />
szövettenyészeti sejtekből<br />
Prokalcitonin (PCT)<br />
A prokalcitonin mint a kalcitonin prohormonja<br />
egészségesek vérszérumában a kimutathatósági határ<br />
körül mozog. Körülbelül 10-15 éve fedezték fel, hogy<br />
szisztémás bakteriális és gombás fertőzéseknél (szepszis)<br />
a PCT szintje a vérben sokszorosára emelkedik.<br />
Az egyik leghatékonyabb stimulusnak az endotoxint<br />
találták, endotoxinexpozíció után már 4 óra múlva<br />
szignifikáns PCT-emelkedést regisztráltak. Ma a PCT<br />
szérumszintjének mérése a szepszis felismerésében<br />
az egyik legkoraibb és legmegbízhatóbb laboratóriumi<br />
marker. A nagyszámú irodalmi adat ellenére nem<br />
teljesen ismert a PCT fokozott kiáramlásának szöveti<br />
lokalizációja. A kérdés lehetséges megválaszolására<br />
mutatjuk be az Intézetünkben Hep G-2 májsejtkultúrán<br />
végzett kísérletünket.<br />
A vizsgálathoz monolayer sejtkultúrákat különböző<br />
koncentrációjú, a tenyésztő médiumban oldott endotoxin<br />
révén expozíciónak tettük ki. A 24 órás inkubáció<br />
után a sejteket mostuk és lizáltuk 0,1% Triton-X<br />
100-at tartalmazó PBS-sel. A lizátumok fehérjetartalmát<br />
meghatároztuk (Bradford szerint), majd a<br />
mintákból lumineszcenciás szendvics immunoassayvel<br />
mértük a prokalcitonin mennyiségét. A PCT-t a<br />
sejtek fehérjetartalmára vonatkoztattuk (μg/g). Eredményeink<br />
a 11-19. ábrán láthatók.<br />
11-19. ábra. Hep G-2 sejtek PCT-válasza endotoxinexpozícióra<br />
(Tf: tápfolyadék, az endotoxin a tenyésztő médiumban<br />
lett feloldva)<br />
Vizsgálataink azt mutatják, hogy a máj a PCT-válasz<br />
egyik lehetséges szöveti lokalizációja lehet. A paradoxnak<br />
tűnő fordított arányosság (endotoxin:PCT)<br />
okát egyelőre nem ismerjük.<br />
*<br />
A kis molekulatömegű szérumfehérjék óriási palettája<br />
áll rendelkezésre a laboratóriumi diagnosztikában<br />
és a kutatásban. Ez a terület az analitikai módszerek<br />
finomodásával egyre több lehetőséget ad a patofiziológiás<br />
folyamatok jobb megértésére és a betegségek<br />
minél koraibb diagnosztikájára.<br />
Irodalom<br />
Buijs, J., Franklin, G. C.: SPR-MS in functional proteomics.<br />
http://www.google.hu/search?source=ig&hl=-<br />
hu&rlz=1G1GGLQ_HUHU408&=&q=Jos+Buijs-<br />
+and+Gary+C.+Franklin&btnG=Google+keres%C3-<br />
%A9s&aq=&oq<br />
Flower, D. R.: The lipocalin protein family: structure and<br />
function. Biochem. J. 318:1-14, 1996.<br />
Kőszegi T., Kéri Gy., Molnár Zs. és mtsai: Szisztémás<br />
fertőzés monitorozása a szérum procalcitonin szint és<br />
a keringő kismolekulasúlyú fehérjék analízisével. Focus<br />
Medicinae 2:38-43, 2000.<br />
Kőszegi, T.: Immunoluminometric detection of human<br />
procalcitonin. J. Biochem. Biophys. Methods 53(1-<br />
3):157-164, 2002.<br />
Lee, P.-S., Patel, S. R., Christiani, D. C. et al.: Plasma<br />
Gelsolin Depletion and Circulating Actin in Sepsis - Pilot<br />
Study. PLoS ONE 3(11):e3712.<br />
Liu, C., Wang, H., Pan, C. et al.: Serum protein fingerprint<br />
of patients with gastric cancer by SELDI technology. African<br />
Journal of Biotechnology 9(15):2298-2304, 2010.<br />
Merrell, K., Southwick, K., Graves, S.W. et al.: Analysis<br />
of Low-Abundance, Low-Molecular-Weight Serum<br />
Proteins Using Mass Spectrometry. J. Biomol. Tech.<br />
15(4):238–248, 2004.<br />
Moore, D. F., Rosenfeld, M. R., Gribbon, P. M. et al.<br />
:Alpha-1-acid (AAG, orosomucoid) glycoprotein: interaction<br />
with bacterial lipopolysaccharide and protection<br />
from sepsis. Inflammation 21(1):69-82, 1997.<br />
Tirumalai, R. S., Chan, K. C., Prieto, D. A. et al.: Characterization<br />
of the Low Molecular Weight Human<br />
Serum Proteome. Mol. Cell Proteomics 2:1096-1103,<br />
2003.<br />
Purification of Serum Peptides for Biomarker Research<br />
with Amicon Ultra Centrifugal Filters (http://www.millipore.com/techpublications/tech1/6djqfn)
240 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Sejtes elemek differenciálása:<br />
flow citometria – Bevezetés<br />
a flow citometriába<br />
Magyarlaki Tamás<br />
Definíciók és célkitűzések<br />
A flow citometria (FCM) vagy áramlási citometria<br />
igen hatékony méréstechnika, amellyel heterogén<br />
összetételű sejtpopulációkban lévő egyedi sejtek multiplex<br />
paramétereit mérhetjük. A flow citométerek<br />
(az áramlási citométerek) sokféle szerepkörben alkalmazhatók:<br />
immunfenotipizálásban; sejtszámlálásban<br />
(volumetriás vagy mikrogyöngyös módszerrel);<br />
DNS-ploiditás és funkcionális marker vizsgálatokban<br />
(pl. daganatos sejtek in vitro multidrog-rezisztencia<br />
vizsgálatában, növekedési faktor, ill. citokinreceptor-expresszió<br />
kimutatásban stb.). Az expresszió mérésére<br />
az ún. átlag fluoreszcencia (mean fluorescent<br />
intensity, MFI) értéket alkalmazzuk, amely a sejtek<br />
„egészséges” vagy „kóros” állapotát hivatott kimutatni.<br />
Az áramlási citometria során olyan mérést végzünk,<br />
melynek során másodpercenként több ezer<br />
sejt egymást követve keresztezi a lézerfény útját, és<br />
a keletkezett szórt fényt minden egyes sejtről egyenként<br />
tudjuk begyűjteni analízis céljára. Ennyi adatot<br />
természetesen csak számítógép segítségével lehet begyűjteni<br />
és FCM analízis szoftver segítségével statisztikailag<br />
elemezni. Az adatokból nyert eredmények<br />
információt adnak a következőkről:<br />
• A vizsgálati minta egyes sejtjeinek és összességüknek<br />
mérete (size).<br />
• A sejtek belső összetettsége (complexity).<br />
• Sejfelszíni fehérjék (phenotype).<br />
• Esetenként a sejt- vagy sejtfelszíni fehérjék<br />
működéséről, ill. állapotáról (funcional expression).<br />
E rövid ismertetőben áttekintjük, hogyan is működnek<br />
az áramlási citométerek? Hogy detektáljuk a sejtekről<br />
érkező különböző szórt fény típusokat (forward<br />
scatter: FSC; side scatter: SSC; fluorescent scatter: FL)<br />
a készülék különböző optikai csatornáin. Miként lehet<br />
kezelni a keletkezett rengeteg adatot? Hogyan is<br />
vizsgálhatók specifikus fehérjék egyedi sejtekhez kötötten<br />
az FCM segítségével a kutató és klinikai laboratóriumi<br />
munkákban?<br />
Műszeres áttekintés<br />
A 11-20. ábrán sematikusan mutatjuk be a flow citométer<br />
elsődleges rendszerét, az egyes alkotórészeket.<br />
az alábbiak:<br />
• Folyadékrendszer (centrális csőszerű alkatrész a<br />
függőlegesen beinjektált sejtekkel és a köpenyfolyadékkal).<br />
Ez a rendszer hivatott biztosítani a<br />
minta sejtjeinek átfolyását („hidrodinamikai<br />
fokuszálás” ) úgy, hogy e sejtek külön-külön is<br />
mérhetők legyenek (innen származik az áramlási<br />
citométer név is!).<br />
• Lézerek, a látható- és fluoreszcens fény forrásaként.<br />
• Optika, amely összegyűjti és elvezeti a látható a<br />
fluoreszcens fényt.<br />
• Detektorok, amelyek fogadják az egyes fénynyalábokat.<br />
• Elektronikai és perifériás számítógéprendszer (a<br />
komputer alakítja át a detektorokról jövő szignálokat<br />
digitalizált adatokká, és ez végzi a szükséges<br />
elemzést is).<br />
11-20. ábra. Az áramlási citometria (FCM) működésének<br />
elve<br />
(IP: centrális zöld pont, sejtek, köpenyfolyadék; FSC: forward<br />
scatter, előreszórás; SSC: side scatter, oldalszórás;<br />
FL1, FL2, FL3: fluoreszcens csatornák)
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába<br />
241<br />
A „találkozási pont” (interrogation point, IP) alkotja<br />
a rendszer „szívét”. Ez az a pont, ahol a minta sejtjei<br />
találkoznak a lézersugárral (a lézer a sejteket tartalmazó<br />
folyadékáramot 90°-ban merőlegesen éri!). Az<br />
ütközésből keletkező látható és fluoreszcens fényszórást<br />
az optika gyűjti be.<br />
A legtöbb flow citométerben a beinjektált sejtes<br />
mintákat az áramló sheath-folyadékkal vagy fiziológiás<br />
sóoldattal fokuszálják kb. egy sejtsorátmérőnyi<br />
széles sejtáramra, ezzel megelőzve a „sejttorlódást” és<br />
a gyakori kapillárisdugulást.<br />
Nézzük, hogy milyen mérettartományban tudunk<br />
az FCM-mel mérni? Az FCM-ek általában 3 nagyságrendnyi<br />
részecskeméretben képesek mérésekre: a<br />
legtöbb FCM hematológiai és immunológiai applikációban<br />
az 1-15 μm-es vérsejttartományban működik<br />
(PLT: 2-4 μm, RBC: 6-7 μm, lymphocyta (Ly: 8 μm,<br />
granulocyta (Gran): 12 μm, monocyta (Mo): 14 μm).<br />
Azonban speciális igények esetén kisebb tartományban<br />
(baktériumok: 0,5 μm, mikropartikulumok vagy<br />
mikrovezikulumok: 0,1-1 μm) vagy nagyobb mérettartományban<br />
(tumorsejtvonalak: 20-50 μm, blastocysta:<br />
100 μm) is mérhetünk.<br />
szórt fény kerül mérésre. Mivel a kis sejtek kisméretű,<br />
a nagy sejtek nagyméretű FSC feszültségimpulzust<br />
keltenek, ezért a regisztrált feszültségpulzusok arányosak<br />
az átfolyó sejtek méretével. Ha ezt egy hisztogramon<br />
ábrázoljuk, a kis sejtek balra, a nagy sejtek<br />
jobbra esnek a diagramon (11-21. ábra).<br />
Az FSC hisztogram tipikus egydimenziós méreteloszlási<br />
populációs diagramnak felel meg.<br />
Side scatter (SSC)<br />
Amint ezt láthattuk, a sejteket érő fényszórást nem<br />
csak elölről, de más irányokban is megfigyelhetjük.<br />
Azt a fényszórást, amely nagyobb szögből (általában<br />
90°) detektálható, megegyezés szerint oldalszórásnak<br />
(side scatter, SSC) nevezzük. Az SSC a sejtek szemcsézettségével<br />
(citoplazmagranulumok) és a sejten<br />
belüli struktúrák összetettségével (nagyrészt a sejtmag<br />
alakjával) áll összefüggésben. Az SSC nagysága<br />
arányos a sejtek strukturális komplexitásával. Az SSC<br />
fényt optikai lencsék és tükrök „szállítják” a lézernyalábra<br />
rendszerint merőlegesen (90°-ban) elhelyezett<br />
detektorokhoz. A jeleket az SSC detektor hisztogramokká<br />
alakítja (11-22. ábra).<br />
Az egyes sejtek lézeres vizsgálata<br />
Az FCM módszer alkalmas az egyes sejtek folyadékáramban<br />
lézerrel való vizsgálatára: amint egy-egy sejt<br />
áthalad a lézer előtt, a fény fel-felvillanva töredezik/<br />
szóródik a tér összes lehetséges irányában:<br />
Forward scatter (FSC)<br />
Előre történő (pontosabban 0° körüli) szórás az a<br />
fénypászta, amelyet az elölről (a „lézerrel szemben”)<br />
detektálunk. Az FSC nagysága arányos a sejt nagyságával,<br />
így a FSC paramétert a sejtnagyság mérésére<br />
tudjuk alkalmazni. De hogyan lehetséges a „lézerrel<br />
szemben” sejt eredetű fényszórást mérni? Az FSC<br />
fényt az FSC-detektor felfogja, majd a fényintenzitást<br />
elektromos feszültségimpulzussá alakítja. A legtöbb<br />
FCM-ben a detektort a lézerfény direkt hatásától az<br />
ún. obscuration bar (OB) védi, amelyet közvetlenül az<br />
FS-detektor elé helyeznek. Az OB részlegesen befedi<br />
az FS-detektor elülső központi részét, megvédve azt a<br />
közvetlen lézersugárzástól. Amint az FS lézerfény eléri<br />
az F-detektort, a fény az OB körül (alacsony fokban,<br />
2-3°) szóródik, így kizárólag a sejtekről származó<br />
11-21. ábra. Flow citométeres vizsgálat hisztogramja<br />
11-22. ábra. SSC hisztogram-
242 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Multiparaméteres (többparaméteres)<br />
analízis perifériás vérsejteken (PBC)<br />
Színjelöléssel való kapuzás (colour gating)<br />
Az eljárás lényege, hogy „színjelöléssel való kapuzás”<br />
(colour gating) segítségével kombináljuk az 1D<br />
hisztogramokat: az 1D hisztogramok (FSC, SSC) – a<br />
korábban bemutatott „szürke” formátumban – nem<br />
feltétlenül képesek ábrázolni a sejtpopulációk összetettségét<br />
(összegzett, szummált képet adnak). Például<br />
az olyan sejtcsoportokból, amelyek a „szürke” diagramokon<br />
az egyik dimenzióban homogénnek tűnhetnek<br />
(lásd 11-21. ábra: FSC) [egy színes hisztogram<br />
alkalmazásával, amely „áttükrözi” egy másik dimenzióból<br />
(11-23b ábráról: SSC) az ott sokkal inkább elkülönülő,<br />
eltérő színekkel ábrázolt populációkat], az<br />
egységesnek tűnő „szürke” hisztogramon belül színekkel<br />
láthatóvá tehetők az „egyébként átfedő” sejtpopulációk<br />
(11-23a ábrára: FSC). A 11-23. a ábrán<br />
jól láthatók a piros-zöld-kék színnel elkülönített<br />
(„colour-gated”) lymphocyta-monocyta-granulocyta<br />
(Ly-Mo-Gran) sejtcsopotok.<br />
A 11-23. b ábrán az SSC színes hisztogram dimenziójában<br />
ugyanazok a sejtek (Ly-Mo-Gran) természetesen<br />
azonos színekben jelennek meg, ami lehetővé<br />
teszi azonos populációk eltérő tulajdonságainak<br />
szimultán vizsgálatát.<br />
11-23. ábra. Multiparaméteres analízis<br />
a) Színjelöléssel láthatóvá tett lymphocyta-monocyta-granulocyta<br />
sejtcsoportok; FSC hisztogram<br />
b) Colour gating segítségével készült színes SSC hisztogram<br />
11-24. ábra. Felhődiagram (az FSC és SSC diagram egyesítése)<br />
Színes dot plot (felhődiagram)<br />
Elegánsabb grafikai megoldás, ha a két (FSC és<br />
SSC) hisztogaramot egyesítjük egy 2D pont diagramban,<br />
amelyet színes dot plot-nak („felhődiagram”-nak)<br />
is nevezünk (11-24. ábra): látszik, hogy az<br />
egyesítéshez az SSC hisztogramot egyenes állásban<br />
(X-tengelyhez), az SSC hisztogramot 90°-ban balra<br />
elforgatva (Y-tengelyhez) kell illesztenünk, hogy<br />
a megfelelő színű Ly (vörös), Mo (zöld), Gran (kék)<br />
sejtpopulációk ponthalmazai („felhőkép”) azonos kapuba<br />
kerüljenek.<br />
Íme két emberi vérminta felhődiagram fehérvérsejt-alcsoportjai<br />
az FCM-en:<br />
• Lymphocyták (Ly) kis sejtek (FSC) minimális<br />
belső komplexitással (SSC).<br />
• A monocyták (Mo) kissé nagyobbak (FSC)<br />
mérsékelt belső komplexitással (SSC).<br />
• Granulocyták (Gran), nagyobb a sejtméretük<br />
(FSC) és kifejezett a komplexitásuk (polimorfonukleáris<br />
mag + citoplazmagranuláció). Több<br />
csoportjuk van:<br />
- Neutrophilek. Általában a granulocyták legtömegesebb<br />
képviselői (a 11-25a ábrán: Neu:<br />
narancs).<br />
- Eosinophilek (Eo).<br />
- Basophilek (Ba).<br />
E két utóbbi kisebb granulocytacsoport FCM-en csak<br />
ritkán látható elkülönülten (11-25. ábra a).<br />
SSC-CD45-kapuzás<br />
A felhődiagramokon nem mindig különülnek el egyértelműen<br />
az egyes sejtcsoportok (mint már láttuk, az<br />
Eo és a Ba populációk normál mintákon sem mindig
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába<br />
243<br />
azonosíthatók, patológiás mintákon pedig gyakori az<br />
„átfedés” pl. myeloproliferativ vagy myelodysplasiás<br />
kórképekben, valamint gyakori a normálistól eltérő<br />
új populációk, vagyis blastok, lymphomás kóros sejtek<br />
megjelenése). Ezen segít a SSC-CD45-kapuzási<br />
technika (SSC-CD45-kapuzás): ebben az esetben a<br />
szokásos SSC paraméter (x tengely) mellett egy kiegészítő<br />
fluoreszcens (FL: y tengely) monoklonális<br />
antitest jelölést, a CD45, pán-leukocyta-antigén jelölést<br />
alkalmazzuk (a fluoreszcens jelölési technika<br />
részleteit később a Fluoreszcencia fejezetben tárgyaljuk).<br />
Ha előzőleg a felhődiagramon (11-25. ábra a)<br />
helyesen kapuztuk az egyes populációkat (Ly: vörös,<br />
Mo: zöld, Neu: narancs), akkor a koherens csoportok<br />
(Ly-Mo-Neu) azonos, „tiszta” színekben jelennek<br />
meg a SSC-CD45-kapuzásban is (11-25. ábra b).<br />
Blast ablak (BL)<br />
Az SSC-CD45-kapuzás igen hasznos „mellékterméke”,<br />
hogy a CD45-negatív, alacsony SSC-vel bíró<br />
sejttörmeléket (kevés pont középen és lent az x tengelyen<br />
a 10°-10 1 log közötti régióban) leválasztja a<br />
mérni kívánt sejtektől (az utóbbiak füzéralakban középen).<br />
Talán még lényegesebb előny, hogy a leírt részecskeeloszlás<br />
kapcsán alakuló pontdiagramon egy<br />
központi (normálisan) jelmentes terület válik azonosíthatóvá,<br />
az ún. blast ablak (BL: blast window),<br />
amely patodiagnosztikai szempontból lehet igen fontos.<br />
A normális sejtek helyét (a bemutatott vérmintában<br />
minimális sejtaránnyal szemben, lásd 11-25.<br />
ábra b, ahol a BL: 0,4%) kóros állapotokban (leukaemiák,<br />
lymphomák) éretlen, blastos sejtek foglalhatják<br />
el, amelyek jelenléte támogathatja a diagnózist, ill. e<br />
sejtek további fenotípusvizsgálatra kikapuzhatók.<br />
A flow citometriában a multiparaméter-analízis<br />
tekinthető a legfőbb diagnosztikai vívmánynak. Így<br />
tudjuk a kóros sejtek egyedi tulajdonságait szimultán<br />
mérni (sejtes koexpressziók) és diagnosztikai értékű<br />
hematológiai, ill. immunológiai információkat gyűjteni.<br />
Fluoreszcencia<br />
Nézzük, hogy ha a látható fény sejtes szórási paraméterei<br />
mellett a fluoreszcens fény vizsgálatát is bevetjük,<br />
milyen további strukturális és funkcionális adatokat<br />
nyerhetünk sejtjeinkről?<br />
Az áramlási citometriában a sejtek fluoreszcens jelölése<br />
révén azok differenciálódási fehérjéit (CD: cluster<br />
of differentiation) vizsgáljuk. A vizsgálatokhoz az<br />
e fehérjékhez kapcsolódó fluoreszcens molekulával<br />
konjugált monoklonális antitesteket (moat) alkalmazunk.<br />
A fluorofór (fluoreszcenciát hordozó molekula)<br />
lézerrel gerjesztett emissziós fluoreszcenciáját mérjük.<br />
A monoklonális antitestek CD osztályozása lehetővé<br />
teszi, hogy a sejtes differenciálódás fehérje antigénjei<br />
között egységes logikai rendszer szerint tudjunk dolgozni.<br />
Itt csak utalunk arra az információtömegre,<br />
amely a CD moat reagensek tulajdonságaival és diagnosztikai<br />
alkalmazhatóságával kapcsolatban az interneten<br />
elérhető (lásd irodalom).<br />
A vérminta egyedi sejtjeinek FCM (áramlási citometriai)<br />
morfológiai parmétereit (FSC és SSC) első<br />
11-25. ábra. SSC-CD45-ös kapuzási technika<br />
a) Emberi vérből készült felhődiagram fehérvérsejt-alcsoportjai [lymphocyta (Ly): vörös; monocyta (Mo): zöld; neutrophil<br />
(Neu): narancs]<br />
b) SSC-CD45-ös kapuzással készült diagram (BL: blast ablak)
244 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
menetben „festetlen” formában vizsgáltuk (1. tesztcső:<br />
autofluoreszcencia) 2D felhődiagramokon.<br />
A további csövekben (2-tól n-ig tetszőleges számú<br />
„festett mintában”: fenotípuspanelben) monoklonális<br />
antitest festéseket is alkalmazunk. Az egyes tesztcsövekben<br />
akár 2-3 vagy több eltérő színű fluorofór jelölt<br />
monoklonális antitestet együtt is alkalmazhatunk: ez<br />
a kombinált színjelölés (11-26. ábra).<br />
Példa egy tipikus hármas színjelölési kombinációra:<br />
a FITC: fluoreszcens izotiocianát (zöld), a fikoeritrin<br />
(PE, vörös) és a peridinin-klorofill-protein komplex<br />
(PerCP, kék) fluorofór konjugátumokat alkalmazhatjuk<br />
a monoklonális antitesteken.<br />
11-26. ábra. Fluoreszcens jelölés alkalmazása vérminta<br />
egyedi sejtjeinek vizsgálatában. A sejtek FCM morfológiai<br />
paramétereinek vizsgálata (magyarázat a szövegben)<br />
11-27. ábra. FCM morfológiai paraméterek vizsgálata hármas<br />
fluoreszcens színjelöléssel<br />
A fluoreszcencia elméleti alapjai<br />
De miként lehet ezeket az eltérő fluoreszcens színemissziókat<br />
(általában FL1: zöld, FL2: piros, FL3:<br />
kék) létrehozni (gerjeszteni) és sejtszinten elkülönítve<br />
mérni? A flow citometria ideális eszköz erre a célra<br />
is. Hogy jobban megértsük az FCM fluoreszcens<br />
technikáját, a fluoreszcencia elméleti alapjaihoz kell<br />
visszatérnünk.<br />
Energiaállapot. A (lézer)fény általi gerjesztés (excitatio)<br />
során a fluorofórmolekula magasabb energiaszintre<br />
emelkedik, majd egy gyors (10 -15 s) és egy<br />
viszonylag lassabb (10 -9 s) visszatérést követve ismét<br />
eléri az alapállapotot. Ezenközben az első fázisban<br />
hőtermelés, a másodikban fénykibocsátás (emissio)<br />
kapcsán távozik a befektetett gerjesztő energia. Az<br />
emissziónak (a hőveszteség miatt) természetesen<br />
kisebb az energiája, nagyobb a hullámhossza (Stokes-shift),<br />
és természetesen az emissziós fény színe<br />
eltér az excitációs fény színétől. Ez a fizikai tény ad<br />
alapot a gerjesztő fényforrás (FCM esetén lézer) és<br />
a sejtjelölő fluorofór (a konjugált monoklonális antitest)<br />
emissziós spektrumának elkülönítésére. Azaz a<br />
jelölt sejt eltérő színben fluoreszkál, mint a gerjesztő<br />
lézer. Az egyes fluorfórok emissziós színe is eltér egymásétól<br />
(11-27. ábra).<br />
Fluoreszcens mérés az FCM-ben<br />
A PBC sejtmintánkban mérendő - fluorofór konjugált<br />
monoklonális antitestekkel festett - sejtek először<br />
is a hidrodinamikusan fokuszált áramlatban<br />
ütköznek a lézernyalábbal, és minden irányban fényszórást<br />
okoznak. A fluorofórok, amelyek az egyes<br />
sejteken utaznak („jelölés”), a lézer fluoreszcens fénye<br />
által azonos hullámhosszon (általában 488 nm)<br />
gerjesztődnek, és szinte azonnal eltérő (fluorofórspecifikus)<br />
hullámhosszokon emittálják a fényt. A fluoreszcens<br />
fényszóródási jel (amely magában foglalja az<br />
egyes fluorofórok által emittált, egymástól eltérő színeket<br />
és ennek megfelelő hullámhosszakat) azután<br />
továbbutazik a műszerben (90°-os szögben elvezetve<br />
optikai filterek és tükrök révén), hasonlóképpen mint<br />
ahogy ezt az SSC szignál esetében már leírtuk (11-28.<br />
ábra).<br />
A megfelelő optikai filterek és tükrök a heterogén<br />
hullámhosszú szórt fluoreszcens fényjeleket azután a<br />
megfelelő hullámhosszakat kimutató detektorokhoz<br />
(FL1, FL2, FL3) osztják le.<br />
A fluoreszcens fényjelekből elektronikus impulzusok<br />
(voltage pulse) és a továbbiakban digitalizált<br />
komputeradatok (data), valamint diagramok (hisztogram,<br />
dot plot) keletkeznek, csakúgy, mint ahogy
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába<br />
245<br />
11-28. ábra. Fluoreszcens mérés az FCM-ben<br />
ezt az FSC- és SSC-detektálás kapcsán ezt korábban<br />
leírtuk. A fluoreszcensen jelölt sejtcsoportokban az<br />
intenzívebben festődő sejtek („bright”) több sejtfelszíni<br />
jelölődést (ennek megfelelően több sejtfelszíni<br />
fehérjemolekulát), a kevésbé festődők („dim”) kevesebb<br />
sejtfelszíni molekulát hordoznak. Az előbbi<br />
jobbra, az utóbbi balra halmozódik mint elektromos<br />
impulzusjel („voltage pulse” signal) az FL-hisztogramon<br />
(11-29. ábra a).<br />
Az egyes elektromos impulzusjeleket a komputer<br />
elektronikus programja lesimítja a hisztogramokon.<br />
Ennek megfelelően a legtöbb regisztrált fluoreszcens<br />
hisztogram szabályos, közel Gauss-szerű eloszlást<br />
mutat, amelyre jellemző egy többnyire középponti<br />
helyzetű maximális eseményszám (Mean Fluorescent<br />
Intensity, MFI), amelyet alulról és fölülről szimmetrikusan<br />
vesznek körül az alacsonyabb, ill. magasabb<br />
MFI-vel (festődési intenzitással) jellemezhető csökkenő<br />
számú „széli mérési események” (11-29. ábra b;<br />
itt kb. 10°:1 felel meg az MFI-nek az FL1 Log skálán).<br />
Kombinált színjelölés („multicolour labeling”)<br />
A megfelelő színkombinációhoz először is ismernünk<br />
kell az alkalmazandó fluorofórok excitációját és<br />
emissziós spektrumát (11-30. ábra).<br />
Az FITC és a PE gyakran szerepel kettős festési<br />
kombinációkban, ill. gyakori a hármas kombinációként<br />
ezekkel együtt alkalmazott PC5. E fluorofóroknak<br />
közös az excitációs hullámhossza (488 nm hullámhosszúságú<br />
kék argonlézer). Amint az excitációt<br />
biztosító lézer mindhárom fluorofórt az FCM-ben<br />
egyidejűleg stimulálja, akkor az emittált fény háromféle<br />
hullámhossznak megfelelően jelenik meg (FITC:<br />
520 nm: zöld, PE: 580 nm: sárga, PC5 (fluorokróm<br />
R fikoeritrin-cianin 5.1): 670 nm: bordó), így a specifikus<br />
emissziók külön-külön gyűjthetők. Ha ezek<br />
a spektrális maximumok közel esnek egymáshoz,<br />
előfordul, hogy hullámhosszátfedések zavarhatják a<br />
fluorofórok specifikus emisszióinak szelektív begyűjtését<br />
(„spectral overlap”). Ilyen átfedő hullámhosszterületek<br />
előfordulnak az FITC és PE emissziók ese-<br />
11-30. ábra. Kombinált színjelölés (multicolour labeling)<br />
alkalmazása a fluoreszcenciás mérés során<br />
11-29. ábra. Fluoreszcens jelölésű sejtekről készült hisztogram<br />
a) A fluoreszcenciásan jelölt sejtek által előidézett elektromos impulzusjelek szétválása a hisztogramon a sejtek festődésének<br />
mértéke szerint<br />
b) Az impulzusjelek számítógépes átalakítása révén létrejött hisztogram alak
246 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
tében is (a 11-30. ábrán sötét vonalak alatti területek<br />
a FITC, ill. PE görbén), ezek azonban, ha nem érintik<br />
a maximális emissziós hullámhosszakat, akkor kompenzációs<br />
technikával elektronikusan eltávolíthatók<br />
(a részleteket később tárgyaljuk).<br />
Az egymástól távol eső emissziós maximumú<br />
diszkrét emissziós spektrumok esetén, mint pl. PC5<br />
az FITC-vel vagy PE-vel kombinálva nincs hasonló<br />
gond. A hármas és négyes színkombinációk mindennapossá<br />
váltak az FCM-es rutin laboratóriumokban,<br />
ahol általában 1 vagy 2 lézerrel működő flow citométerek<br />
működnek. Újabban a tudományos kutatólaboratóriumokban<br />
akár 10 feletti színkombináció<br />
is elérhető (több szimultán lézerrel rendelkező flow<br />
citométereket alkalmazva). A közeli jövőben ezek is<br />
minden bizonnyal bevezetésre kerülhetnek a rutin laboratóriumokban.<br />
Kétszínű dot plot analízis<br />
Ha két szín kombinációs kísérletet végzünk, ennek<br />
értékeléséhez kvadránsdiagramokat használhatunk,<br />
amelyeken négyféle populáció látható (11-31. ábra a).<br />
• Csak vörös (bright) fluoreszcens sejtek (A1<br />
kvadráns: CD8-PE) a bal felső sarokban (UL:<br />
upper left).<br />
• Csak sárga(bright) fluoreszcens sejtek (A4 kvadráns:<br />
CD4-FITC) a bal alsó sarokban (LR):<br />
lower left).<br />
• Kettős pozitív sárga + zöld sejtek (A2 kvadráns:<br />
CD8-PE+CD4-FITC) a jobb felső (UR: upper<br />
right).<br />
• Kettős negatív sejtek(A3 kvadráns: alacsony<br />
intenzitású „dim” CD8-PE és CD4-FITC),<br />
melyek a bal alsó kvadránsban (LL: lower left).<br />
Normál vér vizsgálatakor (lásd 11-31. ábra a) ez az eloszlás<br />
jellemző az egymás markerexpresszióit kizáró,<br />
un. exkluzív CD4 és CD8 humán perifériás lymphocytapopulációkra<br />
(PBC), azaz gyakorlatilag nincs<br />
CD4 + CD8 kettős pozitív populáció (az A2-kvadráns<br />
mindössze 0,4%).<br />
Ezzel szemben patológiás esetekben (11-31. ábra<br />
b) – például egy LGL-lymphoproliferatív szindrómában,<br />
ahol a kóros sejtek LGL (large granular lymphocyte)<br />
morfológiát mutatnak - már szignifikáns menynyiségű<br />
CD4 + CD8 kettős pozitív (A2 kvadránsban<br />
30%) lymphocyta található, és ennek az eredménynek<br />
akár diagnosztikai jelentősége lehet.<br />
11-31. ábra. Kétszínű dot plot analízis<br />
a) Kétszínű dot plot analízis kvandránsdiagramja egészséges<br />
személy lymphocytáit vizsgálva<br />
b) Kétszínű dot plot analízis kvandránsdiagramja LGL<br />
lymphoproliferativ szindrómában szenvedő beteg lymphocytáiról<br />
Optikai filterek (fényszűrők)<br />
Excitációs (gerjesztési) és/vagy emissziós filtereket<br />
kombinációban alkalmazunk a fluorofórok specifikus<br />
gerjesztésére és emissziós hullámhosszainak<br />
begyűjtésére. Ezt a célt az excitációs filterek a gerjesztő<br />
fényforrás (lézer) legeffektívebb hullámhosszának<br />
szelektív átengedésével, az emissziós filterek pedig a<br />
fluorofór specifikus emissziójából a legintenzívebb<br />
hullámhosszú fény kigyűjtésével érik el (11-32. ábra).<br />
A band pass filterek olyan optikai filterek (fényszűrők),<br />
melyek önmagukban képesek a fluorofórmolekulák<br />
fényemissziós csúcs hullámhosszait (peak<br />
emissions) kiszűrni (band pass emissziós filterek).<br />
Emellett egyes band pass filterekkel megoldhatjuk,<br />
hogy ha a gerjesztő fény túlzottan széles, nem specifikus<br />
spektrummal rendelkezik (pl. halogén fényforrás<br />
esetén) kizárólag a fluorofórokat specifikusan<br />
gerjesztő monokromatikus hullámtartomány jusson<br />
át a készülékbe (band pass excitációs filterek). Minden<br />
erőfeszítésünk ellenére a legtöbb fluorofór excitációs
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába<br />
247<br />
11-32. ábra. Optikai filter<br />
alkalmazásával készült diagramok<br />
és emissziós spektruma sajnos nem jól körülhatárolható<br />
csúcsokból, hanem gyakran meglehetősen széles<br />
hullámhossztartományban terpeszkedő, szabálytalan<br />
alakú görbékből áll. A spektrális fluorofór emissziós<br />
csúcsok centrális pontjai általában jól körülhatárolhatók<br />
(pl. 520 nm az FITC-re és 580 nm a PE-re). Azonban<br />
pl. az emissziós band pass filterek kiszűrt hullámhossztartományának<br />
szélessége (width) is van (pl. 530<br />
± 30 és 585 ± 42 nm az FITC-, ill. PE-filterekre vonatkozóan).<br />
Ha ez tartalmazza a centrális pontot (PE<br />
brand pass filterre ez 564-606 nm, amely alkalmas<br />
a PE fluorofór 580 nm-es csúcs kiszűrésére) és nem<br />
szűr ki túl széles tartományt (PE: 585 ± 21 nm), akkor<br />
a filter alkalmas a méréshez.<br />
Másfajta filterek is vannak, amelyek párokban<br />
használatosak, ezek a long és short pass filterek. A short<br />
pass filterek bizonyos hullámhossz alatt (cut-off pont<br />
pl. 550 nm), a long pass filterek bizonyos hullámhossz<br />
felett (cut-off pont 610 nm) szűrik a fényt. A short<br />
pass és long pass filterek kombinációjával ugyanúgy<br />
elérhető egy hullámhossztartomány kiszűrése, mint<br />
egy band pass filter alkalmazásával (pl. jelen esetben<br />
az 550-610 nm tartományban az 585 nm-es PE jel<br />
mérhető, az 520 nm-es FITC jel kívül marad). Multiplex<br />
optikai filter és lézer kombinációkkal az FCM<br />
gyártó cégek igyekeznek a felhasználói igényeknek<br />
megfelelő egyedi rendszereket kialakítani.<br />
Kompenzáció<br />
Bár láttuk, hogy az optikai filterek a spektrális fluoreszcens<br />
fény szelektív detektálása terén sok kérdést<br />
megoldanak, azonban nem az összeset. Előfordul,<br />
hogy az egymáshoz közel eső emissziós spektrumok<br />
egy kisebb része a legjobb filterkombinációk ellenére<br />
is kismértékben átfed (spectral overlap). Ezt tapasztaljuk<br />
pl. az FITC és a PE (lásd 11-30. és 11-32. ábra)<br />
esetében is. Ezt a mérési precizitást zavaró hatást fizikailag<br />
nem, csak az elektronikus adatok matematikai<br />
korrekciójával küszöbölhetjük ki. Amennyiben<br />
nem a fluorofórok csúcsemisszióiról, hanem csak a<br />
spektrum „szélső”, kevésbé intenzív emissziójú területeiről<br />
van szó, akkor az FCM-ben a kompenzáció<br />
elnevezésű elektronikus komputeres eljárással a<br />
kis százalékban jelen lévő átfedő hullámhosszterület<br />
emisszióját egyszerűen kivonjuk a szomszédos fluorofór<br />
teljes emissziójából és vice versa (FL1 - FL2%<br />
és FL2 - FL1%). Így vélhetőleg mindkét fluorofór vonatkozásában<br />
korrekt (átfedésmentes) eredményeket<br />
kapunk. Egyes készülékek programjai ezt automatikusan<br />
is el tudják végezni.<br />
Forward scatter treshold<br />
Végül még egy pont, amely érzékenyen érintheti a<br />
flow citométeres adatgyűjtés pontosságát, a treshold<br />
(lefordíthatalan szó, kb. kimutatási szintet jelent, itt<br />
azt a minimális kimutatott részecskeméretet, amely<br />
alatt nem érdemes adatot gyűjteni). Ha minden egyes<br />
11-33. ábra. Számítógépes kompenzáció az elektronikus<br />
adatok matematikai korrekciójával; ezáltal a mérésre nem<br />
érdemes kisméretű részecskék zavaró hatása kiküszöbölhető<br />
(PLT: platelet, vérlemezke; MP: mikropartikulum)
248 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
apró részecskét (< 2 μm) „beengednénk” az FCM-be,<br />
akkor olyan sok jelet kapnánk, hogy a bennünket érdeklő<br />
nagyobb méretű részecskék mennyiségi aránya<br />
vizsgálhatatlanul kicsinnyé válna. Ezért kell egy alsó<br />
mérethatárt meghatároznunk a rutin PBC-méréseknél.<br />
A sejttörmelékek, mikropartikulumok (MP) és<br />
mikrovezikulumok például a FSC/SSC diagramon a<br />
vérlemezkék (PLT) mérethatára alatt vannak (11-33.<br />
ábra).<br />
Ha a mérés célja a vérsejtek (PBC) mérettartományának<br />
mérése (Ly-Mo-Gran, 8-14 μm), akkor az<br />
FSC szokásos cut-off értéke a forward scatter treshold<br />
(általában 50 arbitrary FCM egység, kb.2 μm), ami<br />
egyértelműen kizárja a zavaró kis részecskéket a mérésből.<br />
Kis részecskék mérése<br />
Speciális igények jelentkezésekor, ahol viszonylag<br />
kis részecskéket mérünk az FSC treshold határán (pl.<br />
kis vérlemezkéket, PLT), akkor egy másik, fluoreszcens<br />
tresholdot is alkalmazhatunk. A vérlemezkéket<br />
specifikus CD61 monoklonális antitest festődésük<br />
alapján választjuk ki a méréshez (ebben benne lesznek<br />
a méretre „határeset” microthrombocyták is), így<br />
azonban minden más FCM részecskét – méretétől<br />
függetlenül mindent, ami nem vérlemezke – kizárunk<br />
a mérésből. Ha az FCM mérésünk során kifejezetten<br />
a kisméretű részecskékre (pl. mikropartikulumokra)<br />
összpontosítunk, akkor a leírtakkal ellentétben<br />
semmiféle méret-tresholdot nem alkalmazhatunk,<br />
hacsak nincs valamilyen mikropartikulumokra specifikus<br />
fluoreszcens markerünk (pl. FL-treshold Annexin-V-FITC-re).<br />
A következő ábrán (11-34. ábra<br />
a) a treshold kikapcsolásával láthatóvá válik, hogy<br />
az mikropartikulumok nagyobb része (piros pontok)<br />
csak így jelenik meg. Amig korábban a treshold alatt<br />
voltak a mikropartikulumok, nagyrészt kimutatlanul<br />
(összevethető a 11-33. ábrával: ahol kevés mikropartikulum<br />
van a PLT régió alatti részében, piros<br />
populáció 4,6%;. kék populáció). Az is látható, hogy a<br />
treshold feloldásával a mikropartikulumokra (piros)<br />
annyira dominálnak, hogy a PLT (kék) populáció<br />
mennyisége egészen háttérbe szorul.<br />
A kis részecskék szelektív elemzésében egy másik<br />
speciális lehetőség, hogy a mintához kevert standard<br />
kisméretű fluoreszcens jelölésű műanyag mikrogyöngyökkel<br />
(microbead, MB: zöld) pontosan meghatározhatjuk<br />
pl. a mérendő mikropartikulumok mérettartományát<br />
(felső határ: 0,9 μm MB és alsó határ: 0,5<br />
μm MB), és szelektíven kapuzva csak innen mérünk.<br />
Sejtszámmeghatározás mikrogyöngyökkel - one<br />
platform FCM-analízist<br />
Mikrogyöngyökkel abszolút sejtszámmeghatározást<br />
is végezhetünk az FCM-en. A 11-34. b ábrán<br />
egy nagyobb méretű MB (3 μm) alkalmazását látjuk<br />
mikropartikulummérés során. Ennek a mikrogyöngynek<br />
a részecskekoncentrációja standard (6 ×<br />
10 6 részecske/ml). Ha az ismeretlen koncentrációjú<br />
MP mintánkhoz sztöchiometrikus arányban keverjük<br />
az MB-t, a százalékos arányok megoszlása alapján,<br />
aránypár segítségével könnyen kiszámíthatjuk<br />
11-34. ábra. Igen kis méretű részecskék vizsgálata<br />
a) Vizsgálat a treshold kikapcsolásával<br />
b) Fluoreszcensen jelöl mikrogyöngyökkel (MB, microbead) végzett abszolút sejtszámmeghatározás
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába<br />
249<br />
az ismeretlen minta koncentrációját. Ezt az ún. one<br />
platform FCM analízist (ismert koncentrációjú mikrogyöngyöt<br />
keverünk ismeretlen koncentrációjú részecskékkel)<br />
a klinikai laboratóriumi gyakorlatban<br />
is alkalmazzuk: a csontvelői őssejt transzplantáció<br />
során. A multicolour (azaz kombinált színjelöléses<br />
CD34 + CD45 + CD133 monoklonális antitestest<br />
festésekkel azonosított) őssejtek a perifériás vérből<br />
vagy csontvelőből csak rendkívül kis arányban<br />
nyerhetők („low incidence stem cell population”).<br />
Az egyéb sejtek keverékével együtt a recipiensbe<br />
beadott őssejtek abszolút számának meghatározása<br />
elengedhetetlen a terápia várható hatékonyságának<br />
megítélésére, ez technikailag azonban nagy kihívás<br />
az FCM számára. A pontatlan volumetriás őssejtmérési<br />
technikák helyett ez esetben is az ismert koncentrációjú<br />
mikrogyöngyökkel végzett one platform<br />
FCM analízis ajánlott.<br />
FCM minőségi kontrollja mikrogyöngyökkel<br />
Végül a mikrogyöngyök az áramlási citometria minőségi<br />
kontrolljában (quality control, QC) is nélkülözhetetlenek.<br />
FCM műszeres QC célokra a gyártók<br />
a gépek rendszeres ellenőrzése és beállítása céljára 3<br />
mérettartományban és 5 fluorofór jelöléssel biztosítanak<br />
beállításra való (setting) mikrogyöngyöket, hogy<br />
az FCM korrekt működésében mindig biztosak lehessünk<br />
már mérés előtt (11-35. ábra).<br />
11-35. ábra. FCM minőségi kontrolljára gyártott mikrogyöngyökkel végzett vizsgálat
250 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Irodalom<br />
www.invitrogen.com/resources/education/tutorials<br />
CD moat reagensek tulajdonságai: http://en.wikipedia.org/<br />
wiki/Talk:Cluster_of_differentiation,http://www.clinicalflow.com/Cases/Introduction_to_Flow_Cytometric_Analysis/Cluster_of_Differentiation_(CD_Markers)<br />
http://www.lumrix.net/medical/immunology/<br />
cluster_of_differentiation.html<br />
kombinált színjelölés: www. invitrogen.com/ etc/medialib/<br />
en/filelibrary/pdf.Par.38320.File.dat/flow_worksheet.<br />
pdf<br />
Baumgarth, Nicol, Roederer, M.: A practical approach<br />
to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.<br />
Journal of Immunological Methods 243 77–97, 2000.<br />
www.elsevier.nl / locate /jim<br />
Berki Tímea: Áramlási cytometriai vizsgálatok autoimmun<br />
betegségekben (vizsgálati tájékoztató). Immunbiológiai<br />
és Immuntechnológiai Intézet (IBI). http://www.<br />
pote.hu/ibi<br />
BD Bioscience: Introduction to Flow Cytometry: a Learning<br />
Guide. Manual Part Number 11-11032-01. 2000.<br />
http://www.bdbiosciences.com/home.jsp<br />
BD Flow cytometry on-line training. http://www.bdbiosciences.com/support/training<br />
Beckman Coulter FC500 CXP Training manual 130105<br />
2004. https://www.beckmancoulter.com/eCatalog/Catalog/Flow_Cytometry<br />
Beckman Coulter on-line training. Animated flow cytometry<br />
theory. http://www.coulterflow.com/bciflow/<br />
theory.php<br />
Jabłoński, A. http://en.wikipedia.org/wiki/Jablonski<br />
Jáksó P.: A Flow Cytometria (FCM) alkalmazása a pathologiában”<br />
(PhD kurzus, évente); Pécsi Orvostudományi<br />
Kar, Pathológiai Intézet http://www.pote.<br />
hu/index.php?page=egyseg&egy_id=230&menu=dinam&dmid=117&nyelv=hun<br />
Kappelmayer J.: Flow cytometria (áramlási cytometria) a<br />
diagnosztikában. Debreceni Egyetem KBMPI oktatási<br />
anyaga http://kbmpi.deoec.hu/info.aspx?sp=1<br />
Kriván G., Karászi Éva, Gopcsa L. és munkatársai: Az<br />
áramlási citometria klinikai alkalmazása. Clinical use of<br />
of flow cytometry. Focus Medicinae 4:2-7., 2009. http://<br />
www.pharmaline.hu/index.php?page=medkat&kod=-<br />
FOM&mode=show&order=kiado<br />
Magyarlaki T., Tőkés-Füzesi Margit: Tájékoztató az<br />
áramlási cytometria klinikai laboratóriumi hematológiai<br />
alkalmazásáról. Pécsi Tudományegyetem Orvoskar<br />
Laboratóriumi Medicina Intézet, 2001 (revised 2008).<br />
http://aok.pte.hu/index.php?page=egyseg&nyelv=hun-<br />
&egy id=140&egy=140<br />
Matolcsy A., Udvardy M., Kopper L.: Hematológiai<br />
betegségek atlasza. Medicina Könyvkiadó, Budapest,<br />
2006. http://www.medicina-kiado.hu/<br />
Pálinger Éva: Áramlási cytometriai vizsgálatok (Felhasználói<br />
tájékoztató). Semmelweis Egyetem, Genetikai,<br />
Sejt és Immuniológiai Intézet. http://www.dgci.sote.hu/<br />
Robinson, J. P. (ed.): Handbook of Flow Cytometry Methods.<br />
Wiley-Blackwell, 1993. http://eu.wiley.com/WileyCDA/
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
251<br />
Autoimmun kórképek<br />
diagnosztikai lehetőségei<br />
Berki Tímea<br />
Az autoimmun betegségek jellemzői<br />
Autoimmun betegségek azok az ismeretlen etiológiájú,<br />
progrediáló, gyulladásos-degeneratív betegségek,<br />
amelyekben az immunrendszer valamely szabályozási<br />
zavar miatt a saját struktúrák ellen indít el reakciót.<br />
Ennek bizonyítékai a betegségre jellemző, sokszor<br />
már előtte megjelenő autoantitestek, amelyek patogenetikai<br />
jellege sokszor nem bizonyítható, de jól jelzik<br />
a betegség típusát, némelykor annak aktivitását is.<br />
Autoantitestek. Az emberi szervezetben kétféle autoantitestet<br />
(AAT) különböztetünk meg, az egyik a<br />
természetes autoantitestek, a másik a patológiás autoantitestek<br />
csoportja:<br />
• A természetes autoantitestek hálózata az immunrendszer<br />
részeként, a saját, ősi, konzervatív<br />
molekulák leképezései, azok védelmét szolgáló<br />
antitestek, amelyek az ún. „immunológiai<br />
homunculus”-t alkotják. Ezek az antitestek az<br />
egyénre jellemzőek. Már csecsemőkorban<br />
kimutathatók, és jellemző, hogy alacsony affinitású,<br />
polireaktív, általában IgM izotípusú antitestek,<br />
a szérumban pg/ml koncentrációban<br />
vannak jelen. Autoantitestek nagyobb koncentrációban<br />
megjelenhetnek átmenetileg bizonyos<br />
betegségekben, mint fertőzések, sérülések, regeneratív<br />
folyamatok, de az immunrendszer szabályozó<br />
mechanizmusai normális esetben a<br />
betegség lezajlása után visszaállítják az egyensúlyt,<br />
és az autoantitestek eltűnnek.<br />
• A patológiás autoantitestek valamely autoimmun<br />
betegség részeként jelennek meg, általában<br />
IgG vagy IgA, ritkábban IgM izotípusúak és<br />
nagyobb a szérum koncentrációjuk (ng/ml, mg/<br />
ml) (11-6. táblázat).<br />
A szérumban mért autoantitestek önmagukban tehát<br />
nem jelentik valamely betegség diagnózisát. Viszont<br />
segítik a klinikust a színes tünettanú autoimmun betegségcsoportban<br />
elhelyezni a betegséget, segítenek<br />
a differenciáldiagnosztikában („marker antitest”), a<br />
betegség progressziójának követésében, a prognózis<br />
felállításában. Némelyik autoantitest alkalmas a betegség<br />
aktivitásának, a terápia eredményességének<br />
nyomon követésére is (11-7. táblázat).<br />
Autoimmun betegségek tényezői. Az autoimmun betegségek<br />
kialakulásában számos tényező játszik szerepet.<br />
• Így a genetikai hajlam jellemző bizonyítéka az<br />
egyes kórképek HLA- vagy egyéb génekkel való<br />
szoros asszociációja.<br />
• A jellemző női dominancia felhívja a figyelmet<br />
a hormonális tényezők befolyásoló szerepére.<br />
Jellemzően fiatal nőkben kialakuló betegségek<br />
ezek, amelyek progresszióját a hormonális státus<br />
változása pl. terhesség, laktáció idején jelentősen<br />
befolyásolhatja.<br />
• Különféle külső, provokáló tényezők szerepének<br />
bizonyított volta így bizonyos vírusok, bakteriális<br />
infekciók, vegyszerek, munkahelyi ártalmak<br />
provokálhatják egy-egy betegség kialakulását,<br />
manifesztációját, ill. a nyugvó betegség fellobbanásához<br />
vezethetnek.<br />
11-6. táblázat. Természetes és patológiás autoantitestek összehasonlítása<br />
Jellemző Természetes AAT Patológiás AAT<br />
izotípus legtöbbször IgM IgG, IgA vagy IgM<br />
koncentráció pg/ml ng/ml, mg/ml<br />
affinitás alacsony nagyobb<br />
reaktivitás polireaktív monoreaktív<br />
termelő sejt B1-sejt konvencionális B-sejt<br />
T-sejt-függés T-independens T-dependens
252 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-7. táblázat. Autoantitestek laboratóriumi kimutatásának jelentősége<br />
Antitest alkalmazása<br />
diagnózis felállítása<br />
stádium (aktív-inaktív) megítélése<br />
alcsoport, rizikócsoport elkülönítése a kórképen belül<br />
prognózis megállapítása<br />
terápia eredményességének lemérése<br />
több kórkép egyidejű fennállásának (overlap) megállapítása<br />
A célra felhasználható antitest<br />
dsDNS, CCP, kardiolipin stb.<br />
dsDNS, ANCA<br />
Scl-70, Cenp-B<br />
Cenp-B, Scl-70<br />
foszfolipid, dsDNS, ANCA<br />
ENA-G<br />
Az autoimmun betegségek típusai<br />
Attól függően, hogy az immunrendszer a szervezet mely<br />
struktúrája ellen irányul, megkülönböztetünk szisztémás<br />
és szervspecifikus autoimmun betegségeket.<br />
A szisztémás kötőszöveti betegségek prototípusa<br />
a szisztémás lupus erythematosus (SLE), amelyre<br />
jellemző a szervezet minden sejtjében előforduló<br />
antigének elleni immunreakció, legjellemzőbben az<br />
antinukleáris autoantitestek megjelenése. Ebben a betegségben<br />
jellemző még antigén-ellenanyag immunkomplexek<br />
megjelenése a keringésben, azok lerakódása<br />
különböző szervek hurokkapillárisaiban (vese,<br />
ízületek, szív, tüdő, agy stb.), ahol a komplementrendszert<br />
aktiválva gyulladásos reakciót hoznak létre.<br />
A szervspecifikus auto immun betegségekben az autoimmun<br />
reakció viszont általában egyetlen antigén<br />
(pontosabban egyetlen szerv, egyetlen sejttípus néhány<br />
antigénje) ellen irányul, és ennek a szervnek a<br />
betegségét, esetenként pusztulását okozza. A szervspecifikus<br />
autoimmun betegség közismert példája a<br />
Hashimoto-tyreoiditis, amelyben az autoimmun re-<br />
11-8. táblázat. Betegségcsoportokra jellemző autoantitestek<br />
Betegség<br />
Szisztémás betegség<br />
SLE<br />
Sjögren-szindróma<br />
SSC<br />
vasculitis<br />
myositis<br />
foszfolipid-szindróma<br />
RA, JRA<br />
Szervspecifikus betegség<br />
thyroiditis<br />
coeliakia<br />
1-es típusú diabetes mellitus<br />
primer biliaris cirrhosis<br />
colitis - Crohn-betegség<br />
Goodpasture-szindróma<br />
Autoantitest<br />
dsDNS, nukleoszóma, ENA: Sm, RNP<br />
SSA, SSB<br />
Scl-70, centromer (Cenp-B)<br />
ANCA: MPO, PR3<br />
Jo-1, Rib-P, SRP, Ku, Mi-2, PL-7, PL-12, PMScl-100<br />
kardiolipin, b 2<br />
-GP1, foszfatidilszerin, protrombin<br />
CCP, rheumatoid faktor<br />
tireoglobulin (TG), thyroidea-peroxidáz (TPO)<br />
szöveti transzglutamináz (tTG), gliadin<br />
glutaminsav-dekarboxiláz (GAD), tirozin-foszfatáz (IA2)<br />
M2-mitokondriális (PDH)<br />
ASCA-PR3<br />
GBM<br />
ENA: extrahálható nukleáris antigén
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
253<br />
akció a pajzsmirigy lassú pusztításával hypothyreosishoz<br />
vezet (11-8. táblázat).<br />
A legismertebb szisztémás autoimmun betegségek:<br />
• Szisztémás lupus erythematosus (SLE) és rokon<br />
betegségek (dis coid lupus, szubakut cutan lupus<br />
erythematosus).<br />
• Rheumatoid arthritis (RA) és az ezzel rokon<br />
betegségek, mint pl. a juvenilis krónikus arthritis<br />
(JCA) stb.<br />
• Antifoszfolipid-szindróma (APS).<br />
• Sjögren-szindróma (SS).<br />
• Progresszív szisztémás sclerosis (PSS) és az<br />
ezzel rokon betegségek.<br />
• Kevert kötőszöveti betegség (MCTD).<br />
• Polymyositis/dermatomyositis (az „idiopathiás<br />
gyulladásos myopathia” csoport betegségei).<br />
• Szisztémás vas culitisek.<br />
• Nem differenciált kötőszöveti betegség (UCTD),<br />
más néven: nem differenciált collagenosis<br />
(NDC) vagy nem differenciált autoimmun<br />
betegség (NDAS) valójában nem önálló betegség,<br />
hanem bizonyos szisztémás kórképek (pl.<br />
SLE, PSS stb.) kezdeti vagy átmeneti („over lap”)<br />
formája. A kezdetben ilyen diagnózissal kezeltek<br />
egy részének betegsége később, újabb tünetek,<br />
manifesztációk megjelenése után definitív<br />
SLE, PSS stb. betegséggé alakul.<br />
Egy-egy példa a szervspecifikus autoimmun betegségekre<br />
szervek szerint:<br />
• Bőr: pemphigus vulgaris.<br />
• Endokrin rendszer: Hashimoto-thyreoiditis.<br />
• Gyomor-bél rendszer: autoimmun gastritis,<br />
anaemia perniciosával vagy a nélkül.<br />
• Idegrendszer: sclerosis multiplex.<br />
• Máj: primer biliaris cirrhosis.<br />
• Szív: autoimmun myocarditis.<br />
• Tüdő: idiopathiás tüdőfibrosis.<br />
• Vese: Goodpasture-szindróma.<br />
• Vér: autoimmun haemolyticus anaemia.<br />
Az autoimmun betegségek<br />
diagnózisának kérdései<br />
Az autoimmun betegségek nagy részének felismerését<br />
diagnosztikai vagy klasszifikációs kritériumok<br />
segítik. A klinikusnak számos tüneti, anamnesztikus<br />
és diagnosztikus paraméter együttes fennállását figyelembe<br />
véve, egy pontrendszer alapján szabad csak<br />
kimondania a diagnózist. A szisztémás kötőszöveti<br />
betegségek közül az SLE, az RA, a JCA, az MCTD,<br />
az SS, a PSS, a polymyositis/dermatomyositis, az APS<br />
és a szisztémás vasculitisek kritériumrendszere széles<br />
körben használatos. Ennek csak egy része a klinikai<br />
immunológiai laboratóriumból származó autoantitest<br />
és egyéb immunológiai és gyulladásos paraméterek<br />
(vérkép, vérsejtsüllyedés, CRP, komplement stb.)<br />
eredménye (11-9. táblázat).<br />
Ezért nagyon fontos, hogy ezt a klasszifikációs score-rendszert<br />
(pontrendszert) jól ismerő szakorvos állapítsa<br />
meg a diagnózist, kérje a konkrét autoimmun<br />
betegség gyanúját alátámasztó célzott laboratóriumi<br />
autoantitest-vizsgálatokat. A hozzá nem értő klinikust<br />
önmagában az autoantitest jelenléte téves diagnózishoz<br />
és a betegség fel nem ismeréséhez, hibás<br />
terápiához vezetheti. Az autoimmun betegségek sokfélesége<br />
miatt a legtöbb esetben az immunológiai laboratóriumi<br />
diagnosztikai eljárások szűrővizsgálatra<br />
nem alkalmasak – nincs „autoimmun laboratóriumi<br />
diagnosztikai panel”. Tehát célszerű a betegek anamnézise,<br />
tünetei és a rendelkezésre álló egyéb leletek<br />
alapján valamiféle iránydiagnózist készíteni, és ennek<br />
megfelelően kérni a speciális vizsgálatokat. Fontos azt<br />
11-9. táblázat. Általános laboratóriumi eltérések<br />
• Gyorsult süllyedés<br />
• Hypocomplementaemia<br />
• Vizeleteltérések (haematuria, proteinuria, cylindruria stb.)<br />
• Leukopenia, thrombocytopenia<br />
• Anaemia (normocytás, normochrom, Coombs-pozitivitás)<br />
• Autoantitestek jelenléte (nukleoszóma, dsDNS, anti-Sm, antifoszfolipid AAT stb.)
254 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
is tudni, hogy önmagában egy-egy auto antitest kimutatása<br />
egyáltalán nem jelzi az autoimmun betegség<br />
jelenlé tét. Tehát ha a kérdéses beteg – pl. antinukleáris<br />
antitest (ANA-) vagy rheumafaktor- (RF-) pozitív,<br />
ettől még akár egészséges is lehet. Az immunológiai<br />
laboratóriumi tesztek döntő többsége nem kellően<br />
specifikus, és nem is elég érzékeny, pl. a rheumafaktor.<br />
Vannak specifikusabb és elég szenzitív markerek,<br />
amelyek a betegség aktivitását jól jelzik, pl.: dsDNS,<br />
ANCA, foszfolipidantitestek, CCP.<br />
Az autoantitest-meghatározás módszertana<br />
A különböző autoantitest-meghatározási módszerek<br />
az antinukleáris autoantitest mérési lehetőségein keresztül<br />
kerülnek bemutatásra. Az egyes módszerek<br />
előnyei, hátrányai szintén itt kerülnek tárgyalásra. A<br />
többi autoantitestnél a mérési módszert csak megemlítjük.<br />
Antinukleáris autoantitestek a szisztémás<br />
kötőszöveti betegségek elkülönítésében<br />
Az antinukleáris antitest (ANA) vagy antinukleáris<br />
faktor (AF) kifejezés a sejtmag különböző komponensei<br />
ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve.<br />
Ma már jól definiált, a sejtmagból tisztított vagy rekombináns<br />
technikával előállított antigének állnak<br />
rendelkezésre e nagy autoantitest-csoport egyes típusainak<br />
elkülönítésére. Ezen ellenanyagok pontos kimutatása<br />
a szisztémás autoimmun betegségek laboratóriumi<br />
diagnosztikájának legfontosabb része. Segítik<br />
a differenciáldiagnózist, egy adott betegségen belüli<br />
alcsoportba sorolást, számos esetben a betegség aktivitásának<br />
és prognózisának megítélését. Néhány<br />
autoantitest az egyes kórképek diagnosztikai kritériumai<br />
között is szerepel (11-10. táblázat).<br />
Indirekt immunfluoreszcencia<br />
Az immundiagnosztikai laboratóriumok számos<br />
módszert alkalmaznak az ANA kimutatására, amelyek<br />
között a legrégebbi az indirekt immunfluoreszcens<br />
(IIF) technika. Mintaként kezdetben rágcsálókból<br />
származó szervmetszeteket, majd a nyolcvanas<br />
évektől egy humán eredetű sejtvonalat, a HEp-2 sejteket<br />
[Human Epithelioma Type 2 Cells (CCL-23)<br />
- American Type Culture Collection] használták, ill.<br />
használnak ma is. A HEp-2 sejtek alkalmazásának<br />
nagy előnye, hogy a kitapadó sejtek nagy sejtmagja,<br />
jól látható citoplazmája miatt az ANA több külön-<br />
11-10. táblázat. A leggyakoribb antinukleáris autoantitestek prevalenciája és relevanciája<br />
AAT Asszociált betegség AAT-frekvencia (%) IIF-mintázat<br />
SSA (Ro)<br />
SSB (La)<br />
SLE<br />
Sjögren-szindróma (SS)<br />
neonatalis lupus<br />
Sjögren-szindróma<br />
SLE<br />
25-35<br />
40-70<br />
100<br />
30<br />
10<br />
finoman pöttyözött sejtmag<br />
finoman pöttyözött sejtmag<br />
Sm SLE (specifikus) 15-30 durván pöttyözött sejtmag<br />
RNP<br />
MCTD (kevert kötőszöveti betegség:<br />
Raynaud-szindróma, sclerodactylia,<br />
oesophagusdysmotilitas)<br />
95<br />
SS 20<br />
SLE 30-50<br />
nagy, durván pöttyözött sejtmag<br />
Scl-70 scleroderma 20-35 granuláris, nukleoláris/homogén mag<br />
Jo-1 polymyositis 20-40 pöttyözött, citoplazmatikus<br />
Cenp-B<br />
scleroderma<br />
CREST variáns<br />
limitált SS 80<br />
SS 20<br />
hiszton drog indukálta SLE 90 homogén mag<br />
dsDNS SLE (specifikus) 40-60 homogén mag<br />
diszkréten pöttyözött, a metafázisban<br />
lévő sejtekben
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
255<br />
böző típusa különíthető el rajta (eltérő fluoreszcens<br />
festődési mintázatot adva), valamint az osztódó sejteken<br />
a sejtciklusfüggő autoantitestek is jól látszanak<br />
(11-36. ábra). Mindezek miatt a HEp-2 sejteken végzett<br />
IIF-vizsgálatot az ANA-kimutatás „gold standard”-jának<br />
(referenciamódszerének) tekintjük.<br />
Az ANA kimutatása ezzel a módszerrel szűrővizsgálat,<br />
mert a mikroszkópban látott kép csak egyes<br />
esetekben teszi lehetővé az antitest pontos azonosítását.<br />
Az esetek többségében az ANA specificitásának<br />
kimutatását további, antigénspecifikus indirekt ELI-<br />
SA vagy immunoblot-vizsgálatokkal végezzük.<br />
Az indirekt immunfluoreszcens technikával végzett<br />
ANA-kimutatás diagnosztikus kitek (tesztek)<br />
használatával is időigényes, sok manuális munkát és<br />
nagy gyakorlatot kíván. Értékelése tapasztalatot és<br />
gyakorlatot igényel, ugyanakkor bizonyos mértékig<br />
szubjektív. Emiatt csak immunológiai centrumokban<br />
javasolt végezni, ahol mind a kellő mintaszám, mind<br />
a kellő gyakorlat rendelkezésre áll.<br />
Az indirekt immunfluoreszcencia előnyei:<br />
• A vizsgálathoz használt antigén természetes<br />
környezetében látható.<br />
• A mintahígítás változtatásával (csökkentésével)<br />
a metodika érzékenysége fokozható.<br />
• Az inkubációs idő növelésével a vizsgálat érzékenysége<br />
növelhető.<br />
• A beteg különféle autoantitestjei sokszor nem<br />
tankönyvi vagy jól ismert formában jelennek<br />
meg - ilyenkor lehetőség van sejt/szövet/szerv<br />
metszetek kombinált használatára (biochip).<br />
11-36. ábra. ANAscreen indirekt immunfluoreszcencia<br />
(IIF). Több különböző autoantitest összefoglaló elnevezése.<br />
Szűrőteszt, a leggyakrabban kért vizsgálat<br />
Hep-2 sejt. 1.: szérum-AAT; 2. antihumán IgG-FITC<br />
• Az antihumán IgG, IgA vagy IgM-PO (peroxidáz)<br />
konjugátum változtatásával az autoantitest<br />
izotípusa is meghatározható.<br />
• Szűrésre alkalmas.<br />
• Kis mintaszám esetén is olcsó, részben automatizálható.<br />
Az indirekt immunfluoreszcencia hátrányai:<br />
• Kiértékelése gyakorlatot igényel.<br />
• A kiértékelésben sok a szubjektív elem.<br />
• Fluoreszcens mikroszkóp szükséges.<br />
• Heterofil antitestek zavaró hatása.<br />
• A háttér-fluoreszcencia zavaró hatása.<br />
• Aspecifikus lelet nem ritka.<br />
• Konfirmáló metodikára van szükség (dsDNS,<br />
ENA-6 stb.).<br />
• Nagy mintaszériára megszorításokkal alkalmas.<br />
ANA ELISA-szűrőteszt (screen)<br />
Az utóbbi években azonban számos cég ANA kimutatására<br />
alkalmas ELISA teszteket ún. ANAscreen<br />
ELISA-t hozott forgalomba. Az ELISA technika számos<br />
előnnyel rendelkezik az indirekt immunfluoreszcencia<br />
technikához képest: kivitelezése egyszerű, automatizálható,<br />
értékelése objektív, nagyszámú minta<br />
egyidejű vizsgálatára alkalmas. Magyarországon is<br />
sokféle ANA-ELISA teszt kapható, de hiányoznak<br />
azok az összehasonlító vizsgálatok, amelyek a tesztek<br />
eredményeit összevetik egymással és a standard indirekt<br />
immunfluoreszcencia technika eredményeivel<br />
(11-11. táblázat).<br />
Az elméleti megfontolások legfontosabb tárgya az<br />
alkalmazott antigén. Mivel szűrővizsgálatról van szó,<br />
célszerű olyan tesztet választani, amely valamennyi<br />
nukleáris antigént tartalmazza.<br />
A 11-37. ábrán látható tesztben az ELISA-lemezt<br />
a következő, HEp-2 sejtek magjából kivont antigének<br />
keverékével érzékenyítik:<br />
• dsDNS<br />
• hiszton<br />
• centromer<br />
• SSA/Ro, SSB/La<br />
• Sm, Sm/RNP<br />
• Scl-70, Jo-1<br />
Pozitivitás esetén egy-egy antigénnel fedett külön<br />
ELISA-lemezeken „kifejtő” vizsgálatok következnek.
256 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-11. táblázat. ANA-mintázat, ANA/ENA antigén és egyes betegségek összefüggése<br />
ANA HEp-2 mintázat Antigén Betegség<br />
homogén ds-DNA-hiszton komplex SLE<br />
foltos, szemcsés<br />
nukleoláris<br />
Sm<br />
RNP<br />
SS-A<br />
SS-B<br />
centromer<br />
nukleoláris RNS<br />
Scl-70<br />
PM-Scl<br />
SLE<br />
MCTD<br />
Sjögren-szindróma, SLE, RA<br />
scleroderma, CREST, PBC<br />
scleroderma<br />
scleroderma myositis<br />
scleroderma overlap<br />
citoplazma Jo-1 riboszóma polymyositis/dermatomyositis<br />
A gyakran előforduló, jól definiált autoantitesteken<br />
kívül vagy azok mellett ugyanis számos egyéb,<br />
ritkábban előforduló vagy nem pontosan azonosított<br />
ellenanyag is jelen lehet, amelyeknek ugyanúgy<br />
diagnosztikai, differenciáldiagnosztikai, prognosztikai<br />
jelentősége van (pl. magmembrán elleni antitest<br />
antifoszfolipid-szindrómában, PCNA elleni antitest<br />
SLE-ben stb.). Amikor egy ANA-ELISA tesztben<br />
csak néhány antigént kötnek a szilárd fázishoz, akkor<br />
csak az ezek ellen irányuló antitesteket lehet kimutatni,<br />
minden egyéb sejtmagkomponens elleni antitest<br />
láthatatlan marad. Ezért célszerű olyan ANAscreen<br />
ELISA tesztet választani, amely a HEp-2 sejtek lizátumát<br />
is tartalmazza. Ugyanakkor ebben az esetben<br />
sokszor előfordul olyan pozitív szűrőteszteredmény,<br />
amelynek specificitását az antigénspecifikus ELI-<br />
SA-tesztekkel nem tudjuk azonosítani (11-38. ábra).<br />
Probléma lehet az ANAscreen ELISA érzékenysége is,<br />
ami azt eredményezi, hogy fontos ellenanyagok (pl.<br />
anti-dsDNS) alacsonyabb koncentrációját nem jelzi<br />
(11-12. táblázat).<br />
11-37. ábra. ANAscreen microplate ELISA befejező mozzanata<br />
11-38. ábra. Antigénspecifikus autoantitest ELISA<br />
ANA-immunoblot<br />
Az antinukleáris autoantitestek szemikvantitatív<br />
meghatározásának egyik lehetősége az immunoblot<br />
módszer. A tesztben nitrocellulózcsík felszínére immobilizált<br />
autoantigének szolgálnak reakciófelszínnek<br />
(11-39. ábra).<br />
Előnyei:<br />
• Egyszerre egy mintából több antigénre specifikus<br />
autoantitest kimutatására alkalmas, vagyis<br />
multiplex módszer.<br />
• Gyors.<br />
• Egyetlen beteg mintája is vizsgálható vele.
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
257<br />
11-12. táblázat. Az antinukleáris autoantitest ELISA-szűrővizsgálat elemzése<br />
Az ANA-ELISA előnyei<br />
• Nagy szenzitivitás<br />
• Kis és nagy aviditású antitestek kimutatására egyaránt alkalmas<br />
• Kvantitatív meghatározás<br />
• Izotípus-meghatározás lehetséges<br />
• Automatizálható<br />
• Nagyszámú minta gyors és olcsó vizsgálata<br />
Az ANA-ELISA hátrányai<br />
• Sokszor bizonytalan antigén(forrás)<br />
• Bizonytalan antigéntisztaság<br />
• Egyedi standardok és kontrollok<br />
• A nemzetközi standardizálás hiánya<br />
• Aspecifikus reakciók okozta álpozitivitás (CIC, RF, immunglobulinok)<br />
Hátrányai:<br />
• Az antigének többnyire rekombináns fehérjék<br />
vagy tisztított nukleoproteinek, melyek a nitrocellulóz<br />
felszínére immobilizálva más konformációt<br />
vesznek fel, mint pl. az ELISA-lemez<br />
felszínén abszorpcióval kikötött antigének.<br />
Ennek az a következménye, hogy bizonyos antigéndeterminánsok<br />
(epitópok) eltűnnek, vagy új<br />
epitópok kerülnek a felszínre a harmadlagos<br />
szerkezet változása miatt. Így előfordulhat, hogy<br />
bizonyos, az indirekt immunfluoreszcenciában<br />
vagy ELISA-ban mért autoantitestek nem,<br />
mások pedig nemspecifikusan oda tudnak<br />
kötődni az immunoblot felszínéhez.<br />
• Előfordulnak álpozitív és álnegatív reakciók.<br />
• Nem vizsgálható egyszerre sok antigén.<br />
Gyorsasága, egyszerű kivitelezhetősége miatt olyan<br />
laboratóriumokban alkalmazzák, ahol kicsi a mintaszám.<br />
Nem igényel speciális felszereltséget, leolvasását<br />
szemmel (vizuálisan) vagy egy szkennerhez<br />
(optikai kiértékelőhöz) kapcsolt automatikus analizáló<br />
szoftver segítségével végzik. Ugyanakkor kevésbé<br />
tartják specifikusnak, mint az előző két módszert,<br />
főleg az antinukleáris antitestek megbízható meghatározására.<br />
Ugyancsak hátránya, hogy nem minden<br />
autoantigén immobilizálható (pl. kardiolipin, foszfolipidek<br />
stb.) a nitrocellulóz- vagy egyéb felszínhez.<br />
Multiplex autoantitest-meghatározási<br />
módszerek<br />
11-39. ábra. ANA-profil immunoblot<br />
A legújabb technológiai fejlesztések olyan irányba<br />
haladnak, hogy a minta egyszeri felhasználásával,<br />
egy méréssel 5-100 különböző autoantitest koncentrációját<br />
tudjuk detektálni. Ezek a multiplex mérési<br />
módszerek két nagy kategóriába sorolhatók az alkalmazott<br />
szilárd hordozó alapján. Az egyik esetben a<br />
mikrochip technológiára adaptálták az immunoas-
258 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
say-t, a másikban méret vagy fluoreszcencia alapján<br />
jól elkülöníthető mikropartikulumokra.<br />
Mindkét esetben a kritikus lépés az antigén felvitele<br />
a szilárd hordozó felszínére az antigenitás megtartásával.<br />
A cél olyan méréstechnika optimalizálása,<br />
amelyben a standard antigénspecifikus ELISA-val<br />
egyenként mért autoantitest eredmények egy mérésben<br />
reprodukálhatók.<br />
11-40. ábra. Autoimmun MicroSpot Protein Array<br />
Az ábrán 14 szisztémás autoimmun betegséget jelző autoantitestet<br />
mérnek egyszerre, egy mintából. 1-5: kalibrátor;<br />
6: Cenp-B; 7: Ui-70k; 8: Sm; 9: SSA/Ro52; 10: SSA/Ro60;<br />
11: SSB/La; 12: Mi-2; 13: PM/Scl-75; 14: PM/Scl-100; 15:<br />
Jo-1; 16: Scl-70; 17: PR3; 18: MPO; 19: dsDNS; 20: puffer;<br />
21: pozitív kontroll<br />
MicroSpot Assay<br />
A mikrochip hordozó felszínén kis, elkülönített<br />
területekre viszik fel a különböző antigéneket az ún.<br />
„micro-dot” technológiával. Így akár 200 különböző<br />
antigénspecifikus reakcióhelyet tudnak létrehozni<br />
(„nyomtatni”) egy 3-6 mm nagyságú nitrocellulóz<br />
felszínre (Ekins, 1998). Minden egyes reakcióhely<br />
(antigén) egy 80 μm átmérőjű terület, amelyre kevesebb<br />
mint 1 nL mennyiségű antigént „nyomtatnak”<br />
egy automatával (11-40. ábra). Ebben az eljárásban a<br />
microspot felszínén befogott autoantitest mennyisége<br />
olyan kicsi, hogy ez nem befolyásolja annak koncentrációját<br />
a mintában, még akkor sem, ha a kötés<br />
nagy affinitású. Ilyen körülmények között a mintából<br />
kifogott autoantitest mennyisége közvetlenül tükrözi<br />
annak koncentrációját. Érdekes, hogy a koncentrációmérés<br />
ilyen környezeti („ambiens”) analit körülmények<br />
között független a minta volumenétől,<br />
és a kis mintafelhasználás ellenére nagyon szenzitív.<br />
Ennek két oka van: egyrészt a kötés a legmagasabb<br />
célmolekula-koncentráción zajlik, másrészt a befogó<br />
molekula-analit komplex egy nagyon kis felületen található,<br />
nagy jelet okozva ott.<br />
A mérési formátum egy kétlépéses fluoreszcens<br />
immunoassay, ahol a fluoreszcens jelet egy lézerdetektor<br />
méri.<br />
Áramlási citometriás immunoassay - multiplex<br />
microbead assay<br />
A Luminex cég (Austin, TX, USA) kifejlesztett<br />
egy áramlási citometriás mérési elven alapuló, multiparametrikus<br />
fluoreszcens immunoassay-t. Ebben a<br />
rendszerben két különböző fluorofór különböző koncentrációival<br />
feltöltött latexgyöngyök (bead) szolgálnak<br />
szolid fázisként. Ezek a részecskék az áramlási<br />
citométeren mind külön csoportként jelennek meg.<br />
A több mint 60 különböző tulajdonságú partikulum<br />
mindegyike külön célmolekula (autoantitest) mérésére<br />
szolgál, egy mintából. Egy adott gyöngycsoportból<br />
kb. 1000 darab képezi a reakciófelszínt, amelyhez<br />
az adott antigént kovalens kötéssel kapcsolják. Az autoantitest<br />
kötődését a mikrogyöngyökhöz egy második<br />
színű fluoreszcens molekulával jelölt anti-humán<br />
IgG antitesttel tesszük láthatóvá. A készülék egyetlen<br />
méréssel minden gyöngycsoportból 1000-1000 partikulomot<br />
lemérve elkülöníti azokat fluoreszcens jelzésük,<br />
valamint intenzitásuk alapján, és külön jelként<br />
detektálja az adott gyöngycsoportnak a jelölő fluoreszcencia<br />
intenzitását is. Ez a jel egyenesen arányos<br />
a befogott autoantitest mennyiségével.<br />
A multiplex assay-k ígéretesek az autoantitest-diagnosztikában,<br />
ugyanakkor a szilárd fázishoz kötött<br />
molekulák antigenitásának megtartása még nem tökéletes.<br />
Cél az indirekt immunfluoreszcencia technikával<br />
és ELISA-val verifikált standard, kvantitatív<br />
mérések reprodukálhatósága a multiplex mérésekben<br />
is. Néhány esetben a szenzitivitást és a specificitást<br />
is vizsgálni kell. Ugyanakkor a miniatürizálás mint<br />
végső cél fontos az immundiagnosztikában is, mert<br />
költséghatékonyabb, gyorsabb, klinikailag hasznos, és<br />
nem utolsósorban kevésbé terheli a beteget.
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
259<br />
A laboratóriumi gyakorlatban mért<br />
autoantitestek<br />
Az autoimmun betegségekben elsősorban<br />
meghatározott autoantitestek<br />
Anti-dsDNS – kettős szálú DNS elleni autoantitest<br />
Az antitest elsősorban SLE aktív szakaszaiban pozitív,<br />
de más szisztémás autoimmun betegségben is előfordulhat.<br />
SLE-ben szenvedő betegben a dsDNS pozitívvá<br />
válása megelőzheti a klinikai tünetek megjelenését.<br />
Az autoantitest-pozitivitást a betegség aktivitási<br />
markerének tartják, amely általában komplementfaktor-<br />
(C3, C4, CH50) csökkenéssel együtt jelenik meg.<br />
A dsDNS antitest mérésével jól követhető a terápia<br />
sikeressége.<br />
Anti-dsDNS-pozitivitás jellemző: SLE aktív fázisában,<br />
SLE veseérintettsége esetében,<br />
más szisztémás autoimmun betegségekben: RA,<br />
Sjögren-szindróma, MCTD, scleroderma, egyéb autoimmun<br />
kórképekben: krónikus aktív hepatitis<br />
(CAH), primer biliaris cirrhosis (PBC).<br />
Mérőmódszer:<br />
• A klasszikus HEp-2 indirekt immunfluoreszcenciánál<br />
megbízhatóbb a Crithidia luciliae<br />
(gerinctelenek béltraktusában élősködő protozoon)<br />
szubsztráton végzett IIF-vizsgálat. Ez<br />
utóbbi előnye, hogy ebben az egysejtűben óriás<br />
mitokondriumok vannak nagyfokban kondenzált<br />
kettős szálú DNS-sel, hisztonok nélkül. Így<br />
a diagnosztikus értéke jobb, mint a HEp-2<br />
homogén rajzolatú képnek.<br />
• Antigénspecifikus ELISA: fontos, hogy a gyártó<br />
valóban tiszta, általában humán rekombináns<br />
kettős szálú DNS-preparátumot használjon<br />
antigénnek.<br />
Antinukleoszóma-autoantitest<br />
A nukleoszóma a kromatin alapszerkezeti eleme,<br />
147 bázispár hosszúságú szuperhelikális DNS szakasz,<br />
amelyet hiszton fehérjék (H2a, H2b, H3, H4)<br />
vesznek körül. Az e struktúra ellen megjelenő autoantitestek<br />
jellemző korai diagnosztikus markerei az<br />
SLE-nek és a gyógyszerindukálta SLE-nek. Az antitest<br />
sokszor megelőzi az anti-dsDNA autoantitest<br />
megjelenését, aktív SLE 100%-os markere.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
ENA – extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek<br />
Az ENA a sejtmagból kémiai eljárással kivonható<br />
antigének összefoglaló neve. Minden ANA-pozitív<br />
mintát ENA-ra tovább kell vizsgálni. A mérőmódszer<br />
általában az antigénspecifikus ELISA. Az ENA-pozitivitás<br />
szisztémás autoimmun betegségekre jellemző<br />
(lásd 11-10. és 11-11. táblázat).<br />
Az ENA csoportba tartoznak a következő antitestek:<br />
• RNP-antitest (U1-RNP – small nuclear uridine-rich<br />
ribonucleoproteins).<br />
• Sm-antitest (small nuclear ribonucleoprotein<br />
particles, más néven Smith-antigén).<br />
• SS-A antitest (soluble substance A nuclear antigen,<br />
más néven SS-Ro – Robert-antigén vagy<br />
Sjögren A).<br />
• SS-B antitest (soluble substance B nuclear antigen,<br />
más néven SS-La – Lane-antigén, vagy<br />
Sjögren B).<br />
• Scl-70 antitest (scleroderma antigén, lényegében<br />
70 kDa anti-topoizomeráz).<br />
• Jo-1 antitest (hisztidil-tRNS-szintetáz-ellenes<br />
antitest, a Jo-1 jelölés egy beteg nevéből ered).<br />
Anti-RNP<br />
Kevert kötőszöveti betegség (MCTD) esetén<br />
100%-ban fordul elő egyetlen antitestként, SLE-ben<br />
32%-ban, de mellette megtalálható az anti-dsDNS,<br />
anti-Sm és antihiszton antitestek jelenléte is. Szisztémás<br />
sclerosisban 10% az előfordulási gyakorisága.<br />
Anti-Sm<br />
Az SLE diagnózisának ACR-kritériumában egyik<br />
paraméter. 99%-ban specifikus a jelenléte SLE-re, előre<br />
jelezve annak súlyos szervi manifesztációit (KIR,<br />
vese).<br />
Anti-SS-A<br />
Collagenosisok, különösen a Sjögren-szindróma<br />
diagnosztikus markere, de SLE-ben is előfordul.<br />
Anti-SS-B<br />
Diagnosztikus érzékenysége primer Sjögren-szindrómában<br />
70%, szekunder Sjögren-szindrómában<br />
50%, SLE-ben 25%, neonatalis lupusban 70%, szubakut<br />
cutan lupusban 80%.
260 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Anti-Scl-70<br />
A progresszív szisztémás sclerosis (PSS) súlyosabb<br />
lefolyású formájára jellemző autoantitest. Raynaud-jelenség<br />
meglétekor az antitopoizomeráz-I autoantitest<br />
pozitivitása előre jelzi a PSS kialakulását korai bőr- és<br />
belső szervi (szív, tüdő, vese) manifesztációkkal.<br />
Anti-Jo-1<br />
Az idiopathiás myositis ismert, 100%-ban specifikus<br />
markere. Szenzitivitása 30%-os idiopathiás myositisben,<br />
46% polymyositisben. A Jo-1-pozitív esetek<br />
súlyosabb lefolyásúak, 65%-os a valószínűsége a tüdő<br />
érintettségének (alveolitis, tüdőfibrosis).<br />
A gyakorlatban vizsgált egyéb<br />
autoantitestek<br />
Cenp-B – centromer elleni autoantitest<br />
A centromer B-protein DNS-kötő fehérje, amely<br />
más fehérjékkel együtt fontos szerepet játszik a centromer<br />
kialakulásában. Az ellene megjelenő autoantitesteknek<br />
fontos diagnosztikus és prognosztikus jelentősége<br />
van a progresszív szisztémás sclerosis (PSS)<br />
enyhébb formájának kialakulásában és Raynaud-jelenségben.<br />
Az anti-Cenp-B autoantitest prognosztikai<br />
marker, és évekkel megelőzheti a progresszív<br />
szisztémás sclerosis egy lokális, enyhébb formájának,<br />
a CREST-szindrómának a kialakulását.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
Anti-C1q komplementfaktor autoantitest<br />
A C1q komplementfaktor ellen megjelenő IgG autoantitest<br />
fontos segítség az SLE lefolyásának, főképp<br />
a veseérintettségnek és a terápia eredményességének<br />
nyomon követéséhez. Ugyancsak diagnosztikus<br />
markere a hypocomplementaemiás-urticariás vasculitis<br />
szindrómának (HUVS), ebben 100%-ban pozitív,<br />
membranoproliferativ glomerulonephritisben<br />
(MPGN) 88%-ban mutatható ki az anti-C1q autoantitest.<br />
Mivel az antitest megjelenése akár hónapokkal<br />
is megelőzheti az SLE vesemanifesztációját, folyamatos<br />
monitorozása indokolt.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
Anti-CCP - ciklikus citrullinált peptid elleni autoantitest<br />
A CCP (filaggrin) kötőszöveti antigén, amely ellen<br />
antitest termelődik rheumatoid arthritises betegekben.<br />
A CCP (ciklikus citrullinált peptid) elleni antitest<br />
korai biomarker, évekkel a rheumatoid arthritis<br />
klinikai megjelenése előtt megjelenik a vérben. A<br />
CCP-t jobb diagnosztikai markernek tartjuk rheumatoid<br />
arthritisesben, mint a rheumatoid faktort. Az<br />
anti-CCP a rheumatoid arthritises betegek 85-95%-<br />
ában kimutatható.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
RF (rheumatoid faktor) izotípusok – anti-IgG IgG/<br />
IgA/IgM<br />
Az RF az IgG Fc-régiója ellen termelődő antitest.<br />
Három izotípusa fordul elő: RF-IgG, RF-IgM,<br />
RF-IgA. Alacsony a specificitása, rheumatoid arthritis<br />
és juvenilis krónikus arthritis mellett autoimmun<br />
kórképekben, fertőzésekben, gyulladásos folyamatokban<br />
is pozitív lehet.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
Kardiolipin IgG/IgA/IgM antitest<br />
Az antitest-pozitivitás az antifoszfolipid-szindróma<br />
diagnózisának egyik laboratóriumi kritériuma. A<br />
kardiolipin a mitokondrium belső membránjának integráns<br />
(20%) foszfolipidje, nélkülözhetetlen számos<br />
energiatermelő metabolikus folyamatban fontos enzim<br />
működéséhez. A kardiolipin fehérje elleni antitest<br />
számos kórképben megjelenik. Az antitest gátolja<br />
az alvadási kaszkád foszfolipid fehérjéinek aktivitását,<br />
ennek következtében alvadási zavar, érelzáródás<br />
jöhet létre. Kardiolipinantitest jelenlétében nem tud<br />
az embrió beágyazódni és a placenta kialakulni. Kardiolipin-pozitivitás<br />
a terhesség későbbi szakaszában<br />
magzati retardációt, placentaér-thrombosist, koraszülést<br />
okozhat.<br />
Különféle bakteriális infekciókban keresztreakció<br />
miatt előfordulhat álpozitivitás (pl. tbc, Treponema<br />
pallidum, Staphylococcus, Streptococcus, Borrelia,<br />
HIV fertőzés).<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
β 2<br />
-glikoprotein I elleni IgG/IgA/IgM antitest<br />
(β 2<br />
-GPI antitest)<br />
A b 2<br />
-GPI fehérje a kardiolipin és más foszfolipid<br />
fehérjék kofaktora. Gátolja a véralvadás intrinsic útját.<br />
Az antitest-pozitivitás az antifoszfolipid-szindróma<br />
diagnózisának egyik laboratóriumi kritériuma.<br />
Kardiolipin- és β 2<br />
-GPI-antitest vizsgálat javasolt a<br />
következő esetekben:
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
261<br />
• Thrombophilia kivizsgálásakor.<br />
• 45 év alatti betegben nem tisztázott mélyvénás<br />
thrombosis, ill. artériás elzáródás esetén.<br />
• Szisztémás autoimmun betegségekben a thrombosis-<br />
és abortuszrizikó megítélésére.<br />
• Habituális abortuszban.<br />
• In vitro fertilizáció sikertelenségekor.<br />
• SLE, SLE-szerű kórképek vagy más szisztémás<br />
autoimmun betegségben.<br />
• Ismeretlen eredetű recidiváló thrombocytopeniában.<br />
• Neurológiai kórképekben, ha a megszokott okok<br />
és rizikótényezők nem igazolhatók (migrén, chorea,<br />
multiinfarctus okozta dementiában, myelitis<br />
transversában,
262 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Myositis overlap-szindrómában előforduló autoantitestek<br />
• Ku (70-86 kDa) - 15%.<br />
• SS-A/Ro - 5-10%.<br />
• U1-RNP - 5-10%<br />
• U2-RNP - 4-17%<br />
Autoimmun polymyositis gyanújában ajánlott laboratóriumi<br />
vizsgálatok (11-13. táblázat):<br />
• ANA (Hep-2).<br />
• ANA ELISA.<br />
• ANA-pozitivitás esetén ENA.<br />
• autoimmun myositis autoantitest profil.<br />
Szükséges kiemelni, hogy a betegség CK-, GOT- és<br />
LDH-szint emelkedéssel jár!<br />
Szervspecifikus autoantitestek<br />
Pajzsmirigyellenes autoantitestek (anti-Tg, anti-TPO,<br />
TRAK)<br />
Anti-Tg (antithyreoglobulin)<br />
A tiroglobulin 660 kD molekulatömegű, vízoldékony<br />
thyreoprotein. A pajzsmirigyben termelődik, a<br />
fehérjék 75%-át adja. Belőle képződik a T 3<br />
és T 4<br />
hormon<br />
úgy, hogy a molekula 2 tirozincsoportja jódatomot<br />
vesz fel, összekapcsolódik, és proteolitikusan<br />
lehasad a fehérjéről. A thyreoglobulin elleni antitest<br />
(anti-Tg) jelenlétében csökken a pajzsmirigyhormon<br />
termelése, ami hosszú távon hypothyreosist okozhat.<br />
A pajzsmirigy-peroxidáz enzim (TPO) a mirigysejt<br />
membránjához kötött fehérje, amelynek funkciója<br />
a pajzsmirigyhormon szintézise. A TPO ellen<br />
termelődő antitestek tönkretehetik a pajzsmirigy<br />
hormonszintézisét, ennek következtében hosszú távon<br />
hypothyreosis jöhet létre.<br />
Az anti-Tg-pozitivitás jellemző Hashimoto-thyroiditisben<br />
60-70%-ban, primer myxoedemában<br />
szintén 60-70%-ban, Basedow-Graves-kórban kb.<br />
20%-ban, más autoimmun betegségekben, mint idiopathiás<br />
diabetes mellitus (IDDM), anaemia perniciosa,<br />
coeliakia és egyéb krónikus gyulladások.<br />
Anti-TPO<br />
Az anti-TPO-pozitivitás előfordulása Hashimoto-thyroiditisben<br />
és primer myxoedemában kb. 90%,<br />
Basedow-Graves-kórban kb. 80%. Nem immunológiai<br />
eredetű pajzsmirigybetegségekben (struma, autonom<br />
ademoma) és széles skálájú autoimmun betegségekben<br />
(Addison-kór, IDDM, anaemia perniciosa,<br />
autoimmun polyendocrinopathia, coeliakia, CAH),<br />
vitiligóban szintén leírtak anti-TPO-pozitivitást.<br />
11-13. táblázat. ANA-pozitivitás előfordulása különféle<br />
betegségekben<br />
Betegség<br />
Előfordulás<br />
%-a<br />
SLE 95-100<br />
DIL 95-100<br />
discoid SLE 21-50<br />
SCLE 20-65<br />
MCTD 100<br />
scleroderma 31-90<br />
CREST-szindróma 95<br />
Sjögren-szindróma (SS) 50-95<br />
egyéb rheumás betegség 20-50<br />
panarteritis nodosa 15<br />
polymyositis/dermatomyositis 40<br />
psoriasis vulgaris 30<br />
uveitis 60<br />
autoimmun CAH 45-100<br />
PBC 40<br />
vírushepatitis 30<br />
alkoholos cirrhosis 30<br />
cryptogen cirrhosis 30<br />
myasthenia gravis 35-50<br />
tüdőfibrosis, alveolitis 20-60<br />
ITP 50-70<br />
autoimmun haemolyticus anaemia 40-50<br />
autoimmun thyroiditis 20-40<br />
anaemia perniciosa/atrophiás gastritis 20-30<br />
leukaemia 70<br />
terhesség 50<br />
mononucleosis 30-70<br />
LE-beteg egészséges rokonai 25<br />
egészséges személy 60 éves kor alatt 0-5<br />
egészséges személy 60 éves kor fölött 5-30
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
263<br />
Ilyenkor a TSH-szintet ellenőrizni szükséges.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
TRAK<br />
TSH-receptor elleni antitest. Mára bebizonyították<br />
róla, hogy diagnosztikus értéke kizárólag a neonatalis<br />
thyreotoxicosis predikciójában van, de a bonyolult<br />
metodika miatt kevés helyen alkalmazzák.<br />
Szöveti transzglutamináz (tTG), endomysium<br />
(EMA) és gliadin elleni antitestek<br />
A coeliakia minden életkorban előforduló betegség,<br />
amelynek oka a glutén okozta intolerancia. Glutént<br />
tartalmaz a búza-, az árpa- és a rozsliszt. Genetikailag<br />
prediszponált egyénekben a glutén által<br />
okozott immunológiai elváltozások miatt a bélbolyhokban<br />
atrophia alakul ki. A betegek tüneteinek egy<br />
része a felszívódási zavarral függ össze, amely érintheti<br />
a fehérje-, zsír- és ásványi anyagcserét is. A betegség<br />
társulhat más autoimmun betegségekkel is.<br />
Gluténmentes diéta hatására a panaszok megszűnnek,<br />
és az autoantitestek kb. 6 hónap alatt eltűnnek.<br />
A klasszikus gasztroenterológiai tünetek (hasmenés,<br />
haspuffadás) mellett a betegségre gondolni<br />
érdemes vashiányos anaemiában, autoimmun pajzsmirigybetegségekben,<br />
korai osteoporosisban, 1-es típusú<br />
diabetes mellitusban, recidiváló herpesfertőzéseknél<br />
és stomatitis aphthosában, alopecia areatában,<br />
férfi és női meddőségben, habituális abortuszban,<br />
laktózintoleranciában, ismeretlen eredetű polyneuropathiában.<br />
Az EMA- és a tTG-mérések diagnosztikai<br />
hatékonysága igen nagy (90-95%).<br />
Mérőmódszerek:<br />
• Indirekt immunfluoreszcencia: majomesophagus-metszeten<br />
endomizium IgA (EMA IgA).<br />
IgA-hiányos betegeknél az IgG típusú ellenanyagot<br />
kell mérni.<br />
• Antigénspecifikus ELISA: szöveti transzglutamináz<br />
IgA és IgG antitest, anti-gliadin IgA.<br />
ASCA (Saccharomyces cerevisiae elleni antitest) IgG<br />
és IgA<br />
Az ASCA a pékélesztő (Saccharomyces cervisiae)<br />
elleni autoantitest. Az élesztőgomba falában lévő<br />
mannóztartalmú foszfopeptid ellen termelődik. A<br />
gyulladásos bélbetegségek közül Crohn-betegségben<br />
kb. 70%-os pozitivitás fordul elő, colitis ulcerosában<br />
viszont csak 6 %-os. Az autoantitest már a betegség<br />
korai fázisában kimutatható. A két betegség differenciálásán<br />
túl az autoantitest-kimutatás a betegség aktivitási<br />
markere is.<br />
A gyulladásos bélbetegségek között jól differenciál<br />
az ASCA- és ANCA-vizsgálat együttes végzése is. Colitis<br />
ulcerosában ANCA- (PR3), Crohn-betegségben<br />
ASCA-pozitivitás gyakoribb.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
Gyomor parietalis sejt (GPC, vagy PCA) és az intrinsic<br />
faktor (IF) elleni IgG antitest<br />
A gyomor parietalis sejt antitest a H + /K + -ATP-áz<br />
protonpumpa elleni antitest, amely biztosítja a gyomor<br />
normális pH-ját. Az intrinsic faktor a B 12<br />
-vitamin<br />
felszívódásához nélkülözhetetlen faktor. A<br />
gyomor parietalis sejtjei ellen termelődő antitest atrophiás<br />
gastritist okoz. A teszt specificitása alacsony,<br />
mert más szervspecifikus autoimmun betegségben,<br />
ill. egyéb kórképekben és tünetmentes egyéneknél<br />
is kimutatható. Az autoantitest-pozitivitás anaemia<br />
perniciosában 86-90%-ban jellemző.<br />
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.<br />
Autoimmun májbetegség autoantitest-immuno blot<br />
profil (AMA-M2, LKM1, LC, SLA, dezmin, miozin,<br />
F-aktin)<br />
Az autoimmun májbetegségek csoportjába tartozik<br />
az autoimmun hepatitis (AIH), a primer biliaris<br />
cirrhosis (PBC) és a primer sclerotizáló cholangitis<br />
(PSC).<br />
Gyakran előfordul, hogy overlap-szindróma képében<br />
jelentkezik a betegség, egyszerre vannak jelen<br />
gyulladásra (GOT, GPT) és cholestasisra (AP, γ-GT)<br />
jellemző laboratóriumi eredmények.<br />
Az autoimmun hepatitis diagnosztikai kritériuma:<br />
normális α 1<br />
-antitripszin, réz- és cöruloplazminszint,<br />
negatív HBV-, HCV-, CMV- és EBV-szerológia, csekély<br />
alkoholfogyasztás (< 25 g/nap), ANA és/vagy<br />
SMA, LKM, SLA antitest-pozitivitás.<br />
A tesztben szereplő antigének:<br />
• SMA: simaizom elleni antitestek (smooth muscle<br />
antibodies, anti-F-aktin, antidezmin és antimiozin).<br />
• LKM: máj-vese mikroszóma (liver-kidney microsomal)<br />
antitest.<br />
• LC-1: májcitoszol (liver-cytosol antigen type I)<br />
antitest.<br />
• SLA/LP: szolubilis máj (soluble liver) antigén.
264 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
• AMA-M2: a mitokondriális belső membránhoz<br />
asszociált piruvát-dehidrogenáz komplex elleni<br />
antitest a primer biliaris cirrhosis marker autoantitestje,<br />
a kórkép kb. 95%-ában pozitív.<br />
Az autoimmun hepatitisek egyes típusait és a rájuk<br />
jellemző autoantitestek előfordulási gyakoriságát a<br />
11-14. táblázat mutatja.<br />
Onconeuronalis/paraneoplasiás antitest immunoblot<br />
[Hu, Ri, Yo amphiphysin, CV2 (CRMP5),<br />
PNMA2, Ma-2/Ta]<br />
A tumorok által exprimált különféle antigének<br />
(11-15. táblázat) ellen az immunrendszer antitesteket<br />
termel. Ezek az antitestek reakcióba lépnek az idegszövet<br />
hasonló antigénszerkezetű elemeivel, aminek<br />
következtében neurológiai zavarok alakulnak ki. Az<br />
11-14. táblázat. Autoimmun májbetegségekben előforduló autoantitestek<br />
Autoantitest ANA SMA SLA LKM LC pANCA AMA<br />
%<br />
AIH I. típus 80-100 60-90 - - - -<br />
AIH II. típus - - - 100 - -<br />
AIH III. típus - - 100 - - -<br />
PBC 10 10 - - 10 95<br />
PSC 5
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei<br />
265<br />
így létrejövő központi idegrendszeri elváltozást paraneoplasiás<br />
neurológiai kórképnek nevezik.<br />
Jelenleg vizsgálható paraneoplasiás antitestek:<br />
• Anti-Hu (ANNA-1, anti-neuronalis nukleáris<br />
antigén 1).<br />
• Anti-Yo (Purkinje-sejt elleni antitest).<br />
• Anti-Ri (ANNA-2, anti-neuronalis nukleáris<br />
antigén 2).<br />
• Anti-Ma2/Ta (anti-pnma2 – paraneoplasticus<br />
neuronal antigén).<br />
• Anti-CV2 (CRMP5 Collapsin Response<br />
Mediator Protein).<br />
• Anti-amphiphysin (szinaptikus vezikulák citoplazmatikus<br />
proteinje).<br />
Irodalom<br />
Ta, E., Cohen, A., Fries, J. et al.: The 1982 revised criteria<br />
for the classification of systemic lupus erythematosus.<br />
Arthritis Rheum. 25:1271-1277, 1982.<br />
Hochberg, M. C.: Updating the American College of<br />
Rheumatology revised criteria for the classification<br />
of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum.<br />
40:1725, 1999.<br />
Muna, N. M., Verner, J. L., Harnmond, D. F. et al.: Fluorescent<br />
antibody technique as a routine procedure in<br />
the diagnosis of lupus erythematosus using stored tissue<br />
culture cells. Am. J. Clin. Pathol. 45:117, 1966.<br />
Humbel, R. .L.: Detection of antinuclear antibodies by immunofluorescence.<br />
In: Van Venrooij, W. J., Maini, R. N.<br />
(eds.): Manual of biological markers of disease. Dordrecht,<br />
the Netherlands. Kluwer Academic Publishers,<br />
1-16, 1993.<br />
Bradwell, A. R., Stokes, R. P, Johnson, G. D: Atlas of<br />
HEp-2 patterns. The Binding Site 1995.<br />
Engvall, E., Perlmann, P.: Enzyme-linked immunosorbent<br />
assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.<br />
G. Immunochemistry 8:871-874, 1971.<br />
Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J.: Electrophoretic<br />
transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose<br />
sheets: procedure and some applications. Proc.<br />
Natl. Acad. Sci. USA 76:4350, 1979.<br />
Emlen, W., O’Neill, L.: Clinical significance of antinuclear<br />
antibodies: comparison of detection with immunofluorescence<br />
and enzyme-linked immunosorbent assays.<br />
Arthritis Rheum. 40:1612-1618, 1997.<br />
Smolen, J. S., Butcher, B., Fritzler, M. J. et al.: Reference<br />
sera for antinuclear antibodies II. Further definition<br />
of antibody specificities in international antinuclear antibody<br />
reference sera by immunofluorescence and western<br />
blotting. Arthritis Rheum. 40:413-418, 1997.<br />
Koizumi, H., Onozuka, Y., Shibata, M. et al.: Detection<br />
of anti-nuclear antibodies in liver diseases by indirect<br />
immunofluorescence method and enzymelinked immunosorbent<br />
assay. Rinsho Byoni 8:744-748, 1999.<br />
Czirják L.: Klinikai Immunológia. Medicina Könyvkiadó,<br />
Budapest, 2006.
266 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A celluláris immunitás klinikai<br />
laboratóriumi vizsgálata<br />
Berki Tímea<br />
Morfológiai módszerek<br />
Az immunrendszer sejtjeit vizsgálhatjuk funkcionális<br />
és morfológiai megközelítéssel. A sejtek morfológiai<br />
sajátságait vizsgálhatjuk festés után hagyományos<br />
képalkotó eljárásokkal, de ellenanyagokkal való specifikus<br />
jelölés segítségével pontosabb molekuláris információkra<br />
tehetünk szert. A sejtek intracelluláris és<br />
sejtfelszíni fehérjemolekulái ellen fejlesztett specifikus<br />
poli- vagy monoklonális ellenanyagokkal, enzim vagy<br />
fluoreszcens jelzés felhasználásával immunhisztokémiai<br />
eljárással mikroszkópos megfigyeléseket tehetünk<br />
a sejtek fehérje alkotóelemeiről. Morfológiailag<br />
a fehérjék lokalizációján kívül azok mennyiségéről és<br />
megoszlásáról is információt kapunk. Ezek a módszerek<br />
ugyanakkor nagyon időigényesek, értékelésükben<br />
szubjektív elemek vannak, megbízható kvantitatív analízisre<br />
nehezen alkalmazhatók. Ennek kiküszöbölésére<br />
fejlesztették ki az áramlási citometriát.<br />
Immunsejtek fenotípus meghatározása<br />
CD markerek<br />
Elsősorban a sejtfelszíni molekulák, az ún. CD<br />
markerek (cluster of differentiation) alapján tudunk a<br />
fehérvérsejtek alcsoportjai közt különbséget tenni (11-<br />
43. ábra). A CD markerekre specifikus ellenanyagokkal<br />
nem csak az immunsejtek fenotípusát, hanem az<br />
ún. aktivitási markereket, differenciálódási stádiu-<br />
Áramlási citometria<br />
Az áramlási citometria gyors, többparaméteres meghatározásra<br />
alkalmas módszer, nagyszámú sejt többféle<br />
tulajdonságának statisztikai feldolgozását teszi lehetővé.<br />
A sejtek morfológiai (méret, granularitás) és<br />
fenotípus analízise mellett funkcionális (enzimaktivitás,<br />
életképesség, fehérjeexpresszió, DNS-tartalom,<br />
sejtciklus, intracelluláris pH és kalciumion-szignál<br />
stb.) vizsgálatokat is lehetővé tesz különböző fluoreszcens<br />
festékek alkalmazásával. Az áramlási citometria<br />
elvét és módszereit a 11.4. fejezet taglalja.<br />
Az áramlási citometriával mérhető legfontosabb paraméterek<br />
(11-41. ábra, 11-42. ábra):<br />
• Sejtméret (SSC).<br />
• Granuláltság (FSC).<br />
• Fluoreszcenciaintenzitás: FL-1 (zöld), FL-2<br />
(narancs), FL-3 (piros), FL-4 (távoli vörös).<br />
• Idő (pl. kalciumszignál-mérésnél, az ábrán nem<br />
szerepel).<br />
11-41. ábra. Áramlási citometria elve és fizikai paraméterei<br />
(Gr: granulocyta; Ly: lymphocyta; Mo: monocyta)<br />
a) SSC, side scatter: granularitás<br />
b) FSC, forward scatter: nagyság<br />
c) Áramlási citometriai diagram<br />
11-42. ábra. Sejtfelszíni molekulák fluoreszcens jelölése<br />
áramlási citometriához<br />
CD3-FITC: zöld → FL1; CD19-PE: narancs → FL2;<br />
CD56-CyChr: piros → FL3; CD45-APC: vörös → FL4
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata<br />
267<br />
11-43. ábra. CD markerek<br />
mokat is mérhetjük. A sejtfelszíni CD markerek tulajdonképpen<br />
különböző funkciójú sejtfelszíni receptorok,<br />
azok ligandjai, adhéziós molekulák vagy más,<br />
a sejt működése szempontjából fontos molekulák. A<br />
legtöbb receptor jelátviteli funkcióval is rendelkezik,<br />
amellyel a sejt működésének megváltozását okozza.<br />
2009-ig több mint 350 humán CD markert írtak le,<br />
jellemeztek, és jelölhetjük őket monoklonális ellenanyagokkal.<br />
A CD-nómenklatúrát 1982-ben Párizsban az I.<br />
Nemzetközi Humán Leukocyta Differenciálódási<br />
Antigén (HLDA) Workshopon hozták létre és kezdeményezték.<br />
A rendszert a leukocyta antigénekkel<br />
reagáló monoklonális ellenanyagok klasszifikációjára<br />
alkották, és a világ különböző laboratóriumaiban fejlesztették<br />
ki. Azóta a rendszer elterjedt, és ma számos<br />
sejtcsoportra több mint 350 CD antigént különböztetünk<br />
meg. Ezt jelzi a munkacsoport névváltoztatása<br />
is 2004-ben Human Cell Differentiation Molecules<br />
(HCDM) Workshopra, jelezve a szélesebb kiterjedésű<br />
céljaikat.<br />
Egy molekula CD számozása nem csak a specifikus<br />
monoklonális ellenanyaggal való reaktivitását jelenti,<br />
11-44. ábra. Lymphocytacsoportokat azonosító CD markerek
268 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
hanem szükséges az antigén jellemzése is. Ha a molekula<br />
nincs karakterizálva, akkor a w indikátor jelzést<br />
kapja (pl. CDw186) [9].<br />
A CD markerekre specifikus ellenanyagokat használják<br />
a perifériás vérből vagy csontvelőből nyert sejtek<br />
fenotípusmeghatározására áramlási citometrás<br />
mérőmódszerrel, de alkalmazzák szövettani körülmények<br />
között is, pl. malignus hematológiai folyamatok<br />
diagnózisára, monitorozására is. A módszer<br />
nélkülözhetetlen a különböző hematológiai megbetegedésekben<br />
a sejtek differenciálódási stádiumának<br />
besorolásához, autoimmun megbetegedésekben,<br />
infekciókban az aktivált sejtek arányának detektálásához,<br />
az egyes lymphocyta-alcsoportok százalékos<br />
arányának és abszolút számának meghatározásához.<br />
A CD rendszerrel jellemezhetünk fehérvérsejtcsoportokat<br />
azok differenciálódási állapota és funkciója<br />
szerint. Rendszerint több marker kombinációjával<br />
tudunk pontos definíciót kapni (11-44. ábra). Ezt a<br />
CD-specifikus antitestek különböző fluorofórral való<br />
jelölése teszi lehetővé, amely egy mintában több különböző<br />
hullámhosszon aktiválható és emittáló fluoreszcens<br />
molekula egyidejű detektálásában segít (11-<br />
16. táblázat, 11-17. táblázat).<br />
A CD molekulákat felhasználjuk a sejtek különböző<br />
módszerekkel való szeparálására, beleértve az<br />
áramlási citometriát is. Egy-egy sejtcsoportot a CD<br />
marker után tett plusz (+) vagy mínusz (-) jellel jelölhetünk<br />
aszerint, hogy expresszálja vagy sem az adott<br />
molekulát. A haemopoeticus őssejtre jellemző pl. a<br />
11-16. táblázat. Fontosabb fluorofórmolekulák<br />
Festék Abszorpciós hullámhossz Emissziós hullámhossz Szín<br />
Hydroxycoumarin 325 386 blue<br />
Methoxycoumarin 360 410 blue<br />
Alexa fluor 345 442 blue<br />
Aminocoumarin 350 445 blue<br />
Cy2 490 510 green (dark)<br />
FAM 495 516 green (dark)<br />
Alexa fluor 488 494 517 green (light)<br />
Fluorescein FITC 495 518 green (light)<br />
Alexa fluor 430 430 545 green (light)<br />
Alexa fluor 532 530 555 green (light)<br />
HEX 535 556 green (light)<br />
Cy3 550 570 yellow<br />
TRITC 547 572 yellow<br />
Alexa fluor 546 556 573 yellow<br />
Alexa fluor 555 556 573 yellow<br />
R-phycoerythrin (PE) 480; 565 578 yellow<br />
Rhodamine Red-X 560 580 orange<br />
Tamara 565 580 red<br />
Cy3.5 581 581 596 red<br />
Rox 575 602 red<br />
Alexa fluor 568 578 603 red<br />
Red 613 480; 565 613 red
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata<br />
269<br />
11-17. táblázat. Fluoreszcens DNS-festékek<br />
Festék Abszorpciós hullámhossz Emissziós hullámhossz Szín<br />
DAPI 345 455 blue<br />
Hoechts 33258 345 478 blue<br />
SYTOX blue 431 480 blue<br />
Hoechts 33342 343 483 blue<br />
YOYO-1 509 509 green<br />
SYTOX green 504 533 green<br />
TOTO 1, TO-PRO-1 509 533 green<br />
SYTOX orange 547 570 yellow<br />
Chromomycin A3 445 575 yellow<br />
Mithramycin 445 575 yellow<br />
Propidium iodide 536 617 red<br />
Ethidium bromide 493 620 red<br />
CD34+, CD31- megjelölés (11-18. táblázat; lásd 11-<br />
43. ábra) [8].<br />
A CD markerekre specifikus monoklonális ellenanyagok<br />
általában élő, nem fixált sejtek jelölésére<br />
alkalmasak. Fixálás vagy bármilyen eljárás, amely a<br />
CD antigének konformációjának megváltozását idézi<br />
elő, a jelölést zavarhatja vagy megakadályozza. Ezért<br />
a mononukleáris sejtek (lymphocyták és monocyták)<br />
sejtfelszíni antigénjeinek jelölését alvadásgátolt vérmintán<br />
végzik, majd a jelölés után fixálják a sejteket<br />
az áramlási citometriás analízisig. Ugyancsak fixált<br />
sejteket használunk intracelluláris fehérjemolekulák<br />
(pl. citokinek, jelátvivő molekulák, transzkripciós<br />
faktorok) jelölésére, mert a jelölő antitest sejtbe juttatásához<br />
a sejtek membránját először átjárhatóvá kell<br />
tenni. A permeabilizált sejtből fixálás nélkül kiáramlanak<br />
az intracelluláris molekulák, ezért szükséges<br />
permeabilizálás előtt a sejteket fixálni.<br />
11-18. táblázat. A legjellemzőbb CD-markerek (lásd 11-43. ábra is)<br />
Sejttípus<br />
őssejt<br />
minden leukocyta<br />
granulocyta<br />
monocyta<br />
T-lymphocyta<br />
T helper sejt<br />
T citotoxikus sejt<br />
B-lymphocyta<br />
thrombocyta<br />
NK-sejt<br />
CD-marker<br />
CD34+, CD31-<br />
CD45+<br />
CD45+, CD15+<br />
CD45+, CD14+<br />
CD45+, CD3+<br />
CD45+, CD3+, CD4+<br />
CD45+, CD3+, CD8+<br />
CD45+, CD19+ vagy CD45+, CD20+<br />
CD45+, CD61+<br />
CD16+, CD56+, CD3-
270 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Vizsgálati irányok, lehetőségek<br />
Immunfenotipizálás<br />
• Malignus hematológiai kórképek diagnosztikája<br />
és differenciál diagnosztikája.<br />
• Autoimmun betegségek aktivitásának nyomon<br />
követése.<br />
• Pre- és poszttranszplantációs állapotok nyomon<br />
követése.<br />
• HLA-haplotípus vizsgálata.<br />
• Tumorsejtek vizsgálata: proliferációs antigének<br />
vizsgálata, adhéziós molekula expresszió kimutatás.<br />
• Fertőző betegségek diagnosztikája és nyomon<br />
követése.<br />
• Sejtfelszíni fehérje- vagy egyéb struktúrák távolságának<br />
meghatározása (energiatranszfer)<br />
Kvantitatív mérési lehetőségek<br />
• A vizsgált markert expresszáló sejtek mennyiségének<br />
meghatározása.<br />
• Sejtfelszínen expresszálódó antigének kvantitatív<br />
meghatározása.<br />
DNS- és RNS-tartalom mérése<br />
• Sejtciklus-analízis.<br />
• Apoptózismérés.<br />
• Reticulocytaszám meghatározása.<br />
Funkcionális vizsgálatok<br />
• Fagocitálóképesség vizsgálata: fagoburst-teszt.<br />
• Intracelluláris kalciumion-koncentráció meghatározás,<br />
sejtaktiváció-mérés.<br />
• Intracelluláris pH-meghatározás.<br />
• Enzimmennyiség, -aktivitás, ill. -lokalizáció<br />
mérés.<br />
• Reaktív oxigénintermedierek (ROI) termelődésének<br />
detektálása (pl. H 2<br />
O 2<br />
).<br />
• Kemotaxis vizsgálat.<br />
• Proliferációs index meghatározása.<br />
Sejtszeparálás<br />
Vizsgálati panelek fenotípus meghatározásra<br />
Immunhiányos állapotok, transzplantáció monitorozása:<br />
• Immunstátus-monitorozás: T-, B-, Mo-, Th-,<br />
Tc-szubpopuláció meghatározása perifériás vérből.<br />
• CD3, CD4, CD8 sejtek abszolút számának meghatározása<br />
CD3/CD45, CD4/CD45, CD8/CD45<br />
jelöléssel.<br />
• Naiv/memória sejtarány meghatározás: CD3/<br />
CD45RO/CD45RA.<br />
• Adhéziós molekulák expressziójának vizsgálata<br />
(keringő leukocyták, ill. stimulált leukocyták<br />
felszínén). LAD diagnosztika (CD11/CD18<br />
expresszió zavara).<br />
Fertőzéses állapotok nyomon követése:<br />
• Aktivitási markerek vizsgálata: CD3/CD69,<br />
CD3/HLA-DR/CD25, CD8/HLA-DR.<br />
• Immunstátus-monitorozás: T-, B-, Mo-, Th-,<br />
Tc-alcsoport meghatározása perifériás vérből.<br />
Autoimmun folyamat monitorozása (11-19. táblázat):<br />
• Immunstátus-monitorozás: T-, B-, Mo-, Th-,<br />
Tc-alcsoportok meghatározása perifériás vérből.<br />
• Autoantitest-termelő B-sejtek vizsgálata: CD5+<br />
B-sejt-arány meghatározása.<br />
• Aktivitási markerek vizsgálata: CD3/CD69,<br />
CD3/HLA-DR/CD25, CD8/HLA-DR.<br />
• Naiv/memória T-sejt arány meghatározása:<br />
CD3/CD45RA/CD45RO.<br />
• Intracelluláris citokin mintázat, fagocitózis vizsgálat.<br />
A legutóbbi Cluster of Differentiation lista és leírás az<br />
interneten érhető el [8, 10].<br />
Mikroszkópos módszerek<br />
Hagyományos hisztokémiai módszerek<br />
A hagyományos hisztokémiai módszerekkel a szöveti<br />
környezetben lévő sejteket vagy izolált sejteket is<br />
vizsgálhatunk az egyes sejtalkotókhoz szelektíven kötődő<br />
festékek segítségével vagy a sejtekben előforduló<br />
enzimek szubsztrátjainak hozzáadásával, e folyamatok<br />
színes terméket eredményeznek. Ily módon egyes<br />
sejttípusok és funkcionális sajátságok vizsgálhatók,<br />
de a sejtalkotók molekuláris szintű vizsgálatát nem<br />
teszi lehetővé.<br />
Enzimhisztokémiai technika<br />
Az enzimhisztokémiai technika felfedezése és kifejlesztése<br />
elsősorban a magyar Gömöri György nevéhez<br />
fűződik, vele egy időben, de tőle függetlenül<br />
a japán Takamatsu 1939-ben közölte az alkalikus
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata<br />
271<br />
11-19. táblázat. A hematológiai malignitások azonosítására használt CD-markerek *<br />
CD1a<br />
CD2<br />
CD3<br />
CD4<br />
CD5<br />
CD7<br />
CD8<br />
CD10<br />
CD11b<br />
CD11c<br />
CD13<br />
CD14<br />
CD15<br />
CD16<br />
CD19<br />
CD20<br />
CD22<br />
CD23<br />
CD25<br />
CD30<br />
CD33<br />
CD34<br />
CD38<br />
CD41<br />
CD43<br />
Antitest (CD)<br />
CD56<br />
CD57<br />
CD61<br />
CD79a<br />
CD103<br />
CD117<br />
bcl-2<br />
nehézlánc<br />
(IgG, IgA, IgM, IgD)<br />
HLA DR<br />
könnyűlánc (k vagy l)<br />
TdT<br />
thymocyta és éretlen T-sejt<br />
Reaktivitás<br />
T-sejt, large granular lymphocyte (LGL), NK-sejt, némelyik APL, tumoros hízósejt<br />
T-sejt, primer lymphoma<br />
T-sejt (helper/inducer), monocyta, myeloblast, NK-sejtes lymphoma<br />
T-sejt, B-CLL/SLL, MCL<br />
T-sejt, némelyik myeloblast<br />
T-sejt (szuppresszor/citotoxikus), large granular lymphocyte (LGL), némely NK-sejt<br />
folliculus-centrumsejt, FL, némelyik DLBCL, pre-B-ALL, pre-T-ALL, thymocyta, BL<br />
granulocyta, monocyta<br />
monocyta, HCL, LGL, aktivált T-sejt, MZL<br />
myeloid sejt, ritka pre-B-ALL<br />
monocyta<br />
granulocyta, Hodgkin-lymphoma<br />
granulocyta, NK-sejt, LGL<br />
B-sejt, pre-B-ALL, AML alcsoportok (AML1/ETO t(8;21)-al)<br />
B-sejt, ritka plazmasejtes myeloma<br />
B-sejt<br />
B-CLL/SLL, plazmasejt, follicularis dendritikus sejt<br />
HCL, B- és T-sejtes lymphoma-alcsoportok<br />
Hodgkin-lymphoma, anaplasticus nagysejtes lymphoma, DLBCL alcsoport, B-sejtes<br />
lymphoma alcsoportok<br />
myeloid sejt, ritka pre-B-ALL, ritka blastos NK-lymphoma<br />
myeloblast, lymphoblast, endothelsejt<br />
plazmasejt, aktivált T- és B-sejt, B-CLL/SLL alcsoportok, epithelsejt<br />
megakaryocyta<br />
myeloid sejt, T-sejtes lymphoma, pre-B-ALL, pre-T-ALL, B-sejtes lymphoma(subset), plazmasejt<br />
NK-sejt, LGL<br />
NK-sejt, LGL<br />
megakaryocyta<br />
B-sejt, plazmasejt, megakaryocyta<br />
HCL, ritka T-sejtes lymphomák<br />
AML, hízósejt, stromasejtes tumorok (GIST), plazmasejt<br />
érett B-sejt (kivéve benignus GCC), T-sejt és FL<br />
B-sejt, plazmasejt, DLBCL ALK expresszióval<br />
AML (kivéve APL), B-sejt, monocyta<br />
B-sejt (sejtfelszín), plazmasejt (citoplazma)<br />
pre-B-ALL, pre-T-ALL, némelyik AML<br />
*<br />
A kurzivált rövidítések a betegségeknek az interneten a wikipaediában megtalálható leírására utalnak.
272 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
foszfatázok hisztokémiai azonosítására szolgáló eljárást.<br />
Az enzimcitokémia alapja az, hogy az adott enzimreakció<br />
termékei oldhatatlan és lehetőleg fény-, ill.<br />
elektronmikroszkópban látható csapadékot adjanak.<br />
Fontos az enzimreakcióhoz megfelelő olyan fixálószer<br />
alkalmazása, amely az enzimet rögzíti, de aktivitását<br />
nem változtatja meg. Erre legelterjedtebben<br />
az aldehidek használatosak (formaldehid, glutáraldehid),<br />
mégpedig semleges pH-ra pufferelt oldatok<br />
formájában. Az enzimcitokémiai eljárások jellegüket<br />
tekintve indirekt technikák, azaz nem magukat az enzimfehérjéket<br />
mutatjuk ki, hanem azok aktivitásából<br />
következtetünk előfordulásukra. Az enzimcitokémiai<br />
reakciókat a sejt egy bizonyos specifikus struktúrájára<br />
(pl. egyes organellumra, plazmamembránra stb.) vonatkoztatjuk,<br />
így mondjuk, hogy specifikus citotopobiokémiai<br />
reakciókat végzünk.<br />
Immunhisztokémiai technika<br />
Az immunhisztokémiai reakció az elsődleges<br />
antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló jelzéses<br />
technikák közé sorolható. Célja szöveti körülmények<br />
között vagy sejteken ellenanyag segítségével<br />
bizonyos antigének (tumor marker, enzimek, citokinek<br />
stb.) kimutatása. Diagnosztikus célra a fagyasztott<br />
metszeteken kívül elsősorban 4% formalinban<br />
fixált metszeten végeznek immunhisztokémiai reakciót.<br />
Az eljárás előnye, hogy a fixálás konzerválja a<br />
fehérjék antigenitását és megőrzi a szöveti struktúrát.<br />
Ugyancsak előnye a formalinban fixált, paraffinba<br />
ágyazott mintáknak, hogy patológiai célra évek<br />
múlva is lehet retrospektív immunhisztokémiai<br />
reakciót elvégezni a szöveten. A formalinfixálás hátránya,<br />
hogy keresztkötéseket hoz létre a fehérjékben<br />
és ezért álnegatív reakciót eredményezhet. Ennek<br />
elkerülésére számos megoldást dolgoztak ki. Ezek<br />
közül az egyik, hogy a szövet minél rövidebb ideig<br />
(2 nap) legyen a fixálószerben. A másik eljárás az<br />
antigénfeltárás, amelyre számos módszer áll rendelkezésre,<br />
pl.:<br />
• Detergens kezelés (Tween 20, Saponin, Nonidet<br />
p40) a harmadlagos kötéseket felbontó anyagok,<br />
(urea, tiourea, guanidin-klorid, litium-perklorát<br />
stb.).<br />
• Enzimatikus emésztés (tripszin, proteináz-K,<br />
pronáz-E).<br />
• Hőfeltárás főzéssel, mikrohullámú kezeléssel,<br />
amely az immunreakció felerősödését eredményezi.<br />
Szintén fontos az endogén enzimaktivitás gátlása is<br />
(peroxidáz, alkalikus foszfatáz) a nem specifikus háttér<br />
csökkentésére.<br />
Ha az antigénre specifikus ellenanyagot festékkel<br />
vagy enzimmel közvetlenül jelöljük, direkt módszerről<br />
beszélünk. A direkt citokémia előnye, hogy gyors<br />
és kevéssé munkaigényes, ugyanakkor magas a háttér<br />
és relatíve gyenge a jel. Ha az antigénspecifikus elsődleges<br />
ellenanyag jelöletlen és kimutatásához általában<br />
egy poliklonális, jelölt másodlagos ellenanyagot használunk,<br />
indirekt jelölésnek nevezzük (11-45. ábra). Az<br />
indirekt módszer előnye, hogy alacsonyabb a jelölt<br />
második ellenanyag nemspecifikus kötődése okozta<br />
háttérreakció, ugyanakkor a jel erősítését teszi lehetővé.<br />
A jelölő molekula lehet valamely fluoreszcens festék<br />
(lásd 11-16., 11-17. táblázat), amelynek láthatóvá<br />
tételéhez speciális aktiváló fényforrással és szűrőkkel<br />
ellátott fluoreszcens mikroszkópot használunk. A<br />
fluoreszcens jelölést zavarhatja a szövetek autofluoreszcenciája,<br />
ami elsősorban a flavin típusú vegyületeknek<br />
köszönhető. Magas autofluoreszcencia esetén<br />
célszerű olyan jelölő fluoreszcens festéket alkalmazni,<br />
amelynek abszorpciója vagy emissziója nem esik egybe<br />
az autofluoreszcenciát adó anyagéval. Ugyancsak<br />
alacsonyabb a fagyasztott metszetek autofluoreszcenciája.<br />
11-45. ábra. Immunhisztokémia<br />
a) Direkt<br />
b) Indirekt
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata<br />
273<br />
A hagyományos fénymikroszkópos vizsgálathoz<br />
leggyakrabban peroxidáz és/vagy foszfatáz enzimet<br />
használunk jelölő molekulának. Az enzimreakció<br />
oldhatatlan, színes terméke a szövetekhez kötődve<br />
jelzi az antigén-antitest kapcsolódás helyét. A peroxidáz<br />
enzim katalizálja pl. a diaminobenzidin oxidációs<br />
reakcióját, kromogénként barna színű termék keletkezik,<br />
miközben az alkalikus foszfatáz enzim szubsztrátja<br />
általában kék színreakciót ad.<br />
Nagyon kis mennyiségű antigén kimutatásához a<br />
jelet tovább erősíthetjük ún. többlépcsős technikák<br />
alkalmazásával, amelyek közül az avidin-biotin-peroxidáz<br />
(ABC) eljárás (11-46. ábra) és a peroxidáz-antiperoxidáz<br />
(PAP) komplex használata terjedt el (11-<br />
47. ábra).<br />
A PAP módszernél az első két antitest hasonló az<br />
indirekt módszerben használttal, azzal a különbséggel,<br />
hogy a második antitest jelöletlen. A harmadik<br />
antitest egy peroxidáz enzimre specifikus, az első antitesttel<br />
azonos fajban termelt monoklonális antitest.<br />
Így a második antitest egyik karja az első antitesthez<br />
kötődik, másik karja pedig a peroxidáz enzimre specifikus<br />
antitestet fogja, vagyis hidat képez a két antitest<br />
között (lásd 11-47. ábra). A módszer 100-1000-<br />
szer érzékenyebb az indirekt módszernél, ugyanakkor<br />
megtartja a specificitását.<br />
Az avidin-biotin komplex (ABC) módszer az tojásfehérjéből<br />
izolált avidin biotinhoz (H vitaminhoz)<br />
való rendkívül magas affinitásán alapul. Ebben<br />
a módszerben a második antitestet biotináljuk, míg<br />
a harmadik réteg az avidin-peroxidáz enzim komplexet<br />
tartalmazza (lásd 11-46. ábra).<br />
Citokinek kimutatása<br />
Általános jellemzők<br />
Az immunválasz sejtjeinek párbeszéde, az információtovábbítás<br />
két mechanizmussal zajlik. Egyrészt<br />
közvetlen sejt-sejt kapcsolatok útján, adhéziós molekulák<br />
segítségével, másrészt szekretált fehérjék, ún.<br />
citokinek és receptoraik útján. A citokin görög eredetű<br />
szó: a cito-, azaz „sejt” és kinosz, azaz „mozgás”<br />
szóösszetételből származik, de összességében azokat<br />
a szabályozó polipeptideket soroljuk ide, amelyek az<br />
immunrendszer működését összehangolják. Ugyanakkor<br />
ismert, hogy szerepük van az embriogenezis<br />
bizonyos folyamataiban is.<br />
A citokinek általános jellemzői:<br />
• Kis molekulatömegű (10-40 kDa) glikoproteinek,<br />
peptidek.<br />
• Izolált sejtek termelik átmeneti génaktiváció<br />
hatására.<br />
• Pikomoláris koncentrációban termelődnek,<br />
igen bomlékonyak, rövid a féléletidejük, ezért<br />
nehezen mérhetők.<br />
• Receptorokon keresztül hatnak, nagy affinitású<br />
kötődéssel.<br />
• Sejtek közötti kapcsolatokat közvetítik: információtovábbítás,<br />
immunválasz szabályozása.<br />
11-46. ábra. Avidin-biotin-peroxidáz komplex módszer.<br />
A biotinált másodlagos antitest nagy affinitású kapcsolatot<br />
létesít az avidin-biotin-peroxidáz komplexszel<br />
11-47. ábra. Peroxidáz-antiperoxidáz (PAP) módszer. A<br />
háromrétegű módszer során egy hídképző antitest köti<br />
össze az elsődleges antitestet a PAP-komplexszel
274 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A citokinműködés formája a következő lehet:<br />
• Autokrin, a citokint termelő sejtre visszaható.<br />
• Parakrin, a termelő sejt közvetlen közelében<br />
lévő sejtre ható.<br />
• Endokrin, a szervezet egy távoli pontjára ható.<br />
A legtöbb citokinnek többféle szerepe is van, ezért<br />
több helyre is besorolható a hatásaik szerinti csoportok<br />
közt.<br />
A citokinek csoportosítása:<br />
• A haemopoesisben ható növekedési faktorok:<br />
- SCF (stem cell factor),<br />
- GM-CSF,<br />
- G-CSF,<br />
- erythropoetin,<br />
- IL-3, IL-7, IL-11 stb.<br />
• A lymphocyták aktiválódására, differenciálódására<br />
ható citokinek:<br />
- Th1-citokinek: IL-2, IFN-g, IL-3, TNF, LT<br />
- Th2-citokinek: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 stb.<br />
- Th17: IL-17,<br />
- Treg: IL-10, TGF-b.<br />
• A természetes immunitásban ható, vagy a gyulladási<br />
folyamatokra ható citokinek. Ezek a nem<br />
fajlagos immunrendszer sejtjeiből azonnal termelődnek<br />
vagy felszabadulnak, amikor egy kórokozó<br />
a szervezetbe kerül. Ilyenek az antivirális<br />
hatású interferonok (IFNα, -β és -γ), a tumornekrózis-faktorok<br />
(TNFα és β), az IL-1α és β, az<br />
IL-6, az IL-10, az IL-12, a migrációt gátló faktor<br />
(MIF) és a kemokinek.<br />
Mivel a citokinek zöme lokálisan hat, a szérumban<br />
megbízhatóan mérhető koncentrációt csak kivételes<br />
esetben érnek el. Közülük az ún. „gyulladásos citokinek”<br />
(IL-6, TNF-alfa) sepsisben érnek el olyan szérumszintet,<br />
hogy közvetlenül is meghatározhatóak.<br />
Immunsejtek stimulálása<br />
Diagnosztikai vagy kutatási célokra a vérből, egyéb<br />
testfolyadékokból vagy szövetekből izolált immunsejtek<br />
stimulálása révén tudunk mérhető citokinmenynyiséget<br />
nyerni. Attól függően, hogy milyen sejttípus<br />
citokintermelésére vagyunk kíváncsiak, különböző<br />
stimulálószerekkel kezeljük a sejteket. A lymphocytákat<br />
4-12 órán át PMA/ionomycin stimulációnak<br />
vetjük alá. A PMA (forbol-12-mirisztát-13-acetát)<br />
protein-kináz C (PKC) aktivátor, míg az ionomycin<br />
a Streptomyces conglobatus baktérium által termelt<br />
ionofór, amely növeli az intracelluláris Ca 2+ -jelet. A<br />
PMA-stimuláció hátránya, hogy megváltoztatja a sejtek<br />
morfológiáját (11-48. ábra), és számos sejtfelszíni<br />
CD marker, pl. a CD4, CD33, CD14 expressziójának<br />
drasztikus csökkenését idézi elő (11-49. ábra). Ezért<br />
bizonyos laboratóriumok a PHA (fitohemagglutinin<br />
lektin) stimulációt használják (11-50. ábra). A monocytákat<br />
általában LPS (lipopoliszacharid) stimulációnak<br />
tesszük ki.<br />
Abban az esetben, ha a sejtekben intracellulárisan<br />
kívánjuk a citokineket meghatározni, pl. áramlási citometria<br />
vagy mikroszkópos immuncitokémiai reakció<br />
segítségével, akkor a stimulálószert tartalmazó<br />
reakcióelegybe brefeldint vagy monenzint (Sander<br />
et al 1993) is teszünk, amely gátolja a fehérjék Gol-<br />
11-48. ábra. A PMA/ionomycin stimulálás megváltoztatja a sejtek FSC/SSC flow citometriás megjelenését
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata<br />
275<br />
gi-készülékből való transzportját és szekrécióját. Így<br />
a termelt citokin viszonylag magas koncentrációban a<br />
termelő sejtben a Golgi-ciszternákban marad, ott egy<br />
fluorokrómmal jelzett antitest felhasználásával detektálható<br />
lesz.<br />
Citokin mérése áramlási citometriával – intracelluláris<br />
jelölés<br />
Ma az áramlási citometriás mérés terjedt el leginkább<br />
a citokinek egysejt szintű kimutatására. A multiparaméteres<br />
meghatározási mód lehetőséget ad a<br />
sejtfelszíni fenotípus (CD marker) jelölés után intracellulárisan<br />
is a citokinek egyidejű kimutatására egy<br />
mintában.<br />
A metodika hátránya a stimulálás és az intracelluláris<br />
jelölés miatt annak hosszadalmas volta.<br />
Megoldható viszont, hogy a sejtek stimulálása után<br />
folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk a mintát,<br />
és később végezzük el a sejtfelszíni és intracelluláris<br />
jelöléseket. A sejtfelszíni jelölésre még intakt sejten<br />
kerül sor, azt követően 1-4%-os paraformaldehidben<br />
(PFA) fixáljuk a sejteket, majd következik a permeabilizálásuk,<br />
általában 0,1% saponin detergenst tartalmazó<br />
pufferben. Ennek előnye, hogy reverzibilisen<br />
tárja fel a sejtmembránt. A saponint kimosva a<br />
pufferből az intracelluláris jelölőmolekula a sejt belsejében<br />
marad, mert a sejtmembrán folyamatossága<br />
visszaáll.<br />
Egy lehetséges mérőmódszer leírása<br />
Anyagok:<br />
• heparin a vérvételhez, RPMI-1640, PMA törzsoldat<br />
(1 mg/ml), ionomycin to. (1 mg/ml),<br />
monensin (0,5 mM = 500 mM to.).<br />
• anti-CD4-PE (sejtfelszíni jelöléshez).<br />
• anti-IL-4-FITC, anti-IL-2-FITC, anti- IFNg-<br />
FITC (50 mg/ml-es törzsoldatok) PBS/BSA/<br />
NaN 3<br />
pufferben. Izotípus-FITC (vagy patkány<br />
IgG-FITC).<br />
• pufferek: PBS/NaN 3<br />
, PBS/NaN 3<br />
/BSA (mosó<br />
puffer), PBS/saponin/BSA/NaN 3<br />
permeabilizáló<br />
puffer), 4% PFA/PBS (fixáló puffer), lízispuffer<br />
(Becton Dickinson), FACSFix.<br />
11-49. ábra. A PMA/ionomycin stimulálás megváltoztatja a CD4-expressziót
276 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-50. ábra. A PMA/ionomycin hatékonyabb citokinstimuláló szer<br />
Sejtek stimulálása:<br />
1. Stimuláló oldat készítése: RPMI-be 40 ng/ml<br />
PMA-t, 2 mg/ml ionomycint és 4 mM monensin<br />
összemérése. A stimulálatlan mintákra RPMI + 4<br />
mM monensin jön.<br />
2. 200 ml heparinos vérhez adjunk 200 ml stimuláló<br />
oldatot, inkubáljuk CO 2<br />
-inkubátorban 4–6 órát. A<br />
stimulálatlan vérhez a monensines RPMI jön 1:1<br />
arányban. (annyiszor 50 ml vér + 50 ml stimuláló<br />
puffert kell kiszámítani, ahány mintát szeretnénk<br />
jelölni).<br />
Jelölés:<br />
1. 100 ml stimulált vérmintát (a hígítottból) jelöljünk<br />
5 ml a-CD4-PE ellenanyaggal 30 percig jégen.<br />
2. Majd adjunk hozzá 1 ml szobahőmérsékletű lízispuffert,<br />
inkubáljuk 10 percig.<br />
3. Mosás 1-szer mosó puffereben, 1-szer PBS/<br />
NaN 3<br />
-ban.<br />
4. Fixálás 200 ml 4%-os PFA/PBS-ben 20 percig, jégen.<br />
5. Mosás 1-szer PBS/NaN 3<br />
, 1-szer saponin pufferben.<br />
6. Ezután felvenni a sejteket 80ml saponin pufferben,<br />
hozzátenni 20 ml a-IL-2, vagy a-IL-4, vagy<br />
a-IFN-FITC, vagy 10 ml izotípus-FITC antitestet.<br />
Inkubálás 30 percig jégen.<br />
7. Mosás 2-szer saponin pufferben, 1-szer mosó pufferben.<br />
8. Felvenni a sejteket 500 ml FACSfix oldatban.<br />
9. 24 órán belül mérés, analízis áramlási citométeren.
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata<br />
277<br />
Az ELISPOT-módszer<br />
Az enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT)<br />
eljárás elterjedt funkcionális módszer az immunválasz<br />
monitorozására. Elsőként 1983-ban Cecil<br />
Czerkinsky alkalmazta antigénspecifikus ellenanyag<br />
termelő B-sejt-szám meghatározásra. Mára számos<br />
más szekretált molekula mérésére is adaptálták, legáltalánosabban<br />
az aktivált lymphocyták citokintermelésének<br />
meghatározásra egysejt szinten. Minden<br />
spot (folt) megfelel egy citokintermelő sejtnek, a spot<br />
(folt) nagysága pedig arányos a termelt molekulamennyiséggel.<br />
Így az ELISPOT-assay minőségi és<br />
mennyiségi analízisre is szolgál.<br />
Az ELISPOT rendkívüli érzékenységének az oka az,<br />
hogy a sejt által termelt fehérjemolekulát a membránra<br />
immobilizált befogó antitest azonnal megköti annak<br />
enzimatikus bomlása előtt. A módszer alkalmas<br />
igen ritka sejtpopulációk (antigénspecifikus sejtek, citokintermelő<br />
sejtek stb.) frekvenciájának meghatározására.<br />
Ezzel a konvencionális citokin szendvics-ELI-<br />
SA-nál nagyságrendekkel érzékenyebb módszer áll<br />
rendelkezésünkre. Érzékenységére jellemző, hogy<br />
méréshatára 1/100 000 sejt, ami azt jelenti, hogy ez<br />
a jelenleg rendelkezésre álló legérzékenyebb celluláris<br />
módszer. Az RT-PCR-analízis érzékenységéhez<br />
hasonló, azzal a különbséggel, hogy fehérjét és nem<br />
mRNS-t mér.<br />
Ez citokinek esetében nagyon előnyös, hiszen számos<br />
citokin transzlációs szabályozás alatt áll, ezért az<br />
RNS-szintű meghatározás nem tükrözi a valóban termelt<br />
citokin mennyiségét.<br />
Az ELISPOT assay kivitelezése (11-51. ábra):<br />
Első lépésként a citokinspecifikus befogó antitestet<br />
immobilizáljuk a szilárd fázishoz, amelyre a legjobb a<br />
polivinil-difluorid membránnal bélelt 96 lyukú mikrotitráló<br />
lemez.<br />
A második lépésben a vizsgálandó sejtet adjuk a<br />
lemezhez stimulálószer jelenlétében vagy anélkül, és<br />
megfelelő ideig (O/N) inkubáljuk, hogy citokin termelődjék.<br />
A termelődött citokint a befogó antitest<br />
megköti a termelő sejt környezetében.<br />
Ezután mosással eltávolítjuk a sejteket, és a citokinspecifikus<br />
detektáló antitestet adjuk a rendszerhez.<br />
Ez a második antitest lehet direkt enzimkonjugált<br />
vagy biotinált, amikor egy harmadik lépésben<br />
enzimkonjugált streptavidint adunk a reakciócellába.<br />
Végül az enzim szubsztrátja következik, amely oldhatatlan<br />
csapadékot képez a termelt citokin helyén.<br />
Így a látható spot (folt) megfelel egy citokint termelő<br />
sejt helyének. A spotokat (foltokat) vagy mikroszkóposan,<br />
vagy egy automata ELISPOT-olvasó (reader)<br />
segítségével detektáljuk (11-52., 11-53. ábra) [11].<br />
ELISPOT lemez<br />
11-51. ábra. ELISPOT. Az eljárás lépései:<br />
1. A T-sejtek (ismert mennyiségének) stimulálása specifikus<br />
antigénnel a sejtkultúra lemezen<br />
2. Az Elispot-lemez üregeit előzetesen anti-citokin antitestekkel<br />
érzékenyítik<br />
3. A T-sejtek átvitele az Elispot-lemezre<br />
4. A sejtek inkubációja; citokinszekréció<br />
5. Citokinkötés az antitesthez<br />
6. A sejtek mosása; a lemezekre jelölő antitestek adagolása<br />
7. Enzimmel jelölt másodlagos antitestek kötődése a citokinhez<br />
8. A lemez mosása; szubsztrát hozzáadása<br />
9. Oldhatatlan színes termék keletkezik<br />
10. A pozitív pontok (spotok) megszámlálása mikroszkóppal
278 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-52. ábra. ELISPOT dot analízis<br />
11-53. ábra. Humán IL-17A citokin mérése Elispot-tal<br />
[M: közepes; SA: hővel elölt, formalinban fixált Staphylococcus<br />
aureus sejtek (valamennyi baktériumrészecskét tartalmazza);<br />
PHA: fitohemagglutinin]<br />
Irodalom<br />
[1] Zola, H., Swart, B., Banham, A. et al: CD molecules<br />
2006 - Human cell differentiation molecules. Journal of<br />
Immunological Methods 319(1-2):1-5, 2007.<br />
[2] Sander, B., Andersson, J., Andersson, U.: Assessment<br />
of cytokines by immunofluorescence and the<br />
paraformaldehyde-saponin procedure. Immunol. Rev.<br />
119:65-93, 1991.<br />
[3] Jung, T, Schauer, U, Heusser, C. et al.: Detection of<br />
intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol.<br />
Methods 159(1-2):197-207, 1993.<br />
[4] Baran, J., Kowalczyk, D., Ożóg, M. et al.: Three-Color<br />
Flow Cytometry Detection of Intracellular Cytokines<br />
in Peripheral Blood Mononuclear Cells: Comparative<br />
Analysis of Phorbol Myristate Acetate-Ionomycin<br />
and Phytohemagglutinin Stimulation. Clin. Diagn. Lab.<br />
Immunol. 8(2):303–313, 2001.<br />
[5] Czerkinsky, C., Nilsson, L., Nygren, H. et al.: A solid-phase<br />
enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay<br />
for enumeration of specific antibody-secreting cells.<br />
J. Immunol. Methods 65(1-2):109–121, 1983.<br />
[6] Chambers, I. R., Cone, T. R., Oswald-Richter, K.<br />
et al.: Enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT):<br />
Quantification of Th-1 cellular immune responses<br />
against microbial antigens. J. Vis. Exp. (45):2221. 10.<br />
3791/2221, 2010.<br />
[7] Karlsson, A. C., Martin, J. N., Younger, S. R. et al.:<br />
Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry<br />
assays for the enumeration of antigen-specific T<br />
cells. J. Immunol. Methods 283(1-2):141-153, 2003.<br />
[8] http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters_<br />
of_differentiation<br />
[9] http://www.sciencegateway.org/resources/prow/index.<br />
html<br />
[10] http://www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/<br />
54/Default.aspx<br />
[11] http://www.mabtech.com/main/Page.asp?PageId= 16<br />
&PageName=About+ELISpot
A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana<br />
279<br />
A hemosztázis vizsgálatának<br />
újabb fehérjemódszertana<br />
Tőkés-Füzesi Margit<br />
A véralvadási rendszer fontos szerepet tölt be a szervezet<br />
homeosztázisának fenntartásában. Ezt a szerepét<br />
a vascularis endothel, a thrombocyták, a pro- és<br />
antikoaguláns fehérjék, valamint a fibrinolitikus<br />
rendszer segítségével valósítja meg. A véralvadási<br />
rendszer fehérjéi nem csak az érsérülés helyén létrejövő<br />
alvadási folyamatban és repairben vesznek részt,<br />
hanem a gyulladásos folyamatok kialakulásában és<br />
lezajlásában is fontos szerepet játszanak. Az alvadási<br />
faktorok szerepet játszanak az embrionális növekedésben<br />
és fejlődésben is.<br />
A véralvadás folyamata<br />
A véralvadás folyamatának leírására régebben a kaszkád<br />
(11-54. ábra) modellt használták, amelyben a<br />
zimogén formában jelen lévő enzimek szigorú sorrendet<br />
követve fehérjefragmentumok lehasításával<br />
egymást követően aktiválják egymást. A folyamatok<br />
nagy része foszfolipidfelszínt és kalciumiont igényel,<br />
néhány esetben szükséges az enzim és szubsztrátjának<br />
kofaktorhoz való kötődése is.<br />
Ez a modell a véralvadás folyamatában egy extrinsic<br />
és egy intrinsic utat különböztet meg. Az extrinsic<br />
11-54. ábra. A véralvadás kaszkádmodellje<br />
út beindításához szöveti faktorra (TF), valamint aktív<br />
VII-es faktorra (FVIIa) van szükség. Az intrinsic út<br />
esetében a XII-es faktor kontakt aktiválása negatívan<br />
töltött felszínen megy végbe. A két út a X-es faktor<br />
szintjén találkozik, és innen a közös útba torkollik,<br />
amelynek végén a trombin hatására megtörténik a<br />
fibrinogén-fibrin átalakulás.<br />
A véralvadás kaszkádmodellje hasznos volt az alvadás<br />
folyamatának megértésében, vala mint a véralvadási<br />
laboratóriumi tesztek klinikai értékelésében.<br />
A véralvadással kapcsolatos tudásunk bővülésével ez<br />
a modell már nem tudott választ adni az in vivo végbemenő<br />
folyamatokra. A kaszkádmodell szerint az<br />
intrinsic és az extrinsic út egymástól függetlenül működik<br />
és indítja be az alvadás folyamatát.<br />
Ennek ellentmondanak olyan klinikai megfigyelések,<br />
mint pl. az intrinsic út beindításában részt<br />
vevő faktorok - XII-es faktor, prekallikrein, nagy<br />
molekulatömegű kininogén - hiánya, ami megnyúlt<br />
APTI-vel (aktivált parciális tromboplasztinidő) jár,<br />
azonban nem okozza a beteg vérzékenységét. A XI-es<br />
faktor hiánya (haemophilia C) is csak változó mértékben<br />
okoz vérzékenységet, ezzel szemben a VIII-as<br />
és IX-es faktor hiánya (haemophilia A és B) súlyos<br />
vérzé keny séggel jár annak ellenére, hogy az extrinsic<br />
véralvadási út intakt. Hasonlóképpen a VII-es faktor<br />
hiánya is vérzékenységhez vezethet jól működő intrinsic<br />
út mellett.<br />
Ezek alapján úgy tűnik, hogy a két út nem egymástól<br />
függetlenül működve jut el a X-es faktor aktiválásáig.<br />
Ezek után vezették be a véralvadás ma is elfogadott<br />
sejtes modelljét. Ennek alapján az alvadás in vivo<br />
sejtfelszínen (szöveti faktort hordozó sejt, thrombocyta)<br />
indul el, és három különböző, egymáshoz kapcsolt<br />
fázisban zajlik le:<br />
• Iniciáció. Ennek során az érsérülés helyén a szöveti<br />
faktort hordozó sejtek szabaddá válnak, és a<br />
vérben keringő VIIa faktor gyorsan kötődik a<br />
TF-hez. A VII-es faktor az egyetlen, amelynek<br />
egy kis része, kb. 1%-a, aktivált formában kering<br />
a vérben. Ennek eredményeként kis mennyiségű<br />
IXa és Xa faktor, valamint trombin képződik<br />
(11-55. ábra).<br />
• Amplifikáció. Ebben a fázisban az előző lépésben<br />
kis mennyiségben keletkezett trombin aktiválja<br />
a thrombocytákat, von Willebrand-faktort<br />
(vWF) szabadít fel, és az V-ös, a VIII-as és a<br />
XI-es faktorok aktiválásához vezet (11-56. ábra).
280 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
• Propagáció. A propagáció fázisában az előző<br />
lépésekben kelet kezett enzimek az aktivált<br />
thrombocyták prokoaguláns membránfelszínén<br />
összeszerelődnek és létre hozzák a tenáz komplexet.<br />
Ez a thrombocyták felszínén Xa faktort<br />
hoz létre, mely a protrombináz komplex részévé<br />
válik. Ennek eredménye lesz a trombin képződés<br />
,,robbanás,, a thrombocyták fel színén, mely<br />
beindítja a fibrinogén–fibrin átalakulást (11-57.<br />
ábra, 11-20. táblázat).<br />
11-56. ábra. A véralvadás sejtes modellje – II. lépés – amplifikáció<br />
11-55. ábra. A véralvadás sejtes modellje – I. lépés – iniciáció<br />
11-57. ábra. A véralvadás sejtes modellje – III. lépés – propagáció<br />
11-20. táblázat. Prokoaguláns alvadási faktorok<br />
Jelenlegi nevezéktan szerint (név) Funkció Féléletidö (óra)<br />
faktor I (fibrinogén) fibrin prekurzora 90<br />
faktor II (protrombin) szerin-proteáz a protrombináz-komplexben 65<br />
faktor III (kalcium) kofaktor -<br />
faktor IV (szöveti faktor) a véralvadási kaszkád elindítója -<br />
faktor V (proakcelerin) kofaktor a protrombináz-komplexben 15<br />
faktor VII (prokonvertin) a véralvadási kaszkád elindítója 5<br />
faktor VIII (antihemofíliás faktor) kofaktor a tenáz-komplexben 12<br />
faktor IX (Christmas-faktor) szerin-proteáz a tenáz-komplexben 24<br />
faktor X (Stuart-Prower-faktor) szerin-proteáz a protrombináz-komplexben 40<br />
faktor XI (plazmatromboplasztin) a véralvadás amplifikációja 45<br />
faktor XII (Hageman-faktor) kontakt faktor 50<br />
faktor XIII (fibrinstabilizáló faktor) fibrin keresztkötése 200<br />
prekallikrein (Fletcher-faktor) kontakt faktor 35<br />
nagy molekulatömegű kininogén (Fitzgerald-faktor) kontakt faktor 150
A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana<br />
281<br />
Az alvadás folyamatában természetes inhibitorok is<br />
részt vesznek, amelyek a trombinképződést ellenőrzik<br />
(11-21. táblázat).<br />
A fibrinolitikus rendszer véralvadásban betöltött<br />
szerepe egyrészt az, hogy biztosítsa a véralvadék kialakulását<br />
az érsérülés helyén, másrészt hogy eltávolítsa<br />
a sebgyógyulás lezajlása után az alvadékot.<br />
A véralvadék kialakulása során pro- és antifibrinolitikus<br />
fehérjék épülnek be a fibrinhálóba a fibrinhez<br />
való kötődés által (11-22. táblázat). A szöveti plazminogénaktivátor<br />
(tPA), a plazminogén és a plazmin a<br />
fibrin lizin helyeihez kötődik, miközben az α 2<br />
-antiplazmint<br />
a XIIIa faktor keresztköti a fibrinhez.<br />
A plazmin/plazminogén két formában található meg:<br />
• Glu-plasmin/plasminogén, amelyben a fehérje<br />
1. pozíciójában egy glutamát található, és ez a<br />
vegyület kevésbé aktív.<br />
• Lys-plasmin/plasminogén, amelyben az első 76<br />
aminosav katalitikus lebontása után az első aminosav<br />
lizin.<br />
11-22. táblázat. A fibrinolízis fehérjéi<br />
Antifibrinolitikus fehérjék<br />
• α 2<br />
-antiplazmin<br />
• PAI-1<br />
• PAI-2<br />
• TAFI<br />
Profibrinolitikus fehérjék<br />
• plazminogén<br />
• plazmin<br />
• tPA<br />
• uPA<br />
A plazminogén-plazmin átalakulást egyrészt a tPA<br />
(szöveti plazminogén aktivátor), amely az endothelsejtekből<br />
szabadul fel, másrészt az uPA (urokináz)<br />
(ez elsősorban a vizeletben található meg) aktiválja.<br />
A tPA féléletideje a plazmában rövid, mivel az I-es<br />
típusú plazminogénaktivátor inhibitor (PAI-1) gyorsan<br />
inaktiválja és a máj lebontja. A fibrinhez kötött<br />
tPA azonban védve van a gátló faktortól, ezért aktivitása<br />
is nagyobb mértékű. A plazmin nem specifikus<br />
enzim, a fibrinogént, a fibrint és a keresztkötött<br />
fibrint is lebontja (arginin és lizin kötéseket hidrolizál).<br />
Az ennek eredményeként keletkező termékek a<br />
fibrin/fibrinogén degradációs termékek (FDP). D-dimer<br />
azonban csak a keresztkötött fibrin bontása után<br />
keletkezik, és ez specifikus a keletkezett alvadékhoz<br />
kötött fibrinre, vagyis kialakulását mindig thrombusképződés<br />
előzi meg.<br />
A fibrinolízis legfontosabb gátló fehérjéje a PAI-1<br />
és a PAI-2 (1-es és 2-es típusú plazminogénaktivátor<br />
inhibitor), az α 2<br />
-antiplazmin és a trombin által<br />
aktiválható fibrinolízisinhibitor (TAFI). A PAI-1 és<br />
PAI-2 megtalálható a thrombocytákban és az endothelsejtekben.<br />
A PAI-2 nagy mennyi ségben termelődik<br />
terhességben a placenta által, de megtalálható a<br />
monocytákban is. Az α 2<br />
-antiplazmin és a TAFI a májban<br />
termelődik. A keringésben jelen lévő plazmint az<br />
α 2<br />
-antiplazmin gyorsan inaktiválja. A fibrinhez kötött<br />
forma viszonylagosan védett a gátlás alól, viszont<br />
a plazmin fibrinhez való kötődését az FXIIIa által az<br />
alvadékhoz keresztkötött α 2<br />
-antiplazmin gátolja. A<br />
TAFI-t a trombin-trombomodulin komplex aktiválja,<br />
és az alvadékban jelen lévő fibrinről lizin maradványokat<br />
távolít el, ezáltal megakadályozva, hogy a<br />
plazmin ki tudja fejteni hatását.<br />
11-21. táblázat. Természetes alvadási inhibitorok<br />
Fehérje<br />
antitrombin<br />
protein C<br />
protein S<br />
TFPI<br />
heparinkofaktor 2<br />
α 2<br />
-makroglobulin<br />
α 1<br />
-antitripszin<br />
Funkció<br />
gátolja a trombint, a Xa, IXa, XIa faktort<br />
gátolja a VIIIa és Va faktort<br />
a protein C kofaktora<br />
gátolja a TF-VIIa komplexp C-t és a TAFI-t a trombinnal komplexben<br />
gátolja a trombint<br />
gátolja a trombint és a Xa faktort<br />
gátolja a XIa faktort és más szerin-proteázokat
282 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Véralvadási tesztek<br />
Egy rutin diagnosztikai feladatokat ellátó laboratórium<br />
szintjén a véralvadás folyamatának ellenőrzésére<br />
az ún. véralvadási szűrőtesztek állnak rendelkezésre.<br />
Ezek lehetnek globális tesztek, amelyek arról adnak<br />
felvilágosítást, hogy a fibrinképződéshez vezető reakciók<br />
normálisan folynak-e le, vagy defektus áll fenn<br />
(pl. vérzési idő). A globális tesztek viszonylag érzéketlenek,<br />
segítségükkel csak súlyos alvadási zavar ismerhető<br />
fel. A fázisvizsgálatok segítségével meghatározható,<br />
hogy az alvadási zavar a véralvadás melyik<br />
fázisára lokalizálódik (pl. PI, APTI, TI). A faktoranalízis-vizsgálatoknál<br />
úgy választjuk meg a feltételeket,<br />
hogy az egyes faktorok aktivitását vagy koncentrációját<br />
mennyiségileg tudjuk meghatározni (pl.<br />
fibrinogén). Az alap véralvadási szűrőtesztek tehát:<br />
PI (protrombinidő), APTI (aktivált parciális tromboplasztinidő),<br />
TI (trombinidő) és a fibrinogénmeghatározás.<br />
Minden esetben fontos a thrombocytaszám<br />
meghatározásához egy gépi vérképvizsgálat elvégzése<br />
is. A hemosztázis vizsgálatainak eredményeit jelentősen<br />
befolyásolhatják a preanalitikai tényezők. Ezeket<br />
soroljuk fel a 11-23. táblázatban anélkül, hogy kitérnénk<br />
a részletekre.<br />
A véralvadási mérésekhez koagulométereket használunk.<br />
A koagulométerek a mintához adott reagens<br />
vagy startreagens és a fibrinháló megjelenése között<br />
eltelt időt másodpercben mérik (funkcionális tesztek).<br />
Ezek működhetnek mechanikus és optikai elven.<br />
Az optikai elven működő koagulométerek általában<br />
405 és 660 nm hullámhosszon mérnek. A mérést zavarhatja<br />
a lipaemia, ill. az emelkedett bilirubinszint.<br />
Ennek kiküszöbölésére mérhetünk egy másik hullámhosszon<br />
is, és a keletkezett jelet erre korrigáljuk,<br />
vagy az alvadási végpont meghatározásához a görbét<br />
deriválhatjuk (ez általában az első derivált). Mechanikus<br />
mérés során az ívelt fenekű küvetta alján található<br />
golyó mágneses térben mozog, a fibrinpolimer kialakulásával<br />
egy időben a közeg viszkozitása nő, ami a<br />
golyó mozgásának lassulásához és megállásához vezet.<br />
Ebből lehet megfelelő algoritmus segít ségével az<br />
alvadási időt kiszámolni, ezt az értéket a készülékek<br />
másodpercben kijelzik.<br />
Az alap alvadási paraméterek mérési eredményei,<br />
amennyiben szűrésre használjuk őket, egyrészt felvethetik<br />
a lehetséges diagnózist, másrészt ezek alapján<br />
további speciális tesztek végezhetők el a véralvadási<br />
defektus pontos meghatározásához (11-24. táblázat).<br />
Protrombinidő- (PI-) meghatározás<br />
A citráttal alvadásgátolt thrombocytaszegény plazmához<br />
feleslegben adunk tromboplasztint és kalciumiont,<br />
és a reagens hozzáadása és a fibrinképződés<br />
11-23. táblázat. Preanalitikai tényezők<br />
Mintavétel és feldolgozás<br />
• Mintavétel során kerüljük a hosszan tartó vénás leszorítást (
A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana<br />
283<br />
11-24. táblázat. Véralvadási szűrőteszt eredmények eltéréseinek értelmezése<br />
Teszt<br />
PI APTI TI Fibrinogén<br />
megnyúlt normál normál normál VII-es faktor hiány<br />
normál megnyúlt normál normál<br />
megnyúlt megnyúlt normál normál<br />
megnyúlt megnyúlt megnyúlt normál vagy alacsony<br />
Lehetséges véralvadási defektus<br />
VIII, IX, XI, XII-es vagy kontakt faktor hiány,<br />
lupus-antikoaguláns<br />
II, V, X-es faktor hiány<br />
oralis antikoaguláns terápia<br />
K-vitamin-hiány<br />
kevert V + VIII-as faktor hiány<br />
kevert II, VII, IX, X-es faktor hiány<br />
májbetegség<br />
hypo- vagy dysfibrinogenaemia<br />
májbetegség<br />
masszív transzfúzió<br />
DIC (disszeminált intravascularis koaguláció)<br />
között eltelt időt másodpercben mérjük. A tromboplasztin<br />
szöveti faktort (TF-t) és foszfolipideket tartalmaz,<br />
amely lehet állati eredetű (nyúlagyból, patkányplacentából<br />
kivonva) vagy rekombináns készítmény.<br />
A szöveti faktor a VIIa faktorral reagálva a véralvadás<br />
,,extrinsic,, útját indítja el. Az eredményt megadhatjuk<br />
másodpercben, a normál százalékában, il. PR<br />
(protrombinráta) formájában. Az így kapott eredmények<br />
azonban nagymértékben függnek az alkalmazott<br />
tromboplasztin reagenstől, mivel különböző<br />
érzékenységet mutatnak a II-es, V-ös, X-es és VII-es<br />
faktor irányában. Az oralis antikoaguláns terápián<br />
lévő betegek vizsgálatakor a PIVKA (Proteins Induced<br />
by Vitamin K Absence or Antagonism) zavarja<br />
a PI-meghatározásban részt vevő normál koagulációs<br />
faktorok aktiválását. Ezek a fehérjék a II-es, VII-es,<br />
IX-es és X-es faktor nem-γ-karboxilált prekurzorait<br />
foglalják magukba, amelyek a K-vitamin-antagonista<br />
terápia hatására jönnek létre. Ezért a protrombinidő<br />
nemzetközi szabványosítása érdekében bevezették az<br />
INR (International Normalised Ratio) használatát:<br />
referencia tromboplasztinkészítményhez hasonlítják.<br />
Ennek ISI- (International Sensitivity Index) értéke<br />
1,0.<br />
A PI érzékeny és ily módon megnyúlt a VII-es,<br />
X-es, V-ös és II-es faktor és fibrinogénszint-csökkenés<br />
esetén. Az oralis antikoaguláns terápia monitorozására<br />
használt módszer. Megfelelően antikoagulált<br />
beteg esetében INR = 2-3 közötti célértéket kell<br />
elérnünk, kivéve a műbillentyű-beültetett betegeknél,<br />
ahol ez az érték nagyobb is lehet. A 11-58. ábra mutatja<br />
be a megnyúlt PI esetén elvégzendő szükséges<br />
vizsgálatokat.<br />
INR = PR ISI ,<br />
ahol a PR a beteg plazmájában mért PI/normál plazmából<br />
mért PI (MNPT, Mean Normal PT).<br />
A gyártók által forgalomba hozott különböző érzékenységű<br />
reagenseket egy WHO által bevezetett<br />
11-58. ábra. Megnyúlt PI kivizsgálása<br />
*Ritka esetben a lupus-antikoaguláns is megnyújthatja a<br />
PI-t, azonban ilyen esetben az ATPI is mindig megnyúlik
284 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Aktivált parciális tromboplasztinidő (APTI-) meghatározás<br />
A minta ebben az esetben is thrombocytaszegény<br />
plazma. A reagens parciális tromboplasztin, amely<br />
nem tartalmazza a szöveti faktort, csak a foszfolipidrészt.<br />
A reakció azonban így nagyon lassan zajlana le,<br />
ezért a reagenshez kontakt aktivátort (kaolin, szilika,<br />
elagsav) is hozzáadnak. A minta és a reagens előinkubálása<br />
(aktiválása) után hozzáadott kalcium-klorid<br />
startreagens és a fibrinalvadék megjelenése között eltelt<br />
időt mérjük másodpercben. A módszer a véralvadás<br />
„intrinsic,, és ,,közös” útját modellezi, az ezekben<br />
részt vevő faktorok csökkenése esetén megnyúlik.<br />
Az eredményt normál kontrollhoz viszonyítva (kórosnak<br />
tekinthető a ±8 s eltérés) vagy APTI-ráta (betegnél<br />
mért APTI/normál kontroll APTI) formájában<br />
adjuk meg. Az APTI megnyúlását okozhatja a XII-es,<br />
XI-es, X-es, IX-es, VI-as, V-ös és II-es faktor és a fibrinogén<br />
szintjének csökkenése.<br />
Használjuk nem frakcionált heparin (UFH) terápia<br />
monitorozására. Ilyen esetben az APTI 1,5-2,5-szörös<br />
megnyúlását kell elérni. Megnyúlt APTI-t eredményezhet<br />
lupus-antikoaguláns (LA) jelenléte is. A<br />
11-59. ábra mutatja be a kóros APTI esetén végzendő<br />
további vizsgálatokat. Az APTI jelentős megnyúlása<br />
tapasztalható néha vérzés meg jelenése nélkül is. Ez<br />
XII-es faktor, HMWK (high molecular weight kininogén),<br />
PK (prekallikrein) hiányban, lupus-antikoaguláns<br />
jelenlétében és nem megfelelő vér : citrát arány<br />
esetén észlelhető.<br />
A keveréses teszt során a beteg plazmájához 1:1<br />
arányban normál plazmát keverünk. Ezáltal az alvadási<br />
faktorok minimum 50%-a rendelkezésre áll. Ennek következtében,<br />
ha a keveréses teszt eredményeként normál<br />
APTI-t mérünk, az APTI-megnyúlás hátterében<br />
faktorhiány áll. Nem korrigálható keveréses teszt inhibitor<br />
jelenlétét (heparin, specifikus faktorellenes inhibitor<br />
vagy lupus-antikoaguláns) valószínűsíti.<br />
11-59. ábra. Megnyúlt APTI kivizsgálása
A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana<br />
285<br />
Trombinidő- (TI-) meghatározás<br />
A thrombocytaszegény plazmához meghatározott<br />
mennyiségű trombin reagenst adunk és másodpercben<br />
mérjük a fibrinalvadék megjelenéséig eltelt időt.<br />
A fibrinogén polimerizált fibrinné való átalakulásának<br />
arányát követjük nyomon. Az eredményt normál<br />
kontrollhoz viszonyítva (kórosnak tekinthető a ±8 s<br />
eltérés) vagy TI ráta (betegnél mért TI/normál kontroll<br />
TI) formájában adjuk meg. A TI megnyúlását<br />
okozhatja hypo- vagy dysfibrinogenaemia, heparin<br />
terápia (heparinszennyezettség esetén is), FDP (fibrin/fibrinogén<br />
degradációs termékek) és a fibrin polimerizációját<br />
zavaró faktorok (pl. paraprotein) jelenléte<br />
a mintában. A 11-60. ábra mutatja be a kóros TI<br />
esetén végzendő további véralvadási vizsgálatokat.<br />
Fibrinogénmeghatározás<br />
A fibrinogénkoncentráció meghatározására több<br />
módszer is rendelkezésünkre áll, így direkt meghatározás<br />
kinetikus turbidimetriával, immunkémiai<br />
módszerek és az ún. PI-származtatott vagy derivált<br />
fibrinogén módszer. Ez utóbbi esetében a fibrinogén<br />
koncentrációt a PI mérése során a fényszórás mértékének<br />
változásából vagy optikai denzitásából számítjuk<br />
ki. Előnye, hogy gyors és olcsó. Hátránya, hogy<br />
bizonyos betegcsoportok esetén nem ad pontos eredményt<br />
(pl. DIC, májbetegek, vesebetegek, dysfibrinogenaemia,<br />
trombolitikus terápia, ill. erősen megnyúlt<br />
protrombinidő).<br />
Ezért a fibrinogén meghatározására ajánlott módszer<br />
a Clauss szerinti. Ez biológiai hatás alapján<br />
mér – egy módosított trombinidő-meghatározás -,<br />
az 1:9 arányban hígított plazmához trombint adunk<br />
feleslegben, és másodpercben mérjük a fibrinalvadék<br />
megjelenéséig eltelt időt. Ennek eredményeként a fiziológiásan<br />
jelen lévő inhibitorok hatása elhanyagolhatóvá<br />
válik, és a mért idő csak a mintában jelen lévő<br />
fibrinogén koncentrációjától függ. Ismert fibrinogénkoncentrációjú<br />
plazma hígításaival kalibrációs görbét<br />
készítünk, amelyről a beteg plazmájának fibrinogénkoncentrációja<br />
leolvasható. Az eredményt g/l mértékegységben<br />
adjuk meg (referenciatartomány: 2-4 g/l).<br />
A fibrinogént a máj termeli és az akut fázis fehérjék<br />
csoportjába tartozik. Szintje csökken csökkent<br />
szintézis (pl. májbetegség), megnövekedett felhasz-<br />
11-60. ábra.<br />
Megnyúlt TI<br />
kivizsgálása
286 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
nálás (pl. DIC, hyperfibrinolysis) miatt. Emelkedett<br />
fibrinogénkoncentrációt mérhetünk megemelkedett<br />
szintézis, pl. akut fázis reakció (gyulladás, tumor, trauma,<br />
égés), krónikus gyulladásos reakció (rheumatoid<br />
arthritis, bizonyos autoimmun megbetegedések)<br />
következményeként, fehérjevesztéses állapotokban az<br />
albuminveszteség kompenzálására vagy veleszületetten<br />
(az atherosclerosis rizikófaktora).<br />
Irodalom<br />
Debreczeni L., Kovács L. G. (szerk.): Gyakorlati laboratóriumi<br />
medicina. 2. kiadás, Literatura Medica Kiadó,<br />
Budapest, 2008.<br />
Kitchen, S., Olson, J. D., Preston, F. E. (eds): Quality in<br />
Laboratory Hemostasis and Thrombosis, Wiley- Blackwell<br />
Publishing Ltd, Oxford, 2009.<br />
O’Shaughnessy, D., Makris, M., Lillicarp, D. (eds):<br />
Practical Hemostasis and Thrombosis. Oxford, Blackwell<br />
Publishing Ltd, 2005.<br />
Smith, Stephanie A.: The cell-based model of coagulation.<br />
J. Vet. Emerg. Crit. Care 19(1):3–1, 2009.
A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája<br />
287<br />
A thromboemboliás kórképek<br />
fehérjediagnosztikája<br />
Tőkés-Füzesi Margit<br />
A thromboemboliás kórképek az artériás vagy vénás<br />
keringésben kórosan létrejövő thrombus következményei.<br />
Eredményeként létrejöhet részleges vagy teljes<br />
érelzáródás, ill. a keletkezett vérrögből embolusok<br />
szakadhatnak le, tovább súlyosbítva a kórlefolyást. A<br />
vénás thromboemboliák (VTE) a mélyvénás thrombosist<br />
(MVT) és a pulmonalis emboliát (PE) foglalják<br />
magukba. Az artériás thrombosis elsősorban<br />
akut ischaemiás állapot formájában jelentkezik, ami<br />
érintheti a szívartériákat (akut coronaria-szindróma:<br />
instabil angina, szívinfarktus), az agyi artériákat (átmeneti<br />
agyi ischaemiás attak, agyvérzés), valamint<br />
a végtagok perifériás és a mesenterium artériáit. A<br />
thromboemboliás kórképek diagnosztizálása elsősorban<br />
nem laboratóriumi teszteken alapul. Ilyen<br />
esetekben a laboratórium a mérhető rizikótényezők<br />
felderítésében, a praethromboticus állapot előrejelzésében,<br />
ill. a nehezen diagnosztizálható thrombosis és<br />
pulmonalis embolia kizárásában segítheti a klinikus<br />
munkáját. Praethromboticus állapotban mérhető alvadási<br />
paraméterek:<br />
• Fibrinopeptid A (FPA), amely a fibrinogénből<br />
trombin hatására lehasadó molekula.<br />
• Fibrin monomer.<br />
• Trombin-antitrombin komplex (TAT) kimutatás.<br />
Ezek szintje hamar emelkedik a plazmában, mérésük<br />
viszont költséges és időigényes. Rutin laboratóriumok<br />
szintjén is elvégezhető vizsgálat ilyen esetekben<br />
a D-dimer-mérés.<br />
D-dimer-meghatározás<br />
A fibrinolízis során, mivel a plazmin nem specifikus<br />
enzim (lebontja a fibrinogént, a fibrint és a stabil fibrinhálót<br />
is), különböző fibrindegradációs termékek<br />
(FDP) keletkeznek, pl. D-dimer, DXD fragmentum,<br />
DD/E fragmentum (11-61. ábra). A D-dimer a többi<br />
FDP-vel szemben csak a XIII-as faktor által keresztkötött<br />
fibrinháló plazmin általi hasításakor keletkezik,<br />
ami azt jelenti, hogy létrejöttét mindig thrombusképződés<br />
előzi meg. Kimutatására kvalitatív/szemikvantitatív<br />
gyorstesztek, ELISA, immunturbidimetria és<br />
fluoreszcens immunoassay-k is rendelkezésre állnak.<br />
Ezek közül a legelterjedtebb a turbidimetriás mérés.<br />
Monoklonális antitesttel bevont latexpartikulumokat<br />
tartalmazó reagenshez adjuk a mintát. D-dimer<br />
jelenlétében a partikulumok agglutinálódnak, a fényabszorbancia<br />
csökken. Az abszorbanciaváltozás pedig<br />
arányos a mintában jelen lévő D-dimer mennyiségével,<br />
amelynek értékét ismert koncentrációjú D-dimer<br />
hígításaiból készített kalibrációs görbéről olvasunk le.<br />
Az eredményt a különböző módszerek különböző<br />
mértékegységben adják meg; a hazánkban forgalomban<br />
lévő tesztek mg/l (μg/ml) vagy mgFEU/l (μgFEU/<br />
ml) egységben. A FEU (fibrinogen equivalent unit) azt<br />
a fibrinogénmennyiséget fejezi ki, amelyből az adott<br />
koncentrációjú fibrindegradációs termék keletkezett.<br />
11-61. ábra. A fibrinolízis (P: plazmin; D, E: a fibrinogén D, E régiója; ezek N- és C-terminális fehérjék)
288 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Két μgFEU/ml D-dimer immunreaktivitása annyi,<br />
mint 1 μg/ml tisztított D-dimeré. Ez azt jelenti, hogy<br />
a FEU-ban kifejezett D-dimer-értékek kétszer olyan<br />
magasak lehetnek, mint a D-dimer egységekben kifejezett<br />
értékek. A kvantitatív D-dimer-tesztek eredményei<br />
nem könnyen hasonlíthatók össze egymással,<br />
mivel a különböző tesztekben alkalmazott antitestek<br />
specificitása és affinitása különböző, valamint a kalibrátor<br />
készítmények előállítása is. Ebből adódnak a<br />
különböző referenciatartományok és cut-off értékek,<br />
a legtöbb teszt esetén azonban ez
A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája<br />
289<br />
11-26. táblázat. Ajánlott első vonalbeli kivizsgálások thrombophiliában<br />
Teszt neve Teszt típusa Módszer<br />
véralvadás-szűrőteszt funkcionális APTI, PI, TI<br />
antitrombin<br />
funkcionális<br />
protein C funkcionális kromogén aktivitás<br />
protein S immunológiai szabad PS antigén<br />
heparin kofaktor aktivitás mérés szarvasmarha trombinnal vagy Xa<br />
szubsztráttal<br />
APC-rezisztencia funkcionális minta előhígítása V. faktor hiányos plazmával<br />
vagy<br />
faktor V Leiden-mutáció<br />
protrombin G20210A<br />
DNS alapú<br />
DNS alapú<br />
lupus-antikoaguláns funkcionális alvadás alapú teszt (clotting-based)<br />
antikardiolipin<br />
immunológiai<br />
11-27. táblázat. Thrombophilia kivizsgálásában lehetőség szerint elvégezhető tesztek<br />
Teszt neve<br />
aktivált PC rezisztencia<br />
AT antigén<br />
protein C antig;n<br />
protein C aktivitás<br />
össz-protein S antigén<br />
protein S aktivitás<br />
fibrinogén<br />
fibrinogén<br />
VIII, IX, XI. faktor szint<br />
homocisztein<br />
Módszer<br />
eredeti, nem módosított teszt<br />
immunológiai módszer<br />
immunológiai módszer<br />
alvadás alapú funkcionális teszt<br />
immunológiai módszer<br />
alvadás alapú funkcionális teszt<br />
alvadás alapú funkcionális teszt<br />
immunológiai módszer<br />
alvadás alapú funkcionális teszt<br />
funkcionális vagy immunológiai teszt<br />
mikor alkalmas, és az élet során elegendő egy vizsgálat<br />
elvégzése (FV Leiden, Protrombin 20210A mutációk).<br />
Más alapelven működő tesztek esetében a thrombosis<br />
lezajlása után 3-6 hónappal érdemes elvégezni a<br />
kivizsgálást. Oralis antikoaguláns kezelésen lévő betegek<br />
kivizsgálása nem ajánlott, mivel a protein C, a<br />
protein S és a lupus-antikoaguláns eredmények nem<br />
interpretálhatók. Tartós heparinkezelés csökkenheti az<br />
antitrombin- (AT-) szintet. Amennyiben az antikoaguláns<br />
kezelés nem függeszthető fel, akkor a vizsgálat<br />
idejére ajánlott a beteg kis molekulatömegű heparinkezelésre<br />
való átállítása. Thrombophilia diagnózisát<br />
nem molekuláris teszt végzésekor csak akkor mondhatjuk<br />
ki, ha az két ismételt mintavétel után is pozitív<br />
eredményt adott.<br />
A thrombophilia szűrésére ajánlott teszteket a 11-<br />
26. táblázaton mutatjuk be; részletes leírásuk a megfelelő<br />
helyen a szövegben szerepel. A lehetőség szerint<br />
elvégezhető további teszteket a 11-27. táblázat<br />
foglalja össze.
290 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Antitrombin- (AT-) defektusok<br />
Az előzőleg antitrombin III néven ismert antitrombin<br />
a májban termelődő 58 kDa nagyságú fehérje. A<br />
trombin legfontosabb inhibitora, ugyanakkor más<br />
szerin-proteázokat is gátol, így a Xa, IXa, XIa, XIIa,<br />
valamint a szöveti faktorhoz kötött VIIa faktort is.<br />
Funkcionális szempontból két fontos régiója van: egy<br />
trombinkötő domén a molekula karboxi-terminális<br />
részén (Arg393-Ser394) és egy heparinkötő hely<br />
az N-terminális részen. Heparin nélkül az AT lassan<br />
inaktiválja a trombint, ezt nevezzük az antitrombin<br />
progresszív aktivitásának. Heparin bekötődésekor viszont<br />
az AT konformációváltozáson esik át, ennek<br />
eredményeként az AT és a szerin-proteázok közötti<br />
komplexképződés a 4000-szeresére emelkedik. A heparin<br />
jelenlétében végbemenő gyors trombin- és Xa<br />
faktor inaktiválást nevezzük az antitrombin heparinkofaktor-aktivitásának.<br />
Az AT-hiány a thromboembolia<br />
kialakulásának kockázatát 8-10-szeresére emeli.<br />
A veleszületett antitrombinhiánynak két formája<br />
ismert.<br />
• I-es típusú AT hiány. Ilyenkor a minőségileg jól<br />
működő antitrombin mennyisége csökken,<br />
vagyis mind az AT antigén, mind az aktivitás<br />
csökken.<br />
• II-es típusú AT hiány. Mennyiségileg megfelelő,<br />
de funkcionálisan rosszul működő fehérje termelődik.<br />
Ebben az esetben az AT antigénszint<br />
normál vagy közel normál, de az aktivitás jelentősen<br />
csökkent. A II. típuson belül is három<br />
alcsoportot különböztetünk meg attól függően,<br />
hogy az AT melyik részét érinti a molekuláris<br />
defektus.<br />
Az AT-aktivitás kimutatására alkalmazott tesztek közül<br />
az AT-deficienciák szűrésére a heparinkofaktor-aktivitás<br />
mérése ajánlott, mivel ezzel a klinikailag fontos<br />
eltérések kimutathatók.<br />
A mérés két lépésben megy végbe:<br />
• Az első lépésben a beteg plazmáját ismert menynyiségű<br />
szarvasmarha Xa faktorral inkubáljuk<br />
fölös mennyiségű heparin jelenlétében.<br />
• Majd az el nem reagált Xa faktor aktivitását kromogén<br />
szubsztrát segítségével mérjük. A<br />
szubsztrátról lehasadó kromogén p-nitro-anilint<br />
405 nm-en kinetikusan mérjük. A mért<br />
színintenzitás fordítottan arányos a beteg plazmájában<br />
jelen lévő AT-nal.<br />
Vannak gyártók, akik a Xa faktor helyett IIa faktort<br />
alkalmaznak a tesztben. Az eredményt az aktivitás<br />
százalékában adjuk meg.<br />
Protein C (PC-) defektusok<br />
A protein C a májban zimogén formájában termelődő<br />
62 kDa nagyságú K-vitamin-függő fehérje. K-vitamin<br />
hatására poszttranszlációs módosuláson esik át, vagyis<br />
a fehérjében lévő glutaminsavhelyek γ-karboxilációja<br />
megy végbe. Az aktív protein C kialakulásához a<br />
plazmában kalciumion, trombin és foszfolipid jelenlétére<br />
van szükség. A protein C trombin általi aktiválásához<br />
az endothelsejtekhez kötött trombomodulinra<br />
és endotelhialis protein C-receptorra van szükség. Az<br />
aktivált protein C kofaktora, a protein S jelenlétében<br />
inaktiválja a VIIIa és Va faktort, ezáltal gátolva a trombinképződést<br />
(11-62. ábra). A PC-hiány hétszeresére<br />
emeli thrombosis kialakulásának a kockázatát.<br />
Az öröklött protein C-deficienciának is két formája<br />
ismert:<br />
• I-es típus. A deficienciák 75%-át teszi ki.<br />
Ilyenkor a PC-nek mind mennyiségileg, mind<br />
funkcionálisan csökken a szintje.<br />
• II-es típus. E deficienciában a funkcionális<br />
fehérje szintje csökken az antigénszinthez viszonyítva.<br />
A PC-aktivitás mérésére ajánlott teszthez kromogén<br />
szubsztrátot alkalmaznak; a teszt két lépésben megy<br />
végbe. Az első lépésben a beteg plazmáját inkubáljuk<br />
PC-aktivátorral (Agkistrodom contortrix contortrix<br />
kígyó mérge).<br />
11-62. ábra. A protein C és a protein S rendszer működése
A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája<br />
291<br />
A második lépésben az aktivált PC a kromogén<br />
szubsztrátot hasítja, a felszabaduló p-nitro-anilint pedig<br />
405 nm-en kinetikusan mérjük. A színintenzitás<br />
egyenesen arányos a mintában jelen lévő PC mennyiségével.<br />
Protein S (PS-) defektusok<br />
A protein S 84 kDa molekulatömegű, májban termelődő,<br />
K-vitamin-függő fehérje. A plazmában lévő PS<br />
(protein S) kb. 65%-a a komplement C4b-kötőfehérjéhez<br />
(C4b-BP) kapcsolódik. Ez nem tud kofaktoraktivitást<br />
kifejteni. A maradék szabad PS képes az aktivált<br />
protein C-hez (APC) kötődni, kifejteni kofaktor<br />
hatását és ezáltal részt venni a VIIIa és Va faktor inaktiválásában.<br />
A protein S-hiány thrombosis kialakulásának<br />
a kockázatát nyolcszorosára növeli.<br />
Az örökletes PS hiánynak három formája ismert.<br />
• I-es típus. Kvantitatív hiány, amelynek eredményeként<br />
csökkent mennyiségű, de strukturálisan<br />
normál fehérje termelődik. Ennek következtében<br />
mind a kötött, mind a szabad PS szintje<br />
csökken, ennek eredménye a funkcionális PS<br />
szint csökkenése.<br />
• II-es típusú deficiencia. Kvalitatív elváltozás,<br />
vagyis csökken a PS-aktivitás, amely normál<br />
vagy közel normál össz- és szabad PS-szinttel<br />
párosul.<br />
• III-as típusú deficiencia. A szabad PS antigén és<br />
a funkcionális PS mennyisége csökken, az<br />
össz-PS-mennyiség normál.<br />
A PS-hiány a thrombosis kockázatát nyolcszorosára<br />
növeli.<br />
A PS mérésére használt immunológiai módszerek<br />
mind az aktív, mind az inaktív szabad PS-formát<br />
mérik, ezért a funkcionális szabad PS-mennyiséget<br />
fölémérik. Az össz-PS mérésekor az inkubációs időt<br />
úgy kell megválasztanunk, hogy a PS-nek kellő ideje<br />
legyen kilépni a C4b-BP komplexből és reagálni az<br />
antitestekkel. ELISA-tesztek végzésekor magas hígításra<br />
és a primer antitesttel hosszú inkubációs időre<br />
van szükség. Kezdetben poliklonális antitestet használtak,<br />
amely nem tudott különbséget tenni a kötött<br />
és szabad forma között. Ezért a C4b-BP forma eltávolítására<br />
polietilén-glikolos (PEG) kicsapást alkalmaztak.<br />
A későbbiekben olyan antitestet fejlesztettek<br />
ki, amely a PS C4b-BP-hez való kötőhelyét ismeri fel.<br />
Ezek a szabad PS kicsapás nélküli, direkt mérését tették<br />
lehetővé.<br />
Az utóbbi időben széles körben elterjedt mérési<br />
módszer a latexhez kötött immunológiai mérés. Az<br />
antigén ilyen esetben a szabad PS. Az első lépésben a<br />
tisztított latexhez kötött C4b-BP kalciumion jelenlétében<br />
megköti a beteg plazmájában lévő szabad PS-t.<br />
Második lépésben a szintén latexhez kötött PS ellen<br />
termelt antitest reagál a C4b-BP-hez kötött szabad<br />
PS-sel. Ennek eredményeként agglutináció jön létre,<br />
és a turbiditásváltozás egyenesen arányos a plazmában<br />
lévő szabad PS-sel.<br />
A funkcionális tesztek a PS kofaktoraktivitásán<br />
alapulnak. A plazmában lévő PS kofaktoraktivitásától<br />
függően az aktivált PC antikoaguláns aktivitás fokozódik,<br />
ami az alvadási idő (APTI) megnyúlásával jár<br />
együtt. Amennyiben a plazmához Va faktort is adunk<br />
(amely az aktivált PC szubsztrátja), kiküszöbölhetővé<br />
válik az APC-rezisztens betegben mért téves eredmény.<br />
Aktivált Protein C (APC-) rezisztencia<br />
Az APC-rezisztenciát nem megfelelő antikoagulánsválaszként<br />
határozhatjuk meg egy APTI alapú alvadási<br />
tesztben, ha a plazmához in vitro aktivált protein<br />
C-t adunk. Az APC kofaktorával, a PS-sel együtt a<br />
VIIIa és Va faktort inaktiválja. Az Va faktort az Arg<br />
506 aminosavpozícióban hasítja.<br />
A fokozott alvadékonyságot okozó APC-rezisztencia<br />
hátterében 95%-ban az V-ös faktor génjének<br />
pontmutációja áll, amely az 506-os hasítási helyet<br />
érinti, és Leiden-mutációként vált ismertté. A gén<br />
1691-es pozíciójában a guanin adeninre cserélődik<br />
(G1691A), aminek eredménye az 506-os pozícióban<br />
létrejövő aminosavcsere, az arginin glutaminra cserélődik.<br />
Ennek következménye, hogy az APC lassabban<br />
inaktiválja az Va faktort. Magyarországon az APC-rezisztencia<br />
prevalenciája 10% körüli. A Leiden-mutációra<br />
heterozigóta egyéneknél a thrombosis kockázata<br />
hétszeres, a homozigótáknál (gyakoriság 1:1000)<br />
ez 50-80-szoros is lehet.<br />
Az APC-rezisztencia mérésére használt tesztek<br />
APTI alapúak. Az első generációs tesztekben párhuzamosan<br />
két APTI-t mérünk, egyiket a beteg<br />
plazmájához adott exogén APC, a másikat anélkül,<br />
kalciumion jelenlétében. Az eredményt APC-ráta<br />
formájában adjuk meg, amelyet a két alvadási időből
292 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
képezünk. Képezhetünk normalizált rátát is, amelynek<br />
során a beteg APC-rátáját osztjuk a poolozott<br />
(gyűjtött) normál plazmából mért APC-rátával. Ilyen<br />
esetekben azonban a normál plazmákat ajánlott előzetesen<br />
APC-rezisztenciára leszűrni, mivel egyetlen<br />
Leiden-mutációt hordozó beteg mintája is jelentősen<br />
befolyásolhatja az eredményeket. A teszt nem tekinthető<br />
diagnosztikusnak Leiden mutáció szempontjából,<br />
mivel az eredményeket jelentősen befolyásolja<br />
a plazmában lévő VIII-as faktor, protein S-szint, valamint<br />
az antifoszfolipid-antitestek jelenléte. A teszt<br />
specificitása növelhető, ha a tesztplazmát V-ös faktor<br />
hiányos plazmával hígítjuk (1:4). Az újabb generációs<br />
tesztekben az APTI alvadási teszt nem kontakt aktivációval,<br />
hanem specifikus kígyóméreggel vagy IXa<br />
faktorral, amelyek a X-es faktort közvetlenül aktiválják.<br />
Protrombin 20210A polimorfizmus<br />
A protrombin gén 3’ untranslated (át nem íródó) régiójában<br />
a 20210-es pozícióban a guanin adeninre<br />
(G20210A) cserélődik ki, aminek eredményeként a<br />
plazmában megnő a protrombinszint, növelve ezáltal<br />
thrombosis kialakulásának a kockázatát. Heterozigótákban<br />
a kockázat 2-4-szeres, homozigótákban akár<br />
tízszeres kockázatot is jelenthet.<br />
Kimutatására molekuláris genetikai módszert<br />
használnak.<br />
Antifoszfolipid-antitestek,<br />
lupus-antikoaguláns kimutatása<br />
Az antifoszfolipid-szindróma (APS) a thrombosisok<br />
és a terhesség során bekövetkező komplikációk egyik<br />
fontos oka. Szerzett thrombophilia, autoimmun betegség,<br />
amelyben a tüneteket a plazmában megjelenő<br />
foszfolipid- (PL-) ellenes antitestek okozzák. Ezek az<br />
antitestek átmenetileg, klinikai tünetek nélkül is megjelenhetnek<br />
gyógyszerhatás vagy vírusinfekció (elsősorban<br />
gyermekkorban), bakteriális infekció, ill. parazitás<br />
megbetegedés következményeként. Ebben az<br />
esetben nem tekinthető betegségnek.<br />
Az antifoszfolipid-antitesteket először szisztémás<br />
lupus erythematosisban (SLE) szenvedő betegekben<br />
írták le, akik álpozitív syphilisteszt-eredményt mutattak.<br />
Kiderült, hogy ennek hátterében a plazmájukban<br />
keringő autoantitestek állnak, amelyek képesek<br />
a negatívan töltött foszfolipidekhez – így a kardiolipinhez<br />
– kötődni. Innen ered az antikardiolipin-antitest<br />
(ACA) megnevezés. Ezzel közel egy időben írták<br />
le, hogy a SLE-s betegek in vitro megnyúlt alvadási<br />
idővel rendelkeznek, ami azonban nem jár együtt<br />
vérzékenységgel. A megnyúlt foszfolipid dependens<br />
alvadási teszt eredményt (pl. APTI) normál plazma<br />
hozzáadásával sem lehetett korrigálni, ami inhibitor<br />
jelenlétére mutatott. Ezt az inhibitort nevezték el<br />
lupus-antikoagulánsnak (LA). Paradox módon a lupus-antikoaguláns<br />
jelenléte a SLE-betegekben nem<br />
vérzékenységgel, hanem megnövekedett thrombosiskockázattal<br />
jár együtt. A későbbiek során az antifoszfolipid-antitestekkel<br />
kapcsolatban kiderült, hogy<br />
az antigén tulajdonságot nem maga a foszfolipid<br />
hordozza, hanem a hozzákötött fehérjék. Ezek közül<br />
a legismertebb a β 2<br />
-glikoprotein I, a protrombin, a<br />
XI-es faktor, a protein C, a protein S és az annexin-V.<br />
Ezek akkor exponálódnak, ha anionos PL-hez vagy<br />
negatívan töltött felülethez kötődnek.<br />
Az APS nemzetközileg elfogadott diagnosztikai<br />
kritériumait a 11-28. táblázat mutatja be. A diagnózis<br />
kimondásához legalább egy klinikai és egy laboratóriumi<br />
kritériumnak teljesülnie kell. A laboratóriumi<br />
eredmény akkor tekinthető diagnosztikusnak, ha legalább<br />
két alkalommal 12 hetes különbséggel elvégezve<br />
pozitív. Az LA-t az ISTH SSC LA/PL-függő antitestek<br />
albizottsága iránymutatása szerint kell kimutatni, az<br />
ACA-t pedig standardizált β 2<br />
-glikoprotein I-dependens<br />
ELISA-val.<br />
Az LA kimutatásának laboratóriumi kritériumai:<br />
• Foszfolipidfüggő alvadási teszt megnyúlása LA<br />
jelenlétében.<br />
• A megnyúlást okozó inhibitor kimutatása (keveréses<br />
teszt).<br />
• Az inhibitor PL-függőségének kimutatása:<br />
- relatív korrekció emelt mennyiségű PL-lel;<br />
- a hatás fokozódása a PL hígításával.<br />
• Ha a diagnózis bizonytalan, egyéb coagulopathiák<br />
kizárása (faktorhiány, faktorellenes gátlótest).<br />
A kimutatás lehetőségei:<br />
• A mérésekhez használt plazma (a beteg plazmája<br />
és kontroll normális plazma) centrifugálása<br />
kétszer 20 perc 2000xg-vel.
A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája<br />
293<br />
11-28. táblázat. Antifoszfolipid-szindróma diagnosztikai kritériumai<br />
Klinikai kritériumok<br />
thrombosis:<br />
artériás, vénás vagy kis erek thrombosisa bármilyen szövetben<br />
vagy szervben<br />
terhességi komplikációk:<br />
a morfológiai szempontból normális magzat megmagyarázhatatlan<br />
halála a 10. héten vagy azt követően;<br />
három vagy több megmagyarázhatatlan 10. hét előtti abortusz<br />
egymás után;<br />
34. hét előtti koraszülés súlyos praeeclampsia vagy placentaelégtelenség<br />
következtében<br />
Laboratóriumi kritériumok<br />
IgG és/vagy IgM antikardiolipin-antitest<br />
közepes vagy magas koncentrációban és/vagy<br />
IgG és/vagy IgM anti b 2<br />
-glikoprotein I közepes<br />
vagy magas koncentrációban<br />
és/vagy lupus-antikoaguláns<br />
• LA-érzékeny alvadási idők: APTI, LA-érzékeny<br />
APTI, hígított Russell viperaméreg-idő (RVMI).<br />
A LA-pozitív betegminta LA-érzékeny alvadási<br />
ideje szignifikánsan megnyúlt a kontrollhoz<br />
képest. A PI ritkán nyúlik meg LA jelenlétében,<br />
ennek oka a nagy mennyiségű LA jelenléte<br />
lehet.<br />
• A megnyúlást okozó inhibitor kimutatása keveréses<br />
teszttel. APTI és LA-szenzitív APTI esetében<br />
1:1 vagy 1:4 arányú hígításban végezzük a<br />
mérést. LA jelenlétében a keveréses teszt nem<br />
korrigál. A nem korrigálhatóság megítélésére<br />
számíthatjuk ki a következőket:<br />
1. APTI keverék – APTI kontroll: > 5 s.<br />
2. APTI keverék – APTI kontroll/APTI beteg ×<br />
100: > 15% (Rosner-index).<br />
Hígított Russell viperaméreg-idő teszt esetében a számítás<br />
a következő:<br />
betegplazma kontrollplazma keverék RMVI/kontrollplazma<br />
RMVI: > 1,2.<br />
• A megerősítő tesztek két elven működhetnek:<br />
- A PL csökkenésével a foszfolipidfüggő teszt alvadási<br />
ideje megnyúlik ilyen pl. a RVMI hígított<br />
PL-lel vagy az APTI hígított PL-lel.<br />
- A PL koncentrációjának növelésével az alvadási<br />
idő rövidül; ilyen a thrombocytaneutralizációs<br />
teszt (PNP), a neutralizáció hexagonális<br />
PL-lel és RVMI megerősítő tesztje.<br />
• A PL-ellenes antitestek direkt kimutatására<br />
ELISA technikát használnak.<br />
- Antikardiolipin-antitest (ACA) esetében az<br />
IgG-, IgM-, IgA-nak közepes vagy magas titerben<br />
kell jelen lennie;<br />
- β 2<br />
-glikoprotein I-gyel reagáló antitest kimutatás<br />
esetén az IgG és az IgM.<br />
Irodalom<br />
Debreczeni L., Kovács L. G. (szerk.): Gyakorlati laboratóriumi<br />
medicina. 2. kiadás, Literatura Medica Kiadó,<br />
Budapest, 2008.<br />
Kitchen, S., Olson, J. D., Preston, F. E. (eds): Quality in<br />
Laboratory Hemostasis and Thrombosis, Wiley- Blackwell<br />
Publishing Ltd, Oxford, 2009.<br />
O’Shaughnessy, D., Makris, M., Lillicarp, D. (eds):<br />
Practical Hemostasis and Thrombosis. Oxford, Blackwell<br />
Publishing Ltd, 2005.<br />
Smith, Stephanie A.: The cell-based model of coagulation.<br />
J. Vet. Emerg. Crit. Care 19(1):3–1, 2009.
294 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A testnedvek<br />
fehérje-összetételének<br />
diagnosztikus kémlelése<br />
A könny vizsgálata<br />
Ludány Andrea<br />
A könny mint vizsgálati objektum viszonylag ismeretlen<br />
a laboratóriumi diagnosztikában annak ellenére,<br />
hogy nem invazív módon nyerhető. Egyre több<br />
megfigyelés és vizsgálati eredmény utal arra, hogy<br />
összetételének analízise nem kizárólag a szemészeti<br />
betegségek diagnosztikájában játszhat fontos szerepet.<br />
Információt nyújthat az egész szervezet állapotáról.<br />
Ezért a könnyfehérjék ismeretének mind fiziológiai,<br />
mind patofiziológiai szempontból jelentősége<br />
van.<br />
A könny fiziológiai szerepe és összetétele<br />
A könny a szem külső felszínén filmszerű réteget képez,<br />
ezáltal védelmet biztosít a cornea és a conjunctiva<br />
epithelsejtjei számára mind a külső fizikai kémiai,<br />
mind a kórokozók hatásaival szemben. Összetett<br />
viszkózus folyadékrendszer, amely három rétegből<br />
áll: lipidekből, fehérjékből és elektrolitokból, valamint<br />
mucinszerű anyagokból tevődik össze.<br />
A lipidek a külső fázist, a fehérjék és az elektrolitok<br />
a vízoldékony középső fázist, a „ragadós” szialomucin<br />
komplexek a könnyfilm belső rétegét képezik. A<br />
könny jelentős mucintartalmát, amely glikoproteinekből<br />
és glükóz-aminoglikánokból áll, az emlősökben<br />
a cornea és a conjunctiva kehelysejtjei termelik.<br />
Mind a cornea és conjunctiva epithelsejtjei által termelt<br />
transzmembrán forma, mind a glandula lacrimalis<br />
által szekretált szekretoros mucin jelenléte<br />
szükséges a könnyfilm stabilitásához. Az anorganikus<br />
sókat és glikoproteineket tartalmazó vizes fázist főleg<br />
a könnymirigy (glandula lacrimalis) és a conjunctiva<br />
felső áthajlásában elhelyezkedő járulékos könnymirigyek<br />
állítják elő. A Meibom-mirigy és a szemhéjszéli<br />
faggyúmirigyek (Zeiss- és Moll-mirigyek) a lipideket<br />
szekretálják (11-63. ábra).<br />
A könny fiziológiai szerepe<br />
A könnyfilm nedvesen tartja az avascularis corneát,<br />
így biztosítva a gázcserét a levegő és az epithelsejtek<br />
között. Ha a szem felszínére idegentest vagy<br />
valamilyen vegyi szennyeződés kerül, a reflexesen<br />
beinduló könnyezés kimossa, felhígítja a károsító<br />
idegen anyagokat. A fertőzésektől antibakteriális és<br />
antivirális hatású anyagai (lizozim, laktoferrin, b-lizin,<br />
immunglobulinok: szekretoros IgA) védik meg.<br />
Fontos feladata az epithelsejtek tápanyag- és vitaminellátása,<br />
valamint az anyagcseretermékek eltávolítása.<br />
A könny ezen kívül nélkülözhetetlen metabolitokat is<br />
tartalmaz, mint pl. retinolt, amely szerepet játszik a<br />
cornea transzparenciájának a megőrzésében. Minden<br />
szemhéjzárásnál („pislogásnál”) újraképződik.<br />
Vizsgálataink szempontjából kiemelendő a könny<br />
fehérjetartalma; előállítását nagyrészt a könnymirigy<br />
epithelsejtjei és a sejt közötti térbe vándorolt plazmasejtek<br />
biztosítják. Irodalmi adatok szerint a könnyfehérje<br />
összetételében az emlősfajoknál nagyfokú konzervativizmus<br />
figyelhető meg.<br />
A könny fehérjéi<br />
11-63. ábra. A szem és a könnytermelő szövetek sematikus<br />
ábrázolása. A könnyfilm három rétege<br />
Gachon és munkatársai 1979-ben elektroforetikus<br />
analízissel kb. 60 fehérjét detektáltak és azonosítottak<br />
a könnyben, ezek közül kb. 20 fehérje származik<br />
a könnymirigyből. Némi egyszerűsítést alkalmazva a<br />
könnyproteineket 3 csoportba osztották:<br />
• Fehérjék, amelyek jelen vannak a szérumban és<br />
a könnyben is.
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése<br />
295<br />
• Fehérjék, amelyek csak a könnyben vannak<br />
jelen, a szérumban nem detektálhatók.<br />
• Proteinek, amelyek a könnyben is és az epithelsejtben<br />
is megtalálhatók.<br />
A 2. csoport legjelentősebb képviselője a laktoferrin,<br />
a lizozim és a könnyspecifikus prealbumin (TSPA,<br />
tearspecific prealbumin). Azok a fehérjék, amelyek a<br />
szérumban is és a könnyben is jelen vannak, a conjunctiva<br />
kapillárisainak „szivárgása” során juthatnak<br />
a könnybe. Megfigyelték, hogy a conjunctiva hyperaemiában<br />
szenvedők könnyében nagyobb az albumin<br />
koncentráció, ami jelentős csökkenést mutat kalcium-dobezilát<br />
adásakor. (Ez a gyógyszer csökkenti<br />
a vasopermeabilitast). Azt a következtetést vonták le,<br />
hogy a szérumproteinek a kötőhártya-kapillárisok<br />
„szivárgása” során keverednek a könnyhöz.<br />
Nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás<br />
(HPLC) és tömegspektrometriás (MS) vizsgálatokat<br />
alkalmazva a kutatók 2006-ban már 491 proteint<br />
azonosítottak a könnyben. A 491 fehérje közül 200<br />
intracelluláris, ezek az epithelsejtek pusztulása során<br />
kerülnek a könnybe, 68 extracelluláris, 24 membránfehérje<br />
és 199 nem osztályozható ilyen módon.<br />
A könnymirigy által termelt fehérjék: lizozim, laktoferrin,<br />
EGF, lipokalin és IgA<br />
A lizozimet Fleming azonosította először a könnyben,<br />
1922-ben. Ez a lizoszómákban termelődő glikolitikus<br />
enzim a könnyben fordul elő legnagyobb<br />
arányban. Antibakteriális hatású, normális szintje<br />
0,6-2,6 mg/ml.<br />
A laktoferrin szintén antibakteriális hatású, a<br />
könnymirigy acinussejtei termelik. Elsőként 1966-<br />
ban detektálták a könnyben. ELISA-val vizsgálták a<br />
könny laktoferrintartalmát: a total protein 25%-át teszi<br />
ki, átlagos koncentrációja 2 mg/ml. Reverzibilisen<br />
képes kötni két vasatomot, ez magyarázza antibakteriális<br />
hatását. Bakteriosztatikus hatása mellett a klaszszikus<br />
komplementrendszer erős inhibitora. Szintje<br />
jelentősen csökkenhet egyes betegségekben, főleg<br />
olyanokban, amelyekhez száraz szem szindróma is<br />
társul. Ilyen betegség például a hepatitis C fertőzés.<br />
Abe és munkatársai 42 hepatitis C-ben szenvedő beteget<br />
vizsgáltak, és azt találták, hogy mind a könny<br />
volumene, mind a laktoferrin szintje csökken a szisztémás<br />
betegségben [1]. A gyulladással járó szembetegségek<br />
(pl. conjunctivitisek) szintén csökkent laktoferrinszinttel<br />
járnak. A humán könny lizozim- és<br />
laktoferrin koncentrációja jól tükrözi a könnymirigy<br />
funkcióját.<br />
A könnyben jelentős mennyiségben találhatunk<br />
még EGF (epidermal növekedési faktor) fehérjét is,<br />
amely a cornea épségére vigyáz, az apró sérüléseket<br />
állítja helyre. Sjögren-szindrómában az EGF szintje<br />
jelentős csökkenést mutat. Szintjének pontos mérésére<br />
ELISA módszert dolgoztak ki, koncentrációját 1,6<br />
ng/ml-nek találták.<br />
A lipokalin olyan savas protein, amely bőséges<br />
mennyiségben van jelen a könnyben. 1956-ban detektálták<br />
és azonosították először. Segíti a magas<br />
viszkozitás fenntartását, a könnyfilm felületi feszültségének<br />
csökkentését, ezáltal hozzájárul a könnyfilm<br />
stabilitásának megőrzéséhez. A lipokalin a fő lipidkötő<br />
fehérje a könnyben. Emellett rendelkezik antibakteriális<br />
és antivirális hatással is, hiszen endonukleáz<br />
aktivitása és cisztein proteáz gátló hatása van.<br />
A szekretoros IgA a legjelentősebb mennyiségben<br />
jelen lévő immunglobulin a könnyben, első védelmi<br />
vonalként szerepel.<br />
Szérumproteinek: albumin, transzferrin, IgG és IgM<br />
Az albumin azonos a szérumban lévő albuminnal.<br />
A humán könny minor komponense, de bármilyen<br />
conjunctiva stimulációra nő a mennyisége a már említett<br />
fokozott éráteresztés miatt.<br />
A transzferrin hatása hasonló a laktoferrinéhez,<br />
csak kisebb koncentrációban van jelen. A könnybe<br />
a többi szérumproteinhez hasonlóan passzív transzport<br />
útján kerül. Gyulladás esetén nagyobb mennyiségben<br />
található IgE, IgG és IgM.<br />
Egyéb proteinek: akvaporin-5 és gyulladásos fehérjék<br />
Az akvaporin-5 olyan membránprotein, amely nagyobb<br />
mennyiségben expresszálódik a könny- és a<br />
nyálmirigyekben. Normális esetben az acinaris és a<br />
ductalis sejtek apicalis membránjában mutatható ki.<br />
Sjögren-szindrómában az akvaporin-5 megoszlása<br />
változik meg: a citoplazmában marad, és nem jut ki<br />
az apicalis membránba.<br />
Száraz szem szindrómában a gyulladásos markerek<br />
emelkedést mutatnak a könnyben: nagyobb koncentrációban<br />
van jelen az IL-1α és IL-1-β, az IL-6, az IL-<br />
8, a TGF-β 1<br />
és a TNF-α. A csökkent könnytermelés<br />
miatt kialakuló apró sérülések a conjunctiván gyul-
296 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
ladásos környezetet teremtenek, megnő a különböző<br />
citokinek mennyisége, a védő EGF fehérje mennyisége<br />
viszont csökken.<br />
További fehérjéket is identifikáltak kis koncentrációkban<br />
a könnyben. Ilyen többek között: az amiláz, a<br />
peroxidáz, a plazminogénaktivátor, az alvadási faktor<br />
XIII, a prolaktin, a TGF-b, az endotelin-1, a retinol.<br />
Természetesen ez a felsorolás korántsem teljes így<br />
sem. A humán könnyben még jó néhány fehérje vár<br />
azonosításra, amelyek funkciója egyelőre ismeretlen.<br />
Kiemelendő, hogy a könny nagy total protein tartalma<br />
mellett egyre nagyobb lehetőség nyílik érzékeny<br />
analitikai eljárásokkal újabb fehérjék kimutatására és<br />
a proteomika jövőbeni alkalmazására.<br />
A könnyfehérjék vizsgálata – klinikai<br />
diagnosztikai lehetőségek<br />
Szemészeti vonatkozások – a száraz szem<br />
szindróma<br />
A szemgolyót borító folyadék a szemhéjak sima mozgását<br />
„kenőanyagként” is segíti. Így a könnytermelés<br />
csökkenése, a könny összetételének megváltozása révén<br />
a könnyfilm instabillá válhat, felszakadhat, bizonyos<br />
esetekben teljesen hiányozhat. Ilyenkor a cornea<br />
és a conjunctiva kiszáradhat, kiszáradás okozta szaruhártya-<br />
és kötőhártya-gyulladás, keratoconjunctivitis<br />
sicca alakulhat ki. A keratoconjunctivitis sicca<br />
enyhébb és súlyosabb formái igen gyakoriak. Az etiológiája<br />
igen összetett.<br />
Az 1996-ban született új felosztás (Report of the<br />
National Eye Institute/Industry Workshop on Clinical<br />
Trials in Dry Eyes) a különböző száraz szem formákat<br />
két fő csoportba sorolja:<br />
• A csökkent könnytermelésen, a szem kisebb<br />
könnytartalmán alapuló száraz szem (tear-deficient<br />
dry eye, TDDE).<br />
• A fokozott könnyvesztésen, a könnyfilm instabillá<br />
válásán vagy kifejezett párolgáson alapuló<br />
száraz szem (evaporative dry eye, EDE).<br />
Csökkent könnytermelésen alapuló száraz szem<br />
(TDDE)<br />
Erre a csökkent könnytermelés és az alacsonyabb<br />
könnytartam jellemző, és az ebből adódó tünetek:<br />
égő, viszkető, szúró érzés. A könnydeficiens száraz<br />
szem csoportját további két alcsoportra lehet osztani:<br />
• Nem Sjögren-szindrómás, de csökkent könnytermelésen<br />
alapuló száraz szem (Non-Sjögren<br />
Tear Deficient Dry Eye, NSTD).<br />
• Sjögren-szindrómához társuló, csökkent könnytermelésen<br />
alapuló száraz szem (Sjögren<br />
Syndrome Tear Deficient Dry Eye, SSTD).<br />
A keratoconjunctivitis sicca gyakran szisztémás betegség,<br />
azaz a Sjögren-szindróma részjelensége lehet. A<br />
szemszáradás xerostomiával, ízületi panaszok nélkül<br />
(primer) vagy valamilyen szisztémás autoimmun betegség<br />
(SLE, rheumatoid arthritis, dermatomyositis<br />
stb.) talaján alakul ki (szekunder). A primer Sjögren-szindrómát<br />
az egyéb kötőszöveti betegségektől a<br />
könny fehérjetartalmának változásával lehet megkülönböztetni.<br />
Az albumin:laktoferrin 2:1-nél nagyobb<br />
aránya sokkal gyakoribb primer Sjögren-szindrómásoknál.<br />
Az életkor előrehaladtával kismértékben csökken<br />
a könnymirigy által termelt fehérjék koncentrációja.<br />
Ezen kívül a nem is befolyásolja a könnymirigy funkcióját.<br />
A humán könny-peroxidáz aktivitása ugyanis<br />
különbözik férfiakban és nőkben. A menopauza során<br />
– az ösztrogénszint változásával – nőkben szignifikánsan<br />
csökken a peroxidázaktivitás, így ez magyarázhatja<br />
a változókorban lévő nőknél a száraz szem<br />
szindróma gyakori előfordulását.<br />
Fokozott könnyvesztésen, a könnyfilm instabillá<br />
válásán vagy kifejezett párolgáson alapuló száraz<br />
szem (EDE)<br />
Normális könnytermelés mellett is száradhat a<br />
szem felszíne. Megváltozhat a könny összetétele, a<br />
könny nem nedvesíti a felszínt, „lepereg”.<br />
Diabeteses betegeknél megfigyelték, hogy szignifikánsan<br />
gyakoribb a száraz szem szindróma előfordulása.<br />
A szemhéjak és a pislogás rendellenességei,<br />
amikor nem képződik időről időre újra a könnyfilm,<br />
nem záródik a szemrés, fokozott párolgás van jelen.<br />
A cornea felszínének makroszkópos vagy mikroszkópos<br />
elváltozásai, felületi egyenetlenségei és szintkülönbségek<br />
miatt instabillá válik a könnyfilm, vagy ki<br />
sem alakul.<br />
Kontaktlencse jelenléte miatt is kialakulnak a<br />
szemszáradás tünetei, ugyanis kontaktlencsét viselő
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése<br />
297<br />
szemen a könnyfilm elvékonyodik, könnyebben felszakad,<br />
közvetlen epithelkárosodás is létrejöhet. Az is<br />
kiderült, hogy a lágy, hidrofil kontaktlencsét viselőknél<br />
a lencsén talált fehérjedepozitumok lizozimdimerek,<br />
ill. polimerek, melyek a normális könnyben ilyen<br />
formában nincsenek jelen.<br />
A könnyfehérjék vizsgálata szisztémás<br />
betegségekben<br />
Egyre több közlemény utal arra, hogy a könnyfehérjék<br />
vizsgálatát nem csak „lokális”, szemészeti, hanem<br />
az egész szervezetet érő szisztémás betegségekben is<br />
hasznosítani lehet. A mintavétel nem invazív, fájdalommentes,<br />
és így könnyedén szerezhetünk információkat<br />
a szervezet állapotáról.<br />
Diabetes mellitus<br />
Leginkább kiemelt célcsoportja az ezzel kapcsolatos<br />
kutatásoknak a diabetes mellitus. Úgy tűnik, a<br />
diabeteses betegek könnyfehérje-összetételében más<br />
jellegű megoszlási mintázatok vannak, mint azoknál<br />
a cukorbetegeknél, akiket száraz szem tünetekkel<br />
kezeltek. Ez az új fehérjemintázat-beli változás<br />
(amely specifikusan a 30-50 kDa molekulatömegű<br />
tartományban detektálható, és egészségeseknél nem<br />
észlelhető) további vizsgálatok tárgyát képezheti.<br />
A cukorbetegség időtartama és ezen fehérjemintázat-beli<br />
változások között szoros összefüggést mutattak<br />
ki, vagyis minél hosszabb ideje tart a betegség,<br />
annál több fehérjeexpressziós változás figyelhető meg<br />
a könnyben. További vizsgálatok szükségesek annak<br />
tisztázására, hogy ezek az eltérések összefüggnek-e a<br />
diabeteses retinopathia kialakulásával.<br />
Az 1-es típusú diabetesben szenvedő betegek többsége<br />
határozottan mutatja a kötőhártya-betegségre<br />
utaló jeleket annak ellenére, hogy náluk a könnyelválasztás<br />
funkcionális próbái, mint pl. a basalis könnyáramlás<br />
(basal tear flow) és a szemészeti diagnosztikában<br />
használt könnyfilm-stabilitási próba (tear<br />
brake-up time) a normális tartományba esnek.<br />
Dohányzás<br />
A dohányzás - mint számos betegség ismert rizikófaktora<br />
– is okozhat száraz szem szindrómát. A<br />
könny elektroforetikus fehérjemintázata dohányzóknál<br />
megváltozik, és ezek a proteineltérések a száraz<br />
szem tüneteinek súlyosságával párhuzamosan nőnek.<br />
Krónikus hepatitis C<br />
E betegekben is kimutatták, hogy mind a könny<br />
mennyisége, mind a könnymirigy által termelt fehérjék<br />
(laktoferrin) koncentrációja csökken. Ez a glandula<br />
lacrimalis díszfunkciójára utal e betegségcsoportban,<br />
ami száraz szem tünetként jelenik meg.<br />
Daganatos betegségek<br />
A könnyfehérjék vizsgálata új fordulatot hozhat<br />
néhány daganatos betegség vonatkozásában is. Mai<br />
irodalmi adatok szerint daganatos megbetegedésekben<br />
nem csak a szérum, hanem a könnyfehérjék<br />
összetétele is megváltozik. A humán könny térképezése<br />
során felfedezett lakriglobin nagy szekvenciaazonosságot<br />
mutat a mellrákban „túlexpresszálódó”<br />
mammaglobinnal. Lakriglobin jelenlétét detektálták<br />
mell-, prostata-, tüdő-, ovarium- és vastagbél-daganatos<br />
betegek nagy százalékban. További vizsgálatok<br />
szükségesek a lakriglobin könnybeli szekréciója és a<br />
daganatos megbetegedések megjelenése közötti öszszefüggések<br />
kiderítéséhez.<br />
A könny fehérjéinek változása 2-es típusú diabetes<br />
mellitusban<br />
Világszerte több mint 100 millió ember szenved<br />
diabetes mellitusban és ennek a szisztémás anyagcsere-betegségnek<br />
a szövődményeiben. Számos szemészeti<br />
komplikáció felmerülhet, amelyek akár vaksághoz<br />
is vezethetnek. A cataracta kialakulásának<br />
kockázata 2-4-szer nagyobb az átlagpopulációhoz<br />
képest, a száraz szem szindróma súlyossága pedig<br />
korrelációt mutat a diabeteses retinopathia fennállásával<br />
(11-29. táblázat).<br />
Minél hosszabb ideje tart a diabetes, annál jelentősebbek<br />
a könnyben lévő változások. Elektroforézissel<br />
vizsgálva a diabetes mellitusban szenvedők könnyfehérje-mintázatát,<br />
jelentős különbségek vannak az<br />
egészségesekéhez képest. A fő proteinek: a lizozim,<br />
a laktoferrin, a lipokalin és az albumin változatlan<br />
képet mutatnak, de a proteincsúcsok számában emelkedés<br />
figyelhető meg. A legjelentősebb változások a<br />
30-50 kDa közötti tartományban vannak. A feltételezések<br />
szerint ezek az „új” proteinek valójában az<br />
eredeti fehérjék glikozilált változatai, és felelősek a<br />
szemészeti komplikációk kialakulásáért a diabeteses<br />
betegek körében.<br />
Klinikai vizsgálatok igazolták, hogy a diabetesben<br />
szenvedők Schirmer-teszttel nyert eredményei „rosz-
298 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-29. táblázat. A cukorbetegség szemészeti szövődményei<br />
Szemgolyón kívül jelentkező szövődmények<br />
• szemhéjszéli gyulladás (blepharitis), xanthelasma<br />
• száraz szem szindróma<br />
• kötőhártyai értágulatok<br />
• orbitalis mucormycosis<br />
• a külső szemmozgató izmok paresise [n. abducens<br />
(VI.), n. oculomotorius (III.)]<br />
• látóideg-neuropathia<br />
A szem belsejében jelentkező szövődmények<br />
• a corneában Descemet-membrán-redők<br />
• az elülső szemcsarnok melaninpigmentációja<br />
• glaucoma<br />
• rubeosis iridis<br />
• az akkomodáció (közelre tekintési alkalmazkodóképesség)<br />
romlása<br />
• fénytörésváltozások (átmeneti rövidlátás, túllátás)<br />
• időskori szürkehályog korai jelentkezése, diabeteses<br />
hópehely-cataracta<br />
• retinopathia diabetica<br />
szabbak”, mint az egészséges önkéntesekéi, azaz a cukorbetegek<br />
körében sokkal gyakoribb a száraz szem<br />
kialakulása, ami paradox módon néha könnyezéssel<br />
jár (ennek a könnynek azonban teljesen más az öszszetétele,<br />
mint a normálisénak) A reflexkönny menynyisége<br />
is szignifikánsan kevesebb a diabeteses csoportban,<br />
ami magyarázza a cornea és a conjunctiva<br />
nagyobb érzékenységét, fogékonyságát a különböző<br />
betegségekre.<br />
Ajánlott módszertani megközelítések<br />
a könny vizsgálatakor<br />
Mintavétel, mintakezelés<br />
Könnyminta vételére kétféle módszer alkalmazható:<br />
• Reflexkönnyet stimulálva (pl. szagingerrel)<br />
nagyobb mennyiségű, „hígabb” minta nyerésére<br />
van lehetőség. A mintavételhez megfelelően<br />
kialakított, hajlékony, kereskedelmi forgalomban<br />
kapható kapillárisvégű Eppendorf-pipetták<br />
alkalmasak. A könnyet a conjunctiva alsó fornixából,<br />
annak érintése nélkül vesszük. Mérhető<br />
mintavolumen esetén (a kapilláris „hitelesítésével”)<br />
a fehérjekoncentráció az eredeti könnymintában<br />
mg/ml (g/l) értékben is kifejezhető.<br />
• Másik módszerként a szemészeti gyakorlatban<br />
ismert és diagnosztikai célra is alkalmazott<br />
Schirmer-teszt szolgálhat. A teszt a megnedvesedő<br />
szűrőpapír kockák számából enged a<br />
könnymennyiségre következtetni. Hátránya,<br />
hogy ez a mintavétel pontos volumenadatok<br />
meghatározására nem alkalmas. Előnye gyorsasága<br />
és egyszerűsége, hiszen a tesztcsíkot a beteg<br />
magának is felhelyezheti. Mindössze néhány<br />
percet vesz igénybe a mintavétel. További előnye,<br />
hogy az alapszekréciót képes mutatni stimuláció<br />
nélkül. Bizonyos esetekben standardizált<br />
gyűjtési időre is szükség lehet (11-64. ábra).<br />
A könnymintákat pufferoldatban hígítottuk, a felhasználásig<br />
pedig -70 °C-on tároltuk. (Pufferoldat:<br />
150 mM TRIS-HCl, pH 6,8; 1 mM EDTA; 4 mM<br />
EGTA; 0,2 mM PMSF.)<br />
Mennyiségi mérések - ajánlott fehérjemeghatározások<br />
A könny nagy fehérjetartalmú szekrétum: reflexes<br />
mintákban 2,9-8,6 mg/ml, a basalis szekréciónál<br />
pedig még nagyobb a fehérjekoncentráció. A fehérjemeghatározáshoz<br />
az eredeti könny nagy fehérje<br />
koncentrációja miatt a Benedikt-módszer (fehérjemeghatározás<br />
mikrobiurettel) és a hígított mintákhoz<br />
a Bradford-módszer (festékkötésen alapuló eljárás) a<br />
megfelelő. A Bradford-módszer a Schirmer-tesztes<br />
eljárásnál ajánlott, nagyságrenddel nagyobb érzékenysége<br />
miatt. Itt ugyanis a könny hígításával kell<br />
számolni a tesztpapírból való mintaextrakció miatt.<br />
A Schirmer-tesztben a könnymintákat a mintavétel<br />
során olyan „feltáró” oldattal kezeljük, amely a további<br />
analízisekig ideális médiumként szolgál: azaz puf-<br />
Filter<br />
paper<br />
11-64. ábra. Schirmer-teszt
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése<br />
299<br />
ferolt, proteolízist gátló rendszer, megelőzi a fehérjék<br />
esetleges autolízisét, és a hígulással a könnyminta<br />
nagy mucintartalmából eredő kezelési nehézségeket<br />
is áthidalja.<br />
A mért értékek vonatkoztatásai, értékelései.<br />
Automatizált sorozatméréseknél (pl. célzott specifikus<br />
fehérjevizsgálatok) a kapott vizsgálati eredményeket<br />
minden esetben az összfehérje-koncentrációra<br />
vonatkoztatjuk, tehát a mért specifikus fehérje pg/ml<br />
értéket az összfehérje mg/ml koncentráció egységére<br />
számoljuk. Így kerülhetjük el az abból adódó problémát,<br />
hogy nem ismerjük a Schirmer-teszttel vett<br />
könnyminták eredeti fehérjekoncentráció-adatait.<br />
A minták fehérje-összetétele – elválasztási és detektálási<br />
technikák<br />
SDS elektroforézis lapgélen – kombinált ezüstözéssel<br />
A donor (egészséges) könnyminták fehérje-összetételét<br />
egydimenziós SDS poliakrilamid-lapgél elektroforézissel<br />
standard körülmények között (12,5%-os<br />
gélkoncentráció) vizsgálva azt találtuk, hogy a humán<br />
könny összetétele kombinált ezüstözési technikával<br />
jól detektálható. A fehérjék között különböző molekulatömegű<br />
fehérjék szerepelnek, ami az elektroforetogramokon<br />
jellegzetes mintázatot mutat (11-65.<br />
ábra), (lásd 4. fejezet).<br />
Western blot eljárás – Gallyas-féle és ECL-előhívással<br />
Az irodalomban közölt könnyfehérjék (lizozim,<br />
laktoferrin, IgA, szérumalbumin, lipokalin, lipofilin)<br />
közül immunoblotting eljárással alkalmunk volt magunknak<br />
is a lizozimet (14 kDa) és a laktoferrint (75<br />
kDa) azonosítani. Western blottal mind a peroxidáz<br />
alapú immundetektálást a Gallyas-féle ezüstözéssel,<br />
mind az ECL-előhívással sikerült a könnymintákra<br />
adaptálnunk (ECL: Enhanced Chemiluminescence:<br />
erősített kemilumineszcenciás detektálás). Míg a<br />
Gallyas-féle ezüstözés mennyiségi megítélésre ismerten<br />
kevésbé alkalmas, addig az ECL-detektálás KO-<br />
DAK Image Station 2000R készülékünk segítségével<br />
mennyiségi meghatározást is lehetővé tesz (lásd 4. fejezet).<br />
Kétdimenziós nagy feloldású elektroforézis (O’Farrell)<br />
– fehérje térkép<br />
Az O’Farrell-féle fehérjeszeparálás előzetes dúsítást<br />
igényel az analízisekhez. A fehérjék detektálása<br />
11-66. ábra. Immunoblotting. Humán könny lizozim<br />
[Ni-DAB + ezüst (Gallyas-féle) előhívással; 1-7: egyedi<br />
könnyminták; 3-3 mg protein/pászta]<br />
11-65. ábra. Könnyminták 12,5% SDS lapgél összehasonlító<br />
elektroforetogramja kombinált ezüstözéssel (1-6-ig<br />
egyedi könnyminták, pásztánként 1,3 µg proteinnel, Willoughby-féle<br />
ezüstözéssel)<br />
11-67. ábra. Immunoblotting. Humán könny laktoferrin;<br />
ECL-detektálás (ECL: enhanced chemiluminescence)<br />
(egyedi könnyminták: 3-3 µg protein/pászta, gyűjtött minta:<br />
8 µg)
300 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Marshall szerint módosított ultraszenzitív ezüstözési<br />
eljárással végezhető. Ily módon 75 µg könnyfehérjéből<br />
sikerül elegendő intenzitású detektálást elérnünk<br />
(11-68. ábra).(lásd 4. fejezet).<br />
Könnyfehérjék azonosítása kiegészítő MALDI TOF<br />
MS technikával<br />
Értékes további információk szerezhetők az említett<br />
szeparálási és detektálási eljárások tömegspektrometriás<br />
kombinációival: különösen azért, mert ez<br />
már a proteomika megvalósítását eredményezheti<br />
olyan nem szokványos vizsgálati anyagoknál, mint a<br />
könny (11-69. ábra).<br />
Tömegspektrometriával laktoferrint, szérumalbumint,<br />
b-aktint, lipokalint (más néven orozomukoidot),<br />
lizozimet és immunglobulin-fragmentumokat<br />
sikerült magunknak is egészséges donorok mintáiból<br />
azonosítani. További frakciók azonosítása, valamint<br />
az analízisek kiterjesztése a betegmintákra vizsgálataink<br />
jövőbeni irányát jelenti.<br />
[4] Bjerrum, K. B.: The ratio of albumin to lactoferrin in<br />
tear fluid as diagnostic tool in primary Sjögren’s syndrome.<br />
Acta Ophthalmol. Scand. 75:507-511, 1997.<br />
[5] Bradford, M. M.: A rapid and sensitive method for<br />
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing<br />
the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.<br />
72:248-254, 1976.<br />
[6] Dékány Helga: Fehérje elválasztási és detektálási<br />
módszerek alkalmazása szemészeti vizsgálati anyagokon<br />
– különös tekintettel a könnyre. Diplomamunka<br />
PTE/ÁOK 2009.<br />
[7] Evans, V., Vockler, C., Friedlander, M et al.: Lacryglobin<br />
in human tears, a potential marker for cancer.<br />
Clin. Experiment. Ophthalmol. 29:161-163, 2001.<br />
[8] Grus, F. H., Sabuncuo, P., Augustin, A. et al.: Effect<br />
of smoking in tear proteins. Graefes Arch. Clin. Exp.<br />
Ophthalmol. 240:889-892, 2002.<br />
[9] Grus, F. H., Sabuncuo, P., Dick, H. B. et al.: Changes<br />
in the tear proteins of diabetic patients. BMC Ophthalmol.<br />
2:4, 2002.<br />
[10] Grus, F. H., Joachim, Stephanie C., Pfeiffer, N.:<br />
Proteomics in ocular fluids. Proteomics Clin. Appl.<br />
1:876-888, 2007.<br />
Irodalom<br />
[1] Abe, T., Nakajima, A.., Matsunaga, M. et al.: Decreased<br />
tear lactoferrin concentration in patients with chronic<br />
hepatitis C. Br. J. Ophthalmol. 83:684-687, 1999.<br />
[2] Argueso, P., Gipson, I. K.:Epithelial mucins of the<br />
ocular surface: structure, biosynthesis and function.<br />
Exp. Eye Res. 73:281-289, 2001.<br />
[3] Ballow, M., Donshik, P. C., Rapacz, P. et al.: Tear<br />
Lactoferrin levels in patients with external inflammatory<br />
ocular diseases. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 28:543-<br />
545, 1987.<br />
11-68. ábra. Humán könny kétdimenziós fehérjetérképe<br />
nagy feloldású O’Farrell-technikával<br />
(12,5%-os gélkoncentráció; pH 3-10; Marshall szerinti<br />
ezüstözés; a proteinmennyiség 75 µg)<br />
11-69. ábra. Könnyfehérjék elektroforetikus fehérjefrakcióinak<br />
azonosítása MS-technikával<br />
1. Laktoferrin (1BKA) 77 572 Da<br />
2. Szérumalbumin (AAA98798) 71 177 Da<br />
3. Ismeretlen<br />
4. b-aktin (Q53G76) 42 036 Da<br />
5. pHL E1F1 (154810) 15 088 Da<br />
könny (AAM94338) 15 088 Da<br />
Ig könnyűlánc Fab fragmentum a5b7 lánc a (1AD0A)<br />
23431 Da<br />
Ig k lánc V-III régió (K3HUGO) 11937 Da<br />
6. Könny-lipokalin (LCHUL) 19 409 Da<br />
7. Lizozim (134L) 15 120 Da
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése<br />
301<br />
[11] Hartmann Ágnes: Módszerek a könnyfehérjék öszszehasonlító<br />
mikroanalízisére. Diplomamunka PTE/<br />
ÁOK 2007.<br />
[12] Klaeger, A.J., Cevallos, V., Sherman, M. D. et al.:<br />
Clinical application of homogenous colorimetric assay<br />
for tear lysozyme. Ocul. Immunol. Inflamm. 7:7-15,<br />
1999.<br />
[13] Marcozzi, G., Liberati, V., Madia, F. et al.: Age- and<br />
gender-related differences in human lacrimal fluid peroxidase<br />
activity. Ophthalmologica 217:294-297, 2003.<br />
[14] Marshall, T.: Detection of protein in polyacrylamide<br />
gels using an improved silver stain. Anal Biochem.<br />
1984; 136: 340-346.<br />
[15] Németh J.: A cukorbetegség szemészeti szövődményei.<br />
Családorvosi fórum 7: 14-17, 2005.<br />
[16] Redl, B.: Human tear lipocalin. Biochim. Byophys.<br />
Acta 1482:241-248, 2000.<br />
[17] Scott, G., Mowrey-McKee, M.: Dimerization of<br />
tear lysozyme on hydrophilic contact lens polymers.<br />
Curr. Eye Res. 15:461-466, 1996.<br />
[18] de Souza, G., Godoy, A., Lyris, M. F. et al.: Identification<br />
of 491 proteins in the tear fluid proteome reveals<br />
a large number of proteases and protease inhibitors. Genome<br />
Biology 7:R72, 2006.<br />
[19] Xu Shengyuan, Venge Per: Lipocalins as biochemical<br />
markers of disease. Biochimica et Biophysica Acta<br />
1482:298-307, 2000.<br />
A nyál fehérjéinek vizsgálata<br />
Kőszegi Tamás<br />
A nyál biológiai funkciói<br />
Régóta ismert, hogy a nyálmirigyek szekrétumából<br />
és a szájüregben lévő sejtes elemekből kialakuló<br />
nyál fontos és sokrétű szerepet tölt be a szájüreg és<br />
az emésztőrendszer épségének fenntartásában. A legismertebbek<br />
ezek közül az antimikrobiális, sebgyógyulást<br />
segítő vagy a fogszuvasodást, fogkőképződést<br />
gátló hatások. A nyál emésztőenzim-tartalmánál fogva<br />
részt vesz a szénhidrátok és a zsírok lebontásában<br />
is. Ezen kívül mucinban gazdag fehérjéi segítségével<br />
védőbevonatot képez a fogakon és a nyálkahártyákon,<br />
„kenőanyagként” működve. A nyál pH-ja enyhén lúgos,<br />
ami a savtermelő bakteriális tevékenységet ellensúlyozza,<br />
ezzel is védve a fogzománc épségét. A nyál<br />
képes a fogzománc mikrosérüléseivel kölcsönhatásba<br />
lépve elősegíteni azok regenerációját. Az étkezés<br />
során a kellően alapos rágás nem csak az emésztést<br />
könnyíti meg, de az étel bevonásával védi a nyelőcsövet<br />
és a gyomornyálkahártyát az irritáló hatásoktól.<br />
Mindezeket a hatásokat a nyál elsősorban speciális<br />
fehérje-összetételének köszönhetően fejti ki.<br />
A kedvező hatások mellett a nyálfehérjék kétélű kardként<br />
is viselkedhetnek: egy részük képes a cariogen<br />
baktériumok adhézióját elősegíteni vagy a savtermelő<br />
bakteriális tevékenységet fokozni. A nyál fehérje-öszszetétele<br />
az egyénre jellemző, nukleotidpolimorfizmusoknak<br />
köszönhetően bizonyos fehérjék expreszsziója<br />
és funkciója is variabilitást mutat. Legújabban a<br />
nyálfehérjék spektrumának változását biológiai markerként<br />
kívánják hasznosítani pl. a szájüregi daganatok<br />
korai felismerésében.<br />
A nyál fehérje-összetétele<br />
Egydimenziós gélelektroforézissel kb. 30 fehérjecsoportot<br />
lehet elkülöníteni, a kétdimenziós technikával<br />
100-nál is többet. A leg<strong>modern</strong>ebb eljárások (szeparációt<br />
követő tömegspektrometria) alapján legalább<br />
1000 egyedi nyálfehérjét különítettek el, beleértve a<br />
fehérjedegradációs termékeket is. A fehérjespektrum<br />
körülbelül fele a vérplazmában is kimutatható.<br />
A következőkben néhány jellegzetes nyálfehérjét mutatunk<br />
be részletesebben. A molekulatömeg szerinti<br />
csoportosításban a kisebbtől a nagyobb tömegig haladva<br />
a következő fő fehérjecsoportokat különböztetjük<br />
meg:<br />
hisztatinok→sztatherinek→lizozim→prolin-gazdag<br />
fehérjék→karboanhidráz→amilázok→peroxidázok→laktoferrin→mucin<br />
2→szekretoros IgA→mucin 1.<br />
A főbb fehérjecsaládokat a 11-30. táblázaton összesítettük.<br />
A fogzománc védelmében és az antimikrobiális<br />
hatásban részt vevő fehérjék egy része kedvezőtlen<br />
biológiai funkciót is betölthet abban az esetben, ha<br />
a fogak felszínére kötődik. Itt segítik a baktériumok<br />
megtapadását és a savas anyagcseretermékek képződését.<br />
A fehérjék jelentős hányada izoformákban van jelen,<br />
pl. a nyál eredetű amiláznak 7 izoenzime ismert.<br />
Elsősorban újszülöttekben van jelentősége a nyállipáznak,<br />
ez erősen hidrofób protein, és a tejzsír lebontásában<br />
játszik szerepet. A nyál proteázokat is tartalmaz,<br />
melyek a saját fehérjéket is emésztik, elősegítve<br />
a természetes eliminációt.
302 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A nyálfehérjék vizsgálati módszerei<br />
Mintavétel<br />
A helyes mintavétel a nyál esetében elsőrendű fontosságú,<br />
hiszen a szájüregben rengeteg zavaró tényezővel<br />
kell számolni. Alapvetően a nyálmintát a reggeli<br />
órákban, éhgyomorra kell venni, 2-3 desztillált vizes<br />
öblítés után. Vehetünk nyugalmi és stimuláció (pl.<br />
citrommal) utáni szekrétumot, a kétféle minta öszszetétele<br />
némileg különbözik. A nyálmintát a fehérjedegradáció<br />
megakadályozása érdekében azonnal<br />
érdemes olvadó jégre tenni és/vagy proteázinhibitorokat<br />
adni hozzá. A sejtes elemektől és az egyéb korpuszkuláris<br />
szennyeződéstől a nyálat centrifugálással<br />
szabadítjuk meg: 3000–10 000 g, 15 perc 4 °C-on. A<br />
felülúszót azonnal felhasználhatjuk, -70 °C-on tárolhatjuk,<br />
vagy kicsapjuk a nyálfehérjéket pl. 10%-os<br />
triklórecetsav/aceton/ditiotreitol keverékével vagy<br />
etanollal, de ismert olyan módszer is, ahol a nyálat<br />
100-szoros térfogatú vízzel szemben dializálják, majd<br />
liofilezik az analízis előtt.<br />
11-30. táblázat. Nyálfehérjecsaládok<br />
Nyálfehérjecsalád<br />
savanyú prolingazdag fehérjék<br />
amilázok<br />
bázikus prolingazdag fehérjék<br />
karboanhidrázok<br />
cisztatinok<br />
hisztatinok<br />
laktoferrin<br />
lizozim<br />
mucinok<br />
peroxidázok<br />
sztatherinek<br />
szekretoros IgA<br />
defenzinek<br />
Funkció<br />
védőbevonat<br />
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése<br />
csersavak megkötése<br />
szénhidrátemésztés<br />
antibakteriális hatás<br />
csersavak megkötése<br />
antibakteriális hatás<br />
védőbevonat<br />
védőbevonat<br />
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése<br />
antibakteriális hatás<br />
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése<br />
csersavak megkötése<br />
antibakteriális hatás<br />
antibakteriális hatás<br />
mikrobákhoz kötődés<br />
védőbevonat<br />
antibakteriális hatás<br />
mikrobákhoz kötődés<br />
síkosítás<br />
védőbevonat<br />
nyelés megkönnyítése<br />
mikrobákhoz kötődés<br />
antibakteriális hatás<br />
síkosítás<br />
védőbevonat<br />
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése<br />
antibakteriális hatás<br />
mikrobákhoz kötődés<br />
antibakteriális hatás
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése<br />
303<br />
Fehérjemeghatározás<br />
A felülúszóból mindenféle manipuláció előtt érdemes<br />
a fehérjetartalmat megmérni. Bevált módszer a<br />
nyálminta 10-szeres hígítása 1 mol/l NaOH-val, azután<br />
a fehérjetartalmat Bradford szerint mérjük. A<br />
nyugalmi nyál totál proteintartalma 0,2–1,0 g/l között<br />
változik.<br />
Fehérjeelektroforézis<br />
Egy- vagy kétdimenziós elektroforézist végezhetünk,<br />
a mintákat mindkét esetben a megfelelő protokoll<br />
szerint kell előkészíteni (lásd 3. fejezet). Nagyon<br />
gyakran a kísérleti modellben felvetett kérdés megválaszolására<br />
elegendő az egydimenziós SDS PAGE,<br />
esetleg kiegészítve immunoblot vagy tömegspektrometriás<br />
analízisekkel. Amennyiben a mintánk fehérjetartalma<br />
kicsi, célszerű azt 5-szörös töménységű<br />
mintapufferbe felvenni.<br />
Tömegspektrometriás vizsgálatok<br />
A kutatás ma nem csak a lehető legnagyobb számú<br />
fehérje detektálására irányul, hanem betegségspecifikus<br />
molekulák, fehérje-peptid markerek azonosítására<br />
és klinikai alkalmazhatóságuk eldöntésére,<br />
lehetőleg non-invazív módon kapott mintákból, mint<br />
amilyen pl. a nyál is. Erre a célra széles körben használatos<br />
az előzetes elektroforetikus elválasztás és a<br />
tömegspektrometria kombinálása. A kisméretű polipeptidek<br />
közvetlenül, a nagyobb fehérjék tripszines<br />
emésztés után analizálhatók tömegspektrométerben<br />
(lásd 7. fejezet). A nyál fehérjetérképe jellegzetes eltéréseket<br />
mutat egészségesek és szájüregi daganatokban<br />
szenvedők között, a nyálfehérjék közül a potenciális<br />
tumormarkerként használható molekulák kutatása<br />
igen intenzíven folyik. Ugyanígy vizsgálják a dohányzás<br />
vagy egyes autoimmun betegségek okozta jellegzetes<br />
fehérjekép-eltéréseket is.<br />
A nyálfehérjék összetételének változását felhasználhatjuk<br />
a szájüreget érő kémiai anyagok hatásainak<br />
analízisére. Ismert, hogy a vörösborok zamatát tannintartalmuk<br />
jelentősen befolyásolhatja, ezért a borok<br />
derítése, a polifenolok egy részének eltávolítása<br />
a bor előállítási technológiájának része. A tanninok<br />
a nyál egyes fehérjéivel – különösen a prolingazdag<br />
frakcióval – komplexet képeznek, és a komplex precipitálódik.<br />
Amennyiben a nyálat vörösborral keverjük,<br />
majd SDS-PAGE vizsgálatot végzünk, a nyál<br />
fehérjemintázata jellegzetes változást mutat a csersavtartalom<br />
függvényében. A kontroll, nem kezelt<br />
nyálhoz képest a nagy csersavtartalom következtében<br />
több fehérjesáv eltűnhet vagy kevesebb fehérjét tartalmazhat.<br />
A fehérjeanalízisek egzakt módon egészítik<br />
ki az érzékszervi vizsgálatokat.<br />
A nyálfehérjék (pl. parotis-agglutinin, amiláz)<br />
baktériumkötődése is tanulmányozható in vitro<br />
modellekben. Különböző baktériumtörzsek (pl.<br />
Staphylococcus, Streptococcus) összehozhatók izolált<br />
nyálfehérjékkel adhéziós, agglutinációs vagy immunfluoreszcenciás<br />
assay-kben (analitikai tesztekben) és<br />
a kötődés kimutatható. A bakteriális aggregáció egyrészt<br />
elősegíti a baktériumok megcsapdázását és kiürítését<br />
a szájüregből, másrészt amennyiben az a fogzománc<br />
felületén történik, kedvez a lokális bakteriális<br />
tevékenységnek és a fogszuvasodás kialakulásának.<br />
A fogászati prevencióban használatos szájvizek<br />
nyálfehérjékre gyakorolt hatása is tanulmányozható<br />
elektroforetikus módszerekkel. A csersavas fehérjekicsapás<br />
analógiájára saját vizsgálatainkban az Intézetünkben<br />
illóolajokkal kiegészített gyógynövénytinktúrás<br />
szájöblögető oldat hígításait nyálmintával<br />
kevertünk össze 1:3 arányban (etanol-végkoncentráció<br />
5%). Kontrollként 40%-os etanolt, PBS-t (fiziológiás<br />
sót tartalmazó foszfátpuffer, pH 7,2) és összehasonlító<br />
készítményként kereskedelmi forgalomban<br />
Funkcionális vizsgálatok<br />
11-70. ábra. Szájvizek hatása a nyál fehérje-összetételére<br />
(10% SDS-PAGE hordozó és ezüstfestés. 1.: 32-szeres;<br />
2.:16-szoros; 3.: 8-szoros; 4.: 4-szeres hígítású kezelés saját<br />
szájvízzel; 5.: 5% etanol; 6.: 4-szeres hígítású cserszömörcés<br />
szájvizes kezelés; 7.: 4-szeres PBS; 8.: kezeletlen nyál,<br />
M: markerek)
304 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
kapható cserszömörcés szájvizet használtunk ugyanabban<br />
az arányban. 10 perces inkubáció után minden<br />
mintát Laemmli-féle mintapufferben vettünk fel,<br />
100 °C-on kezeltünk majd centrifugáltunk. 10%-os<br />
SDS-PAGE elválasztást követően a géleket kombinált<br />
ezüstözéssel festettük (3,4 μg/pászta). Eredményeink<br />
azt mutatták, hogy a kezeletlen nyálminta fehérjemintázatával<br />
összehasonlítva nem találtunk eltéréseket<br />
sem a saját, sem a kereskedelmi oldattal kezelt<br />
nyálaknál (11-70. ábra).<br />
A bemutatott kísérlet példa arra, hogy a nyál fehérjemintázata<br />
alkalmas komplex vegyületek hatásának<br />
detektálására vagy kizárására. Természetesen az egydimenziós<br />
elválasztás a finom eltéréseket nem jelzi<br />
kellő érzékenységgel.<br />
A bemutatott példák alapján a nyál értékes, könynyen<br />
nyerhető testnedv, amelynek klinikai felhasználása<br />
várhatóan egyre nagyobb teret fog kapni a közeljövőben.<br />
Irodalom<br />
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3000095/<br />
Tabak, L. A: In Defense of the Oral Cavity: The Protective<br />
Role of the Salivary Secretions. Pediatric Dentistry<br />
28(2):110-117, 2006.<br />
Jessie, K., Pang, W. W., Abdul Rahim, Z. H. et al.: Proteomic<br />
Analysis of Whole Human Saliva Detects Enhanced<br />
Expression of Interleukin-1 Receptor Antagonist, Thioredoxin<br />
and Lipocalin-1 in Cigarette Smokers Compared<br />
to Non-Smokers. Int. J. Mol. Sci. 11:4488-4505,<br />
2010.<br />
Hu, S., Xie, Y., Ramachandran, P. et al.: Large-scale<br />
identification of proteins in human salivary proteome<br />
by liquid chromatography/mass spectrometry and<br />
two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry.<br />
Proteomics 5:1-15, 2005.<br />
Wu, Z.-Z., Wang, J.-G, Zhang, X.-L.: Diagnostic model of<br />
saliva protein finger print analysis of patients with gastric<br />
cancer. World J. Gastroenterol. 15(7): 865-870, 2009.<br />
Sondej, M., Denny, P. A., Xie, Y. et al.: Glycoprofiling<br />
of the Human Salivary Proteome. Clin. Proteomics<br />
5(1):52–68, 2009.
Vizeletvizsgálatok<br />
305<br />
Vizeletvizsgálatok<br />
Vizeletvizsgálatok a proteinürítés tükrében<br />
Ludány Andrea<br />
Klinikai laboratóriumi analitikai<br />
módszerek<br />
Az emberi vizelet fehérjéi<br />
Ismert, hogy a humán vizelet fiziológiás körülmények<br />
között is különböző fehérjéket tartalmazhat. E fehérjék<br />
összességükben is igen kis koncentrációban, azaz<br />
csak „nyomokban” jelennek meg. Ismeretük mind fiziológiai,<br />
mind kórélettani szempontból jelentős lehet.<br />
Klinikailag a vizeletben fellelhető fehérjék nyolc<br />
csoportba oszthatók:<br />
1. Normál plazmafehérjék vagy fragmentjeik. Napjainkig<br />
már több mint 30 plazmafehérjét azonosítottak<br />
a vizeletben. Valószínű, hogy elég érzékeny<br />
módszer segítségével valamennyi plazmafehérje<br />
kimutatható lehetne. Molekulatömegük széles határok<br />
között mozog. Ebbe a csoportba tartozik<br />
pl. az albumin, a retinolkötő fehérje, az α 1<br />
-mikroglobulin,<br />
a fibrinogén degradációs termékek, a<br />
β 2<br />
-mikroglobulin és az IgG-könnyűláncok.<br />
2. A vesében keletkező és a vizeletbe kerülő fehérjék. E<br />
fehérjék egy része a vesére specifikusan jellemző,<br />
csak itt termelődik, másik részük egyéb szervekre<br />
is jellemző (pl. az előbbiekhez a Tamm-Horsfall-protein,<br />
az urokallikrein, az eritropoetin, az<br />
utóbbiakhoz pedig a basalis membrán antigének,<br />
az alkalikus foszfatáz, a γ-glutamil-transzferáz, a<br />
lizozomális enzimek tartoznak).<br />
3. A húgyúti traktusból származó fehérjék. A húgyúti<br />
traktus bármely részének sérülésekor, gyulladásakor<br />
szöveti fehérjék fokozott mértékben áramlanak<br />
a tubuluslumenbe. Normál körülmények között is<br />
kerülnek a vizeletbe fehérjék az epithelsejtekből, a<br />
nemi mirigyekből (pl. savi foszfatáz a prostatából)<br />
és a vaginalis váladékból.<br />
4. Nem az urogenitalis traktusból származó szöveti<br />
fehérjék. A különböző szövetek, szervek sérülései<br />
folytán sejtfehérjék kerülnek a keringésbe. Azok a<br />
fehérjék, amelyek molekulatömege elég kicsi ahhoz,<br />
hogy a glomerulusban filtrálódni tudjanak,<br />
megjelennek a vizeletben. Ezek a fehérjék általában<br />
szöveti/szervspecifikus antigének.<br />
5. Terhesség alatt termelődő fehérjék. Öt fő antigént<br />
írtak le a humán placentában, amelyek terhesség<br />
alatt a vizeletben is megjelennek. Számos fázisspecifikus<br />
foetus-autoantigénről azonban jelenleg<br />
még nem igazolt, hogy bejut az anyai vizeletbe.<br />
6. Tumorantigének. Számos klinikai jelentőséggel<br />
bíró tumorantigént azonosítottak tumoros betegek<br />
vizeletében, így pl. carcinoembryonalis antigént,<br />
melanomaspecifikus antigént és a-fötoproteint.<br />
7. Hormonok, szignálszubsztanciák. A humán koriongonadotropint<br />
először terhes nők vizeletéből<br />
izolálták, azóta is a hormonizolációk prototípusaként<br />
szolgál. Minden ismert hypophysishormont<br />
azonosítottak már a vizeletben, egyedül a prolaktinnal<br />
kapcsolatosan vetődtek fel kétségek.<br />
8. Baktérium-, vírus- és gombafertőzés termékei. Széles<br />
körben tanulmányozott téma. Napjainkban<br />
nagy figyelmet szentelnek a vírusinfekciót követő<br />
korai szakban a sejtek által feleslegben szintetizált,<br />
ún. korai fehérjéknek. Ezek a vizeletben megjelennek<br />
és valószínűleg kapszid antigének. Bakteriális,<br />
ill. gombafertőzésben szintén fellelhetők a vizeletben<br />
jellemző antigének. Az említett fehérjék/antigének<br />
a vizelet kismolekulatömegű frakciójában<br />
találhatók.<br />
A fehérjék mennyiségi mérése<br />
Teljes proteinkoncentráció<br />
A teljes (össz-) proteinkoncentráció mennyiségi<br />
vizsgálatára a klinikai laboratóriumi munkában ma<br />
is a hagyományos, sorozatmérésekre alkalmas biuretvagy<br />
az ún. mikrobiuret- (Benedikt szerint) módszer<br />
használatos. Előnye, hogy együtt méri az összes<br />
vizeletfehérjét és proteoglikánt összehasonlítható<br />
analitikai érzékenységgel. Hátránya, hogy kis fehérjekoncentrációknál<br />
nem elég érzékeny. (Lásd a Mintaelőkészítés<br />
című fejezet módszertani részét.)<br />
A „vizelet-összfehérje” meghatározás egyébként<br />
egyszerű rutin eljárás számos betegség, főképpen a<br />
veseérintettséggel járó folyamatok diagnosztikájában.<br />
Kiemelt szerepe van a betegségek szűrő jellegű vizsgálatában,<br />
ill. a betegség lefolyásának monitorozásában.<br />
A vizelettel kiválasztott fehérjék összetétele változhat<br />
a proteinuria eredetétől és a betegség okától függően<br />
is. A naponta ürített fehérje mennyiségének megítélése
306 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-31. táblázat. A vizelet összfehérje mennyiségének mérésére elterjedt módszerek<br />
Módszer<br />
Eljárás<br />
A detektálás<br />
határa (mg/l)<br />
Referenciatartomány<br />
triklórecetsav (TCA) nefelometria 100 < 100 mg/l<br />
TCA-HCl turbidimetria 10 < 70 mg/l<br />
benzthonium-klorid turbidimetria 60 < 135 mg/24 óra<br />
tanninprecipitáció<br />
a fehérjékhez kötődő FeCl 3<br />
-tannin<br />
színreakciója<br />
30 < 350 mg/24 óra<br />
Coomassie blue-G250 + SDS festékkötés a proteinmicellákhoz 2 < 120 mg/24 óra<br />
pyrogallol red + molibdát festékkötés 10 24-140 mg/24 óra<br />
pyrogallol red + molibdát+<br />
SDS<br />
festékkötés 35 40-80 mg/24 óra<br />
biuret réz-fehérje komplex 110 50-240 mg/l<br />
pedig nagymértékben függ a választott analitikai módszertől.<br />
A 11-31. táblázat mutatja be az összfehérje mérésére<br />
jelenleg ajánlott módszereket, érzékenységüket,<br />
és az elfogadott referenciatartományokat.<br />
A táblázatból kiderül, hogy a referenciatartományok<br />
jelentős eltéréseket mutatnak attól függően,<br />
hogy a használatos fehérjekimutatási eljárás milyen<br />
érzékenységi határral rendelkezik. A referenciatartomány<br />
megítélésekor mindezt figyelembe kell venni.<br />
Egyedi, célzott vizeletfehérje meghatározás<br />
A diagnosztikában és így a klinikai biokémiai vizsgálatokban<br />
általában az egyedi célzott vizeletfehérje<br />
meghatározások igénye is felvetődik. Módszertanilag,<br />
mivel specifikus fehérjemeghatározásokról van<br />
itt szó, az immunkémiai eljárások kerültek bevezetésre.<br />
A 11-32. táblázaton foglaltuk össze a vizeletben<br />
normál körülmények között is megtalálható fehérjék<br />
individuális mérésére alkalmas módszereket és<br />
a fehérjék mérhető legkisebb koncentrációit. A mért<br />
koncentrációadatok (mg/l) kifejezhetők napi ürítésben<br />
is (a vizeletmennyiség ismeretében) vagy kreatininkoncentráció-hányadosban<br />
is. Az utóbbi kifejezésmód<br />
előnye, hogy nem igényel vizeletgyűjtést.<br />
A vizeletfehérjék megoszlási képének<br />
vizsgálata<br />
A fehérjekutatásban az egyre fejlődő immunkémiai<br />
módszerek mellett kiemelt jelentőséget kapnak a<br />
különböző elektroforetikus technikák is. Régről ismertek<br />
azok a módszerek, amelyek mindkettő kombinációját<br />
alkalmazzák. Ismert például, hogy a vizeletben<br />
megjelenő immunglobulin-könnyűláncok<br />
megjelenítésére rutinszerűen immunelektroforézist,<br />
ill. immunfixációt használnak. A klasszikusnak számító<br />
kvalitatív, ill. szemikvantitatív meghatározások<br />
(pl. Rocket-elfo) szintén ehhez a vizsgálatcsoporthoz<br />
tartoznak, jóllehet egyedi fehérjék kimutatására szolgálnak.<br />
A minták fehérjeösszetételének, a különböző fehérjék<br />
megoszlási arányának (mintázatának) vizsgálatára<br />
a klinikai laboratóriumi munkában ma is a<br />
sorozatmérésekre is alkalmas elektroforetikus eljárások<br />
terjedtek el leginkább. Az alkalmazott elektroforézistechnikák<br />
főképpen a hordozóanyagban különböznek.<br />
Agar, agaróz mellett a poliakrilamidgél nyert<br />
nagyobb teret az utóbbi években. A Laemmli-féle SDS<br />
PAG elektroforézis pl. már bekerült a speciális diagnosztikai<br />
laboratóriumok analitikai módszereinek<br />
repertoárjába. Mind az egy-, mind a kétdimenziós<br />
PAGE (poliakrilamidgél-elektroforézis) elválasztások<br />
ismertek a vizeletfehérjék vizsgálatában. Tekintettel<br />
a vizeletminták extrém tartományokban változó fehérjekoncentrációira,<br />
fontosnak látszott a detektálási<br />
érzékenység növelése. Erre az ezüstözési módszerek<br />
széles változatai kínálkoznak. Olyan ezüstözést célszerű<br />
választani, amely kompatibilis egy esetleg csatlakozó<br />
tömegspektrometriás (MS) méréshez is. Tapasztalataink<br />
szerint a Willoughby és munkatársai
Vizeletvizsgálatok<br />
307<br />
által közölt kombinált (gyors) ezüstözési eljárást tartjuk<br />
erre a legalkalmasabbnak (lásd 4. fejezet). Mintánként<br />
az egydimenziós gélen 2-3 µg protein elegendő<br />
a mintázat megjelenítéséhez.<br />
A kétdimenziós elektroforézisek, azaz a nagy feloldású<br />
fehérjetérképek készítésében a minták fehérjetartalmának<br />
előzetes dúsítása általában elengedhetetlen.<br />
Munkánkban olyan dúsítási eljárást vezettünk be,<br />
amely a normál vizelet fehérjeanalitikai vizsgálatára<br />
és fehérjetérképe megjelenítésére is eredményesnek<br />
bizonyult. A módszer nem csak egyszerű és gyors,<br />
hanem mint későbbi vizsgálatainkból kiderült, a procedúra<br />
során a fehérjevesztés elhanyagolható (lásd 4.<br />
fejezet: A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása<br />
Marshall szerint).<br />
A dúsítási eljárás a vizeletfehérjék kétdimenziós<br />
elektroforéziséhez mint minta-előkészítő eljárás alkalmazható.<br />
A nagy feloldású kétdimenziós elektroforézis<br />
géljeinek nagy felületén a fehérjefrakciók megoszlanak<br />
és további detektálási érzékenység növelést<br />
igényelnek. A gélek ezüstözésére ehhez a Marshall<br />
és munkatársai által kifejlesztett ezüstözési technikát<br />
használtuk, amelynél a „jel/zaj” arány az ideális<br />
kompromisszumra beállítható, és a vizsgálat információs<br />
értéke így sokszorosára növelhető (11-71.<br />
ábra). További MS vizsgálatok tervezése esetén viszont<br />
Gromova és munkatársai eljárását javasoljuk.<br />
Áttekintő jellegű módszertani ismertetőnket néhány<br />
hangsúlyozott tanáccsal zárjuk. A vizeletminták fehér-<br />
11-32. táblázat. Individuális fehérjék normálértékeinek felső határa a vizeletben<br />
összfehérje<br />
albumin<br />
Fehérje Mérési módszer Normálérték felső határa (cut-off érték)<br />
TCA<br />
turbidimetria<br />
tesztcsík<br />
immunonefelometria<br />
turbidimetria<br />
radioimmunassay<br />
immunkémiai tesztek<br />
70 mg/l<br />
20 mg/l<br />
20 mg/l<br />
transzferrin immunonefelometria 0,2-1,2 mg/l<br />
IgG<br />
α 1<br />
-mikroglobulin<br />
β 2<br />
-mikroglobulin<br />
immunonefelometria<br />
turbidimetria<br />
immunonefelometria<br />
turbidimetria<br />
immunonefelometria<br />
immunoassay<br />
10 mg/l<br />
12 mg/l<br />
0,3 mg/l<br />
retinolkötő fehérje immunonefelometria 0,5 mg/l<br />
β-NAG * enzimaktívitás-mérés 6,3 U/l<br />
Ig könnyűlánc immunonefelometria 10 mg/l<br />
hemoglobin, mioglobin tesztcsík 0,3 mg/l<br />
α 2<br />
-makroglobulin<br />
immunonefelometria<br />
turbidimetria<br />
apolipoprotein A-1 immunonefelometria 0,4 mg/l<br />
CRP immunonefelometria 6 µg/l<br />
*<br />
β-NAG: N-acetil-β-D-glukózaminidaz<br />
7 mg/g kreatinin
308 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
a<br />
11-71. ábra. 50 éves szívbeteg férfi vizeletmintája. Kétdimenziós<br />
PAG-elektroforetogram (10% gélkoncentráció,<br />
ezüstözés Marshall szerint; vizeletminta-dúsítással, a felvitt<br />
proteinmennyiség 250 µg, M: molsúlymarker)<br />
b<br />
jevizsgálatainál fontos szem előtt tartani a következőket:<br />
• A vizeletminta azonosítása, a mintavétel módja,<br />
mennyisége stb.<br />
• Szűrővizsgálatok, üledékvizsgálat.<br />
• A minta mielőbbi előkészítése az analízisekhez:<br />
centrifugálás, dekantálás.<br />
• A minta összfehérje- és kreatininkoncentrációjának<br />
meghatározása (vonatkoztatások és a<br />
későbbi analízisek érdekében).<br />
• Individuális fehérjekomponensek célzott,<br />
immunkémiai, ill. kromatográfiás műszeres<br />
meghatározása, automata analizátorok révén.<br />
• A mért adatok nem koncentrációban, hanem<br />
kreatininre vagy total proteinre számítandók.<br />
• A fehérje frakcionálásig mintapufferben tárolása<br />
-70 °C-on (proteolízisgátlás!).<br />
• Az ezüst-detektáláshoz ajánlott fehérjeminta-mennyiség<br />
SDS ELFO-nál: 2-3 µg/pászta.<br />
• Western blothoz ajánlott fehérjeminta-mennyiség<br />
SDS ELFO-nál: 3-4 µg/pászta.<br />
• Fehérjemintázat értékelése: kontroll/beteg,<br />
beteg/beteg, betegcsoportok(aktív/non-aktív,<br />
akut/krónikus) hasonlításával - kizárólag azonosan<br />
kezelt mintákkal és azonos fehérjemennyiségekkel<br />
végezhetők (11-72. ábra a-b-c, 11-73.<br />
ábra).<br />
• Kétdimenziós O’Farrell-technika fehérjetérképe:<br />
Coomassie-detektálásnál 300 µg, ezüstözési<br />
technikánál 75-150 µg/géllap. Mintától függően<br />
az analízis előtt dúsítás szükséges.<br />
c<br />
11-72. ábra. Összehasonlító vizeletfehérje-elektroforézis<br />
krónikus gyulladásos bélbetegeknél (12,5% SDS gél, kombinált<br />
ezüstfestés, pásztánként 2,5 µg protein)<br />
a) A vizeletfehérjék mintázata kontroll mintákban<br />
b) A vizeletfehérjék mintázata aktív betegeknél<br />
c) A vizeletfehérjék mintázata „non-aktív” betegeknél<br />
Vizeletfehérjék klinikai biokémiája<br />
és információs értékei<br />
A fejezet következő részében a vizeletfehérje-analízisek<br />
klinikai biokémiai jelentőségét illusztráljuk - a teljesség<br />
igénye nélkül - néhány általunk kiemelt példával.
Vizeletvizsgálatok<br />
309<br />
11-73. ábra. Mikroalbumin-vizsgálatok Crohn-betegeknél;<br />
totál proteinre és kreatininre számított értékek összevetése<br />
Számos közleményben találunk utalást arra, hogy<br />
különböző szisztémás betegségekben a vizelet kétdimenziós<br />
fehérjemintázata diagnosztikus támpontul<br />
szolgálhat. Norman G. és Leigh Anderson betegségekkel<br />
asszociált fehérjetérkép-változásokat írt le a<br />
„Human Protein Index” című dolgozatban már 1982-<br />
ben. Ismert, mint ahogy az a bevezetőben is említésre<br />
került, hogy a vizeletfehérjék számos forrásból eredhetnek.<br />
Glomerularis betegségek következményeként<br />
megváltozik a szelektivitás: nagy molekulatömegű<br />
proteinek (60 kDa felettiek), albumin és plazmafehérjék,<br />
mint pl. transzferrin, IgG jelennek meg a vizeletben.<br />
Tubularis betegségekben a kisebb molekulatömegű<br />
proteinek (60 kDa alattiak), mint pl. az α 1<br />
savanyú glikoprotein, α 1<br />
-mikroglobulin, retinolkötő<br />
fehérje, β 2<br />
-mikroglobulin, lizozim, β-NAG (de albumin<br />
is) mutathatók ki nagyobb mennyiségben.<br />
Az α 1<br />
savanyú glikoprotein a vizeletben normál<br />
körülmények között is mérhető fehérje, a leukocyták<br />
egy külső membránfehérjéjének fragmentje. Szintjének<br />
emelkedése a szérumban és a vizeletben különösen<br />
jellemző a leukocyta proliferációval járó betegségekre<br />
[4]. A β 2<br />
-mikroglobulin szintén a sejtmembrán<br />
alkotórésze, hisztokompatibilitási antigénekkel aszszociált.<br />
Az exkréció növekedése diagnosztikus értékű<br />
kadmiummérgezett munkásokban a proximalis<br />
tubulus károsodásának jeleként. Emelkedését kimutatták<br />
SLE-ben és malignus betegségekben is. Ma<br />
már a plazmasejttumoros betegekben monitorozzák<br />
a kezelés hatékonyságának ellenőrzésére. Előrehaladott<br />
malignus betegségekben jelentősen fokozódhat<br />
az albuminuria mértéke is [13]. A retinolkötő fehérje<br />
az A-vitamin transzportjában vesz részt, szintje emelkedik<br />
vesetranszplantációt, kadmiummérgezést követően.<br />
A Gc-globulin (D-vitamin-kötő fehérje) szintje<br />
emelkedik nephrosis-szindrómában, nagy valószínűséggel<br />
a glomeruluskárosodás jeleként.<br />
Az immunglobulin-könnyűláncok diagnosztikus<br />
jelentőségűek. Bizonyos betegségekben, így myeloma<br />
multiplexben jellemző mind a mennyiségük, mind pedig<br />
a láncok fajtája és egymáshoz viszonyított aránya,<br />
mert a nagy mennyiségben termelődő monoklonális<br />
immunglobulin-könnyűláncok megjelenhetnek a vizeletben.<br />
Gyakoribb a l-lánc mennyiségének emelkedése.<br />
Vesekárosodásban is jellemző lehet a l típusú<br />
Bence-Jones-proteinuria. Bence-Jones-proteinuriát<br />
találunk még amyloidosisban, Fanconi-szindrómában.<br />
Az immunfixációt kombinálva a vizeletfehérje-elektroforézissel<br />
biztonságos diagnózishoz juthatunk<br />
ezekben az esetekben (Levinson, S.S., 2000).<br />
A vesekárosodás jó indikátora a retinolkötő fehérje,<br />
a β-NAG, a transzferrin és az IgG emelkedése, amelyek<br />
mennyisége a betegség súlyosságával ugyan nem korrelál,<br />
de a vese korai károsodását az esetek nagy részében<br />
kimutatja [3]. Nephrosis-szindrómában kimutatták a<br />
fibrin/fibrinogén degradációs termékek emelkedését,<br />
proliferatív glomerulonephritisben mindezeken felül<br />
a keresztkötött fibrindegradációs termékek szintje is<br />
emelkedett [14]. Nephropathiában diagnosztikus segítség<br />
lehet az a tény, hogy az össz-glükóz-aminoglikán<br />
szint emelkedett, míg a kondroitin-szulfát/heparán-szulfát<br />
arány nem változik [8].<br />
Glomerulonephritisben különböző albuminpolimereket<br />
találtak a vizeletben [2]. Mesangiocapillaris<br />
glomerulonephritisben pl. az albumin olyan<br />
izomerjét írták le, amelynek magasabb az izoelektromos<br />
pontja. Lupus-nephritisben ninhidrin-pozitív<br />
anyagokhoz kötődő albumint találtak. Így Doman és<br />
munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy az<br />
albuminpolimerizáció nem biokémiai műtermék, hanem<br />
klinikai jelentősége lehet.<br />
Az elektroforetikus vizsgálatok fontos segítséget<br />
adhatnak a vesetranszplantált betegek állapotának, a<br />
terápia nefrotoxicitásának monitorozásában is. A rejekciós<br />
krízisre jellemző az albuminuria, a kis molekulatömegű<br />
fehérjék, valamint a g-globulinok szintjének<br />
emelkedése. Az említett fehérjék kimutatása<br />
megkönnyíti a gyulladásos reakció elkülönítését egy<br />
esetleges kilökődési krízistől.
310 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A vizeletben lévő albumin mennyisége emelkedik<br />
hypertoniában a glomerularis hypertensio és basalis<br />
membrán sérülése következtében. A IV-es típusú<br />
kollagén mennyisége pedig a mesangialis mátrix,<br />
ill. szintén a glomerularis basalis membrán sérülése<br />
következtében nő meg. Mindezek jellemzőek a hypertrophiás<br />
szívbetegségekre és az atheroscleroticus<br />
elváltozásokra is [7]. Hypertoniában újabban, mivel a<br />
betegség fennállásának idejével korrelál, a microalbuminuria<br />
meghatározását is hasznosnak tartják. Szívizombetegségekben<br />
a vizelet albumin-, transzferrin-,<br />
IgG-tartalma nagymértékben, az α 1<br />
- glikoprotein és<br />
az Apo-A1-szint kissé emelkedett, a vizelet össz-fehérjetartalma<br />
viszont nem nő szignifikánsan [5].<br />
Miközben primer glomerulonephritisben a proteinuria<br />
jelenléte és mértéke utalhat a veseelégtelenség<br />
kialakulásának lehetőségére, lupus-nephritisben még<br />
mindig ellentétesek a nézetek a proteinuria és a betegség<br />
prognózisának összefüggésével kapcsolatban.<br />
Az SLE-s betegek csak mintegy 20%-ában emelkedik<br />
az összfehérje mennyisége a vizeletben. Egyéb tünetek<br />
hiányában itt is diagnosztikus támpontul szolgálhat<br />
az albumin és a retinolkötő fehérje (proximalis<br />
tubulus dysfunctióra jellemző) szint együttes emelkedése<br />
[6]. Aktív lupus-nephritisben pedig a vizelet C3<br />
komplement tartalmának vizsgálata ajánlott [11]. Az<br />
SLE okozta tubulointerstitialis nephritisben a vizelet<br />
β 2<br />
-mikroglobulin-szintje emelkedik, a Tamm-Horsfall-glikoproteiné<br />
pedig csökken. Szintén mennyiségi<br />
növekedést tapasztalhatunk az IL-6 és az IL-8 vonatkozásában<br />
is [15].<br />
IgA-nephropathiaban, diabeteses nephropathiában<br />
a fehérjetérkép révén a nephronsérülés non-invazív<br />
lokalizációja válik lehetségessé. A kétdimenziós<br />
fehérjeelektroforézis jól használható annak megállapítására,<br />
hogy a károsodás elsősorban glomerularis<br />
vagy tubularis. Kimutatták, hogy diabeteses nephropathiában<br />
a vizelet albumin-, β-NAG-, ill. β 2<br />
-mikroglobulin-szintje<br />
emelkedik. A glomerularis típusú<br />
proteinuria a diabetes fennállásának tartamával, a<br />
β-NAG-ürítés pedig a diabeteses angiopathia súlyosságával<br />
korrelál.<br />
Irodalom<br />
[1] Anderson, N. G., Anderson, N. L., Tollaksen, S. L.:<br />
Proteins in human urine. I. Concentration and analysis<br />
by two-dimensional electrophoresis. Clin. Chem.<br />
25/7:1199-1210, 1979.<br />
[2] Bazzi, C., Petrini, C., Rizza, V. et al.: Characterization<br />
of proteinuria in primary glomerulonephritides:<br />
Urinary polymers of albumin. Am. J. Kidney Dis.<br />
30(3):404-412, 1979.<br />
[3] Corso, A., Serricchio, G., Zappasodi, P. et al.: Assesment<br />
of renal function in patients with multiple<br />
myeloma: the role of urinary proteins. Ann. Hematol.<br />
78(8):371-375, 1999.<br />
[4] Gahmberg, C. G., Anderson, L. C.: Leukocyte surface<br />
origin of human alfa-1-acid glycoprotein (orosomucoid).<br />
J. Exp. Med., 148:507-521, 1978.<br />
[5] Graber, H. U., Martig, J.: Urinary protein analysis in<br />
cardiomyopathy-affected and healthy cattle by SDS-polyacrylamide<br />
gel electrophoresis. Zentralbl. Veterinarmed.<br />
39(10):769-776, 1992.<br />
[6] Guy, J. M., Brammah, T. B., Holt, L. et al.: Urinary<br />
excretion of albumin and retinol binding protein in<br />
systemic lupus erythematosus. Ann. Clin. Biochem.<br />
34:668-674, 1997.<br />
[7] Ishimitsu, T. et al.: Urinary excretions of albumin and<br />
type IV collagen in normotensive and hypertensive subjects.<br />
Hypertens. Res. 23(5):459-466, 2000.<br />
[8] Juretic, D., Cvoriscec, D., Vukovic-Holjevac, A et<br />
al.: Urinary glycosaminoglycans in different phases of<br />
Balkan endemic nephropathy. Nephron 65(4):564-567,<br />
1993.<br />
[9] Marshall, T., Williams, K. M.: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide<br />
gel electrophoresis of urine: concentration<br />
of urinary proteins by precipitation with<br />
Coomassie Blue. Clin. Chem. 39/11:2314-2318, 1993.<br />
[10] Marshall, T., Williams, K.: Two-dimensional<br />
electrophoresis of human urinary proteins following<br />
concentration by dye precipitation. Electrophoresis<br />
17:1265-1272, 1996.<br />
[11] Negi, V. S., Aggarwal, A., Dayal, R. et al.: Complement<br />
degradation product C3d in urine: marker of lupus<br />
nephritis J. Rheumatol. 27(2):380-383, 2000.<br />
[12] Nemes Vanda: Módszertani fejlesztések a vizeletfehérjék<br />
térképezésében. Diplomamunka PTE/ÁOK<br />
2002.<br />
[13] Pedersen, L. M., Terslev, L., Slrensen, P. G. et<br />
al.: Urinary albumin excretion and transcapillary escape<br />
rate of albumin in malignancies. Med. Oncol.<br />
17(2):117-122, 2000.<br />
[14] Taira, K., Matsunaga, T., Kawahara, S. et al.: Fragments<br />
of urinary fibrin/fibrinogen degradation products<br />
and cross-linked fibrin degradation products in<br />
various renal diseases. Thromb. Res. 53(4):367-377,<br />
1989.<br />
[15] Tsai, C. Y., Wu, T. H., Yu, C. L. et al.: Increased excretions<br />
of beta2-microglobulin, IL-6, and IL-8 and<br />
decreased excretion of Tamm-Horsfall glycoprotein in<br />
urine of patients with active lupus nephritis. Nephron<br />
85(3):207-214, 2000.
Vizeletvizsgálatok<br />
311<br />
A proteinuria klinikai szempontjai<br />
Wittmann István<br />
Fogalmak, definíciók<br />
A fehérjevizelés (proteinuria) lehet normális és kóros.<br />
A kóros eredete szerint lehet praerenalis, glomerularis,<br />
tubularis és postrenalis. Praerenalis proteinuriában<br />
a kóros körülmények között képződött és filtrált<br />
fehérjék jelennek meg a vizeletben (pl. myoglobinuria,<br />
Ig-könnyűlánc-vizelés stb.). A könnyűlánc-proteinuria<br />
esetén beszélnek „túlfolyásos” (overflow) eredetről<br />
is. Glomerularis proteinuriában a glomerularis<br />
molekulatömeg-küszöb feletti (> 65 kDa), tubularis<br />
proteinuriában pedig az ez alatti tömegű fehérjék<br />
jelennek meg a vizeletben. Vérzések miatt lehetnek<br />
plazmafehérjék a vizeletben postrenalis fehérjevizelésben.<br />
Amennyiben a napi proteinürítés < 1 g, enyhe,<br />
ha >3,5g, akkor nephroticus mértékű proteinuriáról<br />
van szó. Amikor szinte csak albumin ürül a vizeletben,<br />
akkor szelektív, amennyiben más nagy molekulatömegű<br />
fehérjék is, akkor nem szelektív proteinuriával<br />
van dolgunk.<br />
Microalbuminuriáról akkor beszélünk, ha a vizeletben<br />
speciális immunanalitikai módszerekkel<br />
mérhető, kis mennyiségű albumin jelenik meg. Alkalmazzák<br />
a vizelet-albuminkoncentrációt is, de ez a<br />
legkevésbé elfogadott (> 20 mg/l koncentráció esetén<br />
micro-, >200 mg/l esetén macroalbuminuria lehetősége<br />
vetődik föl).<br />
Az albuminuria definícióját a 11-33, 11-34. táblázat<br />
foglalja össze.<br />
A proteinuria, microalbuminuria<br />
kialakulása<br />
A fehérjék és az albumin keringésben tartását a vese<br />
több struktúrája szolgálja. A 65 kDa-nál nagyobb tömegű<br />
fehérjék már csak kis mennyiségben jutnak át a<br />
glomeruluson, ill. az átkerülő mennyiséget a vesetubulus<br />
sejtjei majdnem teljes mértékben reabszorbeálják.<br />
A 65 kD-nál kisebb molekulatömegű fehérjék<br />
azonban szabadon átjutnak a glomerulus szűrő-rendszerein,<br />
de legnagyobb részük szintén reabszorbeálódik<br />
a proximalis tubularis sejtek kubilin- és megalinreceptorai<br />
segítségével.<br />
A fehérjék visszatartása a vese glomerulusában:<br />
• Első vonalban a glomerularis ér fenesztrált<br />
endothelje szolgál, mivel a fenesztrumokat az<br />
endothel felszínén található glycocalyx lezárja.<br />
• Második vonalbeli szűrőként a glomerularis<br />
basalis membránt említhetjük, amelynek negatív<br />
töltése (amit a szialiláltság és a heparinoidok<br />
okoznak) és kicsiny pórusátmérője biztosítja a<br />
szelektív (kis molekulatömegű és/vagy pozitív<br />
töltésű) fehérjék áthaladását, ill. az ettől eltérők<br />
visszatartását.<br />
• Harmadik vonalban a glomerulus epithelsejtjei<br />
(a podocyták) állábnyúlványai és a közöttük<br />
feszülő membrán (slit membrane) tartja vissza a<br />
keringésben a fehérjéket.<br />
A glomeruluson mégis keresztüljutó fehérjék az említett<br />
módon, aktív reabszorpcióval (ATP felhasználásával)<br />
a tubularis epithelsejtekbe jutnak, ahol<br />
nagyobbrészt degradálódnak. A belőlük képződő<br />
11-33. táblázat. Az albuminuriák definíciója 24 órás gyűjtött<br />
vizeletből *<br />
Albuminuria<br />
Ürítés 24 órás gyűjtött<br />
vizeletben (mg/nap)<br />
normoalbuminuria 300<br />
*<br />
Amennyiben 3-6 hónapon belül végzett 3 mérésből 2 pozitív,<br />
akkor beszélünk micro/ vagy macroalbuminuriáról<br />
11-34. táblázat. Az albuminuriák definíciója nem gyűjtött<br />
vizeletből, az albumin/kreatinin hányados szerint *<br />
Albuminuria<br />
normoalbuminuria<br />
Ürítés nőknél<br />
(mg/mmol)<br />
Ürítés férfiaknál<br />
(mg/mmol)<br />
25<br />
*<br />
Amennyiben 3-6 hónapon belül végzett 3 mérésből 2 pozitív,<br />
akkor beszélünk micro- vagy macroalbuminuriáról.
312 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
aminosavak visszakerülnek a keringésbe, de a fehérjék<br />
kisebb része többé-kevésbé intaktan ismét szecerneálódva<br />
a vizelettel kiürül.<br />
A vese glomerularis betegségeiben olyan mennyiségű<br />
fehérje kerül a tubulusokba, amennyit az már<br />
nem tud reabszorbeálni. Tubularis bajban a szabadon<br />
filtrálódó fehérjék egy része nem reabszorbeálódik.<br />
Mindkét károsodás a nephron pusztulásához<br />
és végeredményben veseelégtelenséghez vezet. Ezért<br />
a vizeletfehérje- vagy speciálisan az albuminürítés<br />
meghatározása a veseállapot követésének egyik legfontosabb<br />
módja.<br />
A proteinuria, microalbuminuria<br />
előfordulása és jelentősége<br />
Populációs szintű, válogatás nélküli népességen végzett<br />
vizsgálatokból tudjuk, hogy a microalbuminuria<br />
előfordulása hozzávetőlegesen 6% körüli. Az analízisek<br />
szerint a microalbuminuria összefüggése a vesebetegségekkel<br />
és a cardiovascularis megbetegedésekkel<br />
szoros.<br />
Több mint 105 ezer beteg vizsgálatából az derült<br />
ki, hogy az összmortalitás a 0,6 mg/mmol-os albumin/kreatinin<br />
hányadoshoz képest 1,1 mg/mmol<br />
esetén 20%-kal, 3,4 mg/mmol mellett 63%-kal, 33,9<br />
mg/mmol esetén 122%-kal nő. Sőt mint látható, ez az<br />
összefüggés az albuminuria normális tartományában<br />
is létezik. Így tehát a vizeletalbumin-ürítés alacsony<br />
tartományának vizsgálata is előnyökkel jár a beteg<br />
vagy a magát egészségesnek gondoló egyén számára.<br />
Tanulmányok arra is rávilágítottak, hogy minél jobban<br />
csökkentjük az albuminürítés mértékét a kezelés<br />
során, annál jobban csökken a veseelégtelenség és a<br />
cardiovascularis betegség kockázata.<br />
A metabolikus szindróma fejezetben leírtaknak<br />
megfelelően (lásd 11.16. fejezet, a Metabolikus<br />
szindróma WHO kritériumrendszere című részben)<br />
korábban az volt az állásfoglalás, hogy a microalbuminuria<br />
a metabolikus szindróma része. Az újabb<br />
kritériumrendszerek (ATPIII, IDF) ugyan már nem<br />
tartalmazzák a microalbuminuriát, de a WHO definíció<br />
rávilágított a metabolikus szindróma és a microalbuminuria<br />
szoros kapcsolatára. Így tehát microalbuminuriás<br />
beteg vizsgálatakor a vesebetegségen<br />
kívül keressük a cukorbetegséget, a dyslipidaemiát, az<br />
obesitast, a hypertoniát és a micro-, valamint macrovascularis<br />
szövődményeket.<br />
Az albuminuria meghatározása<br />
A vizeletalbumin mérésére kifejlesztett szemikvantitatív<br />
módszer (tesztcsík) csak 300 mg/l és a feletti<br />
albuminmennyiség kimutatására képes. Az első<br />
kvantitatív analitikai módszer, amelyet ennél kisebb<br />
koncentrációjú albumin mérésére fejlesztettek ki, egy<br />
RIA módszer volt, amelyhez 125 I jelölt albumint használtak.<br />
Ez azonban túl időigényesnek és költségesnek<br />
bizonyult ahhoz, hogy a rutin laboratóriumi vizsgálat<br />
részévé váljon. Ezért más immunanalitikai mérőmódszert<br />
és automatizálható teszteket fejlesztettek<br />
ki, pl. immunnefelometriás és immunturbidimetriás<br />
módszert. Ennek során az albumint tartalmazó mintát<br />
(szérum vagy vizelet) albuminellenes antitesttel<br />
hozzák reakcióba, és az így keletkező immunkomplex<br />
optikai tulajdonságát detektálják (turbidimetria vagy<br />
fényszórás).<br />
Meghatározás méretkizárásos<br />
kromatográfiával<br />
Napjainkban egy új, a méretkizárásos kromatográfián<br />
alapuló, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás<br />
(HPLC) módszer is rendelkezésünkre áll a microalbuminuria<br />
detektálására. Az új módszert alkalmazó<br />
első vizsgálat kimutatta, hogy a vizeletalbumin koncentrációját<br />
a hagyományos immunológiai módszerek<br />
diabeteses betegekben jelentősen alábecsülik. A<br />
HPLC-vel mérhető vizeletalbumint ezt követően öszszes<br />
(total) vizeletalbuminnak (t-uAlb) nevezték el.<br />
Azon vizeletalbumin-frakciót, amely hagyományos<br />
immun alapú módszerrel nem, de HPLC-vel mérhető,<br />
nem immunreaktív vagy immunkémiailag nem<br />
reaktív albuminnak nevezték el.<br />
A HPLC-vel való mérésekhez használt kit szenzitivitása<br />
(méréshatár): 3 mg/l, méréstartománya:<br />
3-2000 mg/l, inter- és intra-assay pontossága 5,8 és<br />
2,5%). A kit méretkizárásos kromatográfián alapul, és<br />
mobil fázisként sótartalmú foszfátpuffert tartalmaz<br />
(pH: 6,93).<br />
A proteinuria, microalbuminuria<br />
meghatározását befolyásoló tényezők<br />
Klinikai tényezők<br />
Ismert, hogy elsősorban fiatal, egészséges egyéneknél<br />
előfordul a testhelyzettől függően, azaz felállást
Vizeletvizsgálatok<br />
313<br />
követően jelentkező, úgynevezett orthostaticus proteinuria.<br />
Ennek jelentősége vitatott.<br />
Húgyúti fertőzések, a legtöbb gyulladásos betegség,<br />
akut lázas állapot, fizikai aktivitás, szívelégtelenség,<br />
diétás proteinterhelés kiválthat átmeneti proteinuriát.<br />
Felvetődik annak lehetősége is, hogy cukorbetegekben<br />
vagy bármilyen betegségben, amelyben az<br />
oxidatív stressz miatt karbonilstressz is létrejön és<br />
ez módosítja az albumint, ennek következtében az<br />
immunológiai módszerek nem képesek detektálni<br />
a vizeletben az albumint. Újabb eredmények szerint<br />
azonban ezek a tényezők nem tűnnek fontosnak az<br />
albuminuria immunológiai alapú meghatározásában.<br />
Preanalitikai tényezők<br />
Tárolt vizeletből végzett albuminmeghatározás során<br />
számítani kell arra, hogy csökkenő koncentrációértéket<br />
kapunk. Igaz ez a -80 °C-os tárolásra is. Úgy<br />
tűnik, hogy minél alacsonyabb a vizelet pH-ja, annál<br />
nagyobb koncentrációban van jelen a vizeletben a<br />
szabad SH-csoport, amely felelőssé tehető a vizeletalbumin<br />
csökkenéséért. A vizeletben lévő albumin<br />
egy része ugyanis enzimatikus emésztésen esett át, és<br />
csak diszulfidhidak tartják össze. Ezek felbomlásakor<br />
csökkent koncentrációt detektálunk HPLC-vel való,<br />
molekulatömegre alapozott meghatározás során.<br />
Irodalom<br />
Anderson, S., Komers, R., Brenner, B. M.: Renal and<br />
systematic manifestations of glomerular disease. The<br />
Kidney. pp. 820-940. Saunders Elsevier, Philadelphia,<br />
2008.<br />
Cameron, J. S.: The patient with proteinuria and/or haematuria.<br />
Oxford Textbook in Clinical Nephrology. pp.<br />
389-414. Oxford University Press, New York, 2005.<br />
Matsushita, K., van der Velde, M. et al.: Chronic Kidney<br />
Disease Prognosis Consortium,.Association of estimated<br />
glomerular filtration rate and albuminuria with<br />
all-cause and cardiovascular mortality in general population<br />
cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet<br />
375(9731):2073-2081, 2010.<br />
Krumme, B., Walb, D.: Diagnostische Massnahmen bei<br />
Nierenerkrangungen und Beurteilung der Nierenfunktion.<br />
Nephrologie. pp. 1-32. Thieme, Stuttgart, 2008.<br />
Markó, L., Cseh, J., Kőszegi, T. et al.: Storage at -80 degrees<br />
C decreases the concentration of HPLC-detected<br />
urinary albumin: possible mechanisms and implications.<br />
J. Nephrol. 22(3):397-402, 2009.<br />
Markó, L., Molnár, G. A., Wagner, Z. et al.: Measurement<br />
of the modification and interference rate of urinary<br />
albumin detected by size-exclusion HPLC. Physiol.<br />
Meas. 30(10):1137-1150, 2009.<br />
Markó, L., Szigeti, N., Szabó, Z. et al.: Potential urinary<br />
biomarkers of disease activity in Crohn’s disease. Scand.<br />
J. Gastroenterol. 45(12):1440-1448, 2010.<br />
http://emedicine.medscape.com/article/238158-overview<br />
http://kidney.niddk.nih.gov/kudiseases/pubs/proteinuria<br />
http://www.kidney.org/atoz/content/albuminuria.cfm<br />
http://emedicine.medscape.com/article/244631-overview<br />
http://www.gpnotebook.co.uk/simplepage.cfm?ID=<br />
x20030124010449665170<br />
http://care.diabetesjournals.org/content/27/suppl_1/s79.<br />
full<br />
http://www.ifcc.org/index.asp?cat=Publications&scat-<br />
=eJIFCC_&suba=Vol_20_No_1&subx=LABORA-<br />
TORY%20STANDARDS%20IN%20THE%20DIAG-<br />
NOSIS%20AND%20MONITORING%20OF%20<br />
THERAPY&zip=1&dove=1&zona=full&numero=-<br />
&aq=1<br />
http://hopkins-diabetesguide.org/clinical_tests/renal/full_<br />
albuminuria.html<br />
https://ssl.adam.com/content.aspx?productId=49&-<br />
pid=49&gid=150230&site=welldynerx.adam.com&login=well1815
314 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Száraz-kémiai<br />
fehérjekimutatások mint<br />
betegágy melletti gyorstesztek<br />
(POCT) – A POCT diagnosztikus<br />
értékei, a vizsgálatok<br />
hitelességének ellenőrzése<br />
Liszt Ferenc<br />
A laboratóriumi diagnosztika nem a szokásos laboratóriumi<br />
környezetben, hanem a betegellátás közvetlen<br />
közelében, legtöbbször nem laboratóriumi<br />
képesítéssel rendelkező egészségügyi szakszemélyzet<br />
által végzett tevékenysége az angol „Point-of-Care<br />
Testing” kifejezés rövidítéséből származó POCT. A<br />
POCT laboratóriumi diagnosztika, amelynek számos<br />
szinonimája él az angolszász irodalomban (bedside<br />
testing, near patient testing, home testing, self-management).<br />
Definíció szerint magában foglal minden<br />
olyan laboratóriumi vizsgálatot, amelyet a hagyományos<br />
központi laboratóriumokon kívül végeznek. Ez<br />
végezhető akár fekvőbeteg-intézményekben közvetlenül<br />
a betegágy mellett, sürgősségi ellátás keretében<br />
vagy az elsődleges ellátásban a háziorvosi rendelőben,<br />
ill. a beteg által otthoni környezetben. A sürgősségi<br />
betegellátás olyan klinikai helyzetet jelent, amikor<br />
életfontos szervi dysfunctio, súlyos trauma, nagy<br />
sebészeti beavatkozás, általános anesztézia, súlyos<br />
sepsis vagy más súlyos kórképben szenvedő betegeket<br />
kell ellátni. Ilyen klinikai helyzetet jelent intenzív osztályon,<br />
műtőben, sürgősségi osztályokon, sürgősségi<br />
és légi mentés során és a mellkasi fájdalom/trauma/<br />
stroke egységekben való betegellátás. Ebben a fejezetben<br />
csak a sürgősségi betegellátás keretében végzett<br />
POCT-vizsgálatok diagnosztikus értékével foglalkozunk.<br />
A POCT-diagnosztika elterjedését a klinikusok<br />
laboratóriumi vizsgálatokkal szemben támasztott rövidebb<br />
„turn-around-time” (TAT) igénye és a betegápolási<br />
napok lerövidítéséből fakadó gazdaságossági<br />
előnyök segítették. A központi laboratóriumi teszthez<br />
képest rövidebb leletátfordulási időt nyújtó, sokszor<br />
más módszertannal végzett POCT-vizsgálattal szemben<br />
egyértelmű elvárás, hogy eredménye a központi<br />
laboratóriumi teszthez hasonlóan megbízható és öszszevethető<br />
legyen. A nem megfelelő minőségbiztosítással<br />
alkalmazott POCT ugyanis a beteg számára<br />
veszélyes lehet (pontatlan laboratóriumi eredmények<br />
a kivitelezés hibáiból, rossz adatrögzítés, leletdokumentálás<br />
miatt). A POCT-vizsgálatok gazdaságossági<br />
előnye a betegápolási, leginkább az intenzív osztályon<br />
töltött napok számának lerövidülésén keresztül érvényesül,<br />
így azok túlzott gyakorisággal vagy központi<br />
laboratóriumi szolgáltatással parallel „biztonsági” alkalmazása<br />
költséges és felesleges. Az is nyilvánvaló,<br />
hogy egyes klinikai állapotokban a gyors laboratóriumi<br />
eredményeken alapuló döntéshozatal valóban<br />
alapvető a beteg jobb gyógyulási esélyeinek biztosításához,<br />
ugyanakkor más helyzetekben a gyors laboratóriumi<br />
eredmény csupán a nagyobb fokú betegmegelégedettséget<br />
szolgálja.<br />
A betegellátás klinikai eredményességét<br />
javító POCT-gyakorlat lehetőségei<br />
a sürgősségi és intenzív terápiás ellátásban<br />
A sürgősségi és intenzív betegellátás legfontosabb sajátsága,<br />
hogy a beteg klinikai állapotában igen gyorsan<br />
olyan jelentős változások történnek, ami azonnali<br />
terápiás beavatkozást igényel. A vérnyomás, a pulzus,<br />
a testhőmérséklet, a légzésszám és néhány biokémiai<br />
marker olyan “vitális jeleknek” tekinthetők, amelyek<br />
jelzik a beteg állapotának destabilizálódását. A klinikusnak<br />
felkészültnek kell lennie ezen kritikus helyzetek<br />
gyors diagnózisára és kezelésére annak érdekében,<br />
hogy az életfontos szervek és szervrendszerek<br />
következményes károsodását elkerülje. Ez a klinikai<br />
környezet igen fontos területe lehet a megbízható,<br />
pontos POCT-alkalmazásoknak, ami a vitális markerek<br />
valós idejű követésével a kialakuló dysfunctio<br />
azonnali kezelését teszi lehetővé, így javítva a beteggyógyulás<br />
esélyeit.<br />
A sürgősségi és intenzív terápiás betegellátás laboratóriumi<br />
tesztpaneljét illetően ugyan általánosan<br />
elfogadott javaslat nem létezik, több-kevesebb eltéréssel<br />
azonban a laboratóriumi tesztek következő<br />
csoportjai használatosak a fekvőbeteg-intézmények<br />
sürgősségi gyakorlatában:<br />
• Kardiológiai marker vizsgálatok.<br />
• Gyulladásos marker vizsgálatok.<br />
• Klinikai kémiai tesztek (vérgázok, ionok, vércukor,<br />
laktát, a vesefunkció tesztjei, cooximetria).
Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) – A POCT diagnosztikus értékei, ...<br />
315<br />
• Hormonmeghatározások.<br />
• Véralvadási tesztek.<br />
• Toxikológiai vizsgálatok.<br />
Hogy ezek közül mely vizsgálatok azok, amelyek<br />
POCT-módszerrel végezve a betegellátás klinikai<br />
eredményességét fokozzák, csak a POCT-használat<br />
bizonyítékokon alapuló nemzetközi irányelvére támaszkodó<br />
ajánlások alapján foglalható össze.<br />
POCT alkalmazása sürgősségi kardiológiai marker<br />
vizsgálatokra<br />
A mellkasi fájdalom differenciáldiagnosztikája az<br />
intenzív és sürgősségi osztályok egyik legnagyobb kihívása.<br />
Az akut coronariabetegség korai kizárása vagy diagnózisa<br />
alapvetően meghatározza a beteg további<br />
kórházi elhelyezését, kezelését. E betegség differenciáldiagnosztikájában<br />
a nemzetközi és magyar szakmai<br />
irányelvek a következő biokémiai markerek használatát<br />
ajánlják:<br />
• cardialis troponin-I vagy troponin-T;<br />
• kreatin-kináz MB izoenzimtömeg;<br />
• mioglobin bizonyos esetekben.<br />
A szakmai ajánlások a diagnosztikára és terápiára<br />
vonatkozó ajánlásokkal összhangban a biokémiai<br />
markerek a mellkasi fájdalom kezdetétől eltelt időre<br />
vonatkoztatott eredményeitől függő döntéshozatalon<br />
alapulnak. Ha hagyományos központi laboratóriumi<br />
módszerekkel és a kapcsolódó logisztikai mechanizmusokkal<br />
a cardialis markerek eredménye egy órán<br />
belül nem biztosítható, akkor kvantitatív eredményt<br />
adó és a központi laboratóriummal összehangolt<br />
eredményt biztosító POCT bevezetése ajánlott.<br />
A krónikus coronariabetegség kezelésére és diagnózisára<br />
vonatkozó irányelv ajánlja az NT-pro-B natriuretikus-peptid<br />
gyors, betegágy melletti meghatározását,<br />
mert az echocardiográfiás vizsgálat nem áll mindig<br />
rendelkezésre.<br />
POCT-módszerek gyulladásos marker vizsgálatokra<br />
A gyulladásos folyamat diagnosztikája minden orvosi<br />
diszciplina központi kérdései közé tartozik. A<br />
C-reaktív protein, procalcitonin és interleukin-6 marker<br />
vizsgálata POCT-készüléken csak részben lehetséges.<br />
A CRP meghatározásának elsősorban az alapellátásban,<br />
a háziorvosi gyakorlatban, gyermekek<br />
esetében van létjogosultsága. A prokalcitonin és az<br />
interleukin-6 vizsgálatára módszertani okokból kifolyólag<br />
csak szemikvantitatív POCT áll rendelkezésre.<br />
POCT-módszerek sürgősségi klinikai kémiai vizsgálatokra<br />
A fekvőbeteg-intézmények sürgősségi és intenzív<br />
terápiás osztályai változatos összetételű sürgősségi<br />
klinikai kémiai tesztpanelt tartanak szükségesnek<br />
munkájukhoz. A gyors klinikai döntéshozatal érdekében<br />
a vizsgálatok eredményére rövid leletátfordulási<br />
időre van szükség, a tesztek egy részét már jelenleg<br />
is POCT-műszerekkel végzik. Hogy a gyorsabb teszteredmény<br />
valóban javítja a betegellátás klinikai eredményességét,<br />
az inkább feltételezett, mint bizonyított.<br />
Vérgázok<br />
A vérgázanalízis tipikusan sokféle klinikai környezetben<br />
alkalmazott POCT-eljárás. A sürgősségi<br />
osztályokon a beteg gyors megítélése nagy előnyökkel<br />
jár, hiszen a betegektől gyakran nem nyerhető<br />
anamnézis, gyakran korábbi kezeléseikről szóló dokumentáció<br />
sem áll rendelkezésre. A POC vérgáztesztek<br />
alkalmazásával a vérgázeredményekhez való<br />
hozzájutás ideje csökken, és bizonyíték vannak arra<br />
vonatkozóan, hogy ezáltal nő a betegellátás klinikai<br />
eredményessége.<br />
Ionok<br />
Az elektrolit-háztartás (Na + , K + , Ca ++ , Mg ++ )<br />
POCT-módszerrel való megítélésének klinikai hasznossága<br />
sürgősségi ambuláns, intenzív és műtétes<br />
osztályok esetében bizonyított, elsősorban a TAT rövidülése<br />
és a klinikai eredményesség fokozódása révén.<br />
Vesefunkció: kreatinin, karbamid<br />
Nem ajánlott sürgősségi osztályon lévő betegek<br />
karbamid- vagy kreatininszint-meghatározását<br />
POCT-módszerrel rutinszerűen végezni. Ugyanakkor<br />
rutinszerűen alkalmazható cardiovascularis<br />
diagnosztikai laboratóriumokban a karbamid vagy a<br />
kreatinin meghatározása POCT-módszerrel, a POCT<br />
ebben a környezetben javítja a betegellátás klinikai<br />
hatékonyságát.<br />
Vércukor, laktát<br />
A kórházi környezetben POCT-módszerrel vég-
316 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
zett vércukor-meghatározás alkalmazása mellett vagy<br />
ellen nincs elegendő bizonyíték. A laktát-POCT rutinszerű<br />
alkalmazása intenzív, sürgősségi és műtétes<br />
osztályok klinikusai számára ajánlott.<br />
Cooximetria<br />
Cooximetriának hemoglobinpigmentek egy időben,<br />
több hullámhossznál mérő spektrofotometria<br />
elvén való meghatározását nevezzük. Általában total<br />
hemoglobin, oxigénszaturáció, oxihemoglobinfrakció,<br />
karboxihemoglobin (HbCO) és methemoglobin<br />
(MetHb) mérésére alkalmas. Rutinszerű alkalmazása<br />
javasolt influenzaszerű tünetekkel vagy fejfájással<br />
sürgősségi osztályra szén-monoxid-mérgezés gyanújával<br />
felvett betegek szűrésére, methaemoglobinaemiás<br />
betegeknél, sepsis kialakulásának monitorozásában.<br />
POCT-alkalmazás hormonmeghatározásokra<br />
A hormonmeghatározások általában nem tartoznak<br />
a tipikusan POCT-módszerrel mérendő tesztek<br />
közé, bizonyos klinikai alkalmazások (ectopiás terhesség<br />
diagnosztikája, operatív beavatkozások) olyan<br />
rövid TAT-ot igényelnek, amely a POCT-használat<br />
mellett szólhat.<br />
Vizelet-hCG<br />
A hCG POCT eszközök alkalmasak lehetnek ectopiás<br />
terhesség diagnosztikájára, de nem végeztek<br />
összehasonlító vizsgálatokat központi laboratóriumi<br />
módszerekkel. Nincs elegendő bizonyíték ahhoz,<br />
hogy ajánlani lehessen a POC vizelet-hCG-mérő műszereket<br />
ectopiás terhességben való alkalmazásra.<br />
Intraoperatív-PTH meghatározás<br />
A gyors PTH-teszt intraoperatív alkalmazása<br />
klinikai előnyökkel járhat, ami a parathormon-<br />
POCT-módszer bizonyos klinikai alkalmazások során<br />
való bevezetését veti fel.<br />
POCT-alkalmazás sürgősségi véralvadási vizsgálatokra<br />
A sürgősségi és intenzív betegellátás területén<br />
rövid TAT-igénnyel felvetődő véralvadási tesztek<br />
POCT-módszerrel való meghatározásának bizonyított<br />
klinikai hasznosságát megítélő National Academy<br />
of Clinical Biochemistry irányelv főbb megállapításai<br />
a hazai alkalmazások kialakítására vonatkozóan<br />
is irányadók. Rendkívül fontos, hogy valamennyi<br />
POCT alvadásmonitorozó készülékkel mért érték<br />
egyformán jól reprodukálható és pontos legyen. A<br />
POCT PI- és APTI-módszer bevezetése előtt az alkalmazó<br />
intézmény feladata, hogy a POCT-módszerrel<br />
mért értékek antikoaguláns terápia monitorozására<br />
vonatkozó terápiás tartományait, döntési határértékeit<br />
meghatározza, interpretálja azok központi laboratóriumi<br />
hagyományos tesztekkel való összevethetőségét<br />
és kialakítsa a POCT-vizsgálat helyét az<br />
intézmény munkafolyamatában.<br />
POCT-alkalmazás sürgős toxikológiai vizsgálatokra<br />
A mérgezett beteg súlyos szervi dysfunctiók bekövetkezésének<br />
lehetősége miatt intenzív terápiás ellátást<br />
igényel, ennek része a mérgezést okozó ágens<br />
kimutatása és koncentrációjának meghatározása.<br />
Az ismeretlen anyaggal történt intoxikáció eseteiben<br />
a sürgős toxikológiai vizsgálatok elsődleges célja<br />
a diagnózis bizonyítása és a mérgező vegyület kiindulási<br />
koncentrációjának megállapítása a terápia<br />
követéséhez. A toxikológiai célra jelenleg elérhető<br />
POCT-eszközök valamennyien immunoassay elvén<br />
detektálják a vizsgált gyógyszer, gyógyszercsoport<br />
jellegzetes metabolitjait, és szűrőmódszernek tekintendők.<br />
Fontos ismerni más hatóanyag vagy gyógyszerszármazék<br />
interferenciáját a POCT-tesztben. A<br />
műszer cut-off-értékét (a döntési határ értékét) kiválasztásánál<br />
mérlegelni kell. A cut-off körüli drogmennyiséget<br />
tartalmazó minták negativitásának statisztikai<br />
valószínűségét a gyártónak meg kell adnia,<br />
olyan módon, hogy a nem laboratóriumi felhasználó<br />
is felismerje a tévesen negatív eredményt.<br />
A POCT-gyakorlat kialakításának szakmai<br />
kérdései<br />
Hol van szükség POCT-diagnosztika bevezetésére?<br />
Valamennyi fekvőbeteget ellátó intézmény önállóan<br />
dönt a POCT-vizsgálatok bevezetéséről. Indokolt lehet<br />
minden olyan helyen, ahol a nagymértékben laboratóriumi<br />
eredményen alapuló orvosi döntéshozatal<br />
fokozott sürgősséget igényel és a klinikai-terápiás<br />
beavatkozást késleltetné a nem helyszínen végzett<br />
diagnosztikai teszt.<br />
A POCT-vizsgálatok bevezetése előtt a következő<br />
szempontok mérlegelendők:
Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) – A POCT diagnosztikus értékei, ...<br />
317<br />
• Van-e megalapozott klinikai igény POCTmódszerrel<br />
végzendő laboratóriumi teszt bevezetésére?<br />
• A bevezetendő POCT-módszer laboratóriumi<br />
és klinikai szempontból egyaránt megfelelő-e?<br />
• A bevezetendő POCT-módszer növeli-e a<br />
betegellátás eredményességét klinikai, szervezési<br />
vagy gazdaságossági szempontból?<br />
• Mennyire költséghatékony a POCT-módszer a<br />
hagyományos laboratóriumi teszthez képest?<br />
• A kellő gyorsaság a már meglévő központi laboratóriumi<br />
tesztekkel, azok átfutási idejének<br />
csökkentésével biztosítható-e [a preanalitikai<br />
idő csökkentése logisztikai átszervezéssel, a<br />
hagyományos laboratóriumi vizsgálatok analitikai<br />
időigénye és a posztanalitikai idő csökkentése<br />
laboratóriumi információs rendszer (LIR)<br />
fejlesztésével].<br />
A POCT szükségességének eldöntését követően a<br />
leginkább megfelelő készülék kiválasztására kell törekedni.<br />
Ennek során feltétlenül figyelembe kell venni<br />
azt, hogy a klinikai igény kielégítéséhez milyen analitikai<br />
pontosságra, reprodukálhatóságra, ill. detektálási<br />
határra van szükség.<br />
Ki döntsön a POCT-diagnosztika szervezési kérdéseiben?<br />
Azok a fekvőbeteg-ellátó intézmények, amelyek<br />
POCT laboratóriumi vizsgálatokat alkalmaznak, az<br />
intézmény minőségbiztosítási szabályozásának részeként<br />
működő intézményi POCT-programban rögzítik<br />
a POCT működtetésével kapcsolatos szabályozást.<br />
A POCT-programnak tartalmaznia kell a következőket:<br />
• A POCT-vizsgálatok helyét a fekvőbeteg-intézmény<br />
laboratóriumi diagnosztikai stratégiájában.<br />
Milyen diagnosztikai területen kívánja a<br />
POCT-vizsgálatokat alkalmazni, és azok alkalmazása<br />
mennyiben fejleszti az intézmény diagnosztikai<br />
ellátását (gyorsaság, központi laboratóriumtól<br />
távoli osztályok jobb ellátása stb.).<br />
Tervet a POCT-vizsgálatok és a kórházi laboratórium<br />
már alkalmazott módszereinek összehangolására.<br />
• A POCT-vizsgálatok költségviselésének, esetleges<br />
megosztásának meghatározását az adott<br />
intézményben.<br />
• A POCT-programba bevont egységek listáját, az<br />
ott alkalmazott POCT-készülékekkel együtt.<br />
• Fejlesztési tervet az intézményi POCTprogramra<br />
vonatkozóan (milyen további tesztek<br />
bevezetése szükséges osztályonkénti lebontásban,<br />
költség-hatékonyság analízissel).<br />
• Az intézményi POCT-rendszer szervezési és<br />
minőségügyi kérdéseit:<br />
- A döntéshozó és irányelvek megjelölése a bevezetendő<br />
tesztek, műszerek és módszerek kiválasztásával<br />
kapcsolatban.<br />
- A vizsgálatokat végző és értékelő személyek<br />
kijelölése, oktatásuk meghatározása.<br />
- A POCT-eredmény/lelet dokumentálásának<br />
módja.<br />
- Vizsgálatok végzésének szakmai protokollja.<br />
- A POCT-vizsgálatok végzésének és készülékek<br />
minőségi kívánalmainak biztosítását<br />
szolgáló dokumentumok (felelősök megjelölésével).<br />
- A POCT-készülékek karbantartási protokollja.<br />
- A POCT-vizsgálatok végzésének technikai<br />
protokollja.<br />
- A POCT-vizsgálatok minőségbiztosítási protokollja<br />
(belső és külső minőség-ellenőrzés).<br />
A POCT-vizsgálatok szakmai felelőssége<br />
Ezek olyan különleges laboratóriumi vizsgálatok,<br />
amelyek technikai kivitelezésében laboratóriumi<br />
szakismeretekkel nem rendelkező egészségügyi szakszemélyzet<br />
(orvosok, nővérek, intenzív osztályos aszszisztensek,<br />
műtősnők stb.) is részt vehet.<br />
A vizsgálatok minőségének ellenőrzése, a minőség<br />
biztosítása a központi laboratórium vezetőjének<br />
felelőssége, aki ezt megfelelő laboratóriumi szakszemélyzeten<br />
keresztül biztosítja. Az egyéb laboratóriumi<br />
vizsgálatokkal ellentétben a POCT-vizsgálatok<br />
eredményei előzetes laboratóriumi orvosi validálás<br />
nélkül kerülnek klinikai értékelésre. Ezért a megfelelő<br />
(és kielégítően dokumentált) minőség-ellenőrzési<br />
paraméterek mellett az egyedi vizsgálati eredmények<br />
szakmai felelőssége - ha a vizsgálatot nem laboratóriumi<br />
szakember végzi, hanem a betegellátó osztály<br />
munkatársa - a betegellátó osztály vezetőjét terheli. A<br />
POCT-mérőeszközök csak akkor használhatók, ha a<br />
műszerek évenkénti független műszertechnikai ellenőrzését<br />
elvégezték.
318 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A POCT-gyakorlat minőségbiztosítása<br />
A POCT-diagnosztika hibaforrásai<br />
A laboratóriumi eljárásokhoz hasonlóan a POCT-diagnosztika<br />
is ugyanazokkal a - meghatározás preanalitikai,<br />
analitikai és posztanalitikai fázisához<br />
rendelhető - hibaforrásokkal terhelt. A POCT fő előnye<br />
természetesen abban rejlik, hogy számottevően<br />
csökkenti a leletátfordulási időt. Ugyanakkor számos<br />
olyan vélemény is létezik, amely szerint a preanalitikai<br />
fázisban a mintavétel, a mintatranszport,<br />
valamint a posztanalitikai fázis adatközlési hibái is<br />
eliminálódnak. Ez távolról sincs így, ezért a hibák kiküszöbölése<br />
legalább akkora kihívás, mint a központosított<br />
laboratóriumokban.<br />
A POCT-folyamatban a következő hibák előfordulására<br />
lehet számítani:<br />
• A preanalitikai fázisban:<br />
- A vizsgálat elrendelésekor nem megfelelő az<br />
időzítés (pl. cardialis markerek, troponin,<br />
mioglobin, CK-MB panelként kérése konfúziót<br />
okoz).<br />
- A minta nem a megfelelő betegtől származik,<br />
vagy nincs meg a szükséges információ a beteggel<br />
kapcsolatban.<br />
- A minta gyűjtése nem megfelelő térfogatú, inkonzisztens<br />
mintát eredményez.<br />
• Az analitikai fázisban:<br />
- A műszer kalibrációja nem megfelelő, ez különösen<br />
a nem laboratóriumi képzettségű személyzet<br />
miatt jelentkező veszélyforrás.<br />
- Vizsgálati minta és reagens interakciójának<br />
következtében: heterofil antitestek tévesen<br />
negatív vagy pozitív értékeket eredményezhetnek<br />
különösen az agglutinációval működő<br />
meghatározásoknál. Az interferáló anyagok<br />
jelenléte ugyan a laboratóriumi meghatározások<br />
más típusait is befolyásolhatja, de a<br />
POCT-diagnosztikában az eredményeket<br />
szinte azonnal felhasználják a beteg kezelésében.<br />
- Eredménygenerálás, az eredmény a módszer<br />
kínálta határokon kívül található.<br />
- Az eredmény nem validált, hiányos vagy nem<br />
létezik minőség-ellenőrzés. A hagyományos<br />
laboratóriumi gyakorlatban használt külső<br />
minőség-ellenőrzési rendszerek csak módosításokkal<br />
alkalmazhatók POCT-rendszerekre,<br />
mivel az ún. „laboratóriumi típusú”<br />
POCT-rendszerek mellett „cartridge” (mérőkazettás),<br />
ill. „tesztcsík” alapú rendszerek is<br />
léteznek.<br />
• A posztanalitikai fázisban:<br />
- A mérési eredmény értékelését, kezelését<br />
nem megfelelő mértékegységben, referenciaérték<br />
nélkül végzik.<br />
- A kritikus értékek nincsenek jelezve, a döntéshozó<br />
figyelmét semmi nem hívja fel, nincs<br />
megfelelően dokumentálva. Mindkét esetben<br />
a hibák csökkentése a POCT-készülék(ek) és<br />
a beteg adatbázisának közvetlen informatikai<br />
összekötésével oldható meg.<br />
Rizikó-management a POCT területén<br />
A POCT-diagnosztika biztonságát növelő számos<br />
javaslat ellenére (College of American Pathologists,<br />
National Institute of Health, USA, ISO) jelenleg az<br />
irodalomban a leggyakrabban idézett veszélyforrások<br />
a következők:<br />
• A minőség-ellenőrzés végrehajtása és dokumentálása.<br />
• Külső jártassági vizsgálatban nem kielégítő részvétel.<br />
• Megfelelő helyesbítő eljárás megléte nem megfelelő<br />
kontrollértékek esetén.<br />
• A gyártó előírásainak maradéktalan betartása.<br />
• Eljárás a mérés végrehajtására és az eredmény<br />
közlésére.<br />
• A kalibráció verifikálása háromhavonta, dokumentált<br />
formában.<br />
• A személyzet oktatásának és kompetenciájának<br />
nyilvántartása.<br />
• A személyzet folyamatos továbbképzésének<br />
megvalósítása.<br />
A POCT-gyakorlat minőségirányítási<br />
rendszere<br />
A POCT-diagnosztika minőségirányítási rendszerének<br />
biztosítani kell a megbízható központi laboratóriumi<br />
teszttel összevethető eredményszolgáltatást és<br />
az ezt biztosítani tudó személyzet képzését, valamint<br />
a műszerek kiválasztását, ellenőrzését. A minőségirányítás<br />
a következő szempontokra terjed ki:
Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) – A POCT diagnosztikus értékei, ...<br />
319<br />
• Az új/alternatív POCT-készülékek, rendszerek<br />
kiértékelése.<br />
• A felhasználó javaslatainak és szakmai protokolljainak<br />
kiértékelése.<br />
• A műszerek beszerzési és installációs folyamatainak<br />
ellenőrzése.<br />
• Reagens- és fogyóanyag-beszerzések, karbantartások<br />
gyakorlata.<br />
• A POCT-kezelők folyamatos képzése, jogosítványhoz<br />
juttatása és újravizsgáztatása.<br />
• Minőségi kontrollok, minőségbiztosítás.<br />
A POCT-vizsgálatok minőségének biztosítása<br />
A vizsgálatok minőségének biztosítása és annak<br />
ellenőrzése a laboratórium feladata. A minőség biztosítása<br />
azonos alapelveken alapul, mint a laboratóriumban<br />
elvégzett egyéb vizsgálatok minőségének<br />
biztosítása. Módszerleírásokban kell rögzíteni a<br />
POCT-vizsgálatok módszertani alapelveit, a módszer<br />
korlátait, a kvantitatív mérés elvégzésének kritériumait,<br />
analitikai és diagnosztikai érzékenységét<br />
és specificitását. Meg kell határozni a kötelező belső<br />
kontrollvizsgálatok gyakoriságát és a teendőket nem<br />
elfogadható kontrollok esetén. Nyomon kell követni<br />
a mérési bizonytalanságot, a visszavezethetőséget, és<br />
dokumentálni kell a POCT-módszerrel és hagyományos<br />
laboratóriumi módszerrel egyaránt mért paraméterek<br />
egymással való. összevethetőségét.<br />
A POCT-vizsgálatokat kötelező bevonni a külső<br />
minőség-ellenőrzés körébe. POCT- és hagyományos<br />
laboratóriumi vizsgálattal egyaránt végzett vizsgálatok<br />
esetében minden kétséget kizáróan megállapíthatónak<br />
kell lenni, hogy az adott külső minőség-ellenőrzési<br />
eredmény melyik módszerrel készült. A<br />
POCT-műszerek rendszeres, gyártó által előírt karbantartási<br />
protokollját és a karbantartás elvégzésének<br />
tényét dokumentálni kell. A laboratóriumi szakszemélyzetnek<br />
a minőségbiztosítási feladatok ellátása<br />
céljából mindenkor szabad bejárást kell biztosítani a<br />
POCT laboratóriumi berendezésekhez.<br />
A POCT-vizsgálatok kivitelezése, a vizsgálatokat<br />
végző személyzet oktatása<br />
POCT-vizsgálatot kizárólagosan erre kioktatott,<br />
írásban felhatalmazott személyzet végezhet az előzetesen<br />
engedélyezett, azonosítóval ellátott helyen, az adott<br />
fekvőbeteg-ellátó intézmény POCT-szabályzatában<br />
rögzített minőségügyi és módszerleírások alapján.<br />
Az oktatást a laboratórium vezetője köteles megszervezni<br />
és dokumentálni. Az oktatásba be kell vonni<br />
az érintett klinikai osztályok vezetőjét is. Az oktatásnak<br />
ki kell térni a POCT-berendezések biztonságos és<br />
szakszerű használatára, a műszer korlátaira, a minta<br />
típusára, a mérési interferenciákra, a műszer sajátságaiból<br />
adódó interpretációs kérdésekre, a felhasználó<br />
által elkövethető leggyakoribb hibákra, a minőségbiztosítás<br />
kivitelezésére és a vizsgálatok elvégzése során<br />
a személyzetet érintő veszélyforrásokra. Oktatni<br />
kell az elvégzett vizsgálatok dokumentálásának módját.<br />
Fontos a kapott POCT-eredmények értékelésének<br />
és alarm értékek esetén a teendők meghatározásának<br />
oktatása. Az oktatást (oktató, résztvevők) írásban dokumentálni<br />
kell, és meg kell határozni a kapott „jogosítványok”<br />
érvényességi idejét és az újraoktatás időpontját.<br />
A POCT-vizsgálatok adatkezelése<br />
A POCT-vizsgálatokat a laboratóriumi vizsgálatokkal<br />
azonos módon kell dokumentálni. Az eredményről,<br />
leletről másolatot kell készíteni a laboratórium<br />
számára, és azt a laboratóriumi informatikai<br />
rendszerben (LIR) rögzíteni kell (a betegeredmények<br />
követhetősége, OEP-elszámolás érdekében) olyan<br />
módon, hogy a POCT-mérések egyértelműen elkülöníthetők<br />
legyenek a hagyományos laboratóriumi<br />
tesztektől (pl. a mérést végző, ill. elfogadó személy<br />
kódjának feltüntetésével).<br />
Irodalom<br />
Casagranda, I.: Point-of-care testing in critical care:<br />
the clinician’s point of view. Clin. Chem. Lab. Med.<br />
48(7):931–934, 2010.<br />
Cowie, M. R.: Clinical applications of B-type natriuretic<br />
peptide (BNP) testing. European Heart Journal<br />
24:1710–1718, 2003.<br />
Di Serio, F.: Integration between point-of-care cardiac<br />
markers in an emergency/cardiology department and<br />
the central laboratory: methodological and preliminary<br />
clinical evaluation. Clin. Chem. Lab. Med. 43(2):202–<br />
209, 2005.<br />
Monteny, M.: Point-of-care C-reactive protein testing in<br />
febrile children in general practice. Clin. Chem. Lab.<br />
Med.44(12):1428–1432, 2006.<br />
Morrow, D. A.: National Academy of Clinical Biochemistry<br />
Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical<br />
Characteristics and Utilization of Biochemical Markers
320 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
in Acute Coronary Syndromes. http://www.clinchem.<br />
org/cgi/doi/10.1373/clinchem.2006.084194<br />
Nichols, J. H. (ed.): Laboratory Medicine Practice Guidelines<br />
Evidence-Based Practice for Point-of-Care Testing.<br />
American Association for Clinical Chemistry. 2006.<br />
Nichols, J. H.: Executive summary. The National Academy<br />
of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice<br />
Guideline: Evidence-based practice for point-of-care<br />
testing. Clinica Chimica Acta 379:14–28, 2007.<br />
Pfäfflin, A.: Inflammation markers in point-of-care testing<br />
(POCT). Anal. Bioanal. Chem. 393:1473–1480,<br />
2009.<br />
Plebani, M.: Does POCT reduce the risk of error in laboratory<br />
testing? Clinica Chimica Acta 404:59–64, 2009.<br />
Price, C. P.: Improving healthcare accessibility through<br />
point-of-care technologies. Clin. Chem. 53:1665–1675,<br />
2007.<br />
Zaninotto, M.: PATHFAST NT-proBNP (N-terminal-pro<br />
B type natriuretic peptide): a multicenter evaluation<br />
of a new point-of-care assay. Clin. Chem. Lab.<br />
Med. 48(7):1029–103, 2010.
Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban<br />
321<br />
Fehérjék mint tumormarkerek<br />
az orvosi laboratóriumokban<br />
Kőszegi Tamás<br />
A tumormarkerek jellemzői<br />
A tumormarker definíciója<br />
Tágabb értelemben a daganatos állapotot jelző minden<br />
olyan eljárás, molekulakimutatás, amely segíti a<br />
klinikust a daganatos betegséggel kapcsolatos kérdések<br />
megválaszolásában és az orvosi döntések meghozatalában.<br />
Szűkebb értelemben az emberi szervezetből<br />
vett mintákban olyan molekulák és/vagy<br />
folyamatok nyomon követését jelenti, melyek menynyiségi<br />
és minőségi változásai összefüggésbe hozhatók<br />
a daganatmegelőző állapotokkal, ill. a már kifejlődött<br />
tumoros megbetegedéssel.<br />
A tumormarkerek alapvetően két csoportra oszthatók:<br />
• Elsődleges (primer) markerek. Olyan molekulák,<br />
amelyeket a daganatsejtek termelnek, és menynyiségi<br />
változásuk a vérből vagy a daganatszövetből<br />
kimutatható. Szerkezetük szerint igen<br />
sokfélék lehetnek: fehérjék, kis molekulatömegű<br />
hormonok, nukleinsavak stb. A daganatos sejtek<br />
sokszor „nem felejtenek”, azaz részlegesen<br />
differenciálódnak azzá a szövetté, amelyből<br />
transzformálódtak, és képesek sok olyan molekula<br />
termelésére, amelyet az eredeti szövet is<br />
produkált. Így alakulnak ki pl. a hormontermelő<br />
tumorok vagy a plazmasejtes daganatok<br />
(myeloma malignum).<br />
• Másodlagos (szekunder) markerek. A tumor<br />
növekedési sajátságaiból és a szervezet válaszreakcióiból<br />
származó molekulák. Elvben bármilyen<br />
mérhető laboratóriumi paraméter felfogható<br />
szekunder markernek. Néhány példa: a<br />
csontrendszert érintő folyamatoknál kalcium,<br />
kollagén-keresztkötések, epeút-elzáródásakor<br />
bilirubin, alkalikus foszfatáz, γ-GT, kiterjedt<br />
daganatoknál leukocytosis, thrombocytaszám, a<br />
CRP emelkedése stb. Ezek a paraméterek egyáltalán<br />
nem daganatspecifikusak, de jelzik a<br />
szervezet érintettségét.<br />
Általános szempontok<br />
A malignus transzformáció során szinte kivétel nélkül<br />
egyetlen sejt alakul át korlátlan osztódásra alkalmas<br />
állapotba. A transzformáció a sejt genetikai<br />
anyagának finom változásait jelenti (különböző mutációk,<br />
idegen nukleinsav beépülése, a DNS károsodása,<br />
kromoszómarendellenességek), egyszerre több<br />
változásnak is be kell következnie. Mindezek összességükben<br />
az egész genom információtartalmához képest<br />
elenyészően kicsiny eltérések, így amennyiben a<br />
transzformált sejt túlél, az átírt géntermékek (fehérjék)<br />
gyakorlatilag alig különböznek a kiindulási sejt<br />
fehérjéitől. A különbség az egészséges és a daganatos<br />
sejtek közt elsősorban a transzkripció megváltozásában<br />
rejlik, azaz a malignus sejtekben a sejtosztódást<br />
szabályozó fehérjék mennyiségi eltolódása következik<br />
be. Így válhatnak pl. a normálisan is átíródó proonkogének<br />
valódi onkogénné. A valóság természetesen<br />
ennél sokkal bonyolultabb, de annyi bizonyos, hogy<br />
a daganatsejtekben elsősorban a szintetizálódott fehérjék<br />
mennyiségében és nem minőségében jön létre<br />
változás.<br />
A másik fontos szempont a daganatsejtek kimenekülése<br />
a szabályozási folyamatok alól. Érvényes ez a<br />
növekedési sajátosságokra (invazív növekedés) és az<br />
általuk termelt biológiailag aktív molekulákra (növekedési<br />
faktorok, hormonok). A visszacsatolási folyamatok<br />
(feedback) a tumoros szöveteknél nem<br />
működnek, a daganatsejtek autonóm módon megtermelik<br />
a saját szaporodásukhoz szükséges növekedési<br />
faktorokat (pl. parakrin vagy autokrin szekrécióval),<br />
ill. a szervezet szükségleteitől függetlenül szintetizálják<br />
és szekretálják a hormontermészetű molekulákat.<br />
Sajátos mechanizmus működik myeloma multi plex<br />
esetében, itt a kóros plazmasejtté transzformálódott<br />
klón nem csak korlátlan szaporodásra képes, de<br />
kontrollálatlan immunglobulin-szekrécióra is. A<br />
transzformáció érinti az immunglobulin géneket is,<br />
a szintetizált termékek nem töltenek be hasznos védőfunkciót<br />
(paraproteinek), és az esetek egy részében<br />
nem is a teljes molekula termelődik, hanem annak<br />
egy lánca (nehézlánc-betegség, Bence-Jones-fehérje<br />
vagy szabad könnyűlánc).<br />
A fehérje természetű primer tumormarkereknél<br />
nagy jelentőségűek a poszttranszlációs mechanizmusok.<br />
A megszületett fehérjék intracellulárisan vagy a
322 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
keringésben módosulnak, a leggyakrabban cukrokkal<br />
lépnek kapcsolatba. Nagyon sok tumormarker<br />
glikoprotein vagy ún. mucingazdag protein, és módosult<br />
szerkezetük különbözhet az egészséges sejtekben<br />
termelt hasonló fehérjékétől.<br />
Az orvosi terminológiában szokás a markereket tumorantigéneknek<br />
is nevezni. Ez általában helytelen,<br />
mert legtöbbjük az egészséges sejtekben is megtalálható<br />
gének produktuma, így a szervezet számára nem<br />
antigén sajátságú. Amennyiben a markerek valóban<br />
antigének lennének, az immunrendszer képes lenne<br />
hatékonyan védekezni a daganatsejtek ellen. Létezhetnek<br />
azonban valódi, ún. neoantigének is, amelyek<br />
mutáció vagy poszttranszlációs módosulás következtében<br />
ténylegesen különböznek a normális génproduktumoktól.<br />
A tumorantigén kifejezés onnan ered<br />
és arra utal, hogy ha a tisztított tumormarkerrel egy<br />
idegen fajt (leggyakrabban egér, nyúl, kecske stb.) immunizálunk,<br />
akkor a beoltott állat specifikus immunglobulinokat<br />
termel a beadott antigén ellen. Az állati<br />
eredetű, tisztított antitestek felhasználhatók a tumormarker<br />
kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására.<br />
Peptid-fehérje tumormarkerek<br />
A fehérje természetű tumormarkerek<br />
extracelluláris térbe kerülésének<br />
mechanizmusa<br />
A sejtekben szintetizálódott fehérjék alapvetően kétféle<br />
funkciót tölthetnek be:<br />
• Szerepük a sejten belül van, pl. struktúrfehérjék<br />
vagy a metabolizmusban vesznek részt.<br />
• Funkciójukat az extracelluláris térben töltik be<br />
(pl. véralvadási faktorok, albumin).<br />
A primer tumormarkerek jelentős hányada peptid-fehérje<br />
természetű és az első csoportba tartozik.<br />
Ezért elsődlegesen akkor kerülnek ki az extracelluláris<br />
térbe, amikor a daganatsejtek elpusztulnak. A malignus<br />
sejtekre jellemző a fokozott turnover, a rövid<br />
generációs ciklus, pusztulásuk elsősorban nekrózissal<br />
történik a szervezet védekezése, a daganat esetleges<br />
rossz vérellátása vagy éppen a terápiás beavatkozások<br />
következtében. Mindezek ellenére a második típusú<br />
mechanizmus is előfordul, ilyenkor a malignus sejtek<br />
a markereket aktívan szekretálják (pl. peptidhormonok,<br />
paraproteinek). A szisztémás keringésbe jutó<br />
markerek egy része a vizeletben is megtalálható, ép<br />
vesefunkciónál csak az albuminnál kisebb (filtrációs<br />
küszöb alatti) molekulák, károsodott veséknél akár<br />
teljes immunglobulinok is a vizeletbe kerülhetnek.<br />
Az extracelluláris térbe kerülést befolyásoló egyéb tényezők<br />
A tumormarkerek vérszintjét a fentieken kívül<br />
még egyéb tényezők is befolyásolják (11-35. táblázat).<br />
Az ideális fehérje természetű tumormarker jellemzői<br />
1. Legyen specifikus, vagyis csak malignus folyamat<br />
esetében legyen kimutatható.<br />
2. Legyen kellően érzékeny, hogy a daganatos folyamatot<br />
minél koraibb stádiumában jelezze.<br />
3. Legyen szövet/sejt specifikus.<br />
4. Vérszintje korreláljon a tumorsejtek mennyiségével.<br />
5. Legyen jósló (prediktív, azaz maximális előrejelző)<br />
értéke.<br />
6. Legyen megbízhatóan mérhető.<br />
Sajnos az eddigiekben vázoltak alapján az első három<br />
pontban felsorolt követelmények nem teljesülnek<br />
maradéktalanul. A laboratóriumi vizsgálatoknál<br />
11-35. táblázat. Tumormarkerek vérszintjét befolyásoló mechanizmusok<br />
Meghatározó tényező<br />
produkció<br />
szekréció<br />
a szövet vérellátása<br />
szövetszétesés<br />
elimináció<br />
Mechanizmus<br />
a szintézis sebessége a sejtben<br />
a sejtből való kiáramlás sebessége (aktív vagy passzív folyamatok)<br />
oxigenizációs, nutritiós tényezők<br />
a sejt-turnover sebessége, terápiás beavatkozások<br />
a külvilág felé (pl. vizelet útján) vagy természetes metabolizmussal
Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban<br />
323<br />
ismert, hogy egy módszer diagnosztikai specificitása<br />
és szenzitivitása gyakorlatilag sohasem éri el a 100%-<br />
ot; ha a diagnosztikus küszöbérték változtatásával<br />
növeljük a szenzitivitást, akkor csökken a specificitás<br />
és fordítva. Mindennek oka az, hogy az egészségesekre<br />
jellemző referenciatartomány átfedést mutat a betegekre<br />
jellemző patológiás tartománnyal.<br />
Tovább bonyolítja a helyzetet, hogy a legtöbb marker<br />
referenciatartománya az egyénre jellemző és ebben<br />
az örökletes tényezőkön kívül életmódi szokások<br />
(pl. dohányzás) is szerepet játszhatnak. A tumormarkerek<br />
jelentős hányada ezen kívül nem szövetspecifikus,<br />
vagyis ugyanazt a markert többféle daganatsejt is<br />
termelheti.<br />
Ugyanakkor a felsorolás utolsó három feltétele jórészt<br />
teljesül. A vérszint jó korrelációt mutat a malignus<br />
sejtek számával, vagyis a daganat tömegével. Itt<br />
jegyzendő meg, hogy a mai érzékeny analitikai módszerekkel<br />
is kb. 1 g tumormassza (kb. 10 9 sejt) szükséges<br />
ahhoz, hogy a vérbe kihíguló marker mennyisége<br />
detektálható legyen. A prediktív értékről, a klinikai<br />
felhasználásról és a mérési technikákról a fejezet későbbi<br />
részeiben lesz szó.<br />
A peptid-fehérje tumormarkerek felosztása és jellemzői<br />
• Onkofötális markerek<br />
CEA, carcinoembryonalis antigén<br />
Normálisan az embrionális életben termelődő sejtfelszíni<br />
glikoprotein, a sejtadhézióban tölt be fontos<br />
szerepet. A születés után szintézise gyakorlatilag a<br />
kimutathatóság határára csökken. Felnőttekben először<br />
emésztőrendszeri daganatoknál mutatták ki<br />
emelkedett vérszintjét, az lLszelektin és az E-szelektin<br />
ligandja, szerepe valószínűleg a metasztázisok kialakulásában<br />
fontos. Colontumoron kívül gyomor-,<br />
hasnyálmirigy-, tüdő-, emlő- és medullaris carcinoma<br />
markere is lehet, típusos példáját adva annak a<br />
ténynek, hogy a markerek jelentős része nem szövetspecifikus.<br />
Nem tumoros folyamatokban is emelkedett<br />
lehet: erős dohányosoknál, gyulladásos bélbetegségekben,<br />
májcirrhosisban.<br />
AFP, a-fötoprotein<br />
Szintén a magzati életben, az embriózsák és a máj<br />
által termelt fehérje, amely ekkor az albuminhoz hasonló<br />
funkciót tölt be. 591 aminosavból álló glikoprotein,<br />
felnőttkorban szintézise minimálisra csökken,<br />
funkciója ismeretlen. Az AFP több izoformában<br />
fordul elő a keringésben. Rutinszerű meghatározásakor<br />
az összes (total) AFP mennyiségét mérjük, de ma<br />
már lehetőség van az L3-forma szelektív mérésére is.<br />
Az L3 részesedése a total AFP-ből (L3%) prognosztikai<br />
marker: minél nagyobb az L3 százaléka, annál<br />
nagyobb a májcarcinoma kifejlődésének kockázata és<br />
a rossz prognózis lehetősége. Az AFP-értékek emelkedettek<br />
hepatocellularis carcinomában és csírasejtes<br />
(de nem seminoma) daganatokban. Krónikus, nem<br />
malignus májbetegségekben is emelkedett az AFP<br />
(krónikus hepatitis, májcirrhosis).<br />
• Hormonok<br />
Kalcitonin<br />
32 aminosavból álló polipeptid, a pajzsmirigy parafollicularis<br />
sejtjeiben (C-sejtek) termelődik. Emelkedett<br />
szérumszintet mutat a pajzsmirigy medullaris<br />
carcinomájában, a CEA markerrel együtt.<br />
PTH, parathormon<br />
84 aminosavból álló polipeptid, a mellékpajzsmirigy<br />
sejtjei termelik. A mellékpajzsmirigy adenomájában<br />
vérszintje megemelkedik (primer hyperparathyreosis).<br />
Primer folyamatoknál előfordul, hogy<br />
ectopiás (nem a célmirigyben, hanem azon kívüli)<br />
hormontermelés jön létre. A sebészi eltávolítás során<br />
lehetőség van ún. intraoperatív PTH-meghatározásra,<br />
mert a PTH féléletideje a periférián 4 perc. Sikeres<br />
műtéti beavatkozás után a PTH-szintnek a referenciatartományba<br />
kell visszatérnie.<br />
PTH related protein, parathormonszerű fehérje<br />
A PTH-hormoncsaládhoz tartozó fehérje, fiziológiásan<br />
a csontrendszerre és az emlőmirigy fejlődésére<br />
hat endokrin, parakrin, autokrin mechanizmusokkal.<br />
Emelkedett vérszintje többféle malignus tumorhoz<br />
társulhat: emlő-, tüdő laphámsejtes carcinoma. A<br />
hormont szekretáló daganatok esetében a szérumkalciumszint<br />
megemelkedik, gyakran ez a jelenség hívja<br />
fel a figyelmet a malignus folyamatra (paraneoplasiás<br />
tünet).<br />
β-hCG, β humán koriongonadotropin<br />
A hCG elsődlegesen terhesség alatt termelődik<br />
nagy mennyiségben, először a fejlődő embrió, később<br />
a placenta által. A hCG 244 aminosavból álló dimer<br />
(α- és β-alegység), az α rész az LH, FSH és TSH hasonló<br />
alegységével azonos. Csírasejtes tumorok és<br />
trophoblastrendellenességek (mola hydatidosa, choriocarcinoma)<br />
esetében a β-alegység vérszintje igen
324 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
magas lehet. Fontos a β-alegység szelektív mérési<br />
lehetősége – monoklonális antitestekkel –, hogy az<br />
esetleges keresztreakciókat az LH, FSH, TSH hormonnal<br />
elkerüljük.<br />
• Enzimek<br />
PAP, prostata savi foszfatáz<br />
Mérésének ma már nincs különösebb jelentősége,<br />
mert a PSA-vizsgálat lényegesen több információt ad.<br />
PSA, prostataspecifikus antigén<br />
34 kDa tömegű szerin típusú proteáz, amely gyakorlatilag<br />
csak a prostatában termelődik. Feladata az<br />
ondó elfolyósodásának és a cervicalis nyák feloldásának,<br />
így a megtermékenyítésnek az elősegítése. A<br />
PSA a vérben szérumfehérjékhez kötött és nem kötött,<br />
úgynevezett szabad PSA (fPSA) formában van<br />
jelen. Ma már lehetőség van külön a total PSA (tPSA)<br />
mérésére, ahol mindkét formát detektáljuk és külön<br />
az fPSA meghatározására. FPSA-mérést csak akkor<br />
végzünk, ha a tPSA meghaladja az adott életkorra<br />
jellemző referenciatartomány felső határát. Az fPSA/<br />
tPSA arány számításának külön információs értéke<br />
van, kóros tPSA és 25% alatti fPSA arány malignus<br />
folyamatot valószínűsít, míg 25% feletti arány esetében<br />
inkább jóindulatú prostatahypertrophia jön szóba.<br />
A prostata betegségein kívül a PSA ritkán emelkedett<br />
lehet emlő, tüdő, méh- és vesedaganatoknál is.<br />
• Mukoprotein markerek (CA)<br />
CA 15-3<br />
Nagy molekulatömegű, mucinban gazdag fehérje,<br />
amely megtalálható egészséges és daganatos szövetek<br />
hámsejtjeiben (emlő, bél, tüdő, petefészek, hasnyálmirigy).<br />
A MUC 1 gén terméke, glikoprotein,<br />
amelynek glikozilációja malignus folyamatokban az<br />
egészségesre jellemzőtől eltérő lehet. Monoklonális<br />
antitestekkel a CA 15-3 detektálható és mennyiségileg<br />
meghatározható. Elsősorban emlőtumorban alkalmazzuk.<br />
CA 125<br />
A MUC 16 gén terméke, glikoprotein. Funkciója<br />
elsődlegesen a hámsejtek védelme pl. a cornea, a<br />
tüdő és a női nemi szervek esetében a kórokozókkal<br />
és a kiszáradással szemben. Malignus folyamatokban<br />
elsősorban petefészekrákban találhatunk emelkedett<br />
értékeket. Emellett ritkán más tumoros állapotban<br />
is jelezhet (tüdő, emlő, bélrendszeri stb.). Kismértékű<br />
vérszintnövekedést láthatunk a hasüregben zajló<br />
benignus gyulladásos folyamatoknál, egyéb petefészek-rendellenességeknél<br />
és terhességben.<br />
CA 19-9<br />
Glikoprotein, nagy sziálsavtartalommal (másképpen<br />
sziálsavas Lewis (a) antigén). A hasnyálmirigy, a<br />
gyomor és a vastagbél daganatsejtjeinek adhézióját<br />
segíti. Gyakran negatív eredményt ad daganatos betegségben<br />
és hamis pozitívat benignus folyamatokban,<br />
pl. az epevezeték és a máj betegségeiben.<br />
CA 72-4<br />
Más néven tumorasszociált glikoprotein (TAG 72).<br />
Nagyon nagy molekulatömegű, mucinban gazdag fehérje,<br />
amelyet sokféle malignus tumorban kimutattak<br />
(emlő, vastagbél, hasnyálmirigy, gyomor). Jelenleg a<br />
gyomordaganatoknál vizsgálják klinikai használhatóságát,<br />
mert a gyomortumorok gyakran nem szekretálnak<br />
markereket (némák). Benignus folyamatoknál<br />
is emelkedhet a vérszintje (pl. krónikus májkárodosás,<br />
benignus ovariumdaganatok).<br />
• Egyéb fehérje markerek<br />
CYFRA 21-1<br />
Citokeratin 19 fragmens, 30 kDa molekulatömegű.<br />
A citokeratinok az intermedier citoszkeleton filament<br />
családba tartoznak, a hámsejtekre jellemzőek. A daganatos<br />
sejtekből (pl. nekrózis következtében) kiszabaduló<br />
filamentek degradálódnak és így kerülnek<br />
a keringésbe. A CYFRA 21-1 nevű fragmens meghatározása<br />
a nem kis sejtes tüdődaganatoknál a legeredményesebb,<br />
jóllehet figyelembe kell venni, hogy<br />
benignus légzőrendszeri betegségekben és más malignus<br />
daganatokban is emelkedett vérszinteket találhatunk<br />
(urológiai, nőgyógyászati, emésztőrendszeri<br />
daganatok).<br />
TPA<br />
Szöveti polipeptid-antigén. Keringő fehérjekomplexek,<br />
amelyeket a citoszkeleton 8-as, 18-as és 19-es<br />
citokeratin komponensének degradációs termékei alkotnak.<br />
A citokeratinok minden hámsejtben megtalálhatók,<br />
így a hámsejt eredetű tumorokban is (tüdő,<br />
emlő, bél, hólyag).<br />
A fokozott sejtproliferáció jelzője, univerzális tumorasszociált<br />
antigénnek tekinthető. Felezési ideje<br />
egy nap, ebből következően gyorsan és érzékenyen<br />
jelzi a tumoros folyamatok változását.<br />
β 2<br />
-mikroglobulin<br />
Az MHC I. osztályú hisztokompatibilitási antigén<br />
része, minden magvas sejt felszínén megtalálható.
Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban<br />
325<br />
Myeloma malignum esetében a kóros plazmasejtklónból<br />
fokozott mértékben kerül a keringésbe részben<br />
a sejtek elhalása, részben aktív szekréció által, így<br />
a betegség aktivitását tükrözi. Kis molekulatömegű,<br />
ezért a vese filtrálja, de ép veseműködésnél a tubulusokból<br />
reabszorbeálódik.<br />
Tireoglobulin (Tg)<br />
660 kDa tömegű fehérje, a pajzsmirigy sejtjei termelik,<br />
részt vesz a tirozin jodinálásában és a kész<br />
pajzsmirigyhormonok tárolásában. Vérszintje a működő<br />
pajzsmirigyszövet mennyiségével arányos, ezért<br />
tumor miatti pajzsmirigy-eltávolítás után – amennyiben<br />
a műtét sikeres volt – szérumkoncentrációjának a<br />
kimutatási határ alá kell csökkennie. Mindezek alapján<br />
a Tg-t tumormarkernek is tekintjük.<br />
Ferritin<br />
A ferritin óriásmolekula, alapvető funkciója a felszívódott<br />
vas tárolása és leadása a szervezet vasszükségleteinek<br />
megfelelően. Elsősorban a májban és a<br />
bélhámsejtekben termelődik, vérszintje a vasraktárak<br />
telítettségét tükrözi. Emelkedett ferritinszintet találtak<br />
emlő-, máj-, vese- és néhány hematológiai malignitás<br />
esetében, a vasstátustól függetlenül. Feltételezhető,<br />
hogy a tumoros sejtek fokozott szétesése vagy<br />
aktív ferritinszekréciója miatt emelkedik a ferritinkoncentráció<br />
a vérben, de nem kizárt a daganatos betegséget<br />
kísérő gyulladásos válaszreakció sem (akut<br />
fázis fehérje). Mindent együttvéve a ferritin az egyik<br />
legkevésbé specifikus tumormarkernek tekinthető.<br />
Timidin-kináz<br />
Két izoformája fordul elő, az 1-es és a 2-es. Katalizálják<br />
a timidin foszforilálódását. A TK1 citoplazmatikus<br />
lokalizációjú és aktivitása a sejtciklust követi,<br />
ezért szérumkoncentrációja arányos a sejtproliferáció<br />
mértékével. E sajátságának köszönhetően tumormarkerként<br />
is alkalmazható különböző lymphomákban<br />
és leukaemiákban, ill. szolíd tumorokban is (kissejtes<br />
tüdő-, prostata-, emlő-, colorectalis carcinoma, laphámsejtes<br />
fej-nyaki rákok) önállóan vagy más markerekkel<br />
kombinálva.<br />
S100 protein<br />
Kalciumkötő, kisméretű fehérjecsalád, számos<br />
sejtfunkció szabályozásában vesz részt. a- és b-alegységek<br />
különböző kombinációiban fordul elő, eredetileg<br />
az agyban mutatták ki, vérszintje egészségesekben<br />
alacsony, de agysérülések, idegsebészeti beavatkozások,<br />
agyi hypoxia következtében megemelkedik. Az<br />
a-b alegységgel jellemezhető proteint a melanomasejtek<br />
is szintetizálják, így az a melanoma malignum<br />
tumormarkerének is tekinthető. Sajnos kezdeti stádiumban<br />
a vizsgálat nem mutat kellő szenzitivitást, a<br />
progresszióval azonban klinikai jelentősége nő. Meghatározható<br />
külön az S100B protein is, a b-alegység<br />
ellen termeltetett antitest segítségével.<br />
HE4, humán epididymisprotein-4<br />
Az ovarium hám eredetű, serosus malignus tumoraiban<br />
szekretált glikoprotein, amelynek expressziója<br />
a transzformált sejtekben megnő. Benignus folyamatokban<br />
és cystákban vérszintje nem vagy alig emelkedik,<br />
ezért érzékenyebb markernek tekinthető a Ca<br />
125-nél. A legjobb eredmény akkor várható, ha a két<br />
marker meghatározását együttesen használjuk a betegek<br />
követésekor.<br />
A neuroendokrin rendszer fehérje markerei<br />
Lásd A fehérjék, mint neuroendokrin hormonok a<br />
klinikai laboratóriumi kutatásokban című fejezetben.<br />
Tumormarkerek használata az orvosi<br />
gyakorlatban<br />
Szűrés<br />
A legtöbb marker specificitása és szenzitivitása túl<br />
alacsony ahhoz, hogy a daganatos betegséget korai<br />
stádiumban jelezze. Ezért a tumormarkerméréseket<br />
szűrésre nem alkalmazzuk, néhány kivételtől eltekintve.<br />
A kalcitoninmeghatározást akkor végezzük ilyen<br />
célból, ha a beteg családjában már volt medullaris<br />
carcinoma betegség, mert családi halmozódás előfordulhat.<br />
A kalcitoninmérés érzékenysége és fajlagossága<br />
ilyen esetben megközelíti a 100%-ot.<br />
A tPSA-meghatározást általában 50 éves életkor<br />
felett széles körben alkalmazzák szűrésre. A felső küszöbértéket<br />
(nálunk ez általában 4,0 ng/ml) meghaladó<br />
eredmény esetében az fPSA-mérést is elvégezzük.<br />
A módszer szenzitivitása és specificitása meghaladja<br />
a 90%-ot, jóllehet rengeteg tanulmány foglalkozik a<br />
PSA-teszt klinikai eredményességével, és sokan megkérdőjelezik<br />
annak hatékonyságát.<br />
Egy biztos: sohase feledjük, hogy a tumormarkerméréseket<br />
ki kell egészíteni más vizsgálóeljárásokkal<br />
(pl. fizikális, képalkotó, szükség esetén biopszia).
326 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Diagnózis felállítása<br />
Tumormarker-eredmény alapján sohasem szabad<br />
definitív diagnózist megállapítani. Ennek oka nem<br />
csak a markerek eddig felsorolt biológiai korlátja, hanem<br />
jónéhány analitikai interferenciával és következetes<br />
hamis eredménnyel is számolhatunk. A betegek<br />
egy részében a rheumafaktor titere magas lehet, vagy<br />
rendelkeznek heterofil állati immunglobulin-ellenes<br />
antitestekkel. Sok betegben autoimmun folyamat<br />
eredményeként magas az anti-Tg autoantitest menynyisége<br />
a vérben. Ilyenkor az endogén antitestek a<br />
tumormarker-meghatározás során alkalmazott immunoassay-kben<br />
interferálhatnak a módszerrel és<br />
hamisan alacsony vagy magas értéket eredményezhetnek.<br />
A tumormarkermérések valójában inkább<br />
megerősítő jellegűek, jóllehet elsősorban a neuroendokrin<br />
rendszer daganataiban az első, tumort valószínűsítő<br />
észlelet gyakran a nagy biológiai hatást kifejtő<br />
hormon szintváltozásának kimutatása. Azonban<br />
itt is egyéb megerősítő vizsgálatokat kell végezni. A<br />
helyzetet nehezíti, hogy a neuroendokrin tumorok általában<br />
igen kis méretűek és kimutatásuk képalkotó<br />
eljárásokkal nehéz.<br />
A betegség és a terápia követése (monitorozás)<br />
A tumormarkermérések klinikailag legjobban alátámasztott<br />
területe a monitorozás. Ennek legfőbb<br />
oka, hogy a markerek vérszintje és a tumorsejttömeg<br />
viszonylag jó korrelációt mutat egymással. A követéses<br />
vizsgálat legfontosabb szempontjai:<br />
• Mindig legyen kiindulási, a terápia megkezdése<br />
előtti markerszint az összehasonlíthatóság érdekében.<br />
• Annyiféle markert monitorozzunk, amennyi<br />
biológiailag és technikailag lehetséges, a markerkombinációk<br />
több esetben lényegesen emelik<br />
a szenzitivitást.<br />
• A monitorozás gyakoriságát általában nem a<br />
marker féléletideje határozza meg, hanem a<br />
betegség súlyossága és az alkalmazott terápia<br />
intenzitása.<br />
• A markereket mindig ugyanabban a laboratóriumban<br />
és ugyanazzal a módszerrel monitorozzuk,<br />
mert az eredmények sokszor készülék- és<br />
módszerfüggők.<br />
• Eredményes terápia során átmeneti markerkoncentráció-növekedés<br />
is lehet a fokozott sejtpusztulás<br />
következtében.<br />
• A követés során, amennyiben konzekvens markerszint-emelkedést<br />
észlelünk (akár a referenciatartományon<br />
belül), a relapszus lehetősége<br />
fennáll<br />
Prediktív érték<br />
A követéses vizsgálatoknál a tumormarker-vizsgálatoknak<br />
mind a negatív, mind a pozitív prediktív<br />
(jósló) értéke jónak mondható, azonban függ az adott<br />
marker diagnosztikai érzékenységétől és specificitásától.<br />
Az 11-74. ábrán egy metasztatikus emlődaganatban<br />
szenvedő nő CA 15-3 és CEA értékeinek követését<br />
látjuk.<br />
A referenciatartományon belüli növekedés jelzi<br />
a relapszust, a terápia során átmeneti markerszint-emelkedés<br />
látható. A terápia kezdeti sikerét a<br />
markerkoncentráció csökkenése jelzi, majd az újabb<br />
relapszust a meredek emelkedés. A nagy markerkoncentrációk<br />
a betegség kedvezőtlen prognózisát jelzik<br />
(pozitív prediktív érték).<br />
A tumoros állapotra jellemző peptid-fehérje spektrum<br />
kutatása az elválasztási módszerek és a tömegspektrometria<br />
fejlődésével egyre inkább előtérbe<br />
kerül. Különösen az albuminnál kisebb méretű, gyakran<br />
a fehérjék degradációja során kialakult peptidek<br />
mutatnak az egészséges egyénekétől eltérő mintázatot.<br />
Erről az ígéretes módszerről a tömegspektrometriát<br />
tárgyaló fejezetekben olvashatnak.<br />
11-74. ábra. Emlőtumoros beteg követése
Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban<br />
327<br />
Irodalom<br />
Koprowski, H., Herlyn, M., Steplewski, Z. et al.: Specific<br />
antigen in serum of patients with colon carcinoma.<br />
Science 212(4490):53-55, 1981.<br />
Ugorski, M., Laskowska, A.: Sialyl Lewis a: a tumor-associated<br />
carbohydrate antigen involved in adhesion and<br />
metastatic potential of cancer cells. Acta Biochimica<br />
Polonia 49(2): 303–311, 2002.<br />
Perkins, G. L., Slater, E. D., Sanders, G. K. et al.: Serum<br />
tumor markers. Am. Fam. Physician 68:1075-1082,<br />
2003.<br />
Diamandis, E. P., Fritsche, H. A., Lilja, H. et al. (eds):<br />
Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology,<br />
and Clinical Applications. AACC Press, 2002.<br />
Hanausek, M., Walaszek, Z. (eds.): Tumor marker protocols.<br />
Humana Press, 2010.<br />
https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.<br />
php?products_id=12676<br />
http://tlc.istep.org.tw/ntu/Stream/nano/sec11/%E5-<br />
%A5%88%E7%B1%B3%E7%94%9F%E7%89%A9-<br />
%E6%8A%80%E8%A1%93_3.pdf
328 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Cardialis markerek<br />
laboratóriumi diagnosztikája<br />
és információs értéke<br />
a klinikumban<br />
Ludány Andrea, Kőszegi Tamás<br />
Az akut myocardialis infarctus diagnózisa<br />
A cardialis laboratóriumi markerek szerepének megítélése<br />
egyre nagyobb hangsúlyt kap a mellkasi fájdalmak<br />
és az akut coronaria-szindrómára gyanús<br />
esetek diagnosztikájában, a rizikó (a veszélyeztetettség)<br />
megállapításában és a sikeres kezelésben. Nehéz<br />
a „klinikai diagnózis”, ha a betegség klinikai jelei<br />
hiányoznak, mint pl. az ún. tünetmentes akut coronaria-szindrómában.<br />
A legtöbb betegben a kezdeti<br />
EKG sem diagnosztikus értékű. Ez magyarázza, hogy<br />
a későbbiekben szívinfarctusnak nem bizonyult és<br />
osztályra felvett betegek nagy számával ellentétben, a<br />
fel nem ismert esetek száma ma is 1,5-2,0%-ra tehető<br />
a nemzetközi adatok szerint.<br />
A ma érvényes amerikai és európai kardiológiai<br />
útmutatóban (ACC és ESC) az akut myocardialis infarctust<br />
(AMI) egybehangzóan újradefiniálták. E szerint<br />
a szívmarkerek és főként a cardialis troponin az<br />
akut myocardialis infarctus új definíciójának középpontjába<br />
került.<br />
Az akut myocardialis infarctus diagnózisa most, az<br />
útmutató szerint a következő kritériumok egyikén<br />
alapul:<br />
1. A cardialis biomarkerek (lehetőleg a troponin)<br />
szintjének emelkedése, csökkenése vagy mindkettő;<br />
legalább egy értéknél a felső referenciahatárt<br />
meghaladóan, és a felsoroltak közül legalább egy, a<br />
myocardialis ischaemiára utaló nyilvánvaló jellel:<br />
• Ischaemiás tünetek.<br />
• Az EKG-n új patológiás Q-hullám.<br />
• Ischaemiás EKG-változások (új ST-T vagy új bal<br />
szárblokk).<br />
• Új nyilvánvaló változások a képalkotó vizsgálatnál.<br />
2. A percutan coronariabeavatkozás során az eredetileg<br />
normál troponin alapérték a referencia felső<br />
határérték több mint háromszorosára emelkedése.<br />
3. Hirtelen váratlan szívhalált megelőző típusos klinikai<br />
tünetekkel, EKG-jelekkel vagy a coronaria angiográfia/bonclelet<br />
friss thrombosis igazolásával.<br />
4. A myocardialis infarctus patológiai elváltozásai.<br />
Az eredeti WHO beosztástól az AMI új definíciója<br />
szignifikánsan különbözik. Azt a beteget, akinek<br />
emelkedett troponin értéke van negatív CK-MB<br />
mellett, korábban instabil anginaként diagnosztizálták<br />
(minor myocardialis károsodásként), ma mint<br />
non-ST-szegment emelkedést, myocardialis infarctusként<br />
diagnosztizálják (NSTEMI) még akkor is,<br />
ha hiányoznak az EKG diagnosztikus jelei. Az új<br />
standardok alkalmazása a myocardialis infarctus<br />
definíciójában jelentős előrelépést jelent a cardialis<br />
biomarkerek használatában. Gondoljunk például a<br />
sürgősségi betegellátásra akut coronaria-szindróma<br />
gyanúja esetén.<br />
Az instabil anginával és az AMI-val foglalkozó<br />
kórélettani tanulmányok közös patológiás utat állapítottak<br />
meg, amely az érfali plaque (felrakódás) akut<br />
felszakadásával kezdődik. A thromboticus események<br />
sorozata vezet végül a thrombus kialakulásához.<br />
Az infarctus vagy ischaemia ezt követő klinikai eseményei<br />
az elzáródás mértékétől és a kollaterális vérátáramlás<br />
(ha van egyáltalán) jelenlététől függnek.<br />
Kórélettani tényekre támaszkodva az akut coronaria<br />
szindróma kifejezést (ACS) ma egy egész klinikai<br />
spektrumra használjuk, mely a kezdődő anginától<br />
terjed az ST szegment emelkedéssel járó akut myocardialis<br />
infarctusig (STEMI).<br />
Az akut coronaria-szindróma jelenlegi cardialis<br />
markerei<br />
Cardialis troponinok<br />
A troponinok a vázizomban és a szívizomban található<br />
szabályozó proteinek. A három alegység, amelyet<br />
identifikáltak, troponin I-t (TnI), troponin T-t<br />
(TnT) és troponin C-t (TnC) tartalmaz. A troponin C<br />
(TnC) vázizom és cardialis izoformáit kódoló gének<br />
identikusak, úgy hogy nincs strukturális differencia<br />
közöttük. Ezzel szemben a troponin I és a troponin<br />
T szkeletális és cardialis alformái különböznek, és az<br />
immunanalitika eljárások különbséget tesznek közöttük.<br />
Ez a cardialis troponinok szívspecifikusságának<br />
különlegessége. A szkeletális TnI és TnT strukturáli-
Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban<br />
329<br />
san különböző. Nincs keresztreakció a szkeletális és<br />
cardialis TnI és TnT között egy adott tesztben (11-75.<br />
ábra).<br />
A cardialis troponinok release-kinetikájára irányuló<br />
korai tanulmányok azt jelezték, hogy ezek a sejtkomponensek<br />
nem tartoznak a cardialis nekrózis korai<br />
markereihez. A korai generációjú troponintesztek a<br />
szimptómák kezdetétől számított 4-8 órán belül szolgáltattak<br />
pozitív eredményeket, hasonló idő elteltével<br />
mint a CK-MB-kiáramlás. ámbár a troponin 7-10 napig<br />
is emelkedett maradt az AMI kezdete után.<br />
A cardialis troponinok kezdeti vizsgálataikor felfigyeltek<br />
egy olyan instabil anginás maradék betegcsoportra,<br />
akiknél a CK-MB normális, de troponinértékeik<br />
emelkedettek voltak. Ezeknél a betegeknél<br />
nagyobb arányban fordult elő szerencsétlen cardialis<br />
esemény (halál, AMI) a felvételt követő 30 napban és<br />
a kórtörténet nagyon hasonlított az NSTEMI-betegekére.<br />
Az emelkedett troponinérték alkalmas akut coronaria-szindrómás<br />
betegek rizikóbeosztására, és a magas<br />
rizikójú betegek olyan megjelölésére, mint akiknél<br />
nem kívánt kardiológiai esemény (halál, AMI)<br />
az elkövetkező 6 hónapban megtörténhet. Klinikai<br />
troponin- és CK-MB-tanulmányok megerősítik azt a<br />
megfigyelést, hogy bár az AMI diagnózisához mindkettő<br />
elég érzékeny és specifikus, de a CK-MB-nek<br />
sem prediktív, sem prognosztikus értéke nincsen.<br />
A cardialis troponinok érzékeny kardiospecifikus<br />
markerek és prognosztikus információkat nyújtanak<br />
az akut coronaria-szindrómás (ACS) betegekről,<br />
ezért ezeket az ajánlott cardialis markerként tartják<br />
számon.<br />
A fokozott (emelt) érzékenységű és pontosságú<br />
troponintesztek bevezetésével az AMI-betegek 80%-<br />
ában a sürgősségi osztályra érkezést követő 2-3 órán<br />
belül emelkedett troponinértékeket kapunk. Ez a korábbi<br />
troponintesztek esetében csak mintegy 8-10<br />
11-75. ábra. A troponinok organizációjának sematikus ábrázolása<br />
a) Aktin és miozin<br />
b) Miozinfej és -nyak<br />
c) Vékony filamentum<br />
d) Troponin I és troponin T
330 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
óra elteltével teljesült, és gyakran később emelkedett,<br />
mint a CK-MB-szint.<br />
Az új troponintesztek az ún. korán emelkedő biomarkereket<br />
– mint pl. a mioglobin vagy a CK-MB-izoformák<br />
– kezdik a klinikai használatból kiszorítani<br />
(11-76. ábra).<br />
2007-ben az Amerikai Kardiológiai Kollégium<br />
(ACC) egymást követő troponinméréseket ajánlott a<br />
nem típusos MI-betegek (NSTEMI) esetében a definitív<br />
diagnózishoz: a felvételt követő ún. alapérték és<br />
a 6-9 órás érték meghatározásával. Az AMI diagnózisához<br />
- a megállapított cut-off-érték fölött - csak<br />
egy emelkedett érték szükséges. A troponinértékek<br />
változása (emelkedése vagy süllyedése) szükséges a<br />
perzisztálóan magas troponinértékektől való elkülönítéshez<br />
(pl. vesebetegségeknél).<br />
11-76. ábra. A szérum szívmarkereinek időbeni követése<br />
akut myocardialis infarctusban (AMI-ban)<br />
Kreatin-kináz – MB-izoenzimek<br />
A cardialis troponinok bevezetése előtt az ajánlott<br />
biokémiai marker az AMI diagnózisához a<br />
CK-MB-izoenzim-aktivitás volt. Kritériumként az<br />
AMI megállapításához a következő volt az elfogadott:<br />
Két egymást követő emelkedés a diagnosztikus<br />
határérték (cut-off) felett, vagy egyetlen eredmény,<br />
amely magasabb, mint a felső referenciahatárérték<br />
kétszerese.<br />
Jóllehet a CK-MB jóval koncentráltabb a myocardiumban<br />
(mintegy 15%-a a total CK-nak), a vázizomban<br />
is jelen van. A CK-MB szívspecifikussága<br />
nem 100%. Hamis pozitív értékek fordulnak elő számos<br />
klinikai állapotban, beleértve a traumát, a fizikai<br />
megerőltetést és a myopathiákat.<br />
A CK-MB-release kinetikájának ismerete a klinikus<br />
számára fontos lehet. A CK-MB először 4-6 órával<br />
a tünetek kezdete után jelenik meg, a maximális<br />
szint 24 óránál jelentkezik, és 48-72 óra elteltével tér<br />
vissza a normális tartományba. Az AMI korai és késői<br />
(>72 óra) diagnózisában sajnos limitált a vizsgálat<br />
értéke. Kiáramlási kinetikája viszont igen hasznos<br />
lehet a reinfarctus felismerésében, az AMI-t követő<br />
csökkenés ilyenkor ismét emelkedő értékeket mutat.<br />
A thrombolyticus terápiánál megállapították, hogy<br />
bár a CK-MB érzékeny és specifikus vizsgálat, a váratlan<br />
és veszélyeztető cardialis események előrejelzésében<br />
nem hasznosul és nincs prognosztikus értéke.<br />
Nagyszámú akut coronaria-szindrómás (ACS)<br />
beteg vizsgálata során azt találták, hogy az izolált<br />
CK-MB-emelkedésnek limitált prognosztikus értéke<br />
van ST-elevációval nem járó esetekben.<br />
Relatív index, CK-MB és total CK<br />
A relatív indexet a CK-MB (tömeg, mass)/totál<br />
CK arányából számítják. Segíthet a klinikusnak a hamis<br />
pozitív CK-MB-értékek – amelyek a vázizomból<br />
származnak - elkülönítésében. Ha az arány kisebb<br />
mint 3, ez a vázizomeredet mellett szól. Ha az arány<br />
nagyobb mint 5, szíveredetre utal. A 3-5 arány a<br />
„szürke zóna”, határozott diagnózist nem enged meg<br />
anélkül, hogy ismételt időbeni vizsgálatokkal emelkedést<br />
detektálnának.<br />
A CK-MB/CK relatív indexet a CK-MB-emelkedés<br />
AMI infarctusspecifikusságának növelésére vezették<br />
be. Az érzékenysége viszont AMI-ban csökken, ha a<br />
cardialis és szkeletális izomkárosodás együtt van jelen.<br />
Ilyenkor pl. intenzív osztályokon a relatív inde-
Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban<br />
331<br />
xeken kívül az abszolút CK-MB-értéket is figyelembe<br />
szokták venni, ezáltal a specificitás kissé növelhető, az<br />
érzékenység egyidejű csökkenése mellett.<br />
Végül is megállapítható, hogy a relatív index használata<br />
csak akkor „működik”, ha vagy cardialis, vagy<br />
vázizom-károsodás áll fenn, de nem mindkettő. Fontos<br />
megjegyezni, hogy a relatív indexet egyedül nem<br />
használjuk az AMI diagnózisához, ugyanis emelkedett<br />
lehet akkor is, ha a total CK vagy a CK-MB normális<br />
tartományon belül van. Az index klinikailag<br />
csak akkor alkalmazható, ha mindkét érték emelkedett.<br />
Mioglobin<br />
A mioglobin felé azért fordult az érdeklődés, mert<br />
a myocardialis infarctus (MI) korai markereként tartják<br />
számon. Ismert hem protein, mind a vázizomban,<br />
mind a szívizomban megtalálható. Kis molekulatömege<br />
felel a gyors kiáramlási kinetikáért. A mioglobin<br />
az infarctus kezdetét 2-4 órával követően tipikusan<br />
emelkedik, a csúcsot 6-12 óra után éri el, és<br />
24-36 órában tér vissza a normális értékre.<br />
A rendelkezésre álló gyors mioglobin- (POCT-)<br />
tesztek nem szívspecifikusak. Egymást követő, 1-2<br />
óránként ismételt vizsgálatokkal némileg növelhető a<br />
szenzitivitás és a fajlagosság. Az emelkedés vagy 1-2<br />
óra elteltével 25-40%-os különbség egyértelműen sugallja<br />
az AMI-t. A legtöbb tanulmányban a mioglobin<br />
90% diagnosztikus szenzitivitást ér el AMI-ban.<br />
A mioglobin negatív prediktív értéke nem elég<br />
nagy az AMI diagnózisának kizárására. A mioglobint<br />
értékelő eredeti régebbi tanulmányok, az AMI-t<br />
(WHO definícióként) még a CK-MB-re standardizálták.<br />
Az ESC/ACC troponinra standardizált új<br />
AMI-definíció nál a mioglobintesztek diagnosztikus<br />
érzékenysége jelentősen csökkent. Ez szignifikánsan<br />
csökkentette alkalmazását is, és a legújabban kifejlesztett<br />
troponintesztek a mioglobinméréseket talán<br />
szükségtelenné teszik.<br />
Kreatin-kináz MB izoformjai<br />
A kreatin kináz MB-izoenzimnek 2 izoformja van:<br />
CK-MB1 és CK-MB2. A CK-MB laboratóriumi meghatározása<br />
a CK-MB1 és CK-MB2 izoformnak mindenkori<br />
összegét jelenti. A CK-MB2 a szöveti izoform,<br />
és AMI után ez áramlik ki a myocardiumból.<br />
A periférián a szérumban CK-MB1-gyé alakul át. A<br />
tünetek kezdetét követően ez gyorsan történik.<br />
A CK-MB-izoformokat nagyfeszültségű elektroforézissel<br />
lehet vizsgálni. Gyors leletmegfordulási<br />
idővel (turnaround time, TAT) bíró automata analizátorok<br />
is rendelkezésre állnak a mérésre. Számolják<br />
a CK-MB2/CK-MB1 hányadosát. Normálisan a<br />
CK-MB1 van túlsúlyban, ezért az arány jellemzően<br />
kisebb mint 1. Az eredmény pozitív, ha a CK-MB2<br />
emelkedett és az arány több mint 1,7.<br />
A CK-MB-izoformok kiáramlási sebessége nagy. A<br />
CK-MB2 a szérumban 2-4 órával a kezdet után detektálható,<br />
és a csúcsok 6-9 óra között jelentkeznek.<br />
Ez az AMI-nak egyik korai markere. Használatát két<br />
nagyobb tanulmányban értékelve az érzékenységét 6<br />
órával a tünetek kezdetét követően 92%-nak találták,<br />
szemben a CK-MB 66% és a mioglobin 79% értékével.<br />
A hátránya ennek a módszernek, hogy kivitelezése<br />
személy- és időfüggő.<br />
Mi a legjobb markerstratégia?<br />
Minden egyes cardialis marker kiszabadulási kinetikájának<br />
megismerése a szimptómák kezdete óta<br />
eltelt idő jelentőségét hangsúlyozza. Az amerikai és<br />
az európai kardiológusok (ACC/ESC) által elfogadott<br />
útmutató az AMI diagnózisában a cardialis troponint<br />
tartja egyértelműen a legjobb markernek.<br />
Az újabb cardialis troponintesztek bevezetése (nagyobb<br />
érzékenységük és kisebb cut-off-értékük miatt)<br />
a hagyományos korai markereket - mint a mioglobin<br />
és a CK-MB-izoformok – kiszorítja a használatból.<br />
A sürgősségi ellátásban az amerikai orvosok legjobb<br />
cardialis markerstratégiaként olyan 3 szintű<br />
B-változatot ajánlanak, amely ki tudja zárni az<br />
ST-emelkedés nélküli myocardialis infarctust (NSTE-<br />
MI) a sürgősségi osztályokon fekvő betegeknél:<br />
• Egyetlen(?) negatív CK-MB, troponin I vagy<br />
troponin T a tüneteket követő 8-12 órában.<br />
• Negatív mioglobin párosítva negatív CK-MBmass<br />
méréssel, vagy negatív troponinmérési<br />
eredmény a felvételkor és 90 perc múlva, ha a<br />
beteg a tünetek kezdete óta 8 órán belül van.<br />
• Negatív 2 órás CK-MB d-érték együtt negatív 2<br />
órás troponin I d-értékkel, ha a beteg a tünetek<br />
kezdete óta 8 órán belül van.<br />
Megjegyzésünk erre az ajánlatra:<br />
Természetesen ez az ajánlat számos buktatót rejthet<br />
magában, különösen az említett „egyetlen” troponinmeghatározás<br />
mint kritérium a viszonylag korai
332 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
időperiódusban. A szimptómák megjelenését követően<br />
több mint 24 óra elteltével ajánlatosak inkább a<br />
troponinmeghatározással a betegeket megítélni.<br />
Az ajánlott ún.” d”-mérések természetesen igénylik<br />
az adott tesztek variációs koefficienseinek az ismeretét<br />
is, és nem szabad azt sem elfelejteni az értékelésnél,<br />
hogy a referenciatartomány felső határ (cut-off)<br />
értékétől is függ a mérés pontossága adott tartományban.<br />
További instrukciók<br />
Folytatva az ajánlott instrukciókat, a laktát-dehidrogenáz<br />
végkép kihagyandó a marker stratégiából. A<br />
rendelkezésünkre álló cardialis markerekkel ismételt<br />
mintanyerésből kinetikát nyerhetünk. A minta nyerés<br />
ajánlott időpontjai a markertől függnek. A korai diagnózis<br />
fontossága esetén a 3-4 órás mintavétel, míg<br />
más esetekben a 6-9 órás mintavétel vezet célra.<br />
Mikor tekinthetnek el a kardiológusok a cardialis<br />
marker eredmények ismeretétől? Ha a betegnek típusos<br />
ischaemiás mellkasi fájdalma van diagnosztikus<br />
EKG eltéréssel (ST eleváció), a beteg azonnali trombolitikus<br />
terápiának vagy érplasztikának a várományosa.<br />
A terápiás beavatkozás ilyenkor nem várhat<br />
a cardialis markerek eredményeire, annál is inkább,<br />
mert a szimptómák kezdete óta eltelt igen rövid idő<br />
(6 órán belül) miatt a teszt alacsony detektálási érzékenysége<br />
várható. Ilyenkor a re-perfúziós terápia<br />
azonnal elvégzendő (11-77. ábra).<br />
11-77. ábra. Cardialis markerek követése a reperfúziós terápia<br />
sikerének megítélésében (STEMI: ST-elevációval járó<br />
myocardialis infarctus)<br />
A cardialis markerek szerepe az akut<br />
coronaria-szindróma terápiás döntéseiben<br />
Fejezetünkben azt hangsúlyoztuk, hogy a cardialis<br />
markerek döntőek mind diagnosztikus, mind prognosztikai<br />
szempontból. Klinikai vizsgálatok alapján<br />
napjainkban kezdik felvetni azt a kérdést, hogy<br />
mint indikátorok használhatóak-e az akut coronaria-szindróma<br />
specifikus terápiás beavatkozásaihoz.<br />
Jelenleg a terápiás stratégiák akut coronaria-szindrómában<br />
elsődlegesen csak a klinikai indikációkra szorítkoznak<br />
(pl. ischaemiás mellkasi fájdalom) vagy az<br />
EKG változásokra (pl. ST-eleváció vagy -depresszió).<br />
Nincs érvényes terápiás algoritmus olyan esetekre,<br />
amelyek klinikai és EKG-jelek hiányában izolált pozitív<br />
markereredményeken alapulnak.<br />
Az ilyen kiemelt esetek klinikai vizsgálatai megerősítették,<br />
hogy a pozitív troponineredmény egyedüliként<br />
független indikátora a magas rizikónak. Ezért az<br />
alacsony molekulatömegű heparin terápia (LMWH)<br />
és/vagy a thrombocytaaggregáció-gátlók (GIIB/IIIA<br />
inhibitorok) alkalmazása indokoltnak látszott és a<br />
legelőnyösebbnek, legeredményesebbnek bizonyult<br />
az ilyen betegeknél, akiknél az emelkedett cardialis<br />
troponin magas rizikót jelzett.<br />
Laboratóriumi medicina és a troponinok<br />
A technológia fejlődése jelentősen megváltoztatta a<br />
cardialis troponinok klinikai laboratóriumi vizsgálatait.<br />
A harmadik generációs tesztek bevezetésével a<br />
kimutatási határérték egy századára csökkent a troponin<br />
T-nél (1 ng/ml-ről 0,01 ng/ml-re). A teszteknél<br />
a keresztreakció a vázizom eredetű troponinnal<br />
elhanyagolható. Más részről a point-of-care (POCT-)<br />
tesztek bevezetésével a leletmegfordulási idő a teljes<br />
vér analíziseknél jelentősen felgyorsult.<br />
A gyorstesztek (POCT)<br />
A szívmarkerek vizsgálatát a nap 24 órájában, a hét<br />
minden napján és 1 órán belül kell elvégezni (NACB<br />
ajánlás). A POCT olyan betegágy melletti eljárás,<br />
amely gyors eredményeket kínál minden olyan esetben,<br />
amikor a kórházi laboratórium nem tudja teljesíteni<br />
az előbbieket.<br />
POCT-vizsgálatokra gyártott tesztek a CK-MB-re,<br />
a mioglobinra és a cardialis troponinokra (TnI és
Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban<br />
333<br />
TnT) egyaránt elérhetők kereskedelmi forgalomban.<br />
A TnT-nél viszont csak kvalitatív POC-teszt kapható,<br />
de TnI/POC tesztet mind mennyiségi, mind minőségi<br />
vizsgálatra forgalmaznak. Használatuk sürgősségi<br />
osztályokon különösen indokolt.<br />
A troponinok döntési határértékei<br />
Az értékeléshez néhány laboratóriumi alapfogalommal<br />
kell tisztában lennünk. Egy adott módszer<br />
kimutatási határértéke az a legalacsonyabb szint,<br />
amelyet a módszer jelezni képes, noha ennél a pontnál<br />
a mérés pontossága nem megfelelő. A 99 percentil<br />
a felső referenciahatár, a vizsgálat normális tartományának<br />
felső határát jelenti, és feltételezetten még<br />
normális, egészséges populációból származik. Azaz<br />
az egészséges felnőtt populáció 99%-ának értékei e<br />
határérték alatt vannak. A cut-off alatt az értékek feltehetőleg<br />
„normálok”, bár végül is a cut-off-érték a<br />
mindenkori módszer érzékenységétől függ.<br />
Itt szükséges megjegyezni, hogy a döntési küszöbérték<br />
(cut-off) változtatásával egy teszt szenzitivitása<br />
és specificitása ellentételesen változik.<br />
A jelenleg is használt módszerek értékelését óvatosan<br />
kell kezelni. Az aktuálisan a teszthez mellékelt<br />
referenciatartomány ugyanis egy heterogén betegpopulációra<br />
vonatkozhat – azaz a „valódi” normális<br />
csoporton kívül olyan egyének kis értékeit is tartalmazhatja,<br />
akik a magas rizikójú betegcsoportba tartoznak.<br />
Ez azt is jelenti, hogy a valódi normális populációhoz<br />
tartozó 99 percentiles cut-off-értékeknek<br />
valójában lényegesen (akár 10-50-szer) alacsonyabbnak<br />
kell lenniük a jelenleg megadottaknál. Vagyis általánosságban<br />
sürgetővé vált az ultraszenzitív troponinmérő<br />
módszerek kifejlesztése. Az ultraszenzitív<br />
troponintesztekhez végül is alacsonyabb cut-off-érték<br />
tartozik, ami a teszt diagnosztikus értékét növeli.<br />
A variációs koefficiens (CV, vagy relatív standard<br />
deviáció) egy teszt eredményeinek változását (ingadozását,<br />
reprodukálhatóságát) fejezi ki. Akkor kapjuk,<br />
ha ugyanazt a mintát ismételten analizáljuk, és az átlagtól<br />
való eltérést százalékban fejezzük ki. Általában<br />
a CV-érték emelkedik, ha a mérési eredmény kicsi.<br />
A legalacsonyabb szintnél olyan magas a CV, amely<br />
jelzi ebben a tartományban a mérés pontatlanságát.<br />
Egy 10%-os CV még elfogadható, de akkor ideális,<br />
ha kisebb mint 10% a 99 percentil cut-off-szintnél. A<br />
jelenlegi troponinmérési módszerek legtöbbjénél ez<br />
nem teljesül.<br />
A forgalomban kapható tesztek érzékenysége, fajlagossága<br />
és pontossága igen különböző. Ez visszavezethető<br />
a standardizáció hiányára, a különböző<br />
monoklonális antitestekre, a detektálandó TnI- és<br />
TnT-molekulák patológiás módosulataira, az ellenanyagok<br />
keresztreakcióira, amelyek a detektálható<br />
TnI-molekulák degradációiból erednek. Általában az<br />
immunkémiai analitikai technikák lumineszcens kimutatási<br />
elven alapulnak.<br />
A TnT-módszert egyetlen előállító szabadalmaztatta,<br />
így a különbségek ennél a tesztnél elhanyagolhatóak.<br />
Mind a 99 percentiles cut-off-érték, mind a<br />
10% CV a troponin T-tesztekre megállapított. Ezzel<br />
szemben akár 20-szoros különbségek fordulhatnak<br />
elő a kereskedelmi forgalomban jelenleg kapható<br />
nagyszámú TnI-teszt eredményei között, a saját 99<br />
percentil cut-off-értékük magasságában és 10% CV<br />
mellett. Ezzel a problémával extrém esetben akkor<br />
találkozik a klinikus, ha a kevésbé érzékeny gyors<br />
(POCT) TnI-tesztet követően a mintát újravizsgálják<br />
egy érzékenyített TnT-módszerrel a központi laboratóriumban.<br />
Összefoglalva mind a sürgősségi orvosnak, mind<br />
a laboratóriumnak ismerni kell a rendelkezésre álló<br />
troponintesztek cut-off-értékeit a 99 percentil referenciahatárnál<br />
és az ehhez tartozó CV-értékeknél.<br />
Emlékeztetni kell arra az ACC/ESC által kidolgozott<br />
megegyezéses definícióra, amely a következő: bármely<br />
emelkedése a mért troponinnak10% CV vagy a<br />
99 percentil referenciahatár fölött megfelelő klinikai<br />
állapotban myocardialis infarctusnak tartandó.<br />
Cardialis markerek krónikus<br />
vesebetegségben és nem ischaemiás<br />
szívbetegségben<br />
Krónikus vesebetegek<br />
Hemodializált krónikus vesebetegek halálának<br />
50%-ban cardiovascularis betegség az oka. Ezeknek<br />
a betegeknek fokozott a rizikója coronaria-artériás<br />
betegségre vagy akut coronaria-szindrómára. A rizikó<br />
megítélésére cardialis markereket használtak.<br />
Már korábbi tanulmányok is bizonyították, hogy<br />
ezeknél a hemodializált vesebetegeknél az emelkedett<br />
cardialis troponin nagy gyakorisággal jelentkezik.<br />
A TnT-pozitív eredmények igen nagy (30-70%)<br />
előfordulásáról számoltak be cardialisan tünetmen-
334 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
tes vesebetegeknél. Az emelkedett troponin I előfordulása<br />
ugyanakkor kisebb volt. A CK-MB-emelkedés<br />
okilag közvetlen összefüggésben van a<br />
vese-clearance értékkel.<br />
Biokémiai tanulmányok azt mutatják, hogy a troponinszint-emelkedés<br />
a myocardiumból származik<br />
(így ez nem hamis pozitívitás), és nincs összefüggésben<br />
a vesebetegséggel kapcsolt myopathiával. A<br />
legújabb adatok azt sugallják, hogy a tünetmentes<br />
betegeknél az emelkedett troponinok szubklinikai<br />
microinfarctusokra utalhatnak, ami klinikailag különbözik<br />
az akut coronaria-szindrómától. A krónikus<br />
vesebetegnek gyakran van pangásos szívbetegsége és<br />
magas vérnyomása, ami függetlenül emelheti a troponinértéket.<br />
Az emelkedett troponinérték klinikai szignifikanciája<br />
vitatott. A legalaposabb tanulmányok megerősítették,<br />
hogy a TnT-emelkedés és a cardialis mortalitás<br />
között összefüggés van. Veseelégtelenség és emelkedett<br />
TnT együtt a legnagyobb globális rizikó a mortalitásra<br />
vagy az AMI-ra.<br />
A dialízis nincs befolyással a troponinértékekre.<br />
A CK-MB-molekula dialízálható, ezért a vesepótló<br />
kezelést követően a szérumban/plazmában csökken<br />
a szintje. Az emelkedett troponin megítélése ezért a<br />
krónikus vesebetegeknél nem egyszerű. Mérsékelten<br />
magas rizikójú betegeken végzett sorozatos troponinmérések<br />
– keresve a troponinértékek emelkedését<br />
- szükségesek az AMI felismerésére. Ugyanakkor a<br />
csekély rizikójú, egyébként is tünetmentes páciensek<br />
esetében a klinikus az emelkedett troponinszintet hamis<br />
pozitivitásként értékeli.<br />
Troponinok nem ischaemiás szívbetegségekben<br />
A különböző fokú myocardialis károsodásnak klinikailag<br />
fokozott morbiditás és mortalitás a következménye.<br />
Az emelkedett troponinérték olyankor is<br />
érzékeny markere a rejtett myocardialis károsodásnak<br />
vagy nekrózisnak, ha a klinikai állapot nem ischaemia<br />
következménye. Ischaemia nélküli pangásos<br />
szívbetegségekben vagy bal kamrai funkciózavarokban<br />
a TnT-szintnek rizikót jelző, prognosztikailag<br />
értékelhető jelentéstartalma van. Különböző klinikai<br />
állapotok, mint subarachnoidalis vérzés, pulmonalis<br />
embolia, akut pulmonalis hypertensiót követő jobb<br />
kamrai feszülés emelkedett troponinszinttel járnak.<br />
Az itt következő felsorolásban olyan állapotok vagy<br />
betegségek szerepelnek, amelyek közvetlenül nincsenek<br />
összefüggésben atheroscleroticus koszorúér-betegségekkel:<br />
• Beültetett pacemaker.<br />
• Szapora és nem ritmusos szívműködés.<br />
• Magas vérnyomás.<br />
• Szívizomgyulladás.<br />
• A szívizom zúzódása.<br />
• Heveny és krónikus pangásos szívbetegség.<br />
• Szívműtét.<br />
• Vesebetegség.<br />
• Tüdőembolia.<br />
• Subarachnoidalis vérzés.<br />
• Sepsis.<br />
• Csökkent pajzsmirigyműködés.<br />
• Shock.<br />
Sürgősségi cardialis markerek<br />
A laboratóriumi medicinában igen sok cardialis markert<br />
vizsgáltak idáig és vizsgálnak napjainkban is folyamatosan.<br />
Keresik azt az ideális paramétert, amely pl.<br />
az akut coronaria-szindrómára 100%-ban érzékeny és<br />
100%-ban specifikus. Újabban felismert markerek:<br />
Natriuretikus peptidek<br />
A cardiovascularis rendszert idegi hormonális mechanizmusok<br />
befolyásolják. A sympathicus rendszer<br />
aktiválásával a katekolaminok révén, a renin-angiotenzin-aldoszteron<br />
rendszer (RAAS) aktiválásával,<br />
a vazopresszin aktiválással (ADH-hatásra vízvisszatartás)<br />
és a natriuretikus peptidek felszabadulásával.<br />
Máig megkülönböztethetjük a következő natriuretikus<br />
peptideket:<br />
• ANP (A típusú natriuretikus peptid; korábban<br />
mint A: atrialis, vagyis pitvari natriuretikus<br />
peptidet jelölték).<br />
• BNP (B típusú natriuretikus peptid; korábban<br />
mint B: brain jelölték, a kamrából származik).<br />
• CNP (C típusú natriuretikus peptid; az érfali<br />
endothelsejtekből származik).<br />
A natriuretikus peptidek elnyomják a renin-angiotenzin-aldoszteron<br />
rendszert: csökken a perifériás érellenállás,<br />
megnő a nátriumürítés és a vízkiválasztás a<br />
vesén keresztül.<br />
Noha a CNP nem natriuretikus, hanem csak értágító<br />
hatással rendelkezik, kémiai hasonlósága miatt
Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban<br />
335<br />
sorolják az ANP-vel és a BNP-vel azonos csoportba.<br />
A natriuretikus peptidek nem folyamatosan termelődnek<br />
és tárolódnak az izomsejtekben, hanem a tágulás<br />
és a nyíróerő hatására géntranszkripció aktiválása<br />
révén képződnek.<br />
A BNP (B típusú natriuretikus peptid), mint említettük,<br />
a kamrai szívizomból - a kamrafal feszülésére<br />
(nyomás- és térfogat-növekedéskor) válaszként – kerül<br />
a véráramba. A klinikai laboratóriumokban automatizált<br />
immunmódszerekkel határozzák meg az<br />
NTproBNP-t (az elnevezés a hormon N-terminális<br />
hasítási termékére utal). Lehetőség van az aktív BNP<br />
hormon mérésére is. Mindkét meghatározás nagyon<br />
költséges.<br />
A BNP fontosnak tűnik a klinikusok számára. Eddigi<br />
ismereteink szerint a BNP alacsony értékének<br />
igen nagy a negatív prediktív értéke a kamrai diastolés<br />
nyomásfokozódás megítélésében. Ezért a differenciáldiagnosztikában<br />
is fontos szerepe van. Az akut<br />
coronaria-szindrómás betegek rizikójának megállapításához<br />
is használatos. Számos vizsgálati adat utal a<br />
BNP akut coronaria-szindrómát (ACS) jósló indikátor<br />
szerepére. Továbbá nem csak az ACS, hanem fenyegető<br />
váratlan cardialis események, akár a szívhalál<br />
előrejelzője is lehet, különösen ha a troponinérték is<br />
emelkedik.<br />
C-reaktív protein<br />
A C-reaktív protein mint nem specifikus gyulladásos<br />
marker közvetlenül részt vesz a scleroticus érfali lerakódás<br />
(plaque) kialakulásában. Rendkívül kiterjedt<br />
klinikai tanulmányok igazolták már a kilencvenes évek<br />
elejétől, hogy a kardiológiai betegek gondozásában, a<br />
megelőzésben az emelkedett CRP-értékek előre jelzik<br />
a jövőben veszélyeztető cardialis eseményeket. Ezért<br />
használják a betegek cardialis rizikóprofiljának a kialakításában.<br />
A független „prediktorok” (jósló, előrejelző<br />
paraméterek) csoportjába tartozik. A TnI-vel és<br />
a BNP-vel együtt használatos, de nem specifikus természete<br />
miatt diagnosztikus markerként korlátozott<br />
az értéke. A klinikai laboratóriumokban az újabban<br />
bevezetett nagy érzékenységű automatizált módszert<br />
(High-Sensitive CRP, HS CRP) alkalmazzák mérésére,<br />
csökkent cut-off-érték mellett.<br />
Mieloperoxidáz<br />
A mieloperoxidáz (MPO) leukocytaenzim, reaktív<br />
oxigéneket hoz létre, amelyek prothromboticus<br />
lipidoxidációs termékekkel, plaque-instabilitással,<br />
plaque-képződéssel és nitrogén-monoxid (NO) csökkenéséből<br />
fakadó érösszehúzódással vannak kapcsolatban.<br />
Szignifikánsan emelkedett MPO-értékeket találtak<br />
angiográfiával igazolt koszorúér-betegségben. Használják<br />
továbbá cardiovascularis rizikót jelző független<br />
prediktorként is sürgősségi osztályokon, mellkasi<br />
fájdalmak esetén. Negatív troponin T „baseline”-érték<br />
mellett akár korai markerként is jelentkezhet, a<br />
tünetek fellépte után 2 órán belül. A teszt korai markerkénti<br />
használata a plaque-ok sérülékenységét jelző<br />
képességén alapszik. További MPO-ra irányuló<br />
tanulmányok szükségesek a mellkasi fájdalommal,<br />
sürgősséggel felvett betegpopulációnál: még meghatározásra<br />
vár a vizsgálat szenzitivitása, specificitása,<br />
pozitív, valamint negatív prediktív értéke.<br />
Ischaemia által módosult albumin<br />
A jelenlegi cardialis markerek - beleértve a troponint<br />
és a CK-MB-t - érzékenyek a szívizomnekrózis<br />
kimutatásában. A sejthalál jelzői, amely az AMI-ban<br />
jön létre. A legtöbb akut coronaria-szindrómás betegnél<br />
viszont a myocardialis ischaemia infarctus nélkül<br />
zajlik le. Azok a szívmarkerek viszont, amelyek<br />
képesek jelezni az ischaemiát, értékes kiegészítői lehetnének<br />
a diagnosztikus eljárásnak.<br />
Az ischaemia ilyen új markere lehetne, az ischaemia<br />
okozta módosult albumin (IMA). Akkor keletkezik,<br />
ha a keringő szérum albumin közvetlen kontaktusba<br />
kerül az ischaemiás szívizommal. Az IMA mérése<br />
az albumin kobalt-kötésén (ACB) alapszik, ugyanis a<br />
módosult forma nem képes kötni a kobalt(II)iont. Egy<br />
30 perces leletmegfordulási (TAT) idővel rendelkező,<br />
tehát gyors IMA tesztet fejlesztettek ki és dobtak piacra<br />
a myocardialis ischaemia markereként.<br />
A kezdeti kísérletes és klinikai vizsgálatok nagyon<br />
biztatóak, mert az értékeléshez szükséges paramétereket<br />
is meghatározták. Egyéb molekuláris, ill.<br />
EKG-vizsgálatokkal kombinációban szenzitivitása és<br />
negatív prediktív értéke tovább növelhető, de specificitása<br />
elmarad a kívánatos értéktől. Hasznosulása<br />
azokban az ACS esetekben lesz várható, ahol az EKG<br />
és a troponinszintek nem diagnosztikusak. Figyelembe<br />
kell venni azonban, hogy a szérumban az emelkedett<br />
IMA-koncentráció néhány óra alatt lecseng,<br />
féléletideje 2-3 óra.
336 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Irodalom<br />
Schreibe, D., Miller, Suzanne M.: Use of Cardiac<br />
Markers in the Emergency Department – (Updated:<br />
Jul 8, 2009) http://emedicine.medscape.com/article/811905-overview<br />
Dörner, K.: Klinische Chemie und Hämatologie. pp. 407-<br />
414. 6. aktualisierte Auflage. Georg Thieme Verlag,<br />
Stuttgart-New York, 2006.
A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai<br />
337<br />
A liquorfehérjék újabb vizsgálati<br />
módjai<br />
Komoly Sámuel<br />
A liquor cerebrospinalist (továbbiakban „liquor”) hagyományos<br />
felfogás szerint az agykamrák plexus chorioideusai<br />
termelik részben filtrációval, részben aktív<br />
transzport útján.<br />
A liquor minőségi fehérje-összetétele fiziológiásan<br />
lényegben megegyezik a vérszéruméval, kivétel<br />
a b 2<br />
-transzferrin. A liquor fehérjetartalma azonban a<br />
vérszéruménál sokkal kisebb (150-400 mg/l), tehát a<br />
liquor egyfajta „ultrafiltrátumnak” tekinthető. Megjegyzendő,<br />
hogy a liquor fehérjetartalma újszülöttekben<br />
nagyobb, és szintén nem mindig kórjelző, ha 60<br />
év felett mérsékelten emelkedett összfehérjeértéket<br />
találunk.<br />
A liquor széruménál lényegesen kisebb fehérjetartalmát<br />
az magyarázza, hogy a liquorteret és a központi<br />
idegrendszert egészében a szervezet víztereitől<br />
ún. gátrendszerek választják el. Ilyen vér-liquor, ill.<br />
vér-agy gát, szintén létezik egy ilyen barrier-funkció<br />
a liquorteret a koponyacsont felől határoló lágyagyhártyában<br />
is. A vér-liquor gát biológiai szubsztrátuma<br />
a plexus chorioideust borító epithelsejtek közötti<br />
szoros kapcsolódás, amit sejtmorfológiai fogalomként<br />
zonula occludesként ismerünk. Hasonló módon<br />
zonula occludensekkel kapcsolódnak egymáshoz a<br />
vér-agy gát kulcselemei, az agyi ereket bélelő endothelsejtek<br />
is. Az utóbbiak még abban is különböznek,<br />
a többi szervünkben található endothelsejtektől, hogy<br />
nem fenesztráltak (nincsenek bennük pórusok). A<br />
meningealis barrier szubsztrátuma az egyik lágyagyhártya<br />
(arachnoidea, pókhálóhártya) sejtjeit összekapcsoló<br />
zonula occludensek rendszere.<br />
A liquorvizsgálat indikációi<br />
A liquorvizsgálat nélkülözhetetlen neuroinfekciók<br />
azonosításában (meningitis, encephalitis), segíthet<br />
egyes neuroimmunológiai betegségek diagnózisában<br />
és differenciáldiagnosztikájában: sclerosis multiplex,<br />
dysimmun neuropathiák (Guillain-Barré-szindróma,<br />
krónikus inflammatiós demyelinisatiós neuropathia,<br />
CIDP). Liquorvételre szükség lehet a subarachnoidalis<br />
vérzés diagnosztikájában, amennyiben<br />
subarachnoidalis vérzésre utaló jellegzetes tünet mellett<br />
(a beteg élete legrosszabb, legerősebb fejfájását éli<br />
meg) a CT-vizsgálat nem mutat vérre utaló hiperdenzitást<br />
a subarachnoidalis térben. Liquorvizsgálat igazolhatja<br />
továbbá egyes malignus betegségek intracranialis<br />
propagációját (pl. lymphomák, leukaemiák,<br />
carcinomák: meningosis carcinomatosa) a liquorban<br />
található tumorsejtek kimutatásával.<br />
A liquorból végzett fehérjeanalízis alapelvei<br />
A korrekt liquorfehérje-vizsgálat alapfeltétele,<br />
hogy a liquormintát vevő orvostól a laboratóriumban<br />
dolgozó szakemberek megfelelő tájékoztatást kapjanak<br />
a liquorvétel indikációjáról, helyéről, a levett liquor<br />
betegágy melletti makroszkópos észlelése során<br />
megfigyeltekről.<br />
Liquorminta nyerése<br />
Lumbálpunkciót Quincke végzett először 1891-<br />
ben. A liquort az esetek döntő többségében lumbálpunkcióval<br />
veszik. Ennek technikai részletei<br />
megtalálhatók tankönyvekben. Amennyiben a lumbálpunkció<br />
technikai vagy egyéb okból nem végezhető<br />
vagy kontraindikált, ugyanakkor a liquorvizsgálat<br />
abszolút indikált, liquor nyerhető cisternapunkcióval:<br />
a nyakszirtcsont és az első nyakcsigolya közötti résben<br />
behatolva, röntgen képerősítő kontrollja mellett.<br />
A mintavételre lehetőség van más okból behelyezett<br />
agykamradrénen keresztül is. Tudni kell azonban,<br />
hogy a liquor fiziológiás fehérjetartalma az agykamrai<br />
és a cisternalis liqorban kisebb (~100-200 mg/l),<br />
a lumbalis durazsákból vett liquorban viszont eléri a<br />
400 mg/l értéket.<br />
A levett liquor makroszkópos értékelése<br />
A punkcióval nyert liquor fiziológiásan víztiszta,<br />
átlátszó. Víztiszta liquort két frakcióban (más ajánlások<br />
szerint, mintegy 12 ml liquort 3-4 csőben szétosztva),<br />
véres liquort 3-5 frakcióban, frakciónként<br />
1,5-2 ml-t bocsátunk le steril csövekbe.<br />
Ha a frakciókban gyűjtött véres liquor feltisztul,<br />
arteficiális vérzésről van szó, azaz a punkció során<br />
valószínűleg megsérült egy véna az epiduralis vénás<br />
plexusban; ez a vérzés spontán szűnik. Amennyiben<br />
az egyes frakciók vétele során a liquor nem tisztul fel,<br />
akkor a liquort le kell centrifugálni. Patológiás vérzés<br />
esetén a centrifugált liquor színe megtört lehet, spekt-
338 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
rofotometriával a felülúszóban hemoglobin-bomlástermékek<br />
mutathatók ki. Arteficiális vérzés esetén a<br />
felülúszó víztiszta. Arteficiális vérzésre utal az is, ha a<br />
félretett véres liquorban alvadék képződik. Subarachnoidealis<br />
vérzés esetén a véres liquor nem alvad meg:<br />
félretéve a liquort, a vörösvérsejtek néhány óra alatt<br />
a kémcső aljára ülepednek, de a liquort felrázva a levételkor<br />
észlelt homogénen véres liquort látjuk.<br />
Ha az első lumbálpunkció során kapott és lecentrifugált<br />
liquor felülúszója sárga, az nagyon nagy valószínűséggel<br />
néhány nappal a punkció előtt történt patológiás<br />
vérzésre utal (elsősorban aneurysmaruptura,<br />
esetleg intraparenchymás vérzés liquortérbe törése).<br />
Magas szérumbilirubin-szint esetén vagy kivételesen<br />
nagy dózisú - ma már nagyon ritkán alkalmazott -<br />
tetracyclinkezelés mellett is észlelhetünk sárga színű<br />
liquort.<br />
A liquorvétellel egy időben vért is kell venni a betegtől,<br />
ugyanis az albuminhányados és az intrathecalis<br />
IgG-szintézis megítéléséhez a szérum parallel<br />
vizsgálata is szükséges. A liquor- és vérmintákat hűtés<br />
nélkül, lehetőség szerint egy órán belül a vizsgálatokat<br />
végző laboratóriumba kell szállítani, és egy órán<br />
belül javasolt elvégezni a vizsgálatokat. A 3-4 órás tárolás<br />
4 °C-on még elfogadható, ezt követően a liquor<br />
felülúszóját és a szérumot centrifugálás (pl. 8000-10<br />
000 rpm-en, 15 percig) után mélyhűteni kell (ideálisan<br />
~-70 °C-on). Ezekből a mintából már csak fehérjeanalízis<br />
végezhető.<br />
Pándy-reakció<br />
Pándy Kálmán módszerét 1910-ben írta le a betegágy<br />
melletti azonnali, helyszíni tájékozódó vizsgálatra<br />
a <strong>modern</strong> kézikönyvek még mindig ajánlják.<br />
A módszer lényege, hogy óraüvegbe öntött telített<br />
karbolsavas oldathoz néhány csepp liquort adunk: ha<br />
nem alakul ki opaleszcencia, a liquorösszeférje nem<br />
emelkedett. Opaleszcencia kialakulásának számos<br />
oka lehet, amelyek közül a helyes ok kiválasztására a<br />
<strong>modern</strong> liqordiagnosztikai módszerek adnak lehetőséget.<br />
A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai<br />
Mind a mai napig nincs nemzetközileg egységesen<br />
használt „referencia”-metodika, ezért minden laboratóriumnak<br />
be kell állítani az általa használt metodika<br />
saját normálértékeit, normáltartományait. Természetesen<br />
az azonos metodikával dolgozó laboratóriumok<br />
célszerű, ha minőségbiztosítási rendszerhez (pl. nemzetközi<br />
INSTAND hazai viszonylatban a QualiCont)<br />
csatlakoznak.<br />
Mennyiségi fehérjeanalízis<br />
Az Esbach-, Nogouchi-, Nonne-Apelt-, Takata-Ara-,<br />
Lange-reakció ma már elavult eljárásnak<br />
tekinthető. A Mancini-féle radiális immundiffúzió<br />
munkaigényes és nagy gyakorlatot igénylő eljárás. Az<br />
említett eljárások helyébe a legtöbb laboratóriumban<br />
az immunnefelometriás mérés lépett, egyes esetekben<br />
ELISA és RIA is alkalmazható speciális fehérjemeghatározásokra.<br />
Egyre több előre összeállított mérőszett<br />
(kit, gyári teszt) kapható kereskedelmi forgalomban,<br />
ami egyszerűsíti, pontosabbá és összehasonlíthatóvá<br />
teszi a különböző laboratóriumok munkáját, mérési<br />
eredményeit.<br />
Ma már nem elégedhetünk meg csak az összfehérje<br />
meghatározásával. Minimális követelmény az<br />
összfehérje emellett a liquor-, a szérumalbumin és<br />
az IgG-koncentráció meghatározása. A liquor és az<br />
egyidejűleg vett szérumminta albumin- és immunglobulin-koncentrációit<br />
nem csak azonos módszerrel,<br />
hanem lehetőleg azonos mérési sorozatban is kell<br />
meghatározni.<br />
Elengedhetetlen a liquor- és szérumminták párhuzamosan<br />
futatott izoeleketromos fokuszálással<br />
végzett elektroforézisének elvégzése is, megfelelő készülékkel<br />
(Pl. SEBIA ® CSF-electrophoresis system).<br />
További információ az interneten található [4].<br />
Elektroforézishez a liquort jellemzően natívan<br />
(magasabb összfehérjénél hígított formában) egyidejűleg<br />
viszik fel a hordozó közegre, általában 200-szorosára<br />
hígított szérummal.<br />
A liquor- és a szérumalbumin, valamint az<br />
IgG-koncentráció ismeretében lehetséges két, diagnosztikailag<br />
informatív index (Q) meghatározása:<br />
1. Albuminhányados<br />
liquoralbumin<br />
Q Alb<br />
=<br />
szérumalbumin<br />
2. IgG-index (leírója után Link-index)<br />
liquor-IgG × szérumalbumin<br />
Q IgG<br />
=<br />
liquoralbumin × szérum-IgG
A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai<br />
339<br />
Az albuminhányados és az IgG-index egyaránt dimenzió<br />
nélküli szám. IgA- és IgM-index is meghatározható,<br />
ezeknek azonban nincs igazi gyakorlati<br />
jelentőségük. Az albuminhányados a gátrendszerek<br />
integritásának vizsgálatára alkalmas, normálértéke az<br />
életkorral változik.<br />
Az IgG-index az intrathecalis immunglobulin-szintézisről<br />
nyújt felvilágosítást általában 0,7 felett<br />
tartják kórosnak. Leírója szerint (H. Link) az emelkedett<br />
IgG-index csak akkor értékelhető az intrathecalis<br />
IgG-képzés jelének, ha az albumin hányados<br />
fiziológiás tartományban van. Az intrathecalis IgG<br />
11-78. ábra. Az intrathecalis IgG-képzés helye<br />
forrásaként a gátrendszerek agyi, liquor felőli oldalán<br />
elhelyezkedő lymphocytás-plazmasejtes infiltraciók<br />
valószínűsíthetők, amelyek jellemzően a kis erek perivascularis<br />
terében lokalizálódnak (11-78. ábra). Az<br />
oligoklonális gammopathia (OGP) agarózgél-elektroforézisnél<br />
általában 2-5 extra csík formájában jelenik<br />
meg, izoelektromos fokuszálásnál pedig 6-9-es<br />
pH-tartományban kettőtől akár 9-15 diszkrét csík<br />
formájában is látható (11-79. ábra a, b, c).<br />
Biomarker fehérjék vizsgálata a liquorban<br />
Az utóbbi évek törekvése, hogy neurodegenerativ<br />
betegségek iv vivo diagnosztikájának felállításához liquorban<br />
specifikus és szenzitív biomarker fehérjéket<br />
azonosítsanak.<br />
Tau-protein és amyloid b-peptid<br />
Az Alzheimer-kór keletkezésében a jelenlegi elméletek<br />
szerint fontos szerepet játszhat a tau- (t) protein<br />
(ennek is kórosan foszforilált formái), ill. a b-amyloid<br />
prekurzor proteinből a β- és γ-sectertasok által kihasított<br />
Aβ 1-42<br />
peptidek. A tau- és foszforilált tau-szint<br />
emelkedését az egyidejűleg észlelhető alacsony Aβ 1-42<br />
peptid koncentrációt tartják Alzheimer-kórra specifikus<br />
jelenségnek. Az említett fehérjék, ill. peptidek<br />
meghatározására kereskedelmi forgalomban kapható<br />
szendvics-ELISA kiteket ajánlanak.<br />
11-79. ábra. Oligoklonális<br />
gammopathia (OGP)<br />
agaróz-gélelektroforézise
340 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
14-3-3 protein<br />
A szervezetben mindenütt előforduló protein,<br />
emelkedett lehet prionbetegségekben, ezen belül is<br />
jellemzően sporadikus Creutzfeldt-Jakob-betegségben.<br />
Kimutatását Western-blot vagy kereskedelmi<br />
forgalomban kapható kvantitatív ELISA-technikával<br />
végzik. Tudni kell azonban, hogy a 14-3-3 protein<br />
koncentrációja a liquorban megemelkedhet<br />
más dementiaformákban, metabolikus és hypoxiás<br />
encephalopathiákban is.<br />
Amennyiben Creutzfeldt-Jakob-betegségre utaló<br />
klinikai tüneteken (progresszív dementia, myoclonusok)<br />
túl a liquorban 14-3-3 protein is kimutatható, az<br />
megerősíti ennek a ritka betegségnek (prevalenciája<br />
1/10 6 lakos) a gyanúját, azonban a betegség definitív<br />
diagnózisa csak post mortem neuropatológiai vizsgálattal,<br />
a betegségre jellemző kóros prion protein immunhisztokémiai<br />
vizsgálatával lehetséges.<br />
b 2<br />
-transzferrin<br />
Ez a fehérje a szérumban nem, csak a liquorban<br />
fordul elő. Izoelektromos fokuszálással mutatható<br />
ki, amelyet az egyik technika szerint immunifixáció,<br />
majd ezüstözés követ. Kimutatásának akkor van gyakorlati<br />
jelentősége, ha liquorcsorgás gyanúja vetődik<br />
fel. Ez többnyire fejsérülések (koponyaalapi törések)<br />
után alakul ki, de létezik előzmény nélküli spontán<br />
liquorfolyás az orrüregből vagy a külső hallójáratból.<br />
Amennyiben az említett nyílásokon ürülő nedvben a<br />
b 2<br />
-transzferrin kimutatható, akkor igazolt a liquorcsorgás<br />
(szenzitivitás 80-100%, specificitás 95%).<br />
S-100 protein<br />
Referenciatartománya liquorban: < 5 µg/l (szérumban<br />
< 0,2 µg/l).<br />
Kalciumkötő fehérje többek között a Schwann-sejtekben,<br />
az astrogliában, a melanocytákban is kimutatható.<br />
Érzékenyen jelzi a központi idegrendszer, a<br />
vér-agy gát károsodásait. Fejsérülés, hypoxia hatására<br />
is emelkedik a szintje.<br />
Neuronspecifikus enoláz (NSE)<br />
Referenciatartománya liquorban: < 25 µg/l (szérumban<br />
< 13 µg/l).<br />
Agyi infarctus esetében több nappal az insultus<br />
után szintje megemelkedik, agyoedemában szintén.<br />
Alzheimer-kórban nem változik. Intracerebralis vérzés<br />
utáni prognosztikai marker, 100 µg/l feletti érték<br />
esetén diffúz kéregkárosodásra utal.<br />
Kreatin-kináz BB izoenzim (CK-BB)<br />
Referenciatartománya liquorban: < 5 U/l.<br />
Az agyi eredetű CK-BB izoenzim a szérumban<br />
gyakorlatilag minimális mennyiségben található. Liquorban<br />
szintje emelkedik stroke-ban, fejsérülésekben,<br />
demyelinisatiós betegségekben, tumorokban,<br />
meningitisben.<br />
Irodalom<br />
[1] Pándy K.: A cerebrospinalis folyadék vizsgálatának<br />
újabb módjai. Orv. Hetil. 4:72-73, 1910.<br />
[2] Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis.<br />
Report from an EFNS task force. European Journal of<br />
Neurolog 13:913-922, 2006.<br />
[3] EFNS guidelines on disease-specific CSF investigations.<br />
European Journal of Neurology 16:760-770, 2009.<br />
[4] http://www.laboratorytalk.com/news/anc/anc128.<br />
html#ixzz1DNwDWuQj
A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban<br />
341<br />
A fehérjék mint neuroendokrin<br />
hormonok a klinikai<br />
laboratóriumi kutatásokban<br />
Mezősi Emese, Kőszegi Tamás<br />
A neuroendokrin rendszer és hormonjai<br />
A neuroendokrin rendszer<br />
A neuroendokrin rendszer anatómiailag többlépcsős<br />
felépítése alkalmas arra, hogy a szervezetben<br />
mindig az aktuális szükségleteknek megfelelő menynyiségű,<br />
hatékony szabályozó funkcióval rendelkező<br />
hormon termelődjön. Szokás a többszintű hormonális<br />
szabályozó rendszert „endokrin tengelyeknek” is<br />
nevezni.<br />
A legfelső szinten az agykéreg áll, a kérgi válaszok<br />
képesek direkt az agy célhormon termelő- és szabályozó<br />
struktúráira hatni (gátlás vagy serkentés), ill. a<br />
szervezet különböző válaszreakcióin keresztül a hormontermelést<br />
befolyásolni. Amennyiben a kérgi befolyást<br />
kikapcsolnánk, az agy specifikus területei akkor<br />
is képesek a periférián keringő hormonszinteket<br />
vagy egyéb kulcsfontosságú vezérlő komponenseket<br />
érzékelni és az annak megfelelő gátló vagy stimuláló<br />
választ közvetíteni (feedback).<br />
A többlépcsős szabályozó „tengely” sematikusan a<br />
11-80. ábrán látható.<br />
A hypothalamus és a hypophysis áll a szabályozás<br />
középpontjában. A hypothalamus a perifériás vérben<br />
keringő hormonszinteket érzékelve csökkenti vagy<br />
növeli a hypophysist stimuláló release-hormon elválasztást.<br />
Ezek általában peptid természetű molekulák,<br />
pl. a pajzsmirigy „tengelyben” a TRH (tireotrop<br />
releasing hormon), ez mindössze 3 aminosavból álló<br />
tripeptid (11-81. ábra).<br />
A releasing hormonok a hypophysisbe jutva trop<br />
(serkentő) hormontermelést váltanak ki, amely hormonok<br />
azután a véráramba kerülve eljutnak a endokrin<br />
célmirigyhez, ahol stimulálják annak „utolsó<br />
lépcsős” hormontermelését, azét a hormonét, amely a<br />
szervezet célsejtjeire hat. Ez a látszólag túlbiztosított<br />
szabályozás képes a mindenkori hormonegyensúlyt<br />
fenntartani, és szükség esetén a célsejtek funkcióját<br />
11-81. ábra. A TRH szerkezete: pGlu-His-Pro-NH 2<br />
(piroglutamil-hisztidil-prolinamid)<br />
11-80. ábra. A neuroendokrin<br />
szabályozás<br />
főbb tengelyei
342 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A neuroendokrin rendszer betegségei,<br />
a hormontermelés változásai<br />
11-82. ábra. A pajzsmirigyhormonok elválasztásának szabályozása<br />
nagymértékben befolyásolni (pl. nemi hormonok).<br />
Az utolsó lépcsőben gyakran nem fehérje természetű<br />
hormonok szintetizálódnak (pl. szteroidok), a peptid<br />
- fehérje hormonok a karmester szerepét töltik be a<br />
magasabb szintű agyi regulációban. A visszacsatolásnak<br />
(feedback) nagy jelentősége van a szabályozásban,<br />
ezt a pajzsmirigyhormonok elválasztásának példáján<br />
keresztül mutatjuk be (11-82. ábra).<br />
A negatív visszacsatolás elve: a keringő szabad<br />
hormonszintek érzékelése alapján a hypothalamus és<br />
a hypophysis a serkentő hormonok szintézisét csökkenti<br />
vagy fokozza.<br />
A neuroendokrin rendszer fehérje- és peptidhormonjai<br />
A hormonok kivezetőcső nélküli endokrin mirigyekben<br />
termelődnek, és a vérárammal jutnak el a<br />
távoli célsejtekhez. A sejtek összehangolt működésében<br />
a klasszikus endokrin szabályozás mellett a sejtek<br />
közötti információcsere egyéb formái is fontos szerepet<br />
játszanak. Parakrin szekréció során a hormon a<br />
környezetében található sejtek működésére hat, amelyekhez<br />
diffúzióval jut el. Autokrin hatásról akkor beszélünk,<br />
ha a hírvivő molekula az őt elválasztó sejtre<br />
fejti ki hatását. A hormonok kémiai szerkezetük alapján<br />
glikoproteinek, peptidek, aminosavszármazékok<br />
és lipidek (pl. szteránvázas vegyületek) lehetnek. Ebben<br />
a fejezetben részletesen a fehérje- és peptidhormonokkal<br />
foglalkozunk.<br />
A polipeptidhormonok általában prohormonként<br />
termelődnek, az aktív hormon további enzimatikus<br />
hasítás során alakul ki. Példa erre a proinzulin, ahol a<br />
harmadlagos szerkezet kialakulása során a peptidlánc<br />
két vége között diszulfidhidak keletkeznek, majd a<br />
molekula középső részén található C-peptid kihasad.<br />
A C-peptid-szint mérésének alapvető jelentősége van<br />
az endogén inzulinszekréció megítélésében diabetes<br />
mellitusban szenvedő betegen, valamint az insulinoma<br />
diagnosztikájában. A megszintetizált aktív hormon<br />
szekréciós granulumokba kerül, ahonnan specifikus<br />
inger hatására szabadul fel. Előfordul, hogy egy<br />
nagy fehérjemolekulából számos hormon keletkezik,<br />
pl. a proopiomelanokortin a prekurzora az ACTH,<br />
a-MSH, b-MSH, b-lipotropin és enkefalin hormonnak.<br />
A polipeptidhormonok sejtfelszíni receptorokon<br />
keresztül fejtik ki hatásukat. A receptorok szerkezetéről<br />
és a jelátvitel módjáról az utóbbi években tudásunk<br />
jelentősen gyarapodott, lehetőséget adva a hormonhatás<br />
receptor szintű módosítására. A klinikai<br />
gyakorlatban legfontosabb peptidhormonokat (a teljesség<br />
igénye nélkül) a 11-36. táblázat foglalja össze.<br />
Az endokrin betegségek négy fő kategóriába sorolhatók:<br />
• Fokozott hormontermelés.<br />
• Csökkent hormontermelés.<br />
• A célszövetek megváltozott érzékenysége a hormonnal<br />
szemben.<br />
• Az endokrin mirigyek tumorai.<br />
A hormonszekréció rendellenességei<br />
A hormontúltermeléssel és hormonhiánnyal járó<br />
kórképek változatos klinikai tünetekkel jelentkeznek.<br />
A tünettan ismerete nélkülözhetetlen ahhoz,<br />
hogy a megfelelő laboratóriumi vizsgálatot kérjük a<br />
diagnózis felállításához. A túltermelés és a hiány egyaránt<br />
lehet a hypothalamus, a hypophysis és a perifériás<br />
endokrin mirigy szintjén. A perifériás endokrin<br />
szervek rendellenességei a leggyakoribbak, ilyenkor<br />
primer funkciózavarról beszélünk. Lényegesen ritkábban<br />
fordulnak elő a hypophysis betegségei (szekunder<br />
funkciózavar) és extrém ritka a hypothalamus<br />
működészavara következtében létrejövő kórkép<br />
(tercier funkciózavar). A pajzsmirigy primer túlmű-
A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban<br />
343<br />
11-36. táblázat. Peptidhormonok a klinikai gyakorlatban<br />
Hormon Termelődés helye Aminosavtartalom<br />
gonadotrop releasing hormon (GnRH) hypothalamus 10<br />
növekedési hormon serkentő hormon (GHRH) hypothalamus 44<br />
tireotrop releasing hormon (TRH) hypothalamus 3<br />
kortikotrop releasing hormon (CRH) hypothalamus 41<br />
vazopresszin hypophysis 9<br />
oxitocin hypophysis 9<br />
szomatosztatin hypothalamus 28, 14<br />
adrenokortikotrop hormon (ACTH) hypophysis 39<br />
tireotrop hormon (TSH) hypophysis 211<br />
luteinizáló hormon (LH) hypophysis 204<br />
folliculusstimuláló hormon (FSH) hypophysis 210<br />
növekedési hormon (GH) hypophysis 191<br />
prolaktin hypophysis 199<br />
inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1) máj 70<br />
pitvari natriuretikus peptid szívpitvar 28<br />
parathormon (PTH) mellékpajzsmirigy 84<br />
inzulin pancreas b-sejt 51<br />
kalcitonin C-sejt 32<br />
glukagon pancreas a-sejt 29<br />
leptin zsírszövet 167<br />
ghrelin gyomor 28<br />
ködése esetén a pajzsmirigyhormonok szintje emelkedett,<br />
a hypothalamus és a hypophysis ezt érzékeli,<br />
és negatív feedback-mechanizmus következtében a<br />
TRH- és a TSH-termelés lecsökken. A laboratóriumi<br />
leletben tehát alacsony TSH- és emelkedett szabad<br />
T 4<br />
- és T 3<br />
- érték látható. Ha azonban a hypophysis<br />
TSH-termelő adenomája okoz pajzsmirigy-túlműködést,<br />
a TSH emelkedett és ezt a pajzsmirigyhormonok<br />
magas szintje kíséri. A pajzsmirigy elsődleges<br />
alulműködésében a pajzsmirigyhormonok csökkent<br />
értéket mutatnak, a TSH szintje pedig emelkedett. A<br />
pajzsmirigy alulműködésének hátterében általában<br />
autoimmun gyulladás, a mirigy műtéti eltávolítása<br />
vagy előzetes radiojódkezelés áll. A hypophysis betegsége<br />
miatt létrejövő másodlagos pajzsmirigy-alulműködésben<br />
a TSH termelése csökkent és ehhez a<br />
pajzsmirigyhormonok alacsony szintje társul. A hypophysis-pajzsmirigy<br />
és a hypophysis-gonad tengely<br />
működésének megítéléséhez az alaphormonszintek<br />
mérése általában elegendő. A hypophysis-mellékvese<br />
és a GH-IGF-I tengely működése azonban gyakran<br />
csak stimulációs vagy szuppressziós tesztekben ítélhető<br />
meg. Ezek részletes tárgyalása meghaladja a jelen<br />
fejezet kereteit.<br />
Neuroendokrin tumorok jellemzése a fehérjetermékek<br />
szintjén<br />
Hormonhatású anyag termelése a neuroendokrin<br />
tumorok jelentős részében kimutatható. A klasszikus<br />
hormontúltermeléssel járó kórképek közé tartoz-
344 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
nak a hypophysis elülső lebeny adenomái. Ezek közül<br />
a leggyakoribb a prolaktintermelő tumor, amelyre<br />
diagnosztikus a 150 ng/ml feletti prolaktinszint. Ritkábban<br />
fordulnak elő a növekedési hormont termelő<br />
daganatok, amelyek a pubertás előtt gigantismust, ezt<br />
követően acromegaliát okoznak. A diagnosztikában<br />
perdöntő az oralis glukóztolerancia-tesztben nem<br />
szupprimálódó növekedési hormon szint (>1 ng/ml)<br />
és a korra és nemre normalizált IGF-I emelkedett értéke.<br />
Az ACTH-termelő daganatok laboratóriumi diagnosztikája<br />
különösen nehéz. Átfedés lehet a normális<br />
felső tartomány és a hypophysistumor által termelt<br />
ACTH-szint között, ezért ACTH-termelő daganat<br />
gyanúja esetén fontos a diurnális ritmus vizsgálata<br />
(adenoma esetén a diurnális ritmus eltűnik) és a<br />
kortizolszint szupprimálhatóságának kimutatása<br />
(dexamethasonszuppressziós tesztek), e tesztek számos<br />
típusa ismert. A hypophysisadenoma által okozott<br />
Cushing-kór nehezen különíthető el a benignus<br />
hörgőcarcinoid ACTH-termelése következtében kialakult<br />
ectopiás Cushing-szindrómától. Jelentősen<br />
emelkedett ACTH-szint mérhető rosszindulatú kissejtes<br />
hörgőcarcinomában, ennek elkülönítése általában<br />
nem okoz problémát.<br />
A hypophysis tumorai gyakran nem csak egy hormont<br />
termelnek, előfordul GH és prolaktin együttes<br />
szintézise, ill. FSH-LH-TSH termelés és számos<br />
egyéb kombináció. A hypophysisfunkció vizsgálatakor<br />
és a hormontúltermeléssel járó kórképek diagnosztikájában<br />
ezért valamennyi hypophysishormon<br />
és a perifériás hormonok vizsgálata is szükséges<br />
(TSH-fT 4<br />
, LH-FSH-tesztoszteron, ACTH-kortizol,<br />
GH-IGF-I). Számos, korábban inaktívnak gondolt<br />
hypophysistumor a-alegységet termel (ez közös a<br />
TSH, az LH és az FSH hormonban), így ennek vizsgálata<br />
további előrelépést jelenthet a diagnosztikában.<br />
A pajzsmirigy rosszindulatú daganata a medullaris<br />
carcinoma, amely a C-sejtekből indul ki, és kalcitonintermelése<br />
által mutatható ki. A kalcitonin fontos<br />
tumormarker, amelyet használunk a pajzsmirigygöbök<br />
preoperatív diagnosztikájában és a medullaris<br />
carcinoma miatt operált betegek posztoperatív követésében<br />
is.<br />
A mellékpajzsmirigy adenomája következtében<br />
létrejövő elsődleges mellékpajzsmirigy-túlműködés<br />
gyakori kórkép, ennek laboratóriumi diagnózisa az<br />
emelkedett szérumkalciumszinttel együtt mért emelkedett<br />
parathormonkoncentráció alapján mondható<br />
ki. A parathormonmeghatározásnak van intraoperatív<br />
formája is, amikor műtét során a műtét eredményességének<br />
igazolására használják a parathormonmérést,<br />
erre a parathormon rövid féléletideje ad<br />
lehetőséget.<br />
A széruminzulin meghatározása a hasnyálmirigy<br />
b-sejtjeiből kiinduló daganat gyanúja esetén jelent segítséget.<br />
Ezek a betegek az alacsony vércukorszint tünetei<br />
miatt fordulnak orvoshoz, a diagnosztikában az<br />
inzulin mellett a C-peptid és esetenként a proinzulin<br />
meghatározására is szükséges lehet. Diagnosztikus<br />
értékű az alacsony vércukorszint mellett észlelt emelkedett<br />
inzulin- és C-peptid-szint.<br />
Általános neuroendokrin tumormarkernek tekinthető<br />
a kromogranin-A, amely az utóbbi időben terjedt<br />
el a klinikai gyakorlatban. A kromogranin-A az<br />
endokrin és neuroendokrin sejtek szekretoros granulumaiban<br />
található 439 aminosav hosszúságú fehérje,<br />
amely a hormonokkal együtt szekretálódik. Álpozitív<br />
emelkedés észlelhető súlyos hypertoniában, veseelégtelenségben<br />
és protonpumpagátló gyógyszer adása<br />
során. Elsősorban a carcinoid tumorok diagnosztikájában<br />
használjuk.<br />
A fehérje- és peptidhormonok<br />
meghatározásának klinikai jelentősége<br />
és nehézségei<br />
A hormonok a keringésben igen kis koncentrációban<br />
vannak jelen, ezért meghatározásuk csak olyan módszerrel<br />
lehetséges, amely nagy érzékenységgel és jó<br />
specificitással rendelkezik biomolekulák kimutatására.<br />
Ezek a módszerek a hagyományos laboratóriumi<br />
eljárásoknál több nagyságrenddel érzékenyebbek. A<br />
szenzitív TSH meghatározás pl. femtomoláris (10 -15<br />
mol) mennyiségben képes meghatározni a TSH-molekulák<br />
mennyiségét. A TSH-meghatározás az egyik<br />
legérzékenyebb módszer, a többi peptidhormon méréstechnikája<br />
sajnos jóval elmarad a TSH-mérés mögött.<br />
Az endokrinológiában az antitestkötésen alapuló<br />
módszerek a leggyakoribb vizsgálóeljárások.<br />
Ennek során a fehérjemolekula specifikus epitópja<br />
ellen termelt antitest és a kérdéses peptidhormon között<br />
reverzibilis immunkémiai reakció zajlik. Kezdetben<br />
radioimmunoassay-ket használtak, napjainkban<br />
elterjedtek a nem izotóp jelölésű (alternatív) és au-
A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban<br />
345<br />
tomatizált módszerek. Az immunanalitikai módszer<br />
alapelvéből azonban számos hibalehetőség adódik.<br />
Az egyik legfontosabb probléma, hogy az immunreaktív<br />
molekulák koncentrációja nem mindig arányos<br />
a biológiai aktivitással. Erre példa a parathormonmeghatározás,<br />
amelynek első generációs assay-i<br />
egy antitestet használtak, és bemérték az inaktív<br />
C-terminális fragmenseket is. A második generációs<br />
assay-k két antitesttel dolgoznak, az egyik a molekula<br />
N-terminális, a másik a C-terminális régiója ellen<br />
irányul, az intakt, biológiailag aktív parathormon<br />
meghatározását célozva. Előfordulhat, hogy a monomer<br />
hormon polimerré kapcsolódik, emiatt biológiai<br />
aktivitása csökken, immunreaktivitása azonban megmarad.<br />
Ez történik pl. macroprolactinaemia esetén,<br />
amikor tévesen mérünk emelkedett prolaktinszintet.<br />
További probléma, hogy az antigén-antitest reakciót<br />
befolyásolja a közeg, amelyben zajlik: a plazmában a<br />
fehérjefrakciók, az ionerősség vagy a pH változása. A<br />
módszert autoantitestek vagy heterofil antitestek is<br />
zavarhatják. Immunometrikus módszerek alkalmazásakor<br />
fordul elő, hogy a mintában lévő rendkívül<br />
nagy koncentrációjú antigén az első antitest kötőkapacitását<br />
meghaladja, és a jelet adó második antitestet<br />
is telíti, így tévesen alacsony hormonszintet mér<br />
(„high-dose-hook” effektus).<br />
A peptidhormonok kutatásának eredményei<br />
A peptidhormonok kutatása kiemelt jelentőségű, a<br />
gyógyászatban való alkalmazásuk igazi sikertörténet,<br />
és napjainkban is bevezetés előtt állnak új készítmények.<br />
Az inzulin felfedezése volt az első jelentős lépés,<br />
amit rövidesen követett az első beteg kezelése (1922),<br />
és azóta betegek millióinak életét mentette meg az inzulin.<br />
Az elhúzódó hatású inzulin előállítása a farmakológia<br />
fejlődésének újabb állomásait jelzi. Mérföldkőnek<br />
számít az inzulin aminosavszekvenciájának<br />
megismerését követően a géntechnológia fejlődése<br />
révén a rekombináns technikával előállított humán<br />
inzulinok világméretű elterjedése. Az inzulinkezelés<br />
alapját ma a humán inzulinok adják, Magyarországon<br />
a kilencvenes évek elejétől érhetők el ezek a készítmények.<br />
A fehérjekutatás újabb jelentős eredménye<br />
volt az inzulinanalógok előállítása a humán inzulin<br />
aminosavszekvenciájának megváltoztatása révén. A<br />
cél a hatás megrövidítése vagy megnyújtása volt az<br />
élettanihoz leginkább hasonló inzulinkinetika elérése<br />
érdekében. Az inzulinterápia ugyanis minden törekvés<br />
ellenére korlátokkal bír: nem a megfelelő időben,<br />
mennyiségben és nem a megfelelő helyre kerül az inzulin,<br />
így az étkezést követő gyors inzulincsúcs nem<br />
utánozható és az étkezések között feleslegesen magas<br />
marad az inzulinszint. Az első gyors hatású inzulinanalóg<br />
a lispro-inzulin volt, ahol a B-lánc 28. és 29.<br />
helyén lévő két aminosav sorrendjét megcserélték<br />
(prolin-lizin helyett lizin-prolin). A lispro-inzulin rövid<br />
idő alatt monomer formát vesz fel, ezért gyorsabban<br />
szívódik fel, hatásmaximuma nagyobb, hatástartama<br />
pedig rövidebb, mint a humán inzuliné. Ennek<br />
számos előnyét élvezik a betegek: nem kell várni az<br />
inzulin beadása és az étkezés között (humán inzulinnál<br />
a várakozási idő 30-40 perc), étkezés után kevésbé<br />
emelkedik meg a vércukor, elhagyhatók a főétkezések<br />
közötti étkezések. Ma két további gyors hatású inzulinanalóg<br />
is forgalomban van, az aszpart-inzulin és a<br />
glulizin, amelyek farmakokinetikája nagyon hasonló<br />
a lispro-inzulinéhoz. Problémát jelentett a megfelelően<br />
hosszú hatástartamú, naponta egyszer adható bázisinzulin<br />
előállítása is. A két, klinikai gyakorlatban<br />
használt hosszú hatástartamú inzulinanalóg a glargin<br />
és a detemir, amelyek hatása már közelíti az ideális<br />
bázisinzulint. A glargin molekulában az A-lánc 21.<br />
helyén aszparagin helyett glicin van, a B-lánc végéhez<br />
pedig két további arginin kapcsolódik. A molekulaszerkezet<br />
ilyen módosításával sikerült elérni, hogy az<br />
oldhatóság megváltozott, alacsony pH-n oldható, a<br />
subcutisban lévő neutrális pH-n pedig kicsapódik az<br />
inzulinmolekula, ami a felszívódást jelentősen megnyújtja.<br />
A detemir hatástartamát más mechanizmussal<br />
sikerült megnövelni. Itt a B-lánc 30. aminosava<br />
hiányzik, a 29. aminosavhoz pedig egy zsírsavlánc<br />
kapcsolódik, ami autoasszociációra teszi hajlamossá<br />
a molekulát, és fokozza az albuminhoz való kötődést<br />
is. A detemir lassabban szívódik fel és a keringésben<br />
az albuminról fokozatosan válik le, hatástartama 12-<br />
20 óra.<br />
Az inzulin után rekombináns technikával előállított<br />
következő hormon a növekedési hormon volt, ez<br />
megoldást jelentett a gyermek-, majd később a felnőttkori<br />
súlyos növekedési hormon hiány ellátására.<br />
Hormonkészítmények egész sora került a következő<br />
években a gyógyászatba. Néhány további példa a<br />
teljesség igénye nélkül,: a GnRH-analógok alapvető<br />
szerepet játszanak a prostatarák,az emlőrák, az endometriosis<br />
kezelésében, alkalmazzák őket az asszisztált
346 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
reprodukciós programokban. Az utóbbiban a rekombináns<br />
FSH és LH is nélkülözhetetlen. A szomatosztatin<br />
analógjai (octreotid, lanreotid) a neuroendokrin<br />
tumorok, az acromegalia kezelésének hatékony<br />
eszközei. A rekombináns TSH a pajzsmirigy differenciált<br />
carcinomáinak radiojódkezelésében kapott szerepet.<br />
A dezmopresszin a centrális diabetes insipidus<br />
szuverén szere. A teriparatid, a parathormon N-terminális<br />
1-34 aminosavfragmentuma rendkívül hatékony<br />
az osteoporosis kezelésében.<br />
2010-ben kerültek hazánkban forgalomba a GLP-<br />
1- (glukagonszerű peptid-1) agonisták, amelyek a<br />
2-es típusú diabetes mellitus új kezelési lehetőségét<br />
jelentik (exenatid, liraglutid). Az első tapasztalatok<br />
rendkívül kedvezőek. A GLP-1 a bélrendszer distalis<br />
részében, a nyálkahártya L-sejtjeiben termelődik.<br />
Plazmaszintje a táplálékfelvétel hatására jelentősen<br />
emelkedik. Fokozza az inzulin szintézisét, ugyanakkor<br />
gátolja a glukagon elválasztását, lassítja a gyomorürülést<br />
és csökkenti az étvágyat. Testsúlycsökkentő<br />
hatása járulékos előny a diabetes mellitus kezelésében.<br />
A GLP-1 szekréciója 2-es típusú diabetesben jelentősen<br />
csökkent. A GLP-1 rendkívül gyorsan metabolizálódik<br />
a keringésben, felezési ideje < 2 perc. A<br />
lebontást a dipeptidil-peptidáz-IV (DPP-IV) enzim<br />
végzi. A GLP-1-agonisták klinikai alkalmazásának<br />
feltétele volt az élettartam megnövelése. Az exenatid<br />
előállításában egy Arizonában élő gyík nyálából<br />
izolált polipeptid, az exendin-4 segített. Ez a molekula<br />
aminosavszekvenciájában 53% homológiát mutat<br />
a humán GLP-1-gyel, de rezisztens a DPP-IV-gyel<br />
szemben. A GLP-1-receptoron agonistaként működik.<br />
Az exenatid az exendin-4 szintetikus változata.<br />
A liraglutid a natív GLP-1 egy aminosavban és egy<br />
16 szénatomos oldalláncban módosított analógja, a<br />
DPP-IV hatásával szemben az albuminhoz való kötődés<br />
védi meg.<br />
A neuroendokrin hatású anyagok rohamosan bővülő<br />
tárházát jelentik az adipokinek, a kizárólag vagy<br />
döntően a zsírszövetben termelődő hormonok. A korábban<br />
már jól karakterizált leptin mellett ide tartozik<br />
az adiponektin, a rezisztin, a viszfatin, az apelin, a<br />
vaszpin, a hepcidin, a chemerin és az omentin, amelyek<br />
fiziológiás funkciója még csak részben ismert.<br />
A kutatások egyik fő célpontja az étvágyszabályozás<br />
megismerése. Az étvágyszabályozásban az adipokinek<br />
mellett a bélhormonok is alapvető szerepet játszanak,<br />
a GLP-1 mellett kiemelt fontosságú a ghrelin, a peptid<br />
YY és az oxintomodulin. Az elhízás incidenciája<br />
a világon aggasztó mértékben emelkedik, a testsúly<br />
gyógyszeres csökkentése pedig jelenleg megoldatlan,<br />
némi reményt csak az előbb említett GLP-1-agonisták<br />
jelentenek. A bélben és a zsírszövetben termelődő<br />
hormonok a szervezet tápláltsági állapotáról szállítanak<br />
információt a hypothalamus étvágyszabályozó<br />
központjaiba. Hatásuk jobb megismerése új terápiás<br />
célpontokat jelenthet az elhízás és az ehhez kapcsolódó<br />
civilizációs betegségek terápiájában.<br />
Irodalom<br />
Chaudhri, O. B., Wynne, K., Bloom, S. R.: Can gut hormones<br />
control appetite and prevent obesity? Diabetes<br />
Care 31(S2):84-89, 2008.<br />
Drab, S. R.: Clinical studies of liraglutide, a novel, once-daily<br />
human glucagon-like peptide-1 analog for improved<br />
management of type 2 diabetes mellitus. Pharmacotherapy<br />
29:43S-54S, 2009.<br />
Freeman, J. S.: Insulin analog therapy: improving the<br />
match with physiologicinsulin secretion. J. Am. Osteopath.<br />
Assoc. 109(1):26-36, 2009.<br />
Hartman, I.: Insulin analogs: impact on treatment success,<br />
satisfaction, quality of life, and adherence. Clin.<br />
Med. Res. 2008; 6(2):54-67.<br />
Kovács L. G., Toldy E., Lőcsei Z., Mezősi E.: In: Debreczeni<br />
L., Kovács L. G. (szerk.): Endokrinológiai laboratóriumi<br />
vizsgálatok. Gyakorlati laboratóriumi medicina.<br />
397-425. old. Literatúra Medica Kiadó, Budapest,<br />
2008.<br />
Leövey A., Nagy V. E., Paragh G. et al.: Az endokrin és<br />
anyagcsere betegségek gyakorlati kézikönyve. 403-415.<br />
old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2011.<br />
Modlin, I. M., Gustafsson, B. I., Moss, S. F. et al.: Chromogranin<br />
A-biological function and clinical utility<br />
in neuro endocrine tumor disease. Ann. Surg. Oncol.<br />
17(9):2427-2443, 2010.<br />
Pregun I., Bodoky G., Rácz K. et al.: Carcinoid daganatok.<br />
Orv. Hetil. 151(46):1885-1894, 2010.<br />
Wozniak, S. E., Gee, L. L., Wachtel, M. S. et al.: Adipose<br />
tissue: the new endocrine organ? A review article. Dig.<br />
Dis. Sci. 54(9):1847-1856, 2009.
A csontanyagcsere fehérjemarkerei<br />
347<br />
A csontanyagcsere<br />
fehérjemarkerei<br />
Kőszegi Tamás<br />
A csontrendszer<br />
A csontrendszer funkciói<br />
A csontszövet nagyon sokrétű feladatot lát el.<br />
Amellett, hogy szilárd vázat képez a test és az izomrendszer<br />
számára, a csontvelőben képződnek a vörösés<br />
fehérvérsejtek, a csont óriási kalciumraktárként is<br />
funkcionál, hatékonyan részt vesz a sav-bázis egyensúly<br />
szabályozásában és részese az endokrin folyamatok<br />
szabályozásának is. Mindez csak úgy képzelhető<br />
el, hogy a csontszövet rendkívül dinamikusan képes<br />
válaszolni a szervezetet érintő hatásokra, elsősorban<br />
biológiailag aktív fehérjék termelésével és a sejtes állomány<br />
funkciójának gátlásával vagy stimulációjával.<br />
Ez a fejezet elsősorban a csontanyagcserét érintő legfontosabb<br />
folyamatokat foglalja össze, a fehérje természetű<br />
komponensekre fokuszálva.<br />
A csont összetétele<br />
A csontszövet alapvetően anorganikus és organikus<br />
összetevőkre bontható. Az anorganikus komponens<br />
elsősorban vízből (ez a nedves súly 40%-a) és<br />
hidroxi-apatit kristályokból áll, míg az organikus rész<br />
a sejtes elemeket is magába foglaló „mátrixból” (11-<br />
37. táblázat).<br />
A csontszövet felépítése<br />
Sejtes elemek<br />
Osteoblastok. Az osteoblastok mononukleáris<br />
sejtek, a csontújdonképződés helyein találhatók és<br />
oszteoidnak nevezett, elsősorban kollagéntartalmú<br />
csontszövetprekurzort termelnek. Pluripotens mesenchymalis<br />
őssejtekből származnak, amelyek egy<br />
része adipocytává is képes differenciálódni. A csontfelépítésben<br />
vesznek részt (lásd később), éretlen<br />
csontsejteknek (osteocyták) is tekinthetők. Feladatuk<br />
elvégzése után a differenciált osteoblastok megnyúlt,<br />
lapos „lining” sejtekké is alakulhatnak, ill. apoptotikus<br />
mechanizmusok által el is pusztulhatnak.<br />
Osteoclastok. Többmagvú, nagy sejtek, a monocyta<br />
őssejtvonalból származnak. A csontlebontásban<br />
vesznek részt, a lebontás helyein ún. lacunákban találhatók,<br />
és aktivitásukkal üregeket képeznek az osteoblastok<br />
és az új csontszövet számára. Fagocitózisra<br />
képes sejtek, valamint lebontó enzimeket is termelnek<br />
(részletesen lásd később). Mind az osteoblastok,<br />
mind az osteoclastok aktív mozgásra képesek.<br />
Osteocyták. Érett csontsejtek, az osteoblastokból<br />
alakulnak ki, amelyek a mineralizációs folyamat során<br />
mintegy befalazzák magukat és osteocytává differenciálódnak.<br />
Az osteocyták is aktívak maradnak:<br />
részt vesznek a kalciumhomeosztázis fenntartásában,<br />
a mineralizációban, információkat közvetítenek a lebontó<br />
és felépítő sejtek felé. Mechanoreceptorként<br />
működve szabályozzák a csont terheléstől függő átépülését.<br />
A csont mint dinamikusan átépülő szövet<br />
Az első pillantásra statikusnak látszó, nagy szilárdságú<br />
csontrendszer rendkívül élénk anyagcserét folytat<br />
egész életünk során. Körülbelül 10 évente a teljes<br />
csontállomány ásványi anyagának egésze kicserélődik.<br />
A születés után igen intenzív csontosodási és növekedési<br />
folyamatok zajlanak, majd 20 és 30 éves kor<br />
közt éri el a csontsűrűség (BMD, bone mineral density)<br />
a maximumát. Az átépülési folyamatok felnőttkorban<br />
sem állnak le, de a menopauza után a nemek<br />
között nagy különbség alakul ki a lebontó és felépítő<br />
folyamatok egyensúlyában. Az angol irodalom a folyamatos<br />
csontátépülésre a „remodeling” kifejezést<br />
11-37. táblázat. A csontszövet összetétele<br />
Csontalkotók csoportjai Arányuk a csontszövetben Alkotórészek<br />
anorganikus összetevők<br />
mátrix (organikus<br />
összetevők)<br />
kb. 60-65% száraz súlyra<br />
vonatkoztatva<br />
kb. 30-55% száraz súlyra<br />
vonatkoztatva<br />
hidroxiapatit (kalciumfoszfát kristály),<br />
magnézium, egyéb elemek<br />
I-es típusú kollagén, egyéb fehérjék<br />
sejtes elemek (osteoblast, osteoclast, osteocyta)
348 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
használja. Érthető, hogy a remodeling szabályozásában<br />
a biológiailag aktív fehérjék, a nemi és egyéb<br />
hormonok és a kalcium-anyagcserét befolyásoló<br />
D-vitamin is részt vesz. A karmester jellegű fehérjék<br />
egy részét a csontszövet sejtes elemei termelik. A folyamatos<br />
csontátépülés a terheléshez való alkalmazkodást<br />
és a csontot érő mikrosérülések helyreállítását<br />
szolgálja. Az aktív metabolizmus és átépülés ellenére<br />
a reszorpciós és mineralizációs folyamatok az időtengelyen<br />
relatíve lassan mennek végbe, néhány hét<br />
szükséges a teljes átépüléshez.<br />
A csontanyagcsere<br />
Osteoblastok által termelt faktorok<br />
Oszteoid<br />
A csont organikus mátrixának fő alkotója, több fehérjéből<br />
álló komplex struktúra.<br />
Legfontosabb fehérje alkotói a következők:<br />
I-es típusú kollagén. Csontspecifikus óriásmolekula,<br />
két α 1<br />
- és egy α 2<br />
-láncból álló tripla hélix. Prokollagén<br />
monomerként születik, a lizin és a prolin aminosav<br />
poszttranszlációs hidroxiláción megy keresztül,<br />
majd a monomerek szekretálódnak és mindkét<br />
végükről (N- és C-terminális) részleges proteolízissel<br />
peptidek hasadnak le. A termékek „ragadóssá”<br />
válnak, és hosszú lineáris polimereket képeznek,<br />
amelyeket a hidroxilált lizineken keresztül keresztkötések<br />
stabilizálnak. A hidroxilációs folyamatokhoz<br />
C-vitamin kofaktor szükséges, ennek hiányában<br />
skorbut alakul ki.<br />
Oszteokalcin. Nagy mennyiségben termelődő kis molekulatömegű<br />
fehérje, aktiválásához K-vitamin szükséges,<br />
amely elősegíti a γ-szénatom karboxilációját. A<br />
karboxiláció a szomszédos glutamát mellett alakul ki,<br />
az így létrejövő két szomszédos karboxilcsoport képes<br />
lesz a kalciumion megkötésére. A Ca 2+ megcsapdázáshoz<br />
integrinkötő szialoprotein is szükséges, az<br />
immobilizált komplex ezután kristályosodási magot<br />
képez, és kialakul a hidroxi-apatit (Ca 5<br />
(PO4) 3<br />
(OH)).<br />
Az oszteokalcin működéséhez még egy másik gén átírására<br />
is szükség van, amelyet a D-vitamin specifikus<br />
kötőfehérjéje aktivál.<br />
A nem karboxilált oszteokalcin egy része a keringésbe<br />
kerül, és fokozza az inzulinelválasztást, ill. növeli<br />
a zsírszövet inzulinérzékenységét, ezáltal stimulálja<br />
az adiponektintermelést. Így az oszteokalcin a<br />
szervezet anyagcseréjét is befolyásolja.<br />
Oszteonektin. Az oszteoid komplex része, és összeköttetést<br />
biztosít a hidroxi-apatit és a kollagénmátrix<br />
közt.<br />
Csontspecifikus alkalikus foszfatáz (BAP). Az alkalikus<br />
foszfatáz (AP) izoenzimje, az osteoblastok felszínére<br />
lokalizálódik, és foszfatáz aktivitásával részt vesz<br />
a mineralizációban. A fokozott osteoblastaktivitás a<br />
magyarázata annak, hogy az aktív csontnövekedés<br />
időszakában a szérum AP-aktivitása a felnőtt-értékekhez<br />
képest jóval nagyobb.<br />
Citokinek. Az IL-1 és az IL-6, az osteoclastok érését<br />
segíti elő. Az érési folyamat bonyolult, az osteoblastok<br />
felszínén található és szekretált RANKL (receptor aktivált<br />
nukleáris faktor k-B ligand) összekapcsolódik<br />
az osteoclast prekurzor sejteken lévő RANK fehérjével,<br />
elindítva az osteoclastok érését.<br />
A gp 130 citokincsalád. Az utóbbi néhány évben több<br />
biológiailag aktív fehérjét azonosítottak, amelyek<br />
döntően befolyásolják a csontanyagcserét, és hatásuk<br />
a gp 130-nak nevezett közös jelátviteli rendszeren<br />
keresztül valósul meg. Ide tartoznak: IL-6, IL-11,<br />
onkosztatin M, leukaemiainhibitor faktor (LIF), kardiotrofin-1.<br />
Ezek a citokinek molekuláris felépítésükben<br />
nagyon hasonlóak egymáshoz, a szolubilis<br />
gp 130 rendszeren keresztül mind az osteoclastokra,<br />
mind az osteoblastokra hatnak, és szerepük patológiás<br />
állapotokban is jelentős (pl. oszteolitikus csontáttétek,<br />
Paget-kór).<br />
Egyéb növekedési faktorok. A csontátépülést az eddig<br />
felsoroltakon kívül még számos biológiailag aktív fehérje<br />
szabályozza, amelyek a csontsejtekben, a csontmátrixban<br />
és a környező szövetekben termelődnek.<br />
Hatásmechanizmusuk még nem teljesen tisztázott,<br />
csak néhányat emelünk ki közülük. Transzformáló<br />
növekedési faktor-β (TGF-β), csont eredetű növekedési<br />
faktor (BDGF), fibroblast növekedési faktor<br />
család (FGF), PDGF, egyéb csontnövekedési faktor<br />
(bone morphogenetic protein, BMP). A TGF-β család<br />
kiemelt szerepet játszik az osteoblastok proliferá-
A csontanyagcsere fehérjemarkerei<br />
349<br />
ciójában, amelyek azután BMP-t választanak ki, megindítva<br />
ezzel a mineralizációt.<br />
Mátrix metalloproteinázok, kollagenázok. Úgy tűnik,<br />
az osteoblastok által szekretált proteolitikus enzimek<br />
a még nem mineralizálódott oszteoidot képesek feloldani,<br />
ami kemotaktikus úton vonzza az osteoclastokat,<br />
és azok tovább folytatják a reszorpciót, mintegy<br />
helyet készítve az osteoblastok számára. Így a létrejövő<br />
kis üregekben megindul a csontújdonképződés<br />
és a mineralizáció.<br />
Oszteoprotegerin. Képes a RANKL-molekulához kötődni,<br />
így inaktiválja azt. Az osteoclastaktiváció a<br />
RANKL és az oszteoprotegerin expresszió egyensúlyától<br />
függ.<br />
Osteoclastok által termelt faktorok<br />
Az osteoclastok differenciálódásához szükség van<br />
a felsorolt faktorokon kívül macrophag kolónia stimuláló<br />
faktorra (MCSF) és prosztaglandin E-re is.<br />
Mindezen folyamatokat a parathormonelválasztás is<br />
szabályozza. Az osteoclastok képesek protonszekrécióra,<br />
így a csont anorganikus összetevőit savval oldják<br />
fel. Az organikus komponenseket lizoszomális enzimeik<br />
segítségével emésztik meg.<br />
Lizoszomális savanyú hidrolázok. Nagyon sok enzim<br />
sajátságú fehérje tartozik ide, amelyek többek közt a<br />
kollagén lebontását is végzik. A teljesség igénye nélkül<br />
néhány: tartarátrezisztens savanyú foszfatáz, katepszin-molekulacsalád,<br />
szulfatázok, glikozidázok<br />
stb.<br />
A csontanyagcsere endokrin szabályozása<br />
A vérplazma ionizált kalcium szintje a meghatározó<br />
az endokrin szabályozásban, ugyanis a mellékpajzsmirigy<br />
speciális sejtjei képesek az ionizált forma koncentrációjának<br />
érzékelésére.<br />
Parathormon (PTH). A mellékpajzsmirigyben termelődő,<br />
84 aminosavból álló polipeptid, alacsony<br />
ionizált kalcium szint stimulálja, magas pedig gátolja<br />
a szekrécióját. Féléletideje a keringésben 4 perc. Az<br />
osteoclastok aktivitását stimulálja, így emeli a vér kalciumszintjét.<br />
A stimuláció nem közvetlenül, hanem<br />
az osteoblastokon keresztül valósul meg: az osteoblastok<br />
a magas PTH-szint következtében fokozzák az<br />
IL-1, IL-6 és más citokinek, ill. az MCSF és a RANKL<br />
termelődését, fokozva az osteoclastok érését. Hoszszú<br />
távú hatást a PTH-szekrécióra a szervezet aktív<br />
D-vitamin-szintje fejt ki.<br />
Kalcitonin. Polipeptidhormon, a pajzsmirigy C-sejtjeiben<br />
termelődik, a PTH-val ellentétesen a kalciumszintet<br />
csökkenti. Jelentősége jóval kisebb, még nagy<br />
kalcitoninkoncentrációnál (pl. kalcitonint termelő<br />
tumornál) sem okoz problémát a kalciumhomeosztázisban.<br />
Növekedési hormon (hGH). 191 aminosavból álló fehérje,<br />
a hypophysisben termelődik, elválasztását a hypothalamus<br />
szabályozza. Nélkülözhetetlen a csontok<br />
hosszanti növekedéséhez, hiánya törpenövést, túlprodukciója<br />
gigantismust eredményez. Hatását indirekt<br />
módon fejti ki, fokozva a máj inzulinszerű növekedési<br />
faktor szekrécióját.<br />
Inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1). Az inzulinhoz<br />
hasonló szerkezetű polipeptid, degradációját<br />
specifikus kötőfehérje akadályozza meg. Képes a<br />
csontban a mineralizált területeken deponálódni más<br />
növekedési faktorokkal együtt (TGF-β, thrombocyta<br />
eredetű növekedési faktor, PDGF) és ott hosszú ideig<br />
aktív állapotban maradni. Parakrin módon hat, a<br />
chondrocyták stimulációjával és az osteoblastok osztódásának<br />
serkentésével. Az IGF-1 hatása kiegyensúlyozottabb,<br />
mint a hGH-é, de a növekedés szabályozásában<br />
mindkettő egyaránt fontos. A csontban<br />
deponálódott növekedési faktorok elősegítik a csontáttéteket<br />
adó tumorok gyors proliferációját.<br />
Pajzsmirigyhormonok. Elengedhetetlenül szükségesek<br />
a normális csontmetabolizmushoz, de hatásukról<br />
még keveset tudunk. A trijódtironin (T 3<br />
) hormon<br />
nukleáris támadáspontú, és a génátírást szabályozza,<br />
a DNS-hez specifikus kötőfehérjéken keresztül kapcsolódik.<br />
Újabban kimutatták, hogy a TSH (thyroideastimuláló<br />
hormon) az osteoclastok aktivitását<br />
gátolja. A nem kezelt veleszületett hypothyreosis is<br />
törpenövést eredményez.<br />
Szteroidhormonok. Nem fehérje természetű molekulák,<br />
de a csontmetabolizmusban mégis fontos szere-
350 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
pet töltenek be. Az androgének és ösztrogének szintén<br />
nukleáris támadáspontúak, de hatásuk nagyon<br />
összetett. Az ösztrogének gátolják az osteoclastok<br />
tevékenységét, stimulálják az oszteoprotegerin szekrécióját<br />
és gátolják az osteoclastaktivációt elősegítő<br />
faktorok szintézisét. Megfelelő ösztrogénszintnél a<br />
csontvesztés lassú, a menopauza után ez felgyorsul.<br />
Férfiakban az androgén hormonok mennyisége csak<br />
időskorban csökken számottevően, ezért a csontok<br />
ásványi anyagának vesztése a nőkhöz képest jóval később<br />
következik be.<br />
A glukokortikoidok egyaránt hatnak a felépítő és a reszorpciós<br />
mechanizmusokra. Gátolják az osteoblastokban<br />
a kollagén, az oszteokalcin és az oszteoprotegerin<br />
szintézisét, fokozzák a RANKL-produkciót.<br />
Ennek következtében nő az osteoclastok száma és<br />
aktivitása, fokozódik a csontvesztés.<br />
A fizikai aktivitás szerepe<br />
Régóta ismert, hogy a fizikai inaktivitás csontsűrűségvesztést<br />
eredményez. A csont mechanikai terhelését<br />
az osteocyták érzékelik, egyelőre kevéssé ismert<br />
mechanizmusok alapján, és képesek szintén alig ismert<br />
molekuláris folyamatokkal információt közvetíteni<br />
a szomszédos osteoblast- és osteoclastsejtek felé.<br />
Ily módon a fizikai terhelés befolyásolja, stimulálja a<br />
csontmetabolizmust, a mechanikai szükségleteknek<br />
megfelelően átépülnek a csontgerendák. Újabban azt<br />
is feltételezik, hogy az izom-összehúzódások közvetítette<br />
erőhatás az izmok tapadási helyén szintén aktiválja<br />
az osteocytákon keresztül a lebontó és felépítő<br />
folyamatokat. A megfelelő fizikai aktivitás ily módon<br />
segíti elő a csontsűrűség megőrzését.<br />
Táplálkozás<br />
Ahogyan az előzőkben láttuk, a csontanyagcsere<br />
hat az egész szervezet metabolizmusára az inzulinválasz<br />
módosításán keresztül. Ugyanakkor a szervezet<br />
tápanyag-ellátottsága is visszahat a csontmetabolizmusra<br />
a leptin mediálta folyamatok következtében.<br />
A leptint az adipocyták termelik (szokás ezért adipokinnek<br />
is nevezni), és vérszintje az egyén zsírraktárának<br />
nagyságával arányos. A leptin szintje diurnális<br />
ingadozást mutat, mennyisége a táplálékfelvételtől<br />
is függ. Elsődlegesen az agyban fejti ki hatását a hypothalamuson<br />
keresztül. A hypothalamus impulzusai<br />
a sympathicus neuronokon keresztül stimulálják<br />
a b 2<br />
-adrenerg receptorokat (noradrenalinválasz). Az<br />
osteoblastok és az osteoclastok aktivitása a stimulustól<br />
függően nőhet vagy csökkenhet, egyelőre a mechanizmusáról<br />
keveset tudunk. Egy azonban biztos,<br />
a tápláltsági állapot és a csontsűrűség között összefüggés<br />
van, pl. anorexia nervosában alacsony leptinszintet<br />
és osteoporosist látunk.<br />
A 11-83. ábrán a csontátépülés folyamatai láthatók.<br />
A leggyakoribb csontanyagcsere-betegségek<br />
Osteoporosis<br />
Az osteoporosist népbetegségként tartja számon<br />
az irodalom, holott természetes biológiai folyamatok<br />
eredménye. Amiért mégis betegségként is foglalkoznunk<br />
kell vele, azt az a körülmény magyarázza, hogy<br />
a civilizációs, táplálkozással–életmóddal összefüggő<br />
tényezők fokozottan segítik kialakulását. Szerepet<br />
játszik ebben a fizikai inaktivitás, az ásványi anyagokban<br />
szegény táplálkozás, a fokozott foszfátbevitel<br />
11-83. ábra. A csontátépülés ciklusai
A csontanyagcsere fehérjemarkerei<br />
351<br />
(pl. foszforsavat tartalmazó üdítő italok és ömlesztett<br />
sajtok fogyasztása), ami acidosist és következményes<br />
kalciumkiáramlást eredményez a csontokból.<br />
Az osteoporosis diagnózisa egyértelműen képalkotó<br />
technikákon alapul, de ezek a módszerek nem<br />
mondanak semmit a csontmetabolizmus dinamikájáról.<br />
Osteoporosisnál ugyanis a csontturnover<br />
fokozódik, de a formáció mindig kisebb mértékű<br />
a reszorpciónál, ezért csökken a BMD. Az állapotfelmérés<br />
helyes stratégiája a csontsűrűségméréshez<br />
hozzárendelt biokémiai marker meghatározás. A betegség<br />
követéséhez ezután a továbbiakban elegendő a<br />
biokémiai paraméterek monitorozása.<br />
Laboratóriumi monitorozás<br />
Csontfelépülést jelző (formációs) markerek:<br />
• Oszteokalcin (jobb a teljes, de labilis molekula<br />
helyett annak degradációs termékét meghatározni,<br />
ezt „N-MID-oszteokalcin” névvel jelölik).<br />
• Prokollagén propeptidek (N- vagy C-terminális<br />
I. típusú prokollagén propeptid, P1NP).<br />
• Csont eredetű alkalikus foszfatáz.<br />
• D-vitamin: 25(OH)D 3<br />
és/vagy 1,25(OH) 2<br />
D 3<br />
.<br />
Csontleépülést jelző (reszorpciós) markerek:<br />
• Tartarátrezisztens savanyú foszfatáz (TRAP).<br />
• N- vagy C-terminális I. típusú kollagén telopeptid.<br />
• Vizelet-piridinolin- és dezoxi-piridinolin-ürítés.<br />
A kollagén hármas hélixének stabilizálásában a kollagén<br />
monomerek két végén (N- és C-terminális)<br />
lineáris szakaszok, ún. telopeptidek találhatók. A telopeptidek<br />
gyűrűs vegyületek (piridinolin, PYD és<br />
dezoxi-piridinolin, DPD) segítségével kovalensen<br />
kötődnek a szomszédos kollagénrostok helikális régiójához<br />
(11-84. ábra).<br />
11-84. ábra. A csont eredetű kollagén stabilizációja (keresztkötés)<br />
(DPD: dezoxi-piridinolin)<br />
A reszorpciós markerek széles skáláját határozhatjuk<br />
meg, a kis molekulatömegűeket (PYD és DPD)<br />
elsősorban a vizeletből, ebben az esetben a mért értékeket<br />
a vizelet kreatininkoncentrációjának hányadosaként<br />
adjuk meg. A vérszérumból mérhetjük az<br />
ún. b-keresztkötést, amely a C-terminális telopeptid<br />
8 aminosavból álló stabil degradációs terméke. Az<br />
NTX és CTX nevű reszorpciós marker a telopeptidek<br />
amino- és karboxi-terminális degradációs termékei,<br />
szintén a vérszérumból határozzuk meg őket.<br />
Paget kór<br />
Ismeretlen eredetű betegség, ahol az osteoclastok<br />
aktivitása (csontreszorpció) fokozódik és a csontfelépítés<br />
ezt nem tudja kompenzálni. A biokémiai követésnél<br />
a reszorpciós markerek mennyiségi növekedését<br />
tapasztaljuk.<br />
Daganatos csont áttétek<br />
A malignus folyamatok jó részében a daganatra<br />
jellemző tumormarkerek mérése terjedt el. A tumormarker-koncentrációk<br />
növekedése azonban nem<br />
mond semmit a folyamat szöveti lokalizációjáról.<br />
Csontmetasztázisok gyanújakor nagyon hasznos lehet<br />
a csontszövet érintettségének megítélése szempontjából<br />
a reszorpciós markerek követése.<br />
Irodalom<br />
Ali, S. M., Demers, L. M., Leitzel, K. et al.: Baseline serum<br />
NTx levels are prognostic in metastatic breast cancer<br />
patients with bone-only metastasis. Annals of Oncology<br />
15:455–459, 2004.<br />
Srivastava, A. K., Vliet, Elizabeth L., Lewiecki, E. M.<br />
et al.: Clinical Use of Serum and Urine Bone Markers<br />
in the Management of Osteoporosis. Curr. Med. Res.<br />
Opin. 21(7):1015-1026, 2005.<br />
Buckley, K. A., Fraser, W. D.: Receptor activator for nuclear<br />
factor kappaB ligand and osteoprotegerin: regulators<br />
of bone physiology and immune responses/potential<br />
therapeutic agents and biochemical markers. Ann.<br />
Clin. Biochem. 39(6):551–556, 2003.<br />
Czupalla, C., Mansukoski, H., Riedl, T. et al.: Proteomic<br />
Analysis of Lysosomal Acid Hydrolases Secreted by<br />
Osteoclasts. Molecular & Cellular Proteomics 5:134–<br />
143, 2006.<br />
Helmberg, A.: Bone metabolism. http://helmberg.at/bone-metabolism.htm<br />
Heynmann, D., Rousselle, A.-V.: gp 130 Cytokine family<br />
and bone cells. Cytokine 12(10):1455-1468, 2000.
352 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Hill, PA, Orth, M.: Bone remodelling. British Journal of<br />
Orthodontics 25: 101-107, 1998.<br />
Robling, A. G., Castillo, A. B., Turner, C. H.: Biomechanical<br />
and Molecular Regulation of Bone Remodeling.<br />
Annu. Rev. Biomed. Eng. 8:455–498, 2006.<br />
Utility of Bone Markers in Osteoporosis. http://emedicine.<br />
medscape.com/article/128567-overview<br />
Vesper, H., Cosman, F., Endres, D. B. et al: Application of<br />
Biochemical Markers of Bone Turnover in the Assessment<br />
and Monitoring of Bone Diseases; Approved Guideline.<br />
NCCLS document C48-A (ISBN 1-56238-539-<br />
9), NCLLS Pennsylvania USA, 2004.
A metabolikus szindróma és a fehérjék<br />
353<br />
A metabolikus szindróma<br />
és a fehérjék<br />
Wittmann István<br />
A metabolikus szindróma jelentőségét az adja, hogy<br />
a mai magyar és általánosságban a nyugati típusú<br />
életmódot folytató populációkban folyamatosan és<br />
drasztikusan növekvő arányban fordul elő, ill. ezekben<br />
a populációkban a mortalitási statisztikák élén<br />
járó kardiovaszkuláris betegségek legfőbb kockázati<br />
tényezője. Ráadásul újabb adatok alapján úgy tűnik,<br />
hogy a nyugati típusú életmódot folytató népességek<br />
második legjelentősebb haláloka, a rákos halálozás<br />
kialakulásában is szerepet játszhat.<br />
A metabolikus szindróma komponenseinek száma<br />
az utóbbi időben állandó vita tárgya volt. A különböző<br />
kritériumrendszerek eltérő komponenseket soroltak<br />
ide (lásd később). Mégis mindegyikben közös<br />
az anyagcsere-eltérések és a vérnyomás (a hemodinamikai<br />
változások) egy tünetegyüttesben való szerepeltetése.<br />
Sőt a hemodinamika- és az anyagcserezavarok<br />
kapcsolatának megjelölésére számos elnevezés<br />
is született. Bízvást állíthatjuk, hogy egyik elnevezés<br />
sem ideális abból a szempontból, hogy a kockázati<br />
tényezők és következményeik koherens, együttes<br />
megnevezését rövid formában jelenítse meg. A jelenleg<br />
egyre elterjedtebben használt kardiometabolikus<br />
elnevezéssel kapcsolatban több kritika is felvetődött.<br />
Egyrészt ebből az elnevezésből teljesen hiányzik a hypertonia<br />
megjelölése, holott az nagyon fontos komponense<br />
a szindrómának, és ráadásul ez a terápiásan<br />
leginkább befolyásolható. A kardiometabolikus megjelölés<br />
úgy tűnteti fel a szindrómát, mintha a szív- és<br />
anyagcsere-betegségek közös kockázatát jelölné, holott<br />
a szívbetegség kockázatául szolgáló anyagcsere- és<br />
magasvérnyomás-betegséget jelöli. Hozzá kell tenni<br />
ehhez azt is, hogy nem csak a szívbetegség, hanem<br />
minden artériás, macrovascularis betegségnek a kockázati<br />
tényezőit összegzi, azaz fennállása esetén nem<br />
csak az ischaemiás szívbetegséget, hanem a perifériás,<br />
az agyi és egyéb artériás betegséget is keresni,<br />
megelőzni és szükség esetén kezelni kell.<br />
Mi több, az utóbbi időben azt is felismerték, hogy<br />
a nyugati civilizáció egyik legköltségesebb egészségügyi<br />
kezelési eljárásának, a vesepótló kezelésnek az<br />
indokát jelentő végállapotú veseelégtelenség kialakulásában<br />
is meghatározó szerepet játszik a metabolikus<br />
szindróma.<br />
A metabolikus szindróma definíciói<br />
Mint a címből is kitűnik, a metabolikus szindrómának<br />
az utóbbi években számos definíciója született.<br />
Sőt néhány éve magának a szindrómának a létét is<br />
kétségbe vonták. Ezzel kapcsolatban a klinikusok<br />
álláspontja az, hogy a megelőzés és a kezelés szempontjából<br />
a metabolikus szindróma létezésének hipotézisét<br />
szükséges fenntartani, mert legeredményesebb<br />
az együtt jelentkező tünetek egyidejű megelőzése és<br />
kezelése, az ún. holisztikus, teljességre törekvő megközelítés.<br />
Tudományos szempontból a patofiziológiai<br />
megközelítés, amely a metabolikus szindróma középpontjába<br />
az inzulinrezisztenciát állítja, szintén a<br />
szindróma fogalmának megtartása mellett érvel. Az<br />
epidemiológiai szempontú nézetek szerint továbbra<br />
is kétséges a szindróma léte.<br />
A metabolikus szindróma kritériumrendszerei közül<br />
csak a legismertebbek kerülnek bemutatásra. A<br />
legkorábbi a WHO által megadott kritériumrendszer<br />
[13].<br />
A WHO kritériumrendszere:<br />
1. Inzulinrezisztencia, amit a következők valamelyikével<br />
identifikálunk:<br />
• 2-es típusú diabetes mellitus.<br />
• Emelkedett éhomi plazmaglukózszint (IFG).<br />
• Csökkent glukóztolerancia (IGT).<br />
• Pozitivitás hyperinsulinaemiás-euglykaemiás<br />
clamppel.<br />
2. Ezenkívül bármelyik kettő a következőkből:<br />
• Antihipertenzív kezelés és/vagy > 140/90<br />
Hgmm vérnyomás.<br />
• Szérumtriglicerid-szint > 1,7 mmol/l.<br />
• Szérum HDL-koleszterinszint:<br />
- férfi < 0,9 mmol/l;<br />
- nő < 1,0 mmol/l.<br />
• Testtömegindex (BMI) > 30 kg/m 2 és/vagy a<br />
csípő-derék hányados (WHR):<br />
- férfi > 0,9 (ffi);<br />
- nő > 0,85.<br />
• Vizelet-albuminürítés (UAER) > 20 mg/min,<br />
vagy az albumin-kreatinin hányados (ACR) ><br />
30 mg/g kreatinin.
354 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A National Cholesterol Education Program’s Adult<br />
Treatment Panel III Report (ATPIII) szerinti kritériumrendszer<br />
a következőképpen alakul [14]:<br />
1. Abdominalis obesitas; derékkörfogat:<br />
- férfi > 102 cm;<br />
- nő > 88 cm.<br />
2. Ezenkívül bármelyik kettő a következőkből:<br />
• Szérumtriglicerid-szint > 1,7mmol/l.<br />
• Szérum HDL-koleszterin-szint:<br />
- férfi < 1,04mmol/l<br />
- nő < 1,29mmol/l<br />
• Vérnyomás > 130/85 Hgmm.<br />
• Éhomi plazmaglukóz-koncentráció > 6,1<br />
mmol/l.<br />
A Nemzetközi Diabetes Szövetség (IDF) definíciója<br />
[15]:<br />
1. Centralis obesitas, derékkörfogat:<br />
- férfi > 94 cm;<br />
- nő > 80 cm.<br />
2. Ezenkívül bármelyik kettő a következőkből:<br />
• Szérumtriglicerid-szint > 1,7 mmol/l.<br />
• Szérum HDL-koleszterin-szint:<br />
- férfi < 1,03 mmol/l;<br />
- nő < 1,29 mmol/l.<br />
• Vérnyomás > 130/85 Hgmm vagy kezelt hypertonia.<br />
• Éhomi plazmaglukóz-koncentráció > 5,6<br />
mmol/l vagy 2-es típusú diabetes mellitus.<br />
Az IDF legutóbbi, 2009-es definíciós revíziója szerint<br />
az előző kritériumrendszer annyiban módosult, hogy<br />
a centralis obesitas egyenrangúvá vált a többi komponenssel.<br />
Azaz bármely három komponens együttes<br />
jelenléte esetén a metabolikus szindróma diagnózisa<br />
kimondható [16].<br />
A metabolikus szindróma előfordulása<br />
A metabolikus szindróma előfordulási adatai hatalmas<br />
szórást mutatnak az alkalmazott kritériumrendszer<br />
és a vizsgált populáció szerint. Az USA-ban a<br />
National Health and Nutrition Examination Survey<br />
(NHANES) tanulmányban az ATPIII-kritériumrendszerrel<br />
33,9%, a WHO-kritériumok használatával<br />
36,9% volt a metabolikus szindróma előfordulása. Két<br />
másik amerikai tanulmányban (FOS, SAHS) 21-27%<br />
közötti értékeket találtak az ATPIII-kritériumokat alkalmazva.<br />
Két francia tanulmányban (STANISLAS,<br />
DESIR) az ATPIII kritériumrendszerét alkalmazva<br />
6-9% közötti értékek adódtak, jelentős nemi differenciával.<br />
Ráadásul úgy tűnik, hogy az előfordulás<br />
gyakoribbá válik, a NHANS-vizsgálatban 1988-1994<br />
és 1999-2000 között 5,6 mmol/l-es éhomi plazmaglukózt<br />
alapul véve 28-ról 31,9%-ra, 6,1 mmol/l-es<br />
éhomi plazmaglukózt véve 23,1-ről 26,7%-ra nőtt. Mi<br />
több, a legutóbbi, 2009-es IDF-kritériumrendszert alkalmazva<br />
a 20 év feletti populációban 40,1%-osnak<br />
adódott a metabolikus szindróma előfordulási értéke,<br />
férfiak körében 41,9, nők körében 38,3%-kal.<br />
A metabolikus szindróma patogenezise<br />
Az inzulin szerepe<br />
Kétféle megközelítés különíthető el, amelyek a kritériumrendszerekben<br />
is megnyilvánultak. Az egyik szerint<br />
(lásd WHO-kritériumrendszer) a metabolikus<br />
szindróma kialakulásának központi eleme az inzulinrezisztencia,<br />
a másik megközelítés (lásd ATPIII- és<br />
IDF-kritériumrendszer) a zsírsejtek eltéréseit helyezi<br />
a középpontba. Ez utóbbit a szubklinikus gyulladás<br />
során írjuk le részletesen és az inzulinrezisztencia kialakulásának<br />
okát is később tárgyaljuk.<br />
Az inzulinrezisztencia következményeképpen hyperinsulinaemia,<br />
szénhidrát- és zsíranyagcsere-zavar<br />
alakul ki. Érdekes módon az inzulinszekréció két fázisa<br />
– az első vagy korai és a második vagy késői fázisa<br />
- eltérően változik (11-85. ábra) [17].<br />
A kezdetei normoglykaemiás (normális glukóz-tolerancia,<br />
NGT) fázisban általában csak obesitas van,<br />
esetleg nem komplett vagy komplett metabolikus<br />
szindrómával és csökkenő első, ill. emelkedő második<br />
fázisú inzulinszekrécióval. A betegség progreszsziója<br />
során csökkent glukóztolerancia (IGT) alakul<br />
ki, és tovább csökken az első, ill. maximálisra nő a<br />
második fázisú inzulinszekréció. Amikor a második<br />
fázisú inzulinszekréció is csökkenni kezd a pancreas-szigetek<br />
b-sejtjeinek kimerülése miatt, akkor diagnosztizáljuk<br />
a 2-es típusú diabetes mellitust (DM).<br />
Az inzulinszekréció károsodását az is jelzi, hogy az<br />
inzulinrezisztencia előrehaladtával folyamatosan nő a<br />
keringésben a proinzulin/inzulin arány, jelezve, hogy<br />
az inzulinszekréciós granulumokban az inzulin érési
A metabolikus szindróma és a fehérjék<br />
355<br />
11-85. ábra. Az inzulinszekréció első (korai) és második<br />
(késői) fázisának változása a betegség fennállásának előrehaladtával<br />
folyamata is károsodik. Ráadásul az emelkedő vércukorszint<br />
miatt mind nagyobb lesz a működésében<br />
károsodott, nem enzimatikusan glikált inzulin és inzulinreceptor<br />
aránya.<br />
Amennyiben a metabolikus szindrómás betegnek<br />
károsodik a vesefunkciója (említettük, hogy a metabolikus<br />
szindróma a veseelégtelenség leggyakoribb<br />
oka), akkor csökken a kis molekulatömegű fehérjék<br />
eliminációja is. A vesében ugyanis a 65 kDa molekulatömeg<br />
alatti fehérjék szabadon filtrálódnak, majd a<br />
proximalis tubularis sejtek által reabszorpcióra kerülnek.<br />
A reabszorpció után túlnyomó részük a tubularis<br />
sejtekben lebomlik. Így tehát veseelégtelenségben<br />
a csökkenő filtráció miatt megemelkedik az inzulin,<br />
sőt a C-peptid szintje is, ami miatt az inzulinrezisztencia<br />
ezekben a betegekben kevésbé szembetűnő,<br />
ill. kezelésük során a gyógyszerek és az inzulin dózisa<br />
gyakran csökkenthető. A C-peptidről szerkezeti,<br />
fiziológiai, szabályozási információ az interneten olvasható<br />
[18].<br />
Fehérjék az inzulin kivételével<br />
Obesitasban a zsírsejtek által termelt<br />
proteinek<br />
Obesitasban a zsírsejtek extracelluláris mátrixfehérjéket,<br />
anyagcsere, immun hatású és egyéb proteineket<br />
termelnek:<br />
• Extracelluláris mátrixfehérjék: a 2<br />
-makroglobulin,<br />
katepszin B, D, L, S, kollagén a 1<br />
III, IV, VI,<br />
XIV, XV, XVII, kollagén a 2<br />
I, IV, VI, kollagén a 3<br />
VI, disztroglikán, entaktin, fibulin 2, 3, fibronektin,<br />
galektin-3-kötő fehérje, gelzolin, laminin<br />
a 4<br />
, b 1<br />
, g, lizil-oxidáz, matrilin-2, mátrix-metalloproteináz<br />
1-24, szöveti metalloproteáz<br />
inhibitor 1-4, oszteonektin, perlekán, prokollagén<br />
C-proteináz aktiváló protein, protein-lizin-6-oxidáz,<br />
spondin-1, tenacin, trombospondin<br />
1, 2.<br />
• Anyagcsere-hatású termékek: adipszin, adiponektin,<br />
apelin, apo-E, IGF-1, IGF-1-kötő fehérje,<br />
lipoprotein-lipáz, leptin, éhezés indukálta<br />
obesitasfaktor, PAI-1, rezisztin, retinolkötő protein-4,<br />
vaszpin, viszfatin.<br />
• Immunhatású proteinek: a 1<br />
savas glikoprotein,<br />
kolóniastimuláló faktor-1, komplementkomponens-inhibítor<br />
C1, komplement C1, C2, C3, C4,<br />
C7, komplementfaktor B, C és D, CRP, haptoglobin,<br />
interleukin 1-b, interleukin 4, 6, 7, 8, 10,<br />
12, 18, lipokalin 24p3, macrophagmigrációt<br />
gátló faktor-1, monocyta kemoattraktáns protein-1,<br />
szérumamiloid A3, TNF-a.<br />
• Egyéb proteinek: angiopoetin 1, 2, angiotenzinogén,<br />
kalcitonin, kemerin, ciklofilin A, C, extracelluláris<br />
szuperoxid-dizmutáz (SOD), galektin-1,<br />
fibroblastnövekedési faktor, májnövekedési<br />
faktor, aldoszteron-releasing faktor, idegnövekedési<br />
faktor, pigment-epithelium eredetű<br />
faktor, transzferrin, stroma eredetű faktor-1,<br />
transzformáló növekedési faktor-b (TGF-b),<br />
szöveti faktor, vascularis endothelialis növekedési<br />
faktor.<br />
Ezek közül a fehérjék közül a következőkkel foglalkozunk<br />
részletesebben, tekintettel arra, hogy szorosabb<br />
a kapcsolatuk a metabolikus szindrómával: extracelluláris<br />
mátrix fehérjék, tumornekrózis-faktor-a<br />
(TNF-a), interleukin-6 (IL-6), monocyta kemoattraktáns<br />
protein-1 (MCP-1), leptin, adiponektin, rezisztin,<br />
retinolkötő protein-4, viszfatin, aldoszteron-releasing<br />
faktor.<br />
Extracelluláris mátrix fehérjék<br />
Obesitasban a zsírsejtek megváltoztatják az extracelluláris<br />
mátrix összetételét, ami lokális gyulladáshoz<br />
vezet. Ectopiás zsírszövet képződik az erek<br />
és a szív körül, amely károsítja működésüket, talán<br />
éppen citokinek termelése révén is. Ma még nem
356 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
tudjuk, hogy az extracelluláris mátrix megváltozása<br />
oka vagy következménye-e az obesitasban látott eltéréseknek.<br />
TNF-a [19]. Szérumszintjének emelkedése a sejtek<br />
felszínén megtalálható citokinreceptor aktivációján<br />
keresztül intracelluláris oxidatív stresszt indukál. Ennek<br />
mechanizmusa a NADPH-oxidáz enzim aktivációja,<br />
ami fokozott szuperoxid szabadgyöktermelést<br />
indít meg. A szuperoxid szabad gyököt a SOD emzim<br />
diszmutálja hidrogén-peroxiddá, amely gátolja az inzulin<br />
intracelluláris jelátvitelét és ezáltal inzulinrezisztenciát<br />
vált ki. A folyamat pozitív visszacsatolást<br />
idézhet elő azáltal, hogy az intracelluláris oxidatív<br />
stressz az NF-k-B nukleáris receptort aktiválva további<br />
citokin- és citokinreceptor-expressziót indukálhat<br />
és ezzel circulus vitiosus alakulhat ki.<br />
Interleukin-6 (IL-6) [20]. Az inzulinrezisztenciával<br />
való kapcsolata ellentmondásos. Egyesek szerint<br />
az inzulinreceptor-szubsztrát ubikvitin keltette<br />
degradációját okozza a májban és a zsírsejtekben.<br />
A vázizomban azonban fizikai aktivitás során, amikor<br />
az inzulinérzékenység jelentősen javul, drámai<br />
IL-6-emelkedést írtak le.<br />
Monocyta kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) [21].A<br />
zsírsejtek által termelt MCP-1 kemotaktikus hatású<br />
a macrophagokra. A zsírszövet macrophaginfiltrációja<br />
fontos szerepet játszik a szubklinikus gyulladás<br />
kialakulásában, amely nagy jelentőségű az inzulinrezisztencia<br />
létrejöttében (nem kis részben szerepe van<br />
ebben a macrophagok által termelt citokineknek, lásd<br />
a TNF-a-nál).<br />
Leptin [22].Elnevezése a görög leptosz (sovány) szóból<br />
ered. Ez a 167 aminosavból álló hormon elsősorban<br />
a zsírsejtekben termelődik, és az étvágyat, valamint<br />
az energi-felhasználást szabályozza. Túltáplálás<br />
hatására termelése nő, éhezéskor csökken. Receptora<br />
a citokinreceptor-családba tartozik, jelátvitelében<br />
szerepel az inzulinreceptor-szubsztrát is. Növeli a citokintermelést<br />
és ezáltal is befolyásolja a szubklinikai<br />
gyulladást. Fölvetődött a leptinkezelés lehetősége<br />
obes, metabolikus szindrómás betegek esetében, a kezelés<br />
azonban hatástalannak bizonyult, mert leptinrezisztencia<br />
alakult ki a betegekben. A legmagasabb<br />
leptinszinteket szérumban metabolikus szindrómás,<br />
uraemiás betegekben lehet mérni, ennek szerepe lehet<br />
az uraemiás fogyás kialakulásában.<br />
Adiponektin [23]. Ezt a 30 kDa-os molekulatömegű<br />
proteint is a zsírsejtek termelik; szérumszintje inzulinrezisztenciában<br />
csökken. Polimer formában van<br />
jelen a keringésben, oligomer (trimer, hexamer) és<br />
polimer (18-szoros) formája is előfordul. Inzulinérzékenységet<br />
javító formája nagymértékű polimerizációs<br />
fokot mutat. Ubikviter két receptorán (AdipoR1<br />
és AdipoR2) keresztül fejti ki hatását, amely többek<br />
között az AMP-kinázon (AMPK) keresztül jön létre.<br />
Rezisztin [24]. Ez a 12 kDa molekulatömegű, homodimerként<br />
szekretálódó fehérjehormon zsírsejtekben<br />
és macrophagokban is expresszálódik. Kimutatták<br />
kapcsolatát az inzulinrezisztenciával, gátolja az inzulin<br />
kiváltotta glukóz- és zsírsavfelvételt. Úgy tűnik,<br />
hogy szoros, de ellentmondásos kapcsolatban áll a<br />
gyulladásos folyamatokkal. Lipopoliszaharid (LPS)<br />
növeli a rezisztin termelődését, és a rezisztin hatására<br />
emelkedik a TNF-a-képződés. Ugyanakkor néhány<br />
sejtkísérletben ezeket az eredményeket nem sikerült<br />
megerősíteni és humán epidemiológiai vizsgálatokban<br />
az egyéb adipokinre való korrigálás után a rezisztin<br />
inzulinrezisztenciára kifejtett hatása kismértékűnek<br />
tűnt.<br />
Retinolkötő protein-4 [25]. Overexpressziója során<br />
inzulinrezisztenciát írtak le, sőt a szérumszintje<br />
összefüggést mutatott a metabolikus szindróma<br />
komponenseivel, az obesitassal, a magas<br />
systolés vérnyomással, a szérumtriglicerid-szinttel<br />
és a HDL-koleszterin-koncentrációval. Szoros inverz<br />
korrelációt találtak a zsírszöveti GLUT-4 (az inzulinfüggő<br />
glukóztranszporter) expressziójával. Mivel a<br />
retinolkötő protein-4 az A-vitamin transzportere, a<br />
továbbiakban szükség lesz annak megvizsgálására,<br />
hogy van-e összefüggés az A-vitamin metabolizmusa<br />
és a metabolikus szindróma között.<br />
Viszfatin [26]. A zsírsejtekben és a macrophagokban<br />
termelődő adipokin. Korai B-sejt-növekedési faktorként<br />
ismerték meg először, és csak később derült ki,<br />
hogy hat a szénhidrát-anyagcserére is. Számos gyulladásos<br />
folyamatot befolyásol, ezért úgy tekinthetünk<br />
rá, mint primeren gyulladásos mediátorra. A vércukorszintet<br />
csökkenti, az inzulinrezisztenciát mérsék-
A metabolikus szindróma és a fehérjék<br />
357<br />
li. Ezt a hatását azzal éri el, hogy növeli az IRS-1 és<br />
az IRS-2 tirozin-foszforiláltságát és aktiválja az Akt-t.<br />
Érdekes módon a viszfatin kötődik az inzulinreceptorhoz,<br />
de más pozícióban, mint az inzulin. Szérumszintje<br />
nem változik az étkezéssel párhuzamosan, és<br />
koncentrációja csak mintegy tizede az inzulinénak.<br />
Aldoszteron-releasing faktor [27]. A 2003-ban közölt<br />
adatok arra utalnak, hogy a zsírsejtek termelnek egy<br />
speciális fehérje természetű hormont, amely a mellékveséből<br />
aldoszteronszekréciót indukál. Az aldoszteron<br />
pedig intracellulárisan oxidatív stresszt kelt,<br />
gátolja az inzulinreceptor-szubsztrát tirozinjának<br />
foszforilálását és serkenti a szerin foszforilálását. Ez<br />
csökkenti az inzulin-jelátvitelt (a részleteket lásd még<br />
később).<br />
Az endoplazmatikus retikulum stressz<br />
Az endoplazmatikus retikulum az a sejtorganellum,<br />
amely a fehérjék szintézisét végzi. Fokozott fehérjeszintézis<br />
esetén az endoplazmatikus retikulum<br />
nem tud megbirkózni a feladattal és károsodik működése,<br />
ilyenkor endoplazmatikus retikulum stresszről<br />
beszélünk. Következménye, hogy a fehérjék „folding”-ja<br />
nem történik megfelelően, és a fehérjék az<br />
endoplazmatikus retikulumban akkumulálódnak.<br />
Ennek hatására a sejt speciális folyamatokat indít<br />
be (unfolded protein response, UPR), amelyek eredménye<br />
citokintermelés és gyulladás lesz. Az endoplazmatikus<br />
retikulum stressz során az inzulinreceptor-szubsztrát<br />
szerin-foszforilációja alakul ki, amely<br />
önmagában inzulinrezisztenciát kelt.<br />
Egyéb hormonok<br />
Sok hormon esetében igazoltak inzulinrezisztenciát<br />
okozó hatást. Közismert a glukokortikoidok, a pajzsmirigyhormonok,<br />
a növekedési hormon (IGF-1), a<br />
sympathicus idegrendszer jelátvivőinek és a glukagonnak<br />
a kontrainzuláris hatása.<br />
Gastrointestinalis hormonok<br />
Ghrelin [28]. A ghrelin génnek 3 terméke ismert:<br />
az acil-ghrelin, a dezacil-ghrelin és az obesztatin. Az<br />
acil-ghrelin 28, a dezacil-ghrelin 27, az obesztatin 23<br />
aminosavból áll, és a preproghrelinből proghrelinen<br />
keresztül képződnek. Az acil-ghrelin (GHS-R1a és<br />
GHS-R1b) és a dezacil-ghrelin (GHS-Rx) receptora<br />
ismert, de az obesztatiné nem. Az acil-ghrelin a gyomor<br />
X/A sejtjeiben képződik, növeli a gastrointestinalis<br />
traktus motilitást, képes átlépni a vér-agy gáton<br />
és fokozza az étvágyat, de az obesztatin nem képes<br />
passzálni a vér-agy gátat. Az acil-ghrelin csökkenti<br />
az inzulinszekréciót és az inzulinérzékenységet. Ezzel<br />
szemben a dezacil-ghrelin növeli az inzulinszekréciót<br />
és javítja az inzulinérzékenységet. Ezek alapján úgy<br />
tűnik, hogy az acil- és dezacil-ghrelin aránya fontos<br />
lehet az inzulinérzékenység szempontjából és a dezacil-ghrelinnek<br />
talán terápiás szerepe is lehet a metabolikus<br />
szindrómában. Ezirányú további vizsgálatok<br />
szükségesek.<br />
Inkretinek [29]. Hagyományosan két hormont szokás<br />
itt megemlíteni, amelyek a metabolikus szindróma<br />
szempontjából fontosak lehetnek: a glukagonszerű<br />
peptid-1-et (GLP-1) és a glukózdependens inzulinotrop<br />
peptidet (GIP). Az inzulinrezisztenciával járó 2-es típusú<br />
diabetes mellitus kezelésében mind szélesebb<br />
körben alkalmazott ún. inkretinkezelés ezek befolyásolásán<br />
vagy hatásuk imitálásán keresztül valósul<br />
meg. A GLP-1 az ileum és a vastagbél L-, a GIP a duodénum<br />
K-sejtjeiben termelődik. Mindkettő glukózszintfüggően<br />
stimulálja az inzulinszekréciót, elsősorban<br />
a korai (első) fázist. Ez a hatásuk a nervus vagus<br />
afferentációjának befolyásolásán keresztül valósul<br />
meg. A GLP-1 gátolja a gyomorürülést, csökkenti a<br />
táplálékfelvételt és így a testsúlyt is, gátolja a glukagonszekréciót,<br />
de mindezekre a GIP nincs hatással.<br />
A GLP-1 és a GIP lebontását végző enzim, a dipeptidil-peptidáz-4<br />
(DPP-4) percek alatt hatástalanítja<br />
ezeket a hormonokat. A DPP-4 enzim gátlók nagy<br />
számban kerültek forgalomba az utóbbi években az<br />
obes, 2-es típusú cukorbetegek kezelésére. GLP-1-mimetikus<br />
hatással rendelkező, a DPP-4-inaktivációra<br />
rezisztens készítmények is elérhetők, amelyeknek<br />
testsúlycsökkentő hatásuk van.<br />
Az inzulin intracelluláris jelátvitelében<br />
szerepet játszó proteinek és működésük<br />
károsodása metabolikus szindrómában<br />
Az inzulin intracelluláris jelátvitelére egy olyan fehérjefoszforilációs<br />
kaszkádrendszer jellemző, amely<br />
az inzulinjelet döntően négy irányba továbbítja (11-<br />
86. ábra).
358 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
11-86. ábra. Az inzulin intracelluláris jelátvitelének sematikus<br />
ábrázolása<br />
A folyamat részletei az interneten megtalálhatók:<br />
Inzulin-jelátvitel, vasodilatatio, AKT, eNOS [30],<br />
[31].<br />
Inzulin, sejtosztódás, MAPK-rendszer [32], [33].<br />
Szabad gyökök, inzulin, inzulinrezisztencia, jelátvitel<br />
[34], [35], [36] [37].<br />
Az anyagcsere- és a vasodilatatiós hatás kialakulásában<br />
egyrészt az Akt (protein-kináz B) útvonal játszik<br />
döntő szerepet. Ebben a foszforilációs rendszerben<br />
ugyan fontos szerepe van az Akt-nak, de annak csak<br />
egy eleme, hiszen előtte az inzulinreceptor-szubsztrátok<br />
(IRS, 1-4 izoenzim), a PI-3 kináz, a PDK (foszfoinozitiddependens<br />
protein-kináz) és utána is számos<br />
kináz játszik abban szerepet, hogy kialakuljon<br />
az inzulin anyagcserehatása. Ez által transzlokálódik<br />
a glukóz izomra és zsírszövetre jellemző inzulinfüggő<br />
transzportere, a GLUT-4 (glukóztranszporter-4) az<br />
intracelluláris kompartmentből a plazmamembránba,<br />
aminek segítségével bejuthat a glukóz a sejtekbe.<br />
Másrészt viszont az Akt közvetlen módon foszforilálja<br />
az aktiválóhelyen az endotheliális nitrogén-monoxid-szintáz<br />
(eNOS) enzimet és ez által vasodilatatiót<br />
okoz.<br />
Harmadrészt a mitogén aktiválta protein-kináz<br />
(MAPK) rendszeren keresztül sejtproliferációt, differenciációt,<br />
valamint endotelinszekréciót vált ki. Az<br />
endotelin-1 pedig vasoconstrictor hatású.<br />
Az inzulin tehát egyszerre hat az anyagcserére és<br />
a hemodinamikára (a vérnyomásra), azaz megadja a<br />
metabolikus szindróma anyagcsere-eltéréseinek és a<br />
vérnyomás emelkedésének a közös kulcsát.<br />
Metabolikus szindrómában inzulinrezisztencia<br />
van, amely azonban több szempontból is szelektív.<br />
Egyrészt szervszelektív, azaz a vesében az inzulin<br />
nátriumot retineáló hatása megtartott marad, így a<br />
hyperinsulinaemia nem képes kompenzálni az inzulinrezisztencia<br />
miatt kiesett anyagcserehatást, de a vesében<br />
a fokozott nátriumretenció miatt folyadék-viszszatartáshoz<br />
és vérnyomás-emelkedéshez vezet.<br />
Másrészt pedig szelektív az inzulinrezisztencia olyan<br />
szempontból is, hogy míg az Akt-útvonal nem működik<br />
jól, addig a MAPK-útvonalon normális a jelátvitel.<br />
Ennek az utóbbinak az a következménye, hogy<br />
a második fázisú fokozott inzulinszekréció hatására<br />
létrejövő hyperinsulinaemia fokozott mitogén hatása<br />
következtében az érfali simaizomban sejtproliferáció<br />
alakul ki, amely az atherosclerosis korai jellegzetessége.<br />
Sőt újabban ennek a fokozott MAPK-hatásnak<br />
szerepet tulajdonítanak a metabolikus szindrómában<br />
jelentkező megnövekedett tumorkockázatnak is.<br />
Végül az inzulinrezisztenciában az inzulin intracelluláris<br />
jelátvitelének megtartott MAPK-útvonala<br />
az említett módon az endotelin-1 fokozott termeléséhez<br />
és felszabadulásához vezet, ami ellensúlyozza az<br />
inzulin-eNOS-nitrogén-monoxid útvonal vasodilatatiós<br />
hatását, sőt vasoconstrictiót okoz, amely vérnyomás-emelkedéshez<br />
vezet.<br />
Felvetődik a kérdés, hogy mi okozza az inzulin-jelátvitelnek<br />
ezt a szelektív károsodását. A korrekt válasz<br />
erre a kérdésre az, hogy ma még nem tudjuk<br />
pontosan. Néhány újabb bíztató eredmény szerint<br />
szerepe lehet ebben a jelátviteli fehérjék nem enzimatikus<br />
glikációjának, valamint az enzimatikus O-glikozilációnak.<br />
Ugyancsak szerepet játszhat a folyamatban a fehérjék<br />
redoxregulációja. Ismert ugyanis, hogy az inzulin<br />
jelátvitelében fontos szerepe van a hidrogén-peroxidnak,<br />
amely az inzulin hatására részben a NADPH-oxidáz,<br />
részben a szétkapcsolt eNOS aktiválása révén<br />
termelődik. Az eNOS szétkapcsolódásának számos<br />
oka lehet metabolikus szindrómában, pl. az eNOS<br />
glutationilációja révén is. A hidrogén-peroxid az<br />
adenozin-monofoszfát-kináz (AMPK) aktivációján<br />
keresztül befolyásolja az inzulin anyagcserehatását,<br />
valamint az extracelluláris receptor-kináz (ERK) aktiváló<br />
foszforilációját bontó foszfatáz enzim SH-csoportjának<br />
oxidálása révén is. A foszfatázt inaktiválva<br />
az ERK foszforilációját és így aktivitását is stabilizálja.<br />
Ez utóbbi a MAPK-útvonal aktiválódásában, sejtproliferációban<br />
és vasaconstrictióban jelenik meg. Azt is<br />
kimutatták, hogy a hidrogén-peroxid akut hatása az<br />
inzulin anyagcserehatásának növekedéséhez, króni-
A metabolikus szindróma és a fehérjék<br />
359<br />
kus hatása annak csökkenéséhez vezet, valószínűleg<br />
az IRS-1 foszforilációjának megváltoztatása révén.<br />
Tovább bonyolítja a képet, hogy az Akt és a<br />
MAPK-rendszer között intracellulárisan egy ultrarövid<br />
visszajelzéses rendszer is működik, amely az<br />
mTOR-IRS (mammalian target of rapamycin, az Akt<br />
útvonal egyik effektora) és az ERK-IRS vonatkozásában<br />
valósulhat meg, így az inzulin-jelátviteli utak<br />
egymás aktivitását is szabályozzák.<br />
*<br />
Összefoglalás. A metabolikus szindrómára úgy kell<br />
tekintenünk, mint korunk legjelentősebb egészségügyi<br />
kihívására. A fehérjék szintjén az extracelluláris<br />
mátrix proteinektől a hormonokon és a citokineken<br />
át az intracelluláris foszforilációs kaszkádban részt<br />
vevő proteinekig számtalan közreműködő identifikálható<br />
a tünetegyüttes kialakulásában.<br />
Irodalom<br />
[1] Alberti, K. G., Eckel, R. H., Grundy, S. M. et al.:<br />
International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology<br />
and Prevention; Hational Heart, Lung, and<br />
Blood Institute; American Heart Association; World<br />
Heart Federation; International Atherosclerosis Society;<br />
International Association for the Study of Obesity.<br />
Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim<br />
statement of the International Diabetes Federation Task<br />
Force on Epidemiology and Prevention; National Heart,<br />
Lung, and Blood Institute; American Heart Association;<br />
World Heart Federation; International Atherosclerosis<br />
Society; and International Association for the Study of<br />
Obesity. Circulation 120(16):1640-1645, 2009.<br />
[2] Antuna-Puente, B., Feve, B., Fellahi, S. et al. Adipokines:<br />
the missing link between insulin resistance<br />
and obesity. Diabetes Metab. 34(1):2-11, 2008.<br />
[3] Chen, C. Y., Asakawa, A, Fujimiya, M. et al.: Ghrelin<br />
gene products and the regulation of food intake and gut<br />
motility. Pharmacol. Rev. 61(4): 430-481, 2009.<br />
[4] Giles, W. H.: A comparison of the prevalence of the<br />
metabolic syndrome using two proposed definitions.<br />
Diabetes Care 26(3): 575-581, 2003.<br />
[5] Ford, E. S., Giles, W. H., Mokdad, H.: Increasing prevalence<br />
of the metabolic syndrome among U.S. adults.<br />
Diabetes Care 27(10): 2444-2449, 2004.<br />
[6] Graham, T. E., Yang, Q., Blüher, M. et al.: Retinol-binding<br />
protein 4 and insulin resistance in lean, obese, and<br />
diabetic subjects. N. Engl. J. Med. 354(24):2552-2563,<br />
2006.<br />
[7] Halberg, N., Wernstedt-Asterhol, I., Scherer, P.<br />
E.: The adipocyte as an endocrine cell. Endocrinol. Metab.<br />
Clin. North Am. 37(3):753-768, 2008.<br />
[8] Maumus, S., Marie, B., Siest, G. et al.: A prospective<br />
study on the prevalence of metabolic syndrome among<br />
healthy french families: two cardiovascular risk factors<br />
(HDL cholesterol and tumor necrosis factor-alpha)<br />
are revealed in the offspring of parents with metabolic<br />
syndrome. Diabetes Care 28(3):675-682, 2005.<br />
[9] Pang, S. S., Le, Y. Y.: Role of resistin in inflammation<br />
and inflammation-related diseases. Cell Mol. Immunol.<br />
3(1):29-34, 2006.<br />
[10] Rabe, K., Lehrke, M., Parhofer, K. G. et al.: Adipokines<br />
and insulin resistance. Mol. Med. 14(11-12):<br />
741-751, 2008.<br />
[11] Rasouli, N., Kern, P. A.: Adipocytokines and the<br />
metabolic complications of obesity. J. Clin. Endocrinol.<br />
Metab. 93(11. Suppl. 1.):S64–S73, 2008.<br />
[12] Vachharajani, V., Granger, D. N.: Adipose tissue:<br />
A motor for the inflammation associated with obesity.<br />
IUBMB Life 61(4):424–430, 2009.<br />
[13] http://whqlibdoc.who.int/hq/1999/WHO_NCD_NCS_<br />
99.2.pdf<br />
[14] http://circ.ahajournals.org/cgi/reprint/109/3/433<br />
[15] (http://www.idf.org/webdata/docs/MetS_def_update2006.pdf<br />
[16] http://circ.ahajournals.org/cgi/content/abstract/120/<br />
16/1640?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RE-<br />
SULTFORMAT=&fulltext=metabolic+syndrome+joint+statement&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT<br />
(metabolikus szindróma 2009. évi<br />
definíciója)<br />
[17] http://en.wikipedia.org/wiki/Insulin<br />
[18] http://en.wikipedia.org/wiki/C-peptide<br />
[19] http://en.wikipedia.org/wiki/Tumor_necrosis_factoralpha<br />
[20] http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_6<br />
[21] http://www.scitopics.com/Monocyte_chemoattractant_protein_1.html<br />
[22] http://en.wikipedia.org/wiki/Leptin<br />
[23] http://en.wikipedia.org/wiki/Adiponectin<br />
[24] http://en.wikipedia.org/wiki/Resistin<br />
[25] http://en.wikipedia.org/wiki/Retinol_binding_protein_4<br />
[26] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18691043<br />
[27] http://www.pnas.org/content/100/24/14211.long<br />
[28] http://en.wikipedia.org/wiki/Ghrelin<br />
[29] http://www.glucagon.com/pdfs/CellMetabolism2006.<br />
pdf<br />
[30] http://edrv.endojournals.org/cgi/content/full/28/5/463<br />
[31] http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/101/13/1539<br />
[32] http://endo.endojournals.org/cgi/content/full/141/3/922<br />
[33] http://erc.endocrinology-journals.org/cgi/content/full/<br />
16/2/429
360 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
[34] http://www.sciencedirect.com/science?_ob=Article-<br />
URL&_udi=B6T38-51P9YB8-2&_user=10&_coverDate=12%2F13%2F2010&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&-<br />
view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVer-<br />
sion=0&_userid=10&md5=4ef2847708edb8103de1-<br />
fe3224d3dc86&searchtype=a<br />
[35] http://hyper.ahajournals.org/cgi/content/abstract/50/<br />
2/384<br />
[36] http://www.medscape.com/viewarticle/448389_3<br />
[37] http://edrv.endojournals.org/cgi/content/short/23/5/599
A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában<br />
361<br />
A proteomika kutatási<br />
eredményei a jelen és a jövő<br />
klinikai laboratóriumában<br />
Márk László<br />
A patológiás körülményekre jellemző molekuláris folyamatok<br />
diagnosztikája során a legváltozatosabb típusú<br />
és koncentrációjú biomolekulák, többek között<br />
proteinek, peptidek, hormonok, gyógyszermetabolitok<br />
megbízható minőségi és mennyiségi vizsgálatát<br />
igényli. Ennek a kihívásnak megfelelően a klinikai laboratóriumok<br />
a leg<strong>modern</strong>ebb analitikai módszerekkel<br />
vértezik fel magukat, ebben az eszköztárban többek<br />
között megtalálható a gáz- és folyadékkromatográfiával<br />
kapcsolt tandem tömegspektrometria is. A különböző<br />
polaritású és szerkezetű biomarkerek vizsgálata<br />
során szinte az összes ionforrás- és analizátortípust<br />
alkalmazzák, de a legelterjedtebbek az elektrospray<br />
és a lézerdeszorpciós ionizáción alapuló, valamint a<br />
kvadrupól, ioncsapdás és repülési idő analizátorral, ill.<br />
ezek kombinációjával ellátot készülékek. A jelenlegi<br />
gyakorlatban a tömegspektrometriát elsősorban a kis<br />
molekulatömegű vegyületek meghatározására használják,<br />
így nagy jelentősége van az újszülöttkori szűrés,<br />
az endokrin betegségek diagnosztikája, a toxikológia<br />
és a farmakológia területén. A biopolimerek, elsősorban<br />
peptidek, polipeptidek és fehérjék tömegspektrometriára<br />
épülő diagnosztikus vizsgálata teljesen új és<br />
rendkívül perspektívikus irányt képvisel a laboratóriumi<br />
medicina területén. Segítségével nem csupán a<br />
vegyületek mennyiségi vizsgálatát lehet elvégezni, de<br />
egyaránt megvalósítható a potenciális biomarkerek<br />
szekvenciájának, poszttranszlációs kémiai módosításainak<br />
és metabolitjainak vizsgálata.<br />
A tömegspektrometria alkalmazása a proteomikában<br />
A proteomika napjaink egyik legdinamikusabban<br />
fejlődő tudományága, amely az elmúlt évtizedekben<br />
mind módszertanát, mind bioinformatikai hátterét tekintve<br />
forradalmi változásokon ment keresztül. A proteomika<br />
kifejezést először 1995-ben kezdték el használni<br />
egy sejt, szövet vagy szerv összes fehérjéjének<br />
kvalitatív és kvantitatív meghatározására. A proteom<br />
a genom által kifejezett teljes fehérjeállományt jelenti,<br />
így e fogalom az élő szervezetben előforduló összes,<br />
szerkezetében akár a legkisebb mértékben eltérő fehérje<br />
megismerésével foglalkozó tudományterület, amely<br />
a genommal kapcsolatos kutatás kiegészítőjeként jött<br />
létre. Mára már önálló területté nőtte ki magát a tudományos<br />
köztudatban. Jelentőségét az is nagyon jól<br />
bizonyítja, hogy a proteomikai vizsgálatok a korszerű<br />
gyógyszerkutatás és az orvostudomány továbbfejlesztésében,<br />
ill. a mainál hatékonyabb diagnosztikai eljárások<br />
és terápiás szerek kifejlesztésében elengedhetetlenné<br />
vált. A proteomika kutatási területébe tartozik<br />
az egyes fehérjék eredetének felderítése, rendszertani<br />
besorolása, a különböző forrásból származó, de azonos<br />
biológiai funkciót ellátó proteinek szerkezetének<br />
és lokalizációjának meghatározása, jelenlétének vagy<br />
hiányának igazolása. A <strong>modern</strong> fehérjeanalitikai eljárások<br />
segítségével lehetővé vált a komplex biológiai<br />
rendszerek teljes proteomjának akár szubfemtomol<br />
tartományban végzendő kvalitatív és kvantitatív vizsgálata.<br />
A tömegspektrometriás eljárások nagy érzékenységüknek,<br />
rendkívüli specifikusságuknak, széles<br />
koncentrációtartományon belüli alkalmazhatóságuknak,<br />
reprodukálhatóságuknak, ill. automatizálhatóságuknak<br />
köszönhetően kiválóan alkalmazhatóak a klinikai<br />
diagnosztikában. Az MS - a jelenleg általánosan<br />
alkalmazott rutin-diagnosztikai eljárásokkal szemben<br />
- olyan dinamikus analitikai szemléletmódot tesz lehetővé,<br />
amely egyedülálló lehetőségeket nyújt többek<br />
között a diagnosztikai jelentőségű biomarkerek kimutatása,<br />
a lipidomika, ill. a metabolomika területén.<br />
Segítségével lehetőségünk van a már jól bevált és pontosan<br />
validált diagnosztikai biomarkereken túl azok<br />
analógjainak, izoformáinak, metabolitjainak és molekuláris<br />
kölcsönhatásainak vizsgálatára, ill. új diagnosztikus<br />
jelentőségű biomolekulák kimutatására. A<br />
tömegspektrometria további előnye, hogy az archivált<br />
tömegspektrumok kiértékelése és statisztikai elemzése<br />
bármikor megismételhető, így a jövőben olyan paraméterek<br />
és komponensek is elemezhetővé válnak,<br />
amelyek patológiás és diagnosztikai szerepe a vizsgálatok<br />
lefolytatásakor még nem ismert.<br />
A tömegspektrometria igen gyors és hatékony<br />
diagnosztikai módszer lehet a fertőző humán patogének<br />
kimutatására. Különböző intakt mikroorganizmusok,<br />
mint baktériumok, vírusok és gombák<br />
kimutatására elsősorban a MALDI TOF tömegspektrometriát<br />
alkalmazzák, amelynek többek között<br />
rendkívüli előnye nagy mintaáteresztő képessége és<br />
egyszerű mintaelőkészítési igénye, valamint az, hogy
362 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
széles tömegtartományban (kb. 50 Da-tól 500 000<br />
Da-ig) alkalmazható. A módszert hatékonyan alkalmazzák<br />
olyan tömegesen előforduló fertőzések esetében,<br />
mint pl. a HIV, a mikobakteriális fertőzések és<br />
a malária, de nem csupán a kórokozók kimutatása<br />
végezhető el a MALDI TOF MS segítségével, hanem<br />
meghatározható az új multidrogrezisztens patogének<br />
jelenléte és kialakulása egyaránt. A humán patogének<br />
proteomjának meghatározása alkalmas fajspecifikus<br />
diagnózis felállítására, amelyet kiválóan kiegészít a<br />
kórokozókra jellemző kisebb molekulatömegű komponensek,<br />
pl. mycobacterium esetében a sejtmembránt<br />
felépítő specifikus mikolsavak azonosítása.<br />
Rendívül perspektivikus alkalmazási terület a vírusfertőzések<br />
(HIV, HBV, HCV, HPV stb.) során a fertőzött<br />
sejten belül tapasztalható proteomikai változások<br />
tömegspektrometriás vizsgálata, amelyre 2D-PAGE<br />
gélelektroforézist, MALDI TOF MS-t, folyadékkromatográfiával<br />
kapcsolt tandem tömegspektrometriát,<br />
SELDI proteinchipet és proteinmikroarray technikákat<br />
lehet alkalmazni. A gazdasejt expressziós proteomikai<br />
elemzésén kívül diagnosztikai szempontból<br />
jelentős lehet a gazdaszervezet immunválaszára<br />
jellemző biopolimerek, biomarkerek kimutatása és a<br />
fertőző patogén proteomjának és annak módosulásainak<br />
evolúciós vizsgálata.<br />
Az újszülöttkori szűrések esetében a tömegspektrometria<br />
jól bevált, hatékony diagnosztikai módszer,<br />
azonban főként a különböző lipidek és egyéb kis molekulatömegű<br />
biomarkerek (pl. aminosavak) kimutatására<br />
használják. Viszonylag kevés az olyan applikáció,<br />
amelyben diagnosztikai jelentőségű peptidek és<br />
fehérjék kimutatását végzik el. Ezek közül az egyik<br />
legjelentősebb a hypophysis adenilát-cikláz-aktiváló<br />
polipeptidje (PACAP) jelenlétének, lokalizációjának<br />
és koncentrációjának vizsgálata.<br />
A tömegspektrometriára épülő peptidomika és<br />
proteomika egyik legnagyobb felhasználási területe<br />
az onkológia. A belignus és malignus elváltozások<br />
korai fázisban végzett kimutatása és differenciálása,<br />
valamint a gyógyszeres és sugárterápia nyomon követése<br />
egyaránt elvégezhető a <strong>modern</strong> tömegspektrometria<br />
segítségével. Számos olyan vizsgálat látott<br />
napvilágot, amelyekben különböző testfolyadékok<br />
(vér, szérum, vizelet, nyál stb.) proteomikai vizsgálatát<br />
végezték el tumorokra jellemző, korai fázisban<br />
is kimutatható biomarkerek keresése céljából. Többek<br />
között ilyen potenciális tumorbiomarker lehet az<br />
annexin 1 és 2, valamint a peroxiredoxin-2, amelyek<br />
hatékonyan mutathatók ki nem invazív módon pl. a<br />
betegek nyálából is.<br />
A központi idegrendszerben igen kis mennyiségben<br />
előforduló neuropeptidek és proteinek nagyhatékonyságú<br />
vizsgálata az egyik legfontosabb alkalmazási területe<br />
a tandem tömegspektrometriának. Ennek kiváló<br />
példája a már említett PACAP MALDI TOF és ESI tömegspektrometriás<br />
vizsgálata (11-87. ábra). A PACAP<br />
legnagyobb mennyiségben a központi és a perifériás<br />
idegrendszerben fordul elő, de kimutatható más szövetekben<br />
is, ilyenek pl. az endokrin mirigyek, az ivarszervek,<br />
a gastrointestinalis traktus teljes hossza és a<br />
cardiovascularis rendszer. A PACAP számos endokrin<br />
hatása ismert (pl. a pajzsmirigy, a gonadalis szteroidogenezis,<br />
a spermiogenezis és az ovarialis follicularis fejlődés<br />
befolyásolása, a pancreas inzulintermelésének és<br />
a mellékvese katekolaminszintézisének stimulációja és<br />
a memóriafolyamatok serkentése). Központi szerepet<br />
játszik a ritmusszabályozásokban (pl. alvásszabályozás,<br />
hőszabályozás). Részt vesz a húgyúti szervek vizeletürítési<br />
reflexében, a simaizom reflexáns hatásában és<br />
a stresszadaptációs magatartás szabályozásában. A<br />
PACAP-nál beszélnünk kell neurotrofikus és neuroprotektív<br />
hatásról is. A PACAP különböző jelátviteli<br />
utakon keresztül fejti ki antiapoptotikus, protektív hatásait,<br />
amelyek egymással szorosan konvergálnak. A<br />
citoprotektív hatásokért, majdnem minden esetben<br />
a PAC1-receptor felelős, de a hatások közvetítésében<br />
a VPAC is szerepet játszik. E vegyület neuroprotektív<br />
hatásával szorosan összefügg az idegrendszer fejlődésében<br />
betöltött szerepe. A PACAP és receptorai már<br />
igen korán megjelennek az új idegrendszerben, és<br />
szerteágazó hatásaik vannak a neurogenezisre, a neuronalis<br />
differenciációra, az idegrendszeri mintázat kialakítására<br />
és a gliasejtek fejlődésére.<br />
Napjaink egyik legígéretesebb peptid és protein<br />
biomarker diagnosztikai alkalmazása a MALDI TOF/<br />
TOF tömegspektrometriára épülő képalkotó módszer<br />
(MALDI Imaging), amelynek során egy speciális<br />
mintatartóra 10-20 mikronos szövettani metszetet<br />
és mátixot szárítunk. Ezt követően a mintáról előre<br />
meghatározott szisztémában és lézerintenzitással<br />
több ezer tömegspektrumot veszünk fel, ezeket a<br />
megfelelő szoftver az egyes m/z értékekhez tartozó<br />
intenzitások eloszlását képeként jeleníti meg. A módszer<br />
óriási előnye, hogy párhuzamosan alkalmazható<br />
az egyéb (in vivo fluoreszcens, NMR, MRI, CT, FT
A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában<br />
363<br />
IR) képalkotási módszerekkel, így olyan új tudományos<br />
és diagnosztikai eredményeket szolgáltathat,<br />
amelyek forradalmasítják a klinikai diagsztika mai<br />
módszertanát.<br />
A tömegspektrometria a közeljövőben a <strong>modern</strong><br />
diagnosztikai laboratóriumok egyik leghatékonyabb,<br />
kulcsfontosságú költségkímélő eszköze lesz. Specificitása,<br />
érzékenysége, kitűnő automatizálhatósága és<br />
széles spektrumú alkalmazhatósága révén forradalmasíthatja<br />
az egyes betegségek és kórokozók kimutatásának<br />
technológiáját.<br />
Irodalom<br />
Gross, J. H.: Mass Spectrometry: A Textbook. Springer,<br />
Heidelberg, 2004.<br />
Lipton, M. S., Pasa-Tolic, L.: Mass Spectrometry of Proteins<br />
and Peptides. Humana Press, New York, 2009.<br />
Talián Cs. G., Márk L., Melegh B.: Tömegspektrometria.<br />
In: Debreczeni L., Kovács L.G. (szerk.): Gyakorlati<br />
Laboratóriumi Medicina. 477–492. old. Literatura Medicina<br />
Kiadó, Budapest, 2008.<br />
Vékey, K., Telekes, A., Vértes, A. (eds): Medical Applications<br />
of Mass Spectrometry. Elsevier, Amsterdam, 2008.<br />
11-87. ábra. A PACAP jelenlétének tömegspektrometriás igazolása:<br />
a, b) PACAP standard<br />
c, d) Humán szérum<br />
e, f) Anyatej
364 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
A daganatok epidemiológiai<br />
biomarkerei<br />
Kiss István<br />
A daganatok a fejlett országokban a második legfontosabb<br />
halálokot képezik, de ha nem a halálozások<br />
abszolút számát, hanem az elvesztett életéveket<br />
vesszük alapul, akkor számos országban már az első<br />
helyre kerültek.<br />
Ennek ellenére az is tény, hogy az utóbbi évtizedekben<br />
a daganatos betegségek terápiájának hatékonysága<br />
folyamatosan növekedett, bár néhány daganattípus<br />
esetében még napjainkban sem túl jók az<br />
ötéves túlélési arányok (pl. hasnyálmirigy-daganatok,<br />
tüdőrák). Az említett javulás részben új gyógyszerek<br />
és új kezelési stratégiák (pl. célzott terápia, monoklonális<br />
antitestek, antiszensz oligonukleotidok)<br />
kifejlesztésének, részben a meglevő kezelési módok<br />
továbbfejlesztésének (pontosabb, hatékonyabb besugárzás),<br />
részben pedig a daganatok korábbi diagnózisának<br />
tudható be.<br />
Daganatszűrés<br />
A daganatok előfordulási mintázatait, az ötéves<br />
túlélések változását, valamint a halálozási adatokat<br />
elemezve egyértelmű, hogy a felsorolt tényezők közül<br />
populációs szinten a legnagyobb jelentősége a korai<br />
diagnózisnak van. Éppen ezért a daganatos betegségek<br />
terén kiemelt fontossága van az igen korai, még<br />
tünetmentes állapotban való diagnosztizálásnak. Mivel<br />
tünetmentes stádiumról van szó, a beteg nyilvánvalóan<br />
nem fordul orvoshoz; épp ellenkezőleg, az<br />
egészségügy részéről van szükség aktív magatartásra,<br />
ami az „egészséges” népesség (ill. annak kiválasztott<br />
csoportjai) szűrővizsgálatát jelenti. Mivel itt nem klinikai<br />
vizsgálatokról van szó, hanem nagy lélekszámú<br />
tünetmentes populációk teszteléséről, ezekkel a vizsgálatokkal<br />
kapcsolatban speciális kívánalmak érvényesülnek.<br />
A szűrővizsgálatok kockázatának a klinikai<br />
vizsgálatoknál sokkal kisebbnek kell lennie, a<br />
várható mellékhatások és szövődmények ritkább előfordulásával,<br />
továbbá jóval egyszerűbbnek, olcsóbbnak<br />
is kell lenniük, cserében specifitásuk általában<br />
kisebb mértékű a diagnosztikus vizsgálatokénál. A<br />
daganatok szűrésére számos lehetőség áll rendelkezésre,<br />
pl. megtekintés (melanoma), fizikális vizsgálat,<br />
mammográfia, kolonoszkópia stb. Mivel e módszerek<br />
többsége egyelőre nem tökéletes, ill. számos daganatot<br />
illetően nem is létezik megfelelő szűrőmódszer,<br />
folyamatos kutatás irányul olyan szenzitív és specifikus<br />
biomarkerek kidolgozására és validálására, amelyek<br />
alkalmasak lennének nagy populációk daganatos<br />
szűrővizsgálatára. Ezek a biomarkerek – a tumormarkerek<br />
– tehát nem csak a klinikus számára fontosak,<br />
hanem még inkább hasznosak lennének az epidemiológia,<br />
ill. a közegészségügy és a betegségmegelőzés területén.<br />
Tumormarkerek<br />
A tumormarkerek kutatása nem korlátozódik a fehérje-,<br />
ill. peptid természetű markerekre, a vizsgálati<br />
lehetőségek skálája igen széles. Próbálkoztak már<br />
többek között keringő tumorsejtek kimutatásával,<br />
mutációt hordozó sejtek detektálásával, keringő vagy<br />
a vizeletben található szabad nukleinsavak vizsgálatával,<br />
DNS-metilációs vagy mikroRNS-mintázatok<br />
azonosításával különböző vizsgálati anyagokban. A<br />
jelenlegi gyakorlatban mégis szinte kizárólag fehérje<br />
alapú tumormarkerek használatosak.<br />
A tumormarkerek jelenlegi legfőbb felhasználási<br />
területe a klinikai alkalmazás: Számos tumor markert<br />
alkalmaznak rutinszerűen a terápia hatékonyságának<br />
monitorozása és az adott betegség kiújulásának észlelése<br />
céljából. Ezzel ellentétben az epidemiológiai,<br />
szűrési, betegségmegelőzési célzatú felhasználás ma<br />
egyelőre nagyon korlátozott keretek között mozog. A<br />
fehérje, ill. peptid alapú tumormarkerek populációs<br />
szintű felhasználását egyrészt technikai, másrészt elvi<br />
problémák nehezítik.<br />
A technikai nehézséget a kiválasztott fehérjék megfelelően<br />
szenzitív és specifikus kimutatása jelenti. Az<br />
emberi szérumban található egyedi fehérjék koncentrációja<br />
igen széles tartományban mozog (úgy hogy<br />
22 fehérje adja az összfehérje-mennyiség 99%-át), a<br />
40 g/l koncentráció körül jelen lévő albumintól a néhány<br />
pg/l-nyi különböző citokinen át a csak komoly<br />
metodikai nehézségek árán mérhető, jelenlegi módszereinkkel<br />
a kimutathatóság határát súroló molekulákig.<br />
Önmagában, tiszta oldatból a kimutatás nem<br />
jelentene ekkora problémát, de a nagyságrendekkel<br />
nagyobb koncentrációban jelen lévő egyéb fehérjék<br />
megnehezítik a kis mennyiségben megtalálható biomarkerek<br />
kimutatását. A specifikus fehérjedepléciós<br />
eljárások (pl. az albumin immundepléciója) eltávolít-
A daganatok epidemiológiai biomarkerei<br />
365<br />
ják ugyan a nagy mennyiségű, zavaró fehérjéket, de<br />
nagyon gyakran ezek a fehérjék részben vagy egészben<br />
megkötik a vizsgálandó fehérjemolekulákat, így<br />
azoknak a koncentrációja is jelentősen csökkenhet.<br />
A technikai nehézségek mellett elvi problémák is<br />
jelentkeznek. Számos biomarker inter- és intraindividuális<br />
variabilitása meglehetősen nagy mértékű,<br />
ami nagyon megnehezíti szűrővizsgálati alkalmazás<br />
során a megfelelő határérték kijelölését. A szűrővizsgálatokkal<br />
ellentétben az interindividuális variabilitás<br />
nem okoz gondot a klasszikus (azaz klinikai) tumormarkerként<br />
való alkalmazásban, mivel itt a vizsgált<br />
személy korábban mért értékeihez – amelyet tehát<br />
alapértéknek tekintünk – viszonyíthatunk. További<br />
nehézséget okoz az intraindividuális variabilitás,<br />
amely egyrészt random fiziológiás variabilitást jelent,<br />
másrészt pedig a tumormarkerek szintje nem csak a<br />
daganat jelenléte miatt emelkedhet meg, hanem más<br />
betegségek, állapotok is növekedést okozhatnak, sőt<br />
egyes markerek értéke az életkor előrehaladásával is<br />
változik. Leggyakrabban jóindulatú daganatok, gyulladások,<br />
az érintett szerv hypertrophiája vezet emelkedett<br />
tumormarkerszinthez, vagyis téves pozitivitáshoz.<br />
E problémák miatt jelenleg csakugyan széles körben<br />
mindössze egyetlen tumormarkert használnak<br />
szűrési célzattal, a prostataspecifikus antigént (PSA),<br />
amely kiválóan alkalmas az epidemiológiai-prevenciós<br />
jellegű felhasználás minden problémájának illusztrálására.<br />
A PSA alkalmazását 1986-ban kezdték meg szélesebb<br />
körben, prostatarákos betegeknél, a terápia<br />
nyomon követésére és az esetleges rekurrens daganatok<br />
észlelésére. Ugyanekkor már vizsgálatok folytak<br />
az esetleges szűrési célú alkalmazás tekintetében is,<br />
amely azután a kilencvenes évektől vált elterjedtté,<br />
elsősorban az Amerikai Egyesült Államokban. A szűrővizsgálatok<br />
hatására a betegség incidenciája először<br />
természetszerűleg jelentős emelkedést mutatott, majd<br />
valamelyest csökkent. Jelentősen csökkent ugyanakkor<br />
a prostatarák-mortalitás – és ebben matematikai<br />
modellezések szerint 45-70%-nyi szerepe lehetett a<br />
szűrővizsgálat alkalmazásának –, ill. eltolódás mutatkozott<br />
az újonnan felfedezett prostatarákok stádiumát<br />
illetően, a kedvezőbb stádiumú, ill. grádusú<br />
esetek irányába. Mindmáig e tényezők szolgáltatják a<br />
legfőbb érvet a PSA-szűrés mellett. Ugyanakkor más<br />
epidemiológiai vizsgálatok ellentmondani látszanak<br />
a PSA-szűrések hasznosságát igazoló eredményeknek.<br />
Az USA 9 régiójának prostatarák-mortalitási<br />
elemzése pl. nem talált jelentős különbségeket, annak<br />
ellenére, hogy a PSA-szűrések gyakoriságában, alkalmazásában<br />
igen nagy eltérések voltak az egyes régiók<br />
között. Egy másik vizsgálatban pedig a Seattle és<br />
Connecticut régió összevetése azt mutatta, hogy míg<br />
Seattle környékén a szűrés gyakorisága több mint ötszöröse<br />
volt a Connecticutéinak, prostatabiopsziát<br />
pedig több mint kétszer olyan gyakran végeztek, a<br />
mortalitás mégis gyakorlatilag ugyanannyi volt. A<br />
PSA-szűrés hatékonyságát vizsgáló korai tanulmányok<br />
is egymástól jelentősen eltérő eredményeket<br />
mutattak. A PSA-szűrések szenzitivitása és specifitása<br />
sajnos meglehetősen csekély. A nem kielégítő szenzitivitást<br />
jelzi, hogy egy vizsgálat a 2 ng/ml-nél alacsonyabb<br />
PSA-szintet mutató férfiak körében 33,7%-os<br />
prostatarák-gyakoriságot talált. A specificitást egy<br />
másik vizsgálat a 2,6-10 ng/ml-es tartományban kb.<br />
25-35%-nak írta le. Ezek az adatok a szűrővizsgálati<br />
használhatóságot tekintve jóval elmaradnak pl. a kolonoszkópia<br />
96,6% szenzitivitásától és 100%-os specifitásától<br />
(ha végpontként az adenocarcinomát tekintjük).<br />
A PSA-szűrővizsgálatok egyébként különböző<br />
határértékeket használnak. A legelterjedtebb a 4 ng/<br />
ml volt, de ezt számos országban, ill. intézményben<br />
lecsökkentették 2,5 ng/ml-re, de van, ahol 2 ng/ml-t<br />
javasolnak. Újabban nem ritkán figyelembe veszik azt<br />
is, hogy a PSA-szint az életkorral növekszik, vagyis<br />
életkor-specifikus határértékeket adnak meg.<br />
A PSA-szűrések hatékonyságának értékelését évtizedeken<br />
keresztül nehezítette az a tény, hogy nem<br />
végeztek e területen igazán nagy, randomizált kísérleti<br />
epidemiológiai vizsgálatokat. Jelenleg azonban<br />
két nagy randomizált vizsgálat is folyik, az egyik az<br />
USA-ban zajlik (PLCO), a másik pedig egy multicentrikus<br />
európai vizsgálat (ERSCP). Az amerikai tanulmány<br />
eddigi eredményei szerint a mortalitás nem<br />
különbözött szignifikánsan a szűrt és a kontrollcsoportok<br />
között, az incidencia pedig valamivel magasabb<br />
volt a szűrt csoportban. Ugyancsak nem volt eltérés<br />
a talált daganatok stádiummegoszlását illetően,<br />
viszont a Gleason 8-10-es daganatok valamivel gyakoribbak<br />
voltak a kontrollok körében. Az ERSCP-tanulmány<br />
az amerikai vizsgálattal ellentétben enyhe,<br />
de statisztikailag szignifikáns túlélési előnyt talált a<br />
PSA-szűrt csoportban a kontrollhoz képest. Ez a túlélési<br />
előny az 55-69 éves korosztályra korlátozódott.
366 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
Az ERSCP-vizsgálat keretében a PSA-szűrővizsgálatok<br />
16,2%-a adott pozitív eredményt, amelyből az elvégzett<br />
biopsziás vizsgálatok alapján 75,9% bizonyult<br />
hamis pozitívnak. Az adatok szerint egyébként egy<br />
élet megmentéséhez 1410 ember szűrése, ill. 48 ember<br />
kezelése volt szükséges.<br />
Az ismertetett bizonytalan mortalitási előnnyel<br />
szemben a másik oldalon jelentős potenciális hátrányok<br />
állnak. Így például egy 67 éves ember esetén<br />
a szűréssel megtalált prostatarák kezelése átlagosan<br />
7 évvel a klinikai tünetek várható megjelenése előtt<br />
kezdődik. Ugyanakkor csak minden negyedik prostatarákos<br />
beteg halna meg 15 éven belül. A kiterjesztett<br />
szűrővizsgálatok legnagyobb veszélye tehát a<br />
túldiagnózis és a túlkezelés. Olyan prostatarákokat is<br />
nagy számban diagnosztizálnának, ahol a beteg élete<br />
során egyébként soha nem derülne ki a prostatarák,<br />
mivel az esetek jó részénél a kórfejlődés meglehetősen<br />
lassú. Ezek a betegek azután (feleslegesen) kezelésben<br />
részesülnek, aminek súlyos szövődményei,<br />
mellékhatásai lehetnek, ill. az életminőségük jelentős<br />
csökkenéséhez vezetnek (ezek közül a legfontosabb<br />
az inkontinencia és az erektilis zavarok). A PSA-szűrés<br />
tehát eddigi ismereteink szerint nem alkalmas<br />
arra, hogy megbízhatóan elkülönítse a várhatóan<br />
gyors növekedést mutató tumorokat, ahol valóban<br />
lenne értelme a korai kezelésnek. A sok hamis pozitív<br />
diagnózis ráadásul komoly pszichés terhelést jelent az<br />
érintetteknek, amely hosszabb ideig is fennállhat.<br />
Az eddigiek ismeretében nem meglepő, hogy a<br />
mértékadó testületek, társaságok (Európai Urológusok<br />
Szövetsége, Japán Urológusok Szövetsége, Amerikai<br />
Rák Társaság, Amerikai Preventív Medicina<br />
Kollégium) nem javasolják a rutin PSA-szűrést a<br />
prostatarák megelőzésére (ellentétben pl. a vastagbéldaganatokkal,<br />
cervixtumorokkal, emlőrákkal, ahol<br />
a rendszeres szűrés jól kidolgozott, konszenzuson<br />
alapuló protokollon nyugszik, és fejlett országokban<br />
szinte ”kötelező erővel” ajánlott). Az ajánlások általában<br />
az érintett korosztály (többnyire 55 vagy 50 év<br />
feletti férfiak) tájékoztatását javasolják a várható előnyökről<br />
és hátrányokról, és a döntést az érintettekre<br />
bízzák, azzal a megjegyzéssel, hogy 75 éves kor felett<br />
e szűrés már semmiképpen nem ajánlott. Egyetlen<br />
jelentősebb kivétel az Amerikai Urológusok Szövetsége,<br />
amely ajánlja a rendszeres szűrővizsgálatot, de<br />
– a PLCO és az ERSCP eredményei alapján – kritériumrendszerét<br />
átdolgozva, nem egységes PSA-limitet<br />
javasol, hanem mindenkinek a 40 éves korban<br />
mért saját PSA-szintjéhez viszonyított határértéket. A<br />
PSA-szűrés mellett szóló érv viszont a terápia folyamatos<br />
fejlődése, differenciált kezelési (ill. aktív surveillance-)<br />
sémák kidolgozása a különböző stádiumú<br />
betegségekre, a szövődmények és a mellékhatások<br />
csökkentésére szolgáló erőfeszítések, amelyek együttesen<br />
a szűrt csoportokban idővel jelentősebb mortalitáscsökkenéshez<br />
vezethetnek.<br />
További lehetséges biomarkerek kutatása<br />
Ráadásul a prostatarák az idős kor betegsége, ezért<br />
gyakorisága a várható átlagos élettartam emelkedésével<br />
várhatóan tovább nő, vagyis különösen fontos<br />
lenne olyan biomarkerek azonosítása, amelyek a jelenlegi<br />
egyszerű PSA-vizsgálatnál hatékonyabban és<br />
specifkusabban lennének alkalmazhatók a prostatarák<br />
szűrésére. Az e téren folyó intenzív kutatások<br />
több irányban is bíztatóak. Ígéretesnek tűnik egyrészt<br />
a PSA vizsgálatának továbbfejlesztése, pl. életkor-<br />
vagy akár személyspecifikus határértékek kidolgozása,<br />
a PSA-sűrűség vizsgálata, a szabad/teljes<br />
PSA arány mérése, komplex PSA, PSA-sebesség, ill.<br />
PSA-izoformák (pl. proPSA) vizsgálata formájában.<br />
Tesztelik továbbá a PSA helyett/mellett további fehérje<br />
vagy nem fehérje természetű (pl. PCA3 RNS<br />
mennyisége a vizeletben, DNS-metilációs mintázatok)<br />
tumormarkerek szűrővizsgálati alkalmazhatóságát<br />
is. További szóba jöhető fehérjetermészetű marker<br />
pl. a hK2 (humán kallikrein 2), amely a PSA-val<br />
mintegy 80%-os homológiát mutató szerin-proteáz),<br />
amely - úgy tűnik -, hogy az agresszív, extracapsularisan<br />
terjedő prostatarák prediktív biomarkere. Az<br />
uPAR (urokinase-type plasminogen activator receptor)<br />
felhasználásának elvi alapját az adja, hogy a<br />
prostatarák terjedése során az extracelluláris mátrix<br />
degradációjában szerepe van a plazminogénkaszkád<br />
aktiválódásának. A plazminogénaktivátor receptorának<br />
(uPAR) megnövekedett koncentrációja már<br />
bizonyítottan a rossz prognózis jele emlő-, vastagbél-<br />
és tüdőrákban. Újabb vizsgálatok szerint e biomarker<br />
alkalmas lehet a prostatarák szűrésére is. A<br />
prostataspecifikus membrán antigén (PSMA) a prostata<br />
epithelsejtek membránjának alkotórésze. Eddigi<br />
vizsgálatát elsősorban műtéti anyagokból vagy biopsziából<br />
vett szövetekben vizsgálták, de szűrővizsgálati<br />
alkalmazhatóságát is tesztelik, a szérumból végzett<br />
Western-blot vagy ELISA alapú meghatározással. A
A daganatok epidemiológiai biomarkerei<br />
367<br />
korai prostatarák-antigén (early prostate cancer antigen,<br />
EPCA, ill. az ugyancsak mátrixprotein EPCA-2)<br />
nukleáris mátrix protein, amely nagyobb mennyiségben<br />
van jelen prostatarákos szövetben, mint egészségesben.<br />
Egy – sajnos meglehetősen kis elemszámon<br />
végzett – szűrővizsgálati jellegű tesztben a prostatarákot<br />
az EPCA és EPCA-2 biomarker segítségével<br />
92%-os szenzitivitással és 94%-os specificitással tudták<br />
detektálni. Több vizsgálat irányult a kaveolin-1<br />
(cav-1) lehetséges biomarker felhasználhatóságának<br />
tisztázására. A fehérje a sejtmembrán-invaginációkban<br />
található membránalkotórész, és szerepe van pl. a<br />
molekuláris transzportfolyamatokban, a sejtadhézió<br />
során, ill. a jelátviteli folyamatokban. A szérum emelkedett<br />
cav-1-koncentrációja alkalmasnak bizonyult<br />
olyan prostatarákos betegek azonosítására, akiknél a<br />
PSA-szint két év során sem emelkedett 1,5 ng/ml fölé.<br />
Az eddig felsoroltak mellett számos más potenciális<br />
tumormarkerrel folynak vizsgálatok, pl. a komplement<br />
4a komponens (C4a), a protein-C inhibitor,<br />
a cink-α 2<br />
-glikoprotein, a PEDF (pigment epithelium-derived<br />
factor); remélhetőleg mihamarabb sikerül<br />
epidemiológiai markerként, magas specificitással<br />
és szenzitivitással széles körben alkalmazható biomarkereket<br />
találni.<br />
További lehetséges markerként jönnek szóba egyes<br />
tumorantigénekkel szemben termelődő autoantitestek.<br />
Prostatarákos betegek tumorantigénjeire adott<br />
humorális immunválasz elemzésével sikerült kidolgozni<br />
egy autoantitestpanelt, amellyel 81,6%-os<br />
szenzitivitást és 88,2%-os specificitást értek el a daganat<br />
azonosításában. Ugyancsak számos multidimenzionális<br />
proteomikai vizsgálatot végeztek, főként<br />
tömegspektrometria, MALDI-MS vagy SELDI-MS<br />
alkalmazásával. Kapilláris-elektroforézis és tömegspektrometria<br />
alkalmazásával egy 9 polipeptidből<br />
álló mintázat segítségével, vizeletminta vizsgálata<br />
alapján prostatrákos betegeket tudtak azonosítani,<br />
92%-os szenzitivitással és 96%-os specificitással. A<br />
szérumproteinek nagy dinamikus tartománya által<br />
okozott problémákat esetleg kiküszöbölheti, ha a<br />
vizeletfehérjéket próbáljuk meg vizsgálni. Itt viszont<br />
technikai problémát jelenthet a szervetlen sók nagy<br />
koncentrációja.<br />
Az imént felsorolt, kísérleti jelleggel végzett vizsgálatok<br />
némelyike meglepően magas szenzitivitással<br />
és specificitással rendelkezett. Azonban ezeket a vizsgálatok<br />
kis csoportokon végezték, laboratóriumi körülmények<br />
között, tehát minden esetben szükség van<br />
még nagyobb populációkon való validálásra. A széles<br />
körű felhasználás lehetőségét korlátozhatja még<br />
a vizsgálatok bonyolultsága és drágasága, de egészen<br />
bizonyos, hogy amennyiben nagy sorozatban kerülnek<br />
alkalmazásra, az árak jelentősen csökkenni fognak.<br />
Egyelőre nem létezik a PSA-n kívül – ill. mint láthattuk<br />
a PSA alkalmazása is meglehetősen vitatott –<br />
olyan tumormarker, amelyet rutinszerűen alkalmaznának<br />
nagy, egészséges populációk daganatszűrésére.<br />
Éppen ezért itt nem térünk ki a klinikai tumormarkerek<br />
tárgyalására. Erről a területről mindössze annyit<br />
szükséges megemlíteni, hogy egyes tumormarkereket<br />
„kvázi-szűrési” céllal szokás alkalmazni, vagyis pl. daganatkutatás<br />
során az adott tumormarkerek meghatározását<br />
szokásos elvégeztetni. Az ilyen célból alkalmazott<br />
markerek egy része erősebben, de többségük<br />
inkább kevésbé daganatspecifikus, és felhasználásuk<br />
általában azon az elven alapul, hogy a tumorsejtekből<br />
olyan fehérjék is a keringésbe jutnak (pl. differenciálatlan,<br />
az embrionális fejlődési stádiumhoz közelebb<br />
álló sejteket jellemző fehérjék), amelyek egészséges<br />
sejtekből nem vagy csak igen kis mennyiségben.<br />
Klasszikus tumormarkernek számít a carcinoembryonalis<br />
antigén (CEA), amelyet a hatvanas évektől<br />
használnak, és mára már megtalálta helyét, pl. a vastagbéldaganatok<br />
klinikai markerei között. Ugyancsak<br />
viszonylag gyakran kerül sor CA 15.3 vagy CA 19.9<br />
marker vizsgálatára, ill. klasszikus embrionális jellegű<br />
marker az a-fötoprotein (AFP) és a humán koriogonadotropin<br />
(hCG). Különösen az olyan tumoroknál<br />
lenne fontos szűrésre alkalmazható biomarkereket<br />
fejleszteni, amelyeknél más szűrőmódszerek egyelőre<br />
nem állnak rendelkezésre vagy nem elég hatékonyak,<br />
pl. hasnyálmirigy-daganatok, ovariumtumorok. Ez<br />
utóbbi daganattal kapcsolatban sok vizsgálatot végeztek<br />
a CA 125-tel kapcsolatban, de úgy tűnik, a szűrővizsgálati<br />
alkalmazás kivitelezése nem lehetséges.<br />
A tumormarkerek kutatásának legizgalmasabb és<br />
legtöbbet ígérő fejezete tehát az epidemiológiai markerek<br />
kutatása. E területen van égetően nagy szükség<br />
új tumormarkerekre, ugyanis a daganatepidemiológia<br />
elmúlt ötven éve bebizonyította, hogy ott tudunk<br />
igazán eredményesek lenni a mortalitás csökkentésében,<br />
ahol sikerül igazán korai diagnózist felállítani.<br />
A fehérjekutatás új eredményei bizakodásra adnak<br />
okot megfelelő szűrővizsgálati módszerek kifejlesz-
368 11. fejezet A fehérjekutatás <strong>modern</strong> módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...<br />
tését illetően. Mindazonáltal ezek a módszerek valószínűleg<br />
nem egy fehérje vizsgálatán fognak alapulni<br />
(dacára annak, hogy több százra rúg az e területen<br />
vizsgált vagy vizsgálatra alapos okkal javasolt fehérjék<br />
száma), az eddigi kutatások alapján nem várható,<br />
hogy egyetlen fehérje a kellő szenzitivitást és specificitást<br />
tudná biztosítani. Az analitikai módszerek, a<br />
laboratóriumi medicina és a biomatematika fejlődése<br />
a komplex proteomikai markerek irányába mutat,<br />
amelyeknek a széles körben való elterjedése az utóbbi<br />
időben megjelent publikációk alapján remélhetőleg<br />
már nem sokáig várat magára.<br />
Irodalom<br />
Etzioni, R., Tsodikov, A., Mariotto, A. et al.: Quantifying<br />
the role of PSA screening in the US prostate cancer<br />
mortality decline.Cancer Causes Control 19:175–181,<br />
2008.<br />
Strope, S. A., Andriole, G. L.: Prostate cancer screening:<br />
current status and future perspectives. Nat. Rev. Urol.<br />
7:487–493, 2010.<br />
Andriole, G. L., Crawford, E.. D., Grubb, R. L. 3 rd et<br />
al.:Mortality results from a randomized prostate cancer<br />
screening trial [published erratum in N. Engl. J. Med.,<br />
2009. 360. 1797]. N. Engl. J. Med. 360:1310-1319, 2009.<br />
Schröder, F. H., Hugosson, J., Roobol, M. J. et al.:Screening<br />
and prostate-cancer mortality in a randomized<br />
European study. N. Engl. J. Med. 360:1320-1328, 2009.<br />
Smith, R. A., Cokkinides, V., Brooks, D. et al.: Cancer<br />
screening in the United States, 2010: a review of current<br />
American Cancer Society guidelines and issues in cancer<br />
screening. CA Cancer J. Clin. 60:99–119, 2010.<br />
Lin, D., Beyond, W.: PSA: utility of novel tumor markers<br />
in the setting of elevated PSA. Urol. Oncol. 26:315-321,<br />
2009.<br />
Gion, M., Daidone, M. G.: Circulating biomarkers from<br />
tumour bulk to tumour machinery: promises and pitfalls.<br />
Eur. J. Canc. 40:2613–2622, 2004.<br />
A tananyag elsajátításának ellenőrzéséhez segítséget<br />
nyújtanak a http://tamop.etk.pte.hu/adatbazis/ címen<br />
elérhető kérdések.
Tárgymutató<br />
A tárgymutatóban a címszó előtti vízszintes vonalkák a<br />
felettük lévő szó változatlan megismétlését jelentik (ahány<br />
szó változatlanul ismételhető, annyi vonal van leírva). A<br />
kötőjellel írt szavak egy szónak számítanak.<br />
A vessző után írt, hátravetett szavak általában jelzőként,<br />
a kifejezés előtt olvasandók. A / jellel elválasztott<br />
kifejezések a szövegben mindkét formában előfordulnak.<br />
A görög betűvel kezdődő kifejezések a betűrendben<br />
a kiejtésük szerinti helyen találhatók. A számok és az<br />
indexben lévő jelek a betűrendbe nem számítanak bele;<br />
az előttük, illetve utánuk következő betűk alapján vannak<br />
besorolva.<br />
A<br />
AAT 251<br />
ABP 110<br />
abszorbancia, látszólagos 163<br />
acetonitriles kicsapás 236<br />
acetonos precipitáció 47<br />
acil-ghrelin 357<br />
ACN 236<br />
ACTH 343<br />
- termelő hypophysis adenoma 344<br />
actin binding protein (ABP) 110<br />
ACS 328<br />
adeniláz-ciklát-aktiváló polipeptid (PACAP) 362, 363<br />
adipokin 346<br />
adiponektin 356<br />
adjuváns 133<br />
adrenokortikotrop hormon (ACTH) 343<br />
aequorin 143<br />
AF 254<br />
affinitás címke 58<br />
- elektroforézis 60<br />
- immunelektroforézis 60<br />
- kromatográfia 57<br />
AFP 224, 323<br />
agarózgél elektroforézis 73<br />
agglutináció 108<br />
-, latex 142<br />
agglutináció, passzív 142<br />
-, zselatin 142<br />
agglutinációs módszerek 141<br />
AGP 238<br />
akridíniumészter jelölőmolekula 166<br />
akrilamid monomer 71<br />
Akt útvonal 358<br />
aktin alapú motor 110<br />
- filamentum immunfluoreszcens kimutatása 53<br />
aktinkötő fehérje 110<br />
aktív centrum 33<br />
aktivált parciális tromboplasztinidő (APTI) 284<br />
- protein C (APC) 291<br />
- - -rezisztencia 291<br />
akut coronaria szindróma (ACS) 328<br />
- - - cardialis markerei 328<br />
- - - terápia, cardialis marker alkalmazás 332<br />
- - -, rizikóbeosztás 329<br />
- fázis fehérje elváltozások 223<br />
- myocardialis infarctus (AMI) 328<br />
- - -diagnosztikai kritériumai 328<br />
akvaporin-5, könny 295<br />
albumin 122, 222, 224<br />
- elváltozások 223<br />
-, ischaemia által módosított, cardialis marker 335<br />
-, vizelet 307<br />
albuminmentesítés 41<br />
albuminuria 309, 311<br />
- definíciója 311, 312<br />
aldoszteron releasing faktor 357<br />
a 1<br />
-antitripszin 224<br />
a ciano-4-hidroxi-fahéjsav (HCCA, CHCA) 179, 184<br />
a fötoprotein (AFP) 224, 323<br />
a hélix 102<br />
a 2<br />
-makroglobulin 225<br />
a 2<br />
-makroglobulin, vizelet 307<br />
a 1<br />
-mikroglobulin, vizelet 307<br />
a 1<br />
savanyú glikoprotein (AGP) 238, 309<br />
alignment 69<br />
alkalikus foszfatáz 151<br />
- -, csontspecifikus 348<br />
- gélelektroforézis 73
370 Tárgymutató<br />
alkonyzóna 69<br />
állandó semleges vesztés 183<br />
állatkísérlet 216<br />
állatkísérleti modell 218<br />
állatvédelem 218<br />
alvadási faktor, prokoaguláns 280<br />
- inhibitor 281<br />
amfolit 63<br />
AMI 328, 330<br />
amidofekete 75<br />
amiláz, nyál 302<br />
aminoacil tRNS 29<br />
aminosav 27<br />
- aktiválás 29<br />
-, balra forgató, a 101<br />
- dekarboxilezés 30<br />
-, esszenciális 101<br />
- dezaminálás 30<br />
- szekvencia 28, 102<br />
- -, szekvenciaazonosság 69<br />
amplifikáció 279<br />
amyloid b-peptid, liquor 339<br />
ANA 254<br />
- immunoblot 256<br />
- kimutatás ELISA szűrőteszttel 255<br />
- - indirekt immunfluoreszcenciával 254<br />
- mintázat 256<br />
ANA-ELISA 256<br />
analit, A típusú 188<br />
-, B típusú 188<br />
analitikai interferencia 172<br />
- referenciarendszer 188<br />
analizátor, tömegspektrométer 179<br />
analógia 68<br />
ANA-pozitivitás 262<br />
ANAscreen ELISA 255<br />
ANCA 261<br />
anionos detergens 41<br />
ANP 334, 343<br />
antibiotikum, tápoldat 208<br />
anti-C1q komplementfaktor autoantitest 260<br />
anti-CPP 260<br />
antiegér antitest (HAMA) 157<br />
antifoszfolipid antitest 292<br />
- szindróma (APS) 253<br />
- - diagnosztikai kritériumai 292<br />
antigén 126<br />
- feltárás 272<br />
-, inkomplett 127<br />
antigén jelölés 136<br />
- -, radioizotópos 137<br />
-, komplett 127<br />
-, neo 127, 128, 322<br />
- tisztítás 137<br />
antigén-antitest reakció alkalmazása 139<br />
antigéndetermináns 127<br />
antigénspecifikus autoantitest ELISA 256<br />
antihemofíliás faktor 280<br />
anti-Jo-1 260<br />
antikardiolipin antitest (ACA) 292<br />
antikörper 104<br />
antineutrofil citoplazma elleni antitesz (ANCA) 261<br />
antinukleáris autoantitest (ANA) 254<br />
- - ELISA (ANA-ELISA) 256<br />
- faktor (AF) 254<br />
antinukleoszóma-autoantitest 259<br />
anti-RNP 259<br />
anti-Scl-70 260<br />
anti-Sm 259<br />
anti-SS-A 259<br />
anti-SS-B 259<br />
antitest/ellenanyag 104<br />
- definíció 126<br />
- előállítás 132<br />
- - immunizálással 133<br />
- - rekombináns technológiával 135<br />
- -, molekulafelismerő 109<br />
- -, momoklonális 133<br />
- -, poliklonális 133<br />
antithyreoglobulin 262<br />
anti-TPO 262<br />
antitrombin defektus 290<br />
- hiány, veleszületett 290<br />
anyaion pásztázás 183<br />
APC 291<br />
APCI 178, 179<br />
Apoenzim Reaktivációs Immunoassay (ARIS) 153<br />
apoptózis kimutatása sejttenyészetben 215<br />
APS 253, 292<br />
APTI 284<br />
-, megnyúlt 284<br />
áramlási/flow citometria 240, 266<br />
- citometriás immunoassay 159<br />
ARIS 153<br />
Arisztotelész 216<br />
ASCA 263<br />
assay interferencia 157<br />
A típusú natriuretikus peptid 334
Tárgymutató<br />
371<br />
atmospheric pressure chemical ionization (APCI) 178, 179<br />
ATP 29<br />
atrialis natriuretikus peptid (ANP) 334<br />
autoantitest (AAT) 251<br />
-, analitellenes 173<br />
-, anti-dsDNS 259<br />
-, antinukleáris 254<br />
-, egyes betegségekre jellemző 252<br />
- meghatározás módszerei 254<br />
- -, multiplex 257<br />
-, patológiás 251<br />
-, szervspecifikus 262<br />
-, természetes 251<br />
autofluoreszcencia 138<br />
autoimmun betegség 251<br />
- - diagnosztizálása 253<br />
- - laboratóriumi eltérései 253<br />
- -, szervspecifikus 252, 253<br />
- -, szisztémás 252, 253<br />
- - típusai 252<br />
- hepatitis 263<br />
- májbetegség autoantitest-immunoblot profil 263<br />
- - autoantitestjei 264<br />
- myositis autoantitestprofil immunoblot 261<br />
autokrin 274<br />
automatizáció fehérjeanalitikában 161<br />
- -, tömegspektrometria 175<br />
Avenzoar 216<br />
Avery, Oswald 104<br />
avidin-biotin-peroxidáz (ABC) eljárás 273<br />
aviditás 131<br />
B<br />
bakteriális fehérje minta szolubilizáció 45<br />
band pass emissziós filter 246<br />
- - filter 246<br />
BAP 348<br />
Baylis, William Maddock 115<br />
bázistriplet 102<br />
BCG 222<br />
BCR 191<br />
Behring, Emil Adolf von 104<br />
Bence-Jones-fehérje 227<br />
Bence-Jones-fehérje kimutatása 230<br />
Bence-Jones-proteinuria 233, 309<br />
Benedikt-módszer 49, 298, 305<br />
Berson 143<br />
Berzelius, Jöns Jakob 101<br />
b 2<br />
-GPI antitest 260<br />
b hCG 323<br />
b humán koriongonadotropin (b hCG) tumormarker 323<br />
b 2<br />
-mikroglobulin 225<br />
b 2<br />
-mikroglobulin tumormarker 324<br />
b 2<br />
-mikroglobulin, vizelet 307<br />
b 2<br />
-transzferrin, liquor 340<br />
b redőzött réteg 102<br />
b-N-acetil- -D-glukózaminidáz (b-NAG), vizelet 307<br />
b-NAG, vizelet 307, 309<br />
betétes sejttenyészet 52<br />
bioanalitikai fehérjevizsgálat 57<br />
biogén amin 30<br />
bioinformatika 67<br />
bioinformatikai adatbázis 67<br />
- adatkezelés 68<br />
biokatalizátor 112<br />
biológiai válaszmódosító 102, 116<br />
biological response modifier 102, 116<br />
biolumineszcencia 139<br />
biuret reagens 49<br />
bivalens reagens 139<br />
blast ablak 243<br />
blue-dextrán 41<br />
BMD 347<br />
Bonner-Laskey-módszer 84<br />
Bradford-módszer 298<br />
Bradford-reagens 50<br />
Bradford-reakció 237<br />
brefeldin 274<br />
bróm-krezol-zöld (BCG) 222<br />
B sejt dyscrasia 227<br />
B típusú natriuretikus peptid (BNP) 335<br />
Buchner, Eduard 113<br />
Buchner, Hans Ernest August 105<br />
Burdet, Jules 105<br />
Burnet, Frank Macfarlane 105<br />
Bürker-kamra 213<br />
C, CS<br />
C típusú natriuretikus peptid 334<br />
CA 15-3 324<br />
CA 19-9 324<br />
CA 72-4 324<br />
CA 125 324<br />
c-ANCA 261
372 Tárgymutató<br />
carcinoembryonalis antigén (CEA) 323<br />
cardialis marker 328<br />
- - instrukciók 331<br />
- - orvosi alkalmazása, ACS 332<br />
- - - -, nem ischaemiás szívbetegség 334<br />
- - - -, vesebetegség 333<br />
- -, albumin, ischaemia által módosított 335<br />
- -, CK-MB-izoenzim aktivitás 330<br />
- -, C-reaktív protein 335<br />
- -, mieloperoxidáz 335<br />
- -, mioglobin 331<br />
- -, natriuretikus peptid 334<br />
- -, sürgősségi 334<br />
- -, troponin 328, 329<br />
CBB 50, 75, 237<br />
- festés Wang szerint 89<br />
CCD 96<br />
CD marker 266, 267, 269<br />
- -, hematológiai malignitások 271<br />
- nómenklatúra 267<br />
CEA 323<br />
CEDIA 153<br />
celluláris immunitás 266<br />
- - vizsgálata áramlási citometriával 266<br />
Cenp-B 260<br />
centromer elleni autoantitest (Cenp-B) 260<br />
CGS mértékegységrendszer 187<br />
CHAPS 42<br />
charge-coupled device (CCD) 96<br />
CHCA 179<br />
Chemiluminescent Immunoassay (CLIA) 155<br />
chip elektroforézis 59<br />
-, kémiai 61<br />
Christmas-faktor 280<br />
CID 182<br />
ciklikus citrullinált peptid elleni autoantitest (anti-CCP)<br />
260<br />
cisztatin, nyál 302<br />
citokin, csont 348<br />
- csoportosítás 274<br />
- kimutatás 273<br />
- - áramlási citometriával 275<br />
citoszkeleton 109, 110<br />
- fehérjék vizsgálata antitest felhasználásával 53<br />
- - -falloidinnel 53<br />
citozin-arabinozid (Ara-C) 212<br />
CK-BB 340<br />
CK-MB 330<br />
CK-MB/totál CK relatív index 330<br />
CK-MB1 331<br />
CK-MB2 331<br />
CK-MB-izoenzim aktivitás 330<br />
Clauss-módszer 285<br />
CLIA, akridíniumészter jelölésű 155<br />
Cloned Enzyme Donor Immunoassay (CEDIA) 153<br />
cluster of differentation (CD) 266<br />
Cohen, Stanley 116<br />
collision induced dissociation (CID) 182<br />
colour gating 242<br />
commutability 190<br />
complement system 106<br />
constant neutral loss 183<br />
Coomassie Brilliant Blue (CBB) 50, 75<br />
cooximetria POCT 316<br />
Coulomb-erő 32<br />
Coulomb-robbanás 178<br />
cöruloplazmin 225<br />
CRAB 229<br />
C-reaktív protein (CRP) 225<br />
- - cardialis marker 335<br />
Creutzfeldt-Jakob-betegség 340<br />
CRH 343<br />
CRP 225<br />
CRP, vizelet 307<br />
Cushing-kór 344<br />
Cushing-szindróma 344<br />
cut-off 333<br />
CYFRA 21-1 324<br />
Czerkinsky, Cecil 277<br />
csont dinamikus átépülése 347<br />
csontanyagcsere 348<br />
- endokrin szabályozása 349<br />
-, fizikai aktivitás hatása 350<br />
- rendellenessége 350<br />
-, táplálkozás hatása 350<br />
csontátépülés 350<br />
csontfelépülési marker 351<br />
csontleépülési marker 351<br />
csontrendszer 347<br />
csontsejt 347<br />
csontspecifikus alkalikus foszfatáz (BAP) 348<br />
csontsűrűség (BMD) 347<br />
csontszövet 347<br />
csontvelői őssejt transzplantáció 249
Tárgymutató<br />
373<br />
D<br />
daganat epidemiológiai biomarker 364<br />
daganatos csontáttét 351<br />
daganatsejt-kultúra 51<br />
dagantszűrés 364<br />
daughter ion scan 183<br />
D-dimer teszt 287<br />
De Novo Sequencing 184<br />
defenzin, nyál 302<br />
DELFIA 155<br />
denaturáló IEF + SDS elektroforézis 74<br />
- SDS-gélelektroforézis Laemmli szerint 77<br />
denaturált állapot 103<br />
detergens, anionos 41<br />
-, ikerionos 42<br />
-, minta-előkészítés 41<br />
-, nem ionos 42<br />
-, - -, alkalmazása sejtfrakcionálásra 44<br />
Detre (Deutsch) László 104, 126<br />
dexamethason szuppressziós teszt 344<br />
dezacil-ghrelin 357<br />
dezaminálás 30proteáz 30<br />
DHB 179<br />
diabetes mellitus száraz szemmel 296<br />
- - szemészeti szövődményei 298<br />
- -, könnyfehérjék 297<br />
dialízis, minta-előkészítés 40<br />
DIC 288<br />
differenciálcentrifugálás 43<br />
2,5-dihidroxi-benzoesav (DHB) 179<br />
dimetil-szulfoxid (DMSO) 135<br />
dinein 111<br />
dioxetán-foszfátészter fényemissziója 167<br />
direkt fotometria 49<br />
diszkontinuus gél 72<br />
disszeminált intravascularis koaguláció (DIC) 288<br />
ditioeritrol (DTE) 42<br />
ditiotreitol (DTT) 42<br />
DMSO 135<br />
DNS eltávolítása mintából 48<br />
- motor 111<br />
dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-<br />
PAGE) 62<br />
domén 36<br />
dot plot, kétszínű 246<br />
- -, színes 242<br />
2D PAGE 59<br />
DTE 42<br />
DTT 42<br />
dynamic molecular sieving 62<br />
dysproteinaemia 223<br />
E<br />
ECL 95, 167<br />
- detektálás 95<br />
- reagensek 96<br />
ECLIA 156, 170<br />
EDE 296<br />
Edelman, Gerald 104<br />
egérmáj fehérje szolubilizálás 46<br />
- szövet alkalikus fehérje dúsítása 46<br />
EGF, könny 295<br />
egy foton számlálás 167<br />
egyedi fehérje kimutatása immunfluoreszcenciás módszerrel<br />
52<br />
- - -immunkémiai módszerrel 55<br />
- - -Western blot módszerrel 54<br />
egyedi ion vizsgálat 182<br />
egyes sejt lézeres vizsgálata 241<br />
Ehrlich, Paul 104<br />
EIA 143, 149<br />
-, fluoreszcens 150<br />
-, heterogén 149<br />
-, homogén 152<br />
-, kemilumineszcens 151<br />
EIHIA 153<br />
éjfélzóna 69<br />
ekvivalencia elv 162<br />
elasztikus rost 118<br />
electron transfer dissociation (ETD) 182<br />
ElectroSpray Ionization (ESI) 175<br />
elektroendozmózis 65<br />
elektroforézis, affinitás 60<br />
-, agarózgél 73<br />
- alkalmazása előfrakcionálásra 44<br />
- - fehérjeelválasztásra 71<br />
-, chip 59<br />
- hordozói 71<br />
-, kapilláris 59<br />
- készülék 71<br />
-, kétdimenziós, kombinációi 74<br />
-, Laemmli-féle SDS gél 73<br />
-, savanyú urea gél 73<br />
-, zóna 60<br />
elektrokemiluminescens immunoassay 143
374 Tárgymutató<br />
elektrokemiluminescens jelölés 167<br />
- Immunoassay (ECLIA) 156, 170<br />
elektrokromatográfia 60<br />
elektronionizáció 177<br />
elektrospray, ionizációs (ESI) 175, 178<br />
- tömegspektrometria (ESI-MS) 66<br />
ELISA 149, 164<br />
-, ANAscreen 255<br />
-, befogó 148<br />
-, direkt 148<br />
-, indirekt 148<br />
-, -, szendvics 149<br />
-, kompetitív 148<br />
-, szendvics 148<br />
ELISPOT 150, 277<br />
- dot analízis 278<br />
ellenanyag/antitest definíció 126<br />
- jelölés 136<br />
- -, radioizotópos 137<br />
-, momoklonális 133<br />
-, poliklonális 133<br />
- tisztítás 136<br />
élő állapot 103<br />
előfrakcionálás eljárásai 43<br />
elsődleges fehérje szerkezet 28<br />
EMA 263<br />
embrionális sejt tenyésztése 203<br />
emissziós fluoreszcencia 243<br />
EMIT 149, 152<br />
emlős sejtkultúra típusai 51<br />
emlősszövet minta feltárása 46<br />
ENA 259<br />
endocitózis 34<br />
endokrin 274<br />
- mirigy 342<br />
endomysium elleni antitest (EMA) 263<br />
endoplazmatikus retikulum 34<br />
- - stressz 357<br />
- -, durva felszínű 34<br />
- -, sima felszínű 34<br />
Engelhardt 109<br />
enhanced chemiluminescence (ECL) 95<br />
eNOS 358<br />
enzim 112<br />
- aktivátor 33<br />
-, egyszerű 33<br />
- fehérje 33<br />
- funkciók 114<br />
- immunoassay (EIA) 143, 149, 150<br />
enzim immunoassay, kolorimetrikus 149<br />
- -, színreakción alapuló 149<br />
- jelölés 138, 170<br />
-, összetett 33<br />
- tumormarker 324<br />
enzimcitokémia 272<br />
-, direkt 272<br />
-, indirekt 272<br />
enzimhisztokémia 115, 270<br />
- technikája 272<br />
Enzyme Inhibitory Homogenous Immunoassay (EIHIA)<br />
153<br />
Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) 152<br />
enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) 149<br />
- immunosorbent spot (ELISPOT) 277<br />
enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) 149<br />
epidermalis növekedési faktor (EGF) 295<br />
epitóp 127<br />
-, konformációs 127, 128<br />
-, lineáris 127, 128<br />
Eppendorf-pipetta 298<br />
erősített kemilumineszcencia (ECL) 167<br />
ESI 175, 178<br />
ESI-MS 66<br />
esszenciális aminosav 101<br />
- táplálék 123<br />
ETD 182<br />
etikai megfontolások állatkísérlet végzésekor 218<br />
European Community Bureau of Reference (BCR) 191<br />
- Institute for Reference Materials (IRMM) 191<br />
evaporative dry eye (EDE) 296<br />
exenatid 346<br />
exocitózis 34<br />
exon 36<br />
extracelluláris mátrix fehérje 117, 355<br />
- szerkezet 117<br />
extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek<br />
(ENA) 259<br />
ezüstfestés, gélben, Gromova szerint 89<br />
-, -, MS-kompatibilis, Gromova szerint 89<br />
ezüstintenzifikálás 94<br />
ezüstözés 75<br />
-, direkt 85<br />
- eljárásai 85<br />
-, fehérjedúsítással, majd ezüstdetektálással, Marshall<br />
szerint 87<br />
-, kombinált, leszárított, festetlen vagy festett géllemezen<br />
Willoughby-Lambert szerint 85<br />
-, -, Willoughby-Lambert szerint 85
Tárgymutató<br />
375<br />
ezüstözés, módosított ultraszenzitív eljárással, Marshall<br />
szerint 87<br />
- ultravékony PAGE-lemezen, Sammons szerint 86<br />
F<br />
F ab<br />
106, 129<br />
FACS 43<br />
fág display technika 135, 136<br />
Fahey, John 104<br />
faktoranalízis vizsgálat 282<br />
falloidin 53<br />
fast atom bombardment (FAB) 177<br />
- ion bombardment (FIB) 178<br />
FBS 208<br />
F c<br />
106, 129<br />
FCM 240<br />
FDP 281, 287<br />
fehérje 27, 101<br />
- alegység 28<br />
- analitika automatizációja 161<br />
- - -, tömegspektrometria 175<br />
- analógia 68<br />
- biochip 158<br />
- bioinformatika 66, 67<br />
-, biokatalizátor 112<br />
- biológiai funkciók hordozója 103<br />
- - szerepe 27<br />
- definíciója 101<br />
- detektálás immunoblotting módszerrel 90<br />
- - - -, immunreakció előhívása 94<br />
- - Mini-Trans-Blot készülékkel 90<br />
- - nedves immunoblotting módszerrel 90<br />
- - semi-dry immunoblotting módszerrel 90<br />
- -, MS-kompatibilis 89<br />
- detektálási protokollok 84<br />
- doménszerkezete 36<br />
-, biokatalizátor 112<br />
-, egyszerű 28<br />
-, enzim 112<br />
-, extracelluláris szerkezet 117<br />
-, hormon 115<br />
-, kis molekulatömegű 234<br />
-, kontraktilis 109<br />
- elektroforézis 59, 60<br />
- - technikák 60<br />
- élő anyag produktum 101<br />
- eltávolítása mintából 41<br />
fehérje elválasztás elektroforézissel 71<br />
- enzim 33<br />
- ezüstözés, direkt, egydimenziós SDS-lapgélen 85<br />
- felgombolyodás 29<br />
- frakcionálás ultracentrifugálással 58<br />
- homológia 68<br />
-, hormon 115<br />
- - meghatározás 344<br />
- izoelektromos fokuszálása 63<br />
- jelölés 75, 97, 137, 165<br />
- jelölési protokollok 76<br />
- kapilláris elektroforézis 59<br />
- kimutatás, egyedi, immunkémiai módszerrel 55<br />
- -, -, morfológiai módszerrel 52<br />
- -, -, Western blot 54<br />
- -, immunfluoreszcenciás 52<br />
- -, száraz-kémiai 314<br />
-, kis molekulatömegű 234<br />
- koncentráció mérése 49<br />
-, kontraktilis 109<br />
- kölcsönhatás 31<br />
- kromatográfia 57<br />
- lebomlás 30<br />
-, ligandum 122<br />
- meghatározás 48<br />
- -, Benedikt-módszer 49<br />
- -, bioanalitikai 57<br />
- -, Bradford-módszer 50<br />
- -, direkt fotometria 49<br />
- -, Lowry-módszer 49<br />
- -, mikrobiuret-módszer 49<br />
- - standardizálása 190<br />
- minta koncentrációja 42<br />
- módosult aminosav polimer 101<br />
- molekulatömeg becslése kalibrációs egyenessel 57<br />
-, motor 109<br />
-, natívan rendezetlen 28<br />
- oldatba vitele 41<br />
- oldékonyság alkalmazása előfrakcionálásra 44<br />
- ortológia 69<br />
- osztályozás funkció alapján 28<br />
-, összetett 28<br />
- paralógia 69<br />
-, raktározó 120<br />
- rost 118<br />
-, sejtnövekedési faktor 116<br />
-, struktúraalkotó 34<br />
- szekvenciaanalízis 69<br />
- szekvenciaazonosság 69
376 Tárgymutató<br />
fehérje szerkezet 27<br />
- -, elsődleges 28, 102<br />
- -, harmadlagos 28, 102<br />
- -, másodlagos 28, 102<br />
- -, negyedleges/kvartener 28, 102<br />
- -, primer 28<br />
- -, szekunder 28<br />
- -, tercier 28<br />
- szintézis 28<br />
- szolubilizálás 41<br />
- térbeli konformációja 28<br />
-, transzportőr 121<br />
- tumormarker 321<br />
- - csoportok 323<br />
- - -, enzim 324<br />
- - -, hormon természetű 323<br />
- - -, mukoprotein 323<br />
- - -, onkofötális 323<br />
- - extracelluláris térbe kerülése 322<br />
- - jellemzői 322<br />
- újdonképződés 101<br />
- újragombolyodás 29<br />
- vizsgálat, proteomikai 65<br />
-, zsírsejt termelte 355<br />
fehérjekomplex alegység 102<br />
fehérjevizelés 311<br />
fehérvérsejt alcsoportok elkülönítése 266, 269<br />
felhődiagram 242<br />
fenol eltávolítása mintából 41<br />
fenolvörös 207<br />
fényemisszió mérése 167<br />
fényszűrő flow citometriában 246<br />
ferment 113<br />
ferritin 120<br />
- tumormarker 325<br />
festékkötéses jelölés 75<br />
festékkötési reakció mennyiségi mérésre 237<br />
festés, negatív 75<br />
feszültségtüske 168<br />
FIA 143, 153<br />
-, heterogén 153<br />
-, homogén 155<br />
fibrin 119<br />
fibrin/fibrinogén degradációs termék (FDP) 281, 287<br />
fibrinogén 119, 280<br />
- meghatározás 285<br />
fibrinolitikus rendszer 281<br />
fibrinolízis 287<br />
fibrinopeptid A (FPA) 287<br />
fibrinstabilizáló faktor 280<br />
fikoeritrin 244<br />
Fikoll-gradiens 43<br />
FITC 53, 165, 244<br />
- képlete 165<br />
fitohemagglutinin (PHA) 274<br />
Fitzgerald-faktor 280<br />
flash típusú jelölés 166<br />
flaska 206<br />
flavin-adenin-dinukleotid (FAD) 153<br />
flavoprotein 28<br />
Fleming 295<br />
Fletcher-faktor 280<br />
flow citométer 240<br />
flow/áramlási citometria (FCM) 240, 266<br />
- - mérettartománya 241<br />
- -, fluoreszcens jelölés 243<br />
- citometriás immunoassay autoantitest meghatározásra<br />
258<br />
fluorescent activated cell sorting (FACS) 43<br />
- scatter 240<br />
fluoreszcein-izotiocianát (FITC) 53, 165, 244<br />
fluoreszcencia 244<br />
- rezonancia energia transzfer (FRET) 166, 168<br />
-, lézer indukálta 62<br />
fluoreszcens 4-metil-umbelliferon-foszfát (MUP) 151,<br />
166<br />
- DNS-festékek 269<br />
- EIA 150<br />
- életidő 165<br />
- festés 75<br />
- immunoassay (FIA) 143, 153<br />
- -, heterogén 153<br />
- jelölés 138, 165<br />
- - flow citometriában 243<br />
- -, molekulák 154<br />
- mérés flow citometriában 244<br />
- mikroszkóp 52<br />
- polarizációs immunoassay (FPIA) 154, 155, 170<br />
- Protection Immunoassay 155<br />
- spektrofotometria 216<br />
- színjelölés, kombinált 245<br />
fluorofór 243, 268<br />
fluorogén vegyület 166<br />
fluorográfiás detektálás Bonner-Laskey szerint 84<br />
fluoroimmunometrikus módszer 154<br />
folding 29<br />
Folin-reagens 49<br />
folliculusstimuláló hormon (FSH) 343
Tárgymutató<br />
377<br />
folyadék fázisú izoelektromos fokuszálás 48<br />
- szekunder ion tömegspektrometria (LSIMS) 177<br />
forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA) 274<br />
formalinos fixálás 272<br />
forrásban bomlás 177<br />
forward scatter (FSC) 241<br />
- - treshold 247<br />
foszfoprotein 28<br />
foszforiláció 27<br />
fotopolimerizáció 71<br />
fötális marhasavó (FBS) 208<br />
FPA 287<br />
FPIA 154, 155, 170<br />
fragment antigen binding (F ab<br />
) 106, 129<br />
- crystallizable (F c<br />
) 106, 129<br />
fragmentálás 182<br />
FRET 166, 168<br />
FSC 241, 266<br />
FSH 343<br />
G, GY<br />
Gachon 294<br />
Galenus 216<br />
Gally, Joseph 104<br />
g számláló 167<br />
gammopathia, monoklonális 223, 227<br />
-, -, besorolása 229<br />
-, -, előfordulása 232<br />
-, -, kivizsgálása 228, 229<br />
-, -, malignus 227<br />
-, oligoklonális 339<br />
gél, gradiens 73<br />
-, homogén 72<br />
- koncentráció 72<br />
gélelektroforézis (PAGE) 59, 71<br />
-, alkalikus 73<br />
-, -, nem denaturáló 73<br />
- mikrochippel 62<br />
gélelőkészítés autoradiográfiához 84<br />
gélszűrés 43, 44, 236<br />
genom 36<br />
GH 343<br />
ghrelin 343, 346, 357<br />
GHRH 343<br />
GIP 357<br />
glargin inzulin 345<br />
gliadin elleni antitest 263<br />
glikoprotein 28<br />
glomerulonephritis 309<br />
glomerulus fehérjevisszatartó működése 311<br />
glow típusú jelölés 167<br />
GLP-1 357<br />
- agonista 346<br />
glukagon 343<br />
glukagonszerű peptid-1 (GLP-1) 357<br />
glukokortikoid 350<br />
glukózdependens inzulinotrop peptid (GIP) 357<br />
glutamin 207<br />
glutáraldehides konjugálás 139<br />
GnRH 343<br />
Golgi-készülék 34<br />
gonadotrop releasing hormon (GnRH) 343<br />
Gömöri György 270<br />
gp 130 citokincsalád 348<br />
gradiens centrifugálás 43, 58<br />
- gél 73<br />
Gromova-módszer, ezüstfestés gélben 89<br />
gyomor parietalis sejt elleni antitest 263<br />
gyors atombombázás (FAB) 177<br />
- ionbombázás (FIB) 178<br />
gyorsteszt → POCT<br />
gyulladásos marker vizsgálat POCT 315<br />
gyűjtő gél 72<br />
H<br />
Hageman-faktor 280<br />
HAMA 157, 173<br />
Hanson 110<br />
haptén 127<br />
haptoglobin 225<br />
harmadlagos fehérjeszerkezet 28<br />
Harvey, William 216<br />
hasnyálmirigy b-sejt daganat 344<br />
HAT médium 134<br />
hatpontos kalibráció 171<br />
háttérfluoreszcencia kiküszöbölése 168<br />
HbA 1c<br />
mérés standardizálása 199<br />
HBV 142<br />
HCCA 179, 184<br />
HCV 142<br />
Heidelberger, Michael 104<br />
Heidelberg-görbe 140<br />
hemaglutináció 142<br />
hemoglobin 122
378 Tárgymutató<br />
hemoglobin, vizelet 307<br />
hemolízis hatása mérésekre 172<br />
hemosziderin 121<br />
hemosztázis vizsgálata 279<br />
hemprotein 28<br />
Hep G-2 239<br />
heparinkofaktor aktivitás 290<br />
Hersko, Avram 30<br />
heterofil antitest mintában 173<br />
hGH 349<br />
hibridóma 134, 204<br />
hidrátburok 32<br />
hidrogén-peroxid 358<br />
hidroláz 33, 114<br />
high dose hook effektus/hook effektus/ nagy dózis visszacsapási<br />
effektus 145, 157, 173<br />
hiperimmun savó 133<br />
His-tag 58<br />
hisztatin, nyál 302<br />
hisztidin tag (His-tag) 58<br />
hisztológia 119<br />
HIV 142<br />
homogén gél 72<br />
homológia 68<br />
hook effektus 145, 157<br />
hormon 115<br />
- meghatározás POCT 316<br />
- természetű tumormarker 323<br />
HPLC microalbuminuria kimutatására 312<br />
Humán Anti-Mouse Antitest (HAMA) 157<br />
- Cell Differentation Molecules (HCDM) Workshop 267<br />
- epididymisprotein-4 (HE4) 325<br />
- genom 36<br />
- inzulin 345<br />
Huxley 110<br />
HYDRAGEL 73<br />
hypergammaglobulinaemia 226<br />
-, diffúz 226<br />
-, diszkrét 227<br />
hypoalbuminaemia 222<br />
hypogammaglobulinaemia 226<br />
hypophysis 341<br />
- elülső lebeny adenoma 344<br />
hypothalamus 341<br />
I<br />
időfelbontású számlálási technika 168<br />
időkapuzott megfigyelés 168<br />
IFCC Committee on Plasma Proteins 191<br />
IFE 230<br />
IgA 130<br />
- szint szelektív emelkedése 228<br />
IgA 1<br />
105, 107, 130<br />
IgA 2<br />
105, 107, 130<br />
IgD 105, 107, 130<br />
IgE 105, 107, 130<br />
IGF-1 343, 349<br />
IgG 130<br />
-, vizelet 307<br />
IgG 1<br />
105, 107, 130<br />
IgG 2<br />
105, 107, 130<br />
IgG 3<br />
105, 107, 130<br />
IgG 4<br />
105, 107, 130<br />
IgM 105, 107, 129, 130<br />
- szint szelektív emelkedése 228<br />
ikerionos detergens 42<br />
imidazol-cink festés 75<br />
immortalizált sejtkultúra 51<br />
immunaffinitás kromatográfia 58<br />
immunfixációs elektroforetogram 230, 231<br />
- elektroforézis (IFE) 230<br />
- - vizeletfehérje-vizsgálatban 232<br />
immunfluoreszcencia, indirekt, ANA kimutatására 254<br />
immunfluoreszcenciás egyedi fehérje kimutatás 52<br />
- fehérjekimutatás, direkt 52<br />
- -, indirekt 52<br />
immunglobulin (Ig) 104, 105, 127<br />
- aviditás 131<br />
- előállítás 132<br />
- elváltozások 223<br />
- izotípus 106, 129<br />
- mérés 227<br />
- monomer 106<br />
- osztályok 106, 226<br />
- szerkezet 105, 128<br />
- szérumfehérjék 226<br />
- valencia 131<br />
immunizálás 132<br />
immunkémia 125<br />
immunkémiai analízis 164<br />
- módszerek kimutathatósági értékei 174<br />
immunkomplex, in vitro 140<br />
immunoassay 125, 164<br />
-, áramlási citometriás 159<br />
-, befolyásoló faktorok 156<br />
-, elektrokemiluminescens 143<br />
-, enzim 143<br />
- érzékenysége 125
Tárgymutató<br />
379<br />
immunoassay, fluoreszcens 143<br />
-, heterogén 144, 145<br />
-, -, szilárd fázisa/szendvics 145, 168, 169<br />
imunoassay 142<br />
-, homogén 144, 145, 169<br />
-, - 164, 169, 170<br />
- kalibrációja 171<br />
-, kemiluminescens 143<br />
- kis molekulatömegű fehérje kimutatására 238<br />
-, kompetitív 144, 169<br />
- közege 168<br />
- mérési elve 143<br />
-, multiplex 158<br />
-, nem kompetitív/szendvics 144<br />
-, radio 143, 145<br />
-, szilárd fázisú 164<br />
-, telítési 169<br />
immunogén 127<br />
immunológiai vizsgálómódszerek 139<br />
immunoradiometrikus assay (IRMA) 147<br />
immunreakció 108<br />
- agarózgélben 75<br />
- előhívása, kemilumineszcenciával 95<br />
- -, Ni-DAB-reakcióval 94<br />
- jelölésként 75<br />
immunsejt fenotípus meghatározás 266, 270<br />
- stimulálás 274<br />
immunszerológia 108<br />
immunturbidimetria 162<br />
-, kompetitív, erősített 162<br />
-, latexerősített, direkt 162<br />
immunválasz szakaszai 126, 127<br />
indirekt immunfluoreszcencia (IIF) 254<br />
inhibitor 33<br />
iniciáció 279<br />
inkretin 357<br />
inkubátor, sejttenyésztés 206<br />
INR 283<br />
in source decay (ISD) 177, 182<br />
instabil angina 328<br />
intenzív terápiás ellátás, POCT 314<br />
interferáló vegyület eltávolítása mintából 40, 47<br />
interferencia, analitikai 172<br />
-, -, kiküszöbölése 173<br />
interleukin-6 (IL-6) 356<br />
International Normalised Ratio (INR) 283<br />
- Union of Immunological Societies (IUS) 190<br />
interrogation point 241<br />
intracelluláris vázfehérje 109<br />
intrinsic faktor elleni antitest 263<br />
intron 36<br />
inzulin 343<br />
- intracelluláris jelátvitel 357, 358<br />
- kutatás 345<br />
- szerepe metabolikus szindrómában 354<br />
inzulinanalóg 345<br />
inzulinrezisztencia 354, 358<br />
-, szelektív 358<br />
inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1) 343, 349<br />
ioncserés kromatográfia 57<br />
ionforrás, tömegspektrométer 176<br />
ionizáció módjai 177<br />
ionok meghatározása POCT 315<br />
ionomycin 274<br />
IPG 74<br />
IRMA 147<br />
IRMM 191<br />
ISD 177<br />
Ishikawa 150<br />
Ishizaka, Kikishige 104<br />
Ishizaka, Teruki 104<br />
IUS 190<br />
izoelektromos fokuszálás 60, 63<br />
- - agarózgélben 73<br />
- - gélcsőben; 1. dimenzió 80<br />
- - immobilizált pH-gradiens gélben (IPG) 74<br />
- - lapgélen; 1. dimenzió 84<br />
- - poliakrilamidgélben 73<br />
izomeráz 33, 114<br />
izotiocianát 165<br />
izotóp, b-sugárzó 138<br />
-, g-sugárzó 137<br />
izotópos jelölés 75, 137, 165<br />
J<br />
JCTLM 190<br />
jelölés, citokin 275<br />
-, derengés típusú 167<br />
-, elektrokemilumineszcenciás 167<br />
-, enzimes 138, 170<br />
- ezüstözéssel 75<br />
-, felvillanás típusú 166<br />
-, festékkötéses 75<br />
- fluoreszcens festéssel 75, 138<br />
- immunreakcióval 75<br />
-, izotópos 75, 137<br />
-, jel detektálása 167<br />
-, kemilumineszcenciás 167
380 Tárgymutató<br />
jelölt molekula eltávolítása, RIA 149<br />
Jenner, Anthony 104<br />
Jerne, Niels K. 105, 134<br />
jodinációs reagens 165<br />
Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine<br />
(JCTLM) 190<br />
Jurkat-sejt 180, 214<br />
K<br />
kalcitonin 343, 349<br />
- tumormarker 323, 325<br />
kalcium alvadási faktor 280<br />
-, ionizált 349<br />
kalibráció mestergörbével 172<br />
-, hatpontos 171<br />
kalibrációs görbe 171<br />
kaotróp anyag 41<br />
kapilláris elektroforézis 59<br />
karbamid 30<br />
karboanhidráz, nyál 302<br />
kardiolipin antitest 260<br />
kardiológiai ellátás POCT 315<br />
karriermediált transzport 35<br />
katalízis 33<br />
kémiai chip 61<br />
kémiai ionizáció (CI) 177<br />
- polimerizáció 71<br />
kemilumineszcencia 95, 139<br />
-, erősített 167<br />
kemilumineszcenciás jelölés 167<br />
kemilumineszcens EIA 151<br />
kemilumineszcens immunoassay (CLIA) 143, 155<br />
- Mágneses Immunoassay (CMIA) 156<br />
keratoconjunctivitis sicca 296<br />
- -, primer 296<br />
- -, szekunder 296<br />
késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay (DELFIA) 155<br />
kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D PAGE)<br />
59<br />
kettős fokuszálású szektoros analizátor 180<br />
kevert kötőszöveti betegség (MTCD) 253<br />
Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) 133<br />
kiméra antitest 135<br />
kinezin 111<br />
kis molekulatömegű fehérje 234<br />
- - -biológiai szerepe 234<br />
- - -dúsítása kimutatás előtt 236<br />
- - -kimutatása 235<br />
kis molekulatömegű fehérje kimutatása immunoassay-vel<br />
238<br />
- - -marker 235<br />
- - -mennyiségi mérése 237<br />
- - -csoportosítás 234<br />
kis részecske mérés flow citometriával 248<br />
kísérlet állatfajok 217<br />
kitapadó sejtkultúra 51<br />
KLH 133<br />
klónszelekció 134<br />
koagulométer 282<br />
Koch, Robert 104<br />
KODAK Image Station 2000R 96<br />
kodon 28, 102<br />
koenzim 33<br />
kofaktor 115<br />
- aktivitás 291<br />
kollagén, I-es típusú 348<br />
- rost 118<br />
- szerkezet 351<br />
kollagenáz 349<br />
kommutabilitás 189<br />
kompenzáció, számítógépes, flow citometriában 247<br />
komplementrendszer 106<br />
komplett DMEM médium készítése 208<br />
konformációs epitóp 127, 128<br />
konjugálás immunoassay során 139<br />
konjugált monoklonális antitest 243<br />
kontaktlencse 296<br />
kontamináció sejttenyészetben 211<br />
- -, bakteriális 211<br />
- -, gombás 211<br />
- -, mycoplasma 211<br />
- -, vírusos 211<br />
kontraktilis fehérje 109<br />
kontrollcsoportos vizsgálat 200<br />
konvergens evolúció 68<br />
kortikotrop releasing hormon (CRH) 343<br />
Köhler, Georges J. F. 105, 134<br />
könny 294<br />
- fehérje 294<br />
- - daganatos betegségekben 297<br />
- - diabetesben 297<br />
- - dohányzókban 297<br />
- - hepatitis C-ben 297<br />
- - szisztémás betegségekben 297<br />
- - térkép 299<br />
- - vizsgálat MALDI TOF MS-sel 300<br />
- - -O’Farrell-módszerrel 299<br />
- - -SDS elektroforézissel, ezüstözéssel 299
Tárgymutató<br />
381<br />
könny fehérje térkép Western blottal, Gallyas-ezüstözéssel<br />
és ECL-előhívással 299<br />
- fiziológiai szerepe 294<br />
- összetétele 294<br />
-, reflex 298<br />
könnyfilm rétegei 294<br />
könnyminta vétele 298<br />
könnyspecifikus prealbumin (TSPA) 295<br />
könnyvesztés fokozódása 296<br />
könnyűlánc proteinuria, túlfolyásos 311<br />
kreatin-kináz (CK) 330<br />
- BB-izoenzim (CK-BB) 340<br />
- MB-izoenzim 330<br />
- MB-izoformok 330, 331<br />
kromatográfia 57<br />
-, affinitás 57<br />
-, elektro 60<br />
-, immunaffinitás 58<br />
-, ioncserés 57<br />
-, ligandumreceptor 58<br />
-, méretkizárásos 236, 312<br />
-, -, microalbuminuria kimutatására 312<br />
-, micelláris elektrokinetikus 60<br />
kromatográfiás előfrakcionálás 44<br />
kromogranin-A 344<br />
kubilin 311<br />
kumarin 166<br />
Kühne, Wilhelm 109, 113<br />
kvadrupól analizátor 180<br />
L<br />
lab-on-a-chip 61<br />
Laboratóriumi Medicina Visszavezethetőségi Egyesített<br />
Bizottsága (JCTLM) 190<br />
Laemmli-módszer 77<br />
Laemmli-féle SDS gél elektroforézis 73<br />
Laemmli-féle SDS PAG elektroforézis 306<br />
laktátvizsgálat POCT 316<br />
laktoferrin, könny 295<br />
-, nyál 302<br />
laminár boksz 210<br />
lanreotid 346<br />
lapgél 72<br />
latex agglutináció 142<br />
LCM 43<br />
leányion-pásztázás 183<br />
Leeuwenhoek, Antoni van 109, 203<br />
légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) 178, 179<br />
Leiden-mutáció 291<br />
leptin 343, 356<br />
leukocyta proliferáció 309<br />
Levey-Jennings-grafikon 200<br />
Levi-Montalcini, Rita 116<br />
lézer deszorpciós-ionizációs repülési idő tömegspektrometria<br />
(MALDI-TOF) 66<br />
- indukálta fluoreszcencia (LIF) 62<br />
- mikrodisszekció (LCM) 43<br />
LH 343<br />
liáz 33, 114<br />
LIF 62<br />
ligandum fehérje 122<br />
- receptor kromatográfia 58<br />
ligáz 33, 114<br />
limitált proteolízis 235<br />
lineáris epitóp 127, 128<br />
- ioncsapda analizátor 180<br />
lipaemia hatása mérésekre 172<br />
lipid eltávolítása mintából 40<br />
lipokalin, könny 295<br />
lipopoliszacharid (LPS) 274<br />
lipoprotein 28, 122<br />
liquor liquor cerebrospinalis 337<br />
- albuminhányados 338<br />
liquor fehérje vizsgálat 337<br />
- fehérje vizsgálat, biomarker 338<br />
- - -, elektroforézis 338<br />
- - -, ELISA 338<br />
- - -, IgG-index 338<br />
- makroszkópos vizsgálata 337<br />
- minta vétele 337<br />
-, véres 337<br />
liraglutid 346<br />
lispro inzulin 345<br />
living state 103<br />
lizoszóma 34<br />
lizoszomális savanyú hidroláz 349<br />
lizozim, könny 295<br />
-, nyál 302<br />
long pass filter 247<br />
Lowry-fehérjemeghatározás 49<br />
LPS 274<br />
LSIMS 177<br />
luciferin 139<br />
luciferin-adenozin-trifoszfát 151<br />
lumbálpunkció 337<br />
luminol 96, 151<br />
- fényemissziója 167<br />
lupus antikoaguláns 293
382 Tárgymutató<br />
lupus nephritis 310<br />
luteinizáló hormon (LH) 343<br />
Lyubimova 109<br />
M<br />
makrogyöngy módszer 169<br />
MALDI 175, 179<br />
MALDI Imaging 184<br />
MALDI TOF 66, 176, 184<br />
malignus transzformáció 321<br />
MAPK útvonal 358<br />
Marshall-ezüstözés 87, 300<br />
-, fehérjedúsítással 87<br />
-, módosított 87<br />
másodlagos fehérje szerkezet 28<br />
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)<br />
175, 179<br />
mátrix metalloproteináz 349<br />
- segített lézerdeszorpció (MALDI) 175, 179<br />
MBS 139<br />
M csúcs 227<br />
mechanoenzim 112<br />
Mecsnyikov, Ilja 104<br />
Medawar, Peter Brian 105<br />
médium összetétel változása 215<br />
-, sejttenyésztés 207<br />
megalin receptor 311<br />
MEIA 150, 152, 156<br />
Meibom-mirigy 294<br />
mellékpajzsmirigy adenoma 344<br />
mélyvénás thrombosis (MVT) 287<br />
mérés minőség-ellenőrzése 199<br />
mérési eredmény metrológiai visszavezethetősége 189,<br />
190, 192<br />
méretkizárásos kromatográfia 236, 312<br />
- - microalbuminuria kimutatására 312<br />
Mértékegységek Nemzetközi Rendszere (SI) 187<br />
mértékegységrendszerek 187<br />
mestergörbe 172<br />
mesterkalibráció 172<br />
metabolikus szindróma 353<br />
- - definíciója, ATPIII-kritériumok 354<br />
- - -, IDF-kritériumok 354<br />
- - -, WHO kritériumok 353<br />
- - előfordulása 354<br />
- - patogenezise 354<br />
metabolizmus 35<br />
metalloprotein 28<br />
metilén-bisz-akrilamid 71<br />
metionin 29<br />
metrikus mértékegységrendszer 187<br />
M gradiens 227<br />
MGUS 227<br />
- diagnosztikai kritériumai 229<br />
micelláris elektrokinetikus kromatográfia 60<br />
microalbuminuria 311<br />
- előfordulása 312<br />
microbead 248<br />
- assay 158<br />
- -, multiplex 159<br />
Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA) 150, 151<br />
MicroSpot Assay 158, 258<br />
midnight zone 69<br />
mieloperoxidáz cardialis marker 335<br />
mikrobiuret módszer 49, 298, 305<br />
mikrochip, elektroforetikus 61<br />
mikrocsatornás detektor 182<br />
mikrogyöngy 248<br />
- módszer 158, 170<br />
mikroorganizmus minta extrakció-szolubilizáció 45<br />
Mikropartikulum Enzim Immunoassay (MEIA) 150, 151, 152<br />
mikroszkópos módszerek immunsejtek vizsgálatára 270<br />
mikrotubuláris alapú motor 111<br />
Milstein, César 105, 134<br />
miniatürizálás, mikrochip alkalmazás 61<br />
Mini-Trans-Blot készülék fehérjedetektáláshoz 90<br />
minor myocardialis károsodás 328<br />
minőségi kontroll mikrogyönggyel flow citometriában 249<br />
minta bevitel tömegspektrométerbe 176<br />
minta előfrakcionálás 42, 48<br />
- előkészítés 39<br />
- -, protokollok 45<br />
- -, sejtes 40<br />
-, sejtes 51<br />
- tárolás 42<br />
- vétel állatkísérlet során 217<br />
mioglobin 122<br />
- cardialis marker 331<br />
-, vizelet 307<br />
miozin 111<br />
MKSA mértékegységrendszer 187<br />
m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter (MBS)<br />
139<br />
moat 243<br />
Moll-mirigy 294<br />
monenzin 274<br />
monoclonal gammopathies undetermined significance<br />
(MGUS) 227
Tárgymutató<br />
383<br />
monocyta kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) 356<br />
monoklonális antitest/ellenanyag 133, 204<br />
- - előnyei 135<br />
- gammopathia 223<br />
- gammopathiák nem meghatározott jelentőséggel<br />
(MGUS) 227<br />
- protein (M protein) 223, 227<br />
monolayer sejtkultúra 51<br />
morfológiai módszerek immunsejtek vizsgálatára 266<br />
motorfehérje 109<br />
moving boundary electrophoresis 59<br />
M protein 223, 227<br />
- - elektroforézise 230<br />
mRNS 28, 102<br />
- alternatív vágása 36<br />
MS-kompatibilis fehérjedetektálás CBB-festéssel, Wang<br />
szerint 89<br />
- - ezüstfestéssel gélben, Gromova szerint 89<br />
MTCD 253<br />
mTOR-IRS 359<br />
MUC 1 gén 324<br />
MUC 16 gén 423<br />
mucin 119<br />
-, nyál 302<br />
mukoprotein tumormarker 323<br />
- tumormarker 324<br />
multicolour labeling 245<br />
multiparaméteres analízis 242<br />
multiple reaction monitoring 183<br />
multiplex ambiens assay 158<br />
- microbead assay 258<br />
multipotens őssejt 204<br />
MUP 151, 152<br />
mustársav 179<br />
myeloma, aszimptomás, diagnosztikai kritériumai 229<br />
- multiplex, célszervkárosodások kritáriumai 229<br />
- - diagnosztikai kritériumai 229<br />
-, nem szekretoros, diagnosztikai kritériumai 229<br />
myopathia, idiopathiás gyulladásos 253<br />
myosin 111<br />
myositis overlap szindróma 262<br />
N, NY<br />
NAG 307<br />
nagy dózis visszacsapási effektus/high dose hook effektus/<br />
hook effektus 145, 157, 173<br />
- molekulatömegű kininogén 280<br />
nanoESI 178<br />
natív állapot 103<br />
natívan rendezetlen fehérje 28<br />
nátrium-bikarbonát 207<br />
nátrium-dodecil-szulfát (SDS) 41<br />
natriuretikus peptid cardialis marker 334<br />
NDAS 253<br />
NDC 253<br />
nefelométer 141<br />
nefelometria 140, 164<br />
negyedleges fehérjeszerkezet 28<br />
nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis 73<br />
- - - - Ornstein-Davis szerint 76<br />
- - - gél + SDS elektroforézis 74<br />
- differenciált autoimmun betegség (NDAS) 253<br />
- - collagenosis (NDC) 253<br />
- - kötőszöveti betegség (UCTD) 253<br />
nem ionos detergens 42<br />
neoantigén 127, 128, 322<br />
nephrosis-szindróma 309<br />
neuroendokrin hormon fehérje 341<br />
- - szekréció rendellenessége 342<br />
- rendszer 341<br />
- - betegségei 342<br />
- tumor 343<br />
- tumormarker 344<br />
neuronspecifikus enoláz (NSE) 340<br />
NGT 354<br />
N-hidroxiszukcinimid (NHS) 139<br />
NHS 139<br />
niche 117<br />
Ni-DAB reakció 94<br />
- - ezüstintenzifikálással Gallyas szerint 94<br />
Nidergerke 110<br />
non-Sjögren tear-deficient dry eye (NSTD) 296<br />
non-ST-szegment emelkedés myocardialis infarctus<br />
(NSTEMI) 328<br />
normálérték 193<br />
normális glukóztolerancia (NGT) 354<br />
növekedési hormon (GH, hGH) 343, 349<br />
- - kutatás 345<br />
- - serkentő hormon (GHRH) 343<br />
- - termelő hypophysis adenoma 344<br />
növényi minta feltárása 46<br />
- - -, levél 46<br />
- - -, mag 46<br />
NP-40 42<br />
NSTD 296<br />
NSTEMI 328
384 Tárgymutató<br />
nukleinsav eltávolítása mintából 41<br />
nukleoprotein 28<br />
nyál biológiai funkciói 301<br />
- fehérje 301<br />
- - funkcionális vizsgálata 303<br />
- - összetétele 302<br />
- - vizsgálat 302<br />
- - vizsgálat elektroforézissel 303<br />
- - - tömegspektrometriával 303<br />
- minta vétele 302<br />
O<br />
O’Farrell-módszer 79, 80, 81<br />
obesitas 354, 355<br />
obesztatin 357<br />
obscuration bar 241<br />
octreotid 346<br />
oligoklonális gammopathia 223, 232<br />
onconeuronalis antitest immunoblot 264<br />
one platform FCM-analízis 248<br />
onkofötális tumormarker 323<br />
onkogén 321<br />
optikai filter 246, 247<br />
orbitrap analizátor 181<br />
Ornstein-Davis-módszer 76<br />
orozomukoid 300<br />
orthostaticus proteinuria 313<br />
ortológia 69<br />
osteoblast 347<br />
- faktorok 348<br />
osteoclast 347<br />
- faktorok 349<br />
osteocyta 347<br />
osteoporosis 350<br />
oszteoid 348<br />
oszteokalcin 348<br />
oszteonektin 348<br />
oszteoprotegerin 349<br />
oxidatív dezaminálás 30<br />
oxidoreduktáz 33, 114<br />
oxintomodulin 346<br />
oxitocin 343<br />
Ö<br />
őssejt izolálás 205<br />
-, multipotens 204<br />
-, pluripotens 204<br />
- tenyésztés 204<br />
-, totipotens 204<br />
-, unipotens 204<br />
P<br />
PACAP 362, 363<br />
PAGE 71, 306<br />
-, denaturáló 73<br />
-, kétdimenziós, denaturáló rendszerben 79<br />
-, nagy felbontású, kétdimenziós, O’Farrell szerint, 1.<br />
dimenzió 79, 80<br />
-, - -, -, - -, 2. dimenzió 81<br />
-, natív 73<br />
- planáris horizontális rendszerben 72<br />
- vertikális rendszerben 72<br />
Paget-kór 351<br />
PAI-1 281<br />
PAI-2 281<br />
pajzsmirigy medullaris carcinoma 344<br />
pajzsmirigyhormon 342, 349<br />
p-ANCA 261<br />
Pándy Kálmán 338<br />
Pándy-reakció 338<br />
PAP 273, 324<br />
parajodofenol 95<br />
parakrin 274<br />
paralógia 69<br />
paraneoplasiás antitest immunoblot 264<br />
paraneoplasticus antigének 264<br />
paraprotein 223, 227, 321<br />
parathormon (PTH) 343, 349<br />
- related protein 323<br />
- tumormarker 323<br />
parathormonszerű fehérje tumormarker 323<br />
parent ion scan 183<br />
Pasteur, Louis 113<br />
passzálás 51, 209<br />
-, tripszines 209<br />
pásztázás 182<br />
Pauling, Linus 102<br />
PBC 242<br />
PBS 45<br />
PCA 236<br />
PC-aktivátor 290<br />
PCT 239<br />
PEG 134<br />
peptid 101
Tárgymutató<br />
385<br />
peptid hormon 343<br />
- - kutatás 345<br />
- - meghatározás 344<br />
- YY 3465<br />
Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 184<br />
- - mapping 66<br />
peptidil-transzferáz 29<br />
peridinin-klorofill-protein komplex 244<br />
perjodátos konjugálás 139<br />
perklórsavas kicsapás 236<br />
perklórsavas kicsapás + Western blot 237<br />
peroxidáz 151, 302<br />
-, könny 296<br />
- reakció előhívása kemilumineszcenciával 95<br />
- - -Ni-DAB-reakcióval 94<br />
peroxidáz-antiperoxidáz (PAP) komplex 273<br />
PHA 274<br />
phage display 135<br />
PI 282<br />
-, megnyúlt 283<br />
PINP 351<br />
piridoxál-foszfát 30<br />
pitvari natriuretikus peptid (ANP) 343<br />
PIVKA 283<br />
p-jodofenol 167<br />
plazma albumin 222<br />
- deszorpció (PD) 177<br />
- fehérje 221<br />
- - elektroforézis 222<br />
- - funkciók 221<br />
- - vizsgálat 222<br />
- összfehérje 222<br />
- tromboplasztin 280<br />
plazmasejt 127<br />
plazminogén aktivátor inhibitor 1 (PAI-1) 281<br />
- - - 2 (PAI-2) 281<br />
- plazmin átalakulás 281<br />
plexus chorioideus 337<br />
Pluckthun 135<br />
pluripotens őssejt 204<br />
PMA 274<br />
PMA/ionomycin stimulálás 275, 276<br />
POCT/gyorsteszt 314<br />
- cooximetria 316<br />
- diagnosztika, adatkezelés 319<br />
- -, hibaforrások 318<br />
- -, kialakítás szakmai kérdései 316<br />
- -, minőségbiztosítás 318, 319<br />
- -, minőségirányítási rendszer 318<br />
- -, rizikó-management, biztonság növelése 318<br />
POCT/gyorsteszt diagnosztika, szakmai felelősség 317<br />
- -, személyzet oktatása 319<br />
- -, szervezés 317<br />
- gyulladásos marker vizsgálatokban 315<br />
- hormonmeghatározás 316<br />
- intenzív terápiás ellátásban 314<br />
- ionok meghatározása 315<br />
- kardiológiai ellátásban 315<br />
- laktátvizsgálat 316<br />
- PTH-meghatározás 316<br />
- sürgősségi ellátásban 314<br />
- - klinikai kémiai vizsgálatokban 315<br />
- - toxikológiai vizsgálat 316<br />
- - véralvadás-vizsgálat 316<br />
- szívmarker vizsgálat 332<br />
- vércukorvizsgálat 315<br />
- vérgázanalízis 315<br />
- vesefunkció-vizsgálat 315<br />
- vizelet-hCG 316<br />
Point of Care Testing (POCT) 314<br />
poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE) 71<br />
- - lemez szárítása zselatinnal Popescu szerint 98<br />
polietilén-glikol (PEG) 134<br />
poliklonális antitest ellenanyag 133<br />
- gammopathia 223<br />
polipeptid 102<br />
-, intracelluláris, kimutatása szövettenyészeti sejtből 239<br />
poliriboszóma 29<br />
poliszacharid eltávolítása mintából 41<br />
polivinilpolipirolidon (PVPP) 41<br />
polymyositis/dermatomyositis 253<br />
Popescu-módszer 98<br />
porlasztásos ionizáció 178<br />
Porter, Rodney Robert 104<br />
post source decay (PSD) 182<br />
posztszintetikus módosítás 29<br />
poszttranszlációs módosítás 27, 123<br />
- - vizsgálata 66<br />
praethromboticus állapot jelei 287<br />
prealbumin-transzferrin elváltozások 223<br />
precipitáció 44, 108<br />
precipitációs módszerek 140<br />
- - automatizálása 161<br />
precipitáló reagens 45<br />
precipitátum mosáshoz 45<br />
precíziós profil görbe 197<br />
preimmun szérum 133<br />
prekallikrein 280<br />
primer sejt tenyésztése 203<br />
- sejtkultúra 51
386 Tárgymutató<br />
prionbetegség 339<br />
proakcelerin 280<br />
progresszív aktivitása 290<br />
prokalcitonin (PCT) 239<br />
prokonvertin 280<br />
prolaktin 343<br />
prolaktintermelő hypophysis adenoma 344<br />
prolingazdag nyálfehérjék 302<br />
proonkogén 321<br />
propagáció 280<br />
prostatarák tumormarker 365<br />
- - kutatás 366<br />
prostataspecifikus antigén (PSA) 365<br />
prosztetikus csoport 33<br />
proteaszóma 30<br />
proteáz 30<br />
proteázgátlás, minta-előkészítés 40<br />
proteázgátló 40<br />
protein 27, 101<br />
14-3-3 protein 339<br />
protein C (PC) 290<br />
- - defektus 290<br />
- - -, öröklött 290<br />
- S (PS) 291<br />
- - defektus 291<br />
- - -, öröklött 291<br />
proteinuria 311<br />
- előfordulása 312<br />
-, nephroticus mértékű 311<br />
-, orthostaticus 313<br />
proteolízis 40<br />
proteom 37, 65<br />
proteomika 37, 65, 361<br />
proteomikai fehérjevizsgálat 65<br />
protokollok mintaelőkészítésre 45<br />
protosz 27<br />
protrombin 280<br />
protrombin 20210A polimorfizmus 292<br />
protrombinidő (PI) 282<br />
PSA 365<br />
PSD 182<br />
PTH 343, 349<br />
- meghatározás, POCT 316<br />
- tumormarker 323<br />
pufferolt sóoldat (PBS) 45<br />
pulmonalis embolia (PE) 287<br />
PVPP 41<br />
Q<br />
quality control (QC) 249<br />
Quincke 337<br />
R<br />
rácsrost 119<br />
radiális megosztású immunofluorometrikus assay 154<br />
radioimmunoassay (RIA) 143, 145, 164<br />
-, kompetitív 147<br />
-, szendvics 147<br />
radioizotópos jelölés, antigén 137<br />
- -, ellenanyag 137<br />
raktárfehérje 120<br />
receptor 115<br />
redukálószer, minta-előkészítés 42<br />
referenciaanyag készítése 192<br />
referenciaérték 193, 194<br />
referenciarendszer 188<br />
referenciatartomány 194<br />
refolding 29<br />
rekombináns technika 345<br />
relatív index 330<br />
- standard deviáció 333<br />
releasing hormon 341<br />
repülési idő analizátor 181<br />
részecskék eltávolítása mintából 48<br />
retinolkötő fehérje, vizelet 307<br />
- protein-4 356<br />
rezisztin 356<br />
rheumatoid arthritis 253<br />
- faktor (RF) 173, 260<br />
RIA 143, 145, 164<br />
riboszóma 29, 102<br />
- peptid kötőhelye 29<br />
ribozim 113<br />
rotációs motor 111<br />
Roux, Wilhelm 203<br />
Rowe, David 104<br />
RPMI-1640 tápoldat összetétele 207<br />
rRNS 102<br />
Russell viperaméreg idő 293<br />
ruténium komplex 167
Tárgymutató<br />
387<br />
S, SZ<br />
S100 protein tumormarker 325<br />
- -, liquor 340<br />
Saccharomyces cerevisiae elleni antitest (ASCA) 263<br />
Sahachiro, Hata 104<br />
Sammons-ezüstözés 86<br />
Sanger, Frederick 116<br />
saponin 275<br />
sárgaság hatása mérésekre 172<br />
savanyú urea gél elektroforézis 73<br />
savanyú urea gél + SDS gélelektroforézis 74<br />
scan 182<br />
Schibasaburo, Kitasato 104<br />
Schirmer-teszt 298<br />
Schleiden, Matthias Jakob 203<br />
Schwaber, Jerrold 134<br />
Schwann, Theodor 203<br />
SDS 41<br />
- elektroforézis homogén vagy exponenciális gradiens<br />
poliakrilamid gélben; 2. dimenzió 81<br />
- eltávolítása mintából 47<br />
- PAGE 62<br />
- tartalmú mintapuffer 45<br />
sejt 35<br />
- anabolizmus 35<br />
- feltárás 40<br />
- katabolizmus 36<br />
- malignus transzformációja 321<br />
- tenyésztés in vitro 51<br />
sejtciklus követése sejttenyészetben 214<br />
sejtes minta előkészítése 40<br />
- modell 52<br />
sejtfúzió 134<br />
sejtkultúra/sejttenyészet 51<br />
-, daganatsejt-kultúra 51<br />
- detektálása 215<br />
- - in vitro 215<br />
-, immortalizált 51<br />
-, kitapadó 51, 205<br />
-, primer 51<br />
-, szuszpenziós 205<br />
sejtminta extrakció-szolubilizáció 45<br />
- vizsgálata 51<br />
sejtnövekedési faktor 116<br />
sejtszám meghatározás mikrogyönggyel flow citometriában<br />
248<br />
- monitorozás sejttenyészetben 213<br />
sejtszámláló automata 213<br />
sejtszuszpenzió 51, 52<br />
sejttenyészet/sejtkultúra fagyasztása 212<br />
-, fagyasztott, felolvasztása 212<br />
- fehérjemeghatározása 214<br />
- kezelése 209<br />
- kontaminációja 211<br />
- -, kezelés 211<br />
- sejtjeinek osztódása 213<br />
- sejtpopulációja 213<br />
- sejttípusainak keveredése 211, 212<br />
- súlymérése sejtszám-monitorozáshoz 213<br />
sejttenyésztés 203<br />
-, embrionális sejt 203<br />
- médiumai 207<br />
-, őssejt 204<br />
-, primer sejt 203<br />
-, transzformált sejt 204<br />
sejtvonal 51, 206<br />
short pass filter 247<br />
shuffling 69<br />
SI mértékegységrendszer 187<br />
- - alapegységei 187<br />
- - származtatott egységei 187<br />
side scatter (SSC) 240, 241, 266<br />
SIMS 177<br />
single ion recording 182<br />
Sjögren Syndrome Tear Deficient Dry Eye (SSTD) 296<br />
Sjögren-szindróma (SS) 253, 296<br />
- száraz szemmel 296<br />
Skerra 135<br />
SLE 253<br />
SLFIA 153<br />
só szennyezés 40<br />
spectral overlap 247<br />
Spemann, Hans 117<br />
SSC 241, 266<br />
SSC-CD45 kapuzás 242, 243<br />
SSTD 296<br />
stacking gél 73<br />
standardizálás állatkísérlet során 217<br />
- problémái 198<br />
Stanley, Jackie 105<br />
Starling, Ernest Henry 115<br />
sterilizálás sejttenyészetben 210<br />
stop kodon 29<br />
Straub F. Brúnó 110<br />
Streptomyces conglobatus 274<br />
struktúraalkotó fehérje 34<br />
Stuart-Prower-faktor 280
388 Tárgymutató<br />
Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay (SLFIA) 153<br />
sürgősségi ellátás, POCT 314<br />
- klinikai kémiai vizsgálat POCT 315<br />
- toxikológiai vizsgálat POCT 316<br />
- véralvadás-vizsgálat POCT 316<br />
Svedberg, Theodor 122<br />
Systėme International d’Unités (SI) 187<br />
szállítófehérje 121<br />
száraz szem szindróma 296<br />
- - -diabetesben 296<br />
szekréciós vezikula 34<br />
szekretoros IgA, könny 295<br />
- -, nyál 302<br />
szekunder ion tömegspektrometria (SIMS) 177<br />
szekvenciaanalízis 69<br />
szekvenciaazonosság 69<br />
szekvenciaillesztés 69<br />
Szent-Györgyi Albert 109<br />
szeparáló gél 73<br />
szérum (tápoldatban) 208<br />
szérum fehérje elektroforetogram 223<br />
- - -, kóros 224<br />
- - -, normális 223<br />
- - elektroforézis 222<br />
- - eltávolítása mintából 48<br />
- - elváltozás, izolált 223<br />
- - extra frakciói 223<br />
- - frakció 131<br />
- - -, a 1<br />
224<br />
- - -, a 2<br />
225<br />
- - -, b 225<br />
- - -, g 226<br />
- - vizsgálata 221<br />
- hőinaktiválása 208<br />
széruméheztetés 208<br />
szérumkiegészítő 208<br />
szérumprotein könnyben 295<br />
szervspecifikus autoimmun betegség 252<br />
szialomucin 294<br />
sziálsavas Lewis (a) antigén 324<br />
színjelölés, kombinált 245<br />
színjelöléses kapuzás 242<br />
szinkronizáció, sejttenyészet 213<br />
szisztémás kötőszöveti betegség 252<br />
- lupus erythematosus (SLE) 253<br />
szívizomsejt, neonatális, izolálása 204<br />
szolubilizáló rendszer 41<br />
szomatosztatin 343<br />
- analóg 346<br />
szöveti plazminogén aktivátor (tPA) 281<br />
- transzglutamináz (tTG) 263<br />
szövetminta extrakció-szolubilizáció 45<br />
szövettenyésztő lemez 52<br />
sztatherin, nyál 302<br />
szteroidhormon 349<br />
szubcelluláris frakcionálás 48<br />
szubsztrát 33<br />
szulfobetain 42<br />
szuszpenzióban növő sejtkultúra 51<br />
szűrés sejttenyészetben 210<br />
- tumormarker meghatározással 325<br />
T, TY<br />
TAFI 281<br />
tag 58<br />
Takamatsu 270<br />
találkozási pont 241<br />
tandem tömegspektrometria 182<br />
tápoldat antibiotikumvédelme 208<br />
- pH 208<br />
- - indikátora 208<br />
- sejttenyésztéshez 207<br />
- szűrése 210<br />
-, minimál 207<br />
-, szérum 208<br />
TAT 287, 314<br />
tau-protein, liquor 339<br />
TCA 40<br />
TCA-s kicsapás 40<br />
TDDE 296<br />
tear-deficient dry eye (TDDE) 296<br />
tenyésztőedény 206<br />
tenyésztőflaska 206<br />
térbeli konformáció 28<br />
térdeszorpció 178<br />
térionizáció 178<br />
testnedvek fehérje-összetétele 294<br />
tetrametil-rodamin-izotiocianát (TRITC) 53<br />
tGT 262<br />
Thomson, J. 177<br />
thromboemboliás kórképek 287<br />
thrombophilia 288, 289<br />
- okai 288<br />
TI 285<br />
-, megnyúlt 285<br />
timidin-kináz tumormarker 325
Tárgymutató<br />
389<br />
tiourea 41<br />
- urea lízispuffer 45<br />
tireoglobulin 325<br />
tireotrop hormon (TSH) 343<br />
- releasing hormon (TRH) 343<br />
Tiselius, Arne 59<br />
TnC 328<br />
TNF-a 356<br />
- kimutatása immunokemilumineszcenciás módszerrel<br />
238<br />
TnI 328<br />
TnT 328<br />
Tomasi, Thomas 104<br />
Tonegawa, Susumu 105<br />
totipotens őssejt 204<br />
többszörös reakciómegfigyelés 183<br />
töltéssel rendelkező vegyület eltávolítása mintából 47<br />
tömegspektrometria 175<br />
- alkalmazása 184<br />
- - gyógyszerkutatásban 184<br />
- - orvosi laboratóriumokban 185<br />
- - proteomikában 184, 361<br />
- - -, neuropeptidek 362<br />
- - -, onkológia 362<br />
- - -, újszülöttkori szűrés 362<br />
tömegspektrométer 175<br />
- analizátora 179<br />
- detektora 181<br />
-, hibrid 181<br />
- ionforrásai 176<br />
-, mintabevitel 176<br />
-, tandem 182<br />
- vákuumrendszere 175<br />
tömegspektrum 183<br />
tPA 281<br />
TPA 167, 324<br />
TRAK 263<br />
transzaminálás 30<br />
transzdukció sejttenyészetben 216<br />
transzfekció sejttenyészetben 216<br />
transzferabilitás 190<br />
transzferáz 33, 114<br />
transzferrin 225<br />
-, könny 295<br />
-, vizelet 307<br />
transzformált sejt tenyésztése 204<br />
transzkripció 28, 102<br />
transzláció 29, 102<br />
transzportfehérje/transzporter/transzportprotein 35, 121<br />
transzporter/transzportfehérje/transzportprotein 35, 121<br />
TRAP 351<br />
TRH 341, 343<br />
tributilfoszfin (TBP) 42<br />
trijódtironin 349<br />
tripropilamin (TPA) 167<br />
tripszines passzálás 209<br />
TRITC 53<br />
Triton X-100 42<br />
tRNS 29, 102<br />
trombin által aktiválható fibrinolízisinhibitor (TAFI) 281<br />
trombin-antitrombin komplex (TAT) 287<br />
trombinidő (TI) 285<br />
troponin 328, 329<br />
- C (TnC) 328<br />
- határértékek 333<br />
- I (TnI) 328<br />
- kimutatás 332<br />
- T (TnT) 328<br />
- teszt értékelés 329<br />
TSH 343<br />
TSH-receptor elleni antitest (TRAK) 263<br />
TSPA 295<br />
tumorantigén 322<br />
tumorasszociált glikoprotein (TAG 72) 324<br />
tumormarker 321<br />
- alkalmazása monitorozásra 326<br />
- - szűrésre 325<br />
- fehérje 364<br />
-, neuroendokrin 344<br />
- poszttranszlációs módosulása 321<br />
- prediktív értéke 326<br />
-, primer 321<br />
-, szekunder 321<br />
turbidimetria 140, 141<br />
-, alkalmazott antitest 163<br />
-, - közeg 163<br />
-, jel mérése 163<br />
turn-around-time (TAT) 314<br />
twilight zone 69<br />
U<br />
ubikvitin rendszer 30, 31<br />
UCTD 253<br />
ultracentrifugálás 58<br />
ultraszűrés 236<br />
unfolded protein response (UPR) 357
390 Tárgymutató<br />
unipotens őssejt 204<br />
uPA 281<br />
urea 41<br />
ureatartalmú lízispuffer 45<br />
urokináz (uPA) 281<br />
US National Reference Preparation (USNRP) 191<br />
USNRP 191<br />
UV-abszorbancia 237<br />
V<br />
vákuumionforrás 177<br />
valencia 131<br />
variációs koefficiens (CV) 333<br />
vasculitis, szisztémás 253<br />
vázfehérje, intracelluláris 109<br />
vazopresszin 343<br />
velőcső-záródási rednellenesség 224<br />
vénás thromboembolia (VTE) 287<br />
véralvadás 278<br />
- fázisai 279<br />
- inhibitorai 281<br />
- kaszkád modellje 278<br />
- sejtes modellje 279, 280<br />
véralvadási szűrőteszt 282<br />
- - értékelés 283<br />
- teszt 282<br />
vércukor vizsgálat POCT 315<br />
vérgázanalízis POCT 315<br />
vér-liquor gát 337<br />
vérplazma fehérje vizsgálata 221<br />
vérszérum fehérje vizsgálata 221<br />
vesefunkció vizsgálat POCT 315<br />
vesekárosodás 309<br />
vesetranszplantáció utáni állapot 309<br />
vezikula 34<br />
viszfatin 356<br />
vitálfestés 213<br />
vizelet egyedi fehérje meghatározás 306, 307<br />
- fehérje immunfixációs elektroforézise 232<br />
- - összetétel 305<br />
- - térkép változása 309, 310<br />
- - vizsgálat elvei 307<br />
- - -, biokémia 308<br />
- - -, dúsítás Mashall szerint 307<br />
vizelet fehérje vizsgálat, dúsítás Mashall szerint 307<br />
- összfehérje 305, 307<br />
- - megoszlása 306<br />
- - -, Laemmli-féle SDS PAG elektroforézis 306<br />
- - -, PAGE 306<br />
- - mérés 305, 306<br />
- teljes proteinkoncentráció 305<br />
- vizsgálat 305<br />
- -, proteinürítés 305<br />
- hCG POCT 316<br />
vizsgálat kontrollja 197<br />
vizsgálati módszer követelményei 197<br />
voltage pulse signal 245<br />
VTE 287<br />
W<br />
Wang-módszer, CBB-festés 89<br />
Western blot 54, 75<br />
Westgard-szabályok 200<br />
Willoughby-Lambert-ezüstözés 85<br />
Wright, Almroth 104<br />
X<br />
xerostomia 296<br />
Y<br />
Yalow 143<br />
Yalow, Rosalyn Sussman 137<br />
Z, ZS<br />
Zeiss-mirigy 294<br />
zóna elektroforézis kapillárisban 62<br />
- -, natív 60<br />
- gélelektroforézis 60<br />
zona occludens 337<br />
zselatin agglutináció 142<br />
zsírsejt fehérje 355