A fehérjekutatás modern módszertana

A fehérjekutatás
modern módszertana

A fehérjekutatás
modern módszertana
Szerkesztette: Ludány Andrea
Medicina Könyvkiadó Zrt ● Budapest, 2011
© Dr. Ludány Andrea, 2011
© Szerzők, 2011

A kiadvány a következő program keretében jelent meg:
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0054
© Prof. Dr. Ludány Andrea, 2011
Prof. Dr. Berki Tímea
Prof. Dr. Kellermayer Miklós
Prof. Dr. Kilár Ferenc
Dr. Kiss István
Prof. Dr. Komoly Sámuel
Prof. Dr. Kovács L. Gábor
Dr. Kőszegi Tamás
Dr. Liszt Ferenc
Szerzők:
Prof. Dr. Ludány Andrea
Dr. Magyarlaki Tamás †
Dr. Márk László
Dr. Mezősi Emese
Dr. Nagy Tamás
Dr. Tőkés-Füzesi Margit
Vassné Lakatos Ágnes
Prof. Dr. Wittmann István
Lektorálta:
Dr. Janáky Tamás egyetemi docens
Szegedi Egyetem, Orvosi Kémia Intézet
Dr. Szabó Antal egyetemi tanár
SE I.sz.Gyermekklinika
Medicina
A kiadásért felel a Medicina Könyvkiadó Zrt. igazgatója
Felelős szerkesztő: Benjámin Katalin
Műszaki szerkesztő: Dóczi Imre
Az ábrákat rajzolta: Olgyai Géza
Ábrák száma: 221
Azonossági szám: 3591
Terjedelem: 49,5 (A/5) ív

A könyv szerzői
Prof. Dr. Berki Tímea
PhD, Med. Habil.
egyetemi tanár
PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai
Intézet
Prof. Dr. Kellermayer Miklós
DSc
egyetemi tanár
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet
Prof. Dr. Kilár Ferenc
DSc
egyetemi tanár
PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet
Dr. Kiss István
PhD
egyetemi docens
PTE ÁOK Népegészségtani Intézet
Prof. Dr. Komoly Sámuel
DSc
egyetemi tanár
PTE KK Neurológiai Klinika
Prof. Dr. Kovács L. Gábor
MTA levelező tag
egyetemi tanár
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet
Dr. Kőszegi Tamás
PhD, Med. Habil.
egyetemi docens
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet
Dr. Liszt Ferenc
PhD
egyetemi docens
PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet
Prof. Dr. Ludány Andrea
PhD, Med. Habil.
egyetemi tanár
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet
Dr. Magyarlaki Tamás †
PhD, Med. Habil.
egyetemi docens
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet
Dr. Márk László
PhD, Dr. Habil.
egyetemi docens
PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai
Intézet
Dr. Mezősi Emese
PhD, Med. Habil.
egyetemi docens
I. sz. Belgyógyászati Klinika
Dr. Nagy Tamás
PhD
egyetemi adjunktus
PTE KK. Laboratóriumi Medicina Intézet
Dr. Tőkés-Füzesi Margit
egyetemi tanársegéd
PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet
Vassné Lakatos Ágnes
PhD
egyetemi docens
PTE KK Laboratóriumi Medicina Intézet
Prof. Dr. Wittmann István
PhD Med. Habil.
egyetemi tanár
PTE KK II.sz. Belgyógyászati Klinika
és Nephrológiai Centrum

Előszó
A fehérjekutatás modern módszerei,
proteomika a klinikai kutatásban
A többszerzős szerkesztett tankönyvet a Medicina
Könyvkiadó adja ki elektronikus formában.
2012 első negyedévétől lesz elérhető a www.tankonyvtar.hu
honlapon. A szerzők valamennyien
a Pécsi Tudományegyetem ismert és elismert
oktatói, akik az adott területeken sikeres klinikai
laboratóriumi kutatómunkát végeznek.
A könyv a klinikai laboratóriumi kutatásban
központi szerepet játszó fehérjevizsgálatok jelenleg
használatos módszertanát tárja a hallgatók
elé. Anyaga feltételez alapvető és megfelelő
biokémiai/biológiai előképzettséget.
A könyv 1–10. fejezete a fehérjevizsgálatok
módszertanát elsősorban elméleti megközelítésben
ismerteti gazdag ábraanyaggal. Fejezetről
fejezetre kitér a vizsgálati minták előkészítésére,
az alapvető elválasztási eljárásokra, funkcionális
aspektusokra, műszeres adaptációkra, a fehérjék
azonosítási lehetőségeire, valamint a mérési adatok
értékelésére.
Az utolsó, 11. fejezet 19 alfejezetben a korábban
bemutatott módszertanok közvetlen klinikai
laboratóriumi alkalmazására és diagnosztikus/
terápiás hasznosulására nyújt példákat. Ezzel
különböző kutatási irányokra tereli az olvasó
figyelmét a klinikai patológia területén. Így pl.
a véralvadástól a tumormarkerekig sor kerülhet
különböző fehérje vizsgálatokra a legújabb eljárások
szerint.
A tankönyv anyaga – a szerzők véleménye
szerint – minden bizonnyal nem csak a klinikai
laboratóriumi kutatók mesterképzéséhez, hanem
a terület iránt érdeklődő szakemberek számára is
hasznos lehet.
Pécs, 2011. november
Ludány Andrea
szerkesztő

Tartalom
Rövidítések . .................................................................. 17
1. Bevezetés (Kovács L. Gábor) . .................................................. 27
A fehérje mint az élet princípiuma . .............................................. 27
A fehérjék szerkezete, kémiai tulajdonságai ....................................... 27
Fehérjék az élő sejtben . ....................................................... 28
A fehérjék kölcsönhatásai ..................................................... 32
Fehérjék mint enzimek (katalízis) ............................................... 33
Fehérjék szerepe a struktúraalkotásban ........................................... 34
Fehérjék szerepe a transzportfolyamatokban . ...................................... 35
Sejtek és fehérjék ............................................................ 35
A sejtek anabolizmusa és katabolizmusa .......................................... 35
Az emberi szervezet és a fehérjék ............................................... 36
A fehérjekutatás forradalma: a proteomika ........................................ 37
Összefoglalás ............................................................... 37
2. A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei - a minták előkészítése .......... 39
Különféle minták előkészítése (Ludány Andrea) . ...................................... 39
Sejtes minták előkészítése ..................................................... 40
A sejtek feltárása .......................................................... 40
Interferáló anyagok inaktiválása vagy eltávolítása ................................ 40
A fehérjék szolubilizálása (oldatba vitele) ...................................... 41
A minták tárolása . ......................................................... 42
A minták előfrakcionálása az analízisekhez ....................................... 42
Eljárások (protokollok) ....................................................... 45
Sejt- és szöveti minták extrakciója és szolubilizációja ............................. 45
Az interferáló vegyületek eltávolítása a mintákból . ............................... 47
A minták előfrakcionálása . .................................................. 48
Fehérjemeghatározások . .................................................... 48
Irodalom .............................................................. 50
Sejtes minták vizsgálómódszerei (Kőszegi Tamás) ..................................... 51
Intracelluláris fehérjék kimutatása . .............................................. 51
Módszertani megközelítések ................................................... 52
Egyedi fehérjék kimutatása morfológiai módszerekkel ............................ 52
Egyedi fehérjék kimutatása egyéb módszerekkel ................................. 53
Irodalom .............................................................. 54

8 Tartalom
3. Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei (Kilár Ferenc) ...................... 57
Fehérjék extrakciója . ......................................................... 57
Fehérjék kromatográfiája ...................................................... 57
Fehérjék frakcionálása ultracentrifugával ......................................... 58
Fehérjék vizsgálata elektroforézissel ............................................. 59
Fehérjék kapilláris-elektroforetikus elemzése. Chip-elektroforézis ................... 59
Fehérjék azonosítása és meghatározása a proteomikában ............................. 65
Fehérjék bioinformatikája ..................................................... 66
Irodalom .............................................................. 70
4. Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban -
Fehérjeelválasztási és fehérjedetektálási technikák ............................... 71
(Ludány Andrea, Kőszegi Tamás)
Elektroforézis mint elválasztási technika . ......................................... 71
A klinikai kutatásban használatos módszerek áttekintő ismertetése ................... 71
Gélelektroforetikus technikák - PAGE ...................................... 71
Preparatív és analitikai PAGE-eljárások ..................................... 72
Homogén és gradiens gélek ............................................... 72
Natív és denaturáló PAGE-rendszerek . ...................................... 73
Izoelektromos fokuszálások poliakrilamid- (PAG) és agarózgélben ................ 73
Kétdimenziós elválasztások kombinációi .................................... 74
Fehérjedetektálási technikák a klinikai kutatómunkában ........................... 74
Izotópos jelölés . ........................................................ 75
Festékkötéses jelölés .................................................... 75
Ezüstözés ............................................................. 75
Fluoreszcens festés . ..................................................... 75
Immunreakción alapuló jelölés ............................................ 75
Protokollok - A klinikai kutatásban általunk adaptált és alkalmazott elválasztási
és fehérjejelölési eljárások .................................................. 76
Elválasztási technikák ........................................................ 76
Nem denaturáló és denaturáló PAGE gélrudakban és lapgéleken .................... 76
Nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis (Ornstein és Davis szerint) ............. 76
Denaturáló SDS-gélelektroforézis (Laemmli szerint) . ............................. 77
Kétdimenziós PAGE denaturáló rendszerben .................................... 79
Izoelektromos fokuszálás gélcsövekben ..................................... 80
Második dimenzió; SDS-elektroforézis homogén vagy exponenciális gradiens
poliakrilamidgélben . ................................................... 81
Izoelektromos fokuszálás lapgélen - denaturáló rendszerben (az O’Farrell-technika
első dimenziójának megfelelő rendszer) ..................................... 84
Detektálási technikák . ........................................................ 84
Gélelőkészítés autoradiográfiához . ............................................ 84
Fluorográfiás detektálás (Bonner és Laskey szerint) ............................ 84
Ezüstözési eljárások ....................................................... 85
Fehérjék direkt ezüstözése egydimenziós SDS lapgélen (Giulian, G. G.) . ........... 85

Tartalom
9
Kombinált (gyors) ezüstözési eljárás leszárított festetlen, ill. festett „nedves”
géllemezeken (Willoughby és Lambert) .................................... 85
Ezüstözéses fehérjedetektálás ultravékony PAGE-lemezeken (Sammons) ........... 86
A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása (Marshall szerint) ................... 87
Fehérjék detektálása Marshall szerint, módosított ultraszenzitív
ezüstözési eljárással . ................................................... 87
MS-kompatibilis fehérjedetektálások poliakrilamidgélen .......................... 89
MS-analízishez ajánlott CBB-festés (Wang) .................................. 89
MS-kompatibilis ezüstfestés gélben (Gromova) ............................... 89
Immunoblotting technikák fehérjék azonosítására ................................ 90
Mini-Trans-Blot készülék használata („nedves” eljárás) ......................... 90
Immunoblotting technika a fehérjék azonosítására (semi-dry blotting) . ............. 93
Az immunreakció „előhívása” ............................................. 94
Poliakrilamidgél-lemez szárítása zselatinnal (Popescu szerint) ...................... 98
Irodalom .............................................................. 98
5. Fehérjék vizsgálata biológiai funkcióik alapján (Kellermayer Miklós) . ............... 101
Immunglobulinok, antitestek és a komplementrendszer ............................. 104
Történeti áttekintés ....................................................... 104
Az immunglobulonok, az antitestek és a komplementek szerkezete,
molekuláris sajátosságai . ................................................ 105
Az immunglobulinok, az antitestek és a komplementrendszer funkciói . .............. 106
Az immunglobulinok és az antitestek vizsgálata ................................ 107
Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék, intracelluláris vázfehérjék (citoszkeleton) .......... 109
Történeti áttekintés ....................................................... 109
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék szerkezete,
molekuláris sajátosságai . ................................................ 110
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék funkciói . .......... 112
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék funkcióira
irányuló vizsgálatok .................................................... 112
Enzimek, biokatalizátorok .................................................... 112
Történeti áttekintés ....................................................... 113
Az enzimek, biokatalizátorok molekuláris sajátosságai ........................... 113
Az enzimek funkciói ...................................................... 114
Az enzimek, biokatalizátorok funcióira irányuló vizsgálatok . ...................... 114
Hormonok ................................................................ 115
Történeti áttekintés ....................................................... 115
A hormonok molekuláris sajátosságai . ........................................ 115
A hormonok funkciói ..................................................... 116
A hormonok vizsgálata funkcióik alapján . ..................................... 116
A sejtnövekedést befolyásoló fehérjék, peptidek, a sejtnövekedési faktorok,
a biológiai válaszmódosítók („biological response modifiers”) ..................... 116
Történeti áttekintés ....................................................... 116
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai válaszmódosítók” molekuláris sajátosságai . .... 116
A sejtnövekedési faktorok, a “biológiai válaszmódosítók” funkciói ................. 117

10 Tartalom
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai válaszmódosítók” vizsgálata funkcióik
alapján .............................................................. 117
Extracelluláris szerkezeti elemek . .............................................. 117
Történeti áttekintés ....................................................... 118
Az extracelluláris, főként szerkezeti elemként funkcionáló fehérjék molekuláris
sajátosságai . .......................................................... 118
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék funkciói .................................. 119
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék vizsgálata ................................ 119
Raktárak .................................................................. 120
Történeti áttekintés ....................................................... 120
A raktárfehérjék molekuláris sajátosságai . ..................................... 120
A raktárfehérjék funkciói .................................................. 120
A fehérjeraktárak funkcióira irányuló vizsgálatok ............................... 121
Transzportőrök (szállítófehérjék) . .............................................. 121
Történeti áttekintés ....................................................... 122
A transzportőrök, a szállítófehérjék molekuláris sajátosságai ...................... 122
A transzporterek, a szállítófehérjék funkciói . ................................... 122
A transzportfehérjék azonosítása funkcióik alapján .............................. 122
Ligandumok ............................................................... 122
Esszenciális táplálékok ...................................................... 123
Irodalom ............................................................. 123
6. Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában - Specifikus fehérjekimutatások
oldatban és szilárd fázisú rendszerekben (Berki Tímea) ........................... 125
Immunológiai alapok ........................................................ 126
Immunológiai fogalmak ................................................... 126
Antitest-előállítási módszerek . .............................................. 132
Ellenanyagok, antigének jelölése ............................................ 136
Konjugálási módszerek .................................................... 139
Immunológiai alapú laboratóriumi módszerek csoportosítása ........................ 139
Antigén-antitest reakciókon alapuló módszerek ................................. 139
Precipitáción alapuló eljárások . ........................................... 140
Agglutináción alapuló módszerek ......................................... 141
Immunoassay . ........................................................... 142
Immunoassay-típusok csoportosítása . ...................................... 142
Módszerek ........................................................... 145
Az immunoassay-t befolyásoló faktorok .................................... 156
Az immunoassay-k fejlesztési irányai ...................................... 158
Irodalom ............................................................. 159
7. Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban ...... 161
Automatizáció a fehérjeanalitikában (Kőszegi Tamás) ................................ 161
Általános szempontok ....................................................... 161
Immunprecipitáción alapuló módszerek ......................................... 161

Tartalom
11
Immunturbidimetriás módszerek ............................................... 162
A turbidimetriás jel mérése ................................................. 163
Egyéb megfontolások ..................................................... 163
Nefelometria .............................................................. 164
Immunkémiai analitikai technikák (immunoassay-k) ............................... 164
Történeti áttekintés ....................................................... 164
Az immunoassay-kben leggyakrabban alkalmazott jelölések . ...................... 165
A mért jel detektálásának módjai ............................................ 167
Immunoassay-k típusai a közeg kialakítása szerint . .............................. 168
Immunoassay-k típusai a reakcióelv szerint .................................... 169
Néhány példa a heterogén eljárások technikai megoldásaira ....................... 169
Példa homogén eljárás technikai megoldására .................................. 170
Az immunoassay-k kalibrációjának módjai .................................... 171
Analitikai interferenciák ..................................................... 172
Interferenciák kiküszöbölésének lehetőségei ................................... 173
Különböző immunkémiai módszerek érzékenységének összehasonlítása ............... 174
Irodalom ............................................................. 174
Műszeres analitikai lehetőségek - Tömegspektrometria (Márk László) . ................... 175
A tömegspektrométer elvi felépítése ............................................ 175
A vákuumrendszer . ....................................................... 175
Mintabevitel ............................................................ 176
Ionforrások ............................................................. 176
Analizátor .............................................................. 179
Detektor . ............................................................... 181
Fragmentálás és tandem tömegspektrometria ..................................... 182
A tömegspektrum . .......................................................... 183
A tömegspektrometria főbb alkalmazási területei .................................. 184
Irodalom ............................................................. 185
8. A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai -
Dimenziók, vonatkoztatások (Liszt Ferenc) ..................................... 187
Mértékegységrendszerek ..................................................... 187
Az analitikai referenciarendszer és elemei ....................................... 188
A fehérjemeghatározások standardizálása ........................................ 190
Normálérték és referenciaérték ................................................ 193
Irodalom ............................................................. 194
9. A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége (Lakatos Ágnes) ......... 197
Irodalom ............................................................. 201

12 Tartalom
10. Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban (Nagy Tamás) . .................. 203
Előzmények ............................................................... 203
Sejttenyésztés . ............................................................. 203
Sejttípusok . ............................................................. 203
Tenyésztőedények, flaskák ................................................. 206
Inkubátor ............................................................... 206
Médiumok .............................................................. 207
A tenyészetek kezelése .................................................... 209
A tenyészet kontaminációja . ................................................ 211
Fagyasztás, fagyasztásból való felolvasztás .................................... 212
A tenyészet sejtjeinek osztódása, sejtszámváltozások . ............................ 213
Detektálás - A sejtkultúra állapotának ellenőrzése, az állapot változtatása ............ 215
Állatkísérleti modellek . ...................................................... 216
Irodalom ............................................................. 219
11. A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában -
Az új módszertanok klinikai hasznosulása az orvosi kutatólaboratóriumban ........ 221
A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai (Tőkés-Füzesi Margit) .................... 221
A plazmafehérjék általános áttekintése .......................................... 221
Plazmafehérje-csoportok és vizsgálatuk ......................................... 222
Összfehérje ............................................................. 222
Albumin . ............................................................... 222
A plazmafehérjék elektroforézise ............................................ 222
A különböző frakciókban vándorló jelentősebb fehérjék rendellenességei
betegségekben ........................................................ 224
Az albuminfrakcióban található fehérje ..................................... 224
Az α 1
-frakcióban található fehérjék ........................................ 224
Az α 2
-frakcióban található fehérjék ........................................ 225
A β-frakcióban található fehérjék . ......................................... 225
A γ-frakcióban található fehérjék - Az immunglobulinok . ...................... 226
Irodalom ............................................................. 233
Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása ..................... 234
(Kőszegi Tamás)
A kis molekulatömegű fehérjék jellemzői ........................................ 234
A kis molekulatömegű fehérjék kimutatási lehetőségei . ............................. 235
Módszertani megközelítés . ................................................. 235
Előzetes frakcionálást, dúsítást alkalmazó módszerek ............................ 236
Ultraszűrés ........................................................... 236
Méretkizárásos kromatográfia (gélszűrés) ................................... 236
Acetonitriles (ACN) kicsapás . ............................................ 236
Perklórsavas (PCA) módszer ............................................... 236
Perklórsavas (PCA) kicsapás ............................................. 236
Mennyiségi mérések . ................................................... 237
Perklórsavas (PCA) kicsapás kombinálása Western blot módszerrel .............. 237

Tartalom
13
Egyedi fehérjék kimutatása immunanalitikai módszerrel (immunoassay) ............. 238
Intracelluláris polipeptid kimutatása szövettenyészeti sejtekből .................... 239
Irodalom ............................................................. 239
Sejtes elemek differenciálása: flow citometria - Bevezetés a flow citometriába ............. 240
(Magyarlaki Tamás)
Definíciók és célkitűzések .................................................... 240
Műszeres áttekintés ......................................................... 240
Az egyes sejtek lézeres vizsgálata .............................................. 241
Multiparaméteres (többparaméteres) analízis perifériás vérsejteken (PBC) .............. 242
Fluoreszcencia ............................................................. 243
Irodalom ............................................................. 250
Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei (Berki Tímea) .......................... 251
Az autoimmun betegségek jellemzői . ........................................... 251
Az autoimmun betegségek típusai . ........................................... 252
Az autoimmun betegségek diagnózisának kérdései .............................. 253
Az autoantitest-meghatározás módszertana . ...................................... 254
Antinukleáris autoantitestek a szisztémás kötőszöveti betegségek elkülönítésében . ..... 254
Indirekt immunfluoreszcencia ............................................ 254
ANA ELISA-szűrőteszt (screen) .......................................... 255
ANA-immunoblot ..................................................... 256
Multiplex autoantitest-meghatározási módszerek ............................. 257
A laboratóriumi gyakorlatban mért autoantitestek . ................................. 259
Az autoimmun betegségekben elsősorban meghatározott autoantitestek .............. 259
A gyakorlatban vizsgált egyéb autoantitestek ................................... 260
Szervspecifikus autoantitestek . .............................................. 262
Irodalom ............................................................. 265
A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata (Berki Tímea) ................... 266
Morfológiai módszerek ...................................................... 266
Áramlási citometria ......................................................... 266
Mikroszkópos módszerek .................................................... 270
Citokinek kimutatása ........................................................ 273
Az ELISPOT-módszer . .................................................... 277
Irodalom ............................................................. 278
A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana (Tőkés-Füzesi Margit) ............. 279
A véralvadás folyamata ...................................................... 279
Véralvadási tesztek ......................................................... 282
Irodalom ............................................................. 286
A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája (Tőkés-Füzesi Margit) ................ 287
D-dimer-meghatározás . ...................................................... 287
Thrombophiliák laboratóriumi diagnosztikája . .................................... 288
Antitrombin- (AT-) defektusok .............................................. 290
Protein C (PC-) defektusok ................................................. 290
Protein S (PS-) defektusok ................................................. 291

14 Tartalom
Aktivált Protein C (APC-) rezisztencia . ....................................... 291
Protrombin 20210A polimorfizmus . .......................................... 292
Antifoszfolipid-antitestek, lupus-antikoaguláns kimutatása ........................ 292
Irodalom ............................................................. 293
A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése ............................ 294
A könny vizsgálata (Ludány Andrea) . ........................................... 294
A könny fiziológiai szerepe és összetétele ..................................... 294
A könny fehérjéi ......................................................... 294
A könnyfehérjék vizsgálata – klinikai diagnosztikai lehetőségek . ................... 296
Szemészeti vonatkozások – a száraz szem szindróma .......................... 296
A könnyfehérjék vizsgálata szisztémás betegségekben ......................... 297
Ajánlott módszertani megközelítések a könny vizsgálatakor ....................... 298
Irodalom ............................................................. 300
A nyál fehérjéinek vizsgálata (Kőszegi Tamás) .................................... 301
A nyál biológiai funkciói . .................................................. 301
A nyál fehérje-összetétele .................................................. 301
A nyálfehérjék vizsgálati módszerei .......................................... 302
Funkcionális vizsgálatok . .................................................. 303
Irodalom ............................................................. 304
Vizeletvizsgálatok ............................................................. 305
Vizeletvizsgálatok a proteinürítés tükrében (Ludány Andrea) . ........................ 305
Klinikai laboratóriumi analitikai módszerek . ................................... 305
Az emberi vizelet fehérjéi ............................................... 305
A fehérjék mennyiségi mérése ............................................ 305
A vizeletfehérjék megoszlási képének vizsgálata ............................. 306
Vizeletfehérjék klinikai biokémiája és információs értékei ........................ 308
Irodalom ............................................................. 310
A proteinuria klinikai szempontjai (Wittmann István) . .............................. 311
Fogalmak, definíciók . ..................................................... 311
A proteinuria, microalbuminuria kialakulása ................................... 311
A proteinuria, microalbuminuria előfordulása és jelentősége . ...................... 312
Az albuminuria meghatározása .............................................. 312
Meghatározás méretkizárásos kromatográfiával .............................. 312
A proteinuria, microalbuminuria meghatározását befolyásoló tényezők . ........... 312
Irodalom ............................................................. 313
Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) -
A POCT diagnosztikus értékei, a vizsgálatok hitelességének ellenőrzése (Liszt Ferenc) . ...... 314
A betegellátás klinikai eredményességét javító POCT-gyakorlat lehetőségei
a sürgősségi és intenzív terápiás ellátásban . .................................... 314
A POCT-gyakorlat kialakításának szakmai kérdései ................................ 316
A POCT-gyakorlat minőségbiztosítása .......................................... 318
A POCT-diagnosztika hibaforrásai ........................................... 318
Rizikó-management a POCT területén . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
A POCT-gyakorlat minőségirányítási rendszere ................................. 318
Irodalom ............................................................. 319

Tartalom
15
Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban (Kőszegi Tamás) .............. 321
A tumormarkerek jellemzői ................................................... 321
A tumormarker definíciója ................................................. 321
Általános szempontok ....................................................... 321
Peptid-fehérje tumormarkerek ................................................. 322
A fehérje természetű tumormarkerek extracelluláris térbe kerülésének
mechanizmusa ........................................................ 322
Tumormarkerek használata az orvosi gyakorlatban . ................................ 325
Irodalom ............................................................. 327
Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban
(Ludány Andrea, Kőszegi Tamás) ................................................. 328
Az akut myocardialis infarctus diagnózisa ....................................... 328
Az akut coronaria-szindróma jelenlegi cardialis markerei ........................... 328
A cardialis markerek szerepe az akut coronaria-szindróma terápiás döntéseiben .......... 332
Laboratóriumi medicina és a troponinok ......................................... 332
Cardialis markerek krónikus vesebetegségben és nem ischaemiás szívbetegségben ....... 333
Sürgősségi cardialis markerek ................................................. 334
Irodalom ............................................................. 336
A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai (Komoly Sámuel) ............................. 337
Irodalom ............................................................. 340
A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban . ........... 341
(Mezősi Emese, Kőszegi Tamás)
A neuroendokrin rendszer és hormonjai ......................................... 341
A neuroendokrin rendszer betegségei, a hormontermelés változásai ................... 342
A fehérje- és peptidhormonok meghatározásának klinikai jelentősége és nehézségei ...... 344
A peptidhormonok kutatásának eredményei .................................... 345
Irodalom ............................................................. 346
A csontanyagcsere fehérjemarkerei (Kőszegi Tamás) . ................................. 347
A csontrendszer ............................................................ 347
A csontanyagcsere .......................................................... 348
Osteoblastok által termelt faktorok ........................................... 348
Osteoclastok által termelt faktorok ........................................... 349
A csontanyagcsere endokrin szabályozása ..................................... 349
A leggyakoribb csontanyagcsere-betegségek ..................................... 350
Irodalom ............................................................. 351
A metabolikus szindróma és a fehérjék (Wittmann István) .............................. 353
A metabolikus szindróma definíciói . ............................................ 353
A metabolikus szindróma előfordulása .......................................... 354
A metabolikus szindróma patogenezise . ......................................... 354
Az inzulin szerepe ........................................................ 354
Fehérjék az inzulin kivételével .............................................. 355
Obesitasban a zsírsejtek által termelt proteinek ............................... 355
Egyéb hormonok ...................................................... 357

16 Tartalom
Az inzulin intracelluláris jelátvitelében szerepet játszó proteinek és működésük
károsodása metabolikus szindrómában ........................................ 357
Irodalom ............................................................. 359
A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában ............. 361
(Márk László)
Irodalom ............................................................. 363
A daganatok epidemiológiai biomarkerei (Kiss István) ................................ 364
Irodalom ............................................................. 368
Tárgymutató ................................................................ 369

Rövidítések
A
A2M α 2
-makroglobulin
AAT α 1
-antitripszin
ABC avidin-biotin-peroxidáz komplex
ACC Amerikai Kardiológiai Kollégium
ACN acetonitril
ACR albumin-kreatinin hányados;
albumin-creatinin ratio
ACS akut coronaria szindróma
ACT α 1
-antikimotripszin
ACTH adrenokortikotrop hormon;
corticotropin; adrenocorticotropic hormone
ADH antidiuretikus hormon
ADP adenozin-difoszfát
AF antinukleáris faktor
AFP α-fötoprotein
AGP savanyú glikoprotein
AIDS szerzett immunhiányos szindróma;
acquired immunodeficiency syndrome
AIH autoimmun hepatitis
α 1
-AT α 1
-antitripszin
AMI akut myocardialis infarctus
AMPK adenozin-monofoszfát-kináz
AMPPD dinátrium 3-(4-metilspiro-[1,2-dioxetán-3,2′-triciklo-[3.3.1.1]dekán]-4-il) fenilfoszfát
ANA antinukleáris antitest
ANCA antineutrofil citoplazma elleni antitest
ANNA-1 antineuronalis nukleáris antigén 1
ANP A típusú natriuretikus peptid; atrialis natriuretikus peptid
AP alkalikus foszfatáz
APC antigénprezentáló sejt
APCI légköri nyomású kémiai ionizáció; atmospheric pressure chemical ionization
APCI, APPI fotoionizáció
APS antifoszfolipid-szindróma
APTI aktivált parciális tromboplasztin idő
ARF ADP-ribozilációs faktor
ARIS Apoenzim Reaktivációs Immunoassay
ATCC American Type Culture Collection
ATP adenozin-trifoszfát; adenosine triphosphate

18 Rövidítések
B
BAP
BDGF
BIPM
B 2
M
BMI
BMP
BNP
BPI
BSA
csontspecifikus alkalikus foszfatáz
csont eredetű növekedési faktor
Bureau International des Poids et Mesures
β 2
-mikroglobulin
testtömeg-index; body mass index
bone morphogenetic protein
B típusú natriuretikus peptid; brain natriuretic peptide; agyi natriuretikus peptid
bactericidal/permeability increasing protein
marha-szérumalbumin; bovin serum albumin
C
CAH krónikus aktív hepatitis
CBB Coomassie Brilliant Blue
CCD charge-coupled device
CCP ciklikus citrullinált peptid, filaggrin
CD
cluster of differentiation
CDR komplementaritást detektáló régió
CE
kapilláris-elektroforézis; capillary electrophoresis
CEA carcinoembryonalis antigén
CEDIA Cloned Enzyme Donor Immunoassay
CER cöruloplazmin
CHCA, HCCA α-ciano-4-hidroxifahéjsav; α-cyano-4-hydroxycinnamic acid
CI
kémiai ionizáció; chemical ionization
CID collision induced dissociation
CIDP krónikus inflammatiós demyelinisatiós neuropathia
CIEEL kémiailag indukált elektroncserélő lumineszcencia
CK
kreatin-kináz
CK-BB kreatin-kináz BB izoenzim (agy; brain)
CK-MB kreatin-kináz MB izoenzim (szív)
CK-MM kreatin-kináz MM izoenzim (izom; muscle)
CLIA Chemiluminescent Immunoassay
CMC kritikus micelláris koncentráció
CMIA kemilumineszcens mágneses immunoassay
CMV citomegalovírus
CNP C típusú natriuretikus peptid
CP
cöruloplazmin
CRAB calcium, renal, anaemia, bone
CREST calcinosis, Raynaud-jelenség, oesophagusmotilitás zavara, sclerodactylia,
teleangiectasia
CRMP5 Collapsin Response Mediator Protein
CRP C-reaktív protein
CT
számítógépes rétegvizsgálat; komputer-tomográfia; computer tomography
CV
variációs koefficiens

Rövidítések
19
D
DAB
DCCT
DELFIA
DHB
DM
DMSO
DNS
DPD
DPP-4
dsDNS
DTE
DTT
diaminobenzidin
Diabetes Control and Complications Trial
késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay
2,5-dihidroxi-benzoesav; 2,5-dihydroxybenzoic acid
diabetes mellitus
dimetil-szulfoxid
dezoxiribonukleinsav; deoxyribonucleotic acid; DNA
dezoxi-piridinolin
dipeptidil-peptidáz-4
kétszálas DNS; double stranded DNA
ditioeritritrol
ditiotreitol
E
EBV Epstein-Barr-vírus
ECL enhanced chemiluminescence
ECLIA elektrokemilumineszcenciás immunoassay
EDE párolgáson alapuló száraz szem; evaporative dry eye
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav; ethilenediaminetetraacetic acid
EGF epidermalis növekedési faktor; epidermal growth factor
EGTA etilénglikol-tetraacetát
EIA enzimimmunoassay
EIHIA Enzyme Inhibitory Homogeneous Immunoassay
EKG elektrokardiográfia
ELISA enzyme-linked-immuno-sorbent-assay
ELISPOT enzyme-linked immunosorbent spot
EMIT enzyme-multiplied immunoassay technique
ENA extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek
eNOS endothelialis nitrogén-monoxid-szintáz
EPCA early prostate cancer antigen
EPO erythropoietin
EQA external quality assessment; külső minőségellenőrzési rendszer
ER endoplazmatikus retikulum; endoplasmic reticulum
ERK extracelluláris receptor-kináz
ESI elektroporlasztásos ionizáció; ElectroSpray Ionization
ESI-MS elektrospray ionizációs mass spectrometry
ETD electron transfer dissociation
F
F ab
FAB
FACS
fragment antigen binding
gyors atombombázás; fast atom bombardment
fluorescence activated cell electron transfer dissociation, ETD sorting

20 Rövidítések
FAD
FBS
F c
FCM
FD
FGF
FI
FIA
FIB
FITC
FL
FLC
FPIA
fPSA
FRET
FSC
FSH
flavin-adenin-dinukleotid; flavin adenine dinucleotide
foetal Bovine Somatotrophin)
fragment crystallizable
flow cytometry; áramlási citometria
térdeszorpció
fibroblast növekedési faktor; fibroblast growth factor
térionizáció
fluoreszcens immunoassay
gyors ionbombázás; fast ion bombardment
fluoreszcein-izotiocianát
fluorescent scatter
szabad könnyűlánc; free light chain
fluoreszcenciapolarizációs immunoassay
szabad (free) PSA
fluoreszcenciarezonancia-energiatranszfer
forward scattered
folliculusstimuláló hormon
G
GAPDH
GC-MS
G-CSF
GDF9
GFP
GIP
GLP-1
GLUT
GM-CSF
GOT
GPC
GPT
glicerinaldehid-foszfát-dehidrogenáz
gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria; Gas Chromatography-Mass
Spectrometry
granulocyte-colony stimulating factor
growth differentiation factor-9
green fluorescent protein
glukózdependens inzulinotrop peptid
glukagonszerű peptid-1
glukóztranszporter
granulocyte-macrophage colony stimulating factor
glutamin-oxálecetsav-transzamináz; aszpartát-aminotranszferáz (AAT)
gyomor parietalis sejt
glutamin-piroszőlősav-transzamináz
H
HAMA heterogén anti-mouse (antiegér) antitest
Hb
hemoglobin
HbCO karboxihemoglobin
HBV hepatitis B vírus
HCCA, CHCA α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav
HCDM Human Cell Differentiation Molecules
HCG, hCG humán koriogonadotropin
HCV hepatitis C vírus
HDGF hepatoma-derived growth factor
HDL
high density lipoprotein

Rövidítések
21
HE humán epididymisprotein
HEp-2 sejt Human Epithelioma Type 2 Cells
HGF hepatocyte growth factor
hGH humán növekedési hormon; human growth hormone
HIS kórházi számítógépes rendszer
HIV humán immundeficiencia-vírus
HLB hidrofil/lipofil egyensúly (balansz)
HLDA Humán Leukocyta Differenciálódási Antigén
Hp
haptoglobin
HPLC nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia; High Performance Liquid Chromatography
HPT haptoglobin
HRP torma- (horseradish) peroxidáz
HS CRP High-Sensitive CRP
HUVS hypocomplementaemiás-urticariás vasculitis szindróma
HYDRAGEL agarózgél-elektroforézis
I
IA
immunoassay
IDDM idiopathiás diabetes mellitus
IDF Nemzetközi Diabetes Szövetség
ID-GCMS izotóphígításos gázkromatográfia/tömegspektrometria
IE
immunelektroforézis
IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
IFE immunfixáció
IFG emelkedett éhgyomri vércukorszint; impaired fasting glucose
IFN interferon
Ig
immunglobulin
IGF inzulinszerű növekedési faktor; insulin-like growth factor
IGT csökkent glukóztolerancia; impaired glucose tolerance
IIF
indirekt immunfluoreszcencia
IL-6 interleukin 6
ILAC International Laboratory Accreditation Cooperation
IMA ischaemia okozta módosult albumin
IRS inzulinreceptor-szubsztrát
ISD in source decay
IUIS International Union of Immunological Societies
IVD in vitro diagnosztikum
IVDD In Vitro Diagnostical Directive; in vitro diagnosztikai irányelv
IVF in vitro fertilizáció
J
JCA
JCTLM
juvenilis krónikus arthritis
Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine

22 Rövidítések
K
KIR
KLH
központi idegrendszer
Keyhole Limpet Hemocyanin (limpet: kürtcsiga)
L
LC
LC-ESI
LC-ESI-MS
LCM
LC-MS/MS
folyadékkromatográfia; fluid chromatography
folyadékkromatográfiás elektroporlasztásos ionizáció;
Liquid Chromatography Electron Spray Ionization
folyadékkromatográfiás elektroporlasztásos tömegspektrométer;
Liquid Chromatography Electron Spray Ionization Mass Spectrometry
lézer-disszekció; laser capture microdissection
folyadékkromatográfiával kapcsolt tandem tömegspektrometria
(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
lézerdeszorpciós ionizáció
low density lipoprotein
large granular lymphocyte
luteinizáló hormon
LDI
LDL
LGL
LH
1
LIF lézerindukált fluoreszcencia
2
LIF leukaemiainhibitor faktor
LIR
LIS
LKM
LSIMS
laboratóriumi informatikai rendszer
laboratóriumi számítógépes rendszer
máj-vese mikroszóma; liver-kidney microsomal
folyadék szekunderion tömegspektrometria
M
MALDI
MALDI-MS
MALDI-TOF
MALDI-TOF MS
MAPK
MB
MBS
MCP
MCTD
MEIA
MetHb
MFI
MGUS
MHC
mátrix segített lézerdeszorpciós ionizáció; Matrix-Assisted Laser Desorption/
Ionization
mátrixszal segített lézer-deszorpciós-ionizációs mass spectrometry
mátrixszal segített lézer-deszorpciós-ionizációs repülési idő tömegspektrometria
mátrix segítette lézerdeszorpciós ionizációt alkalmazó repülési idő
tömegspektrometria; Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Time-of-Flight Mass Spectrometry
mitogén aktiválta protein-kináz
microbead; mikrogyöngy
m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter
monocyta kemoattraktáns protein
kevert kötőszöveti betegség; mixed connective tissue disease
Microparticle Enzyme Immunoassay
methemoglobin
mean fluorescent intensity; átlag fluoreszcencia
monoklonális gammopathia nem meghatározott jelentőséggel;
monoclonal gammopathies with undetermined significance
major histocompatibility complex

Rövidítések
23
MIF
miRNS
MPGN
MPO
MR
mRNS
MS
MSH
mTOR
MUP
migrációt gátló faktor
mikro-RNS
membranoproliferativ glomerulonephritis
mieloperoxidáz
mágneses rezonancia képalkotás
hírnök RNS; messenger RNS
tömegspektrometria; mass spectrometry
melanocytastimuláló hormon
mammalian target of rapamycin
4-metil-umbelliferon-foszfát
N
NACB National Academy of Clinical Biochemistry
NAD + oxidált nikotinamid-adenin-dinukleotid
NADH redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid
NADP nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NDAS nem differenciált autoimmun betegség
NDC nem differenciált collagenosis
NGF nerve growth factor
NGSP National Glycohemoglobin Standardization Program
NHS N-hidroxiszukcinimid
NO nitrogén-monoxid
NSE neuronspecifikus enoláz
NSTD Non-Sjögren Tear Deficient Dry Eye
NSTEMI non-ST-szegment emelkedés myocardialis infarctus
NT-pro BNP N-terminális pro-B típusú natriuretikus peptid
O
OGP
oligoklonális gammopathia
P
PACAP adenilát-cikláz-aktiváló polipeptid
PAG poliakrilamidgél
PAGE poliakrilamid-gélelektroforézis
1
PAP peroxidáz-antiperoxidáz
2
PAP prostata savi foszfatáz
1
PBC primer biliaris cirrhosis
2
PBC vérsejtek
PBS pufferolt sóoldat
PCA perklórsav
PCR polimeráz-láncreakció; Polymerase Chain Reaction
PD
plazmadeszorpció

24 Rövidítések
PDGF
PDK
PE
PerCP
PHA
PI
PIGF
PKC
PMA
PMF
PMSF
POC
POCT
PPO
PSA
PSC
PSS
PSD
PTC
PTH
PYD
thrombocyta eredetű növekedési faktor; platelet-derived growth factor
foszfoinozitiddependens protein-kináz
fikoeritrin
peridinin-klorofill-protein
fitohemagglutinin
protrombinidő
placental growth factor
protein-kináz C
forbol-12-mirisztát-13-acetát
Peptide Mass Fingerprinting
fenil-metil-szulfonil-fluorid
point-of-care
point of care testing; point-of-care test
difeniloxazol
prostataspecifikus antigén
primer sclerotizáló cholangitis
progresszív szisztémás sclerosis
post source decay
procalcitonin
parathormon
piridinolin
Q
QC
quality control
R
RA
RAAS
RANKL
RES
RF
RIA
RNP
RNS
rRNS
rheumatoid arthritis
renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer
receptor aktivált nukleáris faktor k-B ligand
reticuloendothelialis systema; reticuloendothelialis rendszer; monocyta-macrophag
rendszer
rheumatoid faktor
radioimmunoassay
ribonucleoprotein (particle)
ribonukleinsav; ribonucleotic acid; RNA
riboszóma RNS
S
SA
SDS
SELDI-MS
mustársav
nátrium-dodecil-szulfát; Sodium Dodecyl Sulphate
felület segítette lézerdeszorpciós/ionizációs tömegspektrometria; Laser Desorption
Ionization Mass Spectrometry

Rövidítések
25
SI
SIMS
siRNS
SLE
SLFIA
SMA
snuRNS
SOD
SPDE
SPE
srpRNS
SS
SSC
STEMI
Système International d’Unités; Mértékegységek Nemzetközi Rendszere
szekunder ion tömegspektrometria
short interfering RNA
szisztémás lupus erythematosus
Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay
simaizom elleni antitestek; smooth muscle antibodies
mag-RNS
szuperoxid-dizmutáz
szilárd fázisú dinamikus extrakció; Solid Phase Dynamic Extraction
szérumfehérje elektroforézis
mag-RNS
Sjögren-szindróma
side scatter
ST szegment emelkedéssel járó akut myocardialis infarctus
T
TAG tumorasszociált glikoprotein
TAT turn around time; leletátfordulási idő
TBP tributilfoszfin
TBS TRIS pufferolt sóoldat
TCA triklórecetsav
TDDE kis könnytartalmon alapuló száraz szem; tear-deficient dry eye
TEMED N,N,N,N-tetra-metilén-diamin
Tg tireoglobulin
TGF-a transforming growth factor alpha
TGF-b transzformáló növekedési faktor-β; transforming growth factor beta
TK timidin-kináz
TNF-a tumour necrosis factor alpha
TnC troponin C
TnI troponin I
TnT troponin T
TOF repülési idő (analizátor); time-of-flight
TPA tripropilamin
TPA szöveti (tissue) polipeptid-antigén
1
TPO thrombopoietin
2
TPO pajzsmirigy-peroxidáz
tPSA total PSA
TRAP tartarátrezisztens savanyú foszfatáz
TRF transzferrin
TRH tireotrop releasing hormon
TRITC tetrametil-rodamin-izotiocianát
tRNS szállító RNS; transzfer RNS
TSH thyroideastimuláló hormon
TSPA könnyspecifikus prealbumin; tearspecific prealbumin
tTG szöveti transzglutamináz

26 Rövidítések
U
UAER vizelet-albuminürítés
UCTD nem differenciált kötőszöveti betegség
UPE
vizeletfehérje elektroforézis; urine protein electrophoresis
UPI
vizeletfehérje immunfixáció; urine protein immunofixation
UPLC igen nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia; Ultra Performance Liquid
Chromatography
UPLC-MS/MS ultrahatékonyságú folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometria;
Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
UPR
unfolded protein response
UV
ultraibolya; ultraviolet
V
VEGF
VLDL
vascular endothelial growth factor
very high density lipoprotein
W
WHO
World Health Organization, Nemzetközi Egészségügyi Világszervezet

1. Bevezetés
Kovács L. Gábor
A fehérje mint az élet princípiuma
Az élő rendszernek inherens módon egységnek kell
lennie, és biológiai anyagcserét kell folytatnia. Ez nem
pusztán anyagok felvételét és leadását, valamint átalakítását
jelenti, hanem azt is, hogy eközben a szervezet
saját anyagait a rá jellemző arányokban, időben és
térben előállítja, sőt akár gyarapíthatja is, miközben
az anyagátalakítások kémiai energiával is ellátják. Az
anyagátalakítások során a rendszer azokat az információkat
is forgalmazza, amelyek a szabályozásához
és önszerveződéséhez szükségesek. A sajátos módon
szervezett biokémiai reakcióhálózatok egyes vagy sorozatos
reakciói katalizáltak és szabályozottak. Az élő
rendszernek stabilisnak kell lennie; vagyis reagálni
kell tudnia környezetének ingereire, de ezenközben
nem vesztheti el önazonosságát (a homeosztázis folyamata).
Az élő rendszernek rendelkeznie kell olyan
alrendszerekkel, amelyek a teljes rendszer keletkezése,
létezése és működései számára hordoznak információkat.
Ilyen az örökletes információt hordozó
genetikai állomány, a sejtek közötti kommunikáció
rendszere (főleg a hormonális és az idegrendszer), továbbá
a sajátot az idegentől megkülönböztető önvédő
rendszer (immunrendszer). Ez összetett feladatrendszer
ellátásának egyik titka a fehérjékben rejlik.
A fehérje (protein) kifejezés a görög „protosz”
szóból ered, jelentése az „első” az elemek közt. A fehérjék
az élő szervezetet felépítő biomolekulák egyik
meghatározó csoportját alkotják. Szerkezetükben az
unikális és az univerzális elemek sajátos egyensúlya
valósul meg. Így amellett, hogy pl. egyedi enzimfunkciókat
látnak el, számos közös tulajdonsággal is
rendelkeznek. A fehérjék valamennyi élő sejt számára
az optimális szerkezet, a jó funkció, a növekedés, a
működési zavarok helyreállításának elengedhetetlen
eszközei. Fontos biológiai szerepüket jellemzi, hogy
minden sejtben lejátszódó folyamatban részt vesznek.
Számos fehérje enzimaktivitást mutat, azaz valamilyen
biokémiai folyamat katalizátoraként segíti elő
a sejt életben maradását. Fehérjék rendelkezhetnek
stabilizáló, szerkezeti funkcióval is. Ilyen a sejt alakjának
kialakítása (aktin, mikrotubuláris sejtváz, intermedier
filamentum), sejten belüli transzportfolyamatok
lebonyolítása (dinein, kinezin, miozin), mozgatás
(aktomiozin rendszer). Más fehérjék a sejt és környezete
közötti információáramlás megvalósítása révén
teszik lehetővé, hogy a sejt érzékelni tudja a külvilág
ingereit és reagálni tudjon rájuk. Összegezve, a fehérjék
az élet nélkülözhetetlen tényezői.
A molekuláris biológia központi tétele a genetikai
információ áramlását az élő szervezetekben a DNS-től
az RNS-en keresztül a fehérjékig határozza meg. A
legújabb technikák már alkalmasak arra, hogy az e
biomolekulák közötti sokféle kölcsönhatásról és a genetikai
információáramlás minden egyes lépcsőfokáról,
az azokat befolyásoló specifikus körülményekről,
így a környezeti hatásokról és a stresszállapotokról
információt szerezzünk. Közülük megemlíthetjük a
genomikát, a transzkriptomikát, a proteomikát, valamint
a glikomikát és a metabolomikát.
A fehérjék szerkezete, kémiai tulajdonságai
A fehérjék szerkezete és kémiája. A fehérjék aminosavak
lineáris polimerjeiből felépülő szerves makromolekulák.
Aminosavsorrendjüket a gének nukleotidszekvenciája
kódolja a genetikai kódszótárnak
megfelelően. Kialakításukban 20 féle „proteinogén”
(fehérjealkotó) aminosav vesz részt, melyek az amino-
és karboxilcsoportjaik között kialakuló peptidkötés
révén kapcsolódnak egymáshoz. Egyes polipeptidek
kialakításában több ezer aminosav is részt
vehet, míg azokat, melyek kevesebb (

28 1. fejezet Bevezetés
fehérjére specifikus kináz enzim foszfátcsoportot helyez
egy meghatározott Ser, Thr, Tyr, ritkábban His
oldalláncra. A glikoziláció szintén gyakori jelenség,
ebben az esetben oligoszacharid/monoszacharid láncok
kapcsolódnak Asn, Ser, Thr láncokhoz. Az amidés
aminocsoportot tartalmazó aminosav-oldalláncok
között, transzglutamináz-reakció eredményeként, kialakulhatnak
peptidkötést tartalmazó kereszthidak,
mint pl. véralvadás vagy a tej megalvadása során.
Az elsődleges vagy primer szerkezet a fehérje aminosavszekvenciája.
A fehérjelánc szintézisekor a legutoljára
beépült aminosav karboxilcsoportjához kapcsolódik
a következő aminosav aminocsoportja és így
tovább. Így megkülönböztetjük a fehérjelánc „elejét”,
a szabad aminocsoportot tartalmazó N-terminálist,
valamint a „végét”, a szabad karboxilcsoportot tartalmazó
C-terminálist.
A másodlagos vagy szekunder szerkezeten a peptidgerinc
hidrogénkötések által stabilizált lokális
(legalább négy aminosavra kiterjedő) rendezettségét
értjük. Ezt a szerkezeti szintet a peptidsíkok egymáshoz
képest történő elfordulásával jellemezhetjük.
E szerkezeti elemek legfőbb csoportjai a jobb- vagy
balmenetes hélixek, a redők, a hurkok és a kanyarok;
leggyakoribb az α-hélix, az antiparallel β-redő és a
β-kanyar.
A harmadlagos vagy tercier szerkezet egy polipeptidlánc
teljes térbeli konformációja. Ezt a konformációt
mindenekelőtt a hidrofób kölcsönhatások stabilizálják.
Egy peptidlánc tartalmazhat egyetlen vagy
többféle másodlagos szerkezeti elemet, melyek rendezetlen
szakaszokkal váltakoznak, de ismertek olyan
fehérjék is, melyekből teljesen hiányoznak a rendezett
szerkezetek, ezeket natívan rendezetlen fehérjéknek
nevezzük.
Bizonyos fehérjéket több peptidlánc alkot, melyeket
ez esetben alegységeknek nevezünk (negyedleges
szerkezet). A peptidláncok lehetnek azonosak vagy eltérőek,
számuk általában nem haladja meg a nyolcat,
de ismertek fontos kivételek: pl. egyes vírusok kapszidja
hatvan polipeptidből is állhat.
Egyszerű és összetett fehérjék. A fehérjéket osztályozhatjuk
összetételük alapján. Az egyszerű fehérjéket
csak aminosavak építik fel, hidrolízisükkor csak
aminosavak képződnek. Az összetett fehérjék hidrolizátuma
egyéb alkotórészt is tartalmaz. Így lehetnek
metalloproteinek (fémionokat tartalmaznak, pl.
az alkohol-dehidrogenáz Zn 2+ -t, a citokróm-oxidáz
Cu 2+ -t), foszfoproteinek (pl. kazein), hemproteinek
(pl. hemoglobin, mioglobin, citokróm-c), glikoproteinek
(szénhidrátrészt tartalmaznak, pl. γ-globulin),
lipoproteinek (pl. β 1
-lipoprotein), flavoproteinek (pl. a
szukcinát-dehidrogenáz) vagy nukleoproteinek (nukleinsavakat
tartalmaznak, pl. a dohánymozaik-vírus
és az atelomeráz enzim).
A fehérjék osztályozása funkciójuk alapján. A fehérjék
sokféle funkciót töltenek be a szervezetben,
ezek közül a fontosabbak: enzimek (pl. tripszin, citokróm-c),
transzportfehérjék (hemoglobin, hemocianin,
szérumalbumin), védőfehérjék (lehetővé teszik,
hogy a szervezet fertőzéssel vagy sérüléssel szemben
védekezzék, pl. ellenanyagok, fibrinogén, trombin),
toxinok (pl. kígyómérgek), hormonok (pl. inzulin,
mellékvesekéreg-serkentő hormon: ACTH, növekedési
hormon), struktúrfehérjék (a mozgáshoz szilárd
vázat biztosítanak, és a külső védelmet szolgálják, pl.
kollagén, elasztin, retikulin), motorfehérjék (a sejtszervecskék,
vezikulumok sejten belüli mozgatása a
feladatuk, pl. aktin, miozin, kinezin, dinein), valamint
tartalékfehérjék (az embrionális fejlődés zálogai,
pl. ovalbumin).
Fehérjék az élő sejtben
A fehérjék szintézise. A sejt DNS-állományában bázispár-kombinációk
formájában tárolt információ
tulajdonképpen a 20 féle aminosav valamelyikét kódolja,
3 bázispáros szavakban. Egy-egy gén egy fehérje
tervrajzát tartalmazza. A transzkripció során ez a
leírás egy közti molekula (mRNS) formájában mobilizálódik,
és a genomból a fehérjeszintézist végző riboszómákhoz
kerül, amelyek az mRNS-t tervrajzként
használva legyártják a fehérjéket, az aminosavakat
egyenként egymás mögé kapcsolva. A transzkripció
helye a sejt DNS-állományához kötött eukarióták
vagy valódi sejtmagosokban a sejtmag, a prokarióták,
vagy sejtmagnélküliekben a citoplazma.
Transzkripció. Az RNS-szintézist az RNS-polimeráz
nevű enzim katalizálja („alternatív splicing”). A szintézis
kezdetén a DNS kettős hélix szerkezete felnyí-

Bevezetés
29
lik. Az RNS-polimeráz a DNS ún. értelmes szálához
kapcsolódik, és megkezdi annak átírását. Ez az átírás
a bázispárképzés szabályainak megfelelően megy
végbe. A bázisok beépítéséhez ATP eredetű energia
szükséges. A szintézis végén az RNS-molekula leválik
a DNS-ről, és visszaáll a kettős hélix szerkezet. Ezután
eukariótákban az mRNS a sejtmaghártya pórusain
át a citoplazmába transzportálódik, prokariótáknál
viszont már a transzkripció alatt úgynevezett riboszómák
kapcsolódnak az mRNS-hez, és megkezdik
a fehérjék előállítását. Egy-egy mRNS-hez egyszerre
több riboszóma is kapcsolódhat, ami meggyorsítja a
fehérjeszintézis folyamatát. Ezeket a képződményeket
poliriboszómáknak nevezzük.
Aminosavak aktiválása. Az aminosavak aktiválása
energiaigényes, a szükséges mennyiséget az ATP
hidrolízise fedezi. Az aminosavak aminosavaktiváló
enzimhez kapcsolódnak, mely kapcsolatba lép a
tRNS-molekulával, végül az aminosav kapcsolódik a
tRNS aminosavkötő helyére.
Transzláció. A riboszóma kisebbik alegysége kapcsolódik
az mRNS 5’ végéhez, majd ezután kapcsolódik
a riboszóma nagyobbik alegysége is. A transzláció
során a riboszóma (multienzim-komplex) határozza
meg a szintézisben részt vevő molekulák térbeli
elrendeződését, együtt tartja az mRNS-t és a növekvő
polipeptidláncot, és a szintézis előrehaladásával
folyamatosan továbblép az mRNS-en. A transzláció
apparátusa a polipeptid képzésekor az mRNS-en
5’–3' irányban halad. Minden egyes aminosavnak 3-3
nukleotidból álló kodonja sorakozik egymás után az
mRNS-en, amelyek a tRNS-eken található 3-3 komplementer
nukleotidból álló antikodonnal párosodnak.
A transzláció első lépéseként az első aminosavat
(a lánckezdő metionint) szállító tRNS kapcsolódik
a riboszóma P- (peptidkötő) helyéhez, a következő
aminosavat szállító tRNS pedig az A- (aminosavkötő)
helyéhez. A P-helyen lévő metionin (majd később
a polipeptid) és az A-helyre szállított aminosav
között ATP-energia felhasználásával és enzimek segítségével
peptidkötés alakul ki, ezután a kialakított
peptidszakasz továbbítódik a peptid-kötőhelyre, a
beépült aminosavat szállító tRNS szabadon leválik, a
riboszóma továbblép az mRNS-en. A megfelelő kodon
felismerése után az aminoacil-tRNS-ek egymás
után kapcsolódnak a riboszómához, adják le az aminosavakat
és így hosszabbítják a polipeptidláncot. A
növekvő polipeptidlánc a riboszóma kis alegységéhez
kapcsolódik.
A polipeptidlánc szintézisének végét az úgynevezett
„stop”-kodonok határozzák meg. Három
lánczáró kodon létezik: UAA, UGA, UAG. A terminációs
kodonhoz egy release-faktor kapcsolódik
(peptidil-transzferáz), amely képes a P-helyen lévő
utolsó tRNS és aminosav közötti kötés hidrolízisére.
Ezután a tRNS és a polipeptid távozik, majd megszűnik
a riboszóma és az mRNS közötti kapcsolat, végül
a riboszóma alegységeire hidrolizál.
A fehérjék felgombolyodása (folding). A fehérje
gombolyodásának problémája, hogy a frissen szintetizált
polipeptidlánc hogyan jut el abba a háromdimenziós
szerkezetbe, amely biztosítja a biológiai
rendszerben neki szánt funkció teljesítését. Bizonyos
konformációs betegségekben félig felgombolyodott
fehérjék vízben oldhatatlan aggregátumai rakódnak
le a szövetekben. Az irodalomban publikált felgombolyodási
vizsgálatok valójában az újragombolyodást
(refoldingot) tanulmányozták. A fehérjefelgombolyodás
kísérleti tanulmányozására használt általános
módszer a kémiai ágensekkel való denaturáció és az
ezt követő hirtelen kihígítás, aminek következményeként
a denaturáló kémiai ágens koncentrációja a kritikus
alá csökken, így megindul a felgombolyodás. (A
nyomás-denaturáció olyan új eszközt kínált, amellyel
a kémiai ágenst kiválthattuk.)
A fehérjefelgombolyodási vizsgálatok egyik fontos
kérdése a feltekeredési útvonalon létrejövő köztes
állapotok létezése volt. Számos kísérletet, ill. modellszámolást
végeztek ugyanis annak bizonyítására,
hogy a fehérjék feltekeredésük során köztes állapotokon
mehetnek keresztül.
Posztszintetikus módosítások. A polipeptidlánc a
szintézis lezárultával további átalakulásokon megy
keresztül. Ilyen átalakulás során kialakul a fehérje
másodlagos szerkezete, az első (metionin) vagy első
néhány aminosavat enzimek eltávolíthatják, vagy a
láncot elvághatják, vagy különböző funkciós csoportok
kapcsolódhatnak a lánchoz (foszfátok, lipidek,
szénhidrátok).

30 1. fejezet Bevezetés
A fehérjék lebomlása. A fehérjelebontás, az aminosavátalakulás
különösen az emlősök szervezetében
igen nagy jelentőségű. A táplálékkal felvett fehérjéket
hidrolitikus enzimek első lépésben aminosavakra
bontják. A peptidkötést bontó enzimek a proteázok.
Az aminosavak aztán különféle átalakulási folyamatokban
vehetnek részt, pl. az extracelluláris térből
aktív transzporttal a sejtbe jutó aminosavak felhasználódnak
fehérjék, peptidek bioszintéziséhez; az
aminosavak részt vesznek egyéb nitrogéntartalmú
vegyületek bioszintézisében (koenzimek, purin- és
pirimidinvázas vegyületek, hormonok); dekarboxilezéssel
biogén aminok keletkeznek; az aminocsoport
lehasadása után szénláncuk a lipid- és szénhidrát-anyagcserefolyamatokba
kapcsolódhat be (a
citrátkörön keresztül); a sejtek ketosavaiból transzaminálással
más aminosavak keletkeznek; az aminosavak
egymásba alakulásukkal endogén aminosavak
(nem esszenciális) szintézisében is részt vehetnek, ill.
a lehasadó ammónia és szén-dioxid karbamiddá alakulva
kiürül a szervezetből.
Az aminosavak dezaminálása. A legtöbb dezaminálás
transzaminálási reakcióban valósul meg. Az ezt
katalizáló enzim aktív centrumában piridoxál-foszfát
(a B 6
-vitamin származéka) van. Ennek aldehidcsoportja
képes kapcsolatot létesíteni az aminosav
aminocsoportjával. Ez víz hatására elbomlik, és ketosav
lép ki a komplexből, míg az aktív centrumban
piridox amin-foszfát marad vissza.
Oxidatív dezaminálás során ammónia keletkezik.
A glutaminsav oxidatív dezaminálását katalizáló dehidrogenáz
enzim jelentős szerepet játszik a folyamatban.
Az aminocsoport eltávolításakor a NAD +
koenzim redukálódik, és egy könnyen hidrolizálódó
iminosav köztiterméken keresztül α-keto-glutársav
és ammónia képződik. Az ammónia karbamid formájában
ürül ki a szervezetből.
Nem oxidatív dezaminálás során az ammónia
mellett kettős kötést tartalmazó termék is létrejön.
A dezaminálás során képződő szénlánc főként a citrátkörön
keresztül alakul széndioxiddá és vízzé. Az
aminosavak hét fő intermedier molekulává (piruvát,
α-keto-glutársav, szukcinil-KoA, fumársav, oxálecetsav,
acetil-KoA, acetoacetát) bomlanak le.
Az aminosavak dekarboxilezése. Az aminosavak a
széndioxid kilépése után a megfelelő aminokká alakulnak.
Az aminokat biogén aminoknak nevezzük,
mert számos képviselőjük fontos biológiai funkciókat
tölt be. Az aminosavak dekarboxilezését specifikus,
piridoxál-5-foszfát koenzimmel működő dekarboxiláz
enzim végzi. A hisztamin hisztidinből, a tiramin
tirozinból, a triptamin triptofánból, a kadaverin a lizinből
keletkezik dekarboxilezéssel. A glutaminsavból
γ-amino-vajsav jön létre.
Az ubikvitinrendszer. Miközben a fehérjékkel kapcsolatos
kutatások nagy része azzal foglalkozott, vajon
hogyan jöhetnek létre a proteinek, addig a magyar
származású Avram Hershko, a haifai Technion
– Israel Institute of Technology munkatársa első kutatásai
óta a lebomlás iránt érdeklődik. A fehérjék lebontásáról
sokáig nem sok ismeretünk volt, néhány
egyszerű proteinlebontó enzimről tudtunk mindöszsze.
Ilyen pl. a tripszin, mely a vékonybélben bontja
le az elfogyasztott ételekből származó fehérjéket. Ma
már tudjuk, hogy a sejtek az ubikvitinrendszeren keresztül
bontják le hibás fehérjéiket. Az újonnan létrejött
proteinek 30%-a végzi a proteaszóma megsemmisítő
gépezetében, ha nem jutnak keresztül a sejt
szigorú ellenőrző rendszerén. Az ubikvitinrendszer
hibás működése számos betegséghez, pl. rákhoz vezet.
A szisztéma megismerésének orvosi jelentősége,
hogy (többek között) bizonyos daganatos, immun-,
idegrendszeri betegségek gyógyíthatók lennének, ha
csak a káros fehérjék jelölődnének és bomlanának le.
A Nobel-díjas eredmények ahhoz is hozzájárultak,
hogy jobban megértsük az immunrendszer működését.
Ezekkel az új ismeretekkel lehetővé vált annak
megértése is, hogy a sejtek molekuláris szinten miként
kontrollálnak számos fontos biokémiai folyamatot,
mint pl. a sejtciklust, a DNS-újratermelést és a
génmásolást (1-1. ábra).

Bevezetés
31
1-1. ábra. Fehérjék lebomlása – az ubikvitin (UB) szerepe
1. Az E1 enzim aktiválja az ubikvitinmolekulát
2. Az E1 enzim átadja az ubikvitinmolekulát az E2 enzimnek
3. Az E3 enzim már képes felismerni a lebontandó fehérjét
4. Az E2 enzim közel kerül a fehérjéhez, és átadja az ubikvitint
5. Ez többször is megismétlődik, így ubikvitinlánc alakul ki
6. A proteaszóma felismeri az ubikvitinláncot, és feldarabolja a fehérjét

32 1. fejezet Bevezetés
A fehérjék kölcsönhatásai
A fehérjék szerkezetét fenntartó kölcsönhatások alapvetően
négy nagyobb csoportba oszthatók:
• Elektrosztatikus kölcsönhatások.
• Diszperziós erők.
• H-hidak.
• Hidrofób kölcsönhatások.
Mai értelmezésünk szerint a komplex biológiai rendszerek,
pl. egy sejt alkotóelemei, sokrétű bonyolult
és dinamikus kölcsönhatásban vannak egymással,
és ezek a kölcsönhatások elektromágneses természetűek,
elsősorban Coulomb-erőkre vezethetőek vissza.
A fehérjék mindig vizes közegben működnek, és maguk
is jelentős mennyiségű (20–70%), felszínükön és
üregeikben kötött vizet tartalmaznak. E hidrátburok
vízmolekulái integráns részét képezik a térszerkezetnek,
és elengedhetetlenek a működéshez. A fehérjék
különleges képessége, szerkezeti és funkcionális sokoldalúsága
elsősorban annak tulajdonítható, hogy
szemben a szilárd anyagokkal, amelyeket főként erős
kovalens és ionos kötések tartanak egyben, és a folyadékokkal,
amelyeknek részecskéi között gyenge másodlagos
kötések hatnak, a fehérjékben e két kötéstípus
kombinációjával találkozunk. Az aminosavak
oldatát a sejt fehérjéitől az különbözteti meg, hogy
a sejt működési körülményei között az aminosavak
kovalens kötéssel, adott sorrendben láncba vannak
rendezve. Ez a polipeptidlánc korlátozott flexibilitással
rendelkezik, ami lehetővé teszi a térbeli gombolyodást,
felcsavarodást, a lánc nem szomszédos
oldalláncainak közelkerülését. A nem-kovalens kötések
közeli molekulák és molekularészletek közöt-
1-2. ábra. Sejt-sejt kapcsolatot kialakító fehérjék (pl. integrinek) aktiválódása során jellegzetes makroszkopikus szerkezetváltozás
következik be
(Rövidítések – EGF: epidermalis növekedési faktor; I: integrin; ICAM: intercelluláris adhéziós molekula)

Bevezetés
33
ti töltéskölcsönhatások következményei. Egyenként
kicsiny stabilizációs energiát jelentenek. Az élettel
összeegyeztethető hőmérsékleten, a hőmozgás következtében
könnyen felhasadnak, de nagy számuk
és együttműködő, kooperatív természetük miatt
együttesen jelentős szerkezetrögzítő, stabilizáló hatást
jelentenek. Az ilyen, részben kovalens, részben
másodlagos kötésekkel stabilizált szerkezetek, a fehérjék
sok különleges, az élettelen világban ritka tulajdonsággal
rendelkeznek. Legfontosabb sajátságuk,
hogy miközben jól definiált szerkezettel rendelkeznek,
az óriásmolekulát alkotó atomhalmaz állandó, a
hőmozgás által hajtott dinamikus fluktuációban van.
Ennek folytán a térszerkezet nagyfokú flexibilitással
is rendelkezik, könnyen képez komplexet egy nagyjából
komplementer felülettel (egy másik, bonyolult
makromolekulával), a kölcsönös adaptáció lehetősége
révén (1-2. ábra).
Fehérjék mint enzimek (katalízis)
Az enzimek a szervezetben lejátszódó folyamatok
reakciósebességét növelő anyagok. Az aktiválási energiát
csökkentik, így az enzimeket biokatalizátoroknak
tekinthetjük. Mint minden katalizátor, az enzimek
is csak olyan folyamatok lejátszódását segítik elő,
amelyek egyébként is végbemennének, de a reakció
lényegesen lassabban játszódna le. Minden enzim
fehérje, emiatt mindegyikre jellemző egy hőmérséklet-
és pH-optimum. Az optimális pH rendszerint az
5–9 tartományba esik, de pl. a gyomorban termelődő
emésztőenzim, a pepszin esetében 2 körüli. Az optimális
hőmérséklet általában 36–40 °C környékén van.
Magasabb hőmérséklet növeli a reakciósebességet, de
ha túl magas, az az enzimek denaturálódását okozza.
Az enzimfehérjék térbeli szerkezete az, ami lehetővé
teszi a reagáló anyagokkal való kapcsolat kialakítását,
azok megkötését. A fehérjék e részét nevezzük aktív
centrumnak. Az enzimek specifikusak, csak egy
adott vegyület (vagy vegyületcsoport, a szubsztrát)
adott reakcióját katalizálják, azét a vegyületét, amely
képes a kérdéses fehérje térszerkezetéből és energetikai
viszonyából adódóan az enzimhez kapcsolódni
az aktív centrumon. Az inhibitorok olyan vegyületek,
amelyek az aktív centrumhoz kapcsolódnak, és ezzel
megakadályozzák az enzim működését, irreverzibilis
gátlást okoznak. A kompetitív inhibitorok térszerkezete
a szubsztrátéhoz hasonló, ezért tudnak kapcsolódni
az enzimhez. Hatásuk reverzibilis, nagyobb
szubsztrátkoncentrációval leszoríthatóak. Bizonyos
enzimeknek aktivátorokra van szüksége a működéshez.
Ilyen aktivátorok lehetnek bizonyos kationok, pl.
magnézium, cink, kalcium, kobalt. Az enzimek egy
része egyszerű fehérje, ami önmagában is képes katalizátorként
működni (egyszerű enzimek), más részüknek
viszont szüksége van valamilyen kiegészítő
anyagra (összetett enzimek). Ez lehet valamilyen szerves
vegyület vagy fémion (gyakori pl. a cink), vagy
valamilyen nem fehérje természetű anyag, pl. vitaminszármazék
(a NAD + és NADP + molekulákban).
Amennyiben erősen kötődik az enzimhez, prosztetikus
csoportnak nevezzük. Gyakori azonban, hogy
egy organikus vegyület csak lazán kapcsolódik, és
könnyen leválik a fehérjéről, ezeket a szakirodalom
koenzimnek nevezi. A koenzimek, fogalmazzunk így,
„praktikusabbak” az élővilágban, ugyanis a nem fehérje
természetű rész többféle fehérjéhez is képes
kapcsolódni, így többféle enzim alkotójává válhat (pl.
a NADH-t nagyjából 700 különböző ismert enzim
használja). Koenzimek: NAD + , FAD, citokrómok, liponsav
stb. A teljes, működőképes enzimet holoenzimnek
nevezzük, ennek a fehérjerésze az apoenzim, a
kapcsolódó nem fehérje rész pedig a koenzim.
A katalizált kémiai reakciók alapján is csoportosíthatók:
transzferázok (kémiai csoport átvitele egyik
vegyületről a másikra), oxidoreduktázok (oxigénfelvételt,
hidrogén-, ill. elektronátvitelt katalizálnak),
hidrolázok (hidrolitikus bontás), izomerázok (izomerképződés
elősegítése), ligázok (bioszintézisek
katalizálása kovalens kötések létrehozásával), liázok
(nem hidrolitikus bontás). Az enzimek nem csak
a zsírok, a fehérjék és a szénhidrátok lebontásában
(emésztés) vesznek részt, hanem építő folyamatokban
is. Az immunrendszer működésében is több szinten is
szerepet játszanak: egyrészt a bőr felszínén nem csak
a savköpeny igyekszik a támadó kórokozókat elpusztítani,
hanem az ott lévő enzimek is károsítják azokat
és toxinjaikat. Ezek a védő enzimek a testnyílásoknál
is megtalálhatók (pl. a lizozim a nyálban, a könnyben,
a légutakban). Másrészt a szervezetbe mégis bejutott
kórokozók elpusztításában is aktív szerepük van azok
burkának feloldása, „kilyuggatása” által.

34 1. fejezet Bevezetés
Fehérjék szerepe a struktúraalkotásban
Az eukarióta sejtben a sejtet kívülről borító plazmamembránon
kívül vannak belső sejtmembránok is;
melyek egy része nem kerül kapcsolatba, de egy részük
érintkezhet, összeolvadhat a plazmamembránnal,
ill. leválhat arról (exocitózis, endocitózis). Az
egyik legfontosabb ilyen belső sejtmembránrendszer
az endoplazmatikus retikulum (ER) membránrendszere
a citoplazma belső, a sejtmaghoz közelebbi
részében. Ez a membránrendszer közvetlen fizikai
érintkezésben van a sejtmag maghártyájával; a maghártya
két membránlemeze közötti tér az endoplazmatikus
retikulum üregrendszerében folytatódik. Az
endoplazmatikus retikulum membránjaiban található
a sejt bioszintézisét végző enzimek nagy része,
vagyis az ER membránjai a sejt szintetizáló rendszerét
adják. Itt képződnek az új lipidmolekulák, így a
membránok foszfolipidjei is. Az ER membránjaihoz
kapcsolódhatnak riboszómák, melyek a citoplazmatikus
fehérjeszintézis helyei. A riboszómák ide speciális
helyeken és sajátos mintázatban kapcsolódnak;
emiatt az ilyen ER elektronmikroszkópban szemcsés
vagy durva felszínűnek tűnik. A durva felszínű ER riboszómái
szintetizálják azokat a fehérjéket, amelyeket
a sejt „exportra” termel, vagyis melyek végül exocitózissal
ki fognak jutni a sejt külső felszínére, vagy
el is hagyják a sejtet. Az ER másik típusának membránján
nem találhatók riboszómák, ezért az elektronmikroszkópban
sima felszínű. A sejt saját használatra
szánt fehérjéit a citoplazmában szabadon található riboszómák
termelik.
A másik fontos belső membránrendszer eukarióta
sejtben a Golgi-készülék, mely voltaképpen egymásra
rétegzett lapos membránzsákokból áll. Ez a 4-5
membránzsák kissé ívben meg is hajlik, az íve „szája”
leginkább a sejtmag felé található, domborulata meg
a plazmamembrán felé néz. Ez a membránrendszer
kapcsolatban van az ER membránrendszerével olyan
módon, hogy az ER kötött riboszómái által termelt
fehérjék bejutnak az ER üregébe, majd ott benn megkezdik
átalakulásaikat: egyes darabjaik lehasadnak,
egyes aminosavaikhoz szénhidrátok vagy azok rövidebb-hosszabb
láncai kapcsolódnak, majd a módosult
fehérje transzportálódik az ER membránjainak
széli hólyagocskáiba. Itt azután kis hólyagocskaként
lefűződnek az ER-ről, bennük az exportra szánt fehérjékkel.
Ezek a kis citoplazmatikus, membránnal
körülvett hólyagocskák azután átalakulhatnak lizoszómává,
ha a megfelelő fehérjék és enzimek vannak
bennük és a belsejük megsavanyodik; ekkor a sejt
anyagait, ill. a sejt által a külvilágból felvett makromolekulákat
fogják lebontani. A lizoszómák tehát
az eukarióta sejtekben a sejten belüli emésztés helyei.
A membránnal körülvett kis citoplazmatikus
hólyagocskák másik része eljut a Golgi-készülék
membránjaihoz, és a sejtmaghoz közeli membránzsákokba
beleolvad. Ezáltal a bennük levő fehérjék
is a Golgi-készülék membránzsákjaiba kerülnek. Az
azokban lévő enzimek újabb átalakításokat végeznek
a fehérjéken, elsősorban újabb szénhidrátláncok kapcsolódnak
hozzájuk. Ezek a glikoproteinek vagy mukoproteinek
fognak kapcsolatba lépni a sejtet borító
plazmamembránnal. A Golgi-készülék külső membránzsákjaiból
a megváltozott fehérjék és foszfolipidek
szintén kis hólyagocskákba csomagolódnak, melyeket
most szekréciós vezikulának neveznek. Ezek tartalma
a plazmamembránon át exocitózissal ürül ki a
sejtből. A szekréciós vezikula membránja már össze
tud olvadni a plazmamembránnal, az összeolvadás
helyén a plazmamembrán felszakad, így a belső tartalom
a sejten kívülre kerül. A szekréciós vezikula
membránja teljes felszínével a plazmamembrán felületét
növeli. A kijutott anyagok egy része megkötődik
a plazmamembránban, ezért találunk annak külső
oldalán szénhidrátláncokat hordozó gliko- és mukoproteineket,
glikolipideket. A kijutott anyagok egy
másik részét egyes sejtek el is engedik, így azok a sejtek
közötti térbe kerülnek. A szekréciós vezikulának a
plazmamembránnal való összeolvadását (fúzióját), a
vezikula tartalmának kiürülését és a plazmamembrán
felületének megnagyobbodását és anyagainak eme
gyarapodását nevezik exocitózisnak. Ezzel az aktív,
membránmozgással járó folyamattal a plazmamembránon
egyébként átjutni nem tudó makromolekulák
és makromolekuláris oldatok is ki tudnak jutni a sejtből.
Hasonló, de ellentétes irányú folyamat az endocitózis,
amellyel makromolekulák és oldataik is be tudnak
jutni a sejtbe. Ekkor a felveendő makromolekula
a plazmamembránon speciális receptorához kötődik,
a plazmamembrán elkezd alatta gödörré mélyülni,
majd hólyagocskát (vezikulát) formálva magába zárja
a makromolekulákat, Ezt követően a membránnal
körülvett hólyagocska leválik a plazmamembránról,
és a keletkezett endoszóma vagy fagoszóma a citoplaz-

Bevezetés
35
mába süllyed. Ez az endocitotikus folyamat természetesen
csökkenti a plazmamembrán felületét.
Fehérjék szerepe
a transzportfolyamatokban
A membrántranszport-fehérjék (transzporterek)
olyan membránfehérjék, amelyeknek szerepe van ionok,
kis molekulák, makromolekulák (pl. másik fehérje)
szállításában a biológiai membránokon keresztül.
A fehérjék az anyagszállításban facilitált diffúzió
vagy aktív transzport segítségével működhetnek közre.
Ezeket összefoglalóan karriermediált transzportnak
nevezzük. A facilitált diffúziót elősegítő fehérjék
energia felhasználása nélkül, csak az elektrokémiai
gradiensnek megfelelő irányban hatnak közre az
anyagok szállításában. Az anyagszállítás magas specificitású
pórusok vagy csatornák mentén megy végbe.
A membrántranszport-fehérjék számos családját ismerjük
élettani vagy betegségekhez kötődő szerepük
révén (pl. karioferin, mitokondriális membrántranszport-proteinek,
ATP-binding cassette transzporterek,
CD36, neurotranszmittertranszporterek, iontranszporterek).
A vezikuláris transzportproteinek
transzmembrán vagy membránasszociált fehérjék.
Elősegítik a vezikulák transzportját. Kiterjedt csoportjaik:
archain, ARF-ek, klatrin, kaveolin, dinamin,
Rab proteinek, nexinek, szinaptotagmin.
Sejtek és fehérjék
Minden sejt önfenntartó működésre is képes. Tápanyagait
energiává tudja alakítani, speciális funkciókat
képes végrehajtani, ha szükséges, meg tudja
önmagát ismételni (osztódás). Őrzi magában a lehetőséget
saját maga kivitelezésére és reprodukálására.
A sejtek számos képességgel rendelkeznek: osztódás,
anyagcsere lehetősége, beleértve a tápanyag-felhasználást,
az energia átalakítását, molekulák, vegyületek
létrehozását. A sejt működése függ képességeinek kihasználásától,
amit a tárolt kémiai anyagok felhasználásból
nyer. Ez lehet nukleinsav- és fehérjeszintézis,
funkcionális sejtrészek szintézise, mint az enzimek. A
tipikus emlőssejtek közel 10 000 különböző fehérjét
tartalmaznak. A sejt reagál a külső és belső változásokra,
mint pl. a hőmérséklet vagy a pH megváltozására.
Transzportfolyamatai vannak, környezetével
dinamikus kölcsönhatásban van. Minden sejt állít elő
fehérjéket élete során. Ezekre vagy a sejt felépítéséhez
van szükség (szerkezeti fehérjék), vagy pedig valamilyen
biológiailag aktív funkciójuk van: enzimek, szállítómolekulák,
ingerületátvivő anyagok. A fehérjék
keletkezéséhez szükséges kódot a sejtmagban található
örökítő anyag, a DNS hordozza. Innen az információt
a hírvivő RNS (mRNS) szállítja el a fehérjeképződés
helyére, a sejtmagon kívülre, a riboszómákhoz.
Ide fut be az összes információ és a fehérjék képződéshez
szükséges alapanyagok. A hírvivő RNS belép
a „fehérjegyárba”, elfoglalja dokkolóhelyét, és várja a
riboszómában dolgozó enzimeket, hogy elvégezzék
feladatukat.
A sejtek anabolizmusa és katabolizmusa
Az anyagcsere (metabolizmus), bonyolult vegyi folyamat,
amely minden élő állati és emberi sejtben
szakadatlanul, éjjel-nappal végbemegy. Minden élő
sejt táplálkozik: anyagokat vesz fel. Az egysejtű állat
ezeket közvetlenül a környezetéből veszi fel. A sejtek
milliárdjai, amelyek az emberi test különféle szöveteit
és szerveit alkotják, a hajszálerek véréből kapják
a szükséges anyagokat oldott vagy igen finoman elosztott
állapotban. Keringő vérünk két helyen, a tüdőben
és a vékonybélben pótolja a sejtek milliói által
elfogyasztott anyagokat: a vér a tüdőben az oxigént,
a vékonybél bolyhai útján pedig a különféle anyagok
hosszú sorát veszi fel. A felvett anyagok nagyjából a
következőképpen csoportosíthatók: oxigén, víz, sók,
szénhidrátok, egyszerű és bonyolult zsírok, zsírszerű
anyagok, lipoidok, egyszerű és összetett fehérjék, ill.
egyéb szerves anyagok, amelyekből igen kis mennyiségekre
van szükségünk. Ide tartoznak az enzimek, a
hormonok, a vitaminok stb.
Anabolikus folyamatok. Építő folyamatok: a sejt a
saját testét tovább építi, nő. A felvett egyszerűbb, fajidegen
anyagokból a saját fajára, egyéniségére és szöveteire
jellemző bonyolultabb anyagokat készít. Az
állati és az emberi sejtek asszimilációs tevékenysége
sokkal kisebb mértékű, mint a növényeké. A növények
a föld szervetlen anyagaiból és a levegő széndioxidjából
a legbonyolultabb szerves vegyületeket
képesek felépíteni, miközben az állatoknak és az em-

36 1. fejezet Bevezetés
bernek a bonyolult szerves vegyületeknek legalább is
az építőtégláit készen kell kapnia. Ezeket kívülről, a
táplálékkal veszik fel. A fehérjemolekula pl. 20 építőtéglából
(aminosavak) van összerakva, melyek sorrendjének
változtatásával sok millió különféle fehérje
állítható elő.
Katabolikus folyamatok. A katabolizmus révén a
felvett anyagokat véglegesen elhasználjuk. 1 g cukor
4,1 kilokalóriát, 1 g zsír átalakulása 9,3 kilokalóriát
ad. Ez az átalakulás fűti testünket és biztosítja állandó
hőmérsékletünket. A katabolizmus nem csak hőt
termel, de minden működésünknek energiaforrása.
Ha testünket kizárólag szénhidráttal és zsírral lehetne
energiával ellátni, akkor csak kétféle bontási termék
volna: szénsav és víz. Az állati és az emberi testet
azonban nem lehet kizárólag szénhidráttal és zsírral
táplálni. Fehérje is kell hogy energiaforrásként szerepeljen.
Bizonyos minimális fehérjemennyiség nélkül
az ember elpusztul. A fehérjemolekulában szénen,
hidrogénen, oxigénen kívül nitrogén és kén is van,
valamint vannak foszfort és fémionokat is tartalmazó
fehérjék is. A fehérjéket a szervezetünk nem tudja
tökéletesen elbontani, a különféle fehérjebontási termékek
egész sora keletkezik. Ilyen az urea, a húgysav,
a kén- és foszfortartalmú vegyületek stb. Ezek mind a
vesén át vizelet alakjában távoznak. 1 g fehérje fűtőértéke
4,1 kg kalória, vagyis ugyanannyi, mint a szénhidráté.
A bontási folyamatok végtermékeitől (szénsav,
víz, vizelet-alkotórészek) a szervezetnek meg kell
szabadulnia. A katabolizmus, ha nem pótoljuk az
elhasznált anyagokat, a testsúly fogyására vezet. Az
éhező ember napról napra veszít súlyából, soványodik.
Az anabolizmus és a raktározás viszont súlynövekedéssel,
erősödéssel, hízással jár.
Az emberi szervezet és a fehérjék
A humán genom első nyers szekvenciájának közzététele
több szempontból is nagyon fontos eredmény
volt. Az előzetesen vizsgált kisebb genomokhoz képest
a humán genom körülbelül 25-ször nagyobb és
hétszer több információt tartalmaz, mint az ezt megelőzően
ismert összes genom együttvéve. A legmeglepőbb
eredmény talán az, hogy a gének számát az
első adatok alapján 30–40 ezerre becsülték (ma inkább
20–22 ezernek tartják). Ez a szám jóval kisebb
a vártnál, és mindössze kétszerese, mint amennyit
a muslincában meghatároztak. Hol van hát a humán
funkciók komplexitásának genetikai háttere? A
komplexitás titka feltehetően nem a gének számában,
hanem a gének által meghatározott fehérjék összerakási
módjában van elrejtve. Feltehetően a gerincesekben
és különösen az emberben igen fontos szerepet
játszik a DNS-ről képződő és a fehérjék szintézisét
meghatározó hírvivő RNS (mRNS) alternatív vágása.
Ennek eredményeként egyetlen gén többféle fehérjét
is meg tud határozni. A variálható komplexitás másik
aspektusa a fehérjék doménszerkezete. A domén olyan
funkcionális egység a fehérje működésében, amely
egy adott funkcióhoz kapcsolható. Egy adott domén
többféle fehérjében is előfordulhat, ha ezeknek a fehérjéknek
van azonos jellegű funkciójuk. Az emberi
fehérjék esetében körülbelül 1800 domént tételeznek
fel; ez a szám közel kétszerese annak, amennyit
az alacsonyabbrendűekben találtak. A doménszerkezet
a fehérjék közti kölcsönhatások alapját képezi.
Az egymással kapcsolódó fehérjék pedig bonyolult
és magas szervezettségű információs hálózatok szerkezeti
alapját adják. Hozzájárul ehhez a gének exon/
intron szerkezete is (az exon a fehérjét kódoló információ,
az intron kivágódik az átírás során). A nyers
szekvencia adatai alapján megállapították az emberi
gének exonjainak (100–200 bázispár) és intronjainak
(1000–4000 bázispár) átlagos hosszát, és azt, hogy
egy emberi gén átlagosan 7–9 exonból áll. Mindezek
alapján a ténylegesen fehérjében megjelenő információ
a genom kevesebb mint 1%-a. A viszonylag kisszámú
humán gén megkönnyíti a gének funkcionális
azonosítását. A cél a humán gének és fehérjék teljes
körű egymáshoz rendelése. Ez az eredmény feltehetően
olyan mérföldkő lesz a biológiai és orvostudományok
kutatásaiban, mint amilyen óriási hatást
gyakorolt a kémiai periódusos rendszer elkészítése a
kémiai tudományok fejlődésére. Tudjuk majd, hogy
mely szerkezeti egységekből, ill. ezek milyen kombinációjából
áll a testünk. Ezek közt kell keresnünk a
gyógyszerek támadáspontjait és a betegségek biológiai
alapjait.

Bevezetés
37
A fehérjekutatás forradalma: a proteomika
A proteom fogalma (protein complement to a genome)
az utóbbi években vált a tudományos köztudat
részévé. A proteomika a proteom, vagyis az élő
szervezetben előforduló összes, szerkezetében akár
a legkisebb mértékben eltérő fehérje megismerésével
foglalkozó tudományterület, amely a genommal
kapcsolatos kutatás mintájára, annak kiegészítőjeként
jött létre, de ma már a genomikától független, önálló
diszciplína.
A proteomika meg kívánja ismerni a fehérjék szerkezetét,
biológiai funkcióját és ezek térbeli és időbeli
változását. Nem csak úgy tekinti a fehérjét, mint izolált
molekulát. Figyelembe veszi a fehérje és környezete
közötti kölcsönhatást. Vizsgálódási körébe tartozik
a fehérje eredetének meghatározása, rendszertani
besorolása, a különböző forrásból származó, de azonos
biológiai funkciót ellátó proteinek szerkezetének
összehasonlítása, a fehérje jelenlétének vagy hiányának
igazolása egészséges, ill. patológiás körülmények
között. Célja – a korszerű kémiai analitika eszközeit
felhasználva – az igen kis mennyiségben, ill. koncentrációban
jelen lévő fehérjék kimutatása, azonosítása,
szerkezetük meghatározása; a fehérjékkel kapcsolatos
ismeretek taxonómiai, szerkezeti vagy funkcionális
rendszerezése, a kísérleti adatok megerősítése (validálás),
valamint az így képződő adathalmazok (adatbázisok)
információtartalmának elemzése. Sokak
nézete szerint ide sorolhatók a proteomika módszertanával
foglalkozó témakörök is (pl. nagy érzékenységű
tömegspektrometriás módszerek, fluoreszcencián
alapuló mikroszkópos technikák stb.). Már most jól
látszik, hogy a proteomika jelentősen segíti a korszerű
gyógyszerkutatást és az orvostársadalmat a mainál
hatékonyabb diagnosztikai eljárások és terápiás szerek
kifejlesztésében.
Összefoglalás
Amint azt az élő szervezetek esetében láthatjuk, a fehérjék
szerepe kiemelkedő, mert önszerveződő molekuláris
gépezetek építhetők belőlük. Az önszerveződés
alatt azt értjük, hogy az egyes fehérjealegységek
képesek felismerni egymást, meghatározott módon
egymáshoz kapcsolódni, és minden külső beavatkozás
nélkül létrehozni az adott szupramolekuláris
struktúrát. Az élő szervezetekben található molekuláris
gépezetek rendkívül változatos funkciók ellátására
képesek. Találhatók közöttük molekuláris vegyi
üzemek, energiaátalakítók, molekuláris motorok,
biológiai jelfelismerők és jelátalakítók, információfeldolgozó
rendszerek, multifunkcionális gépezetek és
programvezérelt összeszerelő „gépsorok”. A bemutatott
példák alapján láthatjuk, hogy a 4,5 milliárd éves
földi evolúció eredményeként az élő rendszerekben
található fehérjék fantasztikus dolgokra, rendkívül
szerteágazó feladatok ellátására képesek. A természetes
fehérjék szerkezetének vizsgálata során felismert
összefüggések, törvényszerűségek, szerveződési elvek
sokat segítenek abban, hogy egy fehérje szerkezetében
vagy tulajdonságaiban célzott módosításokat
idézhessünk elő. Könyvünkben áttekintést szeretnénk
adni e szerteágazó funkciókról, különösen a sejt
funkciójának szabályozásában betöltött szerepükről
és egyre sokasodó diagnosztikai felhasználhatóságukról.

2. A fehérjevizsgálatok általános és alapvető
módszerei – a minták előkészítése
Különféle minták előkészítése
Ludány Andrea
Klinikai kutatólaboratóriumokban a biológiai minták
sokféleségével kell szembesülnünk. Gondolnunk kell
egyrészt az experimentális munkákra: így az állatkísérletekből
nyert sejt-, szövet- és szervmintákra, sejtkultúrákra,
másrészt pedig a klinikai, azaz betegekből
nyert mintákra is, amikor rendszerint célzottan diagnosztikus
markereket (pl. fehérjemolekulákat) keresünk.
Napjainkban a fehérjeanalitika modern módszerei
képesek tükrözni a biológiai minták fehérje-öszszetételének
sokféleségét és változékonyságát (diverzitását).
Azok a fehérjetérképek pl., melyeket 1975
óta a nagyfelbontású kétdimenziós poliakrilamid
gélelektroforézis technikával [11] kaptunk – ha érzékeny
detektálási eljárással párosítottuk – kezdetben
akár „zavart” is, a bőség zavarát is okozhatták. Valóban
nehezítette az értékelést a fehérjék „túl nagy”
száma (akár 3000 is) egyetlen nagy gélen. Több mint
szükséges, mondhattuk. Másrészről viszont ennél az
érzékeny technikánál szembesülhettünk azzal, hogy
a helyes mintavétel, a standardizált mintakezelés elengedhetetlen
az adott kérdés megválaszolásában, az
eredmények reprodukálhatóságában. A kérdés megfelelő
kiválasztásával és alkalmas mintakezeléssel az
értékelés könnyebbé válhat.
E fejezetrészben a következő vizsgálatok minta-előkészítéséről
lesz szó:
• Proteinek in vitro vizsgálatai.
• Sejtmentes, teljes sejt, teljes szerv.
• Fehérjekimutatások, mennyiségi meghatározások.
Általánosságban megállapíthatjuk, hogy különböző
mintatípusoknál a következő sajátságokat kell szem
előtt tartanunk:
• Sejtek, sejtkultúrák – szinkronizálás, kontrollált
körülmények.
• Szövetek – sejtösszetételükben heterogének.
• Organellumok – a kinyerési módszer meghatározó.
• Biológiai folyadékok – dinamikusan változóak.
Az in vitro fehérjeanalíziseknél gyakran szembesülünk
a következő fogalmakkal is:
• A fehérjék oldékonysága (szolubilizálása).
• Fehérjeprecipitáció (mint tisztítási, előfrakcionálási
eljárás).
• A minta integritása (a proteindegradáció veszélye).
Célunk mindenképpen az lesz, hogy az in vitro vizsgálatokhoz
minél egyszerűbb és hatékonyabb fehérjekivonási
módszereket alkalmazzunk. Egyszerűségét
és reprodukálhatóságát tekintve ilyen lenne pl. egy
egylépcsős extrakciós módszer, melyet valamennyi
mintára egyöntetűen alkalmazhatnánk. Természetesen
ilyen univerzális módszer nem létezik. Ellenkezőleg,
az irodalomban közölt ún.„standard” protokollok
száma igen nagy, melyeket vagy mintatípusokra
fejlesztettek ki és tovább „optimalizáltak” (pl. mikrobiológiai
minták vagy emlősszövetek), vagy célzottan
kérdéses fehérjék/fehérjecsoportok vizsgálatára ajánlanak
(mint pl. az oldékony „citoszol”-fehérjék vagy
az inszolubilis citoszkeletális sejtkomponensek).
A minták előkészítése és a fehérjék oldatba vitele. A kiválasztott
protokollunknál mindenképpen két vezérlő
elvet helyes betartani:
• A minta előkészítése (kezelése) olyan egyszerű
legyen, amennyire csak lehetséges (a jó reprodukálhatóság
érdekében).
• Minimálisra kell csökkenteni a fehérjék in vitro
módosulásait/károsodását, azaz lehetőleg meg
kell tartani eredeti tulajdonságaikat.

40 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
Sejtes minták előkészítése
A sejtes minták előkészítése röviden a következőkben
foglalható össze:
• Sejtfeltárás.
• Az interferáló anyagok inaktiválása, ill. eltávolítása.
• A fehérjék ezt követő szolubilizálása (oldatba
vitele).
A sejtek feltárása
A sejtek feltárása fizikai (mechanikai) vagy kémiai
(biokémiai) úton egyaránt elérhető. Ismerünk ultrahangos
kezelést, ozmotikus „sejtoldást”, fagyasztás
és olvasztás ciklikus ismétlését, detergens (tenzid-)
kezelést, a sejtfal enzimes oldását, nagy nyomásos
préseléses eljárásokat, különböző mechanikus homogenizálásokat:
közelebbről forgó késes, üveg- vagy
teflondugattyús és áramlásos feltárásokat. Ezek a
módszerek alkalmanként egyenként is, de kombinációikban
is használhatók. Mindegyiknek van előnye
és hátránya is. A kezelendő minta típusa határozza
meg kiválasztásukat. Típusosan pl. a baktériumok
vagy növényi szövetek keményebb bánásmódot követelnek
a sejtfeltáráshoz extrémen ellenálló sejtfaluk
miatt, míg az emlősszövetek jóval kíméletesebb
módszert igényelnek. Jóval „gyengédebb” sejtfeltárási
procedúra (pl. enzimes lízis) szükséges az intakt organellumok
kinyeréséhez (pl. mitokondriumok), főleg
ha ezt követően proteomikai vizsgálatot akarunk
végezni.
Interferáló anyagok inaktiválása
vagy eltávolítása
A sejt lizálása alatt (és után) interferáló vegyületek
szabadulnak ki a sejtekből (pl. proteolitikus enzimek,
sók, lipidek, poliszacharidok, nukleinsavak és/vagy
növényi fenolok). Ezeket szükséges lehet hatástalanítani
vagy eltávolítani. A legjelentősebb zavaró tényező
a sók és a fehérjék degradációja (proteolízis).
Proteázok. A proteázok működését mindenkor gátolni
kell, hogy megelőzzük a vizsgált fehérje degradációját,
mely járulékos fehérjefrakciókat eredményezhet,
és a nagy molekulatömegű (Mr) fehérjék
mennyiségének csökkenéséhez vezet. Elméletileg
egyszerűen proteázgátlók adásával célhoz tudnánk
érni, de a fehérjék töltésmódosulatai miatt ilyenkor is
keletkezhetnek műtermékek.
Másik megoldás lenne pl. a forralás SDS-tartalmú
mintapufferben, de a proteázok inaktiválása alacsony
pH-n is szóba jöhetne (lásd jéghideg triklórecetsavas –
TCA-s – fehérjekicsapás).
Sajnos igaz, hogy nem könnyű valamennyi fehérjebontó
enzimet egyidejűleg és teljesen hatástalanítani.
Az ismertetett megoldások közül a TCA-s kicsapás
valóban minimalizálja a fehérjék degradációját, egyidejűleg
eltávolítja az interferáló vegyületeket, végül
a csapadékban a teljes sejtlizátum alkalikus fehérjéi
fel is dúsulhatnak (pl. riboszómafehérjék, [3, 4]).
Számolni kell azonban azzal a fehérjeveszteséggel,
amit az inkomplett precipitáció és az újraoldás eredményez.
Ha a TCA-kezelt és nem kezelt sejtminták
fehérjetérképeit összevetjük, a különbségek szembeötlők.
Sóval szennyeződés. A sejtminták sókkal történő
szennyeződése lehet a másik igen gyakori probléma.
Ismert, hogy az ionok (sók) jelenléte lerontja az elektroforetikus
és az izoelektromos fokuszálásos elválasztások
hatékonyságát. Extrém nagy sókoncentráció-értékeknél
(>100 mM) a minta fehérjéi akár ki is
csapódhatnak. A sók eltávolításának klasszikus módjaként
a dialízis kínálkozik, de elérhetjük a médium
(puffer) cseréjét ultrafiltrációs kamrában is (nitrogéntúlnyomás
alatt), és sótlaníthatjuk fehérjemintáinkat
akár elektroforézissel is. Ilyenkor kezdeti alacsony feszültségen
(100 V) „kivándoroltatjuk” a rendszerből
az ionokat. (Számos protokollnál példát találhatunk
erre az irodalomban.)
A dialízishez a kereskedelmi forgalomban kapható
membránok garantált pórusmérettel rendelkeznek.
Megfelelő kezeléssel és duzzasztással aktiválhatók,
és akár ismételten újra használhatók. Ha a mintánk
a dialízist követően sűrítésre, azaz koncentrálásra kerül,
ajánlatos olyan illékony pufferelegyet alkalmazni
a sómentesítéshez (pl. ammónium-bikarbonátot),
amely később pl. a liofilizáláskor akadálytalanul eltávolítható.
Lipidek. A lipidek mint interferáló molekulák eltávolítására
– különösen az olyan lipidekben gazdag
biológiai mintánál, mint az agyszövet – organikus

Különféle minták előkészítése
41
oldószeres extrakció is szóba jöhet. A hideg alkoholos
vagy acetonos extrakcióknál azonban jelentős fehérjevesztést
észleltek: egyrészt bizonyos fehérjék szolvensbe
kikerülése miatt, másrészt a delipidált anyag
nem teljes újraoldódása miatt. Alternatív megoldásként
a feltárt szövet vagy biológiai minta lipidmentesítését
ultracentrifugálással lehet elvégezni, amikor
is a flotálódott, azaz a nem ülepedő lipidréteg a minta
felszínéről egyszerűen eltávolítható (pl. „Air-fuge”
centrifugák használata a rutin klinikai laboratóriumokban
a szérumminták delipidálásához).
Poliszacharidok és nukleinsavak. A poliszacharidok
(különösen, ha töltéssel rendelkeznek) és a nukleinsavak
kölcsönhatásba lépnek a fehérjékkel, és ezek az
összetett makromolekulák az oldatok viszkozitását
jelentősen megnövelve zavarhatják a fehérjevizsgálatokat
(gélpórusok eltömítése stb.). Hacsak nem igen
kis koncentrációban vannak jelen, eltávolításuk javasolt.
A már említett TCA-s fehérjekicsapás – számolva
a fehérjeveszteséggel – itt is szóba jöhet.
A nukleinsavak esetében proteázmentes RNS-áz
vagy DNS-áz kezelést, ill. bázikus poliamin addíciót
(pl. spermin) és ultracentrifugálást lehet az irodalom
szerint alkalmazni [13].
Fenolok. A növényekben, különösen a növényi levelekben
jelen lévő fenolok a fehérjékkel kölcsönhatásban
zavarhatják a 2D elektroforézis gélek fehérjetérképét.
Ajánlott a polifenol vegyületeket vízben
nem oldódó (inszolubilis) polivinilpolipirolidonhoz
(PVPP) kötni.
Fehérjék. Végül a mintában nagy mennyiségben
(túlsúlyban) „ballasztként” jelen lévő fehérjék zavarhatják
a kisebb koncentrációban jelen lévő fehérjék
vizsgálatát. Más szóval egyszerűen elfedhetik a számunkra
érdekes és kérdéses fehérjefrakciókat. Közismerten
ilyen az albumin, amely a plazmafehérjék
60%-át képviseli a vérplazmában. Eltávolítására a
kereskedelemben albuminmentesítő kitek kaphatók.
Használatuk azért int óvatosságra, mert a nem specifikus
kötésen alapuló módszer más fehérjéket is eltávolíthat
a mintánkból [15]. Magunknak egyébként
a blue-dextránnal volt kétségtelenül pozitív tapasztalatunk,
amelynek hatása az albumin festékkötési affinitásán
alapszik.
A fehérjék szolubilizálása (oldatba vitele)
A sejtfeltárást és az interferáló anyagok eltávolítását
követően a mintafehérjék híg pufferoldatban szolubilizálhatók.
A fehérjefunkciók megtartása kíméletes
eljárást feltételez, általában enyhén alkalikus közegben,
az intakt fehérjekomplexek szolubilizálása mellett.
Az individuális polipeptidláncok vizsgálatához a
fehérjéket denaturálják, az intra- és intermolekuláris
kölcsönhatásokat minimalizálják, miközben az eredeti
töltésviszonyokat igyekeznek megtartani.
A nem denaturáló pufferhez denzitásnövelés céljából
glicerint vagy szacharózt adhatunk, és nem ionos
detergensekkel növeljük az oldékonyságot és a
fehérjemolekulák diszpergálását. A kalcium- és magnéziumdependens
proteázok hatásának tompítására
EDTA vagy EGTA jelenléte szolgál.
A denaturáló szolubilizáló rendszerek kaotróp
anyagokat (urea és/vagy tiourea) tartalmaznak, redukálószerekkel
(ditiotreitol és/vagy b-merkaptoetanol)
adjuválhatók, valamint különböző ionos és nem ionos
detergensekkel egészülnek ki.
Kaotróp anyagok. A kaotróp anyagok, pl. az urea hatékony
szer a hidrogénhidak felbontására, és a fehérjék
kitekeredéséhez (unfolding), végül is denaturációhoz
vezet. A tiourea még hatékonyabb a hidrofób
interakciók megszüntetésére, de szemben az ureával,
nehezen oldódik vízben. A legjobb megoldás az extrém
hidrofób fehérjék oldására az a kompromisszum,
hogy 5–7 M ureát és 2 M tioureát kombinálnak megfelelő
detergenssel az oldatban. Ureás oldatban a fehérjék
karbamilációjára mindig gondolnunk kell. Ennek
elkerülésére az oldat hőmérsékletét 37 °C fölé nem
szabad emelni. A karbamiláció mértéke az általában
ajánlott 24 órás periódus alatt – mely a legtöbb szolubilizációs
protokoll időtartama – elhanyagolható. Az
elektroforézis során az urea bomlástermékei eltávoznak
a rendszerből.
Detergensek (felületaktív anyagok). Ionos és nem
ionos detergensek széles körben elterjedtek a fehérjeanalitikában.
Hatásuk a hidrofób kölcsönhatások megszüntetésében,
az aggregáció és precipitáció okozta fehérjeveszteségek
prevenciójában jelentkezik.
Az anionos detergensek között az SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát)
tartják az egyik leghatékonyabb

42 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
szolubilizáló ágensnek, különösen ha az oldatot felforraljuk.
A nem ionos detergensek közül az NP-40-et
és a Triton X-100-at kell megemlítenünk, melyek
igaz, elmaradnak az SDS hatékonyságától, de számos
más előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. Az extrém
hidrofób fehérjék vizsgálatához (pl. membránkomponensek)
az ikerionos detergensek, mint a CHAPS
vagy a szulfobetainok (SB 3-10, ASB 14) ajánlottak
[10, 14]. E felületaktív anyagok használata különösen
a korábban említett kaotróp ágensekkel (urea, tiourea)
párosítva jár sikerrel.
A detergensek esetében is igaz, hogy univerzális
recept nem adható meg valamennyi biológiai mintára.
Esetenként empirikusan kell az optimális módszert
kidolgoznunk a detergensek kölönböző fajtáinak
kombinációját párosítva egyéb adjuvánsokkal,
pufferekkel, akár organikus oldószerekkel.
A megfelelő detergens kiválasztásakor figyelembe
kell vennünk a kritikus micelláris koncentrációt
(CMC), a nem ionos detergensek jellemzésére
használt lipofil/hidrofil balansz/egyensúlyi adatot
(HLB-érték: 1–20) és a detergenshatást befolyásoló
egyéb faktorokat (hőmérséklet/CMT érték, ellenionok,
sók, szennyeződések, kaotróp anyagok stb.).
A fogalmak tisztázására egyrészt kémia, biokémia
tankönyvek szolgálhatnak, a detergensek számszerűsített
jellemzőinek pedig vegyszerkatalógusokban
ajánlott utánanézni.
Redukálószerek. A minta-előkészítés folyamatában
kritikus lépést jelenthet a redukció és a diszulfidkötések
újraképződésének megakadályozása. A redukcióval
a molekulán belüli és a molekulák közötti diszulfidhidak
felszakítása és a fehérjék teljes „kitekeredése”
(unfoldingja) érhető el. A leggyakrabban használt redukálószerek
– a ditiotreitol (DTT) és a ditioeritriol
(DTE) – vízben jól oldódnak, így nagy feleslegben
alkalmazhatók. Hátrányuk, hogy nem minden fehérjénél
hatékonyak, így a nagy ciszteintartalmú gyapjúkeratin
esetében helyettük a kevésbé oldékony és toxikus
tributilfoszfint (TBP) ajánlják.
A vizsgálandó fehérjék koncentrációja. Fehérjeminták
analíziséhez 5–10 mg/ml fehérjekoncentráció az
ideális. Túl csekély koncentrációnál (< 0,1 mg/ml) a
minta fehérjetartalma hozzátapad a kémcső, pipetta
vagy laboratóriumi edény falához, tovább növelve a
nem kívánt veszteséget. Híg fehérjeoldatoknál – ha
2-1. ábra. Kötött és szabad anyagok elválasztása ultraszűréssel.
Az Amicon ultrafiltrációs elválasztás vázlatos ábrázolása.
A technika a minta-előkészítés tekintetében az
egyik legkíméletesebb eljárás
nagy a sókoncentráció – „sótalanítás” szükséges, amit
a fehérjék koncentrálásával kapcsolhatunk össze. Ultraszűréssel
a fehérjéket károsodás nélkül egyidejűleg
lehet sómentesíteni és dúsítani is (2-1. ábra).
A fizikai-kémiai fehérjekicsapásos eljárások (szerves
oldószerekkel, pl. alkohollal, savas, pl. TCA-s,
hőkezeléssel stb.) célravezetők lehetnek, de mindig
felvetődik a natív fehérjék károsodásának veszélye.
Illékony pufferoldatokkal (ammónium-bikarbonát)
végzett dialízis liofilezéssel (fagyasztva szárítással)
párosítva is ajánlott megoldás. Kis pórusátmérőjű
ultraszűrő membránok alkalmazásával a fehérjeoldat
szintén koncentrálható, ill. különböző áteresztőképességű
(cut-off) membránok segítségével akár frakcionálható
is.
A minták tárolása
Rövid ideig – néhány órás vagy éjszakán át való várakozásnál
– elegendő a mintákat hűtőben 4 °C-on tartani.
Hosszabb időre a minták fagyasztóban (–70 °C),
száraz jégben (–78 °C) vagy folyékony nitrogénben
(–196 °C) tárolhatók.
Ismételt fagyasztás és olvasztás mindig kerülendő.
Többszöri felhasználáshoz a mintát célszerű
100–200 µl-es adagokban szétosztva tárolni.
A minták előfrakcionálása az analízisekhez
Tekintettel a biológiai minták fehérjetartalmának
összetettségére és dinamikus változékonyságára, előfrakcionálási
lépés(ek) közbeiktatása gyakran ajánlott.
Ezzel a lépéssel a közvetlen analízisre kerülő

Különféle minták előkészítése
43
szubfrakciók komplexitása mérséklődik, és a vele járó
dúsulással a diszkrét fehérjefrakciók is detektálhatóvá
válnak.
Néhány példa a minta típusától és a vizsgálatok
céljától függő előfrakcionálásra:
• Specifikus sejtek izolálása szövetből pl. FACS
technikával (fluorescence activated cell sorting)
vagy lézer-mikrodisszekcióval (LCM laser capture
microdissection).
• Sejtkompartmentek és/vagy organellumok izolálása
pl. szacharóz-gradiens centrifugálással.
• Szelektív fehérjecsoportok kicsapása (pl. riboszómafehérjék
TCA/aceton kezelése).
• Lépcsőzetes extrakciós eljárások növekvő oldékonyság
alapján (vizes pufferek, organikus oldószerek,
detergens alapú extrakciós oldatok).
• Kromatográfiás vagy elektroforetikus elválasztási
módszerek (gélszűréses, ioncserés oszlopkromatográfia,
affinitásos tisztítási eljárások,
preparatív izoelektromos fokuszálás stb.) (2-2.,
2-3. ábra).
Mindig nagy probléma a rendszerint rendkívül heterogén
emlősszövetből (pl. rákbetegség esetén) a további
vizsgálatra kerülő célsejteket megfelelő menynyiségben
kinyerni. Nagyszámú metszet készítésével
az LCM (lézer-mikrodisszekció) technika révén tiszta
sejtpopulációhoz lehet jutni, mely tovább analizálható
2D elektroforetikus eljárással. Az LMC hátránya
munka- és időigényessége. Másik lehetőség a FACS
(fluorescent activated cell sorting) technika, mely antitestkötés
alapján nyeri ki a specifikus célsejteket, azaz
a kívánt szöveti szubpopulációt [12]. A sejtszeparálási
eljárások közül a vér alakos elemei vizsgálatában a
Fikoll-gradiens és centrifugálás együttes alkalmazása
látszik a legkönnyebben elérhetőnek.
Az organellumok (pl. mitokondriumok) izolálására
leghatékonyabb módszer a növekvő sűrűségű
cukoroldatban való ún. gradiens-centrifugálás. Az eljárás
egyik hagyományos változatának tekinthető a
differenciálcentrifugálás [7]. Ilyenkor pufferolt cukoroldatban
egy- és kétértékű kationok jelenlétében a kíméletesen
homogenizált szövetmintát lépcsőzetesen
kiülepítjük, és a sejtorganellumokat, azaz a sejtmagot,
a mitokondriumokat, a mikroszóma- és a citoszolfrakciókat
elválasztjuk.
Szemben a humán és az állati sejtekkel, ahol a sejtfelszíni
struktúrák könnyen megbonthatók, a mikroorganizmusok
esetében a rendkívül ellenálló sejtfal
miatt bonyolultabb eljáráshoz kell folyamodni,
2-2. ábra. Cinkkötő fehérjék gélkromatográfiás előfrakcionálása
(Sephadex G-75, minta: patkánymájsejt-citoszol)
2.-3. ábra. Gélszűréses frakciók (Sephadex G-75 I., II., III.,
1D elektroforetikus) nem denaturáló PAGE képe. A nem
denaturáló alkalikus gélek az előző ábra frakcióinak elektroforetikus
fehérjemegoszlását hasonlítják össze (a detektáláshoz
amidofekete-festést használtak, 100 µg/gélrúd
proteinmennyiségekkel)

44 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
ugyanakkor a kinyert organellumok épségét is óvni
kell. Élesztősejtek mitokondriumainak izolálásához
a sejtfal poliszacharidbontó enzimes kezelését követően
a sejttartalmat hipotóniás oldattal és/vagy kíméletes
mechanikus úton nyerik ki [9, 18].
A teljes sejtlizátumok analízise nem vezet eredményre
az egyes fehérjék célzott vizsgálatakor. Az
analitikai eljárás kapacitása, felbontóképessége limitálja
a vizsgálandó protein mennyiségét. Ennek
áthidalására ajánlott a fejezetünkben már többször
említett precipitációs (TCA/aceton) eljárás, amelynek
számos előnyét hangsúlyoztuk. Az alkalikus fehérjék
dúsítása, azaz az analizálandó proteinek mennyiségének
növelése ebben az esetben együtt jár a nem kívánt
proteolitikus hatások kiküszöbölésével és az interferáló
vegyületek eltávolításával.
A sejtek és a szövetek lépcsőzetes extrakciója elérhető
a fehérjék oldékonysága alapján. Végső soron
ide tartoznak a lépcsőzetes kisózási eljárások (ammónium-szulfát),
organikus oldószerként az alkoholos
frakcionált kicsapások (Cohn-frakcionálás/albumin),
ureakezelések (pl. szérum alkalikus foszfatáz
izoenzim vizsgálatok) a hidrofób fehérjék vizsgálatában
(membránfehérjék), de a hőkezelések is a hőstabil
és hőrezisztens fehérjecsoportok szeparálására (pl.
tropomiozinkinyerés vérlemezkékből).
Itt kell megemlítenünk a nem ionos detergensek
használatát a sejtfrakcionálásban. A detergensrezisztens
sejtfrakció a citoszkeleton felfedezéséhez
vezetett. Számos sejtfunkció vizsgálata a detergens
szolubilis, az ún. lazán kötött fehérjék és a citoszkeletonfehérjék
dinamikusan változó kölcsönhatásához
kapcsolódik.
A különböző kromatográfiás eljárások hatékony
eszközei lehetnek az előfrakcionálásnak. A frakciók
közötti keresztszennyeződések itt kevésbé érvényesülnek,
mint általában az említett extrakciós módszerekben.
Megfelelő detektálások kombinációival,
kíméletes körülmények között értékes, a további
analízisekre minőségben és mennyiségben optimális
mintákat kaphatunk.
A gélszűrés elvén (azaz a molekulaméreten) alapuló,
valamint az ioncserélő kromatográfiás elválasztásokat
kihasználó (kation- és anioncserélő oszlopok)
és az affinitásos (ligandkötésen alapuló) elválasztási
technikák a preparatív laboratóriumi munkák során
egyaránt felhasználásra kerülhetnek. A nem denaturáló
rendszerek különösen előnyösek lehetnek
a fehérjék biológiai aktivitásának megőrzésében.
Dextrán-, akril-, agaróz-, poliakrilamidgél alapú elválasztási
rendszerek egyaránt ismertek. A fehérjefrakciók
elválasztásának követésére alkalmas módszerek
a spektrofotometria, az enzimaktivitás mérése,
az izotópaktivitás, valamint a kemilumineszcenciás
detektálás (lásd 2-2., 2-3. ábra).
További lehetőség fehérjék csoportjainak izolálására
és dúsítására az egy- és kétdimenziós elektroforézis
technikák. Fehérjekomplexek vizsgálatában alkalmaztuk
magunk is, a következők szerint:
• Cink/fehérje komplexeket vizsgáltunk. Az előzetes
feltáró/elválasztó eljárásokhoz (homogenizálás,
centrifugálás, dialízis, ultraszűrés, gélszűrés)
csatoltan végül – mintegy befejező
lépésként – nem denaturáló gélben végeztük a
natív fehérjekomplexek elegyének vizsgálatát. E
frakciókban a komplexek funkciója rendszerint
megtartott. Ha viszont 2D elektroforézissel folytattuk
az elválasztást denaturáló jellegű lapgélen,
az első dimenziós natív fehérjekomplexek
összetételéről (pl. alegységeiről) kaphattunk
információt.
• Nagyobb fehérjefelbontást akkor értünk el mintáinkban,
ha az első dimenziós frakcionálásra
izoelektromos fokuszálással és denaturáló rendszerben
került sor. Széles, 1–11 pH-tartományban
ún. preparatív IEF gélben előfrakcionáltunk.
Majd befejezésül az O’Farrell által bevezetett
és jól ismert nagy feloldású kétdimenziós
poliakrilamid gélelektroforézissel fehérjetérképet
készítettünk. A térkép készítésekor – analitikai
célból – már nem széles, hanem keskeny
pH-tartományt használtunk a nagyobb felbontás
elérésére. Immunkémiai detektálást alkalmazva
vagy tömegspektrometriás (MS) mérésekkel
kombinálva (MS-kompatibilis jelöléssel!)
a fehérjefrakciók azonosításához juthatunk
(lásd proteomika).
Összefoglalásként megállapítható, hogy az előfrakcionálási
eljárások sok előnnyel rendelkeznek, melyek
közül a fehérjék dúsítása és a diszkrét fehérjefrakciók
megjelenítése kiemelendő. Hátrányuk lehet viszont
az individuális frakciók keresztszennyeződése,
a munka- és időigényesség, amit tovább növel az a
tény, hogy a kromatográfiás és a hígítási folyamatok
miatt rendszerint mintakoncentrálás szükséges. Vé-

Különféle minták előkészítése
45
gül megjegyezzük, hogy az egyedi mintakezelések
miatt csak néhány minta egyidejű párhuzamos kezelése
lehetséges.
Eljárások (protokollok) [6]
Sejt- és szöveti minták extrakciója
és szolubilizációja
Fejezetünk további részében néhány konkrét eljárást
ismertetünk kivonatosan, rövid összefoglalások formájában.
Az összeállítás választási lehetőséget kínál
az igen különböző biológiai minták analízisében. A
rövid leírások mikroorganizmusok, növényi magvak
és emlősszövetek extrakciós és szolubilizációs kezeléseiről
egyaránt szólnak. A procedúra általában a
sejtek és a szövetek mechanikus roncsolásával (feltárásával)
kezdődik, és ez alatt vagy ezt követően a
sejteket lizálják, majd az interferáló anyagokat vagy
közömbösítik, vagy eltávolítják. A proteineket ureaés
detergenstartalmú lízispufferben oldják ultrahangkezelés
mellett. Az ajánlott mintamennyiség 5 × 10 8
sejtszám, 50 mg máj- vagy szívszövet, az optimális
fehérjekoncentráció 5–10 mg/ml.
A fehérjék szolubilizációját követően az ureatartalmú
extraktumokat 10 000 g-vel 15 °C-on egy órán át
centrifugálják az oldhatatlan sejttörmelékek kiülepítésére.
Az SDS-tartalmú minták mind alacsony, mind
magasabb hőmérsékleten (4–37 °C között) centrifugálhatók.
Az IEF-szeparálás előtt a fehérjekivonatot
célszerű a detergenstől megszabadítani (pl. a fehérjék
kicsapásával).
A proteinkivonatok közvetlenül használhatók,
vagy több hónapig –70 °C-on tárolhatók. A 2D-PA-
GE-elektroforézisekhez analitikai céllal 50–100 µg
protein, preparatív munkáknál 0,5–1,0 mg is futtatható.
Reagensek, mintapufferek
• Ureatartalmú lízispuffer denaturáló IEF-hez: 9,5
M urea, 1% ditiotreitol, 2% nem ionos detergens,
2% Ampholine (pH 3–10), 10 mM proteázgátló.
• Tiourea/urea lízispuffer rezisztens fehérjék denaturáló
kezelésére: 2 M tiourea, 7 M urea, 4%
CHAPS (ikerionos detergens), 1% redukálószer,
2% Ampholine (pH 3–10), 10 mM proteázgátló.
• SDS-tartalmú mintapuffer: 1% SDS, 100 mM
TRIS-HCl puffer (pH 9,5).
• Precipitáló reagens: 20% TCA + 0,2% ditiotreitol
jéghideg acetonban (–20 °C).
• Precipitátum mosáshoz: 0,2% ditiotreitol jéghideg
acetonban (–20 °C).
• Pufferolt sóoldat (PBS): 0,9%-os NaCl-oldat 10
mM foszfátpufferben (pH 7,4).
Fontos megjegyzések: Az ureatartalmú oldatokat nem
szabad hőkezelni a fehérjék karbamilációja miatt. Az
Ampholine-tartalmú lízispufferek „romlandók”, elkészítésüket
követően 1 ml-es adagokban mélyhűtve,
fagyasztva tárolandók (–70 °C).
Mikroorganizmusok. A mikrobiológiai sejtkultúrák,
mint a baktériumok vagy a gombák tenyésztése optimalizálást
és standardizálást igényel. Mivel a növekedési
fázis nagymértékben függ a sejtek biokémiai
állapotától, a minták összegyűjtését előre kigondoltan
és standardizáltan kell elvégezni. A sejtek proteázokat
és más extracelluláris enzimeket választanak
ki a szövetkultúra médiumába, és ezek a molekulák
interferálnak az extrakcióval. Ezen anyagoktól meg
kell szabadulni, mert károsítják a vizsgálandó fehérjéket,
csökkentve a kinyerés hatásfokát. A kultúrát
ezért izotóniás pufferoldattal (pl. PBS) vagy szacharózoldattal
kell átmosni. Hogy stresszhatást ne okozzunk,
a mosópuffernek azonos hőmérsékletűnek és
pH-értékűnek kell lennie, mint a médium [2]. A mosási
lépés ugyanolyan körülményeket biztosít a sejtek
számára, mint amelyek a mintagyűjtést megelőzően
voltak a kultúrában.
A sejtfallal körülvett sejtek, pl. a gombák ozmotikusan
sokkal eredményesen nem extrahálhatók. Az
ilyen sejteknél erőteljes roncsolásra van szükség: ez
vagy mechanikusan, pl. üveggyöngyös rázással, urea/
tiourea tartalmú lízispufferben (jégfürdőben) való
ultrahangos kezeléssel vagy SDS jelenlétében melegítéssel
érhető el. Ha szükséges, proteázmentes DNS-áz
és RNS-áz adható a nukleinsavak emésztésére.
A bakteriális fehérjék szolubilizációja. A sejtek öszszegyűjtésére
előre meghatározott növekedési fázisban
és tenyésztési körülmények között kerül sor.
Hacsak lehet, kémiailag jól defineált médium a kísérleteknél
előnyös lehet. Nagy optikai denzitás esetén
számításba kell venni, hogy ilyenkor sok halott sejt

46 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
kerülhet az analízisbe. Mintagyűjtésre ezért a korai
logaritmusos növekedési fázis ajánlott, mert akkor
még túlnyomórészt élő sejtek kerülnek feldolgozásra.
1. A sejtek centrifugálása 3 percig 10 000 g-vel végezhető.
Ez az ülepítés a legtöbb baktériumtípus
számára elegendő. Az indítás meghatározott térfogattal
kezdődik: pl. 10 ml 0,5 optikai denzitású kultúra.
Az üledéknek ebben az esetben jól láthatónak
kell lennie. Azonos térfogatú előmelegített PBS-sel
reszuszpendálás következik, majd ismételt centrifugálás.
A kívánt tisztaságú és interferáló molekuláktól
mentes vizsálati minta nyeréséhez többszöri
mosás és centrifugálás szükséges.
Megjegyzés: Ha az extracelluláris proteolitikus
enzimek eltávolítása mégsem teljes, a fehérjetérképen
a nagy molekulatömegű fehérjék eltűnnek;
míg horizontális csíkok vagy fehérjeprecipitátumok
megjelenése a minta nagy sókoncentrációjára
utal.
2. Az üledéket 0,2 ml SDS-tartalmú szolubilizáló lízispufferben
szuszpendáljuk. A puffer vagy jéghideg
legyen, vagy aktív proteázok esetén 95 °C-ra
hevítés szükséges.
3. Következik a minta ultrahangos homogenizálása.
4. A roncsolt és feltárt sejteket mikrocentrifugában
14 000 g-vel 30 percig 4 °C-on ülepítjük.
5. A felülúszót óvatosan leszívjuk, majd 50-50 µl-es
adagokban –70 °C-on tároljuk. Az extraktumok
felengedés és ismételt fagyasztás nélkül egy évig
stabilak.
6. Izoelektromos fokuszáláshoz az SDS-sel kezelt fehérjemintákat
150 µl tiourea/urea lízispufferrel hígítjuk
a detergens leszorítására.
Emlősszövetminták. Az emlősszöveti mintákat (állati
szövetek, szöveti biopsziák stb.) kivétel után azonnal
le kell fagyasztani (pl. folyékony nitrogén alatt
–196 °C-on). Kisebb minták fagyasztás/felolvasztás
eljárással, nagyobb szövetdarabok késes homogenizálás
után lízispufferben való szolubilizálással tárhatók
fel.
Egérmájfehérjék szolubilizálása:
1. A lefagyasztott májszövetet erőteljes hűtés mellett
homogenizáljuk proteinázgátló jelenlétében.
2. A homogenizálást követően 60 mg anyagot azonna1
1,0 ml lízispuffert tartalmazó mikrocentrifugacsőbe
mérünk.
3. A hatékony sejtlízis érdekében 5 × 2 másodperces
(10 mp szünetekkel) ultrahangkezelést végzünk.
30 perc szobahőmérsékleten való inkubációt követően
40 000 g-vel 60 percig 15 °C-on centrifugálunk.
4. A szupernatánst –70 °C-on tároljuk. Az extraktum
fehérjekoncentrációja ideális esetben 5–10 mg/ml
legyen.
Megjegyzés: A teljes máj eltávolítása esetén a
további analízisek szempontjából ajánlott a teljes
szerv perfúziója vértelenítés céljából. Pufferolt szacharózoldat
a portalis vénán keresztül általunk is
kipróbált előnyös beavatkozás lehet.
Alkalikus fehérjék dúsítása egérmájszövetben TCA/
aceton kicsapással:
1. Mélyhűtött egérmáj-homogenizátum a kiindulási
anyag.
2. 100 mg alapanyagot egy előhűtött (–20 °C), 25 ml
acetonban oldott 20% TCA-t (triklórecetsavat) és
0,2% ditiotreitolt (DTT) tartalmazó centrifugacsőben
felszuszpendálunk.
3. A centrifugacsövet –20 °C-on tartjuk a fehérjék
komplett kicsapása érdekében. 40 000 g-vel 60 percig
–10 °C-on centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük.
Az üledéket 20 ml 0,2% DTT-t tartalmazó jéghideg
acetonban reszuszpendáljuk.
4. Ismételt centrifugálás következik, majd az üledéket
vákuum alatt szárítjuk. A mintákat ismételt vortex-kezeléssel/vagy
ultrahanggal oldjuk megfelelő
térfogatú (2-3 ml) lízispufferben. A fehérjeoldat
koncentrációja 5–10 mg/ml tartományban legyen.
Kis mennyiségekben szétosztva –70 °C-on tároljuk.
Megjegyzés: A fehérjeüledéket vákuumos szárítás
nélkül direkt oldhatjuk a lízispufferben.
Növény minták
A száraz növényi magvakat, amelyekben a proteázok
rendszerint nem aktívak, egyszerűen összetörjük.
A növényi szövetet ezt követően lízispufferben oldjuk,
centrifugáljuk és szétosztjuk [16, 17].
Megjegyzés: Specifikus fehérjefrakciók kivonása
érdekében ezeknél a mintáknál is végezhetünk előfrakcionálást
az analízisek előtt. Ilyen pl. a vízben oldódó
fehérjék (albumin) kivonása, vagy az alkoholban
oldható fehérjék (gliadinok) elválasztása.
Növények levelei nem csak fehérjebontó enzime-

Különféle minták előkészítése
47
ket, hanem fenolokat is tartalmaznak igen nagy koncentrációban,
amelyek proteineket adszorbeálnak,
és csíkozottságot okoznak a kétdimenziós (2D) géltérképeken.
Ezt a zavaró hatást elkerülendő, itt is a
májszövetnél leírtakhoz hasonlóan járunk el. A sejteket
egy mozsárban szétroncsoljuk, a fehérjéket 20%
TCA-t tartalmazó jéghideg acetonban kicsapjuk. Az
üledéket kétszer –20 °C-os acetonnal mossuk a növényi
fenolok eltávolítására, a végső üledéket szárítjuk
és lízispufferben oldjuk.
Az interferáló vegyületek eltávolítása
a mintákból
A mintaelőkészítés során számos zavaró komponens
kerülhet az analizálandó mintába, melyektől meg kell
szabadulni. Ezek lehetnek módosult fehérjék, fehérje
és nem fehérje természetű szennyezések, sejtes elemek,
nukleinsavak stb. Ha pl. a proteomikai vizsgálat
alapját képező fehérjetérképeket szándékozunk készíteni,
a 2D gélben látható műtermékek, zavaró festődő
sávozottság, elmosódott frakcionálás teszi néha lehetetlenné
az értékelést.
A leggyakoribb interferáló mintaösszetevők és az
eltávolításukra javasolt leginkább használatos egyszerű
módszerek a következők lehetnek:
• Töltéssel rendelkező molekulák. Ezek lehetnek
sók (pl. NaCl, KCl), puffer komponensek (pl.
TRIS, PBS) és töltéssel rendelkező egyéb molekulák,
mint pl. nukleotidok. Az izoelektromos
fokuszálások szerény felbontásának ez az egyik
leggyakoribb oka. A sók és a töltéssel rendelkező
molekulák ugyanis megnyújtják a fokuszálási
időt, azaz a fehérjék csak akkor érik el az izoelektromos
pontjukat, ha az ion elhagyja a hordozót.
A töltéssel bíró molekulákat dialízissel
vagy gélszűréssel lehet eltávolítani.
• SDS. A fehérjék az SDS-molekulákkal komplexet
alkothatnak. A keletkezett komplex többszörösen
negatív töltésű, ezért a pozitív elektród
felé vándorol. Acetonos precipitáció segít az
SDS-koncentráció csökkentésében. Ha az SDSkoncentráció,
amit a minta előkészítéséhez
használtunk, nem túl nagy (0,25–0,50%), nem
ionos detergenssel (pl. NP-40) 5:1–8:1 arányban
hígítva a hatását minimalizálni lehet.
2-4. ábra. Szérumproteinek (2D PAGE – O’Farrell-technika). SwissProt adatbázisból átvett kép a frakciógazdagság demonstrálására

48 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
• DNS. A DNS negatívan töltött; fehérjékhez
kötődve műterméket eredményez, és mint nagy
molekula, a szeparáló gél pórusait eltömíti. Ha
ezüstözéssel detektáljuk a fehérjéket, a DNS
szintén festődik, növeli a háttér festődését. A
DNS a mintából enzimes kezeléssel (DNS-áz)
vagy ultrahanggal vonható ki.
• Részecskék a mintában. Nagy fordulatszámú
centrifugálással ülepíthetők ki.
• Szérumfehérjék. A szérumfehérjék, mint az
albumin és az immunglobulinok (IgG), a teljes
fehérjetartalomnak mintegy 75%-át teszik ki. A
két nagy mennyiségű fehérje eltávolítása megkönnyíti
a kisebb szérumfehérje-frakciók detektálhatóságát.
Módszertanilag affinitásos kromatográfiás
eljárással, pl.Blue Dextran révén érhető
el e szérumfehérjék eltávolítása. Kerekedelmi
forgalomban beszerezhetők olyan antitesteket
tartalmazó kitek, amelyek tetszés szerint a 6, 12,
20 legnagyobb mennyiségű szérumfehérjét
képesek eltávolítani (2-4., 2-5. ábra).
Megjegyzés: A dialízis, a gélszűrés, az affinitásos kromatográfiás
szeparálások, valamint a fehérjekicsapásos
eljárások részletei a megfelelő irodalomban fellelhetők.
A minták előfrakcionálása
A prefrakcionálás a rendkívül összetett fehérjeminta
analízisek előtti, kisebb frakciókra való elválasztását
jelenti. Célja a minta komplexitásának csökkentése.
Segítségével dúsítani lehet az érdeklődésünk középpontjában
szereplő fehérjefrakciót.
• Folyadék fázisú izoelektromos fokuszálás. Lényege,
hogy izoelektromos pontjuk alapján pH-tartományokba
frakcionáljuk a sejtlizátumot.
• Szubcelluláris frakcionálás. A sejthomogenizátumok
szubcelluláris frakciókra választhatók
differenciál-centrifugálással (magok, mitochondriumok,
mikroszómák, detergensrezisztens
sejtalkotók stb.)
• Konvencionális kromatográfiás technikák. Itt
utalunk ismételten a gélszűréses, ioncserés és
affinitás kromatográfiákra.
Fehérjemeghatározások
A fehérjekoncentráció pontos meghatározása elengedhetetlen
a fehérjevizsgálatokban. Mind a preparatív,
mind az analitikai eljárások fontos vonatkoztatási
alapja. Fehérjemintázatok összehasonlító értékelése
csak azonos mennyiségekkel végezhető. A kísérleti
2-5. ábra. Humán plazmafehérjék 2D PAGE térképe (az értékelést az albumin- és IgG-mentesítés – mint ajánlott előtisztítás
– lényegesen megkönnyíti)

Különféle minták előkészítése
49
minták speciális egyedi fehérjéit nem koncentrációban
adjuk meg, hanem össz-fehérjetartalomra fejezzük
ki. Ha térfogati adatokkal nem rendelkezünk,
rendszerint fehérjére számolunk.
Az irodalomban számos érzékeny fehérjemennyiség-mérési
módszer ismeretes. Megjegyzendő, hogy
a mintánk tartalmazhat olykor olyan komponenst,
amely interferál az adott meghatározással (urea, detergens,
redukálószer stb.). Olyan módszert kell kiválasztani,
amely nem érzékeny ezekre az anyagokra.
Fehérjekoncentráció-mérési módszerek
Direkt fotometria. A direkt fotometriás eljárások közül
ismert a 205 nm-en, valamint a 280 nm-en való
mérés. Az előbbi a peptidkötések meglétén, az utóbbi
az aromás aminosavak jelenlétén alapszik. Előnyük,
hogy a minta nem „használódik” el, további vizsgálatokhoz
rendelkezésre áll. Leginkább kromatográfiás
elválasztások frakciókövetésére használatosak. Hátrányuk,
hogy érzékenységük elmarad pl. a Folin-féle
vagy a különböző festékkötéses módszerekétől, és
mennyiségi referenciájuk (kalibráció és standardizálás)
sem megoldott.
Biuret reagens. A peptidkötést detektáló alkáliás réz
reagens, a keletkező színreakcióban követi a Lambert–Beer-törvényt.
Klasszikus, a rutin laboratóriumokban
használatos spektrofotometriás mennyiségi
fehérjemeghatározás.
A reakció elve a következő: A réz(II)ionok a peptidkötés
4-4 N-atomjával alkalikus közegben vörösibolya
komplexet képeznek, amelyet 546 nm hullámhosszon
fotometriásan mérnek. A biuret reagens
(kereskedelmi forgalomban kapható, rutin laboratóriumi
reagens) rézszulfátot, kálium-nátrium-tartarátot,
kálium-jodidot és nátrium-hidroxidot tartalmaz.
A tartarát köti komplexbe a réz(II)iont, amely
alkalikus pH-nál mint réz(II)hidroxid kiválna, a jodid
megakadályozza a réz(II)ion autoredukcióját.
A színintenzitás a peptidkötések számával arányos.
150–1000 μg/mL proteinkoncentráció tartományban
alkalmazható.
Lowry-féle fehérjemeghatározás. Kis fehérjekoncentrációnál
használatos módszer a tudományos laboratóriumokban.
Valójában a biuretmódszer Lowry
által módosított változata ez a fehérjemeghatározás,
amelynél a réz-peptid komplexek a rákövetkezően
hozzáadott Folin-reagenssel (foszfomolibdát/foszfovolframát)
molibdénkékké redukálódnak.
Használatos reagensek:
1. 2%-os Na-karbonát (2 g 0,1-szer normál NaOH
100 ml-ében oldva).
2. 1%-os CuSO 4
× 5H 2
O (1 g 100 ml vízben).
3. 2%-os Na-tartarát (2 g 100 ml vízben).
4. Munkaoldat: Alkalikus rézoldat; (98 ml 1-es oldat
+ 1 ml 3-as oldat + l ml 2-es oldat – a sorrend betartása
ajánlatos).
5. Folin-reagens (gyári készítmény).(Folin & Ciocalteu’s
phenol reagent suitable for determination of
total protein by Lowry method).
A meghatározás menete:
0,2 ml minta
l ml alkalikus rézoldat (4-es oldatkeverék, frissen készül)
15 perc várakozás
1 ml víz
0,1 ml 1:1 hígítású Folin-reagens (vizes hígítás)
30 perc várakozás után fotometrálás 500 nm-nél
Megjegyzés: Triton-X detergenst tartalmazó minták
esetén az 1 ml víz helyett 1 ml 10%-os SDS-t kell
bemérni. Az ionos detergens jelenlétében megszűnik
a minták zavarossága.
Standard: ismert fehérjekoncentrációjú standard oldat
100–600 μg/ml tartományban (pl. BSA, marha-szérumalbumin)
hasonlóan kezelve alkalmas a
kalibrációs egyenes felvételére [8].
Fehérjemeghatározás mikrobiuret-módszerrel (Benedikt-módszer).
Mivel a Lowry-módszer részben
az aromás aminosavak – mint a tirozin és a triptofán
– jelenlétén alapszik, ezért ha ezek alig vagy egyáltalán
nem fordulnak elő a fehérjében, a proteinoldat fehérjemeghatározására
ez a Benedikt-módszer látszik
alkalmasnak. A meghatározás a peptidkötések számán
alapszik. Érzékenység: 0,25–5 g/L protein.
Reagensek:
1. 17,3 g trinátrium-citrát × 2 H 2
O + 10 g vízmentes
Na-karbonát kevés vízben oldva.
2. 1,73 g CuSO 4
× 5 H 2
O oldva 10 ml vízben, és az oldathoz
az 1. oldatot hozzáadni
3. A keveréket 100 ml-re vízzel feltölteni (Benedikt-reagens).

50 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
Procedúra: 1 ml 3%-os NaOH, 50 µl Benedikt-reagens
és 100 μl proteinoldat.
Fotometrálás: 330 nm-nél.
Fehérjemeghatározás Bradford szerint, mikromódszerrel.
Festékkötésen alapuló eljárás (1–1,400
μg/ml protein). Ez a módszer a fehérjék és a Coomassie
Brilliant Blue G festék kötődésén alapszik. A
fehérjeminta a festékreagenssel összekeverve, rövid
ideig tartó, szobahőmérsékleten való inkubációt követően
595 nm-en fotometrálható. Nagy érzékenysége
miatt a meghatározáshoz a biológiai mintákat
rendszerint hígítani kell. (A humán könnymintáknál
pl. 20–40-szeres hígítást alkalmaztunk.)
A Bradford-reagens összetétele:
• – 10 mg Comassie Brilliant Blue (CBB) G-250
• – 5 ml 95% etanol
• – 10 ml 85% foszforsav
• – 85 ml desztillált víz
15 μl mintához 200 μl Bradford-reagenst adunk. (A
térfogatok természetesen arányosan növelhetők: pl.
150 μl mintához 2000 μl Bradford-reagens.)
5 perc inkubációt követően 595 nm hullámhoszszon
vakkal szemben fotometrálunk.
Standardként 1 mg/ml pl. BSA törzsoldatból készült
hígítási sort (25–400 μg/ml) használhatunk, az
eredményeket grafikusan ábrázoljuk. A fehérjekoncentrációkat
a hígítások figyelembevételével az eredeti
mintára visszaszámoljuk (g/l).
Irodalom
[1] Bradford, M. M.: A rapid and sensitive method for
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.
72:248–254, 1976.
[2] Drews, O., Weiss, W., Reil, G. et al.: High pressure
effects step-wise altered protein expression in Lactobacillus
sanfrasciscensis. Proteomics 2:765–774, 2002.
[3] Görg, A., Obermaier, C., Bogouth, G. et al.: Recent
developments in 2D gel electrophoresis with immobilized
pH gradients: Wide pH gradients up to pH 12,
longer separation distances and simplified procedures.
Electrophoresis 20:712–717, 1999.
[4] Görg, A., Bogouth, G., Harder, A. et al.: The current
state of two-dimensional electrophoresis with immobilized
pH gradients. Electrophoresis 21:1037–1053,
2000.
[5] Görg, A., Weiss, W., Dunn, M. J.: Current two-dimensional
electrophoresis technology for proteomics. Proteomics
4:3665–3685, 2004. (Review)
[6] Görg, A., Lück, C., Weiss, W.: Sample prefractionation
in granulated Sephadex-IEF gel. Meth. Mol. Biol.
424:277–286, 2007.
[7] Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I.: Organelle Proteomics:
implications for subcellular fractionation in
proteomics. Circ. Res. 92:962–968, 2003.
[8] Lowry, O. H. et al.: Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265–275, 1951.
[9] Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N.: Purification
of S. cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and
cytosolic contaminant. Anal. Biochem. 287:339–342,
2000.
[10] Molloy, M. P.: Two-dimensional electrophoresis of
membrane proteins using immobilized pH gradients.
Anal. Biochem. 280:1–10, 2000.
[11] O’Farrell, P. H.: High Resolution Two-Dimensional
Electrophoresis of Proteins. J. Biol. Chem. 250:4007–
4021, 1975.
[12] Orfao, A., Ruiz-Arguelles, A.: General concept
about cell sorting techniques. Clin. Biochem. 29:5–9,
1996.
[13] Rabilloud, T.: Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis.
An outline. Methods Mol. Biol. 112:9–19,
1999.
[14] Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T.: Membrane
proteins and proteomics: Un amour impossible? Electrophoresis
21:1054–1070, 2000.
[15] Simpson, R. J.: International proteomics initiatives:
technological challenges. European Pharmaceutical Review
1:25–36, 2004.
[16] Weiss, W., Postel, W., Görg, A.: Application of
sequential extraction procedures and glycoprotein
blotting for the characterization of the 2-D polypeptide
patterns of barley seed proteins. Electrophoresis
13:770–773, 1992.
[17] Weiss, W.,Vogelmeier, C., Görg, A.: Electrophoretic
characterization of wheat grain allergens from different
cultivars involved in baker’s asthma. Electrophoresis
14:805–816, 1993.
[18] Zinser, E., Daum, G.: Isolation and biochemical characterization
of organelles from the yeast Saccharomices
cerevisiae. Yeast 11: 493–536, 1995.

Különféle minták előkészítése
51
Sejtes minták vizsgálómódszerei
Kőszegi Tamás
Intracelluláris fehérjék kimutatása
Sejtkultúrák. A sejtek in vitro tenyésztése több mint
50 éves múltra tekint vissza. A különböző tápfolyadékok,
tenyésztési körülmények optimalizálását jórészt
tapasztalati úton végezték és végzik ma is. Fontos
körülmény, hogy a sejtek rendszerint akkor képesek
szaporodásra, osztódásra, ha a tápoldat tartalmazza
a tápanyagok mellett a sejtosztódáshoz szükséges növekedési
faktorokat is. Ezt egyszerűen úgy érjük el,
hogy a tenyésztő médiumhoz 10%-ban embrionális
marhaszérumot keverünk.
Bármilyen legyen is az alkalmazott sejttípus vagy
tápoldat, a siker meghatározó tényezője a steril körülmények
betartása. Ez egyben analitikai előnyt is jelent,
hiszen a minta nem tartalmazhat idegen organizmusokat
(baktériumok, mikrogombák). Ugyanakkor a
tenyésztő médium – elsősorban a savótartalma miatt
– egyéb fehérjékben is gazdag, ami hátrányt jelent. A
szövettenyésztés hőskorában nem álltak rendelkezésre
ún. sejtvonalak, amelyek ma már a kereskedelemben
beszerezhetők és garantált tulajdonságokkal rendelkeznek.
Az első sejtkultúrákat műtéti mintákból,
biopsziás anyagokból készítették. Ezeket ma primer
kultúrának nevezzük. A primer kultúrát a steril körülmények
közt kimetszett élő szövetekből különböző
eljárásokkal lehet kinyerni, pl. finom szitán való
préseléssel vagy óvatos tripszines emésztéssel, de e
módszerek részletes bemutatása nem célja a jelen fejezetnek.
Az így kapott sejtek megfelelő tápfolyadékba
téve néhány osztódási cikluson mennek keresztül,
majd előbb-utóbb elpusztulnak. A perifériás vérből is
lehet sejteket izolálni, erre legegyszerűbb módszer a
szeparálás sűrűség alapján (gradiens-centrifugálás).
Amennyiben nem malignusan transzformált sejtekről
van szó, a primer kultúrák élettartama mindenképp
véges. Néha azonban történnek finom genetikai
változások a tenyésztés során, és az így kialakult sejtek
– még nem daganatsejtek – korlátlan ideig fenntarthatók.
Ezeket a sejtvonalakat szokás immortalizált
sejkultúrának nevezni. A harmadik, legkönnyebben
tenyészthető típus a valódi daganatsejt-kultúra.
A szövettenyésztés második titka a rendszeres
tápanyag-utánpótlás, az ún. passzálás. Ilyenkor lecseréljük
a már kihasznált tápfolyadékot a tenyésztőedényből,
és a sejtek egy kis hányadát kinyerve, új
médiumba és rendszerint új edénybe tesszük azokat.
Az inkubálást emlőssejtek esetében stabil 5% szén-dioxid-koncentrációt
fenntartó, 37 °C-os termosztátban
végzik.
Az emlőssejteken kívül lehetséges különböző növényi
kultúrákat is létrehozni és fenntartani. Itt olyan
szöveteket kell választani, amelyek megtartják osztódóképességüket,
és akár pluripotensek is lehetnek (pl.
gyökércsúcsszövet, rügyek merisztémaszövetei stb.).
A növényi kultúráknál az optimális körülményekhez
a periodikus megvilágítás is hozzátartozik.
Természetesen mikrobiológiai módszerekkel baktériumok
és mikro-gombák is tenyészthetők, ennek
részleteire nem térünk ki.
Az emlős sejtkultúrák típusai. Alapvetően kétféle típust
különböztetünk meg:
• A tenyésztőedény falához kitapadó (anchorage
= horgony függő) sejteket.
• Szuszpenzióban növő sejteket.
Nagyon fontos különbség a kétféle sejttípus között,
hogy a kitapadó sejtek csak akkor képesek normális
életfunkciókra és szaporodásra, ha a tenyésztőedény
fala alkalmas azok megtapadására. Hidrofób felületeken
ezek a sejtek nem szaporíthatók, szuszpenziót
alkotva legömbölyödött alakot vesznek fel és leáll az
osztódásukhoz szükséges fehérje- és nukleinsavszintézis.
A passzáláshoz először a használt tápfolyadék
eltávolítása után a kitapadt sejtek kíméletes leválasztása
(tripszines-citrátos oldattal) szükséges, majd felszuszpendálás
után a kitapadó felülettől megfosztott,
lekerekedett sejtek egy részét új edénybe és friss tápfolyadékba
tesszük.
A szuszpenzióban növő sejtek (pl. lymphoblastok)
tenyésztése rendkívül egyszerű, itt a passzáláshoz
lecentrifugáljuk a mintát és annak egy kis részét új
edényben, friss tápoldatban reszuszpendáljuk.
Vizsgálati lehetőségek, modellek
Kitapadó sejtek. Általában a sejteket tenyésztőflaskákban,
egyrétegű (monolayer) formában előtenyésztjük
úgy, hogy a fedettség kb. 80%-os legyen. Ez
nagyon fontos – különösen akkor, ha daganatsejtekkel
dolgozunk –, mert a daganatsejtek szeretnek egy-

52 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
más „tetejére” is nőni, így elveszítik az egysejt-réteg
jelleget. A monolayer formának technikai jelentősége
is van: a kezelő oldatoknak minden sejtet egyszerre,
azonos valószínűséggel kell elérnie. Az előtenyésztett
kultúrát 80%-os fedettségnél leválasztjuk az edény
faláról és friss tápfolyadékban reszuszpendáljuk. A
kísérletekhez leggyakrabban szövettenyésztő lemezeket
használunk, ezek lehetnek 6, 24 vagy 96 lyukú,
szabvány méretű lemezek, tetővel ellátva. A lyukakba
tehetünk beleillő kerek műanyag vagy üveglapkát
is („betétes tenyészet”), ekkor a sejtek ránőnek a betétre,
és később egy mozdulattal kivehetők onnan. A
lyukakat friss tápfolyadékban lévő sejtszuszpenzióból
töltik meg steril pipettázással, minden lyukba azonos
térfogatot mérve. Ennél a fázisnál nagyon kell vigyázni,
hogy a sejtszuszpenzió homogén legyen, hogy
minden lyukba közel azonos számú sejt kerüljön.
Általában egynapos előtenyésztést végzünk, hogy
a sejtek kitapadhassanak és folytathassák normális
életműködésüket. A sejtek kezelhetők úgy, hogy
a vizsgálni kívánt anyagot egyenként a lyukakba pipettázzuk,
de úgy is, hogy a tápfolyadékot steril tűvel,
vákuummal eltávolítjuk és a kezelő oldatot már tartalmazó
új tápfolyadékra cseréljük.
A kitapadó sejtek előnye, hogy a kezelés során –
amennyiben nem pusztulnak el – mindvégig lehorgonyozódva
maradnak, így mosásuk, előkészítésük a
további vizsgálatokhoz egyszerű. Betétes tenyészeteket
használva a kiemelt lemezeket morfológiai, mikroszkópos
célokra is könnyen alkalmazhatjuk.
Sejtszuszpenziók. A szuszpenzióban növő sejteket
módszertanilag máshogyan kell megközelíteni, mint
a kitapadókat. Jóllehet a passzálásuk egyszerű, de a
kezelések, mosások centrifugálást igényelnek. A centrifugálás
során vigyázni kell, nehogy túl nagy fordulatszámot
használjunk, mert ekkor a sejtek sérülhetnek
vagy aktiválódhatnak, ugyanakkor túl alacsony
fordulatszámon nem ülepednek ki teljesen és egy
részüket elveszíthetjük. További problémát jelenthet
a sejtek aggregációja (a daganatsejtek szeretnek kis
csoportokban, kolóniákban nőni), ezért a kísérletekhez
óvatos szuszpendálást kell alkalmazni, legjobb az
1 ml-es pipettaheggyel fel-le szívás.
Sejtes modellek használata. A sejtkultúrákat sokféle
módon, sokféle kérdés megválaszolására használhatjuk.
Az egyik gyakori vizsgálattípus izolált molekulák
(toxinok, gyógyszerek, gyógyszermolekula-jelöltek,
természetes gyógyhatású anyagok stb.) hatásának
analízise. Elsősorban toxicitásvizsgálatról van szó,
ahol a célsejtek életképességének mérése a döntő, ill.
az esetleges toxikus hatás molekuláris mechanizmusának
felderítése (apoptózis, nekrózis). Mind több
tanulmány foglalkozik a sejten belüli jelátviteli folyamatokkal,
azok fehérjemediátoraival. A tiszta, sejtes
modellek erre is nagyon alkalmasak, hogy csak néhány
példát említsünk.
Módszertani megközelítések
Egyedi fehérjék kimutatása morfológiai
módszerekkel
Immunfluoreszcencia. A sejt felszínén vagy a sejten
belül található fehérjemolekulák láthatóvá tételére
alkalmas módszer. Lehetőség van direkt és indirekt
kimutatásra. A direkt eljárásban egyetlen specifikus
antitestet használunk a keresett fehérje kimutatására,
mely kovalensen kötött fluoreszcenciás jelölőt
hordoz. Ez a módszer egyszerű, széles körben alkalmazzák
nem mikroszkópos megfigyelésre is, pl. flow
citometriában. Az indirekt módszer „szendvics”-elven
alapuló, két antitestet használó eljárás, ahol az első
antitest alakítja ki a keresett molekulával a specifikus
kötést, a második antitest pedig a már lekötődött első
antitest ellen termeltetett immunglobulin, mely fluoreszcens
jelölőt hordoz (2-6. ábra).
A morfológiai vizsgálathoz fluoreszcens mikroszkóp
szükséges. Ennek optikája különleges, az ultraibolya
fényt is átengedő üvegből készül, a megvilágító
fényforrás pedig nagy energiájú UV-sugarakat is kibocsát
(higanylámpa, xenonlámpa). A mikroszkóp
felépítésében gyakori a fordított elrendezés: az objektív
a tárgyat alulról látja (fordított, inverz mikro-
2-6. ábra. Transzmembrán sejtfehérje kimutatása immunfluoreszcenciás
módszerrel

Különféle minták előkészítése
53
szkóp). Ez a geometria azért terjedt el, mert a mintát
gerjesztő fény az objektíven keresztül halad át,
és nem kerül bele az okulárrendszerbe, minimálisra
csökkentve a gerjesztő fény zavaró hatását. A mintából
a fényemisszió a tér minden irányában terjed, így
a hasznos jel szintén az objektíven halad át visszafelé
az okulárokba. Mind a gerjesztő fény útjában, mind
a megfigyelési oldalon a fénysugarak megfelelő hullámhosszúságú
szűrőkön haladnak keresztül, tovább
növelve a jel/zaj viszonyt.
Az egyik leggyakrabban alkalmazott immunfluoreszcenciás
vizsgálat a sejtváz (citoszkeleton) fehérjéinek
vizualizációja megfelelő antitestek használatával,
lehetőség van külön az aktin, a tubulin és a köztes
(intermediate) filamentumok kimutatására. Amenynyiben
különböző hullámhosszon emittáló jelölőket
használunk, akkor egyszerre kettő vagy mind a három
citoszkeletonrendszert láthatóvá tudjuk tenni
ugyanabban a sejtben, a mikroszkópban változtatva
a gerjesztés hullámhosszát és az emissziós oldalon a
szűrőket. Az egyes hullámhosszakon kapott képeket
lefényképezzük, és azután a digitalizált képeket számítógép
segítségével egymásra vetítjük.
A citoszkeleton aktin komponense, a mikrofilamentáris
rendszer antitest nélkül, más specifikus
molekuláris interakcióval is detektálható. Ehhez a
gyilkos galóca (Amanita phalloides) falloidin toxinjának
használata terjedt el széles körben. Fluoreszcens
festékkel kovalensen jelzett falloidint használnak
leginkább erre a célra, mely irreverzibilisen kötődik
a fibrilláris (F) aktinhoz. Jelölőként leggyakrabban
fluo reszcein-izotiocianátot (FITC, zöld színű emiszszió)
és tetrametil-rodamin-izotiocianátot (TRITC,
piros) alkalmaznak. A fluoreszcein igen intenzív
emissziót mutat, de hátránya az UV-gerjesztés hatására
gyorsan bekövetkező halványulás (fading). Ma
már széles körben hozzáférhetőek a kioltásra nem
vagy alig érzékeny fluoreszkáló molekulák is, pl. az
AlexaFluor-származékok.
Aktinfilamentumok kimutatása indirekt immunfluoreszcenciával
és jelölt falloidinnel. Ezen a példán keresztül
kívánjuk bemutatni az egyedi fehérjemolekulák
mikroszkópos detektálásának általánosan bevált
receptjét. Nagyon fontos, hogy a sejtek jó minőségű
üveglemezre legyenek tenyésztve, a műanyag optikailag
nem megfelelő. Nem szabad túl sok sejtet tartalmazó
kultúrát vizsgálni, legjobb a kb. 30%-os fedettség.
Általánosságban a következő lépésekből áll
a folyamat, amelyet a következőkben részletezünk
is: sejtek mosása, fixálás, blokkolás, permeabilizálás
(átjárhatóvá tevés), jelölés specifikus antitesttel vagy
más módon, mosás, második antitest hozzáadása,
mosás, beágyazás, mikroszkópos megfigyelés. Falloidin
esetében a jelölést egy lépésben végzik, a második
inkubációt elhagyjuk.
• Fixálás. A hideg pufferelt sóoldattal (PBS)
mosott monolayer sejteket vagy –20 °C-ra
hűtött acetonnal, vagy metanolmentes pufferelt
formaldehidoldattal (2,0–4,0%-os) fixáljuk 10
percig. Az aceton a fixáláson kívül a sejteket
permeabilizálja is, ezért ebben az esetben ez a
lépés a továbbiakban elhagyható.
• Blokkolás. Az intracelluláris nem specifikus
kötődések kivédésére szokás a sejteket PBS-ben
oldott 1%-os albuminoldattal kezelni szobahőmérsékleten
1 órát.
• Permeabilizálás. A formaldehidben fixált, blokkolt
sejteket alaposan, többször mossuk PBSben,
majd 0,1% Triton-X 100-at (nem ionos
detergens) tartalmazó PBS-oldatba tesszük a
mintát szobahőmérsékleten, 15 percre.
Amennyiben detergenst alkalmazunk, akkor
minden további lépésben az oldatoknak tartalmazniuk
kell a detergenst.
• Inkubálás az 1. antitesttel. Ehhez a lépéshez célszerű
a sejteket az üveglemezen „bekeríteni”, pl.
körömlakkal vagy speciális, levegőn megdermedő
anyaggal, ily módon akadályozva meg, hogy
a drága antitest a mintáról lefolyjon. Az inkubációt
szobahőmérsékleten végezzük 60 percig a
blokkolóoldattal hígított antitesttel. A mintát
nedves kamrába téve óvjuk a beszáradástól. Az
antitest optimalizálásához célszerű kikísérletezni
a legmegfelelőbb hígítást. Detergenst tartalmazó
oldatnál különösen vigyázni kell, hogy az
nehogy lecsússzon a mintáról.
• Mosás és inkubálás a 2. antitesttel. A sejteket
többször mossuk PBS-sel, majd befedjük a jelzett
2. antitest megfelelő hígítású oldatával, és az
előző pont szerint inkubálunk. A mintát ne érje
fény!
• Mosás, beágyazás. A sejteket újra többször mossuk
PBS-sel, majd az utolsó mosás után a mintát
rövid ideig desztillált vízbe mártjuk a sók eltávolítása
érdekében. A sejtes oldallal lefelé a

54 3. fejezet A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei – a minták előkészítése
lemezt tiszta tárgylemezre cseppentett speciális
„anti-fading” készítményre helyezzük (pl.
VectaShield), ami a fluoreszcens jel halványulását
késlelteti.
• Mikroszkópos megfigyelés. Először normális
megvilágítással vagy fáziskontrasztos módszerrel
ellenőrizzük a készítményt. Ezután megfelelő
hullámhosszúságú gerjesztő és analizáló szűrők
alkalmazásával először kis nagyítással tanulmányozzuk
a sejteket, vigyázva arra, hogy a
megfigyelt látóteret ne érje túl sokáig a gerjesztő
fény. Immerziós nagyításra is van lehetőség,
ekkor speciális, fluoreszcenciás minőségű
immerziós olajat kell alkalmaznunk.
• Dokumentáció. Hagyományos analóg fényképezésnél
lehetőleg 400 ASA érzékenységű filmet
használjunk, a legjobb a színes diapozitív film
(napjainkban kevesen használják és nehezen
hozzáférhető, de jobb felbontást ad a digitális
technikánál). A digitális technika ma már széles
körben rendelkezésre áll különböző, hűtött
CCD chipet tartalmazó nagy érzékenységű
kamerával és analizáló szoftverrel.
• Általános megjegyzések. Nagyon fontos, hogy a
minta nem száradhat ki az egész procedúra
során, mert álpozitív jelölést kaphatunk. Mindig
legyen negatív kontroll, ami olyan mintát jelent,
amit csak a 2. antitesttel inkubáltunk (ennek
negatívnak kell lennie).
A 2-7. és 2-8. ábrán indirekt immunfluoreszcens és
falloidines módszerrel vizualizált aktinfilamenteket
mutatunk. A két képen jól megfigyelhető az eltérő
sejttípusok eltérő mikrofilamentum struktúrája.
Egyedi fehérjék kimutatása egyéb
módszerekkel
Western blot. További lehetőség az intracelluláris fehérjék
egyedi kimutatására a sejtek feltárása után az
SDS-PAGE-vel szétválasztott mintáknál western blot
alkalmazása. A módszer részleteiről már szó esett
ebben a fejezetben, itt csak annyit jegyeznénk meg,
hogy ezt a vizsgálatot gyakran alkalmazzák egy bizonyos
fehérje expressziójának követésére. Mivel a
leggyakrabban használt kemilumineszcenciás detektálás
közel kvantitatív mérést tesz lehetővé, ezért
a különböző mintákban a kérdéses fehérje átírásáról
mennyiségi információt is kaphatunk. Ehhez szükség
van egy referensként használt fehérje detektálására
is, melynek mennyisége független az alkalmazott
kezelésektől. Erre a célra leggyakrabban a b-aktint és
a GAPDH-t (glicerinaldehid-foszfát-dehidrogenáz)
használják. A vizsgálni kívánt molekula lumineszcenciás
jelét a referens molekula jeléhez viszonyítva
nyomon követhetővé válik a kérdéses fehérje expreszsziójának
változása.
2-7. ábra. Humán embrionális fibroblastsejtek aktinfilamentjeinek
detektálása nyúlban termeltetett antiaktin
primer antitesttel és FITC-vel jelzett antinyúl-IgG másodlagos
antitesttel (200×) (Fujifilm 400 ASA, Contax fényképezőgép)
2-8. ábra. MDCK (kutya-vesetubulus tenyészet) aktinfilamentjeinek
festése AlexaFluorral jelzett falloidinnel (400×)
(Olympus Cell^D CCD kamera és képelemző szoftver)

Különféle minták előkészítése
55
Immunkémiai módszerek. A kép nem lenne teljes
anélkül, hogy az érzékeny immunoassay- (lásd 7. Automatizáció
a fehérjeanalitikában) palettát meg ne
említenénk. Itt lehetőség van nem denaturáló módszerekkel
feltárt sejtekből (sejtlizátumokból) vagy
a tenyésztőmédiumból egyedi fehérjék, peptidek
mennyiségi meghatározására. A vonatkoztatási alap
a tápfolyadékban a szérumhoz hasonlóan a térfogat
(pl. nmol/l), a sejtlizátumokból pedig általában a sejtek/minták
összfehérje-tartalma. A 2-9. ábrán bemutatott
kísérletünkben HepG-2 (transzformált májsejtkultúra)
sejteket endotoxinhatásnak tettünk ki 24
órán keresztül (endotoxint tartalmazó tápfolyadékban
tenyésztettük őket), majd eltávolítva a médiumot
a sejteket nem-ionos detergenssel lizáltuk. A lizátumokból
kemilumineszcenciás immunoassay-vel prokalcitoninméréseket
végeztünk, a prokalcitoninértékeket
a sejtek fehérjetartalmára vonatkoztattuk.
2-9. ábra. Endotoxinexpozícióra bekövetkező prokalcitoninválasz
kimutatása HepG-2 sejtek lizátumaiban
Irodalom
Érdekességként megjegyezzük, hogy a sejtekben a
prokalcitonin mennyisége az endotoxinnal fordított
arányosságot mutatott. Hasonló modelleket alkalmazva,
a patofiziológiás történéseket utánozva számos
biológiailag aktív molekula viselkedése tanulmányozható.
http://www.protocol-online.org/prot/Immunology/Immunofluorescence/
http://web.mit.edu/ki/facilities/microscopy/immunofluorescence-protocol.pdf
http://www.protocol-online.org/prot/Cell_Biology/Cell_
Culture/
http://www.molecularstation.com/protocol-links/Cell-Biology-Cell-Culture/
http://www.mnstate.edu/provost/cellcultureprotocol.pdf
http://www.andor.com/learning/applications/Immunofluorescence/
http://www.google.hu/search?q=cell+culture+protocols&hl=hu&client=firefox-a&hs=MaV&rls=org.
mozilla:en-US:official&channel=s&prmd=ivns&ei=SrU2TZDnN435sgbzptWfAQ&start=10&sa=N
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/
mb2/part1/actin.htm
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Productsand-Services/Applications/Cell-and-Tissue-Analysis/
Cellular-Imaging/Fluorescence-Microscopy-and-Immunofluorescence-IF/Phalloidin-and-Phalloidin-Conjugates-For-Staining-Actin.html

3. Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai
módszerei
Kilár Ferenc
A fehérjék analitikai elemzésére alkalmas módszerek
elsősorban tisztított fehérjék vizsgálatát jelentik, de
növekszik az olyan módszereknek a száma, amelyek a
keverékekben, mátrixokban jelen lévő fehérjék vizsgálatára
alkalmasak.
A fehérjék vizsgálatának célja tisztítás, elválasztás,
a kölcsönhatások vizsgálata, a jellemző paraméterek
meghatározása, biológiai funkciók elemzése, a térszerkezet
meghatározása, konformációs, denaturációs
tulajdonságok jellemzése. Mindez a bioanalitika
tárgykörébe tartozik. A bioanalitikai módszerek felölelik
az elválasztástechnikák, a szerkezetanalízis, a
bioinformatika, a biológiai fizikai kémia majdnem
teljes eszköztárát.
E fejezet – amellett, hogy érinti a fehérjék vizsgálatára
alkalmas módszerek céljait és főbb kérdéseit, valamint
előjelzi a további fejezetek tartalmát – néhány
bioanalitikai területet tárgyal részletesebben.
Fehérjék extrakciója
A fehérjék extrakciójának még ma is a legszélesebb
körben alkalmazott módja az oldószeres kinyerés és
az ezt követő, csapadékképzésen alapuló, esetenként
lépcsőzetes kicsapással végrehajtott frakcionálás.
akár a 100 000 Da molekulatömeg értékig egymástól
elválasztani és frakcionálni. A módszer preparatív
felhasználása mellett fehérjék molekulatömegének
analitikai megbecsülésére is alkalmas (3-1. ábra). A
gélszűrés hátrányai közé tartozik az, hogy két fehérje
elkülönítésének feltétele molekulatömegükben legalább
10%-os különbség megléte, valamint az, hogy
a frakciók gyűjtése során az oldat hígul, ezért töményítési
eljárásokat (pl. szelektív membránokon való
„ultraszűrés”) vagy pl. liofilizálást kell alkalmazni a
megfelelő fehérjepreparátum elkészítéséhez.
A fehérjék különböző tulajdonságain alapuló kromatográfiás
elválasztások közül az ioncserés kromatográfiával
egy adott pH-n a töltéskülönbség alapján
lehet fehérjéket elválasztani. Ennek hátrányai közül
meg kell említeni, hogy az elúcióhoz alkalmazott
esetlegesen nagy ionerősségű oldószer a molekulák
denaturációját okozhatja.
Az affinitáskromatográfia alkalmazásával lehet a
legtisztább preparátumokat előállítani. Ennek formája
a fehérjékkel specifikusan kölcsönhatás kialakítására
alkalmas oszlopok használata. Glikoproteinek tisz-
Fehérjék kromatográfiája
A fehérjetisztítás másik legfontosabb területe annak
elválasztástechnikai alkalmazása, azok közül is
a kromatográfia. A kromatográfiás eljárások széles
felhasználási köréből a fehérjék kinyerésére alkalmas
gélszűrés (méretkizárásos kromatográfia, gélkromatográfia)
a legfontosabb módszer, amellyel preparatív
módon, nagy mennyiségben lehet tisztított preparátumot
előállítani. A gélszűrés során különböző pórusméretű
gélmátrixon megfelelően lehet a fehérjéket
3-1. ábra. Ismeretlen fehérje molekulatömegének becslésére
alkalmazható kalibrációs egyenes gélszűréssel való
elemzésben

58 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
títására alkalmazható a lektinkromatográfia, fémkötő
fehérjék elválasztására immobilizált fémionokat tartalmazó
oszlopok, de a legszélesebb körben használható
módszer az immobilizált, specifikus ellenanyagokat
alkalmazó „immunaffinitás-kromatográfia”.
A különböző kötött ligandumokat alkalmazó ligandumreceptor-kromatográfia
akár 1000-szeres fehérjetisztítási
hatékonyságot képes elérni 10–50%-os
visszanyeréssel. A specifikus ligandumok egy ”spacer”-en
keresztül kapcsolódnak az agaróz- vagy poliakrilamidmátrixhoz
(3-2. ábra). Amennyiben a ligandum
reaktív, a fehérjék szelektíven kötődnek az
oszlophoz. A kötött fehérjék eltávolítása az eluensben
oldott azonos vagy attól különböző, más ligandummal
végrehajtott extenzív mosással érhető el.
Specifikus fehérjetisztítás lehetséges ún. affinitáscímkék,
„tag”-ek segítségével. Egy adott fehérjéhez
kovalensen kötött pl. hisztidin-„tag” („His-tag”),
„címke” nagy affinitással rendelkezik nikkel- és kobaltionokkal
szemben, vagyis az ilyen immobilizált
fémionokat tartalmazó oszlopon azokat a fehérjéket,
amelyek ilyen címkékkel rendelkeznek, nagy specificitással
lehet elválasztani. A His-tag-et elsősorban
rekombináns technikák alkalmazásakor használják,
az így előállított fehérjékről a „címkét” proteolitikus
hasítással el lehet távolítani.
Fehérjék frakcionálása ultracentrifugával
A fehérjéket ultracentrifugálással is el lehet választani
a vizsgálatokhoz. Az analitikai és a preparatív ultracentrifugálási
technikák közül ma már elsősorban a
gradienscentrifugálást alkalmazzák, amelyhez szacharóz-
vagy glicerin-koncentrációgradienst, ill. kolloid
szilikagél-részecskéket tartalmazó ún. Percoll-gradienst
használnak. Megfelelően hosszú centrifugálást
követően a különböző molekulatömegű fehérjék
(kolloidrészecskék) a sűrűségüknek megfelelő zónában
helyezkednek el, és a centrifugálás után frakciókba
gyűjthetők. Bár a felbontás (molekulatömeg
szerinti elválasztás) nem nagy, alkalmazása bizonyos
esetekben hasznos.
3-2. ábra. Ligandum kötése mátrixokhoz
a) A ligandum az aminocsoportján keresztül kötődik az N-hidroxi-szukcinimid-észterrel aktívált mátrixhoz
b) Karboxilcsoporttal rendelkező ligandum kötése karbodiimid-aktiválás után a mátrix aminocsoportjához

Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
59
Fehérjék vizsgálata elektroforézissel
A pH-tól függő töltéssel rendelkező, amfoter tulajdonságú
fehérjék analízisére leggyakrabban alkalmazott
elválasztástechnika az elektroforézis. Az
elektroforézis – bár korlátozott mértékben alkalmas
preparatív elválasztásra – elsősorban analitikai módszer,
amellyel ugyanakkor számos vizsgálatot el lehet
végezni. A fehérje-összetétel meghatározása mellett
egyértelműen alkalmazható tisztaságvizsgálatra, de
más molekulákkal (kis molekulák és makromolekulák)
történő kölcsönhatások vizsgálatára, az amfoter
tulajdonságaikat jellemző paraméterek (izoelektromos
pont) meghatározására, konformációs stabilitásuk
(denaturációs tulajdonságuk) jellemzésére.
Az elektroforézis technikának az Arne Tiselius által
a harmincas években leírt módszere az elektromos
térben vándorló ionokat oldatban, hordozó nélkül írta
le, amelynek során fehérjéket és fehérjekeverékeket
(pl. szérum) választott el elektroforézissel. A vándorló
komponensek határfelületét (a zóna vándorlását)
törésmutató-detektorral követte nyomon (moving
boundary electrophoresis). Az azóta eltelt időszak alatt
az elektroforetikus technikák két lényeges formában
jelentek meg. Az eredeti Tiselius-készülék „szabad oldat”-ban
nem volt alkalmas nagyszámú minta elemzésére,
a detektálás módja is gondot jelentett. Ezért a
technika akkor kezdett teret hódítani, amikor gélmátrixokat
(Hjertén – agaróz, 1955, Ornstein és Davis,
valamint Raymond és Weintraub – poliakrilamid,
1959) kezdtek alkalmazni.
A csak makromolekulák (fehérjék és nukleinsavak)
vizsgálatára alkalmas gélelektroforetikus módszerek
a mai napig fontos szerepet játszanak. Elsősorban
fehérjék molekulatömegének meghatározására használatosak,
ugyanakkor a proteomikai kutatások előtérbe
kerülésével, a tömegspektrometriával kapcsolva
egyértelműen helyük van a mai elemzésekben is.
A hatvanas-hetvenes évek során azonban egy „új”
elektroforetikus módszer hódította vissza Tiselius
eredeti módszerének érdemeit. Az oldatban, de most
már vékony (üveg)csövekben, kapillárisokban, érzékeny
detektálási technikákkal kombinált módszerek
egy új, nagyon sok lehetőséget kínáló elektroforetikus
elemzőrendszert alkotnak, a kapilláris-elektroforetikus
technikákat.
Az egyes elemző-detektáló technikák részletesebb
tárgyalása előtt azonban fontos az elektromos térben
végrehajtható elemzések összefoglalása. A 3-1. táblázat
az elválasztási módok fajtáit, a végrehajtás körülményeit,
az elválasztási elveket és a vizsgált komponenseket
összegzi.
A 3.1. táblázaton leírt módszerek többsége tehát
gél- és oldatrendszerekben is végrehajtható. A táblázat
elektroforetikus technikái ugyanakkor egymással
vagy más technikákkal kapcsolhatók. Többek között
így jött létre a 2D-PAGE, vagyis a „kétdimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis”.
A gélmátrixban végrehajtott, fehérjék analízisére
alkalmazható egy- és kétdimenziós elektroforetikus
elválasztások elméleti és gyakorlati leírása a 4. fejezetben
található. E fejezetben a fehérjék kapilláris-elektroforetikus
elemzésére használatos legfontosabb
technikák leírását adjuk meg.
Fehérjék kapilláris-elektroforetikus
elemzése. Chip-elektroforézis
A kapillárisméretben végzett, elektromigráción alapuló
elválasztás egyike a leggyorsabban fejlődő elválasztási
módszereknek. Az elektroforetikus elválasztási
módszerek azon alapulnak, hogy elektromos
térben az oldott anyagok különböző sebességgel
vándorolnak. A kapilláris-elektroforézisnél (capillary
electrophoresis, CE) az elektroforézis egy vékony,
általában 25–75 µm belső átmérőjű, pufferoldattal
töltött kapillárisban történik. A kapilláris alkalmazásának
számos előnye van, így pl. az, hogy a kapilláris
nagy elektromos ellenállásánál fogva a rendkívül
nagy térerő (100–500 V/cm) alkalmazását csekély
hőfejlődés mellett teszi lehetővé. A fejlődött hő
(joule-hő) a kapilláris nagy felület/térfogat aránya
miatt jól eloszlik. A nagy elektromos térerő használata
rövid mérési időt, valamint nagy elválasztási hatékonyságot
és felbontást biztosít. A kapilláris-elektroforézis
minimális mintamennyiséget (1–10 nl)
igényel, könnyen automatizálható. A módszer egyik
legnagyobb előnye a lehetséges alkalmazások rendkívül
széles köre. Míg a kapilláris-elektroforézist eleinte
csak biológiai makromolekulák vizsgálatához használták,
ma már aminosavak, királis vegyületek, vitaminok,
peszticidek, szervetlen ionok, szerves savak,
peptidek és fehérjék, szénhidrátok, oligonukleotidok
és DNS-részek, de még egész sejtek és vírusok elválasztásához
és meghatározásához is alkalmazzák. A
kapilláris-elektroforetikus módszerek gyorsaságuk-

60 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
nak, automatizálhatóságuknak, jó felbontásuknak
(10 6 elméleti tányérszám/m) és kis anyagigényüknek
köszönhetően nagyon gyorsan elterjedtek.
A kapilláris-elektroforézis ma már a mikrofluidika,
azaz a miniatürizált, folyadékban végrehajtott elemzések
területén fejlődik a legnagyobb mértékben. A
genomika, a proteomika és a metabolomika rohamosan
növekvő igényeinek és a technikában megfigyelhető
általános fejlődési tendenciáknak megfelelően
a miniatürizálás az elválasztástechnikák körében is
egyre inkább tért hódít, mivel egyre kisebb térfogatú,
ugyanakkor nagyszámú minta kis helyen végzett
gyors analízisét teszi lehetővé. E módszereknek meg
kell felelniük korunk és természetesen a vizsgált biológiai
rendszer kívánalmainak, úgymint kis menynyiségű
minták (mikro- és nanoliter térfogat) gyors
analízise (másodperces elválasztási idő), nagy felbontóképesség
és olyan enyhe elválasztási körülmények,
amelyek lehetővé teszik a szeparált komponensek további
azonosítását, többnyire tömegspektrometriával
vagy mikroszekvenálással. A detektálási érzékenységnek
bizonyos esetekben el kell érnie az egy mo-
3-1. táblázat. Elektroforetikus technikák jellemzése
Elnevezés
Kísérleti körülmények
Az elválasztás elve (az
elektroforetikus vándorlást
befolyásoló körülmény vagy
tulajdonság)
Vizsgált komponensek
(natív) zóna-elektroforézis
pufferelt elektrolitoldat (háttérelektrolit)
oldatban vagy
gélmátrixban
a vándorlás a komponens
töltés/tömeg arányától függ
oldatban vagy gélben:
egyszerű szervetlen
ionok, kismolekulák,
makromolekulák
csak oldatban: kolloid
részecskék, sejtalkotórészek,
sejtek
(denaturáló) zóna-gélelektroforézis
gélmátrix (vagy agaróz, vagy
poliakrilamid, vagy lineáris
poliakrilamidláncok kolloid
oldata)
molekulaméret (molekulatömeg)
szerinti vándorlás
fehérjék (magas pH-n
SDS jelenlétében) és
nukleinsavak
izoelektromos fókuszálás
oldatban vagy gélmátrixban,
a rendszerben az anolit és katolit
között amfolitok segítségével
létrehozott pH-gradiens
amfoter vegyületek izoelektromos
pontja alapján való
fókuszálódás
oldatban vagy gélben:
amfoter tulajdonságú
kis- és makromolekulák
csak oldatban: kolloid
részecskék, sejtek
micelláris elektrokinetikus
kromatográfia
oldatban vagy gélmátrixban,
egy nagy és egy kis elektroforetikus
mobilitású anionokat
vagy kationokat tartalmazó
rendszer
elektroforetikus mobilitás
egyszerű szervetlen
ionok, kismolekulák,
makromolekulák
elektrokromatográfia
kromatográfiás állófázist vagy
ún. „monolit”-ot tartalmazó
kapillárisban pufferelt vagy
nem pufferelt háttérelektrolit
jelenlétében
elektroendozmózis jelenlétében
vándorló komponensek,
amelyek a kromatográfiás
állófázissal tulajdonságaiknak
megfelelően kölcsönhatásba
lépnek
kis- és makromolekulák
affinitás- (immun-)elektroforézis
oldatban vagy gélmátrixban,
specifikus kölcsönhatásra
képes komponens jelenlétében
vándorló vizsgált anyagok
a szabad és a kölcsönhatással
komplexbe került komponensek
vándorlási sebességeinek
különbözősége
kis- és makromolekulák

Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
61
3-3. ábra. Egy kapilláris-elektroforézishez használható
mikrochip, amelyen az elválasztó csatornákon kívül reagenstartályok,
elektródok és pufferek elhelyezésére szolgáló
nyílások, kialakított lyukak (well) találhatók
lekula kimutathatósági határt. E modern elválasztási
módszereket főleg a rendszer biológia részterületein
használhatják, de ezen túl természetesen alkalmazást
találnak biomarkerek felfedezésekor, metabolizmusutak
analízisében és gyógyszercéltermékek validálási
eljárása során is.
A kémiai chipek előállítása a számítógépchipek
gyártása során alkalmazott technikákat (fotolitográfia,
kémiai maratás stb.) alkalmazza. A miniatürizálás
számos előnnyel jár különösen azon alkalmazások
esetében, ahol nagyszámú minta gyors elemzése
szükséges, ami a rendszer biológia korszakában alapvető
fontosságú. Az analízist kisméretű üveg- vagy
műanyag lapba maratott csatornákban végzik (3-3.
ábra), és a néhány cm hosszúságú kapillárisokban a
nanoliternyi mennyiségű minták elemzése csupán
másodperceket, esetleg perceket vesz igénybe.
A miniatürizálás előnyei közé tartozik a kis reagensigény,
a csökkentett oldószer-felhasználás és
akár egymást követő kémiai és biokémiai reakciók,
valamint elválasztási lépések integrálása egyetlen
mikrochipben (lab-on-a-chip). A módszer magában
hordozza a multiplex, integrált rendszerek kialakításának
lehetőségét is. Sokcsatornás chipek alkalmazásával
akár több száz minta párhuzamos vizsgálata
válik lehetővé (96, 384 stb.), és mivel ez az új módszer
könnyen automatizálható, mindez jelentős munka-,
idő-, anyag- és költségmegtakarítást jelent.
Az elektroforézis-mikrochip elkészítésének első lépése
a csatornahálózat és a reagenstartó edények elrendezésének
megtervezése annak tudatában, hogy
mit várunk el a kémiai chiptől. A következő lépés
a terv megfelelő chipalapanyagra való átvitele felhasználva
a számítógépes mikrochipek gyártásánál
bevezetett és ma már nagyiparilag is alkalmazott
módszereket. Ezzel a technikával akár több ezres
nagyságrendben is előállíthatók elektroforézis-chipek.
Megfelelő detektorok alkalmazásával femto- és
attomol mennyiségű minta detektálása lehetséges,
és az így kialakított mikrochipek 10-, sőt 100-szoros
analízissebességet biztosítanak a konvencionális elválasztási
módszerekhez képest. Különösen előnyös,
hogy a már beállított folyadékkromatográfiás vagy
kapilláris-elektroforézis módszerek egyszerűen átültethetők
mikrochip formátumra.
Elektroforézis-mikrochipeket mikromegmunkálással
készíthetünk üvegből, kvarcból és különböző
műanyagokból, úgymint polimetil-metakrilát, teflon,
polikarbonát stb. A kémiai chip alapanyag kiválasztásánál
megfontolandó, hogy miniatürizált
körülmények között e nagy felület anyagi minősége
fontos szerepet játszhat. Ez különösen lényeges lehet
fehérjék elektroforézise, ill. kémiai reakciók (polimeráz-láncreakció,
restrikciós emésztés) során, amikor
a negatív töltésű üvegfelszín esetleg gátló tényezőként
szerepelhet (pl. nem specifikus kötődés). Műanyagokat
alkalmazva a kedvezőtlen hatásokkal kevésbé
kell számolni, emellett a műanyagból készült kémiai
chipek olcsók, nem törékenyek és könnyen megmunkálhatók.
A chipekben kialakított munkacsatornákban egyszerű
pufferoldatoktól a bonyolult géleken keresztül a
monolitikus elektrokromatográfiás állófázisokig bármilyen
elválasztórendszert alkalmazhatunk. A csatornák
a mikrochip felszínén lévő nyílásokban végződnek,
amelyek az oldatok (minta, puffer, szeparáló
mátrix) betöltésére szolgálnak (lásd 3-3. ábra). Az
ide csatlakozó elektródok segítségével az egyes csatornákban
különböző nagyságú és polaritású elektromos
mezők alakíthatók ki, amelyek alkalmasak a
mikrochipben lévő anyagok mozgatására és a mintakomponensek
elektroforetikus elválasztására.

62 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
A detektálás a mikrochipeken főképpen lézer indukálta
fluoreszcencia (LIF) segítségével biztosítható,
de emellett más, hagyományos fotometriai (pl. ultraibolya
fényelnyelés) vagy elektrokémiai (vezetőképesség-mérés,
amperometria), valamint tömegspektrometriai
technikák is alkalmazhatók.
A leggyakrabban használt egyszerű mikrochipalkalmazások
mellett (DNS-fragmentum-analízis,
fehérjék SDS-gélelektroforézise, komplex szénhidrátok
elválasztása stb.) olyan integrált rendszereket is
kidolgozhatunk, melyek korábban a konvencionális
módszerek alkalmazásával elképzelhetetlenek voltak.
A kapilláris-elektroforetikus eljárások lefedik az
összes elektroforetikus elválasztási módszert, azaz zónaelektroforézis,
izoelektromos fókuszálás, izotachoforézis,
gélelektroforézis, micelláris elektrokinetikus
3-4. ábra. Peptidek zónaelektroforézise. (Kísérleti körülmények:
kapilláris 50 μm × 24 cm, feszültség 10 kV, hőmérséklet
25 °C, háttérelektrolit: 50 mM foszfátpuffer, pH
2,5, detektálás: 200 nm.) A peptidek a negatív pólus felé
vándoroltak
kromatográfia és elektrokromatográfia. Mindegyik
módszer alkalmas fehérjék analízisére és elválasztására,
mégis a fehérjeanalízisekben elsősorban zónaelektroforézist,
izoelektromos fókuszálást, gélelektroforézist
és micelláris elektrokinetikus kromatográfiát
használnak.
Zónaelektroforézis kapillárisban. A legegyszerűbb
zónaelektroforézis a leggyakrabban alkalmazott fehérjeanalitikai
módszer a kapilláris-elektroforézis
technikák közül. A natív körülmények között, a pufferelt
közeg pH-ját erősen figyelembe vevő elektroforézis
aminosavak, peptidek, de akár komplex fehérjekeverékek
nagy felbontású elválasztására képes. Az
üvegkapillárisban 2,5-ös pH-jú foszfátpufferben végrehajtott
peptidanalízis a kapilláris-elektroforetikus
elválasztások fontos standard módszere (3-4. ábra). A
„szabad” oldatban végzett elektroforézis nem a molekulatömeg
alapján választ el.
A szérumelektroforézist natív körülmények között
végrehajtva a klinikai-kémiai diagnosztikában alkalmazható
eredményeket kapunk (3-5. ábra).
Gélelektroforézis molekulatömeg-meghatározásra
mikrochipanalízisekben. Az SDS-PAGE (dodecil-szulfát
poliakrilamid gél elektroforézis) kapilláris
formában is megvalósítható, és ez a technika a legjobban
elterjedt miniatürizált kapilláris-elektroforézis
technikák egyike. A kapillárisban (mikrochip-kapillárisban)
végzett gélelektroforézishez lineáris
(nem térhálós) gélt használnak, mert a térhálós (keresztkötött)
poliakrilamid gél a kapilláris-elektroforézis
körülményei között csak néhány fehérjeminta
analízisére alkalmas és az elkészítés módja alapján
a kapillárisból nem távolítható el (nem cserélhető),
s így csak korlátozott mértékben automatizálható.
A dinamikus molekulaszűrésnek (dynamic molecular
sieving) megfelelő körülményeket dextrán, polietilén-oxid
vagy lineáris poliakrilamidláncok biztosítják.
A fehérjékhez tapadó dodecil-szulfát-láncok
minden saját töltést elfedő, nagy negatív töltése miatt
a fehérje-dodecil-szulfát komplexek szabad oldatban
azonos töltés/tömeg arányuk miatt azonos sebességel
vándorolnának, de a lineáris polimer-láncok jelenlétében
– amelyek úgy viselkednek a gyakorlatban,
mint egy térhálós polimer – a komplexek molekulatömegüknek
(méretüknek) megfelelően vándorolnak
az elektromos térben.

Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
63
3-5. ábra. Szérumelektroforézis
natív körülmények között.
(Kísérleti körülmények: kapilláris
50 μm × 44 cm, feszültség
15 kV, hőmérséklet 25 °C, háttérelektrolit:
30 mM borátpuffer,
pH 10, detektálás: 215 nm)
A molekulatömeg a kalibrációs molekulatömegmeg
határozás segítségével (3-6. ábra a, b) meghatározható.
A fehérjék mennyiségének a biológiai folyamatok
függvényében történő változása nagyon érzékenyen
követhető nyomon a mikrochipanalízisekkel. A csökkentett
vasmennyiséget tartalmazó táptalajon tenyésztett
baktériumok külső membránfehérjéinek menynyiségi
változása az elektroforetikus fehérjeprofilban
érzékenyen tükröződik. A 3-7. ábra mutatja a Pseudomonas
aeruginosa NIH Hungary 170 000 baktériumtörzs
külső membránfehérjéinek profilját teljes táptalajon,
ill. vasat nem tartalmazó táptalajon való tenyésztés
során. A vasmentes körülmény legalább egy fehérje
(92 kDa, 31 s) nagymértékű termelődését idézte elő.
Izoelektromos fókuszálás fehérjék jellemzésére. Az
izoelektromos fókuszálás az elektroforetikus technikák
közül az egyik legnagyobb felbontással képes amfoter
jellegű komponenseket, esetünkben fehérjéket jellemezni.
Az akár egy aminosav különbség következtében
előforduló izoformák elválasztása az izoelektromos
pont alapján nagy érzékenységgel lehetséges. Az
izoelektromos fókuszálást önállóan vagy egy másik
technikával kapcsoltan is fel lehet használni. A technika
speciálisan igényli olyan nagy elektroforetikus
mozgékonyságú, amfoter komponensek, amfolitok
alkalmazását, amellyel az elválasztás során (előtt) egy
alkalmas pH-gradiens alakítható ki. Az amfolitok poliamino-polikarboxi-savak,
amelyek egy alacsony és
egy magas pH-jú elektrolitoldat között, elektromos tér
3-6. ábra. Elektroforézis (kísérleti körülmények: készülék: Bioanalyzer 2100, Agilent, Germany; Protein 80 mikrochip)
a) Standard fehérjekeverék mikrochipen végrehajtott elektroforézise
b) A „markerek” és az ismert molekulatömegű fehérjék segítségével a vándorlási idő meghatározásával az ismeretlen fehérjék
molekulatömege meghatározható

64 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
3-7. ábra. Baktérium külső membránfehérje-profiljában bekövetkező változások
nyomon követése gélelektroforézissel microchipen. A Pseudomonas aeruginosa
NIH Hungary 170 000 törzs normális táptalajon való tenyésztése során (folytonos
vonal) kilenc fő komponens látható, míg a vasat nem tartalmazó táptalajon (szaggatott
vonal) egy fehérje (10-es) fokozott termelődése volt észlelhető. [A kísérletek
a Bioanalyzer 2000 (Agilent) készüléken, a Protein 200 Labchip Kit felhasználásával
készültek. A fluoreszcens festékkel megjelölt fehérjék vándorlását lineáris polimer
jelenlétében LIF (lézerindukált fluoreszcencia) detektorral követték.]
hatására mobilitásuknak (izoelektromos
pontjuknak) megfelelően
sorba állnak, és nagy pufferkapacitásuknak
megfelelően
a kialakuló pH-gradiensben az
amfoter fehérjék fókuszálódását
idézik elő. A fókuszálási lépés
során 1000–3000-szeresre töményedő
fehérjezónák detektálása
vagy az egész pH-gradiens „lefényképezésével”,
vagy egy stacionáris
detektor irányában végzett
megfelelő mobilizálási lépés
segítségével lehetséges.
Az izoelektromos fókuszálás
gélben az egész pH-gradiens
egyidejű megfestésével zajlik,
de a kapilláris- vagy chipformátumban,
oldatban végrehajtott
izoelektromos fókuszálás során
általában stacionárius detektorokat
(akár tömegspektrométert)
alkalmaznak.
3-8. ábra. Monoklonális ellenanyag minták izoelektromos fókuszálása standardizált körülmények között (az ábra a fókuszált
zónáknak csak a mobilizálási lépés során történő vándorlási profilját mutatja) (Kísérleti körülmények: 1,8 v% Pharmalyte
pI 3–10 amfolitkeverék által kialakított pH-gradiens, kétlépéses izoelektromos fókuszálás, feszültség a fókuszálás
során 15 kV, mobilizálás 350 mM ecetsavval 30 kV feszültségen, peptidmarkerek koncentrációja: 10 mM, fehérjekoncentráció:
210 mg/ml, detektálás 280 nm-en, mintafelvitel az egész kapilláris hosszában)

Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
65
Az amfoter komponensek izoelektromos pontját
a vándorlás során csak standardok (marker peptidek
vagy fehérjék) segítségével, kalibráció után lehet
meghatározni. Bár a technika gél formátumban
már hosszú idő óta elsősorban a 2D-PAGE technika
alkotórésze, a standardizálás problémái miatt csak
az utóbbi időben sikerült megfelelő, reprodukálható
körülményeket kialakítani kapilláris-elektroforézis
készülékekben. A 3-8. ábra egy standardizált, reprodukált
körülmények között végrehajtott fehérjeanalízist
mutat. A monoklonális ellenanyagok előállítása
során keletkező izoformák kapilláris izoelektromos
fókuszálásával sikeresen lehet a főkomponensek mellett
a kis mennyiségben jelen lévő bázikus és savas
izoformák izoelektromos pontjait reprodukálhatóan
meghatározni.
Az izoelektromos fókuszálás fókuszálási és mobilizálási
lépéseit egy lépésben is meg lehet valósítani
a kapilláris-elektroforetikus eljárások során, az elsősorban
üvegkapillárisokban fellépő elektroendozmózis
jelenségének felhasználásával. A mintát ez esetben
csak a kapilláris egy rövidebb szakaszában viszik fel,
és lehetséges az amfolitok és az elválasztandó komponensek
egymás utáni injektálása is. A nagy felbontású
elválasztás során a komponensek egy időben vándorolnak
a detektor irányába, amely vándorlás során a
3-9. ábra. Hemoglobinvariánsok és -komponensek detektálása
kapilláris izoelektromos fókuszálással egy diabeteses
betegből származó mintában (Az egy lépésben végrehajtott
izoelektromos fókuszálás kísérleti körülményei: feszültség
20 kV, kapilláris 50 μm × 60 cm, katolit: 20 mM
NaOH, anolit: 10 mM foszforsav, injektálási paraméterek:
1. 2% Pharmalyte 6,7–7,7 – 3000 mbar·s; 2. 1 mg/ml hemoglobinminta
– 500 mbar·s; 3. 2% Pharmalyte 3–10 – 1500
mbar·s.) A magas glikált HbA 1c
-szint a diabetesre jellemző.
fókuszálódás is lezajlik. A 3-9. ábra hemoglobinvariánsok
izoelektromos fókuszálással való minőségi és
mennyiségi meghatározását mutatja egy diabeteses
betegből származó mintában.
Fehérjék azonosítása és meghatározása
a proteomikában
A genomika célja egy élő szervezet teljes genomjának
a feltérképezése. A genetikai állományban rejlő információ
megismerésének célja az adott gén által expresszált
polipeptidek meghatározása. A génexpreszszió
tanulmányozható mRNS- vagy fehérjeszinten,
de tekintettel arra, hogy az mRNS mennyisége nincs
összefüggésben a megfelelő fehérje mennyiségével,
ezért a génexpresszió vizsgálatának pontosabb módja
az expresszált fehérje meghatározása.
A proteomika kifejezést először 1995-ben használták
egy sejt, szövet vagy szerv összes fehérjéjének
kvalitatív és kvantitatív meghatározására. A proteom
a genom által kifejezett teljes fehérjeállomány (PRO-
TEins expressed by the genOM).
A megfelelő felbontású elválasztástechnika kialakulásával,
a kétdimenziós gélelektroforézis segítségével
lehetővé vált (először radioaktívan jelzett)
fehérjék tanulmányozása. A technika nagy felbontóképessége
néhány ezer fehérje elválasztását is lehetővé
teszi egyetlenegy gélben. A gélen elválasztott kis
mennyiség megfelelő érzékenységű fehérjeazonosítási
technikáknak, úgymint pl. elektrospray ionizációs
(ESI) és mátrixszal segített lézer deszorpciós-ionizációs
(MALDI) tömegspektrometriának az alkalmazását
igényli.
A proteomikai módszereknek ma már több csoportját
különböztetjük meg: expressziós proteomika,
funkcionális proteomika, fehérje-fehérje kölcsönhatás,
strukturális (szerkezeti) proteomika, fehérje
poszttranszlációs módosítások vizsgálata. Az expreszsziós
proteomika egy adott minta különböző körülmények
között expresszálódott fehérjéinek mennyiségi
összehasonlítására szolgál. Az eljárás során lehetőség
nyílik up- vagy down-regulált fehérjék meghatározására.
A funkcionális proteomika a fehérjék szerepének
meghatározását vizsgálja különböző életfolyamatokban
és változó környezeti körülmények között. A
szerkezeti (strukturális) proteomika célja egy fehérje-

66 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
komplex vagy egy adott sejtszerv összes fehérjéjének
azonosítása és szerkezetének meghatározása. A fehérjék
poszttranszlációs módosításainak tanulmányozása
során többek között a fehérjék közötti jelátvitelben
kiemelkedő fontosságú foszforilációnak vagy pl.
a fehérjék egymás közötti kölcsönhatásaiban, ill. az
enzimatikus aktivitást meghatározó glikolizációnak a
szerepét vizsgálják.
A fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatának
fontos szerepe van pl. az anyagcsere-folyamatok megismerésében.
A metabolizmusban részt vevő enzimek
specificitásukat nemegyszer fehérjekomplexek formájában
érik el, más enzimekkel vagy alegységekkel
összekapcsolódva. E fehérjekomplexek összetételének,
szerkezetének tanulmányozása az anyagcsereutak
mélyebb megértését eredményezheti.
A fehérjék szeparálása és azonosítása alapján a proteomikai
vizsgálatok a következő csoportokba sorolhatók:
• A natív, tisztított vagy elválasztástechnikával
(pl. kapilláris-elektroforézissel) elválasztott
fehérjék tömegspektrometriás analízise.
• A kétdimenziós gélelektroforézissel elválasztott
fehérjék azonosítása enzimatikus emésztés után
tömegspektrometriával.
• A fehérjékből enzimatikus emésztéssel előállított
peptidkeverék elemzése és feldolgozása
folyadékkromatográfiával (LC) vagy kapilláris-elektroforézissel
(CE), amelyet aztán tömegspektrometriás
azonosítás követ.
• Mikroarray-technikák.
A tömegspektrometriának (a módszer részletes tárgyalása
a 7. fejezetben található) számos alkalmazási
lehetősége ismert a fehérjekémiában, úgymint: peptidek
és fehérjék tömegmeghatározása; izolált fehérjék
(HPLC, PAGE) primer szerkezetének felderítése;
poszttranszlációs módosítások (acilezés, formilezés,
amidálás, foszforilezés, szulfatálás, glikozilezés) detektálása,
azonosítása és lokalizálása; fehérjebontási
termékek, metabolitok azonosítása; fehérje–ligandum
kötődések vizsgálata; enzimek aktív helyeinek
felderítése; diszulfidhidak helyeinek feltérképezése.
A proteomikai vizsgálatokban az elválasztott fehérjék
azonosítására, szekvenciájuk meghatározására az
elektrospray-tömegspektrometria (ESI-MS) és mátrixszal
segített lézer deszorpciós-ionizációs repülési
idő tömegspektrometria (MALDI-TOF) technikát
3-10. ábra. A 2D-PAGE segítségével, elektroforetikusan elválasztott
fehérjék azonosításának lehetséges módjai
alkalmazzák, kapcsolva esetleg más, tandem tömegspektrometriás
(MS/MS) szekvenálási módszerekkel.
Az egyik lehetőség a „peptide mass mapping”,
amelynek lényege, hogy a meghatározni kívánt fehérjét
specifikus enzimmel (általában tripszinnel) vagy
kémiai reagenssel fragmenseire bontják, redukálják,
alkilálják, majd közvetlenül (nano-ESI vagy MAL-
DI) vagy HPLC-vel való elválasztás után (LC-MS)
tömegspektrométerrel meghatározzák az egyes peptidek
tömegét. Ezek a peptidtömegek szolgálnak bemeneti
adatként a számítógépes adatbázis-kiértékelő
programban, amely az adatbázisban lévő fehérjék
összes lehetséges fragmentálási reakciónak megfelelően
összeveti a lehetséges fragmensadatokat a kísérletekkel
meghatározott tömegadatokkal. Már 3-4
peptidtömeg elég lehet egy fehérje azonosítására, és
lehetőség szerint a szekvencialefedettség minimum
15% legyen. A tandem tömegspektrometriás eljárások
segítségével tovább pontosíthatjuk az azonosítást.
A tömegspektrometriás „peptide mass mapping”
gyorsasága és nagy érzékenysége miatt ma már nagyon
elterjedt módszer fehérjék 2D gélből való azonosítására
(3-10. ábra).
Fehérjék bioinformatikája
Korunkban a komplex biológiai minták vizsgálatánál
elengedhetetlen az olyan modern bioanalitikai
módszerek alkalmazása, mint a genomtérképezés
és szekvenálás, proteomanalízis és -szekvenálás, va-

Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
67
lamint metabolomanalízis és azonosítás. A kapott
adatokat bioinformatikai módszerek segítségével hasonlítjuk
össze a már meglévő adatbázisokkal. Korábban
a kémiai szintézissel előállított molekulákat
egyszerűen próba szerencse alapon vizsgálták. Ma a
nagy mennyiségben rendelkezésre álló kombinatorikus
kémiai könyvtárak lehetővé teszik, hogy milliószámra
vizsgáljunk újabb és újabb vegyületeket. Így
a génszekvenciák és géntermékek ismeretében egyre
inkább áttérünk a biológiai fekete doboz vizsgálatáról
a rendszerbiológiai megközelítésre. A modern orvostudományi
kutatások ennek kapcsán genomikai adatbázisokból
kiindulva a transzkriptom, a proteom és a
metabolom feltérképezésén keresztül érnek el újabb
és újabb eredményeket.
A biológiai feladatokkal rendelkező, nagyszámú
alkotóelemből álló rendszerek elemzésére számítógépes
módszerek kidolgozása és alkalmazása vált
szükségessé. A bioinformatika tágabb értelemben a
számítógép segítségével folytatott és a biológiához
kapcsolódó elemző folyamatokat, szűkebb értelemben
a biológiai szekvenciaadatok, ill. a 3D szerkezeti
információk kezelését és elemzését takarja. A bioinformatika
olyan információmenedzselési rendszer a
molekuláris biológia számára, amelynek sok gyakorlati
alkalmazása van. A bioinformatikai ismeretek
terjedésével csökkenhet a tényleges kísérletek elvégzésének
lehetősége, mert a folyamatokat különböző
módokon szimulálhatjuk.
A bioinformatikai ismeretekhez adatbázisokra van
szükség. A feladat többcélú:
• Adatbázisok létrehozása és karbantartása, az
adatok megszervezése, rendezése és az információhoz
való hozzáférésnek, valamint a kiegészítés
lehetőségének biztosítása.
• Eszközök, módszerek kifejlesztése az adatok
elemzésére.
3-2. táblázat. A bioinformatikai adathalmaz jellemzése
Adatforrás Az adathalmaz nagysága Bioinformatikai célok
DNS-szekvenciák
fehérjeszekvenciák
makromolekuláris
szerkezetek
genomok
12 millió szekvencia,
13 milliárd bázis
400 000 szekvencia
(egyenként kb. 300
aminosav)
15 000 szerkezet
(egyenként kb.
1000 atom koordinátái)
300 teljes genom
(egyenként 1,6 millió-
3 milliárd bázis)
génexpressziós adatok legnagyobb: kb. 20
időpont az élesztő kb.
6000 génjénél
egyéb: anyagcsere-útvonalak
a kódoló és nem kódoló régiók elkülönítése
az intronok és az exonok azonosítása
a géntermékek predikciója
igazságügyi elemzések
szekvencia-összehasonlítási algoritmusok
többszörös szekvenciaillesztő algoritmusok
konzerválódott szekvenciamotívumok azonosítása
másodlagos és harmadlagos szerkezet jóslása
3D szerkezeteket illesztő algoritmusok
fehérjegeometriai mérések
felszín, térfogat és alak számítása
intermolekuláris kölcsönhatások
molekulaszimulációk (energiafüggvény, molekuláris
mozgások, dokkolás)
az ismétlődések jellemzése
szerkezetek hozzárendelése génekhez
filogenetikai analízis
genomi méretű felmérések (fehérjetartalom jellemzése,
anyagcsere-útvonalak), kapcsoltság elemzése egyes betegségek
és gének összefüggésének vizsgálatához
az expressziós mintázatok korrelációjának vizsgálata
az expressziós adatok összekapcsolása a szekvencia-, szerkezeti
és biokémiai adatokkal
reakcióútvonal-szimulációk

68 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
• Az eszközök és módszerek alkalmazása az adatok
elemzésére, és az eredmények értelmezése a
biológia szempontjából.
A biológiai információ méretét, forrását és elemzési
módszereit a 3-2. táblázat összegzi. Amint az a táblázatból
is látható, a bioinformatikai módszerek a
genetikai kód és a fehérjeszekvenciák óriási tömegű
adatának kezelését végzik, egymással való összefüggéseit
keresik. Ennek célja a szekvenciákban kódolt
információ megfejtése a térszerkezetek, a funkciók és
az evolúciós összefüggések leírásához. Ehhez páronkénti
szekvencia-összerendezés, többszörös szekvencia-összerendezés,
filogenetikai analízis, nukleotidszekvenciák
analízise, fehérjeszekvenciák analízise,
fehérjeszerkezetek elemzése, fehérjék térszerkezetének
jóslása útján lehet eljutni.
Az adatok kezelésére elsősorban a biológiai hasonlóságok
alapján való csoportosítás alkalmas; pl. a
genomban található ismétlődő szekvenciarészletek,
a funkció (pl. enzimhatás) vagy az anyagcsere-útvonalak
szerint csoportosítható gének, a hasonló a szekvenciájú
különböző fehérjék vagy a véges számú alapvető
fehérjeszerkezet (becslések 1000 és 10 000 közé
teszik) összehasonlítása lehetséges.
Mindezek alapján a feladat a mintázatfelismerés
és a predikció megfelelő alkalmazása. A mintázatfelismerés
célja a hasonlóságok megtalálása, a funkcióra/szerkezetre
jellemző, konzerválódott sajátosságok
felismerése a hasonló funkciójú/szerkezetű
fehérjék vizsgálata alapján, amelyet aztán felhasználhatunk
új szekvenciák funkciójának/szerkezetének
azonosítására. A predikció a funkció vagy a
térszerkezet megjóslása (hasonlóság alapján vagy
másképpen). A bioinformatika egyik fő célja a szekvenciából
megjósolni a térszerkezetet. Tudjuk, hogy
az aminosavsorrend meghatározza a térszerkezetet,
de még ma sem értjük, hogyan. Jelenleg csak a másodlagos
szerkezet jóslása lehetséges, korlátozott
megbízhatósággal.
A bioinformatikai eljárásokban alkalmazott néhány
fogalom a következőképpen írható le. A fehérjék homológiájának
és analógiájának kérdése evolúciós eredetük
szempontjából tárgyalható. Elfogadott állítás,
hogy a szekvenciák esetében megjelenő homológia
megfelel a közös evolúciós eredetnek. Két szekvencia
vagy homológ, vagy nem, amit nem lehet százalékosan
kifejezni (a homológiának nincs mértéke). A két
fehérje közötti analógia azt jelenti, hogy szerkezetük
hasonló, de nincs közöttük szekvenciális hasonlóság,
vagy azonosak a katalitikus csoportjaik, de térszerkezetük
különböző. Az analógia olyan hasonlóság,
amelynek nincs közös evolúciós eredete, valószínűleg
az ún. konvergens evolúció állhat a háttérben; pl. a
szubtilizin és a kimotripszin mindegyike szerin-pro-
a
b
3-11. ábra. Vegyületek térszerkezete
a) Szubtilizin, b) Kimotripszin

Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
69
teáz, azonos His/Asp/Ser katalitikus triáddal, de térszerkezetük
teljesen eltérő (3-11. ábra a, b).
A homológia két típusa az ortológia és a paralógia.
Két gén ortológ, ha két különböző fajban találhatók,
és egy közös ősgénből származnak, amely a
két faj közös ősében volt jelen. A gének ugyanazt a
funkciót szolgálják a két fajban (pl.: a tejsav-dehidrogenáz
az emberben és az egérben). Két gén paralóg,
ha ugyanabban az organizmusban találhatók, és egy
közös ősgénből génduplikáció és azt követő divergens
evolúció útján alakultak ki. Többnyire különböző, de
egymással összefüggésben lévő funkciójuk van (pl. a
hisztidinbioszintézis enzimeinek génjei emberben,
amelyek nagyon hasonló szerkezetűek, de más-más
reakciót katalizálnak).
A bioinformatikai módszerek egyik dimenziója a fizikai
megközelítés, amely szerint veszünk egy fehérjét,
és azt igyekszünk minél mélyebben megérteni (génszekvencia–fehérjeszekvencia–térszerkezet–geometria–kötőhelyek–gyógyszertervezés).
A másik dimenzióban
az informatika segítségével összehasonlításra
kerül sor (páronkénti, majd többszörös szekvenciaillesztés,
szekvenciamintázatok azonosítása, filogenetikai
elemzés, teljes genom elemzése stb).
Az ismert fehérjeszekvenciák és az ismert térszerkezetek
számának növekedése nagymértékű, a szekvenciaadatok
száma az utóbbi években évente folyamatosan
megduplázódik, emiatt a nagy információs
deficit miatt nagy szerepe van a bioinformatikának.
A genomprojektek következtében óriási mennyiségű
genetikai információ áll rendelkezésre, amelyet a
fehérjék vizsgálatára fel lehet használni.
A legfontosabb eljárás a bioinformatikában a szekvenciaanalízis,
amelynek során egy új (ismeretlen
szerkezetű/funkciójú fehérjéhez tartozó) szekvenciához
próbálunk hasonlót találni a már ismert szerkezetű/funkciójú
fehérjék szekvenciái között. Ebben a
szekvenciák összerendezése (vagy -illesztése) (alignment)
segít. A szekvenciaazonosságot ebben az öszszerendezésben
az azonos aminosavpárok százalékos
arányával fejezzük ki. A szekvenciaazonosság csökkenésével
a funkció/szerkezet átvihetősége csökken.
A szekvenciaanalízis során számos probléma merülhet
fel. Az ortológia és a paralógia bonyolult viszonyai
új szekvenciák vizsgálatánál megnehezítik annak
eldöntését, hogy a funkcionális információ mennyire
vihető át az új fehérjére (a talált hasonló szekvencia
lehet az ortológ paralógja egy másik organizmusban).
Emiatt az automatikus funkció-hozzárendelés
sok esetben hibás lehet. A szekvenciahasonlóság
sokszor csak a szekvencia egy részére vonatkozik, pl.
moduláris fehérjék esetében. A moduláris fehérjékben
modulok, olyan fehérjedomének találhatók, amelyek
cserélhető építőkőként szerepelnek. Ezek nem csak
génduplikációval, hanem shuffling révén is terjednek,
3-3. táblázat. A szekvenciaazonosság mértékének jellemzése
Szekvenciaazonosság (%) Zóna Megjegyzés
50-100 biztosra vehető a homológia és a nagyfokú szerkezeti hasonlóság
erősen valószínűsíthető az azonos vagy rokon funkció
20-50 biztosra vehető a homológia és a jelentős szerkezeti hasonlóság
a funkció feltételezhetően azonos vagy rokon
20 körül alkonyzóna
(twilight zone)
0-10 éjfélzóna
(midnight zone)
kétségessé válik a homológia és a szerkezeti hasonlóság
ekkora hasonlóság véletlenül is kialakulhat, egymással nem rokon
fehérjék között is
kifinomult módszerek szükségesek a homológia detektálásához
a szekvencia sokszor nem elég, térszerkezeti információ is szükségessé
válik a rokonság mértékének eldöntéséhez
esetleg fennállhat funkcionális és szerkezeti hasonlóság a két fehérje
között, de ezt a szekvencia alapján nem lehet eldönten
az esetleges rokonságot csak más információk alapján (elsősorban
térszerkezet) lehet megállapítani

70 3. fejezet Fehérjék vizsgálatának bioanalitikai módszerei
a
b
3-12. ábra. Vegyületek térszerkezete
a) a-laktalbumin, b) Lizozim
funkciójuk változhat attól függően, milyen fehérje részét
képezik. Sajnos az evolúció nagyon változatosan
használja fel a modulokat, ezért az új szekvenciák kb.
egyharmadának egyáltalán nem lehet a funkciójára
következtetni az ismert funkciójú fehérjék szekvenciái
alapján. S végül a nagy szekvencia- és szerkezeti
hasonlóság sem jelent mindig funkcionális azonosságot
vagy rokonságot. A 3-12. a, b ábra az 50% szekvenciaazonosságú,
lényegében azonos térszerkezettel
rendelkező a-laktalbumint és lizozimot mutatja,
ugyanakkor a két fehérjének teljesen más a funkciója.
A lizozim a baktériumok sejtfalát emészti, míg az
a-laktalbumin a laktóz-szintáz szabályozófehérjéje.
Összefoglalva a bioinformatikai programok, eljárások,
algoritmusok nem végleges, biztos válaszokat
adnak, csak segítenek leszűkíteni a lehetőségek körét
és kísérleteket tervezni a kérdések eldöntésére. A valódi
válaszokat a biológiai háttérismeretek fényében
találhatjuk meg.
Irodalom
Gáspár A.: Kapilláris zónaelektroforézis. (Jegyzet) Debreceni
Egyetem, Debrecen, 2000.
Righetti, P. G. (ed.): Capillary Electrophoresis in Analytical
Biotechnology. CRC, Boca Raton, 1996.
Kilár, F., Végvári, A., Mód, A.: New setup for capillary
isoelectric focusing in uncoated capillaries. J. Chromatogr.
813:349–360, 1998.
Kustos, I, Andrasfalvy, M, Kustos I. et al.: Effect of iron
restriction on outer membrane protein composition of
Pseudomonas strains studied by conventional and microchip
electrophoresis. Electrophoresis 26:3789–3795,
2005.
Scott Mack, Cruzado-Park, Ingrid, Chapman, J. et
al.: A systematic study in CIEF: Defining and optimizing
experimental parameters critical to method reproducibility
and robustness, Electrophoresis 30:4049–
4058, 2009.
Zvelebil, Marketa, Baum, J. O.: Understanding bioinformatics.
Garland Science, New York, 2008.
Bioinformatikai webhelyek, EMBL, SRS, NCBI (Medline,
Genbank, stb.), Expasy, Swissprot, Amos, CCP11 projekt

4. Az analitikai kémia módszerei
a fehérjekutatásban – Fehérjeelválasztási
és fehérjedetektálási technikák
Ludány Andrea, Kőszegi Tamás
Elektroforézis mint elválasztási technika
A klinikai kutatásban használatos
módszerek áttekintő ismertetése
Az elektroforetikus eljárások alkalmasak a fehérjék
mint töltéssel rendelkező ún. amfotér molekulák szeparálására.
A fehérjemolekulák elektromos térben
vándorlásra képesek. A különböző molekulák aktuális
ionizáltsági állapota a vezetőképességet biztosító
médium, rendszerint egy pufferoldat adott pH-jától
függ. Minél távolabbi az amfotér fehérjemolekula
izoelektromos pontja ettől az értéktől, annál nagyobb
a vándorlási sebessége az ellenkező pólus felé. A vándorlási
sebességet nem csak a töltés, hanem a molekula
mérete is befolyásolja (fordított arányban). Az
elválasztandó fehérjék és a hordozó anyagának kölcsönhatásai
miatt ez utóbbiak szerkezete is hatással
van a vándorlási sebességre. A különböző töltéssel
és mérettel rendelkező fehérje-összetevők adott vándorlási
idő elteltével a vizsgálandó mintára jellemző
elektroforetikus megoszlási képet eredményeznek.
A hordozók szerint megkülönböztetünk papír-,
keményítő gél-, nitrocellulóz membrán, agar/agaróz
gél, poliakrilamidgél-elektroforézist. A felsorolás egymásutánisága
utal a történeti sorrendiségre is. Ezek
egyik része elsősorban rutin klinikai kémiai eljárásként
nyert teret, míg mások – így a poliakril amidgél
(PAG) alapú elválasztás – a kutatásokban kaptak elsődlegesen
szerepet.
Formailag a hordozók szilárdságuktól függően
vagy önállóan (áthidalásokkal kiegészítve) képesek
a minta közegét biztosítani, vagy támasztékot (üveg,
műanyag lemez, cső, kapilláris) igényelnek a funkciójukhoz.
A készülékek tartozékai:
• az „elektroforézis-futtatókád”, ami manapság
már a legkülönbözőbb alakot veheti fel, és nem
is hasonlít kádhoz. Inkább hídnak mondanánk,
amely a két elektromos pólus között feszül ki, és
a hordozókkal együtt a vándorlási teret biztosítja.
• Mindenképpen része a rendszernek a két elektród,
amely az egymástól elválasztott puffertankokba
merül, valamint az áramforráshoz kapcsolódik.
• Az áramforrások egyenáramot szolgáltatnak.
Pulzáló vagy folyamatos áramerősséget, ill.
feszültséget képesek szabályozni.
Gélelektroforetikus technikák – PAGE
Az elválasztási technikák közül legflexibilisebbek a
poliakrilamidgél (PAGE) alapú eljárások. Ennek oka,
hogy itt a gélkoncentráció tetszőleges tartományban
alakítható ki, és jól is reprodukálható. A polimerizáció
két alapkomponense az akrilamid-monomer és a
metilén-bisz-akrilamid keresztkötő reagens. A polimerizációnak
két útja lehet:
• Fotopolimerizáció (riboflavin + UV-kezelés).
• Kémiai polimerizáció (ammónium-perszulfát).
Az utóbbi használata elterjedtebb, jóllehet oxidációs
hatása nem egészen közömbös az érzékeny molekulakomplexeknél.
A fotopolimerizációt korábban a nem
denaturáló IEF-nél írták le, de ma már ehhez is a kémiai
polimerizációt használják.
Csöves és lapgél módszerek egyaránt ismertek.
Mindkét módszerrel kivitelezhetők többszörös és
szinkron mintaanalízisek.

72 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
Preparatív és analitikai PAGE-eljárások
A poliakrilamidgél-elektroforézisek vertikálisan
(függő/álló helyzetben), pl. rudakban (üvegcsövekben)
és lapgélekben (üveglemezek között kiöntött kazettákban),
valamint horizontálisan fektetett lemezen
is végezhetők.
A vertikális rendszerek rendszerint vastagabbak,
több gél egymás melletti futtatására is alkalmasak, a
pufferoldattal közvetlen kontaktusban vannak, nagyobb
mintamennyiséget képesek felvenni. Kezelésük
egyszerűbb, nem kíván különösebb óvatosságot.
Magától értetődően ezek alkalmasabbak a mikropreparatív
módszerekre is (4-1., 4-2. ábra).
A planáris horizontális gélek igen vékony gélfilmet
alkotnak, izoelektromos fokuszálásra is ideálisak.
Nem szükséges üveglap a gél kialakításához. Ehhez a
rendszerhez lehet leginkább hozzájutni a kereskedelmi
forgalomban, kész változatban is. Izoelektromos
fokuszálásra különösen ajánlottak a non ekvilibrium
pH-gradiensek futtatásához.
Amint említettük, kereskedelmi kiszerelésben ún.
kész gélek kaphatók, de házilag készített változatok
is használatosak. Jóllehet a saját készítésű rendszerek
munka- és időigényesek, de ezeket lehet leginkább
kutatási célokra a vizsgálandó mintákhoz kívánság
szerint megfelelően igazítani.
Homogén és gradiens gélek
A gél koncentrációja szerint lehet lágy vagy tömör gél.
A polimerizált gél pórusmérete a monomerkoncentráció
függvénye. Munkánk tervezésekor a vizsgálandó
fehérjeelegy összetétele és a célfehérje molekulamérete
szerint állítható össze a szeparálógél
szerkezete. Az egyébként kémiailag inert gélhálózat
„lágyabb” gélnél (5–10%-os AA-koncentráció) a nagyobb
fehérjemolekuláknak kedvez, míg kis molekulatömegű
fehérjékhez rigidebb gél (13–15%) ajánlott.
Tudnunk kell, hogy a polimerizáció hőmérsékletfüggő,
és a reakció folyamán hőfejlődés észlelhető. Az
inkomplett polimerizáció megelőzésére 20 °C fölött
kell a környező hőmérsékletet tartani. A gél oxigénelnyelésének
minimalizálására a gél kiöntésekor annak
felszínét vákuumal „gáztalanítjuk” és folyadékkal
felülrétegezve a külső légtértől lezárjuk. (Így egyúttal
egyenletes polimerizációs felszínt nyerhetünk.)
Az elválasztóképesség növelésére fejlesztették ki az
ún. diszkontinuus (homogén) és a gradiens géleket.
• A diszkontinuus gél [13] nevét onnan kapta,
hogy két egymás fölött képzett gélmezőt tartalmaz.
Ebből már következik, hogy a vertikális
szisztémák épülnek ily módon fel. A fölső ún.
–
+
4-1. ábra. Preparatív lap-gélelektroforézis (Nem denaturáló
alkalikus gél – PAGE – preparatív elektroforézis; minta:
szérumfehérjék, amidofekete festés; a festés kizárólag demonstráció
céljából készült)
a
4-2. ábra. Analitikai poliakrilamid-gélelektroforézis (festés:
amidofekete)
(Nem denaturáló alkalikus gél – PAGE: 5–15% gradiens
gél; minta: humán szérumalbumin „mentesítése”)
a) Kezeletlen minta
b) Kezelt minta
b

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
73
gyűjtő- (stacking) gél feladata valamennyi gélbe
vándorló fehérjemolekula összegyűjtése a lényegi
szeparálódás előtt. A pórusmérete nagy, ezért
nem akadályozza az extrém nagy molekulák
gélbe hatolását sem. Az alsó szeparálógél koncentrációját
a várható molekulaméretű fehérjeelegy
ideális elválasztásához állítjuk be.
• Gradiens gél elkészítésénél az ioncserés kromatográfiás
eljárások puffer/só oldatainak hígításaihoz
(gradienseihez) hasonlóan lineárisan
vagy exponenciálisan folyamatosan változó gélkoncentrációt
alakítunk ki a vertikális lemez
kazettarendszerében.
A munkafolyamat, csak röviden, a lényeget kiemelve:
A lezárt keverőtankból folyamatosan rétegezve folyatjuk
a monomerkeveréket a feltöltendő kazettába. Az
elfolyás egy tároló (rezervoár) magas koncentráció jú
tankból azonos sebességgel pótlódik. Az ily módon
létrehozott koncentrációváltozás exponenciális öszszefüggést
mutat (lásd később, a Protokollok című
fejezetrészben). Különösen jó eredményt lehet elérni
az O’Farrell-féle kétdimenziós fehérjetérképezésnél.
Natív és denaturáló PAGE-rendszerek
Natív fehérjekomplexek vizsgálata. Már a minták
előkészítésével kezdődik a két eljárás megkülönböztetése.
A mintafeltárás, a szolubilizálás és a tisztítási
lépés során végig szem előtt kell tartani a biológiailag
aktív fehérjekomplexek védelmét, aktívitásuk megőrzését.
Proteolízisgátlás, oxidatív károsító effektusok
kivédése, fehérjeaggregáció elkerülése, fiziko-kémiai
ágensek hatásának megakadályozása egyaránt szerepet
kap a minták előkészítésében. Előtisztításként pl.
a gélszűréses eljárások jönnek leginkább számításba.
A legismertebb PAGE-technika, melyet magunknak
is alkalmunk volt számos esetben sikeresen alkalmazni,
a nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis.
A mintákat gélrudakban, de lapgélben is elektroforetizálhattuk.
A biológiai funkciót a gélrudak szegmentjeiben
(a kiszemelt frakciók magasságában) akár
biokémiai módszerekkel kontrollálhattuk.
Említést érdemel a rutin klinikai vizsgálatok sorában
a mostanra kifejlesztett és automatizálásra alkalmas
agarózgél-elektroforézis (HYDRAGEL), amely
szintén nem denaturáló rendszernek tekinthető. Igazolja
ezt a különböző izoenzimdetektálási technika,
melyeket számos mintánál diagnosztikusan is felhasználunk.
Denaturáló PAGE-rendszerek. Denaturáló elektroforetikus
eljárásokat különböző biológiai mintákra
célirányosan dolgoztak ki az ismert kutatócsoportok.
• Savanyú urea gél elektroforézis. Az eljárást
ismert, nagyon hidrofób és bázikus fehérjék
urea jelenlétében való PAGE-szeparálására fejlesztették
ki. A magfehérjék, köztük a hiszton
típusúak, térképezését ezzel az ureatartalmú,
savanyú típusú (ecetsavas) szeparálási móddal
indítottuk.
• Laemmli-féle SDS gél elektroforézis. Ez a legismertebb
denaturáló PAGE módszer. Nem lehet
olyan fehérjeanalitikával foglalkozó közleménynyel
találkozni, mely ne használná vagy ne idézné
ezt a szellemes és sikeres frakcionálást. Az
SDS-sel borított szolubilizált fehérjemolekulák
az ionos detergenssel bevonva elvesztik eredeti
töltésüket, és elsődlegesen molekulatömegük
szerint vándorolnak a gélben. A kicsik gyorsabban,
a nagyobbak egyre lassabban mobilizálódnak.
Fontos tudni – és ez a kísérő molekula
markerek vándorlási sebességéből is kiderül –,
hogy nem lineáris, hanem logaritmusos az
összefüggés a két tulajdonság (molekulaméret
és sebesség) között.
Izoelektromos fokuszálások
poliakrilamid- (PAG-) és agarózgélben
A fejezetben megemlített egydimenziós PAGE részletezésén
túl az izoelektromos fokuszálás mint elválasztási
technika itt kiemelést érdemel, jóllehet elvileg
lényegesen különbözik az előzőktől.
Az izoelektromos fokuszálás töltéssel rendelkező molekulák
szeparálása izoelektromos pontjuk szerint. A
savba merülő pozitív pólus (anód) és a lúgba merülő
negatív pólus (katód) között létrehozott mesterséges,
pH-gradienst „szállító” (carrier) amfolit molekulák
hozzák létre. Ezek szintetikus oligoamino/oligokarboxil
savak keveréke, alacsony molekulatömeggel és
eltérő izoelektromos ponttal. Az áram rákapcsolásával
az egyébként nagy diffúziós sajátságú amfolitok
közül az alacsony pI-értékűek az anód felé, a magas
pI-értékkel bírók a katód felé mozdulnak, és pufferolt

74 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
pH-gradienst hoznak létre. Az egyes amfolitok addig
vándorolnak, amíg el nem érik az izoelektromos
pontjuknak megfelelő pH-értéket, majd ott maradnak.
(Az izoelektromos pontjukon túlhaladva ugyanis
megfordul vándorlási irányuk, kilépni a hordozóból
ezért nem tudnak.) Az így elkészült pH-„grádics”
most már készen várja a hasonló amfotér tulajdonságú
fehérjemolekulákat a minta felvitele után. Az amfolitok
nagy pufferkapacitással rendelkeznek, és nincs
biológiai hatásuk.
Az izoelektromos fokuszálás különböző hordozókban
mehet végbe (agaróz-, PAG-, szacharózoszlop,
immobilizált réteg stb.). Ismerünk natív és denaturáló
fokuszáló rendszereket.
Izoelektromos fokuszálás immobilizált pH-gradiens
gélben (IPG). Bevezetésre került az immobilizált
pH-gradiens (IPG) fogalma, amely az izoelektromos
fokuszálásban új távlatokat nyitott. Számos méretben
és különböző pH-tartományban kereskedelmi forgalomban
megvásárolható.
Az immobilizált pH-gradiens olyan akrilamidszármazékokból
épül fel, amelyek pufferoló csoportokkal
az immobilinokkal együtt kopolimerizálódtak az akrilamidgélben.
Előnye, hogy stabil és reprodukáható
gradienst lehet létrehozni, igen nagy felbontóképességgel
(a finom pH-érték-különbségek miatt). Megfelelő
tápegységet (magas feszültség) és horizontális
szeparálásra alkalmas felszerelést (tankot) igényel.
Alkalmazása forradalmasította a 2D-elektroforéziseket.
Kétdimenziós elválasztások kombinációi
Az elválasztások felbontóképessége a kétdimenziós
módszerek bevezetésével természetesen tovább növelhető.
A gradiens-gél-elektroforézisek csak a második
dimenzióban kaphattak teret, de az első dimenziós
elektroforézisek/izoelektromos fokuszálások
színes változatai kínálják a különböző kombinációs
lehetőségeket. Fejezetünkben ezekről részletesebb
módszertani ismertetőt adunk.
• Nem denaturáló alkalikus gél + SDS elektroforézis
(4-3. ábra, 4-4. ábra).
• Savanyú urea gél + SDS-gélelektroforézis
• Denaturáló IEF + SDS gradiens vagy homogén
gélelektroforézis.
Fehérjedetektálási technikák
a klinikai kutatómunkában
A fejezet az elektroforetikusan elválasztott fehérjefrakciók
megjelenítési módjait taglalja. A detektálási
módok fajlagosságukban és érzékenységükben jelentősen
különbözők lehetnek. A minták analízisénél a
helyesen kiválasztott és alkalmazásra kerülő jelöléssel
keressük a választ feltett kérdéseinkre.
4-3. ábra. 2D PAGE alkalmazása albumin/biszalbumin
frakciók vizsgálatára (festés: CBB; nem denaturáló 1. dimenzió
+ SDS lapgél 2. dimenzió)
1. Humán szérumalbumin
2. Biszalbumin
4-4. ábra. 2D PAGE alkalmazása szérumglobulinok megjelenítésére
(Nem denaturáló 1. dimenzió + SDS lapgél 2.
dimenzió; minta: albumin-„mentesített” humán szérum,
festés: CBB)

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
75
Izotópos jelölés
Izotópjelölési módok rendszerint élő sejtekre alkalmazhatók.
Kellő érzékenységű detektálási lehetőséget
kínálnak, és mennyiségi értékelésre is alkalmasak.
Leggyakrabban baktériumok és sejtek/szövetek kultúráiban,
de kísérleti állatoknál is használatos módszer.
A fémek (pl. Zn és Cd) izotópjainak beépülését
a fehérjekomplexeikben nem magában a hordozó
gélekben, hanem az eltávolított/kimetszett frakciók
aktivitásának mérésével in vitro igazoljuk. A lágy
b-sugárzó izotópok (H, C, P, S) jelenlétében optimális
jelölési effektust érhetünk el a minták elektroforetikus
szeparálását követően magában a gélben is. A
detektálás megfelelő fényátalakító (szcintillációs) kezeléssel
autoradiográfiásan, helyesebben fluorográfiásan
kivitelezhető és dokumentálható.
Festékkötéses jelölés
Festékkötésen alapuló eljárások mind agaróz-, mind
poliakrilamidgélre széles körben elterjedtek. Általános
fehérjefestésként a leginkább ismert az amidofekete
és a Coomassie Brilliant Blue (R250 és G250) festés.
Az utóbbi festék csaknem valamennyi fehérjéhez
és peptidhez mennyiségileg is értékelhetően kapcsolódik,
érzékenysége 0,1 µg.
Alternatívaként negatív festés érhető el az imidazol-cink
(Hardy és mtsai, 1996) technikával, mely
az előbbieknél jóval érzékenyebb. A detektálási limit
15 ng-nál van. Ennél a módszernél a köztes terek festődnek
és nem a proteinek, ami a további kinyerések
számára és egy tervezett tömegspektrometriás fehérjeazonosításnál
előnyt jelent.
Ezüstözés
Ezüstözési eljárásoknál direkt és kombinált jelölési
módok különböztethetők meg. A direkt ezüstözés a
fehérjemolekulákat közvetlenül jelöli, míg a kombinált
eljárások egy megelőző fehérjefestéssel párosulnak.
A nagyszámú (több mint 50) közölt eljárásnál
mind ezüst-nitrátos, mind ezüst-diaminos változatok
szerepelnek. A legérzékenyebb detektálás akár 0,2 ng
fehérjét tartalmazó foltot is képes megjeleníteni. A
változatok nem mindegyike alkalmas viszont proteomikai
vizsgálatokra, mert nem MS-kompatibilisek.
A módszerek rendszerint többlépcsősek, a reagensek
(víz) tisztasága és a rendszer keratinszennyeződéstől
óvása elengedhetetlen a sikeres vizsgálatok érdekében.
Fluoreszcens festés
A fluoreszcens festési eljárások kevésbé érzékenyek
(2–8 ng limittel), mint az ezüstözési technikák. Menynyiségi
méréshez viszont széles lineáris tartománnyal
rendelkeznek, és MS-kompatibilisek is. A kereskedelmi
forgalomban kapható festékek sajnos igen drágák,
és az értékeléshez scanner vagy CCD-kamera szükséges.
A detektálórendszernek megfelelő hullámhosszú
fényforrással és szűrőkkel kell rendelkeznie, hogy különböző
festékeket alkalmazhassunk.
Immunreakción alapuló jelölés
Immunreakción alapuló azonosítások agarózban és
PAGE-szeparálás és transzfer után blotting membránfelszínen
(Western blotting).
Agarózban mind elektroforetikus szeparálással kombinálva,
mind a nélkül a rendkívül fajlagos antigén–
antitest találkozás lejátszható. Az agarózgél pórusai
megengedik a makromolekulák diffúzióját is, és a
két immunkomponens között a megfelelő arányban
létrejövő „találkozás” látható, festéssel jól detektálható
precipitációt eredményez. Ezek a fajta vizsgálatok
egyébként kontrollok használata mellett akár szemikvantitatív
értékelést is lehetővé tesznek a klinikai/
biológiai laboratóriumokban.
A Western blotting ma már a legtöbb laboratóriumban
elsajátított rutin eljárásnak számít. Mi magunknak
is módunk volt mindkét alapvető blottolási módszert
kipróbálni. Az ún. nedves módszer vertikális
(függőleges) kazettában és pufferoldatba merülő
elektroforetikus fehérjetranszfert jelent. A félszáraz
módszernél a transzfer horizontális grafitlemezek
között történik, csak nedvesített szűrőpapírrétegek
áramvezetésével.
A blotting lépései egész röviden a következők:
• Elektroforézis (pl. PAGE).
• Elektroforetikus transzfer nitrocellulózmembránra.

76 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
• A membrán blokkolása (a szabad kötőhelyek
lefedése immunológiailag inert makromolekulával).
• Primer antitestkezelés és mosás.
• Szekunder (jelölt) antitestkezelés és mosás.
• A jelölőreakció lejátszása (előhívás).
Az előhívás a jelölőreakciónak megfelelően végzendő
(pl. peroxidáz alapú reakciók változatai: diaminobenzidin
– DAB – vagy NiDAB és ezüstözés).
A mennyiségi mérésre is alkalmas, igen érzékeny
kemilumineszcens reakciók műszeres értékelése a fehérjefrakciók
azonosításán túl új távlatokat nyitott a
kutatásnak (piko- és femtomol koncentrációkról van
szó). Nem utolsósorban megfelelő készülékeket használva
a minták dokumentációja is megoldott.
Protokollok – A klinikai kutatásban
általunk adaptált és alkalmazott elválasztási
és fehérjejelölési eljárások
Fejezetünk következő részében olyan szeparálási/
elektroforetikus (túlnyomórészt PAGE) technikákat
és detektálási eljárásokat közlünk, amelyek a tervezett
proteomikai vizsgálatok alapját képezhetik. A leírások
különös információs értéke abban rejlik, hogy
valamennyi módszer általunk kidolgozott, ma is sikeresen
alkalmazható és többszörösen kipróbálásra
került klinikai kutatásunkban.
Hangsúlyoznunk kell, hogy az esetek túlnyomó részében
az ismertetett eljárások leginkább azért tűnnek
hagyományosnak, mert mellőzik a kereskedelmi
forgalomban kapható ún. kész reagens összeállításokat.
Ezt elsősorban nem financiális ok, hanem mindenkori
kutatási célunk változó igényei indokolták.
Elválasztási technikák
Nem denaturáló és denaturáló PAGE
gélrudakban és lapgéleken
Nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis
(Ornstein és Davis szerint)
Az egydimenziós poliakrilamidgél-elektroforézis
nem denaturáló közegben különösen alkalmas biológiai
fehérjekomplexek elválasztására és a funkcionálisan
megtartott fehérjék in situ gélben való detektálására.
Mind gélrudakban, mind vertikális géllapon
elvégezhető (4-5. ábra a, b).
Oldatok:
1. Pufferoldat a gélelegyhez (A):
36,3 g TRIS és kb. 48 ml 1M sósav elegye, 8,9
pH-t eredményez.
Az oldatot 0,46 mL TEMED (N,N,N , ,N-tetra-metilén-diamin)
hozzámérése után 100 mL-re
egészítjük ki desztillált vízzel.
a
b
4-5. ábra. Nem denaturáló PAGE
a) Sephadex G-75 gélkromatográfiás
cink-fehérje frakciók „fehérjeképe”
(festés: amidofekete)
b) Sephadex G-75 kromatográfiás
frakció összehasonlító vizsgálata:
Zn 65 -aktivitások a nem denaturáló
PAGE-szegmentekben)

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
77
2. Akrilamid-keverék (B):
45 g akrilamidot és 1,2 g metilén-bisz-akrilamidot
oldás után 100 mL-re egészítünk ki desztillált
vízzel.
3. Ammónium-perszulfát-oldat (C):
28 mg ammónium-perszulfátot 20 mL desztillált
vízben oldunk. Az oldat a gélkészítés előtt közvetlenül,
mindenkor frissen készítendő!
4. Mintapuffer az alkalikus gél elektroforézishez:
14,25 g TRIS-t vízben oldás után 1M H 3
PO 4
-gyel
(kb. 64 mL) 6,9 pH-ra hozunk elektromos pH-mérővel
kontrollálva, majd 1000 mL-re egészítjük ki
desztillált vízzel. A pufferoldat 5-szörös töménységű
törzsoldatot képez, ezért a használathoz
desztillált vízzel 5-szörösére hígítjuk. A hígított
mintapuffer a denzitás növelésére, a minták felülrétegzésének
megkönnyítésére 10% glicerint is tartalmaz.
5. Futtatópuffer:
12 g TRIS-t és 57,6 g glicint oldás után 1000
mL-re egészítünk ki desztillált vízzel. A pufferoldat
pH-ja 8,3. A használatos puffert az említett oldat
10-szeres hígításával készítjük.
A gélek elkészítése:
8 mL gélkeverékhez az AA-koncentrációtól függően
a 4-1. táblázatban szereplő adatok alapján mérjük
össze a komponenseket. Ha nagyobb gélmennyiség
szükséges, ezek többszöröseit alkalmazzuk. (A szükséges
mennyiség a lapgélek, ill. a gélcsövek méretéből
és számából adódik.)
A gélelegy összekeverése és vákuum alatti gáztalanítása
után az üvegcsöveket megtöltjük. Majd felülrétegzése
következik 50-50 μL desztillált vízzel.
4-1. táblázat. Alkalikus gél keverék készítése nem denaturáló
alkalikus gél elektroforézishez
Kívánt gélkoncentráció 5% 7,5% 10%
A oldat 1 mL 1 mL 1 mL
B oldat 0,87 mL 1,3 mL 1,78 mL
H 2
O 2,11 mL 1,70 mL 1,22 mL
C oldat 4 mL 4 mL 4 mL
Minta-előkészítés alkalikus gélhez:
A fehérjetartalmú mintákat mintapufferben oldjuk.
A minták gélre való felvitele után azt óvatosan felülrétegezzük
a futtatópufferrel. Alkalikus közegben a fehérjék
anionként az anód felé vándorolnak, így a pozitív
pólus (anód) alul helyezkedik el a kádrendszerben.
Elektroforézis:
2 mA/cső konstans áramerősség mellett elektroforetizálunk.
Jelzőfestékként brómfenolkéket tehetünk
a mintákhoz. Az elektroforézis az alatt megy végbe,
amíg a szabad festék a gélcső alsó részét eléri.
Festés:
Az üvegcsövekből eltávolított géleket 1%-os amidofekete
oldatával festhetjük.
A festékoldat összetétele: 10 g amidofekete, 70 mL
jégecet, 100 mL metanol; desztillált vízzel 1 literre
egészítjük. A festés időtartama 1 óra.
Differenciálás:
7% ecetsav, 10% metanol vizes oldatában, a differenciálóoldat
többszöri váltogatásával.
Denaturáló SDS-gélelektroforézis
(Laemmli szerint)
Egydimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis SDS-t
és b-merkaptoetanolt tartalmazó denaturáló közegben.
A fehérjék molekulatömegük szerint vándorolnak.
A gélcső vagy a lapgél ún. „disc” (nem folytonos)
elektroforézist képez, ugyanis felső gyűjtőgélt és alsó
szeparálógélt tartalmaz az élesebb elválasztás céljából
(4-6. ábra a, b).
Oldatok:
1. Akrilamidelegy (A):
30% akrilamidot és 0,8% metilén-bisz-akrilamidot
tartalmaz:
30 g akrilamid
0,8 g bisz-akrilamid oldása után 100 mL-re egészítjük
ki desztillált vízzel.
2. TRIS-puffer az alsó gélelegyhez (pH 8,8) (B):
18,17 g TRIS-t vízben oldunk. pH-ját 6M sósavval
elektromos pH-mérő kontrolljával 8,8-re állítjuk
(kb. 20–25 mL).

78 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
4 mL 10%-os vizes SDS-oldatot adunk hozzá,
majd desztillált vízzel 100 mL-re egészítjük ki.
3. TRIS-puffer a felső gélelegyhez (pH 6,8) (C):
6,06 g TRIS-t oldás után 6N sósavval 6,8-es pH
ra hozunk.
4 ml 10%-os SDS hozzámérése után desztillált
vízzel 100 mL-re egészítjük ki.
4. Pufferoldat az elektroforézishez (D):
4-szeres töménységű TRIS-glicin törzsoldat (pH
8,3).
12 g TRIS-t + 57,6 g glicint oldás után desztillált
vízzel 1000 mL-re egészítünk ki.
5. Mintapuffer (E):
– 10 mL glicerin
– 5 mL b-merkaptoetanol
– 30 mL 10%-os SDS
12,5 mL felső gél TRIS-puffer elegyét desztillált
vízzel 100 mL-re egészítjük ki.
6. Ammónium-perszulfát-oldat (AP) (F):
200 mg ammónium-perszulfátot 2 mL desztillált
vízben oldunk. A gélkészítés előtt mindenkor
frissen készül!
A gélek elkészítése:
Megfelelően tisztított üveglemezeket (esetleg üvegcsöveket)
függőleges helyzetben a gélkiöntő állványba
erősítünk. A gélkiöntéséhez a kívánt gélkoncentrációtól
függően a 4-2. táblázat szerint oldatkeveréket
készítünk. A táblázatban megadott mennyiség két 9
× 12 cm-es szeparálógélhez (0,75 mm vastagságnál)
elegendő.
4-2. táblázat. Gélkészítés denaturáló Laemmli szerinti
SDS-gélelektroforézishez
Alsó (futtató/szeparáló) gél
Kívánt gélkoncentráció 10% 12,5% 15%
H 2
O 4,2 mL 3,45 mL 2,5 mL
A oldat 3,4 mL 4,15 mL 5,0 mL
B oldat 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL
F oldat 30 µL 30 µL 30 µL
TEMED 5 µL 5 µL 5 µL
Felső (gyűjtő/koncentráló) gél
Az alsó gél koncentrációjától függetlenül
azonos gélelegyet készítünk
H 2
O
A oldat
C oldat
F oldat
TEMED
2,9 mL
0,83 mL
1,25 mL
15 μL
5 μL
a
4-6. ábra. SDS-lapgél
a) Detektálás: Coomassie Brilliant Blue (CBB) R250 (minta: 6 klinikai beteg széruma, M: marker)
b) Detektálás: CBB + kombinált ezüstözés (minta: 6 klinikai beteg széruma, M: marker)
b

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
79
A gélelegy összekeverése után a cellákat megtöltjük.
Felülrétegzését 0,1%-os SDS-oldattal végezzük.
A „kondenzvíz” kiitatása után 2–2,5 mL-t rétegezünk
az alsó gél fölé. A fésűk behelyezése buborékmentes
legyen.
A minták előkészítése az elektroforézishez:
1. A fehérjemintát ún. mintapufferben oldjuk (E oldat).
2. 2-3 percig 100 °C-on forraljuk.
3. 0,1%-os brómfenolkékoldatból 5 μL-t adunk a molekulatömeg-jelölő
fehérjékhez, majd a mintákat a
gélekre visszük (10–20 µL térfogatban).
4. A felülrétegezésre futtatópuffert használunk (lásd a
következő pontban).
Futtatópuffer:
125 mL D oldatot (4-szeres töménységű) és 5 mL
10%-os SDS-oldatot 500 ml-re egészítünk ki desztillált
vízzel.
Elektroforézis
Az SDS-sel fedett fehérjemolekulák anionként az
anód felé vándorolnak. Az elektroforéziskészülék alsó
tankjába merül a pozitív pólus (anód).
A minicellánál konstans, 150 V feszültséggel elektroforetizálunk,
míg a brómfenolkék jelzőfesték éppen
az alsó gél végéig vándorol (ez kb. 45 perc).
Festés (4-7. ábra a, b):
Coomassie Brilliant Blue-val, 2 óra hosszán át a
következő összetételű festékoldatban:
– 1 g CBB (Coomassie Brilliant Blue) R-250
– 450 mL víz
– 450 mL metanol
– 100 mL jégecet
Differenciálás:
Differenciálóoldat:
– 100 mL ecetsav
– 450 mL metanol
– 450 mL víz
Ezeket elegyítjük, ebben differenciáljuk, az oldat
többszörös cseréjével.
Kétdimenziós PAGE denaturáló
rendszerben
Nagy felbontású kétdimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis
technika (O’Farrell). Denaturáló
jellegű kétdimenziós poliakrilamidgél-elektroforézis.
Az első dimenzió izoelektromos fokuszálás urea és
redukáló ágens (b-merkapto-etanol, ditiotreitol vagy
ditioeritrol) jelenlétében. Adaptáló kezelést követően
az izoelektromos fokuszált gélcsöveket – vagy
az immobilizált pH-gradiensen elválasztott fehérjéket
– SDS-elektroforézisnek vetjük alá, homogén
gélkoncentrációjú vagy exponenciális gradiens gélkoncentrációjú
poliakrilamidgélben. Míg az első dimenzió
során a peptidláncok izoelektromos pontjuk
szerint, a második dimenzió során molekulatömegük
szerint vándorolnak a poliakrilamidgélben.
a
4-7. ábra. Lizált mosott vörösvértestek fehérjéi (M: marker)
a) CBB R250 festéssel SDS-lapgélen
b) CBB + kombinált ezüstözéssel
b

80 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
Izoelektromos fokuszálás gélcsövekben
Az izoelektromos fokuszálás oldatai:
A. Lízispuffer a minták szolubilizálásához.
Az oldat összetétele:
– 9,5 M urea (5,7 g)
– 2% Nonidet P-40 detergens (tömeg/térfogat%)
– 5% b-merkaptoetanol (térfogat%/térfogat%)
– 1,6% pH 5–8-as Amfolit/Servalit (0,4 mL)
– 0,4% pH 3–10-es Amfolit/Servalit (0,1 mL)
A zárójelben feltüntetett adatok 10 mL mintapufferre
vonatkoznak. Az amfolit cégenként változó
névvel kereskedelmi forgalomban kapható. Az
A oldat 1 ml-es adagokban –20 o C-on tárolandó.
A lízispuffer az ureát a fehérjék oldatban tartásához
telített oldatban tartalmazza. A detergensek
a szolubilizáláshoz természetesen kizárólag nem
ionos vagy ikerionos detergensek lehetnek (pl. NP-
40 vagy Triton X-100) az izoelektromos fokuszálás
miatt.
D. Akrilamid törzsoldat izoelektromos fokuszáláshoz:
30%-os
28,38%-os akrilamid és 1,62%-os metilén-biszakrilamid
vizes oldata.
10 mL elkészítése javasolt, 4 °C-on tárolandó.
E. Nonidet P-40 (vagy Triton X-100) detergens törzsoldata:
10 tömeg/térfogat%-os.
10 mL oldatot készítünk, és 4 °C-on tároljuk.
G. Ammónium-perszulfát 10 tömeg/térfogat%-os vizes
oldata. (1 mL elkészítése javasolt; frissen készül.)
H . 8 M-os urea vizes oldata. Az ureából ún. „ultrapure”
tisztaságú készítmény ajánlott. 4,8 g ureát
vízben oldunk, majd 10 mL-re egészítjük ki. Tárolása
–20 °C-on javasolt.
I. Izoelektromos fokuszáláshoz anódoldat: 0,01 M-s
H 3
PO 4
.
85%-os H 3
PO 4
(analitikai tisztaságú) 0,67 mL-ét
hígítjuk 1 literre desztillált vízzel. Az anódoldat az
izoelektromos fokuszálás során a vertikális kamrarendszerben
alul helyezkedik el, és mint a nevéből
is kiderül, a pozitív pólus merül bele.
J. Katódoldat: 0,02 M-s NaOH; 1,6 g NaOH granulált
készítményt oldunk 2 liter desztillált vízben.
Mind az anód-, mind a katódoldat 20 °C-on tárolható.
K. Felülrétegző oldat: 8 M ureát és 1% Amfolit/Servalit
keveréket tartalmaz.
– 0,8% pH 5–8-as Amfolit/Servalit (0,2 mL).
– 0,2% pH 3–10-es Amfolit/Servalit (0,05 mL).
4,8 g ureát oldás után az Amfolittal összekeverünk,
és desztillált vízzel 10 mL-re egészítjük ki. 1
mL-es adagokban –20 °C-on fagyasztva tároljuk.
A gélcsövek elkészítése és előfokuszálás
10 ml gélkeverékhez az alábbi mennyiségek szükségesek:
– 1,5 g ultra-pure urea
– 1,33 ml akrilamid törzsoldat (D)
– 2 mL NP-40 törzsoldat (E)
– 1,97 mL víz
– 0,4 mL pH 5–8-as Amfolit
– 0,1 mL pH 3–10-es Amfolit
A keverék igen kevés vízben oldandó az urea nagy
térfogata miatt!
A receptben feltüntetett vízmennyiség elegendő a
10 mL-es össztérfogathoz.
Teljes oldódás után
– 10 μL 10%-os ammónium-perszulfát (G)
– 7 μL TEMED hozzámérése biztosítja a polimerizációt.
A polimerizálatlan gélelegyet igen vékony hosszú
üvegcsövekbe töltjük (mi 20 cm-re vágott 1 mL-es
botpipettákat használunk erre a célra). Felülrétegzését
50-50 μL 8 M ureaoldattal (H) végezzük.
1-2 óra állás után a már megpolimerizált gélekről
a H oldatot 50-50 μL lízispufferrel (A) cseréljük le. A
lízispuffer fölé 20-20 μL desztillált vizet rétegzünk a
bekoncentrálódás, ill. az ureakiválás megelőzésére.
Újabb 1-2 óra állás után friss lízispufferrel (A) előzetes
izoelektromos fokuszálást végzünk. Ennek célja
az Amfolit pH-gradiensének kialakítása a minták felvitelének
időpontjára.
Az egydimenziós elektroforézis kamrarendszerbe,
vertikális helyzetben felerősítjük az Amfolit-tartalmú
gélcsöveket. Az alsó puffertankba kerül a sav, míg a

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
81
felső puffertankba a lúg. A savba merül a pozitív, a
lúgba pedig a negatív pólus.
Konstans feszültség mellett az alábbiak szerint izoelektromos
fokuszálást végzünk ennél a lépésnél:
– 200 V/15 perc
– 300 V/30 perc
– 400 V/30 perc
Az előfokuszálást követően a készüléket kikapcsoljuk,
a katódoldatot elöntjük, majd a csövek felső részét
a lúgtól szűrőpapír csíkokkal leitatjuk.
A minták felvitele és izoelektromos fokuszálása
A fehérjetartalmú mintákat A oldatban oldjuk, ill.
szükséglet szerint a kívánt fehérjekoncentrációnak
megfelelően hígítjuk. 20–100 μl térfogatban ajánlott
a minták gélre rétegzése, melyet K oldattal való felülrétegzés
követ. 50-50 μl K oldat védi meg a mintákat
a közvetlen lúghatástól.
Friss NaOH-oldattal feltöltjük a csöveket és a fölső
pufferkamrát. Az izoelektromos fokuszálás 12 órán
át konstans feszültség mellett 400 V-on megy végbe.
Az elválasztott frakciók élesítése végett befejezés előtt
800 V-on 1 órán át fokuszálunk.
Az üvegcsövekből eltávolított géleket a szükségletnek
megfelelőn detektáljuk (festés, izotópaktivitás-mérés,
pH-mérés stb.), vagy a második dimenziós
elválasztáshoz adaptáló kezelésnek vetjük alá.
Az izoelektromosan fokuszált gélcsíkok festése
Ha a minta nem kerül második dimenziós elválasztásra,
a gélcsíkok fehérjefrakcióit megfesthetjük. A
festés során nem csak az elválasztott fehérjefrakciók
detektálására, hanem azok fixálására és a szintén festődő,
tehát zavaró Amfolit eltávolítására is szükség
van. Mindezek elérésére a gélrudakat a következő kezelésnek
vetjük alá:
1. 50% triklórecetsav és 0,1% Coomassie-Brilliant-Blue
tartalmú vizes oldatban 1 órát kezeljük a
géleket.
2. Tovább festjük, majd differenciáljuk ORTEC szerint
65 o C-on, az ún. gyorsfestési eljárással.
• Festés az alábbi festékoldatban 1 órán át 65
o
C-on.
– 45 rész etanol
– 45 rész 0,2%-os CBB vizes oldata
– 10 rész ecetsav
• Differenciálás és rehidrálás:
– 25 rész etanol
– 10 rész ecetsav
– 65 rész víz elegyében kétszer 60 percig 65
o
C-on.
A metakromáziásan festődő fehérjefrakciók
előhívására és a gélek tárolására 10%-os ecetsavat
használunk.
Második dimenzió; SDS-elektroforézis
homogén vagy exponenciális gradiens
poliakrilamidgélben
Oldatok:
L. 0,4%-os SDS-tartalmú alsó gél puffer: 1,5 M-s
TRIS-sósav, pH 8,8.
36,34 g TRIS-t vízben oldunk, 2 M sósavval
pH-mérő kontrolljával 8,8 pH-ra titráljuk, majd
0,8 g SDS-t oldunk az elegyben. 200 ml-re desztillált
vízzel feltöltjük. 4 °C-on tárolandó.
M. Felső gél puffer: 0,4% SDS-tartalmú, 0,5 M-s
TRIS-sósav, pH 6,8.
6,05 g TRIS-t oldunk desztillált vízben, 2 N sósavval,
6,8 pH-ig titrálunk, majd 0,4 g SDS-t oldunk
hozzá, és 100 ml-re desztillált vízzel feltöltjük.
4 °C-on tárolandó.
Megjegyzendő, hogy ugyanez a puffer készül az
O oldathoz is, de SDS nélkül.
N. 30%-os akrilamid-törzsoldat SDS-gélhez;
29,2 g akrilamidot és 0,8 g metilén-biszakrilamidot
desztillált vízben oldunk és 100 ml-re jelig
hígítjuk. 4 °C-on tárolandó.
O. SDS mintapuffer; 10% glicerint, 5% b-merkaptoetanolt,
valamint 2,3% SDS-t tartalmazó 0,0625
M-s TRIS-sósav puffer (pH 6,8).
Az SDS nélküli M oldatból 12,5 ml-t veszünk,
10 ml glicerint, 5 ml b-merkaptoetanolt, valamint
2,3 g SDS-t adva hozzá desztillált vízben feloldjuk,
és 100 ml-re egészítjük ki. 4 °C-on tárolandó.
P. 1% agaróztartalmú O oldat az első dimenziós gélcsíkok
beágyazásához; 10 ml-t készítünk:
100 mg agarózt oldunk 10 ml O oldatban melegítéssel.
A gélbeágyazás előtt, frissen készítjük.

82 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
Q. Futtatópuffer SDS-elektroforézishez
0,025 M TRIS, 0,192 M glicin-, valamint 0,1%
SDS-tartalmú oldat.
10-szeres töménységű törzsoldat készítése javasolt,
amely 20 °C-on tárolható.
l liter törzsoldathoz az alábbi mennyiségeket
mérjük ki:
30,28 g TRIS-t, 139,27 g glicint, 10 g SDS-t oldunk
desztillált vízben, és 1 literre feltöltjük. A
törzsoldat 10-szeres vizes hígításából készül a mindenkori
futtatópuffer.
R. 50% triklórecetsavat, valamint 0,1% Coomassie
Brillant Blue-t tartalmazó vizes festékoldat a géllemezek
festéséhez. 1000 g triklórecetsavat 1 liter
vízben oldunk és 1 g CBB-t (melyet megelőzően
desztillált vízben oldunk) adunk hozzá.
S. Dehidrálófolyadék a megfestett és fixált géllemezek
kezeléséhez: 50% etanolt, 7% jégecetet, valamint
0,005% CBB-t tartalmazó oldat.
T. 7% ecetsavtartalmú rehidráló, differenciáló oldat.
A második dimenziós géllemez elkészítése (4-8.
ábra a, b).
Általában az elektroforézist megelőző napon
készítjük el a futtatógélt. Használható homogén
koncentrációjú géllap, de készíthetünk ún. exponenciális
konvex gradiensgélt is. Ez utóbbi felel
meg az eredeti O’Farrell elválasztási technikának.
A rendelkezésünkre álló oldatokból 5–22,5%-os
akrilamidgél-koncentráció alakítható ki.
100 × 140 × 2 mm 1-1 lemez mérete, 2 lemezt
elektroforetizálunk egyszerre. A szükséges gélkeverék
60 ml össztérfogatú.
A gél kialakításánál a következő térfogatarányokat
kell betartani:
0,25 térfogat alsó gél puffer (L).
A gélkoncentrációtól függően 0,75 térfogatot
képvisel az akrilamid-törzsoldat (N) és a hígító víz
együttes mennyisége.
A polimerizációhoz 0,0033 térfogat 10%-os ammónium-perszulfát-oldat
(G), valamint 0,0005
térfogat TEMED szükséges.
Gradiensgélnél a nagy gélkoncentrációjú komponens
hígítójaként víz helyett 75%-os glicerint
tartalmaz, és a G oldat térfogataránya 0,00145-re
csökkentett.
Homogén gélkoncentráció kialakítása lemezben
Példa homogén 12,5%-os géllemez kiöntéséhez (60
ml össztérfogat esetén).
– 15 ml L oldat
– 25 ml N oldat
– 20 ml víz
– 200 μl G oldat
– 30 μl TEMED
Összekeverés után az összeállított második dimenziós
géltartályokat megtöltjük ezzel az eleggyel, majd kb. 1
ml desztillált vízzel felülrétegezzük. 1 óra elteltével a
polimerizáció végbemegy, majd 4-szeresre hígított L
oldattal cseréljük le a felülrétegező vizet. Az így előkészített
alsó, ún. futtató/szeparáló gél másnapig eláll.
4-8. ábra. Gélek kiöntése
a) Gradiens gélek kiöntése
b) Homogén gélek kiöntése
c) A konvex gradiens gél készítési elve
Konvex gradiens gél kialakítása
Exponenciálisan növekvő konvex gradiens gélkoncentráció
kialakítása azért ajánlott, hogy a második
dimenziós géllapon a molekulatömeggel lineáris vándorlási
sebességet érjünk el a fehérjéknél a géllapon.
A különböző molekulatömegű fehérjék így egyenletesen
oszlanak el a géllemezben. A gélkialakítás az
egyre fokozódó koncentrációjú gél alárétegzésével ér-

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
83
hető el, ez legegyszerűbben a tankok alulról való feltöltésével
érhető el keveredés nélkül. Az egyre változó
gélkoncentráció konstans térfogatú keverőtank és változó
térfogatú feltöltő-, rezervoártank összekapcsolásával
alakítható ki (lásd a 4-8. b ábrát).
A konstans térfogatú keverőtankból töltjük fel a
géllemezeket. Az alacsony gélkoncentrációjú komponenssel
levegőmentesre feltöltjük a keverőtankot,
és egyrészt a géllemezekhez, másrészt a rezervoártankhoz
csatlakoztatjuk. A rezervoártankból befolyó
magasabb gélkoncentrációjú oldat áramlási sebessége
megegyezik a géllapok feltöltési sebességével, így a
keverőtank térfogata a feltöltés során változatlan marad.
A keverőkamrában a gélkoncentráció folyamatosan
változik a következő egyenlet szerint:
C = C 2
-(C 2
-C 1
) exp -K
ahol
C: a keverőtankból eltávozó folyadék koncentrációja
a kérdéses időpontban, ill. volumennél.
C 1
: a keverőkamra kezdeti gélkoncentrációja.
C 2
: a rezervoártankban lévő, tehát a keverőtankba bemenő
folyadék gélkoncentrációja.
K: a keverőtankból eltávozott folyadék térfogataránya
a keverőtankban lévő fix volumenhez képest a kérdéses
időpontban (K = v /V).
Példák exponenciális konvex gradiens gél kialakítására:
A lemezek kiöntéséhez az említett méretek mellett
60 ml gélre van szükség. 60 ml konstans keverőtank-térfogat
mellett az alacsony gélkoncentrációból
60 ml-t, a magasabb gélkoncentrációból (a lemezekhez
szükséges gélmennyiség szabályozza) szintén 60
ml-t készítünk.
1. példa
60 ml 5%-os gélhez
(keverőtankban)
15 ml L 15 ml L
10 ml N 30 ml N
60 ml 15%-os gélhez
(rezervoár tankban)
35 ml víz 15 ml 75%-os glicerin
200 μl AP (G) 90 μl AP (G)
30 μl TEMED 30 μl TEMED
E gélkeverék elkészítése után a 60 ml elfolyási pontnál
az említett egyenlet szerint a következő gélkoncentráció
érhető el:
15–(15–5) e –60/60 = 11,4%,
tehát a géllemezek feltöltésével 5–11,4%-os gradiens
gél keletkezik.
2. példa
60 ml 8%-os gélhez
(keverőtankban)
15 ml L 15 ml L
16 ml N 40 ml N
60 ml 20%-os gélhez
(rezervoártankban)
29 ml víz 5 ml 75%-os glicerin
200 μl AP (F) 200 μl AP (G)
30 μl TEMED 30 μl TEMED
20–(20–8) e –60/60 = 15,7%,
tehát 8–15,7%-os gélt fogunk kapni.
A felülrétegezést hasonló módon végzik, mint a homogén
géllemezeknél. Mindkét géllemeztípusra másnap
ún. hordozógélt öntünk ki. Ennek célja, hogy a
gélcsövekből kimozduló fehérjék az elektroforézis során
ebben felgyűljenek és azonos startpozícióban lépjenek
be a futtatógélbe.
A gyűjtőgél elkészítése
4,75% akrilamidot, 0,1% SDS-t és 0,125 M-s
TRIS-sósav puffert tartalmaz (pH 6,8):
– 0,25 térfogat felső gél puffer (M)
– 0,15 térfogat akrilamid törzs (N)
– 0,6 térfogat víz
– 0,03 térfogat AP (G)
– 0,001 térfogat TEMED
10 ml gél-elegy elkészítése elegendő
Miután a futtatógélről a rétegezőfolyadékot eltávolítottuk,
ezt a gélelegyet rátöltjük. A polimerizáció 30
perc körül következik be. A hordozógélt 4-szeresre
hígított M oldattal ajánlatos felülrétegezni.
Az első dimenziós gélcsíkokat időközben az izoelektromos
fokuszálás befejeztével adaptáljuk, ill. ekvilibráljuk
(redukció, SDS stb.) a második dimenziós
elválasztás körülményeihez. Ehhez a gélcsíkokat 5-5

84 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
ml O oldatban tartjuk 2-3 órán keresztül szobahőmérsékleten.
Az így ekvilibrált gélek második dimenziós
géllemezre való beágyazása következik.
A gélcsíkok beágyazása a második dimenziós géllemezre
80 °C-ra hevített O oldatot öntünk (kb. 5 ml) a
hordozógél tetejére. Az ekvilibrált gélcsíkokat ebbe
fektetjük. Az agaróz rövid időn belüli megdermedése
után a második dimenziós géllemezeket 10-szeresre
hígított futtatópuffert (Q) tartalmazó elektroforézistankba
helyezzük. A második dimenziós elektroforézist
20 mA/géllemez konstans áramerősség mellett
végezzük. A felső tankba oldott kis mennyiségű
brómfenolkék vándorlási sebessége jelzi az elektroforézis
befejeztét.
A géllemezek megfesthetők, ill. festés nélkül megfelelő
kezeléssel autoradiográfiás értékeléshez felhasználhatók.
A géllemezek festése
Két órán át R oldatban festünk. Ezt követően 24
órát S oldatban dehidrálunk. Végül T oldatban hívjuk
elő, differenciáljuk és tároljuk a megfestett fehérjefrakciókat
(4-9. ábra).
Megjegyzés: autoradiográfiás detektáláshoz a megfestett
géllemezek is felhasználhatók.
Ehhez a fluorográfiás detektálás megfelelő előkészítése,
valamint a gélek szárítása szükséges (lásd később).
Röntgenfilmre, –20 °C-on exponáljuk.
Izoelektromos fokuszálás lapgélen –
denaturáló rendszerben
(az O’Farrell-technika első dimenziójának
megfelelő rendszer)
A gél összetétele (15 ml-hez):
– 5% akrilamid – 2,5 ml (törzs: 2,838g AA + 0,085g
Bis AA ad 10 ml desztillált víz)
– 9 M urea – 8,1g
– 1% Ampholine pH 3–10 – 0,15 ml
– 4% Ampholine pH 5–8 – 0,6 ml
– 2% Triton X-100 v. NP-40 – 0,3 ml
ad 15 ml desztillált víz
15 ml készül 25 ml 10%-os ammónium-perszulfáttal
és 25 ml TEMED-del!
Mintapufferben oldott fehérjék:
Az összetétel megfelel az O’Farrell-technika A oldatának:
– 9 M urea
– 1% Ampholine pH 3–10
– 4% Ampholine pH 5–8
– 2% Triton X-100
– 5% b-merkaptoetanol
Fokuszálás a katódos mintafelvitelt követően:
5 W konstans áram 4 órán át (teljesítményreguláció!)
8 W konstans áram 2 órán át.
Anódoldat (+) 10 mM H 3
PO 4
– alul (vertikális
rendszer esetén).
Katódoldat (–) 20 mM NaOH – felül.
Fixálás – 20–50%-os TCA-ban festékkel vagy festék
nélkül.
A továbbiakban az O’Farrell-technika szerint kell
eljárni.
Detektálási technikák
Gélelőkészítés autoradiográfiához
Fluorográfiás detektálás
(Bonner és Laskey szerint)
4-9. ábra. 2D PAGE O’Farrell szerint (minta: 400 µg protein,
humán thrombocytafehérjék; CBB-festés)
14
C, 3 H vagy 35 S izotópot tartalmazó minták poliakrilamidgélben
való detektálásához mind fixálatlan,
mind fixált, mind festett gélek alkalmasak.

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
85
A detektálás folyamata:
1. A géllemezeket 20-szoros térfogatuknak megfelelő
dimetilszulfoxidba merítjük 30 percig.
2. Ismételt dimetilszulfoxidos kezelés következik friss
reagensben (30 perc).
3. Az előző két lépéssel vízmentesített, impregnált géleket
4-szeres térfogat szcintillációs oldatba merítjük:
20%-os (súly/súly) PPO-t (2,5-difeniloxazolt)
tartalmazó dimetilszulfoxid (DMSO). A kezelés 3
órán át tart.
4. 20-szoros térfogat desztillált vízben a PPO-t a gélben
kicsapjuk (1 órás kezelés).
5. A géleket desztillált vízzel leöblítjük a felesleges
csapadéktól, majd nedves celofánba burkolva a gélszárító
készülékbe fektetjük.
6. Szobahőmérsékleten vákuum alatt szárítjuk.
7. A megszárított poliakrilamidlemezeket RP Royal
„X-Omat” filmen (vagy ezzel megegyező röntgenfilmen)
–70 °C-on exponáljuk. (Az idő az előzőleg
tesztelt radioaktivitás mértékétől függ.)
8. Az előhíváshoz KODAK hívót, ill. fixálót használunk.
Ezüstözési eljárások
Fehérjék direkt ezüstözése egydimenziós
SDS lapgélen [6]
Oldatok:
A. Savas alkoholos fixálóoldat – 150 ml/gél.
– 50%-os etanol, 10%-os ecetsav:
– 500 ml abszolút etanol.
– 100 ml cc. ecetsav, desztillált vízzel 1000 ml-re
kiegészítve.
B. Glutáraldehid „cross linking” oldat – 150 ml/gél.
– 10%-os oldat: frissen készül használat előtt!
– 100 ml 25%-os glutáraldehid
– 150 ml desztillált víz
C. Ammóniás ezüstfestő oldat – 150 ml/gél.
Törzsoldatai – előre elkészíthetők (4 o C).
1. 90 mM NaOH: 3,6 g NaOH ad 1000 ml desztillált
víz
2. 14,8 M NH 4
OH – cc. ammóniaoldat, gyógyszertári
kiszerelésben
3. 1,14 M AgNO 3
-oldat: 19,38 g ad 100 ml desztillált
víz (sötét üvegben tartandó)
Munkaoldat – felhasználás előtt kell elkészíteni:
– 31,5 ml 90 mM NaOH
– 2,5 ml 14,8 M NH 4
OH
– 4 ml 1,14 M AgNO 3
+ 110 ml desztillált víz
D. Citromsav – formaldehid hívó – 500 ml/gél
Törzsoldatai:
1. 47,6 mM citromsav: 9,14 g citromsav (vízmentes)
vagy 10 g citromsav (egy kristályvizes) ad
1000 ml desztillált víz
2. 37% formaldehidoldat (9 rész) + 10% metanol (1
rész), 100 ml készül.
Munkaoldat – felhasználás előtt összeönteni
– 2,5 ml 47,6 mM citromsav
– 250 µl (!) formaldehid/metanol
+ 500 ml desztillált víz
Eljárás
Az ezüstözést csak vékony (max. 1 mm) gélen lehet
végezni. Valamennyi edény 3-szor desztillált vízzel
tisztítandó, és a reagensek is azzal készülnek!
1. Fixálás 150 ml A oldatban, 30 percig, mozgatva (tárolásra
is alkalmas médium).
2. Keresztkötés 150 ml B oldatban.
3. Mosás 3-szor desztillált vízzel (2-3 liter, átfolyó
rendszerben).
4. Kezelés C oldat 150 ml-ével, mozgatva (3–5 percig,
gélvastagságtól függően).
5. Mosás 2-szer 500-500 ml váltott vízben 1-1 percig.
6. Másik edényben előhívás 500 ml frissen készült D
oldatban. Hívási idő a felvitt fehérjemennyiségtől
függ: 2–7 perc.
7. Mosás másik edényben, többször váltott desztillált
vízzel. Legalább 3 literrel, órákig!
Kevés mosás magas hátteret okoz!
Kombinált (gyors) ezüstözési eljárás
leszárított festetlen, ill. festett „nedves”
géllemezeken (Willoughby és Lambert [19])
Gélszárítás és a festetlen gélek előkészítése:
1. 30 perces fixálás 20%-os TCA-ban.
2. 2 × 5 perc metanol : cc. ecetsav : víz = 45:10:45
elegyben.
3. 4 × 2 perc vizes mosás.
4. 2 perc 0,75%-os glicerines áztatás.
5. Szárítás.

86 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
Oldatok gyors ezüstözéséhez:
A. 25 g Na 2
CO 3
(10 kristályvizesből 67,5 g!) 500 ml
desztillált vízben oldva.
B. oldat:
– 1 g NH 4
NO 3
– 1 g AgNO 3
– 5 g szilikovolframát
– 7 ml formaldehidet (37%-os) vízben 500 ml-re
oldani.
C. Rögzítőoldat:
– 0,05 mol/l glicin
–3,75 g glicin
ad 1000 ml víz
Valamennyi oldat készítésekor nagy tisztaságú 3-szor
desztillált víz használandó.
Eljárás:
1. Közvetlenül a felhasználás előtt készült 35 ml A és
65 ml B oldat elegyében a kívánt intenzitásig ezüsthívást
végzünk.
2. Rövid, 2-szer váltott vizes mosás.
3. Rögzítés: C oldatban. A kivált ezüstöt a gélfelszínről
„letörölni”, majd újabb C oldatban dokumentálásig
tárolni.
Megjegyzés: Az előkészítés (szárítás) csak festetlen gélek
esetén szükséges. Az ezüstözés CBB-festések után
is alkalmazható. (Kolloidos festések, CBB-R250 vagy
formalinos CBB G-250 eljárásokat követően.) Ajánlott
minden olyan esetben, amikor a festett gél intenzitása
nem elegendő (SDS-elektroforézis vagy IEF
poliakrilamidgélben, de agaróz hordozóra is).
Az ecetsavban tárolt, festett géleket az ezüstözés
előtt vízben kell rövid ideig áztatni (4-10. ábra a, b)!
Ezüstözéses fehérjedetektálás ultravékony
PAGE-lemezeken (Sammons [16])
Bármelyik fajta poliakrilamidgél-elektroforézis után,
ha azt 1 mm körüli vastagságú lemezgélen végezzük,
a fehérjedetektálás nagy érzékenységű ezüstözéssel
lehetővé válik.
Szétszedhető cellában 0,8 mm vastag SDS 6–12%
poliakrilamid gradiens gélt állítunk elő, a szokásos
módon elektroforetizálunk, majd a fehérje-előhívást
ezüstözéssel végezzük.
Szükséges oldatok (készítésükhöz ioncserélt vizet
használunk):
1. Fixálóoldat: 50% etilalkohol, 10% ecetsavtartalmú
vizes oldat.
2. Mosóoldat I.: 25% etilalkohol, 10% ecetsavtartalmú
vizes oldat.
3. Mosóoldat II.: 10% etilalkohol, 0,5% ecetsavtartalmú
vizes oldat.
4. Ekvilibrálóoldat: 1,9 g/l ezüst-nitrát-tartalmú vizes
oldat. 1,9 g AgNO 3
-t feloldunk desztillált vízben,
és 100 ml-re egészítjük ki. Használat előtt 10-szeres
hígítást készítünk a szükséges mennyiségben.
5. Redukálóoldat: 30 g/l nátrium-hidroxid-tartalmú
a
b
4-10. ábra. Két ezüstözési eljárás összehasonlítása (egyedi könnyminták, SDS-PAGE)
a) Kombinált ezüstözés (CBB festés + ezüst; pásztánként 1,3 mg protein, Willoughby-féle ezüstözés)
b) Direkt ezüstözés (pásztánként 1,3 mg protein, Giulian-féle ezüstözés)

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
87
oldatban közvetlenül a használat előtt 37%-os formaldehidet
(7,5 ml/l), ill. nátrium-borohidridet
(80 mg/l) oldunk.
6. Színstabilizáló oldat: 7,5 g/l töménységű nátrium-karbonát.
A festés menete:
Az elektroforézis után az óvatosan eltávolított géleket
(kézzel ne fogjuk meg) műanyag dobozban legalább
2 óráig fixáljuk. Az oldatot lecseréljük, és legalább
2 óra hosszat, de inkább egy éjszakán át tovább
fixáljuk. A gélt az I. mosóoldattal, kétszeri váltással
egy óra hosszat, majd a II. mosóoldattal szintén kétszeri
váltással egy óra hosszat mossuk. (Ha a festést
nem tudjuk befejezni, ennél a lépésnél abbahagyhatjuk,
ebben az oldatban a gél tárolható.)
A további lépéseket külön edényekben kell végezni!
A gélt lassú rázás közben 2 óra hosszat az ekvilibrálóoldatban
inkubáljuk, majd ioncserélt vízzel a
felületre tapadt ezüstöt rövid mosással eltávolítjuk
(10–20 s). Utána a gélt a redukálóoldatba merítjük,
amelyet közvetlenül a használat előtt készítünk el.
A fehérjefoltok néhány perc után halványsárga háttérben
kezdenek előtűnni. Az első elszíneződött redukálóoldatot
kb. 1 perc elteltével elöntjük és frissel
pótoljuk. A redukálóoldatban a kívánt színintenzitás
eléréséig hagyjuk a gélt (kb. 10–15 perc), majd a színstabilizálóba
tesszük azokat. 1 órás inkubálás után a
színstabilizálót cseréljük, majd a gélt ebben az oldatban
tárolhatjuk. A szín ebben az oldatban napokon
keresztül stabil.
A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása
(Marshall szerint [12])
A minták fehérjedúsítása
A kétdimenziós elektroforézisek esetén gyakran
nem elég koncentrált a vizsgálandó minta sem az első
dimenziós felvitelhez (IEF), sem a második dimenziós
detektáláshoz. Az itt ismertetésre kerülő Marshall-féle
ultraszenzitív ezüstözési eljárás egy közbeiktatott
dúsítási eljárással nagyságrendileg növelheti a
mintafehérjék detektálásának érzékenységét a második
dimenziós lapgélen.
Az eljárás elve: az előkészítés során a minták fehérjetartalmát
CBB R-250 alkoholos savas festékreagens
segítségével kicsapjuk, SDS-oldat hozzáadásával növeljük
a precipitációs tartományt, majd a fehérje-festék
komplexet centrifugálva üledékként nyerjük vizsgálandó
mintáinkat. A felesleges festéket acetonos
mosással távolítjuk el. A módszert vizeletfehérjék 2D
vizsgálatához írták le először.
Munkaoldatok:
Coomassie Brilliant Blue R-250 festékreagens (a
precipitációhoz):
– CBB 0,05 g/40 ml vízben
– etanol 25 ml
– 85% foszforsav 30 ml
majd desztillált vízzel kiegészítjük 100 ml-re
+ 10% SDS-oldat
Eljárás:
A Bradford-módszer alapján megelőzően meghatározott
fehérjekoncentrációjú mintákat két csoportra
osztjuk:
• A 0,1–1,0 g/l fehérjetartalmú minták 1 ml-éhez
0,25 ml festékreagenst és 3 μl SDS-t adunk
• Az 1,0 g/l-nél magasabb fehérjetartalmú vizeletek
0,25 ml-éhez 1 ml festékreagenst és 5 μl
SDS-oldatot mérünk.
Ezután centrifugálás következik: 13 500 rpm 5 percig
Eppendorf típusú centrifugában, ill. nagy mennyiségű
minta esetén Du Pont Sorvall RC5 típusú centrifugában.
A felülúszót leöntve az üledéket 1 ml acetonnal felszuszpendáltuk,
majd ezt követően újra centrifugálás
következik. Célunk a felesleges kezelőoldat kimosása.
A felülúszót leöntve a végső pelletet lízispufferbe
vesszük fel (lásd 2D elfo). A végső fehérjekoncentrációt
2 mg/ml-nek állítjuk be.
Fehérjék detektálása Marshall szerint
módosított ultraszenzitív ezüstözési
eljárással [10]
A módszer lényege, hogy a fixált géleket az ezüstözés
során „túlhívjuk”, majd differenciálással (destaining)
a feleslegben kivált ezüstöt eltávolítjuk. Ily módon a
jel/zaj arány mintától függő optimális beállítása érhető
el (4-11., 4-12. ábra).
Ezüstözés
Felhasznált oldatok:
Savas, alkoholos fixálóoldat (500 ml/gél):

88 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
– metanol 500 ml
– ecetsav 100 ml
tridesztillált vízzel 1000 ml-re kiegészítve
Formaldehidoldat (500 ml/gél):
– 37% formaldehid 2,7 ml
– tridesztillált vízzel 1000 ml-re kiegészítve
Diaminos ezüstfestő oldat (400 ml/gél, mindig frissen
készül használat előtt):
– 40% metil-amin 8 ml
– 0,36% NaOH-oldat 40 ml
– 20% AgNO 3
12 ml
– tridesztillált víz 340 ml
Hívóoldat (500 ml/ gél, többször cserélve):
– 1% citromsav 15 ml
– 37% formaldehidoldat 1,62 ml
– tridesztillált víz 3 l
Festési procedúra:
1. Fixálás egy éjszakán át 200 ml savas, alkoholos fixálóoldatban.
2. Mosás 2 × 200 ml tridesztillált vízben 10, majd 20
percig.
3. Inkubálás 200 ml formaldehidoldatban 60 °C-on
30 percig.
4. Mosás, hűtés 200 ml vízben 10 percig.
5. Kezelés diaminoldattal, mozgatva, 10 percig.
6. Mosás kétszer, 200-200 ml váltott tridesztillált vízben,
1-1 percig.
7. Előhívás 200 ml frissen készített hívóoldattal 5 percenként
cserélve az oldatot, maximum 30 percig,
amíg a gél felszínén az egyenletes ezüsttükörréteg
megjelenik. (A túlhívás a metodikához tartozik,
így érünk el minél nagyobb jelölési effektust.)
8. Mosás kétszer 200-200 ml vízben 10, ill. 20 percen
keresztül.
9. Tárolás tridesztillált vízben legalább egy éjszakán
át.
Destaining
A kezelés célja a megfelelő háttér elérése úgy,
hogy minél több fehérjefrakció látható maradjon.
A destaininghez felhasználandó oldatok (elkészítve
Switzer és munkatársai szerint):
A oldat:
– NaCl 11,1 g
– CuSO 4
11,1 g
(17,3 g CuSO 4
. 5H 2
O)
– tridesztillált víz 285 ml
– NH 4
OH, amíg a feltisztuló oldat sötétkék lesz
B oldat:
– Na-tioszulfát-pentahidrát 44 g
– tridesztillált víz 70 ml
C oldat:
– Hypo (kereskedelmi) 5 ml (12,5 ml)
– tridesztillált víz 195 ml (488 ml)
Destaining kezelés
1. Az A és B oldatot 1:1 arányban összekeverjük, a
10%-os gél esetében tapasztalataink szerint 3-szoros,
a 12,5%-os gél esetében 4-szeres mennyiségű
vizet adunk hozzá.
2. A gélt 1–4 percre az így elkészült oldatba (200 ml/
gél) helyezzük, az aranysárga színű háttér eléréséig.
4-11. ábra. 2D PAGE Marshall-ezüstözés lapgélen (75 µg
protein; minta: humán könny)
4-12. ábra. Marshall-ezüstözés 2D O’Farrell-gélen (minta:
H50 sejtkultúra)

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
89
3. Mosás kétszer 200-200 ml váltott tridesztillált vízben
1-1 percig.
4. Destaining leállítása 200 ml C (Hypo) oldattal 30
percig.
5. Mosás 200 ml desztillált vízben 10, 20, ill. 30 percen
át.
6. Tárolás tridesztillált vízben
A gélek kezelésekor minden esetben kesztyűt használtunk.
Dokumentáció
A gélfotókat alsó megvilágításból (transzparencia),
Fujicolor 100 ASA filmre készítettük.
MS-kompatibilis fehérjedetektálások
poliakrilamidgélen
MS-analízishez ajánlott CBB-festés
(Wang [20])
Az eljárás a következő
1. Elektroforézis után a gélt 20 térfogat fixálóoldatba
merítjük és fixáljuk 1 órát
fixálóoldat:
– 10% (v/v) ecetsav
– 10% v/v metanol
– 40% v/v etanol
2. Ezt követően a gélt érzékenyítőoldatba merítjük és
további két órát mozgatva keverjük (rázzuk).
érzékenyítőoldat:
– 1% v/v ecetsav
– 10% ammónium-szulfát
3. 20 térfogat festőoldatba helyezzük legkevesebb 4
órára vagy egy éjszakára.
festőoldat:
– 5% v/v ecetsav
– 45% v/v etanol
– 0,125% v/v CBB R250
4. A festés után a gélt 1 órára keverés mellett az I. differenciálóba
tesszük.
I. differenciáló:
– 5% v/v ecetsav
– 40% v/v etanol
5. Ezt követően a II. differenciálóba helyezzük, amíg
a háttér tiszta lesz.
II. differenciáló:
– 3% v/v ecetsav
– 30% v/v etanol
6. Végül a gélt 5% w/v ecetsavban hónapokig tárolhatjuk.
MS-kompatibilis ezüstfestés gélben
(Gromova [7])
A módszer az ezüst-nitrát-festési procedúra (Shevchenko
et al., 1996; Yan et al., 2000) módosítása,
amely alkalmas fehérjék megjelenítésére, gélben való
emésztést követő MS-analízishez.
Nagy érzékenységű és alacsony hátterű eredményhez
fontos az inkubációs idők szoros betartása. Valamennyi
oldathoz és mosáshoz „ultra pure” víz szükséges.
Az eljárás menete (Az eredeti cikk tükörfordításával)
Oldatok
1. Fixálóoldat: 50% etanol, 12% ecetsav, 0,05% formalin.
1 literhez: 120 ml jégecetet adjunk 500 ml 96%-
os etanolhoz, valamint további 500 µl 35% formaldehidet.
(A kereskedelmi formaldehid 35%-os!)
Egészítsük ki egy literre. Szobahőmérsékleten tárolható.
2. Mosás: 20% etanol.
1 literhez: adjunk 200 ml 96%-os etanolt 800 ml
deionizált vízhez. Szobahőmérsékleten tárolható.
3. Érzékenyítőoldat: 0,02% (w/v) nátrium-tioszulfát
(Na 2
S 2
O 3
).
1 literhez: adjunk 200 mg vízmentes nátrium-tioszulfáthoz
kis vizet, oldódás után egészítsük
ki a végső térfogatra.
4. Festés: 0,2% (w/v) ezüst-nitrát (AgNO 3
), 0,076%
formalin. Frissen készítendő!
1 literhez: 2 g ezüst-nitrátot oldunk kevés vízben,
majd 760 µl 35%-os fomaldehidet adunk hozzá.
Oldódás után kiegészítjük a végső térfogatra ionmentes
vízzel. Használat előtt lehűtjük az oldatot
4 °C-ra.
5. Hívó: 6% (w/v) nátrium-karbonát (Na 2
CO 3
),
0,0004% (w/v) nátrium-tioszulfát (Na 2
S 2
O 3
),
0,05% formalin.
1 literhez: 60 g nátrium-karbonátot kevés vízben
oldunk. 4 mg vízmentes nátrium-tioszulfátot külön
kevés vízben oldunk. Keverjük össze a két oldatot,
adjunk hozzá 500 µl 35% formaldehidet és egészítsük
ki egy literre. Szobahőmérsékleten tárolható.

90 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
6. Leállítóoldat: 12% ecetsav.
1 literhez: adjunk 120 ml jégecetet 500 ml ionmentes
vízhez. Keverjük össze és egészítsük ki egy
literre. Szobahőmérsékleten tárolandó.
A festés menete
A festési eljárás teljes időtartama alatt talkummentes
gumikesztyű viselete ajánlott. Mossuk le a kesztyűt
vízzel a festési eljárás előtt és alatt. A gélfixálást
és a mosási lépéseket olyan festőtartályban végezzük
(polipropilén ajánlott), amelyet kizárólag csak ezüstfestésre
használunk. A tartály mérete legyen elég nagy
ahhoz, hogy a rázás alatt a gél szabadon mozoghasson.
Minden lépéshez elegendő folyadékmennyiséget
kell használni, hogy az teljesen befedje a gélt. Zárjuk
le a műanyag tartályt egy fedővel, és helyezzük egymásra,
megvédve a párolgástól. Valamennyi lépést
szobahőmérsékleten, tartályonként egy géllel végezzük,
és a rázóasztalon alacsony sebességgel mozgatjuk.
A kezelés során ne érintsük a gélt kesztyű nélkül
vagy fémtárggyal. Műanyag pipettaheggyel vagy hagyományos
üvegpipettával kezelhetjük a géleket.
1. Az elektroforézist követően távolítsuk el a gélt a
kazettából és helyezzük a fixálóoldatot tartalmazó
tartályba. Áztassuk a gélt ebben az oldatban
kb. 2 órát. A fixálás megakadályozza a protein kiáramlását
a gélmátrixból, és el fogja távolítani az
interferáló ionokat és a detergenst a gélből. A fixálás
éjszakán át is végezhető. Ez növeli a festés érzékenységét
és csökkenti a hátteret.
2. Öntsük le a fixálóoldatot, és mossuk a gélt 20% etanolban
20 percig. Váltsuk az oldatot háromszor,
hogy eltávolítsuk a maradék detergenst, az ionokat
és a fixáló savakat a gélből.
Megjegyzés: Víz helyett etanolos oldat használatát
ajánljuk a mosáshoz, ezzel megelőzve a gél duzzadását.
Ha mégis vizes mosást végeznek, akkor
20%-os etanol 20 perces inkubációjával a gélnagyság
megőrizhető.
3. Az etanolos oldat elöntése után adjunk a gélhez elegendő
térfogatú érzékenyítőoldatot. Az inkubálás
erős rotáció mellett 2 percig tart. Ez növelni fogja
az érzékenységet és a festés kontrasztosságát.
4. Öntsük el az érzékenyítőoldatot és mossuk a gélt
kétszer 1-1 percig ionmentes vízzel. Öntsük el a vizet.
5. Adjunk a gélhez hideg ezüst festőoldatot, és rázzuk
20 percig, hogy az ezüstionok rákötődjenek a fehérjékre.
Megjegyzés: Ne öntsük a festőoldatot közvetlenül
a gélre, mert ez egyenlőtlen hátteret eredményezhet.
Adjuk az oldatot pl. a tartály sarkába.
6. A komplett festés befejeződésével öntsük le a festőoldatot,
és öblítsük le a gélt nagy mennyiségű
ionmentes vízzel 20–60 másodpercig, hogy a felesleges,
azaz a kötetlen ezüstionokat eltávolítsuk.
Ismételjük meg a mosást még egyszer.
Megjegyzés: ha a gél mosása tovább tart, mint
egy perc, eltávolíthatja az ezüstionokat a gélből is,
és ez magától értetődően csökkent érzékenységet
eredményez.
7. Öblítsük le a gélt hirtelen a hívóoldattal. Öntsük el
az oldatot.
8. Adjunk hozzá egy új adag hívóoldatot, és hívjuk elő
a fehérjeképet a gél 300 ml hívóban való 2–5 perces
inkubációjával. A reakció azonnal leállítható, ha a
kívánt intenzitást elérik a frakciók.
9. Állítsuk le a redukciót 50 ml ún.„termináló”-oldatnak
a gélhez öntésével, mikor a gél még a hívóban
van. Erőteljes rázás következik 10 percig. Ha az oldat
buborékolása megszűnik, a hívás leállítódott.
10. A nedves gélek 4 °C-on 12%-os ecetsavban, műanyag
zsákban eltarthatók. (Vagy 20%-os etanolos
kezelés után vákuumban leszáríthatók.)
Immunoblotting technikák fehérjék
azonosítására
Létezik nedves és félszáraz transzferálás
Mini-Trans-Blot készülék használata
(„nedves” eljárás)
A „blotting” általános menete/Fehérje-„blotting”
(immunológiai detektálással)
• Elektroforézis (pl. SDS PAGE Laemmli-féle
vagy 2D O’Farrell-féle).
• Ekvilibráció transzfer előtt (15 perc–1 óra).
• Elektroforetikus transzfer (gélről nitrocellulózmembránra,
több órán át).
• A le nem kötött membránhelyek blokkolása (1
óra).
• Inkubáció a primer antitesttel (egy éjszakán át,
4 °C).

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
91
• Az el nem reagált anyag kimosása a membránból
(5 × 10 perc).
• Inkubáció a szekunder antitesttel (1 óra szobahőmérsékleten).
• A fölösleges és nem specifikus reagens kimosása
a membránból (4 × 10 perc).
• Detektálás (reakció-előhívás) (5 percen belül).
Használatos felszerelés
Elektroforézishez: Mini Protean II. Dual Slab Cell
vagy Bio Rad Dual Vertical Slab Gel Electrophoretic
Apparate (Model 220).
Elektroforetikus transzferhez: Mini Trans-Blot
Electrophoretic Transfer Cell; tápegység – pl. Büchler
Instrument.
Használatos oldatok és reagensek
1. Transzferpuffer pH 8,1–8,3 (transzfer előtti ekvilibráláshoz
és elektroforetikus transzferhez használatos).
– 25 mM TRIS: 3,03 g TRIS; 1000 ml-re desztillált/
deionizált vízzel feltöltve
– 192 mM glicin: 14,4 g glicin
– 20% metanol (v/v): 200 ml metanol
Hűtőszekrényben kell tartani. Használatkor
fontos, hogy 4 °C-os legyen indításkor. Sem savat,
sem lúgot nem szabad hozzáadni a pH-állításhoz.
Analitikai tisztaságú metanol használata ajánlott.
2. Ponceau S festés (az immunológiai detektálást megengedi)
a transzfer effektivitásának ellenőrzésére.
Festékoldat:
– 0,25% Ponceau S 0,25 g
– 40% metanol 40 ml
– 15% ecetsav 15 ml
kiegészítés 100 ml-re desztillált vízzel
Differenciálás: desztillált vízzel (20 perc után
látható fakulás)
3. TBS –TRIS pufferolt sóoldat pH 7,5 (alapoldat és
mosóoldat a detektálás előtt)
– 50 mM TRIS: 6,05 g
– 150 mM NaCl: 8,78 g
pH-beállítás HCl-lel 7,5-re
ad 1 liter desztillált vízzel (tárolás 4 °C-on)
Az egyszerűség kedvéért 2 literre való anyagot
oldunk, és a pH-t beállítjuk, de 1 literre töltjük csak
fel (2-szeres töménységű TBS-oldatot használva!).
500 ml-re felezzük, és úgy töltjük fel egyik felét
újra 1 literre. A másik részt a zselatinos oldathoz
használjuk.
4. Zselatinos TBS-oldat (kezelőoldat immundetektálásnál
és hígítóoldat a szekunder antitesthez)
– 0,25% zselatin 2,5 g
– TBS-ben 1 liter
2,5 g zselatint melegítéssel 100 ml desztillált
vízben oldunk. A feloldódott zselatint az 500 ml
2-szeres töménységű TBS-hez öntjük, desztillált
vízzel 1000 ml-re kiegészítjük. 4 °C-on tároljuk.
5. Blokkolóoldat – zselatinos TBS + BSA
1% BSA (bovine serum albumin, liofilizátum)
1 g BSA-t oldunk 100 ml 4-es oldatban (4 °C).
6. Zselatinos TBS + azid (hígítóoldat a primer antitesthez)
0,02% nátrium-azid (20 mg = 0,02 g)
100 ml zselatinos TBS (4-es) oldatban (4 °C)
Tudni kell, hogy az azid a peroxidázreakció potens
inhibitora!
7. Szubsztrátoldat a peroxidázreakcióhoz (frissen készül,
1-2 órával a detektálás előtt)
– 20 mg DAB (diaminobenzidin tetra HCl, Serva)
– 100 ml TBS-ben oldani, fénytől védeni kell.
Csiszolt dugós Ehrlenmayer-lombikot alufóliával
burkolni, keverés mellett oldani. Nem szabad
melegíteni. 1 óra alatt maradéktalanul oldódik.
Szűrés nem szükséges: a kezelt szűrőpapír a festéket
„kiránthatja” az oldatból, amint azt észleltük.
A reakció 100 μl 30%-os H 2
O 2
-oldat hozzáadásával
indul. A reakciót 2 × 50 ml TBS-oldattal való mosással
állítjuk le. Látható reakció 5 percen belül.
A blotting kivitelezése
A blottingegység összeállítása
Elektroforetikus transzfer
• Vizsgálati „anyag”. AA géllemez, Laemmli-féle
SDS-elektroforézist vagy 2D O’Farrell-féle nagy
felbontású elektroforézist követően. A Mini-
Trans-Blot blottoló apparátushoz a maximális
gélnagyság 7,5 × 10 cm. A géllemezt középen

92 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
elfelezve a kérdéses mező blottolható a „nagy”
géllemezből is. A „mini” gél nagysága megfelel a
blottolóegységnek.
• Előkészület a transzferhez. Szükséges eszközök
összekészítése: puffertank, elektródrész, 2 géltartó
kazetta, 3 üvegkád, 4 °C-ra hűtött transzferpuffer
(2 liter), tápegység (Büchler), nitrocellulózmembrán,
mágneses keverő: azaz
„Kerge-Ferke”.
A gélek és a membránok ekvilibrálása. A géllapokat
egy transzferpuffert tartalmazó üvegkádba helyezzük
(kb. 500 ml), és a gél vastagságától függően 15
perctől 60 percig ekvilibráljuk. Az ekvilibrálás célja
az SDS-elektroforézis médiumának eltávolítása. (A
transzfer alatti hőképződés csökkentésére). A gél méreteit
az inkubáció letelte előtt meghatározzuk. Maximális
nagysága 7,5 × 10 cm lehet. A kb. 2 mm vastag
O’Farrell-géllemezt 1 órát áztatjuk. A lemez nagyságának
megfelelő membránt éles szikével vagy pengével
felvágjuk (7,5 × 10 cm). A felvágott membránokat
tiszta edényben 15–30 perc időtartamban transzferpufferrel
ekvilibráljuk.
Szűrőpapír. Schleicher–Schüll- vagy Whatmann-szűrőpapírból
a gél vastagságától függő számban 7,7 ×
10,2 cm-es darabokat vágunk: gélenként 4–6 darabot,
O’Farrell-gélhez 2 × 2 réteget (összesen 2 gélhez
8 db-ot).
Szivacs. A szivacsokat transzferpufferrel telítjük.
Üvegkádba transzferpuffert öntünk; a szivacsokat és
a szűrőpapírokat ebben telítjük pufferrel.
Géltartó kazetta. A két géltartó kazettát a harmadik
üvegkádba helyezzük. A kazetták szürke része fekszik
az edény alján. A kinyitott kazetta átlátszó része
az edény oldalának támaszkodik. A kazettába helyezzük
a transzferpufferrel telített „szendvics”-rétegeket,
pontosan egymásra centrálva, minden réteg után
transzferpufferrel meglocsolva, buborékmentesen a
következőképpen:
– szivacs (8 × 11 cm)
– 2 vagy 3 réteg szűrőpapír (7,7 × 10,2 cm)
– géllemez (7,5 × 10 cm)
– nitrocellulózmembrán (az orientáció bejelölve,
pl. a lemez sarkának lemetszésével; 7,5 × 10 cm).
A membrán/gél adhéziós kontaktusának biztosítására
egy kémcsővel, nyomással és görgetéssel érjük el a
megfelelő érintkezést.
– 2-3 réteg szűrőpapír (7,7 × 10,2 cm)
– szivacs
A kazettát óvatosan zárjuk, a műanyag kallantyú oldalra
fordításával és visszacsúsztatásával.
Puffertank. A puffertankot kb. 400 ml transzferpufferrel
töltjük. Az elektródegységet behelyezzük. Kb.
2–2,5 cm-es keverőpálcát engedünk az aljára. A géltartó
kazettákat az elektródrészbe csúsztatjuk. Szürke
oldaluk néz az elektródpanel szürke oldalára mindkét
kazetta esetén. A tankot mágneses keverőre állítjuk.
A keverőt bekapcsoljuk. Ha hűtőegységet nem
használunk (éjszakán át végzett transzfer, alacsony
feszültség) további kb. 450 ml transzferpufferrel teljesen
megtölthető a tank.
Ügyeljünk a túlfolyás elkerülésére.
Elektroforetikus transzfer. A tető ráhelyezésével és az
elektródok csatlakoztatásával a tápegységhez, hideg
(4 °C) pufferrel indul. Ügyelni kell a színazonosságra
a csatlakozásnál. Piros a piroshoz, fekete a feketéhez,
mind a tetőnél, mind a tápegység kimenőinél.
Az ily módon összeállított blottinggységben a fehérjék
a gélből az anód felé vándorolva (anód: a kazetta
átlátszó része, az elektród piros jelölése) a membránhoz
kötődnek.
Elektroforetikus transzfer. Konstans feszültségállásnál
(volt-regulálás) a tápegységen a 0–200 V és 0–200
mA tartomány kiválasztása után az áramot bekapcsoljuk,
és 30 V-ra állítjuk a feszültséget. A transzfer
20 órát vesz igénybe. (O’Farrell-géleknél – kb. 2
× 2 mm-es gélvastagságnál – induláskor fokozatosan
csökken 200 mA-ről 100 mA-re a vezetés, és ez az érték
másnapig megmarad.) A transzfer befejezése után
az áramot kikapcsoljuk, a kazettákat kiemeljük, majd
a membránokat tetszés szerint festjük.
Festés immundetektálás előtt. Ponceau S-festéssel,
desztillált vizes öblítéssel végezzük. A membránokat
a gélről leemelve, a géllel érintkező oldalukkal fölfelé,
óvatosan festékkel töltött tiszta edénybe helyezzük.
(A további kezelés is végbemehet ebben az edényben).
A membránok fotografálását azonnal el kell végezni
a fakulás miatt.

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
93
Immundetektálás. Lényege, hogy a gélről a membránra
átkerült és rákötött fehérjék közül specifikus
antitest (primer antitest) segítségével keressük és azonosítjuk
a kérdéses fehérjét.
Antigén-antitest találkozás esetén a specifikus reakció
kimutathatóságának érzékenységét nagymértékben
növelhetjük egy második antitesttel, amelyet
valamilyen módon korábban jelöltünk. Ez a jelölés
fogja „indikátorként” igazolni a kérdéses fehérje és a
primer antitest kapcsolódását. Esetünkben egy olyan
alkalmazást ismertetünk, ahol a szekunder antitest
enzimmel, nevezetesen peroxidázzal jelölt. Szubsztrát
jelenlétében az immobilizált enzim látható reakciót
katalizál (ELISA-módszer), és a termék a keletkezés
helyén marad. [A nitrocellulózon lejátszódó immunreakciónak
nagy előnye, hogy az antigén (transzblottolt)
fehérjemembránhoz kötődése, tehát fix helyzete
miatt nincs szükség ún. immunprecipitációra, vagyis
optimális antigén-antitest arányra a kimutatáshoz].
Az eljárás menete. Az elektroforetikusan blottolt
(festett vagy festetlen) nitrocellulózmembránt a géllel
érintkező felszínével fölfelé reakcióedénybe helyezzük.
Előnyös a fedeles kis „ételdobozok” használata.
1. Blokkolás. A le nem kötött membránkötő helyek
blokkolása az immunreakció szempontjából indiferens
fehérjével.
20 ml blokkolóoldattal (5-ös oldat).
Rázás 1 órán át szobahőmérsékleten, majd leöntés.
2. Primer antitestreakció. Az antitest a megadott adatok
szerinti mértékben hígítandó zselatinos + azidos
TBS-sel 6-os oldat); példaként a tropomiozinra
irányuló vizsgálatunkat mutatjuk be:
Tropomiozinnál pl. 160-szoros hígítás ajánlott
(125 μl + 20 ml hígítóoldat) (Sigma: csírkezúza-tropomiozin
ellen termelt nyúlimmunsavó).
Egy éjszakán át 4 °C-on tartva (37 °C 1 óra, 25
°C 2-3 óra).
Az antitestoldat visszatöltése további használatra
(4 °C-on tartva).
3. Az el nem reagált anyag kimosása a membránból.
50 ml zselatinos TBS-sel (4-es oldat) 10 percig.
(Ezt a lépést 5 × 50 ml-re 5 × 10 percig ajánlatos
végezni, szobahőmérsékleten, rázogatva).
4. Inkubáció a szekunder antitesttel; pl. peroxidázkonjugált
nyúl-IgG-ellenes kecskeszérumot használva,
a tartósítószer nem azid, hanem tiomerzál.
Az antitest hígítása zselatinos TBS-sel (4-es oldat)
1:1000 arányban (20 μl + 20 ml hígító).
20 ml hígított szekunder antitestet öntünk a
membránra. Inkubáció szobahőmérsékleten legalább
1 órás rázás mellett.
5. A fölösleges és nem specifikus reagens kimosása a
membránból:
1 × 50 ml zselatinos TBS (4-es oldat) 10 perc
4 × 50 ml TBS (3-as oldat) 4 × 10 perces rázással,
szobahőmérsékleten.
6. Detektálás: enzimreakció (tiszta edényben):
50-50 ml szubsztrátoldat lemezenként (7-es oldat),
a membrán belecsúsztatása „színével” fölfelé,
2-2 csepp (kb. 50-50 μl) 30%-os H 2
O 2
-oldat rázás
mellett.
Színreakció előhívása 5 percen belül. Mosás 2 ×
50 ml TBS-sel, fotografálás, szárítás nedves szűrőpapír
között szobahőmérsékleten, fénytől védve.
Megjegyzés:
A szárított membránok könyv lapjai között tárolhatók.
További felhasználás lehetséges. Új reakció 2-3-
szor lejátszható, ha megfelelő detergens kezeléssel
az antitesteket az elektroforetikusan blottolt fehérjékről
eltávolítjuk. Ily módon az ismételt reakciónál
különböző primer antitestek próbálhatók ki.
Immunoblotting technika a fehérjék
azonosítására (semi-dry blotting)
A fehérjefrakciók immunkémiai detektálására szolgál.
Az immundetektáláshoz pásztánként (mintánként)
3–5 mg proteint elektroforetizálunk.
Oldatok
Blokkolóoldatok: a szabad kötőhelyek blokkolására
– 3 és 5%-os tejes zselatinos TBS-oldat
– 3, ill. 5 g tejpor
100 ml zselatinos TBS-ben
vagy
– 1%-os BSA (bovin szérumalbumin, liofilizátum)
– 1 g BSA
100 ml zselatinos TBS-ben
Alternatív puffer pH 8,1–8,3: a transzfer előtti ekvilibráláshoz
és az elektroforetikus transzferhez használatos:

94 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
– 48 mM TRIS 5,8 g
– 39 mM glicin 2,9 g
oldás után 1,3 mM SDS 3,7 ml 10%-os oldata
ad 800 ml desztillált víz
– 20% metanol 200 ml
Hűtőszekrényben tároljuk, használatkor 4 °C-os
legyen.
TBS (TRIS-pufferolt sóoldat), pH 7,5 (alapoldat és
mosóoldat a detektálás előtt)
– 50 mM TRIS 6,05 g
– 150 mM NaCl 8,78 g
pH beállítása HCl-lel 7,5-re, és 1000 ml-re vízzel
kiegészíteni.
Zselatinos TBS (kezelőoldat immunreakciónál és hígítóoldat
az antitesthez)
– 0,25% zselatin 2,5 g
ezt melegítéssel oldjuk 100 ml vízben
– + 2-szeres töménységű TBS-ből 500 ml
a fentieket desztillált vízzel kiegészítjük 1000 ml-re.
Elektroforetikus transzfer
Az egydimenziós géllap transzferálásának menete
nitrocellulózmembránra: A semi-dry NovaBlot
(Pharmacia) készülék grafitlapjainak benedvesítése
után az alternatív pufferbe mártott szűrőpapírokat
egymásra tesszük, föléjük helyezzük a vízzel benedvesített
membránt, majd az alternatív pufferben ekvilibrált
gélt, majd ismét a nedves szűrőpapírokat.
A transzferálást 150 mA áramerősségen 20 percen
keresztül végezzük.
A membrán blokkolása:
A blokkoláshoz a membránt egy éjszakán át 4 °Con,
tejben vagy BSA pufferoldatban tartjuk.
Immunreakció:
Vizsgálataink során többféle fehérjét detektáltunk
(vírusfehérjék, hősokkprotein, aktin, aktomiozin, lizozim,
szekretoros IgA, laktoferrin, orozomukoid,
XIII. faktor, fibrinogén stb.).
A jel-zaj arány optimalizálásához fehérjénként különböző
médiumokat fejlesztettünk ki. Az immunreakcióhoz
használt különböző médiumok lehetnek:
• A oldat: 5% tej- (non fat dry milk) tartalmú TBS.
• B oldat: 0,05% Tween 20 TBS-ben.
• C oldat: TBS.
• D oldat: 0,5%Tween 20 zselatinos TBS-ben.
• E oldat 0,05% Tween 20 zselatinos TBS-ben.
• F oldat: zselatinos TBS.
A primer antitestreakció egy órán át 37 °C-on termosztátban
ment végbe, folyamatos rázás mellett.
Az immunreakció közege minden esetben a vizsgált fehérjére
lett kifejlesztve. Az immunreakció részleteit a
4-3. táblázaton foglaltuk össze. HRP-konjugátumokat
használtunk a jelölésre. A táblázat ennek változatait
mutatja be, a teljesség igénye nélkül.
Az immunreakció „előhívása”
A peroxidázreakció előhívásához két különböző eljárást
is alkalmaztunk:
Ni-DAB-reakció ezüstintenzifikálással (Gallyas et
al., 2003)
Ni-DAB-reakció:
Az előhívás enzimreakción alapul: a szekunder antitesthez
kötött peroxidáz enzim szubsztrátja a H 2
O 2
.
A reakció hatására a DAB elszíneződik, és a színreakciót
a NiSO 4
erősíti fel.
Előhívóoldat: Ni-DAB-reagens
– 20 mg DAB (3,3-diamino-benzidin-tetrahidroklorid)
– 56 mg nikkel-szulfát (NiSO 4
× 7H 2
O)
Mindkettőt külön-külön feloldjuk 50-50 ml
TBS-ben.
Az oldódás után összeöntjük, és a Ni-DAB-oldatba
50 μl 30%-os H 2
O 2
-t teszünk. Az így frissen készült
előhívóoldatba helyezzük a membránt, és megvárjuk,
amíg a színreakció kifejlődik. A színreakció leállításához
a membránt 1%-os nátrium-acetát-oldatba
tesszük néhány percre.
Ezüstintenzifikálás:
A Ni-DAB-os immundetektálást követően az ezüsterősítést
a következő elegyben végezzük [Na-volframátot
és C-vitamint (gyógyszertári ampulla) tartalmazó
oldat].
Oldatok:
– 60 ml A oldat (pufferolt detergenssel stabilizált
Ag-kolloid-oldat).
– 7,5 ml B oldat: 5% Na-volframát-dihidrát.
– 7,5 ml C oldat: 0,2% aszkorbinsav vizes oldata.

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
95
4-3. táblázat. Fehérje detektálása immunreakcióval *
Módszer 1. 2. 3.
blokkolás A oldat 3% tejes zselatinos TBS 1% BSA zselatinos TBS
mosás - C oldat C oldat
primer antitest
poliklonális antipatkány IgA
(kecske)
1:50 hígítás A oldatban
poliklonális anti-tojásfehérje
lizozim (nyúl)
1:50 hígítás D oldatban
antihumán laktoferrin (nyúl)
1:50 hígítás F oldatban
mosás 4 × 5 perc B oldat 5 × 10 perc D oldat 5 × 10 perc E oldat
szekunder antitest:
mosás
antikecske immunglobulin
(nyúl)
1:1000 hígítás A oldatban
3 × 10 perc B oldat
10 perc C oldat
antinyúl immunglobulin (disznó)
1:1000 hígítás F oldatban
10 perc D oldat
3 × 10 perc C oldat
antinyúl immunglobulin
(disznó)
1:1000 hígítás F oldatban
3 × 10 perc E oldat
10 perc C oldat
*
Az immunreakció közege minden esetben a vizsgált fehérjékre lett kifejlesztve. HRP konjugátumokat használtunk a jelölésre.
A táblázat ennek változatait mutatja be, a teljesség igénye nélkül.
Közvetlenül használat előtt készítjük el a három
komponens keverékét az előbbi arányban. Az előhívás
során a kívánt intenzitás eléréséig tart a kezelés.
Az ezüstözési reakció leállításához 1%-os ecetsavoldatot
használunk.
Az előhívott membránt üveglapon szárítjuk tridesztillált
vízzel átitatott szűrőpapír között. A megszáradt
membránok száraz körülmények között, szobahőmérsékleten,
fénytől védve archiválhatók (4-13.
ábra).
Kemilumineszcencia (ECL, enhanced chemiluminescence).
A kemilumineszcencia az a fénykibocsátás,
amely a kémiai reakció során felszabaduló
energiá ból keletkezik. Leggyakrabban peroxidáz enzimmel
konjugált második antitestet használtunk a
detektáláshoz, amely ECL esetében a következő reakciósémán
alapul:
A fényjel gyorsan csökken (flash típusú kemilumineszcencia),
ezért ún. erősítőt is használunk.
Az immunoblott ECL detektálását a 4-14. és 4-15.
ábrán mutatjuk be: a membránhoz kötött, detektálni
kívánt fehérjéhez először hozzákapcsolódik a primer
antitest, majd a torma-peroxidáz-konjugátummal jelölt
szekunder antitest. Erősítő ágensként parajodofenolt
alkalmaztunk, ezután a H 2
O 2
- és luminoltartalmú
reagens hozzáadásával fénykibocsátás történik,
amelyet detektálunk.
A parajodofenol mint jól bevált erősítő hatására a
kemilumineszcencia-intenzitás percekig stabil ma-
luminol + H 2
O 2
+ peroxidáz = luminol * + fény
4-13. ábra. Western blotting. Gallyas-féle immundetektálás
(minta: humán könyminták, laktoferrin; detektálás: Ni-
DAB + ezüst)
4-14. ábra. Western blotting; az ECL-detektálás elve

96 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
rad, a csökkenés lassan megy végbe. Az oldat pH-jának
növelése is nagyobb jelet eredményez.
Általunk kipróbált és ajánlott ECL-reagensek:
• Kereskedelmi forgalomba kapható gyári kit:
SuperSignal West Pico Chemiluminescent
Substrate (Pierce Biotechnology Inc.) 34077; 50
ml Luminol/Enhancer + 50 ml Stable Peroxide
(szubsztrát)
A reagens szobahőmérsékleten tartandó, kb.
1 évig stabil, a gyári ajánlás szerint 800 cm 2 felületre
elegendő.
A kereskedelmi forgalomban ma már akár
1000-szer érzékenyebb reagens is elérhető. Mi
könnyfehérjék identifikálásában használtuk.
• „Házilag”, laboratóriumunkban készült reagenselegy:
– Luminololdat (10 ml):
4-15. ábra. Western blotting; lizozim ECL-detektálása
0,1 M TRIS-HCl puffer, pH 9,35 100 ml-ében
78 mg luminol + 95 mg parajodofenol együtt
oldva.
– Szubsztrát: 10 μl H 2
O 2
Az eljárás részletezése:
1. A gyári reagenseknél a két komponenst (luminol
és szubsztrát) 1:1 arányban elegyítjük, a szükséges
mennyiségnek megfelelően. Az összekevert reagens
szobahőmérsékleten órákig stabil marad. Óvjuk
az oldatot erős fénytől.
2. Az ECL-reagenssel való előhívás két módja ismeretes:
• Folyadékfilmmel, amely a takarékos változat.
• A membránt éles felével fölfelé reagensbe merítjük.
Ez utóbbi érzékenyebb és stabilabb detektálást
eredményez.
3. Fényszegény környezetben inkubáljuk 5 percig.
4. Az értékelés esetünkben KODAK Image Station
2000R készülékkel végeztük, de ez készülék hiányában
röntgenfilm-expozícióval is helyettesíthető.
A KODAK Image Station 2000R készülék:
CCD (charge-coupled device) technikát alkalmaz:
lényege, hogy a detektorba érkező fotonok egyenként,
közvetlenül számolhatók, így ez a módszer kvantitatív
értékelésre is alkalmas.
4-16. ábra. MS-kompatibilis
detektálást
követő könnyfehérje-azonosítás
(MALDI TOF)

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
97
A CCD-kamerás felvétel a berendezés
saját szoftverével értékelhető. Ez
lehetőséget ad mind automata, mind
kézi vezérlésű elemzésre. Az alapparaméterek
egy adott területről a következők
lehetnek:
– átlagos fényintenzitás
– az összes képpont szummált (öszszegzett)
jele
– nettó intenzitás (az összes képpont
szummált jele – a háttér intenzitás)
– a terület nagysága, alakja stb.
A berendezés ugyanakkor alkalmas
a kép valós idejű követésére, azaz kinetikus
mérésre és a jel/zaj viszony
optimalizálására is. Hagyományos festett
gélek (4-16. ábra) és fluoreszcenciásan
jelzett gélek fotózása (4-17. ábra)
és kiértékelése szintén (2 × 2 cm-től 20
× 20 cm nagyságig) lehetséges ezzel a
technikával (4-18. ábra).
4-17. ábra. 2D DIGE analízis (fluoreszcens jelöléssel).
A szeparálás itt is az O’Farrell-technikán alapszik
4-18. ábra. Fehérjejelölési módok a blottingot követően (összefoglalás)

98 4. fejezet Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
Dokumentáció. A gélfotókat alsó megvilágításból
(transzparencia), Fuji Velvia 50 ASA filmre készítettük,
ill. számítógépes, digitális technikával rögzítettük.
Poliakrilamidgél-lemez szárítása
zselatinnal (Popescu szerint [15])
A módszer vékony és nagy poliakrilamid-koncentrációjú
gradiens lemezek szárítására alkalmas. 0,8 mm
vastagságú, 17–25%-os koncentrációjú lemezgélek
töredezés nélkül leszáríthatók.
1. A festett géleket differenciálás, a festetlen géleket
40%-os etanolban való 1-2 órás fixálás után 7,5%
ecetsavat és 1,5% glicerint tartalmazó oldatban áztatjuk
2 órán át, szobahőmérsékleten.
2. Az így előkészített géllemezt vízszintezett plexilapra
helyezzük. A gél és a plexilap közé szorult buborékokat
óvatosan eltávolítjuk. A gél felszínéről és
széleiről a felesleges folyadékot felitatjuk.
3. Háztartási zselatin 5%-os vizes oldatát (+ 0,02%
Na-azid) még forró állapotban, 1-2 mm castagságban
a gélfelszínre rétegezzük, vigyázva arra, hogy
az a széleken ne csorduljon le. 1-2 óra múlva, amikor
a zselatin már elég viszkózus, de még nem gél
állapotú, a lemezszélekre pipettával újabb zselatinréteget
húzunk úgy, hogy az kb. 1,0–1,5 cm szélességben
ráterjedjen a plexilapra is.
Így a géllemezt borító zselatinréteg középütt vékonyabb,
mint a széleken. Ez az előfeltétele a deformálódás
nélküli száradásnak.
A lemez szobahőmérsékleten 36–48 óra alatt leszárad.
Teljes száradás után a plexilapról film formájában
lehúzható.
Ajánlatos a gélfilmet sima felszínek között tárolni.
Irodalom
A módszertanok eredeti forrásai szerint
[1] Bonner, W. M., Laskey, R. A.: A film detection method
for tritium-labelled proteins and nucleic acids in
polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46: 83–88, 1974.
[2] Burnette, W. N.: „Western Blotting”: electrophoretic
transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
gels to unmodified nitrocellulose and radiographic
detectation with antibody and radioiodinated
protein A. Anal. Biochem. 112:195–203, 1981.
[3] Davis, B. J.: Disc Electrophoresis. 2. Method and application
to human serum proteins. Ann. New York Acad.
Sci. 121:404–427, 1964.
[4] O’Farrell, P. H.: High resolution two-dimensional
electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250:4007–
4021, 1975.
[5] Gershoni, J. M., Palade, G.E.: Protein blotting: principles
and applications. Anal. Biochem. 131:1–45, 1983.
[6] Giulian, G. G. et al.: Improved methodology for analysis
and quantitation of proteins on one-dimensional silver
stained slab gels. Anal. Biochem. 128:277–287, 1983.
[7] Gromova, I. Celis, J. E.: Protein detection in gels by silver
staining: A procedure compatible with mass-spectrometry.
In: Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T. et al. (eds):
Cell Biology: Laboratory Handbook. 3 rd Ed. Academic
Press, Elsevier, 2006.
[8] Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during
assembly of the head bacteriopghage T4. Nature
227:680–685, 1970.
[9] Ludány, A., Gallyas, F., Gaszner, B. et al.: Skimmed
milk blocking improves silver post-intensification of
peroxidase-diamino-benzidine staining on nitrocellulose
membrane in immunoblotting. Electrophoresis
14:78–80, 1993.
[10] Marshall, T.: Detection of protein in polyacrylamide
gels using an improved silver stain. Anal. Biochem.
136:340–346, 1984.
[11] Marshall, T., Williams, K. M.: Sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of urine:
concentration of urinary proteins by precipitation with
Coomassie Blue. Clin. Chem. 39/11:2314–2318, 1993.
[12] Marshall, T., Williams, K.: Two-dimensional
electrophoresis of human urinary proteins following
concentration by dye precipitation. Electrophoresis
17:1265–1272, 1996.
[13] Ornstein, L.: Disc Electrophoresis, 1. Background
and Theory. Ann. New York Acad. Sci. 121:321–
349,1964.
[14] Otey, C. A., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C.: A procedure
for the immunoblotting of proteins separated
on isoelectric focusing gels. Anal. Biochem. 157:71–76,
1986.
[15] Popescu, O.: A simple method for drying polyacrylamide
slab gels using glycerol and gelatin. Electrophoresis
4:432–433, 1983.
[16] Sammons, D. W. et al.: Ultrasensitive silver-based
color staining of polypeptides in polyacrylamide gels.
Electrophoresis 2:135–141, 1981.
[17] Towbin, H. et al.: Electrophoretic transfer of proteins
from polyacrilamide gels to nitro-cellulose sheets: procedure
and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci.
76:4350–4354, 1979.

Az analitikai kémia módszerei a fehérjekutatásban – Fehérjeválasztási és fehérjedetektálási technikák
99
[18] Westermeier, R.: Electrophoresis in Practice. 4 th Ed.
Wiley-VCH Verlag GmbH Co. KgaA, Weinheim, 2005.
(Ajánlott összefoglaló munka)
[19] Willoughby, E. W., Lambert, A.: A sensitive silver
stain for protein in agarose gel. Anal. Biochem.
130:353–358, 1983.
[20] Wang, Xuchu et al.: A modified CBB staining method
at nanogram sensitivity compatible with proteomic
analysis. Biotechnol. Lett. 29:1599–1603, 2007.
A gradiens gél kialakításához
[21] Work, E. (eds): Laboratory techniques in biochemistry
and molecular biology. Vol. 2. North-Holland publishing
Company, Amsterdam–London, 1970.

5. Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók
alapján
Kellermayer Miklós
Minden fejezetben, mint a legalapvetőbb, a leglényegesebb
kiindulási pontot, a név, a fogalom eredetét,
tartalmát célszerű újra meg újra elismételni. A protein,
fehérje (görögül πρωτεϊνη – első számú alkotóelem)
név, fogalom 1838-ban született. Jöns Jakob
Berzelius írta le először az 1838. július 10-i keltezésű,
Gerhardus Johannes Mildernek címzett levelében.
Arra a kérdésre, hogy mi a fehérje, három
meghatározás, három definíció van:
1. Az eredet szerinti meghatározás: A fehérjék az élő
sejtek termékei (produktumai).
2. A molekuláris anatómiai meghatározás: A fehérjék
módosult aminosavpolimerek.
3. A funkcionális meghatározás: A fehérjék olyan
molekulák, amelyeknek sajátos biológiai funkcióik
vannak.
Az első meghatározás kifejtése
Az eredet szerinti meghatározás azért olyan fontos,
mert magára a lényegre, az anyag élővé szerveződésére
mutat rá. Élettelen anyagból, még a sejteket felépítő
makromolekulákból sem tudott élőlényt, élő sejtet
eddig soha senki létrehozni! Tehát az élet maga a folytonosság!
Az első egyetlen élő sejttől, a legősibb őssejttől,
Darwin elnevezésében a „progenitortól” eltelt
3,5–4 milliárd éves folytonosság. Ez egyben a fehérje-újdonképződés,
a fehérjeszintézis folytonosságát is
jelenti. Így a „mi az élet” kérdésre az egyik lehetséges
válasz, hogy az élet = folytonos fehérje-újdonképződés!
Azt, hogy mennyire lényegi megállapítás ez, bizonyítja
a peptidkémia, a szintetikus peptidgyártás mérethatára.
Ugyanakkor 20 perc alatt (ennyi a megkettőződési,
a generációs ideje) a székletünkben tenyésző,
1-2 µm nagyságú prokarióta Escherichia coli bacilus
több száz, akár ezer aminosavból álló fehérjékből
több mint 1000 félét gyárt. Ez maga a csoda, az élet
csodája! Az élő sejtek fehérjegyártásáról nagyon sokat
tanítunk, de a hogyanról(?), magáról a mechanizmusról
azonban sajnos nagyon keveset, majdnem
semmit sem tudunk!
A második meghatározás kifejtése
A második, a molekuláris anatómiai meghatározás
szerint a fehérjék módosult aminosavpolimerek. Az
egyes részletek megismeréséből, az adatokból elméleti
kiegészítésekkel valamiféle „egyezség” született a
polimerképződésre és a polimerek módosítására is.
Ezt az „egyezséget” – a polimer képződésére és módosítására,
vagyis magára a fehérjék gyártására megszerkesztett
és általánosan elfogadott leírást – sajnos
ténynek kezeljük, tudásnak, tudománynak tartjuk.
Így került be a tankönyvekbe, így kell megtanulni, így
kell tudni a felnövekvő fiataloknak középiskolás és
egyetemi szinten egyaránt.
Az emberi szervezetet felépítő 10 14 élő sejtben 20
aminosav polimerizációjából keletkeznek a fehérjék.
A 20-ból 11-et a sejtek szintetizálni tudnak, míg kilencet
– ezeket esszenciális aminosavaknak nevezzük
– kívülről, a táplálékból kell megkapni. Vagyis a fehérjéink
felépítéséhez szükséges építőelemek (aminosavak)
majdnem felét csak más élőlények tudják
számunkra előállítani. A fehérjéinkben α-aminosavak
vannak, amelyek optikailag aktív molekulák. Az első
(α helyzetű) szénatomhoz kapcsolódó amino- és karboxilcsoportok
elhelyezkedése határozza meg az optikai
aktivitást, a polarizációs fény elforgatását, amely
lehet jobbra és balra forgatás. A fehérjéinkben csak az
egyik, csak a balra forgató, l-aminosavak fordulnak
elő. Az aminosavak amfotérek, ikerinonos szerkezetűek,
azaz disszociáló amino- és karboxilcsoportokat
tartalmaznak. Ebből a tulajdonságukból és abból,
hogy egyes aminosavak még egy karboxil- és mások
még egy aminocsoportot is tartalmazhatnak, a polimerük,
a peptidlánc olyan amfotér, ikerionos természetű
molekula, amelynek pH 7 vagy a pH 7-től eltérő
saját izoelektromos pontja van, azaz olyan pontja,
ahol semleges, ahol nincs töltése a molekulának. Az
egyes aminosavak peptidkötéssel kapcsolódnak egymáshoz
és képeznek láncot. A peptidkötés egy karboxil-
és egy aminocsoport között egy vízmolekula
kilépésével jön létre.

102 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
Az aminosavak lánccá, polipeptiddé fűzése az élő
sejteken belül speciális „szerelőműhelyekben”, a riboszómákban
folyik. A hogyan(?), vagyis a mechanizmus
itt sem teljesen ismert! A leírás szerint, amelyet
viszont a diákoknak meg kell tanulni, a fehérjék létrehozásában
számos RNS-molekulacsalád vesz részt.
Számos RNS „irányítja” a riboszómákban végbemenő
polipeptidlánc-szintézist. Az rRNS-molekulák (a riboszomális
RNS) a riboszómák szerkezeti felépítésének
fontos alkotói. A tRNS molekulák (a transzfer
RNS) az aminosavak „kiválasztását”, „kínálatának”
biztosítását végzik. Az aminosavak sorrendjét, az
aminosavszekvenciát, amelyett a fehérjeláncok elsődleges
szerkezetének nevezünk, az mRNS-molekulák
(a messenger – hírvivő – RNS-ek) határozzák meg
a kodonjaik, bázis-„hármasaik” által. A kodonok, az
aminosavak sorrendjét meghatározó bázishármasok
a génekből az mRNS-molekulákba való átírásért felelős
DNS-ből, DNS-bázishármasokból származnak. A
négyféle bázist, az A–T (U) és G–C bázist figyelembe
véve elméletileg 4 3 = 64 kodon (bázistriplet) létezne.
Valójában 61 „élő” kodonról tudunk, ami azt jelenti,
hogy több kodon van, mint aminosav. Így lehet, hogy
van olyan, amelyet csak egy, és van olyan, vannak
olyanok, amelyeket több bázistriplet határoz meg. Valóban
van olyan aminosav, pl. a metionin, amelynek
csak egy meghatározó kodonja van (AUG), és vannak
olyanok, pl. a leucin és az arginin, amelyeknek 6-6
meghatározó kodonjuk van. Az mRNS-, az rRNS- és
a tRNS-molekulákon kívül az átírás (transzkripció)
és a polipeptidlánc-szintézis (transzláció) véghezviteléhez
további RNS-molekulák, mint a kis molekulatömegű
mag-RNS-ek (snuRNS és srpRNS), valamint
mikro-RNS-ek (miRNS) vesznek részt. Mindazonáltal
magát a munkát, a fehérjeláncok szintézisét egy
sereg fehérje vezérli és hajtja végre.
Így a molekuláris anatómiai definíció már az aminosavpolimerek
keletkezésénél „átfed” a 3. definícióval,
vagyis azzal, hogy a fehérjék speciális biológiai
funkciókat végző molekulák. Az átfedés a molekuláris
definíció második részénél, a módosulások többségénél
is tetten érhető. Az újdonképződött polipeptidlánc
első módosulásánál, vagyis akkor, amikor a
lánc megcsavarodik, amikor Linus Pauling szerint
az α-hélix kialakul, nem szükségeltetik egy másik fehérje
vagy fehérjék. Viszont a peptidlánc kinyújtott
állapotban tartása, az ún. elongáció is más fehérjéket
igényel. Általános elvként fogadható el, hogy az
élő sejten belüli történések közül egyetlenegyre se
lehet bizonyossággal kimondani, hogy más fehérjéktől
független. A fehérjelánc felcsavarodását, az α-hélix
kialakulását a folyamat felfedezői, Linus Pauling
és Robert Corey is és azóta a tudomány is spontán
folyamatnak, az aminosavak peptidkötéssel történő
lánccá formálása „kötelező” következményének tartják.
Az α-hélix-konfigurációt a CO- és NH-csoportok
közt kialakult hidrogénhidak stabilizálják úgy, hogy
a hélix tengelyében a szomszédos aminosavak 1,5 Å
távolságban vannak egymástól, és egy teljes fordulathoz
3,6 aminosav szükségeltetik. Tehát 3,6 aminosavanként
ismétlődnek a fordulatok az α-hélix-ben.
Ezt a konfigurációt nevezzük a fehérjék, a polipeptidláncok
másodlagos szerkezetének. Linus Pauling
és Robert Corey az α-hélixen kívül még egy másik
standard konfigurációt is felfedezett, amelyet b-redőzött
rétegnek neveztek el. Ez a konfiguráció eltér az
α-konfigurációtól már csak azért is, mert ebben a két
szomszédos aminosav közti távolság nagyobb, az 1,5
Å-mel szemben 3,5 Å. A másik lényeges különbség,
hogy a b-redőzött rétegben a hidrogénhidak két egymás
melletti peptidláncot kapcsolnak egybe, míg az
α-hélixben a hidrogénhidak a láncon belül vannak.
Ami még lényeges, hogy mindkettő , az α és a b konfiguráció
együtt jelenti a fehérjék másodlagos szerkezetét,
és mindkettőt a fehérjelánc saját belső tulajdonsága
eredményének lehet felfogni.
A fehérjeláncok harmadlagos szerkezete, amely
szintén a módosulások része, az egymástól távol eső
aminosavak közti kötések, pl. diszulfidkötések által
jön létre.
A negyedleges szerkezet, amikor több fehérjelánc
kapcsolódik egymáshoz. Az egymáshoz kapcsolódó
fehérjéket általában a fehérjekomplex alegységeinek
nevezzük. A módosulások külön csoportját képezik
a szabályozott hasítások. Különösen az élő sejtekből
kikerült peptidhormonok, a peptid növekedési faktorok,
közös néven „biológiai válaszmódosítók” (biological
response modifiers) keletkeznek így. Még a sejteken
belül vagy a sejtek felszínén specifikus proteáz
enzimek hatására képződnek a speciális funkciókat
végző, kicsi, aktív molekulák. A módosulások harmadik
nagy csoportja, amikor bizonyos nem fehérje
természetű molekulák reakciókba lépnek a peptidláncokkal,
majd hozzájuk kapcsolódnak. Ilyen pl. a
glikoproteinek nagy csoportja, amikor is a szénhidrátok
csoportjába tartozó molekulák kovalensen a pep-

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
103
tidláncokhoz kapcsolódnak. A módosulások újabb
külön csoportját képezik azok a kapcsolatok, amikor
anorganikus elemek kötődnek a fehérjékhez. Ezek általában
metalloproteinek.
A molekuláris anatómiai definíció, vagyis az, hogy
a fehérjék módosult aminosavpolimerek, lehetővé
tette számunkra, hogy bizonyos fokig megismerjük,
megértsük a lehetséges mechanizmusokat, amelyek
az élő rendszerekben a fehérjék felfoghatatlan sokaságát
eredményezik. A kodonok száma és a 20 aminosav
együtt a lánc méreteinek változhatóságával már a
primer szerkezetük alapján végtelen nagy számú peptidlánc
szintézisét adja. A módosulások sokfélesége
még tovább biztosítja, hogy a ma élő élőlényekben,
különösen az emberi szervezetben végtelenül nagy
számú fehérje képződhessék, és valóban képződik is.
A harmadik meghatározás kifejtése
A fehérjék meghatározott, sajátságos biológiai
funkciókkal rendelkező molekulák. Mivel ez a meghatározás
adja ennek a fejezetnek az alapját, érdemes
alaposabban megvizsgálnunk. Már az előző két meghatározás
is sejteti, hogy a fehérjéknek bizonyosan
vannak olyan funkciói, amelyeket közvetlenül még
nem tudunk vagy egyáltalán nem tudhatunk vizsgálni,
csak következtetni tudunk rájuk az „eredményből”.
Később olyan vizsgálati módszereket is tárgyalunk
majd, amelyeket magában az érintetlen élő sejtekben
tudunk elvégezni, de „a fehérjék vizsgálata biológiai
funkcióik alapján” – ami a fejezet címe – mégis azt jelenti,
hogy az élő sejtekből fiziológiásan kikerült vagy
az élő sejtek elpusztítása után kivett fehérjéket vizsgálunk.
Az, hogy vannak olyan fehérjékhez kapcsolt
biológiai, sejtélettani funkciók, amelyek csak az élő
sejteken belül zajlanak, és nincs módszerünk, amelylyel
ezek közvetlenül vizsgálhatók lennének, könnyen
elfogadható. Az a feltételezés, hogy egy fehérje az élő
sejten belül más funkciót is betölt, mint amit a sejtekből
kivéve bizonyíthatunk róla, ma már elfogadott.
Elfogadott, mert több bizonyíték is van arra, hogy pl.
az mRNS védelmét az élő sejtekben bőségben előforduló
RNS-bontó enzimektől (RN-áz molekuláktól)
bizonyos glikolikus enzimek is végzik.
A harmadik állítás, hogy az élő sejten belül a fehérjéknek
van egy lényegi funkciójuk, ami nem más,
mint maga az élő állapot (a „living state”) biztosítása(!),
ma még nincs széles körben elfogadva. Mintha
az élettudomány félne a „vis vitalis” elmélet viszszacsempészésétől.
Ugyanakkor sokkal több adat,
közvetlen megfigyelés szól amellett, hogy van „living
state”, hogy van a fehérjéknek „dinamikus élő állapota”,
mint ellene. Ezért helyes, ha minden fiatal úgy tekint
a fehérjékre, mint az élő sejtek azon alkotóelemére,
amelynek nem 2, hanem 3 állapota van:
• Élő állapot (living state).
• Natív állapot, ami az élő sejtekből kikerült vagy
általunk kivett fehérjék állapotát jelöli.
• Denaturált állapot. Ezt a denaturált állapotot
hővel, savval, lúggal laboratóriumban könnyen
elő lehet idézni. Ekkor a fehérjék elveszítik a
biológiai funkciójukat.
*
Lezárva a „mi a fehérje(?)” kérdésre adható 3 választ,
körvonalazódik, hogy ez a „A fehérjék vizsgálata biológiai
funkcióik alapján” című fejezet elsődlegesen az
élő sejtekből kivett vagy fiziológiásan kikerült fehérjék
biológiai funkciói alapján való vizsgálatáról fog
szólni, és csak röviden utalunk majd olyan kutatási
irányokra, amelyek közvetlenül az élő sejteken belül
vizsgálják, regisztrálják a fehérjefunkciókat.
Az emberi test 10 14 élő sejt „társadalma”. Az általuk
termelt 9–12 kg teljes fehérjeállomány funkcióik
alapján 10 csoportba lett felosztva, és a következőkben
e csoportokat ismertetjük:
• Immunglobulinok, antitestek és a komplementrendszer.
• Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék, intracelluláris
vázfehérjék (citoszkeleton).
• Enzimek, biokatalizátorok.
• Hormonok.
• Sejtnövekedést befolyásolók, sejtnövekedési
faktorok, „biológiai válasz módosítók” (biological
response modifiers).
• Extracelluláris szerkezeti elemek.
• Raktárak.
• Transzportőrök (szállítófehérjék).
• Ligandumok.
• Esszenciális táplálékok.
Az egyes fehérjecsoportok ismertetésének menete:
rövid történeti áttekintéssel kezdődik, majd következik
a leírás, molekuláris sajátosságaik ismertetése, ezután
funkcióik bemutatása, végül a funkcióik alapján
végezhető vizsgálatuk bemutatása következik.

104 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
Immunglobulinok, antitestek
és a komplementrendszer
Történeti áttekintés
Az antitestek, az immunglobulinok és a komplementrendszer
felfedezésének, elnevezésének története természetesen
bele van ágyazva az egész immunológia
történetébe. Lehetne és talán kellene is Edward
Anthony Jenner (1749–1823) munkásságával kezdeni,
hiszen méltán nevezik őt az „immunológia atyjának.”
Minden kétséget kizáróan ő volt az első, aki
tudatosan immunizált, védőoltást (vakcinációt) alkalmazott.
Híressé vált a kertészének 8 éves fia, James
Phipps, akit 1796. május 14-én beoltott egy fejőlány,
Sarah Nelmes kezén lévő tehénhimlőhólyagból vett
folyadékkal. A fiú bizonyítottan védetté vált a himlő
ellen. Sok más óriást, köztük Louis Pasteurt (1822–
1895), Robert Kochot (1843–1910), Ilja Iljics
Mecsnyikovot (1845–1916) kellene feltétlenül említeni
és felfedezéseiket ismertetni, a kitűzött konkrét
cél, az antitestek felfedezésének története szempontjából
mégis mindenekelőtt Paul Ehrlichet (1854–
1915), az ő munkásságát kell részletesebben ismertetni.
Igazi kutató volt, akinek orvosdoktori diplomája
is volt! Először patológus, és a hisztológiai festések
érdeklik. Harminckét éves, amikor Koch Robert
Berlinbe, a Charite-re hívja. Együtt dolgozott ekkor
Adolf von Behringgel, a diphtheriaellenes szérum
kifejlesztésén. Ekkor használja először az antitest
(„antikörper”) fogalmat, és alkotja meg a humorális
immunitás tanát, az „oldallánc-teóriát”, miszerint a
toxinok, mint „kulcs a zárban” kapcsolódnak a kritikus
sejtek felszínéhez. Ez a kötődés indukálja a speciális
antitest termelését. Mecsnyikovval közösen
kapott 1908-ban orvosi-élettani Nobel-díjat. Ezt követően
Dr. Hata Sahachiróval, tanítványával kifejlesztették
a syphilis elleni hatékony gyógyszert, a
Salvarsant. Fontos tudni, hogy jóllehet az antitest (antikörper)
elnevezés Ehrlichtől származik, az első
rendszeres kutatásokat az antitestekkel, ill. az ún. humorális
immunitással kapcsolatban Emil Adolf von
Behring (1854–1917) és Kitasato Schibasaburo
(1853–1931) végezte. Kimutatták, hogy passzív immunizálás
(védettség) érhető el a kórokozóval fertőzött
állati vér szérumának befecskendezésével. Emil
Adolf von Behring kapta az első orvosi-élettani
Nobel-díjat éppen az antitestekkel kapcsolatos kutatásaiért
1901-ben, azaz 8 évvel korábban, mint a névadó
Paul Ehrlich. Tudománytörténeti szempontból
érdekes, hogy amíg az antitest (antikörper) fogalmat
minden bizonnyal Paul Ehrlich alkotta, használta
először, az antigén fogalmat, elnevezést viszont a magyar
Detre (Deutsch) László (1874–1939) mikrobiológus.
Nagyon fontos, hogy egy ilyen kiváló tudósról,
mint amilyen Detre László volt, mindenki, aki
az orvostudomány és az egészségtudomány terén szerez
felsőfokú képzettséget, alapos ismeretekkel rendelkezzék.
Nagysurányban (ma Szlovákia) született
1874-ben, 1895-ben avatták orvosdoktorrá Budapesten.
A Kórbonctani Intézetben lett asszisztens, majd
Bécsben Landsteiner mellett, valamint Párizsban, a
Pasteur Intézetben, Mecsnyikov laboratóriumában
dolgozott. Itt a Pasteur Intézetben a typhus elleni immunitást
tanulmányozva dolgozta ki a specifikus ellenanyagok
keletkezésének „antigén-teóriáját”, amely
szerint a fertőzéssel szembeni immunitás sajátos antigéningerre
jön létre. Az „antigén-teóriát” a tudomány
általánosan elfogadta, nevét azonban nem emlegetik
méltóan. Az első magyar szérumintézetet, a Jenner–
Pasteur Intézetet is ő alapította és vezette. Az első magyar
nyelvű immunológiai összefoglaló munkát, „A
gyakorlati immunizálás tana” címmel 1906-ban szintén
ő írta. 1939-ben Washingtonban (USA) halt meg.
Az 1900-as évek elején sok tudós volt már meggyőződve
arról, hogy az állatok és így az ember vérében
is szabad antitestek sokasága kering. Almroth
Wright (1861–1947) feltételezte és bizonyította,
hogy a specifikus antitestek kötődnek a kiváltó baktériumok
felszínéhez, amely a fagocitózisukat és ezáltal
az elpusztításukat eredményezi. Ezt a folyamatot ő nevezte
el opszonizációnak. Michael Heidelberger
(1888–1991) és Oswald Avery (1877–1955) figyelte
meg először, hogy az antigén kicsapható antitesttel,
és azt is, hogy az antitest fehérje. Astrid Fagreaus
1948-ben fedezi fel, hogy a B-sejtekből képződő plazmasejtek
termelik az antitesteket, az immunglobulinokat.
Az antitestek (immunglobulinok) könnyűláncát
Gerald Edelman és Joseph Gally fedezte fel a
hatvanas évek elején. Gerald Edelman és Rodney
Robert Porter megosztva kapta az orvosi-élettani
Nobel-díjat 1972-ben az antitestek, elsődlegesen az
IgG- és IgM-molekulák szerkezetének kutatásáért.
Az IgA felfedezése Thomas Tomasi, az IgD-é Dawid
Rowe és John Fahey, az IgE-é Kikishige Ishizaka
és Teruki Ishizaka nevéhez kapcsolható. Az

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
105
immunglobulinok termelésének celluláris hátterének
kutatásáért, az immuntoleranca felismeréséért,
pontosabban a klónelméletért az orvosi-élettani Nobel-díjat
1960-ban Frank Macfarlane Burnet
(1915–1985) és Peter Brian Medawar (1915–1987)
kapta. Az immunglobulin-termelés genetikai hátterének
kutatásáért, a variabilitás hátterében lévő génátrendeződés
felfedezéséért Susumu Tonegawa kapott
orvosi-élettani Nobel-díjat 1987-ben. Arra a kérdésre,
hogy melyik a legmeghatározóbb felfedezés és ki
a legjelentősebb felfedező az immunológia terén, lehetetlen
válaszolni! Ma azt kell mondanunk, hogy az
antitestek kutatási, diagnosztikai és terápiás hasznosítása
szempontjából van első, van legkiemelkedőbb
technikai vívmány! Ez – minden kétséget kizáróan
– a monoklonális immunglobulin (antitest) termelés
technikájának kimunkálása, amelyért Niels K. Jerne,
Georges J.F. Köhler és César Milstein kapta
meg az orvosi-élettani Nobel-díjat 1984-ben.
Ami a komplementrendszer felfedezésének rövid
történeti áttekintését illeti, Hans Ernst August
Buchner (1850–1902) német orvos, bakteriológus
volt az első, aki felfedezett egy anyagot a vérszérumban,
amely képes volt baktériumokat elpusztítani.
Ezt az anyagot alexinnek nevezte el, ennek adta később
Paul Ehrlich a „complement” nevet. Jules
Burdet (1870–1961) bizonyította be először, hogy
a vérszérumban lévő, a baktériumokat elölni képes
anyag kétkomponensű. Van egy hőrezisztens és
egy hőérzékeny része. A hőérzékeny frakció az, amit
Ehrlich komplementnek nevezett el. Jackie Stanley
és munkatársai szereztek kiemelkedő érdemeket
a komplementfunkció pontosabb megismerésében,
eszerint a komplementrendszer a specifikus antitestekkel
együtt funkcionál, közösen fejtik ki hatásukat,
de van amikor a komplement egyedül, nem specifikus
módon is hat.
Az immunglobulonok, az antitestek
és a komplementek szerkezete, molekuláris
sajátosságai
Az immunglobulinok szerkezeti sajátosságainak teljes
ismertetése messze meghaladja ennek a könyvnek
a követelményeit és ennek a fejeznek a terjedelmét. Itt
csak a lényegi sajátosságok ismertetésére kerülhet sor.
Az egyik legfőbb közös tulajdonságuk, hogy glikoproteinek.
Előfordulásuk és fizikai állapotuk alapján két
fő csoportba sorolhatók:
• Szabad, oldat fázisban lévő immunglobulinok
(antitestek), amelyek legfőképpen a vérplazmában
és sokkal kisebb mennyiségben, koncentrációban
a különböző testnedvekben, pl. nyálban,
hörgőváladékban stb. vannak jelen.
• Kötött formában bizonyos B-lymphocyta-sejtek
perifériás zónájában, amelyeket ezért felszíni
(sIg) vagy membrán-immunglobulinnak (mIg)
neveznek.
Az alapszerkezet két nehézláncból és két könnyűláncból
diszulfidhidakkal összekapcsolt Y alakú molekula.
Ez a molekula, jóllehet 4 polipeptidláncból összekapcsolt
komplex, mégis monomer (Ig-monomer) a
5-1. táblázat. Az emberi immunglobulinok fizikai-kémiai tulajdonságai
Immunglobulin IgG 1
IgG 2
IgG 3
IgG 4
IgM IgA 1
IgA 2
sIgA IgD IgE
nehézlánc γ 1
γ 2
γ 3
γ 4
μ α 1
α 2
α 1
vagy
α 2
δ ε
nehézláncdomének száma 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5
nehézlánc-molekulatömeg
(kilodalton)
51 51 60 51 65 56 52 52-56 69,7 72,5
molekulatömeg (kilodalton) 146 146 170 146 970 160 160 385 184 188
átlagos szérumkoncentráció (g/l) 9 3 1 0,5 1,5 3,0 0,5 0,05 0,03 0,00005
szénhidrát (%) 2-3 2-3 2-3 2-3 12 7-11 7-11 7-11 9-14 12
(Forrás: Petrányi, Benzúr, Falus: Klinikai Immunológia. 38. old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1988.)

106 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
neve. Az emberi szervezetben fellelhető immunglobulinokban
ötféle nehézlánc (μ, δ, γ, α, ε) és kétféle
könnyűlánc (κ, λ) fordul elő. A nehézláncokban az
aminosavak száma 450–550 között, míg a könnyűláncokban
210–220 között változik. Mivel az emberi
szervezet fehérjéit felépítő 20 aminosav átlagos molekulatömege
100 körül van, az aminosavak számából,
ha megszorozzuk 100-zal, jó megközelítéssel megkaphatjuk
az egyes láncok, sőt az egész immunglobulin-molekula
(Ig-monomer) nagyságát, molekulatömegét
is (5-1. táblázat).
Az összes immunglobulint (antitestet) osztályokba
vagy más néven izotípusokba soroljuk. Az emberi
szervezetben, együtt az összes placentaris emlőssel,
a nehézláncok eltéréséből fakadóan 5 izotípus (osztály)
van, amelyeket nagybetűkkel, ábécésorrendben
a következőképpen jelölünk: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.
Az IgD, IgE és IgG csak monomer formában fordul
elő, az IgA lehet monomer vagy dimer. Az IgM, amely
messze a legnagyobb méretű immunglobulin, pentamer,
azaz 5 monomer egymásba kapcsolódása által
képződött molekulakomplex. Az IgM lehet kötött
formában az effektor B-lymphocyta sejtek felszínén
vagy szabadon a vérplazmában. Azok az immunglobulinok,
amelyek sejtek felszínéhez kötöttek, mint pl.
az IgM és az IgD, tartalmaznak ún. „transzmembrán”
régiót. Azokban viszont, amelyek csak szabadon, oldott
állapotban vannak jelen a vérplazmában vagy a
különböző testnedvekben, nincs „transzmembrán”
régió. Az 5 immunglobulin-osztályon belül az IgG
immunglobulinokat 4 alosztályba (IgG 1–4
), az IgA
immunglobulinokat 2 alosztályba soroljuk. Mivel az
IgA monomer és dimer formában is előfordul (főként
a testnedvekben), háromféle IgA van. Így a teljes immunglobulin
(osztály–alosztály) szám 10(!) (lásd 5-1.
táblázat).
Az immunglobulinok alapegysége, a két nehéz- és
két könnyűláncból felépült immunglobulin-monomer
(Ig-monomer) két fő részből áll, az F ab
(fragment
antigen binding) és az F c
(fragment crystallizable)
régió ból. Az F ab
- és F c
-régió közti szakasz (kapocsvagy
csukló- (hinge-) régió) bizonyos proteázokkal
(pl. papain) széthasítható, és így külön-külön részletesebben
tanulmányozhatók.
Az Ig-monomerek felépítését úgy is vizsgálhatjuk,
hogy külön a nehézláncokat és külön a könnyűláncokat
osztjuk régiókra szerkezetük és funkciójuk alapján.
Így a nehézláncokban is és a könnyűláncokban is
megkülönböztethetünk konstans (állandó) és variábilis
(változó) régiókat. A nehézláncokban a konstans
régió azonos az összes idiotípusú (osztályú) antitestben.
Ami a könnyűláncokat illeti, a két lánctípus (κ és
λ) úgy fordul elő, hogy egy antitestben vagy az egyik,
vagy a másik van jelen, azaz egy monomerben mind
a kettő mindig azonos.
A komplementrendszer (complement system) molekuláris
sajátosságai általánosságban úgy jellemezhetők
mint proteázkaszkád, amely az immunreakció,
az antigén-antitest kapcsolódás hatására aktiválódik.
Különös jelentősége van fertőző ágensek (baktériumok,
vírusok) elpusztításában. A komplementrendszer
tagjai különböző nagyságú, molekulatömegű
fehérjék. Elsődlegesen a máj termeli ezeket, de más
sejtekben is, pl. macrophagokban, monocytákban,
a gyomor-bél és az urogenitalis traktus epithelialis
sejtjeiben is termelődnek. Stimulus nélkül nyugalmi
(proprotein) állapotban keringenek a vérben. Mai ismereteink
szerint több mint 25 fehérje alkotja a teljes
rendszert. Az aktiválásnak 3 útját különböztetjük
meg:
• Klasszikus út.
• Alternatív út.
• Mannózkötő lektinindukált út.
Mivel a komplementrendszer valójában proteolitikus
rendszer, az enzimek között lenne/lehetne a helye.
Azért került mégis ide, az immunglobulinokhoz,
mert a szervezetet külső hatásoktól, elsődlegesen fertőzésektől
védő mechanizmushoz tartozik.
Az immunglobulinok, az antitestek
és a komplementrendszer funkciói
Az antigénstimulusra aktivált B-sejtek, a B-lymphocyták
antitesttermelő plazmasejtté vagy memóriasejtté
differenciálódnak. Az utóbbiak „emlékeznek” az
antigénre, így a következő találkozáskor gyorsabb és
intenzívebb védekezésre lesz képes az egész szervezet.
A termelőkből, a plazmasejtekből, a szintézis helyéről
kikerült antitestek szabadon úsznak a véráramban, az
oldott antitestek a „humorális immunitás” (védekezés)
legmeghatározóbb szereplői.

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
107
5-2. táblázat. Az emberi immunglobulinok funkcionális tulajdonságai
Immunglobulin IgG 1
IgG 2
IgG 3
IgG 4
IgM IgA IgD IgE
komplementaktiválás (klasszikus út) + + + +++ - +++ - - -
átjut a placentán + + + - - - -
monocytához kötődik + - + - - - - +
granulocytához kötődik + - + + - + - -
hízósejthez kötődik - - - - - - +++
lymphocytához kötődik + + + + + + - +
thrombocytához kötődik + + + + - - - ?
(Forrás: Petrányi, Benzúr, Falus: Klinikai Immunológia. 46. old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1988.)
Az antitestek 3 módon vesznek részt a szervezet
védekezésében:
1.) Kötődnek a fertőző ágensekhez megakadályozzva
belépésüket és elszaporodásukat a szervezetben.
2.) Stimulálják a macrophag, a fagocita és más
sejteket a patogénnek eltávolítására 3.) Beindítják a
patogén destrukcióját, lebontását elvégző rendszereket,
pl. a komplementrendszert. Az egyes immunglobulinokra
lebontva az antitestek funkciói az 5-2.
táblázatban vannak összefoglalva.
A komplementrendszer konkrét funkciója többrétű.
Először is meg kell említeni az „opszonizációt”,
ami elősegíti az antigén, a patogén kórokozó fagocitózisát.
A kemotaxis az a mechanizmus, amely a macrophagok
és a neutrophil leukocyták mozgósítását
stimulálja. A lízis maga a kórokozók feloldását, szétroncsolását
jelenti. A komplement vírusok molekuláris
struktúráját képes megváltoztatni, és így az antigenitás
megváltoztatásával a védekezést hatékonyabbá
teheti.
Az immunglobulinok és az antitestek
vizsgálata
Az immunglobulinok és az antitestek funkcióira irányuló
vizsgálatok (A típusú). Az egész terület részletes
leírása több kézikönyv terjedelmű lenne. Az antitestek
funkcióira irányuló vizsgálatok ma egy külön
tudományterületet, magát az immunológiát jelentik.
Az immunológia ma már teljes önálló tudományterület,
amelynek kutatási, diagnosztikai és terápiás oldala
egyaránt van. Azok a vizsgálatok, ahol antitesteket
különböző molekulák azonosítására, vérben, szövetnedvekben,
sejtekben, sejtek felszínén az antigén kimutatására,
mennyiségi meghatározására használunk,
több kutatási területetet, több orvosi diszciplínát érint.
Ezek: laboratóriumi medicina, patológia, mikrobiológia.
Ma, a monoklonális antitesttechnika bevezetése
óta, mindhárom diszciplina kutatási és diagnosztikai
tevékenységében az antigénmolekulák felismerése,
meghatározása – az immuntechnológia elvének alkalmazása
által – egyike a legfontosabb módszereknek.
Mindebből következik, hogy itt, ebben a fejezetben
csak röviden, az elvek rövid ismertetésével lehet az antitestekre
funkcióik alapján irányuló vizsgálatokról (A
típusú vizsgálatok) szólni, illetve azokról a vizsgálatokról,
ahol célzatosan termelt monoklonális antitesteket
használnak az antigénmolekulák azonosítására, mérésére
(B típusú vizsgálatok).
• Az antitestek vizsgálatánál elsőként az egyes
osztályokba tartozó immunglobulinok mennyiségi
meghatározását említhetjük (A1-es vizsgálat).
Ezekhez a mérésekhez az osztályokba tartozást
meghatározó nehézlánc konstans régiója
ellen termelt ellenanyagot használunk. Maga a
meghatározás valamelyik immunkémiai módszer.
A mérési eredmény a humorális immunstátus
állapotáról adhat általános, nem specifikus
információt. Bizonyos betegségekben, pl.
egyes májbetegségekben diagnosztikai értékű is
lehet, ill. a betegség súlyosságáról is informálhat
az IgA, IgM, IgG immunglobulin-osztály menynyiségi
meghatározása.

108 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
• Immunszerológia vagy egyszerűen csak szerológia
(serology; A2-es vizsgálat). A szerológia az
immunológia tudományágának egyik részterülete.
Összefoglaló neve azoknak a vizsgálatoknak,
ahol diagnosztikai céllal (lehet kutatási
céllal is) az antigén-antitest kapcsolódást, az
antitesteket, az antigén-antitest komplexumokat
határozzák meg. Konkrétan a szerológia keretében
azt vizsgáljuk, hogy van-e speciális ellenanyag,
antitest és immunkomplex jelen a vérplazmában
vagy bármely testfolyadékban egy
speciális antigén ellen. Az antigén lehet bármely
kórokozó, vírus, baktérium, gomba, parazita
stb., de lehet csupán idegen fehérje- vagy nem
fehérje molekula is. Bizonyos patológiás állapotokban,
pl. az autoimmun betegségekben saját
molekulák, fehérjék és nem fehérje molekulák is
lehetnek antigének, amelyek ellen ellenanyagok
(antitestek, immunglobulinok) termelődnek.
Az immunreakció, vagyis az antigén-antitest kapcsolódás
felismerése, kimutathatósága, bizonyíthatósága
módszertani értelemben elsődlegesen attól függ,
hogy az antigén alakos (korpuszkuláris) elemen
van-e, vagyis szuszpenzió formában van-e jelen a
kérdéses mintában, vagy oldottan, valódi oldat fázisban.
Az alakos elem természetesen lehet sejt vagy
más, mint pl. latexszemcse, amelyre az antigén rá van
kötve. Az antitest az antigént magán viselő (prezentáló)
alakos elemeket képes egymáshoz kapcsolni, azaz
a szuszpendált (lebegő) állapotból csapadékká formálni.
Ezt az átalakulást agglutinációnak nevezzük.
Amikor valódi oldat fázisban lévő antigént kapcsolnak
az antitest molekulák csapadékká, precipitációról
beszélünk! Direkt agglutinációról, precipitációról
vagy egyáltalán immunreakcióról beszélünk, amikor
egyetlen antitest vesz részt a reakcióban, ez általában
az IgM antitestek esetében van így. Indirekt a reakció,
amikor második antitest hatására következik be az
agglutináció, precipitáció vagy csak az immunreakció
detektálása. Az agglutináció aktív, ha az antigén eleve
rajta vagy benne van a sejt perifériás zónájában, a
membránjában vagy más alakos elem felszíni rétegében.
Passzív agglutinációról akkor beszélünk, ha valamilyen
alakos elemhez (pl. latexszemcse) mi magunk
kötjük az antigént. Az agglutinációt és a precipitációt
különböző tényezők befolyásolják. Így a hőmérséklet,
a pH, az inkubációs idő, az antigén-antistest arány, az
ionerősség, a különböző felületaktív (detergens természetű)
molekulák jelenléte stb. Az antigén-antitest
arányban van „kritikus arány”. Ez az az arány, amikor
az agglutináció, ill. a precipitáció bekövetkezik.
A „kritikus arány” bizonyára a víz miatt van, hiszen a
víznek, a fehérjék vízburkának meghatározó szerepe
van az antigén-antitest kapcsolódásban. Sajnos azonban
a részletek itt sem pontosan ismertek.
Az agglutináción alapuló tesztek, vizsgálatok – teljesség
nélkül – a következők:
• Vércsoport-szerológia.
• Bakteriális antigén-antitest vizsgálatok.
• Autoantitestek kimutatása.
• Különféle hemagglutinációs tesztek.
• Coombs-teszt.
• Latexszemcsékhez kötött antigének és antitestek
alkalmazása stb.
A precipitáción alapuló szerológiai tesztek is sokfélék.
Részletes leírásuk a módszertani részben található
meg. Itt csak rövid felsorolásukra kerülhet sor:
• Mancini-technika.
• Ouchterlony-módszer.
• Immunelektroforézis.
• Immunfixáció.
• Rakéta-immunelfo stb.
A szuszpendált (lebegő) állapotban maradó immunkomplexek
direkt vizsgálata általánosságban a nefelometria
(fényszórás) elvének alkalmazásával
lehetséges. Külön érdemes megemlíteni a „lézer-nefelometriát”
és a turbidimetriát. A fluoreszcens polarizáció
elvén alapuló technikák is a lebegő immunkomplexek
közvetlen vizsgálatát jelentik. Fontos
megjegyezni, hogy ezek a módszerek, ezek a technikák,
ahol a lebegő, szuszpenzióban maradó antigén-antitest
komplexek direkt vizsgálatára kerül sor,
nem kizárólagos szerológia (A2) módszerek, hanem
széles körben alkalmazhatók és alkalmazzák őket a
speciálisan termelt monoklonális immunglobulinokat
felhasználó (B típusú) vizsgálatokhoz is.
A szerológiai vizsgálatokhoz (A2) kell sorolni azokat
az immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálatokat
is, ahol direkt vagy indirekt módszerrel mik-

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
109
roszkópos preparátumokon vizsgáljuk az antitestek
specifikus kötődését bizonyos sejtorganellumokban
lévő antigénekhez.
Az antitestek molekulafelismerő funkcióit felhasználó
vizsgálatok (B típusú). Mint előbb már említettük,
részben ide tartoznak a szuszpendált állapotban
maradó immunkomplexeket vizsgáló nefelometria,
turbidimetria, és a fluoreszcens polarizáción alapuló
eljárások alkalmazhatók a speciálisan termelt monoklonális
immunglobulinokat felhasználó (B típusú)
vizsgálatokhoz is.
A különböző ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay)
technikák, a RIA (radioimmunoassay)
módszerek, a magas érzékenységű „immunochemiluminescence”
technikák döntően nem a szerológiai
módszertani arzenálhoz tartoznak, vagyis már szorosan
nem az immunológia területének, hanem sokkal
nagyobb arányban az általános laboratóriumi diagnosztikának,
a klinikai biokémiának a módszerei. Hiszen
céljuk nem a vérben fellelhető speciális antitestek
kimutatása, meghatározása, hanem az antigének, a kis
koncentrációban jelen lévő peptidek, hormonok, szerves
molekulák pontos mérése a feladat. Így e technikai
eljárásokat az immunmódszerek B típusánál alkalmazzák,
vagyis ott, ahol a vizsgálatot végző termel magas
specificitású monoklonális ellenanyagot, antitesteket
pontosan azzal a céllal, hogy nagy érzékenységgel és
specificitással tudja az antigént meghatározni, akár
diagnosztikai, akár kutatási célra.
Külön csoportba tartoznak az ún. blott, immunoblott
technikák. Közülük ki kell emelni a kétdimenziós
poliakrilamid-gélelektroforetikus elválasztást követő
immunoblottot. A lényeg, hogy a nagyfelbontású kétdimenziós
poliakrilamid-gélelektroforézis gyakorlatilag
individuális fehérjék elválasztását teszi lehetővé.
Ha az elválasztott egyedi fehérjéket harmadik dimenziós
elektroforézissel nitrocellulózmembrán felszínére
viszik, a speciális monoklonális ellenanyaggal az
egyes fehérjék közvetlen detektálása végezhető el.
*
A komplementrendszer funkcionális vizsgálata valójában
a szerológia tárgykörébe, s így az immunológia
területére tartozik. Részletesebb ismertetésére a
könyv más fejezetében kerül sor.
Motorfehérjék, kontraktilis fehérjék,
intracelluláris vázfehérjék (citoszkeleton)
Történeti áttekintés
Az ember ősidőktől észlelte, tudta, hogy önmaga és
minden más élőlény is, különösen az állatok – szemben
az élettelen anyagi világ szereplőivel – mozognak.
Olyannyira, hogy a mozgás maga az élet meghatározója
lett(!) Él, ami önmagában, önmagától mozog! A
legelső mikroszkópos megfigyelések, amelyeket Antoni
van Leeuwenhoek (1632–1723) végzett, azt
bizonyították, hogy körülöttünk a vizekben és bennünk
parányi, szabad szemmel nem látható, önmaguktól,
önmagukban mozgó létezők, élőlények (protozoonok,
spermiumok, baktériumok stb.) vannak.
Azt is korán felismerték az emberek, hogy a nagyobb
(soksejtű) élőlényeknek, az állatoknak és természetesen
önmagának, az embernek mozgásához külön
szerve van. Ez az izomzat, ami egyben mint hús a legfőbb
tápláléka is az embernek.
Arra a kérdésre azonban a válasz, hogy pontosan
milyen anyag/anyagok és milyen mechanizmus felelős
az izomzat működéséért, az izomzat vezérelte
mozgásokért, a negyvenes évekig gyakorlatilag teljesen
ismeretlen volt. Nagy büszkeséggel kell minden
magyar embernek, minden magyar diáknak fogadnia
azt a tényt, hogy az izomműködésért felelős
anyag, molekulák és a mechanizmus átfogó kutatását
először magyar kutatócsoport kezdte el és ért el kimagasló
eredményeket. 1940–1945 között Szegeden.
Szent-Györgyi Albert – miután a C-vitaminnal
kapcsolatos kutatásaiért 1937-ben megkapta az élettani-orvosi
Nobel-díjat –, munkatársaival együtt új
területre, az izomkutatásra tért át. Bízvást lehet állítani,
hogy 1938-1945 között Szeged, pontosabban
Szent-Györgyi Albert intézete a Szegedi Tudományegyetemen
volt a világ izombiokémiai kutatásának
legjelentősebb központja [1]. Igaz, a miozin
felfedezése sokkal korábbra, 1864-re tehető, és Wilhelm
Kühne nevéhez köthető [2], és az is igaz, hogy
a bizonyítékot arra, hogy a miozin ATP-áz funkcióval
rendelkezik, nem ők, hanem Engelhardt és Lyubimova
fedezte fel [3], Szent-Györgyi Albertnek és
munkatársainak munkája, eredeményei örökérvényű
mérföldkövek az izom, az izom biokémiája, a kontraktilis
fehérjék kutatása, megismerése szempontjá-

110 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
ból. Az aktomiozin izolálása, majd a miozin mellett a
kontrakcióért felelős másik fehérje, az aktin felfedezése,
sőt a névadás maga Szent – Györgyi Albertnek
és munkacsoportjának, az aktinkutatás tekintetében
kiemelten Straub F. Brúnónak tulajdonítható. Ők
fedezték fel azt is, hogy az aktin monomer, a G-aktin,
a közeg ionerősségétől függően polimerré, F-aktinná
alakul.
Az izomkutatás a II. világháború után Szegeden
ugyan megszakadt, de a világ számos kutatóintézetében,
laboratóriumában tovább folytatódott és ma
is nagy intenzítással folyik. A kutatások egyszerre
terjednek ki a szervek, a szövetek (harántcsíkolt,
sima- és szívizom), a molekulák és a mechanizmusok
megismerésére. A miozin–aktin–ATP rendszer
megismerése mellett az ionizált kalciumot reguláló
troponinok, a tropomiozin megismerése, a 200-at
meghaladó aktinkötő fehérje (aktin-binding proteins)
leírása, a mioglobin és az elaszticitás biztosításáért
felelős óriási fehérjemolekula, a titin felfedezése
a legjelentősebb. Külön ki kell emelni azt a lényegi
felismerést is, hogy aktin nem csak az izomsejtekben,
hanem minden élő sejtben jelen van! Az izom-öszszehúzódás,
az izomkontrakció mechanizmusára, bár
más elméletek is léteznek, bizonyos módosításokkal
a Huxley, Nidergerke és Hanson által kidolgozott
csúszó filamentum modell a legelfogadottabb [4].
Az élő sejtek belső vázfehérjerendszerének kutatása,
sőt diagnosztikai célú vizsgálata az elmúlt 50 évben
a fehérjebiokémia, a fehérjeanalitika egyik jelentős
területévé lett. Az élő sejtek belső fehérjevázát, a
citoszkeletont három fehérjecsoport építi fel:
• Mikrotubuláris rendszer.
• Intermedier filamentumrendszer (közti; 100
Å-ös).
• Aktinfilamenentumok, a mikrofilamentumok
rendszere.
Nem-ionos detergensekkel kezelve egyrétegű (monolayer)
sejtkultúrák sejtjein a vázfehérjerendszer egyes
alkotóelemei ellen termelt ellenanyagokat használva,
indirekt immunfluoreszencia technikával a háromdimenziós
vázrendszer jól detektálható. Mivel detergenskezelés,
vagyis a monomerek eltávolítása után
lehet a filamentumokat jól látni, a sejtvázat detergensrezisztens
citoszkeletonnak szokás nevezni. Az igazság
érdekében meg kell említeni, hogy a sejtmagokat a
környezethez kipányvázó detergensrezisztens citoszkeletont
mi láttuk és írtuk le elsőként a világon Pécsett
[5]. A kontraktilis fehérjék kutatásának legújabb
és leggyorsabban bővülő területe a „molekuláris motorok“,
a „motorproteins“ kutatása, vizsgálata.
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék
és a citoszkeletonfehérjék szerkezete,
molekuláris sajátosságai
A kontraktilis és a motorfehérjéket ma egységes rendszerben
lehet és érdemes vizsgálat alá venni: a molekuláris
motoroknak több típusát különítik el:
• Aktin alapú motorok.
• Mikrotubuláris filamentum alapú motorok.
• DNS alapú motorok.
• Rotációs motorok, baktériumokban.
• Mechanoenzimek.
Aktin alapú motorok
Az aktin alapú motorok a miozinmolekulákkal képeznek
működő molekuláris motorokat. Az aktin,
ahogyan vizsgálni tudjuk, 42 000 dalton (42 kDa)
molekulatömegű globuláris fehérje (G-aktin). Fiziológiás
ionerősség mellett in vitro is polimerré, F-aktinná
alakítható.
Ma az aktint tekintjük az egyik legősibb, leggyakrabban
előforduló és legtömegesebb fehérjének az
egész élővilágban. Gyakorlatilag minden élő sejtben
előfordul, és a sejt össz-fehérjetartalmának 15%-át
vagy még nagyobb hányadát teszi ki. Jelenlegi tudásunk
szerint minden sejtben monomer (G-aktin) és
polimer (F-aktin) formában is jelen van. Az F-aktin
a nem izomsejtekben mikrofilamentum formában, az
izomrostokban vékony, 9 nm (90 Å) filamentum formában
van jelen. Az aktinkötő fehérjék (actin-binding
proteins, ABP) száma rohamosan növekszik. A
Wikipedia (free encyclopedia) 2010. november 8-i
közlésében az ábécé betűi alatt több mint 280 speciális
aktinkötő fehérje van felsorolva. Az izom funkciója,
a kontrakció, az aktin alapú motorfehérje munkája
szempontjából a miozin a legjelentősebb az aktinkötő
fehérjék közül. Ezért itt részletesen csak a miozin
molekuláris sajátosságait ismertetjük. Csak felsorolásszinten
azért érdemes néhány egyéb, ismertebb
aktinkötő fehérjét megemlíteni: aldoláz, angiogenin,
annexin, brevin (gelzolin), kalpain, kaldezmon, disztrofin,
endosszin, fondrin, fimbrin, glikogenin, gluko-

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
111
kináz, hexokináz, hsp 70, integrin, inzertin, kaptin,
miopodin, myelin basic protein, nebulin, neurokalcin,
plasztin, p53, protein-kináz C, porin, rapszin,
szinaptopodin, szpektrin, titin, tau, utrofin, vinkulin,
villin, WASp, cipper protein stb.
Ahogy a kontraktilis fehérjék történeti leírásánál
korábban említettük, a miozin (myosin) volt az első
fehérje, amelyet az izom kontraktilis apparátusából
izoláltak, megismertek [6]. A harántcsíkolt izomból
izolálható miozin, amely az izom alegységében, a
miofibrillumban vastag (15 nm, 150 Å) filamentum
formában van jelen, 520 kDa nagyságú fehérjekomplexum.
Ma a miozinról azt kell tudni, hogy nem egységes
összetett fehérje, hanem nagyon sokféle miozin
van. Az alegységek felépítettsége, aminosavszekvenciája
alapján több mint 100 féle miozint különböztetünk
meg. E nagyszámú miozint nehézláncaik
aminosav-összetétele alapján családokba osztjuk.
Jelenleg 18 miozincsaládot különböztetünk meg, és
azokat, római számmal jelöljük. Azt, amelyet elsőként
haráncsíkolt vázizomból izoláltak (a 520 kDa nagyságú
miozin), a II. családba sorolták be, és a miozin II.,
ill. konvencionális miozin nevet kapta. Ennek a besorolásnak
az a „logikája“, magyarázata, hogy a harántcsíkolt
izomból izolált miozinnak két „fejrésze“ van,
miközben a nem izomsejtekből izoláltnak egy. Ebből
következett, hogy a nem izomsejtekből izolált „egyfejű“
miozin került az I. osztályba miozin I., „nem konvencionális“
miozin néven. A miozinokat alapvetően
3 részre osztjuk: fej, nyak, farok. A fejrész tartalmazza
az ATP-kötő helyet, az ATP-áz centrumot és az aktinkötő
helyet. A nyaki rész a flexibilitást adja. Különböző
könnyűláncok kapcsolódnak ide, ill. itt van a
kalmodulin (Ca 2+ -regulátor) fehérje kapcsolódási helye
is. A farki rész molekuláris összetételének eltérései
miatt térnek el az egyes miozin-molekulacsaládok. A
miozin II., a konvencionális miozin, amely időben és
mélységében a legismertebb, két (220 kDa) nehézláncot
(egyenként 2000 aminosavat) és négy könynyű-
(20 kDa) láncot tartalmaz, így 520 000 dalton
(520 kDa) nagyságú. Az aktin alapú motorok, mint
általában a molekuláris motorok, közvetlenül in vitro
kísérleti körülmények között vizsgálhatók. Történetileg
először aktinfilamantumokon miozinnal fedett
gyöngyök mozgását követték. Manapság inkább miozinnal
fedett tárgylemezen aktinfilamentumok (F-aktin)
mozgását tanulmányozzák.
Mikrotubuláris alapú motorok
A mikrotubuláris rendszer a citoszkeleton fontos
összetevője. Rajta mint „sínpályán” kétféle motorfehérje
mozgását írták le az élő sejteken belül és in vitro
kísérleti feltételek között. Ezek a dineinek és a kinezinek.
Magáról a „sínpályáról”, a tubuláris rendszerről,
annak molekuláris sajátosságairól azt kell tudni, hogy
két közel azonos, 50 kDa nagyságú alegységből, α- és
b-tubulinból felépült, 25–30 nm átmérőjű csavarodott
csőrendszer.
A dineinmotorok felelősek a ciliumok és a flagellumok
mozgásáért. A dinein (dynein) fehérjecsalád
összetételében és szerkezetében eltér a miozinoktól.
1000–2000 kDa nagyságú óriás molekulakomplex,
ATP-áz funkcióval rendelkezik, azaz az ATP-vel közölt
energiát használja a mikrotubuláris kábelén,
„sínpályáján” való mozgáshoz, ami a ciliumok és a
flagellumok mozgását biztosítja.
Az elmúlt évtizedekben vált ismertté, hogy a mikrotubuláris
rendszernek fontos szerepe van minden
eukarióta sejtben a vezikulumok és a különböző organellumok
mozgásában, és ezeket a mozgásokat a
kinezinmotorok vezérlik. Különösen jelentős a vezikulumok
transzportja a neuronokban, ahol akár egy
méter távolságot is meg kell tenni a transzport során.
Az in vitro technikák alkalmazásával sikerült a vezikulák
és a sejtorganellumok mozgatásáért felelős kinezin
motorfehérje-családot mélyebben megismerni.
A kinezinmolekula két 110 kDa nagyságú nagyobb és
két 70 kDa nagyságú kisebb fehérjéből áll. Alakját tekintve
hosszúkás, hossza 110 nm. Van mikrotubuláris
kötő- és organellum-, ill. vezikulum kötőhelye, és
mint a motorfehérjék általában, ATP-áz aktivitással
rendelkezik.
DNS alapú motorok
A DNS alapú mechanoenzimek mint motorfehérjék
kutatása, motorként való elfogadása teljesen új.
Maguk a polimerázok, az izomerázok, a girázok mechanikai
munkát végeznek. A puszta tényt ismerte a
tudomány korábban is, de hogy maga a mechanika, a
működő erő közvetlenül analizálható, valóban teljesen
új. Az új technikák tették, teszik ezt lehetővé.
Rotációs motorok
A rotációs motorok a prokariótákban, a baktériumokban
működő motorok. A baktériumok ostoraik-

112 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
kal (flagellum) mozognak. A flagellumokban a filamentumok
53 kDa nagyságú flagellin alegységekből
épülnek fel. A baktériumok ostoraiban működő motor
teljesen eltér az eukarióták flagellumaiban vagy
ciliumaiban működő motoroktól (lásd a spermiumok
vagy a bronchialis csillók mozgását). Először
is az energiát nem ATP, nem ATP-áz enzim aktivitás
adja. Nem belső része a sejteknek, hanem „extracelluláris”
képződmény. A motor hatékonyságára
jellemző, hogy a baktériumsejt energiájának csupán
1%-át használja ostorának mozgatására. A baktérium
haladási sebessége viszont meglehetősen nagy, 25
μm/s. Méretére vetítve és az emberrel összehasonlítva
a baktérium mozgásával azonos sebesség azt jelentené,
hogy a 100 m-es síkfutást az embernek 5,5 másodperc
(s) alatt kellene teljesítenie. A baktériumok
ostoraiban „protonvezérelt” motor végzi a munkát. A
protongradiens, a protonáram rotációs mozgássá változik.
A hogyanra(?) biztos ismeretünk nincs, de több
elméletet is kialakítottak.
Mechanoenzimek családja
Az ötödik motorfehérje-féleség. Elsődlegesen a
szintézisnél, a riboszómákban írták le az ilyen motorfehérje-működést.
Teljesen új, de kétségbevonhatatlanul
igaz, és még sok újabb és újabb ismeretet ígérő
gondolkodást kíván a fehérjeszintézist, a transzlációt
mechanikai eseménynek is tekinteni. Ugyancsak helyes
mechanikai eseményként felismerni, vizsgálni a
DNS és az RNS enzimatikus hasítását, pl. a restrikciós
endonukleázok hatásmechanizmusánál, de valamennyi
proteolitikus hasításánál is. Új világ tehát a
molekuláris mechanika, a molekuláris motorok kutatása
és új szemléletet is igényel tőlünk is az élő sejtet
nem csak kémiai és fizikai rendszernek, hanem dinamikusan
működő mechanikai(!) molekuláris gépezetnek
is tekinteni.
tárgyalni. A motorfunkció, a mechanika mikéntjére
sok elképzelés van. Ezeknek ismertetésére azért sem
kerül itt sor, mert ma még nyilvánvalóan bizonytalan
és terjedelmes is. Maga az energia, az ATP-áz, a makroerg
foszfát emlegetése is ismeretnek hangzik, holott
a puszta szavak évtizedek óta nem visznek közelebb
a mechanizmus mélyebb megismeréséhez. Tehát úgy
helyes elfogadni, hogy a funkció leírására az előző két
alfejezetben már sor került, hiszen tényszerűen jelenleg
többet állítani nem lehet.
A kontraktilis fehérjék,
a motorfehérjék és a citoszkeletonfehérjék
funkcióira irányuló vizsgálatok
A soksejtű élőlények, elsődlegesen az állatok és természetesen
az emberek mozgásának szerv szintű
vizsgálata több tudományterületet érint. Ezek a
vizsgálatok kiterjednek a vázizom funkciójának, teljesítőképességének
vizsgálatára. A szívműködés, a
szívizom-kontrakció vizsgálata a kardiológia tárgykörébe
tartozik. Azoknak a szerveknek a vizsgálata,
amelyekben a mozgást simaizomsejtek összehangolt
működése adja, a fiziológia és az orvoslás különböző
ágazataihoz tartozik.
Az egyes sejtek mechanikájának vizsgálata nyilvánvalóan
olyan speciális mikroszkópos technikához
kötött, ahol az élő sejtek közvetlenül és folytonosan
tanulmányozhatók. Ilyen a fáziskontraszt-mikroszkópia,
az interferenciamikroszkópia, a fluoreszcens
mikroszkópia és a konfokális mikroszkópia is.
Az izolált fehérjék mechanikájának közvetlen vizsgálata
teljesen új világ. Kimondottan a kutatás világa!
Lézer alapú és fluoreszcens technikai eljárások szellemes,
sokszor egyéni ötvözete adja itt a módszertani
arzenált.
A kontraktilis fehérjék, a motorfehérjék
és a citoszkeletonfehérjék funkciói
A történeti részben és a molekuláris sajátosságok leírásánál
is azt kellett, azt lehetett észrevenni, hogy a
fehérjekutatás teljesen új területéről van itt szó. Új
szemlélet, új kutatási módszerek. Éppen ezért se a
történeti leírást, se a molekuláris sajátosságokat nem
lehetett a funkció leírása, a funkcióra utalás nélkül
Enzimek, biokatalizátorok
Az enzimekkel foglalkozó tudományterületet enzimológiának
nevezzük. Az enzim másik, szinonim,
alternatív neve „biokatalizátor”. Molekuláris természetüket
tekintve az enzimek fehérjék. Ezen állítás
igazságtartalmán semmit sem változtat az, hogy bizonyos
kísérletekben az RNS-ek enzim sajátosságát
ismerték fel. Ennek alapján az enzimaktivitást mu-

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
113
tató RNS-eket ribozimnak nevezték el. A „biokatalizátor”
elnevezés jól kifejezi, hogy az enzimek kémiai
reakció kat befolyásolnak, serkentenek, gátolnak vagy
maguk hajtanak végre. Amikor igaz állításnak fogadjuk
el, hogy minden enzim fehérje, érdemes megvizsgálni
az állítás fordítottját is. Azt, hogy igaz lehet-e,
hogy minden fehérje enzim? Látva a sokféle fehérje
sokféle funkcióját, elsőre a válasz egyértelműen nem!
Nem minden fehérje enzim – állítanánk, azonban jól
kell tudnunk, hogy egy fehérje a léte során többféle
funkciót is betölthet, különösen, amikor darabolódik.
Más a funkciója egészben, mint darabolódás után.
Ismert, hogy szintéziskor minden kialakuló peptidlánchoz
ATP kapcsolódik. Ez jól bizonyított az ún.
elongációs fázisban. Az új peptidlánchoz kapcsolódó
ATP „sorsa” háromféle lehet:
• Hasítatlanul lekerül a láncról.
• Elhasítódik és a foszfát a láncon kötve marad.
• Elhasítódik és az ADP marad a fehérjéhez
kötve.
Bármelyik történik is, maga a fehérjelánc részt vesz a
reakcióban, vagyis valamilyen módon katalizálja azt.
Ebből a tényből fakad, hogy a léte során legalább egyszer,
a kezdetnél minden fehérje enzimként is viselkedik.
Tehát helyes úgy tekintenünk minden fehérjére,
hogy általános tulajdonságuk, ATP-kötő képességük
miatt, mindegyik képes enzimként is viselkedni.
Történeti áttekintés
Minden kétséget kizáróan Louis Pasteur (1822-
1895) francia mikrobiológus és kémikus volt az első,
aki a cukor alkohollá erjesztését tanulmányozva bebizonyította,
hogy az élesztőgombákból származó
anyag, amit fermentnek nevezett, felelős a fermentációért.
Wilhelm Kühne (1837–1900) német élettanász
volt az első, aki az enzim elnevezést („élesztőből”
– görögül ένζυμο) használta. Eduard Buchner
(1860–1917) bizonyította és közölte elsőként (1897),
hogy az élesztősejtek jelenlétére nincs szükség, hogy
a sejtekből származó anyag, amelyet „sucrose zymase”-nak”
nevezett, végrehajtsa a cukor → alkohol átalakítást.
E felfedezéséért, nevezetesen azért, hogy
elsőként írta le a sejtmentes fermentációt, kémiai
Nobel-díjat kapott 1907-ben. Ezt követően a XX.
századot a biokémia, az élővilág kemizmusát feltáró
tudomány századának szokták tekinteni, ami viszont
elsődlegesen az enzimeknek, a biokatalizátor
fehérjéknek a kutatását, megismerését, felfedezését
jelentette. Az elnevezés, az enzimek nómenklatúrája
egyszerűen a szubsztrátmolekula neve, amelynek
valamilyen átalakulását segíti elő, serkenti, az „áz”
képzővel kiegészítve.
Az enzimek, biokatalizátorok molekuláris
sajátosságai
Az a meghatározás, hogy az enzimek fehérjék, egyértelműen
meghatározza molekuláris sajátosságaikat.
Egyszóval az enzimek sokfélék (heterogének). Valóban
a legegyszerűbb fehérjétől, 50–100 aminosavból
felépült peptidtől (lásd bizonyos proteázok és a restrikciós
endonukleázok) a sok-sok alegységből felépült
és nem fehérje alkotókat (pl. nyomelemeket)
is tartalmazó, többszázezres molekulatömegű óriás
molekulakomplexekig, mind, mind előfordulnak az
élővilágban. Viszont érdemes az enzimeket, mint
ahogy az összes fehérjét, termelődésük logikai rendjében
megvizsgálni. Különösen érdemes ezt a logikai
rendet követni a diagnosztikus célú enzimológiában.
Mint minden fehérjét, az enzimeket is, élő sejtek termelik.
Tehát az enzimek az élő sejt produktumai. A
második fontos logikai állítás, tény, hogy az élő sejt az
enzimeket is, mint minden fehérjét, két célból termeli.
Saját használatra, saját alkotóelemének vagy „exportra”,
azaz sejten kívüli felhasználás céljából termeli.
Mivel a diagnosztikai célú vizsgálatokhoz a minta
általában a vérszérum vagy a vérplazma, fontos tudni,
hogy a vizsgálni kívánt enzim vagy bármely fehérje
a két lehetőség közül hova tartozik. Azért termelődött-e,
hogy magának a sejtnek alkotórésze legyen,
vagy azért, hogy a sejten kívül végezzen katalitikus
vagy bármilyen más funkciót? A sejtalkotók ugyanis
csak a sejtek elhalása vagy haldoklása, áteresztővé
válása idején jutnak az extracelluláris teret jelentő
vérplazmába, a külső hasznosulásra termelt fehérjék
viszont fiziológiai úton választódnak ki (szecernálódnak)
a termelő sejtekből. A vérplazmában vagy a
vérszérumban mért aktivitásuk vagy koncentrációjuk
jól értékelhető információt ad a termelő sejtek állapotáról.
Azok az enzimek és más fehérjék, amelyek
amúgy sejtalkotók, magasabb aktivitással, magasabb
koncentrációban lesznek jelen a plazmában, amikor a

114 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
termelő sejteknek fokozott a károsodottsága, fokozott
az elhalási rátája, míg a külső használatra termelteké
ilyenkor alacsonyabb.
Az enzimek funkciói
A pontosabb eligazodás érdekében a funkciók alapján
a beláthatatlanul sok enzimet 6 osztályba soroljuk.
Az osztályokon belül vannak csoportok, majd
maguk az egyes enzimek.
Az egyes enzimosztályokat az 5-3. táblázat tartalmazza.
Már a XX. század kezdetén kimutatták, hogy az
enzimreakciók nem egyszerű másodrendű reakciók.
Több megfigyelésből azt a következtetést vonták
le, hogy az enzim komplexet kell hogy képezzen a
szubsztrátjával mielőtt átalakítja. A legegyszerűbb,
két egymást követő lépésből álló enzimfolyamat feltételezett
mechanizmusát és kinetikáját Michaelis
és Menten írta le 1913-ban. Az igazsághoz hozzátartozik,
hogy Victor Henri (1849–1933) volt az első,
aki 1902-ben kidolgozott egy kvantitatív enzimkinetikai
elméletet, a teljes bizonyosságot azonban a német
kémikus, Leonor Michaelis (1875–1949) és az
ő fiatal kanadai munkatársa, Maud Leonora Menten
(1879–1960) adták. Éppen ezért helyesebb Henri–Michaelis–Menten
enzimkinetikának, mint csak
Michaelis–Menten kinetikának nevezni. Ezen elmélet
szerint a legegyszerűbb enzimreakció a következő
egyenlettel írható le:
k 1
k 2
E+S ES E+P
k –1
–
E az enzimet, S a szubsztrátot, P az enzimreakció
termékét (a produktumot) jelenti. A nyilakhoz írt
sebességi állandók indexébe írt szám a reakciólépés
számát, előjele a reakció irányát jelöli. Általánosságban
az enzimek, a biokatalizátorok funkciójáról nem
csupán azt a tényt kell tudni, hogy kémiai reakciókat
katalizálnak, gyorsítanak fel, hanem a gyorsítás
mértékét is. Ez elképesztően, megdöbbentően nagy,
a spontán átalakulás sebességének 10 9 –10 12 -szerese is
lehet. (Illusztrálásképpen csak egy példa egy közleményből:
az orotidin-5’-monofoszfát nem katalizált,
spontán dekarboxilációjának féléletideje 78 millió év
lenne, ha viszont az orotidin-5’-foszfát-dekarboxiláz
jelen van, a reakció 25 ms alatt végbemegy [7]).
Az enzimek, biokatalizátorok funcióira
irányuló vizsgálatok
Az enzimek funkcióinak, az enzimreakcióknak az elsődleges
vizsgáló-, mérőeszköze a spektrofotométer.
Pontosabban a fényelnyelésváltozást (∆ extinkciót)
mérni képes speciális spektrofotométer. A XX. század
a biokémia óriási fejlődésének századaként fogadható
el. Ez egyben azt is jelenti, hogy a XX. század
az enzimológia fejlődésének százada is, ami egyben
a spektrofotometria fejlődését, széles körű alkalmazását
is magában foglalja. Az enzimaktivitás, vagyis
a szubsztrátátalakítás sebességének mérhetőségénél
már a kezdetektől azzal az alapvető problémával találkoztak,
hogy a szubsztrátátalakulás a spektrofotometria
módszerével – az esetek döntő többségében – közvetlenül
nem analizálható, nem monitorozható, nem
5-3. táblázat. Enzimosztályok
Sorszám Elnevezés Funkció
I. oxidoreduktázok elektron, ill. H + átvitele
II. transzferázok csoportátvitel egy szubsztrátról egy másikra
III. hidrolázok vízbevitellel kovalens kötések hasítása
IV. liázok a szubsztrátmolekulát úgy hasítják ketté, hogy az egyik termékben kettős kötés
alakul ki,
vagy visszafelé: kettős kötésre való addíció játszódik le
V. izomerázok különböző típusú izomerizációt katalizálnak
VI. ligázok energiaigényes szintéziseket katalizálnak

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
115
mérhető. Viszont fokozatosan ismertté vált, hogy az
enzimreakciók igen nagy részében kapcsolódó faktorok
(kofaktorok) átalakulására kerül sor, ill. kapcsolódó
enzimreakciók (koenzimreakciók) zajlanak. A
kapcsolódó enzimreakciók viszont sok esetben olyan
végterméket eredményeznek, amely kiválóan mérhető
spektrofotometriásan. Technikailag az enzimdiagnosztika,
amely a laboratóriumi diagnosztika
jelentős területe, a kapcsolt vagy indikátor enzimreakciók
termékeinek spektrofotometriás analízisére
épült, épül. A követelmény tehát az, hogy a kapcsolt
indikátorreakció végterméke vízben oldható, stabil,
jól fotometrálható (határozott elnyelési maximuma
legyen, lehetőség szerint a látható fénytartományban)
és a keletkezett végtermék mennyisége szigorúan arányos
legyen a szubsztrátátalakulással. A diagnosztikus
enzimológiában a méréseknél azt is figyelembe
kell venni, hogy vannak enzimaktivitást befolyásoló
tényezők. Ezek: a hidrogénion-koncentráció (pH), az
ionerősség, az ionösszetétel, a hőmérséklet és a különböző
specifikus és kevésbé specifikus aktivátorok
és gátlók arzenálja. Az enzimdiagnosztika standardizálására
nemzetközi egyezségek léteznek. Manapság
a megválasztott hőmérséklet, a módszer és más kondíciók
tekintetében egységes előírások vannak.
Külön kell említést tenni az enzimhisztokémia
alapelvéről. Itt is kapcsolt indikátorreakciót alkalmazunk,
de itt az az alapkövetelmény, hogy a látható
fénytartományban elnyelő (színes) végtermék vízben
oldhatatlan legyen. Maradjon ott, ahol az enzim van.
Ezt az elvet alkalmazzuk az elektroforézissel elválasztott
(membránban vagy gélben) izoenzimek detektálásához.
Végül az enzimek analitikai vizsgálata után „szubsztrátfelismerő”
képességük méréstechnikai alkalmazásáról
kell szólni. Ennek kiemelkedő jelentősége van a laboratóriumi
diagnosztikában. Bizonyos kisebb méretű
szerves molekulák specifikus és érzékeny meghatározása
csak az enzimfehérje szubsztrátfelismerő sajátosságával
lehetséges. A vércukor-meghatározást pl. az
enzim-szubsztrátfelismerés alkalmazása nélkül, csak
kémiai reakcióval sokkal kisebb érzékenységgel és
pontossággal lehet kivitelezni. Ilyen enzim szubsztrátfelismerésére
épített reakciót alkalmazunk a laboratóriumi
diagnosztikában a glükózon kívül számos
molekula, pl. koleszterin, triglicerid, karbamid, kreatinin,
húgysav stb. mérésekor.
Hormonok
A hormonok definíciója nem könnyű. Egy bizonyos,
hogy külön óriási tudományterület, ma is gyorsan
fejlődő tudományterület, az endokrinológia tárgykörébe
tartozik. Itt, a biológiai funkcióik alapján való
fehérjevizsgálatok általános fejezetében, annyit le kell
szögezni, hogy nem minden hormon peptid vagy fehérje.
Ebből az következik, hogy a hormonfogalom
nem analitikai, hanem fiziológiai fogalom. Közös
neve azoknak a molekuláknak, amelyek a szervezetben
képződnek és más sejtek, sejtcsoportok, szövetek,
szervek működését befolyásolják. A termelésük
speciálisan differenciálódott sejtekben, általában mirigyekben,
a belső elválasztású (endokrin) mirigyekben
megy végbe.
Történeti áttekintés
A hormon fogalmat William Maddock Baylis
(1860–1924) angol fiziológus és Ernest Henry
Starling (1866–1927), szintén angol fiziológus alkotta
és használta először1904-ben. Ők fedezték fel
együtt a szekretin hormont és szerepét a bélperisztaltikában.
A hormon név görög szó és „sarkantyúz” a
jelentése. Mára általános neve lett azoknak a molekuláknak,
amelyekkel az endokrinológia foglalkozik.
Így a részletes történeti ismeretek azok számára, akik
mélyebb ismeretekre vágynak az endokrinológiai kézikönyvekben
lelhetők fel.
A hormonok molekuláris sajátosságai
A hormonok a szervezeten belül a véráram útján
közvetített molekulák, amelyek a „célsejtekhez”, a
„célszervekhez” eljutva ott fejtik ki hatásukat. A hormonok
tárgyalásánál találkozunk azzal a molekuláris
szerveződéssel, úgy is fogalmazhatunk, hogy fehérjemolekulák
szerveződésével, amely biztosítja a sejt
felszínén, hogy a hormont a számára elérhető helyen
„fogadják”. Idegen szóval ezt a fogadó fehérjét vagy fehérjekomplexet
receptornak(!) nevezzük. Amíg a hormon
maga nem mindig fehérje, sőt az esetek jelentős
többségében nem az (lásd szteránvázas molekulák,
kortizol, ösztrogén, tesztoszteron stb.), a receptor
mindig fehérje. Ebből következik, hogy a hormonok
vizsgálatán kívül a receptorok vizsgálata is tárgya az

116 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
endokrin kutatásnak és az endokrin diagnosztikának
is. A hormonok molekuláris sajátosságukat illetően
három csoportba sorolhatók:
• Módosult aminosavak (pl. tiroxin, adrenalin).
• Peptidek, polipeptidek, fehérjék (pl. tireotrop
releasing hormon: TRH, kortikotropin: ACTH,
prolaktin).
• Szteroid hormonok.
A hormonok funkciói
Az összes számba vehető, ismert hormon funkcióját
itt felsorolni lehetetlen, és azért sem illenek ide, mert
jelentős hányaduk nem fehérje. A peptid- és fehérjehormonok
funkcióit kiemelten ismertetni szintén
nem célszerű, mert egy sajátos tudományterület, az
endokrinológia tárgykörébe tartoznak és funkcióikat
megérteni, megismerni csak az összefüggések ismeretében
lehet.
A hormonok vizsgálata funkcióik alapján
Kezdetben a hormonokat valóban funkcióik alapján
vizsgálták. Sok esetben maga a hormon még ismeretlen
volt, mégis vizsgálatokat végeztek túléltetett
szervekkel vagy állatokon, pl. békákon. Manapság
azonban hormonok közvetlen meghatározását végzik
kutatási célú vizsgálatoknál, de az egész endokrin
diagnosztika terén is. Ma általában még a nem peptid,
nem fehérje hormonok meghatározására is elsődlegesen
monoklonális ellenanyagokat felhasználó immunológiai
módszereket használnak. Természetesen
a különböző kromatográfiás eljárások, közülük első
helyen a folyadékkromatográfia (HPLC) is a hormonanalitika
módszertani arzenáljához tartozik. Lehetséges
azonban, hogy a jövőben a tömegspektrometria
lesz a hormondiagnosztika elsőszámú módszere.
A sejtnövekedést befolyásoló fehérjék,
peptidek, a sejtnövekedési faktorok,
a biológiai válaszmódosítók
(„biological response modifiers”)
Mára ez a csoport óriásira duzzadt fehérje-, peptidcsoportot
jelent. Kétségtelenül ez a fehérjecsoport átfedésbe
került a hormonokkal, pl. az inzulint felismerése,
izolálása, szekvenálása és terápiás felhasználása
óta több évtizeden át a hormonok közé sorolták, manapság
viszont egyre több alkalommal sejtnövekedési
faktorként említik.
Történeti áttekintés
A biológiai válaszmódosító anyagok (biological response
modifiers) összefoglaló elnevezés bevezetése a
hetvenes évek közepére tehető, ez fejezi ki leginkább
az ide sorolt kis molekulatömegű fehérjék, peptidek
szerepét. A sejtnövekedési faktor elnevezés ettől eltérő
anyagokra vonatkozik, kutatásuk a sejtbiológia újabb,
gyorsan bővülő területét adja. Így ma az összefoglaló
elnevezés helyett az egyes molekulák külön vizsgálata
és csoportosítása a gyakorlat, mint pl. citokinek, limfokinek,
interleukinek, interferonok, transzformáló
faktorok stb. Stimulálóan hatott a sejtnövekedési faktor
kutatásra, hogy 1986-ban az élettani-orvosi Nobel-díjat
Stanley Cohen és Rita Levi-Montalcini
kapta sejtnövekedési faktor kutatásért. Mivel jelenleg
az inzulint, az 51 aminosavból álló kettős láncú peptidet
is a sejtnövekedési faktorok közé sorolják, itt említendő,
hogy ez volt az első fehérje, peptid, amit szekvenáltak,
és aki ezt tette nem más, mint a kétszeres
Nobel-díjas Frederick Sanger (1918–). Az inzulin
szekvenálásáért 1958-ban, a DNS-szekvenálás módszeréért
1980-ban kapott Nobel-díjat.
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai
válaszmódosítók” molekuláris sajátosságai
A közös tulajdonságuk, hogy peptidek, kis molekulatömegű
fehérjék. Sejteket ismernek fel, vagyis szerepet
játszanak a sejtek differenciálódásában. Itt is
lehet beszélni speciális kötőhelyekről, kötőfehérjékről,
fehérjekomplexekről, vagyis receptorokról. Annak
demonstrálására, hogy milyen szerteágazó molekulacsaládról
van szó és mennyire az érdeklődés
középpontjában vannak diagnosztikai, sőt terápiás
felhasználási lehetőségeik miatt, az emberi szervezetben
fellelhető biológiai válaszmódosító peptidek,
sejtnövekedési faktorok nem teljes, angol nyelvű felsorolását
illesztjük ide be:
• Epidermal growth factor (EGF)
• Erythropoietin (EPO)

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
117
• Fibroblast growth factor (FGF)
• Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF)
• Granulocyte-macrophage colony stimulating
factor (GM-CSF)
• Growth differentiation factor-9 (GDF9)
• Hepatocyte growth factor (HGF)
• Hepatoma-derived growth factor (HDGF)
• Insulin-like growth factor (IGF)
• migration-stimulating factor
• Myostatin (GDF-8)
• Nerve growth factor (NGF) and other neurotrophins
• Platelet-derived growth factor (PDGF)
• Thrombopoietin (TPO)
• Transforming growth factor alpha (TGF-a)
• Transforming growth factor beta (TGF-b)
• Tumour necrosis factor alpha (TNF-a)
• Vascular endothelial growth factor (VEGF)
• Wnt Signaling Pathway
• placental growth factor (PIGF)
• Foetal Bovine Somatotrophin (FBS)
• IL-l- Cofactor for IL-3 and IL-6. Activates T
cells
• IL-2- T-cell growth factor. Stimulates IL-l synthesis.
Activates B-cells and NK cells
• IL-3- Stimulates production of all non-lymphoid
cells
• IL-4- Growth factor for activated B cells, resting
T cells and mast cells
• IL-5- Induces differentiation of activated B cells
and eosinophils
• IL-6- Stimulates Ig synthesis. Growth factor for
plasma cells
• IL-7- Growth factor for pre-B cells
• Adrenomedullin (AM)
• Autocrine motility factor
• Bone morphogenetic proteins (BMPs)
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai
válaszmódosítók” funkciói
Általában a funkció a névből kikövetkeztethető.
Részletezésükre itt nem kerülhet sor, de nem is lenne
célszerű.
A sejtnövekedési faktorok, a „biológiai
válaszmódosítók” vizsgálata funkcióik
alapján
Vérplazmabeli, ill. szövetváladékbeli koncentrációjuk
meghatározását szinte kizárólag monoklonális ellenanyagok
felhasználásával végzik.
Extracelluláris szerkezeti elemek
Az emberi szervezetben fellelhető összes fehérjét
funkcióik alapján 10 csoportba soroltuk. Minden
csoportnál el lehetett volna mondani, hogy nagyon
sokféle fehérje tartozik oda, és éppen a funkcióik lényegének
ismerete, a mechanizmus, ahogy hatásukat
az élő szervezeten belül kifejtik, mélységében kevéssé
vagy egyáltalán nem ismert. Mégis a sokszínűsége
miatt és a hatásmechanizmus lényegi ismerete tekintetében
is ez a fehérjecsoport, amely főként szerkezeti
elemként a sejtek felszínén a termelő sejtektől különböző
távolságban, az extracelluláris térben funkcionáló
fehérjéket fogja össze, a legösszetettebb, funkció juk
mechanizmusát illetően a legkevésbé ismert. A soksejtű
élőlényekben, így természetesen az emberi szervezetben
is az extracelluláris térben főként szerkezeti
elemként funkcionáló fehérjéket a kötőszövet fehérjeállományaként
kellene, lehetne tárgyalni. Döntően ezt
is fogjuk követni, de itt kell, itt lehet arra utalni, hogy
a sejtek „társadalom”-formálódása, a sejtdifferenciálódás
szempontjából a fő meghatározó a sejtekből kinyúló
fehérjék szövedéke, az ún. extracelluláris fehérje
mátrix. A sejtek differenciálódását meghatározó „hely”
(Hans Spemann definíciója, amiért 1935-ben az orvosi-élettani
Nobel-díjat kapta), újabb nevén „niche”
ugyanis csak a sejtekből kinyúló fehérjék összessége,
az ún. „extracelluláris mátrix” lehet. Ma, amikor az őssejt
(stem cell) terápia ennyire az érdeklődés előterébe
került, a „hely” ismerete, amelyet az adott helyen élő
sejtek felszínén lévő, a sejtekből kinyúló extracelluláris
fehérjék „differenciációs szignálja” jelent, szintén
sok-sok további, mélyebb kutatómunkát követel. A
kötőszövetrost fehérjéinek és alapállományának rövid
ismertetésén kívül a fibrinogén-fibrin átalakulás
is ide kerül, már csak azért is, mert a szövettudomány
(hisztológia) világában a vért is a kötőszövethez sorol-

118 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
ják, mint „folyékony kötőszövet”-et. Végül a mucin, a
nyákfehérjék csoportja is itt kerül említésre, mint az
extracelluláris térben, bizonyos hámsejtek felszínén elhelyezkedő,
általuk termelt, többrétű funkciót betöltő
tömeges fehérje.
Történeti áttekintés
Egy ilyen szerteágazó fehérjecsoporthoz tartozó tudásunk,
ismereteink teljes történeti áttekintése lehetetlen,
csak külön-külön lehetne ezeket ismertetni.
Csak példaként vegyük a kollagénrostokhoz tartozó
ismereteink történetét. A neve görög eredetű, kolla
= ragasztó. Már az egyiptomiak 4000 évvel ezelőtt is
állítottak elő maguknak „zselatint”, ragasztót állatok
bőrének megfőzésével! Ezt tették az amerikai indiánok
is, úgy 1500 évvel ezelőtt. A kollagénrostok szerkezetkutatása
azonban csak a harmincas-negyvenes
években kezdődött. Először a polarizációs mikroszkóp,
majd az elektronmikroszkóp és manapság az
atomerőmikroszkóp mint a legmodernebb szerkezetkutatási
eszköz használatos a különböző rostok
finomszerkezetének mélyebb megismerésére. A rostok
és az alapállomány kémiai összetételére irányuló
kutatások az egész XX. századon át mind a mai napig
egyre fokozódó intenzitással folytak, folynak.
Az extracelluláris, főként szerkezeti
elemként funkcionáló fehérjék molekuláris
sajátosságai
Fehérjerostok
Általánosságban a kötőszövetben, az extracelluláris
térben háromféle fehérjerostot különítünk el:
• Kollagénrostok.
• Elasztikus rostok.
• Rácsrostok.
Kollagénrostok
Mára az emberi szervezetben 29 fajta kollagénrostot
különítünk el. A testünket felépítő 9–12 kg
teljes fehérjetartalom 25–35%-a kollagén. A 29 rostféleségből,
az I. típusú kollagén teszi ki az összkollagén
90%-át, tehát messze ebből van a legtöbb. Ezért
a kollagénrostok élő szervezeten belüli „gyártásának”
menetét képződésének rövid áttekintésével célszerű
bemutatni. A kollagén „gyártásának” két fázisa van:
sejten belüli (a különböző fibroblastokban) és sejten
kívüli fázis.
• Sejten (fibroblaston) belüli folyamat:
1. A transzláció során a riboszómákon két peptidlánc,
az α 1
és α 2
lánc szintetizálódik. Ezeket a
peptidláncokat nevezzük preprokollagénnek.
2. Az ún. szignálpeptid lehasítása után kialakulnak
az ún. pro-a-láncok.
3. A lizin és prolin aminosav a láncon belül hidroxilálódik.
Ez a lépés C-vitamin-függő.
4. A következő lépés a hidroxilizin glikozilációja.
5. Két α 1
-láncból és egy α 2
-láncból egy hármas, helikális
szerkezetű egység alakul ki.
6. A hármas helikális prokollagén a Golgi-apparátusban
további láncokkal „csomaggá” alakul,
amely exocitózis mechanizmus révén kijut a
sejtből.
• Sejten kívüli átalakulások:
1. A prokollagén-peptidáz enzim hatására az ún.
regisztrációs peptidek lehasítása után tropokollagén
jön létre.
2. Több tropokollagénmolekula a lizil-oxidáz enzim
hatására, amely a hidroxilizin- és lizinmolekulákat
kapcsolja össze, kialakítja a kollagénfibrillumokat,
majd ezek kollagénrostokká állnak
össze.
3. A kollagénrostok a sejtekhez, a sejtek felszínéhez
számos fehérjével vannak összekapcsolva. Ilyen
pl. a fibronektin és az integrin.
A különböző kötőszöveteken belül a háromféle rostot,
(a kollagén-, az elasztikus és a rácsrostokat) sajátos
alapállomány, a „ground substance” veszi körül. Ez az
alapállomány a legfőbb összetevője alapján proteoglikán
állománynak, más szóval mukoproteinállománynak
nevezhető. Benne módosult poliszacharidok,
glükózaminoglikán-molekulák kovalens kötésekkel
kapcsolódnak a vázfehérjékhez, gyakorlatilag a rostokhoz.
Az alapállomány felépítésében főbb szerepet
játszó módosult poliszacharidok, glükózaminoglikánok
a következők: hialuronsav, dermatán-szulfát,
kondroitin-szulfát, heparin, heparán-szulfát és keratán-szulfát.
Elasztikus rostok
Ezek fehérjealegysége az elasztin, az elaunin és
az oxitalan fehérje. A fibroblastokban és bizonyos
mértékben a simaizomsejtekben termelődnek. Mint

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
119
ahogy a kollagénrostok képződésének, úgyanúgy az
elasztikus rostokénak is van sejten belüli és sejten kívüli
fázisa. A képződés első fázisa a sejten belül zajlik
az elasztin mikrofibrillinumok kialakításáig, amelyben
több fehérje is részt vesz, mint pl. a fibrillin, a
fibulin és az elasztinreceptor fehérje. Az amorf elasztinból
a sejteken kívül keresztkötések sokaságának
kialakulása után jön létre az elasztinváz, az elasztikus
rostok struktúrája. Az elasztikus rostok szinte minden
szervben, minden kötőszöveti állományban előfordulnak.
Ezek a rugalmasság biztosítékai.
Rácsrostok
A rácsrostok kollagénrostok. Úgy is lehet mondani,
hogy a sejtek közelében, felszínén fellelhető finom
kollagénrostok hálózata.
Fibrinogén–fibrin
A fibrinogén-fibrin fehérjerendszer külön sajátos
helyet foglal el az extracelluláris szerkezeti elemként
funkcionáló fehérjék csoportjában. A fibrinogén
nagy molekulatömegű (340 kDa) glikoprotein ,
amely három pár fehérjeláncból (α, b, γ) épül fel, és
a májsejtekben (hepatocyták), ill. a megakaryocytákban
termelődik. Normál tartománya a vérplazmában
meglehetősen széles, 1,5–4,0 g/l, amely függ a választott
módszertől (leggyakrabban a Clauss-módszer).
A szervezetet érő különböző hatásokra, pl. fertőzésekben
a fibrinogén plazmakoncentrációja nagymértékben
emelkedni tud. Ezért az akut fázis fehérjék
csoportjába lett besorolva. A protrombinból keletkező
aktív szérumproteáz, a trombin hatására peptidek
hasadnak le a fibrinogénről, majd a maradék többlépcsős
polimerizáció és keresztkötések után fibrinhálóvá
alakul. A fibrin a megsebzett erek mechanikai
„eltömeszelésének” hatékony váza. A fibrinháló fizikai
állapotváltozásában, kontrakciójában a hálóba bekerült,
felnyílt vérlemezkéknek (thrombocytáknak)
fontos szerepük van.
Mucin
A mucinok az extracelluláris térben szerkezeti
elemként funkcionáló fehérjék csoportjában sajátos
helyet töltenek be. Az epithelialis sejtek termelik.
Óriás méretűek és nagyon sok szénhidrát-molekulát
tartalmaznak. A mucinok különböző konzisztenciájú
gélt képeznek az őket termelő epithelialis sejtek felszínén.
A mucin alapszerkezetét adó peptidláncok
mindkét végüknél, azaz a C- és az N-terminálisnál
is glikoziláltak. Gazdagok cisztein aminosavban, ami
lehetővé teszi, hogy a mucin monomerek diszulfidhidakkal
egymáshoz kapcsolódjanak. A mucin monomerek
középső része gazdag szerin és treonin
aminosavban. Ide bőségesen O-kötött és N-kötött
oligoszacharidok halmozódnak fel. Tehát a mucin
monomerek génjei az epithelialis sejtek szintetikus
apparátusával olyan peptideket termelnek, amelyek a
poszttranszlációs módosulások során extrém módon
glikozilálódnak, extrém módon kötnek meg szénhidrát
monomereket, oligomereket és polimereket.
A nagymennyiségű szénhidrát rendkívüli méretűre
emeli ezeknek a mucin molekulakomplexeknek a vízkötő
képességét. A szénhidrátok egyben megvédik a
peptidláncokat a proteolitikus degradációtól. Az epithelialis
sejtekből óriás mucinaggregátumok kerülnek
ki a sejtek felszínére, amelyek molekulatömege
1–10 millió Da.
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék
funkciói
A kötőszövet – mint a szervezetünket felépítő negyedik
szövetféleség – nagyon sokrétű elhelyezkedésében
és funkciójában egyaránt. Általános funkciója
a szervek elkülönítése, funkciójuk összehangolása.
A kötőszövet sejtjei sajátos fehérjéket termelnek és
juttatnak ki az extracelluláris térbe, amelyek ott egyrészt
rosttá, másrészt sajátos alapállománnyá formálódnak.
Az egyes szövetekben a rostok és a speciális
alapállomány sokrétű funkcióinak puszta felsorolása
is meghaladja ennek a fejeznek a keretét, és helyesebb
is róluk a szervek funkcióit tárgyaló élettan tantárgy
keretében tanulni.
Az extracelluláris szerkezeti fehérjék
vizsgálata
Az extracelluláris fehérjerostok és az alapállomány
vizsgálata a hisztológia, ill. hisztopatológia körébe tartozik,
vagyis különböző mikroszkópos technikákkal
végzik. Kétségtelen, hogy a polarizációs mikroszkópos
technika jelentős szerepet játszott a rostfehérjék
szerkezeti kutatásában. Feltétlenül meg kell említeni,
hogy a festésekkel kombinált polarizációs mikroszkó-

120 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
pos módszerek kidolgozásában és általuk a rostszerkezet-kutatásban
Pécsett Romhányi Györgynek és
munkatársainak kiemelkedő szerepe volt. A mucinok
vizsgálata is a hisztológia, ill. hisztopatológia körébe
tartozik, csupán a fibrinogén plazmakoncentrációjának
meghatározása és a fibrinogén-fibrin átalakulás
folyamatos követése, a trombelasztográfia tartozik a
klinikai biokémia, a laboratóriumi medicina tárgykörébe.
Raktárak
A fehérjék mint raktárak bizonyára sokkal szélesebb
és mélyebb szerepet töltenek be az élőlényekben és
természetesen az emberi szervezetben is, mint amit
eddig megismertünk e szerepükről. Bizonyosan van
raktáruk a szénhidrátoknak, a zsíroknak, az aminosavaknak
és a különböző anorganikus elemeknek. A
raktárak pedig nem lehetnek mások, mint fehérjék,
fehérjerendszerek. Itt csak egy raktárfehérje, a vasat
(Fe 3+ ) az élő sejteken belül raktározó ferritin tárgyalására
kerül sor. Ez az a raktározó fehérje, amit a jelek
szerint eddig legjobban megismertünk. Ugyanakkor
csak végiggondolásra utalok a kalcium (Ca) sokrétű,
bonyolult raktározására, a csontokra. Az emberi testben
jó megközelítéssel átlagosan 1 kg kalcium (Ca)
van, amelynek döntő hányada, 99%-a a csontokban
van dinamikusan „raktározva”. Ez a „raktár” extracelluláris,
mégis a sejtek – osteoblastok, osteoclastok,
osteocyták – vezérlik a Ca 2+ felhalmozását vagy kiszabadulását
kis peptidek (parathormon, kalcitonin,
oszteokalcin) „parancsára” a mátrixfehérjék „közreműködésével”.
A kalciumraktárt részletesen nem ismertetjük
itt, már csak azért sem, mert „csontmetabolizmus”
címen az élettan és a kórélettan egy-egy
fejezetéhez tartozik.
Történeti áttekintés
Azok számára, akik a ferritinnnel kapcsolatos kutatási
eredményekről, a felismerések időrendi sorrendjéről
és a felfedezőkről alaposabb ismeretekre vágynak,
az itt idézett összefoglaló közleményben találnak
részleteket [8].
A raktárfehérjék molekuláris sajátosságai
Mivel itt most a raktárfehérjék egyetlen fehérje, a ferritin
példáján kerülnek bemutatásra, csak ennek a
molekuláris sajátosságait ismertetjük röviden. A ferritin
nagy, 450 kDa molekulatömegű összetett globuláris
fehérje. A ma létező összes élő szervezetben, a
prokarióta egysejtűekben, baktériumokban épp úgy,
mint a soksejtű növények és állatok sejtjeiben szintetizálódik,
jelen van. Minden molekula 24 alegységből,
21 kDa nehézláncú vagy/és 19 kDa könnyűláncú
peptidből épül fel. A 24 peptidlánc gömbszerű struktúrát
képez, amelynek belsejében üregek, csatornák
vannak a foszfátionokkal és a hidroxidionokkal kristályt
képező Fe 3+ -ionok számára. Egy ferritinkomplex
4500 (Fe 3+ )-iont képes dinamikusan tárolni. A vas
nélküli ferritinmolekulát apoferritinnek nevezzük.
Az emberi vérplazmában, ill. vérszérumban is van
ferritin, amely kevés vasat (a maximális telítettség
10–12%-át) tartalmaz, és főleg könnyűláncokból épül
fel.
A raktárfehérjék funkciói
Nyilvánvalóan minden raktárfehérjének az a funkciója,
hogy amit raktároz, szükség esetén funkcionális
felhasználásra kerüljön. Ebből következik, hogy a
„raktárból” a felhasználás helyére juttatáshoz „szállítómechanizmusra”
van szükség. Ennek az állításnak
különösen igaznak kell lenni olyan elemek, atomok,
molekulák esetében, amelyek szabadon toxikusak,
mérgezők. A vas ilyen! A szabad vasion Fe 3+ vagy Fe 2+
formában toxikus az életfolyamatokra. Nincs is szabad
vas az élőlényekben. Az emberi testben, szervezetben
sincs, se a sejteken belül, se az extracelluláris
térben. Így természetesen a vérplazmában sem. A
raktárak és a felhasználás helye közt a transzportot,
a szállítást csak fehérjék végezhetik és végzik is. Ebből
fakad, hogy a raktározás és a transzport, a szállítás
összekapcsolt. A raktár és a szállítófehérjék tehát
egymásra utaltak, közös rendszert képeznek. A vasanyagcsere
jó bizonyíték erre. Úgy számolunk, hogy
a 70 kg-os emberi testben 4 g anorganikus vas van. A
szervezetünkben lévő összes vasnak 65–70%-a a vörösvérsejtekben,
a hemoglobinban van. Mintegy 25%

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
121
a vasraktárakban, vagyis a ferritin molekulakomplexekben,
5–10% a többi hemfehérjében (pl. mioglobin
és a citokróm fehérjékben) van. A „hivatalos” vasszállító
fehérjéhez, a transzferrinhez kötötten csak a teljes
vas 0,1–0,2%-a van. Ami a raktárakat, a ferritin fehérjekomplexet
illeti, azt kell világosan tudnunk, hogy a
testünket felépítő összes sejtünkben, tehát mind a 10 14
sejtben, sőt a saját sejtjeinkkel szimbiózisban élő, hasonló
számú (10 14 ) prokarióta sejtben, a belünkben, a
nyálkahártyáinkon élő baktériumsejtekben is szintetizálódik,
jelen van a ferritin, a dinamikus vasraktár.
A vas sejtfelszíni „fogadására” és sejten belüli transzportjára
sajátos fehérjék vannak, mint a vas-reduktáz,
a kétértékű fém transzporter, a ferroportin és a kis
molekulatömegű hepcidin. Még azt kell tudni, hogy
a vékonybél nyálkahártyasejtjeiben lévő ferritin a sejten
belüli „fogadó” és szállítófehérjékkel „védőzsiliprendszerként”
és „továbbpostázóként” működik. A
szükségletnek megfelelően „enged be” a szervezetbe
vasat. Ugyan minden sejtünkben van ferritin vasraktár,
mégis bizonyos sejtekben, mint pl. a májsejtek,
a lép és a csontvelő bizonyos sejtjeiben messze több
ferritin van, mint a többi sejtben. Ezért úgy szoktuk
tekinteni, hogy a máj, a lép és a csontvelő a vasraktározás
fő szervei. Abban az esetben, amikor a ferritin
túlhalmozódik, aggregálódhat, és bizonyos macrophag
sejtekben felhalmozódhat. Ezt a felhalmozódott
fehérje-vas aggregátumot hemosziderinnek nevezzük.
Az ilyen aggregátumból, tehát a hemosziderinből a
vas felszabadulása nehéz, vagyis a hemosziderinné
aggregálódott ferritin elveszti dinamikus „vaskínáló”
képességét. Egy bizonyos örökletes betegségben, a
haemochromatosisban kóros mértékben szaporodik
fel a hemosziderin.
A fehérjeraktárak funkcióira irányuló
vizsgálatok
A ferritin, a 24 peptidláncból (főleg könnyűláncból:
L) felépült 450 kDa nagyságú óriás molekulakomplex
szabadon jelen van a vérplazmában. Igaz, ebben az
„úszó” vasraktárban az „apoferritin” nincs telepakolva.
A lehetséges 4500 vas (Fe 3+ ) atom helyett kevesebb
mint 10–12% van a plazmaferritinben. Monoklonális
ellenanyagot használva a plazma ferritinkoncentrációját
nagyon pontosan mérni tudjuk. A koncentrációtartomány
széles, férfiakat és nőket közösen véve:
15–300 μg/l. 50 μg/l alatti érték figyelmet érdemel,
hiszen jól jelzi a vasraktárak állapotát. Csökkent értékeket
mérünk vashiányos anémia esetén, de alultápláltság,
hypothyreosis, C-vitamin-hiány esetén és
fertőző betegségek után is. Emelkedett értékeket találunk
viszont haemochromatosisban és porphyriákban,
de mivel a ferritin akut fázis fehérje is, megtévesztően
emelkedett értékeket lehet mérni fertőzések,
különböző betegségek akut fázisában is.
Transzportőrök (szállítófehérjék)
Rendkívül nagy fehérjecsalád ez is! Érdemes és kell is,
hogy két csoportra osszuk:
• Sejten belüli szállítófehérjék.
• Sejten kívüli szállítók.
Ugyanakkor aszerint is célszerű két csoportra osztani,
hogy fehérjét szállítanak-e vagy mást. A sejten belüli
„fehérjeszállítás” koncepciója és kutatása új keletű,
alig néhány évtizedre tehető. Külön neve van a fehérjeszállító
fehérjéknek, ezek a „chaperonok”. A chaperon
francia eredetű, angolba is átvett szó, jelentése
„gardedám”, vagyis az a személy, aki a fiatal lányokat
régen a bálba elkísérte. Az élő sejten belül ugyanis
nagy kérdés, hogy a szintézis helyéről a peptidláncok
hogyan kerülnek az „összeszerelő műhelyekbe”, ill.
az egyes organellumokba, a funkció helyére, az egyes
kompartmentekbe. A citoszol elnevezés azt sugallja,
hogy a képződött peptidek szabadon diffundálnak,
„keresgélik” a párjukat vagy a helyüket. Ez nincs így!
Nincs rá idő se! Tehát az alapgondolat bizonyosságot
eredményezett, nagy családja van a sejten belül
az olyan fehérjéknek, amelyek „karonfogva elkísérik”,
vagy „elcipelik” nagy gyorsasággal a peptideket, a fehérjéket
ahová kell. Ezek tehát a chaperonok. Közéjük
tartoznak pl. a különböző „hősokkfehérjék”. A sejten
belüli transzportfehérjék koncepcionálisan olyanok
is lehetnek, amelyek valamit transzportálnak, de nem
mozdulnak el a helyükről. Ilyenek az elektront (e – )
transzportáló citokrómok. Az előző részben utaltunk
arra, hogy a raktárfehérjék és a szállítófehérjék funkcionálisan
általában össze vannak kapcsolva. Ugyanez
elmondható a szállítófehérjék és a következő csoportba
sorolt ligandumfehérjék összekapcsoltságáról

122 5. fejezet Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
is. A globin pl. ligandumfehérje, a „hem” a liganduma.
Viszont szállító, az egyik legfontosabb szállító a
szervezetünkben, hiszen a minden sejtünk számára
nélkülözhetetlen oxigént szállítja.
Történeti áttekintés
A szállítófehérjékről, a kutatásukról, a hozzájuk tartozó
felfedezésekről időrendi sorrendben számot adni
teljességgel lehetetlen. Ha egyet, pl. az extracelluláris
tér, a vérplazma fontos szállítórendszerét, a lipoproteineket
kiválasztjuk, annyit leszögezhetünk, hogy
felfedezésük, leírásuk az ultracentrifuga kifejlesztéséhez,
alkalmazásához kapcsolt. Így Theodor Svedberg
(1884–1971) munkásságának meghatározó
szerepe volt benne, aki kémiai Nobel-díjat is kapott
1926-ban a makromolekulák, molekulakomplexek
kutatásáért, az ultracentrifuga kifejlesztéséért. Azt
is lehetetlen lenne kinyomozni, hogy az albuminról
ki bizonyította be először, hogy a vérünk univerzális
„szállítómunkása”. Szállítja a toxikus, még nem konjugált
bilirubint, a zsírsavakat, a rengeteg gyógyszert,
idegen molekulát, de, hogy ki, mikor bizonyította be
ezeket, nemigen tudjuk és nehéz is lenne, de felesleges
is kinyomozni.
A transzportőrök, a szállítófehérjék
molekuláris sajátosságai
A transzportfehérjék általánosan globuláris fehérjék,
fehérjekomplexek, amelyek külső felszínén „vízszeretők”,
hidrofilek, míg a belsejükben hidrofób „üregek”
lehetnek.
Molekuláris felépítettségét, sajátosságát tekintve
egyértelműen különös molekula a hemoglobin és
az izmokban az oxigén „helyre” szállítását biztosító
mio globin. A mioglobinban egy globin (151 aminosavból
álló fehérje) és egy hem van. A hemoglobinban
4 globin és négy hem, 4 oxigénmolekula (O 2
)
szállítására. A hemoglobin molekulatömege tehát
64 500 dalton.
A már említett lipoproteinek felépítése is rendkívül
bonyolult, rendkívül összetett. A lipoproteineket
felépítő fehérjéket közös néven apolipoproteineknek
nevezzük. Számuk ma már meghaladja a százat. Az
egyes apolipoproteineket lehet az ellenük termelt monoklonális
ellenanyagokkal vizsgálni.
Az anorganikus elemek, pl. a Ca 2+ és a Mg 2+ nem
specifikus szállítója az albumin, melynek „szállítókedve”
érzékenyen függ a plazma-pH-tól. Ha emelkedik
a pH, vagyis alkalózis felé tolódik el, növekszik
az albumin Ca 2+ -kötő képessége, ami izomgörcsöt,
tetaniát is eredményezhet. A kisebb koncentrációban
jelen lévő szervetlen elemeknek, a ritkafémeknek
speciális szállítójuk van. Ilyen speciális szállító pl. a
70 kDa nagyságú transzferrin a vas vagy a cöruloplazmin
a réz szállítására stb.
A transzporterek, a szállítófehérjék
funkciói
Nyilvánvaló, hogy a funkciójuk a szállítás. Külön
részletezésre itt semmi indok nincs. Egy biztos, szerteágazó
funkció, és sok kutatásra váró feladat van itt.
A transzportfehérjék azonosítása
funkcióik alapján
A fehérje által szállított atom vagy molekula alkalmas
és a gyakorlatban valóban fel is használt magának a
szállítófehérjének azonosítására. Különösen jól alkalmazható
ez a fehérjék elektroforetikus elválasztása
után, ha az elektroforetikus szeparálás során a fehérjéről
nem válik le, amit szállít. Ekkor a szállított anyag
detektálása a szállítófehérjét is jelöli. Erre nagyon jó
példa a lipoidelektroforézis. A szérumfehérjék elektroforetikus
elválasztása után lipoidfestést alkalmazunk,
és a lipoproteineket 4 frakcióban ismerhetjük
fel: α (HDL), b, pre-β (LDL ÉS VLDL) és kilomikron.
Ezek relatív „mennyiségi” összevetése hasznos diagnosztikai
szempontból.
Ligandumok
Fehérjeligandumok, ligandumfehérjék egyet jelentenek:
fehérjéket, amelyekhez valami kapcsolódik.
Ebből adódik, hogy nincs messze az igazságtól az az
állítás, hogy az élő sejtekből kivett vagy fiziológiás
úton kijutott fehérjék többsége nem csak egyszerű
polimerje az aminosavaknak, hanem módosultak,
valami kapcsolódik hozzájuk, tehát ligandumfehérjék.
A peptidszintézis, a transzláció utáni módosulásokat
közös néven poszttranszlációs módosulásoknak

Fehérjék vizsgálata a biológiai funkciók alapján
123
nevezzük. Ezek többségében valami kapcsolódik a
peptidlánchoz. Ligandum (kapcsolt anyag) lesz része
a fehérjéknek. Így pl., ha cukormolekulák, monoszacharidok
kapcsolódnak abból a célból(?), hogy vízben
jobban oldottak legyenek, mint ahogy a vérplazmába
került fehérjék esetében így van, a ligandumfehérjéknek
glikoprotein lesz a nevük. Ha fémek kapcsolódnak,
akkor metalloproteinek, ha lipoidok, akkor lipoproteinek.
Ligandumfehérje a K-vitamin-dependens
módon γ-karboxileződött protrombinmolekula is. A
fehérjékhez atomok, molekulák kapcsolódása azonban
nem csak sejten belül, intracellulárisan következhet
be, hanem sejten kívül is. Különböző fehérjékhez,
„receptorfehérjékhez” bizonyos molekulák, potenciális
gyógyszermolekulák kapcsolódásának kutatása
az egész világon fejlett módszerekkel, fejlett számítógépes
technikákkal intenzíven folyik. Néhány módszer,
amelyet ma a ligandumkutatásban alkalmaznak:
Raman-spektroszkópia, fluoreszcens spektroszkópia,
cirkuláris dikroizmus, magmágneses rezonancia
spektroszkópia, tömegspektrometria, atomerő-mikroszkópia,
kettős polarizációs interferometria, a paramágnesesség
vizsgálata stb.
Esszenciális táplálékok
Ezek a fehérjék csak azért kerültek ide, a felsorolás
végére, hogy alázatra figyelmeztessenek. Az emberi
test fehérjéi 20 aminosavból épülnek fel. Ebből kilencet
a testünket felépítő 10 14 saját sejtünk nem tud előállítani.
A táplálékokkal kell megkapnunk. Ha csak
egyszerűen kimondjuk, hogy 9 esszenciális aminosav
van, nem fogjuk fel eléggé az újabb bizonyítékokat
arra, hogy az életünk más élőlényektől függ. A fáktól,
a zöld növényektől függ, hogy van-e oxigén, védő
ózonpajzs a Föld körül, van-e tiszta levegő és tiszta
vizünk. Itt azt is fel kell fognunk, hogy az, hogy az
életünket jelentő fehérjéink legyenek, más élőlények
lététől függ. Minden tanulás végén alázattal azt kell
megértenünk és elfogadnunk, hogy tisztelnünk, védenünk
kell az élővilágot.
Irodalom
[1] Szent-Györgyi, A. (ed.): Studies from Insitute of Medical
Chemistry, Univ. Szeged. Vol. 1., S. Karger, AG.,
Basel, 1942.
[2] Kühne, W.: Untersuchungen über das Protolazma und
die Contractilitat. W. Engelman, Leipzig, 1864.
[3] Engelhardt, W. A., Lyubimova, M .N.: Myosin and
adenosin triphosphatase. Nature 144:668–669, 1939.
[4] Huxley, A. F., Nidergerke, R., Huxley, H., Hanson,
J.: Sliding filament hypothesis. Nature 173:4412, May,
1954.
[5] Kellermayer, M., Jobst, K.: Cytoplasmic protein network
in HeLa cells. Histochemistry 44:193–195, 1975.
[6] Kühne, W.: Untersuchurigen über das Protoplasma
und die Contactitat. W. Engelmann, Leipzig, 1864.
[7] Radzicka, A., Wolfenden, R.: Science 6:267, 931,
1995.
[8]. Theil, E.: Ferritin: Structure, gene regulation, and cellular
function in animals, plants and microorganisms.
Annual Review of Biochemistry 56:289–315, 1987.

6. Immunkémiai eljárások a fehérjék
azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások
oldatban és szilárd fázisú
rendszerekben
Berki Tímea
Hogyan tudunk egy bonyolult, összetett, akár több
ezer komponenst tartalmazó biológiai mintából egy
nagyon kis koncentrációjú anyagot meghatározni (pl.
vérmintából pajzsmirigyhormont vagy egy sejt lizátumából
egy fehérjét stb.)?
Erre kétféle megközelítés áll rendelkezésére:
• Valamilyen nagy hatékonyságú elválasztástechnikai
módszerrel (pl. HPLC, GC, MS) a mintát
komponenseire bontjuk, és a meghatározandó
komponenst mérjük.
• Szelektíven kiválasztjuk az adott komponenst a
mintából, majd mérjük (pl. immunoassay).
Az immunanalitikai módszerekkel egy speciális reakciót,
az élő szervezetekben is lejátszódó, rendkívül
szelektív antigén-antitest reakciót használnak ki arra,
hogy a mintából a meghatározandó anyagot kiválasszák,
majd valamilyen analitikai módszerrel (pl.
spektrofotometriásan, fluoreszcenciaméréssel, radioaktív
izotópos méréssel) detektálják.
Immunkémiai eljárások tágabb értelemben azok a laboratóriumi
fehérjeazonosítási módszerek, amelyekben
két ligandum, az antigén (haptén) és az antitest
specifikus kapcsolódása révén határozzuk meg az
analit (antigén vagy antitest) mennyiségét. Ebben az
esetben a vizsgálandó molekula annak ellenére, hogy
immunológiai módszerrel határozzuk meg, nem feltétlenül
az immunválasz valamely eleme, hanem lehet
akár a vas- vagy a csontanyagcsere markere, akár
tumormarker, akár egy sejt alkotórésze is. Szűkebb
értelemben immunszerológiai módszerekkel az immunválasz
normális és kóros komponenseit (antitestek
osztályai, akut fázis fehérjék, komplementkomponensek,
autoantitestek stb.) tudjuk tanulmányozni.
Ezeknek az immunoassay-nek nevezett eljárásoknak
a nagyfokú fajlagossága az antitestek nagy epitópspecificitásán
és affinitásán alapul. Felhasználásukkal
mérhető akár antigén, akár antitest mennyisége egy
mintából. Az immunológiai elven működő laboratóriumi
mérési technikákat forradalmasította az ellenanyagok
előállítási módszerének fejlődése: az egyre
tisztább poliklonális ellenanyagok mellett a monoklonális
ellenanyagok előállításának és alkalmazásának
elterjedése.
Az immunológiai mérőmódszerek érzékenységét
nem csak az alkalmazott antitest típusa (poliklonális
vagy monoklonális antitest) szabja meg, hanem
az a mérőrendszer is, amelyben az antigén-antitest
reakciót detektáljuk. Így az immunológiai elven alapuló
tesztek érzékenységének széles skálája 0,1 pikogrammtól
mg-ig terjedő analit jelenlétének kimutatását
teszi lehetővé (6-1. táblázat). Az analit
koncentrációjának meghatározását ismert kalibráló
mintasorral kapott illesztőgörbéről való leolvasással
végezzük.
6-1. táblázat. Az immunoassay-k érzékenysége
Eljárás
immunfluoreszcencia
enzim-immunoassay
(ELISA)
lumineszcencia
radioimmunoassay
(RIA, Farr)
immunoblott
Kimutatható legkisebb
ellenanyag-koncentráció
1–100 ng
0,2–100 pg
0,1–100 pg
0,1–100 pg
0,2–100 pg

126 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
Az egyes testfolyadékok (plazma, szérum, liquor,
vizelet) fehérjetartalmának mennyiségi és minőségi
meghatározása fontos eszköz bizonyos betegségek
diagnózisához, a terápia hatékonyságának nyomon
követéséhez vagy a betegség aktivitásának megítéléséhez.
A szérum-, liquor- és vizeletfehérjék analízisénél
alkalmazott kvantitatív és kvalitatív módszerek igen
jelentős fejlődésen mentek keresztül az utóbbi néhány
évben, különösen a gyakorlati alkalmazás és az érzékenység
tekintetében. Ez az alkalmazott ellenanyagok
minősége mellett a jelölő- és mérőrendszerek, műszerek
egyre tökéletesedő voltának köszönhető.
Az immunkémia tárgykörébe tartozó vizsgálatok
profilja széles körű, mivel plazmaproteinek (akut fázis
fehérjék, immunglobulinok, cisztatin C), hematológiai
paraméterek (transzferrin, szolubilis transzferrin
receptor, ferritin, B 12
-vitamin, folsav), cardialis
markerek (mioglobin, troponin T), sepsismarkerek
(prokalcitonin, citokinek), valamint a szénhidrát-deficiens
transzferrin meghatározása egyaránt ide tartozik.
Ugyancsak ezzel a módszerrel detektáljuk azokat
a molekulákat is, amelyeket a szervezet termel, de
normális esetben nem fordulnak elő a plazmában (pl.
tumorantigének), vagy azon molekulákat, amelyek
normális esetben nincsenek a szérumban (pl. drogok,
gyógyszerek).
A rutin diagnosztika mellett a kutatólaboratóriumok
módszertanához is hozzátartozik az immunoassay
típusú vizsgálatok széles köre, amely igen érzékeny,
specifikus és ezért sokféle fehérjét tartalmazó,
kis mennyiségű mintából tud egyetlen molekula
jelenlétére információt adni. Így a sejtalkotórészek,
sejtfelszíni antigének, sejtek által termelt citokinek,
ellenanyagok mennyiségi meghatározását fehérjeszinten
immunanalitikai módszerekkel végzik.
A vizsgálatokat a közös módszertan foglalja egységbe.
Immunológiai alapok
Immunológiai fogalmak
Az ellenanyagok vagy antitestek a specifikus humorális
immunválasz antigén által kiváltott aktivációjának
eredményeként termelődnek az antigénfelismerő
B-sejtekből differenciálódó plazmasejtekben. A specifikus
immunválaszban az antigén ismétlődő megjelenésekor
(immunizálás) egyre nagyobb affinitású
és nagyobb mennyiségű antitest termelődik. Ezek
az antitestek a testfolyadékokban, így a szérumban
is mérhetők, abból különböző tisztítási eljárással kinyerhetők.
A specifikus immunválasznak 3 fő szakaszát különböztetjük
meg:
1. A lymphocyták antigénfelismerése.
2. Az antigénspecifikus T- és B-sejtek differenciálódása
és klonális osztódása.
3. Effektor és memóriasejtek és molekulák képződése,
antigéneltakarítás.
Az emlősszervezetben a B-lymphocyták antigénreceptoruk
(BcR) révén bármely kémiai természetű,
idegen molekulát (natív antigént) képesek felismerni
és megkötni. A felismert antigén kémiai természetétől,
bejutása helyétől, mennyiségétől, valamint
a gazdaszervezet állapotától függően vagy támadó
jellegű immunválaszt, vagy toleranciát vált ki. A fehérje
természetű antigének nagyrészt ún. T-sejt-függő
(T-dependens) immunválaszt váltanak ki, ami
azt jelenti, hogy az antigénmolekula egyes szakaszait
nem csak B-sejtek, hanem T helper (Th-) sejtek is
felismerik. Ehhez a folyamathoz a fehérjemolekulák
antigénbemutató (APC) sejtek általi felvétele, feldolgozása
és MHC-II-vel való bemutatása is szükséges a
Th-sejtek számára. Az antigénspecifikus Th-sejtek és
B-lymphocyták együttes aktivációja és kölcsönhatása
eredményezi a B-lymphocytákban zajló izotípusváltást
és affinitásérést (6-1. ábra), amelynek eredményeként
nagy affinitású IgG, IgA vagy IgE izotípusú
ellenanyagok termelődnek. In vitro laboratóriumi
mérőmódszerekhez a leginkább ideális, ha IgG izotípusú
ellenanyag keletkezik az immunválasz során.
Antigén, epitóp
Az antigén fogalom Detre László magyar mikrobiológus
nevéhez fűződik, aki „antitestgenerátornak”
nevezte azokat a molekulákat, amelyek immunválaszt
váltanak ki. Detre a Pasteur Intézetben a typhus elleni
immunitást tanulmányozva dolgozta ki a specifikus
ellenanyagok keletkezésének antigénteóriáját,
az igazságügyi orvostanban elsőként alkalmazott
immunbiológiai (szerológiai) eljárást, leírta az immunszuppressziónak
nevezett jelenséget, valamint a
szérumdiagnosztikában nagy jelentőségű zónajelenséget.

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
127
6-1. ábra. A humorális B-sejtes immunválasz lépései
Mai, korszerűbb megfogalmazás szerint antigén az
a molekula, amelyet az adaptív immunrendszer specifikusan
felismer, és ellene vagy támadó jellegű immunválasz,
vagy tolerancia kialakulását eredményezi.
Szorosabb értelemben azok az anyagok, amelyek
immunválaszt váltanak ki, az immunogének, míg az
antigének olyan anyagok, amelyek specifikus antitestekhez
kötődnek. Az immunogén választ kiváltó
antigént komplett vagy teljes antigénnek nevezzük. Az
antigénmolekula azon kisebb szakaszát, amely közvetlen
kapcsolatot létesít a T- vagy B-lymphocyták
antigénreceptorával, epitópnak vagy antigéndeterminánsnak
nevezzük (6-2. ábra).
Minél nagyobb és minél változatosabb egy molekula,
annál több fajta epitóp helyezkedik el rajta, így
annál több B-lymphocyta aktivációját eredményezi
6-2. ábra. Az antitest felismeri a komplex antigén epitópjait
(antigéndeterminánsait)
és annál több fajta (poliklonális) antitest termelődik
ellene. Megkülönböztetünk lineáris epitópokat, amelyek
a fehérje harmadlagos szerkezetének felbontása
után is változatlanok maradnak és az ellenük termelődött
antitestet továbbra is kötik. A konformációs
epitópok – a fehérjék harmadlagos szerkezetéből
adódóan – egymástól távoli aminosavak által alkotott
felszínen jönnek létre, amelyet a fehérje denaturálása
tönkretesz, vagyis az antitest kötődése nem jön létre.
A neo-antigének a fehérjék harmadlagos szerkezetének
felbontása után felszínre kerülő epitópok, amelyek
ellen a natív formában nem generál antitestet az
immunrendszer (6-3. ábra).
A B-lymphocyták felismernek olyan kis molekulákat
is (szteroidhormon, antibiotikum, szervetlen
vagy szerves kis molekulák stb.), amelyek önmagukban
nem váltanak ki immunválaszt, csak ha hordozó
fehérjéhez kapcsolódva jelennek meg. Ezeket inkomplett
antigénnek vagy hapténnek nevezzük.
Antitest szerkezet, izotípus, funkció
Az immunglobulinok a plazmasejtek által termelt
glikoproteinek, szerkezetüket tekintve globulinok (a
fehérjeelektroforézis γ-régiójában találhatók). Az N-,
ritkábban az O-terminális (IgA 1
és IgD) aminosavmaradványokhoz
kacsolódó cukor oldalláncok (glikoziláció)
főként a molekula in vivo effektor funkciói
(FcR-kötés, komplementaktiválás) szempontjából
nélkülözhetetlenek.

128 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-3. ábra. Az epitópok (antigéndeterminánsok) fajtái
a) Konformációs determináns
b) Lineáris determináns
c) Neoantigéndetermináns (proteolízissel képződik)
6-4. ábra. Az immunglobulin-molekula doménes szerkezete
Szerkezet. Az Y alakú, monomer immunglobulint
4 polipeptidlánc alkotja, 2 identikus nehéz- és 2 egyező
könnyűlánc, amelyeket diszulfidhidak kapcsolnak
össze. A globuláris szerkezetű polipeptidláncok alapelemeit,
a 110 aminosav hosszúságú doméneket szintén
diszulfidhidak kötik össze (6-4. ábra). A könnyűláncok
2-2 doménből épülnek fel, egy variábilis (V) és
egy konstans (C) doménből. A nehézláncokat egy V
és 3-4 C domén alkotja. A könnyű- és nehézláncok V
doménjei együtt hozzák létre a molekula N-terminális
végén az antigénkötő helyet, vagyis a molekula specificitását.
Mind a nehéz-, mind a könnyűlánc variábilis
doménjének aminosavszekvenciájában
3-3 hipervariábilis szakasz alkotja
az antigénkötő „komplementaritást
determináló régiót” (CDR) (lásd 6-4.
ábra). E molekulaszakaszok aminosav-variabilitása
ellenanyagonként
eltér, így valósul meg az a sokféleség,
amely lehetővé teszi szinte valamenynyi
létező molekula felismerését. A
CDR régióban bekövetkező spontán
mutációk okozzák a memória típusú
immunválaszban tapasztalható affinitásérés
folyamatát. Ez azt jelenti,
hogy az antigénspecifikus aktiválódó
és osztódó B-lymphocytákban az immunglobulin
nehéz-és könnyűlánc V
régióinak CDR szakaszai mutációk
miatt változnak, így az ellenanyag af-

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
129
finitása is változik. A B-sejtek abban az esetben élnek
túl és termelnek további immunglobulinokat, ha ez a
mutáció az ellenanyag nagyobb affinitású kötőhelyét
eredményezi. Ismételt immunizálás folyamán az ellenanyagok
átlagos affinitása nő (affinitásérés).
Régebbi szerkezeti leírások a monomer immunglobulin-molekulát
a papain enzimmel való hasítás
során kapott két Fab- (fragment antigen binding)
fragmensre és egy Fc- (fragment crystallizable) fragmensre
bontják (6-5. ábra). Egy másik enzim, a pepszin
a kapocsrégió alatt hasítja a molekulát, így egy
F(ab)2-fragmens és egy Fc-fragmens keletkezik. A
nehézlánc konstans domének az effektor funkciók
létrehozásáért felelősek.
Az egy B-lymphocyta által termelt ellenanyagok a
nehézlánc vonatkozásában különbözhetnek egymástól,
ill. előfordul, hogy ugyanakkor több osztályba
tartozó immunglobulint is termel a sejt. Mindazonáltal
ezek az immunglobulinok antigénkötő képességük
szempontjából megegyeznek, amit a variábilis
6-5. ábra. Az immunglobulin-molekula harmadlagos szerkezete
régió kódol (6-6. ábra). Ahhoz, hogy az óriási számú
különböző specificitású antitest megjelenjen a szervezetben
és védje azt a számtalan idegen anyaggal
szemben, szervezetünk sok millió, egymástól eltérő
B-lymphocytát állít elő. Amennyiben egy olyan rendszer
biztosítaná ezt a sokszínűséget, amelyben minden
egyes eltérő variábilis szakaszt egy önálló gén kódolna,
akkor a teljes genom sem lenne elég erre a célra. Ezzel
szemben, amint azt Susumu Tonegawa 1976-ban
kimutatta, a B-lymphocyták genomjának egyes részeiben
olyan szerkezeti változások (génrekombinációs
folyamatok) zajlanak le, amelyek az immunglobulinok
változékonyságát biztosítják. Tonegawa ezért a felfedezéséért
orvosi Nobel-díjat kapott 1987-ben.
Immunglobulin-izotípusok
Emlősök esetén az immunglobulinoknak a nehézlánc
konstans doménjei alapján öt típusa (izotípusa) van:
γ, α, μ, δ és ε. Ezek alapján az immunglobulinokat öt
osztályba vagy izotípusba sorolhatjuk: IgG, IgA, IgM,
IgD és IgE. Az IgG és IgA (6-7. ábra) molekulákat
még tovább sorolhatjuk alosztályokba: IgG 1
, IgG 2a
,
IgG 2b
, IgG 3
, IgG 4
, valamint IgA 1
és IgA 2
. A könnyűláncnak
csak két izotípusa ismert: k és l, amelyek
emberben hasonlóak egymáshoz, de minden egyes
immunglobulinban csak egyikük fordul elő. Minden
immunglobulin-izotípus más-más biológiai funkciókat
lát el (6-2. táblázat).
IgM
Az IgM monomer formában az érett, de még antigénnel
nem találkozott, „naiv” B-lymphocyták antigénreceptora
(az IgD mellett), a primer immunválaszban
elsőként termelődő immunglobulin. A
6-6. ábra. Antigénfelismerés. Minden antitest (ellenanyag)
specifikus antigént (epitópot) ismer fel, a kapcsolódás a
kulcs–zár viszonyhoz hasonló
6-7. ábra. Az immunglobulin-osztályok szerkezete; nehézlánctípusok

130 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-2. táblázat. Az immunglobulin-alosztályok szerkezeti és funkcionális eltérései *
Jellemző
Osztály-Alosztály
IgM IgG 1
IgG 2
IgG 3
IgG 4
IgA 1-2
IgE IgD
forma pentamer monomer monomer monomer monomer dimer monomer monomer
IgE
Monomer immunglobulin-molekula, amely a többi
immunglobulintól eltérően 4 nehézlánc konstans
doménből épül fel, amely jelentős mértékben gliko-
szérumkoncentráció
(mg/ml)
komplementaktiváció
placentatranszfer
Fc-receptorkötés
megjelenés
szekrétumokban
1,5 9 3 1 0,5 3,5 0,00005 0,03
+++ +++ + +++ - - - -
- + + + + - - -
- + - + - - - -
mucus
stb.
tej tej tej tej mucus
stb.
*
A - hiányt, a + valamely tulajdonság vagy aktivitás meglétét, többszörözéssel annak mértékét jelöli.
- -
plazmasejtek által termelt, szekretált forma pentamer
szerkezetű, ahol az 5 monomer IgM-et egy J (joining)
lánc kapcsolja össze. A polimerszerkezet miatt a molekula
igen nagy méretű, molekulatömege közel 900
kDa, ezért kapta az „M” (makro) jelölést. Főleg a vérszérumban
fordul elő, mert nehezen jut át az érfalon
a szövetközti térbe. Ugyanakkor a poli-FcReceptor
(pFcR) segítségével transzportálódik a nyálkahártyák
felszínére. Miután a pentamer molekulát 10 antigénkötő
helye több antigén keresztkötésére teszi alkalmassá,
jó precipitáló és agglutináló antitest. Polimer
szerkezete miatt nagy aviditással köti az antigéneket,
és ugyancsak hatékony a komplementrendszer aktiválásában
is.
IgD
Az IgM mellett a naiv B-lymphocyták antigénreceptora.
Szekretált formában, nyomokban fordul elő,
funkciója nem ismert.
IgG
A memória B-sejtek antigénreceptora, a másodlagos
immunválaszban termelődő, legnagyobb menynyiségű
immunglobulin-osztály. Mind a szérumban,
mind a szövetközti térben megtalálható. Az anyai IgG
transzportfolyamatok révén a placentán átjut a magzatba,
az újszülött immunvédekezését biztosítja, amíg
kb. 6 hónap alatt a saját immunrendszere át nem veszi
ezt a feladatot. Az IgG számos patogén ellen termelődik,
így vírusokat, baktériumokat, gombákat,
azok toxinjait neutralizálja, a komplementrendszer
aktiválásával (klasszikus út) azokat elpusztítja, vagy
a kórokozók opszonizációjával azok fagocitózisát is
elősegíti. Az egyes IgG alosztályok effektor funkciói
eltérőek (1ásd 6-2. táblázat).
IgA
Elsősorban a nyálkahártyák védelmét szolgáló immunglobulin.
Monomer formában a vérben és a szövetnedvekben
fordul elő, a dimer formát egy J-lánc
kapcsolja össze, nyálkahártyafelszínre való transzportját
a pFcR biztosítja. A dimer IgA-val együtt lehasad
a receptor extracelluláris része is, és mint szekretoros
komponens védi a molekulát a proteolitíkus enzimektől.
Az IgA számos patogén ellen termelődik, így
vírusokat, baktériumokat, gombákat, azok toxinjait
neutralizálja, az alternatív komplementaktivációs út
elindítója, ugyanakkor viszont a kórokozók opszonizációját
és fagocítózisát csak kismértékben segíti elő.

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
131
zilálódik, molekulatömege 190 kDa. Az IgE molekula
termelődését követően nagy affinitással kötődik a
basophil granulocyták, a hízósejtek és az eosinophil
granulocyták Fce-receptorához, vérbeli koncentrációja
rendkívül alacsony. Az IgE-nek alapvető szerepe
van az azonnali túlérzékenységi reakcióban és a paraziták
(férgek) elleni immunitás kialakításában. Nem
aktiválja a komplementrendszert, hőre érzékeny.
Az immunglobulinok koncentrációjának megközelítő
mennyiségi meghatározását fehérjeelektroforézissel
végzik (6-8. ábra). Ezzel a módszerrel a
vérplazmafehérjéket albuminra, α 1
-, α 2
,- β 1
-, β 2
- és
γ-globulinra választják szét, töltésüknek és méretüknek
megfelelően. Az immunglobulinok a g régióban
vannak. Myeloma és néhány más betegség esetén egy
adott immunglobulin rendkívül nagy koncentrációban
van jelen, amely monoklonálisnak tekinthető, és
elektroforézissel egy éles sávot ad.
Az immunglobulin-izotípus meghatározás minőségi
vizsgálata végezhető immundiffúzóval, immunelektroforézissel
vagy immunfixációval, mennyiségi
mérésük nefelometriával, turbidimetriával vagy ELI-
SA módszerrel.
Ellenanyag-affinitás, aviditás
Az antigén-ellenanyag komplexben a két molekulát
nem-kovalens kötések tartják össze. Ilyenek:
Coulomb-erők, hidrogénhidak, elektrosztatikus
erők, van der Waals-erők, hidrofób kapcsolatok. Az
antigén-antitest kapcsolódás legegyszerűbb formája,
amikor univalens ligandum (haptén) reverzibilisen
kapcsolódik az immunglobulin antigénkötő helyéhez.
Az egy immunglobulin-molekulához a telítettség
állapotában kapcsolódó ligandumok száma fejezi
ki az ellenanyag valenciáját (6-9. ábra).
Az antigénkötő hely és a ligandum kapcsolódása
reverzibilis, a kölcsönhatás során az antigén koncentrációjától
és a kötés erősségétől függő dinamikus
egyensúlyi állapot alakul ki.
Az ellenanyagot Ab-vel (antibody), az antigént
Ag-vel jelölve:
2Ag + Ab ↔ Ag 2
– Ab
6-8. ábra. A fő szérumfehérje-frakciók és az azokhoz tartozó
fehérjék
(Rövidítések, sorrendben – Gc: D-vitamin-kötő globulin;
AT 3
: antitrombin III; pl: plazminogén; aLp: a-lipoprotein;
Hpt: haptoglobin; C1q: C1 komplementfaktor q része;
CRP: C-reaktív protein; a 1
-Ac: a 1
-kimotripszin; a 1
-At:
a 1
-antitripszin; a 2
-M: a 2
-makroglobulin; Tf: transzferrin;
C3: C3 komplementfaktor; Fibr: fibrinogén; pre-A: prealbumin;
a 1
-Ag: a 1
-sav-glikoprotein; b-Lp: b-lipoprotein;
IaTI: inter-a-tripszininhibitor; C4: C4 komplementfaktor;
IgM: M immunglobulin; C1-inh: C1-inhibitor; C5:
C5 komplementfaktor; C1s: C1 komplementfaktor s része;
Hpx: hemopexin; IgA: A immunglobulin; IgD(E): D (E)
immunglobulin; Cer: cöruloplazmin; Fn: fibronektin; IgG:
G immunglobulin; C1r: C1 komplementfaktor r része; FB:
B faktor)
6-9. ábra. Az immunglobulin-valencia és -aviditás viszonya

132 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
Hagyományosan azonban a következő sémával jelölik
a reakciót, vagyis a két egyforma kötőhely közül
csak az egyikre vonatkozóan:
Ag + Ab ↔ Ag – Ab
Ez annyiban jogos, hogy a két kötőhely általában egymástól
függetlenül és egyforma egyensúlyi állandóval
reagál. A reakció egyensúlyi állandója:
[Ag-Ab]
K eq
=
[Ag] [Ab]
Az egyensúlyi állandó széles határok közöttt változik
a különböző antigén-antitest párok esetén. Sok esetben
K eq
> 10 8 ~ 10 10 , ami azt jelenti, hogy a képződő
komplexek nagyon stabilak, ill., hogy a reakció nagyon
híg oldatban is a komplexképződés irányába
történik.
A kapcsolódás erősségének mértéke az ellenanyag
affinitása (6-10. ábra), amelyet azzal az antigénkoncentrációval
jellemezhetünk, amely a rendszerben
6-10. ábra. Az antigén-antitest reakció affinitása. Az antitest
(Ab) affinitása kifejezi azt, hogy miyen erővel képes
kötődni az antigénhez (Ag). Ezt az antigén-antitest komplex
(Ag-Ab) képződésének egyensúlyi állandójával (K eq
)
írhatjuk le
6-12. ábra. A komplex antigén poliklonális immunválaszt
vált ki, ami eltérő specificitású ellenanyagok termelődéséhez
vezet
lévő antigénkötő helyek felének telítéséhez szükséges.
Az antigénnek ez a mol-ban kifejezett koncentrációja
a disszociációs konstans (Kd). A kisebb Kd-érték
nagyobb affinitást jelent, ami ellenanyagok esetében
10 –7 -10 –11 mol/l között változhat. Egy adott polivalens
antigénnel reagáló immunsavó (poliklonális antitestek)
számos egyedi affinitású antitestet tartalmaz,
amelyek összessége az aviditás (6-11. ábra).
Poliklonális ellenanyagválasznál gyakran tapasztalható,
hogy az ellenanyag-termelést indukáló
antigénnel szerkezeti hasonlóságot mutató más
molekulák, amelyek azonos epitópokat hordoznak,
kisebb-nagyobb mértékben reagálhatnak a termelődött
ellenanyaggal. Ilyenkor keresztreakcióról beszélünk.
Mivel az antigének általában polivalensek,
vagyis több különböző epitópot tartalmaznak, számos,
különböző affinitású ellenanyag termelődését
váltják ki (6-12. ábra).
Antitest-előállítási módszerek
6-11. ábra. Az antigén–antitest reakció aviditása. Az aviditás
a több kötőhellyel rendelkező antigének és több kötőhellyel
rendelkező antitestek között kialakuló kötések
együttes erősségére utal (az affinitás egyetlen antitest és
antigén között kialakult kötéserősség)
Immunizálás
Immunanalitikai célra leginkább IgG osztályú ellenanyag
előállítása a cél. Ehhez a megfelelő antigén
kiválasztásán kívül a bejutás helye, módja és a kísérleti
állat megfelelő kiválasztása is nélkülözhetetlen.
Immunogenitás szempontjából az antigéneket osztályozhatjuk
kémiai természetük (fehérje > polipeptid
> poliszacharid > lipid > nukleinsav), méretük, bio-

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
133
lógiai tulajdonságaik szerint. Megfelelő nagyméretű
antigének (pl. vírusok, baktériumok, sejtek, fehérjék,
polipeptidek, poliszacharidok) önmagukban is
immunogének, míg kisebb molekulák csak polimer
formájában vagy hordozóhoz kapcsoltan váltanak ki
immunválaszt. Fehérjehordozóként leggyakrabban
KLH-t (Keyhole Limpet Hemocyanin: extrém nagy
méretű, vegyes összetételű, glikozilált, réziontartalmú
protein, piros kürtcsigákból nyerik ki), borjú szérumalbumint
(BSA), vagy tireoglobulint (Tg) használunk,
amelyek jó immunogének és megfelelő számban
tartalmaznak haptének kapcsolódására alkalmas
oldalláncokat (–NH 2
, –SH, fenol, imidazol). A poliszacharidok
fehérje hordozó nélkül T-sejttől független
immunválaszt váltanak ki, amelyet alacsony affinitású,
IgM ellenanyagok túlsúlya jellemez.
Az oltóanyagot leggyakrabban a bőrbe (intradermalis),
a bőr alá (subcutan), izomba (intramuscularis),
a hasüregbe (intraperitonealis), ritkábban intravenásan
adjuk be a kísérleti állatnak. Az optimális
immunválasz kiváltásához szükséges antigén menynyisége,
a beadás módja, az ismételt oltások gyakorisága
fajonként jelentősen eltér.
A létrejövő immunválasz minőségi és mennyiségi
jellemzőit jelentősen befolyásolják az antigénnel beadott
segédanyagok, az ún. adjuvánsok, amelyek a válasz
specificitását nem befolyásolják. Szerepük az antigén
felszívódásának, bomlásának lassítása (olajok,
alumíniumgélek alkalmazásával), a nem specifikus
gyulladásos reakció kialakulásának elősegítése (elölt,
nem virulens kórokozókkal) és ezzel az antigénbemutatás
hatékonyságának növelése. A leggyakrabban
alkalmazott kórokozók közül egérben a Bordetella
pertussis IgG 1
és IgE, a Mycobacterium tuberculosis
IgG 2a
-termelését váltja ki.
Poliklonális antitest
A hagyományos in vivo immunizálással előállított
ellenanyagok poliklonális jellegűek, vagyis több
B-sejt-klón termékei, ezért a szérumból izolálható ellenanyagok
sok szempontból heterogének (6-13. ábra).
Az olyan minőségi paraméterek, mint epitópspecificitás,
affinitás, izotípusmegoszlás határozzák meg alkalmazhatóságukat
és titerüket egy adott rendszerben. Az
antitesttiter azt a szérumhígítást jelenti, amely az adott
mérési rendszerben még pozitív eredményt ad.
A poliklonális ellenanyag ezen heterogenitása
egyben az ellenanyag mint reagens előnye is, mert
6-13. ábra. A poliklonális antitest az antigén több epitópját
ismeri fel
ugyanannak az antigénnek különböző determinánsait
ismerik fel, így keresztkötésen, mint pl. precipitáción,
agglutináción, ill. az Fc-függő funkciókon alapuló
módszerekben (komplementaktiváció) jól alkalmazhatók.
További előnyük viszonylag olcsó előállíthatóságuk,
bár ha figyelembe vesszük a szükséges nagy
tisztaságú antigén előállítási költségeit és a kiválasztott
állatfaj költségeit, az egyes állatokból nyert szérumok
ismételt minőségi vizsgálatait, hosszú távon
nem biztos, hogy olcsóbb a híbridóma technikával
előállított monoklonális ellenanyagok termelésénél.
A poliklonális reagensek hátránya továbbá, hogy rokon
szerkezetű antigénekkel gyakori a keresztreakció,
amit jelentős titerveszteség árán, affinitás-előtisztítással
lehet kiküszöbölni.
Poliklonális ellenanyag előállításakor célszerű párhuzamosan
több állatot immunizálni és az antigénspecifikus
ellenanyagok megjelenését egyedenként
követni minden oltás után. Az ellenanyagtiter változását
célszerű az oltások előtt vett ún. preimmun
szérumhoz hasonlítani abban a tesztrendszerben,
amelyben majd az ellenanyagot alkalmazni szeretnénk.
A hiperimmun savó előállításához célszerű az
oltások között 3-4 hetet várni és az újraoltásokat az
első oltásnál kisebb antigénmennyiséggel végezni, az
affinitásérés így növelhető. Hapténekkel való immunizálásnál
a teszteléshez és az immunizáláshoz célszerű
a haptén molekulát más-más fehérje hordozóhoz
kapcsoltan alkalmazni.
Monoklonális ellenanyag előállítása
Felfedezések. A hetvenes években, a myelomák
felfedezése és leírása kapcsán már sikerült megállapítani,
hogy ezek a sejtek egységes típusú ellenanyagot
termelnek, amelyet paraproteinnnek nevezünk.

134 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
1973-ban Jerrold Schwaber ember-egér hibrid
monoklonális antitest előállítási eljárást írt le, majd
1975-ben César Milstein, Georges Köhler és
Niels Jerne tette először közzé a monoklonális antitestek
létrehozásának elvét. 1984-ben orvosi Nobel-díjat
kaptak érte.
Az eljárás sejtfúzión alapul, megpróbáltak egy ellenanyagot
termelő B-sejtet egy myeloma-sejtvonallal
egyesíteni, ez a hibridóma technológia (6-14. ábra).
A fúzió célja a kétféle sejt tulajdonságainak egyesítése
volt. Az adott tulajdonságú antitestet termelő B-sejtet
hiába izoláljuk, sejttenyészetben nem osztódik. A
myelomasejtek viszont korlátlanul osztódnak (immortalitás).
Egyesítésükkel tehát egy bizonyos antitestet
termelő és korlátlanul, gyorsan szaporodó, stabil
sejtvonalat kaphatunk. A monoklonális antitestek
termelése során egy specifikus antigénnel ismételten
oltanak beltenyésztett egereket (ma már patkányt és
nyulat is), így a többlépcsős immunizálással a kívánt
antitestet termelő B-sejtek száma nagymértékben növelhető.
Ezek feldúsulási helye a lépben és a nyirokcsomókban
van. A lépből izolált lymphocytákat in
vitro fuzionáltatják egy folyamatos Sp-2/0-Ag14 egér
myeloma-sejtvonallal. Fontos, hogy ez a sejtvonal
ugyanabból a fajból származzék, mint az immunizált
állat, stabil, könnyen fenntartható, gyors szaporodóképességgel
rendelkezzék, továbbá önmagában
ne termeljen ellenanyagot, és rendelkezzék egy olyan
enzimhiánnyal (HGPRT, hipoxantin-timidin-foszforibozil-transzferáz
és TK, timidin-kináz), amelynek
kihasználásával könnyen elkülöníthetők a B-sejt–
myeloma hibridektől.
A sejtfúziót legegyszerűbben polietilén-glikol
(PEG) segítségével lehet létrehozni, amely reverzibilisen
megbontja a sejtek vízburkát, így a szorosan egymás
közelébe került sejtek lipidmembránjai összeolvadhatnak.
A véletlenszerű sejtfúzió után a kevert
sejteket szelektálni kell, HAT médium (hipoxantin,
aminopterin, timidin) segítségével, amelynek jelenlétében
a myelomasejtek szaporodása leáll, csak a hibrid
sejtek tudnak túlélni. A sejteket 96 lyukú steril szövettenyésztő
lemezeken tenyésztjük, és kb. 7–10 nappal
a fúzió után a sejtek felülúszóit teszteljük antigénspecifikus
antitesttermelésre egy megfelelően gyors, sok
minta vizsgálatára alkalmas módszerrel (pl. ELISA,
áramlási citometria stb.). Az antitesttermelő, túlélő
sejtek szétválogatását a klónszelekció módszerével végezzük,
amikor a sejttenyészetet 96 lyukú lemezekre
tesszük ki olyan hígítással, hogy elvileg minden lyukba
1 sejt kerüljön. A hibrid sejtek növekedését invert
mikroszkópos vizsgálattal tudjuk ellenőrizni. Mivel
ez véletlenszerű esemény, a pozitív, antitestet termelő
sejtvonalakat ismételt klónszelekciónak (stabilizálás)
tesszük ki mindaddig, amíg a klónozás összes sejt-
6-14. ábra. Monoklonális ellenanyag (antitest) előállítása hibridómatechnikával

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
135
vonala a kívánt antitestet termeli. A kiválasztott klón
sejtjeit ezután egyre nagyobb tenyésztőedénybe helyezve
felszaporítjuk, egy részüket dimetil-szulfoxid-
(DMSO-) tartalmú tápfolyadékban lefagyasztva tároljuk,
másik részüket antitesttermelésre használjuk
fel. A felülúszóból nyert antitestet tovább jellemezzük
izotípus, affinitás, keresztreakciók, egyes módszerekben
való alkalmazhatóság, tisztíthatóság szempontjából
(http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/monoclonalantibodies.html).
A monoklonális ellenanyagok előnyei immunanalitikai
módszerekben. A monoklonális ellenanyagok
nagyfokú specificitásuk miatt alkalmasak molekulák
epitópról epitópra való analízisére. Ugyanakkor
a monoklonális ellenanyag – szemben a poliklonális
ellenanyagokkal – nem alkalmas az egész molekula
felismerésére (6-15. ábra). Előfordulhat, hogy egy
monoklonális ellenanyag többféle antigén azonos
epitópjait ismeri fel: ezt keresztreaktivitásnak nevezzük.
Ennek a keresztreakciónak az oka lehet közös
aminosavszekvencia, szénhidrát- vagy lipidoldallánc
a különböző molekulákban. Az anti-CA 19-9 antitest
olyan közös szénhidrátepitópot ismer fel, amely mint
6-15. ábra. Ellenanyagok összehasonlítása
a) Monoklonális ellenanyag: azonos specificitású ellenanyag-molekulák;
egyetlen B-sejtből származó sejtvonal
(sejtklón) termeli ezeket; egyetlen epitóp felismerésére képesek
b) Poliklonális ellenanyag: eltérő specificitású több ellenanyag
keveréke; több B-sejt-klón termékei; egy adott antigén
eltérő epitópjait ismerik fel
6-16. ábra. A monoklonális antitest az antigén egyetlen
epitópját ismeri fel
tumormarker különböző méretű és formájú molekulák
mérésére alkalmas. Ugyanakkor a nagyfokú specificitás
miatt a különböző monoklonális antitestekkel
különbség tehető izoenzimek, fehérjeizotípusok,
molekulák konformációs eltérései között. A monoklonális
ellenanyagok előnye, hogy a stabil sejtklónból
gyakorlatilag korlátlan mennyiségben lehet ugyanazon
minőségű, egy epitóp felismerésére alkalmas,
azonos izotípusú, ritkán keresztreagáló antitestet előállítani
(6-16. ábra). Ezért a monoklonális ellenanyag
technológia rendkívül hasznos és csaknem ideális
reagenseket biztosít a klinikai laboratóriumnak az
immunoassay tesztrendszerekben.
A monoklonális ellenanyagok immunanalitikai
felhasználásának előnyei:
• A monoklonális ellenanyagok jól definiálható
reagensek.
• Korlátlan mennyiségben előállítható, homogén,
állandó affinitású és specificitású reagensek.
• Monoklonális ellenanyag előállítható nem tisztított
antigénnel végzett immunizálással is.
A monoklonális ellenanyagok felhasználásának korlátai:
• Elégtelen precipitációs és agglutinációs reaktivitásúak,
mert egyetlen monoklonális ellenanyag
nem vagy csak mérsékelten tud nagy immunkomplex-kialakulást
eredményezni.
• Nagy, heterogén epitópokkal rendelkező antigént
nehezebb egyetlen epitópjára specifikus
monoklonális ellenanyaggal immunkémiailag
jellemezni.
Antitest előállítása rekombináns technológiával
Elsőként Skerra és Pluckthun (1988) állította
elő rekombináns technikával egy specifikus antitest
Fv-fragmensének variábilis doménjeit E. coliban expresszáltatva.
Ez a technológia tette lehetővé enzimmel
fuzionáltatott kiméra antitestek előállítását. A „phage
display” technológia (Winter, 1994) segítségével antitestfragmenseket
állítanak elő előre meghatározott
kötőspecificitással, immunizálás nélkül. Ehhez egy
random antitest variábilis régió (V) gén-könyvtár
(génrepertoire) kerül megalkotásra elsőként in vitro,
amelyet bakteriofágban expresszáltatnak (6-17.
ábra). Ebből a fágkönyvtárból az antigén segítségével
ki lehet válogatni a megfelelő V-géneket expresszáló
fágot, azt föl lehet szaporítani és baktériumban meg-

136 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-17. ábra. A fág-display technika ellenanyag előállítására
termeltetni. A kiválasztott antitest affinitása mutációkkal
tovább növelhető. Ezzel a módszerrel nagy aviditású
ellenanyagokat lehet előállítani laboratóriumi
felhasználásra.
Ellenanyagok tisztítása
Különböző mértékben tisztított ellenanyagra számos
módszer alkalmazásakor szükség van. A jó hiperimmun
szérumok antigénspecifikus poliklonális
ellenanyag tartalma általában 0,1–1 mg/ml. Az in vitro
tenyésztett hybridomák által termelt monoklonális
ellenanyagok koncentrációja pedig nem több mint
10–20 mg/ml.
Ezeket a g-globulinok családjába tartozó fehérjéket
az egyéb szérumkomponensektől, ill. a tápfolyadék
egyéb elemeitől a molekula fizikai-kémiai tulajdonságai
alapján kidolgozott biokémiai módszerekkel (sóval
kicsapás, ioncserélő kromatográfia, gélszűrés stb.)
vagy affinitáskromatográfia segítségével választhatjuk
el. Ez utóbbi módszer alapja az, hogy a különböző osztályba
tartozó ellenanyagok bizonyos molekulákhoz,
pl. növényi lektinekhez (Mannose Binding lektin)
vagy bakteriális fehérjékhez (Staphylococcus Protein
A, Streptococcus Protein G, Peptostreptococcus Protein
L) szelektíven kötődnek (6-3. táblázat). Ezeket a
molekulákat immobilizálva (pl. Sepharose-gyöngyhöz
kötve), oszlopkromatográfiával szelektíven tisztíthatók
a megfelelő osztályba tartozó immunglobulinok
(6-18. ábra). Ha a Sepharose-gyöngyökhöz
antigént kötünk kovalensen, az immunszérumból
vagy felülúszóból az antigénspecifikus ellenanyagok
szelektíven izolálhatók. Az oszlop molekuláihoz kötődő
antitesteket megfelelő alacsony pH-jú és ionerősségű
pufferrel tudjuk eluálni. Ugyanígy fordítva
is, megfelelő tisztaságú antitestet immobilizálva Sepharose-gyöngyökhöz,
kis mennyiségű antigént tudunk
kevert oldatból tisztítani affinitáskromatográfia
segítségével (6-19. ábra).
Ellenanyagok, antigének jelölése
Mivel az antigén-ellenanyag immunkomplex létrejötte
nem okoz minden esetben mérhető változást, ezért
az immunanalitikai mérésekhez legtöbbször szükségünk
van egy jelölő molekulára, amely a teszt típusától
függően lehet akár az antigén, akár az ellenanyag
egy jelölt változata. A jelölés annyit jelent, hogy a
molekulához általában kovalensen hozzákötünk egy
analitikailag jól mérhető részt. Fontos, hogy a jelölő
anyag lehetőleg minél kevésbé változtassa meg az immunreagens
kötődési tulajdonságait. A jelölő molekula
lehet radioaktív izotóp, enzim, fluoreszcens molekula,
kemilumineszcens molekula vagy mágneses
nanopartikulum.

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
137
6-18. ábra. Ellenanyag tisztítása Protein-G Sepharose affinitáskromatográfiával
Radioizotópos jelölés
Ez volt az első jelölési technika, amit az ötvenes
évektől alkalmaztak az immunoassay-knél (RIA,
IRMA). Az izotóp beépítése gyakorlatilag nem változtatja
meg az antigén vagy ellenanyag kötődési tulajdonságait.
Máig ez az egyik legérzékenyebb eljárás,
de mivel drága, és különleges kezelést igényel a radioaktív
izotópok miatt, mára már visszaszorult. A módszer
egyik kidolgozója Rosalyn Sussman Yalow
1977-ben Nobel díjat kapott az inzulin radioimmunoassay-vel
való meghatározásáért.
• Jelölő izotópok:
– 125 I, 131 I (g-sugárzók).
– 3 H, 14 C (lágy b-sugárzók)
• Az eljárás hátrányai:
– A hulladékok elhelyezése gond.
– Korlátozott felhasználási idő.
– Veszélyes anyagokat kell tárolni.
– Költséges mérőberendezés szükséges.
– Állandó szervezett ellenőrzésre, a dolgozók és
a munkahely egészségügyi felügyeletére van
szükség.
6-19. ábra. Antigén tisztítása affnitáskromatográfiával
• A g-sugárzó izotópos jelzés jellemzői:
– Jól kidolgozott, gyors, olcsó jelölés.
– Érzékeny módszer (10 –8 –10 –12 mol/l tartomány).
– Viszonylag rövid felezési idő ( 125 I: 60 nap, 131 I:
8 nap).

138 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-3. táblázat. Különböző fajok ellenanyagainak affinitása
protein A-hoz és protein G-hez
Ellenanyag
Faj Protein A Protein G
humán IgG 1
++++ ++++
humán IgG 2
++++ ++++
humán IgG 3
- ++++
humán IgG 4
++++ ++++
humán IgA ++ -
humán IgD ++ -
humán IgE ++ -
humán IgM ++ -
egér IgG 1
+ ++
egér IgG 2a
++++ ++++
egér IgG 2b
+++ +++
egér IgG 3
++ +++
egér IgM + / - -
patkány IgG 1
- +
patkány IgG 2a
- ++++
patkány IgG 2b
- ++
patkány IgG 2c
+ ++
patkány IgM + /- -
nyúl IgG ++++ +++
hörcsög IgG + ++
tengerimalac IgG ++++ ++
szarvasmarha IgG ++ ++++
birka IgG + / - ++
kecske IgG + / - ++
sertés IgG +++ +++
csirke IgG - +
Fragmensek
humán Fab + +
humán F(ab’) 2
+ +
humán scFv + -
humán Fc ++ ++
humán k - -
humán l - -
– „Lebomlási katasztrófa” – a kémiai szerkezet
is nagymértékben sérül.
– Kiváló minőségű számláló szükséges.
• A b-sugárzó izotópos jelzés jellemzői:
– Jól kidolgozott jelöléstechnika.
– Érzékeny módszer (10 –8 –10 –12 mol/l tartomány).
– Hosszú felezési idő ( 3 H: 12,3 év, 14 C: 5760 év).
– Bonyolult és igen drága számlálóberendezést
igényel.
– Bonyolult és környezetszennyező vegyszeres
előkészítés.
– Kereskedelemi forgalomban nemigen kapható.
Enzimjelölés
A hetvenes években kifejlesztett technika, kevésbé
érzékeny, mint a radioizotópos technika, de sokkal
stabilabb jelölés, nem sugárveszélyes, nem igényel
speciális egészségügyi ellenőrzést, tárolási feltételeket,
ezért jobban elterjedt. Alkalmazásánál az enzimet
nem közvetlenül detektáljuk, hanem annak
kromogén vagy fluorogén szubsztrátját, amelyből az
enzimkatalízis hatására színes termék képződik. A
színreakció egyszerű fotométerrel detektálható, az
abszorbanciaváltozás arányos az enzimaktivitással,
amelynek mértékéből meghatározható a szilárd fázishoz
kötött antigén vagy antitest mennyisége. Az
enzimjelölést alkalmazó immunoassay-k legelterjedtebb
formája az ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay) technika, ahol egy speciális, 96 lyukú
műanyag lemez mélyedéseiben (mikrotiter-tálca)
végzik az immunreakciót, a lemez mélyedései (angolul
well) szolgálnak küvettaként is a fotometriás mérésnél.
A használt jelölő enzim leggyakrabban alkalikus
foszfatáz és peroxidáz, ritkábban b-galaktozidáz
vagy glükóz-oxidáz.
Fluoreszcens jelölés
Az ehhez alkalmazott jelölő anyagok (festékek)
nagyenergiájú (kis hullámhosszú) fénnyel megvilágítva
más, alacsonyabb frekvenciájú fényt bocsátanak
ki. Ezt a jelenséget fluoreszcenciának nevezik. Néhány
mintának önmagában is van fluoreszcens tulajdonsága,
az alkotó vegyületektől függően, ezt autofluoreszcenciának
nevezik.

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
139
Probléma: biológiai mintákban fluoreszcens anyagok
(pl. fehérjék, bilirubin, egyes vitaminok) interferálhatnak,
ami háttér-fluoreszcencia, autofluoreszcencia
formájában jelentkezik.
Előnyei:
• Az enzimjelöléssel szemben nagyobb érzékenység,
kisebb mérési tartomány (10 –14 mol/l vs.
10 –8 mol/l).
• Nagyon érzékeny és segítségével kis molekulák
is kimutathatók, ezért elterjedt a modern biológiai
kutatásokban
Sok különféle fluoreszcens jelölőfesték létezik, pl.
fluoreszcein, rodamin B, lantanida kelátkomplexek,
umbelliferonszármazékok.
Kemilumineszcencia
A gerjesztés kémiai reakcióban történik. A gerjesztett
állapotú termék molekula-fénykibocsátással
tér vissza alapállapotba. Általában oxidációs reakciókban
fordul elő, amikor egy molekulát erős oxidálószerrel
(pl. hidrogén-peroxiddal) lúgos közegben
oxidálunk.
Biolumineszcencia
A kemilumineszcencia sajátos esete, amikor a kémiai
reakciót enzim katalizálja. Ilyen a szentjánosbogárban
lejátszódó reakció, amelyet a luciferáz enzim
katalizál:
luciferin + oxigén = oxiluciferin + foton
Jellemzői:
• Érzékenyebb, mint a fluoreszcens módszerek,
jelenleg az egyik legérzékenyebb jelölés.
• Probléma, hogy a szennyeződések és a biológiai
mátrix zavarhatja a mért jelet.
• Jelölő anyagok: luminol, izoluminol, akridínium-észterek
stb.
Konjugálási módszerek
A kiválasztott immunoassay sikeres működése nagymértékben
függ attól, hogy a jelölő molekula (enzim,
fluorofor stb.) kapcsolódása ne változtassa meg az antigén/antitest
biológiai tulajdonságait (konformáció,
affinitás, antigenitás stb).
Glutáraldehiddel való konjugálás esetén (Avrameas,
1978) a glutáraldehid aldehidcsoportjai kapcsolódnak
a fehérjék aminocsoportjaihoz. Ez magas
pH-n lezajló, kevert reakció, amely különböző formátumú
konjugátumokat eredményez, mivel több aktív
csoport kapcsolódik össze.
A perjodátos módszer (Nakane, 1966) az antitestek
peroxidáz enzimmel való jelölésére terjedt el, mivel
szénhidrátot tartalmaz a molekula.
E módszerek nem alkalmasak a molekulák térbeli
konfigurációjának megtartására, ezért újabb konjugálási
eljárásokat fejlesztettek ki bivalens reagensek
felhasználásával, mint az m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter
(MBS), ahol annak aktivált
észter- és maleimidcsoportjai reagálnak –NH 2
és
–SH csoportokkal egyaránt, összekapcsolva azokat.
N-hidroxiszukcinimid (NHS) felhasználásával a molekulák
karboxicsoportjait is használhatjuk jelölésre,
ami a fehérjék –NH 2
csoportjaihoz kapcsol. Ez a
módszer felhasználható fehérjék szilárd fázisú hordozóhoz
kapcsolására is.
Immunológiai alapú laboratóriumi
módszerek csoportosítása
• Elválasztás-technikai mérőmódszerek: affinitás-kromatográfia,
immundiffúzió, immunelektroforézis.
Ezek a 4. fejezetben már részletezésre
kerültek.
• Optikai mérőmódszerek: turbidimetria, nefelometria
• Immunanalitika: immunoassay
Antigén-antitest reakciókon alapuló
módszerek
Az antigén- és ellenanyag-molekula kölcsönhatása
az antigénkötő hely és a megfelelő epitóp kapcsolódásán
alapul, amelyet elsődleges kölcsönhatásnak
nevezünk. Bivalens vagy polivalens antigének két
vagy több antitest összekapcsolódását eredményezhetik,
ami az Fc-részek interakciójához vezethet. Az
így kialakuló másodlagos kölcsönhatások az antigén-antitest
között kialakuló térhálószerkezet, vagyis
immunkomplex keletkezéséhez vezetnek. Ezek általában
az oldatból kiválva az antigén természetétől

140 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
függően precipitálódnak vagy agglutinálódnak. Az in
vitro immunkomplex-képződés számos immunológiai
módszer alapja, így a laboratóriumi gyakorlatban
igen elterjedt.
Precipitáción alapuló eljárások
6-20. ábra. Heidelberg-görbe. Az antigén-antitest reakcióban
képződő immunkomplex keletkezésének jellemzői
Egy oldott polivalens antigénmolekula és az ellenanyag
kölcsönhatása precipitátum képződéséhez vezethet,
ha a két komponens megfelelő arányban van
jelen. A reakcióban a komponensek optimális kapcsolódásához
azok megfelelő aránya, a közegben
fennálló megfelelő pH, ionerősség és hőmérséklet
szükséges, valamint fontos az ellenanyag affinitása és
aviditása is. A végleges térháló kialakulása optimális
tényezők jelenlétében is hosszabb ideig tart (30–120
perc). Azonos antigénmennyiséghez növekvő ellenanyag-mennyiséget
adva, vagy fordítva, állandó antitestkoncentrációhoz
növekvő antigénmennyiséget
adva ún. precipitációs görbét írhatunk le, ez jellegzetesen
Gauss-görbe alakú (6-20. ábra), és Heidelberg
írta le 1935-ben. A jellegzetesen 3 szakaszra osztható
függvény segítségével mennyiségileg meghatározható
az antigén : antitest arány. A görbe első szakaszára
jellemző az antitesttúlsúly, amikor a precipitátumtól
elválasztott felülúszóban szabad antitest mutatható
ki. Tovább növelve a hozzáadott antigén mennyiségét
egyre több és nagyobb térháló képződik, elérve az ún.
ekvivalenciazónát, ahol szabad antigén és szabad antitest
nem található. A görbe harmadik szakaszában
antigéntúlsúly jön létre, amikor a precipitátum menynyisége
újra csökken. Valamely analit meghatározásához
optimalizálni kell azt az antitestkoncentrációt,
amellyel az ekvivalenciazónában tudunk mérni egy
molekulát dinamikus határok között.
Immunprecipitátumokat oldatban a nefelometria
és turbidimetria segítségével, gélben immundiffúziós
eljárások segítségével tudunk festés után vagy UV
fényben meghatározni. A módszer előnye a specificitás
és az egyszerűség, hátránya a viszonylag alacsony
szenzitivitás, amely 0,1–0,5 mg/dL között mozog. Ez
a szenzitivitás ugyanakkor elégséges a fő szérumkomponensek
mennyiségi meghatározásához.
Precipitációs módszerek:
• Kvalitatív precipitációs módszerek
– Egyszerű immundiffúzió (Williams, 1970).
– Kettős immundiffúzió (Garvey, 1977).
– Kétdimenziós immundiffúzió (Williams,
1970).
– Elektroimmunodiffúzió (Ritzmann, 1975.
– Immunoelektroforézis (Rose, 1973).
• 2. Szemikvantitatív precipitációs módszerek
– Egyszerű, radiális immundiffúzió (Fahey,
1965; Mancini, 1965).
– Egydimenziós elektroimmundiffúzió (Axelsen,
1975) („rocket”-elektroforézis).
• 3. Kvantitatív precipitációs módszerek
– Nefelometria (Ritchie, 1978).
– Turbidimetria.
Nefelometria és turbidimetria
E mérőmódszereket nagyobb partikulumok koncentrációjának
mérésére használjuk (mint antigén-antitest
komplex, micropartikulumok stb.),
amelyeket méretük miatt nem tudunk abszorpciós
spektfotometriával vizsgálni. A nefelometria elve,
hogy a mintán áthaladó fény különböző irányban
történő szóródását mérjük, a kapott gyenge optikai
jel felerősítésével. Ezzel ellentétben a turbidimetriánál
a mintán áthaladó fény elnyelődését detektáljuk,
vagyis a fényintenzitás-csökkenést.
Tehát a nefelometria és a turbidimetria egy szuszpenzióban
keletkezett részecskék okozta fénysugárzás
szóródásának mérésén alapul (6-21., 6-22., 6-23.
ábra). Amikor egy párhuzamos fénysugár a szuszpenzióban
egy részecskéhez ér, a fény egy része elnye-

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
141
lődik vagy reflektálódik, szóródik, a nagyobbik része
viszont áthalad a mintán. Egy adott oldat részecskéinek
fényszórását mérjük a nefelometriában. A fény
hullámhosszától függően 3 különböző fényszóródás
jöhet létre:
• Ha a fény hullámhossza (λ) sokkal nagyobb,
mint a részecske átmérője, akkor a fény szóródása
szimmetrikus a részecske körül. A legkisebb
fényszóródás a beeső fénysugárra 90°-os
szögben mérhető.
• Ha a fény hullámhossza jóval kisebb a részecske
átmérőjénél, a fény előrefelé szóródása romlik a
hátrafelé szóródásnak köszönhetően (Mieteória).
• Ha a hullámhossz nagyrészt megegyezik a
részecske méretével, nagyobb az előrefelé történő
fényszóródás, mint más irányokba, amit a
Rayleigh–Debye teória ír le.
6-21. ábra. A nefelometria mérési elve
6-23. ábra. A nefelometria és a turbidimetria optikai részei
Mivel az antigén-antitest komplexek átmérője a 250–
1500 nm tartományba esik, a nefelometriában használt
320–650 nm-es fénysugár főként előrefelé szóródik
(Rayleigh–Debye típus).
Nefelométer
Egy tipikus nefelométer részei: fényforrás, kollimátor,
monokromátor, mintatartó küvetta, szórt
fény csapda és fotodetektor. A részecskék által szórt
fényt tipikusan a küvettából kijövő fényre 15–90°-os
szögben detektáljuk. A megvilágító lézerfény általában
kisteljesítményű hélium-neon lézerből származik,
amely koherens, monokromatikus (632,8 nm
hullámhosszúságú) és polarizált. A biológiai anyagok
önmagukban ezen a hullámhosszon nem mutatnak
elnyelődést. A nefelometria a turbidimetriánál jóval
érzékenyebb módszer, mivel nem a fényszórással arányos
fényintenzitás-csökkenés mérését, hanem magának
a szórt fénynek a mérését jelenti.
Turbidimetria
Valamely részecske képződése következtében egy
áthaladó fénynyaláb intenzitásának csökkenését méri
a turbidimetria. A szuszpenzióban abszorbeált fény
arányos a minta koncentrációjával és a részecskemérettel.
A nagy érzékenységű fotodetektorok alkalmazásával
a látható fény kis intenzitásváltozásai is detektálhatók,
így a módszer érzékenysége megközelíti a
nefelometriáét.
Agglutináción alapuló módszerek
6-22. ábra. A nefelometria elve
1. bejövő fény; 2. nyílás; 3. reakciós lombik; 4. fénydetektor
A folyamat abban különbözik a precipitációtól, hogy
az antigén vagy antitest nem oldott állapotban, hanem
részecskék (sejtek, vörösvérsejtek, baktériumok
vagy partikulumok) felszínéhez kötve helyezkedik el.

142 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
Így az antigénnel kapcsolódó ellenanyag méretében
és valenciájában is különbség van: általában az IgM
izotípusú ellenanyagok agglutinálnak jól. A dimer
szerkezetű IgA szintén jobb agglutinin, mint az IgG.
Az agglutináció úgy jön létre, hogy a két vagy több
valenciával rendelkező antitest egyik antigénkötő
helye az egyik, a másik antigénkötő helye egy másik
részecske felszínén elhelyezkedő epitóphoz kapcsolódik.
Az agglutináció mértéke ugyanolyan függvénynyel
jellemezhető, mint a precipitáció.
Agglutinációval meghatározhatunk egy mintából
antitestmennyiséget, ha az antigén van a hordozó
felszínéhez kapcsolva (passzív vagy direkt agglutináció).
Reverz agglutinációról beszélünk, ha a megfelelő
antitest van a partikulumhoz hozzákötve, és segítségével
szolubilis antigént mérünk egy mintából. Kis
molekulák, amelyek csak egy kötőhelyet tartalmaznak,
mint a haptének (gyógyszerek, drogok, hormonok
stb.), nem tudnak keresztkötéseket létesíteni, így
nem agglutinálnak. Ezt úgy lehet áthidalni, hogy a
haptént immobilizáljuk a hordozóhoz, és egy agglutinációt
gátló kompetíciós assay segítségével mérjük
a mintában lévő haptén mennyiségét. Ezt használják
ki a terhességi gyorstesztek, ahol ily módon vizeletből
tudunk humán koriogonadotropint (hCG) meghatározni.
Passzív agglutináció – hordozó felszínek
Vörösvérsejtek, zselatinpartikulumok, liposzómák
és különböző latexpartikulumok alkalmasak hordozó
felszínnek. Az agglutinációban használt hordozó
részecske mérete 7–0,01 μm között változik, fontos a
töltése, a hidrofobicitás és a stabilitása. E nagy méretkülönbség
miatt a felszínükön lejátszódó antigén-antitest
reakciót nem lehet egyetlen mechanizmussal
leírni. A 3–5 μm-nél nagyobb partikulumokra a
Brown-mozgás jellemző, és szobahőmérsékleten nem
zavarja a diffúzió. Ugyanakkor a kis latex-mikropartikulumoknál
a kolloid koagulációs reakciót figyelembe
kell venni. A multivalens IgM antitest 750-szer
jobb agglutináló ágens, mint a bivalens IgG, mert a
részecskék közti távolság 120 nm-nél kisebb kell hogy
legyen az antitest hossza miatt.
Hemagglutináció
A vörösvérsejtet mint passzív hordozót előszeretettel
alkalmazzák agglutinációs tesztekhez, mivel a
reakciót egyszerű végrehajtani és nem igényel speciális
felszereltséget. Főleg a fejlődő országokban terjedt
el számos infekciót jelző antitestet meghatározó
passzív agglutinációs eljárás, mint a Treponema pallidum,
a hepatitis B vírus (HBV), a hepatitis C (HCV),
a humán immundeficienciavírus (HIV-l, HIV-2) elleni
antitest szerológia. Reverz agglutinációs tesztet
használnak a HBV surface (felületi) antigénje, az
α-fötoprotein (AFP), a humán hemoglobin székletmintából
való meghatározásához. Az ilyen antigénmeghatározó
gyári teszteknek a szenzitivitása közel
50 ng/mL antigén (analit).
Zselatinrészecske agglutinációja
A hidrofil felszínű speciális, kb. 3 μm átmérőjű
zselatinrészecskék előnye, hogy nincs saját antigenitásuk,
viszont nagyobb a szenzitivitásuk, mint a
vörösvérsejteknek, és a teszt elvégzése nem igényel
pontos hőmérséklet kontrollt. Infekciós szerológiai
vizsgálatoknál érzékenysége megközelíti az ELISA
érzékenységét.
Latexagglutináció
Leginkább a terhességi gyorstesztekben terjedt el,
de használják plazmafehérjék detektálására is. A latex
mint szilárd fázis jó kinetikai tulajdonságú. Rövidebb
immunreakciós idővel kell számolni. Kvantitatív
tesztként adaptálták turbidimetriára és nefelometriára
is, ahol az 1 μm-nél kisebb részecskék fényszóródást
okoznak. A teszt érzékenysége tized ng/mL, míg
a precipitáción alapuló immunkomplexet mérő turbidimetriás
módszereké kevesebb mint 0,5 μg/mL.
Ma már működnek latexpartikulum alapú automata
rendszerek, amelyekkel óránként közel 200 tesztet
végezhetünk el ng/mL érzékenységgel. A részecske
alapú immunoassay-k előnye, hogy egyszerűek, mert
nem igényelik a kötött és a szabad reaktánsok szeparálását.
Immunoassay
Immunoassay-típusok csoportosítása
Csoportosítás a jelölő molekula szerint
Minden immunoassay-ben szükség van jelölt molekulára,
hogy a mintában jelen lévő antigén vagy
antitest mennyiségét meg tudjuk mérni. A jelölő molekula
részt vesz az immunreakcióban, így a létrejövő
szignálváltozást mérhetjük a mintában. A módszer tí-

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
143
6-24. ábra. Immunoassay-formátumok a jelölés helye szerint
a) Indirekt immunoassay-ben és szendvicsformátumban
jelölt antitestet alkalmaznak
b) Kompetíciós formátumú immunoassay-ben jelölt antigént
alkalmaznak
6-25. ábra. RIA; radioaktív jelölést használnak
pusa szerint akár az antigént, akár az ellenanyagot is
jelölhetjü, mint reaktánst (6-24. ábra).
Yalow és Berson 1959-ben fejlesztette ki és tette
közzé a radioimmunoassay (RIA) módszert, amelyben
radioizotópos jelölést használtak. Ez áttörést jelentett
nyomokban jelen lévő molekulák (analitok)
mennyiségi meghatározásában, és nagymértékben
hozzájárult az alapkutatás és a klinikai laboratóriumi
módszerek fejlődéséhez. Így pl. az inzulinbioassay-t
helyettesítette az inzulin mennyiségi meghatározása
RIA-val. A szolid fázisú RIA-ban lehetőség van az
izotóppal jelzett kötött és szabad molekulák egyszerű
elkülönítésére. A radioizotópos módszer veszélyessége
miatt azonban egyre inkább előtérbe kerülnek
a nem izotópos immunoassay-k, amelyek enzimet,
fluorokrómot vagy más jelölő anyagot használnak az
antigén-ellenanyag reakció kimutatására (6-25. ábra).
Az enzimimmunoassay (EIA) a korai hetvenes
években került kifejlesztésre (Engvall, 1971; Van
Weeman, 1971), és hamarosan nagy népszerűségre
tett szert. A jelölő enzim katalitikus aktivitásának
turnovere szerint felerősíti a jelet. Az egyre újabb, érzékenyebb
és jobb kromogének, fluorofórok és kemilumineszcens
molekulák megjelenésével a rendelkezésre
álló szubsztrátok köre lehetővé tette a módszer
szenzitivitásának növelését. A kiválasztott szubsztráttól
függően beszélünk fluoreszcens enzimimmunoassay-ről
vagy kemilumineszcens enzimimmunoassay-ről
(Thorpe, 1984).
A fluoreszcens immunoassay-k (FIA) fluorofórokat
használnak jelölő molekulának. A fluorofórokat megfelelő
hullámhosszúságú fényenergiával kell aktiválni
(excitáció), hogy mérhető fényemissziót adjanak. A
FIA szenzitivitása kissé alacsonyabb az EIA-énál a biológiai
minták jelentős háttér-fluoreszcenciája miatt.
A 100 ns tartamú késleltetett fluoreszcencia emissziós
fluorofórok az időeltolódásos FIA-ban használhatók.
Az új típusú fluorofórok bevezetése nagymértékben
javított a FIA érzékenységi tartományán, mivel olyan
hullámhosszon működnek, ahol eltűnt a háttérzaj. A
fejlett műszeres háttér bevezetése oly mértékben növelte
a FIA érzékenységét, hogy extrém kis koncentrációk
is mérhetőek vele (10 –15 mol/l).
Kemilumineszcens immunoassay-ben mesterséges
vagy a természetben előforduló (aequorin) kemilumineszcens
jelölő molekulát használunk. A kemilumineszcens
molekula nem fény-, hanem fizikai (pl.
elektromos) gerjesztő energiát igényel ahhoz, hogy
fényemisszót generáljon. Az oxidoredukciós elven
alapuló reakcióban nincs lehetőség amplifikálásra,
mivel egy foton generálódik a molekula alapállapotba
történő visszatérésekor. Számos új, egyre jobb molekula
került felhasználásra az elektrokemilumineszcens
immunoassay-ben. A tribifenilek fémkelátjai folyamatosan
emittálnak fényt egy oxidoredukciós reakcióban
elektródok felszíné. (Blackburn, 1991).
Az eddig említett különböző eljárásoknál a módszer
érzékenységét nagymértékben meghatározza
a reaktánsok asszociációs konstansa (affinitás vagy
aviditás), a jelölő molekula jelintenzitása és a jel : zaj
arány is.
A 125 I izotópok esetében 7 millió molekula generál
1 foton/s jelet, míg enzimek kemilumineszcens
szubsztrátjait alkalmazva 6 nagyságrenddel lehet növelni
a teszt érzékenységét. Ez az enzimek katalitikus
aktivitása miatti amplifikációnak köszönhető.
A mérés elve szerinti csoportosítás
Az immunoassay-technológiák különböző formátumaiban
az antigén-ellenanyag komplex különbözőképpen
kerül elválasztásra a szabad (jelölt) reaktáns-

144 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
tól. Ezek alapján e módszerek 4 kategóriára oszthatók:
nem-kompetitív és kompetitív immunoassay-k, valamint
homogén és heterogén immunoassay-k.
Kompetitív immunoassay-forma
Ebben az immunoassay-formátumban a mintában
lévő mérendő molekula, vagyis a jelöletlen analit
(legtöbbször az antigén) verseng a jelölt antigénnel az
antitest kötőhelyeiért. A jelöletlen antigén elfoglalja
az antitest kötőhelyeit, így az utólag a mintához adott
jelölt antigén nem tud az antitesthez kapcsolódni. Így
a kompetitív immunoassay-ben a mért kisebb jel azt
jelenti, hogy több jelöletlen antigén van a mintában.
A kompetitív formában tehát az antigén mennyisége
fordított arányosságot mutat a mért jellel (6-26. ábra).
Az egylépéses kompetitív formában mind a jelölt
antigén, mind a mintában lévő antigén egyszerre vetélkednek
a kismennyiségű antitest kötőhelyiért.
A kétlépéses kompetíciós formában az antitest
mennyisége többletben van az antigén koncentrációjához
képest. Az antitestet mint reagenst először a
vizsgálati mintában lévő antigénnel inkubáljuk, majd
a második lépésben adjuk hozzá a jelölt antigént. A
kétlépéses kompetitív assay forma nagyságrendekkel
nagyobb szenzitivitású, mint az egylépéses forma.
Nem kompetitív (szendvics) módszer
A nem kompetitív tesztformátumok nyújtják általában
a legnagyobb szenzitivitást, specificitást;
és leginkább olyan kritikus paraméterek mérésére
használjuk, mint a cardialis és a hepatitismarkerek.
Ezt a nagyérzékenységű formátumot „szendvics”-assay-nek
nevezzük, mert a mérendő molekula (analit)
két specifikus antitest (reagens) közé kötődik be (6-
27. ábra). Ezt a formátumot is alkalmazhatjuk egyvagy
kétlépéses formában is. A kétlépéses formában
egy mosási lépéssel elkülönítjük az összekapcsolódott
szendvicskomplexet a fölöslegben maradt jelölt reagenstől,
ill. más zavaró molekuláktól. Ez a kétlépéses
nem kompetitív formátum biztosítja a legnagyobb
specificitást és szenzitivitást az itt tárgyalt teszttípusok
közül. A nem kompetitív módszernél a jelölt reagens
(általában antitest) mennyisége egyenesen arányos
a mintában lévő antigén mennyiségével. Ezt egy
dózis–hatás görbén ábrázolhatjuk, ahol az x tengelyen
az antigén koncentrációját, az y tengelyen a hatást ábrázoljuk,
amely jelen esetben a mért jel erőssége. Így
minél több antigén van jelen, annál több jelölt antitest
kötődik hozzá, ami egyenes arányosságot jelent.
Homogén és heterogén immunoassay-módszerek
Azokat az immunoassay módszereket, amelyekben
a kötött antigén-antitest komplex szeparálása szükséges
a szabad jelölt reagenstől, heterogén immunoassay-nek
nevezzük. Azokat a módszereket, amelyekben
nem szükséges szeparálási lépést közbeiktatni,
homogén immunoassay-nek hívjuk (6-28. ábra). Ho-
Ab 1 Ab 2
Ag
6-26. ábra. Kompetíciós assay
a) Fordított arány a jel és az analit koncentrációja között
b) Egylépéses kompetíciós immunoassay
c) Kétlépéses kompetíciós immunoassay
6-27. ábra. Nem kompetitív szendvics-assay
a) Egyenes arány a jel és az antigén koncentrációja között
b) Szendvicsassay; az antitestek az antigén két epitópját
ismerik fel (Ab 1 = befogó antitest, Ab 2 = jelölt antitest,
Ag = antigén)

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
145
mogén módszereket alkalmazunk kis molekulák,
mint gyógyszerek, drogmaradványok kimutatására,
pl. EMIT alkalmazásakor. Mivel a homogén módszereknél
nincs szükség az antitest jelölt antigénkomplex
(Ab-Ag*) elkülönítésére a szabad jelölt antigéntől
(Ag*), ezek a technikák sokkal egyszerűbbek és gyorsabb
a kivitelezésük, mint a heterogén módszereké,
amelyekben a két komponens elkülönítésére gyakran
egy szilárd fázisú hordozót alkalmazunk, pl. a mágneses
partikulumokat vagy műanyag gyöngyöket.
A szilárd fázis (hordozó) jellemzői heterogén immunoassay-kben.
Minden heterogén immunoassay-ben
legalább egy szeparálási lépést szükséges beiktatni,
amelyben a szilárd fázishoz kötött immunkomplexet
elkülönítjük a szabadon maradt jelölt reaktánstól.
Az antigén vagy antitest szolid fázishoz kapcsolására
alkalmas a kovalens kötés vagy egyszerű fizikai abszorpció,
nem kovalens interakciók. Szilárd fázisként
alkalmazhatunk agaróz- vagy poliakrilamidgél-partikulumokat,
műanyag mikrogyöngyöket (beads),
polisztirén, ill. polipropilén csöveket, mikrotitráló
lemezeket vagy vas-oxiddal fedett partikulumokat,
amelyeket mágneses térben szeparálhatunk.
A műanyag csövek vagy mikrotitráló lemez mélyedéseiben
a nagy felület miatt az immunreakció gyorsítására
célszerű a reakcióelegyet rázni.
A pro zóna vagy „hook”-effektus, amelyet az analit
magas koncentrációja okozhat, akkor áll elő, ha az
egylépéses módszerben kevés az alkalmazott szilárd
fázishoz kötött vagy jelölt antitest. Mikrotiterlemezen
vagy -csíkon gyakran tapasztalható ún. „széli effektus”,
ami az immunreakció kimutatására használt enzim
hőmérsékletfüggő működésének köszönhető. A
lemez széle és közepe között akár 2 °C hőmérsékleti
különbség is lehet. A szilárd fázis alakja és mérete
is fontos tényező az antigén- vagy antitest befogó
képesség és az immunreakció kinetikája szempontjából.
Szférikus, 3 mm nagyságú, kis mágneses vagy
latexpartikulumok a legideálisabb szilárd hordozófelszínek,
amelyek a legjobb reakcióidőt biztosítják.
Módszerek
Radioimmunoassay (RIA)
Az immunoassay-k gyakorlati felhasználása a hatvanas
években kezdődött a radioimmunoassay (RIA)
elvének alkalmazásával, amely forradalmasította a
kutatást és számos területen a klinikai gyakorlatot is,
pl. az endokrinológiában, a véradásban, az allergiadiagnosztikában.
A RIA radioaktív izotópot használ
jelölő molekulaként, és a mért radioaktivitás arányos
a mintában lévő analit mennyiségével. Két fő RIA-típust
alkalmazunk, a kompetitív és a nem kompetitív
heterogén formátumot, amelyek mosási lépést igényelnek
a kötött és szabad jelölt molekulák elkülönítésére.
A nem kompetitív szendvics formában a jel
egyenesen arányos a mintában lévő antigén mennyiségével,
a kompetitív formában viszont a mintában
lévő antigén fordítottan arányos a jelintenzitással (6-
29., 6-30., 6-31. ábra). RIA-t ma is használnak nagy
szenzitivitása miatt, különösen nagyon kis mennyiségű
analit meghatározására. Nagy affinitású antitestet
használva (K 0
= 10 8 –10 11 M −1 ) néhány pg-nyi (10 −12
g) antigén is kimutatható a mintából. Ugyanakkor a
6-28. ábra. Homogén és
heterogén immunoassay

146 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-29. ábra. Kompetitív RIA; második antitestet használnak a kötött és a szabad frakció elválasztására (jelölés 125 jóddal)
radioaktív anyag bonyolult kezelése, tárolása miatt
a klinikai laboratóriumok ma már kevésbé gyakran
alkalmazzák, mint a különböző típusú enzimimmunoassay-ket
(EIA).
A radioaktív sugárzást, mint a 125 jód-izotóp g-sugárzását
beütés/perc (counts per minute, CPM)
egységekben mérjük g-szcintillációs számláló segítségével.
A kiválasztott radioaktív jelölő molekula
meglehetősen befolyásolja a vizsgálat menetét. A legnépszerűbb
125 jód-izotóp esetén a beütésszám detektálása
viszonylag rövid ideig tart, de rövid féléletideje
miatt a jelölt anyagnak rövid a felhasználhatósági ide-
6-30. ábra. Kompetitív RIA; az elsődleges antitest szilárd fázishoz van kötve (jelölés 125 jóddal)

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
147
6-31. ábra. Szendvics-RIA; immunoradiometrikus assay, a befogó antitest a szilárd fázishoz van kötve (jelölés 125 jóddal)
je. Ugyanakkor a trícium- ( 3 H-) jelölésnél hosszabb
mérési idő szükséges, ami megnöveli a vizsgálat kivitelezésének
időtartamát. Ma a legtöbb RIA-ban 125 jód
jelölést használnak, egyrészt az egyszerű kapcsolási
technika miatt, másrészt nem változtatja meg a reaktáns
biológiai aktivitását. A legáltalánosabban kloramin-T
(Hunter, 1962) módszert használják, mely a
fehérjék tirozincsoportjaihoz köti a jódizotópot. Az
enzimekkel ellentétben az izotópjelölés nem zavarja
még a kis molekulák (haptének) antigenitását sem,
mert nem okoz sztérikus gátlást.
A kompetitív RIA-módszer elve (6-32., 6-33. ábra).
• Összemérjük a következőket:
– A 125 I vagy 131 I-el jelzett radioaktív antigént
(„meleg” antigén)
– Az antigénre specifikus antitestet szolid fázishoz
kapcsoltan
• Ismert mennyiségű, jelöletlen („cold”) antigént
adunk a mintákhoz (standard sor), amely vetélkedik
az antitest kötőhelyeiért.
• Növekvő koncentrációjú jelöletlen antigén
növekvő mennyiségű radioaktív antigént szorít
le az antitest kötőhelyeiről.
• Az antitesthez kötött antigént elválasztjuk a szabad
antigéntől, és az immunkomplex radioaktivitását
mérjük.
• Ezen eredményekből a készülék komputerprogramja
kalibrációs görbét szerkeszt.
• Az ismeretlen mintákat párhuzamosan mérjük.
• A minták antigénkoncentrációját a program a
kalibrációs görbére illesztve meghatározza (lásd
6-29. ábra).
A szendvics RIA-módszer elve
Az immunoradiometrikus assay (IRMA) a szendvics
formátumot használja antigénmérésre (lásd 6-31.
ábra). Ez a módszer a nagy specificitású monoklonális
ellenanyagok előállítása óta vált népszerűvé olyan
molekulák mérésére, amelyek legalább két epitóppal
rendelkeznek. A szendvics formátumban antitestfölösleget
alkalmazunk és az érzékenysége nagyobb,
mint a kompetíciós módszereké. A szilárd fázishoz
kötött első ellenanyag (capture antibody) mint be-

148 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
fogó ellenanyag a mintából megköti az antigént. Ezt
követően mosási lépés után adjuk a mintához a második,
jelölt antitestet, amely kapcsolódik a szilárd
fázishoz kötődött antigénhez. A szabad, jelölt reaktáns
mosási lépéssel való eltávolítása után mérjük az
immunkomplex radioaktivitását. A mérés során nem
jöhet létre interferencia, mivel a két monoklonális
antitest az antigén két különböző epitópját ismeri fel.
6-32. ábra. ELISA-formátumok (http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html)
6-33. ábra. ELISA-formátumok
a) Szendvics-ELISA
b) Kompetitív ELISA

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
149
Ezért a két antitestet egyszerre is össze lehet keverni
a mintával és egy mosási lépés után mérni a szilárd
hordozóhoz kötődött immunkomplex radioaktivitását.
A szendvics-assay formátum érzékenysége nagy.
Példaként a thyroideastimuláló hormon (TSH) immunoradiometrikus
meghatározásának szenzitivitása
a 0,07 μU/mL alatt van, míg a konvencionális,
radioaktív antigént alkalmazó assay érzékenysége 0,7
μU/mL.
A kötött és szabad jelölt molekula eltávolításának
lehetőségei:
• Egy második antitesttel precipitálni az antigén-antitest
komplexet. Ha pl. az első ellenanyagot
egérben termelték, akkor egy anti-egér IgG
hozzáadásával (lásd 6-29. ábra).
• Az antigénspecifikus antitestet a tesztcső falához
kötjük.
• Az antigénspecifikus antitestet egy részecskéhez
kötjük, pl. Sephadex gyöngyhöz. Ebben az esetben
a tesztcső centrifugálásával különítjük el a
kötött (pellet) és szabad (felülúszó) jelölt molekulát.
Enzimimmunoassay (EIA)
Az enzimjelölést alkalmazó kvantitatív immunoassay-k
a radioizotópos módszerek alternatíváiként kerültek
kifejlesztésre a hetvenes évek elején (Engvall,
1971; Van Weeman, 1971). A legelterjedtebb közülük
az enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA),
az EIA és az enzyme-multiplied immunoassay technique
(EMIT). A heterogén EIA-k alapvetően hasonlítanak
a RIA-hoz, azzal a különbséggel, hogy enzimjelölést
alkalmazunk.
Az enzimjelölés lehetővé teszi a homogén EIA-k
kifejlesztését, elhagyva az amúgy szükséges mosási
lépéseket. Az egyre innovatívabb EIA formátumok
kifejlesztése különböző szenzitivitású, pontosságú,
bonyolultságú és különböző ideig tartó módszerekhez
vezetett (lásd 6-32. ábra).
Heterogén EIA
A radioaktív detektáláshoz képest itt szükséges egy
másodlagos reakciót elvégezni, hogy az enzim katalitikus
reakcióját láthatóvá tegyük. Az enzim szubsztrátjainak
egyre bővülő köre lehetővé tesz fotometriás,
fluorimetriás és kemilumineszcens detektálási módot.
Szilárd fázist használunk a kötött és szabad konjugátumok
elkülönítésére, ez lehet mikrotitráló lemez
mélyedése, műanyag beadek vagy csövek felszíne,
mágneses partikulumok vagy latexfilterek. A különféle
heterogén EIA-kban leggyakrabban alkalmazott
enzimek: peroxidáz (PO), alkalikus foszfatáz, β-galaktozidáz,
glükóz-oxidáz, ureáz és kataláz. Az enzimmel
elérhető érzékenységet az enzim turnovere és
a jel mérési módszere határozza meg, közülük a kemiluminometriás
detektálás a legérzékenyebb.
A heterogén EIA formátuma hasonlít a RIA-ra,
ugyanúgy lehet kompetitív és nem kompetitív forma.
A kompetitív módszer (analittúlsúly) antigén-enzim
konjugátumot használ, míg a nem kompetitív teszt
(reaktánsfelesleg) lehet kétoldalú immunometrikus
szendvics assay és indirekt módszer antitestmérésre
(lásd 6-33. ábra). Az immunometriás szendvics
tesztformátum nagyon elterjedt olyan antigének
meghatározására, mint hormonok, tumormarkerek,
plazmaproteinek és fertőző ágensek. Indirekt mérési
módszert fejlesztettek antitestmérésekre, mint az
infekciós szerológia (pl. anti-HIV, HBV, HCV IgG-
/A/M)) és az autoantitest-meghatározás.
Színreakción alapuló (kolorimetrikus) EIA
Ebben az assay-formátumban az enzimreakciót
kromogén szubsztrát hozzáadásával végezzük, amely
az enzim katalitikus reakció eredményeként színes
termékké alakul. A kromogén színreakcióját, azaz op-
6-34. ábra. Indirekt szendvics-ELISA
Lépések:
1. A lemezt a befogó antitesttel érzékenyítik
2. A mintában lévő antigén kötődik a befogó antitesthez
3. A detektáló antitest kötődik az antigén egy másik epitópjához
4. Enzimmel jelölt másodlagos antitest kötődik a detektáló
antitesthez
5. Szubsztrát hozzáadása színreakciót eredményez

150 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-35. ábra. ELISPOT
1. Antihumán IFNy-val bevont nitrocellulózfilter a vályú alján
2. IFNy-t termelő stimulált sejtek
3. A szekretált IFNy a befogó antitesthez kötődik
4. A spotokat precipitáló szubsztráttal előhívják
5. AP/HRPO enzimmel konjugált riporter antitesttel detektálják a lekötődött IFNy-t
6. A sejteket és a nem kötődő fehérjéket lemossák
tikai denzitását (OD) spektrofotométerrel detektáljuk
(lásd 6-33. ábra; 6-34. ábra). Különböző készülékek
állnak rendelkezésre a színreakció mérésére, csövekben
vagy mikrotitráló lemezek mélyedéseiben a manuális
módozattól a teljes automatizáltságig. Ha az
enzimmel jelzett immunreakciót nitrocellulóz- vagy
egyéb membránon (ELISPOT, Dot blot, Western
blot) végezzük (6-35. ábra), oldhatatlan szubsztrátot
használunk (6-4. táblázat). A terhességi gyorstesztek
ezen az elven alapulnak, mert a szilárd hordozóra az
enzimreakció eredményeként lerakódó színes termék
szemmel is leolvasható.
Elvben a fényabszorbancia mérése a 0 és 3,0 A
közötti tartományban mozoghat, ezért azon analitoknak
a meghatározása, amelyek széles dinamikus
tartományban vannak jelen, problémás lehet annak
ellenére, hogy fölöslegben alkalmazzuk a konjugátumot
és nagy kötőkapacitású hordozót alkalmazunk a
szendvics EIA-hoz. Ishikawa (1989) kifejlesztett egy
ultraszenzitív EIA-t, amely képes 3 fmol specifikus
IgG antitest mérésére. Ahhoz, hogy ezt a szenzitivitást
elérje, számos bonyolult lépés szükséges, mint
pl. az immunkomplex áthelyezése egyik hordozóról a
másikra, hogy csökkentse a háttér jelet.
Fluoreszcens EIA
Az előzőktől abban különbözik, hogy az enzim egy
fluoreszcens szubsztrátot bont, amely ennek eredményeként
fluorofórrá alakul. A fluorofór megfelelő
hullámhosszúságú fénnyel való gerjesztéssel karakterisztikus
hullámhosszúságú fényt emittál. A mintában
előforduló autofluoreszcencia növelheti a háttér
jelet és csökkenti az assay szenzitivitását. Ugyanakkor
a fotometriás EIA-hoz képest a fluoreszcens assay egy
nagyságrenddel nagyobb jelintenzitást generál.
Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA).
Olyan szendvics immunoassay, amelyben az antigén-antitest
komplexet szilárd hordozóhoz, ún.
mikropartikulumokhoz kötjük, immobilizáljuk. A
MEIA-t automatákon alkalmazzák nagy fehérjemolekulák
mérésére, mint cardialis markerek, fertilitás,
tumormarkerek, metabolikus fehérjék, hepatitis és
pajzsmirigyfehérjék vizsgálatára (6-36., 6-37. ábra).
A MEIA komponenseit egy speciális pufferben
szuszpendálják:
• Mikropartikulum-antitest szilárd fázis: latexgyöngyök
antigénspecifikus antitesttel (befogó
antitest) fedve.
• Antitest-enzim konjugátum: alkalikus foszfatáz-Ig
konjugátum (jelölő antitest).

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
151
6-4. táblázat. Az alkalikus foszfatáz és a peroxidáz enzim tulajdonságai
Enzim Szubsztrátrendszer Színreakció
alkalikus
foszfatáz
peroxidáz
Végtermék
oldhatósága
p-nitrofenil-foszfát (pNPP) oldható ELISA
5-bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát/
nitro-kék tetrazolium (BICP/NBT)
gyors vörös (Fast Red)/naftanol-
AS-TR-foszfát
2,2’-azino-bisz(3-etilbenztiazolin-
6-szulfonsav) (ABTS)
o-feniléndiamin
(OPD)
3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin
(TMB)
oldhatatlan
oldhatatlan
oldható
oldható
oldható
Alkalmazás
immunoblotting,
immunhisztológia
immunoblotting,
immunhisztológia
ELISA
ELISA
ELISA
o-dianizidin oldható ELISA
5-aminoszalicilsav
(SAS)
3,3’-diaminobenzidin
(DAB)
3-amino-9-etilkarbazol
(AEC)
4-kloro-1-naftanol
(4CIN)
oldható
oldhatatlan
oldhatatlan
oldhatatlan
ELISA
immunoblotting,
immunhisztológia
immunoblotting,
immunhisztológia
immunoblotting,
immunhisztológia
• Enzimszubsztrát: fluoreszcens 4-metil-umbelliferon-foszfát
(MUP).
6-36. ábra. Mikropartikulum enzim immunoassay (MEIA);
heterogén szendvicsformátum, amelyben az immunkomplexek
mikrogyöngyökön jönnek létre (MUP: 4-metil-umbelliferon-foszfát)
Kemilumineszcens EIA
A kemilumineszcens enzimreakció fényt generál,
a biolumineszcenciához hasonlóan, és természetes
szubsztrátokat használ, mint a luciferin-adenozin-trifoszfát.
Az elmúlt 20 évben számos kemilumineszcens
enzimszubsztrátrendszer került kifejlesztésre.
A mai nagy érzékenységű rendszerek vagy valamely
luminolderivátumot használnak a peroxidázhoz erősítéssel,
vagy dioxetánszármazékokat az alkalikus
foszfatáz enzimhez. A luminolanalógok enzimatikus
oxidációja peroxidáz enzim és H 2
O 2
jelenlétében
régóta alkalmazott módszer a rutin laboratóriumi
diagnosztikában. A fenolderivátumok vagy aromás
vegyületek alkalmazása mint erősítő tovább javította
az assay szenzitivitását. A luminol-peroxidáz p-iodofenol
mint erősítő jelenlétében a fénykibocsátás
kb. 2800-szorosára növelhető egy optimalizált reak-

152 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-37. ábra. Mikropartikulum enzim immunoassay (MEIA) (MUP: 4-metil-umbelliferon-foszfát)
Lépések:
1. Antitesttel fedett mikropartikulum + minta keveréke együtt inkubálva
2. A reakciókeveréket üvegszálmátrixra helyezik, majd mossák
3. Alkalikus foszfatázzal jelölt antigénspecifikus antitest hozzáadása, kötődése
4. MUP hozzáadása; a fluoreszcens termék metilumbilliferon (MU) mérése
cióelegyben. Ez az assay alkalmas 0,04 μU/mL TSH
meghatározására szérumban. Ugyanakkor az oxidációs
reakciókkal számos faktor interferál, ami növeli
a nem specifikus háttér zajt.
Bronstein 1989-ben kifejlesztette az alkalikus
foszfatáz enzimnek egy kemilumineszcens szubsztrátját,
az AMPPD-t (dinátrium 3-(4-metilspiro-[1,2-dioxetán-3,2′-triciklo-[3.3.1.1]dekán]-4-il)
fenilfoszfát), egy adamantil-dioxetán-származékot.
Ennél nincs szükség egyéb hozzáadott oxidáló molekulára
a kemilumineszcens fény emittálásához.
Az AMPPD egy új, komplett szubsztrát, mert az
adamantilcsoport stabilizálja a molekulát, a dioxetánkötés
szolgál energiaforrásul, a foszforilészter az
enzimbontás helye, és a fenilcsoport adja a kemilumineszcenciát,
mind együtt vannak a molekulában.
A foszfoészterkötés enzimatikus bontása elindítja a
kémiailag indukált elektroncserélő lumineszcenciát
(CIEEL). 477 nm-es hullámhossz maximummal kemilumineszcencia
detektálható néhány perctől néhány
óráig tartó időtartamban a szubsztrát koncentrációjától
függően. E technika érzékenysége kisebb
mint 10 -21 mol. Ezt a reakciót alkalmazzák teljesen
automata műszereken is nagy érzékenysége és gyorsasága
miatt.
A kemilumineszcens mágneses immunoassay-hez
(CMIA) szilárd fázisként 0,3 μm vaspartikulumokat
alkalmazva nő a felszín és csökken a reakcióidő is kb.
30 percre. A kemilumineszcens jel és az analit koncentrációjának
összefüggése lineáris, kb. hét nagyságrend
dinamikus tartományban. Egy AFP-meghatározó
tesztben a CL-EIA érzékenysége kb. 10-szer
nagyobb volt, mint a konvencionális RIA érzékenysége,
30 pg/mL 30 pereces assay időtartammal.
Homogén EIA
Az enzimjelölés lehetővé teszi a hosszadalmas mérési
módszerek egyszerűsítését, a mosási lépések kihagyásával
a homogén típusú formátum alkalmazását,
mert az enzimaktivitást könnyen lehet változtatni
az antigén-antitest reakció környezeti tényezőinek
módosításával. A homogén formátum ugyan kevésbé
érzékeny, mint a RIA vagy a heterogén formátumok,
de a komplex immunkémiai reagensek ellenére
gyors, egyszerű és a szokásos készülékekre adaptálható.
Minden ilyen technikánál az antigén-antitest
kapcsolódása módosítja az enzimaktivitást a szubsztrát
jelenlétében, amely arányos az immunreakcióval.
A homogén EIA-k is feloszthatók kompetitív és nem
kompetitív technikákra. A kompetitív formában az
antigént jelzik vagy az enzimmel, vagy a szubsztráttal,
vagy az enzim egy prosztetikus csoportjával. Ezzel
ellentétben a nem kompetitív formában az antitest a
jelölt molekula.
A következő homogén assay-formátumok a leggyakoribbak:
Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique (EMIT).
Ez volt az első kifejlesztett homogén EIA. Ebben az
esetben enzimmel jelölt haptént adunk a rendszerhez,
mely ha a hapténspecifikus antitesthez kapcsolódik,
a kötés gátolja az enzim aktivitását, mert meggátolja
az ehhez szükséges konformációváltozást. Szabad

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
153
haptén a standardban vagy az ismeretlen mintában
vetélkedik a kötőhelyért, és leszorítja a jelölt haptén
kötődését, így feloldva az enzimaktivitás gátlását. Így
az enzimaktivitás egyenesen arányos a mintában lévő
haptén koncentrációjával. Ez alól az elv alól kivétel a
tiroxin-EMIT, ahol az antitesthez kötődés nem gátolja,
hanem aktiválja az enzimet. Ezekkel a tesztekkel
általában kis molekulákat, mint pl. gyógyszereket
mérünk mg/L koncentrációtartományban, kivétel a
digoxin-assay, amelynek érzékenysége a 0,8–2 μg/L
tartományban van.
Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay (SLFIA).
Antigénhez kapcsolt umbelliferil-β-galaktozidot
használ szubsztrátként, amelyet a β-galaktozidáz
enzim bont fluoreszcens umbelliferonra. Ha a jelölt
antigén a specifikus antitesthez kötődik, a β-galaktozidáz
nem fér a szubsztráthoz, és azt nem tudja fluoreszcens
termékké alakítani. A mintában lévő szabad
antigén (analit) vetélkedik a kötőhelyekért, leszorítja
a jelölt antigént, amelyet az enzim bontani tud. Így a
mintában lévő antigén koncentrációja arányos a fluoreszcenciaintenzitással.
Az SLFIA nem csak gyógyszerek,
haptének mérésére alkalmas, hanem fehérjemolekulák
detektálására is. A hátránya, hogy nincs
lehetőség amplifikációra, ezért érzékenysége 10 −9 –
10 −10 mol tartományba esik.
Apoenzim Reaktivációs Immunoassay (ARIS). A glükóz-oxidáz
apoenzim egy prosztetikus csoportjával,
a flavin-adenin-dinukleotiddal (FAD) konjugált antigént
használ. A mintában lévő antigén vetélkedik a
mintához adott konstans mennyiségű, jelölt antigénnel
az antitest kötőhelyeiért. Egyensúlyi helyzetben a szabadon
maradt jelölt antigén arányos a mintában lévő
antigénnel. Az apoenzimet csak a szabadon maradt jelölt
antigén tudja aktiválni, így az enzimaktivitás arányos
a szabadon maradt jelölt antigénnel. A tesztbe egy
erősítési lépést is betettek, növelve az érzékenységét. A
módszer kis molekulák mellett alkalmas nagy fehérjék
mérésére is (pl. thyroid binding globulin).
Enzyme Inhibitory Homogeneous Immunoassay (EI-
HIA). Enzimmel konjugált antitestet és oldhatatlan
szubsztrátot használ nagy antigének (analit) mérésére.
A nagy fehérje kötődése a jelölt antitesthez gátolja
a szilárd fázison lévő szubsztrát enzimatikus bontását.
α-amiláz enzimmel jelölt antitestet használnak
pl. a ferritin vagy az AFP meghatározására. A reakció
igen gyorsan, kb. 10 perc alatt éri el platóját, és ferritin
esetében 10–800 ng/mL, AFP esetében –5-200
ng/mL érzékenységgel mér.
Cloned Enzyme Donor Immunoassay (CEDIA). A rekombináns
DNS technológia óta vált lehetségessé,
amikor a β-galaktozidáz enzimet mint fehérjét kettévágták
egy nagy polipeptidre (ez az enzimakceptor)
és egy kisebb polipeptidre (enzimdonor). Az akceptor
és donor enzim összekapcsolódása hozza létre
az enzimatikusan aktív tetramert. Az eljárásban az
antigénhez konjugálják az enzimdonort, és az antigénspecifikus
antitest akadályozza meg az enzim aktív
formába történő spontán összekapcsolódását. A
beteg mintájában lévő antigén vetélkedik az antitest
kötőhelyeiért az enzimdonorral konjugált antigénnel.
Minél több a mintában a szabad antigén, annál jobban
leszorítja a jelölt antigént a kötésből, annál több
enzim jön létre és okoz színreakciót. Ez a rendszer
alkalmas kémiai automatában végzett mérésre is.
Fluoreszcens Immunoassay (FIA)
Ma már a minta háttér-fluoreszcenciáját kiküszöbölő
eljárások állnak rendelkezésre új szubsztrátok
bevezetésével és új mérőműszerek használatával. Így
a FIA ma már elterjedt hormonok, fehérjék, polipeptidek
10 –15 mol/L koncentrációjú antigén meghatározására.
Fontos a megfelelő fluorokróm kiválasztása (6-5.
táblázat). Az ismert fluoreszcein izothiocianát esetében
1 ns az excitáció és emisszió közti időtartam, miközben
a ma használatos késleltetett fluoreszcenciájú
molekulák (pl. europium) néhány száz ns késéssel
fluoreszkálnak. Ezért alkalmasak rövid időtartamú
megvilágítás után késleltetett fluoreszcenciára, amikor
már a minta komponenseinek autofluoreszcenciája
rég lezajlott.
A különböző FIA formátumok hasonlóak az előzőkhöz,
lehetnek heterogének vagy homogének, ligand-
vagy antitestjelöltek, kompetitívek vagy nem
kompetitívek és szilárd fázisúak vagy nem.
Heterogén FIA
Egy mosási lépést közbeiktatva elkülönítjük a kötött
és szabad fluoreszcensen jelzett molekulákat. Ezzel eltávolítjuk
a mintában lévő fluoreszcens tulajdonságú
zavaró komponenseket (autofluoreszcencia) is.

154 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-5. táblázat. Néhány fontosabb fluoreszcens jelölőmolekula
Fluoreszcens festék Fluoreszcens emissziós szín Emissziós maximun (Em-Max; nm)
BD Horizon TM V450 kék 448
Pacific Blue TM kék 452
Alexa Fluor ® 448 zöld 519
FITC zöld 519
PE sárga 578
PE-Texas Red ® narancsszín 615
Texas Red ® narancsszín 615
APC vörös 660
Alexa Fluor ® 647 vörös 668
PE-Cy TM 5 vörös 667
PerCP vörös 678
PerCP-Cy TM 5.5 távoli vörös 695
Alexa Fluor ® 700 távoli vörös 719
PE-Cy TM 7 infravörös 785
APC-Cy7 infravörös 785
BD APC-H7 infravörös 785
Fluoroimmunometrikus módszer. Az analit folyadékfázisban
reagál a fölöslegben hozzáadott jelölt antitesttel.
A fölöslegben maradt jelölt antitestet eltávolítjuk
egy szilárd fázishoz kötött antigénhez kacsolással.
A szolid fázisú mátrixot mossuk, és mérjük a fluoreszcencia
intenzitását, amely fordított arányban áll
az analit koncentrációjával. Ezt a módszert használják
mikroorganizmusok elleni antitest koncentrációjának
mérésére, autoantitestdetektálásra és szérumfehérjék,
hormonok meghatározására is.
Radiális megosztású immunofluorometrikus assay.
Radiális kromatográfiát alkalmaznak, és a reakció
üvegszál filterpapíron megy végbe.
6-38. ábra. Fluoreszcens polarizációs immunoassay (FPIA)
a) Az assay folyamata
b) A fluoreszcens konjugátum fluoreszcenciája
c) A nagy antigén jelölt antitestkomplex lassabban mozog,
nem forog, a polarizált fényt előrefelé átengedi

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
155
Késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay (DELFIA).
Az eljárás során speciális készüléket és fluoreszcens
molekulát használnak az eljárás érzékenységének növelésére.
A 100 ns-os vagy hosszabb idejű késleltetett
fluoreszcenciájú jelzőmolekula és az impulzus üzemmódban
való gerjesztés alkalmazásával elkerülhető a
zavaró háttér-fluoreszcencia, amely rendszerint 10 ns
alatt lezajlik.
Homogén FIA
Nem igényel mosási lépést, viszont kevésbé érzékeny,
standard készülékkel mérve kb.10 −10 M az érzékenysége.
Fluoreszcens Polarizációs Assay. A fluoreszcens detektálás
különleges változata a fluoreszcenciapolarizációs
immunoassay (6-38. ábra). Ez a mérési módszer a
fluoreszcencia jelenség egy sajátos vonásán alapszik.
Ha a fluoreszcenciát egy oldatban (amelyben – az
egyszerűség kedvéért tegyük fel, hogy – csak a vizsgálandó
anyag képes fluoreszcenciára) síkban polarizált
fénynyalábbal idézzük elő, akkor a fluoreszcens fény
(amit, mint tudjuk, a gerjesztett mintamolekulák bocsátanak
ki) lehet továbbra is síkban polarizált, de el
is veszítheti polarizált jellegét. Ez attól függ, hogy milyen
gyorsan forognak a molekulák. Ha a gerjesztés és
a fénykibocsátás között eltelt időben (amely általában
a ns dimenzióba esik) a molekulák térhelyzete változatlan,
akkor a kibocsátott fény polarizációs síkja
megegyezik az elnyelt fényével. Ellenkező esetben a
molekula elfordulásának megfelelő más irányban lesz
polarizált a kibocsátott fény. Mivel az egyes molekulák
egymástól függetlenül forognak, ekkor a kibocsátott
fény összességében már nem polarizált.
A molekulák forgási sebessége nagyban függ a
méretüktől. A néhány száz dalton molekulatömegű
fluoreszcensen jelzett mintamolekulák olyan gyorsan
forognak, hogy a fluoreszcens fény polarizációja eltűnik,
vagy nagyon lecsökken. Ha viszont egy ilyen
molekula egy nagy fehérjéhez, pl. ellenanyaghoz kötődik,
akkor az így létrejött komplex forgási sebessége
(amely nagyjából azonos magának a fehérjének a
forgási sebességével) olyan kicsi, hogy a fluoreszcens
fény polarizált marad. Ha tehát a kis molekulájú fluoreszcensen
jelzett antigén és a nagy molekulájú ellenanyag
oldatát elegyítjük, és ezután mérjük a poláros
fény által kiváltott fluoreszcencia polarizációs fokát,
akkor azt tapasztaljuk, hogy a reakció időbeni előrehaladásával
a polarizációs fok egyre nő. Ezzel a módszerrel
tehát követhető a reakció kinetikája is, majd az
egyensúly beállása után a keletkezett komplex menynyiségére
is következtetni lehet. Adott mennyiségű
ellenanyagot és kompeticiót alkalmazva az egyensúlyi
polarizációs fok és a fluoreszkáló anyag koncentrációja
közti kalibrációs összefüggés kimérhető.
Ennél a módszernél nincs szükség elválasztásra, ez
tehát homogén eljárás. Számos egyéb homogén mérési
technika ismeretes. Ezek nagy része szintén kompetitív
eljárás, ahol a mérendő antigénnel a jelzett antigén
versenyez az antitestek kötőhelyeiért, és a jelzett
antigén szabad, ill. kötött formájának nem egyforma
a jelintenzitása. Így pl. lehet, hogy a kötött formában
a jelzett molekulák gyengébben fluoreszkálnak, mint a
szabad formában. Mivel ilyenkor a szabad és a kötött
forma egyaránt ad jelet (csak eltérő intenzitással), ezért
az ilyen módszerek csak viszonylag nagy koncentráció
(10 –5 –10 –6 mol/l) mérésére alkalmasak.
Fluoreszcens Protection Immunoassay. A fluoreszcens
jelölt antigén reagál a specifikus antitesttel. A kapcsolódás
térbelileg megakadályozza egy második, a fluoreszceinre
specifikus antitest odakötődését a fluorofórra.
Ez az antitest, ha a fluorofórhoz kötődik, kioltja
(quencheli) annak a fluoreszcenciáját. A mintában
lévő antigén leszorítja a jelölt antigént a kötődésből,
több olyan szabad jelölt molekula marad, amelynek
fluoreszcenciáját a második antitest meggátolja.
Chemiluminescent Immunoassay (CLIA)
Jelölésre kemilumineszcenciát gerjesztő molekulát
használunk: luminolderivátumokat, akridíniumésztereket,
nitrofenil-oxalát-derivátumokat, valamint
ruténium-tri-bipridil-tripropilamint (TPA) az elektrokemilumineszcenciában.
A heterogén assay formátumok lényegében nem
különböznek a RIA és a FIA formátumaitól. Mivel a
kemilumineszcens anyag elektrokémiailag bocsát ki
fényt elektródok felszínén, így alkalmazható homogén
assay formátumban is.
Akridíniumészter jelölésű CLIA esetén az használjuk
ki, hogy az aktivált, kemilumineszcens molekulák
igen gyorsan, az oxidációs reakció megindulása után
5–10 s múlva nagyenergiájú villanófényt emittálnak.
A villanófény típusú (flash-type) fluoreszcencia miatt
ennek a detektálása növeli a módszer érzékenységét.

156 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
6-6. táblázat. A MEIA és a CMIA összehasonlítása
Módszer Szilárd fázis Szeparációs lépés Jelölés Érzékelő módszer
MEIA latex mikrorészecske üvegszál mátrix alkalikus foszfatáz enzim fluoreszcenciadetektor
CMIA
mágneses
mikrorészecske
mágnes
kemilumineszcens
vegyület
kemilumineszcenciás
fotosokszorozó cső
Elektrokemilumineszcens Immunoassay (ECLIA). A
jelölő anyag elektrokémiailag generál fényt, egy oxidoredukciós
reakcióban.
Az assay-protokoll a következő: antitesttel fedett
mágneses mikropartikulumok szilárd fázisként a
mintából megkötik az antigént, amelyet egy második,
jelölt antitesttel hozunk komplexbe (6-39. ábra, 6-6.
táblázat). A szabad konjugátumot mosással távolítjuk
el, majd a szilárd fázisú szuszpenzió kemilumineszcenciáját
mérjük elektród segítségével. Az assay érzékenysége
0,2–0,4 ng/mL CEA és 0,4 ng/mL AFP esetében.
Előnye, hogy nem igényel bonyolult műszert,
és gyors a szignálmérés.
Az immunoassay-t befolyásoló faktorok
Pontosság, precizitás
Ez a két elvárható követelmény egy laboratóriumi
méréstől. A pontosság azt jelenti, hogy az assay képes
azt az eredményt adni a laboratóriumi analitikusnak
és a klinikusnak, amely a mintában lévő analit valódi
mennyisége. Vagyis a laboratórium képes mintában
lévő anyag valós koncentrációját kimutatni. A precizitás
pedig azt jelenti, hogy az adott reagensekkel
és mérőműszerrel, standard körülmények között az
eredmény reprodukálható.
Egy immunoassay, amely pontosan és precízen képes
eredményt adni anélkül, hogy hamis pozitív eredményt
mérne, klinikai szempontból specifikusnak
mondható (6-40. ábra).
Egy immunoassay klinikai szenzitivitása azt jelenti,
hogy pontosan és reprodukálhatóan méri a legkisebb
mennyiségeket is, vagyis nem ad hamis negatív
eredményt.
Kalibrátorok és kontrollok
Megfelelő alkalmazásuk meghatározza az említett
faktorokat.
A kalibrátorok olyan ismert mennyiségű mérendő
molekulát tartalmazó oldatok, amelyek meghatározzák
a jelerősség és az analit koncentrációjának
viszonyát. Kalibrációs sort alkalmazva kalibrációs
(dózis–hatás) görbe írható le a készülék szoftverének
segítségével, amelyben a jel korrelál a standard koncentrációjával.
Az ismeretlen beteg mintájának jelintenzitását
megmérve a kalibrációs görbe segítségével
meghatározható a mintában lévő analit koncentrá-
6-39. ábra. Kemilumineszcens mágneses immunoassay
(CMIA)
6-40. ábra. Az immunoassay követelményei
a) Követelmények
b) Megfelelő kalibrációs görbe

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
157
ciója. Fontos, hogy a kalibrátorokat
a gyártó utasításai szerint
kezeljük, ellenkező esetben pontatlan
a mérés, a beteg mintájának
hamis mérését eredményezi.
Ha a kalibrátorok használatra
kész formában állnak rendelkezésre,
megfelelő az oldószerük
(szérum), kisebb a tévedési lehetőség.
A kontrollok (pozitív, negatív)
ismert koncentrációjú analitot
tartalmazó minták, amelyeket
a mérés pontosságának és reprodukálhatóságának
ellenőrzésére
használunk. Amennyiben
a gyártó által megadott tartományban
vissza tudjuk mérni azokat, ez azt jelenti,
hogy a beteg mintáját is jól mértük meg. A kontrollok
le- vagy fölfelé történő hamis mérése jelzi a reagensek,
a kalibrátorok vagy az analízis hibáját.
A mérésre ható tényezők (assay-interferencia)
Azt jelenti, hogy valamely külső tényező zavarja
a mérés pontosságát, legtöbbször az antigén-antitest
összekapcsolódását. Az egylépéses módszereknél az
interferencia általában megváltoztatja a mérés specifitását
és szenzitivitását is. A kétlépéses módszerek
pontosságát általában kevésbé zavarják külső tényezők
(mint nem specifikus kötőfehérjék, interferáló
anyagok, általános mátrixeffektus), mert a mosással
ezeket eltávolítjuk.
Nagydózis-visszacsapási („hook”) effektus. Nagy antigénfelesleg
(prozóna-fenomén) nagydózis-visszszacsapási
effektust okozhat, ami egylépéses szendvics-assay
esetében fordulhat elő (6-41. ábra). Ekkor a
nagy antigénkoncentráció telíti mind a befogó, mind
6-41. ábra. Szendvics-assay. A mintában lévő extrém nagy
antigénkoncentráció visszacsapási effektusa
6-42. ábra. Az antiegér antitest (HAMA) zavaró hatásai
a) A HAMA okozhat álpozitív eredményt
b) HAMA okozta álnegatív eredmény
a jelölő antitest összes antigénkötő helyét, meggátolva
a szendvics kialakulását. Ilyen körülmények között
a mért antigénmennyiség sokkal kisebb lesz, mint a
minta valós antigénkoncentrációja. Ez a dózis–hatás
görbén jól látható, ahol emelkedő antigén koncentráció
egy adott ponton csökkenő jelintenzitást ad. Ezt a
jelenséget prozóna effektusnak is hívják.
Humán Anti-Mouse Antitestek (HAMA). A mintában
előforduló egérantigének ellen kialakult antitestek
okozzák ezt a fajta interferenciát (6-42. ábra). Ennek
különféle okai lehetnek, mint pl. egér monoklonális
antitest terápia, egerekkel dolgozó személyek szintén
immunizálódhatnak egérantigénekkel.
A beteg mintájában lévő HAMA okozhat hamis
pozitív és hamis negatív reakciót egyaránt olyan
tesztben, ahol egér monoklonális antitestet használnak
mint reagenst.
• Hamis pozitív eredmény HAMA miatt: ebben az
esetben a hamis pozitivitás oka, hogy az
anti-egér antitest szendvicsként összeköti a szolid
fázison lévő befogó antitestet a jelölt antitesttel,
vagyis úgy tűnik, mintha a mintában
lévő antigén kapcsolta volna össze a komplexet.
• HAMA okozta hamis negatív eredmény: két
mechanizmussal jöhet létre: gátlás révén vagy a

158 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
szolid fázison lévő befogó antitestet blokkolja a
HAMA, vagy a jelölő antitestet.
Carryover (átszennyezés). Azt jelenti, hogy egy extrém
nagy analitkoncentrációjú mintából minimális
mintamennyiség átkerül egy mellette lévő csőbe
(kontamináció), amelyik ezért alacsony pozitív eredményt
ad. A legtöbb készülék az extrém magas minta
melletti alacsony pozitív mintát jelzi, és azt újramérik.
Az immunoassay-k fejlesztési irányai
Multiplex immunoassay-k: fehérje-biochip, microbead-array
A legújabb technológiai fejlesztések olyan irányba
haladnak, hogy a minta egyszeri felhasználásával, egy
méréssel 5–100 különböző analitmolekula koncentrációját
tudjuk detektálni. Ezek az ún. multiplex mérési
módszerek két nagy kategóriába sorolhatók az alkalmazott
szilárd hordozó alapján. Az egyik esetben
a microchip-technológiára adaptálták az immunoassay-t,
a másikban egymástól méret vagy fluoreszcencia
alapján jól elkülöníthető mikropartikulumokra.
Mikrochipet alkalmazva a mérendő fehérjék menynyisége
szinte határtalan, a mikrogyöngyök viszonz
a rendelkezésre álló bead-fajták korlátozzák az egyszerre
mérhető paraméterek számát. Ezek a miniatürizált
technikák kis mennyiségű reagenst és mintát
igényelnek, ezért környezetkímélők, olcsók és energiakímélők.
MicroSpot Assay
A microchip hordozó felszínén kis, elkülönített
területekre viszik fel a különböző reagenseket az ún.
micro-dot technológiával. Így 100–200 különböző
reakcióhelyet tudnak létrehozni („nyomtatni”) egy
3 mm átmérőjű polisztirénlemez felszínén (Ekins,
1998). Minden egyes reakcióhely egy 80 μm átmérőjű
terület, amelyre kevesebb mint 1 nL mennyiségű
reagenst „nyomtatnak” egy automatával (6-43. ábra).
Ez a módszer az Ekins által leírt „ambiens assay teóriá”-n
alapul, amelyben az assay érzékenysége és mérési
határa a befogó antitest telítettségének mértékétől
és nem a szilárd fázis felszínének méretétől függ
(6-44. ábra). Ebben az eljárásban a microspot felszínén
befogott analit mennyisége olyan kicsi, hogy ez
nem befolyásolja az analit koncentrációját a mintában
még kis koncentrációban jelen lévő célmolekula
6-44. ábra. A multiplex „ambiens assay” teória elve: a jel és
a jelsűrűség aránya a mikrospoton. Növekvő méretű spoton
a befogó molekulák, ha ugyanolyan sűrűségben vannak
nyomtatva, nő a teljes jel. Ha viszont csökken a befogó
molekulák száma, és eléri a < 0,1/K értéket, a jeldenzitás nő
6-43. ábra. A protein-mikroarray lehetséges befogó molekulái

Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
159
esetében sem és akkor sem, ha a kötés nagy affinitású.
Ez akkor igaz, ha < 0,1/K befogó molekulát immobilizálnak,
ahol K az immunreakció affinitáskonstansa.
Ilyen körülmények között a mintából kifogott
célmolekula mennyisége közvetlenül tükrözi annak
koncentrációját. Érdekes, hogy a koncentrációmérés
ilyen környezeti („ambiens”) analit körülmények között
független a minta volumenétől, és a kis menynyiségű
mintafelhasználás ellenére nagyon szenzitív.
Ennek két oka van: egyrészt a kötés a legmagasabb
célmolekula-koncentráción zajlik, másrészt a befogó
antitestmolekula–antigén- (analit) komplex nagyon
kis felületen található, nagy jelet okozva ott.
A Roche Diagnostics cég avidinnal fedett szolid
fázist használ, amelyre biotinnal jelölt befogó antitestet
vagy antigént nyomtatnak. Különféle paraméterek
(mint anti-HIV, anti-HBsAg, anti-hepatitis-C
és rubeolaantitestek) detektálhatók egy mintából egy
méréssel a microchip felszínén. Az assay-formátum
egy háromlépéses fluoreszcens immunoassay, ahol a
fluoreszcens jelet egy lézer szkenner detektálja.
Áramlási citometriás immunoassay – multiplex
microbead-assay
A Luminex cég (Austin, TX) kifejlesztett egy
áramlási citometriás mérési elven alapuló, multiparametrikus
fluoreszcens immunoassay-t. Ebben a
rendszerben két különböző fluorofór különböző koncentrációival
feltöltött latexpartikulumok (latexbead)
szolgálnak szolid fázisként. Ezek a partikulumok az
áramlási citométeren mind külön bead-populációként
jelennek meg. A több mint 60 különböző tulajdonságú
partikulum mindegyike külön célmolekula
mérésére szolgál, egy mintából. Egy adott microbeadből
kb. 1000 darab képezi a reakciófelszínt, amelyhez
vagy a befogó antitestet, vagy antigént kapcsolnak. Az
analit kötődését a mikrogyöngyökhöz egy másik színű
fluoreszcens molekulával jelölt antitesttel tesszük
láthatóvá.
A mérés kivitelezése a következő. A mintát összekeverjük
a befogó antitestet tartalmazó microbeaddel
és a fikoeritrinnel (PE) jelölt második antitesttel.
A keveréket 10–30 perc inkubáció után mérjük egy
áramlási citométeren, amely több paraméteres fluoreszcens
detektálásra alkalmas. A készülék egyetlen
méréssel minden gyöngycsoportból 1000-1000 partikulomot
lemérve elkülöníti azokat fluoreszcens
jelzésük és intenzitásuk alapján, és külön jelként detektálja
az adott bead-csoportnak a jelölő fluoreszcenciaintenzitását
is. Ez a jel egyenesen arányos a befogott
analit mennyiségével.
Ezt az elvet alkalmazzák pl. 15 féle citokin egyidejű
mesésére, egy mintából (Carson, 1999), de autoantitestek
vagy mikrobák elleni antitestek mérésére is alkalmas.
A szimultán mérés kevésbé érzékeny, mint az
individuális citokinszendvics-ELISA-k, de így is elég
érzékeny, pl. 100 pg/ml IL-2-re, 10 pg/ml IL-4-re, 100
pg/ml GM-CSF-re és 200 pg/ml interferon-a-ra.
A multiplex technikai eljárások területén nagy fejlődés
mutatkozik, de néhány megoldandó probléma
még mindig maradt, így nem vonultak be a rutin diagnosztikába.
Az egyik probléma, hogy a miniatürizálás
nem valósul meg az assay-ben minden ponton.
Így kis folyadék- és mintamennyiség kezelése nincs
megoldva, ezért azok gyakran elpárolognak és zavarják
a reakciót. Néhány esetben a szenzitivitást és a
specificitást is vizsgálni kell. Ugyanakkor a miniatürizálás
mint végső cél fontos a laboratóriumi diagnosztikában,
mert költséghatékonyabb, gyorsabb, klinikailag
hasznos, és nem utolsósorban kevésbé terheli
a beteget.
Irodalom
Carson, R. T., Vignali, D. A.: Simultaneous quantitation
of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.
J. Immunol. Methods 227(1-2):41–52, 1999.
Czirják László: Klinikai Immunológia1. kiadás. 775–
857. old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2006.
Debreczeni Lóránd, Kovács L. Gábor: Gyakorlati laboratóriumi
medicina. 2. kiadás. Literatura Medica, 2008.
Doorbar, J., Winter, G.: Isolation of a peptide antagonist
to the thrombin receptor using phage display. J. Mol.
Biol. 244(4):361–369, 1994.
Ekins, R. P.: Multi-analyte immunoassay. J. Pharm. Biomed.
Anal. 7:155–168, 1989.
Engvall, E., Perlmann, P.: Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin
G. Immunochemistry 8(9):871–874, 1971.
Erdei Anna: Immunológiai Módszerek. Medicina Könyvkiadó,
Budapest, 2006.
Finckh, P. et al.: Microspot – an ultrasensitive microarray-based
ligand assay system. Apractical application of
ambient analyte assay theory. Proc. UK NEQAS Meeting
3:155–165, 1998.
Gergely János, Erdei Anna: Immunbiológia. Medicina
Könyvkiadó, Budapest, 2004.

160 6. fejezet Immunkémiai eljárások a fehérjék azonosításában – Specifikus fehérjekimutatások oldatban ...
Hozumi, N., Tonegawa, S.: Evidence for somatic rearrangement
of immunoglobulin genes coding for variable
and constant regions. J. Immunol. 173(7):4260–4264,
1976.
Hunter, W. M., Greenwood, F. C.: Preparation of iodine-131
labelled human growth hormone of high specific
activity. Nature 5(194):495–496, 1962.
Ishikawa, E., Hashida, S., Tanaka, K. et al.: Development
and applications of ultrasensitive enzyme immunoassays
for antigens and antibodies. Clin. Chim. Acta
15;185(3):223–230, 1989.
Joos, T. O. et al.: A microarray enzymelinked immunosorbent
assay for autoimmune diagnostics. Electrophoresis
21:2641–2650, 2000.
Komissarenko, S. V., Avrameas, S.: Properties of immunoadsorbents
prepared by antigen coupling to glutaraldehydeactivated
polyacrylamide gel, BrCN-activated
Sepharose and by copolymerization of antigens by glutaraldehyde
.Ukr. Biokhim. Zh. 50(4):500–511, 1978.
Köhler, G., Milstein, C.: Continuous cultures of fused
cells secreting antibody of predefined specificity. 1975.
Biotechnology 24:524–526, 1992.
McPherson, Pincus: Henry’s Clinical Diagnosis and Management
by Laboratory Methods. 21 st ed. W. B. Saunders
Company, 2006.
Nakane, P. K., Pierce, G. B. Jr.: Enzyme-labeled antibodies:
preparation and application for the localization
of antigens. J. Histochem. Cytochem. 14(12):929–931,
1966.
Rubenstein, K. E., Schneider, .S., Ullman, E. F: „Homogeneous“
enzyme immunoassay. A new immunochemical
technique. Biochem. Biophys. Res. Commun.
26;47(4):846–851, 1972.
Skerra, A., Plückthun, A.: Assembly of a functional immunoglobulin
Fv fragment in Escherichia coli. Science
240(4855):1038-1041, 1988.
Schwaber, J., Cohen, E. P.: Human × mouse somatic cell
hybrid clone secreting immunoglobulins of both parental
types. Nature 244(5416):444–447, 1973.
Templin, M. F., Stoll, D., Schrenk, Monika et al.: Protein
microarray technology TRENDS in Biotechnology.
20(4), 2002.
Thorpe, R., Bird, C. R, Spitz, M.: Immunoblotting with
monoclonal antibodies: loss of immunoreactivity with
human immunoglobulins arises from polypeptide chain
separation. J. Immunol. Methods 73(2):259–265, 1984.
http://en.wikipedia.org/wiki/Monoclonal_antibodies
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/
content/ELISA.html
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/
content/pregtest.html

7. Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai
laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
Automatizáció
a fehérjeanalitikában
Kőszegi Tamás
Általános szempontok
Az egyedi fehérjék kimutatására és mennyiségi meghatározására
a laboratóriumi gyakorlatban jórészt
specifikus molekulafelismerésen alapuló kölcsönhatások
adnak lehetőséget. Leggyakrabban a mérni
kívánt fehérjét arra specifikus antitesttel reagáltatják,
majd az antigén-antitest reakciót valamilyen módon
mérhetővé teszik. Léteznek azonban más, nem antigén-antitest
alapú módszerek is, de lényegük olyan
molekulák alkalmazása, melyek az adott fehérjével
szoros és specifikus kölcsönhatásba lépnek (affinitásos
elv).
Ebben a fejezetben elsősorban az antigén-antitest
elvű méréstechnikák automatizációját ismertetjük.
Az egyes módszerek bemutatásának logikája a nagy
koncentrációban lévő antigének mérésétől lefelé az
egyre kisebb koncentrációjú analitok mérési elvének
ismertetése.
Az egyedi molekulák automatizált meghatározását
az utóbbi évtizedek kétirányú fejlődése tette lehetővé.
Egyrészt a műszeres analitika és a számítógépes
vezérlés ugrásszerű tökéletesedése, másrészt az orvos-biológiában
a monoklonális antitest technológia
felfedezése és ipari méretű alkalmazásának kidolgozása.
A kétféle fejlesztés ötvözése következtében az
automatizált, nagy érzékenységű és specifikus módszerek
ma már széles körben elterjedtek a rutin laboratóriumi
diagnosztikában, és lehetővé teszik a fehérjék
kvantitatív mérését a pg/ml vagy más kifejezéssel
a nano–femtomoláris nagyságrendben.
Immunprecipitáción alapuló módszerek
Az egyik legrégebben alkalmazott technika, amely
általában szilárd hordozón lévő gél fázist használ az
antigén-antitest reakció kimutatására. A gél általában
agar- vagy agaróztartalmú, a hordozó lehet üveg
vagy műanyag lemez. Az antigént a gélben kiképzett
lyukakba viszik fel, a specifikus antitestet a gél tartalmazza.
A legegyszerűbb az ún. radiális immundiffúziós
technika, ahol az antigén és az antitest diffúzió
útján találkozik egymással. Gyorsabb eljárás a
„rakéta”-elektroforézis és a „counter”-elektroforézis,
ahol feszültségkülönbség hatására az antigén a gélben
addig vándorol, amíg az antitesttel precipitátumot
nem képez. Mindegyik módszernél gondos mosással
el kell távolítani a gélből a ki nem csapódott fehérjéket,
majd a precipitátumot fehérjefestékkel meg kell
festeni. Az értékelés a precipitációs ív átmérőjének
nagysága vagy az antigén diffúziójának mértéke alapján,
egyszerű távolságméréssel lehetséges. Mennyiségi
meghatározást standard koncentrációsorra kapott
adatok alapján végezhetünk. A módszer ma már
kevéssé használt, de olcsó és leolvasókészülékek (pl.
CCD-kamera) segítségével automatizálható. Nagy
klinikai immunológiai centrumok is alkalmazzák –
főleg a radiális immundiffúziót – előre gyártott, kereskedelmi
forgalomban megvásárolható agarózgélek
használatával. Az eljárás inkább félautomatizáltnak
tekinthető, mert a minták bemérését általában manuálisan
kell végezni. Mint minden immunreakciónál,
itt is figyelni kell az optimális antigén-antitest arányra,
mert bármelyik túlsúlya esetén a komplex a gélből
kioldódhat, fals eredményeket produkálva.

162 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
Immunturbidimetriás módszerek
Az immunturbidimetriás módszerek a diffúziós eljárások
továbbfejlesztett változatai. Itt a reakció csőben
vagy küvettában megy végbe, a szem számára láthatatlan
a képződött immunkomplex, nincs szükség
festési műveletekre. Már e tényekből is következik,
hogy a technika jóval érzékenyebb mennyiségi meghatározást
tesz lehetővé a precipitációs eljárásokhoz
képest. A módszer alapelve, hogy a fény hullámhosszával
összemérhető méretű immunkomplexek
keletkezzenek, melyek a rendszert megvilágító monokromatikus
fényt szórják. Ez úgy lehetséges, hogy
poliklonális antitestet alkalmaznak, az immunglobulinok
mindkét antigénkötő helye aktív kell hogy legyen
(bivalens). A fehérje antigén általában elég nagy
ahhoz, hogy több epitóppal is rendelkezzék, ezért a
poliklonális, bivalens antitestpopuláció képes áthidalni
a molekulák közti távolságot és létrehozni a
megfelelő méretű komplexet. Itt is érvényes az optimális
antigén-antitest arány elve (az ekvivalenciaelv),
mert ellenkező esetben az immunkomplex mérete kicsiny
marad, és a rendszer nem képes a detektálására
(7-1. ábra), ami az immunkomplex fényszórásán
alapul. Az ábráról az is leolvasható, hogy a turbidimetriás
technika relatíve nagy antigénkoncentrációt
igényel az optimális detektálási körülményekhez. Ha
ez a feltétel nem teljesül, akkor az ún. direkt turbidimetria
érzékenységét meg kell növelni a kis koncentrációban
jelen lévő antigének kimutatásához. Ezt úgy
lehet elérni, hogy a specifikus antitestet standard méretű
részecskékhez (általában latexgömböcskékhez)
kötik. Itt is fontos körülmény, hogy az antigénnek
kellően nagynak (több epitóppal rendelkezőnek) kell
lennie az immunkomplexek kialakulásához. Az érzékenységnövelés
a latexszemcsék fényszórásnövelő tulajdonságán
alapul. A módszer sematikus áttekintése
a 7-2. ábrán látható.
Egy epitóppal rendelkező, kisméretű peptid antigének
kimutatására a direkt turbidimetria nem alkalmas,
mert nem tud keresztkötött immunkomplex
létrejönni. A problémát a kompetitív elvvel lehet
áthidalni. A tesztrendszerben mikrorészecskékhez
vagy albuminhoz kötik standard mennyiségben a kimutatni
kívánt fehérje antigént. A specifikus antitestet
és a kötött antigént tartalmazó rendszerben a minta
hozzáadására vetélkedés alakul ki a tesztben lévő
standard mennyiségű antitest és a minta/teszt antigén
között. Az immunkomplexek kialakulása és így a fény
szóródása is fordítottan arányos a kimutatni kívánt
analit koncentrációjával (7-3. ábra).
7-1. ábra. Az antigén-antitest arány hatása az immunkomplex
fényszórására (Heidelberger–Kendall-görbe)
7-2. ábra. A latexerősített direkt immunturbidimetriás
mérés elve
7-3. ábra. A kompetitív, erősített immunturbidimetria elve

Automatizáció a fehérjeanalitikában
163
A turbidimetriás jel mérése
A turbidimetria alapja a mintán áthaladó monokromatikus
fény szóródás miatti intenzitásának csökkenése
(látszólagos abszorbancia). A mérés geometriájának
sematikus ábrázolása a 7-4. ábrán látható.
Az optimális detektálási körülményekhez nagyon
sok tényezőt kell figyelembe venni.
Hullámhossz
A direkt (nem erősített) méréseknél az ultraibolya
tartomány (340 nm körül) a legmegfelelőbb. Mikrorészecskék
alkalmazásánál a részecskeméret (és ennek
megfelelően az immunkomplex mérete) döntő,
a mérettel arányosan nő a hullámhossz. Általában
40–60 nm méretű részecskéket alkalmaznak, amelyek
önmagukban kevéssé szórják a fényt, de az immunreakció
során méretük növekszik és a fényszórás
lényegesen erősebbé válik. Detektálásra, megvilágító
fényforrásként 340–360 nm-es fényt alkalmaznak.
Hőmérséklet
A hőmérséklet emelkedésével gyorsul a reakciókinetika,
ugyanakkor az antigén-antitest komplex
stabilitása csökken. A legtöbb készülék a mérést 37
°C-on végzi.
Végpontos vagy kinetikus mérés?
A végpontos mérés technikailag egyszerűbb, de sok
hibalehetőséget rejt magában, pl. az ekvivalenciazónától
messze eső tartományt nem jelzi, így a linearitási
tartományon kívül eső minták koncentrációjának
mérése bizonytalanná válik.
A kinetikus módszer kétféle lehet:
• Adott időegységenként végzett mérés.
• Folyamatos mérés.
7-4. ábra. Turbidimetriás jel detektálásának elve
Mindkét esetben fontos, hogy a készülék a reakció
indításához képest igen rövid időn belül (< 5 s) képes
legyen az első mérési pont felvételére, ez jelenti
a kiindulási (vak) értéket. A kinetikus detektálással
követni tudjuk az immunkomplexek kialakulásának
sebességét és mérni a telítéshez szükséges időtartamot.
Ezek alapján a készülék érzékeli a linearitási
tartományon kívül eső antigénkoncentrációt és jelzi
a felhasználónak, hogy hígítás szükséges (vagy akár
automatikusan hígít és újramér). A kinetikus mérés
nagyobb érzékenységet is eredményez.
Részecskeszámlálásos elv
Mind a direkt, mind a kompetitív módszereknél
használható mérési mód. A vérsejtszámlálás elvéhez
hasonlóan a mikrorészecskék meghatározott méretű
nyíláson haladnak át, ahol impedanciás vagy optikai
elv alapján működő rendszer (ún. ablak diszkriminátor)
csak a szabad részecskéket számlája, a dimer
vagy nagyobb komplexeket figyelmen kívül hagyja.
Ez a detektálási technika a turbidimetriás eljárás érzékenységét
jelentősen növeli.
Egyéb megfontolások
Az alkalmazott antitestek sajátságai
A poliklonális antitestek általában jobb eredményt
adnak, mint a monoklonálisak. Ennek oka a jobb
komplexképző (áthidaló) sajátsággal és a nagyobb
aviditással magyarázható. Az affinitáskromatográfiával
tisztított antitestek jobb eredményt adnak, mint
a tisztítatlan antiszérumok. A részlegesen emésztett
IgG molekulák, (Fab2’) fragmentek használata előnyösebb
a teljes antitestnél, és a reumatoid faktor
(RF) kötő rész elvesztése miatt az RF-fel nem mutatnak
interferenciát. Biotinnal jelzett antitestek és
streptavidinnel borított mikrorészecskék használata
növeli a rendszer érzékenységét és stabilitását.
Az alkalmazott közeg sajátságai
A reakciós közeg (puffer) összetétele döntően befolyásolja
az antigén-antitest reakciót. Az optimális
pH 6,0–8,0 között van, a puffer nem tartalmazhat ún.
kaotrop anyagokat, amelyek a fehérjék konformációváltozását
segítik elő (pl. perklorát, rodanid, nitrát).
Előnyös a foszfát-, kalcium-, magnéziumtartalmú közeg,
kerülni kell a túl alacsony és túl magas ionerősséget.

164 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
7-5. ábra. Nefelométer felépítésének elvi vázlata
Nefelometria
Az előzőkben leírt alapelvek lényegében alkalmazhatók
a nefelometriás eljárásokra is. Az alapvető különbség
a két módszer között a detektálás elvében van. Itt
a valóban szóródott fényt mérjük, nem a látszólagos
abszorbanciát. A fényforrás a nefelométerekben általában
lézer, amellyel egy kis térrészre tudjuk a fényt
fókuszálni. Az immunkomplexek méretére és számára
elméletileg a 0°-os (szemből való) detektálás lenne
a legalkalmasabb, de a megvilágító lézer fényforrás
jelét a hasznos jeltől nagyon nehéz lenne különválasztani.
Ezért a legtöbb nefelométerben 90°-os detektálást
végeznek (7-5. ábra).
A nefelometria a kisebb méretű immunkomplexeket
érzékenyebben detektálja, mint a turbidimetria,
és hígabb rendszerekben is használható, a mérési ciklusa
rövidebb. A kinetikus detektálást alkalmazó készülékek
a fényszórás folyamatos követésével érzékelik,
ha az antigénkoncentráció kívül esik a linearitási
tartományon, és a mintát ennek megfelelően automatikusan
hígítják. A turbidimetriás és a nefelometriás
módszerek érzékenysége az antigéntől függően kb.
10 –11 mol/l koncentrációig terjed.
Immunkémiai analitikai technikák
(immunoassay-k)
Ma a rutin laboratóriumi gyakorlatban a legérzékenyebb
peptid-, fehérjekimutatási és mennyiségi meghatározási
módszer az immunoassay (a módszerről a
6. fejezetben is olvashatnak, itt elsősorban az automatizációra
fektetjük a hangsúlyt). Érzékenységét elsősorban
annak köszönheti, hogy az antigén-antitest
reakció detektálásához jelzett antigént vagy antitestet
használ. A jelző lehet radioaktív izotóp, fluoreszcens
vagy kemilumineszcens molekula, ill. enzim. Az
egyes módszerek elnevezései is innen származnak:
RIA, FIA, LIA, EIA stb. Történelmileg az első sikeres
eljárás a radioimmunoassay volt, amelyet a hatvanas
években fejlesztettek ki, természetesen akkor
még manuális úton mértek, és 1-2 napig is eltartott az
analitikai művelet. A radioaktív jelölést fokozatosan
kiszorította a nem izotópos eljárások sokasága, de ma
is sok biológiailag aktív vegyület van, amelyet kizárólag
RIA-val tudunk meghatározni.
Az immunoassay-k csoportosítása
Logikailag kétféle csoportosítás jön szóba:
1. A reakciós közeg felépítése szerinti csoportosítás.
2. Az immunreakció típusa szerinti felosztás.
A közeg alapú csoportosításban kétféle assay lehetséges:
• Szilárd fázisú (heterogén) assay, ahol vagy az
antitest, vagy az antigén valamilyen szilárd hordozóhoz
van kötve, és az immunkomplexek a
szilárd fázis felületén jönnek létre.
• Homogén assay, ahol az immunkomplexek
oldatban maradnak, nincs szükség szilárd hordozó
közegre.
A reakció elve alapján lehet:
• Telítési assay.
• Kompetitív assay (lásd később részletesen).
Történeti áttekintés
A RIA módszerek a hatvanas évektől kezdtek elterjedni,
nagyon sok laboratórium maga állította elő a
kívánt antitestet és az izotópjelölést is házilag végezték.
A hetvenes években megindult a műszerek technikai
fejlődése, az automatizáció. Kifejlesztették a 96
lyukú inkubációs lemezeket, az ehhez szükséges pipettorokat
és mosóegységeket, ill. a lemez mélyedéseiben
lévő reakcióelegy optikai denzitását (abszorbanciáját)
leolvasó fotométereket. Ezzel párhuzamosan
kidolgozták az enzimjelölést glutáraldehid-keresztkötés
alkalmazásával. Hamarosan forgalomba kerültek
az első enzimjelölést alkalmazó ELISA (Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay) gyári tesztek, de
ezeknél továbbra is több manuális lépést kellett beiktatni.
Időközben a műszeres analitika teljes auto-

Automatizáció a fehérjeanalitikában
165
matizációjú, elsősorban RIA és ELISA készülékeket
fejlesztett ki, ún. batch típusú analizátorokat, amelyek
egyszerre egyféle analit nagyszámú mérésére voltak
alkalmasak. A kilencvenes évektől kezdték használni
a monoklonális antitesteket és a nem izotópos jelölőket,
ami forradalmasította az immunoassay-n alapuló
módszereket. A számítógépes vezérlést alkalmazó új
műszercsalád a számos új eljárás adaptálásával már
teljes automatizációt biztosított, és ún. beteg orientált
elven működött. A betegorientált készülékek egy
mintából többféle meghatározást képesek elvégezni
a készülékbe előzetesen bevitt kérőlista alapján. Ma
már a laboratóriumok önálló számítógépes rendszerrel
(LIS) vannak ellátva, amely kommunikál a kórházi
számítógépes rendszerrel (HIS), és a vizsgálatkérések
és az eredményközlés is on line megy végbe.
Az immunoassay-kben leggyakrabban
alkalmazott jelölések
Radioaktív izotópos jelölés
Ma a leggyakrabban alkalmazott jelölő a 125 I-izotóp.
A fehérjék jodinációját korábban klóramin-T segítségével
végezték, az izotópot tartalmazó Na-jodidot
oxidálva, az a fehérjék tirozin aminosavába épül be.
Az oxidációs folyamat során a fehérje szerkezete és
biológiai funkciója károsodhat, ezért ma már kevésbé
agresszív módszereket alkalmaznak. Egy korszerű,
oxidációs jodinálásra alkalmas vegyület szerkezete a
7-6. ábrán látható.
7-6. ábra. Korszerű jodinációs
reagens szerkezete
(1,3,4,6-tetrakloro-3a,-
6a-difenil-glikoluril)
Az izotópjelölés legfőbb korlátja az aránylag rövid
felezési idő, ezért a kiteket ennek megfelelően időzítve
kell felhasználni.
Fluoreszcenciás jelölés
A fluoreszcens emisszióra alkalmas vegyületek általában
kettős kötéseket tartalmazó gyűrűs molekulák,
de ismerünk atomi fluoreszcenciát is (lantanida
elemek). Közös jellemzőjük, hogy szerkezeti sajátságuktól
függő hullámhosszúságú fénnyel gerjesztve
őket, a gerjesztett állapot energiatöbbletét foton formájában,
szintén az adott struktúrára jellemző hullámhosszon
bocsátják ki. A gerjesztett állapot élettartama
(ún. fluoreszcens életidő) a legtöbb vegyület
esetében néhány ns, de léteznek olyan molekulák,
atomok, ahol az élettartam a ms-os időskálán írható
le (pl. európium, terbium, XL 665). Néhány széles
körben elterjedt fluoreszcens jelölő tulajdonságait
a továbbiakban részletezzük. Megjegyezzük, hogy a
fluoreszcenciára képes molekulákat nem mindig közvetlenül
kötik az antitestre vagy az antigénre, hanem
az immunreakció lezajlása után injektálják a rendszerhez.
Itt az immunkomplexeket enzimmel jelölik,
és a fényemisszió az enzimatikus aktivitás hatására
jön létre.
A fluoreszcein izotiocianát (FITC) reaktív izotiocianátcsoportot
tartalmaz, amely enyhén lúgos közegben
kovalens kötésbe lép a fehérjék szabad aminocsoportjaival
(diamino-monokarbonsavak és láncvégi
aminosavak). A jelölés után a feleslegben maradt szabad
FITC-t a rendszerből el kell távolítani (dialízissel,
kromatográfiával stb.). Az FITC előnye a jó kvantumhatásfok
és az egyszerű jelölési technika, hátránya az
egymáshoz közel eső gerjesztési és emissziós hullámhossz,
ami a detektálást optikailag megnehezíti. A
7-7. ábra. FITC szerkezeti képlete
és spektrális tulajdonságai

166 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
molekula szerkezete és spektrális tulajdonságai a 7-7.
ábrán láthatók.
A lantanida csoport elemei, ezek közül is az európium
szintén használatos a fehérjék (antitestek)
jelölésére. Legérdekesebb sajátságuk, hogy a fluoreszcencia-élettartamuk
hosszú, ezért alkalmasak
ún. időfelbontású analízisekre. Az európium képes
a gerjesztés során nyert energiatöbbletet egy megfelelő
közelségben lévő másik fluoreszkáló molekulának
átadni (donor–akceptor páros), és a hasznos jel
a második komponens fluoreszcenciája lesz. A jelenséget
fluoreszcencia rezonancia energia transzfernek
(FRET) nevezzük (a részleteket lásd később).
A fluoreszcens jelölők másik csoportja az ún. fluorogén
vegyületek, amelyeket az előbb vázoltak szerint
nem kötik antigénhez vagy antitesthez, hanem
az immunreakció után injektálják az antigén-antitest
komplexhez. A fluorogén vegyületek önmagukban
nem mutatnak emissziót, rendszerint foszfátészter
formában vannak jelen. A fényreakció indukálásához
enzimjelölést (alkalikus foszfatáz) alkalmaznak,
ahol az AP enzim az észterkötést hasítja, kiváltva ezzel
a fluoreszcenciát. Az egyik legismertebb fluorogén
molekula egy kumarinszármazék, a metil-umbelliferon-foszfát-észter.
Emissziós sajátsága a 7-8. ábrán
látható.
Kemilumineszcenciás módszerek
A kemilumineszcencia alkalmazása a fluoreszcenciával
szemben számos technikai előnyt jelent.
Nincs szükség gerjesztő fényre, hiszen a gerjesztett
állapot kémiai reakció vagy elektrontranszfer útján
jön létre, így nem kell számolnunk a gerjesztés zavaró
optikai hatásaival. További előny, hogy a lumineszcenciás
jel detektálásához nincs szükség optikai
elemekre (monokromátor vagy fényszűrő), így a detektort
(fotoelektron-sokszorozó) a mintához közel
tudjuk elhelyezni, a fényveszteség minimalizálásával.
A kemilumineszcenciás jelölők ugyanakkor molekuláris
sajátságaik alapján időben különböző kinetikájú
fényjelet produkálnak. Alapvetően háromféle jeltípussal
találkozunk:
• Felvillanás (flash) jel, amely általában 1 s alatt
lezajlik,
• „Derengés” jel, amely elsősorban enzimkatalizált
reakció során jön létre, és akár több percig
is stabil jelet produkál,
• Időben majdnem konstans fényjel, amelyre legjobb
példa a szentjánosbogárból izolált, ATPfüggő
luciferin/luciferáz rendszer emissziója.
Itt is érvényes az előzőkben tárgyalt elv, hogy a jelölés
lehet kovalensen kötött kemilumineszcenciára alkalmas
molekula vagy a fluorogén mintára enzimjelölést
alkalmazó rendszerhez injektált luminogén vegyület
(pl. észterkötésben).
Felvillanás (flash) típusú jelölés
Bevált jelölők az akridíniumészter típusú vegyületek.
Kovalensen köthetők a fehérjékhez, lúgos közegben,
hidrogén-peroxid jelenlétében kb. 1 s-ig tartó
fényjelet produkálnak (7-9. ábra).
7-8. ábra. Szabad kumarinmolekula emissziós spektruma
(gerjesztés: 360 nm; kvantumhatásfok: 0,73)
7-9. ábra. Akridíniumészter jelölő fénykibocsátásának
mechanizmusa

Automatizáció a fehérjeanalitikában
167
7-10. ábra. Luminol fényemissziójának mechanizmusa
A luminol régóta ismert molekula, lúgos közegben
vagy peroxidvegyületek és peroxidáz enzim jelenlétében
fényt emittál, az emisszió flash típusú (7-10.
ábra).
Erősítő komponensek hatására az emissziós kinetika
megváltozik, és időben hosszú ideig stabil fényjel
keletkezik. Az egyik leggyakrabban alkalmazott erősítő
a p-jodofenol, a jelenséget erősített kemilumineszcenciának
nevezik (ECL). A luminol alapú jelöléseknél
kiterjedten alkalmazzák az ECL módszert.
Elektrokemilumineszcenciás jelölés
Ruténiumkomplex. A trisz(2,2’-bipiridil)ruténium-
(II) vegyület alkalmas fehérjék közvetlen jelölésére. A
gerjesztést itt nem kémiai reakció során felszabaduló
energiatöbblet idézi elő, hanem elektromos áram
(elektrokemilumineszcencia). A rendszerhez szükséges
egy elektrondonor és egy speciális, elektródot
tartalmazó mérőcella. Az elektrondonor szerepét a
tripropilamin (TPA) veszi át, amellyel a mérőcellát a
benne lévő komplexekkel együtt feltöltik. Elektromos
áram hatására a TPA egy elektront ad át a ruténium 3+
komplexnek, mely redukálódik ruténium 2+ -vé, gerjesztett
állapotba kerül, és egy fotont emittál (620
nm). A ruténiumkomplex az elektron leadásával regenerálódik,
és újabb gerjesztési ciklusra lesz képes.
A fényreakció mindaddig folytatódik, amíg az aktív
TPA el nem fogy, így a fényjel felerősödik.
Derengés (glow) típusú jelölés
A dioxetán-foszfátészterek luminogén vegyületek,
azaz észteráz (pl. AP) hatására kerülnek gerjesztett
állapotba, vagyis enzim jelölőt használó immunkomplexek
detektálására alkalmas. A reakció sémáját
a 7-11. ábrán láthatjuk.
A luminogén szubsztrátot az immunkomplexhez
injektálva az alkalikus foszfatáz enzim hasítja a
foszfátészter-kötést, amelynek eredményeképpen egy
7-11. ábra. Dioxetán-foszfátészter fényemissziójának mechanizmusa
[AMPPD: 3-(2’-án-4-metoxi-4-(3’’foszforiloxi)fenil-1,2-dioxetán;
AMPD – : metastabil köztes termék,
2–30 perc élettartammal]
több perces életidejű köztes termék képződik, amelynek
a bomlása során kialakul a gerjesztett állapot és
a fényemisszió. A jel mindaddig közel konstans, amíg
megfelelő mennyiségű szubsztrát van jelen a rendszerben.
A módszer érzékenysége 10 –15 mol vagy kevesebb
AP enzim molekula (vagyis immunkomplex).
A mért jel detektálásának módjai
A 125 I radioaktív jelölésű módszereknél g-számlálót
alkalmaznak, a rövid felezésű idejű (60 nap) izotópból
magas specifikus aktivitása miatt csak igen kevés
szükséges a mérésekhez, és a gyors lebomlás miatt a
radioaktív hulladék kezelése viszonylag egyszerű.
A fényemisszió mérésén alapuló módszerek (mind
fluoreszcenciás, mind kemilumineszcenciás) érzékenységét
nagyban növeli az ún. egy foton számlálásos
technika. Ennek lényege, hogy speciális (külön
erre a célra gyártott) fotoelektron-sokszorozót alkalmazva
a mintáról beérkező alacsony intenzitású jel
fotonjai a detektort egyesével érik el. A fotoelektro-

168 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
mos hatás következtében minden egyes, a fotokatódot
érő foton elektronlavinát indít el a csőben, amely
az anód ellenállásán keresztül feszültséget indukál.
Egy elemi jelenség a modern készülékekben 1 ns alatt
lejátszódik, de tudnunk kell, hogy a létrejövő hasznos
jel (feszültségtüske) szélessége is 1 ns körül mozog,
melyet impulzus üzemű erősítővel alakítanak át
a készülékbe épített számítógép számára kompatibilis
formátumba. Az erősítő megkülönbözteti az egyetlen
foton okozta és az egyszerre, egy csomagban érkező
több foton keltette jelet, amelyet azután nem vesz figyelembe
(diszkriminátor elv). Amennyiben a fényjel
túl erős (vagyis a fotonok csomagokban vagy folytonosan
érkeznek), lehetőség van egy optikailag semleges
(szürke) szűrő alkalmazására, hogy a linearitás
elve megmaradjon. A készülékek az időegység alatt
beérkező fotonok számát mérik, pl. cps egységben
(beütés/szekundum) vagy egy adott idő alatt beérkező
összes foton mennyiségét (valójában integrálásként
fogható fel).
Az időfelbontású technika szintén egy foton számláláson
alapul, de ehhez a módszerhez hosszú életidejű
fluoreszcens jelölők és impulzus üzemű fénygerjesztés
szükséges. Az első kereskedelmi forgalomba kerülő
időfelbontású detektálást alkalmazó gyári kiszerelésű
teszt európiumot használt. Az európium 340 nm-en
gerjeszthető, és optikailag ettől távol eső, 620 nm-es
emissziót ad, minimálisra csökkentve a gerjesztő
fény detektorba szóródását. A gerjesztés 1 ms-ig tartó
fényfelvillanások sorozatából áll, két ciklus közt 1 ms
intervallummal. A mintában esetleg jelen lévő nem
specifikus háttér-fluoreszcencia ns-ok alatt lecseng,
ugyanakkor az európium fluoreszcencia-élettartama
a ms-os időskálán van. Ezért ún. időkapuzott megfigyeléssel
a gerjesztő impulzustól számítva 400–800 ms
közötti emissziót mérik egymás után több ezer ciklusban,
a jeleket akkumulálják. Ezáltal elérhető lesz,
hogy a háttér-fluoreszcenciát teljesen kiküszöbölve
csak a hasznos jel kerüljön feldolgozásra. A módszer
sematikusan a 7-12. ábrán látható.
E módszert ötvözhetjük a FRET elvvel is (fluoreszcenciarezonancia-energiatranszfer)
ahol az antigént
megcsapdázó két antitest mindegyike más módon
van jelölve, donor–akceptor párost képezve. A donor
lehet a korábbi példából ismert európium, az akceptor
pedig pl. egy növényi eredetű bonyolult vegyület,
fantázianeve XL 665. Impulzus üzemű UV lézer
7-12. ábra. Időfelbontású fluoreszcenciadetektálás elve
(európium jelölést alkalmazva)
gerjesztéssel a donor európium a kialakult immunkomplexben
megfelelő közelségben lévő akceptort
gerjeszti. Az akceptor jelét szintén az ismertetett időkapuzott
technikával mérik.
Immunoassay-k típusai a közeg kialakítása
szerint
Heterogén, szilárd fázisú assay-k
Ezeknél a módszereknél az immunreakció valamilyen
szilárd hordozó felületén jön létre. Ez lehet
egy kémcső fala vagy 96 lyukú lemez, mikro-, makrogyöngy,
speciális töltettel rendelkező átfolyó rendszerű
küvetták vagy mágnesezhető részecskék, számtalan
megoldás ismert. A módszer lényege, hogy a
reakcióban részt vevő egyik partnert (antigén vagy
antitest) szorosan a hordozó fázishoz kötik, kovalensen
vagy egyéb módon. A minta hozzáadása után a
kialakult immunkomplexet el kell választani a felesleges
molekuláktól, ezt mosással valósítják meg. Gyakran
egy második inkubációra is szükség van, pl. jelölt
második antitest hozzáadására, ekkor a detektálás
előtt egy újabb mosási ciklus következik. A többlépé-

Automatizáció a fehérjeanalitikában
169
7-13. ábra. Szilárd fázisú (szendvics) immunoassay sémája,
egyszerű csőben (bevont cső assay). A két antitest
mindegyike monoklonális, az antigén más-más epitópjához
kötődik
ses technika az ún. szekvenciális eljárás. Tehát a heterogén
assay-kben szükséges a kötött és szabad fázis
elkülönítése. A módszert sematikusan a 7-13. ábrán
mutatjuk.
Homogén assay-k
A homogén módszereknél együtt vannak jelen a kialakult
immunkomplexek és a komplexet nem képező
molekulák (pl. a reagensben feleslegben lévő szabad
antitestek vagy a minta egyéb fehérjemolekulái). A kötött
és szabad molekulákat szeparáció/mosás nélkül,
fizikai-kémiai módszerekkel különítik el egymástól.
Homogén assay a fluoreszcenciapolarizáción alapuló
eljárás (FPIA), ill. a FRET-technika. Részletesebben a
reakciótípusok tárgyalásánál ismertetjük őket.
Immunoassay-k típusai a reakcióelv szerint
Telítési assay-k
Sokféle megoldás létezik, de a közös bennük, hogy
akkor alkalmazzák, ha az antigén nagyméretű (pl.
fehérje) és több antigéndeterminánssal rendelkezik.
Mind heterogén, mind homogén rendszerben
kialakítható. A 7-13. ábrán valójában egy heterogén
telítési assay látható („szendvics”-eljárás). A szilárd
fázist leggyakrabban monoklonális antitesttel borítják,
elsődlegesen ez adja a módszer specificitását.
A második, jelzett antitest lehet poliklonális, mert a
szekvencialitás miatt nem vetélkedik az első kötéssel.
Abban az esetben, ha a mérendő anyag maga is humán
immunglobulin, akkor az antigént kell a szilárd
fázishoz kötni, és az inkubáció során a mérni kívánt
immunglobulin képez immunkomplexet a hordozó
felületén. A második, jelzett antitest pedig valamilyen
7-14. ábra. Szilárd fázisú kompetitív immunoassay elve.
Az ábra a végső inkubálás utáni (mérés előtti) állapotot
tükrözi, A kompetitív módszernél a jel nagysága fordítottan
arányos az analit koncentrációjával. Az eljárás szintén
alkalmas homogén és heterogén esszék kialakítására
állatban termeltetett antihumán immunglobulin. A
telítési módszereknél a jel nagysága egyenesen arányos
az analit koncentrációjával, szokás az eljárást
immunometrikus assay-nek is nevezni.
Kompetitív assay-k
Általában akkor alkalmazzák őket, amikor a kimutatni
kívánt molekula tömege kicsi (pl. gyógyszerek,
szteroidhormonok stb.), de autoantitesttiter-méréseknél
is használatosak (pl. anti-TPO, anti-Tg). A
módszer lényege, hogy a meghatározás során standard
mennyiségű jelölt antigént hoznak össze a mintában
lévő ismeretlen koncentrációjú antigénnel és a
jelöletlen/jelölt molekulák arányától függően versengés
alakul ki a specifikus antitesteken lévő kötőhelyekért.
A leegyszerűsített elv a 7-14. ábrán látható.
Néhány példa a heterogén eljárások
technikai megoldásaira
Makrogyöngy-módszer
Az eljárás speciális tesztegységeket használ, melyekben
egy néhány mm átmérőjű gyöngy található.
A gyöngy felszínéhez kötik az antitestet vagy az anti-
7-15 ábra. Makrogyöngyöt alkalmazó heterogén immunoassay
egyes lépései sematikusan (1: inkubáció, 2: többszöri
mosás, 3: a mosófolyadék végső eltávolítása, 4: szubsztrát injektálása
után létrejövő kemilumineszcenciás fényemisszió)

170 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
gént, a készülékben található a reagens, amelyben AP
enzimmel jelölt antitest van. A 7-15. ábrán láthatók a
meghatározás egyes lépései.
Az első lépésben a készülék a mintát és a reagenst a
tesztegységbe pipettázza, majd inkubáció következik.
A második lépés a többszöri mosás, az egyes ciklusok
között az egység nagy sebességgel forog, a centripetális
erő a folyadékfázist a felső, dupla falú részbe
viszi. A kiszárított gyöngyhöz (3. lépés) egy injektor
dioxetán-foszfát-észtert ad, ahol megindul az enzimkatalízis,
az emittált fényjelet a 4. lépésben a fotoelektron-sokszorozó
méri.
Mikrogyöngy-módszer
Nagyon sokféle megoldás létezik, itt egy paramágneses
sajátságú gyöngyre és elektrokemilumineszcenciára
épülő eljárást mutatunk be. A gyöngyök
streptavidinnel borítottak, amihez biotinilált
antitestet kötnek. A gyöngyök felszínén kialakulnak
a mintában és a reagensben lévő antigénekből és
antitestekből az immunkomplexek. A 2. antitest ruténium
jelölőt hordoz (7-16. ábra). A felesleges molekulák
kimosását a rendszerből szellemes módon,
egy mágnes segítségével biztosítják, amely az inkubálócellában
lévő mikrogyöngyöket immobilizálja. A
fényemisszió elektromos gerjesztésre következik be, a
módszert elektrokemilumineszcenciás immunoassaynek
(ECLIA) nevezik.
Enzimjelölés alkalmazása (ELISA, EIA)
Heterogén assay, a reakcióhoz általában 96 mélyedést
tartalmazó lemezeket használnak. A mélyedésekben
található a kötött reakciópartnerek egyike, a
kialakuló immunkomplexek tormaperoxidáz enzimmel
jelöltek. Mosás után a mélyedésekbe a peroxidáz
enzim szubsztrátját pipettázza a készülék, majd egy
adott inkubációs idő után erős sav hozzáadásával a
színes termék képződését leállítja. Speciális ELI-
SA-fotométerrel minden egyes lyukban lévő reakcióelegy
abszorbanciája leolvasásra kerül. A hagyományos
színezékképzésen kívül fluoreszcenciás vagy
luminometriás módszereket is kifejlesztettek.
Példa homogén eljárás technikai
megoldására
A legelterjedtebb homogén assay a fluoreszcenciapolarizáción
alapuló módszer (FPIA). Kisméretű antigének
(pl. gyógyszerek) mennyiségi meghatározására
alkalmas kompetitív assay. A készülék a mérés során
standard mennyiségű, fluoreszcenciásan jelzett antigénhez
hozzákeveri a fehérjementesített mintát és a
specifikus antitestet. Az inkubáció során vetélkedés
alakul ki az antitestkötésért. Nagy analitkoncentrációnál
kevés jelzett molekula tud kötődni, kis értékeknél
pedig sok fluoreszkáló analit kötődik az antitesthez.
A fluoreszcenciapolarizáció foka a molekulák
rotációs mozgási szabadságát tükrözi, ezért a szabadon
maradt jelzett molekulák gyors rotációs mozgása
miatt a polarizációs fok alacsony lesz. Tehát a gyors
molekuláris mozgások alacsony, nullához közeli fluoreszcenciapolarizációval
(p) jellemezhetők, a gátolt,
lassú rotációs mozgás (pl. antitesthez kötött fluoreszcenciásan
jelölt analit esetében) pedig magasabb
p-értékkel. A p dimenzió nélküli szám, maximális
értéke az adott fluoreszkáló molekula fizikai kémiai
sajátságaitól függően megközelítheti a 0,5-ös értéket.
A mérés rendkívül egyszerű: a mintát függőleges síkban
polarizált gerjesztő fénnyel világítjuk meg, majd
az emittált fény intenzitását a gerjesztő fénnyel pár-
7-16. ábra. Heterogén szilárd fázisú immunoassay (EC-
LIA-módszer) elve
7-17. ábra. FPIA mérés elve. A nyilak mérete a molekulák
rotációs mozgási szabadságát jelképezi (a kicsi nyíl az antitest
kötésben lévő komplex lassú mozgására, a nagy nyíl a
szabad, jelzett analitok gyors forgó mozgására utal)

Automatizáció a fehérjeanalitikában
171
huzamos, ill. azzal 90º-os szöget bezáró polarizációs
szűrőn keresztül detektáljuk. A polarizációs fok a két
szűrőállasra kapott intenzitás értékekből, egyszerű
képlet segítségével számítható. Az elmondottak alapján
amennyiben a jelzett analit az antitesthez kötődni
tud, mozgása lelassul, a polarizációs fok nő. Tehát a
fluoreszcenciapolarizáció értéke fordítottan arányos a
mintában lévő, mérni kívánt molekulák koncentrációjával
(7-17. ábra).
A homogén módszer előnye az egyszerűség és a gyorsaság,
mivel nincs szükség szeparációra és mosásra.
Hátránya, hogy pl. az FPIA-eljárás csak kisméretű
antigének mérésekor használható. A korábbiakban
vázolt FRET-technika viszont már alkalmas fehérjék
mennyiségi meghatározására is homogén assay-ben,
pl. a prokalcitonin mérése ilyen elv alapján is lehetséges.
A mennyiségi meghatározások alapvető kérdése a
megfelelő standardok alkalmazása és maga a standardizálás
módja. Mivel 10 –12 mol/l vagy annál is kisebb
koncentrációk méréséről van szó, ezért nagyon fontos
a megfelelő tisztaságú készítmények használata,
ezt ma már sokszor rekombináns fehérjékkel, peptidekkel
érik el. A legtöbb cég a diagnosztikai kiteknél
megadja a standardok visszavezethetőségét is. A
kalibrációra használható többpontos módszer (rendszerint
6 standard segítségével), ill. ún. mesterkalibráció.
Mindkét esetben parallel méréseket kell végezni,
készüléktől függően duplikátumban vagy akár
négyes parallelben. Általánosan igaz, hogy kalibrációt
az immunoassay-knél 2 hetente, új gyártási számú
(lot-szám) reagens használatakor, ill. a minőség-ellenőrzési
szabályok szerinti, rekalibrációt igénylő hiba
esetén kell végezni. Az automatizált technikáknál a
legtöbb készülék vezérlő számítógépébe vonalkódos
beolvasással be kell vinni az adott módszerre, kalibrátorra,
reagens lot-számra jellemző kalibrációs görbe
adatait, és a készülék összehasonlítja az aktuálisan
mért jeleket a gyárilag definiált jelekkel. Szintén előre
definiált adatok alapján a készülék vezérlőegysége jelzi,
hogy sikeres volt- e a kalibráció, a megengedettnél
nagyobb eltérés esetén sok műszer automatikusan le
is tiltja a mérést. A manuálisabb technikáknál (pl. bevont
csöves, ELISA-módszerek) a felhasználónak kell
eldöntenie, hogy a kalibráció megfelelő volt- e vagy
sem. Általános szempont még, hogy a kalibrátoroknak
ugyanabban a közegben (mátrix) kell lenniük,
mint a mintáknak.
Hatpontos kalibráció
Parallel mérések szükségesek, a mérési pontok átlagából
a készülékek megrajzolják a kalibrációs görbét
vagy kiszámolják annak egyenletét. Kompetitív eljárásnál
fordított a jel–koncentráció arányosság, telítési
assay-nél egyenes (7-18. ábra).
Szokás a kalibrációs görbét a kötött/szabad antigén
arányában is megadni, ekkor pl. egy kompetitív assay
mérési pontjai a 7-19. ábrán látható módon néznek
ki, bonyolult matematikai ún. 4 paraméteres illesztési
algoritmus felhasználása után.
A kalibrációs görbe esetenként „kiegyenesíthető”
az ábrázolásmód függvényében (pl. logit-log, log-log
Az immunoassay-k kalibrációjának módjai
7-18. ábra. Jel–koncentráció összefüggés
a) Kompetitív assay esetében
b) Telítési assay esetében
7-19. ábra. Kompetitív assay négyparaméteres illesztésű
kalibrációs görbéje a kötött–szabad antigénhányad (% B/
B 0
) alapján. A vízszintes tengely logaritmikus skálájú.

172 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
stb. átszámítás/átalakítás/transzformáció). A készülékek
megadják a kalibrátorok névleges értékeit és az
aktuális görbe alapján visszaszámolt koncentrációkat.
A visszaszámolt értékek és a névleges értékek összehasonlításával
a kalibráció elfogadhatósága megítélhető.
Mestergörbén alapuló kalibráció
Kiterjedten alkalmazott módszer, számos előnynyel
rendelkezik. A módszertől, a detektálás elvétől
függően rendszerint két „igazító, korrigáló” (adjustor)
standard szükséges, amely lefedi a lineáris mérési
tartományt (alacsony, magas adjustor). A gyártó
egy adott reagens és kalibrátor lot-számra több készüléken
sok párhuzamos mérést végez 6–10 kalibrátorkoncentráció
felhasználásával, a kapott átlagjelek
és a koncentráció képezi az adott rendszerre nézve
igaz ún. mestergörbét. A gyártó a mestergörbére kapott
jelek adatait mellékeli a reagenshez vonalkód
formájában, amelyet kalibrálás előtt be kell olvasni a
készülékbe. Ezután következik a saját készülék illesztése
a gyári ún. alapkészülékhez. Ez valójában nem
tekinthető a hagyományos értelemben vett kalibrációnak,
mert azt a gyár már elvégezte. Az „igazító”
kalibrátorok (2–4 parallel) mérésekor kapott jelet a
készülék számítógépes algoritmusa megvizsgálja és
összehasonlítja a mestergörbe megfelelő mérési pontjainak
jelével (pl. fotonszám). Amennyiben az azonos
koncentrációra kapott, gyártó által megadott és saját
magunk által mért fotonszámokat megvizsgáljuk, lineáris
összefüggést találunk, függetlenül a kalibráció
típusától. A 2 adjustor jeléből egyenest képezve és az
egyenes egyenletét összehasonlítva a gyári adatokkal,
megkapjuk az aktuális „igazító” egyenes egyenletét:
y = a*x + b
ahol y a gyári adat, x a saját adjustorra mért adat,
a az egyenes meredekségének együtthatója, b pedig
a tengelymetszet. Ideális esetben a saját egyenesünk
pontosan illeszkedik a gyártó által megadott
adatokra, ezért a meredekségi együttható értéke 1,0
lesz. Amennyiben a saját készülékre kapott egyenes
egyenlete eltér a gyártó által megadottól, az aktuális
meredekséget a rendszer a mestergörbe meredekségéhez
illeszti az „a” együttható korrekciójával. A még
elfogadható korrekciós tartomány 0,8–1,2 között változhat.
Ennél nagyobb eltérés esetében durva hibával
kell számolnunk, és a hiba felderítése, kiküszöbölése
után újra kell kalibrálnunk. A rendszer a tengelymetszet
értékét is figyeli, ennek különösen a kompetitív
assay-knél van jelentősége. Egy grafikus ábrázolású
példát a mesterkalibrációra a 7-20. ábrán mutatunk.
Példa egy mesterkalibrációra: TNF-α kalibrációs
egyenlete. TNF Kit Lot 153, az illesztett egyenes adatai:
meredekség (a) 1,068, tengelymetszet (b) 3226
cps. A kalibráció megfelel az elfogadhatósági kritériumoknak.
A mesterkalibráció előnye, hogy a mestergörbe
minden egyes pontja (szemben a felhasználó által
mindig aktuálisan végzett 6 pontos kalibrációval) a
gyártó által sok-sok parallel mérés alapján nagy pontossággal
jellemzi az adott adjustorra elvárható jel
nagyságát. További előny a reagensmegtakarítás, a 12
mérési pont helyett rendszerint csak 4 mérést kell végeznünk.
Természetesen mindegyik típusú kalibráció
után kétszintű, független kontrollméréssel ellenőrizzük
a módszert.
Analitikai interferenciák
„igazító” 1
„igazító” 2
7-20. ábra. Mesterkalibráció: a gyártó által megadott és a
saját mérés alapján kapott értékek összevetése. Az alapkészülék
és a saját készülék kalibrációjának egymáshoz való
viszonyítása
Az interferenciák egy része a betegek mintáinak sajátságaiból
is származhat. Itt azokra a zavaró tényezőkre
térünk ki, amelyek in vitro képesek a valóságtól eltérő
eredményeket produkálni.
Hemolízis, lipaemia, sárgaság
Az immunkémiai módszerek a hagyományos fotometriánál
kevésbé érzékenyek ezekre a tényezőkre.

Automatizáció a fehérjeanalitikában
173
Minden teszt leírásában megtalálhatók azok a kritikus
határértékek, amelyek felett a vizsgálatot elvégezni
nem szabad.
Heterofil antitestek jelenléte a mintában
Az átlagpopulációban is előfordul, hogy a betegek
vérszéruma ismeretlen okok miatt heterofil antitesteket
tartalmaz különböző állati immunglobulinok
ellen. Ez különösen állatgondozók vagy háziállatot
tartók vizsgálatakor lehet probléma. Mivel a tesztek
állati antitesteket tartalmaznak, ezért a beteg állati
immunglobulin-ellenes ellenanyagai interferálhatnak
a kitben található antitestekkel, hamisan magas vagy
alacsony eredményt adva (a teszt típusától függően).
Külön ki kell térnünk az antiegér-immunglobulin
kérdésére.
HAMA (heterofil antiegér antitest). A monoklonális
immunglobulinok jó része egér eredetű, ezért
az egérimmunglobulin-ellenes antitestek különösen
nagy problémát okozhatnak az immunkémiai módszereknél
(pl. tumormarkermérések). A jelenség gyakorisága
nő, sok beteg kap egérimmunglobulin-készítményt
diagnosztikai vagy terápiás céllal (pl. az ún.
célzott immunterápia alkalmával). A telítési immunoassay-kben
okoz problémát, szintén hamisan magas
vagy alacsony eredményeket előidézve.
Analitellenes autoantitestek
Lehetnek a mintában a mérni kívánt analit elleni
immunglobulinok is, erre jó példa az anti-Tg autoantitest.
Ezért Tg-vizsgálat kérésekor érdemes az anti-Tg-titert
is ellenőrizni, mert magas érték esetében
a Tg-meghatározás eredménye fenntartással kezelendő.
Más, saját fehérje elleni autoantitestek is előfordulhatnak,
pl. CK, fehérjehormonok, troponin stb.
A reumatoid faktor (RF) szerepe
Titere az életkorral nő, időseknél akár 80%-os is lehet
a magas RF incidenciája. Az RF sajátsága, hogy
hasonlóan a heterofil antitestekhez, bármilyen állati
immunglobulinhoz képes hozzákötődni, meghamisítva
a mérési eredményt.
7-21. ábra. „High dose hook” effektus jelenség. Extrém
nagy analitkoncentrációnál gátolt a jelölt immunkomplexek
kialakulása, a mért jel a valóságos koncentrációhoz
tartozónál kisebb (lehet akár a referenciatartományon belül
is)
„High dose hook” effektus
Valójában a mérni kívánt antigén extrém mennyisége
idézi elő a jelenséget telítési assay-kben. A laboratóriumi
szakember számára észrevehetetlen hiba,
a kapott hamis eredmény gyakran a referenciatartományba
esik. A jelenség in vitro jön létre a mérőrendszerben,
mert az antigén extrém nagy mennyisége
gátolja a szekunder jelzett antitesttel kialakítandó
szendvics létrejöttét, és a mosási fázis után tévesen
alacsony jelet kapunk (7-21. ábra).
A jelenséget csak a beteg kezelőorvosa veszi észre,
amennyiben az alacsony érték nem illik a klinikai
képhez. Konzultáció után a hiba kiküszöbölhető a
minta hígításával és újramérésével. Mindaddig hígítani
kell a mintát, amíg az eredmény már nem mutat
további koncentrációnövekedést.
Interferenciák kiküszöbölésének
lehetőségei
Elsősorban a beteg szérumában jelen lévő antitestinterferencia
csökkentésére törekszenek. Az egyik
lehetséges módszer pl. az analit szempontjából semleges
állati (egér) immunglobulin hozzáadása a reagensekhez
(blokkolás). Csökkenthetjük az RF zavaró
hatását immunglobulin-fragmentek (FAb2’) alkalmazásával
is. Az ún. visszanyerési (recovery) módszerek
is használhatók pl. a Tg esetében, de valójában nem
váltották be a hozzájuk fűzött reményeket.
Talán az egyik legegyszerűbbnek látszó eljárás az, ha
interferencia gyanújakor a mintát egy másik módszerrel,
másik antitesttel dolgozó laboratóriumba is
elküldjük és összehasonlítjuk az eredményeket.

174 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
Különböző immunkémiai módszerek
érzékenységének összehasonlítása
A 7-1. táblázatban feltüntettük a klasszikus (jelölőt
nem tartalmazó) és a modern immunanalitikai módszerek
becsült kimutathatósági határértékeit. Az adatok
csak tájékoztató jellegűek, mert fehérjék esetében
sokszor nem tudjuk moláris koncentrációban megadni
az analit mennyiségét, ill. a jelölőt nem alkalmazó
módszereknél ma már (a korábban is leírt) sokféle
érzékenységnövelő eljárást alkalmaznak a különböző
gyártók.
Irodalom
Bangs, L. B.: New developments in particle-based immunoassays:
introduction. Pure & Appl. Chem. 68(10):
1873–1879, 1996.
Forkman, J.: Optimal Calibration in Immunoassay and
Inference on the Coefficient of Variation. Doctoral Thesis,
Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala,
2008.
Tate, J., Ward, G.: Interferences in Immunoassay. Clin.
Biochem. Rev. 25(2):105–120, 2004.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1904417/)
http://www.bangslabs.com/files/bangs/docs/pdf/304.pdf
http://www.slideshare.net/many87/immunological-methods-of-analysis-1
http://www.cwc.nic.in/main/HP/download/35%20Emission%20Spectroscopy%20and%20Nephelometry.pdf
http://www.rcpa.tv/parts/educational/immunology/
RCPA3.pdf
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&-
pid=S0036-46652000000300008
http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=
1CC1AF24-9D9B-4D21-B850-688931CF7E3B
http://books.google.hu/books?id=_9kEeTjyJdMC&printsec=frontcover#v=onepage&q&f=false
7-1. táblázat. Immunkémiai módszerek becsült (analitikai) kimutathatósági határértékei
Jelölőt nem alkalmazó módszer
immunprecipitáció
immunturbidimetria
immunnefelometria
Kimutathatósági határ (tömeg/térfogat koncentráció)
> 0,1 g/l
> 0,05-5 mg/l
> 0,01 mg/l
Jelölőt tartalmazó módszer Kimutathatósági határ (moláris koncentráció; mol/l) Alkalmazott assay típusa
RIA 10 -12 -10 -13 heterogén
FIA 10 -11 heterogén
FPIA, FRET 10 -9 homogén
LIA, ECLIA 10 -12 heterogén
EIA 10 -12 heterogén

Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria
175
Műszeres analitikai lehetőségek –
Tömegspektrometria
Márk László
A tömegspektrometria (mass spectrometry, MS)
napjaink legáltalánosabban alkalmazott analitikai
eljárása, amely alkalmas szerves és szervetlen komponensekből
képződött ionok tömeg/töltés (m/z)
arányának nagyhatékonyságú meghatározására. Kezdetben
az eljárást tömegspektroszkópiának nevezték,
hiszen az ionok egy fluoreszkáló ernyőn detektálták,
azonban ez az elnevezés napjainkban nem használatos.
A tömegspektrometria lényege, hogy a vizsgálandó
vegyületek gáz halmazállapotú részecskéiből ionokat
állít elő, majd ezeket a relatív tömegük és töltésük hányadosa
szerint szétválasztja és detektálja.
A tömegspektrometriás eljárások közel 100 éve
járulnak hozzá a fizikai, kémiai, biológiai és orvosi
kutatások rohamos fejlődéséhez. Napjainkban a
tömegspektrométerek méretének és árának jelentős
csökkenése nagyban elősegíti a módszerek elterjedését,
így jelenleg ez az egyik legdinamikusabban
fejlődő és legtöbbet alkalmazott analitikai eljárás.
Rutinszerűen alkalmazható széles tömeg- és polaritástartományban
különféle vegyületek tömegének
és szerkezetének vizsgálatára. Intenzív a fejlesztés a
különböző ionforrások területén is, amelynek eredményeként
jött létre a két leggyakrabban alkalmazott
technika:
• Mátrixsegített lézerdeszorpció (MALDI, Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization).
• Elektrosprayionizációs (ESI, ElectroSpray
Ionization) technika.
Ezek kifejlesztése alapvető fontosságú volt a modern
tömegspektrometria fejlődésében, hiszen segítségükkel
lehetőség nyílt nagy molekulatömegű, nem
illékony biopolimerek, peptidek, fehérjék, valamint
szintetikus rendszerek szerkezetének komplex tanulmányozására.
Általánosan kijelenthetjük, hogy tömegspektrométerek
rendkívül kis anyagmennyiségű
minták (subfemtomol) gyors, pontos, megbízható
analízisére alkalmasak, és az elválasztástechnikában
használatos módszerekkel (HPLC, UPLC, nanoLC,
nanoUPLC, gélelektroforézis) jól kombinálható készülékek.
A tömegspektrométer elvi felépítése
A tömegspektrométer-készüléknek rendelkeznie kell
mintabevivő rendszerrel, ionforrással, analizátorral
és detektorral, valamint az ezekhez kapcsolódó
számítógépes adatfeldolgozó és irányító rendszerrel
(7-22. ábra). Az analizátor, a detektor és a nem légköri
nyomáson működő ún. vákuumionforrások (pl.
vákuum-MALDI) viszonylag jelentős vákuum (10 –4 –
10 –7 mbar) mellett üzemeltethetők. A nagyvákuum az
ion-molekula ütközések minimalizálását szolgálja, de
hozzájárul az ionizáció és a fragmentáció hatékonyságához
is. A nem kívánt kinetikai kölcsönhatások
módosíthatják az ionok repülési pályáit, részben vagy
teljesen kiolthatják töltésüket, és így reprodukálhatatlanná
tehetik a tömegspektrumot, valamint csökkentik
a műszer érzékenységét és felbontását.
A vákuumrendszer
Az ionforrást elhagyó töltéssel rendelkező részecskék
m/z értékének pontos meghatározása csak akkor lehetséges,
ha az analizátorban és a detektorban az ionok
energiája – a nem kívánt ütközések miatt – nem
változik meg. Ennek érdekében a tömegspektrométer
e részeiből el kell távolítani a gázmolekulákat. A mo-
7-22. ábra. A tömegspektrométer elvi felépítése
7-23. ábra. A tömegspektrométerben uralkodó nyomásviszonyok

176 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
dern tömegspektrométerekben a nagyvákuumot két
lépésben állítják elő. Elsőként egy elővákuum-szivatytyú
10 –2 –10 –3 mbar vákuumot hoz létre, erre a célra
általában rotációs szivattyút alkalmaznak, de használható
olajmentes csavarszivattyú is. A 10 –5 –10 –7 mbar
nagyvákuumot egy vagy több turbómolekuláris szivattyú
biztosítja. A tömegspektrométerben kialakuló
tipikus nyomásértékeket a 7-23. ábra szemlélteti. A
vákuumrendszer stabilitása és megbízható működése
elengedhetetlen a tömegspektrométer megfelelő üzemeléséhez,
meghibásodásuk a tömegspektrométer
számára végzetes lehet, mivel a nagyvákuumba hirtelen
beáramló anyagok (olajgőz, vízpára) súlyosan
károsítják a műszert és tartozékait. Ennek elkerülése
érdekében a vákuumrendszer gondos karbantartást
és folyamatos áramellátást igényel.
Mintabevitel
Tömegspektrometriával elméletileg bármilyen halmazállapotú
sokkomponensű rendszer vizsgálható,
azonban ezt nagyban befolyásolja az alkalmazott
mintabeviteli és ionizációs technika. Illékony vegyületeket
(pl. gázok, könnyen párolgó anyagok) közvetlenül
be lehet vezetni a forrásba, ahol az ionizáció
megtörténik. Ha a vegyület nem illékony, akkor először
fel kell oldani, majd valamilyen alkalmas megoldással
gázfázisba kell juttatni, amely előidézhető pl.
elektromos erőtér vagy porlasztás és szárítógáz segítségével.
Az oldószer helyes megválasztása alapvetően
befolyásolja a tömegspektrum minőségét. Általánosságban
kerülendő a pufferek és a nem illékony sók alkalmazása.
Egyszerű, néhány komponensű minták, ill. kalibrációs
standardok esetében alkalmazhatunk közvetlen
adagolást, amelynek során egy automata infúziós
pumpa és egy fecskendő segítségével juttatjuk a
mintát tartalmazó oldatot az ionforrásba. Komplex
biológiai mintáknál szinte minden esetben szükség
van a komponensek előzetes elválasztására is, erre alkalmazhatunk
többek között gázkromatográfot vagy
HPLC-készüléket. A fejlesztések folyamán a folyadékkromatográfia
és a tömegspektrometria összekapcsolása
során legnagyobb megoldandó probléma a
vákuum stabilitásának megőrzése volt, hiszen az ionforrásba
bekerülő mintamolekulák és oldószergőzök
rontják a vákuumot. Napjainkban azonban a nagy
7-24. ábra. A MALDI TOF tömegspektrometriánál használatos,
a minta töményítésére is alkalmas rozsdamentes
acél mintatartó tálca
hatékonyságú vákuum- és zsiliprendszerek használatával,
ill. a mikro és a nano áramlási sebességek alkalmazásával
ez a probléma kiküszöbölhető.
A lézerdeszorpcióra épülő ionizációs eljárások során
a mintát szilárd állapotban viszik be, ennek során
a vizsgálandó mintát általában mátrix jelenlétében
egy mintatartó tálcára kristályosítják. A mintatartók
mérete és kialakítása igen változatos lehet, azonban
a legelterjedtebb a 384 férőhelyes well-plate méretű
formátum, amely könnyűvé teszi a módszerek automatizálását.
A mintatartók anyaga is eltérhet, általában
valamilyen kémiai szempontból ellenálló fémből
készülnek, így igen elterjedtek a rozsdamentes
acél, alumínium- és aranybevonattal ellátott tálcák,
de léteznek egyszer használatos műanyag változatok
is (7-24. ábra). Néhány klinikai (pl. lézersebészet)
és gyógyszergyári alkalmazásnál elterjedőben van a
közvetlen deszorpción alapuló ionizáció is, amelynek
során a minta, pl. gyógyszertabletta, szövetminta
közvetlenül érintkezik az ionizációt kiváltó lézerrel.
Ionforrások
A tömegspektrometriában szükség van a vizsgált
részecskék hatékony ionizálására, mivel a részecskék
készülékben való mozgatása és szétválasztása
az elektromos töltésükre gyakorolt hatáson alapul.
A megfelelő érzékenység eléréséhez elengedhetetlen
az ionizációs paraméterek optimalizálása. Az ionizációs
technika megválasztását főként a vizsgálandó
molekula és az azt körülvevő mátrix határozza meg.
Mivel univerzálisan alkalmazható ionizációs technika
nincs, így a készülékek fejlődésében meghatározó
szerepű a különböző ionforrások cseréjének gyorsasága
és egyszerűsége. Ennek következtében főként az

Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria
177
atmoszferikus nyomású ionforrások terjedtek el, hiszen
azok függetlenek a készülék vákuumrendszerétől,
így cseréjük, tisztításuk, karbantartásuk gyorsan
és könnyen elvégezhető. A vákuumionforrások közül
a legjelentősebb a MALDI, ennek karbantartási igénye
jóval kisebb a folyadékkromatográfiával kapcsolt
változatokénál.
A legrégibb és igen gyakran alkalmazott eljárás az
elektronionizáció (EI). Ebben az esetben a minta egy
fűtött katódból kilépő elektronnyalábbal találkozik,
és az ütközések révén elektronok lépnek ki, így pozitív
ionok jönnek létre. Az elektronok ideális gyorsító
feszültsége jellemzően 70 volt. A módszer jól alkalmazható
a könnyen gázfázisba vihető szerves vegyületek
széles körének vizsgálatára kb. 1000 Da molekulatömegig.
Előnye, hogy intenzív, stabil, könnyen
reprodukálható ionáramot biztosít, és kompatibilis a
legtöbb tömeganalizátorral. Hátránya azonban, hogy
megfelelő eredményességgel csak a viszonylag illékony,
kis molekulatömegű, stabil vegyületek vizsgálatára
alkalmazható, a jelentős fragmentáció miatt a
tömegspektrum bonyolult, gyakran a molekulaion
nem jelentkezik. Az elektronionizáció során alkalmazott
magasabb hőmérsékleten egyes anyagok bomlást
szenvedhetnek az alkalmazott ionizáló energiától
függő mértékben. Ez a jelenség, a forrásban történő
bomlás (in source decay, ISD), megfelelően alkalmazva
hasznos lehet szerkezetvizsgálatokhoz, mivel
további elemzésre felhasználható, anyagi minőségre
jellemző töredékionok (fragmensek) képződnek.
Ennek elkerülésére alakultak ki a kíméletes (soft)
ionizációs technikák, amelyek kevesebb fragmentumot
hoznak létre, így a spektrum egyszerűbb, könynyebben
értékelhető. A lágy ionizációs módszereket
három csoportba soroljuk: részecskeütközéses technikák,
párolgáson-porlasztáson alapuló módszerek
és lézerdeszorpciós módszerek.
• Részecske ütközésen alapuló technikák:
– kémiai ionizáció (CI);
– szekunder ion tömegspektrometria (SIMS);
– gyors atom- és ionütköztetés (FAB, FIB);
– plazmadeszorpció (PD).
• Párolgáson-porlasztáson alapuló eljárások:
– térdeszorpció (FD);
– térionizáció (FI),
– termikus porlasztásos (TS) atmoszférikus
nyomáson lejátszódó kémiai ionizáció;
– f otoionizáció (APCI, APPI);
– elektroporlasztásos (ESI, nanoESI, DESI) ionizáció.
• Lézerdeszorpciós (LDI) technikák közül a jelentősebbek:
– mátrixsegített lézerdeszorpció (MALDI);
– felületsegített lézerdeszorpciós ionizáció
(SELDI).
Kíméletes eljárást jelent a kémiai ionizáció (chemical
ionization, CI), amelynek lényege, hogy először egy
nagy fölöslegben jelen lévő reagens gázt ionizálunk, és
az így képződött ionok a minta molekuláival reagálva
azokat ionizálják. Ezt a jelenséget, amikor az ionizáció
ion–molekula kölcsönhatás eredményeként jön létre,
1913-ban J. J.Thomson figyelte meg hidrogéngázban.
A leggyakoribb reagensgázok: metán, izobután, ammónia,
klór, dinitrogén-oxid. Minthogy a kölcsönhatások
valószínűsége arányos a nyomással, ezeket az
ionforrásokat általában légköri nyomáson működtetik.
Ennek a módszernek az előnye a kíméletes ionizáció,
így kevesebb fragmens ion képződik, valamint
általában megjelenik a spektrumban a pozitív vagy negatív
molekulaion. Pozitív ionizáció esetén gyakori a
[M+H] + protonált kvázi-molekulaion megjelenése is.
A szekunder ion tömegspektrometria (SIMS) esetében
a sík – általában fém – felületen elhelyezett mintát
részecske- vagy ionnyalábbal bombázzuk, és a
mintából kibocsátott szekunder ionokat analizáljuk.
Ide tartozik a plazmadeszorpció és a folyadék szekunder
ion tömegspektrometria (LSIMS).
A plazmadeszorpció (PD) elve, hogy a vizsgálandó
mintát vékony filmrétegre viszik fel, és e mögé, a mintával
ellentétes oldalra, helyezik el az erősen α-sugárzó
252 Cf radioaktív izotópot. Az izotópból kilépő nagy
energiájú hasadási termékek a mintán való áthaladáskor
helyi felmelegedést okoznak és mikroplazmát
hoznak létre; így energiát adnak át a minta molekuláinak,
amelyek ionizálódnak és deszorbeálódnak. A
PDMS volt az első módszer, amelynek segítségével
nagy molekulatömegű fehérjék, ill. összetett antibiotikumok
vizsgálhatók voltak.
A folyadék szekunderion tömegspektrometria
(LSIMS) technika napjainkban is használatos elsősorban
a hőre érzékeny vagy nem illékony kis és közepes
molekulatömeggel rendelkező anyagok esetében.
Két alapvető módszert különíthetünk el:
• A gyors atombombázás (fast atom bombardment,
FAB) során egy atomágyúból gyors

178 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
argon- vagy xenonnyalábot bocsátanak a mintára,
amely viszkózus, kevéssé illékony folyadékban,
többnyire glicerinben van oldva.
• A gyors ionbombázás (fast ion bombardment,
FIB) esetében céziumionokat (Cs + ) alkalmaznak.
A részecskék a folyadékfelszínbe ütközve
energiát adnak át a felszínnek, amely eloszlik a
felületi réteg mintamátrix molekulái között,
azok ionizációját eredményezve. A képződő
minta- és mátrixionok kiszakadnak a felszínről,
és az így létrejött szekunder ionokat analizáljuk.
A folyadékfilm felületi rétege diffúziós folyamatok
révén állandóan pótlódik, frissül, ennek
köszönhetően az analizált felület folyamatosan
regenerálódik.
A FAB hőérzékeny, poláros, 300–6000 Da tömegű
molekulák vizsgálatára alkalmas, a FIB pedig elsősorban
nagyobb részecsketömegek esetén (akár 30 000
Da). A módszer szerkezeti információkat is nyújt,
mivel jellegzetes fragmensionok is képződnek. Napjainkban
is folyamatos a módszer fejlesztése, többek
között nagyon ígéretes eredményeket értek el fullerénionok
(C 60+
) ionizáló részecskeként való alkalmazásával.
A térdeszorpció és a térionizáció a deszorpciós
módszerek közé tartozó rokon ionizációs technikák,
amelyeknek főként történelmi jelentősége van. Mindkét
esetben a minta ionizációját erős elektromos tér
váltja ki, a módszerek tulajdonképpen csak a mintabeviteli
módban különböznek egymástól. A vizsgált
részecskék szerkezetéről ugyan kevés információt
szolgáltatnak, azonban tömegpontosságúk jó.
A porlasztáson alapuló ionizációs eljárások különösképpen
a folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrométerek
esetében számítanak nélkülözhetetlen
megoldásnak. A módszer elvét már a hatvanas
években kigondolták, de a megvalósítás a nyolcvanas
évekig váratott magára. A termikus porlasztás jelentette
az első igazi előrelépést a hőre érzékeny, nem illékony
anyagok MS-, ill. LC-MS-vizsgálatának területén.
Elve, hogy a folyadékkromatográfiás oszlopon
szétválasztott komponenseket és a mozgófázist nagy
nyomással egy elektromosan melegített (100–200 ºC)
fémkapillárisba juttatják, amelynek vége a tömegspektrométer
ionforrásában van, így a minta és az
oldószergőzök nagy sebességű ionizált spray formájában
kerülnek be a tömegspektrométerbe. Ebben az
esetben az ionizációt az oldószer (mozgófázis) illékony
elektrolitjai valósítják meg.
A leggyakrabban alkalmazott porlasztásos ionizációs
forma az elekrospray (ESI, nanoESI), amelynek
során a kromatográfról lejövő minta egy fém vagy
fémbevonatú szilika kapillárison halad keresztül,
amelyre 2–5 kV feszültséget kapcsolnak. A kapilláristól
és a tőle 1-2 cm-re, nanoESI esetén néhány mm-re
elhelyezett, ellentétes töltésű elektród között erős
elektrosztatikus tér képződik, ennek hatására a kapillárisból
kilépő folyadék kúpszerűen kicsúcsosodik
(Taylor-kúp), és róla töltéssel rendelkező folyadékcseppek
szakadnak le.
A technika továbbfejlesztése nagyobb áramlási sebességek
(100–300 μL/perc) mellett is jól alkalmazható.
Itt a kapilláris körül elhelyezkedő külső csőben
vezetett inert porlasztógázzal (többnyire nitrogénnel)
pneumatikusan hozzuk létre a töltött aeroszolt a folyadékmintából.
A folyadékcseppekből az oldószer
párolgását további nagy mennyiségű, fűtött (200–300
ºC) nitrogénárammal segítjük elő. A párolgás során
a cseppecskék térfogata csökken, így a felületi töltéssűrűség
egyre nagyobb lesz, ami végül a cseppek felbomlását
(Coulomb-robbanás) okozza. A folyamat
végén a mintából származó kompakt, többszörösen
töltött ionokat kapunk (7-25. ábra). Az ESI elsősorban
a nem illékony, poláros, bázikus csoportot hordozó
molekulák vizsgálatához ideális.
A porlasztásos és a kémiai ionizációs eljárások
kombinációja a légköri nyomású kémiai ionizáció (atmospheric
pressure chemical ionization, APCI). Az
aeroszol képződését és elpárologtatását az ESI-nél ismertetett
módon idézik elő, de itt nem a kapilláris,
hanem a mintaárammal szemben elhelyezkedő elektród
áll nagyfeszültség alatt (koronafeszültség). E körül
a koronakisülések hatására az elpárolgott víz- és
egyéb oldószer-molekulák ionizálódnak, és protonálják
az itt áthaladó mintát is (7-26. ábra). A módszer
7-25. ábra. Az elektrospray-ionforrás (ESI) vázlatos működési
elve

Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria
179
7-26. ábra. Atmoszférikus nyomású kémiai ionforrás (APCI) vázlatos felépítése
7-27. ábra. A mátrix segítette lézerdeszorpciós ionizáció
elve
nagy előnye, hogy lényegében bármilyen oldószer és
puffer mellett használható.
A lézerdeszorpciós ionizáció (LDI) lényege a mintamolekulák
lézersugárral való elpárologtatása és
ionizációja, azonban ilyenkor gyakran keletkeznek
rövid élettartalmú fragmentionok. E problémák megoldását
a nyolcvanas évek végén kifejlesztett mátrixsegített
lézerdeszorpciós ionizáció (MALDI) jelentette.
Ilyenkor a mintamolekulákhoz kis molekulatömegű,
szerves ún. mátrixanyagot keverünk, amely elnyeli és
közvetíti a lézer energiáját a vizsgálandó anyagnak, ill.
ionizálja azt, miközben meggátolja a keletkezett ionok
fragmentációját. A módszer egyik legkényesebb
pontja az adott vizsgálathoz optimális mátrix kiválasztása,
általában mustársavat (SA), α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat
(HCCA, CHCA), 2,5-dihidroxi-benzoesavat
(DHB) alkalmazunk. A minta-előkészítés
során a mátrix és a mintaoldat keverékét (0,2–2 μl)
a mintatartóra szárítjuk úgy, hogy lehetőleg homogén
mikrokristályos szilárd elegyet kapjunk. A
gyors lézerimpulzusok (50–100 Hz) ebből a szilárd
felületből párologtatnak el anyagot, és ez az ionizált
részecskefelhő kerül az analizátorba (7-27. ábra). A
MALDI segítségével igen kíméletesen, de hatékonyan
ionizálhatóak még nagy tömegű, bomlékony molekulák
is (fehérjék, szénhidrátok, oligonukleotidok,
polimerek), így igen elterjedt módszer a biológiai,
orvosbiológiai kutatásokban. További előnye az óriási
mintaáteresztő képessége, amely napi több ezer minta
automatizált vizsgálatát is jelentheti.
Analizátor
Az analizátorban zajlik a képződött ionok szétválasztása
a tömegük és a töltésük hányadosa (m/z) szerint.
Minél kisebb az ion tömege, ill. minél nagyobb
a töltése, annál nagyobb sebességre képes szert tenni
egy adott elektromágneses erőtér hatására. Lényegében
ezt használják ki az ionok transzportján alapuló
módszerek. Az újabb, modernebb készülékek inkább
az ionok szelektív tárolása révén választják szét a részecskéket.
Az analizátor jellemző paraméterei a maximális
vizsgálható m/z érték, az áteresztőképesség (a
detektált és a képződött ionok számának hányadosa),
ill. egy adott tömegre jellemző maximális felbontóképesség
(molekulatömeg/csúcsszélesség). A Fourier-transzformációs
tömegspektrométerek esetében
az utóbbi érték elérheti akár az egymilliót is.

180 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
7-30. ábra. A 3D ioncsapda analizátor felépítése
7-28. ábra. Kettős fokuszálású szektoros analizátor elvi felépítése
A legrégebbi típusok a szektoros analizátorok, ahol
az ionok a haladásukra merőleges mágneses térbe
jutnak. Itt az elektromágneses impulzusuk és a töltésük
szerint különböző sugarú körpályákra térülnek.
A mágneses térerősség értékét változtatva más és más
ionok juttathatók a detektorra. Az ionnyalábot ezt
követően egy elektrosztatikus analizátorban sebesség
szerint fokuszálják, ahol az ionok a haladásukra
merőleges elektromos térerősség mellett a kinetikus
energiájuknak megfelelő körpályát követnek (7-28.
ábra). A szektoros készülékeket nagy felbontás, nagy
érzékenység és széles mérési tartomány jellemzi. Hátrányuk,
hogy drágák, lassúak, nagy a technikai háttérigényük,
napjainkban az izotóparány-méréseknél
van gyakorlati jelentőségük.
Az egyik legelterjedtebb analizátortípus az ún.
kvadrupól (quadrupol, Q). Itt az ionok négy párhuzamos
hengeres rúd között haladnak, amelyekre
egyenáramot és nagyfrekvenciás váltóáramot kapcsolnak.
A szemben lévő rudak azonos, a szomszédosak
ellentétes polaritásúak, így közöttük oszcilláló
elektromágneses tér alakul ki. A kvadrupólba bejutó
különböző m/z értékkel rendelkező ionok különböző
amplitúdójú kitéréseket végezve haladnak, azonban a
rudak közti ideális pályát csak meghatározott m/z értékű
ionok képesek tartani, a többi ion vagy elveszti
a kinetikus energiáját, vagy a rudakba csapódik (7-
29. ábra). A rudakra kapcsolt váltóáram frekvenciáját
változtatva a kvadrupól mindig más-más m/z értékkel
rendelkező ionokat enged a detektorba, így a teljes
tömegtartomány végigpásztázható. A kvadrupól
készülékek viszonylag egyszerűbben működtethetők,
gyorsak, mennyiségi vizsgálatokra kiválóan használhatók,
mivel lineáris tartományuk 5-6 nagyságrend,
valamint jól kombinálhatók különféle ionforrásokkal
és analizátorokkal. Hátrányuk, hogy tömegpontosságuk
és felbontóképességük viszonylag alacsony.
Hasonló elven működik az ioncsapda (iontrap, IT),
amelynél egy gyűrű alakú és két másik elektród között
jön létre az oszcilláló háromdimenziós elektromágneses
tér. A bejutott ionok ebben az erőtérben
haladnak egy körpályára kényszerítve, miközben a
körre merőleges irányban rezgéseket végeznek (7-30.
ábra). Lényeges újítás, hogy itt az ionok szétválasztására
nem térben, hanem időben kerül sor; ha nö-
7-29. ábra. A kvadrupól-analizátor felépítése és működési
elve
7-31. ábra. A lineáris (2D) ioncsapda analizátor felépítése

Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria
181
7-32. ábra. Az orbitrap analizátor vázlatos felépítése
veljük a váltóáram amplitúdóját, akkor az ionok rezgőmozgása
egyre fokozottabb lesz, és növekvő m/z
sorrendben távoznak a kilépési elektród nyílásán a
detektor felé (ún. tömegszelektív instabilitási üzemmód).
Az ioncsapda előnye a nagyobb érzékenység és
felbontóképesség, a gyorsabb működés, a szélesebb
mérési tömegtartomány és a többszörös fragmentáció
(MS n ) lehetősége. Hátránya a mennyiségi mérések
korlátozott lehetősége (lineáris tartomány kb. 4
nagyságrend). Az ioncsapdás készülékek sikerét reprezentálja,
hogy számos típusuk érhető el, így vannak
lineáris (2D, LTQ) és 3D ioncsapdák, ill. (7-31. ábra)
ún. orbitrap analizátoros (7-32. ábra) készülékek. Ez
utóbbiakra jellemző a rendkívüli tömegpontosság és
felbontóképesség.
Az elektrotechnika fejlődésével lehetővé vált igen
kicsiny időkülönbségek pontos észlelése, ami a repülési
időn (time-of-flight, TOF) alapuló elválasztás
alapját képezi. A megoldás lényege, hogy az elektromosan
térmentes repülési csőbe azonos időpillanatban,
azonos kinetikai energiával rendelkező ionok kis
csomagjai érkeznek, és a detektort az m/z arányos repülési
idő után érik el (7-33. ábra). Különféle kisegítő
korrekciós eszközök (pl. reflektron, iontükör) révén a
7-34. ábra. Példák hibrid felépítésű tömegspektrométerekre
a) Q-TOF analizátoros készülék, B)
b) Q-Trap analizátorral ellátott MS
TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség,
széles mérési tartomány érhető el, ill. alkalmazásukkal
megvalósítható többféle fragmentációs lehetőség
is. Megfelelő ionforrással (MALDI) kombinálva a nagyobb
biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek.
A MALDI-hoz ideális a repülési idő analizátor,
mivel általa kihasználható a több száz daltonos felső
tömeghatár, valamint nagy felbontás és érzékenység
érhető el.
A felsorolt analizátortípusok bármilyen kombinációja
is elképzelhető az ún. hibrid készülékekben,
amelyek két vagy több analizátor összekapcsolásából
jönnek létre. Leggyakrabban ezeket a hibrid készülékeket
alkalmazzák a rutin vizsgálatok során, amelyek
közül a legelterjedtebb kombináció a Q-TOF, a hármas
kvadrupól (QqQ), az LTQ-orbitrap, a Q-IT, az
IT-TOF megoldás (7-34. ábra).
Detektor
7-33. ábra. A repülési idő analizátor felépítése és működési
elve
A tömegspektrométerben haladó ionok csoportja lényegében
a forrástól a detektorig tartó elektromos
áramot jelent. A készülékek detektorai a hozzájuk
érkező rendkívül kis ionáramot (10 –10 –10 –15 A) érzékelik,
és értékével arányos analóg elektromos jelet képeznek.
A pontdetektorok az időben szétválasztott, a
sordetektorok pedig a térben elkülönített ionok érzékeléséhez
használatosak. Alapvető követelmény, hogy

182 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
7-35. ábra. Mikrocsatornás detektor vázlatos működési
elve
a detektorok képesek legyenek követni az ionáramok
igen gyors változásait, tehát „memóriaeffektusuk”
kicsi legyen. A legelterjedtebben alkalmazott típus
a mikrocsatornás detektor (7-35. ábra). A kapott kis
jeleket többnyire elektron- vagy fotonsokszorozókkal
felerősítik, majd számítógépes feldolgozás céljára digitalizálják.
Fragmentálás és tandem
tömegspektrometria
Ha viszonylag kis energiával ionizáljuk a vizsgálandó
anyagunkat, akkor a molekulák egészben maradnak,
és a tömegükre és töltésükre jellemző ún. molekulacsúcsot
[M + , M – ] kapunk. Többnyire azonban jóval
nagyobb mennyiségű információ nyerhető, ill. speciális
problémákra (pl. több anyag elkülönítése, szekvenálás)
jobb megoldást jelent, ha a részecskéket kinetikus
energia hozzáadásával pontosan szabályzott
módon széttördeljük, fragmentáljuk. Ez a folyamat
végbemehet az ionizációs folyamat során, ill. röviddel
utána (in source és post source decay, ISD, PSD),
vagy az analizátorban egy inert gázzal való ütközés
révén (collision induced dissociation, CID; és electron
transfer dissociation, ETD). A keletkező fragmentumok
kémiai felépítése és aránya az anyaion
anyagi minőségétől és az alkalmazott energiától függ,
és így további tömegspektrometriás vizsgálatra felhasználhatók.
Természetesen ilyenkor csak azok a
fragmentumok, más szóval leányionok jönnek szóba,
amelyek az eredeti töltést tovább hordozzák.
Ezt a jelenséget használják ki a tandem tömegspektrometria
– jelölése: MS/MS vagy MS n –esetében,
amikor két egymás után kapcsolt analizátor közé
egy jellemzően argon, hélium vagy nitrogén gázzal
működtetett ütközési cellát (collision cell) iktatnak.
Itt lehetőség van az első analizátorban szétválasztott
ionok egyenkénti fragmentálására, és a leányionok
szelektív vizsgálatára. Tipikus megoldás a QqQ elrendezés,
ahol két kvadrupol analizátor közé kerül a
cella. Az ioncsapda esetén kissé más a helyzet: itt a
fragmentációt megelőző és követő folyamatok nem
térben, hanem időben válnak szét egymástól egyetlen
analizátorban. Fontos tudni, hogy a rutinszerűen
használt készüléktípusokban a fragmentáció az
ionintenzitás 1-2 nagyságrenddel való csökkenését
okozza, így tényleges gyakorlati haszna az MS/MS és
MS 3 méréseknek van.
Mérési üzemmódok tandem tömegspektrométerrel:
Egyedi ion vizsgálat (single ion recording). Az egyik
analizátor egy bizonyos m/z értéknél enged át, a másik
nem aktív (7-36. ábra).
Pásztázás (scan). Az egyik analizátor egy bizonyos
m/z tartományt pásztáz, a másik nem aktív (7-37.
ábra).
7-36. ábra. Az egyedi ionkiválasztás sematikus működése
7-37. ábra. A teljes pásztázás elvi működése

Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria
183
7-38. ábra. A többszörös reakció megfigyelés elve
7-41. ábra. A semleges vesztéses pásztázás elve
Többszörös reakció megfigyelés (multiple reaction
monitoring). Mindkét analizátor egy-egy bizonyos
m/z értéknél enged át; általában egy iont és valamely
fragmentumát. Több, független fragmentációs átmenet
vizsgálható így (7-38. ábra).
Anyaion-pásztázás (parent ion scan). Az első analizátor
egy tartományt pásztáz, a második pedig egy
bizonyos m/z értéknél enged át. Azokat az ionokat
vizsgálhatjuk, amelyek egy bizonyos méretű töltött
fragmentumot adnak (7-39. ábra).
Leányion-pásztázás (daughter ion scan). Az első analizátor
egy bizonyos m/z értéknél enged át, a második
pedig egy tartományt pásztáz. Megvizsgálhatjuk,
hogy egy bizonyos méretű ion milyen fragmentumokra
esik szét (7-40. ábra).
Állandó semleges vesztés (constant neutral loss).
Mindkét analizátor pásztázó módban működik, de a
második egy állandó m/z értékkel lejjebb. Azok az ionok
vizsgálhatók, amelyek egy bizonyos méretű semleges
fragmentumot képeznek (7-41. ábra).
A tömegspektrum
7-39. ábra. Prekurzor ion pásztázás
7-40. ábra. A fragmens ion pásztázás elvi működése
A tömegspektrum a tömeg/töltés (m/z) arány és az
ionintenzitás függvényszerű ábrázolása. A legmagasabb
csúcs a báziscsúcs, ehhez viszonyítjuk az öszszes
többi komponenst. Az abszolút ionmennyiség
arányos a mintában jelen lévő anyagmennyiséggel, a
fragmentumok relatív ionintenzitásai pedig a molekulatípusra
és az alkalmazott mérési eljárásra jellemzőek.
A készülékre, így a kapott tömegspektrumra is
jellemző a felbontóképesség, amely azt a R = m/Δm
értéket jelenti, ahol m a tömegszám, melytől egy
szomszédos csúcsot még éppen el tudunk különíteni.
Ehhez meg kell adni, hogy a két csúcs közös átfedő
szakasza legfeljebb milyen relatív magasságú lehet,
Δm a két csúcs tömegének különbsége (ill. helyesebb
m/z és Δ[m/z] értékekről beszélni). A felbontóképesség
a nagyobb tömegek felé haladva általában csökken,
tipikusan 15 000–100 000 értékű.

184 7. fejezet Műszeres analitikai lehetőségek a klinikai laboratóriumi fehérjevizsgálatokban
A tömegspektrometria főbb alkalmazási
területei
Minél többet tudunk a gének szerepéről, annál világosabbá
válik a fehérjék és azok módosításainak
szerepe a patológiás folyamatokban. A proteomika
összetett fehérjekeverékek, valamint azok enzímatikus
emésztményeinek egyidejű vizsgálatát jelenti. A
proteomkutatás módszertana egyszerű: az egészséges
és a beteg rendszer fehérjekészletét összehasonlítva
olyan markereket fedezhetünk fel, amelyek egyértelmű
diagnózis felállítását teszik lehetővé. Tehát az
adott pillanatban minőségi és lehetőleg mennyiségi
vizsgálatot kell végezni az adott fiziológiás állapotú
sejt teljes fehérjeállományáról, és azt össze kell vetni a
kísérletesen manipulált vagy beteg sejt proteomjával.
A különbséget okozó fehérjék vagy fehérjetöredékek
mennyiségi és minőségi analízise, pontos szekvenciájának
és kovalens módosításainak meghatározása
diagnosztikai célokat szolgálhat. A MALDI TOF tömegspektrometria
által biztosított széles tömegtartomány
miatt célszerűen két detektort alkalmazunk.
A kis tömegű ionokat a nagyobb úthosszat biztosító
reflektron detektorban, míg a nagyobb tömegűeket lineáris
módban mérjük. A kimutatási határ rutinszerűen
femtomol nagyságrendű. A készülékkel megvalósítható
tandem tömegspektrometria (TOF/TOF) is,
amelynek során az ionforrásból kilépő részecskéket
két módon fragmentálhatjuk: közvetlenül az ionforrás
után (PSD) vagy argongáz segítségével egy erre a
célra kialakított ütközési cellában (CID, ETD).
A valóságban a megoldás azért bonyolult, mert több
tízezer fehérje vagy peptid egyszerre végzendő analíziséről
van szó. Ma a legelterjedtebb módszer az, hogy
valamilyen elválasztástechnikai módszerrel a több tízezer
fehérje, peptid közül kiválasztják azt a nagyobb
csoportot (szubproteomot), amelyben az összehasonlítani
kívánt peptidek, fehérjék megtalálhatók. Erre
a célra a gélelektroforézis vagy a nagy hatékonyságú
folyadékkromatográfia a legalkalmasabb, ezt követően
a frakciókat tisztítjuk és enzimatikusan emésztjük. Az
így kapott peptidkeverékhez meghatározott arányban
mátrixoldatot keverünk és az elegyet mintatartó
tálcára szárítjuk. A mátrix kiválasztásánál a molekula
típusát, polaritását, valamint molekulatömegét is figyelembe
kell venni. Ennek megfelelően a fehérjeemésztmények
(molekulatömeg < 5 kDa) elemzéséhez
ideális mátrix az α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav (HCCA,
CHCA). A vizsgálat során rögzítjük a peptidkeverékre
jellemző tömegspektrumot, majd az értékelés során
megfelelő matematikai átalakítások után az eredményeket
elküldjük egy fehérjeszekvenciákat tartalmazó
adatbázisba (Mascot, SwissProt, NCBInr). A keresés
eredményeként megkaphatjuk az adott tömegspektrum
által meghatározott fehérjét vagy fehérjéket. Ezt a
meghatározási módszert Peptide Mass Fingerprintingnek
(PMF) nevezzük. A gyulladásos betegségek laboratóriumi
diagnosztikájában alapvető jelentősége van
a sejten belüli jelátviteli utak monitorozásának. A patológiás
folyamatok detektálásának leggyorsabb módja
a jelátviteli utak fontosabb enzimjei, fehérjéi kovalens
módosításának meghatározása, amely többek között
jelenthet foszforilációt, farnezilációt, lizin oldalláncok
acetilezését és fehérjék ADP-ribozilezését is. A MALDI
TOF tömegspektrometria felhasználásával azonosítjuk
a különböző fehérjemódosításokat, valamint azokat a
fehérjéket, amelyek szerepe jelentős a folyamatok patomechanizmusában,
ill., amelyek diagnosztikai értékűek
lehetnek. A meghatározás során a PMF-hez hasonlóan
rögzítjük az elsődleges tömegspektrumot, majd
ezt követően a nagyobb intenzitású vagy diagnosztikailag
jelentős peptideket PSD vagy CID fragmentációval
tovább bontjuk. Így meghatározható a peptidek
pontos elsődleges szerkezete és annak módosulása, valamint
megismerhetővé válik eddig még nem ismert
peptidek és proteinek felépítése (De Novo Sequencing).
Napjaink egyik legizgalmasabb fejlesztése a MAL-
DI TOF tömegspektrometria képalkotó módszerként
való alkalmazása (MALDI Imaging) (7-42. ábra).
Ennek során egy speciális mintatartóra 10–20 µm-es
szövettani metszetet és mátrixot szárítunk. Ezt követően
a mintáról előre meghatározott szisztémában és
lézerintenzitással több ezer tömegspektrumot veszszünk
fel, amelyeket a megfelelő szoftverfeldolgoz: az
egyes m/z értékekhez tartozó intenzitások eloszlását
képként jeleníti meg. A mycobacteriumok sejtmembránjában
nagy mennyiségben jelen lévő mikolsavak
jelenléte igen jól vizsgálható MALDI TOF tömegspektrometriával.
A módszer érzékenységét jellemzi,
hogy még több száz éves Mycobacterium tuberculosissal
fertőzött csontminták esetében is eredményesen
alkalmazható.
A gyógyszergyárak számára rendkívüli jelentősségű
a felhasznált vegyületek lehetséges bomlástermékeinek
ismerete. A MALDI TOF tömegspektrometria
segítségével a gyógyszerhatóanyagok stabilitásvizsgá-

Műszeres analitikai lehetőségek – Tömegspektrometria
185
lata is elvégezhető. Ilyenkor a minták azonos menynyiségeit
speciálisan előkészített mintatartó tálcára
cseppentjük, majd analizáljuk. A vizsgálatok után a
hatóanyagokat tartalmazó tálcákat akár –70 °C-on tárolhatjuk,
és a későbbiek folyamán mérhetjük a molekulák
szerkezetében bekövetkező változásokat.
A tömegspektrometria alkalmazása az orvosi laboratóriumi
diagnosztikában már eddig is számos, a
medicina számára nagy fontosságú anyag vizsgálatát
tette lehetővé vagy éppen egyszerűbbé, pontosabbá.
Az elemzés alá vont molekulák köre folyamatosan
bővül, gyakran egész betegségcsoportokat lefedő tematikus
panelekbe rendeződik. Nem elhanyagolható
körülmény, hogy a tömegspektrometriás eljárások
sok esetben gazdaságilag is a legkedvezőbb megoldást
kínálják más, hagyományosabb technikákkal összehasonlítva.
Természetesen arról sem szabad megfeledkezni,
hogy az alapberuházás és a szervizelés
költségei igen nagyok. Az MS, különösképpen megfelelő
kromatográfiás elválasztással és tandem mérési
módozattal kombinálva jelenleg az egyik leghatékonyabb
technológia a szerves molekulák vizsgálata
terén. Óriási előnye, hogy egyetlen rövid méréssel,
amelyet gyakran csak egyszerű minta-előkészítés előz
meg, nagyszámú vegyület elemzésére van lehetőség,
továbbá ez a repertoár viszonylag könnyen és olcsón
bővíthető. A jövőben várhatóan egyre több módszer
fog átvándorolni az MS alkalmazások területére.
A tömegspektrometria tudománya folyamatosan
és nagy ütemben fejlődik. A tandem triple quadrupol
készülékeknél egy-egy újabb generáció mindig jó
egy nagyságrenddel nagyobb érzékenységű az előzőnél.
A korábban költségesnek számító típusok, mint
pl. a TOF-készülékek, egyre inkább elérhetők lesznek
a klinikai laboratóriumok számára. Az állandó technikai
újítások egyre bővítik az analitikai lehetőségek
körét, fokozva az alkalmazások és az új igények gyarapodását.
A MALDI és a SELDI (Surface Enhanced
Laser Desorption Ionization) TOF módszerek
napjainkban bekövetkező intenzív fejlődését óriási
mintafeldolgozó képességüknek, valamint egyszerű
kezelhetőségüknek köszönhetjük. Ennek megfelelően
az elkövetkező néhány évben globálisan is a nagy
áteresztőképességű analitika nélkülözhetetlen eszközeivé
válnak.
Irodalom
7-42. ábra. A hypophysis adenilát-cikláz-aktiváló polipeptidjének
(PACAP-38) MALDI TOF tömegspektrometriás
vizsgálata
a) A PACAP-38 protonált kvázimolekula ionja lineáris detektálási
módban
b) A PACAP-38 nátriummal képzett kvázimolekula ionja
lineáris detektálási módban
c) A PACAP-38 triptikus peptidjeinek azonosítása reflektron
módban
Gross, J.: Mass Spectrometry: A Textbook. Springer, Heidelberg.
2004.
Lipton, M. S., Pasa-Tolic, L.: Mass Spectrometry of Proteins
and Peptides. Humana Press, New York, 2009.
Talián Cs. G., Márk L., Melegh B.: Tömegspektrometria.
In: Debreczeni L., Kovács L.G. (szerk.): Gyakorlati
Laboratóriumi Medicina. 477–492. old. Literatura Medicina
Kiadó, Budapest, 2008.
Vékey, K., Telekes, A., Vértes, A. (eds): Medical Applications
of Mass Spectrometry. Elsevier, Amsterdam, 2008.

8. A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai -
Dimenziók, vonatkoztatások
Liszt Ferenc
Mértékegységrendszerek
A laboratóriumi kvantitatív analitikai folyamatokban
megszülető eredmények a számszerű érték mellett
minden esetben mértékegységgel is rendelkeznek.
A metrikus mértékegységrendszer alapjául a
francia nemzetgyűlés 1791-ben fogadta el a métert
és a kilogrammot. Tizennyolc állam (köztük hazánk
is) 1875-ben Párizsban írta alá az első nemzetközi
mértékegyezményt. Ezt követte az 1881-ben elfogadott
CGS rendszer, amelyet 1939-ben felváltott a
nemzetközileg is elfogadott – a méter, a kilogramm,
a másodperc és az amper mértékegységen alapuló
– MKSA mértékegységrendszer. 1948-ban ezt kiegészítették
további három alap mértékegységgel:
az erő (newton), az energia (joule) és a teljesítmény
(watt) egységével.
A Mértékegységek Nemzetközi Rendszere, SI (Système
International d’Unités) a legújabb, nemzetközileg
elfogadott mértékegységrendszer, amely néhány
kiválasztott mértékegységen, ill. a tíz hatványain alapul.
A mértékegységek rendszerét az alapegységek, a
kiegészítő egységek és a velük leírható származtatott
egységek alkotják. A mértékegységek nagyságrendjét
a prefixumok (előtagok) adják meg. A jelenleg használt
SI mértékegységrendszert a XI. Általános Súlyés
Mértékügyi Konferencia fogadta el 1960-ban.
Magyarországon 1960-tól az SI figyelembevételével
készült kormányrendelet szabályozta a mértékegységek
használatát. 1972-ben megjelent az MSZ 4900
„Fizikai mennyiségek neve, jele és mértékegysége”
című szabvány, amely teljes egészében a nemzetközi
mértékegységrendszert használta, de kötelező használatát
nem írta elő. 1976-ban adták ki a 8/1976.
(IV.27) MT. sz. rendeletet, amely előírta az SI rendszerre
való kötelező áttérést és az SI kizárólagos használatát
(azaz más mértékegységek használatának tilalmát)
1980. január 1-jétől tette kötelezővé. A WHO
30. közgyűlésén 1977-ben a tagországok elfogadták
az SI mértékegységrendszer bevezetését az egészségügyben.
A Magyar Köztársaság országgyűlése az
1991. évi XLV. törvény 1. mellékletében ismét meghatározta
a szabványos magyar mértékegységrendszer
alapjait, az 1976 óta ismertté vált tudományos eredmények
figyelembevételével.
Az általános laboratóriumi rutin és kutatás gyakorlatában
ma alkalmazott SI mértékegységrendszernek
hét alapegysége van:
1. Hosszúság: m (méter).
2. Tömeg: kg (kilogramm).
3. Idő: s (másodperc).
4. Elektromos áramerősség: a (amper).
5. Termodinamikai hőmérséklet: °k (kelvin).
6. Fényerősség: cd (kandela).
7. Anyagmennyiség: mol (mól).
A laboratóriumi gyakorlatban sokszor alkalmazunk
származtatott SI mértékegységeket is:
1. Térfogat: m 3 (köbméter), ill. tört része: dm 3 (köbdeciméter).
2. Sűrűség: kg/m 3 (kilogramm/köbméter).
3. Anyagmennyiség-koncentráció: mol/m 3 (mól/köbméter).
4. Molalitás (mol/kg oldószer).
Az SI rendszer bevezetése a legtöbb országban orvosi,
biológiai laboratóriumban csak részben valósult meg,
manapság is használnak több régebbi, nem SI mértékegységet,
pl. Hgmm, °C, U/L, mol/L, kg/L.
Egyéb használt mértékegységek:
1. Térfogat (űrtartalom) : L (liter = 1 dm 3 = 10 -3 m 3 ).
2. Hőmérséklet: °C (Celsius-fok).
3. Tömegkoncentráció: g/L (gramm/liter).
4. (Sejt) szám koncentráció: 1/L.
5. Molaritás (anyagmennyiség-koncentráció): mol/L
(mol/liter oldat).
6. Katalitikus aktivitás (nem SI egység): U (nemzet-

188 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
közi enzim egység, 1 U = egy perc alatt átalakított
egy mikromol szubsztrát).
7. Katalitikus aktivitás (SI egység): kat (1 katal = egy
s alatt átalakított egy mol szubsztrát).
8. Katalitikus aktivitáskoncentráció (nem SI egység):
U/L (1 nemzetközi egység/liter).
9. Katalitikus aktivitáskoncentráció (SI egység): kat/L
(1 katal/liter).
Az analitikai referenciarendszer és elemei
Egy biológiai minta adott komponensei esetében a
laboratóriumi mérési eredmények valódisága akkor
biztosítható teljes körűen, ha a laboratórium által
működtetett mérőrendszer kalibrációja és valódiságmeghatározó
eljárása dokumentáltan visszavezethető
az SI rendszerig. Ezt az MSZ EN ISO/IEC 17025:2005
(Vizsgáló és kalibrálólaboratóriumok felkészültségének
általános követelményei) és az MSZ EN ISO
15189:2007 (Orvosi laboratóriumok. A minőségre
és a felkészültségre vonatkozó külön követelmények)
szabvány pontosan meghatározza.
A mérések valódisága a legmagasabb rangú etalonokhoz
(primer referenciakalibrátor, primer referencia-mérőmódszer)
való visszavezetés révén, referenciarendszerben
biztosítható.
A referenciarendszer összetevői:
• A mérendő komponens pontos definiálása a
humán mintában.
• A komponenst specifikusan mérő referenciamódszer.
• Primer vagy szekunder, mátrix alapú referens
anyag.
• Referencialaboratóriumok hálózata.
A laboratóriumi medicinában és a kutatásban is több
száz különböző analit koncentrációját határozzuk
meg, a vizsgált komponens pontos definiálása alapvető
igény.
Az A típusú analitok pontosan meghatározott molekulatömegű
molekulák, melyek visszavezethetők SI
mértékegységre, amennyiben megfelelő mérési eljárás
és kalibrátorok rendelkezésre állnak. Az A típusú
analitok közé tartoznak a klasszikus klinikai kémia
analitjai, elektrolitok, ásványi anyagok, anyagcseretermékek
(pl. koleszterin, kreatinin, húgysav), szteroidok,
vitaminok, gyógyszerek. A mérések eredményét
mol/L, elfogadott SI egységben adjuk meg. Mivel az A
típusú analitok megfelelően tisztított formában előállíthatók,
a komponenst tartalmazó referenciaanyagok
könnyen előállíthatók és a rutin mérési eljárástól
független referenciaeljárás kifejleszthető. Jó példa egy
referenciamérési rendszerrel vizsgált A típusú analit,
a kortizol meghatározása vérszérumban. A kortizol,
jól definiált molekulatömeggel bíró anyag, koncentrációja
mol/L-ben kifejezhető, és gravimetriás úton
megfelelően tiszta anyagból primer referenciaanyag
készíthető. A referenciamérési eljárás, pl. izotóphígításos
gázkromatográfia, tömegspektrometria
(ID-GC/MS) közvetlenül kalibrálható erre az elsődleges
referenciaanyagra. A referenciaeljárást alkalmazó,
jól definiált körülmények között dolgozó referencialaboratóriumok
rendelik hozzá a hiteles értékeket a
másodlagos mátrix referenciaanyagokhoz. A gyártók
ezeket az eredményeket alkalmazzák a rutin módszerek
kalibrálásához, ami visszavezethető eredményeket
biztosít a végfelhasználó rutin módszer számára
(8-1. ábra).
A B típusú analitok (ezek száma az A típusú analitok
számát sokszorosan meghaladja) vizsgálatakor a
komponens olyan heterogén molekula (legtöbbször
fehérje), amelyhez nem lehet meghatározott, homogén
molekuláris szerkezetet rendelni. A mérést legtöbbször
valamilyen immunkémiai technikával végzik,
az eredmények nem fejezhetők ki SI egységben,
csak tömegegységben (g/L) vagy önkényes egységekben,
ill. WHO által javasolt nemzetközi egységekben.
Jó példa a nem SI rendszerben visszavezethető
biológiai analitra a plazmaprolaktin. Ha ezt a komponenst
mérjük, valójában a különböző mennyiségben
előforduló három különböző izoformát mérjük: prolaktin-A,
prolaktin-B és prolaktin-C, amelyek aránya
a keverékben ismeretlen. A B típusú biológiai anali-
8-1. ábra. A referenciarendszer koncepciója a gyakorlatban,
a szérumkortizol-meghatározás példáján

A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
189
tokat általában immunkémiai eljárásokkal mérjük,
ahol különböző reagensek eltérő módon reagálnak
a molekula különböző epitópjaival, egymással ugyan
arányban lévő, de eltérő koncentrációértékeket eredményezve.
Következésképpen, a nem SI rendszerben
visszavezethető, különböző immunkémiai eljárásokkal
meghatározott biológiai analitok mérési eredményei
nem hasonlíthatók össze. Ezek a tények drámai
következménnyel járnak az inter- és intraindividuális
biológiai szórás vizsgálatok értékelésénél. Biológiai
eltérések esetén a különböző immunkémiai mérési
eljárásokkal kapott eredményeket nem szabad összevonni.
Így a B típusú analitoknál a referenciaanyagok előállítása
sokkal nagyobb nehézséget jelent. Mivel az
analitok rendkívül heterogének lehetnek - összetételük
a különböző humán testfolyadékokban változó
-, ezért minden B típusú analit referenciaanyaga csak
korlátozott mértékben lehet azonos a beteg mintájáéval.
Ezek a referenciaanyagok bizonyos mértékig hasonlíthatnak
a humán testfolyadékminta heterogén
keverékére, de ez csak „átlagos” mértéket jelent. Továbbá
a B típusú analitoknál a rutinszerűen alkalmazott
eljárásoktól független referenciameghatározási
eljárások jelenleg az esetek többségében hiányoznak.
Így az értékek hozzárendelése a szóba jövő referenciaanyagokhoz
gyakran problematikus. Ennek következtében
a gyártók készítik el saját kalibrátorukat a
rendelkezésre álló preparátumból, és hozzárendelik
tömegmérés alapján az értékeket, ez pedig a különböző
gyártók közti eltérésekhez vezethet.
A klinikai laboratóriumi mérési eredmények metrológiai
visszavezethetősége (visszakövethetősége)
annak az elvnek a gyakorlati megvalósítása, hogy a
laboratóriumi leleten feltüntetett rutin mérési eredmény
pontosságát és valódiságát ismert és egyre csökkenő
bizonytalanságú (azaz egyre megbízhatóbb)
standardizált összehasonlítások, szabványos hiteles
mérések megszakítatlan láncolata garantálja. A rutin
laboratóriumi mérési eredmény ezen a szabványos,
megbízható, hiteles mérési láncolaton keresztül vezetődik
vissza országos vagy nemzetközi etalonokhoz,
referenciaanyagokhoz és referenciamérési eljárásokhoz.
A láncolat minden tagjának pontossága, valódisága
ismert és garantált, ami biztosítja az eredmény
pontosságát és valódiságát.
Különösen fontos, hogy laboratórium ismerje a
mért mintakomponens esetében a használt kalibrátor
(valódiságkontroll) hibáját és a komponensre
vonatkozó összes megengedett hibát. Ha ez kisebb
vagy egyenlő, mint a kalibrátor kumulált hibájának
és a mérési rendszer összes hibájának összege, akkor
a rendszer egyáltalán nem kontrollálható és nem is
alkalmas az adott komponens mérésére.
A bizonyított (bizonylatolt) visszavezethetőség teszi
lehetővé azt is, hogy összehasonlíthassuk adott
beteg adott paraméterének különböző laboratóriumok
által különböző időpontokban különböző rutin
mérési módszerekkel meghatározott értékét. Ezt az
biztosítja, hogy egy mintakomponens többféle mérőmódszerének
kalibrátor anyagait közös referens kalibrátorral
vagy referens módszerrel ellenőrzik és állítják
be.
Ez a mérési lánc a klinikai laboratóriumokban kezdődik,
a referencialaboratóriumokon át és az in vitro
diagnosztikumok előállítóinak (IVD gyártók) laboratóriumaiban
folytatódik, és a nemzeti és nemzetközi
laboratóriumi intézeteken át halad a nemzeti és nemzetközi
metrológiai intézetekig.
A leletezéshez méréstechnikai és mérési jogi aspektusból
szükséges az elsődleges standarddal, azaz
meggyőzően bizonyított és igazolt „kommutabilitással”
(transzferabilitással, átvihetőséggel) rendelkező
referens anyaggal végzett kalibrálás, a gyártó által
meghatározottak szerint használt mérési módszer, a
kontrollok, a minta, a laboratóriumi végfelhasználói
rutin (beteg) mérés eredménye valódiságának az
ellenőrizhetősége. A mérőrendszer hitelesítését és
ellenőrzését a mérési feladat megvalósításához tartozó
valamennyi elem, tehát a megoldás sorrendjében a
kalibrálástól a minta mérési eredményéig halmozódó
hibák becslésén alapuló mérési bizonytalanság, míg
ellenkező irányban az etalonokra (definitív módszerre
és primer referenciaanyagra) való visszavezethetőség
jellemzi.
Az európai In Vitro Diagnostical Directive (In Vitro
Diagnosztikai Irányelv, IVDD, az Európai Parlament
és Tanács 98/79/EC számú irányelve) az in vitro diagnosztikai
orvosi eszközökre vonatkozik, és előírja, hogy
a klinikai laboratóriumi rutin mérési eredmények megbízhatóságát
méréstechnikailag biztosító kalibrátorok és
valódiságkontroll anyagok értékeinek visszavezethetőnek
kell lennie valamilyen elsődleges referenciamérési
eljárásra vagy referens kalibrátor anyagra.
A primer referenciaanyagtól és a primer referenciamódszertől
kiinduló mérési láncolat végén áll a ru-

190 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
tin laboratóriumi mérési eredmény, amint azt a 8-2.
ábra mutatja. A metrológiai visszavezethetőség (viszszakövethetőség)
iránya az ábra nyílirányaival ellentétes,
a laboratóriumi eredmény hitelességét az adja,
hogy dokumentáltan visszavezethető a primer kalibrátorral
kalibrált primer referencia-mérőmódszerre.
A folyamat ellenkező irányban is igaz: „commutability”-nek
vagy a magyarított kifejezéssel transzferabilitásnak,
kommutabilitásnak nevezzük.
Jelenleg elsősorban két szabvány foglalkozik az
eredmények visszavezethetőségével. Az EN ISO
17511:2003 a kalibrátorok és a valódiságkontroll
anyagok értékeinek metrológiai visszavezethetőségével,
az EN ISO 18153:2003 a kalibrátorok és a valódiságkontroll
anyagok enzimkoncentráció-értékeinek
metrológiai visszavezethetőségével foglalkozik. A
pontosság ellenőrzését szolgáló kontrollanyagokra ez
a két szabvány nem vonatkozik. Ismeretes több, részben
kapcsolódó szabvány is, pl. az EN 12287:1999 a
referenciaanyagokkal, az EN ISO 15197:2003 a kalibrátorok
és a kontrollanyagok értékeinek metrológiai
visszavezethetőségének ellenőrzésével foglalkozik.
Manapság még nem minden anyag (mintakomponens)
esetén hozható létre ez a mérési visszavezetési
láncolat, nem minden mérendő komponensre van
nemzetközileg elfogadott referenciaanyag vagy referenciamérési
eljárás, és a láncolat gyakran végződik
az IVD-gyártóknál.
A Laboratóriumi Medicina Visszavezethetőségi
Egyesített Bizottsága (JCTLM Joint Committee on
Traceability in Laboratory Medicine) a gyártók törekvéseit
egyesíti és irányítja az IFCC (International Federation
of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine),
a BIPM (Bureau International des Poids et
Mesures) és az ILAC (International Laboratory Accreditation
Cooperation) közös bizottságaként. Tagjai
között 23 nemzetközi szervezet támogatásával működik
együtt a megfelelő referens anyagok és referens
mérőmódszerek kutatásában. A JCTLM iránymutatást
ad arra vonatkozóan, hogy a klinikai laboratóriumok
mérési eredményei nemzetközileg is összevethetők,
egyenértékűek és a mérési szabványoknak
megfelelően visszavezethetők legyenek.
A jelenleg rendelkezésre álló referens anyagok és
mérőmódszerek listáját a JCTLM állítja össze.
A fehérjemeghatározások standardizálása
8-2. ábra. A laboratóriumi mérési eredmények visszavezethetőségi
láncolata, transzferabilitás és a mérési bizonytalanság
A fehérje mennyiségi vizsgálatok eredményeinek
összehangolására világszerte nagy igény jelentkezik,
elsősorban a populáció mobilitásának és migrációjának
következtében: az alkalmazott módszereket
egységesíteni kell. Korábban számos kísérletet tettek
e cél elérésére. A hatvanas években a Rowe és munkatársai
által készített referenciakészítmény humán
szérumimmunglobulin-mérésekhez azzal a céllal
készült, hogy a különböző laboratóriumok eredményei
összehasonlíthatóbbak legyenek. Korábban azt
gondolták, hogy a laboratóriumok közötti nagy variabilitás
annak köszönhető, hogy eltérő standard
preparátumokat, antiszérumokat és elsősorban manuális
módszereket alkalmaznak. A közös kalibrátor
használata révén az eredmények reprodukálhatósága
jelentősen javult. Ez a preparátum volt az első jelentős
lépés a fehérjevizsgálatok harmonizációjában.
1973-ban a WHO és az IUIS (International Union

A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
191
of Immunological Societies) kezdte meg egy új standard
kifejlesztését. A választott készítmény lett az US
National Reference Preparation (USNRP) és a WHO
referenciapreparátuma (WHO6HSP) hat humán szérumfehérjére.
Önkényesen nemzetközi egységeket
rendeltek az albuminhoz (ALB), az α 1
-antitripszinhez
(AAT), a cöruloplazminhoz (CER), az α 2
-makroglobulinhoz
(A2M), a transzferrinhez (TRF) és a komplement
C3c-hoz, míg az immunglobulin-koncentrációk
(IgA, IgG, IgM) esetében a korábbi WHO 67/86
preparátum volt használatos. A hetvenes években
bekövetkező jelentős változások eredményeképpen
a szérumfehérjék koncentrációjának meghatározására
bevezetett turbidimetriás és nefelometriás tesztek
megkövetelték a nem turbid referencia anyagokhasználatát.
Az IFCC a plazmafehérje-vizsgálatok egységesítése
érdekében kidolgozta az IFCC 74/1 referenciaanyagot,
amely az összes technikára (gél alapú és
turbidimetriás vagy nefelometriás módszerre) alkalmazható
volt. Szigorú protokoll szerint készített referenciaanyag
volt, szöveti és leukocytaproteáz-mentes,
az előállítás során kiküszöbölték a fibrinogén hatását
és a liofilizálást követő denaturációt. A nyolcvanas
évek a példa nélküli változások ideje volt a fehérjelaboratóriumokban.
A gél alapú, 24–48 órát igénylő
mennyiségi fehérjemeghatározásoktól a 3-5 órás fix
idejű nefelometrián keresztül a kinetikus nefelometria
vagy az automatizált, egy-két perc mérési idejű
turbidimetria felé tolódtak el az analízisek. A munkaterhelés
drámaian megnövekedett a monoklonális
fehérjék, a B-sejtes malignitások, az immunhiányos
elváltozások és a speciális fehérjemeghatározások
(CRP, AAT, TRF, C3, C4, HPT) bevezetésének következtében.
A diagnosztikai cégek bevezették a fehérjevizsgáló
automatákat, az EQA cégek specifikus
fehérjeprogramokat vezettek be a megbízható és öszszehasonlítható
eredmények biztosítása érdekében. A
speciális laboratóriumok helyett a vizsgálatok a rutin
klinikai kémiai laboratóriumok részévé váltak és bizonyos
fehérjevizsgálatokat sürgősséggel is elkezdtek
használni. Ugyanakkor az EQA adatok Európában és
az USA-ban néha 100%-os szórást mutattak. Ennek
oka a referenciaanyagok kommutabilitásának hiánya,
a különböző szekunder referenciaanyagok használata
és a modern optikai mérőrendszerekre használható
referenciaanyagok hiánya volt.
Mindebből egyértelmű volt, hogy a laboratóriumok
közötti variabilitás csökkentése érdekében
nemzetközileg elfogadott referenciaanyagokra van
szükség. 1989-ben az IFCC Committee on Plasma
Proteins vezetésével folyamat indult egy új, 14 szérumfehérjét
tartalmazó másodlagos (mátrix) referenciakészítmény
preparálására, jellemzésére és kalibrálására.
A preparátumhoz tisztított CRP-t is adtak. A
referenciaanyag előállítása közben még szigorúbb
feltételeket kellett teljesíteni, mint a korábbiak esetében:
a donoroknak 12 órás éhomi vérvételt írtak elő, a
lipaemiás, turbid és icterusos mintákat nem használták
fel, az esetleges maradék lipideket szilícium-dioxidra
adszorbeáltatták. Vizsgálták az AAT és a HPT
fenotípust, és a pozitív reumatoid faktort vagy elektroforetikusan
kimutatott monoklonális fehérjéket
tartalmazó mintákat elvetették. Csak a hepatitis B- és
C-vírus- és a HIV-mentes mintákat használták fel. A
preparátumokat az European Community Bureau of
Reference (BCR) hitelesítette mint hiteles anyagmintát,
és CRM 470 néven tették elérhetővé 1993-1994-
ben, majd később átnevezték ERM-DA470-ra.
2004-ben az ERM-DA470 (eredetileg CRM 470-
nek nevezett) referenciaanyag készleteinek kimerülése
miatt az European Institute for Reference
Materials (IRMM) vette át a feladatot egy új referenciaanyag
elkészítésére. Az eljárás a sikeresnek bizonyult
ERM-DA470 előállítási módja volt, ugyanakkor
a fejlesztés és a gyártás egy új tétel referenciaanyagok
esetében lehetőséget nyújtott bizonyos kérdések
megváltozására és optimalizálására. Elhatározták a
β 2
-mikroglobulin (B 2
M), a myeloma multiplex prognosztikus
indikátorának addícióját és az α 1
-antikimotripszin
(ACT) kihagyását a referenciaanyagból.
Előkísérletekben vizsgálták a tervezett változások,
a rekombináns B 2
M addíciójának és a dialízis helyett
diafiltráció bevezetésének hatását. A β 2
M addíciója
nem befolyásolta más fehérjék stabilitását. A liofilizálás
és az azt követő feloldás a CRP visszanyerésének
csökkenését eredményezte, de a probléma a liofilizálás
előtt kalcium hozzáadásával kiküszöbölhető volt.
Ez a preparátum az ERM-DA470k/IFCC referenciaanyag
nevet viseli.
A referenciaanyag homogenitását, stabilitását és
kommutabilitását a kilencvenes évek végétől széles
körű megvalósíthatósági tanulmányokban vizsgálták.
A hosszú távú stabilitás lehetséges következményeként
megjelenhető mérési bizonytalanság értékét is
feltüntették a hiteles értékben, ahogy azt az ISO Guide
34 megköveteli.

192 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
Az ERM-DA470k/IFCC referenciaanyag hiteles értékeket
közölt A 2
M, α 1
-savas glikoprotein (AAG), AAT,
ALB, C3, C4, HPT, IgA, IgG, IgM, TRF és transztiretin
(TTR) fehérjére, ill. az ERM-DA472/IFCC a CRP-re. A
β 2
M hiteles értékének hozzárendelése csak a közeljövőben
várható. A méréseket különböző elven alapuló immunoassay-k
segítségével (nefelometria, turbidimetria)
végezték el, különböző tulajdonságú antitestekkel.
Ezek az eljárások jelenleg szerepelnek a JCTLM referenciamódszerek
listáján. A módszerek közti szórás
jellemzően 2% körül, az összes esetben 4% alatt volt a
12 hitelesített fehérjére vonatkozóan. Ez meglehetősen
alacsony érték, figyelembe véve a különböző vizsgálati
minták komplexitását és a különböző antitestek használatát.
Nincs általánosan elfogadott célérték a mérési
bizonytalanságra vonatkozóan a szérumfehérjék esetében,
a diszkussziók e témában jelenleg is folynak.
Mégis, a teljes hiba elfogadható, ha összehasonlítjuk
a Westgard biológiai eltérések adatbázisával (13,5%
IgA-ra és 3,9% albuminra).
A visszavezethetőség érdekében jól meghatározott
teljesítményű módszert kell választani, megfelelő referens
vagy kalibrátoranyag használatával. A gyártó
termék kalibrátor értékét hozzá kell rendelni magasabb
szintű referenciaanyagok értékéhez. Más szóval
a lánc hitelesített lépéseit kell létrehozni, hogy a
végső eredmény jelenthető legyen. Metrológiai szempontból
a visszavezethetőség határozza meg a mérési
eredményt, minden lépés hozzájárul a mérési bizonytalansághoz
(8-3. ábra).
értéktranszfer eljárás
• Módszer-optimalizálás
Manapság a klinikai laboratóriumok a fehérjemennyiségi
meghatározásokat leggyakrabban automatizált
rendszerekkel, turbidimetria vagy nefelometria
elvén alapuló módszerekkel végzik.
Kisebb eltérések a mérési elvben, a műszer programozásában
és a reagensben eltérő eredményekre
vezethetnek, ezért a módszerek optimalizálására
és szabványosítására van szükség. Az optimalizált
vizsgálati módszer lehetőleg széles mérési tartoértéktranszfer
eljárás
értéktranszfer eljárás
értéktranszfer eljárás
8-3. ábra. Szérumfehérje-mérések visszavezethetőségi láncolata
Az eljárás lépései:
• Első lépés: a tiszta fehérjepreparátum előállítása
A visszavezethetőségi láncban az első, legfontosabb
pont az, hogy a plazmafehérje mért értéke
tiszta fehérjekészítményre visszavezethető legyen.
Ez tisztított fehérjék előállítását követeli meg, akár
natív formában - emberi forrásból - vagy rekombináns
fehérje formájában. Ahhoz, hogy az ilyen
módon előállított elsődleges referenciakészítmények
szérum alapú másodlagos referenciaanyagok
értékének meghatározásához használhatók legyenek,
számos feltételt kell teljesíteniük:
- A tiszta fehérje teljesen hasonló legyen a szérumvagy
plazmapoolban található fehérjével, mind
a makroheterogenitás (pl. genetikai variánsok),
mind a mikroheterogenitás (pl. különböző szénhidrát-izoformák)
vonatkozásában.
- A fehérje - amennyire lehetséges - natív legyen,
biológiai és immunológiai identitását meg kell
őrizni. Ezt csak egyetlen módon lehet elérni,
óvatos és jól reprodukálható, szubfrakcionálás
nélküli eljárással.
- A végső preparátum tisztasága a lehető legnagyobb
legyen (> 98%), ami immunkémiai és
nem immunkémiai módszerekkel ellenőrizhető.
- A tisztított fehérje stabil legyen legalább addig,
amíg felhasználásával a másodlagos referenciaanyag
kalibrációját nem végezték el.
• Koncentrációmeghatározás tömegméréssel
A tisztított fehérje koncentrációjának mérésére ismételt
szárítás és tömegmérés után kerülhet sor,
g/L koncentrációegységben. A mérés lehetőséget
nyújt a fehérje részleges specifikus térfogatának
meghatározására is (mL/g egységben), ez egyben a
fehérje jellemzésére szolgáló paraméter is.

A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
193
mányban - széles körű megbízhatósági tartománynyal
kombinálva -, kevesebb ismételt méréssel képes
a minták koncentrációjának meghatározására,
és biztosítja az antitesttúlsúlyt.
• Értéktranszfer eljárások
A nyolcvanas években fejlesztették ki az eljárást 14
szérumfehérje koncentrációértékének transzferére
a tiszta fehérjepreparátumból a CRM 470 (most
már az ERM- DA470) referenciaanyagba. A gyakorlati
eljárás lényege az, hogy a fehérjepreparátum
hat hígítását együtt analizáljuk a referencia- (cél-)
preparátum hat hígításával. Ezzel a módszerrel a
pontatlanság csökken, és a mátrixhatás jelenléte
vagy hiánya közvetlenül értékelhető regressziós
egyenes felvételével. Ha mátrixhatások nincsenek,
a regressziós egyenes áthalad az origón, az egyenes
meredeksége mindkét anyagnál azonos. A protokoll
alapja egy több pontos érték hozzárendelése
naponta több mérési sorozattal, legalább négy napon
belüli ismétléssel. Alapvető feltétel, hogy minden
mintavisszaoldást és hígítást tömegméréssel
ellenőrizni kell.
• Végleges hiteles érték hozzárendelés folyamata
Az ERM-DA470k/IFCC referenciaanyag jellemzésében,
a végleges hiteles érték hozzárendelésében
20 laboratórium vett részt. Az összes laboratórium
kiváló eredményeket kapott, a variációs koefficiens
az összes szérumfehérje esetében jóval 4% alatt
volt.
• ERM-DA470 referencia anyag hatása a fehérje
meghatározások harmonizálására
A legújabb minőségbiztosítási programok lényegében
azt mutatják, hogy a legtöbb fehérjemeghatározásnál
semmilyen további csökkenés nem
mutatkozott a laboratóriumok közötti variabilitásban,
bizonyos esetekben az még nőtt is. Problémák
jelentkeznek a legtöbb meghatározásnál abban az
esetben, ha a fehérje koncentrációja nagyon kicsi
vagy a fehérje analit labilis volt, ill. jelentős különbségek
mutatkoznak az alkalmazott antitestek
epitópfelismerésében, pl. a cöruloplazmin nagyon
labilis fehérje, és a különböző antiszérumok reakcióba
léphetnek a fehérjefragmenumokkal, ha a
fehérje nem ép. A komplementkomponens C4, a
cöruloplazminhoz hasonlóan kis koncentrációban
van jelen egészséges emberek vérmintáiban, a rutin,
nem érzékenyített immunoassay-k érzékenységének
és pontosságának határán. Hasonlóan a
fiziológiás körülmények között 2 mg/L koncentráció
alatt lévő CRP-hez ebben az esetben érzékenyített
nefelometriás vagy turbidimetriás módszert
kell használni, ennek harmonizációja viszont igen
sok kívánnivalót hagy maga után.
Normálérték és referenciaérték
A laboratóriumi mérési eredmények értékelésében
nagy szerepe van a normálértékek vagy helyesebben
a referenciaértékek ismeretének. A korábban használt
normálérték vagy normál tartomány fogalom - bár
manapság is sokszor használatos -, nem egyértelműen
definiált fogalom. A laboratóriumi medicinában
első megközelítésben a normál tartomány egy analit
esetében azt a koncentrációtartományt jelenti, amelyben
az egészséges, normális egyének eredményei várhatók.
Ezzel a megközelítéssel ugyanakkor számos
probléma van:
• Nem definiált az egészséges vagy normális egyének
fogalma.
• A mintapopuláció kiválasztási és kizárási kritériumai
nem ismertek.
• A mintaadók előkészítése, a mintavétel körülményei
ismeretlenek.
• Az alkalmazott analítikai módszer, annak megbízhatósági
kritériumai nem ismertek.
• A mintaadók és az analitikai eredmények statisztikai
kiértékelése ismeretlen.
A biológiában, medicinában a „normális” fogalom
különböző értelmezésben használatos, statisztikai
valószínűség eloszlást, károsodást nem okozó hatást
is érthetünk alatta. A normálérték meghatározásához
szükséges mintapopuláció kiválasztása jelenti a
legnagyobb nehézséget, legtöbbször egészségesnek
feltételezett orvostanhallgatók, asszisztensek, ápolónők,
kórházi személyzet vagy véradók jöhetnek szóba.
Ugyanakkor adott paraméter, analit diagnosztikai
érzékenységének, hatékonyságának és specificitásának
meghatározásához szükséges bizonyos betegségben
szenvedő páciensek mintájának vizsgálata is. Az
egészséges és beteg közti határok nem egyértelműen
definiáltak.

194 8. fejezet A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
Amikor az irodalomból átvett normál tartománynyal
kívánunk dolgozni, a következő adatokat kell
megvizsgálni:
• Az alkalmazott analitikai eljárást, annak elvét és
analitikai megbízhatósági kritériumait.
• A normális populációt, a mintaadók számát,
nem és kor szerinti megoszlását.
• A preanalitikai tényezőket: a befolyásoló tényezők
figyelemvételét, a mintavételi körülményeket
és a minták tárolási körülményeit.
A vizsgált problémákra való tekintettel a nyolcvanas
évek végén az IFCC kidolgozta a referenciaérték-elméletet,
amelynek alapján bevezetésre került
a referenciaértékek, referenciatartomány fogalma,
ez jobban definiált, mint a normálérték és a normál
tartomány. A laboratóriumi medicinában manapság
csak a referenciaérték és a referenciatartomány fogalom
használatos (8-1. táblázat).
Irodalom
Blirup-Jensen, S.: Protein standardization V: value transfer.
A practical protocol for the assignment of serum
protein values from a Reference Material to a Target
Material. Clin. Chem. Lab. Med. 46(10):1470–1479,
2008.
Fuentes-Arderiu, X.: Biological variation of non-SI traceable
biological quantities:example of proteins. Clin.
Chem. Lab. Med. 44(12):1497, 2006.
8-1. táblázat. A referenciaérték koncepciója és sémája
referenciaegyének kiválasztása
A referenciaegyének pontosan definiált kritériumok alapján választhatók ki. Fontos, hogy az egyén egészségi állapota
definiált legyen, pontos beválaszthatósági, ill. kizárási körülmények meghatározásával. A kizárási kritériumok között
vese, szív, tüdő és májbetegségek szerepelnek. Pontosan ismerni kell az alkalmazott gyógyszerek esetleges befolyásoló
hatását a vizsgált paraméterre. Bizonyos rizikófaktorok (pl. túlsúly, magas vérnyomás) esetében az egyén szintén
kizárható a mintát szolgáltató populációból.
referenciapopuláció képzése a referenciaegyénekből
A referenciapopuláció az összes lehetséges referenciaegyénből áll.
referenciaminták kiválasztása a referenciapopulációból
A referenciaminta pontos számú referenciaegyénből áll, megfelelően reprezentálja a referenciapopulációt.
referenciaértéke(ke)t határozunk meg a referenciamintákból
A referenciaérték a referenciaegyén mintájából az adott analit kvantitatív mérési eredménye.
referenciaeloszlás a referenciaérték(ek) tekintetében figyelhető meg
A referenciaeloszlás a mért értékek statisztikai eloszlását jelenti.
referenciahatárok képzése a referenciaeloszlásból
Statisztikai megfontolások, megadott valószínűség alapján állapítható meg a referenciaeloszlásból.
↓
↓
↓
↓
↓
↓
referencia intervallum a referenciahatárok alapján definiálható
A referenciaintervallum a referenciahatárok által bezárt értéktartomány. Legtöbbször úgy állapítjuk meg, hogy a
minták 95%-ának analíziseredménye a határokon belül található. Általános szabály szerint az eredmények 2,5%-a a
referenciaintervallum alatt, 2,5%-a pedig a referenciaintervallum felett található.

A vizsgálati eredmények kifejezésmódjai - Dimenziók, vonatkoztatások
195
Klein, G.: Creation of the necessary analytical quality for
generating and using reference intervals. Clin. Chem.
Lab. Med. 42(7):851–857, 2004.
Merlini, G.: Standardizing plasma protein measurements
worldwide: a challenging enterprise. Clin. Chem. Lab.
Med. 48(11):1567–1575, 2010.
Myron Johnson, A.: Necessity for high-quality reference
materials in the harmonization of laboratory assays.
Clin. Chem. Lab. Med. 48(6):747–748, 2010.
Panteghini, M.: Standardization in laboratory medicine:
New challenges. Clinica Chimica Acta 355:1–12, 2005.
Panteghini, M.: Traceability as a unique tool to improve
standardization in laboratory medicine. Clinical Biochemistry
42:236–240, 2009.
Petersen, H.: Reference values: from philosophy to a
tool for laboratory medicine. Clin. Chem. Lab. Med.
42(7):686–691, 2004.
Thienpont, L. M.: Traceability to a common standard for
protein measurements by immunoassay for in-vitro
diagnostic purposes. Clinica Chimica Acta 411:2058–
2061, 2010.
WHO International Biological Reference preparations,
http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/
Zegers, I.: Development and preparation of a new serum
protein reference material: feasibility studies and processing.
Clin. Chem. Lab. Med. 48(6):805–813, 2010.
Zegers. I.: Characterisation of the new serum protein reference
material ERM-DA470k/IFCC: value assignment
by immunoassay. Clin. Chem. 56:1880-1888, 2010.
http://physics.nist.gov/cuu/Units/prefixes.html
http://web.inc.bme.hu/fpf/kemszam/alapegysegek.html
http://www.bipm.org/en/committees/jc/jctlm/
http://www.bipm.org/en/bipm/mou/jctlm.html
http://www.bipm.org/jctlm/
http://www.westgard.com/biodatabase1.Htm

9. A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése,
pontossága, helyessége
Lakatos Ágnes
A klinikai kutatások fontos eszköze a mérés, amelynek
során sokféle előkészítő eljárás után egy fizikai
paramétert mérünk, amely összefüggésben van a mérendő
anyag koncentrációjával. Az összefüggés lehet
lineáris (pl. a Lambert-Beer-törvény szerint [1]), de
nem feltétlenül az, akár fordított függvénykapcsolatot
is tapasztalhatunk. Egy új paraméter mérésekor, kísérleteink
legelső szakaszában az is elég információ
számunkra, hogy tudjuk, melyik mintában nagyobb,
melyikben kisebb a vizsgálandó anyag koncentrációja.
Már ekkor is szükséges tudnunk, hogy a módszer,
amelyet kidolgoztunk, megfelel-e a következőknek:
1. Elég specifikus-e, vagyis az az anyag okozza-e a
mért fizikai változást, amelyikre kíváncsiak vagyunk.
2. Megfelelő-e a mérés precíziója, pontossága, azaz
többszörös mérés esetén a kapott szórás, ill. a variációs
koefficiens elég kicsi-e elvárásainkhoz képest.
A precízió függ a mérendő anyag koncentrációjától,
ezt az összefüggést ábrázolja a precíziós
profil görbe (9-1. ábra). Az elvárásaink - biológiai
minta mérése esetén - többek között attól függnek,
hogy a meghatározandó anyag biológiai szórása,
változatossága, változékonysága mekkora. A
kémikusok szempontjából, ha mátrixhatás nélküli
tiszta oldatot vizsgálnak, az analitikai módszerek
pontossága az esetek többségében 0,1% vagy ennél
kisebb nagyságrendben van. Ezzel szemben a
biológiai méréseknél gyakran megelégszünk 10%
körüli pontossággal. Fehérjénél nem ritka, hogy
kóros állapotokban koncentrációja a referenciaértékhez
képes sok ezerszeresre is emelkedhet. Így a
mért változás nagyobb pontatlanság, kisebb precízió
mellett is egyértelműen értékelhető.
A mérés pontosságát egyrészt az „intraassay”
(egy mérési napon belül meghatározott) szórás fejezi
ki, de nagyon fontos, hogy a különböző mérési
napok között mennyire tudjuk egyformán beállítani
a körülményeket. Ezt az „interassay” (minden
mért értéket különböző mérési napon meghatározva)
szórás mutatja.
3. Elég szenzitív-e a módszer, vagyis a mintában lévő
mérendő analit mennyisége elég-e ahhoz, hogy
mérhető fizikai választ kapjunk. Itt is változhatnak
az elvárásaink, ill. a mérés érzékenységének
javulásával a teszt funkciója is változhat. Ilyen volt
9-1. ábra. Precíziós profil görbe

198 9. fejezet A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége
pl. a TSH [2] esete. Az első generációs teszteknél
a funkcionális érzékenység nem volt elég kicsi ahhoz,
hogy a referenciatartomány alatti alacsony
TSH-szinteket elkülönítse a referenciatartományon
belüli értékektől, csak a nagyobb értékek esetében
lehetett következtetéseket levonni. Amikor a
tesztek fejlesztésével lehetségessé vált az alacsony
értékek megítélése, megnőtt a TSH-mérés jelentősége,
és elsődlegessé vált a pajzsmirigy-diagnosztikában.
Hasonló változást figyelhettünk meg a CRPtesztnél,
eleinte a 10 mg/l alatti koncentrációkat
nem tudta a teszt megbízhatóan mérni. Az akut
gyulladások kimutatására azonban így is alkalmas
volt. Amikor a tesztek érzékenyebbé váltak, ill. a
megbízható alsó mérési tartomány csökkent, az
5-10 mg/l közötti értékekről megtudtuk, hogy jelezheti
az atherosclerosis érfalban lévő mikrogyulladásait
is [3].
4. Fontos szempont, hogy az adott minta mátrixa
mennyire befolyásolja a mérésünket. Tudnunk
kell, hogy milyen biológiai minta milyen előkészítési
módszerrel tehető alkalmassá a mérésre. A
mátrix kérdése mindenképpen felvetődik akkor is,
amikor a viszonyítási standard problémájával foglalkozunk.
5. A mérési eljárás kidolgozásának fontos eleme,
hogy ismerjük a mérési tartományt, azt a koncentrációtartományt,
amelyen belül a koncentrációváltozás
egyértelmű kapcsolatban áll a fizikai jel
változásával. Immunológiai módszereknél mindig
gondolnunk kell a High Dose Hook jelenségre [4],
vagyis arra, hogy a reagens antitestkoncentrációjához
képest nagy mérendő antigénkoncentráció
esetén hamisan alacsony eredményt kaphatunk.
6. Egy módszer beállítása során fontos annak a vizsgálata,
hogy a mérendő minta a mérendő komponensre
nézve mennyire, és milyen körülmények
között stabil.
Fehérjék mérésekor gyakran igazi kihívás a mért
eredmény kifejezése koncentrációértékekben. Míg kis
molekulájú anyagnál, ahol a kristályos anyag a rendelkezésünkre
áll, vagy egyszerű gravimetriás beméréssel,
vagy a mátrix zavaró hatásának kiküszöbölése
érdekében alkalmazott standard addíciós módszerrel,
vagy bonyolultabb esetben referenciamódszerrel
mért másodlagos standard alkalmazásával egyértelműen
összefüggésbe hozhatjuk a mért fizikai jelet a
koncentrációval, fehérjék esetében ez sohase ilyen
egyszerű. Így mindig érdemes fenntartással fogadni,
még a gyári mérési tesztek esetében is az alkalmazott
standardok valódi értékét és a mérési tesztek eredményeinek
valódiságát. Sok esetben nem kapunk összehasonlítható
eredményeket különböző, önmagukban
nagyon megbízható gyári teszteket használva sem.
A fehérjék mérésekor alkalmazott kontrollok eredményei
is módszerfüggők, a független kontrollokra
minden módszerhez más-más érték van megadva, a
reagensgyártó saját kontrolljai pedig nem alkalmasak
más módszerek kontrollálására.
A standardizáció nehézségeinek következményeit
jól példázza a fruktózamin mérés esete. A fruktózamin
mérést mint a diabetes monitorozására használható
redoxireakción alapuló fotometriás módszert
1983-ban használták először és írták le Johnson
és munkatársai [5]. Standardnak ők a glikált fehérje
Amadori-termékének szerkezetét utánzó dezoxi-morfolin-fruktózt
használták. Mivel egyértelmű
volt, hogy a szérum fehérjéje szükséges a reakcióhoz,
standard addíciót alkalmaztak. Módszerükkel a fruktózamin
referenciatartománya 2,0-2,4 mmol/l volt.
Az alkalmazás során kiderült, hogy a módszer legérzékenyebb
része, amelyet legjobban befolyásolnak
a reagens összetételének és egyéb körülményeknek a
kisebb eltérései is, maga a kalibrálás (noha a kalibrálás
célja a kisebb szisztémás hibák kiküszöbölése
lenne) [6, 7], ezért másodlagos, természetes „fruktózamin”-tartalmú
standard alkalmazását javasolták a
mindennapokban. A fruktózaminmérés elterjedését
végül az segítette, hogy egy gyári teszt megjelenésével
párhuzamosan bevezették a 14 C-izotóppal jelzett glükózzal
glikált polilizinre visszavezetetett másodlagos
standard használatát [8]. Így a referenciatartomány
205-285 μmol/l lett. Az így kapott értékek valószínűleg
jobban tükrözik a valódi koncentrációt, mint a
dezoxi-morfolin-fruktózra standardizált mérés eredményei,
bár abszolút helyességében nem lehetünk
biztosak, hiszen a polilizin nem ugyanaz, mint a szérumfehérjék
[9].
Másik standardizálási probléma ugyancsak a diabetes
monitorozás területén a HbA 1c
mérése [10, 11].
A mérés története 1958-ig nyúlik vissza. Itt néhány
évtizednyi standardizálási káosz után az ioncserés
kromatográfiát választották referenciamódszernek,
az eredményt pedig az összes hemoglobin százaléká-

A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége
199
9-2. ábra. Beteg HbA 1c
-értékeinek longitudinális követése
ban adták meg. A HbA 1c
standardizálásának összehangolása
a különböző laboratóriumok, különböző
mérési módszerek között nagyon fontos, mert a betegek
monitorozását sok éven át kell folytatni, és az
eredmények összehasonlítása csak standardizált mérési
módszerek alkalmazásával lehetséges. A standard
a nemzetközi megállapodáson alapuló, ioncserés kromatográfiás
módszerre visszavezethető módon megállapított
koncentrációjú preparátum volt az immunológiai
módszerek esetében is, 1993-tól a Diabetes
Control and Complications Trial (DCCT) javaslatára.
A standardizálást az NGSP (National Glycohemoglobin
Standardization Program) referencialaboratóriumai
felügyelték. Nem csatlakoztak az amerikai
(DCCT-NGSP) rendszerhez, de ugyancsak ioncserés
HPLC-t használtak referenciamódszerként Japánban
(JDS) és Svédországban (MonoS) is, ezek egymástól
eltérő eredményeket adtak.
Napjainkban megy végbe az átállás az új standardizálásra.
Ennek alapja, hogy sikerült tiszta HbA 1c
-t
előállítani, és ebből definitív összetételű preparátumokat,
valamint egy új referencia mérési rendszert
kidolgozni. Lényege, hogy az enzimatikus (endoproteináz
Glu-C) hasítással előállított N-terminális hexapeptidet
izolálják, és tömegspektrometriásan mérik
glikált és nem glikált formáját. Az IFCC ajánlása
szerint az eredményt továbbra is az összes hemoglobinhoz
viszonyítva, de nem százalékban adjuk meg,
hanem mmol/mol mértékegységben. Az új módszer
alapján kiderült, hogy a DCCT-NGSP standardizálással
kapott eredmények nagyobbak a valódi értéknél
(9-2. ábra).
A különféle standardizálásra kapott eredmények
egymásba lineáris összefüggés szerint átszámíthatók
(9-1. táblázat) [12].
Méréseink minőségét különböző referenciaanyagokkal
biztosíthatjuk, ill. ellenőrizhetjük:
• Kalibrátorok. A fehérjék esetében szorosan egy
adott készülék típushoz készült, egy vagy több
koncentrációjú (egy-, ill. többpontos kalibráció).
referencia anyagra/módszerre visszavezethetősége
kötelező.
• Valódiság kontrollok. Nem készülékhez kötött,
nemzetközi szervezetek által felügyelt, referencia
anyagra/módszerre kötelező visszavezethetőség.
• Gyártói precízió kontrollok. Adott készüléktípusra
optimalizált, gyakran a kalibrátorral azonos
alapanyagból készül, visszavezethetősége nem
kötelező.
• Független precízió kontrollok. Nem készülékre
optimalizált, elfogulatlan megítélést tesz lehetővé,
visszavezethetősége nem kötelező.
• Saját precízió kontrollok. Új, általunk kidolgozott
mérés esetében gyakran az egyetlen lehetőség.
Gyűjtött mintából mérünk minden alkalommal.
A többi precízió kontrollhoz hasonló-
9-1. táblázat. A HbA 1c
átszámítási összefüggései
IFCC egységből indulva
X = HbA 1c
IFCC egységben (mmol/mol)
Számítás
NGSP egységből indulva
X = HbA 1c
NGSP egységben (%)
IFCC (mmol/mol) = X IFCC (mmol/mol) = 10,93 X – 23,5
NGSP (%) = 0,0915X + 2,15
NGSP (%) = X
JDS (%) = 0,0927X + 1,73 JDS (%) = 1,013X – 0,45
MonoS (%) = 0,0989X + 0,88 MonoS (%) = 1,081 X – 1,44

200 9. fejezet A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége
an, bár a módszer valódiságát (bias) nem mutatja
a mérés relatív szisztémás hibáját, eltérését (az
előző mérésekhez viszonyítva) követni lehet
vele. Nagyon fontos, hogy biztosak legyünk
benne, hogy a kontrollminta tárolása nem befolyásolja
a mérés eredményét.
• Külső kontroll. Rutin laboratórium munkájához
elengedhetetlen külső kontrollok használata,
hogy tudjuk, eredményeink mennyire összehasonlíthatók
más laboratóriumokéval. Több szervezet
foglalkozik külső kontrollrendszerek szervezésével,
minták küldésével, eredmények feldolgozásával.
A külső kontrollként, „körkontrollként”
használt minták minősége a valódiságkontrollok
minőségének felelnek meg. Elterjedt
rutin módszerek esetében ezek elérhetők. Ennek
hiányában, újabb módszereknél arra kell törekednünk,
hogy évente néhány mintát több, egymástól
függetlenül működő laboratóriumban
meghatározzunk.
Kontrolljainkra mért eredményeket az ötvenes évek
óta a jól ismert Levey-Jennings-grafikonon (9-3. ábra)
ábrázoljuk [13]. A középértékeket és a szórás értékeit a
gyári kontrolloknál a gyártó adja meg, saját kontrollnál
magunknak kell számolnunk. A megadott szórás értékei
logikusan a mérési eljárás precízióját fejezik ki, de
elképzelhető olyan megoldás is, hogy a határértékeket
a paraméter biológiai varianciájából képezik megfelelő
statisztikai módszerrel („six sigma”). Jó az, ha a kettő
között nincsen nagy eltérés vagy ha a mérési eljárás
precíziójából számolt határértékek a kisebbek. Ilyenkor
szigorúbbak vagyunk a szükségesnél. A cél mindenképpen
az kell hogy legyen, hogy a mérés hibája
ne befolyásolja a klinikai megítélést vagy kutatásainkban
a vizsgált és a kontrollcsoport eredményei közti
9-3. ábra. Levey-Jennings-grafikon
különbségek értékelését. A kontrollok értékelésére a
Westgard-szabályok szerinti számítás alkalmas [14].
A kontrollméréseket hagyományosan „batch”, azaz
sorozatmérés esetén a mérendő minták közé tesszük,
és a mintával egyezően kezeljük. Ilyenkor, ha a kontrollokban
hiba mutatkozik, a Westgard-szabályoknak
megfelelően az egész sorozatot meg kell ismételnünk.
Manapság tendencia, hogy egyrészt a rutin laboratóriumok
és ezzel a mérési sorozatok egyre nagyobbak,
másrészt az automaták többsége nem batch, hanem
betegorientált módon mér. Ezért egyre inkább az az általános
szokás, hogy a minták mérését akkor kezdjük,
ha a kontrollmintákat már lemértük, eredményeit értékeltük,
az esetleges hibákat kijavítottuk.
A kontroll szónak van másik jelentése is. Klinikai
kutatásainkban, ha kíváncsiak vagyunk, hogy a mérendő
paramétert hogyan befolyásolja valamilyen
állapot (betegség, gyógyszer, környezeti hatás stb.),
nem elég, ha a vizsgált személyek vagy kísérleti állatok
mintájából mérjük az adott paramétert jól beállított
analitikai módszerrel, hanem a vizsgált csoporthoz
majdnem mindenben hasonlító kontrollcsoportot
is vizsgálnunk kell. Leginkább a kor és a nem eloszlására
kell figyelni, a csoport létszámának pedig a vizsgált
csoport létszámával összevethetőnek kell lennie.
Következtetések levonására, statisztikai értékelésre
csak ezek figyelembevételével alkalmas a mérési sorozat.
Ettől a szabálytól legföljebb akkor lehet eltekinteni,
ha széles körben elterjedt, jól leírt paramétert
standardizált gyári teszttel mérünk, amelynek a referenciatartományát,
annak változásait jól ismerjük.
Rossz példa volt erre Schoenfeld és munkatársainak
[15] kutatása, amely szerint az antihiszton
antitest mennyisége monoklonális gammopathiák,
myeloma multiplex betegségben is hasonló arányban
emelkedett, mint autoimmun SLE vagy rheumatoid
arthritis esetében. (Hiszton fehérjék ellen termelt
autoantitest, autoimmun betegségekben várható a
megjelenése.) Amikor követni akartuk ezeket a kísérleteket
megfelelő korú kontrollcsoportot is bevonva,
kiderült, hogy az antihiszton antitestek megjelenése
(gyári, szemikvantitatív ELISA tesztet használva)
idős korban (70 év felett) gyakori, emiatt a myeloma
multiplexben talált előfordulási valószínűség nem
volt nagyobb, mint a korban megfelelő kontrollcsoportban
[16, 17] Ebből is látszik, hogy a megfelelő
kontrollcsoport kiválasztása van olyan lényeges, mint
a vizsgálati csoporté.

A vizsgálatok kontrollja, ellenőrzése, pontossága, helyessége
201
Az eddigiekből levonható az a következtetés, hogy
a kontrollok alkalmazása (a szó mindkét értelmében)
létfontosságú mind a klinikai laboratóriumi rutinmunkában,
mind kutatásainkban.
Irodalom
[1] http://en.wikipedia.org/wiki/Beer%E2%80%93Lambert_law
[2] http://hu.wikipedia.org/wiki/Pajzsmirigyserkent%-
C5%91_hormon
[3] http://en.wikipedia.org/wiki/Atherosclerosis
[4] http://www.mercodia.se/learning-center/mercodia-elisa-technology/high-dose-hook-effect.html
[5] Johnson, R. N. et al.: Fructosamine: a new approach
to the estimation of serum glycosylprotein. An index of
diabetic control. Clin. Chem. Acta 127: 87–95, 1983.
[6] Baker, J. R. et al.: Use of protein-based standards in
automated colorimetric determinations of fructosamine
in serum. Clin. Chem. 31:1550–1554, 1985.
[7] Lakatos Á., Jobst K.: A p-Nitro-Tetrazóliumkék koncentráció
szerepe a fruktózamin Standardizálásában.
Laboratóriumi Diagnosztika 16:241–243, 1989.
[8] Schleicher, E. D., Vogt, B. W.: Standardization of
serum fructosamine assays. Clin. Chem. 36:136–139,
1990.
[9] Fructosamine Cobas Teszt leírás, Roche.
[10] http://en.wikipedia.org/wiki/Glycated_hemoglobin
[11] Weykamp, C., John, W. G., Mosca, A.: A Review of
the Challenge in Measuring Hemoglobin A 1c
. J. Diabetes
Sci. Technol. 3:(3), 439–445, 2009.
[12] Little, R. R., Rohlfing, C. L., Wiedmeyer, H. M. et
al. – NGSP Steering Committee.: The national glycohemoglobin
standardization program: a five-year progress
report. Clin. Chem. 47(11):1985–1992, 2001.
[13] Levey, S., Jennings, E. R.: The use of control charts in
the clinical laboratory. Am. J. Clin. Pathol. 66:268–275,
1976.
[14] Westgard, J. O., Barry, P. L., Hunt, M. R. et al.: A
multi-rule Shewhart chart for quality control in clinical
chemistry. Clin. Chem. 27:493–501, 1981.
[15] Schoenfeld, Y., El-Roeiy, A., Ben-Yehoda, O. et al.:
Detection of antihistone activity in sera of patients with
monoclonal gammopathies. Clin. Immunol. Immunopath.
42:250–258, 1987.
[16] Lakatos, Á., Sétáló, J., Jobst, K. et al.: Relationship
of serum antihistone antibody level to the patient‘s age.
Acta Med. Hung. 49:91–100, 1992.
[17] Jobst, K., Lakatos, Á., Sétáló, J.: Diagnostic value
of the antihistone antibody (AHA) test in autoimmun
diseases. Klin. Lab. 5:109–110, 1992.

10. Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai
kutatásban
Nagy Tamás
Előzmények
Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) volt az első
a történelemben, aki - saját készítésű mikroszkópjával
– sejteket, egysejtű élőlényeket figyelt meg, többek
között baktériumokat, izomrostot, spermiumot.
1839-ben Theodor Schwann és Matthias Jakob
Schleiden kidolgozzák azon elméletüket, hogy a
növények és az állatok sejtekből épülnek fel. A XIX.
század második felében jelentős előrelépésekre került
sor a sejtkultúrák fenntartásához elengedhetetlen oldatok,
médiumok kifejlesztésében; Ringer, akinek
neve máig ismerősen cseng minden klinikus számára
(Ringer-oldat), nátrium-, kálium-, kalcium- és magnéziumion-tartalmú
oldatot készített, hogy állatok
izolált szívpreparátumait életben tartsa. Wilhelm
Roux 1885-ben speciális tápoldatban több napig életben
tartott csirkeembrióból származó idegszövetet.
A sejttenyésztési technikák a múlt század negyvenes-ötvenes
éveiben jelentős fejlődésen mentek keresztül;
ebben az időszakban vált nyilvánvalóvá, hogy
a vírusok önmagukban nem szaporodnak, tenyésztésükhöz
és kimutatásukhoz élő sejtek szükségesek.
Sejtkultúra segítségével dolgozták ki a pl. a poliomyelitis
elleni vakcinát. Jonas Salk az ún. HeLa sejtkultúrát
használta a poliomyelitisvakcina tesztelésére. A
HeLa sejtvonalat nem sokkal halála előtt a Henrietta
Lacks nevű méhnyakdaganatos betegből izolálták, ez
az egyik legrégebbi immortalizált sejtvonal, amelyet
máig széles körben használnak, és az első humán eredetű
sejtvonal, amelyet sikeresen tenyésztettek [1, 2].
Jelenleg a sejttenyésztés szinte minden biológiai kutatólaborban
használt általános technika, általános
sejtélettani folyamatok és specifikus sejttípusok vizsgálatára
is kiválóan alkalmas. Az őssejtkutatások központi
kérdése, hogy a sejtkultúrák környezetének, körülményeinek
megváltoztatásával hogyan lehet az el
nem kötelezett sejteket specifikus feladatok irányába
terelni. Szintén intenzíven vizsgált terület az elkötelezett
sejtek visszafordítása éretlenebb sejtté, hiszen
így kiválthatnánk az embrionális őssejtek izolálását
és kutatásra való felhasználását, amely eljárások máig
vitatott etikai problémákat és kérdéseket vetnek fel.
Egyre szofisztikáltabb technológiai újítások teszik
lehetővé, hogy a primitív, immortalizált sejtek helyett
olyan sejtkultúrákat és a sejtek számára olyan
mátrixokat hozzanak létre, amelyek nagyfokban hasonlítanak
a szervezet szerveiben, szöveteiben élő elkötelezett
sejtekre. Sőt talán nem kell hangsúlyozni,
mekkora a jelentősége azoknak a kutatásoknak, amelyek
több sejttípus felhasználásával élő szöveteket és
szerveket próbálnak létrehozni.
Sejttenyésztés
Sejttípusok
Sejttenyésztésben használt sejtek
A sejttenyésztésben használt sejteket eredetük szerint
alapvetően három csoportra lehet osztani:
• primer sejtek;
• transzformált sejtek,
• embrionális sejtek és őssejtek.
Primer sejt
A primer sejtek valamilyen szövetből, szervből
annak homogenizálása, szerkezetének kíméletes felbontása
által nyerhetők ki. Ez a folyamat lehet mechanikus
(pl. lágy szövetből – pl. az idegrendszerből
- a szövetet egyre csökkenő belső átmérőjű pipettán/fecskendőtűn
szívjuk át), vagy igénybe vehetők
emésztőenzimek (pl. kollagenáz, tripszin), amelyek a
sejt-sejt, ill. a sejt-extracelluláris mátrix közötti kapcsolatokat
bontják fel. A primer sejtek általában lassabban
vagy egyáltalán nem osztódnak, osztódásuk
néhány ciklus után megáll, és a sejtek elöregednek, elfajulnak.
Ezzel szemben előnyük, hogy kezdetben az

204 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
eredeti szövetre, szervre jellemző sajátságokkal rendelkeznek,
mint pl. a sejt alakjának, morfológiájának,
fehérjeexpressziós profiljának, sejtfelszíni markereinek
megtartása. Általában ezek a tulajdonságok az
első 1-2 osztódás során a legkifejezettebbek, a később
sejtek ezekből a jellegzetességekből veszíthetnek. A
keretes mellékletben egy rövid módszertani leírást ismertetünk
patkányszívizomsejt izolálásához.
Neonatális szívizomsejt izolálása. 2–5 napos újszülött
patkányokat használunk erre a célra. Az eltávolított
patkányszíveket módosított MEM pufferben
előbb steril szikével 1-2 mm-es darabokra
vágjuk, majd kollagenáz enzimes emésztésnek
vetjük alá. 3-4 × 10 perces, 37 ºC-on lejátszódó
emésztési ciklus végén a sejtszuszpenziókat öszszeöntjük
(poolozzuk). Centrifugálás (500 rpm,
10 perc) következik előbb fötális marhaszérumban,
majd ún. „overnight” médiumban reszuszpendáljuk
a sejteket [(DMEM:M199 (4:1) + 15%
FBS + penicillin (100 U/mL) + streptomicin (100
µg/mL) + arabinóz C (10 µM)]. A sejtszuszpenziót
ezután kollagénnel fedett Petri-csészékbe
vagy ún. „chambered coverslip”-re öntjük. A sejtsűrűség
~1*106/mL, ez elegendő ahhoz, hogy a
kitapadó cardiomyocyták összefüggő hálózatot
alkossanak és spontán, ritmusosan kontraháljanak.
24 óra elteltével a médiumot szérummentes
médiumra cseréljük (DMEM + Nutridoma supplement).
Természetesen egy adott primer sejttípus sikeres izolálása
és tenyésztése eltérő lehet, így a módszert minden
laboratóriumnak egyedileg kell optimalizálnia.
Újabban gyári izolálókiteket is lehet vásárolni, sőt
primer sejtvonalak is elérhetők kereskedelmi forgalomban,
ez esetben a szállító garantálja a sejtszámot
és a primer kultúra fenntarthatóságának időtartamát.
Transzformált sejt
A transzformált sejtek lehetnek malignus szövetből
származó daganatos sejtek. Az ilyen sejtek élő
szervezetben mutációk során alakulnak át kontrollt
vesztett, immortális sejtekké (pl. a daganatos betegekből
származó minták, lásd HeLa sejtvonal, vagy
állatokban mesterségesen, pl. benzpirén, aflatoxin,
vírusok stb. révén előidézett daganatokból származó
minták).
A transzformált sejtvonalak egy másik csoportja
eredetileg primer sejt volt, de mesterségesen transzformálták.
Az utóbbit elő lehet idézni pl. vagy a telomeráz
enzim expressziójának fokozásával, vagy
vírusfertőzéssel (SV-40 vírus), vagy esetleg már malignusan
transzformálódott sejtek fúziójával. Ez esetben
hibridómáról beszélünk, amely mindkét „szülő”
sejttípus sajátságait magán viseli: ilyen a korlátlan
osztódásra való képesség, de megmarad a primer
sejtre jellemző fenotípusa. A hibridómatechnológiát
leggyakrabban antitestek gyártására használják: egy
specifikus antitestet termelő B-sejtet fuzionálnak
szintén B-sejt eredetű, de malignus myelomasejttel.
A fúzió eredményeként a hibrid sejt hosszú ideig és
relatíve rövid ciklusidővel képes osztódni, és szerencsés
esetben megőrzi specifikus antitest termelésére
való képességét is. Ezek az ún. monoklonális antitestek
ma már a kutatásnak (immunhisztokémia, Western
blot, immunprecipitáció stb.), de a diagnosztikának
(szérumfehérjék, hormonok detektálása számos immunológiai
módszerrel) is elengedhetetlen reagensei.
A transzformált, immortalizált sejtek, bár a primer
sejtekhez képest nagyságrendekkel tovább tenyészthetők,
bizonyos idő és osztódásszám (60–80 generáció)
után szintén elöregedhetnek. Ennek oka a sorozatos
osztódásból adódó környezeti hatásokra kialakuló
vagy random hibákból származó és egyre gyakoribbá
váló DNS-replikációs hibák. Jelei: lassabb növekedés,
gyakoribb apoptózis, az eredeti fenotípus eltűnése.
Őssejt
Az őssejtek differenciálatlan, ún. pluripotens sejtek.
Ez azt jelenti, hogy egyrészt számos sejtosztódás
után sem öregednek el (tehát ilyen szempontból hasonlítanak
a transzformált sejtekhez), másrészt az
osztódáskor keletkező „leánysejtek” elindulhatnak a
differenciálódás irányába valamilyen külső inger hatására.
Totipotensnek nevezzük azokat az őssejteket,
amelyekből bármilyen sejttípus kialakulhat, tehát
gyakorlatilag egy teljes szervezet minden szövete.
A multipotens őssejtek számos, de egymással szoros
rokonságot, hasonlóságot mutató sejttípussá tudnak
csak alakulni, az unipotens őssejt pedig csak egyetlen
típusú differenciált leánysejtet képes létrehozni, természetesen
önmaga osztódási képességének fenntartása
mellett.

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
205
Őssejteket izolálni több módon lehetséges. Az
egyik módja, hogy 50–150 sejtből álló embrióból
nyernek ki őssejteket. Ez lehetséges állatból (pl. egér)
vagy humán embrionális őssejteket in vitro fertilizációt
(IVF) követően a beültetésre nem kerülő, megtermékenyített
petesejtekből. Az utóbbi eset, vagyis
humán embrió felhasználása kísérleti célokra szigorú
etikai engedélyekhez kötött, és a humán embrionális
őssejtkutatás jelenleg is komoly viták tárgya. Felnőtt
állatokból vagy emberekből is származhat őssejt, habár
számuk az összes sejthez képest felnőtt szervezetben
már kicsi és ezek nagy része is csak multipotens.
A gyakorlatban izolálhatnak őssejteket vérből,
csontvelőből, köldökzsinórvérből, de izomszövetből,
szívizomból, bőrből vagy akár fejlődő fogból is. A hematopoetikus
őssejteket már régóta alkalmazzák terápiában
is: a saját (autológ) vagy idegen (allogén),
gyűjtött őssejteket tenyésztés után a betegbe juttatják.
Kedvező esetben az őssejtek az előzetesen kemoterápiával
vagy besugárzással kiirtott csontvelő helyén
megtelepednek, és újra beindítják a vérképzést.
Újabban sikeres kísérleteket végeztek differenciált,
szomatikus sejtek őssejtállapotba való visszafordítására.
2006-ban elsőként japán kutatóknak sikerült
emberi, differenciált bőrsejtekből őssejteket előállítani
oly módon, hogy vírus segítségével az őssejtekre
jellemző transzkripciós faktorok génjeit juttatták be.
Majd néhány hétre rá a sejtek az őssejtekre jellemző
morfológiát kezdtek mutatni, valamint a telomeráz
enzim (amely megakadályozza a kromoszómák fokozatos
rövidülését osztódás során, vagyis a sejtek öregedését)
aktivitása is fokozódott [3].
Szuszpenziós vs. kitapadó sejtek
A sejtkultúrák típusait feloszthatjuk aszerint is,
hogy kitapadó vagy szuszpenziós sejtekkel dolgozunk.
A szuszpenziós sejtek leggyakrabban fehérvérsejtek
vagy azok transzformált változatai, közös
jellemzőjük, hogy a gyakorlatban elterjedt műanyag
vagy üvegfalú tenyésztőedények falához nem vagy
csak nagyon lazán kötődnek, enyhe rázás elegendő
a leülepedett sejtek felkavarásához. E sejtek egymáshoz
való kapcsolata is rendszerint kisfokú, az osztódások
során ugyan az utódsejtek közel maradhatnak
egymáshoz, kisebb csoportokat létrehozva, azonban
néhányszor felpipettázva azokat egyenletes, homogén,
„egysejtű” sejtszuszpenziót kaphatunk. A szuszpenziós
sejtkultúrák előnye, hogy könnyebb a passzálás,
nem igényel tripszines kezelést, valamint ideális
alanyai azon kísérleteknek, ahol a sejteket egyesével,
külön-külön szeretnénk vizsgálni (flow citometria,
fluorimetria). Mikroszkópos vizsgálatokhoz, mint pl.
az immunhisztokémia, a szuszpenziós sejteket ún.
citospin eszközzel ülepíthetjük tárgylemezre [4]. A
sejtszám optimális beállításával elérhetjük, hogy se
túl sűrűn, se túl ritkán ne helyezkedjenek el.
A sejtvonalak nagyobb része kitapadó sejtkultúra,
vagyis az edény falához, ill. egymáshoz tapadva
„monolayereket”, sejtréteget képeznek. E tulajdonságukból
kiindulva egy adott kultúra jellemezhető
az ún. konfluenciával, vagyis hogy egy adott felület
hány százalékát fedik le. A legtöbb sejttípusra
jellemző valamilyen fokú kontakt inhibíció; ennek
hiánya erősen differenciálatlan sejtet jelez. Kontakt
inhibíció során a sejtek elfoglalva egy adott felületet,
elegendő tápanyag esetén sem fognak tovább osztódni.
Inhibíció hiányában a monolayer kialakítása
után (vagy már közben) második, sőt további rétegeket
foglalnak el.
Általános szabályként alkalmazható, hogy körülbelül
5-10% konfluenciát érdemes a passzálás során
beállítani, majd a sejtek osztódása után 70–80%
konfluenciát elérve tanácsos az újabb passzálást elvégezni.
Ez azt jelenti, hogy ha pl. 24 óránként megduplázódik
a sejtek száma (korlátlanul rendelkezésre
álló tápanyagot feltételezve), kb. 3-4 naponta szükséges
átpasszálni a sejteket. Kitapadó sejtekkel dolgozva
a passzálás során először el kell távolítani a sejteket
mind egymástól, mind pedig a tenyésztőedény felületéről.
Ezt leggyakrabban tripszin és valamilyen
Ca 2+ -elvonó (EDTA vagy EGTA) kombinációjával
érhető el. Mind a Ca 2+ -megvonás, mind a sejtfelszíni
fehérjék emésztése elősegíti a sejtek lekerekedését és
leválását a felületről. Ezután mosást követően vehetjük
fel a kívánt mennyiségű, homogén sejtszuszpenziót
megfelelő mennyiségű friss médiumban. Az így
kezelt sejtek általában néhány óra alatt ismét kitapadnak,
és felveszik a rájuk jellemző morfológiát.
A kitapadó kultúrák előnyei:
• A sejtszámnövekedés könnyebben megítélhető.
• Esetleges kontaminációt könnyebb kezelni.
• Mikroszkópos kísérletek során nincs szükség
citospinre, közvetlenül növeszthetők fedő- vagy
tárgylemezen.
• Nagyobb méretű citoplazma segíti az intracelluláris
történések megfigyelését.

206 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
• A sejtek egymással való kölcsönhatása is vizsgálható.
Sejtvonalak. Néhány gyakran használt sejtvonal (a
teljesség igénye nélkül):
• HeLa: humán cervixcarcinoma.
• 3T3: egér fibroblast (3 naponta transzfer, 3 × 10 5
sejt/20 cm 2 sűrűséggel).
• Jurkat: humán T-sejt eredetű immortalizált sejtvonal.
• MDCK – kutyavese epithelialis sejt (Madin
Darby Canine Kidney).
• RBL: patkányhízósejtek (Rat Basophilic
Leukemia).
• SHSY5Y: humán neuroblastoma.
• Caco: humán epithelialis colorectalis adenocarcinoma.
• CHO: hörcsög petefészek (Chinese Hamster
Ovary).
• PC12: patkány phaeochromocytoma.
• Hep G2: humán hepatocellularis carcinoma.
Természetesen több ezer további sejtvonal létezik, talán
a legteljesebb katalógus, megvásárolható törzsekkel,
az ATCC (American Type Culture Collection)
honlapján található [5].
Tenyésztőedények, flaskák
A sejtek tenyésztéséhez ún. tenyésztőflaskákat alkalmazunk
[6]. A tenyésztőflaskák helyett használhatunk
steril Petri-csészét vagy akár steril, fektetett
kémcsövet is, de a flaskák kiképzése biztosítja az optimális
feltételeket:
• Felületet biztosít kitapadó sejtek számára. A
kitapadás leggyakrabban a flaska anyagához
történik, de bevonhatják a felületet pl. kollagénnel
vagy poli-D-lizinnel a jobb kitapadás érdekében.
• A flaskát az inkubátorban elfektetve nagyobb
felületen érintkezik a médium az inkubátor
levegőjével, elősegítve ezzel a gázcserét.
• A döntött nyak megkönnyíti a pipettázást és a
fektetett tárolást.
• A kupakban elhelyezett filter a gázcserét megengedi,
de a pórusméretnél (0,2 μm) nagyobb
részecskék, baktériumok átjutását nem.
Különböző méretben kaphatók flaskák, leggyakrabban
25, 75 vagy 150 cm 2 felszínű típusokat alkalmazunk.
A kisebb, 25 cm 2 -es flaskát kb. 8-10 mL médiummal
optimális feltölteni, a 75 cm 2 -es flaska 40-50
mL, a 150 cm 2 -es flaska pedig 100-150 mL médiummal
is feltölthető anélkül, hogy az az inkubátorban a
fektetett flaskából kifolyna.
A flaskák kívül gyakoriak a lemezek [7]. Különböző
számú és méretű lyukakban (well) helyezhetjük
el a sejteket tartalmazó szuszpenziót (6, 12, 24 vagy
96 lyuk). Ezeket a lemezeket nem elsősorban a sejtek
fenntartására vagy szaporítására használjuk, hanem
olyan kísérleteknél, ahol párhuzamosan több különböző
kezelés hatását vizsgáljuk. Fedőlemezeket is elhelyezhetünk
bennük, amelyeken a sejtek kitapadása
után pl. immunhisztokémiai vizsgálatokat végezhetünk.
A fedőlemezeket 96%-os alkoholba mártva,
majd Bunsen-égő lángjában leégetve sterilizálhatjuk,
mielőtt a sejtszuszpenziót rápipettázzuk.
Inkubátor
A sejttenyésztés elengedhetetlen feltétele a hőmérséklet
és a gázcsere kontrollált körülmények között
tartása, ezért minden sejttenyésztéssel foglalkozó laboratóriumban
megtalálható legalább egy inkubátor.
Az esetek nagy részében 37 ºC-ot és normális légköri
oxigén- és nitrogé tenzió mellett 5-os CO 2
-tartalmat
tartunk fent. Ez a CO 2
- (vízben oldódva, fiziológiás
pH-n HCO 3-
-tá disszociál) koncentráció
jóval nagyobb a légköri értéknél (~0,04%), azonban
megközelíti az emberi és állati szövetekben, kapillárisokban
található, aerob metabolizmus által termelt
HCO 3–
-koncentrációt. Az inkubátorok a hőmérsékletet
és csatlakoztatott gázpalack segítségével a CO 2
-ot
is a beállított értéken tartják. A levegő szűrőn keresztül
jut el az inkubátor légterébe. A szűrő állapotát
időszakosan ellenőrizni, szükség szerint cserélni kell.
Mivel az inkubátor hőmérsékletét 37 ºC-on tartjuk,
a párolgás sokkal kifejezettebb, mint szobahőmérsékleten.
Így az inkubátorba helyezett sejttenyészetek
médiumai nagyon gyorsan bekoncentrálódnának.
Ennek kivédésére az inkubátorba egy edényben vizet
helyezünk (lehetőség szerint desztillált vizet, és a
sterilitására is ügyelni kell, hiszen könnyen kontamináció
forrása lehet), ami az adott hőfokon telített vízgőzt
alakít ki, megakadályozva a médiumok túlzott
párolgását.

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
207
Médiumok
Médiumok összetevői
Míg régen általában a laboratóriumok
maguk állították össze a médiumokat,
manapság gyakoribb azok
megrendelése biotechnológiai kereskedelmi
cégektől. Kétféle formátum
terjedt el: az azonnal használható oldat,
ill. a tárolás szempontjából kedvezőbb
por forma, ezt használat előtt
megadott térfogatú vízben fel kell oldani
és pH-ját beállítani.
A 10-1. táblázatban egy gyakran
alkalmazott és viszonylag egyszerűbb
összetételű médium, az RPMI-1640
összetételét ismertetjük. E médiumot
gyakran alkamazzuk „igénytelen”, jól
tenyészthető sejtek esetén. Az RPMI
mint „minimál” tápoldat összetétele
jól demonstrálja a sejtek számára
alapvetően szükséges összetevőket:
ionok (nátrium, kálium, kalcium,
magnézium, klorid), glukóz, vitaminok,
esszenciális aminosavak.
Általában a megvásárolható médiumokból
vagy a glutamin, vagy
a nátrium-bikarbonát szándékosan
hiányzik (a táblázatban pirossal jelezve),
ezt utólag kell pótolni a médiumot
használónak. Az utólagos
adagolásra elsősorban a glutamin lebomlása
miatt van szükség. Újabban
a glutamint más aminosavhoz kötve
(alanin), dipeptid formátumban adhatják,
így a médiumban a glutamin
koncentrációja lassabban csökken le,
élettartama nagymértékben megnő.
Ilyen médiumok vásárlásakor győződjünk
meg arról, hogy az általunk
használt sejttípus képes-e a dipeptidből
kinyerni a glutamint.
A fenolvörös pH-indikátor savas
oldatban sárga, lúgosban lila színű;
ezáltal a régóta használt vagy nyitva
felejtett oldatokban a szén-dioxid
elpárolgását, eltűnését lila színnel, a
sejtek metabolizmusa miatt felszapo-
10-1. táblázat. Az RPMI-1640 médium összetétele *
Vegyület Mennyiség Mértékegység
l-lizin-monohidroklorid 40 mg/l
l-szerin 30 mg/l
glicin 10 mg/l
l-aszparagin, vízmentes 50 mg/l
l-leucin 50 mg/l
l-prolin 20 mg/l
l-aszpartánsav 20 mg/l
l-triptofán 5 mg/l
l-glutaminsav 20 mg/l
l-izoleucin 50 mg/l
l-fenilalanin 15 mg/l
l-hidroxi-l-prolin 20 mg/l
l-valin 20 mg/l
l-cisztin-dihidroklorid 65,2 mg/l
l-hisztidin 15 mg/l
l-metionin 15 mg/l
l-arginin, kötetlen bázisos 200 mg/l
l-treonin 20 mg/l
l-tirozin-dinátrium, dihidrát só 28,83 mg/l
l-glutamin 300 mg/l
kalcium-nitrát-tetrahidrát 100 mg/l
nátrium-foszfát, dibázikus, vízmentes 800 mg/l
nátrium-klorid 6,000 mg/l
nátrium-bikarbonát 2,000 mg/l
magnézium-szulfát, vízmentes 48,84 mg/l
kálium-klorid 400 mg/l
folsav 1 mg/l
d-biotin 0,2 mg/l
mioinozitol 35 mg/l
riboflavin 0,2 mg/l
d-Ca-pantotenát 0,25 mg/l
piridoxin-hidroklorid 1 mg/l
B 12
-vitamin 0,005 mg/l
p-aminobenzoesav (PABA) 1 mg/l
kolin-klorid 3 mg/l
tiamin-hidroklorid 1 mg/l
nikotinamid (nikotinsavamid) 1 mg/l
fenolvörös nátriumsó 5,3 mg/l
l-glutation, redukált 1 mg/l
d-glukóz, vízmentes 2,000 mg/l
*
A piros színnel jelzett vegyületek a készen beszerzett médiumból hiányozhatnak,
utólag pótlandók.

208 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
rodó savak (tejsav, szénsav) megjelenését pedig sárga
színnel jelzi.
Egy adott médiumon belül is számos változtatásra
van lehetőség, pl. az egyik leggyakoribb, amikor glükózmentes
médiumot rendelnek/állítanak elő. Mivel
a médium általában 10-20 mM glukózt tartalmaz
(alapesetben a sejtek bőséges tápanyagellátása élvez
prioritást), fiziológiás (~5,5mM) mennyiségű glükózt
igénylő kísérletekben ilyen médium nem használható,
glükózmentes médium glükózkoncentrációja viszont
tetszőlegesen állítható be.
pH, indikátor
A médium pH-ját több tényező befolyásolja: a
benne oldott pufferek (foszfátok, amfotér aminosavak,
bikarbonát), az inkubátor által szabályozott CO 2
/
HCO 3-
, a szérum (albumin, fehérjék, laktát stb.) és a
sejtek által termelt anyagok (bikarbonát, laktát). Médiumok
elkészítésénél a bikarbonát hozzáadása után
a pH-t általában 7,2–7,4 közé kell beállítani. Mivel a
bikarbonát illékony, idővel a tárolás során a médium
lúgos irányba változhat. Ezt a médium indikátora
színváltozással jelzi is, legtöbbször ez mégsem okoz
különösebb gondot, hiszen az inkubátorban a magasabb
CO 2
-tenzió a pH-t megfelelő szintre állítja viszsza.
Szérum
A táptalajok egyik legfontosabb összetevője a szérum.
Ez leggyakrabban fötális marhasavó (FBS), de
használható pl. lószérum, ezek keverékei vagy akár
humán szérum is. A szérumra azért van szükség,
mert a sejtek elsöprő többsége nem élne, nem osztódna
pusztán szintetikus médiumot tartalmazó táptalajban.
A szérumban többek között albumin, vastartalmú
fehérjék (transzferrin), koleszterinforrás, inzulin
és számos növekedési faktor található. A szérum pufferkapacitása
segíti a pH-t fiziológiás tartományban
tartani. Arányát általában 5-15%-ra (leggyakrabban
10%-ra) állítják be. Ez elegendő ahhoz, hogy a sejtek
megfelelő egyéb tápanyagok esetén exponenciális növekedésnek
induljanak.
Újabban megvásárolhatók ún. szérumkiegészítők
is, amelyekben mesterségesen pótolják a felsorolt szérumalkotókat.
Szérumkiegészítő választandó, ha egy
speciális igényű sejtvonalat (pl. neuronalis eredetű
sejtek) kívánunk tenyészteni. Számos különböző öszszetételű,
előre gyártott szupplemens megvásárolható
vagy egyedi igény esetén magunk is megpróbálkozhatunk
megfelelő összeállításukkal, kiegészítésükkel.
Számos esetben széruméheztetésre kerülhet sor,
a médiumból kihagyjuk szérumot. Erre azért lehet
szükség, mert az adott kísérletet annak jelenléte
zavarja (szérumfehérjék megköthetnek bizonyos
gyógyszereket, fluoreszcens festékeket, radioaktívan
jelzett anyagokat). Mivel a szérum szükséges a sejtek
növekedéséhez, a széruméheztetést a megfelelő sejtszám
elérése után, maximálisan 24–48 óráig szokás
alkalmazni. A sejtek osztódása ekkor leáll, hosszabb
időtartamig fennálló széruméheztetés hatására pedig
apoptózis is bekövetkezhet.
Régebben gyakran alkalmaztak hőinaktiválást, mielőtt
a szérumot sejttenyésztésre felhasználták volna.
Ennek az az oka, hogy az 56 °C-os, 30 perces kezelés
a szérum komplementfaktorait és más, pontosabban
meg nem határozott sejtnövekedés-gátló faktorát
is inaktiválja. Ez azonban idő- és eszközigényes,
ráadásul a kezelés inaktiválhat a sejtek számára fontos
faktorokat is. Amióta az FBS terjedt el az újszülött-marhasavó
helyett, erre az eljárásra nemigen van
szükség. Néhány differenciált sejtvonalnál azonban
elképzelhető, hogy hőinaktivált szérumban jobban
érzik magukat a sejtek. Ilyen esetekben továbbra is ez
a választandó protokoll.
Antibiotikumok
A sejttenyészetek az élő szervezetből kiragadott
monokultúrák, amelyek nem rendelkeznek immunitással,
ezért a fertőzések, kontaminációk veszélye igen
nagy. Ráadásul a használt médiumok kiváló táptalajt
jelentenek a baktériumok számára is. A fertőzések
elkerülése érdekében természetesen a sterilitási szabályok
betartásán túl nagyon gyakran alkalmazunk
a médiumokban antibiotikus védelmet. Az antibiotikumok
kiválasztását és koncentrációját igyekszünk
úgy beállítani, hogy effektív védelmet nyújtsanak, de
ne gátolják a sejtek növekedését. A leggyakoribb alkalmazott
kombináció a 100 U/mL penicillin és 100
μg/mL streptomicin keveréke. Ez elegendő arra, hogy
az óhatatlanul a médiumba kerülő, de kis csíraszámú
baktériumokat megölje, masszív kontaminációt
azonban nem képes kivédeni, hiszen nagyon gyorsan
kialakul az antibiotikumrezisztencia.
Komplett DMEM médium készítése
Tájékoztatásul ismertetjük az egyik leggyakrabban

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
209
használt médium, a DMEM elkészítését és komplettálását.
• A por formában kapható (pl. Sigma©,
Invitrogen©), 1 L médium készítésére elegendő
médiumot (kb. 10g/L) ~900 mL desztillált vízben
folyamatosan keverve feloldjuk.
• A gyártó által javasolt mennyiségű NaHCO 3
-ot
(általában 2 g) kimérjük, és a médiumhoz
adjuk. A keverés során igyekezzünk elkerülni a
túlzott buborék/hab képződést.
• Lehetőség szerint minél hamarabb beállítjuk a
pH-t 7,3 (±0,05) értékre 1 N sósavval.
• Az oldatot desztillált vízzel 1 L-re egészítjük ki.
• Hozzáadunk 10% FBS-t (100 mL). Opcionális:
kiönthetünk a médiumból 100 mL-t, mielőtt az
FBS-t hozzátesszük, így valóban 10%-os lesz,
valamint a kiöntött médiumot külön tárolva
később felhasználható olyan esetekben, amikor
a szérumtartalmú médium nem alkalmazható.
• Hozzáadunk 10 mL, 100X antibiotikum- törzsoldatot
(10 000 U/mL penicillin, 10 mg/mL
streptomicin), így a végkoncentráció 100 U/mL
penicillin és 100 μg/mL streptomicin lesz.
• A komplett médiumot steril fülke alatt 0,22 μm
pórusátmérőjű steril szűrővel, ugyancsak steril,
autoklávozott üvegedénybe leszűrjük.
• Amennyiben e lépések bármelyikét nem tudjuk
rögtön elvégezni, érdemes a médiumot lezárni,
lefedni, állás közben ugyanis a bikarbonát CO 2
formájában idővel távozik a rendszerből, a
pH-értékét megváltoztatva.
• Az FBS-t általában 0,5 L-es kiszerelésben árulják;
érdemes 50 mL-es részletekre osztani (steril
edényben, csövekben), és fagyasztva tárolni. Az
antibiotikum-törzsoldatból szintén érdemes
legalább 100 mL-t készíteni, és 10 mL-es alikvotokban,
fagyasztva tárolni.
A tenyészetek kezelése
Passzálás, szuszpenziós sejtek
A tápanyagok fokozatos felhasználása miatt időről-időre
szükséges a médiumot lecserélni a sejtekről.
Ez végezhető az eredeti médium megtartásával vagy
a médium teljes cseréjével. Az első esetben is törekedni
kell arra, hogy az elhasznált médium aránya minél
kisebb legyen, pl. 1 mL sejtszuszpenziót 9 mL friss
médium oldatával hígítunk.
Célszerűbb azonban a teljes médiumot lecserélni:
ez esetben steril centrifugacsőbe, csövekbe töltjük a
kívánt mennyiségű sejtet tartalmazó szuszpenziót,
majd rövid, kis sebességű centrifugálás után (1200
rpm, 2 perc) a felülúszót leöntjük (figyelve arra, hogy
a nem túl erősen letapadt sejteket a cső aljáról ne keverjük
fel), majd friss médiumban, néhányszori fel-le
pipettázással felvesszük a sejteket.
Amennyiben kitapadó sejtkultúrának csak a médiumát
kívánjuk lecserélni, egyszerűen leöntjük a használt
médiumot és újat pipettázunk a sejtekre. Fontos,
hogy a pipettázással ne mossuk le a sejteket: irányítsuk
a pipettát a flaska oldalfalára.
Tripszin
A kitapadó sejtkultúrák passzálásához szükség van a
sejtek szuszpenzióba vitelére. Ehhez a mechanikus eltávolítás
– a sejtek lekaparása valamilyen steril, nem túl
éles végű eszközzel, pl. sejtkaparóval (cell scraper) [8]
– is megfelelő lehet, ha nem célunk homogén, különálló
sejtekből álló szuszpenzió készítése. Mivel azonban a
sejtek erősen tapadhatnak egymáshoz, a mechanikus eltávolítás,
majd az ezt követő kitartó pipettázás sem elegendő
homogén sejtszuszpenzió létrehozására. Passzálásnál
azért van erre szükség, mert a sejtek gyorsabban
osztódnak, gyorsabban benövik a rendelkezésükre álló
felületet, ha egyenletesen elosztjuk őket. Ellenkező esetben
a nagyobb sejtcsoportok, csomók a kontakt inhibíció
miatt eleve lassabban osztódnak, és egyenetlenebbül
is oszlanak el a tenyésztőedény felületén.
Tripszines emésztés során a tripszin a sejtek közötti
fehérje-fehérje, ill. a sejt (membránfehérjék) és
a tenyésztőedény felülete közötti kapcsolatokat roncsolja
el.
A tripszines oldat összetétele:
• 0,25% (g/g) tripszin
• 0,5 mM EDTA
PBS-ben oldva.
Az EDTA szerepe a Ca 2+ megvonása, ui. a Ca 2+ fontos
kofaktor a sejtek kitapadásához. Sok esetben már
az EDTA-s oldat is elegendő lehet a sejtek szuszpenzióba
vitelére, PBS pedig biztosítja a fiziológiás ozmotikus
koncentrációt és pH-t.
A tripszines passzálás menete:
• A médiumot tartalmazó üveget tegyük 37 ºC-os
vízfürdőbe, vagy várjuk meg, amíg szobahőmérsékletűre
melegszik.

210 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
• Az elhasznált médiumot leöntjük vagy leszívjuk
a sejtekről.
• 1-2 mL steril PBS-sel (vagy akár a tripszinoldattal)
mossuk a sejteket, vigyázva arra, hogy a
mosófolyadék pipettázásakor ne sodorjuk le a
sejteket (célszerű a tenyésztőedény oldalfalára
irányítani a pipettát).
• A mosó leszívása után 0,5–1,5 mL (a tenyésztőedény
felületétől függően) friss tripszinoldatot
pipettázunk a sejtekre, és meggyőződünk arról,
hogy a teljes felületet ellepi az oldat.
• 37 ºC-os termosztátba helyezzük a tenyészetet
2–15 percre (az időtartam függ a sejttípustól, ill.
a tripszin minőségétől, az optimális időt egyénileg
kell meghatározni).
• Az inkubálás után a szuszpenzióba került sejteket
(a flaska enyhe ütögetésével meggyorsíthatjuk
a folyamatot) steril csőben lecentrifugáljuk
(500 rpm, 5 perc, vagy mikrocentrifugában 10
másodperc „pulse” üzemmódban), a felülúszót
leöntjük, és a sejteket friss, komplett médiumba
felvesszük.
• Mivel a komplett médium tartalmaz szérumot,
az pedig antitripszint, a tripszinezés után mosás
nélkül is felvehetjük a sejteket, ügyelve arra,
hogy a tripszin alaposan kihíguljon (legalább
30–50-szeresre).
• A szuszpenziót új, steril tenyésztőedénybe
helyezzük, azt pedig a 37 °C-on termosztátba.
Ügyeljünk arra, hogy flaskában a sejtszuszpenzió
egyenletesen ülepedjen le (körkörös mozdulatok,
a flaska szükségtelen rázását kerüljük).
Fontos megjegyezni, hogy a tripszines emésztés valamilyen
mértékben mindig károsítja a sejteket, ezért
annak időtartamát érdemes a még szükséges minimumra
csökkenteni.
Sterilizálás, filtrálás
Eszközök
A sejttenyésztés elengedhetetlen feltétele a sterilitás
megteremtése. Minden olyan eszköznek, oldatnak,
edénynek, amely a sejtekkel kapcsolatba kerülhet,
sterilnek kell lennie. Pipetták, műanyag tenyésztőedények,
Petri-csészék, centrifugacsövek megvásárolhatók
steril csomagolásban. Ezek az eszközök
egyszer használatosak, ui. a gyártó g-besugárzással
sterilizál, amire normális laboratóriumi körülmények
között általában nincs mód, az autoklávozás hőfokát
pedig nem mindegyik műanyag eszköz bírja.
Az üvegeszközöket, ill. azon oldatokat, tápfolyadékokat,
amelyek minősége hőkezelésre nem változik,
autoklávozhatjuk: 120–130 °C, fél óra időtartamig
elégséges sterilitást ad. Ügyeljünk arra, hogy az autoklávban
legyen elegendő víz, ill. hogy az üvegedényeket
lazán zárjuk csak, így a forró vízgőz a belső
felületüket is fertőtleníti.
Tápoldatok szűrése
A tápfolyadékok többségét nem célszerű autoklávozni
vagy egyéb hőhatásnak, kémiai hatásnak
kitenni, ezért itt a választott sterilezési módszer a
szűrés. Az oldatokat (természetesen előzetesen sterilizált
vagy sterilen megvásárolt) filteren szűrjük át,
túlnyomás vagy ellenkező oldali szívás (vákuum) segítségével
[9]. A filter pórusátmérője legfeljebb 0,22
μm lehet. A szintén kapható 0,4 μm pórusátmérőjű
filterek csak előszűrésre alkalmasak, hiszen számos
baktérium átmérője ennél kisebb. Meg kell azonban
jegyezni, hogy a 0,22 μm pórusátmérőjű filter sem
véd meg minden kórokozótól: a vírusokat nem szűri
ki, ill. a sajnos nagyon gyakori mycoplasmát sem.
„Laminár boksz”
A sejttenyészetekkel való foglalkozás során különös
gondot kell fordítani arra, hogy a kialakított steril
körülményeket fenntartsuk. Az ún. laminár boksz
olyan fülke, amely egyenletes, szűrt légáramlatot biztosít,
így a fülke alatt dolgozva a nyitott edényekbe
a levegőből bekerülő kontamináció esélyét csökkenti.
A fülke lehet negatív vagy pozitív nyomású. A negatív
nyomású a fülkét használó személyt védi elsősorban,
veszélyes (pl. M. tuberculosis) anyagokkal való munka
során (egyenletes légáramlás – „légfüggöny” mellett)
a fülke alatti levegő a negatív nyomás miatt nem
kerülhet ki közvetlenül a kinti térbe. Pozitív nyomás
esetén az áramoltatott levegő egy része a nyitott fülke
ajtaján kiszökik, viszont ez a pozitív nyomás a kinti
levegő szálló részecskéit, a potenciális kontaminációt
„kifújja”.
A laminár boxok filterei (amelyek a lamináris
áramlású levegőből kiszűrik a lebegő részecskéket)
időszakosan cserére szorulnak. Ugyancsak ellenőrizni
kell megfelelő műszer segítségével a bekapcsolt
fülké belsejében a levegőben található részecskék számát.
A legtöbb fülke rendelkezik beépített UV lám-

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
211
pával. Bekapcsolásával ( ha a fülke zárt és a ventiláció
ki van kapcsolva) a fülke belső felületét, terét lehet
sterilizálni: 15 perc UV megvilágítás a munka megkezdése
előtt és után elegendő.
A fülke alatt végzett munka szabályai;
• Minden edényt, tenyésztőflaskát, médiumot
tartalmazó üveget, steril pipettahegyek dobozát
csak addig nyitjuk ki, amíg dolgozunk vele,
utána azonnal visszazárjuk.
• Kesztyűt kell használni.
• Nyitott edény felett nem nyúlunk át, mert a
pipettahegyről vagy a kezünkről beszennyezhetjük
a sejtkultúrát.
• Az edények, flaskák kupakját fejjel lefelé tegyük
le, így annak steril felülete nem ér a fülkéhez
vagy más, a fülkében található tárgyhoz.
• Bunsen-égő használata; bezárás előtt az edények
száját, ill. a kupakokat rövid ideig (1-2 s) „leégethetjük”
Bunsen-lángban – fontos, hogy Bunsenlángot
csak bekapcsolt lamináris áramlás esetén
használjunk, és soha ne hagyjuk felügyelet nélkül
vagy a kelleténél tovább bekapcsolva!
• A munka megkezdése előtt 15 percre kapcsoljuk
be a fülke UV lámpáját. A munka végeztével
alkoholos dezinficiálóval a munkalapot töröljük
át, majd ismét kapcsoljuk be az UV-t szintén kb.
15 percre.
A tenyészet kontaminációja
Felismerés
A kontaminációt okozhatja baktérium, gomba, vírus,
mycoplasma vagy akár egy másik eukarióta sejtvonal,
sejttípus is.
A bakteriális kontaminációt könnyű felismerni,
mert a populáció növekedése jóval gyorsabb, mint
a sejteké: kétóránként megduplázódhat a baktériumok
száma. Ezt jelzi a médium gyors lesavanyodása
(a médium pH-indikátora sárga színre vált), zavarossá
válása. Sokszor az inkubátort kinyitva már jellegzetes
szag fogadja a kutatót. Mikroszkóp alatt már
közepes nagyítással is jól megfigyelhetők a nyüzsgő
baktériumok. Antibiotikus védelem mellett a baktériumok
szaporodása lassabb lehet, de amint kialakul
az antibiotikumrezisztencia, felgyorsul a folyamat.
Általában a tenyésztett sejtek elhalása is bekövetkezik
a baktériumok hatására.
Gombás kontamináció szerencsére jóval ritkább,
kevésbé fulmináns, és mikroszkópban szintén könynyen
felismerhető jellegzetes morfológiája alapján.
A vírusfertőzések sajnos kevésbé feltűnőek, sokszor
csak a sejtek látszólag indokolatlan pusztulása
hívhatja fel a figyelmet rá. Hagyományos sterilezési
eljárások elégtelenek a vírusok eliminálására, a vírusok
a filtereken átjutnak, ill. maga a sejt hordozhatja
a vírust intracellulárisan. Amennyiben nem ismert,
megbízható forrásból származó sejtvonalat alkalmazunk,
a saját biztonságunk érdekében is különösen
ügyelnünk kell a sterilitás betartására. Primer, különösen
humán eredetű sejtek tenyészetében hepatitis-,
HIV-vírus is előfordulhat.
A mycoplasma által okozott kontamináció sajnos
nagyon elterjedt, és kivédése is nehéz, mivel intracelluláris
kórokozó. A kereskedelmi forgalomban kapható
szérumok is nagyon gyakran mycoplasmával
fertőzöttek, ill. a garantáltan mycoplasmamentes szérumok
sokkal drágábbak. A kontamináció megléte
nehezen fedezhető fel, viszont kísérleti eredményünket
megzavarhatja. Ilyen a mycoplasma hatása a peroxidáz/kataláz
aktivitásra, ami szignifikánsan befolyásolhatja
pl. egy H 2
O 2
-vel kiváltott oxidatív stressz
kísérlet eredményeit. A mycoplasma felfedezésére
számos kit áll rendelkezésre, in vivo festési technikák
vagy PCR alapú detekciós eljárások egyaránt.
Elsősorban primer kultúránál, de többféle, nem
kellő körültekintésel kezelt, immortalizált sejtvonal
tenyészetében is előfordulhat a sejttípusok keveredése.
Csekély számú, akár egy-két rossz helyre került sejt
is okozhat komoly problémát, hiszen már minimális
előnnyel rendelkezve is néhány generációt követően
túlsúlyba kerülhet, „túlnőheti” a másik sejtvonalat.
Primer kultúránál leggyakoribb a fibroblastszennyezés;
ez a médiumot illetően viszonylag igénytelen sejt,
gyorsan osztódik.
Kezelés, a sejtvonal megmentése
A kontamináció elkerülésének alapja a precíz, steril
munka, a fülke rendeltetésszerű használata, steril, egyszer
használatos eszközök, antibiotikumok alkalmazása.
Gyakori médiumcsere nem csak a sejtek tápanyagforrását
hivatott szolgálni, de az óhatatlanul bejutó
baktériumok megtelepedésének esélyét is csökkenti.
A kontamináció felfedezése után az első dolog
a még meg nem fertőzött kultúrák elkülönítése, és
amennyiben lehetséges, a kontamináció forrásának

212 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
felkutatása. Ha rendelkezünk lefagyasztott, biztosan
kontaminációmentes sejtekkel, a kontaminált kultúrát
dobjuk ki, és olvasszuk fel a tárolt törzset.
A médiumokat, törzsoldatokat, ha szemmel láthatóan
kontamináltak, mindenképpen, de ha nem vagyunk
biztosak benne, akkor is célszerű kiönteni és
új, friss oldatokat készíteni (esetleg opció lehet a médium
újbóli szűrése is). Az inkubátor dezinficiálása
(és amennyiben szükséges, a filterek cseréje), a használt
eszközök újbóli sterilezése, a nem steriliezhetők
kidobása ugyancsak elvégzendő.
Még korai fázisban és nem pótolható sejtek kontaminálódásakor
megpróbálkozhatunk a kontaminációmentesítéssel.
Először is a sejteket steril, biztosan
kontaminációmentes médiumban kell mosni, majd -
ha baktériumfertőzés történt - antibiotikus kezelést
alkalmazni (ha eredetileg is alkalmaztunk antibiotikus
védelmet, természetesen váltani kell más típusú,
más hatásmechanizmusú antibiotikumra). Gyakori
médiumcsere is hasznos lehet, esetleg több, külön kezelt
kisebb csoportra osztva a sejteket növelhetjük a
sikeres dekontamináció esélyét.
Vírusfertőzésben nem sok lehetőségünk van,
célszerű új, vírusmentes törzzsel újrakezdeni a tenyésztést,
és a fertőzött sejteket kidobni. Mycoplasmafertőzés
leküzdésére viszont ma már kaphatók
meglehetősen hatásos kitek, amelyekkel a sejtvonal
megszabadítható a mycoplasmától. Ugyanakkor sikeres
mycoplasmamentesítést követően fontos a monitorozás,
ill. a továbbiakban biztosan mycoplasmamentes
médiumok alkalmazása.
Másik sejttel, sejtvonallal történt keveredés után
egyetlen választandó megoldás a fagyasztva tárolt,
homogén sejtkultúra újraindítása. Ugyanakkor primer,
nem osztódó sejtek esetén a fibroblastok növekedésének
megakadályozására alkalmazhatunk mitózisgátló
citozin-arabinozidot (Ara-C). Nem tünteti el
a fibroblastokat, de megakadályozza, lassítja az osztódásukat,
így a primer sejtek túlsúlya tovább megmarad.
Szintén alkalmazható primer sejteknél, kisszámú
sejt esetén sztereomikroszkóp alatt a morfológiai jegyek
alapján elkülönítve a nem kívánt sejttípus mechanikus
elpusztítása (pl. vékony steril tűvel).
Fagyasztás, fagyasztásból való felolvasztás
Mivel még az immortalizált sejtek sem tenyészthetők
a végtelenségig, valamint a kontamináció veszélye
miatt a sejtvonalakat több részre osztva, hosszú távon
folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk. Egy új
sejtvonalból izolálása vagy beszerzése, vásárlása után,
minél hamarabb, néhány passzálás után célszerű lefagyasztani
sejteket, 2-3 egymást követő passzálásból
külön-külön.
Fagyasztás során a lassú fokozatos fagyasztás, valamint
ún. „cryopreservative” anyagok hozzáadásával[
(dimetil-szulfoxid (DMSO), glicerin] gátoljuk meg a
jégkristályok kialakulását és a sejtek struktúrájának
sérülését.
A fagyasztás menete:
• Kb. 10 6 , log-fázisban lévő sejt, legalább 90% viabilitással.
• Szuszpenzióba hozzuk a sejteket (kitapadó sejtek
esetén tripszinezéssel, szuszpenziós kultúránál
elegendő centrifugálás után friss médiumban
felszuszpendálni).
• Lecentrifugáljuk (1200 rpm, 2 perc), majd 1-2
mL fagyasztó médiumban reszuszpendáljuk a
sejteket (komplett tenyésztőmédium 5-10%
DMSO-val kiegészítve; a fagyasztó médiumot a
DMSO hozzáadása után szűrjük!).
• 2 mL-es, steril, ún. „cryo-vial”-ba, fagyasztócsövekbe
töltjük a sejtszuszpenziót (1mL/cső)
[10].
• –70 ºC hűtőbe helyezzük a csöveket, vagy még
jobb, ha speciális fagyasztóval szabályozottan
hűtjük le (controlled rate freezer [11]).
• 24 óra múlva a csöveket áttesszük folyékony nitrogénes
(-196 ºC) tartályba, ahol hosszú ideig
tárolhatók [12].
• Fontos a folyékony nitrogénes tároló nyilvántartásának
naprakész vezetése, ami nagyban
megkönnyíti az esetenként több száz, évekkel
korábban lefagyasztott minta megtalálását.
Sejtek kiolvasztása:
• Készítsük elő a sejtek tenyésztéséhez szükséges
médiumot és a tenyésztőflaskát.
• Vegyük ki a nitrogénből a sejteket tartalmazó
csövet.
• Hagyjuk szobahőmérsékleten kiolvadni.
• Centrifugálást követően mossuk egyszer komplett
tenyésztőoldatban, majd pipettázzuk át a
médiumot tartalmazó flaskába.
• 24 óra múlva cseréljünk médiumot, így a lassab-

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
213
ban ülepedő, ki nem tapadó, elhalt sejtektől,
sejttörmeléktől megszabadulva az életképes sejtek
túlsúlyba kerülnek.
A tenyészet sejtjeinek osztódása,
sejtszámváltozások
Populáció, növekedés
Médiumcsere nélkül a sejtek száma időben szigmoid
görbe lefutását mutatja. Kezdetben exponenciális
növekedés figyelhető meg (ezt megelőzi egy
„lag”-fázis, amely a sejteknek ahhoz szükséges, hogy
a tripszinnel való kezelés, az előző elhasznált, tápanyagban
szegény, savas médium okozta stagnálás
után ismét log-fázisba kerüljenek. A log-fázis végén a
tápanyagok elfogyásával lassulás következik be, majd
a sejtek osztódása teljesen leáll, sőt friss médium adásának
elmulasztása esetén apoptózis és sejtszámcsökkenés
következik be [13].
A sejtek számára ideális körülmények között –
log-fázisban - a következő sejteket figyelhetjük meg:
• Élő, nyugalmi fázisban (G0) lévő sejtek (kitapadó
sejtek esetén ellapult, széles citoplazmával,
laza kromatinszerkezetű maggal rendelkező sejtek):
>85–90%.
• Osztódó sejtek (lekerekedett sejtek, keskeny
citoplazma, „denz” kromatin): 1–10%.
• Apoptotikus sejtek, elhalt sejtek, sejttörmelék
(kisebb, kontrasztosabb részecskék, lebegnek
vagy más sejtekhez tapadhatnak): < 5%.
Ez az átlagos összetétel természetesen optimálistól eltérő
körülmények között megváltozhat, ezért célszerű
a sejtek fenntartása esetén naponta egyszer, a médium
színe (pH) és a sejtsűrűség megítélése mellett
mikroszkópban is ellenőrizni a sejtkultúrákat.
Szinkronizáció
Szinkronizálás alatt azt értjük, hogy minden sejt
(de legalábbis a sejtek nagy többsége) a sejtciklus
ugyanazon fázisába kerül (pl. G1, S, G2). Ennek elérésére
széruméheztetést, timidint vagy egyéb kémiai
ágenst alkalmaznak, amellyel a sejteket valamelyik
fázisban megállítják, amíg az összes sejt ugyanazon
fázishoz nem ér. A helyes módszer megválasztása
sejtfüggő, és nem utolsó szempont a sejtek átlagos
ciklusidejének ismerete.
Az itt ismertetett protokoll szerinti szinkronizálás elvégzése
a HeLa sejtekben a sejtciklus G1/S fázisban
való szinkronizációját okozza, amely 1-2 sejtciklus
idejéig fennmarad:
• Növesszük a sejteket standard DMEM + 10%
FBS médiumban kb. 40% konfluenciáig.
• Adjunk a médiumhoz 2 mm végkoncentrációjú
timidint (törzsoldat legyen kb. 20-szoros; 40
mm oldva PBS-ben).
• Inkubáljuk 37 ºC-on 19 óráig (fontos az idő
betartása!).
• Mossuk a sejteket 3-szor steril PBS-sel.
• Adjunk friss (timidinmentes) médiumot, és
újabb 9 óráig inkubáljuk a tenyészetet 37 ºC-on.
• Ismét 2 mm timidint adjunk a médiumhoz és
inkubáljuk 16 óráig 37 ºC-on.
• A sejtek G1 fázisban vannak, új, timidinmentes
médiumban szinkronizáltan fognak belépni a
sejtciklus következő fázisába (S) [14].
A sejtszám monitorozása
Gyakorlattal rendelkező kutató a sejttenyésztő flaskán
áttekintve az oldat fényszórásából vagy a felületre
kitapadt, szabad szemmel is látható monolayerből is
jó közelítéssel meg tudja mondani, mennyi sejt található
a médiumban, vannak azonban ennél pontosabb
és informatívabb mérési lehetőségek.
Talán legegyszerűbb Bürker-kamra használata
[15], ahol az osztott felületű tárgylemez és 0,1 μm távolságra
lévő fedőlemez közé cseppentjük a sejtszuszpenziót,
majd mikroszkópban leszámoljuk a sejteket.
Elvégezhető festés nélkül is, de célszerű a sejtekhez
1:10 arányban 2%-os tripánkék oldatot adni. Ez az
ún. vitálfestés az élő sejteket nem, csak az elpusztult
sejteket festi kékre, így a sejtek száma mellett azok
viabilitását is megmérhetjük.
A Bürker- kamránál pontosabb eredményt kaphatunk,
ha sejtszámláló automatában is meg tudjuk
mérni a sejteket. A rutin klinikai laboratóriumokban
használt vérképes automaták ún. nyitott módban alkalmasak
homogén sejtszuszpenziók mérésére, és
szemben a Bürker- kamrában leszámolható néhány
száz sejttel, az automata több ezer sejtet mér le pillanatok
alatt. A fényszórási értékek ismeretében (forward
scatter, side scatter) a sejtek méretéről, morfológiájáról
is információt kaphatunk.
Nagyszámú sejtet tartalmazó mintában a sejtek
össztömege is informatív lehet, sőt teljes kiszárítás

214 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
előtt és után megmérve azt, a nedves és száraz súlyt is
megkapjuk. Pontos tömegméréshez analitikai mérleg
(0,1 mg-os érzékenység) és legalább 80-100 mg nedves
súlyú sejt kell. Az utóbbi mennyiség már elegendő
ahhoz, hogy elfogadható hibán belül tudjuk a sejtüledékről
a felülúszót leszívni és a súlymérést nedves és
száraz súly esetén is elvégezni.
A sejtek alkotóinak, pl. a DNS vagy a fehérjék izolálás
utáni mennyisége is egyenesen arányos a kiindulási
sejtmennyiséggel. Habár a fehérjemennyiség
meghatározása általában nem az elsőként választott
módszer sejtnövekedés ellenőrzésére, nagyon gyakran
alkalmazzuk viszonyítási alapnak egyéb sejtalkotók
koncentrációjának mérésekor. Ionok, pl. a
kalcium vagy a kis molekulák, metabolitok, pl. glükóz-6-foszfát
koncentrációját sejtfehérjére vonatkoztatjuk
(mmol/g protein vagy mg/g protein).
A sejtciklus követése
A mikroszkópos megfigyeléssel csak durva becsléssel
állapíthatjuk meg az osztódó sejtek számát,
azonban a sejtciklus egyéb fázisaiban lévő sejtek vizsgálatához
festés szükséges. A propidium-jodid fluoreszcens
festék, amely a kettős szálú DNS (vagy RNS)
láncaiba interkalálódva fest. Az élő sejt membránján
nem jut át a festék, viszont az elpusztult vagy fixált
sejtekbe bejut, és a festődés mennyisége arányos lesz
a sejtekben található DNS (RNS) mennyiségével. A
megfestett sejteket legkönnyebben áramlási citométerrel
(flow citométer) mérhetjük le, így minden
(több ezer) sejt fluoreszenciáját és az azzal arányos
DNS-mennyiségét külön-külön le tudjuk mérni.
A propidium-jodid-festés menete:
• Nagyjából 10 5 -10 6 , homogén, különálló sejtekből
álló szuszpenziót készítünk, PBS-ben mossuk.
• Lecentrifugáljuk (kb 8-10 s, pulzus üzemmódban),
majd 50 µL kivételével a felülúszót leszívjuk.
• A maradék 50 µL PBS-ben a sejteket alaposan
felkeverjük, majd cseppenként 1 mL jéghideg
(az eljárás elött fél órával -70 ºC-es hűtőben
hűthetjük le), 96%-os alkoholt adunk a mintához.
Minden csepp után vortexszel összekeverjük.
Ez a felszálló sorozatú alkoholkezelés fixálja
a sejteket, valamint kioldja a lipidkomponenseket,
így átjárhatóvá válik a sejtmembrán a propidium-jodid
számára.
• A mintát 2-szer mossuk PBS-ben. Az etanolfixált
sejtpellet könnyebben felkeveredik a felülúszó
leszívásakor, így fokozott óvatosság szükséges
e művelet elvégzésekor.
• A sejteket 1 mL propidium-jodid-oldatban
szuszpendáljuk fel (az oldat összetétele: PBS,
0,1% Triton X-100, 20 μg/ml propidium-jodid,
0,2 mg/ml RN-áz A). A Triton X-100 detergens,
a festék sejtbe való bejutását segíti elő, az RN-áz
A pedig a RNS molekulákat bontja le, így csak a
kettős szálú DNS fog jelölődni. A propidium-jodid
karcinogén, ezért megfelelő eővigyázatosság
szükséges! Bőrre kerülve bő vízzel azonnal mossuk
le!
• 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten,
sötétben,
• A mintákat mosás nélkül, azonnal vizsgálhatjuk
flow citométerrel, 610 nm hullámhosszú fluoreszcens
detekcióval.
10-1. ábra, a, b, c. Jurkat-sejtek propidium-jodid-festődése
(1)

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
215
Detektálás – A sejtkultúra állapotának
ellenőrzése, az állapot változtatása
10-2. ábra. Jurkat-sejtek propidium-jodid-festődése (1)
A 10-1. a, b, c ábra és a 10-2. ábra Jurkat-sejtek propidium-jodid-festődését
mutatja. A legnagyobb csúcs a
G0, G1 fázisban lévő sejtek (M1), a második, kisebb
csúcs a G2 fázisban lévő, dupla DNS-tartalmú, ezért
nagyjából dupla mennyiségű propidium-jodiddal jelölődött
sejtek számát adja meg (M3). A kettő közötti,
átmeneti régió az S fázisú, DNS-replikációt folytató
sejteket mutatja (M2). Ezeken a csoportokon kívül
előfordulhat nagyobb mennyiségű jelölés (triploid,
multiploid sejt, esetleg két vagy több sejt összetapadását
a műszer 1 sejtnek érzékeli) vagy kisebb (apoptotikus
vagy elhalt sejtek).
Apoptózis kimutatása
Az apoptózis fokának mérése egyrészt a sejttenyésztés
optimális körülményeinek beállítására is
kiválóan alkalmas, de még gyakrabban alkalmazzák
konkrét kísérletekben a sejtek életképességének felmérésére.
Az apoptózis több módon is detektálható,
pl. a DNS-fragmentáció vagy a kaszpázaktivitás mérésével,
továbbá a foszfatidil-szerin membrán transzlokációját
kimutató Annexin-V-vel.
Az utóbbi módszer esetén élő, fixálatlan sejteket
rövid (15 perc) ideig propidium-jodid és fluoreszceinnel
konjugált Annexin-V keverékével inkubáljuk.
A propidium-jodid az elhalt sejteket festi, míg az
Annexin-V minden olyan sejthez kötődik, amelyen
bekövetkezett a foszfatidil-szerin membrán transzlokációja.
A jelölés után flow citometriával detektálhatók
a sejtek.
Négy csoportot különíthetünk el:
1. Élő, egészséges (kettős negatív) sejtek.
2. Élő, apoptotikus (Annexin-V-pozitív, propidium-negatív)
sejtek.
3. Apoptózisban elhalt sejtek (kettős pozitív).
4. Nekrotizált sejtek (propidium-pozitív) [16].
Az immunhisztokémia, immunfluoreszcencia, Western
blot, Southern blot, PCR módszer alanyai természetesen
nagyon gyakran sejttenyésztésből származó
sejtek, minták. Valamennyi kísérleti technikát, mérési
módszert azonban lehetetlen itt részletesen tárgyalni.
Ehelyütt a korábban már említetteken kívül azokat
említjük meg, amelyek in vivo vizsgálják a sejteket,
vagy magával a sejttenyésztés technikájával mint
módszertannal összefüggésbe hozhatók.
A médium összetételének változása
A sejtkultúra állapotát nemcsak a sejtszám, a sejtosztódás
mérésén keresztül deríthetjük ki. A médium
rengeteg információt tartogat: a sejtek által elhasznált
anyagok vagy a sejtek által termelt és médiumba kiválasztott
anyagok vizsgálatának jelentős szerepe van.
Ilyenek pl.:
• glükóz, laktát, pH (a metabolizmus állapota,
növekedés nyomon követése),
• összetétel ellenőrzése (pH, ionok, aminosavak),
• felhasznált anyagok (pl. radioaktív izotóp felvétele),
• kiválasztott anyagok detektálása (laktát, export
fehérjék).
Különösen a sejtek által termelt fehérjék kerülnek
gyakran a megfigyelés középpontjába. Ezek lehetnek
– a teljesség igénye nélkül – hormonok, extracelluláris
mátrixfehérjék, immunglobulinok, de a sejtelhalás
termékei is: laktát-dehidrogenáz, kretin-kináz,
troponin stb. Fontos megjegyezni, hogy ez esetben a
szérumtartalmú médiumot szérummentesre kell cserélni,
majd bizonyos idő elteltével mintát gyüjteni a
fehérjék detektálásához. Túl rövid idő kis kiválasztott
fehérjemennyiséggel, túl hosszú pedig a széruméheztetésből
fakadó nem kívánt mellékhatásokkal jár;
alapesetben 24 óra után célszerű a mintavétel.
In vivo detektációs módszerek
A mikroszkóp minden sejtekkel foglalkozó laboratórium
elengedhetetlen kelléke. Szükséges egy invertált
mikroszkóp, amelynek tárgyasztalán a tenyésztőflaska
elfér, így bármikor ellenőrizhető a sejtek
osztódása, kitapadása, morfológiája.
Ha sejtünk fluoreszcens anyagot tartalmaz, pl.

216 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
Green fluorescent proteint (GFP-t) termel, vagy fluoreszcens
festéket juttattunk a sejtekbe (pl. Fluo3 festéket,
amely a Ca 2+ -hoz kötődve zölden fluoreszkál)
szükség lehet fluoreszcens mikroszkópra.
Fluoreszcens spektrofotometria alkalmazható; szintén
élő sejteket vizsgálnak, általában sejtszuszpenzióban,
de speciálisan kialakított küvettában fedőlemezre
kitapadt sejteket is elhelyezhetünk. Az előbb
említett Ca 2+ -festéket tartalmazó sejteket fotométerben
pontosabban és nagyobb számban mérhetjük
meg, mint mikroszópban.
Transzfekció
Transzfekciónak nevezzük azt a módszert, amikor
kívülről juttatunk a sejtbe nukleinsavat. Amennyiben
ezt vírussal tesszük, szokás transzdukcióról beszélni.
A transzfekció, transzdukció (amennyiben szándékos)
célja, hogy a sejtek fehérjeexpressziós profilját
megváltoztassa (akár új fehérjék termelődnek, akár
meglévők szintje nő vagy csökken), ezáltal a fenotípus
megváltozzék.
Mivel ezek a nukleinsavak meglehetősen nagy molekulák,
a sejtmembránon való átjutást elősegíti ún.
transzfekciós ágensek alkalmazása (lényegét tekintve
kationos lipid, liposzómát alkotva beolvad a sejtmembránba,
tartalmát a sejt belsejébe ürítve), vagy
elektroporáció felhasználása, amikor elektromos tér
hatásra ideiglenes pórusok, lyukak keletkeznek a
membránban. Vírus általi transzdukció is szóba jöhet,
amelynek előfeltétele, hogy a vírus genomjának tartalmaznia
kell az adott fehérjét kódoló szekvenciát.
A bejuttatni kívánt nukleinsavat leggyakrabban
expressziós vektorban (módosított plazmid) kódolják.
Sikeres transzfekció után a sejt termelni fogja
azt a fehérjét, amelyet a vektor kódolt. Egy GFP-t
kódoló szekvenciát beillesztve a vektorba (akár úgy,
hogy transzlációkor az expresszálni kívánt fehérjével
ún. kimérát, közös fehérjét alkosson a GFP, akár
két különálló fehérjetermékként) monitorozhatjuk a
transzfekció sikerességét.
A transzfekció lehet átmeneti vagy állandó. Az
utóbbi esetben a transzfektált szekvencia beépül a sejt
saját genomjába. Általában elegendő az ideiglenes
transzfekció, de ha stabil transzfekció a célunk, szükséges
egy szelekciós marker beépítése is. Ilyen pl. egy
toxikus anyag rezisztenciagénje. A geneticin (G418)
a legtöbb sejtre toxikus hatással van, de ha transzfektáljuk
a sejteket a rezisztenciagénnel (egy közös vektorban
más génnel együtt), akkor csak azok a sejtek
maradnak életben és szaporodnak, amelyek genetikai
állományában a vektor (és benne a rezisztenciagén)
stabilan megtalálható.
A géncsendesítés (RNA silence) fiatal módszer, de
gyorsan népszerű lett sokoldalú felhasználhatósága
miatt. Egy rövid (20–25 nukleotid hosszúságú), ún.
siRNS-t (short interfering RNA) juttatnak a sejtekbe,
amelyek egy adott, komplementer szekvenciájú gén
expresszióját csökkentik azáltal, hogy a messenger
RNS-hez kötődve annak lebomlását, degradációját
okozzák. Az siRNS-ekkel a sejtek természetes mechanizmusát
használjuk ki: normális sejt is használ
siRNS-t és mikroRNS-t, egyrészt a virális, parazitás
fertőzés elleni védekezőmechanizmusban, másrészt
az siRNS-ek a fehérjeexpresszió fontos szabályozó
elemei [17].
Állatkísérleti modellek
Előzmények
Természeténél fogva állatkísérlet végzése sokkal
régebbre tehető, mint a sejtes modellek. Már az
ókori görögöktől (Arisztotelész) és rómaiaktól
is maradtak feljegyzések állatkísérletek végzéséről.
Galenus a második században, mivel a római birodalomban
az emberi boncolás tilos volt, majmokon
és sertéseken elvégzett vizsgálatokból kiindulva és
azokat az emberi szervezetre is érvényesnek tartva
alapozta meg az anatómia, a patológia, a fiziológia, a
neurológia tudományát. Felfedezte, hogy az erek két
csoportba oszthatók: artériákra és vénákra, ugyanakkor
úgy gondolta, hogy ezek két különálló rendszert
alkotnak, a vénás vér a májban, az artériás a
szívben termelődik. Galenus keringési rendszerről
alkotott tanai egészen 1628-ig kitartottak, amikor is
William Harvey bebizonyította, hogy a szív pumpaként
keringteti a vért.
A XII. században az arab világban Avenzoar emberi
boncoláson kívül állatkísérleteket is alkalmazott
a sebészeti beavatkozásai tesztelésére, mielőtt embereken
végrehajtotta volna azokat. A középkorban és
azt követően is gyakori kísérleti alanyok voltak az
állatok, a „modern” tudomány pedig, habár számos
kritika érte és éri állatvédelmi szempontból, egyelőre
nem talált tökéletes helyettesítést, és továbbra is kénytelen
állatokat feláldozni a kísérletek oltárán.

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
217
Bevezetés
Állatkísérletekre általában akkor kerül sor, ha az
egyszerűbb modellek, mint pl. a sejtkultúrákon végzett
kísérletek sikeres, új felfedezéseket hoztak, vagy
igazoltak egy elméletet, és a kutatók szeretnék magasabb
szerveződési szinten is megvizsgálni az adott
problémát. Hasonlóan állatkísérleteket végeznek, ha
a felvetett tudományos cél eleve nem vizsgálható sejteken,
mert szöveti, szervi vagy szervrendszeri folyamatokat
kívánnak vizsgálni. Ehelyütt nincs mód arra,
hogy a számtalan kísérleti módszert ismertessük,
ezért a továbbiakban néhány általános szempontot
emelünk ki az állatokkal való tudományos munkával
kapcsolatban.
Mintavétel
Az állatkísérletek több csoportba oszthatók:
• Mintavétel nincs, az állatot „egészben” vizsgáljuk.
Megfigyelhető a viselkedése, a tünetei, megismerhető
afiziológiája, utódai, megvizsgálhatók
képalkotó eljárással, boncolással belső szervi
elváltozásai stb.
• Az állat „csak” a minta forrása, pl. bizonyos sejteket
izolálunk vagy bizonyos szöveteket, szerveket
(pl. izolált szívperfúziós kísérletek), amelyeken
azután magát a kísérletet elvégezzük.
• A különböző kezelésen átesett (pl. gyógyszerkipróbálás,
sebészeti beavatkozás stb.) állatokat
feláldozzuk, majd mintákat gyűjtünk különböző
szövetekből kísérletünk sikerességének tesztelésére.
A két utóbbi esetben a minta izolálása és feldolgozása
között eltelt idő és a minta tárolásának módja döntő
fontosságú. Az élő szervezetből eltávolított szövetek
megfelelő védelem nélkül gyorsan bomlásnak indulnak,
ezért az elsődleges (természetesen az etikai előírások
betartása mellett) a kísérlet megtervezésekor
a minta minél gyorsabb feldolgozása. Izolálás után
azonnal megfelelő hőmérsékletű és összetételű tápfolyadékban
tartva megnövelhető a szövetek, sejtek
élettartama. Folyékony nitrogénben való lefagyasztás
és tárolás célszerű, ha a mintavétel helyén nem lehetséges
az azonnali feldolgozás. Ha a mintából fehérjéket
szeretnénk izolálni, proteázinhibitort adjunk
a mintához, RNS izolálásához (amely, szemben a
DNS-sel, különösen labilis) kaphatók RNS-stabilizáló
oldatok szövetek számára (pl. Qiagen – RNAlater).
Vérvétel esetén, akárcsak a humán diagnosztikában,
elengedhetetlen megfelelő alvadásgátló kiválasztása
és mintagyűjtés után centrifugálás az alakos elemek
elválasztására.
A standardizálás elvei
Éppen az állati szervezetek bonyolultsága okán az
állatkísérleteket sokkal nehezebben lehet kivitelezni
standard körülmények között – nehezebben standardizálhatók,
hiszen a biológiai variabilitás sokrétűbb
(a sejtkultúrákhoz viszonyítva).
Néhány szempont, amely segítheti a standard körülmények
kialakítását:
• Állandó páratartalom, hőmérséklet, nappal-éjszaka
ciklus (12–12 óra).
• Ugyanazon időszakokban adagolt, ismert menynyiségű
táplálék és ivóvíz – az állatok által elfogyasztott
mennyiség feljegyzése, súlygyarapodásuk
regisztrálása.
• Csak hím vagy csak nőstény állat alkalmazása.
• Egyazon korú és hasonló súlyú állatok (a kísérleti
állatok életkora döntő faktor lehet bizonyos
kísérletek megtervezésekor).
• Idegrendszeri, viselkedésbiológiai vagy a tanulást,
a memória állapotát felmérő vizsgálatok
során, de sokszor egyéb esetben is (pl. hormonok,
adrenalin vagy akár vércukorszint mérésekor)
az állatot ért ingerek, az egymással való
összezárás megléte vagy hiánya is fontos szempont
lehet.
A felsorolt követelmények maximális betartása mellett
is nagy valószínűséggel nagyobb lesz a kísérleti
eredmények szórása, mint sejtkultúrákat vizsgálva.
Kísérleti állatfajok
A megfelelő állatfaj kiválasztása számos tényező
eredője:
• A kísérlet célja (pl. humán vonatkozás, gyógyszerkipróbálás
esetén az emberrel minél közelebbi
rokonságban lévő fajt érdemes választani).
• A szükséges esetszám (nagy esetszámhoz szapora,
gyorsan tenyészthető állat használata indokolt).
• A rendelkezésre álló „facility”-állatház felszereltsége.
• Az adott fajra jellemző szekvencia-adatbázis
elérhetősége (manapság már szinte az összes,
gyakran használt állatfaj genomja elérhető).

218 10. fejezet Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
• Specifikus, adott fajra jellemző tulajdonságok
vizsgálata.
• Költségek: „cost–benefit”.
A leggyakrabban használt fajok a következők:
Emlősök: egér, patkány, macska, kutya, sertés, majom.
Rovar: Drosophila melanogaster (ecetmuslica –
klasszikus, de máig használt alanya a genetikának,
egyedfejlődése mindössze 7 napig tart).
Halak: zebrahal (zebradánio – gerincfejlődés, genetika).
Újabban elérhetővé váltak genetikailag módosított
vagy ritka mutációval rendelkező állatok is. Néhány
példa:
• ún. knockout egerek, amelyek valamely génje
mesterségesen el lett némítva;
• ZDF (Zucker Diabetic Fatty) patkányok [18]
2-es típusú diabetes betegséggel rendelkeznek;
• a GFP állatok [19] genetikai állományát úgy
módosították, hogy a GFP fluoreszcens fehérjét
termeljék a sejtjeik.
Az állatkísérleti modellek előnyei
• Összetettebb rendszer, emberi fiziológiára,
humán kutatásokra könnyebben adaptálhatók.
• Több szervet, szövetet lehet egyszerre vizsgálni.
• Primer sejteket lehet izolálni különböző szövetekből.
• Műtéti eljárások kidolgozása és nyomon követése.
• Több szerv, szövet kölcsönhatásáak vizsgálata.
• Daganatok terjedésének vizsgálata.
• A keringési rendszer vizsgálata (szívizom teljesítménye,
érrendszer állapota bizonyos hatásokra).
• Magasabb idegi funkciók vizsgálata (tanulás,
memória, viselkedés, magatartás).
Az állatkísérleti modellek hátrányai
• Etikai engedély köteles.
• Összetett rendszer, sokkal körülményesebb
standardizálni a sejtvizsgálatoknál. Nagyobb a
szórás, ebből következőleg nagyobb esetszám
szükséges.
• „animal facility” állatház fenntartása szükséges.
• Költségesebb.
• Kísérlet időtartama általában hosszabb.
• A kísérleti szerek, gyógyszerek hatásos dózisa
nehezen számítható ki. A készítményekből jóval
nagyobb mennyiség szükséges, ami megdrágítja
a kísérletet. Sokszor nem adható be a kísérlet
szempontjából szükséges dózis, mert az állat
elpusztulna, holott az általunk vizsgálni kívánt
szerv, szövet még elviselné az adott dózist.
Etikai megfontolások
Míg a sejtkultúrákhoz meglévő sejtvonal esetén
etikai engedély általában nem szükséges (kivéve az
őssejtkutatásokat), addig az állatkísérletek engedélykötelesek.
Az ismertetendő magyarországi törvényi
szabályozás előírja a következőket [20]:
• Az állatkísérleteknek indokoltnak, tudományosan
megalapozottnak kell lennie. Bizonyítani
kell, hogy más módon az adott kísérlet nem
végezhető el (pl. alapvető sejtélettani funkciók
vizsgálatához elegendő sejtkultúra, de a keringési
rendszer vizsgálata csak magasabb rendű,
élő szervezet segítségével lehetséges).
• Biztosítani kell, hogy a legkevesebb, még elégséges
számú állatot, a lehető legkíméletesebb
módon használunk fel a tudományos kísérlet
során.
• Alapos dokumentáció szükséges minden egyes
állatról.
• Az engedélyért való kérelmet a Munkahelyi
Állatkísérleti Bizottsághoz (MÁB) kell benyújtani.
Idézet a 1998. évi XXVIII., Az állatok védelméről
és kíméletéről szóló törvényből:
25. § (1)
(2) Állatkísérlet kizárólag nyilvántartásba vett
intézményben és engedély alapján végezhető.
(4) Állatkísérlet kizárólag akkor engedélyezhető,
ha annak elvégzését
a) az ember, a gerinctelen és gerinces állatok
vagy növények betegségének, kóros egészségi
állapotának, egyéb rendellenességének elkerülése,
megelőzése, felismerése és gyógyítása,
valamint azok élettani állapotának feltárása,
felderítése, szabályozása vagy módosítása érde-

Sejtkultúrák, sejttenyésztés a klinikai kutatásban
219
kében gyógyszerek, élelmiszerek, egyéb adalékanyagok
vagy termékek fejlesztése, termelése,
minősítése, hatékonyságának és ártalmatlanságának
vizsgálata,
b) az emberek vagy állatok egészsége vagy
jólléte érdekében a természetes környezet védelme,
c) tudományos kutatás,
d) oktatási és gyakorlati képzés, vagy
e) igazságügyi orvostani vizsgálatok elvégzése
teszi szükségessé.
(5) Az engedélyezés során – a kérelmező által
benyújtott dokumentáció, továbbá az állategészségügyért
felelős miniszter (a továbbiakban: miniszter)
által felkért szakértői testület véleménye
alapján – különösen figyelembe kell venni:
a) az állatkísérlet elvégzésének indokoltságát
és tudományos megalapozottságát.
27. § (1) Az állatkísérlet során felhasznált állatok
számát a feltétlenül szükséges mértékre kell csökkenteni.
Azt a vizsgálati módszert kell választani,
amely előreláthatóan a legkisebb fájdalom okozásával,
illetőleg legkisebb élettani, idegi vagy viselkedésbeli
károsodás mellett végezhető el.
(2) Az állatkísérletről és az állatot ért beavatkozásról
részletes jegyzőkönyvet kell felvenni.
(3) Minden kísérletet úgy kell megtervezni,
hogy elkerülhető legyen a szükségtelen fájdalom,
szenvedés, tartós nélkülözés, ill. maradandó károsodás
okozása.
6. § (1) Állatkísérlet csak az illetékes állomás által
kiadott engedély alapján végezhető. A Munkahelyi
Állatkísérleti Bizottság (a továbbiakban:
MÁB) által jóváhagyott állatkísérlet engedélyezése
iránti kérelmet a 2. számú melléklet szerint
kell benyújtani az állomáshoz. Az állatkísérlet
engedélyezése iránti kérelem elbírálása során az
állomás az Állatvédelmi Tanácsadó Testület Állatkísérleti
Tudományos Etikai Tanácsának (a továbbiakban:
Etikai Tanács) véleményét kikéri. Az
engedély – a rendeletben meghatározott kivételekkel
– a kiadásától számított legfeljebb öt évig
érvényes.
Irodalom
[1] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/d7/Henrietta_Lacks_%281920-1951%29.jpg
[2] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/
4c/HeLa_Hoechst_33258.jpg
[3] Takahashi, K., Yamanaka, S.: Induction of pluripotent
stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast
cultures by defined factors. Cell 126(4):663–676,
2006.
[4] http://www.medica.co.nz/media/catalog/product/cache/
2/image/265x265/5e06319eda06f020e43594a9 c230972
d/f/i/file_55_26
[5] www.atcc.org
[6] http://www.enasco.com/prod/images/products/50/
AC104062l.jpg
[7] http://i00.i.aliimg.com/img/pb/383/602/312/3126023-
83_941.jpg
[8] http://www.hellopro.fr/images/produit-2/0/2/3/grattoir-cell-scraper-longueur-manche-180-mm-430320.jpg
[9] http://www.millipore.com/images/xl/MB4163-06[681-
ALL].jpg
[10] http://www.usascientific.com/productimages/14209-
100_300.jpg
[11] http://www.cellcryogenics.com/
[12] http://www.ccos.ch/userfiles/CMS/189187_lagerung_
staemme_in_fluessigem_stickstoff_jpg.jpg
[13] http://image.wistatutor.com/content/plant-growthmovements/growth-curve.jpeg
[14] http://mousely.com/wiki_image/c/c4/Cell_cycle.png
[15] http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/imagecache/preview/image005.jpg
[16] http://www.biotech.uiuc.edu/images/Annexin_IMG-
%202.jpg
[17] http://www.retrogen.com/images/siRNA_diagram1.
jpg
[18] http://www.criver.com/SiteCollectionImages/Images_255x164/rm_rat_obese_black_hood1_0027_lres.
jpg
[19] http://www.biolreprod.org/content/78/3/425/F3.large.jpg
[20] 1998. évi XXVIII. Törvény az állatok védelméről és
kíméletéről
[21] Paul, J.: Cell and tissue culture. 3 rd Ed. E. & S. Livingstone
Ltd., Edinburgh-London, 1965.
[22] Parker, R. C.: Methods of Tissue Culture. 3 rd Ed., P.
Hoeber, New York, 1961.
[23] http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_culture
[24] http://userpages.umbc.edu/~jwolf/method5.htm

11. A fehérjekutatás modern módszereinek
alkalmazása a klinikai patológiában –
Az új módszertanok klinikai hasznosulása
az orvosi kutatólaboratóriumban
A vérszérum és a vérplazma
fehérjevizsgálatai
Tőkés-Füzesi Margit
Az érpályában keringő vér mennyisége felnőttekben
4-5 liter, amely alakos elemeket és plazmát tartalmaz.
Vérvétel után in vitro körülmények között ezeket
centrifugálással választják el. Amennyiben vérvételkor
alvadásgátlót használunk (heparin, kalciumkötő
kelátképzők, EDTA, citrát), a centrifugálás után kapott
vér felülúszója a plazma. A natív, alvadásában
nem gátolt teljes vér felülúszója pedig a szérum.
A plazmában ez idáig több mint 360 fehérjét azonosítottak.
Nagy részük a májban termelődik, kivéve
az immunglobulinokat, amelyeket plazmasejtek
termelnek. Aminosavakból épülnek fel, poszttranszlációs
módosuláson esnek át, ennek eredményeként
legtöbbször kovalens kötéssel szénhidrátmolekula
kapcsolódik hozzájuk (glikozilált fehérjék). Biológiai
szerepük szerint két csoportba oszthatók:
• Vannak olyan fehérjék, amelyek szerepüket extracellulárisan
töltik be. Ezek mennyisége szervvagy
szövetkárosodáskor csökken.
• A fehérjék másik csoportja sejtalkotó, ezek
mennyisége viszont szerv- vagy szövetkárosodás
esetén általában nő.
A plazmafehérjék általános áttekintése
A plazmafehérjék fő funkciói
1. A plazma kolloidonkotikus nyomásának fenntartása,
ebben a fő szerep az albuminé.
2. Transzportáló szerep, szállítófehérjék révén; a szállítandó
anyagok:
• metabolitok (pl. lipidek);
• hormonok (pl. tiroxin);
• fémionok (pl. kalcium, vas, réz);
• bilirubin,
• gyógyszerek, toxikus molekulák.
3. Részvétel a szervezet védekezésében (immunglobulinok,
komplementrendszer).
4. A véralvadás és a fibrinolízis fehérjéi.
5. Pufferszerep, részvétel a pH-szabályozásban.
6. A plazmában sajátosan betöltött szerep pl. proteázgátlók,
enzimek, növekedési faktorok stb.
A plazmafehérjék vizsgálati lehetőségei:
1. Mennyiségi meghatározás:
• Biuretmódszer (peptidkötés reakciója rézionokkal).
• Festékkötés (pl. az albumin reakciója brómkrezolzöld
festékkel).
• Homogén immunoassay:
- nefelometria;
- turbidimetria;
- particle enhanced immunoassay.
2. A plazmafehérjék elektroforetikus elválasztása után,
különböző detektálási lehetőségekkel:
• Mancini-technika.
• Rocket-elektroforézis.
• Immunelektroforézis.
• Immunfixáció.
• Lipoprotein elektroforézis.
• Izoenzim vizsgálat.
3. Funkció szerint: pl. enzimek fotometriás meghatározása.

222 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Plazmafehérje-csoportok és vizsgálatuk
Összfehérje
A szérumban található összfehérje (total protein, TP)
mennyiségének meghatározására általánosan a biuret
módszert használjuk. A réz(II)ionok alkalikus
közegben kötődnek a peptidkötésekhez, ennek eredményeként
fotometriásan jól mérhető ibolyaszínű
fémkomplex vegyület keletkezik. A szín intenzitáserőssége,
ill. az 540 nm-en mért fényabszorbancia
egyenes arányban van a peptidkötések számával, így
a fehérjekoncentrációval. A fehérjékben található
aminosavak közül az aromás aminosavak UV fényben
280 nm-en nyelnek el, míg a peptidkötések 220
nm-en. Elméletileg ez is alkalmas a plazmában/szérumban
található összfehérje mennyiségi meghatározására,
azonban az albuminhoz kötött bilirubin zavarja
a mérést, ezért a mindennapi gyakorlatban nem
használják a módszert.
A plazmában normál körülmények között 60-80
g/l összfehérje található. Kóros körülmények között
szintje emelkedhet vagy csökkenhet.
Emelkedik az összfehérje a következő állapotokban:
• Dehidráció folyamán (ilyen esetekben nő a
hematokrit, a nátriumion- és az albuminszint
is).
• Emelkedett immunglobulin-szintézis (mono-,
poliklonális eredet).
Csökken az összfehérjeszint a következő állapotokban:
• Zavart fehérjeszintézis (pl. malnutritio, krónikus
májbetegség, malabsorptio).
• Fokozott fehérjevesztés (történhet a vesén, a
gyomor-bél traktuson, ill. a bőrön keresztül).
• Fokozott hidráció (ez iatrogén körülmények
között fordulhat elő).
Albumin
Az albumin meghatározására a szérumban alkalmazható
a bróm-krezol-zöldet (BCG) használó festékkötéses
módszer, valamint az immunológiai módszert
alkalmazó turbidimetria és nefelometria. Mennyiségét
tekintve a legjelentősebb plazmafehérje, szintje
35-50 g/l. Az albumin 66 kDa molekulatömegű, a
májban termelődő egyetlen olyan fehérje, amely nem
glikozilált. Féléletideje 20 nap. A legfontosabb kötőés
szállítófehérje (metabolitok, kalciumion, bilirubin,
zsírsavak, foszfolipidek, aminosavak, hormonok és
gyógyszerek). A kolloidonkotikus nyomás fenntartásában
a legjelentősebb, ezen kívül aminosav-,,raktárt”
képez a perifériás szövetek fehérjeszintéziséhez,
és antioxidáns szerepe is van.
Hypoalbuminaemia, azaz alacsony albuminszint
alakul ki a plazmában a következő állapotokban
• Csökkent szintézis (akut és krónikus májbetegségekben).
• Analbuminaemia; ritka autoszomális receszíven
öröklődő megbetegedés, ahol az albuminkoncentráció
maximum 10%-a a normálisnak.
• Megoszlási zavar: oka a fokozott kapillárispermeabilitás,
amelynek eredményeként a fehérjék
az extravasalis térbe jutnak (pl. égés, ascites).
• Fokozott katabolizmus (pl. trauma, sebészeti
beavatkozás, infekció, malignus betegség).
• Fokozott vesztés során, amely történhet:
- a vesén keresztül (pl. nephrosis-szindróma);
- a gyomor-bél traktuson át (pl. Crohn-betegség,
ulcerativ colitis);
- bőrön át (pl. égés után).
A plazmafehérjék elektroforézise
A szérumfehérjék elektroforetikus elválasztása során
a fehérjék elektromos térben töltésük és méretük
alapján válnak szét. A szérumban található fehérjék
izoelektromos pontja (pK) 2,4-6,4 között van, ami
azt jelenti, hogy elválasztásukhoz használhatnánk 2,4
pH-nál alacsonyabb savas puffert, azonban ebben a
közegben a fehérjék kicsapódnának. Ezért a módszerhez
lúgos pH-jú puffert alkalmazunk, amelyben a fehérjék
negatív töltést mutatnak, így elektromos térben
a katódtól az anód felé vándorolnak. A hordozó szilárd
fázis lehet papír, cellulóz-acetát-membrán, agar-,
agaróz-, poliakrilamid-gél stb. Tiselius, az elektroforézis
leírója (1930) nem használt hordozót, szabad
elektroforézist végzett. Elválasztás után a fehérjéket
fixáljuk, majd fehérjefestékkel (Ponceau, amidofekete
vagy Coomassie blue) megfestjük. Az így kapott
elektroforetogramot egyrészt szemikvantitatív módon
vizuálisan, másrészt különböző hullámhosszon denzitometriásan
értékeljük, így a frakciók százalékos
aránya pontosan megadható. Cellulóz-acetát-fólián

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai
223
vagy agarózgélben való elválasztás után amidofekete
festéket használva 5 frakciót kapunk: albumin, α 1
, α 2,
β és γ frakció (11-1. ábra).
A dysproteinaemiák a szérumfehérjék összetételében
létrejövő kvalitatív és kvantitatív elváltozások,
amelyek szorosan kapcsolódnak a különböző kórképekhez.
Ezek különböző fehérjéket vagy fehérjecsoportokat
érintenek (mennyiségük a betegség
állapotának megfelelően nő vagy csökken), és a szérumfehérje-elektroforetogramon
jól felismerhetők
(11-1. táblázat). A szérumfehérje-elektroforetogramon
látható leggyakoribb patológiás eltéréseket a 11-
2. ábra mutatja be.
11-1. ábra. Normál szérumfehérje-elektroforetogram
11-1. táblázat. Dysproteinaemiák
Fehérje vagy fehérjecsoport
albumin
akut fázis fehérjék
prealbumin-transzferrin
csoport
immunglobulinok
poliklonális
gammopathia
monoklonális
gammopathia
oligoklonális
gammopathia
izolált fehérjeelváltozás
extrafrakciók
Kvalitatív vagy kvantitatív elváltozás
koncentrációja minden olyan esetben csökken, amikor a globulinok abszolút mennyisége
nő, annak ellenére, hogy az összfehérjeszint általában a referenciatartományon belül
marad
az α 1
- és α -frakcióban vándorolnak;
2
mennyiségük akut gyulladásban 50-300%-kal is emelkedhet, csökken viszont akut hepatitisben,
krónikus aktív májbetegségben és fehérjevesztéses állapotban
a prealbumin (transztiretin) az albumin előtt vándorol, 50-70%-a a retinolkötő fehérjével
komplexben található; fehérje- és energiahiányos állapotban mennyiségük csökken;
a transzferrin a b-frakcióban található, vashiányban mennyisége nő;
a transztiretin-transzferrin fehérjecsoport mennyisége akut és krónikus gyulladásokban
csökken - ún. negatív akut fázisfehérjék
a γ-frakcióban, ill. bizonyos mértékben a β-frakcióban vándorolnak, a szervezet védekezésében
vesznek részt;
az immunglobulinszint emelkedését gammopathiának nevezzük
a g-globulin-szint emelkedése a humorális immunválaszt aktiváló betegségek hatására
monoklonális, éles határú M-csík (extrafrakció) a globulinrégióban;
a hátterében egy plazmasejtklón által túlzott mértékben termelt immunglobulin (Ig)
vagy immunglobulin-fragmentum áll
egy vagy több Ig-osztály vagy -alosztály mennyiségének szelektív növekedése;
a g-globulin-frakcióban egy vagy több extrafrakció található (fűrészfog-mintázat)
ritkán detektálható, kivéve az albumint, az α 1
-antitripszint és az IgG-t
ezek a normál fehérjeképben megjelenő ,,extra” fehérjecsúcsok atípusosan a normál csúcsok
között vagy azokra rátevődve jelenhetnek meg, akkor válnak láthatóvá, ha mennyiségük
meghaladja a 2 g/l-t;
az éles határú fehérjecsúcsok és -sávok hátterében monoklonális immunglobulinok,
szabad könnyűláncok, ill. nehézláncok állnak; ezek a γ- és a β-régióban találhatók, és
M-proteinnek (monoklonális) vagy régi szóhasználattal paraproteinnek nevezzük őket

224 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
n
α-fetoprotein (AFP)
A magzati élet során a máj által termelt fehérje, a
magzati albuminnak felel meg. Születés után szintje
csökken, és a 8-12 hónapos korra éri el a felnőttben is
mérhető szintet (< 10 µg/l). Szerepe nem ismert. Terhességben
az anya véréből, ill. az amnionfolyadékból
meghatározva alkalmas velőcső-záródási rendellenességek
(az AFP-szint nő), valamint Down-szindróma
(az AFP-szint csökken) kiszűrésére. Felnőttkorban
az AFP tumormarkerként használható nagy rizikójú
betegcsoportokban, így hepatitis C- és krónikus hepatitis
B-fertőzésben szenvedő betegeknél hepatocelm
A A A
k
h
m
A A A
11-2. ábra. Kóros szérumfehérje-elektroforetogramok
A különböző frakciókban vándorló
jelentősebb fehérjék rendellenességei
betegségekben
Az albuminfrakcióban található fehérje
Lényegében az albumin, amelyet az előzőekben mutattunk
be.
Az α 1
-frakcióban található fehérjék
α 1
-antitripszin (α 1
-AT)
Szerin-proteáz-inhibitor (serpin, α 1
-proteáz-inhibitor),
irreverzibilis komplexet képez az elasztázzal,
a kimotripszinnel, a tripszinnel, valamint a trombinnal,
és inaktiválja őket. Több mint 75 genetikai
variáns ismert, ezek közül azonban csak néhány jár
együtt klinikailag releváns α 1
-antitripszin-hiánnyal.
Az elektroforetikus mobilitás alapján is több variánst
azonosítottak, F, M, S és Z betűvel jelölve ezeket.
Az α 1
-AT akut fázis fehérje. Plazmakoncentrációja
a genotípustól függ. A Pi MM variáns, amely
az europid populáció 93%-ában fordul elő, normál
α 1
-AT-szinttel jár együtt. A populáció kb. 7%-ában
mutatható ki genetikai eltérés, amely közepesen súlyos
vagy súlyos α 1
-AT-hiánnyal jár együtt. Ezek közül
a Pi ZZ variáns a legjelentősebb, prevalenciája
1:1600 (a „Pi” rövidítés a proteáz-inhibitorra utal).
Az α 1
-antitripszin-hiány pulmonalis emphysemával
és májbetegséggel jár együtt. Az emphysema oka,
hogy az α 1
-AT nem gátolja a neutrophil granulocytákból
felszabaduló elasztáz működését, és ez károsítja
a tüdő állományát.

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai
225
lularis carcinománál. Szintje magasabb lehet a gonadokból
kiinduló tumorok esetén is.
Az α 2
-frakcióban található fehérjék
Cöruloplazmin (Cp)
A májban termelődő és redoxi sajátossággal rendelkező
metalloprotein, amely a rézionokat szállítja.
Ferroxidáz aktivitása révén befolyásolja más fémek,
így a vasion státusát, antioxidáns hatást fejt ki azáltal,
hogy gátolja a sejtmembránlipidek fémion katalizálta
oxidációját. Akut fázis fehérje. Szintje a szérumban
csökken veleszületett cöruloplazminszintézis-zavarban,
Wilson-kórban, Menkes-szindrómában és táplálkozási
rézhiányban. Ez utóbbi vasrefrakter hypochrom
microcytás anaemia kapcsán vetődhet fel.
Haptoglobin (Hp)
A májban termelődik. A Hp1 és Hp2 allélokat kódoló
gének három strukturálisan különböző fenotípust
hoznak létre: Hp1-1, Hp2-1 és Hp2-2. Szérumkoncentrációja
minden egyén esetén ezek típusától
függ, ezért referenciatartománya is viszonylag széles
(0,3–2,0 g/l). Akut fázis fehérje, mely a széteső vörösvértestekből
felszabaduló hemoglobint köti meg.
Szintje csökken hemolítikus anaemiákban, akut és
krónikus májbetegségekben, valamint malabsorptiós
szindrómában. Veleszületett haptoglobinhiány ritka.
α 2
-makroglobulin
A szérumban található legnagyobb fehérje, molekulatömege
820 kDa. Vesebetegségben sem jut át a
glomerulusokon. Endopeptidázokat, így tripszint és
kimotripszint köt meg, ezáltal inaktiválva őket. Szintje
emelkedik nephrosis-szindrómában, májcirrhosisban
és bizonyos kollagénbetegségekben.
A β-frakcióban található fehérjék
C-reaktív protein (CRP)
1930-ban írták le, nevét onnan kapta, hogy kötődve
a pneumococcus C poliszacharidhoz a kórokozót
agglutinálja. Klasszikus akut fázis fehérje, amely a
májban termelődik proinflammatorikus citokinek,
így IL-6, IL-1 és TNF hatására. Akut gyulladásos folyamatokban
szintje a plazmában 6-12 óra után kezd
el emelkedni, csúcskoncentrációját 48 óra után éri el
és 1-2 hét alatt normalizálódik. A CRP az endogén és
exogén ligandok széles skálájához (mikroorganizmusok,
apoptotikus sejtek, DNS) képes kapcsolódni és
opszonizálni azokat, ezáltal elősegítve a fagocitózist.
A laboratóriumokban meghatározott CRP-koncentráció
mértékét a klinikumban széles körben
használják fel, ezek a következők:
• Fertőzés diagnózisának megerősítése és monitorozása
pl. posztoperatív állapotokban, intenzív
terápiás betegek, újszülöttek, traumás betegek
kezelésekor, szülészeten korai burokrepedéskor.
• Antibiotikumterápia hatásosságának megítélése.
• Vírusok és baktériumok okozta lázas állapotok
differenciáldiagnózisára (pl. meningitis, pneumonia).
• Bizonyos autoimmun gyulladások aktivitásának
megítélése (rheumatoid arthritis, vasculitis).
• Akut és krónikus gyulladásos betegségek diagnózisának
megerősítére (malignus betegségeket
kísérő krónikus gyulladásban is emelkedik a
szintje).
• Atherosclerosisos betegek hs-CRP- (high sensitivity
CRP) szintjének mérésével cardiovascularis
rizikóbecslésre.
Transzferrin
A plazmában a vasat szállítja a felszívódás és a lebomlás
helyéről a felhasználás helyére. A legjelentősebb
,,vasfelhasználó szerv,, a csontvelő, ahol a vas a
képződő vörösvértestek hemoglobinjába épül be. Egy
transzferrinmolekula két vasiont képes megkötni és
szállítani. Egészséges egyének transzferrinmolekulái
csak 30%-ban telítettek. Szintje csökken fehérjevesztéses
állapotokban, elsősorban vesebetegségekben,
valamint fertőzésekben és gyulladásokban (negatív
akut fázis fehérje). Vashiányos anaemiában szintje
megemelkedik.
b 2
-mikroglobulin
Kis molekulatömegű fehérje (12 kDa), amely minden
magvas sejt sejtmembránjában megtalálható, az
MHC I molekula β-lánca. Ennek ellenére elsősorban
a myeloid és lymphoid sejtekből kerül a plazmába.
Egészséges egyénekben fiziológiás sejtregeneráció
esetén szintézise állandó. A veseglomerulusokban
szabadon filtrálódik, a tubulussejtekben pedig viszszaszívódik.
Szérumban mérhető koncenrációja a

226 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
szintézis és a kiválasztás mértékétől függ, egészségesekben
egyensúlyban van. A klinikumban elsősorban
lymphomák, myeloma multiplex és vesebetegségek
monitorozására használják.
A γ-frakcióban található fehérjék – Az immunglobulinok
Immunglobulinok
A B-sejtekben termelődnek és a szervezetben a humorális
immunválaszban vesznek részt. Minden egyes
immunglobulin-molekula négy polipeptidláncból
épül fel, amelyek egymáshoz kovalens diszulfidkötésen
keresztül kapcsolódnak: egy pár nehézláncból és
egy pár könnyűláncból áll. A nehézláncoknak öt (γ,
α, μ, δ, ε), a könnyűláncoknak pedig két típusa ismert
(κ, λ). Mindkét lánctípus tartalmaz egy variábilis (V)
régiót (antigénfelismerő hely), a Fab fragmentumon
belül és egy konstans (C) régiót, nehézlánc esetében
az Fc, könnyűlánc esetében az Fab fragmentumon
belül. Az immunglobulin-osztályok legfontosabb tulajdonságait
a 11-2. táblázat mutatja be.
Az immunglobulin-molekulák nagyfokú változékonyságát
a genetikai szinten bekövetkező nehéz- és
könnyűlánc-génátrendeződés biztosítja. Sorrendben
ez előbb a nehézlánc szintjén történik meg, majd a
könnyűláncoknak előbb a két κ génje rendeződik át,
és csak azután a λ láncé. Ezzel magyarázható a B-sejtek
szintjén a 2:1 kimutatható κ:λ arány.
Újszülöttek szérumában IgA és IgM csak rendkívül
kis mennyiségben vagy egyáltalán nem mutatható ki.
Viszont az IgG, amely elsősorban anyai eredetű (placentán
keresztül jut át), nagy koncentrációban mérhető,
szintje születés után azonban csökkenni kezd. Az
immunglobulinok koncentrációja fokozatosan emelkedve
éri el az egészséges felnőttre jellemző értéket.
Az immunglobulinok szintézisének két fontos eltérése
van:
• Hypogammaglobulinaemiával járó csökkent
szintézis.
• Hypergammaglobulinaemiát eredményező túltermelődés.
Az immunglobulin-termelődés csökkenésének oka lehet
veleszületett vagy szerzett. Veleszületett hiányos
állapotban egy vagy több immunglobulin-osztály
vagy -alosztály termelődése zavart szenvedhet. Ennek
eredményeként ezek a gyerekek sokkal fogékonyabbá
válnak a különböző fertőzésekre. A felnőttkorban
jelentkező immunglobulinszintézis-zavarok
általában más betegséghez társulva jelentkeznek; így
pl. lymphomák, myeloma multiplex, gyógyszerek, toxinok
hatására, fehérjevesztéses állapotokban fordulnak
elő.
Az immunglobulinok túltermelődése lehet diffúz és
diszkrét.
Diffúz hypergammaglobulinaemiában egy betegség
(pl. fertőző betegség, májbetegség, autoimmun betegség)
váltja ki a nagyszámú B-sejt-klón által termelődő
immunglobulin-szaporulatot, a prezentálódó
antigének sokaságát. Ilyen esetben tehát nagyszámú
különböző tulajdonsággal, primer szerkezettel és fi-
11-2. táblázat. Az immunglobulin-osztályok fő tulajdonságai
Tulajdonság IgG IgA IgM IgD IgE
nehézlánc γ Α μ δ ε
nehézlánc-alosztályok γ 1
, γ 2
, γ 3
, γ 4
, α 1
, α 2
μ 1
, μ 2
nincs nincs
molsúly (kDa) ~ 150 ~ 150–400 ~ 900 ~ 175 ~190
J lánc nincs Van van nincs nincs
szérumkoncentráció (g/l) 8,0–18 1,1–5,0 0,6–2,2 < 0,03 < 0,02
féléletidő a szérumban (nap) 21 6 10 3 2
komplementaktiváció igen ritkán igen nem nem
opszonizáció igen gyenge nem nem nem
anaphylaxia nem nem nem nem igen

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai
227
zikai kémiai tulajdonsággal rendelkező specifikus antitestmolekula
keletkezik, amelyek különböző vagy
ugyanabba az immunglobulin-osztályba sorolhatók.
A szérumfehérje-elektroforetogramon ez elmosódott
széles sáv képében jelentkezik a γ-frakció területén,
és poliklonális gammopathiának nevezzük. Poliklonális
gammopathiával járnak együtt az akut és krónikus
fertőzések és gyulladásos megbetegedések, májbetegségek,
autoimmun folyamatok és a szisztémás malignus
megbetegedések.
Diszkrét hypergammaglobulinaemiában az antigén-,,felismerés,,
szempontjából, szerkezetileg és
funkcionálisan egyforma immunglobulin-molekula
és/vagy töredéke termelődik nagy mennyiségben.
Ezt monoklonális proteinnek (M-protein, régi elnevezése
paraprotein) nevezzük, ami myeloma multiplexben,
Waldenström-macroglobulinaemiában és
más lymphoproliferativ betegségben fordul elő. Monoklonális
szintézisük eredményeként minden egyes
M-protein csak egyetlen immunglobulin-osztályba,
-alosztályba, allo-típus osztályba és lánctípusba tartozik.
Az M-proteinek szerkezete általában a normális
immunglobulinéhoz hasonló. A szérum- és vizeletfehérje-elektroforetogramon
az M-protein-molekulák
egyformasága egy éles, keskeny alapú, diszkrét csík
formájában jelentkezik. Denzitometriás értékelés
után az extrafrakció neve M-protein, M-gradiens, ill.
M-csúcs. Mobilitás szempontjából az α-frakciótól a
γ-frakció végéig lehetnek jelen. Legtöbb esetben rajta
kívül normál poliklonális immunglobulin is kimutatható.
Azokat a betegségeket, amelyek monoklonális
immunglobulin termeléssel, így M-gradiens jelenlétével
járnak együtt, monoklonális gammopathiáknak
vagy plazmasejt-dyscrasiáknak nevezzük. Hátterükben
egy immunkompetens B-sejt ellenőrizetlen, néha
tumoros szaporodása áll.
Immunfixációs elektroforézissel való tipizálás után
az M-protein a következőképpen jelenhet meg:
• Egy osztályba és egy típusba tartozó monoklonális
immunglobulin, pl. IgG k, IgA l stb.
• Egy típusú monoklonális szabad könnyűlánc,
pl. k vagy l (szérumban meghatározva szabad
könnyűlánc, vizeletben Bence-Jones-fehérje az
elnevezése).
• Szabad nehéz- (H-) lánc vagy F c
-rész, pl. α, γ és
μ lánc vagy F c
fragmens.
• Különböző monoklonális immunglobulinok:
bi-, tri- és multiklonális gammopathia.
Malignus monoklonális gammopathiát okozó
B-sejt-dyscrasiák:
• Plazmasejt eredetű (myeloma multiplex, soliter
csontplasmocytoma, extramedullaris myeloma).
• IgM-et termelő lymphoplasmocytás sejtek
(Waldenström-macroglobulinaemia).
• B-sejt eredetű (krónikus lymphocytás leukaemia,
hajas sejtes leukaemia).
• Könnyűláncot termelő B-sejtek, amelyek amyloid
formájában kicsapódhatnak.
A benignus vagy premalignus monoklonális gammopathiákat
MGUS (monoclonal gammopathies with
undetermined significance, monoklonális gammopathiák
nem meghatározott jelentőséggel) néven ismerjük.
Ezekben az esetekben is jelen van az M-protein,
de myelomára vagy B-sejt-malignitásra utaló tünetek
nincsenek. Fontos tudni, hogy milyen tünetek megjelenésekor
ajánlatos a beteget monoklonális gammopathia
irányába kivizsgáltatni. A teljesség igénye
nélkül ezek a következők: megmagyarázhatatlan
hátfájdalom, osteolyticus gócok, osteopenia röntgenfelvételen,
gyengeség, fáradékonyság, anaemia,
hypercalcaemia, veseelégtelenség, Bence-Jones-fehérje
ürítése, gyakori bakteriális fertőzések, megmagyarázhatatlan
érző-motoros perifériás neuropathia,
par aesthesia, nagyfokú súlyvesztés, elsősorban ha a
beteg 50 évesnél idősebb.
Az immunglobulinok vizsgálati lehetőségei
Kvantitatív meghatározás:
• Nefelometria.
• Turbidimetria.
Immunglobulin-osztályok és -alosztályok mérése:
IgA (IgA 1
, IgA 2
), IgG (IgG 1
, IgG 2
, IgG 3
, IgG 4
), IgM.
Teljes könnyűlánc-mérés: k, l (k/larány)
Szabad könnyűlánc (FLC) mérés: k, l (k/larány).
Kvalitatív meghatározás:
• Szérumfehérje elektroforézis (SPE).
• Immunelektroforézis (IE).
• Immunfixáció (IFE).
• Vizeletfehérje elektroforézis (UPE).
• Vizeletfehérje immunfixáció (UPI).
Az immunglobulin-mérési eredmények kiadásánál
és interpretálásánál mindig figyelembe kell vennünk,

228 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
hogy megnövekedett szintézis esetén mono-, oligovagy
poliklonális termelődésről van-e szó. Az IgG,
az IgA és az IgM mennyisége a legtöbb fertőző betegségben
nem emelkedik 150-200%-nál többet a
referencia középértékéhez viszonyítva, kivételt képez
néhány autoimmun betegség és vírusinfekció, ahol
200-400%-kal is nagyobb lehet.
Szelektív IgA-szint-emelkedés fordulhat elő a következő
betegségekben:
• légúti infekciók,
• pneumonia és más tüdőmegbetegedés,
• ízületek megbetegedései (rheumatoid arthritis),
• a béltraktus gyulladásos megbetegedései,
• alkohol indukálta májbetegség, pl. zsírmáj, cirrhosis
(11-3. ábra).
Szelektív IgM-szin-emelkedés fordulhat elő a következő
betegségekben:
• vírusinfekciók pl. hepatitis, mononucleosis,
citomegalovírus-fertőzés (CMV),
• malária,
• trypanosomiasis,
• biliaris eredetű májbetegség – primer biliaris
cirrhosis (PBC) (11-4. ábra, 11-5. ábra).
Monoklonális gammopathia gyanújakor a laboratóriumi
kivizsgálás során mindig célszerű egy diagnosztikai
algoritmust követni. Ezt az algoritmust a 11-6.
ábra mutatja be. A monoklonális gammopathiák besorolása,
ill. diagnosztikai kritériumai is változtak az
utóbbi időben.
11-3. ábra. Szelektív IgA-szintézissel járó megbetegedések (100% - IgG: 10 g/L, IgA: 2,0 g/L, IgM: 1,0 g/L)
11-4. ábra. Szelektív IgM-szintézissel járó megbetegedések I. (100% - IgG: 10 g/L, IgA: 2,0 g/L, IgM: 1,0 g/L)
11-5. ábra. Szelektív IgM-szintézissel
járó megbetegedések II.
(100% - IgG: 10 g/L, IgA: 2,0 g/L,
IgM: 1,0 g/L)

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai
229
Nem szekretoros myeloma diagnosztikai kritériumai:
1. M-protein nem mutatható ki immunfixációval a
szérumban és/vagy a vizeletben.
2. Csontvelő klonális plazmasejt-szaporulat > 10%
vagy plasmocytoma jelenléte.
3. Társuló szöveti és szervi károsodás (célszervkárosodás,
beleértve a csontlaesiókat).
Aszimptomás myeloma diagnosztikai kritériumai:
1. M-protein > 30g/l a szérumban és/vagy a vizeletben.
2. Csontvelő klonális plazmasejtszám > 10%.
3. Nincs társuló szöveti és szervi károsodás (célszerv,
beleértve a csontlaesiókat) és tünetei.
11-6. ábra. Monoklonális gammopathia kivizsgálásának
laboratóriumi algoritmusa
Amennyiben a lelet negatív, de a tünetek alapján továbbra
is fennáll a gyanú, ajánlott koncentrált reggeli első vizeletből
vizeletfehérje-elektroforézist, ill. immunfixációt
végezni az esetleges Bence-Jones-fehérje kimutatására, a
szérumból pedig szabad könnyűlánc mérés végezhető
A monoklonális gammopathiák új besorolása a következő:
1. Monoklonális gammopathia nem meghatározott
jelentőséggel (MGUS).
2. Aszimptomás myeloma multiplex.
3. Szimptomás myeloma multiplex.
4. Nem szekretoros myeloma multiplex.
5. Csont solitaer plasmocytoma.
6. Extramedullaris plasmocytoma.
7. Többszörös solitaer plasmocytoma.
8. Plazmasejtes leukaemia.
Az International Myeloma Working Group 2005-ös
ajánlásai
Myeloma multiplex diagnosztikai kritériumai a következők:
1. M-protein jelenléte a szérumban és/vagy a vizeletben.
2. A csontvelőben klonális plazmasejtek vagy plasmocytoma
jelenléte.
3. Társuló szöveti és szervi károsodás (célszervkárosodás,
beleértve a csontlaesiókat).
MGUS (monoclonal gammopathies with undetermined
significance) diagnosztikai kritériumai:
1. M-protein a szérumban < 30 g/l.
2. Csontvelő klonális plazmasejtszám < 10% és alacsony
plazmasejt-infiltráció csontvelő-biopsziával
(ha készült).
3. Nem igazolható más B-sejtes lymphoma.
4. Nincs myeloma asszociált szervkárosodás (célszerv,
beleértve a csontlaesiókat is).
A célszervkárosodás kritériumai myeloma multiplexben
(CRAB: calcium, renal, anaemia, bone):
1. A kalciumszint emelkedése 0,25 mmol/l-rel nagyobb,
mint a referenciatartomány felső határa
vagy > 2,75 mmol/l.
2. Veseelégtelenség: szérumkreatinin-szint > 173
μmol/l.
3. Anaemia: hemoglobin 20 g/l-rel kisebb, mint a referenciatartomány
alsó határa vagy < 100 g/l.
4. Csontlaesiók: litikus laesio vagy osteoporosis
kompressziós töréssel (MR- vagy CT-vizsgálattal).
5. Más: hiperviszkozitás, amyloidosis, recurráló bakteriális
infekció (> 2/év).
A felsorolt diagnosztikai kritériumok mellett egy laboratóriumi
ajánlást is létrehoztak. Ennek alapján
monoklonális gammopathia gyanúja esetén először a
szérumfehérje-elektroforézis (SPE) elvégzése javasolt.
Ennek kimutatási érzékenysége 1,0–2,0 g/l között van.
Azonosítani lehet vele minden intakt immunglobulin
termelő myelomát. Azonban nem képes azonosítani a
könnyűlánc myelomások 30%-át, az amyloidosisos betegek
50%-át valamint a nem szekretoros myelomáso-

230 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
kat. Következő lépésben a szérumfehérje elektroforézis
mellett elvégezzük az immunfixációs elektroforézist
(IFE) is. A módszer kimutatási szenzitivitása 0,15–0,5
g/l között van, azonban még így sem lehet beazonosítani
minden könnyűlánc myelomást, az amyloidosis
30%-át, valamint a nem szekretoros myelomásokat.
Harmadik lépcsőben elvégezhetjük a vizelet fehérje
elektroforézist és immunfixációt Bence–Jones-fehérje
kimutatásra (UPE) A teszt Bence–Jones-fehérje iránti
kimutatási érzékenysége 0,01- 0,05 g/l. Ennek következtében
képes 30 %-kal több könnyűlánc-myeloma
és az amyloidosis nagy részének kimutatására. Negyedik
lépcsőben ajánlott a szérum és vizelet szabad
könnyűlánc mérés (FLC). Segítségével kiszűrhetünk
minden könnyűlánc myelomás beteget. Kimutatási
érzékenysége ellenére önmagában nem alkalmazható,
mivel teljes immunglobulint nem mutat ki; MGUS
és intakt immunglobulint termelő myelomában sincs
mindig könnyűlánc termelés. A különböző laboratóriumi
tesztek kimutatási érzékenységét a 11-3. táblázat
mutatja be.
Immunfixációs elektroforézis (IFE)
Az IFE segítségével lehetővé válik az M-proteinek
osztályozása és tipizálása. A fehérjéket általában agarózgélen
választják el töltésüknek és nagyságuknak
megfelelően (0,8% agaróz és trisz-barbitál puffer pH
9,1). Ezután következik az elválasztott fehérjék immunprecipitációja
(fixációja) monovalens antihumán
emlős immunglobulinok segítségével. A nem
precipitálódott fehérjéket mosással és leitatással eltávolítjuk.
Végül a kicsapódott immunkomplexeket
festéssel (pl. savanyú viola) tesszük láthatóvá. A 11-7.
ábrán egy immunfixációs lemezt mutatunk be. Egy
lemezre négy beteg mintáját tudjuk felvinni. A fehérjéket
minden beteg esetében 6 sávban választjuk
el. Az első szérumfehérje-elektroforetogram marad,
mivel erre nem rétegezünk immunglobulint, elválasztás
után ebben a sávban fixáljuk a fehérjéket. A
következő sávok esetében a szérumfehérje-elválasztás
után sorrendben IgG, IgA, IgM, k és l könnyűlánc
konstans régiója ellen termelt antitestet rétegezünk.
Az immunfixációs lemez értékelésekor először az
elektoforetogramsávban keresünk esetleges eltérést,
ami általában éles, jól körülhatárolt csík (extrafrakció/extrafrakciók)
formájában jelentkezik. M-protein
jelenlétében ezzel azonos magasságban a nehéz- és
könnyűláncok sávjának valamelyikében az éles, jól
körülhatárolt csík szintén megjelenik; pl. a 11-7. ábrán
a 2-es és a 4-es számú beteg esetében IgG k tí-
11-7. ábra. Immunfixációs elektroforetogramok
11-3. táblázat. Különböző laboratóriumi tesztek diagnosztikus érzékenysége myeloma multiplexben
Teszt
Myeloma AL amyloidosis MGUS
%
SPE 90 50 45
SPE + se-IFE 95 70 80
SPE + UPE 95 75 70
SPE + UPE + se- és vizelet-IFE 97 90 80
FLC 96 95 65
SPE + FLC 99 98 85
SPE + FLC + IFE 99 99 100

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai
231
pusú monoklonális M-protein látható. Az M-protein
γ-frakción belüli pontosabb elhelyezkedésének megadása
érdekében a γ-frakciót három részre osztottuk
fel. A β-frakcióhoz közel eső részt gyors γ-régiónak,
a γ-frakció középső részét középső γ-régiónak, a katódhoz
közel elhelyezkedő γ-frakció részt pedig lassú
γ-régiónak neveztük el. Így az immunfixációs eredmény
kiadásakor nem csak az M-protein típusát, hanem
annak γ-frakción belüli pontos elhelyezkedését
is megadjuk. A 11-7. ábra 2-es és 4-es számú betegének
esetében tehát IgG k típusú M-protein mutatható
ki a lassú γ-régióban a szérumfehérje-elektroforetogramon
megjelenő extrafrakciónak megfelelően.
Az M-protein pontos helyének megadása elsősorban
csontvelő-transzplantáción átesett betegek kezelésében
fontos, az esetleges recidíva minél hamarabbi
kiszűrése érdekében. Poliklonális gammopathiában a
különböző sávokban a precipitációs zóna diffúz, elmosódott
emelkedése látható (11-8. ábra). Normál
immunfixációs kép szintén elmosódott a precipitációs
régióban, mennyiségi elváltozás nélkül (11-7. ábra
1-es és 3-as számú beteg).
A következőkben néhány tipikus példával illusztráljuk
az immunfixációval osztályozott monoklonális
gammopathiákat. A 11-9. ábrán IgG k (2-es és 3-as
számú beteg), valamint IgG l (4-es számú beteg) típusú
monoklonális M-protein látható. A 11-10. ábra
egy IgA k (4-es számú beteg), valamint egy IgA l (1-es
számú beteg) típusú monoklonális M-proteint mutat
be. IgM k típusú monoklonális M-proteineket szemléltet
a 11-11. ábra. Előfordul, hogy a kóros plazmasejtklón
a komplett nehézláncból álló M-proteinen
kívül szabad könnyűláncot is termel. Ilyen esetben a
szabad könnyűlánc a könnyűláncok variábilis régiója
ellen termelt monovalens antitestek segítségével mutatható
ki. Ezek normál körülmények között, amikor
a könnyűlánc a nehézlánccal összeszerelve található,
az antitest számára nem hozzáférhetők. A 11-12. ábra
11-9. ábra. Monoklonális gammopathia – IgG k és l típusú
M-proteinek
11-10. ábra. Monoklonális gammopathia – IgA k és l típusú
M-proteinek
11-8. ábra. Poliklonális gammopathia immunfixációs
elektroforetogramja
11-11. ábra. Monoklonális gammopathia – IgM k típusú
M-proteinek

232 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
egy ilyen beteg immunfixációs lemezét mutatja be.
Az első lemezen a β-frakcióban található extrafrakciónak
megfelelően IgA l típusú M-proteint láthatunk.
Ugyanakkor az α 2
- és a β-frakció között lévő extrafrakcióval
egy magasságban csak a l-sávban találunk
csíkot, a nehézláncok sávjában nem. Felmerül a szabad
l-könnyűlánc jelenlétének a lehetősége, amit a
következő lemezen az L f
sávjában alkalmazott szabad
l-könnyűlánc-ellenes antitest használatával igazoltunk.
Az immunfixációs elektroforézis eredményeinek
klinikai értékelésénél mindig figyelembe kell vennünk
a beteg tüneteit, egyéb laboratóriumi eredményeit
és a képalkotó diagnosztika leleteit, mivel számos
egyéb nem myeloma multiplexes megbetegedés
is járhat együtt monoklonális gammopathiával a következők
szerint:
• Bőrbetegségek:
- scleroderma,
- pyoderma gangrenosum,
- necrobioticus xanthogranuloma,
- discoid lupus erythematosus,
- psoriasis,
- cutan lymphoma.
• Immunszupresszió:
- AIDS- és HIV-infekció,
- vesetranszplantáció,
- csontvelő-transzplantáció.
• Májbetegségek:
- krónikus hepatitis,
- cirrhosis,
- primer biliaris cirrhosis.
• Különféle autoimmun és más megbetegedések:
- rheumatoid arthritis,
- gyulladásos szeronegatív polyarthritis,
- polymyositis (IgG κ),
- rheumás polymyalgia,
- myasthenia gravis,
- angioneuroticus oedema.
A 11-13. ábrán egy csontvelő-transzplantáción átesett
beteg oligoklonális M-proteineket tartalmazó immunfixációs
elektroforetogramját mutatjuk be (ún.
,,zebracsíkos,, mintázat). Mivel a myeloma multiplex
laboratóriumi diagnózisához szervesen hozzátartozik
a vizeletfehérjék elektroforézise és immunfixációja is
a Bence-Jones-fehérjék kimutatására, röviden vázoljuk
ez utóbbi eljárást.
Vizeletfehérje immunfixációs elektroforézise
Az eljárás alkalmas a proteinuria kimutatására és
típusának azonosítására, valamint Bence-Jones-fehérjék
és teljes immunglobulin-molekula ürítésének
kimutatására. A Bence-Jones-fehérje kimutatási érzékenysége
ezzel a módszerrel 0,01-0,05 g/l. A vizeletfehérje-elválasztás
lúgosra pufferolt agaró gélen
megy végbe. A kilenc (ebből egy vizeletfehérje-elektroforézis)
sávban szétválasztott fehérjéket megfelelő
antiszérummal fixáljuk. Az oldatban maradt fehérjéket
leitatással, mosással eltávolítjuk. A kicsapódott
fehérjéket savanyú violával festjük.
A használt antiszérumok az elektroforetikus sávoknak
megfelelően:
1. ELP: vizeletelektroforetogram, antiszérum nélkül.
2. Tubularis fehérjék: b 2
-mikroglobulin, retinolkötő
fehérje (RBP), α 1
-mikroglobulin.
11-12. ábra. Monoklonális gammopathia – IgA lambda típusú
M-protein és szabad lambda könnyűlánc
11-13. ábra. Csontvelő-transzplantáción átesett beteg oligoklonális
M-proteinjei

A vérszérum és a vérplazma fehérjevizsgálatai
233
3. Glomerularis fehérjék: albumin, α 2
-makroglobulin.
4. GAM nehézlánc: trivalens szérum.
5. DE nehézlánc: bivalens szérum.
6. Szabad és kötött κ-könnyűlánc.
7. Szabad és kötött λ-könnyűlánc.
8. Szabad κ-könnyűlánc.
9. Szabad λ-könnyűlánc.
A proteinuria értékelése itt nem kerül részletezésre,
mivel az egy másik fejezetben található. Bence-Jones-proteinuriáról
akkor beszélünk, ha monoklonális
csík jelenik meg a kötött és szabad könnyűláncok
sávjának egyikében, míg a trivalens GAM és a bivalens
DE sávban nem jelenik meg monoklonális csík.
Amennyiben mégis, a beteg a komplett immunglobulin
mellett szabad könnyűláncot is ürít. Ha a k- és/
vagy l-sávban diffúz zónát látunk, ez poliklonális
szabad könnyűláncnak felel meg, nem Bence-Jones-protein.
A 11-14. ábra egy szabad l-könnyűláncot
ürítő beteg vizelet immunfixációs elektroforetogramját
mutatja.
Irodalom
11-14. ábra. Vizelet-immunfixációs elektroforetogram –
Bence-Jones-proteinuria, szabad l-könnyűlánc-ürítéssel
Le Carrer, D.: Serum electrophoresis immunofixation,
illustrated interpretations. Editions FM-BIO, Vanves,
2005.
Thomas, L. (ed.): Clinical Laboratory Diagnostics. Use
and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books
Verlagsgesellschaft, Frankfurt am Main, 1998,
Thomas, L. (ed.): Protein sin Clinical and Laboratory
Medicine. Use and Assessment of Clinical Laboratory
Results. TH-Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt am
Main, 2008.
Smith, A., Wisloff, F., Samson, D: on behalf of the UK
Myeloma forum, Nordic Myloma Study Group and
British Committee for Standards in Hematology: Guidelines
on the diagnosis and management of multiple
myeloma. British Journal of Haematology 132:410-451,
2005.

234 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Kis molekulatömegű fehérjék,
peptidek, peptidhormonok
kimutatása
Kőszegi Tamás
A kis molekulatömegű fehérjék jellemzői
A kis molekulatömegű fehérje fogalma
Általánosságban véve az albuminnál kisebb (67
kDa) tömegű fehérjéket, peptideket soroljuk ebbe a
csoportba. A beosztás talán önkényes, szerepet játszik
ebben az a tény is, hogy a vese filtrációs küszöbe
ebbe a tartományba esik. A másik ok az lehet, hogy
az albumin monoklonális homogén terméknek tekinthető
– legalábbis a transzlációkor született fehérje
esetében – a későbbi poszttranszlációs módosulások
nélkül. Az albumin nagy mennyiségben kering
a vérplazmában és szintje nagyon állandó. Ugyanez
nem mondható el az albuminnál kisebb fehérjékről,
peptidekről, hiszen sok biológiailag aktív molekula
tartozik ebbe a csoportba és ezek vérszintje a szervezet
mindenkori általános állapotától, válaszreakcióitól
függ. Ez a molekulacsoport mind szerkezetét,
mind funkcióját tekintve igen heterogén, és ugyanez
igaz plazmakoncentrációjukra is: a néhány g/l-es
koncentrációtól kezdve a ng/l értékekig terjedő tartományban
találhatók a keringésben. Érthető módon
minél nagyobb biológiai aktivitással rendelkezik
egy molekula, annál kisebb a vérszintje és rövidebb a
biológiai féléletideje. Szintézisük és a sejtből történő
kikerülésük sebessége változó, azonban általánosságban
itt is elmondható, hogy a gyors válaszkészséget
mutató molekulák biológiai aktivitása fokozott.
A kis molekulatömegű fehérjék jelentősége
A molekulacsalád komponensei szerteágazó biológiai
funkciót töltenek be: endokrin hormonok,
sejtosztódást serkentő vagy gátló faktorok, az immunválaszt
befolyásoló pro- és antiinflammatorikus
citokinek, klasszikus akut fázis fehérjék és még
sok egyéb biológiai funkcióval rendelkező molekula.
Biológiai aktivitásuk nem mindig kedvező a szervezet
számára, pl. súlyos bakteriális szepszisben a túlzott
erősségű citokinválasz visszafordíthatatlan szervi
károsodásokat és szeptikus shockot idézhet elő, vagy
a fokozott katabolizmus következtében a sejtekből
kiszabaduló fehérjék (pl. aktin monomerek) tüdőkárosodást
okozhatnak, fokozva ezzel a betegség súlyosságát.
A molekulacsoport fehérjéi hatásukat intracellulárisan,
lokálisan és távoli célsejteken keresztül
fejtik ki (autokrin, parakrin, endokrin módon). Jó
néhány komponens funkcióját kevéssé vagy egyáltalán
nem ismerjük. Az utóbbi évtizedben mind több
elméleti kutatás és klinikai tanulmány foglalkozik a
vérszérumból izolálható kis molekulatömegű peptidekkel
és fehérjékkel, mert bizonyos betegségekben a
betegekből nyert fehérjék spektruma az egészségesekéhez
képest jellegzetes eltéréseket mutat, így vizsgálatuk
ígéretes lehet pl. a daganatos folyamatok minél
koraibb detektálásában.
A kis molekulatömegű fehérjék csoportosítása
Sokféle csoportosítás lehetséges, pl. molekulaszerkezet,
méret, funkció szerint. Legkézenfekvőbbnek a
11-4. táblázat. Kis molekulatömegű fehérjék biológiai szerepük szerinti csoportosítása
Biológiai hatás
proinflammatorikus mediátor
antiinflammatorikus mediátor
sepsismediátor?
hidrofób molekulák transzportja, immunválasz
akut fázis fehérje
növekedési faktor
endokrin funkció
A csoport néhány jellegzetes molekulája
IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-g
IL-4, IL-10, IL-13
prokalcitonin
lipokalin molekulacsalád (a 1
savanyú glikoprotein, retinolkötő
fehérje stb.)
a 1
-antitripszin, a 1
savanyú glikoprotein
PDGF, EGF, FGF, VGF stb.
peptidhormonok

Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása
235
betöltött biológiai szerep szerinti csoportosítás tűnik,
de tudnunk kell, hogy a hasonló funkcióval rendelkező
molekulák kémiai szerkezetükben lényeges eltéréseket
mutathatnak. A legfontosabb csoportokat a
11-4. táblázatban tüntettük fel.
Célszerűnek látszik egy másik szempont szerinti
csoportosítás is, ez a beosztás a molekulacsoport
klinikai értékelését, jelző (marker) szerepét veszi figyelembe.
A markermolekulák sokszor hasznos információt
szolgáltatnak egy kóros állapot felismeréséről,
lefolyásáról, a kezelés hatékonyságáról vagy egy
szerv vagy szervrendszer funkciójáról még akkor is,
ha azok biológiai szerepe kevéssé ismert. A 11-5. táblázatban
a biológiai marker sajátság szerinti csoportosítást
tüntettük fel.
A kis molekulatömegű fehérjék „születése”
Alapvetően kétféle mechanizmust kell megkülönböztetni:
• Szintézis és aktiváció a sejtben és/vagy a sejten
kívül.
• A már kész fehérje degradációja, eliminációja
során létrejött fragmensek keletkezése.
A szintézis – a génátírás és a transzláció – sejten belül
megy végbe, a létrejött polipeptidláncok aminosavsorrendje
megfelel a kódoló génben tárolt információknak.
Azonban az így megtermelt peptid, fehérje a
legritkább esetben tölt be azonnal biológiai funkciót,
előbb aktiválódnia kell. Az aktiválódásra a sejten belül
vagy az extracelluláris térben kerül sor. Nagyon
gyakran a késztermékhez képest az átírt fehérje nagyobb
molekulatömegű, az aktiválódás útja ún. limitált
proteolízis, kisebb fragmentumok enzimatikus
lehasítása. Az aktiváció sokszor több lépésben zajlik,
többszörös hasítással, pl. preproinzulin → proinzulin
→ inzulin, vagy preproBNP → proBNP → NT-proBNP
→ BNP. A BNP a natriuretikus peptidek családjába
tartozik, az agyban és a szívben termelődik (a B az
agyra -.brain - utal), de vérszintje elsődlegesen a szív
bal kamra funkciójától függ. Az aktív hormon a BNP
(32 aminosav), amely a pro-BNP-ből hasad le (inaktív
molekula az NT-proBNP, 76 aminosav), a kiindulási
preprohormon 134 aminosavat tartalmaz. Más
aktivációs mechanizmusok is léteznek: foszforiláció,
glikoziláció, di- vagy trimerizáció stb.
A fehérjék inaktiválását és eliminációját is általában
részleges proteolízis előzi meg, amely után a szérumban
a degradációs termékek vagy szabadon keringenek
és a vizelettel ürülnek, vagy nem specifikus
(pl. albumin), ill. specifikus fehérjekötéssel (pl. szabad
aktin-gelzolin) a májban vagy a RES-ben bomlanak
le építőköveikre.
A kis molekulatömegű fehérjék
kimutatási lehetőségei
Módszertani megközelítés
A kimutatás irányulhat egy adott molekulatömegű
csoportra vagy egy adott konkrét molekulára.
Az előbbi esetben általában valamilyen elválasztásos
módszert használunk, az utóbbiban a specifikusságot
rendszerint a kérdéses fehérje, peptid ellen termeltetett
antitest biztosítja. Az antitest alkalmazását össze
lehet kötni előzetes szeparálással, pl. elektroforetikus
elválasztással, és a detektálni kívánt antigént ezután
jelzett antitestkomplexszel tesszük láthatóvá (Western
blot, lásd 4. fejezet). Ezen kívül az antitesteket
11-5. táblázat. Kis molekulatömegű fehérjék marker jelleg szerinti csoportosítása
A marker információs értéke
vesefunkció, filtráció
sepsis korai diagnózisa, követése
tumormarker
lehetséges tumormarker
uraemiás állapot
csont-turnover
A csoport néhány jellegzetes molekulája
cisztatin C, b 2
-mikoroglobulin
prokalcitonin
fehérje- és peptidhormonok
5-30 kDa tömegű peptidek
kis molekulatömegű fehérjék, parathormon
kollagéndegradációs termékek

236 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
felhasználhatjuk immunanalitikai (elterjedt kifejezéssel
immunoassay) módszerekben, ahol a specifikus
detektálás egyben nagy érzékenységű mennyiségi
meghatározást is lehetővé tesz. Az antitesteken kívül
más, specifikus kötést, molekulaszerkezet-felismerést
alkalmazó technika is ismert. Ezekben általában
egy szilárd hordozón a detektálni kívánt fehérje valamilyen
ligandja vagy a fehérjével kapcsolatba lépő
egyéb molekula helyezkedik el, és a rendszeren átáramoltatjuk
a mintát, ahol az megkötődik és kimutathatóvá
válik (affinitásos elv). Jó példa erre a fehérje-chip
technika, ahol egy chipen többféle affinitásos
elvet is alkalmazhatunk, és több különböző fehérjét
is detektálhatunk egyszerre, egy adott rendszerben. A
másik érdekes új módszer a felszíni plazmonhullám
rezonancia (surface plasmon resonance, SPR), ahol
a szilárd fázis felületén létrejövő kötődés kinetikáját
is monitorozhatjuk. A továbbiakban ismertetünk néhány
példát mind az előzetes elválasztáson és/vagy
előtisztításon, mind az antigén-antitest reakción alapuló
kimutatási technikákra.
Előzetes frakcionálást, dúsítást
alkalmazó módszerek
Ultraszűrés
Kíméletes, nem denaturáló eljárás, ahol a mintából
a nagy molekulatömegű komponenseket molekuláris
szűrővel választjuk el a detektálni kívánt, általában
kis koncentrációban lévő molekuláktól. Többféle
eljárás használatos, de mindegyik lényege, hogy
garantált pórusméretű membránon préselik át a
mintát nyomáscellában, nitrogéngáz alkalmazásával
vagy centrifugában a centripetális erő segítségével.
Leggyakrabban 50 kDa pórusméretű membránt
alkalmaznak, mert ennek segítségével a szérumban
óriási mennyiségben jelen lévő albumin 95 - 98%-a
eltávolítható. Léteznek 30, 20, 10, 5, 1 kDa pórusméretű
membránok is, a tisztítást akár több lépcsőben
is elvégezhetjük fokozatosan kisebb molekulaméretű
szűrőt alkalmazva, így jól meghatározott molekulatömegű
mintákat kaphatunk és analizálhatunk. A módszer
előnye, hogy egyszerű, relatíve gyors, és a kinyert
komponensek általában megőrzik biológiai aktivitásukat.
A szűrők többször is felhasználhatók. Hátránya
az eljárásnak az esetleges gyártási hibából adódóan
vagy a felhasználás során létrejövő sérülés a membránon,
amely a szeparálás biztonságát veszélyezteti.
Ezen kívül a többszöri használat során – még az előírt
tisztítási procedúrák betartásakor is – a fehérjék egy
része adszorbeálódhat a membrán felületén és megváltozhat
a szűrő áteresztőképessége.
Méretkizárásos kromatográfia (gélszűrés)
Szintén nem denaturáló eljárásként alkalmazható
egyszerű módszer. A gél pórusméretének megválasztásával
végezhetünk ún. sótlanítást vagy puffercserét,
ill. kinyerhetjük az analizálni kívánt molekulaméret-tartományt.
Az elúció monitorozását 280 nm-en
való UV fotometriás detektálással végezhetjük, így a
megfelelő molekulaméretű tartomány célzottan öszszegyűjthető
a további analízisekhez.
Acetonitriles (ACN) kicsapás
Széles körben elterjedt egyszerű módszer a kis molekulatömegű
fehérjék, peptidek dúsítására és a nagy
mennyiségben jelen lévő nagyobb molekulatömegű
szérumfehérjék eltávolítására. A szérumot 1:1 arányban
elegyítik ACN-nel, majd centrifugálás után a felülúszót
kinyerik és az oldószert elpárologtatják. A
beszárított mintát trifluoroecetsavban veszik fel és
HPLC oszlopon sótlanítják. Az így nyert eluátum
közvetlenül alkalmas a peptidek tömegspektrometriás
vizsgálatára.
Perklórsavas (PCA) módszer
Perklórsavas (PCA) kicsapás
A rutin kromatográfiás módszereknél általában fehérjementesítésre
használt kicsapásos eljárást Intézetünkben
dolgoztuk ki a szérum savoldékony fehérjefrakciójának
kinyerésére. Rendkívül egyszerű és jól
reprodukálható technika, amely alkalmas a savas közegben
oldódó molekulacsoport mennyiségi meghatározására
és elválasztás, valamint specifikus detektálás
után egyedi fehérjék azonosítására. A perklórsav
a szérumalbumint majdnem 100%-ban eltávolítja, és
a savas közegben az esetlegesen albuminhoz kötődő
peptideket is oldatba viszi. Hátránya, hogy erősen denaturáló
módszer és csak a pH

Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása
237
datban maradó fehérjefrakció vizsgálatára alkalmas
(ez lehet előny is, hiszen valójában szelektív dúsítást
jelent).
A módszer kivitelezése:
Reagensek:
• 10 v/v %-os perklórsav vízben.
• 9,13%-os kálium-hidroxid (frissen készítendő).
• Kicsapás, minta nyerése:
• Eppendorf-centrifugacsövekben végzik, a minta
pl. vérszérum.
• 500 μl szérum + 500 μl 10%-os PCA, vortexelés
és inkubálás szobahőmérsékleten 10 percig.
• Centrifugálás 13 000 fordulattal, 3 percig, majd
300 μl felülúszó leszívása új csőbe.
• 300 μl felülúszó + 200 μl 9,13%-os KOH, vortexelés,
majd 10 perc állás szobahőmérsékleten,
nyitott centrifugacsővel (a képződő gázok eltávolítására).
• Centrifugálás 13 000 fordulattal, 3 percig, 300 μl
felülúszó leszívása új csőbe – ez képezi a mintát.
Az eljárással a perklórsav nagy része csapadék formájában
eltávolítható és a neutralizált savoldékony frakció
alkalmas mennyiségi meghatározásra és fehérjeelektroforetikus
vizsgálatokra egyaránt.
Mennyiségi mérések
UV abszorbancia. A neutralizált mintát desztillált
vízzel 10-szeresére hígítjuk, a fehérjekoncentrációra a
peptidkötésre jellemző, 220 nm-en mért abszorbancia
alapján következtethetünk. Standardként tisztított
bovin albumint használhatunk, amelyet a mintához
hasonló módon kezelt, de fehérjét nem tartalmazó
közegben oldunk fel. Kvarcküvetták és kétsugaras fotométer
használata kívánatos, ahol a csatornák közti
különbséget levegőre korrigáljuk, a mintát levegővel
szemben fotometráljuk. A javasolt albumin standard
koncentráció: 20-100 mg/l-es tartomány.
Az UV-fotometriás mérés kivitelezése egyszerű, de
a mintában lehetnek 220 nm-en elnyelődést mutató
egyéb molekulák is, pl. gyógyszerek, ezért érdemes a
fehérjemeghatározást a következő módon is elvégezni:
Festékkötési (Bradford-) reakció. A módszer lényege
a Coomassie Brilliant Blue G 250 festék fehérjekötésén
alapszik, az abszorbanciát 595 nm-en mérjük
(lásd 2.. fejezet). A javasolt standard fehérjekoncentráció-tartomány
szintén 20-100 mg/l.
Perklórsavas (PCA) kicsapás kombinálása
Western blot módszerrel
A neutralizált minták alkalmasak SDS-PAGE-analízisre
is. A Laemmli szerinti poliakrilamid-elválasztáshoz
a savoldékony frakciókat 5-szörös töménységű
mintapufferben vesszük fel a lehető legkisebb hígulás
érdekében, az elválasztáshoz 15%-os gélkoncentrációt
alkalmazva. A neutralizáláshoz használt kálium-hidroxid
miatt a minták még elegendő káliumiont tartalmaznak
ahhoz, hogy az szobahőmérsékleten az
SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy részével oldhatatlan
csapadékot képezzen. A problémát úgy oldhatjuk
meg, hogy futtatás előtt újabb forralást végzünk, és
a gélekre a kb. 50 °C-os vízfürdőn tartott mintákat
melegen visszük fel. A futtatás után kombinált ezüstfestést
alkalmazunk, a parallel gél fehérjéit nitrocellulózmembránra
transzferáljuk.
Az itt következő példában saját vizsgálatunkat mutatjuk
be. Tejes blokkolást követően α 1
savanyú glikoprotein
(AGP-) ellenes nyúl primer antitestet és peroxidázzal
jelölt antinyúl IgG-t használtunk, erősített
kemilumineszcenciás (ECL) detektálást alkalmazva.
A fényreakciót Kodak Image Station 2000R készülékkel
fényképeztük le, amely alkalmas a kemilumineszcenciás
jel mennyiségi értékelésére. A módszer
részleteit lásd a 4. fejezetben. Egy reprezentatív kísérlet
eredményét 11-15. és a 11-16. ábrán mutatjuk be.
Az első gélen egészséges orvostanhallgatók savoldékony
fehérjéinek elektroforetikus mintázata látható.
A molekulatömeg-markerek alapján a 67 kDa magasságban
alig láthatunk festődést, ami arra utal, hogy
albumin a kicsapás során csak nyomokban maradt a
11-15. ábra. Egészséges orvostanhallgatók savoldékony
szérumfehérjéinek SDS-PAGE vizsgálata (ezüstfestés; baloldalt
a molekulatömeg-markerek láthatók)

238 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-16. ábra. AGP kimutatása szeptikus betegek savoldékony
fehérje frakciójából (ECL-detektálás; az oszlopdiagram
az egyes sávok lumineszcenciaintenzitását mutatja
relatív egységben; az ábra felső részén Western blot luminenszcenciaintenzitások
1-9-ig)
mintában. Jellegzetes, minden pásztán megtalálható
csíkokat látunk a 40-60 kDa és a 20 kDa alatti tartományban.
Az AGP-ellenes antitesttel sikerült a 43
kDa-os markerrel azonos magasságban kemilumineszcenciás
jelet detektálni. A Western blot analízist
szeptikus betegek mintáiból is elvégeztük.
A kemilumineszcenciás kvantitatív eljárás lehetőséget
ad arra, hogy az egyes sávokban detektált
fehérje antigén mennyiségeket egymással összevessük.
Alkalmazhatunk belső referenciamintát is, pl.
kevert szérumból nyert savoldékony frakciót, amelyet
minden futtatáskor felviszünk, és a betegekre
kapott ECL-intenzitásokat a referenciára kapott lumineszcenciára
vonatkoztatjuk (ECL-hányados). Kísérletünkben
a szeptikus betegek savoldékony frakciójának
mennyisége az egészséges kontrollokra mért
értékekhez képest 3-5-szörös volt. Ugyanúgy a Western
blotra kapott kemilumineszcenciás jelek alapján
a betegekben az α 1
savanyú glikoprotein (AGP)
mennyisége jelentősen megemelkedett, a mintákban
az egyik legmarkánsabb sávot mutatva. A vizsgálatokkal
megpróbáltunk a szervezet gyulladásos válaszreakciójára
és az általános katabolizmusra jellemző
mérhető, reprodukálható markert találni.
Az immunoassay-kről, az automatizált módszerekről
részletesen a 7. fejezetben olvashatnak. Itt egy proinflammatorikus
citokin, a TNF-α meghatározásán keresztül
mutatjuk be a kis molekulatömegű peptidek,
fehérjék mennyiségi meghatározásának elvét és gyakorlatát.
A polipeptidek rendszerint több antigéndeterminánssal
rendelkeznek, ezért az ellenük termelt antitestek
különböző epitópokhoz képesek kötődni. Két,
egymástól eltérő helyen lévő epitópra specifikus monoklonális
antitesttel a vizsgálni kívánt antigén detektálható
és mennyisége is mérhető. Az eljáráshoz
rendszerint szilárd fázist használnak, amelyhez az
első antitestet hozzákötik. A mintával való inkubáció
után mosási fázis következik, ezt egy újabb inkubáció
követi, valamilyen érzékeny detektálást lehetővé tévő
jelölőt hordozó (radioaktív izotóp, lumineszcens vegyület
stb.) második antitesttel. Ismételt mosás után
a szilárd fázis felületén kialakult „szendvicskomplex”
jele mérhető, a jel nagysága arányos az antigén menynyiségével
(telítési assay). Standardok alkalmazásával
az antigén koncentrációja meghatározható. A módszer
elvét a 11-17. ábra mutatja.
Jelölőként a nem izotópos módszerek terjedtek el
(fluoreszcencia, kemilumineszcencia), amelyek érzékenysége
hasonló az izotópot alkalmazó módszerekéhez.
Mint minden laboratóriumi vizsgálatnál, az
immunoassay-knél is szükséges a minőség-ellenőrzés,
ismert koncentrációjú kontrollok rendszeres mérésével.
Az ábrán bemutatjuk a TNF-α automatizált
11-17. ábra. Szilárd fázisú telítési immunoassay elve
Egyedi fehérjék kimutatása immunanalitikai
módszerrel (immunoassay)
11-18. ábra. TNF-α kontrollkártyája, az adatok a célérték
százalékában vannak feltüntetve. Immuno kemilumineszcenciás
automatizált módszer

Kis molekulatömegű fehérjék, peptidek, peptidhormonok kimutatása
239
meghatározásának kontrollkártyáját. Az adatok azt
mutatják, hogy a TNF-α a pg/ml-es tartományban
megbízhatóan mérhető: a sorozatok közti pontatlanság
variációs koefficiense 6,6%, az átlagos eltérés a
célértéktől +7,2% (11-18. ábra).
Intracelluláris polipeptid kimutatása
szövettenyészeti sejtekből
Prokalcitonin (PCT)
A prokalcitonin mint a kalcitonin prohormonja
egészségesek vérszérumában a kimutathatósági határ
körül mozog. Körülbelül 10-15 éve fedezték fel, hogy
szisztémás bakteriális és gombás fertőzéseknél (szepszis)
a PCT szintje a vérben sokszorosára emelkedik.
Az egyik leghatékonyabb stimulusnak az endotoxint
találták, endotoxinexpozíció után már 4 óra múlva
szignifikáns PCT-emelkedést regisztráltak. Ma a PCT
szérumszintjének mérése a szepszis felismerésében
az egyik legkoraibb és legmegbízhatóbb laboratóriumi
marker. A nagyszámú irodalmi adat ellenére nem
teljesen ismert a PCT fokozott kiáramlásának szöveti
lokalizációja. A kérdés lehetséges megválaszolására
mutatjuk be az Intézetünkben Hep G-2 májsejtkultúrán
végzett kísérletünket.
A vizsgálathoz monolayer sejtkultúrákat különböző
koncentrációjú, a tenyésztő médiumban oldott endotoxin
révén expozíciónak tettük ki. A 24 órás inkubáció
után a sejteket mostuk és lizáltuk 0,1% Triton-X
100-at tartalmazó PBS-sel. A lizátumok fehérjetartalmát
meghatároztuk (Bradford szerint), majd a
mintákból lumineszcenciás szendvics immunoassayvel
mértük a prokalcitonin mennyiségét. A PCT-t a
sejtek fehérjetartalmára vonatkoztattuk (μg/g). Eredményeink
a 11-19. ábrán láthatók.
11-19. ábra. Hep G-2 sejtek PCT-válasza endotoxinexpozícióra
(Tf: tápfolyadék, az endotoxin a tenyésztő médiumban
lett feloldva)
Vizsgálataink azt mutatják, hogy a máj a PCT-válasz
egyik lehetséges szöveti lokalizációja lehet. A paradoxnak
tűnő fordított arányosság (endotoxin:PCT)
okát egyelőre nem ismerjük.
*
A kis molekulatömegű szérumfehérjék óriási palettája
áll rendelkezésre a laboratóriumi diagnosztikában
és a kutatásban. Ez a terület az analitikai módszerek
finomodásával egyre több lehetőséget ad a patofiziológiás
folyamatok jobb megértésére és a betegségek
minél koraibb diagnosztikájára.
Irodalom
Buijs, J., Franklin, G. C.: SPR-MS in functional proteomics.
http://www.google.hu/search?source=ig&hl=-
hu&rlz=1G1GGLQ_HUHU408&=&q=Jos+Buijs-
+and+Gary+C.+Franklin&btnG=Google+keres%C3-
%A9s&aq=&oq
Flower, D. R.: The lipocalin protein family: structure and
function. Biochem. J. 318:1-14, 1996.
Kőszegi T., Kéri Gy., Molnár Zs. és mtsai: Szisztémás
fertőzés monitorozása a szérum procalcitonin szint és
a keringő kismolekulasúlyú fehérjék analízisével. Focus
Medicinae 2:38-43, 2000.
Kőszegi, T.: Immunoluminometric detection of human
procalcitonin. J. Biochem. Biophys. Methods 53(1-
3):157-164, 2002.
Lee, P.-S., Patel, S. R., Christiani, D. C. et al.: Plasma
Gelsolin Depletion and Circulating Actin in Sepsis - Pilot
Study. PLoS ONE 3(11):e3712.
Liu, C., Wang, H., Pan, C. et al.: Serum protein fingerprint
of patients with gastric cancer by SELDI technology. African
Journal of Biotechnology 9(15):2298-2304, 2010.
Merrell, K., Southwick, K., Graves, S.W. et al.: Analysis
of Low-Abundance, Low-Molecular-Weight Serum
Proteins Using Mass Spectrometry. J. Biomol. Tech.
15(4):238–248, 2004.
Moore, D. F., Rosenfeld, M. R., Gribbon, P. M. et al.
:Alpha-1-acid (AAG, orosomucoid) glycoprotein: interaction
with bacterial lipopolysaccharide and protection
from sepsis. Inflammation 21(1):69-82, 1997.
Tirumalai, R. S., Chan, K. C., Prieto, D. A. et al.: Characterization
of the Low Molecular Weight Human
Serum Proteome. Mol. Cell Proteomics 2:1096-1103,
2003.
Purification of Serum Peptides for Biomarker Research
with Amicon Ultra Centrifugal Filters (http://www.millipore.com/techpublications/tech1/6djqfn)

240 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Sejtes elemek differenciálása:
flow citometria – Bevezetés
a flow citometriába
Magyarlaki Tamás
Definíciók és célkitűzések
A flow citometria (FCM) vagy áramlási citometria
igen hatékony méréstechnika, amellyel heterogén
összetételű sejtpopulációkban lévő egyedi sejtek multiplex
paramétereit mérhetjük. A flow citométerek
(az áramlási citométerek) sokféle szerepkörben alkalmazhatók:
immunfenotipizálásban; sejtszámlálásban
(volumetriás vagy mikrogyöngyös módszerrel);
DNS-ploiditás és funkcionális marker vizsgálatokban
(pl. daganatos sejtek in vitro multidrog-rezisztencia
vizsgálatában, növekedési faktor, ill. citokinreceptor-expresszió
kimutatásban stb.). Az expresszió mérésére
az ún. átlag fluoreszcencia (mean fluorescent
intensity, MFI) értéket alkalmazzuk, amely a sejtek
„egészséges” vagy „kóros” állapotát hivatott kimutatni.
Az áramlási citometria során olyan mérést végzünk,
melynek során másodpercenként több ezer
sejt egymást követve keresztezi a lézerfény útját, és
a keletkezett szórt fényt minden egyes sejtről egyenként
tudjuk begyűjteni analízis céljára. Ennyi adatot
természetesen csak számítógép segítségével lehet begyűjteni
és FCM analízis szoftver segítségével statisztikailag
elemezni. Az adatokból nyert eredmények
információt adnak a következőkről:
• A vizsgálati minta egyes sejtjeinek és összességüknek
mérete (size).
• A sejtek belső összetettsége (complexity).
• Sejfelszíni fehérjék (phenotype).
• Esetenként a sejt- vagy sejtfelszíni fehérjék
működéséről, ill. állapotáról (funcional expression).
E rövid ismertetőben áttekintjük, hogyan is működnek
az áramlási citométerek? Hogy detektáljuk a sejtekről
érkező különböző szórt fény típusokat (forward
scatter: FSC; side scatter: SSC; fluorescent scatter: FL)
a készülék különböző optikai csatornáin. Miként lehet
kezelni a keletkezett rengeteg adatot? Hogyan is
vizsgálhatók specifikus fehérjék egyedi sejtekhez kötötten
az FCM segítségével a kutató és klinikai laboratóriumi
munkákban?
Műszeres áttekintés
A 11-20. ábrán sematikusan mutatjuk be a flow citométer
elsődleges rendszerét, az egyes alkotórészeket.
az alábbiak:
• Folyadékrendszer (centrális csőszerű alkatrész a
függőlegesen beinjektált sejtekkel és a köpenyfolyadékkal).
Ez a rendszer hivatott biztosítani a
minta sejtjeinek átfolyását („hidrodinamikai
fokuszálás” ) úgy, hogy e sejtek külön-külön is
mérhetők legyenek (innen származik az áramlási
citométer név is!).
• Lézerek, a látható- és fluoreszcens fény forrásaként.
• Optika, amely összegyűjti és elvezeti a látható a
fluoreszcens fényt.
• Detektorok, amelyek fogadják az egyes fénynyalábokat.
• Elektronikai és perifériás számítógéprendszer (a
komputer alakítja át a detektorokról jövő szignálokat
digitalizált adatokká, és ez végzi a szükséges
elemzést is).
11-20. ábra. Az áramlási citometria (FCM) működésének
elve
(IP: centrális zöld pont, sejtek, köpenyfolyadék; FSC: forward
scatter, előreszórás; SSC: side scatter, oldalszórás;
FL1, FL2, FL3: fluoreszcens csatornák)

Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába
241
A „találkozási pont” (interrogation point, IP) alkotja
a rendszer „szívét”. Ez az a pont, ahol a minta sejtjei
találkoznak a lézersugárral (a lézer a sejteket tartalmazó
folyadékáramot 90°-ban merőlegesen éri!). Az
ütközésből keletkező látható és fluoreszcens fényszórást
az optika gyűjti be.
A legtöbb flow citométerben a beinjektált sejtes
mintákat az áramló sheath-folyadékkal vagy fiziológiás
sóoldattal fokuszálják kb. egy sejtsorátmérőnyi
széles sejtáramra, ezzel megelőzve a „sejttorlódást” és
a gyakori kapillárisdugulást.
Nézzük, hogy milyen mérettartományban tudunk
az FCM-mel mérni? Az FCM-ek általában 3 nagyságrendnyi
részecskeméretben képesek mérésekre: a
legtöbb FCM hematológiai és immunológiai applikációban
az 1-15 μm-es vérsejttartományban működik
(PLT: 2-4 μm, RBC: 6-7 μm, lymphocyta (Ly: 8 μm,
granulocyta (Gran): 12 μm, monocyta (Mo): 14 μm).
Azonban speciális igények esetén kisebb tartományban
(baktériumok: 0,5 μm, mikropartikulumok vagy
mikrovezikulumok: 0,1-1 μm) vagy nagyobb mérettartományban
(tumorsejtvonalak: 20-50 μm, blastocysta:
100 μm) is mérhetünk.
szórt fény kerül mérésre. Mivel a kis sejtek kisméretű,
a nagy sejtek nagyméretű FSC feszültségimpulzust
keltenek, ezért a regisztrált feszültségpulzusok arányosak
az átfolyó sejtek méretével. Ha ezt egy hisztogramon
ábrázoljuk, a kis sejtek balra, a nagy sejtek
jobbra esnek a diagramon (11-21. ábra).
Az FSC hisztogram tipikus egydimenziós méreteloszlási
populációs diagramnak felel meg.
Side scatter (SSC)
Amint ezt láthattuk, a sejteket érő fényszórást nem
csak elölről, de más irányokban is megfigyelhetjük.
Azt a fényszórást, amely nagyobb szögből (általában
90°) detektálható, megegyezés szerint oldalszórásnak
(side scatter, SSC) nevezzük. Az SSC a sejtek szemcsézettségével
(citoplazmagranulumok) és a sejten
belüli struktúrák összetettségével (nagyrészt a sejtmag
alakjával) áll összefüggésben. Az SSC nagysága
arányos a sejtek strukturális komplexitásával. Az SSC
fényt optikai lencsék és tükrök „szállítják” a lézernyalábra
rendszerint merőlegesen (90°-ban) elhelyezett
detektorokhoz. A jeleket az SSC detektor hisztogramokká
alakítja (11-22. ábra).
Az egyes sejtek lézeres vizsgálata
Az FCM módszer alkalmas az egyes sejtek folyadékáramban
lézerrel való vizsgálatára: amint egy-egy sejt
áthalad a lézer előtt, a fény fel-felvillanva töredezik/
szóródik a tér összes lehetséges irányában:
Forward scatter (FSC)
Előre történő (pontosabban 0° körüli) szórás az a
fénypászta, amelyet az elölről (a „lézerrel szemben”)
detektálunk. Az FSC nagysága arányos a sejt nagyságával,
így a FSC paramétert a sejtnagyság mérésére
tudjuk alkalmazni. De hogyan lehetséges a „lézerrel
szemben” sejt eredetű fényszórást mérni? Az FSC
fényt az FSC-detektor felfogja, majd a fényintenzitást
elektromos feszültségimpulzussá alakítja. A legtöbb
FCM-ben a detektort a lézerfény direkt hatásától az
ún. obscuration bar (OB) védi, amelyet közvetlenül az
FS-detektor elé helyeznek. Az OB részlegesen befedi
az FS-detektor elülső központi részét, megvédve azt a
közvetlen lézersugárzástól. Amint az FS lézerfény eléri
az F-detektort, a fény az OB körül (alacsony fokban,
2-3°) szóródik, így kizárólag a sejtekről származó
11-21. ábra. Flow citométeres vizsgálat hisztogramja
11-22. ábra. SSC hisztogram-

242 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Multiparaméteres (többparaméteres)
analízis perifériás vérsejteken (PBC)
Színjelöléssel való kapuzás (colour gating)
Az eljárás lényege, hogy „színjelöléssel való kapuzás”
(colour gating) segítségével kombináljuk az 1D
hisztogramokat: az 1D hisztogramok (FSC, SSC) – a
korábban bemutatott „szürke” formátumban – nem
feltétlenül képesek ábrázolni a sejtpopulációk összetettségét
(összegzett, szummált képet adnak). Például
az olyan sejtcsoportokból, amelyek a „szürke” diagramokon
az egyik dimenzióban homogénnek tűnhetnek
(lásd 11-21. ábra: FSC) [egy színes hisztogram
alkalmazásával, amely „áttükrözi” egy másik dimenzióból
(11-23b ábráról: SSC) az ott sokkal inkább elkülönülő,
eltérő színekkel ábrázolt populációkat], az
egységesnek tűnő „szürke” hisztogramon belül színekkel
láthatóvá tehetők az „egyébként átfedő” sejtpopulációk
(11-23a ábrára: FSC). A 11-23. a ábrán
jól láthatók a piros-zöld-kék színnel elkülönített
(„colour-gated”) lymphocyta-monocyta-granulocyta
(Ly-Mo-Gran) sejtcsopotok.
A 11-23. b ábrán az SSC színes hisztogram dimenziójában
ugyanazok a sejtek (Ly-Mo-Gran) természetesen
azonos színekben jelennek meg, ami lehetővé
teszi azonos populációk eltérő tulajdonságainak
szimultán vizsgálatát.
11-23. ábra. Multiparaméteres analízis
a) Színjelöléssel láthatóvá tett lymphocyta-monocyta-granulocyta
sejtcsoportok; FSC hisztogram
b) Colour gating segítségével készült színes SSC hisztogram
11-24. ábra. Felhődiagram (az FSC és SSC diagram egyesítése)
Színes dot plot (felhődiagram)
Elegánsabb grafikai megoldás, ha a két (FSC és
SSC) hisztogaramot egyesítjük egy 2D pont diagramban,
amelyet színes dot plot-nak („felhődiagram”-nak)
is nevezünk (11-24. ábra): látszik, hogy az
egyesítéshez az SSC hisztogramot egyenes állásban
(X-tengelyhez), az SSC hisztogramot 90°-ban balra
elforgatva (Y-tengelyhez) kell illesztenünk, hogy
a megfelelő színű Ly (vörös), Mo (zöld), Gran (kék)
sejtpopulációk ponthalmazai („felhőkép”) azonos kapuba
kerüljenek.
Íme két emberi vérminta felhődiagram fehérvérsejt-alcsoportjai
az FCM-en:
• Lymphocyták (Ly) kis sejtek (FSC) minimális
belső komplexitással (SSC).
• A monocyták (Mo) kissé nagyobbak (FSC)
mérsékelt belső komplexitással (SSC).
• Granulocyták (Gran), nagyobb a sejtméretük
(FSC) és kifejezett a komplexitásuk (polimorfonukleáris
mag + citoplazmagranuláció). Több
csoportjuk van:
- Neutrophilek. Általában a granulocyták legtömegesebb
képviselői (a 11-25a ábrán: Neu:
narancs).
- Eosinophilek (Eo).
- Basophilek (Ba).
E két utóbbi kisebb granulocytacsoport FCM-en csak
ritkán látható elkülönülten (11-25. ábra a).
SSC-CD45-kapuzás
A felhődiagramokon nem mindig különülnek el egyértelműen
az egyes sejtcsoportok (mint már láttuk, az
Eo és a Ba populációk normál mintákon sem mindig

Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába
243
azonosíthatók, patológiás mintákon pedig gyakori az
„átfedés” pl. myeloproliferativ vagy myelodysplasiás
kórképekben, valamint gyakori a normálistól eltérő
új populációk, vagyis blastok, lymphomás kóros sejtek
megjelenése). Ezen segít a SSC-CD45-kapuzási
technika (SSC-CD45-kapuzás): ebben az esetben a
szokásos SSC paraméter (x tengely) mellett egy kiegészítő
fluoreszcens (FL: y tengely) monoklonális
antitest jelölést, a CD45, pán-leukocyta-antigén jelölést
alkalmazzuk (a fluoreszcens jelölési technika
részleteit később a Fluoreszcencia fejezetben tárgyaljuk).
Ha előzőleg a felhődiagramon (11-25. ábra a)
helyesen kapuztuk az egyes populációkat (Ly: vörös,
Mo: zöld, Neu: narancs), akkor a koherens csoportok
(Ly-Mo-Neu) azonos, „tiszta” színekben jelennek
meg a SSC-CD45-kapuzásban is (11-25. ábra b).
Blast ablak (BL)
Az SSC-CD45-kapuzás igen hasznos „mellékterméke”,
hogy a CD45-negatív, alacsony SSC-vel bíró
sejttörmeléket (kevés pont középen és lent az x tengelyen
a 10°-10 1 log közötti régióban) leválasztja a
mérni kívánt sejtektől (az utóbbiak füzéralakban középen).
Talán még lényegesebb előny, hogy a leírt részecskeeloszlás
kapcsán alakuló pontdiagramon egy
központi (normálisan) jelmentes terület válik azonosíthatóvá,
az ún. blast ablak (BL: blast window),
amely patodiagnosztikai szempontból lehet igen fontos.
A normális sejtek helyét (a bemutatott vérmintában
minimális sejtaránnyal szemben, lásd 11-25.
ábra b, ahol a BL: 0,4%) kóros állapotokban (leukaemiák,
lymphomák) éretlen, blastos sejtek foglalhatják
el, amelyek jelenléte támogathatja a diagnózist, ill. e
sejtek további fenotípusvizsgálatra kikapuzhatók.
A flow citometriában a multiparaméter-analízis
tekinthető a legfőbb diagnosztikai vívmánynak. Így
tudjuk a kóros sejtek egyedi tulajdonságait szimultán
mérni (sejtes koexpressziók) és diagnosztikai értékű
hematológiai, ill. immunológiai információkat gyűjteni.
Fluoreszcencia
Nézzük, hogy ha a látható fény sejtes szórási paraméterei
mellett a fluoreszcens fény vizsgálatát is bevetjük,
milyen további strukturális és funkcionális adatokat
nyerhetünk sejtjeinkről?
Az áramlási citometriában a sejtek fluoreszcens jelölése
révén azok differenciálódási fehérjéit (CD: cluster
of differentiation) vizsgáljuk. A vizsgálatokhoz az
e fehérjékhez kapcsolódó fluoreszcens molekulával
konjugált monoklonális antitesteket (moat) alkalmazunk.
A fluorofór (fluoreszcenciát hordozó molekula)
lézerrel gerjesztett emissziós fluoreszcenciáját mérjük.
A monoklonális antitestek CD osztályozása lehetővé
teszi, hogy a sejtes differenciálódás fehérje antigénjei
között egységes logikai rendszer szerint tudjunk dolgozni.
Itt csak utalunk arra az információtömegre,
amely a CD moat reagensek tulajdonságaival és diagnosztikai
alkalmazhatóságával kapcsolatban az interneten
elérhető (lásd irodalom).
A vérminta egyedi sejtjeinek FCM (áramlási citometriai)
morfológiai parmétereit (FSC és SSC) első
11-25. ábra. SSC-CD45-ös kapuzási technika
a) Emberi vérből készült felhődiagram fehérvérsejt-alcsoportjai [lymphocyta (Ly): vörös; monocyta (Mo): zöld; neutrophil
(Neu): narancs]
b) SSC-CD45-ös kapuzással készült diagram (BL: blast ablak)

244 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
menetben „festetlen” formában vizsgáltuk (1. tesztcső:
autofluoreszcencia) 2D felhődiagramokon.
A további csövekben (2-tól n-ig tetszőleges számú
„festett mintában”: fenotípuspanelben) monoklonális
antitest festéseket is alkalmazunk. Az egyes tesztcsövekben
akár 2-3 vagy több eltérő színű fluorofór jelölt
monoklonális antitestet együtt is alkalmazhatunk: ez
a kombinált színjelölés (11-26. ábra).
Példa egy tipikus hármas színjelölési kombinációra:
a FITC: fluoreszcens izotiocianát (zöld), a fikoeritrin
(PE, vörös) és a peridinin-klorofill-protein komplex
(PerCP, kék) fluorofór konjugátumokat alkalmazhatjuk
a monoklonális antitesteken.
11-26. ábra. Fluoreszcens jelölés alkalmazása vérminta
egyedi sejtjeinek vizsgálatában. A sejtek FCM morfológiai
paramétereinek vizsgálata (magyarázat a szövegben)
11-27. ábra. FCM morfológiai paraméterek vizsgálata hármas
fluoreszcens színjelöléssel
A fluoreszcencia elméleti alapjai
De miként lehet ezeket az eltérő fluoreszcens színemissziókat
(általában FL1: zöld, FL2: piros, FL3:
kék) létrehozni (gerjeszteni) és sejtszinten elkülönítve
mérni? A flow citometria ideális eszköz erre a célra
is. Hogy jobban megértsük az FCM fluoreszcens
technikáját, a fluoreszcencia elméleti alapjaihoz kell
visszatérnünk.
Energiaállapot. A (lézer)fény általi gerjesztés (excitatio)
során a fluorofórmolekula magasabb energiaszintre
emelkedik, majd egy gyors (10 -15 s) és egy
viszonylag lassabb (10 -9 s) visszatérést követve ismét
eléri az alapállapotot. Ezenközben az első fázisban
hőtermelés, a másodikban fénykibocsátás (emissio)
kapcsán távozik a befektetett gerjesztő energia. Az
emissziónak (a hőveszteség miatt) természetesen
kisebb az energiája, nagyobb a hullámhossza (Stokes-shift),
és természetesen az emissziós fény színe
eltér az excitációs fény színétől. Ez a fizikai tény ad
alapot a gerjesztő fényforrás (FCM esetén lézer) és
a sejtjelölő fluorofór (a konjugált monoklonális antitest)
emissziós spektrumának elkülönítésére. Azaz a
jelölt sejt eltérő színben fluoreszkál, mint a gerjesztő
lézer. Az egyes fluorfórok emissziós színe is eltér egymásétól
(11-27. ábra).
Fluoreszcens mérés az FCM-ben
A PBC sejtmintánkban mérendő - fluorofór konjugált
monoklonális antitestekkel festett - sejtek először
is a hidrodinamikusan fokuszált áramlatban
ütköznek a lézernyalábbal, és minden irányban fényszórást
okoznak. A fluorofórok, amelyek az egyes
sejteken utaznak („jelölés”), a lézer fluoreszcens fénye
által azonos hullámhosszon (általában 488 nm)
gerjesztődnek, és szinte azonnal eltérő (fluorofórspecifikus)
hullámhosszokon emittálják a fényt. A fluoreszcens
fényszóródási jel (amely magában foglalja az
egyes fluorofórok által emittált, egymástól eltérő színeket
és ennek megfelelő hullámhosszakat) azután
továbbutazik a műszerben (90°-os szögben elvezetve
optikai filterek és tükrök révén), hasonlóképpen mint
ahogy ezt az SSC szignál esetében már leírtuk (11-28.
ábra).
A megfelelő optikai filterek és tükrök a heterogén
hullámhosszú szórt fluoreszcens fényjeleket azután a
megfelelő hullámhosszakat kimutató detektorokhoz
(FL1, FL2, FL3) osztják le.
A fluoreszcens fényjelekből elektronikus impulzusok
(voltage pulse) és a továbbiakban digitalizált
komputeradatok (data), valamint diagramok (hisztogram,
dot plot) keletkeznek, csakúgy, mint ahogy

Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába
245
11-28. ábra. Fluoreszcens mérés az FCM-ben
ezt az FSC- és SSC-detektálás kapcsán ezt korábban
leírtuk. A fluoreszcensen jelölt sejtcsoportokban az
intenzívebben festődő sejtek („bright”) több sejtfelszíni
jelölődést (ennek megfelelően több sejtfelszíni
fehérjemolekulát), a kevésbé festődők („dim”) kevesebb
sejtfelszíni molekulát hordoznak. Az előbbi
jobbra, az utóbbi balra halmozódik mint elektromos
impulzusjel („voltage pulse” signal) az FL-hisztogramon
(11-29. ábra a).
Az egyes elektromos impulzusjeleket a komputer
elektronikus programja lesimítja a hisztogramokon.
Ennek megfelelően a legtöbb regisztrált fluoreszcens
hisztogram szabályos, közel Gauss-szerű eloszlást
mutat, amelyre jellemző egy többnyire középponti
helyzetű maximális eseményszám (Mean Fluorescent
Intensity, MFI), amelyet alulról és fölülről szimmetrikusan
vesznek körül az alacsonyabb, ill. magasabb
MFI-vel (festődési intenzitással) jellemezhető csökkenő
számú „széli mérési események” (11-29. ábra b;
itt kb. 10°:1 felel meg az MFI-nek az FL1 Log skálán).
Kombinált színjelölés („multicolour labeling”)
A megfelelő színkombinációhoz először is ismernünk
kell az alkalmazandó fluorofórok excitációját és
emissziós spektrumát (11-30. ábra).
Az FITC és a PE gyakran szerepel kettős festési
kombinációkban, ill. gyakori a hármas kombinációként
ezekkel együtt alkalmazott PC5. E fluorofóroknak
közös az excitációs hullámhossza (488 nm hullámhosszúságú
kék argonlézer). Amint az excitációt
biztosító lézer mindhárom fluorofórt az FCM-ben
egyidejűleg stimulálja, akkor az emittált fény háromféle
hullámhossznak megfelelően jelenik meg (FITC:
520 nm: zöld, PE: 580 nm: sárga, PC5 (fluorokróm
R fikoeritrin-cianin 5.1): 670 nm: bordó), így a specifikus
emissziók külön-külön gyűjthetők. Ha ezek
a spektrális maximumok közel esnek egymáshoz,
előfordul, hogy hullámhosszátfedések zavarhatják a
fluorofórok specifikus emisszióinak szelektív begyűjtését
(„spectral overlap”). Ilyen átfedő hullámhosszterületek
előfordulnak az FITC és PE emissziók ese-
11-30. ábra. Kombinált színjelölés (multicolour labeling)
alkalmazása a fluoreszcenciás mérés során
11-29. ábra. Fluoreszcens jelölésű sejtekről készült hisztogram
a) A fluoreszcenciásan jelölt sejtek által előidézett elektromos impulzusjelek szétválása a hisztogramon a sejtek festődésének
mértéke szerint
b) Az impulzusjelek számítógépes átalakítása révén létrejött hisztogram alak

246 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
tében is (a 11-30. ábrán sötét vonalak alatti területek
a FITC, ill. PE görbén), ezek azonban, ha nem érintik
a maximális emissziós hullámhosszakat, akkor kompenzációs
technikával elektronikusan eltávolíthatók
(a részleteket később tárgyaljuk).
Az egymástól távol eső emissziós maximumú
diszkrét emissziós spektrumok esetén, mint pl. PC5
az FITC-vel vagy PE-vel kombinálva nincs hasonló
gond. A hármas és négyes színkombinációk mindennapossá
váltak az FCM-es rutin laboratóriumokban,
ahol általában 1 vagy 2 lézerrel működő flow citométerek
működnek. Újabban a tudományos kutatólaboratóriumokban
akár 10 feletti színkombináció
is elérhető (több szimultán lézerrel rendelkező flow
citométereket alkalmazva). A közeli jövőben ezek is
minden bizonnyal bevezetésre kerülhetnek a rutin laboratóriumokban.
Kétszínű dot plot analízis
Ha két szín kombinációs kísérletet végzünk, ennek
értékeléséhez kvadránsdiagramokat használhatunk,
amelyeken négyféle populáció látható (11-31. ábra a).
• Csak vörös (bright) fluoreszcens sejtek (A1
kvadráns: CD8-PE) a bal felső sarokban (UL:
upper left).
• Csak sárga(bright) fluoreszcens sejtek (A4 kvadráns:
CD4-FITC) a bal alsó sarokban (LR):
lower left).
• Kettős pozitív sárga + zöld sejtek (A2 kvadráns:
CD8-PE+CD4-FITC) a jobb felső (UR: upper
right).
• Kettős negatív sejtek(A3 kvadráns: alacsony
intenzitású „dim” CD8-PE és CD4-FITC),
melyek a bal alsó kvadránsban (LL: lower left).
Normál vér vizsgálatakor (lásd 11-31. ábra a) ez az eloszlás
jellemző az egymás markerexpresszióit kizáró,
un. exkluzív CD4 és CD8 humán perifériás lymphocytapopulációkra
(PBC), azaz gyakorlatilag nincs
CD4 + CD8 kettős pozitív populáció (az A2-kvadráns
mindössze 0,4%).
Ezzel szemben patológiás esetekben (11-31. ábra
b) – például egy LGL-lymphoproliferatív szindrómában,
ahol a kóros sejtek LGL (large granular lymphocyte)
morfológiát mutatnak - már szignifikáns menynyiségű
CD4 + CD8 kettős pozitív (A2 kvadránsban
30%) lymphocyta található, és ennek az eredménynek
akár diagnosztikai jelentősége lehet.
11-31. ábra. Kétszínű dot plot analízis
a) Kétszínű dot plot analízis kvandránsdiagramja egészséges
személy lymphocytáit vizsgálva
b) Kétszínű dot plot analízis kvandránsdiagramja LGL
lymphoproliferativ szindrómában szenvedő beteg lymphocytáiról
Optikai filterek (fényszűrők)
Excitációs (gerjesztési) és/vagy emissziós filtereket
kombinációban alkalmazunk a fluorofórok specifikus
gerjesztésére és emissziós hullámhosszainak
begyűjtésére. Ezt a célt az excitációs filterek a gerjesztő
fényforrás (lézer) legeffektívebb hullámhosszának
szelektív átengedésével, az emissziós filterek pedig a
fluorofór specifikus emissziójából a legintenzívebb
hullámhosszú fény kigyűjtésével érik el (11-32. ábra).
A band pass filterek olyan optikai filterek (fényszűrők),
melyek önmagukban képesek a fluorofórmolekulák
fényemissziós csúcs hullámhosszait (peak
emissions) kiszűrni (band pass emissziós filterek).
Emellett egyes band pass filterekkel megoldhatjuk,
hogy ha a gerjesztő fény túlzottan széles, nem specifikus
spektrummal rendelkezik (pl. halogén fényforrás
esetén) kizárólag a fluorofórokat specifikusan
gerjesztő monokromatikus hullámtartomány jusson
át a készülékbe (band pass excitációs filterek). Minden
erőfeszítésünk ellenére a legtöbb fluorofór excitációs

Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába
247
11-32. ábra. Optikai filter
alkalmazásával készült diagramok
és emissziós spektruma sajnos nem jól körülhatárolható
csúcsokból, hanem gyakran meglehetősen széles
hullámhossztartományban terpeszkedő, szabálytalan
alakú görbékből áll. A spektrális fluorofór emissziós
csúcsok centrális pontjai általában jól körülhatárolhatók
(pl. 520 nm az FITC-re és 580 nm a PE-re). Azonban
pl. az emissziós band pass filterek kiszűrt hullámhossztartományának
szélessége (width) is van (pl. 530
± 30 és 585 ± 42 nm az FITC-, ill. PE-filterekre vonatkozóan).
Ha ez tartalmazza a centrális pontot (PE
brand pass filterre ez 564-606 nm, amely alkalmas
a PE fluorofór 580 nm-es csúcs kiszűrésére) és nem
szűr ki túl széles tartományt (PE: 585 ± 21 nm), akkor
a filter alkalmas a méréshez.
Másfajta filterek is vannak, amelyek párokban
használatosak, ezek a long és short pass filterek. A short
pass filterek bizonyos hullámhossz alatt (cut-off pont
pl. 550 nm), a long pass filterek bizonyos hullámhossz
felett (cut-off pont 610 nm) szűrik a fényt. A short
pass és long pass filterek kombinációjával ugyanúgy
elérhető egy hullámhossztartomány kiszűrése, mint
egy band pass filter alkalmazásával (pl. jelen esetben
az 550-610 nm tartományban az 585 nm-es PE jel
mérhető, az 520 nm-es FITC jel kívül marad). Multiplex
optikai filter és lézer kombinációkkal az FCM
gyártó cégek igyekeznek a felhasználói igényeknek
megfelelő egyedi rendszereket kialakítani.
Kompenzáció
Bár láttuk, hogy az optikai filterek a spektrális fluoreszcens
fény szelektív detektálása terén sok kérdést
megoldanak, azonban nem az összeset. Előfordul,
hogy az egymáshoz közel eső emissziós spektrumok
egy kisebb része a legjobb filterkombinációk ellenére
is kismértékben átfed (spectral overlap). Ezt tapasztaljuk
pl. az FITC és a PE (lásd 11-30. és 11-32. ábra)
esetében is. Ezt a mérési precizitást zavaró hatást fizikailag
nem, csak az elektronikus adatok matematikai
korrekciójával küszöbölhetjük ki. Amennyiben
nem a fluorofórok csúcsemisszióiról, hanem csak a
spektrum „szélső”, kevésbé intenzív emissziójú területeiről
van szó, akkor az FCM-ben a kompenzáció
elnevezésű elektronikus komputeres eljárással a
kis százalékban jelen lévő átfedő hullámhosszterület
emisszióját egyszerűen kivonjuk a szomszédos fluorofór
teljes emissziójából és vice versa (FL1 - FL2%
és FL2 - FL1%). Így vélhetőleg mindkét fluorofór vonatkozásában
korrekt (átfedésmentes) eredményeket
kapunk. Egyes készülékek programjai ezt automatikusan
is el tudják végezni.
Forward scatter treshold
Végül még egy pont, amely érzékenyen érintheti a
flow citométeres adatgyűjtés pontosságát, a treshold
(lefordíthatalan szó, kb. kimutatási szintet jelent, itt
azt a minimális kimutatott részecskeméretet, amely
alatt nem érdemes adatot gyűjteni). Ha minden egyes
11-33. ábra. Számítógépes kompenzáció az elektronikus
adatok matematikai korrekciójával; ezáltal a mérésre nem
érdemes kisméretű részecskék zavaró hatása kiküszöbölhető
(PLT: platelet, vérlemezke; MP: mikropartikulum)

248 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
apró részecskét (< 2 μm) „beengednénk” az FCM-be,
akkor olyan sok jelet kapnánk, hogy a bennünket érdeklő
nagyobb méretű részecskék mennyiségi aránya
vizsgálhatatlanul kicsinnyé válna. Ezért kell egy alsó
mérethatárt meghatároznunk a rutin PBC-méréseknél.
A sejttörmelékek, mikropartikulumok (MP) és
mikrovezikulumok például a FSC/SSC diagramon a
vérlemezkék (PLT) mérethatára alatt vannak (11-33.
ábra).
Ha a mérés célja a vérsejtek (PBC) mérettartományának
mérése (Ly-Mo-Gran, 8-14 μm), akkor az
FSC szokásos cut-off értéke a forward scatter treshold
(általában 50 arbitrary FCM egység, kb.2 μm), ami
egyértelműen kizárja a zavaró kis részecskéket a mérésből.
Kis részecskék mérése
Speciális igények jelentkezésekor, ahol viszonylag
kis részecskéket mérünk az FSC treshold határán (pl.
kis vérlemezkéket, PLT), akkor egy másik, fluoreszcens
tresholdot is alkalmazhatunk. A vérlemezkéket
specifikus CD61 monoklonális antitest festődésük
alapján választjuk ki a méréshez (ebben benne lesznek
a méretre „határeset” microthrombocyták is), így
azonban minden más FCM részecskét – méretétől
függetlenül mindent, ami nem vérlemezke – kizárunk
a mérésből. Ha az FCM mérésünk során kifejezetten
a kisméretű részecskékre (pl. mikropartikulumokra)
összpontosítunk, akkor a leírtakkal ellentétben
semmiféle méret-tresholdot nem alkalmazhatunk,
hacsak nincs valamilyen mikropartikulumokra specifikus
fluoreszcens markerünk (pl. FL-treshold Annexin-V-FITC-re).
A következő ábrán (11-34. ábra
a) a treshold kikapcsolásával láthatóvá válik, hogy
az mikropartikulumok nagyobb része (piros pontok)
csak így jelenik meg. Amig korábban a treshold alatt
voltak a mikropartikulumok, nagyrészt kimutatlanul
(összevethető a 11-33. ábrával: ahol kevés mikropartikulum
van a PLT régió alatti részében, piros
populáció 4,6%;. kék populáció). Az is látható, hogy a
treshold feloldásával a mikropartikulumokra (piros)
annyira dominálnak, hogy a PLT (kék) populáció
mennyisége egészen háttérbe szorul.
A kis részecskék szelektív elemzésében egy másik
speciális lehetőség, hogy a mintához kevert standard
kisméretű fluoreszcens jelölésű műanyag mikrogyöngyökkel
(microbead, MB: zöld) pontosan meghatározhatjuk
pl. a mérendő mikropartikulumok mérettartományát
(felső határ: 0,9 μm MB és alsó határ: 0,5
μm MB), és szelektíven kapuzva csak innen mérünk.
Sejtszámmeghatározás mikrogyöngyökkel - one
platform FCM-analízist
Mikrogyöngyökkel abszolút sejtszámmeghatározást
is végezhetünk az FCM-en. A 11-34. b ábrán
egy nagyobb méretű MB (3 μm) alkalmazását látjuk
mikropartikulummérés során. Ennek a mikrogyöngynek
a részecskekoncentrációja standard (6 ×
10 6 részecske/ml). Ha az ismeretlen koncentrációjú
MP mintánkhoz sztöchiometrikus arányban keverjük
az MB-t, a százalékos arányok megoszlása alapján,
aránypár segítségével könnyen kiszámíthatjuk
11-34. ábra. Igen kis méretű részecskék vizsgálata
a) Vizsgálat a treshold kikapcsolásával
b) Fluoreszcensen jelöl mikrogyöngyökkel (MB, microbead) végzett abszolút sejtszámmeghatározás

Sejtes elemek differenciálása: flow citometria – Bevezetés a flow citometriába
249
az ismeretlen minta koncentrációját. Ezt az ún. one
platform FCM analízist (ismert koncentrációjú mikrogyöngyöt
keverünk ismeretlen koncentrációjú részecskékkel)
a klinikai laboratóriumi gyakorlatban
is alkalmazzuk: a csontvelői őssejt transzplantáció
során. A multicolour (azaz kombinált színjelöléses
CD34 + CD45 + CD133 monoklonális antitestest
festésekkel azonosított) őssejtek a perifériás vérből
vagy csontvelőből csak rendkívül kis arányban
nyerhetők („low incidence stem cell population”).
Az egyéb sejtek keverékével együtt a recipiensbe
beadott őssejtek abszolút számának meghatározása
elengedhetetlen a terápia várható hatékonyságának
megítélésére, ez technikailag azonban nagy kihívás
az FCM számára. A pontatlan volumetriás őssejtmérési
technikák helyett ez esetben is az ismert koncentrációjú
mikrogyöngyökkel végzett one platform
FCM analízis ajánlott.
FCM minőségi kontrollja mikrogyöngyökkel
Végül a mikrogyöngyök az áramlási citometria minőségi
kontrolljában (quality control, QC) is nélkülözhetetlenek.
FCM műszeres QC célokra a gyártók
a gépek rendszeres ellenőrzése és beállítása céljára 3
mérettartományban és 5 fluorofór jelöléssel biztosítanak
beállításra való (setting) mikrogyöngyöket, hogy
az FCM korrekt működésében mindig biztosak lehessünk
már mérés előtt (11-35. ábra).
11-35. ábra. FCM minőségi kontrolljára gyártott mikrogyöngyökkel végzett vizsgálat

250 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Irodalom
www.invitrogen.com/resources/education/tutorials
CD moat reagensek tulajdonságai: http://en.wikipedia.org/
wiki/Talk:Cluster_of_differentiation,http://www.clinicalflow.com/Cases/Introduction_to_Flow_Cytometric_Analysis/Cluster_of_Differentiation_(CD_Markers)
http://www.lumrix.net/medical/immunology/
cluster_of_differentiation.html
kombinált színjelölés: www. invitrogen.com/ etc/medialib/
en/filelibrary/pdf.Par.38320.File.dat/flow_worksheet.
pdf
Baumgarth, Nicol, Roederer, M.: A practical approach
to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.
Journal of Immunological Methods 243 77–97, 2000.
www.elsevier.nl / locate /jim
Berki Tímea: Áramlási cytometriai vizsgálatok autoimmun
betegségekben (vizsgálati tájékoztató). Immunbiológiai
és Immuntechnológiai Intézet (IBI). http://www.
pote.hu/ibi
BD Bioscience: Introduction to Flow Cytometry: a Learning
Guide. Manual Part Number 11-11032-01. 2000.
http://www.bdbiosciences.com/home.jsp
BD Flow cytometry on-line training. http://www.bdbiosciences.com/support/training
Beckman Coulter FC500 CXP Training manual 130105
2004. https://www.beckmancoulter.com/eCatalog/Catalog/Flow_Cytometry
Beckman Coulter on-line training. Animated flow cytometry
theory. http://www.coulterflow.com/bciflow/
theory.php
Jabłoński, A. http://en.wikipedia.org/wiki/Jablonski
Jáksó P.: A Flow Cytometria (FCM) alkalmazása a pathologiában”
(PhD kurzus, évente); Pécsi Orvostudományi
Kar, Pathológiai Intézet http://www.pote.
hu/index.php?page=egyseg&egy_id=230&menu=dinam&dmid=117&nyelv=hun
Kappelmayer J.: Flow cytometria (áramlási cytometria) a
diagnosztikában. Debreceni Egyetem KBMPI oktatási
anyaga http://kbmpi.deoec.hu/info.aspx?sp=1
Kriván G., Karászi Éva, Gopcsa L. és munkatársai: Az
áramlási citometria klinikai alkalmazása. Clinical use of
of flow cytometry. Focus Medicinae 4:2-7., 2009. http://
www.pharmaline.hu/index.php?page=medkat&kod=-
FOM&mode=show&order=kiado
Magyarlaki T., Tőkés-Füzesi Margit: Tájékoztató az
áramlási cytometria klinikai laboratóriumi hematológiai
alkalmazásáról. Pécsi Tudományegyetem Orvoskar
Laboratóriumi Medicina Intézet, 2001 (revised 2008).
http://aok.pte.hu/index.php?page=egyseg&nyelv=hun-
&egy id=140&egy=140
Matolcsy A., Udvardy M., Kopper L.: Hematológiai
betegségek atlasza. Medicina Könyvkiadó, Budapest,
2006. http://www.medicina-kiado.hu/
Pálinger Éva: Áramlási cytometriai vizsgálatok (Felhasználói
tájékoztató). Semmelweis Egyetem, Genetikai,
Sejt és Immuniológiai Intézet. http://www.dgci.sote.hu/
Robinson, J. P. (ed.): Handbook of Flow Cytometry Methods.
Wiley-Blackwell, 1993. http://eu.wiley.com/WileyCDA/

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
251
Autoimmun kórképek
diagnosztikai lehetőségei
Berki Tímea
Az autoimmun betegségek jellemzői
Autoimmun betegségek azok az ismeretlen etiológiájú,
progrediáló, gyulladásos-degeneratív betegségek,
amelyekben az immunrendszer valamely szabályozási
zavar miatt a saját struktúrák ellen indít el reakciót.
Ennek bizonyítékai a betegségre jellemző, sokszor
már előtte megjelenő autoantitestek, amelyek patogenetikai
jellege sokszor nem bizonyítható, de jól jelzik
a betegség típusát, némelykor annak aktivitását is.
Autoantitestek. Az emberi szervezetben kétféle autoantitestet
(AAT) különböztetünk meg, az egyik a
természetes autoantitestek, a másik a patológiás autoantitestek
csoportja:
• A természetes autoantitestek hálózata az immunrendszer
részeként, a saját, ősi, konzervatív
molekulák leképezései, azok védelmét szolgáló
antitestek, amelyek az ún. „immunológiai
homunculus”-t alkotják. Ezek az antitestek az
egyénre jellemzőek. Már csecsemőkorban
kimutathatók, és jellemző, hogy alacsony affinitású,
polireaktív, általában IgM izotípusú antitestek,
a szérumban pg/ml koncentrációban
vannak jelen. Autoantitestek nagyobb koncentrációban
megjelenhetnek átmenetileg bizonyos
betegségekben, mint fertőzések, sérülések, regeneratív
folyamatok, de az immunrendszer szabályozó
mechanizmusai normális esetben a
betegség lezajlása után visszaállítják az egyensúlyt,
és az autoantitestek eltűnnek.
• A patológiás autoantitestek valamely autoimmun
betegség részeként jelennek meg, általában
IgG vagy IgA, ritkábban IgM izotípusúak és
nagyobb a szérum koncentrációjuk (ng/ml, mg/
ml) (11-6. táblázat).
A szérumban mért autoantitestek önmagukban tehát
nem jelentik valamely betegség diagnózisát. Viszont
segítik a klinikust a színes tünettanú autoimmun betegségcsoportban
elhelyezni a betegséget, segítenek
a differenciáldiagnosztikában („marker antitest”), a
betegség progressziójának követésében, a prognózis
felállításában. Némelyik autoantitest alkalmas a betegség
aktivitásának, a terápia eredményességének
nyomon követésére is (11-7. táblázat).
Autoimmun betegségek tényezői. Az autoimmun betegségek
kialakulásában számos tényező játszik szerepet.
• Így a genetikai hajlam jellemző bizonyítéka az
egyes kórképek HLA- vagy egyéb génekkel való
szoros asszociációja.
• A jellemző női dominancia felhívja a figyelmet
a hormonális tényezők befolyásoló szerepére.
Jellemzően fiatal nőkben kialakuló betegségek
ezek, amelyek progresszióját a hormonális státus
változása pl. terhesség, laktáció idején jelentősen
befolyásolhatja.
• Különféle külső, provokáló tényezők szerepének
bizonyított volta így bizonyos vírusok, bakteriális
infekciók, vegyszerek, munkahelyi ártalmak
provokálhatják egy-egy betegség kialakulását,
manifesztációját, ill. a nyugvó betegség fellobbanásához
vezethetnek.
11-6. táblázat. Természetes és patológiás autoantitestek összehasonlítása
Jellemző Természetes AAT Patológiás AAT
izotípus legtöbbször IgM IgG, IgA vagy IgM
koncentráció pg/ml ng/ml, mg/ml
affinitás alacsony nagyobb
reaktivitás polireaktív monoreaktív
termelő sejt B1-sejt konvencionális B-sejt
T-sejt-függés T-independens T-dependens

252 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-7. táblázat. Autoantitestek laboratóriumi kimutatásának jelentősége
Antitest alkalmazása
diagnózis felállítása
stádium (aktív-inaktív) megítélése
alcsoport, rizikócsoport elkülönítése a kórképen belül
prognózis megállapítása
terápia eredményességének lemérése
több kórkép egyidejű fennállásának (overlap) megállapítása
A célra felhasználható antitest
dsDNS, CCP, kardiolipin stb.
dsDNS, ANCA
Scl-70, Cenp-B
Cenp-B, Scl-70
foszfolipid, dsDNS, ANCA
ENA-G
Az autoimmun betegségek típusai
Attól függően, hogy az immunrendszer a szervezet mely
struktúrája ellen irányul, megkülönböztetünk szisztémás
és szervspecifikus autoimmun betegségeket.
A szisztémás kötőszöveti betegségek prototípusa
a szisztémás lupus erythematosus (SLE), amelyre
jellemző a szervezet minden sejtjében előforduló
antigének elleni immunreakció, legjellemzőbben az
antinukleáris autoantitestek megjelenése. Ebben a betegségben
jellemző még antigén-ellenanyag immunkomplexek
megjelenése a keringésben, azok lerakódása
különböző szervek hurokkapillárisaiban (vese,
ízületek, szív, tüdő, agy stb.), ahol a komplementrendszert
aktiválva gyulladásos reakciót hoznak létre.
A szervspecifikus auto immun betegségekben az autoimmun
reakció viszont általában egyetlen antigén
(pontosabban egyetlen szerv, egyetlen sejttípus néhány
antigénje) ellen irányul, és ennek a szervnek a
betegségét, esetenként pusztulását okozza. A szervspecifikus
autoimmun betegség közismert példája a
Hashimoto-tyreoiditis, amelyben az autoimmun re-
11-8. táblázat. Betegségcsoportokra jellemző autoantitestek
Betegség
Szisztémás betegség
SLE
Sjögren-szindróma
SSC
vasculitis
myositis
foszfolipid-szindróma
RA, JRA
Szervspecifikus betegség
thyroiditis
coeliakia
1-es típusú diabetes mellitus
primer biliaris cirrhosis
colitis - Crohn-betegség
Goodpasture-szindróma
Autoantitest
dsDNS, nukleoszóma, ENA: Sm, RNP
SSA, SSB
Scl-70, centromer (Cenp-B)
ANCA: MPO, PR3
Jo-1, Rib-P, SRP, Ku, Mi-2, PL-7, PL-12, PMScl-100
kardiolipin, b 2
-GP1, foszfatidilszerin, protrombin
CCP, rheumatoid faktor
tireoglobulin (TG), thyroidea-peroxidáz (TPO)
szöveti transzglutamináz (tTG), gliadin
glutaminsav-dekarboxiláz (GAD), tirozin-foszfatáz (IA2)
M2-mitokondriális (PDH)
ASCA-PR3
GBM
ENA: extrahálható nukleáris antigén

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
253
akció a pajzsmirigy lassú pusztításával hypothyreosishoz
vezet (11-8. táblázat).
A legismertebb szisztémás autoimmun betegségek:
• Szisztémás lupus erythematosus (SLE) és rokon
betegségek (dis coid lupus, szubakut cutan lupus
erythematosus).
• Rheumatoid arthritis (RA) és az ezzel rokon
betegségek, mint pl. a juvenilis krónikus arthritis
(JCA) stb.
• Antifoszfolipid-szindróma (APS).
• Sjögren-szindróma (SS).
• Progresszív szisztémás sclerosis (PSS) és az
ezzel rokon betegségek.
• Kevert kötőszöveti betegség (MCTD).
• Polymyositis/dermatomyositis (az „idiopathiás
gyulladásos myopathia” csoport betegségei).
• Szisztémás vas culitisek.
• Nem differenciált kötőszöveti betegség (UCTD),
más néven: nem differenciált collagenosis
(NDC) vagy nem differenciált autoimmun
betegség (NDAS) valójában nem önálló betegség,
hanem bizonyos szisztémás kórképek (pl.
SLE, PSS stb.) kezdeti vagy átmeneti („over lap”)
formája. A kezdetben ilyen diagnózissal kezeltek
egy részének betegsége később, újabb tünetek,
manifesztációk megjelenése után definitív
SLE, PSS stb. betegséggé alakul.
Egy-egy példa a szervspecifikus autoimmun betegségekre
szervek szerint:
• Bőr: pemphigus vulgaris.
• Endokrin rendszer: Hashimoto-thyreoiditis.
• Gyomor-bél rendszer: autoimmun gastritis,
anaemia perniciosával vagy a nélkül.
• Idegrendszer: sclerosis multiplex.
• Máj: primer biliaris cirrhosis.
• Szív: autoimmun myocarditis.
• Tüdő: idiopathiás tüdőfibrosis.
• Vese: Goodpasture-szindróma.
• Vér: autoimmun haemolyticus anaemia.
Az autoimmun betegségek
diagnózisának kérdései
Az autoimmun betegségek nagy részének felismerését
diagnosztikai vagy klasszifikációs kritériumok
segítik. A klinikusnak számos tüneti, anamnesztikus
és diagnosztikus paraméter együttes fennállását figyelembe
véve, egy pontrendszer alapján szabad csak
kimondania a diagnózist. A szisztémás kötőszöveti
betegségek közül az SLE, az RA, a JCA, az MCTD,
az SS, a PSS, a polymyositis/dermatomyositis, az APS
és a szisztémás vasculitisek kritériumrendszere széles
körben használatos. Ennek csak egy része a klinikai
immunológiai laboratóriumból származó autoantitest
és egyéb immunológiai és gyulladásos paraméterek
(vérkép, vérsejtsüllyedés, CRP, komplement stb.)
eredménye (11-9. táblázat).
Ezért nagyon fontos, hogy ezt a klasszifikációs score-rendszert
(pontrendszert) jól ismerő szakorvos állapítsa
meg a diagnózist, kérje a konkrét autoimmun
betegség gyanúját alátámasztó célzott laboratóriumi
autoantitest-vizsgálatokat. A hozzá nem értő klinikust
önmagában az autoantitest jelenléte téves diagnózishoz
és a betegség fel nem ismeréséhez, hibás
terápiához vezetheti. Az autoimmun betegségek sokfélesége
miatt a legtöbb esetben az immunológiai laboratóriumi
diagnosztikai eljárások szűrővizsgálatra
nem alkalmasak – nincs „autoimmun laboratóriumi
diagnosztikai panel”. Tehát célszerű a betegek anamnézise,
tünetei és a rendelkezésre álló egyéb leletek
alapján valamiféle iránydiagnózist készíteni, és ennek
megfelelően kérni a speciális vizsgálatokat. Fontos azt
11-9. táblázat. Általános laboratóriumi eltérések
• Gyorsult süllyedés
• Hypocomplementaemia
• Vizeleteltérések (haematuria, proteinuria, cylindruria stb.)
• Leukopenia, thrombocytopenia
• Anaemia (normocytás, normochrom, Coombs-pozitivitás)
• Autoantitestek jelenléte (nukleoszóma, dsDNS, anti-Sm, antifoszfolipid AAT stb.)

254 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
is tudni, hogy önmagában egy-egy auto antitest kimutatása
egyáltalán nem jelzi az autoimmun betegség
jelenlé tét. Tehát ha a kérdéses beteg – pl. antinukleáris
antitest (ANA-) vagy rheumafaktor- (RF-) pozitív,
ettől még akár egészséges is lehet. Az immunológiai
laboratóriumi tesztek döntő többsége nem kellően
specifikus, és nem is elég érzékeny, pl. a rheumafaktor.
Vannak specifikusabb és elég szenzitív markerek,
amelyek a betegség aktivitását jól jelzik, pl.: dsDNS,
ANCA, foszfolipidantitestek, CCP.
Az autoantitest-meghatározás módszertana
A különböző autoantitest-meghatározási módszerek
az antinukleáris autoantitest mérési lehetőségein keresztül
kerülnek bemutatásra. Az egyes módszerek
előnyei, hátrányai szintén itt kerülnek tárgyalásra. A
többi autoantitestnél a mérési módszert csak megemlítjük.
Antinukleáris autoantitestek a szisztémás
kötőszöveti betegségek elkülönítésében
Az antinukleáris antitest (ANA) vagy antinukleáris
faktor (AF) kifejezés a sejtmag különböző komponensei
ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve.
Ma már jól definiált, a sejtmagból tisztított vagy rekombináns
technikával előállított antigének állnak
rendelkezésre e nagy autoantitest-csoport egyes típusainak
elkülönítésére. Ezen ellenanyagok pontos kimutatása
a szisztémás autoimmun betegségek laboratóriumi
diagnosztikájának legfontosabb része. Segítik
a differenciáldiagnózist, egy adott betegségen belüli
alcsoportba sorolást, számos esetben a betegség aktivitásának
és prognózisának megítélését. Néhány
autoantitest az egyes kórképek diagnosztikai kritériumai
között is szerepel (11-10. táblázat).
Indirekt immunfluoreszcencia
Az immundiagnosztikai laboratóriumok számos
módszert alkalmaznak az ANA kimutatására, amelyek
között a legrégebbi az indirekt immunfluoreszcens
(IIF) technika. Mintaként kezdetben rágcsálókból
származó szervmetszeteket, majd a nyolcvanas
évektől egy humán eredetű sejtvonalat, a HEp-2 sejteket
[Human Epithelioma Type 2 Cells (CCL-23)
- American Type Culture Collection] használták, ill.
használnak ma is. A HEp-2 sejtek alkalmazásának
nagy előnye, hogy a kitapadó sejtek nagy sejtmagja,
jól látható citoplazmája miatt az ANA több külön-
11-10. táblázat. A leggyakoribb antinukleáris autoantitestek prevalenciája és relevanciája
AAT Asszociált betegség AAT-frekvencia (%) IIF-mintázat
SSA (Ro)
SSB (La)
SLE
Sjögren-szindróma (SS)
neonatalis lupus
Sjögren-szindróma
SLE
25-35
40-70
100
30
10
finoman pöttyözött sejtmag
finoman pöttyözött sejtmag
Sm SLE (specifikus) 15-30 durván pöttyözött sejtmag
RNP
MCTD (kevert kötőszöveti betegség:
Raynaud-szindróma, sclerodactylia,
oesophagusdysmotilitas)
95
SS 20
SLE 30-50
nagy, durván pöttyözött sejtmag
Scl-70 scleroderma 20-35 granuláris, nukleoláris/homogén mag
Jo-1 polymyositis 20-40 pöttyözött, citoplazmatikus
Cenp-B
scleroderma
CREST variáns
limitált SS 80
SS 20
hiszton drog indukálta SLE 90 homogén mag
dsDNS SLE (specifikus) 40-60 homogén mag
diszkréten pöttyözött, a metafázisban
lévő sejtekben

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
255
böző típusa különíthető el rajta (eltérő fluoreszcens
festődési mintázatot adva), valamint az osztódó sejteken
a sejtciklusfüggő autoantitestek is jól látszanak
(11-36. ábra). Mindezek miatt a HEp-2 sejteken végzett
IIF-vizsgálatot az ANA-kimutatás „gold standard”-jának
(referenciamódszerének) tekintjük.
Az ANA kimutatása ezzel a módszerrel szűrővizsgálat,
mert a mikroszkópban látott kép csak egyes
esetekben teszi lehetővé az antitest pontos azonosítását.
Az esetek többségében az ANA specificitásának
kimutatását további, antigénspecifikus indirekt ELI-
SA vagy immunoblot-vizsgálatokkal végezzük.
Az indirekt immunfluoreszcens technikával végzett
ANA-kimutatás diagnosztikus kitek (tesztek)
használatával is időigényes, sok manuális munkát és
nagy gyakorlatot kíván. Értékelése tapasztalatot és
gyakorlatot igényel, ugyanakkor bizonyos mértékig
szubjektív. Emiatt csak immunológiai centrumokban
javasolt végezni, ahol mind a kellő mintaszám, mind
a kellő gyakorlat rendelkezésre áll.
Az indirekt immunfluoreszcencia előnyei:
• A vizsgálathoz használt antigén természetes
környezetében látható.
• A mintahígítás változtatásával (csökkentésével)
a metodika érzékenysége fokozható.
• Az inkubációs idő növelésével a vizsgálat érzékenysége
növelhető.
• A beteg különféle autoantitestjei sokszor nem
tankönyvi vagy jól ismert formában jelennek
meg - ilyenkor lehetőség van sejt/szövet/szerv
metszetek kombinált használatára (biochip).
11-36. ábra. ANAscreen indirekt immunfluoreszcencia
(IIF). Több különböző autoantitest összefoglaló elnevezése.
Szűrőteszt, a leggyakrabban kért vizsgálat
Hep-2 sejt. 1.: szérum-AAT; 2. antihumán IgG-FITC
• Az antihumán IgG, IgA vagy IgM-PO (peroxidáz)
konjugátum változtatásával az autoantitest
izotípusa is meghatározható.
• Szűrésre alkalmas.
• Kis mintaszám esetén is olcsó, részben automatizálható.
Az indirekt immunfluoreszcencia hátrányai:
• Kiértékelése gyakorlatot igényel.
• A kiértékelésben sok a szubjektív elem.
• Fluoreszcens mikroszkóp szükséges.
• Heterofil antitestek zavaró hatása.
• A háttér-fluoreszcencia zavaró hatása.
• Aspecifikus lelet nem ritka.
• Konfirmáló metodikára van szükség (dsDNS,
ENA-6 stb.).
• Nagy mintaszériára megszorításokkal alkalmas.
ANA ELISA-szűrőteszt (screen)
Az utóbbi években azonban számos cég ANA kimutatására
alkalmas ELISA teszteket ún. ANAscreen
ELISA-t hozott forgalomba. Az ELISA technika számos
előnnyel rendelkezik az indirekt immunfluoreszcencia
technikához képest: kivitelezése egyszerű, automatizálható,
értékelése objektív, nagyszámú minta
egyidejű vizsgálatára alkalmas. Magyarországon is
sokféle ANA-ELISA teszt kapható, de hiányoznak
azok az összehasonlító vizsgálatok, amelyek a tesztek
eredményeit összevetik egymással és a standard indirekt
immunfluoreszcencia technika eredményeivel
(11-11. táblázat).
Az elméleti megfontolások legfontosabb tárgya az
alkalmazott antigén. Mivel szűrővizsgálatról van szó,
célszerű olyan tesztet választani, amely valamennyi
nukleáris antigént tartalmazza.
A 11-37. ábrán látható tesztben az ELISA-lemezt
a következő, HEp-2 sejtek magjából kivont antigének
keverékével érzékenyítik:
• dsDNS
• hiszton
• centromer
• SSA/Ro, SSB/La
• Sm, Sm/RNP
• Scl-70, Jo-1
Pozitivitás esetén egy-egy antigénnel fedett külön
ELISA-lemezeken „kifejtő” vizsgálatok következnek.

256 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-11. táblázat. ANA-mintázat, ANA/ENA antigén és egyes betegségek összefüggése
ANA HEp-2 mintázat Antigén Betegség
homogén ds-DNA-hiszton komplex SLE
foltos, szemcsés
nukleoláris
Sm
RNP
SS-A
SS-B
centromer
nukleoláris RNS
Scl-70
PM-Scl
SLE
MCTD
Sjögren-szindróma, SLE, RA
scleroderma, CREST, PBC
scleroderma
scleroderma myositis
scleroderma overlap
citoplazma Jo-1 riboszóma polymyositis/dermatomyositis
A gyakran előforduló, jól definiált autoantitesteken
kívül vagy azok mellett ugyanis számos egyéb,
ritkábban előforduló vagy nem pontosan azonosított
ellenanyag is jelen lehet, amelyeknek ugyanúgy
diagnosztikai, differenciáldiagnosztikai, prognosztikai
jelentősége van (pl. magmembrán elleni antitest
antifoszfolipid-szindrómában, PCNA elleni antitest
SLE-ben stb.). Amikor egy ANA-ELISA tesztben
csak néhány antigént kötnek a szilárd fázishoz, akkor
csak az ezek ellen irányuló antitesteket lehet kimutatni,
minden egyéb sejtmagkomponens elleni antitest
láthatatlan marad. Ezért célszerű olyan ANAscreen
ELISA tesztet választani, amely a HEp-2 sejtek lizátumát
is tartalmazza. Ugyanakkor ebben az esetben
sokszor előfordul olyan pozitív szűrőteszteredmény,
amelynek specificitását az antigénspecifikus ELI-
SA-tesztekkel nem tudjuk azonosítani (11-38. ábra).
Probléma lehet az ANAscreen ELISA érzékenysége is,
ami azt eredményezi, hogy fontos ellenanyagok (pl.
anti-dsDNS) alacsonyabb koncentrációját nem jelzi
(11-12. táblázat).
11-37. ábra. ANAscreen microplate ELISA befejező mozzanata
11-38. ábra. Antigénspecifikus autoantitest ELISA
ANA-immunoblot
Az antinukleáris autoantitestek szemikvantitatív
meghatározásának egyik lehetősége az immunoblot
módszer. A tesztben nitrocellulózcsík felszínére immobilizált
autoantigének szolgálnak reakciófelszínnek
(11-39. ábra).
Előnyei:
• Egyszerre egy mintából több antigénre specifikus
autoantitest kimutatására alkalmas, vagyis
multiplex módszer.
• Gyors.
• Egyetlen beteg mintája is vizsgálható vele.

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
257
11-12. táblázat. Az antinukleáris autoantitest ELISA-szűrővizsgálat elemzése
Az ANA-ELISA előnyei
• Nagy szenzitivitás
• Kis és nagy aviditású antitestek kimutatására egyaránt alkalmas
• Kvantitatív meghatározás
• Izotípus-meghatározás lehetséges
• Automatizálható
• Nagyszámú minta gyors és olcsó vizsgálata
Az ANA-ELISA hátrányai
• Sokszor bizonytalan antigén(forrás)
• Bizonytalan antigéntisztaság
• Egyedi standardok és kontrollok
• A nemzetközi standardizálás hiánya
• Aspecifikus reakciók okozta álpozitivitás (CIC, RF, immunglobulinok)
Hátrányai:
• Az antigének többnyire rekombináns fehérjék
vagy tisztított nukleoproteinek, melyek a nitrocellulóz
felszínére immobilizálva más konformációt
vesznek fel, mint pl. az ELISA-lemez
felszínén abszorpcióval kikötött antigének.
Ennek az a következménye, hogy bizonyos antigéndeterminánsok
(epitópok) eltűnnek, vagy új
epitópok kerülnek a felszínre a harmadlagos
szerkezet változása miatt. Így előfordulhat, hogy
bizonyos, az indirekt immunfluoreszcenciában
vagy ELISA-ban mért autoantitestek nem,
mások pedig nemspecifikusan oda tudnak
kötődni az immunoblot felszínéhez.
• Előfordulnak álpozitív és álnegatív reakciók.
• Nem vizsgálható egyszerre sok antigén.
Gyorsasága, egyszerű kivitelezhetősége miatt olyan
laboratóriumokban alkalmazzák, ahol kicsi a mintaszám.
Nem igényel speciális felszereltséget, leolvasását
szemmel (vizuálisan) vagy egy szkennerhez
(optikai kiértékelőhöz) kapcsolt automatikus analizáló
szoftver segítségével végzik. Ugyanakkor kevésbé
tartják specifikusnak, mint az előző két módszert,
főleg az antinukleáris antitestek megbízható meghatározására.
Ugyancsak hátránya, hogy nem minden
autoantigén immobilizálható (pl. kardiolipin, foszfolipidek
stb.) a nitrocellulóz- vagy egyéb felszínhez.
Multiplex autoantitest-meghatározási
módszerek
11-39. ábra. ANA-profil immunoblot
A legújabb technológiai fejlesztések olyan irányba
haladnak, hogy a minta egyszeri felhasználásával,
egy méréssel 5-100 különböző autoantitest koncentrációját
tudjuk detektálni. Ezek a multiplex mérési
módszerek két nagy kategóriába sorolhatók az alkalmazott
szilárd hordozó alapján. Az egyik esetben a
mikrochip technológiára adaptálták az immunoas-

258 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
say-t, a másikban méret vagy fluoreszcencia alapján
jól elkülöníthető mikropartikulumokra.
Mindkét esetben a kritikus lépés az antigén felvitele
a szilárd hordozó felszínére az antigenitás megtartásával.
A cél olyan méréstechnika optimalizálása,
amelyben a standard antigénspecifikus ELISA-val
egyenként mért autoantitest eredmények egy mérésben
reprodukálhatók.
11-40. ábra. Autoimmun MicroSpot Protein Array
Az ábrán 14 szisztémás autoimmun betegséget jelző autoantitestet
mérnek egyszerre, egy mintából. 1-5: kalibrátor;
6: Cenp-B; 7: Ui-70k; 8: Sm; 9: SSA/Ro52; 10: SSA/Ro60;
11: SSB/La; 12: Mi-2; 13: PM/Scl-75; 14: PM/Scl-100; 15:
Jo-1; 16: Scl-70; 17: PR3; 18: MPO; 19: dsDNS; 20: puffer;
21: pozitív kontroll
MicroSpot Assay
A mikrochip hordozó felszínén kis, elkülönített
területekre viszik fel a különböző antigéneket az ún.
„micro-dot” technológiával. Így akár 200 különböző
antigénspecifikus reakcióhelyet tudnak létrehozni
(„nyomtatni”) egy 3-6 mm nagyságú nitrocellulóz
felszínre (Ekins, 1998). Minden egyes reakcióhely
(antigén) egy 80 μm átmérőjű terület, amelyre kevesebb
mint 1 nL mennyiségű antigént „nyomtatnak”
egy automatával (11-40. ábra). Ebben az eljárásban a
microspot felszínén befogott autoantitest mennyisége
olyan kicsi, hogy ez nem befolyásolja annak koncentrációját
a mintában, még akkor sem, ha a kötés
nagy affinitású. Ilyen körülmények között a mintából
kifogott autoantitest mennyisége közvetlenül tükrözi
annak koncentrációját. Érdekes, hogy a koncentrációmérés
ilyen környezeti („ambiens”) analit körülmények
között független a minta volumenétől,
és a kis mintafelhasználás ellenére nagyon szenzitív.
Ennek két oka van: egyrészt a kötés a legmagasabb
célmolekula-koncentráción zajlik, másrészt a befogó
molekula-analit komplex egy nagyon kis felületen található,
nagy jelet okozva ott.
A mérési formátum egy kétlépéses fluoreszcens
immunoassay, ahol a fluoreszcens jelet egy lézerdetektor
méri.
Áramlási citometriás immunoassay - multiplex
microbead assay
A Luminex cég (Austin, TX, USA) kifejlesztett
egy áramlási citometriás mérési elven alapuló, multiparametrikus
fluoreszcens immunoassay-t. Ebben a
rendszerben két különböző fluorofór különböző koncentrációival
feltöltött latexgyöngyök (bead) szolgálnak
szolid fázisként. Ezek a részecskék az áramlási
citométeren mind külön csoportként jelennek meg.
A több mint 60 különböző tulajdonságú partikulum
mindegyike külön célmolekula (autoantitest) mérésére
szolgál, egy mintából. Egy adott gyöngycsoportból
kb. 1000 darab képezi a reakciófelszínt, amelyhez
az adott antigént kovalens kötéssel kapcsolják. Az autoantitest
kötődését a mikrogyöngyökhöz egy második
színű fluoreszcens molekulával jelölt anti-humán
IgG antitesttel tesszük láthatóvá. A készülék egyetlen
méréssel minden gyöngycsoportból 1000-1000 partikulomot
lemérve elkülöníti azokat fluoreszcens jelzésük,
valamint intenzitásuk alapján, és külön jelként
detektálja az adott gyöngycsoportnak a jelölő fluoreszcencia
intenzitását is. Ez a jel egyenesen arányos
a befogott autoantitest mennyiségével.
A multiplex assay-k ígéretesek az autoantitest-diagnosztikában,
ugyanakkor a szilárd fázishoz kötött
molekulák antigenitásának megtartása még nem tökéletes.
Cél az indirekt immunfluoreszcencia technikával
és ELISA-val verifikált standard, kvantitatív
mérések reprodukálhatósága a multiplex mérésekben
is. Néhány esetben a szenzitivitást és a specificitást
is vizsgálni kell. Ugyanakkor a miniatürizálás mint
végső cél fontos az immundiagnosztikában is, mert
költséghatékonyabb, gyorsabb, klinikailag hasznos, és
nem utolsósorban kevésbé terheli a beteget.

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
259
A laboratóriumi gyakorlatban mért
autoantitestek
Az autoimmun betegségekben elsősorban
meghatározott autoantitestek
Anti-dsDNS – kettős szálú DNS elleni autoantitest
Az antitest elsősorban SLE aktív szakaszaiban pozitív,
de más szisztémás autoimmun betegségben is előfordulhat.
SLE-ben szenvedő betegben a dsDNS pozitívvá
válása megelőzheti a klinikai tünetek megjelenését.
Az autoantitest-pozitivitást a betegség aktivitási
markerének tartják, amely általában komplementfaktor-
(C3, C4, CH50) csökkenéssel együtt jelenik meg.
A dsDNS antitest mérésével jól követhető a terápia
sikeressége.
Anti-dsDNS-pozitivitás jellemző: SLE aktív fázisában,
SLE veseérintettsége esetében,
más szisztémás autoimmun betegségekben: RA,
Sjögren-szindróma, MCTD, scleroderma, egyéb autoimmun
kórképekben: krónikus aktív hepatitis
(CAH), primer biliaris cirrhosis (PBC).
Mérőmódszer:
• A klasszikus HEp-2 indirekt immunfluoreszcenciánál
megbízhatóbb a Crithidia luciliae
(gerinctelenek béltraktusában élősködő protozoon)
szubsztráton végzett IIF-vizsgálat. Ez
utóbbi előnye, hogy ebben az egysejtűben óriás
mitokondriumok vannak nagyfokban kondenzált
kettős szálú DNS-sel, hisztonok nélkül. Így
a diagnosztikus értéke jobb, mint a HEp-2
homogén rajzolatú képnek.
• Antigénspecifikus ELISA: fontos, hogy a gyártó
valóban tiszta, általában humán rekombináns
kettős szálú DNS-preparátumot használjon
antigénnek.
Antinukleoszóma-autoantitest
A nukleoszóma a kromatin alapszerkezeti eleme,
147 bázispár hosszúságú szuperhelikális DNS szakasz,
amelyet hiszton fehérjék (H2a, H2b, H3, H4)
vesznek körül. Az e struktúra ellen megjelenő autoantitestek
jellemző korai diagnosztikus markerei az
SLE-nek és a gyógyszerindukálta SLE-nek. Az antitest
sokszor megelőzi az anti-dsDNA autoantitest
megjelenését, aktív SLE 100%-os markere.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
ENA – extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek
Az ENA a sejtmagból kémiai eljárással kivonható
antigének összefoglaló neve. Minden ANA-pozitív
mintát ENA-ra tovább kell vizsgálni. A mérőmódszer
általában az antigénspecifikus ELISA. Az ENA-pozitivitás
szisztémás autoimmun betegségekre jellemző
(lásd 11-10. és 11-11. táblázat).
Az ENA csoportba tartoznak a következő antitestek:
• RNP-antitest (U1-RNP – small nuclear uridine-rich
ribonucleoproteins).
• Sm-antitest (small nuclear ribonucleoprotein
particles, más néven Smith-antigén).
• SS-A antitest (soluble substance A nuclear antigen,
más néven SS-Ro – Robert-antigén vagy
Sjögren A).
• SS-B antitest (soluble substance B nuclear antigen,
más néven SS-La – Lane-antigén, vagy
Sjögren B).
• Scl-70 antitest (scleroderma antigén, lényegében
70 kDa anti-topoizomeráz).
• Jo-1 antitest (hisztidil-tRNS-szintetáz-ellenes
antitest, a Jo-1 jelölés egy beteg nevéből ered).
Anti-RNP
Kevert kötőszöveti betegség (MCTD) esetén
100%-ban fordul elő egyetlen antitestként, SLE-ben
32%-ban, de mellette megtalálható az anti-dsDNS,
anti-Sm és antihiszton antitestek jelenléte is. Szisztémás
sclerosisban 10% az előfordulási gyakorisága.
Anti-Sm
Az SLE diagnózisának ACR-kritériumában egyik
paraméter. 99%-ban specifikus a jelenléte SLE-re, előre
jelezve annak súlyos szervi manifesztációit (KIR,
vese).
Anti-SS-A
Collagenosisok, különösen a Sjögren-szindróma
diagnosztikus markere, de SLE-ben is előfordul.
Anti-SS-B
Diagnosztikus érzékenysége primer Sjögren-szindrómában
70%, szekunder Sjögren-szindrómában
50%, SLE-ben 25%, neonatalis lupusban 70%, szubakut
cutan lupusban 80%.

260 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Anti-Scl-70
A progresszív szisztémás sclerosis (PSS) súlyosabb
lefolyású formájára jellemző autoantitest. Raynaud-jelenség
meglétekor az antitopoizomeráz-I autoantitest
pozitivitása előre jelzi a PSS kialakulását korai bőr- és
belső szervi (szív, tüdő, vese) manifesztációkkal.
Anti-Jo-1
Az idiopathiás myositis ismert, 100%-ban specifikus
markere. Szenzitivitása 30%-os idiopathiás myositisben,
46% polymyositisben. A Jo-1-pozitív esetek
súlyosabb lefolyásúak, 65%-os a valószínűsége a tüdő
érintettségének (alveolitis, tüdőfibrosis).
A gyakorlatban vizsgált egyéb
autoantitestek
Cenp-B – centromer elleni autoantitest
A centromer B-protein DNS-kötő fehérje, amely
más fehérjékkel együtt fontos szerepet játszik a centromer
kialakulásában. Az ellene megjelenő autoantitesteknek
fontos diagnosztikus és prognosztikus jelentősége
van a progresszív szisztémás sclerosis (PSS)
enyhébb formájának kialakulásában és Raynaud-jelenségben.
Az anti-Cenp-B autoantitest prognosztikai
marker, és évekkel megelőzheti a progresszív
szisztémás sclerosis egy lokális, enyhébb formájának,
a CREST-szindrómának a kialakulását.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
Anti-C1q komplementfaktor autoantitest
A C1q komplementfaktor ellen megjelenő IgG autoantitest
fontos segítség az SLE lefolyásának, főképp
a veseérintettségnek és a terápia eredményességének
nyomon követéséhez. Ugyancsak diagnosztikus
markere a hypocomplementaemiás-urticariás vasculitis
szindrómának (HUVS), ebben 100%-ban pozitív,
membranoproliferativ glomerulonephritisben
(MPGN) 88%-ban mutatható ki az anti-C1q autoantitest.
Mivel az antitest megjelenése akár hónapokkal
is megelőzheti az SLE vesemanifesztációját, folyamatos
monitorozása indokolt.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
Anti-CCP - ciklikus citrullinált peptid elleni autoantitest
A CCP (filaggrin) kötőszöveti antigén, amely ellen
antitest termelődik rheumatoid arthritises betegekben.
A CCP (ciklikus citrullinált peptid) elleni antitest
korai biomarker, évekkel a rheumatoid arthritis
klinikai megjelenése előtt megjelenik a vérben. A
CCP-t jobb diagnosztikai markernek tartjuk rheumatoid
arthritisesben, mint a rheumatoid faktort. Az
anti-CCP a rheumatoid arthritises betegek 85-95%-
ában kimutatható.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
RF (rheumatoid faktor) izotípusok – anti-IgG IgG/
IgA/IgM
Az RF az IgG Fc-régiója ellen termelődő antitest.
Három izotípusa fordul elő: RF-IgG, RF-IgM,
RF-IgA. Alacsony a specificitása, rheumatoid arthritis
és juvenilis krónikus arthritis mellett autoimmun
kórképekben, fertőzésekben, gyulladásos folyamatokban
is pozitív lehet.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
Kardiolipin IgG/IgA/IgM antitest
Az antitest-pozitivitás az antifoszfolipid-szindróma
diagnózisának egyik laboratóriumi kritériuma. A
kardiolipin a mitokondrium belső membránjának integráns
(20%) foszfolipidje, nélkülözhetetlen számos
energiatermelő metabolikus folyamatban fontos enzim
működéséhez. A kardiolipin fehérje elleni antitest
számos kórképben megjelenik. Az antitest gátolja
az alvadási kaszkád foszfolipid fehérjéinek aktivitását,
ennek következtében alvadási zavar, érelzáródás
jöhet létre. Kardiolipinantitest jelenlétében nem tud
az embrió beágyazódni és a placenta kialakulni. Kardiolipin-pozitivitás
a terhesség későbbi szakaszában
magzati retardációt, placentaér-thrombosist, koraszülést
okozhat.
Különféle bakteriális infekciókban keresztreakció
miatt előfordulhat álpozitivitás (pl. tbc, Treponema
pallidum, Staphylococcus, Streptococcus, Borrelia,
HIV fertőzés).
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
β 2
-glikoprotein I elleni IgG/IgA/IgM antitest
(β 2
-GPI antitest)
A b 2
-GPI fehérje a kardiolipin és más foszfolipid
fehérjék kofaktora. Gátolja a véralvadás intrinsic útját.
Az antitest-pozitivitás az antifoszfolipid-szindróma
diagnózisának egyik laboratóriumi kritériuma.
Kardiolipin- és β 2
-GPI-antitest vizsgálat javasolt a
következő esetekben:

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
261
• Thrombophilia kivizsgálásakor.
• 45 év alatti betegben nem tisztázott mélyvénás
thrombosis, ill. artériás elzáródás esetén.
• Szisztémás autoimmun betegségekben a thrombosis-
és abortuszrizikó megítélésére.
• Habituális abortuszban.
• In vitro fertilizáció sikertelenségekor.
• SLE, SLE-szerű kórképek vagy más szisztémás
autoimmun betegségben.
• Ismeretlen eredetű recidiváló thrombocytopeniában.
• Neurológiai kórképekben, ha a megszokott okok
és rizikótényezők nem igazolhatók (migrén, chorea,
multiinfarctus okozta dementiában, myelitis
transversában,

262 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Myositis overlap-szindrómában előforduló autoantitestek
• Ku (70-86 kDa) - 15%.
• SS-A/Ro - 5-10%.
• U1-RNP - 5-10%
• U2-RNP - 4-17%
Autoimmun polymyositis gyanújában ajánlott laboratóriumi
vizsgálatok (11-13. táblázat):
• ANA (Hep-2).
• ANA ELISA.
• ANA-pozitivitás esetén ENA.
• autoimmun myositis autoantitest profil.
Szükséges kiemelni, hogy a betegség CK-, GOT- és
LDH-szint emelkedéssel jár!
Szervspecifikus autoantitestek
Pajzsmirigyellenes autoantitestek (anti-Tg, anti-TPO,
TRAK)
Anti-Tg (antithyreoglobulin)
A tiroglobulin 660 kD molekulatömegű, vízoldékony
thyreoprotein. A pajzsmirigyben termelődik, a
fehérjék 75%-át adja. Belőle képződik a T 3
és T 4
hormon
úgy, hogy a molekula 2 tirozincsoportja jódatomot
vesz fel, összekapcsolódik, és proteolitikusan
lehasad a fehérjéről. A thyreoglobulin elleni antitest
(anti-Tg) jelenlétében csökken a pajzsmirigyhormon
termelése, ami hosszú távon hypothyreosist okozhat.
A pajzsmirigy-peroxidáz enzim (TPO) a mirigysejt
membránjához kötött fehérje, amelynek funkciója
a pajzsmirigyhormon szintézise. A TPO ellen
termelődő antitestek tönkretehetik a pajzsmirigy
hormonszintézisét, ennek következtében hosszú távon
hypothyreosis jöhet létre.
Az anti-Tg-pozitivitás jellemző Hashimoto-thyroiditisben
60-70%-ban, primer myxoedemában
szintén 60-70%-ban, Basedow-Graves-kórban kb.
20%-ban, más autoimmun betegségekben, mint idiopathiás
diabetes mellitus (IDDM), anaemia perniciosa,
coeliakia és egyéb krónikus gyulladások.
Anti-TPO
Az anti-TPO-pozitivitás előfordulása Hashimoto-thyroiditisben
és primer myxoedemában kb. 90%,
Basedow-Graves-kórban kb. 80%. Nem immunológiai
eredetű pajzsmirigybetegségekben (struma, autonom
ademoma) és széles skálájú autoimmun betegségekben
(Addison-kór, IDDM, anaemia perniciosa,
autoimmun polyendocrinopathia, coeliakia, CAH),
vitiligóban szintén leírtak anti-TPO-pozitivitást.
11-13. táblázat. ANA-pozitivitás előfordulása különféle
betegségekben
Betegség
Előfordulás
%-a
SLE 95-100
DIL 95-100
discoid SLE 21-50
SCLE 20-65
MCTD 100
scleroderma 31-90
CREST-szindróma 95
Sjögren-szindróma (SS) 50-95
egyéb rheumás betegség 20-50
panarteritis nodosa 15
polymyositis/dermatomyositis 40
psoriasis vulgaris 30
uveitis 60
autoimmun CAH 45-100
PBC 40
vírushepatitis 30
alkoholos cirrhosis 30
cryptogen cirrhosis 30
myasthenia gravis 35-50
tüdőfibrosis, alveolitis 20-60
ITP 50-70
autoimmun haemolyticus anaemia 40-50
autoimmun thyroiditis 20-40
anaemia perniciosa/atrophiás gastritis 20-30
leukaemia 70
terhesség 50
mononucleosis 30-70
LE-beteg egészséges rokonai 25
egészséges személy 60 éves kor alatt 0-5
egészséges személy 60 éves kor fölött 5-30

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
263
Ilyenkor a TSH-szintet ellenőrizni szükséges.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
TRAK
TSH-receptor elleni antitest. Mára bebizonyították
róla, hogy diagnosztikus értéke kizárólag a neonatalis
thyreotoxicosis predikciójában van, de a bonyolult
metodika miatt kevés helyen alkalmazzák.
Szöveti transzglutamináz (tTG), endomysium
(EMA) és gliadin elleni antitestek
A coeliakia minden életkorban előforduló betegség,
amelynek oka a glutén okozta intolerancia. Glutént
tartalmaz a búza-, az árpa- és a rozsliszt. Genetikailag
prediszponált egyénekben a glutén által
okozott immunológiai elváltozások miatt a bélbolyhokban
atrophia alakul ki. A betegek tüneteinek egy
része a felszívódási zavarral függ össze, amely érintheti
a fehérje-, zsír- és ásványi anyagcserét is. A betegség
társulhat más autoimmun betegségekkel is.
Gluténmentes diéta hatására a panaszok megszűnnek,
és az autoantitestek kb. 6 hónap alatt eltűnnek.
A klasszikus gasztroenterológiai tünetek (hasmenés,
haspuffadás) mellett a betegségre gondolni
érdemes vashiányos anaemiában, autoimmun pajzsmirigybetegségekben,
korai osteoporosisban, 1-es típusú
diabetes mellitusban, recidiváló herpesfertőzéseknél
és stomatitis aphthosában, alopecia areatában,
férfi és női meddőségben, habituális abortuszban,
laktózintoleranciában, ismeretlen eredetű polyneuropathiában.
Az EMA- és a tTG-mérések diagnosztikai
hatékonysága igen nagy (90-95%).
Mérőmódszerek:
• Indirekt immunfluoreszcencia: majomesophagus-metszeten
endomizium IgA (EMA IgA).
IgA-hiányos betegeknél az IgG típusú ellenanyagot
kell mérni.
• Antigénspecifikus ELISA: szöveti transzglutamináz
IgA és IgG antitest, anti-gliadin IgA.
ASCA (Saccharomyces cerevisiae elleni antitest) IgG
és IgA
Az ASCA a pékélesztő (Saccharomyces cervisiae)
elleni autoantitest. Az élesztőgomba falában lévő
mannóztartalmú foszfopeptid ellen termelődik. A
gyulladásos bélbetegségek közül Crohn-betegségben
kb. 70%-os pozitivitás fordul elő, colitis ulcerosában
viszont csak 6 %-os. Az autoantitest már a betegség
korai fázisában kimutatható. A két betegség differenciálásán
túl az autoantitest-kimutatás a betegség aktivitási
markere is.
A gyulladásos bélbetegségek között jól differenciál
az ASCA- és ANCA-vizsgálat együttes végzése is. Colitis
ulcerosában ANCA- (PR3), Crohn-betegségben
ASCA-pozitivitás gyakoribb.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
Gyomor parietalis sejt (GPC, vagy PCA) és az intrinsic
faktor (IF) elleni IgG antitest
A gyomor parietalis sejt antitest a H + /K + -ATP-áz
protonpumpa elleni antitest, amely biztosítja a gyomor
normális pH-ját. Az intrinsic faktor a B 12
-vitamin
felszívódásához nélkülözhetetlen faktor. A
gyomor parietalis sejtjei ellen termelődő antitest atrophiás
gastritist okoz. A teszt specificitása alacsony,
mert más szervspecifikus autoimmun betegségben,
ill. egyéb kórképekben és tünetmentes egyéneknél
is kimutatható. Az autoantitest-pozitivitás anaemia
perniciosában 86-90%-ban jellemző.
Mérőmódszer: antigénspecifikus ELISA.
Autoimmun májbetegség autoantitest-immuno blot
profil (AMA-M2, LKM1, LC, SLA, dezmin, miozin,
F-aktin)
Az autoimmun májbetegségek csoportjába tartozik
az autoimmun hepatitis (AIH), a primer biliaris
cirrhosis (PBC) és a primer sclerotizáló cholangitis
(PSC).
Gyakran előfordul, hogy overlap-szindróma képében
jelentkezik a betegség, egyszerre vannak jelen
gyulladásra (GOT, GPT) és cholestasisra (AP, γ-GT)
jellemző laboratóriumi eredmények.
Az autoimmun hepatitis diagnosztikai kritériuma:
normális α 1
-antitripszin, réz- és cöruloplazminszint,
negatív HBV-, HCV-, CMV- és EBV-szerológia, csekély
alkoholfogyasztás (< 25 g/nap), ANA és/vagy
SMA, LKM, SLA antitest-pozitivitás.
A tesztben szereplő antigének:
• SMA: simaizom elleni antitestek (smooth muscle
antibodies, anti-F-aktin, antidezmin és antimiozin).
• LKM: máj-vese mikroszóma (liver-kidney microsomal)
antitest.
• LC-1: májcitoszol (liver-cytosol antigen type I)
antitest.
• SLA/LP: szolubilis máj (soluble liver) antigén.

264 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
• AMA-M2: a mitokondriális belső membránhoz
asszociált piruvát-dehidrogenáz komplex elleni
antitest a primer biliaris cirrhosis marker autoantitestje,
a kórkép kb. 95%-ában pozitív.
Az autoimmun hepatitisek egyes típusait és a rájuk
jellemző autoantitestek előfordulási gyakoriságát a
11-14. táblázat mutatja.
Onconeuronalis/paraneoplasiás antitest immunoblot
[Hu, Ri, Yo amphiphysin, CV2 (CRMP5),
PNMA2, Ma-2/Ta]
A tumorok által exprimált különféle antigének
(11-15. táblázat) ellen az immunrendszer antitesteket
termel. Ezek az antitestek reakcióba lépnek az idegszövet
hasonló antigénszerkezetű elemeivel, aminek
következtében neurológiai zavarok alakulnak ki. Az
11-14. táblázat. Autoimmun májbetegségekben előforduló autoantitestek
Autoantitest ANA SMA SLA LKM LC pANCA AMA
%
AIH I. típus 80-100 60-90 - - - -
AIH II. típus - - - 100 - -
AIH III. típus - - 100 - - -
PBC 10 10 - - 10 95
PSC 5

Autoimmun kórképek diagnosztikai lehetőségei
265
így létrejövő központi idegrendszeri elváltozást paraneoplasiás
neurológiai kórképnek nevezik.
Jelenleg vizsgálható paraneoplasiás antitestek:
• Anti-Hu (ANNA-1, anti-neuronalis nukleáris
antigén 1).
• Anti-Yo (Purkinje-sejt elleni antitest).
• Anti-Ri (ANNA-2, anti-neuronalis nukleáris
antigén 2).
• Anti-Ma2/Ta (anti-pnma2 – paraneoplasticus
neuronal antigén).
• Anti-CV2 (CRMP5 Collapsin Response
Mediator Protein).
• Anti-amphiphysin (szinaptikus vezikulák citoplazmatikus
proteinje).
Irodalom
Ta, E., Cohen, A., Fries, J. et al.: The 1982 revised criteria
for the classification of systemic lupus erythematosus.
Arthritis Rheum. 25:1271-1277, 1982.
Hochberg, M. C.: Updating the American College of
Rheumatology revised criteria for the classification
of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum.
40:1725, 1999.
Muna, N. M., Verner, J. L., Harnmond, D. F. et al.: Fluorescent
antibody technique as a routine procedure in
the diagnosis of lupus erythematosus using stored tissue
culture cells. Am. J. Clin. Pathol. 45:117, 1966.
Humbel, R. .L.: Detection of antinuclear antibodies by immunofluorescence.
In: Van Venrooij, W. J., Maini, R. N.
(eds.): Manual of biological markers of disease. Dordrecht,
the Netherlands. Kluwer Academic Publishers,
1-16, 1993.
Bradwell, A. R., Stokes, R. P, Johnson, G. D: Atlas of
HEp-2 patterns. The Binding Site 1995.
Engvall, E., Perlmann, P.: Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.
G. Immunochemistry 8:871-874, 1971.
Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J.: Electrophoretic
transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose
sheets: procedure and some applications. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76:4350, 1979.
Emlen, W., O’Neill, L.: Clinical significance of antinuclear
antibodies: comparison of detection with immunofluorescence
and enzyme-linked immunosorbent assays.
Arthritis Rheum. 40:1612-1618, 1997.
Smolen, J. S., Butcher, B., Fritzler, M. J. et al.: Reference
sera for antinuclear antibodies II. Further definition
of antibody specificities in international antinuclear antibody
reference sera by immunofluorescence and western
blotting. Arthritis Rheum. 40:413-418, 1997.
Koizumi, H., Onozuka, Y., Shibata, M. et al.: Detection
of anti-nuclear antibodies in liver diseases by indirect
immunofluorescence method and enzymelinked immunosorbent
assay. Rinsho Byoni 8:744-748, 1999.
Czirják L.: Klinikai Immunológia. Medicina Könyvkiadó,
Budapest, 2006.

266 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A celluláris immunitás klinikai
laboratóriumi vizsgálata
Berki Tímea
Morfológiai módszerek
Az immunrendszer sejtjeit vizsgálhatjuk funkcionális
és morfológiai megközelítéssel. A sejtek morfológiai
sajátságait vizsgálhatjuk festés után hagyományos
képalkotó eljárásokkal, de ellenanyagokkal való specifikus
jelölés segítségével pontosabb molekuláris információkra
tehetünk szert. A sejtek intracelluláris és
sejtfelszíni fehérjemolekulái ellen fejlesztett specifikus
poli- vagy monoklonális ellenanyagokkal, enzim vagy
fluoreszcens jelzés felhasználásával immunhisztokémiai
eljárással mikroszkópos megfigyeléseket tehetünk
a sejtek fehérje alkotóelemeiről. Morfológiailag
a fehérjék lokalizációján kívül azok mennyiségéről és
megoszlásáról is információt kapunk. Ezek a módszerek
ugyanakkor nagyon időigényesek, értékelésükben
szubjektív elemek vannak, megbízható kvantitatív analízisre
nehezen alkalmazhatók. Ennek kiküszöbölésére
fejlesztették ki az áramlási citometriát.
Immunsejtek fenotípus meghatározása
CD markerek
Elsősorban a sejtfelszíni molekulák, az ún. CD
markerek (cluster of differentiation) alapján tudunk a
fehérvérsejtek alcsoportjai közt különbséget tenni (11-
43. ábra). A CD markerekre specifikus ellenanyagokkal
nem csak az immunsejtek fenotípusát, hanem az
ún. aktivitási markereket, differenciálódási stádiu-
Áramlási citometria
Az áramlási citometria gyors, többparaméteres meghatározásra
alkalmas módszer, nagyszámú sejt többféle
tulajdonságának statisztikai feldolgozását teszi lehetővé.
A sejtek morfológiai (méret, granularitás) és
fenotípus analízise mellett funkcionális (enzimaktivitás,
életképesség, fehérjeexpresszió, DNS-tartalom,
sejtciklus, intracelluláris pH és kalciumion-szignál
stb.) vizsgálatokat is lehetővé tesz különböző fluoreszcens
festékek alkalmazásával. Az áramlási citometria
elvét és módszereit a 11.4. fejezet taglalja.
Az áramlási citometriával mérhető legfontosabb paraméterek
(11-41. ábra, 11-42. ábra):
• Sejtméret (SSC).
• Granuláltság (FSC).
• Fluoreszcenciaintenzitás: FL-1 (zöld), FL-2
(narancs), FL-3 (piros), FL-4 (távoli vörös).
• Idő (pl. kalciumszignál-mérésnél, az ábrán nem
szerepel).
11-41. ábra. Áramlási citometria elve és fizikai paraméterei
(Gr: granulocyta; Ly: lymphocyta; Mo: monocyta)
a) SSC, side scatter: granularitás
b) FSC, forward scatter: nagyság
c) Áramlási citometriai diagram
11-42. ábra. Sejtfelszíni molekulák fluoreszcens jelölése
áramlási citometriához
CD3-FITC: zöld → FL1; CD19-PE: narancs → FL2;
CD56-CyChr: piros → FL3; CD45-APC: vörös → FL4

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata
267
11-43. ábra. CD markerek
mokat is mérhetjük. A sejtfelszíni CD markerek tulajdonképpen
különböző funkciójú sejtfelszíni receptorok,
azok ligandjai, adhéziós molekulák vagy más,
a sejt működése szempontjából fontos molekulák. A
legtöbb receptor jelátviteli funkcióval is rendelkezik,
amellyel a sejt működésének megváltozását okozza.
2009-ig több mint 350 humán CD markert írtak le,
jellemeztek, és jelölhetjük őket monoklonális ellenanyagokkal.
A CD-nómenklatúrát 1982-ben Párizsban az I.
Nemzetközi Humán Leukocyta Differenciálódási
Antigén (HLDA) Workshopon hozták létre és kezdeményezték.
A rendszert a leukocyta antigénekkel
reagáló monoklonális ellenanyagok klasszifikációjára
alkották, és a világ különböző laboratóriumaiban fejlesztették
ki. Azóta a rendszer elterjedt, és ma számos
sejtcsoportra több mint 350 CD antigént különböztetünk
meg. Ezt jelzi a munkacsoport névváltoztatása
is 2004-ben Human Cell Differentiation Molecules
(HCDM) Workshopra, jelezve a szélesebb kiterjedésű
céljaikat.
Egy molekula CD számozása nem csak a specifikus
monoklonális ellenanyaggal való reaktivitását jelenti,
11-44. ábra. Lymphocytacsoportokat azonosító CD markerek

268 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
hanem szükséges az antigén jellemzése is. Ha a molekula
nincs karakterizálva, akkor a w indikátor jelzést
kapja (pl. CDw186) [9].
A CD markerekre specifikus ellenanyagokat használják
a perifériás vérből vagy csontvelőből nyert sejtek
fenotípusmeghatározására áramlási citometrás
mérőmódszerrel, de alkalmazzák szövettani körülmények
között is, pl. malignus hematológiai folyamatok
diagnózisára, monitorozására is. A módszer
nélkülözhetetlen a különböző hematológiai megbetegedésekben
a sejtek differenciálódási stádiumának
besorolásához, autoimmun megbetegedésekben,
infekciókban az aktivált sejtek arányának detektálásához,
az egyes lymphocyta-alcsoportok százalékos
arányának és abszolút számának meghatározásához.
A CD rendszerrel jellemezhetünk fehérvérsejtcsoportokat
azok differenciálódási állapota és funkciója
szerint. Rendszerint több marker kombinációjával
tudunk pontos definíciót kapni (11-44. ábra). Ezt a
CD-specifikus antitestek különböző fluorofórral való
jelölése teszi lehetővé, amely egy mintában több különböző
hullámhosszon aktiválható és emittáló fluoreszcens
molekula egyidejű detektálásában segít (11-
16. táblázat, 11-17. táblázat).
A CD molekulákat felhasználjuk a sejtek különböző
módszerekkel való szeparálására, beleértve az
áramlási citometriát is. Egy-egy sejtcsoportot a CD
marker után tett plusz (+) vagy mínusz (-) jellel jelölhetünk
aszerint, hogy expresszálja vagy sem az adott
molekulát. A haemopoeticus őssejtre jellemző pl. a
11-16. táblázat. Fontosabb fluorofórmolekulák
Festék Abszorpciós hullámhossz Emissziós hullámhossz Szín
Hydroxycoumarin 325 386 blue
Methoxycoumarin 360 410 blue
Alexa fluor 345 442 blue
Aminocoumarin 350 445 blue
Cy2 490 510 green (dark)
FAM 495 516 green (dark)
Alexa fluor 488 494 517 green (light)
Fluorescein FITC 495 518 green (light)
Alexa fluor 430 430 545 green (light)
Alexa fluor 532 530 555 green (light)
HEX 535 556 green (light)
Cy3 550 570 yellow
TRITC 547 572 yellow
Alexa fluor 546 556 573 yellow
Alexa fluor 555 556 573 yellow
R-phycoerythrin (PE) 480; 565 578 yellow
Rhodamine Red-X 560 580 orange
Tamara 565 580 red
Cy3.5 581 581 596 red
Rox 575 602 red
Alexa fluor 568 578 603 red
Red 613 480; 565 613 red

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata
269
11-17. táblázat. Fluoreszcens DNS-festékek
Festék Abszorpciós hullámhossz Emissziós hullámhossz Szín
DAPI 345 455 blue
Hoechts 33258 345 478 blue
SYTOX blue 431 480 blue
Hoechts 33342 343 483 blue
YOYO-1 509 509 green
SYTOX green 504 533 green
TOTO 1, TO-PRO-1 509 533 green
SYTOX orange 547 570 yellow
Chromomycin A3 445 575 yellow
Mithramycin 445 575 yellow
Propidium iodide 536 617 red
Ethidium bromide 493 620 red
CD34+, CD31- megjelölés (11-18. táblázat; lásd 11-
43. ábra) [8].
A CD markerekre specifikus monoklonális ellenanyagok
általában élő, nem fixált sejtek jelölésére
alkalmasak. Fixálás vagy bármilyen eljárás, amely a
CD antigének konformációjának megváltozását idézi
elő, a jelölést zavarhatja vagy megakadályozza. Ezért
a mononukleáris sejtek (lymphocyták és monocyták)
sejtfelszíni antigénjeinek jelölését alvadásgátolt vérmintán
végzik, majd a jelölés után fixálják a sejteket
az áramlási citometriás analízisig. Ugyancsak fixált
sejteket használunk intracelluláris fehérjemolekulák
(pl. citokinek, jelátvivő molekulák, transzkripciós
faktorok) jelölésére, mert a jelölő antitest sejtbe juttatásához
a sejtek membránját először átjárhatóvá kell
tenni. A permeabilizált sejtből fixálás nélkül kiáramlanak
az intracelluláris molekulák, ezért szükséges
permeabilizálás előtt a sejteket fixálni.
11-18. táblázat. A legjellemzőbb CD-markerek (lásd 11-43. ábra is)
Sejttípus
őssejt
minden leukocyta
granulocyta
monocyta
T-lymphocyta
T helper sejt
T citotoxikus sejt
B-lymphocyta
thrombocyta
NK-sejt
CD-marker
CD34+, CD31-
CD45+
CD45+, CD15+
CD45+, CD14+
CD45+, CD3+
CD45+, CD3+, CD4+
CD45+, CD3+, CD8+
CD45+, CD19+ vagy CD45+, CD20+
CD45+, CD61+
CD16+, CD56+, CD3-

270 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Vizsgálati irányok, lehetőségek
Immunfenotipizálás
• Malignus hematológiai kórképek diagnosztikája
és differenciál diagnosztikája.
• Autoimmun betegségek aktivitásának nyomon
követése.
• Pre- és poszttranszplantációs állapotok nyomon
követése.
• HLA-haplotípus vizsgálata.
• Tumorsejtek vizsgálata: proliferációs antigének
vizsgálata, adhéziós molekula expresszió kimutatás.
• Fertőző betegségek diagnosztikája és nyomon
követése.
• Sejtfelszíni fehérje- vagy egyéb struktúrák távolságának
meghatározása (energiatranszfer)
Kvantitatív mérési lehetőségek
• A vizsgált markert expresszáló sejtek mennyiségének
meghatározása.
• Sejtfelszínen expresszálódó antigének kvantitatív
meghatározása.
DNS- és RNS-tartalom mérése
• Sejtciklus-analízis.
• Apoptózismérés.
• Reticulocytaszám meghatározása.
Funkcionális vizsgálatok
• Fagocitálóképesség vizsgálata: fagoburst-teszt.
• Intracelluláris kalciumion-koncentráció meghatározás,
sejtaktiváció-mérés.
• Intracelluláris pH-meghatározás.
• Enzimmennyiség, -aktivitás, ill. -lokalizáció
mérés.
• Reaktív oxigénintermedierek (ROI) termelődésének
detektálása (pl. H 2
O 2
).
• Kemotaxis vizsgálat.
• Proliferációs index meghatározása.
Sejtszeparálás
Vizsgálati panelek fenotípus meghatározásra
Immunhiányos állapotok, transzplantáció monitorozása:
• Immunstátus-monitorozás: T-, B-, Mo-, Th-,
Tc-szubpopuláció meghatározása perifériás vérből.
• CD3, CD4, CD8 sejtek abszolút számának meghatározása
CD3/CD45, CD4/CD45, CD8/CD45
jelöléssel.
• Naiv/memória sejtarány meghatározás: CD3/
CD45RO/CD45RA.
• Adhéziós molekulák expressziójának vizsgálata
(keringő leukocyták, ill. stimulált leukocyták
felszínén). LAD diagnosztika (CD11/CD18
expresszió zavara).
Fertőzéses állapotok nyomon követése:
• Aktivitási markerek vizsgálata: CD3/CD69,
CD3/HLA-DR/CD25, CD8/HLA-DR.
• Immunstátus-monitorozás: T-, B-, Mo-, Th-,
Tc-alcsoport meghatározása perifériás vérből.
Autoimmun folyamat monitorozása (11-19. táblázat):
• Immunstátus-monitorozás: T-, B-, Mo-, Th-,
Tc-alcsoportok meghatározása perifériás vérből.
• Autoantitest-termelő B-sejtek vizsgálata: CD5+
B-sejt-arány meghatározása.
• Aktivitási markerek vizsgálata: CD3/CD69,
CD3/HLA-DR/CD25, CD8/HLA-DR.
• Naiv/memória T-sejt arány meghatározása:
CD3/CD45RA/CD45RO.
• Intracelluláris citokin mintázat, fagocitózis vizsgálat.
A legutóbbi Cluster of Differentiation lista és leírás az
interneten érhető el [8, 10].
Mikroszkópos módszerek
Hagyományos hisztokémiai módszerek
A hagyományos hisztokémiai módszerekkel a szöveti
környezetben lévő sejteket vagy izolált sejteket is
vizsgálhatunk az egyes sejtalkotókhoz szelektíven kötődő
festékek segítségével vagy a sejtekben előforduló
enzimek szubsztrátjainak hozzáadásával, e folyamatok
színes terméket eredményeznek. Ily módon egyes
sejttípusok és funkcionális sajátságok vizsgálhatók,
de a sejtalkotók molekuláris szintű vizsgálatát nem
teszi lehetővé.
Enzimhisztokémiai technika
Az enzimhisztokémiai technika felfedezése és kifejlesztése
elsősorban a magyar Gömöri György nevéhez
fűződik, vele egy időben, de tőle függetlenül
a japán Takamatsu 1939-ben közölte az alkalikus

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata
271
11-19. táblázat. A hematológiai malignitások azonosítására használt CD-markerek *
CD1a
CD2
CD3
CD4
CD5
CD7
CD8
CD10
CD11b
CD11c
CD13
CD14
CD15
CD16
CD19
CD20
CD22
CD23
CD25
CD30
CD33
CD34
CD38
CD41
CD43
Antitest (CD)
CD56
CD57
CD61
CD79a
CD103
CD117
bcl-2
nehézlánc
(IgG, IgA, IgM, IgD)
HLA DR
könnyűlánc (k vagy l)
TdT
thymocyta és éretlen T-sejt
Reaktivitás
T-sejt, large granular lymphocyte (LGL), NK-sejt, némelyik APL, tumoros hízósejt
T-sejt, primer lymphoma
T-sejt (helper/inducer), monocyta, myeloblast, NK-sejtes lymphoma
T-sejt, B-CLL/SLL, MCL
T-sejt, némelyik myeloblast
T-sejt (szuppresszor/citotoxikus), large granular lymphocyte (LGL), némely NK-sejt
folliculus-centrumsejt, FL, némelyik DLBCL, pre-B-ALL, pre-T-ALL, thymocyta, BL
granulocyta, monocyta
monocyta, HCL, LGL, aktivált T-sejt, MZL
myeloid sejt, ritka pre-B-ALL
monocyta
granulocyta, Hodgkin-lymphoma
granulocyta, NK-sejt, LGL
B-sejt, pre-B-ALL, AML alcsoportok (AML1/ETO t(8;21)-al)
B-sejt, ritka plazmasejtes myeloma
B-sejt
B-CLL/SLL, plazmasejt, follicularis dendritikus sejt
HCL, B- és T-sejtes lymphoma-alcsoportok
Hodgkin-lymphoma, anaplasticus nagysejtes lymphoma, DLBCL alcsoport, B-sejtes
lymphoma alcsoportok
myeloid sejt, ritka pre-B-ALL, ritka blastos NK-lymphoma
myeloblast, lymphoblast, endothelsejt
plazmasejt, aktivált T- és B-sejt, B-CLL/SLL alcsoportok, epithelsejt
megakaryocyta
myeloid sejt, T-sejtes lymphoma, pre-B-ALL, pre-T-ALL, B-sejtes lymphoma(subset), plazmasejt
NK-sejt, LGL
NK-sejt, LGL
megakaryocyta
B-sejt, plazmasejt, megakaryocyta
HCL, ritka T-sejtes lymphomák
AML, hízósejt, stromasejtes tumorok (GIST), plazmasejt
érett B-sejt (kivéve benignus GCC), T-sejt és FL
B-sejt, plazmasejt, DLBCL ALK expresszióval
AML (kivéve APL), B-sejt, monocyta
B-sejt (sejtfelszín), plazmasejt (citoplazma)
pre-B-ALL, pre-T-ALL, némelyik AML
*
A kurzivált rövidítések a betegségeknek az interneten a wikipaediában megtalálható leírására utalnak.

272 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
foszfatázok hisztokémiai azonosítására szolgáló eljárást.
Az enzimcitokémia alapja az, hogy az adott enzimreakció
termékei oldhatatlan és lehetőleg fény-, ill.
elektronmikroszkópban látható csapadékot adjanak.
Fontos az enzimreakcióhoz megfelelő olyan fixálószer
alkalmazása, amely az enzimet rögzíti, de aktivitását
nem változtatja meg. Erre legelterjedtebben
az aldehidek használatosak (formaldehid, glutáraldehid),
mégpedig semleges pH-ra pufferelt oldatok
formájában. Az enzimcitokémiai eljárások jellegüket
tekintve indirekt technikák, azaz nem magukat az enzimfehérjéket
mutatjuk ki, hanem azok aktivitásából
következtetünk előfordulásukra. Az enzimcitokémiai
reakciókat a sejt egy bizonyos specifikus struktúrájára
(pl. egyes organellumra, plazmamembránra stb.) vonatkoztatjuk,
így mondjuk, hogy specifikus citotopobiokémiai
reakciókat végzünk.
Immunhisztokémiai technika
Az immunhisztokémiai reakció az elsődleges
antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló jelzéses
technikák közé sorolható. Célja szöveti körülmények
között vagy sejteken ellenanyag segítségével
bizonyos antigének (tumor marker, enzimek, citokinek
stb.) kimutatása. Diagnosztikus célra a fagyasztott
metszeteken kívül elsősorban 4% formalinban
fixált metszeten végeznek immunhisztokémiai reakciót.
Az eljárás előnye, hogy a fixálás konzerválja a
fehérjék antigenitását és megőrzi a szöveti struktúrát.
Ugyancsak előnye a formalinban fixált, paraffinba
ágyazott mintáknak, hogy patológiai célra évek
múlva is lehet retrospektív immunhisztokémiai
reakciót elvégezni a szöveten. A formalinfixálás hátránya,
hogy keresztkötéseket hoz létre a fehérjékben
és ezért álnegatív reakciót eredményezhet. Ennek
elkerülésére számos megoldást dolgoztak ki. Ezek
közül az egyik, hogy a szövet minél rövidebb ideig
(2 nap) legyen a fixálószerben. A másik eljárás az
antigénfeltárás, amelyre számos módszer áll rendelkezésre,
pl.:
• Detergens kezelés (Tween 20, Saponin, Nonidet
p40) a harmadlagos kötéseket felbontó anyagok,
(urea, tiourea, guanidin-klorid, litium-perklorát
stb.).
• Enzimatikus emésztés (tripszin, proteináz-K,
pronáz-E).
• Hőfeltárás főzéssel, mikrohullámú kezeléssel,
amely az immunreakció felerősödését eredményezi.
Szintén fontos az endogén enzimaktivitás gátlása is
(peroxidáz, alkalikus foszfatáz) a nem specifikus háttér
csökkentésére.
Ha az antigénre specifikus ellenanyagot festékkel
vagy enzimmel közvetlenül jelöljük, direkt módszerről
beszélünk. A direkt citokémia előnye, hogy gyors
és kevéssé munkaigényes, ugyanakkor magas a háttér
és relatíve gyenge a jel. Ha az antigénspecifikus elsődleges
ellenanyag jelöletlen és kimutatásához általában
egy poliklonális, jelölt másodlagos ellenanyagot használunk,
indirekt jelölésnek nevezzük (11-45. ábra). Az
indirekt módszer előnye, hogy alacsonyabb a jelölt
második ellenanyag nemspecifikus kötődése okozta
háttérreakció, ugyanakkor a jel erősítését teszi lehetővé.
A jelölő molekula lehet valamely fluoreszcens festék
(lásd 11-16., 11-17. táblázat), amelynek láthatóvá
tételéhez speciális aktiváló fényforrással és szűrőkkel
ellátott fluoreszcens mikroszkópot használunk. A
fluoreszcens jelölést zavarhatja a szövetek autofluoreszcenciája,
ami elsősorban a flavin típusú vegyületeknek
köszönhető. Magas autofluoreszcencia esetén
célszerű olyan jelölő fluoreszcens festéket alkalmazni,
amelynek abszorpciója vagy emissziója nem esik egybe
az autofluoreszcenciát adó anyagéval. Ugyancsak
alacsonyabb a fagyasztott metszetek autofluoreszcenciája.
11-45. ábra. Immunhisztokémia
a) Direkt
b) Indirekt

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata
273
A hagyományos fénymikroszkópos vizsgálathoz
leggyakrabban peroxidáz és/vagy foszfatáz enzimet
használunk jelölő molekulának. Az enzimreakció
oldhatatlan, színes terméke a szövetekhez kötődve
jelzi az antigén-antitest kapcsolódás helyét. A peroxidáz
enzim katalizálja pl. a diaminobenzidin oxidációs
reakcióját, kromogénként barna színű termék keletkezik,
miközben az alkalikus foszfatáz enzim szubsztrátja
általában kék színreakciót ad.
Nagyon kis mennyiségű antigén kimutatásához a
jelet tovább erősíthetjük ún. többlépcsős technikák
alkalmazásával, amelyek közül az avidin-biotin-peroxidáz
(ABC) eljárás (11-46. ábra) és a peroxidáz-antiperoxidáz
(PAP) komplex használata terjedt el (11-
47. ábra).
A PAP módszernél az első két antitest hasonló az
indirekt módszerben használttal, azzal a különbséggel,
hogy a második antitest jelöletlen. A harmadik
antitest egy peroxidáz enzimre specifikus, az első antitesttel
azonos fajban termelt monoklonális antitest.
Így a második antitest egyik karja az első antitesthez
kötődik, másik karja pedig a peroxidáz enzimre specifikus
antitestet fogja, vagyis hidat képez a két antitest
között (lásd 11-47. ábra). A módszer 100-1000-
szer érzékenyebb az indirekt módszernél, ugyanakkor
megtartja a specificitását.
Az avidin-biotin komplex (ABC) módszer az tojásfehérjéből
izolált avidin biotinhoz (H vitaminhoz)
való rendkívül magas affinitásán alapul. Ebben
a módszerben a második antitestet biotináljuk, míg
a harmadik réteg az avidin-peroxidáz enzim komplexet
tartalmazza (lásd 11-46. ábra).
Citokinek kimutatása
Általános jellemzők
Az immunválasz sejtjeinek párbeszéde, az információtovábbítás
két mechanizmussal zajlik. Egyrészt
közvetlen sejt-sejt kapcsolatok útján, adhéziós molekulák
segítségével, másrészt szekretált fehérjék, ún.
citokinek és receptoraik útján. A citokin görög eredetű
szó: a cito-, azaz „sejt” és kinosz, azaz „mozgás”
szóösszetételből származik, de összességében azokat
a szabályozó polipeptideket soroljuk ide, amelyek az
immunrendszer működését összehangolják. Ugyanakkor
ismert, hogy szerepük van az embriogenezis
bizonyos folyamataiban is.
A citokinek általános jellemzői:
• Kis molekulatömegű (10-40 kDa) glikoproteinek,
peptidek.
• Izolált sejtek termelik átmeneti génaktiváció
hatására.
• Pikomoláris koncentrációban termelődnek,
igen bomlékonyak, rövid a féléletidejük, ezért
nehezen mérhetők.
• Receptorokon keresztül hatnak, nagy affinitású
kötődéssel.
• Sejtek közötti kapcsolatokat közvetítik: információtovábbítás,
immunválasz szabályozása.
11-46. ábra. Avidin-biotin-peroxidáz komplex módszer.
A biotinált másodlagos antitest nagy affinitású kapcsolatot
létesít az avidin-biotin-peroxidáz komplexszel
11-47. ábra. Peroxidáz-antiperoxidáz (PAP) módszer. A
háromrétegű módszer során egy hídképző antitest köti
össze az elsődleges antitestet a PAP-komplexszel

274 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A citokinműködés formája a következő lehet:
• Autokrin, a citokint termelő sejtre visszaható.
• Parakrin, a termelő sejt közvetlen közelében
lévő sejtre ható.
• Endokrin, a szervezet egy távoli pontjára ható.
A legtöbb citokinnek többféle szerepe is van, ezért
több helyre is besorolható a hatásaik szerinti csoportok
közt.
A citokinek csoportosítása:
• A haemopoesisben ható növekedési faktorok:
- SCF (stem cell factor),
- GM-CSF,
- G-CSF,
- erythropoetin,
- IL-3, IL-7, IL-11 stb.
• A lymphocyták aktiválódására, differenciálódására
ható citokinek:
- Th1-citokinek: IL-2, IFN-g, IL-3, TNF, LT
- Th2-citokinek: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 stb.
- Th17: IL-17,
- Treg: IL-10, TGF-b.
• A természetes immunitásban ható, vagy a gyulladási
folyamatokra ható citokinek. Ezek a nem
fajlagos immunrendszer sejtjeiből azonnal termelődnek
vagy felszabadulnak, amikor egy kórokozó
a szervezetbe kerül. Ilyenek az antivirális
hatású interferonok (IFNα, -β és -γ), a tumornekrózis-faktorok
(TNFα és β), az IL-1α és β, az
IL-6, az IL-10, az IL-12, a migrációt gátló faktor
(MIF) és a kemokinek.
Mivel a citokinek zöme lokálisan hat, a szérumban
megbízhatóan mérhető koncentrációt csak kivételes
esetben érnek el. Közülük az ún. „gyulladásos citokinek”
(IL-6, TNF-alfa) sepsisben érnek el olyan szérumszintet,
hogy közvetlenül is meghatározhatóak.
Immunsejtek stimulálása
Diagnosztikai vagy kutatási célokra a vérből, egyéb
testfolyadékokból vagy szövetekből izolált immunsejtek
stimulálása révén tudunk mérhető citokinmenynyiséget
nyerni. Attól függően, hogy milyen sejttípus
citokintermelésére vagyunk kíváncsiak, különböző
stimulálószerekkel kezeljük a sejteket. A lymphocytákat
4-12 órán át PMA/ionomycin stimulációnak
vetjük alá. A PMA (forbol-12-mirisztát-13-acetát)
protein-kináz C (PKC) aktivátor, míg az ionomycin
a Streptomyces conglobatus baktérium által termelt
ionofór, amely növeli az intracelluláris Ca 2+ -jelet. A
PMA-stimuláció hátránya, hogy megváltoztatja a sejtek
morfológiáját (11-48. ábra), és számos sejtfelszíni
CD marker, pl. a CD4, CD33, CD14 expressziójának
drasztikus csökkenését idézi elő (11-49. ábra). Ezért
bizonyos laboratóriumok a PHA (fitohemagglutinin
lektin) stimulációt használják (11-50. ábra). A monocytákat
általában LPS (lipopoliszacharid) stimulációnak
tesszük ki.
Abban az esetben, ha a sejtekben intracellulárisan
kívánjuk a citokineket meghatározni, pl. áramlási citometria
vagy mikroszkópos immuncitokémiai reakció
segítségével, akkor a stimulálószert tartalmazó
reakcióelegybe brefeldint vagy monenzint (Sander
et al 1993) is teszünk, amely gátolja a fehérjék Gol-
11-48. ábra. A PMA/ionomycin stimulálás megváltoztatja a sejtek FSC/SSC flow citometriás megjelenését

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata
275
gi-készülékből való transzportját és szekrécióját. Így
a termelt citokin viszonylag magas koncentrációban a
termelő sejtben a Golgi-ciszternákban marad, ott egy
fluorokrómmal jelzett antitest felhasználásával detektálható
lesz.
Citokin mérése áramlási citometriával – intracelluláris
jelölés
Ma az áramlási citometriás mérés terjedt el leginkább
a citokinek egysejt szintű kimutatására. A multiparaméteres
meghatározási mód lehetőséget ad a
sejtfelszíni fenotípus (CD marker) jelölés után intracellulárisan
is a citokinek egyidejű kimutatására egy
mintában.
A metodika hátránya a stimulálás és az intracelluláris
jelölés miatt annak hosszadalmas volta.
Megoldható viszont, hogy a sejtek stimulálása után
folyékony nitrogénben fagyasztva tároljuk a mintát,
és később végezzük el a sejtfelszíni és intracelluláris
jelöléseket. A sejtfelszíni jelölésre még intakt sejten
kerül sor, azt követően 1-4%-os paraformaldehidben
(PFA) fixáljuk a sejteket, majd következik a permeabilizálásuk,
általában 0,1% saponin detergenst tartalmazó
pufferben. Ennek előnye, hogy reverzibilisen
tárja fel a sejtmembránt. A saponint kimosva a
pufferből az intracelluláris jelölőmolekula a sejt belsejében
marad, mert a sejtmembrán folyamatossága
visszaáll.
Egy lehetséges mérőmódszer leírása
Anyagok:
• heparin a vérvételhez, RPMI-1640, PMA törzsoldat
(1 mg/ml), ionomycin to. (1 mg/ml),
monensin (0,5 mM = 500 mM to.).
• anti-CD4-PE (sejtfelszíni jelöléshez).
• anti-IL-4-FITC, anti-IL-2-FITC, anti- IFNg-
FITC (50 mg/ml-es törzsoldatok) PBS/BSA/
NaN 3
pufferben. Izotípus-FITC (vagy patkány
IgG-FITC).
• pufferek: PBS/NaN 3
, PBS/NaN 3
/BSA (mosó
puffer), PBS/saponin/BSA/NaN 3
permeabilizáló
puffer), 4% PFA/PBS (fixáló puffer), lízispuffer
(Becton Dickinson), FACSFix.
11-49. ábra. A PMA/ionomycin stimulálás megváltoztatja a CD4-expressziót

276 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-50. ábra. A PMA/ionomycin hatékonyabb citokinstimuláló szer
Sejtek stimulálása:
1. Stimuláló oldat készítése: RPMI-be 40 ng/ml
PMA-t, 2 mg/ml ionomycint és 4 mM monensin
összemérése. A stimulálatlan mintákra RPMI + 4
mM monensin jön.
2. 200 ml heparinos vérhez adjunk 200 ml stimuláló
oldatot, inkubáljuk CO 2
-inkubátorban 4–6 órát. A
stimulálatlan vérhez a monensines RPMI jön 1:1
arányban. (annyiszor 50 ml vér + 50 ml stimuláló
puffert kell kiszámítani, ahány mintát szeretnénk
jelölni).
Jelölés:
1. 100 ml stimulált vérmintát (a hígítottból) jelöljünk
5 ml a-CD4-PE ellenanyaggal 30 percig jégen.
2. Majd adjunk hozzá 1 ml szobahőmérsékletű lízispuffert,
inkubáljuk 10 percig.
3. Mosás 1-szer mosó puffereben, 1-szer PBS/
NaN 3
-ban.
4. Fixálás 200 ml 4%-os PFA/PBS-ben 20 percig, jégen.
5. Mosás 1-szer PBS/NaN 3
, 1-szer saponin pufferben.
6. Ezután felvenni a sejteket 80ml saponin pufferben,
hozzátenni 20 ml a-IL-2, vagy a-IL-4, vagy
a-IFN-FITC, vagy 10 ml izotípus-FITC antitestet.
Inkubálás 30 percig jégen.
7. Mosás 2-szer saponin pufferben, 1-szer mosó pufferben.
8. Felvenni a sejteket 500 ml FACSfix oldatban.
9. 24 órán belül mérés, analízis áramlási citométeren.

A celluláris immunitás klinikai laboratóriumi vizsgálata
277
Az ELISPOT-módszer
Az enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT)
eljárás elterjedt funkcionális módszer az immunválasz
monitorozására. Elsőként 1983-ban Cecil
Czerkinsky alkalmazta antigénspecifikus ellenanyag
termelő B-sejt-szám meghatározásra. Mára számos
más szekretált molekula mérésére is adaptálták, legáltalánosabban
az aktivált lymphocyták citokintermelésének
meghatározásra egysejt szinten. Minden
spot (folt) megfelel egy citokintermelő sejtnek, a spot
(folt) nagysága pedig arányos a termelt molekulamennyiséggel.
Így az ELISPOT-assay minőségi és
mennyiségi analízisre is szolgál.
Az ELISPOT rendkívüli érzékenységének az oka az,
hogy a sejt által termelt fehérjemolekulát a membránra
immobilizált befogó antitest azonnal megköti annak
enzimatikus bomlása előtt. A módszer alkalmas
igen ritka sejtpopulációk (antigénspecifikus sejtek, citokintermelő
sejtek stb.) frekvenciájának meghatározására.
Ezzel a konvencionális citokin szendvics-ELI-
SA-nál nagyságrendekkel érzékenyebb módszer áll
rendelkezésünkre. Érzékenységére jellemző, hogy
méréshatára 1/100 000 sejt, ami azt jelenti, hogy ez
a jelenleg rendelkezésre álló legérzékenyebb celluláris
módszer. Az RT-PCR-analízis érzékenységéhez
hasonló, azzal a különbséggel, hogy fehérjét és nem
mRNS-t mér.
Ez citokinek esetében nagyon előnyös, hiszen számos
citokin transzlációs szabályozás alatt áll, ezért az
RNS-szintű meghatározás nem tükrözi a valóban termelt
citokin mennyiségét.
Az ELISPOT assay kivitelezése (11-51. ábra):
Első lépésként a citokinspecifikus befogó antitestet
immobilizáljuk a szilárd fázishoz, amelyre a legjobb a
polivinil-difluorid membránnal bélelt 96 lyukú mikrotitráló
lemez.
A második lépésben a vizsgálandó sejtet adjuk a
lemezhez stimulálószer jelenlétében vagy anélkül, és
megfelelő ideig (O/N) inkubáljuk, hogy citokin termelődjék.
A termelődött citokint a befogó antitest
megköti a termelő sejt környezetében.
Ezután mosással eltávolítjuk a sejteket, és a citokinspecifikus
detektáló antitestet adjuk a rendszerhez.
Ez a második antitest lehet direkt enzimkonjugált
vagy biotinált, amikor egy harmadik lépésben
enzimkonjugált streptavidint adunk a reakciócellába.
Végül az enzim szubsztrátja következik, amely oldhatatlan
csapadékot képez a termelt citokin helyén.
Így a látható spot (folt) megfelel egy citokint termelő
sejt helyének. A spotokat (foltokat) vagy mikroszkóposan,
vagy egy automata ELISPOT-olvasó (reader)
segítségével detektáljuk (11-52., 11-53. ábra) [11].
ELISPOT lemez
11-51. ábra. ELISPOT. Az eljárás lépései:
1. A T-sejtek (ismert mennyiségének) stimulálása specifikus
antigénnel a sejtkultúra lemezen
2. Az Elispot-lemez üregeit előzetesen anti-citokin antitestekkel
érzékenyítik
3. A T-sejtek átvitele az Elispot-lemezre
4. A sejtek inkubációja; citokinszekréció
5. Citokinkötés az antitesthez
6. A sejtek mosása; a lemezekre jelölő antitestek adagolása
7. Enzimmel jelölt másodlagos antitestek kötődése a citokinhez
8. A lemez mosása; szubsztrát hozzáadása
9. Oldhatatlan színes termék keletkezik
10. A pozitív pontok (spotok) megszámlálása mikroszkóppal

278 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-52. ábra. ELISPOT dot analízis
11-53. ábra. Humán IL-17A citokin mérése Elispot-tal
[M: közepes; SA: hővel elölt, formalinban fixált Staphylococcus
aureus sejtek (valamennyi baktériumrészecskét tartalmazza);
PHA: fitohemagglutinin]
Irodalom
[1] Zola, H., Swart, B., Banham, A. et al: CD molecules
2006 - Human cell differentiation molecules. Journal of
Immunological Methods 319(1-2):1-5, 2007.
[2] Sander, B., Andersson, J., Andersson, U.: Assessment
of cytokines by immunofluorescence and the
paraformaldehyde-saponin procedure. Immunol. Rev.
119:65-93, 1991.
[3] Jung, T, Schauer, U, Heusser, C. et al.: Detection of
intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol.
Methods 159(1-2):197-207, 1993.
[4] Baran, J., Kowalczyk, D., Ożóg, M. et al.: Three-Color
Flow Cytometry Detection of Intracellular Cytokines
in Peripheral Blood Mononuclear Cells: Comparative
Analysis of Phorbol Myristate Acetate-Ionomycin
and Phytohemagglutinin Stimulation. Clin. Diagn. Lab.
Immunol. 8(2):303–313, 2001.
[5] Czerkinsky, C., Nilsson, L., Nygren, H. et al.: A solid-phase
enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay
for enumeration of specific antibody-secreting cells.
J. Immunol. Methods 65(1-2):109–121, 1983.
[6] Chambers, I. R., Cone, T. R., Oswald-Richter, K.
et al.: Enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT):
Quantification of Th-1 cellular immune responses
against microbial antigens. J. Vis. Exp. (45):2221. 10.
3791/2221, 2010.
[7] Karlsson, A. C., Martin, J. N., Younger, S. R. et al.:
Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry
assays for the enumeration of antigen-specific T
cells. J. Immunol. Methods 283(1-2):141-153, 2003.
[8] http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_clusters_
of_differentiation
[9] http://www.sciencegateway.org/resources/prow/index.
html
[10] http://www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/
54/Default.aspx
[11] http://www.mabtech.com/main/Page.asp?PageId= 16
&PageName=About+ELISpot

A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana
279
A hemosztázis vizsgálatának
újabb fehérjemódszertana
Tőkés-Füzesi Margit
A véralvadási rendszer fontos szerepet tölt be a szervezet
homeosztázisának fenntartásában. Ezt a szerepét
a vascularis endothel, a thrombocyták, a pro- és
antikoaguláns fehérjék, valamint a fibrinolitikus
rendszer segítségével valósítja meg. A véralvadási
rendszer fehérjéi nem csak az érsérülés helyén létrejövő
alvadási folyamatban és repairben vesznek részt,
hanem a gyulladásos folyamatok kialakulásában és
lezajlásában is fontos szerepet játszanak. Az alvadási
faktorok szerepet játszanak az embrionális növekedésben
és fejlődésben is.
A véralvadás folyamata
A véralvadás folyamatának leírására régebben a kaszkád
(11-54. ábra) modellt használták, amelyben a
zimogén formában jelen lévő enzimek szigorú sorrendet
követve fehérjefragmentumok lehasításával
egymást követően aktiválják egymást. A folyamatok
nagy része foszfolipidfelszínt és kalciumiont igényel,
néhány esetben szükséges az enzim és szubsztrátjának
kofaktorhoz való kötődése is.
Ez a modell a véralvadás folyamatában egy extrinsic
és egy intrinsic utat különböztet meg. Az extrinsic
11-54. ábra. A véralvadás kaszkádmodellje
út beindításához szöveti faktorra (TF), valamint aktív
VII-es faktorra (FVIIa) van szükség. Az intrinsic út
esetében a XII-es faktor kontakt aktiválása negatívan
töltött felszínen megy végbe. A két út a X-es faktor
szintjén találkozik, és innen a közös útba torkollik,
amelynek végén a trombin hatására megtörténik a
fibrinogén-fibrin átalakulás.
A véralvadás kaszkádmodellje hasznos volt az alvadás
folyamatának megértésében, vala mint a véralvadási
laboratóriumi tesztek klinikai értékelésében.
A véralvadással kapcsolatos tudásunk bővülésével ez
a modell már nem tudott választ adni az in vivo végbemenő
folyamatokra. A kaszkádmodell szerint az
intrinsic és az extrinsic út egymástól függetlenül működik
és indítja be az alvadás folyamatát.
Ennek ellentmondanak olyan klinikai megfigyelések,
mint pl. az intrinsic út beindításában részt
vevő faktorok - XII-es faktor, prekallikrein, nagy
molekulatömegű kininogén - hiánya, ami megnyúlt
APTI-vel (aktivált parciális tromboplasztinidő) jár,
azonban nem okozza a beteg vérzékenységét. A XI-es
faktor hiánya (haemophilia C) is csak változó mértékben
okoz vérzékenységet, ezzel szemben a VIII-as
és IX-es faktor hiánya (haemophilia A és B) súlyos
vérzé keny séggel jár annak ellenére, hogy az extrinsic
véralvadási út intakt. Hasonlóképpen a VII-es faktor
hiánya is vérzékenységhez vezethet jól működő intrinsic
út mellett.
Ezek alapján úgy tűnik, hogy a két út nem egymástól
függetlenül működve jut el a X-es faktor aktiválásáig.
Ezek után vezették be a véralvadás ma is elfogadott
sejtes modelljét. Ennek alapján az alvadás in vivo
sejtfelszínen (szöveti faktort hordozó sejt, thrombocyta)
indul el, és három különböző, egymáshoz kapcsolt
fázisban zajlik le:
• Iniciáció. Ennek során az érsérülés helyén a szöveti
faktort hordozó sejtek szabaddá válnak, és a
vérben keringő VIIa faktor gyorsan kötődik a
TF-hez. A VII-es faktor az egyetlen, amelynek
egy kis része, kb. 1%-a, aktivált formában kering
a vérben. Ennek eredményeként kis mennyiségű
IXa és Xa faktor, valamint trombin képződik
(11-55. ábra).
• Amplifikáció. Ebben a fázisban az előző lépésben
kis mennyiségben keletkezett trombin aktiválja
a thrombocytákat, von Willebrand-faktort
(vWF) szabadít fel, és az V-ös, a VIII-as és a
XI-es faktorok aktiválásához vezet (11-56. ábra).

280 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
• Propagáció. A propagáció fázisában az előző
lépésekben kelet kezett enzimek az aktivált
thrombocyták prokoaguláns membránfelszínén
összeszerelődnek és létre hozzák a tenáz komplexet.
Ez a thrombocyták felszínén Xa faktort
hoz létre, mely a protrombináz komplex részévé
válik. Ennek eredménye lesz a trombin képződés
,,robbanás,, a thrombocyták fel színén, mely
beindítja a fibrinogén–fibrin átalakulást (11-57.
ábra, 11-20. táblázat).
11-56. ábra. A véralvadás sejtes modellje – II. lépés – amplifikáció
11-55. ábra. A véralvadás sejtes modellje – I. lépés – iniciáció
11-57. ábra. A véralvadás sejtes modellje – III. lépés – propagáció
11-20. táblázat. Prokoaguláns alvadási faktorok
Jelenlegi nevezéktan szerint (név) Funkció Féléletidö (óra)
faktor I (fibrinogén) fibrin prekurzora 90
faktor II (protrombin) szerin-proteáz a protrombináz-komplexben 65
faktor III (kalcium) kofaktor -
faktor IV (szöveti faktor) a véralvadási kaszkád elindítója -
faktor V (proakcelerin) kofaktor a protrombináz-komplexben 15
faktor VII (prokonvertin) a véralvadási kaszkád elindítója 5
faktor VIII (antihemofíliás faktor) kofaktor a tenáz-komplexben 12
faktor IX (Christmas-faktor) szerin-proteáz a tenáz-komplexben 24
faktor X (Stuart-Prower-faktor) szerin-proteáz a protrombináz-komplexben 40
faktor XI (plazmatromboplasztin) a véralvadás amplifikációja 45
faktor XII (Hageman-faktor) kontakt faktor 50
faktor XIII (fibrinstabilizáló faktor) fibrin keresztkötése 200
prekallikrein (Fletcher-faktor) kontakt faktor 35
nagy molekulatömegű kininogén (Fitzgerald-faktor) kontakt faktor 150

A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana
281
Az alvadás folyamatában természetes inhibitorok is
részt vesznek, amelyek a trombinképződést ellenőrzik
(11-21. táblázat).
A fibrinolitikus rendszer véralvadásban betöltött
szerepe egyrészt az, hogy biztosítsa a véralvadék kialakulását
az érsérülés helyén, másrészt hogy eltávolítsa
a sebgyógyulás lezajlása után az alvadékot.
A véralvadék kialakulása során pro- és antifibrinolitikus
fehérjék épülnek be a fibrinhálóba a fibrinhez
való kötődés által (11-22. táblázat). A szöveti plazminogénaktivátor
(tPA), a plazminogén és a plazmin a
fibrin lizin helyeihez kötődik, miközben az α 2
-antiplazmint
a XIIIa faktor keresztköti a fibrinhez.
A plazmin/plazminogén két formában található meg:
• Glu-plasmin/plasminogén, amelyben a fehérje
1. pozíciójában egy glutamát található, és ez a
vegyület kevésbé aktív.
• Lys-plasmin/plasminogén, amelyben az első 76
aminosav katalitikus lebontása után az első aminosav
lizin.
11-22. táblázat. A fibrinolízis fehérjéi
Antifibrinolitikus fehérjék
• α 2
-antiplazmin
• PAI-1
• PAI-2
• TAFI
Profibrinolitikus fehérjék
• plazminogén
• plazmin
• tPA
• uPA
A plazminogén-plazmin átalakulást egyrészt a tPA
(szöveti plazminogén aktivátor), amely az endothelsejtekből
szabadul fel, másrészt az uPA (urokináz)
(ez elsősorban a vizeletben található meg) aktiválja.
A tPA féléletideje a plazmában rövid, mivel az I-es
típusú plazminogénaktivátor inhibitor (PAI-1) gyorsan
inaktiválja és a máj lebontja. A fibrinhez kötött
tPA azonban védve van a gátló faktortól, ezért aktivitása
is nagyobb mértékű. A plazmin nem specifikus
enzim, a fibrinogént, a fibrint és a keresztkötött
fibrint is lebontja (arginin és lizin kötéseket hidrolizál).
Az ennek eredményeként keletkező termékek a
fibrin/fibrinogén degradációs termékek (FDP). D-dimer
azonban csak a keresztkötött fibrin bontása után
keletkezik, és ez specifikus a keletkezett alvadékhoz
kötött fibrinre, vagyis kialakulását mindig thrombusképződés
előzi meg.
A fibrinolízis legfontosabb gátló fehérjéje a PAI-1
és a PAI-2 (1-es és 2-es típusú plazminogénaktivátor
inhibitor), az α 2
-antiplazmin és a trombin által
aktiválható fibrinolízisinhibitor (TAFI). A PAI-1 és
PAI-2 megtalálható a thrombocytákban és az endothelsejtekben.
A PAI-2 nagy mennyi ségben termelődik
terhességben a placenta által, de megtalálható a
monocytákban is. Az α 2
-antiplazmin és a TAFI a májban
termelődik. A keringésben jelen lévő plazmint az
α 2
-antiplazmin gyorsan inaktiválja. A fibrinhez kötött
forma viszonylagosan védett a gátlás alól, viszont
a plazmin fibrinhez való kötődését az FXIIIa által az
alvadékhoz keresztkötött α 2
-antiplazmin gátolja. A
TAFI-t a trombin-trombomodulin komplex aktiválja,
és az alvadékban jelen lévő fibrinről lizin maradványokat
távolít el, ezáltal megakadályozva, hogy a
plazmin ki tudja fejteni hatását.
11-21. táblázat. Természetes alvadási inhibitorok
Fehérje
antitrombin
protein C
protein S
TFPI
heparinkofaktor 2
α 2
-makroglobulin
α 1
-antitripszin
Funkció
gátolja a trombint, a Xa, IXa, XIa faktort
gátolja a VIIIa és Va faktort
a protein C kofaktora
gátolja a TF-VIIa komplexp C-t és a TAFI-t a trombinnal komplexben
gátolja a trombint
gátolja a trombint és a Xa faktort
gátolja a XIa faktort és más szerin-proteázokat

282 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Véralvadási tesztek
Egy rutin diagnosztikai feladatokat ellátó laboratórium
szintjén a véralvadás folyamatának ellenőrzésére
az ún. véralvadási szűrőtesztek állnak rendelkezésre.
Ezek lehetnek globális tesztek, amelyek arról adnak
felvilágosítást, hogy a fibrinképződéshez vezető reakciók
normálisan folynak-e le, vagy defektus áll fenn
(pl. vérzési idő). A globális tesztek viszonylag érzéketlenek,
segítségükkel csak súlyos alvadási zavar ismerhető
fel. A fázisvizsgálatok segítségével meghatározható,
hogy az alvadási zavar a véralvadás melyik
fázisára lokalizálódik (pl. PI, APTI, TI). A faktoranalízis-vizsgálatoknál
úgy választjuk meg a feltételeket,
hogy az egyes faktorok aktivitását vagy koncentrációját
mennyiségileg tudjuk meghatározni (pl.
fibrinogén). Az alap véralvadási szűrőtesztek tehát:
PI (protrombinidő), APTI (aktivált parciális tromboplasztinidő),
TI (trombinidő) és a fibrinogénmeghatározás.
Minden esetben fontos a thrombocytaszám
meghatározásához egy gépi vérképvizsgálat elvégzése
is. A hemosztázis vizsgálatainak eredményeit jelentősen
befolyásolhatják a preanalitikai tényezők. Ezeket
soroljuk fel a 11-23. táblázatban anélkül, hogy kitérnénk
a részletekre.
A véralvadási mérésekhez koagulométereket használunk.
A koagulométerek a mintához adott reagens
vagy startreagens és a fibrinháló megjelenése között
eltelt időt másodpercben mérik (funkcionális tesztek).
Ezek működhetnek mechanikus és optikai elven.
Az optikai elven működő koagulométerek általában
405 és 660 nm hullámhosszon mérnek. A mérést zavarhatja
a lipaemia, ill. az emelkedett bilirubinszint.
Ennek kiküszöbölésére mérhetünk egy másik hullámhosszon
is, és a keletkezett jelet erre korrigáljuk,
vagy az alvadási végpont meghatározásához a görbét
deriválhatjuk (ez általában az első derivált). Mechanikus
mérés során az ívelt fenekű küvetta alján található
golyó mágneses térben mozog, a fibrinpolimer kialakulásával
egy időben a közeg viszkozitása nő, ami a
golyó mozgásának lassulásához és megállásához vezet.
Ebből lehet megfelelő algoritmus segít ségével az
alvadási időt kiszámolni, ezt az értéket a készülékek
másodpercben kijelzik.
Az alap alvadási paraméterek mérési eredményei,
amennyiben szűrésre használjuk őket, egyrészt felvethetik
a lehetséges diagnózist, másrészt ezek alapján
további speciális tesztek végezhetők el a véralvadási
defektus pontos meghatározásához (11-24. táblázat).
Protrombinidő- (PI-) meghatározás
A citráttal alvadásgátolt thrombocytaszegény plazmához
feleslegben adunk tromboplasztint és kalciumiont,
és a reagens hozzáadása és a fibrinképződés
11-23. táblázat. Preanalitikai tényezők
Mintavétel és feldolgozás
• Mintavétel során kerüljük a hosszan tartó vénás leszorítást (

A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana
283
11-24. táblázat. Véralvadási szűrőteszt eredmények eltéréseinek értelmezése
Teszt
PI APTI TI Fibrinogén
megnyúlt normál normál normál VII-es faktor hiány
normál megnyúlt normál normál
megnyúlt megnyúlt normál normál
megnyúlt megnyúlt megnyúlt normál vagy alacsony
Lehetséges véralvadási defektus
VIII, IX, XI, XII-es vagy kontakt faktor hiány,
lupus-antikoaguláns
II, V, X-es faktor hiány
oralis antikoaguláns terápia
K-vitamin-hiány
kevert V + VIII-as faktor hiány
kevert II, VII, IX, X-es faktor hiány
májbetegség
hypo- vagy dysfibrinogenaemia
májbetegség
masszív transzfúzió
DIC (disszeminált intravascularis koaguláció)
között eltelt időt másodpercben mérjük. A tromboplasztin
szöveti faktort (TF-t) és foszfolipideket tartalmaz,
amely lehet állati eredetű (nyúlagyból, patkányplacentából
kivonva) vagy rekombináns készítmény.
A szöveti faktor a VIIa faktorral reagálva a véralvadás
,,extrinsic,, útját indítja el. Az eredményt megadhatjuk
másodpercben, a normál százalékában, il. PR
(protrombinráta) formájában. Az így kapott eredmények
azonban nagymértékben függnek az alkalmazott
tromboplasztin reagenstől, mivel különböző
érzékenységet mutatnak a II-es, V-ös, X-es és VII-es
faktor irányában. Az oralis antikoaguláns terápián
lévő betegek vizsgálatakor a PIVKA (Proteins Induced
by Vitamin K Absence or Antagonism) zavarja
a PI-meghatározásban részt vevő normál koagulációs
faktorok aktiválását. Ezek a fehérjék a II-es, VII-es,
IX-es és X-es faktor nem-γ-karboxilált prekurzorait
foglalják magukba, amelyek a K-vitamin-antagonista
terápia hatására jönnek létre. Ezért a protrombinidő
nemzetközi szabványosítása érdekében bevezették az
INR (International Normalised Ratio) használatát:
referencia tromboplasztinkészítményhez hasonlítják.
Ennek ISI- (International Sensitivity Index) értéke
1,0.
A PI érzékeny és ily módon megnyúlt a VII-es,
X-es, V-ös és II-es faktor és fibrinogénszint-csökkenés
esetén. Az oralis antikoaguláns terápia monitorozására
használt módszer. Megfelelően antikoagulált
beteg esetében INR = 2-3 közötti célértéket kell
elérnünk, kivéve a műbillentyű-beültetett betegeknél,
ahol ez az érték nagyobb is lehet. A 11-58. ábra mutatja
be a megnyúlt PI esetén elvégzendő szükséges
vizsgálatokat.
INR = PR ISI ,
ahol a PR a beteg plazmájában mért PI/normál plazmából
mért PI (MNPT, Mean Normal PT).
A gyártók által forgalomba hozott különböző érzékenységű
reagenseket egy WHO által bevezetett
11-58. ábra. Megnyúlt PI kivizsgálása
*Ritka esetben a lupus-antikoaguláns is megnyújthatja a
PI-t, azonban ilyen esetben az ATPI is mindig megnyúlik

284 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Aktivált parciális tromboplasztinidő (APTI-) meghatározás
A minta ebben az esetben is thrombocytaszegény
plazma. A reagens parciális tromboplasztin, amely
nem tartalmazza a szöveti faktort, csak a foszfolipidrészt.
A reakció azonban így nagyon lassan zajlana le,
ezért a reagenshez kontakt aktivátort (kaolin, szilika,
elagsav) is hozzáadnak. A minta és a reagens előinkubálása
(aktiválása) után hozzáadott kalcium-klorid
startreagens és a fibrinalvadék megjelenése között eltelt
időt mérjük másodpercben. A módszer a véralvadás
„intrinsic,, és ,,közös” útját modellezi, az ezekben
részt vevő faktorok csökkenése esetén megnyúlik.
Az eredményt normál kontrollhoz viszonyítva (kórosnak
tekinthető a ±8 s eltérés) vagy APTI-ráta (betegnél
mért APTI/normál kontroll APTI) formájában
adjuk meg. Az APTI megnyúlását okozhatja a XII-es,
XI-es, X-es, IX-es, VI-as, V-ös és II-es faktor és a fibrinogén
szintjének csökkenése.
Használjuk nem frakcionált heparin (UFH) terápia
monitorozására. Ilyen esetben az APTI 1,5-2,5-szörös
megnyúlását kell elérni. Megnyúlt APTI-t eredményezhet
lupus-antikoaguláns (LA) jelenléte is. A
11-59. ábra mutatja be a kóros APTI esetén végzendő
további vizsgálatokat. Az APTI jelentős megnyúlása
tapasztalható néha vérzés meg jelenése nélkül is. Ez
XII-es faktor, HMWK (high molecular weight kininogén),
PK (prekallikrein) hiányban, lupus-antikoaguláns
jelenlétében és nem megfelelő vér : citrát arány
esetén észlelhető.
A keveréses teszt során a beteg plazmájához 1:1
arányban normál plazmát keverünk. Ezáltal az alvadási
faktorok minimum 50%-a rendelkezésre áll. Ennek következtében,
ha a keveréses teszt eredményeként normál
APTI-t mérünk, az APTI-megnyúlás hátterében
faktorhiány áll. Nem korrigálható keveréses teszt inhibitor
jelenlétét (heparin, specifikus faktorellenes inhibitor
vagy lupus-antikoaguláns) valószínűsíti.
11-59. ábra. Megnyúlt APTI kivizsgálása

A hemosztázis vizsgálatának újabb fehérjemódszertana
285
Trombinidő- (TI-) meghatározás
A thrombocytaszegény plazmához meghatározott
mennyiségű trombin reagenst adunk és másodpercben
mérjük a fibrinalvadék megjelenéséig eltelt időt.
A fibrinogén polimerizált fibrinné való átalakulásának
arányát követjük nyomon. Az eredményt normál
kontrollhoz viszonyítva (kórosnak tekinthető a ±8 s
eltérés) vagy TI ráta (betegnél mért TI/normál kontroll
TI) formájában adjuk meg. A TI megnyúlását
okozhatja hypo- vagy dysfibrinogenaemia, heparin
terápia (heparinszennyezettség esetén is), FDP (fibrin/fibrinogén
degradációs termékek) és a fibrin polimerizációját
zavaró faktorok (pl. paraprotein) jelenléte
a mintában. A 11-60. ábra mutatja be a kóros TI
esetén végzendő további véralvadási vizsgálatokat.
Fibrinogénmeghatározás
A fibrinogénkoncentráció meghatározására több
módszer is rendelkezésünkre áll, így direkt meghatározás
kinetikus turbidimetriával, immunkémiai
módszerek és az ún. PI-származtatott vagy derivált
fibrinogén módszer. Ez utóbbi esetében a fibrinogén
koncentrációt a PI mérése során a fényszórás mértékének
változásából vagy optikai denzitásából számítjuk
ki. Előnye, hogy gyors és olcsó. Hátránya, hogy
bizonyos betegcsoportok esetén nem ad pontos eredményt
(pl. DIC, májbetegek, vesebetegek, dysfibrinogenaemia,
trombolitikus terápia, ill. erősen megnyúlt
protrombinidő).
Ezért a fibrinogén meghatározására ajánlott módszer
a Clauss szerinti. Ez biológiai hatás alapján
mér – egy módosított trombinidő-meghatározás -,
az 1:9 arányban hígított plazmához trombint adunk
feleslegben, és másodpercben mérjük a fibrinalvadék
megjelenéséig eltelt időt. Ennek eredményeként a fiziológiásan
jelen lévő inhibitorok hatása elhanyagolhatóvá
válik, és a mért idő csak a mintában jelen lévő
fibrinogén koncentrációjától függ. Ismert fibrinogénkoncentrációjú
plazma hígításaival kalibrációs görbét
készítünk, amelyről a beteg plazmájának fibrinogénkoncentrációja
leolvasható. Az eredményt g/l mértékegységben
adjuk meg (referenciatartomány: 2-4 g/l).
A fibrinogént a máj termeli és az akut fázis fehérjék
csoportjába tartozik. Szintje csökken csökkent
szintézis (pl. májbetegség), megnövekedett felhasz-
11-60. ábra.
Megnyúlt TI
kivizsgálása

286 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
nálás (pl. DIC, hyperfibrinolysis) miatt. Emelkedett
fibrinogénkoncentrációt mérhetünk megemelkedett
szintézis, pl. akut fázis reakció (gyulladás, tumor, trauma,
égés), krónikus gyulladásos reakció (rheumatoid
arthritis, bizonyos autoimmun megbetegedések)
következményeként, fehérjevesztéses állapotokban az
albuminveszteség kompenzálására vagy veleszületetten
(az atherosclerosis rizikófaktora).
Irodalom
Debreczeni L., Kovács L. G. (szerk.): Gyakorlati laboratóriumi
medicina. 2. kiadás, Literatura Medica Kiadó,
Budapest, 2008.
Kitchen, S., Olson, J. D., Preston, F. E. (eds): Quality in
Laboratory Hemostasis and Thrombosis, Wiley- Blackwell
Publishing Ltd, Oxford, 2009.
O’Shaughnessy, D., Makris, M., Lillicarp, D. (eds):
Practical Hemostasis and Thrombosis. Oxford, Blackwell
Publishing Ltd, 2005.
Smith, Stephanie A.: The cell-based model of coagulation.
J. Vet. Emerg. Crit. Care 19(1):3–1, 2009.

A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája
287
A thromboemboliás kórképek
fehérjediagnosztikája
Tőkés-Füzesi Margit
A thromboemboliás kórképek az artériás vagy vénás
keringésben kórosan létrejövő thrombus következményei.
Eredményeként létrejöhet részleges vagy teljes
érelzáródás, ill. a keletkezett vérrögből embolusok
szakadhatnak le, tovább súlyosbítva a kórlefolyást. A
vénás thromboemboliák (VTE) a mélyvénás thrombosist
(MVT) és a pulmonalis emboliát (PE) foglalják
magukba. Az artériás thrombosis elsősorban
akut ischaemiás állapot formájában jelentkezik, ami
érintheti a szívartériákat (akut coronaria-szindróma:
instabil angina, szívinfarktus), az agyi artériákat (átmeneti
agyi ischaemiás attak, agyvérzés), valamint
a végtagok perifériás és a mesenterium artériáit. A
thromboemboliás kórképek diagnosztizálása elsősorban
nem laboratóriumi teszteken alapul. Ilyen
esetekben a laboratórium a mérhető rizikótényezők
felderítésében, a praethromboticus állapot előrejelzésében,
ill. a nehezen diagnosztizálható thrombosis és
pulmonalis embolia kizárásában segítheti a klinikus
munkáját. Praethromboticus állapotban mérhető alvadási
paraméterek:
• Fibrinopeptid A (FPA), amely a fibrinogénből
trombin hatására lehasadó molekula.
• Fibrin monomer.
• Trombin-antitrombin komplex (TAT) kimutatás.
Ezek szintje hamar emelkedik a plazmában, mérésük
viszont költséges és időigényes. Rutin laboratóriumok
szintjén is elvégezhető vizsgálat ilyen esetekben
a D-dimer-mérés.
D-dimer-meghatározás
A fibrinolízis során, mivel a plazmin nem specifikus
enzim (lebontja a fibrinogént, a fibrint és a stabil fibrinhálót
is), különböző fibrindegradációs termékek
(FDP) keletkeznek, pl. D-dimer, DXD fragmentum,
DD/E fragmentum (11-61. ábra). A D-dimer a többi
FDP-vel szemben csak a XIII-as faktor által keresztkötött
fibrinháló plazmin általi hasításakor keletkezik,
ami azt jelenti, hogy létrejöttét mindig thrombusképződés
előzi meg. Kimutatására kvalitatív/szemikvantitatív
gyorstesztek, ELISA, immunturbidimetria és
fluoreszcens immunoassay-k is rendelkezésre állnak.
Ezek közül a legelterjedtebb a turbidimetriás mérés.
Monoklonális antitesttel bevont latexpartikulumokat
tartalmazó reagenshez adjuk a mintát. D-dimer
jelenlétében a partikulumok agglutinálódnak, a fényabszorbancia
csökken. Az abszorbanciaváltozás pedig
arányos a mintában jelen lévő D-dimer mennyiségével,
amelynek értékét ismert koncentrációjú D-dimer
hígításaiból készített kalibrációs görbéről olvasunk le.
Az eredményt a különböző módszerek különböző
mértékegységben adják meg; a hazánkban forgalomban
lévő tesztek mg/l (μg/ml) vagy mgFEU/l (μgFEU/
ml) egységben. A FEU (fibrinogen equivalent unit) azt
a fibrinogénmennyiséget fejezi ki, amelyből az adott
koncentrációjú fibrindegradációs termék keletkezett.
11-61. ábra. A fibrinolízis (P: plazmin; D, E: a fibrinogén D, E régiója; ezek N- és C-terminális fehérjék)

288 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Két μgFEU/ml D-dimer immunreaktivitása annyi,
mint 1 μg/ml tisztított D-dimeré. Ez azt jelenti, hogy
a FEU-ban kifejezett D-dimer-értékek kétszer olyan
magasak lehetnek, mint a D-dimer egységekben kifejezett
értékek. A kvantitatív D-dimer-tesztek eredményei
nem könnyen hasonlíthatók össze egymással,
mivel a különböző tesztekben alkalmazott antitestek
specificitása és affinitása különböző, valamint a kalibrátor
készítmények előállítása is. Ebből adódnak a
különböző referenciatartományok és cut-off értékek,
a legtöbb teszt esetén azonban ez

A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája
289
11-26. táblázat. Ajánlott első vonalbeli kivizsgálások thrombophiliában
Teszt neve Teszt típusa Módszer
véralvadás-szűrőteszt funkcionális APTI, PI, TI
antitrombin
funkcionális
protein C funkcionális kromogén aktivitás
protein S immunológiai szabad PS antigén
heparin kofaktor aktivitás mérés szarvasmarha trombinnal vagy Xa
szubsztráttal
APC-rezisztencia funkcionális minta előhígítása V. faktor hiányos plazmával
vagy
faktor V Leiden-mutáció
protrombin G20210A
DNS alapú
DNS alapú
lupus-antikoaguláns funkcionális alvadás alapú teszt (clotting-based)
antikardiolipin
immunológiai
11-27. táblázat. Thrombophilia kivizsgálásában lehetőség szerint elvégezhető tesztek
Teszt neve
aktivált PC rezisztencia
AT antigén
protein C antig;n
protein C aktivitás
össz-protein S antigén
protein S aktivitás
fibrinogén
fibrinogén
VIII, IX, XI. faktor szint
homocisztein
Módszer
eredeti, nem módosított teszt
immunológiai módszer
immunológiai módszer
alvadás alapú funkcionális teszt
immunológiai módszer
alvadás alapú funkcionális teszt
alvadás alapú funkcionális teszt
immunológiai módszer
alvadás alapú funkcionális teszt
funkcionális vagy immunológiai teszt
mikor alkalmas, és az élet során elegendő egy vizsgálat
elvégzése (FV Leiden, Protrombin 20210A mutációk).
Más alapelven működő tesztek esetében a thrombosis
lezajlása után 3-6 hónappal érdemes elvégezni a
kivizsgálást. Oralis antikoaguláns kezelésen lévő betegek
kivizsgálása nem ajánlott, mivel a protein C, a
protein S és a lupus-antikoaguláns eredmények nem
interpretálhatók. Tartós heparinkezelés csökkenheti az
antitrombin- (AT-) szintet. Amennyiben az antikoaguláns
kezelés nem függeszthető fel, akkor a vizsgálat
idejére ajánlott a beteg kis molekulatömegű heparinkezelésre
való átállítása. Thrombophilia diagnózisát
nem molekuláris teszt végzésekor csak akkor mondhatjuk
ki, ha az két ismételt mintavétel után is pozitív
eredményt adott.
A thrombophilia szűrésére ajánlott teszteket a 11-
26. táblázaton mutatjuk be; részletes leírásuk a megfelelő
helyen a szövegben szerepel. A lehetőség szerint
elvégezhető további teszteket a 11-27. táblázat
foglalja össze.

290 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Antitrombin- (AT-) defektusok
Az előzőleg antitrombin III néven ismert antitrombin
a májban termelődő 58 kDa nagyságú fehérje. A
trombin legfontosabb inhibitora, ugyanakkor más
szerin-proteázokat is gátol, így a Xa, IXa, XIa, XIIa,
valamint a szöveti faktorhoz kötött VIIa faktort is.
Funkcionális szempontból két fontos régiója van: egy
trombinkötő domén a molekula karboxi-terminális
részén (Arg393-Ser394) és egy heparinkötő hely
az N-terminális részen. Heparin nélkül az AT lassan
inaktiválja a trombint, ezt nevezzük az antitrombin
progresszív aktivitásának. Heparin bekötődésekor viszont
az AT konformációváltozáson esik át, ennek
eredményeként az AT és a szerin-proteázok közötti
komplexképződés a 4000-szeresére emelkedik. A heparin
jelenlétében végbemenő gyors trombin- és Xa
faktor inaktiválást nevezzük az antitrombin heparinkofaktor-aktivitásának.
Az AT-hiány a thromboembolia
kialakulásának kockázatát 8-10-szeresére emeli.
A veleszületett antitrombinhiánynak két formája
ismert.
• I-es típusú AT hiány. Ilyenkor a minőségileg jól
működő antitrombin mennyisége csökken,
vagyis mind az AT antigén, mind az aktivitás
csökken.
• II-es típusú AT hiány. Mennyiségileg megfelelő,
de funkcionálisan rosszul működő fehérje termelődik.
Ebben az esetben az AT antigénszint
normál vagy közel normál, de az aktivitás jelentősen
csökkent. A II. típuson belül is három
alcsoportot különböztetünk meg attól függően,
hogy az AT melyik részét érinti a molekuláris
defektus.
Az AT-aktivitás kimutatására alkalmazott tesztek közül
az AT-deficienciák szűrésére a heparinkofaktor-aktivitás
mérése ajánlott, mivel ezzel a klinikailag fontos
eltérések kimutathatók.
A mérés két lépésben megy végbe:
• Az első lépésben a beteg plazmáját ismert menynyiségű
szarvasmarha Xa faktorral inkubáljuk
fölös mennyiségű heparin jelenlétében.
• Majd az el nem reagált Xa faktor aktivitását kromogén
szubsztrát segítségével mérjük. A
szubsztrátról lehasadó kromogén p-nitro-anilint
405 nm-en kinetikusan mérjük. A mért
színintenzitás fordítottan arányos a beteg plazmájában
jelen lévő AT-nal.
Vannak gyártók, akik a Xa faktor helyett IIa faktort
alkalmaznak a tesztben. Az eredményt az aktivitás
százalékában adjuk meg.
Protein C (PC-) defektusok
A protein C a májban zimogén formájában termelődő
62 kDa nagyságú K-vitamin-függő fehérje. K-vitamin
hatására poszttranszlációs módosuláson esik át, vagyis
a fehérjében lévő glutaminsavhelyek γ-karboxilációja
megy végbe. Az aktív protein C kialakulásához a
plazmában kalciumion, trombin és foszfolipid jelenlétére
van szükség. A protein C trombin általi aktiválásához
az endothelsejtekhez kötött trombomodulinra
és endotelhialis protein C-receptorra van szükség. Az
aktivált protein C kofaktora, a protein S jelenlétében
inaktiválja a VIIIa és Va faktort, ezáltal gátolva a trombinképződést
(11-62. ábra). A PC-hiány hétszeresére
emeli thrombosis kialakulásának a kockázatát.
Az öröklött protein C-deficienciának is két formája
ismert:
• I-es típus. A deficienciák 75%-át teszi ki.
Ilyenkor a PC-nek mind mennyiségileg, mind
funkcionálisan csökken a szintje.
• II-es típus. E deficienciában a funkcionális
fehérje szintje csökken az antigénszinthez viszonyítva.
A PC-aktivitás mérésére ajánlott teszthez kromogén
szubsztrátot alkalmaznak; a teszt két lépésben megy
végbe. Az első lépésben a beteg plazmáját inkubáljuk
PC-aktivátorral (Agkistrodom contortrix contortrix
kígyó mérge).
11-62. ábra. A protein C és a protein S rendszer működése

A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája
291
A második lépésben az aktivált PC a kromogén
szubsztrátot hasítja, a felszabaduló p-nitro-anilint pedig
405 nm-en kinetikusan mérjük. A színintenzitás
egyenesen arányos a mintában jelen lévő PC mennyiségével.
Protein S (PS-) defektusok
A protein S 84 kDa molekulatömegű, májban termelődő,
K-vitamin-függő fehérje. A plazmában lévő PS
(protein S) kb. 65%-a a komplement C4b-kötőfehérjéhez
(C4b-BP) kapcsolódik. Ez nem tud kofaktoraktivitást
kifejteni. A maradék szabad PS képes az aktivált
protein C-hez (APC) kötődni, kifejteni kofaktor
hatását és ezáltal részt venni a VIIIa és Va faktor inaktiválásában.
A protein S-hiány thrombosis kialakulásának
a kockázatát nyolcszorosára növeli.
Az örökletes PS hiánynak három formája ismert.
• I-es típus. Kvantitatív hiány, amelynek eredményeként
csökkent mennyiségű, de strukturálisan
normál fehérje termelődik. Ennek következtében
mind a kötött, mind a szabad PS szintje
csökken, ennek eredménye a funkcionális PS
szint csökkenése.
• II-es típusú deficiencia. Kvalitatív elváltozás,
vagyis csökken a PS-aktivitás, amely normál
vagy közel normál össz- és szabad PS-szinttel
párosul.
• III-as típusú deficiencia. A szabad PS antigén és
a funkcionális PS mennyisége csökken, az
össz-PS-mennyiség normál.
A PS-hiány a thrombosis kockázatát nyolcszorosára
növeli.
A PS mérésére használt immunológiai módszerek
mind az aktív, mind az inaktív szabad PS-formát
mérik, ezért a funkcionális szabad PS-mennyiséget
fölémérik. Az össz-PS mérésekor az inkubációs időt
úgy kell megválasztanunk, hogy a PS-nek kellő ideje
legyen kilépni a C4b-BP komplexből és reagálni az
antitestekkel. ELISA-tesztek végzésekor magas hígításra
és a primer antitesttel hosszú inkubációs időre
van szükség. Kezdetben poliklonális antitestet használtak,
amely nem tudott különbséget tenni a kötött
és szabad forma között. Ezért a C4b-BP forma eltávolítására
polietilén-glikolos (PEG) kicsapást alkalmaztak.
A későbbiekben olyan antitestet fejlesztettek
ki, amely a PS C4b-BP-hez való kötőhelyét ismeri fel.
Ezek a szabad PS kicsapás nélküli, direkt mérését tették
lehetővé.
Az utóbbi időben széles körben elterjedt mérési
módszer a latexhez kötött immunológiai mérés. Az
antigén ilyen esetben a szabad PS. Az első lépésben a
tisztított latexhez kötött C4b-BP kalciumion jelenlétében
megköti a beteg plazmájában lévő szabad PS-t.
Második lépésben a szintén latexhez kötött PS ellen
termelt antitest reagál a C4b-BP-hez kötött szabad
PS-sel. Ennek eredményeként agglutináció jön létre,
és a turbiditásváltozás egyenesen arányos a plazmában
lévő szabad PS-sel.
A funkcionális tesztek a PS kofaktoraktivitásán
alapulnak. A plazmában lévő PS kofaktoraktivitásától
függően az aktivált PC antikoaguláns aktivitás fokozódik,
ami az alvadási idő (APTI) megnyúlásával jár
együtt. Amennyiben a plazmához Va faktort is adunk
(amely az aktivált PC szubsztrátja), kiküszöbölhetővé
válik az APC-rezisztens betegben mért téves eredmény.
Aktivált Protein C (APC-) rezisztencia
Az APC-rezisztenciát nem megfelelő antikoagulánsválaszként
határozhatjuk meg egy APTI alapú alvadási
tesztben, ha a plazmához in vitro aktivált protein
C-t adunk. Az APC kofaktorával, a PS-sel együtt a
VIIIa és Va faktort inaktiválja. Az Va faktort az Arg
506 aminosavpozícióban hasítja.
A fokozott alvadékonyságot okozó APC-rezisztencia
hátterében 95%-ban az V-ös faktor génjének
pontmutációja áll, amely az 506-os hasítási helyet
érinti, és Leiden-mutációként vált ismertté. A gén
1691-es pozíciójában a guanin adeninre cserélődik
(G1691A), aminek eredménye az 506-os pozícióban
létrejövő aminosavcsere, az arginin glutaminra cserélődik.
Ennek következménye, hogy az APC lassabban
inaktiválja az Va faktort. Magyarországon az APC-rezisztencia
prevalenciája 10% körüli. A Leiden-mutációra
heterozigóta egyéneknél a thrombosis kockázata
hétszeres, a homozigótáknál (gyakoriság 1:1000)
ez 50-80-szoros is lehet.
Az APC-rezisztencia mérésére használt tesztek
APTI alapúak. Az első generációs tesztekben párhuzamosan
két APTI-t mérünk, egyiket a beteg
plazmájához adott exogén APC, a másikat anélkül,
kalciumion jelenlétében. Az eredményt APC-ráta
formájában adjuk meg, amelyet a két alvadási időből

292 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
képezünk. Képezhetünk normalizált rátát is, amelynek
során a beteg APC-rátáját osztjuk a poolozott
(gyűjtött) normál plazmából mért APC-rátával. Ilyen
esetekben azonban a normál plazmákat ajánlott előzetesen
APC-rezisztenciára leszűrni, mivel egyetlen
Leiden-mutációt hordozó beteg mintája is jelentősen
befolyásolhatja az eredményeket. A teszt nem tekinthető
diagnosztikusnak Leiden mutáció szempontjából,
mivel az eredményeket jelentősen befolyásolja
a plazmában lévő VIII-as faktor, protein S-szint, valamint
az antifoszfolipid-antitestek jelenléte. A teszt
specificitása növelhető, ha a tesztplazmát V-ös faktor
hiányos plazmával hígítjuk (1:4). Az újabb generációs
tesztekben az APTI alvadási teszt nem kontakt aktivációval,
hanem specifikus kígyóméreggel vagy IXa
faktorral, amelyek a X-es faktort közvetlenül aktiválják.
Protrombin 20210A polimorfizmus
A protrombin gén 3’ untranslated (át nem íródó) régiójában
a 20210-es pozícióban a guanin adeninre
(G20210A) cserélődik ki, aminek eredményeként a
plazmában megnő a protrombinszint, növelve ezáltal
thrombosis kialakulásának a kockázatát. Heterozigótákban
a kockázat 2-4-szeres, homozigótákban akár
tízszeres kockázatot is jelenthet.
Kimutatására molekuláris genetikai módszert
használnak.
Antifoszfolipid-antitestek,
lupus-antikoaguláns kimutatása
Az antifoszfolipid-szindróma (APS) a thrombosisok
és a terhesség során bekövetkező komplikációk egyik
fontos oka. Szerzett thrombophilia, autoimmun betegség,
amelyben a tüneteket a plazmában megjelenő
foszfolipid- (PL-) ellenes antitestek okozzák. Ezek az
antitestek átmenetileg, klinikai tünetek nélkül is megjelenhetnek
gyógyszerhatás vagy vírusinfekció (elsősorban
gyermekkorban), bakteriális infekció, ill. parazitás
megbetegedés következményeként. Ebben az
esetben nem tekinthető betegségnek.
Az antifoszfolipid-antitesteket először szisztémás
lupus erythematosisban (SLE) szenvedő betegekben
írták le, akik álpozitív syphilisteszt-eredményt mutattak.
Kiderült, hogy ennek hátterében a plazmájukban
keringő autoantitestek állnak, amelyek képesek
a negatívan töltött foszfolipidekhez – így a kardiolipinhez
– kötődni. Innen ered az antikardiolipin-antitest
(ACA) megnevezés. Ezzel közel egy időben írták
le, hogy a SLE-s betegek in vitro megnyúlt alvadási
idővel rendelkeznek, ami azonban nem jár együtt
vérzékenységgel. A megnyúlt foszfolipid dependens
alvadási teszt eredményt (pl. APTI) normál plazma
hozzáadásával sem lehetett korrigálni, ami inhibitor
jelenlétére mutatott. Ezt az inhibitort nevezték el
lupus-antikoagulánsnak (LA). Paradox módon a lupus-antikoaguláns
jelenléte a SLE-betegekben nem
vérzékenységgel, hanem megnövekedett thrombosiskockázattal
jár együtt. A későbbiek során az antifoszfolipid-antitestekkel
kapcsolatban kiderült, hogy
az antigén tulajdonságot nem maga a foszfolipid
hordozza, hanem a hozzákötött fehérjék. Ezek közül
a legismertebb a β 2
-glikoprotein I, a protrombin, a
XI-es faktor, a protein C, a protein S és az annexin-V.
Ezek akkor exponálódnak, ha anionos PL-hez vagy
negatívan töltött felülethez kötődnek.
Az APS nemzetközileg elfogadott diagnosztikai
kritériumait a 11-28. táblázat mutatja be. A diagnózis
kimondásához legalább egy klinikai és egy laboratóriumi
kritériumnak teljesülnie kell. A laboratóriumi
eredmény akkor tekinthető diagnosztikusnak, ha legalább
két alkalommal 12 hetes különbséggel elvégezve
pozitív. Az LA-t az ISTH SSC LA/PL-függő antitestek
albizottsága iránymutatása szerint kell kimutatni, az
ACA-t pedig standardizált β 2
-glikoprotein I-dependens
ELISA-val.
Az LA kimutatásának laboratóriumi kritériumai:
• Foszfolipidfüggő alvadási teszt megnyúlása LA
jelenlétében.
• A megnyúlást okozó inhibitor kimutatása (keveréses
teszt).
• Az inhibitor PL-függőségének kimutatása:
- relatív korrekció emelt mennyiségű PL-lel;
- a hatás fokozódása a PL hígításával.
• Ha a diagnózis bizonytalan, egyéb coagulopathiák
kizárása (faktorhiány, faktorellenes gátlótest).
A kimutatás lehetőségei:
• A mérésekhez használt plazma (a beteg plazmája
és kontroll normális plazma) centrifugálása
kétszer 20 perc 2000xg-vel.

A thromboemboliás kórképek fehérjediagnosztikája
293
11-28. táblázat. Antifoszfolipid-szindróma diagnosztikai kritériumai
Klinikai kritériumok
thrombosis:
artériás, vénás vagy kis erek thrombosisa bármilyen szövetben
vagy szervben
terhességi komplikációk:
a morfológiai szempontból normális magzat megmagyarázhatatlan
halála a 10. héten vagy azt követően;
három vagy több megmagyarázhatatlan 10. hét előtti abortusz
egymás után;
34. hét előtti koraszülés súlyos praeeclampsia vagy placentaelégtelenség
következtében
Laboratóriumi kritériumok
IgG és/vagy IgM antikardiolipin-antitest
közepes vagy magas koncentrációban és/vagy
IgG és/vagy IgM anti b 2
-glikoprotein I közepes
vagy magas koncentrációban
és/vagy lupus-antikoaguláns
• LA-érzékeny alvadási idők: APTI, LA-érzékeny
APTI, hígított Russell viperaméreg-idő (RVMI).
A LA-pozitív betegminta LA-érzékeny alvadási
ideje szignifikánsan megnyúlt a kontrollhoz
képest. A PI ritkán nyúlik meg LA jelenlétében,
ennek oka a nagy mennyiségű LA jelenléte
lehet.
• A megnyúlást okozó inhibitor kimutatása keveréses
teszttel. APTI és LA-szenzitív APTI esetében
1:1 vagy 1:4 arányú hígításban végezzük a
mérést. LA jelenlétében a keveréses teszt nem
korrigál. A nem korrigálhatóság megítélésére
számíthatjuk ki a következőket:
1. APTI keverék – APTI kontroll: > 5 s.
2. APTI keverék – APTI kontroll/APTI beteg ×
100: > 15% (Rosner-index).
Hígított Russell viperaméreg-idő teszt esetében a számítás
a következő:
betegplazma kontrollplazma keverék RMVI/kontrollplazma
RMVI: > 1,2.
• A megerősítő tesztek két elven működhetnek:
- A PL csökkenésével a foszfolipidfüggő teszt alvadási
ideje megnyúlik ilyen pl. a RVMI hígított
PL-lel vagy az APTI hígított PL-lel.
- A PL koncentrációjának növelésével az alvadási
idő rövidül; ilyen a thrombocytaneutralizációs
teszt (PNP), a neutralizáció hexagonális
PL-lel és RVMI megerősítő tesztje.
• A PL-ellenes antitestek direkt kimutatására
ELISA technikát használnak.
- Antikardiolipin-antitest (ACA) esetében az
IgG-, IgM-, IgA-nak közepes vagy magas titerben
kell jelen lennie;
- β 2
-glikoprotein I-gyel reagáló antitest kimutatás
esetén az IgG és az IgM.
Irodalom
Debreczeni L., Kovács L. G. (szerk.): Gyakorlati laboratóriumi
medicina. 2. kiadás, Literatura Medica Kiadó,
Budapest, 2008.
Kitchen, S., Olson, J. D., Preston, F. E. (eds): Quality in
Laboratory Hemostasis and Thrombosis, Wiley- Blackwell
Publishing Ltd, Oxford, 2009.
O’Shaughnessy, D., Makris, M., Lillicarp, D. (eds):
Practical Hemostasis and Thrombosis. Oxford, Blackwell
Publishing Ltd, 2005.
Smith, Stephanie A.: The cell-based model of coagulation.
J. Vet. Emerg. Crit. Care 19(1):3–1, 2009.

294 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A testnedvek
fehérje-összetételének
diagnosztikus kémlelése
A könny vizsgálata
Ludány Andrea
A könny mint vizsgálati objektum viszonylag ismeretlen
a laboratóriumi diagnosztikában annak ellenére,
hogy nem invazív módon nyerhető. Egyre több
megfigyelés és vizsgálati eredmény utal arra, hogy
összetételének analízise nem kizárólag a szemészeti
betegségek diagnosztikájában játszhat fontos szerepet.
Információt nyújthat az egész szervezet állapotáról.
Ezért a könnyfehérjék ismeretének mind fiziológiai,
mind patofiziológiai szempontból jelentősége
van.
A könny fiziológiai szerepe és összetétele
A könny a szem külső felszínén filmszerű réteget képez,
ezáltal védelmet biztosít a cornea és a conjunctiva
epithelsejtjei számára mind a külső fizikai kémiai,
mind a kórokozók hatásaival szemben. Összetett
viszkózus folyadékrendszer, amely három rétegből
áll: lipidekből, fehérjékből és elektrolitokból, valamint
mucinszerű anyagokból tevődik össze.
A lipidek a külső fázist, a fehérjék és az elektrolitok
a vízoldékony középső fázist, a „ragadós” szialomucin
komplexek a könnyfilm belső rétegét képezik. A
könny jelentős mucintartalmát, amely glikoproteinekből
és glükóz-aminoglikánokból áll, az emlősökben
a cornea és a conjunctiva kehelysejtjei termelik.
Mind a cornea és conjunctiva epithelsejtjei által termelt
transzmembrán forma, mind a glandula lacrimalis
által szekretált szekretoros mucin jelenléte
szükséges a könnyfilm stabilitásához. Az anorganikus
sókat és glikoproteineket tartalmazó vizes fázist főleg
a könnymirigy (glandula lacrimalis) és a conjunctiva
felső áthajlásában elhelyezkedő járulékos könnymirigyek
állítják elő. A Meibom-mirigy és a szemhéjszéli
faggyúmirigyek (Zeiss- és Moll-mirigyek) a lipideket
szekretálják (11-63. ábra).
A könny fiziológiai szerepe
A könnyfilm nedvesen tartja az avascularis corneát,
így biztosítva a gázcserét a levegő és az epithelsejtek
között. Ha a szem felszínére idegentest vagy
valamilyen vegyi szennyeződés kerül, a reflexesen
beinduló könnyezés kimossa, felhígítja a károsító
idegen anyagokat. A fertőzésektől antibakteriális és
antivirális hatású anyagai (lizozim, laktoferrin, b-lizin,
immunglobulinok: szekretoros IgA) védik meg.
Fontos feladata az epithelsejtek tápanyag- és vitaminellátása,
valamint az anyagcseretermékek eltávolítása.
A könny ezen kívül nélkülözhetetlen metabolitokat is
tartalmaz, mint pl. retinolt, amely szerepet játszik a
cornea transzparenciájának a megőrzésében. Minden
szemhéjzárásnál („pislogásnál”) újraképződik.
Vizsgálataink szempontjából kiemelendő a könny
fehérjetartalma; előállítását nagyrészt a könnymirigy
epithelsejtjei és a sejt közötti térbe vándorolt plazmasejtek
biztosítják. Irodalmi adatok szerint a könnyfehérje
összetételében az emlősfajoknál nagyfokú konzervativizmus
figyelhető meg.
A könny fehérjéi
11-63. ábra. A szem és a könnytermelő szövetek sematikus
ábrázolása. A könnyfilm három rétege
Gachon és munkatársai 1979-ben elektroforetikus
analízissel kb. 60 fehérjét detektáltak és azonosítottak
a könnyben, ezek közül kb. 20 fehérje származik
a könnymirigyből. Némi egyszerűsítést alkalmazva a
könnyproteineket 3 csoportba osztották:
• Fehérjék, amelyek jelen vannak a szérumban és
a könnyben is.

A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése
295
• Fehérjék, amelyek csak a könnyben vannak
jelen, a szérumban nem detektálhatók.
• Proteinek, amelyek a könnyben is és az epithelsejtben
is megtalálhatók.
A 2. csoport legjelentősebb képviselője a laktoferrin,
a lizozim és a könnyspecifikus prealbumin (TSPA,
tearspecific prealbumin). Azok a fehérjék, amelyek a
szérumban is és a könnyben is jelen vannak, a conjunctiva
kapillárisainak „szivárgása” során juthatnak
a könnybe. Megfigyelték, hogy a conjunctiva hyperaemiában
szenvedők könnyében nagyobb az albumin
koncentráció, ami jelentős csökkenést mutat kalcium-dobezilát
adásakor. (Ez a gyógyszer csökkenti
a vasopermeabilitast). Azt a következtetést vonták le,
hogy a szérumproteinek a kötőhártya-kapillárisok
„szivárgása” során keverednek a könnyhöz.
Nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás
(HPLC) és tömegspektrometriás (MS) vizsgálatokat
alkalmazva a kutatók 2006-ban már 491 proteint
azonosítottak a könnyben. A 491 fehérje közül 200
intracelluláris, ezek az epithelsejtek pusztulása során
kerülnek a könnybe, 68 extracelluláris, 24 membránfehérje
és 199 nem osztályozható ilyen módon.
A könnymirigy által termelt fehérjék: lizozim, laktoferrin,
EGF, lipokalin és IgA
A lizozimet Fleming azonosította először a könnyben,
1922-ben. Ez a lizoszómákban termelődő glikolitikus
enzim a könnyben fordul elő legnagyobb
arányban. Antibakteriális hatású, normális szintje
0,6-2,6 mg/ml.
A laktoferrin szintén antibakteriális hatású, a
könnymirigy acinussejtei termelik. Elsőként 1966-
ban detektálták a könnyben. ELISA-val vizsgálták a
könny laktoferrintartalmát: a total protein 25%-át teszi
ki, átlagos koncentrációja 2 mg/ml. Reverzibilisen
képes kötni két vasatomot, ez magyarázza antibakteriális
hatását. Bakteriosztatikus hatása mellett a klaszszikus
komplementrendszer erős inhibitora. Szintje
jelentősen csökkenhet egyes betegségekben, főleg
olyanokban, amelyekhez száraz szem szindróma is
társul. Ilyen betegség például a hepatitis C fertőzés.
Abe és munkatársai 42 hepatitis C-ben szenvedő beteget
vizsgáltak, és azt találták, hogy mind a könny
volumene, mind a laktoferrin szintje csökken a szisztémás
betegségben [1]. A gyulladással járó szembetegségek
(pl. conjunctivitisek) szintén csökkent laktoferrinszinttel
járnak. A humán könny lizozim- és
laktoferrin koncentrációja jól tükrözi a könnymirigy
funkcióját.
A könnyben jelentős mennyiségben találhatunk
még EGF (epidermal növekedési faktor) fehérjét is,
amely a cornea épségére vigyáz, az apró sérüléseket
állítja helyre. Sjögren-szindrómában az EGF szintje
jelentős csökkenést mutat. Szintjének pontos mérésére
ELISA módszert dolgoztak ki, koncentrációját 1,6
ng/ml-nek találták.
A lipokalin olyan savas protein, amely bőséges
mennyiségben van jelen a könnyben. 1956-ban detektálták
és azonosították először. Segíti a magas
viszkozitás fenntartását, a könnyfilm felületi feszültségének
csökkentését, ezáltal hozzájárul a könnyfilm
stabilitásának megőrzéséhez. A lipokalin a fő lipidkötő
fehérje a könnyben. Emellett rendelkezik antibakteriális
és antivirális hatással is, hiszen endonukleáz
aktivitása és cisztein proteáz gátló hatása van.
A szekretoros IgA a legjelentősebb mennyiségben
jelen lévő immunglobulin a könnyben, első védelmi
vonalként szerepel.
Szérumproteinek: albumin, transzferrin, IgG és IgM
Az albumin azonos a szérumban lévő albuminnal.
A humán könny minor komponense, de bármilyen
conjunctiva stimulációra nő a mennyisége a már említett
fokozott éráteresztés miatt.
A transzferrin hatása hasonló a laktoferrinéhez,
csak kisebb koncentrációban van jelen. A könnybe
a többi szérumproteinhez hasonlóan passzív transzport
útján kerül. Gyulladás esetén nagyobb mennyiségben
található IgE, IgG és IgM.
Egyéb proteinek: akvaporin-5 és gyulladásos fehérjék
Az akvaporin-5 olyan membránprotein, amely nagyobb
mennyiségben expresszálódik a könny- és a
nyálmirigyekben. Normális esetben az acinaris és a
ductalis sejtek apicalis membránjában mutatható ki.
Sjögren-szindrómában az akvaporin-5 megoszlása
változik meg: a citoplazmában marad, és nem jut ki
az apicalis membránba.
Száraz szem szindrómában a gyulladásos markerek
emelkedést mutatnak a könnyben: nagyobb koncentrációban
van jelen az IL-1α és IL-1-β, az IL-6, az IL-
8, a TGF-β 1
és a TNF-α. A csökkent könnytermelés
miatt kialakuló apró sérülések a conjunctiván gyul-

296 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
ladásos környezetet teremtenek, megnő a különböző
citokinek mennyisége, a védő EGF fehérje mennyisége
viszont csökken.
További fehérjéket is identifikáltak kis koncentrációkban
a könnyben. Ilyen többek között: az amiláz, a
peroxidáz, a plazminogénaktivátor, az alvadási faktor
XIII, a prolaktin, a TGF-b, az endotelin-1, a retinol.
Természetesen ez a felsorolás korántsem teljes így
sem. A humán könnyben még jó néhány fehérje vár
azonosításra, amelyek funkciója egyelőre ismeretlen.
Kiemelendő, hogy a könny nagy total protein tartalma
mellett egyre nagyobb lehetőség nyílik érzékeny
analitikai eljárásokkal újabb fehérjék kimutatására és
a proteomika jövőbeni alkalmazására.
A könnyfehérjék vizsgálata – klinikai
diagnosztikai lehetőségek
Szemészeti vonatkozások – a száraz szem
szindróma
A szemgolyót borító folyadék a szemhéjak sima mozgását
„kenőanyagként” is segíti. Így a könnytermelés
csökkenése, a könny összetételének megváltozása révén
a könnyfilm instabillá válhat, felszakadhat, bizonyos
esetekben teljesen hiányozhat. Ilyenkor a cornea
és a conjunctiva kiszáradhat, kiszáradás okozta szaruhártya-
és kötőhártya-gyulladás, keratoconjunctivitis
sicca alakulhat ki. A keratoconjunctivitis sicca
enyhébb és súlyosabb formái igen gyakoriak. Az etiológiája
igen összetett.
Az 1996-ban született új felosztás (Report of the
National Eye Institute/Industry Workshop on Clinical
Trials in Dry Eyes) a különböző száraz szem formákat
két fő csoportba sorolja:
• A csökkent könnytermelésen, a szem kisebb
könnytartalmán alapuló száraz szem (tear-deficient
dry eye, TDDE).
• A fokozott könnyvesztésen, a könnyfilm instabillá
válásán vagy kifejezett párolgáson alapuló
száraz szem (evaporative dry eye, EDE).
Csökkent könnytermelésen alapuló száraz szem
(TDDE)
Erre a csökkent könnytermelés és az alacsonyabb
könnytartam jellemző, és az ebből adódó tünetek:
égő, viszkető, szúró érzés. A könnydeficiens száraz
szem csoportját további két alcsoportra lehet osztani:
• Nem Sjögren-szindrómás, de csökkent könnytermelésen
alapuló száraz szem (Non-Sjögren
Tear Deficient Dry Eye, NSTD).
• Sjögren-szindrómához társuló, csökkent könnytermelésen
alapuló száraz szem (Sjögren
Syndrome Tear Deficient Dry Eye, SSTD).
A keratoconjunctivitis sicca gyakran szisztémás betegség,
azaz a Sjögren-szindróma részjelensége lehet. A
szemszáradás xerostomiával, ízületi panaszok nélkül
(primer) vagy valamilyen szisztémás autoimmun betegség
(SLE, rheumatoid arthritis, dermatomyositis
stb.) talaján alakul ki (szekunder). A primer Sjögren-szindrómát
az egyéb kötőszöveti betegségektől a
könny fehérjetartalmának változásával lehet megkülönböztetni.
Az albumin:laktoferrin 2:1-nél nagyobb
aránya sokkal gyakoribb primer Sjögren-szindrómásoknál.
Az életkor előrehaladtával kismértékben csökken
a könnymirigy által termelt fehérjék koncentrációja.
Ezen kívül a nem is befolyásolja a könnymirigy funkcióját.
A humán könny-peroxidáz aktivitása ugyanis
különbözik férfiakban és nőkben. A menopauza során
– az ösztrogénszint változásával – nőkben szignifikánsan
csökken a peroxidázaktivitás, így ez magyarázhatja
a változókorban lévő nőknél a száraz szem
szindróma gyakori előfordulását.
Fokozott könnyvesztésen, a könnyfilm instabillá
válásán vagy kifejezett párolgáson alapuló száraz
szem (EDE)
Normális könnytermelés mellett is száradhat a
szem felszíne. Megváltozhat a könny összetétele, a
könny nem nedvesíti a felszínt, „lepereg”.
Diabeteses betegeknél megfigyelték, hogy szignifikánsan
gyakoribb a száraz szem szindróma előfordulása.
A szemhéjak és a pislogás rendellenességei,
amikor nem képződik időről időre újra a könnyfilm,
nem záródik a szemrés, fokozott párolgás van jelen.
A cornea felszínének makroszkópos vagy mikroszkópos
elváltozásai, felületi egyenetlenségei és szintkülönbségek
miatt instabillá válik a könnyfilm, vagy ki
sem alakul.
Kontaktlencse jelenléte miatt is kialakulnak a
szemszáradás tünetei, ugyanis kontaktlencsét viselő

A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése
297
szemen a könnyfilm elvékonyodik, könnyebben felszakad,
közvetlen epithelkárosodás is létrejöhet. Az is
kiderült, hogy a lágy, hidrofil kontaktlencsét viselőknél
a lencsén talált fehérjedepozitumok lizozimdimerek,
ill. polimerek, melyek a normális könnyben ilyen
formában nincsenek jelen.
A könnyfehérjék vizsgálata szisztémás
betegségekben
Egyre több közlemény utal arra, hogy a könnyfehérjék
vizsgálatát nem csak „lokális”, szemészeti, hanem
az egész szervezetet érő szisztémás betegségekben is
hasznosítani lehet. A mintavétel nem invazív, fájdalommentes,
és így könnyedén szerezhetünk információkat
a szervezet állapotáról.
Diabetes mellitus
Leginkább kiemelt célcsoportja az ezzel kapcsolatos
kutatásoknak a diabetes mellitus. Úgy tűnik, a
diabeteses betegek könnyfehérje-összetételében más
jellegű megoszlási mintázatok vannak, mint azoknál
a cukorbetegeknél, akiket száraz szem tünetekkel
kezeltek. Ez az új fehérjemintázat-beli változás
(amely specifikusan a 30-50 kDa molekulatömegű
tartományban detektálható, és egészségeseknél nem
észlelhető) további vizsgálatok tárgyát képezheti.
A cukorbetegség időtartama és ezen fehérjemintázat-beli
változások között szoros összefüggést mutattak
ki, vagyis minél hosszabb ideje tart a betegség,
annál több fehérjeexpressziós változás figyelhető meg
a könnyben. További vizsgálatok szükségesek annak
tisztázására, hogy ezek az eltérések összefüggnek-e a
diabeteses retinopathia kialakulásával.
Az 1-es típusú diabetesben szenvedő betegek többsége
határozottan mutatja a kötőhártya-betegségre
utaló jeleket annak ellenére, hogy náluk a könnyelválasztás
funkcionális próbái, mint pl. a basalis könnyáramlás
(basal tear flow) és a szemészeti diagnosztikában
használt könnyfilm-stabilitási próba (tear
brake-up time) a normális tartományba esnek.
Dohányzás
A dohányzás - mint számos betegség ismert rizikófaktora
– is okozhat száraz szem szindrómát. A
könny elektroforetikus fehérjemintázata dohányzóknál
megváltozik, és ezek a proteineltérések a száraz
szem tüneteinek súlyosságával párhuzamosan nőnek.
Krónikus hepatitis C
E betegekben is kimutatták, hogy mind a könny
mennyisége, mind a könnymirigy által termelt fehérjék
(laktoferrin) koncentrációja csökken. Ez a glandula
lacrimalis díszfunkciójára utal e betegségcsoportban,
ami száraz szem tünetként jelenik meg.
Daganatos betegségek
A könnyfehérjék vizsgálata új fordulatot hozhat
néhány daganatos betegség vonatkozásában is. Mai
irodalmi adatok szerint daganatos megbetegedésekben
nem csak a szérum, hanem a könnyfehérjék
összetétele is megváltozik. A humán könny térképezése
során felfedezett lakriglobin nagy szekvenciaazonosságot
mutat a mellrákban „túlexpresszálódó”
mammaglobinnal. Lakriglobin jelenlétét detektálták
mell-, prostata-, tüdő-, ovarium- és vastagbél-daganatos
betegek nagy százalékban. További vizsgálatok
szükségesek a lakriglobin könnybeli szekréciója és a
daganatos megbetegedések megjelenése közötti öszszefüggések
kiderítéséhez.
A könny fehérjéinek változása 2-es típusú diabetes
mellitusban
Világszerte több mint 100 millió ember szenved
diabetes mellitusban és ennek a szisztémás anyagcsere-betegségnek
a szövődményeiben. Számos szemészeti
komplikáció felmerülhet, amelyek akár vaksághoz
is vezethetnek. A cataracta kialakulásának
kockázata 2-4-szer nagyobb az átlagpopulációhoz
képest, a száraz szem szindróma súlyossága pedig
korrelációt mutat a diabeteses retinopathia fennállásával
(11-29. táblázat).
Minél hosszabb ideje tart a diabetes, annál jelentősebbek
a könnyben lévő változások. Elektroforézissel
vizsgálva a diabetes mellitusban szenvedők könnyfehérje-mintázatát,
jelentős különbségek vannak az
egészségesekéhez képest. A fő proteinek: a lizozim,
a laktoferrin, a lipokalin és az albumin változatlan
képet mutatnak, de a proteincsúcsok számában emelkedés
figyelhető meg. A legjelentősebb változások a
30-50 kDa közötti tartományban vannak. A feltételezések
szerint ezek az „új” proteinek valójában az
eredeti fehérjék glikozilált változatai, és felelősek a
szemészeti komplikációk kialakulásáért a diabeteses
betegek körében.
Klinikai vizsgálatok igazolták, hogy a diabetesben
szenvedők Schirmer-teszttel nyert eredményei „rosz-

298 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-29. táblázat. A cukorbetegség szemészeti szövődményei
Szemgolyón kívül jelentkező szövődmények
• szemhéjszéli gyulladás (blepharitis), xanthelasma
• száraz szem szindróma
• kötőhártyai értágulatok
• orbitalis mucormycosis
• a külső szemmozgató izmok paresise [n. abducens
(VI.), n. oculomotorius (III.)]
• látóideg-neuropathia
A szem belsejében jelentkező szövődmények
• a corneában Descemet-membrán-redők
• az elülső szemcsarnok melaninpigmentációja
• glaucoma
• rubeosis iridis
• az akkomodáció (közelre tekintési alkalmazkodóképesség)
romlása
• fénytörésváltozások (átmeneti rövidlátás, túllátás)
• időskori szürkehályog korai jelentkezése, diabeteses
hópehely-cataracta
• retinopathia diabetica
szabbak”, mint az egészséges önkéntesekéi, azaz a cukorbetegek
körében sokkal gyakoribb a száraz szem
kialakulása, ami paradox módon néha könnyezéssel
jár (ennek a könnynek azonban teljesen más az öszszetétele,
mint a normálisénak) A reflexkönny menynyisége
is szignifikánsan kevesebb a diabeteses csoportban,
ami magyarázza a cornea és a conjunctiva
nagyobb érzékenységét, fogékonyságát a különböző
betegségekre.
Ajánlott módszertani megközelítések
a könny vizsgálatakor
Mintavétel, mintakezelés
Könnyminta vételére kétféle módszer alkalmazható:
• Reflexkönnyet stimulálva (pl. szagingerrel)
nagyobb mennyiségű, „hígabb” minta nyerésére
van lehetőség. A mintavételhez megfelelően
kialakított, hajlékony, kereskedelmi forgalomban
kapható kapillárisvégű Eppendorf-pipetták
alkalmasak. A könnyet a conjunctiva alsó fornixából,
annak érintése nélkül vesszük. Mérhető
mintavolumen esetén (a kapilláris „hitelesítésével”)
a fehérjekoncentráció az eredeti könnymintában
mg/ml (g/l) értékben is kifejezhető.
• Másik módszerként a szemészeti gyakorlatban
ismert és diagnosztikai célra is alkalmazott
Schirmer-teszt szolgálhat. A teszt a megnedvesedő
szűrőpapír kockák számából enged a
könnymennyiségre következtetni. Hátránya,
hogy ez a mintavétel pontos volumenadatok
meghatározására nem alkalmas. Előnye gyorsasága
és egyszerűsége, hiszen a tesztcsíkot a beteg
magának is felhelyezheti. Mindössze néhány
percet vesz igénybe a mintavétel. További előnye,
hogy az alapszekréciót képes mutatni stimuláció
nélkül. Bizonyos esetekben standardizált
gyűjtési időre is szükség lehet (11-64. ábra).
A könnymintákat pufferoldatban hígítottuk, a felhasználásig
pedig -70 °C-on tároltuk. (Pufferoldat:
150 mM TRIS-HCl, pH 6,8; 1 mM EDTA; 4 mM
EGTA; 0,2 mM PMSF.)
Mennyiségi mérések - ajánlott fehérjemeghatározások
A könny nagy fehérjetartalmú szekrétum: reflexes
mintákban 2,9-8,6 mg/ml, a basalis szekréciónál
pedig még nagyobb a fehérjekoncentráció. A fehérjemeghatározáshoz
az eredeti könny nagy fehérje
koncentrációja miatt a Benedikt-módszer (fehérjemeghatározás
mikrobiurettel) és a hígított mintákhoz
a Bradford-módszer (festékkötésen alapuló eljárás) a
megfelelő. A Bradford-módszer a Schirmer-tesztes
eljárásnál ajánlott, nagyságrenddel nagyobb érzékenysége
miatt. Itt ugyanis a könny hígításával kell
számolni a tesztpapírból való mintaextrakció miatt.
A Schirmer-tesztben a könnymintákat a mintavétel
során olyan „feltáró” oldattal kezeljük, amely a további
analízisekig ideális médiumként szolgál: azaz puf-
Filter
paper
11-64. ábra. Schirmer-teszt

A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése
299
ferolt, proteolízist gátló rendszer, megelőzi a fehérjék
esetleges autolízisét, és a hígulással a könnyminta
nagy mucintartalmából eredő kezelési nehézségeket
is áthidalja.
A mért értékek vonatkoztatásai, értékelései.
Automatizált sorozatméréseknél (pl. célzott specifikus
fehérjevizsgálatok) a kapott vizsgálati eredményeket
minden esetben az összfehérje-koncentrációra
vonatkoztatjuk, tehát a mért specifikus fehérje pg/ml
értéket az összfehérje mg/ml koncentráció egységére
számoljuk. Így kerülhetjük el az abból adódó problémát,
hogy nem ismerjük a Schirmer-teszttel vett
könnyminták eredeti fehérjekoncentráció-adatait.
A minták fehérje-összetétele – elválasztási és detektálási
technikák
SDS elektroforézis lapgélen – kombinált ezüstözéssel
A donor (egészséges) könnyminták fehérje-összetételét
egydimenziós SDS poliakrilamid-lapgél elektroforézissel
standard körülmények között (12,5%-os
gélkoncentráció) vizsgálva azt találtuk, hogy a humán
könny összetétele kombinált ezüstözési technikával
jól detektálható. A fehérjék között különböző molekulatömegű
fehérjék szerepelnek, ami az elektroforetogramokon
jellegzetes mintázatot mutat (11-65.
ábra), (lásd 4. fejezet).
Western blot eljárás – Gallyas-féle és ECL-előhívással
Az irodalomban közölt könnyfehérjék (lizozim,
laktoferrin, IgA, szérumalbumin, lipokalin, lipofilin)
közül immunoblotting eljárással alkalmunk volt magunknak
is a lizozimet (14 kDa) és a laktoferrint (75
kDa) azonosítani. Western blottal mind a peroxidáz
alapú immundetektálást a Gallyas-féle ezüstözéssel,
mind az ECL-előhívással sikerült a könnymintákra
adaptálnunk (ECL: Enhanced Chemiluminescence:
erősített kemilumineszcenciás detektálás). Míg a
Gallyas-féle ezüstözés mennyiségi megítélésre ismerten
kevésbé alkalmas, addig az ECL-detektálás KO-
DAK Image Station 2000R készülékünk segítségével
mennyiségi meghatározást is lehetővé tesz (lásd 4. fejezet).
Kétdimenziós nagy feloldású elektroforézis (O’Farrell)
– fehérje térkép
Az O’Farrell-féle fehérjeszeparálás előzetes dúsítást
igényel az analízisekhez. A fehérjék detektálása
11-66. ábra. Immunoblotting. Humán könny lizozim
[Ni-DAB + ezüst (Gallyas-féle) előhívással; 1-7: egyedi
könnyminták; 3-3 mg protein/pászta]
11-65. ábra. Könnyminták 12,5% SDS lapgél összehasonlító
elektroforetogramja kombinált ezüstözéssel (1-6-ig
egyedi könnyminták, pásztánként 1,3 µg proteinnel, Willoughby-féle
ezüstözéssel)
11-67. ábra. Immunoblotting. Humán könny laktoferrin;
ECL-detektálás (ECL: enhanced chemiluminescence)
(egyedi könnyminták: 3-3 µg protein/pászta, gyűjtött minta:
8 µg)

300 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Marshall szerint módosított ultraszenzitív ezüstözési
eljárással végezhető. Ily módon 75 µg könnyfehérjéből
sikerül elegendő intenzitású detektálást elérnünk
(11-68. ábra).(lásd 4. fejezet).
Könnyfehérjék azonosítása kiegészítő MALDI TOF
MS technikával
Értékes további információk szerezhetők az említett
szeparálási és detektálási eljárások tömegspektrometriás
kombinációival: különösen azért, mert ez
már a proteomika megvalósítását eredményezheti
olyan nem szokványos vizsgálati anyagoknál, mint a
könny (11-69. ábra).
Tömegspektrometriával laktoferrint, szérumalbumint,
b-aktint, lipokalint (más néven orozomukoidot),
lizozimet és immunglobulin-fragmentumokat
sikerült magunknak is egészséges donorok mintáiból
azonosítani. További frakciók azonosítása, valamint
az analízisek kiterjesztése a betegmintákra vizsgálataink
jövőbeni irányát jelenti.
[4] Bjerrum, K. B.: The ratio of albumin to lactoferrin in
tear fluid as diagnostic tool in primary Sjögren’s syndrome.
Acta Ophthalmol. Scand. 75:507-511, 1997.
[5] Bradford, M. M.: A rapid and sensitive method for
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.
72:248-254, 1976.
[6] Dékány Helga: Fehérje elválasztási és detektálási
módszerek alkalmazása szemészeti vizsgálati anyagokon
– különös tekintettel a könnyre. Diplomamunka
PTE/ÁOK 2009.
[7] Evans, V., Vockler, C., Friedlander, M et al.: Lacryglobin
in human tears, a potential marker for cancer.
Clin. Experiment. Ophthalmol. 29:161-163, 2001.
[8] Grus, F. H., Sabuncuo, P., Augustin, A. et al.: Effect
of smoking in tear proteins. Graefes Arch. Clin. Exp.
Ophthalmol. 240:889-892, 2002.
[9] Grus, F. H., Sabuncuo, P., Dick, H. B. et al.: Changes
in the tear proteins of diabetic patients. BMC Ophthalmol.
2:4, 2002.
[10] Grus, F. H., Joachim, Stephanie C., Pfeiffer, N.:
Proteomics in ocular fluids. Proteomics Clin. Appl.
1:876-888, 2007.
Irodalom
[1] Abe, T., Nakajima, A.., Matsunaga, M. et al.: Decreased
tear lactoferrin concentration in patients with chronic
hepatitis C. Br. J. Ophthalmol. 83:684-687, 1999.
[2] Argueso, P., Gipson, I. K.:Epithelial mucins of the
ocular surface: structure, biosynthesis and function.
Exp. Eye Res. 73:281-289, 2001.
[3] Ballow, M., Donshik, P. C., Rapacz, P. et al.: Tear
Lactoferrin levels in patients with external inflammatory
ocular diseases. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 28:543-
545, 1987.
11-68. ábra. Humán könny kétdimenziós fehérjetérképe
nagy feloldású O’Farrell-technikával
(12,5%-os gélkoncentráció; pH 3-10; Marshall szerinti
ezüstözés; a proteinmennyiség 75 µg)
11-69. ábra. Könnyfehérjék elektroforetikus fehérjefrakcióinak
azonosítása MS-technikával
1. Laktoferrin (1BKA) 77 572 Da
2. Szérumalbumin (AAA98798) 71 177 Da
3. Ismeretlen
4. b-aktin (Q53G76) 42 036 Da
5. pHL E1F1 (154810) 15 088 Da
könny (AAM94338) 15 088 Da
Ig könnyűlánc Fab fragmentum a5b7 lánc a (1AD0A)
23431 Da
Ig k lánc V-III régió (K3HUGO) 11937 Da
6. Könny-lipokalin (LCHUL) 19 409 Da
7. Lizozim (134L) 15 120 Da

A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése
301
[11] Hartmann Ágnes: Módszerek a könnyfehérjék öszszehasonlító
mikroanalízisére. Diplomamunka PTE/
ÁOK 2007.
[12] Klaeger, A.J., Cevallos, V., Sherman, M. D. et al.:
Clinical application of homogenous colorimetric assay
for tear lysozyme. Ocul. Immunol. Inflamm. 7:7-15,
1999.
[13] Marcozzi, G., Liberati, V., Madia, F. et al.: Age- and
gender-related differences in human lacrimal fluid peroxidase
activity. Ophthalmologica 217:294-297, 2003.
[14] Marshall, T.: Detection of protein in polyacrylamide
gels using an improved silver stain. Anal Biochem.
1984; 136: 340-346.
[15] Németh J.: A cukorbetegség szemészeti szövődményei.
Családorvosi fórum 7: 14-17, 2005.
[16] Redl, B.: Human tear lipocalin. Biochim. Byophys.
Acta 1482:241-248, 2000.
[17] Scott, G., Mowrey-McKee, M.: Dimerization of
tear lysozyme on hydrophilic contact lens polymers.
Curr. Eye Res. 15:461-466, 1996.
[18] de Souza, G., Godoy, A., Lyris, M. F. et al.: Identification
of 491 proteins in the tear fluid proteome reveals
a large number of proteases and protease inhibitors. Genome
Biology 7:R72, 2006.
[19] Xu Shengyuan, Venge Per: Lipocalins as biochemical
markers of disease. Biochimica et Biophysica Acta
1482:298-307, 2000.
A nyál fehérjéinek vizsgálata
Kőszegi Tamás
A nyál biológiai funkciói
Régóta ismert, hogy a nyálmirigyek szekrétumából
és a szájüregben lévő sejtes elemekből kialakuló
nyál fontos és sokrétű szerepet tölt be a szájüreg és
az emésztőrendszer épségének fenntartásában. A legismertebbek
ezek közül az antimikrobiális, sebgyógyulást
segítő vagy a fogszuvasodást, fogkőképződést
gátló hatások. A nyál emésztőenzim-tartalmánál fogva
részt vesz a szénhidrátok és a zsírok lebontásában
is. Ezen kívül mucinban gazdag fehérjéi segítségével
védőbevonatot képez a fogakon és a nyálkahártyákon,
„kenőanyagként” működve. A nyál pH-ja enyhén lúgos,
ami a savtermelő bakteriális tevékenységet ellensúlyozza,
ezzel is védve a fogzománc épségét. A nyál
képes a fogzománc mikrosérüléseivel kölcsönhatásba
lépve elősegíteni azok regenerációját. Az étkezés
során a kellően alapos rágás nem csak az emésztést
könnyíti meg, de az étel bevonásával védi a nyelőcsövet
és a gyomornyálkahártyát az irritáló hatásoktól.
Mindezeket a hatásokat a nyál elsősorban speciális
fehérje-összetételének köszönhetően fejti ki.
A kedvező hatások mellett a nyálfehérjék kétélű kardként
is viselkedhetnek: egy részük képes a cariogen
baktériumok adhézióját elősegíteni vagy a savtermelő
bakteriális tevékenységet fokozni. A nyál fehérje-öszszetétele
az egyénre jellemző, nukleotidpolimorfizmusoknak
köszönhetően bizonyos fehérjék expreszsziója
és funkciója is variabilitást mutat. Legújabban a
nyálfehérjék spektrumának változását biológiai markerként
kívánják hasznosítani pl. a szájüregi daganatok
korai felismerésében.
A nyál fehérje-összetétele
Egydimenziós gélelektroforézissel kb. 30 fehérjecsoportot
lehet elkülöníteni, a kétdimenziós technikával
100-nál is többet. A legmodernebb eljárások (szeparációt
követő tömegspektrometria) alapján legalább
1000 egyedi nyálfehérjét különítettek el, beleértve a
fehérjedegradációs termékeket is. A fehérjespektrum
körülbelül fele a vérplazmában is kimutatható.
A következőkben néhány jellegzetes nyálfehérjét mutatunk
be részletesebben. A molekulatömeg szerinti
csoportosításban a kisebbtől a nagyobb tömegig haladva
a következő fő fehérjecsoportokat különböztetjük
meg:
hisztatinok→sztatherinek→lizozim→prolin-gazdag
fehérjék→karboanhidráz→amilázok→peroxidázok→laktoferrin→mucin
2→szekretoros IgA→mucin 1.
A főbb fehérjecsaládokat a 11-30. táblázaton összesítettük.
A fogzománc védelmében és az antimikrobiális
hatásban részt vevő fehérjék egy része kedvezőtlen
biológiai funkciót is betölthet abban az esetben, ha
a fogak felszínére kötődik. Itt segítik a baktériumok
megtapadását és a savas anyagcseretermékek képződését.
A fehérjék jelentős hányada izoformákban van jelen,
pl. a nyál eredetű amiláznak 7 izoenzime ismert.
Elsősorban újszülöttekben van jelentősége a nyállipáznak,
ez erősen hidrofób protein, és a tejzsír lebontásában
játszik szerepet. A nyál proteázokat is tartalmaz,
melyek a saját fehérjéket is emésztik, elősegítve
a természetes eliminációt.

302 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A nyálfehérjék vizsgálati módszerei
Mintavétel
A helyes mintavétel a nyál esetében elsőrendű fontosságú,
hiszen a szájüregben rengeteg zavaró tényezővel
kell számolni. Alapvetően a nyálmintát a reggeli
órákban, éhgyomorra kell venni, 2-3 desztillált vizes
öblítés után. Vehetünk nyugalmi és stimuláció (pl.
citrommal) utáni szekrétumot, a kétféle minta öszszetétele
némileg különbözik. A nyálmintát a fehérjedegradáció
megakadályozása érdekében azonnal
érdemes olvadó jégre tenni és/vagy proteázinhibitorokat
adni hozzá. A sejtes elemektől és az egyéb korpuszkuláris
szennyeződéstől a nyálat centrifugálással
szabadítjuk meg: 3000–10 000 g, 15 perc 4 °C-on. A
felülúszót azonnal felhasználhatjuk, -70 °C-on tárolhatjuk,
vagy kicsapjuk a nyálfehérjéket pl. 10%-os
triklórecetsav/aceton/ditiotreitol keverékével vagy
etanollal, de ismert olyan módszer is, ahol a nyálat
100-szoros térfogatú vízzel szemben dializálják, majd
liofilezik az analízis előtt.
11-30. táblázat. Nyálfehérjecsaládok
Nyálfehérjecsalád
savanyú prolingazdag fehérjék
amilázok
bázikus prolingazdag fehérjék
karboanhidrázok
cisztatinok
hisztatinok
laktoferrin
lizozim
mucinok
peroxidázok
sztatherinek
szekretoros IgA
defenzinek
Funkció
védőbevonat
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése
csersavak megkötése
szénhidrátemésztés
antibakteriális hatás
csersavak megkötése
antibakteriális hatás
védőbevonat
védőbevonat
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése
antibakteriális hatás
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése
csersavak megkötése
antibakteriális hatás
antibakteriális hatás
mikrobákhoz kötődés
védőbevonat
antibakteriális hatás
mikrobákhoz kötődés
síkosítás
védőbevonat
nyelés megkönnyítése
mikrobákhoz kötődés
antibakteriális hatás
síkosítás
védőbevonat
fogzománc kalciumegyensúlyának megőrzése
antibakteriális hatás
mikrobákhoz kötődés
antibakteriális hatás

A testnedvek fehérje-összetételének diagnosztikus kémlelése
303
Fehérjemeghatározás
A felülúszóból mindenféle manipuláció előtt érdemes
a fehérjetartalmat megmérni. Bevált módszer a
nyálminta 10-szeres hígítása 1 mol/l NaOH-val, azután
a fehérjetartalmat Bradford szerint mérjük. A
nyugalmi nyál totál proteintartalma 0,2–1,0 g/l között
változik.
Fehérjeelektroforézis
Egy- vagy kétdimenziós elektroforézist végezhetünk,
a mintákat mindkét esetben a megfelelő protokoll
szerint kell előkészíteni (lásd 3. fejezet). Nagyon
gyakran a kísérleti modellben felvetett kérdés megválaszolására
elegendő az egydimenziós SDS PAGE,
esetleg kiegészítve immunoblot vagy tömegspektrometriás
analízisekkel. Amennyiben a mintánk fehérjetartalma
kicsi, célszerű azt 5-szörös töménységű
mintapufferbe felvenni.
Tömegspektrometriás vizsgálatok
A kutatás ma nem csak a lehető legnagyobb számú
fehérje detektálására irányul, hanem betegségspecifikus
molekulák, fehérje-peptid markerek azonosítására
és klinikai alkalmazhatóságuk eldöntésére,
lehetőleg non-invazív módon kapott mintákból, mint
amilyen pl. a nyál is. Erre a célra széles körben használatos
az előzetes elektroforetikus elválasztás és a
tömegspektrometria kombinálása. A kisméretű polipeptidek
közvetlenül, a nagyobb fehérjék tripszines
emésztés után analizálhatók tömegspektrométerben
(lásd 7. fejezet). A nyál fehérjetérképe jellegzetes eltéréseket
mutat egészségesek és szájüregi daganatokban
szenvedők között, a nyálfehérjék közül a potenciális
tumormarkerként használható molekulák kutatása
igen intenzíven folyik. Ugyanígy vizsgálják a dohányzás
vagy egyes autoimmun betegségek okozta jellegzetes
fehérjekép-eltéréseket is.
A nyálfehérjék összetételének változását felhasználhatjuk
a szájüreget érő kémiai anyagok hatásainak
analízisére. Ismert, hogy a vörösborok zamatát tannintartalmuk
jelentősen befolyásolhatja, ezért a borok
derítése, a polifenolok egy részének eltávolítása
a bor előállítási technológiájának része. A tanninok
a nyál egyes fehérjéivel – különösen a prolingazdag
frakcióval – komplexet képeznek, és a komplex precipitálódik.
Amennyiben a nyálat vörösborral keverjük,
majd SDS-PAGE vizsgálatot végzünk, a nyál
fehérjemintázata jellegzetes változást mutat a csersavtartalom
függvényében. A kontroll, nem kezelt
nyálhoz képest a nagy csersavtartalom következtében
több fehérjesáv eltűnhet vagy kevesebb fehérjét tartalmazhat.
A fehérjeanalízisek egzakt módon egészítik
ki az érzékszervi vizsgálatokat.
A nyálfehérjék (pl. parotis-agglutinin, amiláz)
baktériumkötődése is tanulmányozható in vitro
modellekben. Különböző baktériumtörzsek (pl.
Staphylococcus, Streptococcus) összehozhatók izolált
nyálfehérjékkel adhéziós, agglutinációs vagy immunfluoreszcenciás
assay-kben (analitikai tesztekben) és
a kötődés kimutatható. A bakteriális aggregáció egyrészt
elősegíti a baktériumok megcsapdázását és kiürítését
a szájüregből, másrészt amennyiben az a fogzománc
felületén történik, kedvez a lokális bakteriális
tevékenységnek és a fogszuvasodás kialakulásának.
A fogászati prevencióban használatos szájvizek
nyálfehérjékre gyakorolt hatása is tanulmányozható
elektroforetikus módszerekkel. A csersavas fehérjekicsapás
analógiájára saját vizsgálatainkban az Intézetünkben
illóolajokkal kiegészített gyógynövénytinktúrás
szájöblögető oldat hígításait nyálmintával
kevertünk össze 1:3 arányban (etanol-végkoncentráció
5%). Kontrollként 40%-os etanolt, PBS-t (fiziológiás
sót tartalmazó foszfátpuffer, pH 7,2) és összehasonlító
készítményként kereskedelmi forgalomban
Funkcionális vizsgálatok
11-70. ábra. Szájvizek hatása a nyál fehérje-összetételére
(10% SDS-PAGE hordozó és ezüstfestés. 1.: 32-szeres;
2.:16-szoros; 3.: 8-szoros; 4.: 4-szeres hígítású kezelés saját
szájvízzel; 5.: 5% etanol; 6.: 4-szeres hígítású cserszömörcés
szájvizes kezelés; 7.: 4-szeres PBS; 8.: kezeletlen nyál,
M: markerek)

304 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
kapható cserszömörcés szájvizet használtunk ugyanabban
az arányban. 10 perces inkubáció után minden
mintát Laemmli-féle mintapufferben vettünk fel,
100 °C-on kezeltünk majd centrifugáltunk. 10%-os
SDS-PAGE elválasztást követően a géleket kombinált
ezüstözéssel festettük (3,4 μg/pászta). Eredményeink
azt mutatták, hogy a kezeletlen nyálminta fehérjemintázatával
összehasonlítva nem találtunk eltéréseket
sem a saját, sem a kereskedelmi oldattal kezelt
nyálaknál (11-70. ábra).
A bemutatott kísérlet példa arra, hogy a nyál fehérjemintázata
alkalmas komplex vegyületek hatásának
detektálására vagy kizárására. Természetesen az egydimenziós
elválasztás a finom eltéréseket nem jelzi
kellő érzékenységgel.
A bemutatott példák alapján a nyál értékes, könynyen
nyerhető testnedv, amelynek klinikai felhasználása
várhatóan egyre nagyobb teret fog kapni a közeljövőben.
Irodalom
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3000095/
Tabak, L. A: In Defense of the Oral Cavity: The Protective
Role of the Salivary Secretions. Pediatric Dentistry
28(2):110-117, 2006.
Jessie, K., Pang, W. W., Abdul Rahim, Z. H. et al.: Proteomic
Analysis of Whole Human Saliva Detects Enhanced
Expression of Interleukin-1 Receptor Antagonist, Thioredoxin
and Lipocalin-1 in Cigarette Smokers Compared
to Non-Smokers. Int. J. Mol. Sci. 11:4488-4505,
2010.
Hu, S., Xie, Y., Ramachandran, P. et al.: Large-scale
identification of proteins in human salivary proteome
by liquid chromatography/mass spectrometry and
two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry.
Proteomics 5:1-15, 2005.
Wu, Z.-Z., Wang, J.-G, Zhang, X.-L.: Diagnostic model of
saliva protein finger print analysis of patients with gastric
cancer. World J. Gastroenterol. 15(7): 865-870, 2009.
Sondej, M., Denny, P. A., Xie, Y. et al.: Glycoprofiling
of the Human Salivary Proteome. Clin. Proteomics
5(1):52–68, 2009.

Vizeletvizsgálatok
305
Vizeletvizsgálatok
Vizeletvizsgálatok a proteinürítés tükrében
Ludány Andrea
Klinikai laboratóriumi analitikai
módszerek
Az emberi vizelet fehérjéi
Ismert, hogy a humán vizelet fiziológiás körülmények
között is különböző fehérjéket tartalmazhat. E fehérjék
összességükben is igen kis koncentrációban, azaz
csak „nyomokban” jelennek meg. Ismeretük mind fiziológiai,
mind kórélettani szempontból jelentős lehet.
Klinikailag a vizeletben fellelhető fehérjék nyolc
csoportba oszthatók:
1. Normál plazmafehérjék vagy fragmentjeik. Napjainkig
már több mint 30 plazmafehérjét azonosítottak
a vizeletben. Valószínű, hogy elég érzékeny
módszer segítségével valamennyi plazmafehérje
kimutatható lehetne. Molekulatömegük széles határok
között mozog. Ebbe a csoportba tartozik
pl. az albumin, a retinolkötő fehérje, az α 1
-mikroglobulin,
a fibrinogén degradációs termékek, a
β 2
-mikroglobulin és az IgG-könnyűláncok.
2. A vesében keletkező és a vizeletbe kerülő fehérjék. E
fehérjék egy része a vesére specifikusan jellemző,
csak itt termelődik, másik részük egyéb szervekre
is jellemző (pl. az előbbiekhez a Tamm-Horsfall-protein,
az urokallikrein, az eritropoetin, az
utóbbiakhoz pedig a basalis membrán antigének,
az alkalikus foszfatáz, a γ-glutamil-transzferáz, a
lizozomális enzimek tartoznak).
3. A húgyúti traktusból származó fehérjék. A húgyúti
traktus bármely részének sérülésekor, gyulladásakor
szöveti fehérjék fokozott mértékben áramlanak
a tubuluslumenbe. Normál körülmények között is
kerülnek a vizeletbe fehérjék az epithelsejtekből, a
nemi mirigyekből (pl. savi foszfatáz a prostatából)
és a vaginalis váladékból.
4. Nem az urogenitalis traktusból származó szöveti
fehérjék. A különböző szövetek, szervek sérülései
folytán sejtfehérjék kerülnek a keringésbe. Azok a
fehérjék, amelyek molekulatömege elég kicsi ahhoz,
hogy a glomerulusban filtrálódni tudjanak,
megjelennek a vizeletben. Ezek a fehérjék általában
szöveti/szervspecifikus antigének.
5. Terhesség alatt termelődő fehérjék. Öt fő antigént
írtak le a humán placentában, amelyek terhesség
alatt a vizeletben is megjelennek. Számos fázisspecifikus
foetus-autoantigénről azonban jelenleg
még nem igazolt, hogy bejut az anyai vizeletbe.
6. Tumorantigének. Számos klinikai jelentőséggel
bíró tumorantigént azonosítottak tumoros betegek
vizeletében, így pl. carcinoembryonalis antigént,
melanomaspecifikus antigént és a-fötoproteint.
7. Hormonok, szignálszubsztanciák. A humán koriongonadotropint
először terhes nők vizeletéből
izolálták, azóta is a hormonizolációk prototípusaként
szolgál. Minden ismert hypophysishormont
azonosítottak már a vizeletben, egyedül a prolaktinnal
kapcsolatosan vetődtek fel kétségek.
8. Baktérium-, vírus- és gombafertőzés termékei. Széles
körben tanulmányozott téma. Napjainkban
nagy figyelmet szentelnek a vírusinfekciót követő
korai szakban a sejtek által feleslegben szintetizált,
ún. korai fehérjéknek. Ezek a vizeletben megjelennek
és valószínűleg kapszid antigének. Bakteriális,
ill. gombafertőzésben szintén fellelhetők a vizeletben
jellemző antigének. Az említett fehérjék/antigének
a vizelet kismolekulatömegű frakciójában
találhatók.
A fehérjék mennyiségi mérése
Teljes proteinkoncentráció
A teljes (össz-) proteinkoncentráció mennyiségi
vizsgálatára a klinikai laboratóriumi munkában ma
is a hagyományos, sorozatmérésekre alkalmas biuretvagy
az ún. mikrobiuret- (Benedikt szerint) módszer
használatos. Előnye, hogy együtt méri az összes
vizeletfehérjét és proteoglikánt összehasonlítható
analitikai érzékenységgel. Hátránya, hogy kis fehérjekoncentrációknál
nem elég érzékeny. (Lásd a Mintaelőkészítés
című fejezet módszertani részét.)
A „vizelet-összfehérje” meghatározás egyébként
egyszerű rutin eljárás számos betegség, főképpen a
veseérintettséggel járó folyamatok diagnosztikájában.
Kiemelt szerepe van a betegségek szűrő jellegű vizsgálatában,
ill. a betegség lefolyásának monitorozásában.
A vizelettel kiválasztott fehérjék összetétele változhat
a proteinuria eredetétől és a betegség okától függően
is. A naponta ürített fehérje mennyiségének megítélése

306 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-31. táblázat. A vizelet összfehérje mennyiségének mérésére elterjedt módszerek
Módszer
Eljárás
A detektálás
határa (mg/l)
Referenciatartomány
triklórecetsav (TCA) nefelometria 100 < 100 mg/l
TCA-HCl turbidimetria 10 < 70 mg/l
benzthonium-klorid turbidimetria 60 < 135 mg/24 óra
tanninprecipitáció
a fehérjékhez kötődő FeCl 3
-tannin
színreakciója
30 < 350 mg/24 óra
Coomassie blue-G250 + SDS festékkötés a proteinmicellákhoz 2 < 120 mg/24 óra
pyrogallol red + molibdát festékkötés 10 24-140 mg/24 óra
pyrogallol red + molibdát+
SDS
festékkötés 35 40-80 mg/24 óra
biuret réz-fehérje komplex 110 50-240 mg/l
pedig nagymértékben függ a választott analitikai módszertől.
A 11-31. táblázat mutatja be az összfehérje mérésére
jelenleg ajánlott módszereket, érzékenységüket,
és az elfogadott referenciatartományokat.
A táblázatból kiderül, hogy a referenciatartományok
jelentős eltéréseket mutatnak attól függően,
hogy a használatos fehérjekimutatási eljárás milyen
érzékenységi határral rendelkezik. A referenciatartomány
megítélésekor mindezt figyelembe kell venni.
Egyedi, célzott vizeletfehérje meghatározás
A diagnosztikában és így a klinikai biokémiai vizsgálatokban
általában az egyedi célzott vizeletfehérje
meghatározások igénye is felvetődik. Módszertanilag,
mivel specifikus fehérjemeghatározásokról van
itt szó, az immunkémiai eljárások kerültek bevezetésre.
A 11-32. táblázaton foglaltuk össze a vizeletben
normál körülmények között is megtalálható fehérjék
individuális mérésére alkalmas módszereket és
a fehérjék mérhető legkisebb koncentrációit. A mért
koncentrációadatok (mg/l) kifejezhetők napi ürítésben
is (a vizeletmennyiség ismeretében) vagy kreatininkoncentráció-hányadosban
is. Az utóbbi kifejezésmód
előnye, hogy nem igényel vizeletgyűjtést.
A vizeletfehérjék megoszlási képének
vizsgálata
A fehérjekutatásban az egyre fejlődő immunkémiai
módszerek mellett kiemelt jelentőséget kapnak a
különböző elektroforetikus technikák is. Régről ismertek
azok a módszerek, amelyek mindkettő kombinációját
alkalmazzák. Ismert például, hogy a vizeletben
megjelenő immunglobulin-könnyűláncok
megjelenítésére rutinszerűen immunelektroforézist,
ill. immunfixációt használnak. A klasszikusnak számító
kvalitatív, ill. szemikvantitatív meghatározások
(pl. Rocket-elfo) szintén ehhez a vizsgálatcsoporthoz
tartoznak, jóllehet egyedi fehérjék kimutatására szolgálnak.
A minták fehérjeösszetételének, a különböző fehérjék
megoszlási arányának (mintázatának) vizsgálatára
a klinikai laboratóriumi munkában ma is a
sorozatmérésekre is alkalmas elektroforetikus eljárások
terjedtek el leginkább. Az alkalmazott elektroforézistechnikák
főképpen a hordozóanyagban különböznek.
Agar, agaróz mellett a poliakrilamidgél nyert
nagyobb teret az utóbbi években. A Laemmli-féle SDS
PAG elektroforézis pl. már bekerült a speciális diagnosztikai
laboratóriumok analitikai módszereinek
repertoárjába. Mind az egy-, mind a kétdimenziós
PAGE (poliakrilamidgél-elektroforézis) elválasztások
ismertek a vizeletfehérjék vizsgálatában. Tekintettel
a vizeletminták extrém tartományokban változó fehérjekoncentrációira,
fontosnak látszott a detektálási
érzékenység növelése. Erre az ezüstözési módszerek
széles változatai kínálkoznak. Olyan ezüstözést célszerű
választani, amely kompatibilis egy esetleg csatlakozó
tömegspektrometriás (MS) méréshez is. Tapasztalataink
szerint a Willoughby és munkatársai

Vizeletvizsgálatok
307
által közölt kombinált (gyors) ezüstözési eljárást tartjuk
erre a legalkalmasabbnak (lásd 4. fejezet). Mintánként
az egydimenziós gélen 2-3 µg protein elegendő
a mintázat megjelenítéséhez.
A kétdimenziós elektroforézisek, azaz a nagy feloldású
fehérjetérképek készítésében a minták fehérjetartalmának
előzetes dúsítása általában elengedhetetlen.
Munkánkban olyan dúsítási eljárást vezettünk be,
amely a normál vizelet fehérjeanalitikai vizsgálatára
és fehérjetérképe megjelenítésére is eredményesnek
bizonyult. A módszer nem csak egyszerű és gyors,
hanem mint későbbi vizsgálatainkból kiderült, a procedúra
során a fehérjevesztés elhanyagolható (lásd 4.
fejezet: A minták fehérjedúsítása és ezüstdetektálása
Marshall szerint).
A dúsítási eljárás a vizeletfehérjék kétdimenziós
elektroforéziséhez mint minta-előkészítő eljárás alkalmazható.
A nagy feloldású kétdimenziós elektroforézis
géljeinek nagy felületén a fehérjefrakciók megoszlanak
és további detektálási érzékenység növelést
igényelnek. A gélek ezüstözésére ehhez a Marshall
és munkatársai által kifejlesztett ezüstözési technikát
használtuk, amelynél a „jel/zaj” arány az ideális
kompromisszumra beállítható, és a vizsgálat információs
értéke így sokszorosára növelhető (11-71.
ábra). További MS vizsgálatok tervezése esetén viszont
Gromova és munkatársai eljárását javasoljuk.
Áttekintő jellegű módszertani ismertetőnket néhány
hangsúlyozott tanáccsal zárjuk. A vizeletminták fehér-
11-32. táblázat. Individuális fehérjék normálértékeinek felső határa a vizeletben
összfehérje
albumin
Fehérje Mérési módszer Normálérték felső határa (cut-off érték)
TCA
turbidimetria
tesztcsík
immunonefelometria
turbidimetria
radioimmunassay
immunkémiai tesztek
70 mg/l
20 mg/l
20 mg/l
transzferrin immunonefelometria 0,2-1,2 mg/l
IgG
α 1
-mikroglobulin
β 2
-mikroglobulin
immunonefelometria
turbidimetria
immunonefelometria
turbidimetria
immunonefelometria
immunoassay
10 mg/l
12 mg/l
0,3 mg/l
retinolkötő fehérje immunonefelometria 0,5 mg/l
β-NAG * enzimaktívitás-mérés 6,3 U/l
Ig könnyűlánc immunonefelometria 10 mg/l
hemoglobin, mioglobin tesztcsík 0,3 mg/l
α 2
-makroglobulin
immunonefelometria
turbidimetria
apolipoprotein A-1 immunonefelometria 0,4 mg/l
CRP immunonefelometria 6 µg/l
*
β-NAG: N-acetil-β-D-glukózaminidaz
7 mg/g kreatinin

308 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
a
11-71. ábra. 50 éves szívbeteg férfi vizeletmintája. Kétdimenziós
PAG-elektroforetogram (10% gélkoncentráció,
ezüstözés Marshall szerint; vizeletminta-dúsítással, a felvitt
proteinmennyiség 250 µg, M: molsúlymarker)
b
jevizsgálatainál fontos szem előtt tartani a következőket:
• A vizeletminta azonosítása, a mintavétel módja,
mennyisége stb.
• Szűrővizsgálatok, üledékvizsgálat.
• A minta mielőbbi előkészítése az analízisekhez:
centrifugálás, dekantálás.
• A minta összfehérje- és kreatininkoncentrációjának
meghatározása (vonatkoztatások és a
későbbi analízisek érdekében).
• Individuális fehérjekomponensek célzott,
immunkémiai, ill. kromatográfiás műszeres
meghatározása, automata analizátorok révén.
• A mért adatok nem koncentrációban, hanem
kreatininre vagy total proteinre számítandók.
• A fehérje frakcionálásig mintapufferben tárolása
-70 °C-on (proteolízisgátlás!).
• Az ezüst-detektáláshoz ajánlott fehérjeminta-mennyiség
SDS ELFO-nál: 2-3 µg/pászta.
• Western blothoz ajánlott fehérjeminta-mennyiség
SDS ELFO-nál: 3-4 µg/pászta.
• Fehérjemintázat értékelése: kontroll/beteg,
beteg/beteg, betegcsoportok(aktív/non-aktív,
akut/krónikus) hasonlításával - kizárólag azonosan
kezelt mintákkal és azonos fehérjemennyiségekkel
végezhetők (11-72. ábra a-b-c, 11-73.
ábra).
• Kétdimenziós O’Farrell-technika fehérjetérképe:
Coomassie-detektálásnál 300 µg, ezüstözési
technikánál 75-150 µg/géllap. Mintától függően
az analízis előtt dúsítás szükséges.
c
11-72. ábra. Összehasonlító vizeletfehérje-elektroforézis
krónikus gyulladásos bélbetegeknél (12,5% SDS gél, kombinált
ezüstfestés, pásztánként 2,5 µg protein)
a) A vizeletfehérjék mintázata kontroll mintákban
b) A vizeletfehérjék mintázata aktív betegeknél
c) A vizeletfehérjék mintázata „non-aktív” betegeknél
Vizeletfehérjék klinikai biokémiája
és információs értékei
A fejezet következő részében a vizeletfehérje-analízisek
klinikai biokémiai jelentőségét illusztráljuk - a teljesség
igénye nélkül - néhány általunk kiemelt példával.

Vizeletvizsgálatok
309
11-73. ábra. Mikroalbumin-vizsgálatok Crohn-betegeknél;
totál proteinre és kreatininre számított értékek összevetése
Számos közleményben találunk utalást arra, hogy
különböző szisztémás betegségekben a vizelet kétdimenziós
fehérjemintázata diagnosztikus támpontul
szolgálhat. Norman G. és Leigh Anderson betegségekkel
asszociált fehérjetérkép-változásokat írt le a
„Human Protein Index” című dolgozatban már 1982-
ben. Ismert, mint ahogy az a bevezetőben is említésre
került, hogy a vizeletfehérjék számos forrásból eredhetnek.
Glomerularis betegségek következményeként
megváltozik a szelektivitás: nagy molekulatömegű
proteinek (60 kDa felettiek), albumin és plazmafehérjék,
mint pl. transzferrin, IgG jelennek meg a vizeletben.
Tubularis betegségekben a kisebb molekulatömegű
proteinek (60 kDa alattiak), mint pl. az α 1
savanyú glikoprotein, α 1
-mikroglobulin, retinolkötő
fehérje, β 2
-mikroglobulin, lizozim, β-NAG (de albumin
is) mutathatók ki nagyobb mennyiségben.
Az α 1
savanyú glikoprotein a vizeletben normál
körülmények között is mérhető fehérje, a leukocyták
egy külső membránfehérjéjének fragmentje. Szintjének
emelkedése a szérumban és a vizeletben különösen
jellemző a leukocyta proliferációval járó betegségekre
[4]. A β 2
-mikroglobulin szintén a sejtmembrán
alkotórésze, hisztokompatibilitási antigénekkel aszszociált.
Az exkréció növekedése diagnosztikus értékű
kadmiummérgezett munkásokban a proximalis
tubulus károsodásának jeleként. Emelkedését kimutatták
SLE-ben és malignus betegségekben is. Ma
már a plazmasejttumoros betegekben monitorozzák
a kezelés hatékonyságának ellenőrzésére. Előrehaladott
malignus betegségekben jelentősen fokozódhat
az albuminuria mértéke is [13]. A retinolkötő fehérje
az A-vitamin transzportjában vesz részt, szintje emelkedik
vesetranszplantációt, kadmiummérgezést követően.
A Gc-globulin (D-vitamin-kötő fehérje) szintje
emelkedik nephrosis-szindrómában, nagy valószínűséggel
a glomeruluskárosodás jeleként.
Az immunglobulin-könnyűláncok diagnosztikus
jelentőségűek. Bizonyos betegségekben, így myeloma
multiplexben jellemző mind a mennyiségük, mind pedig
a láncok fajtája és egymáshoz viszonyított aránya,
mert a nagy mennyiségben termelődő monoklonális
immunglobulin-könnyűláncok megjelenhetnek a vizeletben.
Gyakoribb a l-lánc mennyiségének emelkedése.
Vesekárosodásban is jellemző lehet a l típusú
Bence-Jones-proteinuria. Bence-Jones-proteinuriát
találunk még amyloidosisban, Fanconi-szindrómában.
Az immunfixációt kombinálva a vizeletfehérje-elektroforézissel
biztonságos diagnózishoz juthatunk
ezekben az esetekben (Levinson, S.S., 2000).
A vesekárosodás jó indikátora a retinolkötő fehérje,
a β-NAG, a transzferrin és az IgG emelkedése, amelyek
mennyisége a betegség súlyosságával ugyan nem korrelál,
de a vese korai károsodását az esetek nagy részében
kimutatja [3]. Nephrosis-szindrómában kimutatták a
fibrin/fibrinogén degradációs termékek emelkedését,
proliferatív glomerulonephritisben mindezeken felül
a keresztkötött fibrindegradációs termékek szintje is
emelkedett [14]. Nephropathiában diagnosztikus segítség
lehet az a tény, hogy az össz-glükóz-aminoglikán
szint emelkedett, míg a kondroitin-szulfát/heparán-szulfát
arány nem változik [8].
Glomerulonephritisben különböző albuminpolimereket
találtak a vizeletben [2]. Mesangiocapillaris
glomerulonephritisben pl. az albumin olyan
izomerjét írták le, amelynek magasabb az izoelektromos
pontja. Lupus-nephritisben ninhidrin-pozitív
anyagokhoz kötődő albumint találtak. Így Doman és
munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy az
albuminpolimerizáció nem biokémiai műtermék, hanem
klinikai jelentősége lehet.
Az elektroforetikus vizsgálatok fontos segítséget
adhatnak a vesetranszplantált betegek állapotának, a
terápia nefrotoxicitásának monitorozásában is. A rejekciós
krízisre jellemző az albuminuria, a kis molekulatömegű
fehérjék, valamint a g-globulinok szintjének
emelkedése. Az említett fehérjék kimutatása
megkönnyíti a gyulladásos reakció elkülönítését egy
esetleges kilökődési krízistől.

310 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A vizeletben lévő albumin mennyisége emelkedik
hypertoniában a glomerularis hypertensio és basalis
membrán sérülése következtében. A IV-es típusú
kollagén mennyisége pedig a mesangialis mátrix,
ill. szintén a glomerularis basalis membrán sérülése
következtében nő meg. Mindezek jellemzőek a hypertrophiás
szívbetegségekre és az atheroscleroticus
elváltozásokra is [7]. Hypertoniában újabban, mivel a
betegség fennállásának idejével korrelál, a microalbuminuria
meghatározását is hasznosnak tartják. Szívizombetegségekben
a vizelet albumin-, transzferrin-,
IgG-tartalma nagymértékben, az α 1
- glikoprotein és
az Apo-A1-szint kissé emelkedett, a vizelet össz-fehérjetartalma
viszont nem nő szignifikánsan [5].
Miközben primer glomerulonephritisben a proteinuria
jelenléte és mértéke utalhat a veseelégtelenség
kialakulásának lehetőségére, lupus-nephritisben még
mindig ellentétesek a nézetek a proteinuria és a betegség
prognózisának összefüggésével kapcsolatban.
Az SLE-s betegek csak mintegy 20%-ában emelkedik
az összfehérje mennyisége a vizeletben. Egyéb tünetek
hiányában itt is diagnosztikus támpontul szolgálhat
az albumin és a retinolkötő fehérje (proximalis
tubulus dysfunctióra jellemző) szint együttes emelkedése
[6]. Aktív lupus-nephritisben pedig a vizelet C3
komplement tartalmának vizsgálata ajánlott [11]. Az
SLE okozta tubulointerstitialis nephritisben a vizelet
β 2
-mikroglobulin-szintje emelkedik, a Tamm-Horsfall-glikoproteiné
pedig csökken. Szintén mennyiségi
növekedést tapasztalhatunk az IL-6 és az IL-8 vonatkozásában
is [15].
IgA-nephropathiaban, diabeteses nephropathiában
a fehérjetérkép révén a nephronsérülés non-invazív
lokalizációja válik lehetségessé. A kétdimenziós
fehérjeelektroforézis jól használható annak megállapítására,
hogy a károsodás elsősorban glomerularis
vagy tubularis. Kimutatták, hogy diabeteses nephropathiában
a vizelet albumin-, β-NAG-, ill. β 2
-mikroglobulin-szintje
emelkedik. A glomerularis típusú
proteinuria a diabetes fennállásának tartamával, a
β-NAG-ürítés pedig a diabeteses angiopathia súlyosságával
korrelál.
Irodalom
[1] Anderson, N. G., Anderson, N. L., Tollaksen, S. L.:
Proteins in human urine. I. Concentration and analysis
by two-dimensional electrophoresis. Clin. Chem.
25/7:1199-1210, 1979.
[2] Bazzi, C., Petrini, C., Rizza, V. et al.: Characterization
of proteinuria in primary glomerulonephritides:
Urinary polymers of albumin. Am. J. Kidney Dis.
30(3):404-412, 1979.
[3] Corso, A., Serricchio, G., Zappasodi, P. et al.: Assesment
of renal function in patients with multiple
myeloma: the role of urinary proteins. Ann. Hematol.
78(8):371-375, 1999.
[4] Gahmberg, C. G., Anderson, L. C.: Leukocyte surface
origin of human alfa-1-acid glycoprotein (orosomucoid).
J. Exp. Med., 148:507-521, 1978.
[5] Graber, H. U., Martig, J.: Urinary protein analysis in
cardiomyopathy-affected and healthy cattle by SDS-polyacrylamide
gel electrophoresis. Zentralbl. Veterinarmed.
39(10):769-776, 1992.
[6] Guy, J. M., Brammah, T. B., Holt, L. et al.: Urinary
excretion of albumin and retinol binding protein in
systemic lupus erythematosus. Ann. Clin. Biochem.
34:668-674, 1997.
[7] Ishimitsu, T. et al.: Urinary excretions of albumin and
type IV collagen in normotensive and hypertensive subjects.
Hypertens. Res. 23(5):459-466, 2000.
[8] Juretic, D., Cvoriscec, D., Vukovic-Holjevac, A et
al.: Urinary glycosaminoglycans in different phases of
Balkan endemic nephropathy. Nephron 65(4):564-567,
1993.
[9] Marshall, T., Williams, K. M.: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide
gel electrophoresis of urine: concentration
of urinary proteins by precipitation with
Coomassie Blue. Clin. Chem. 39/11:2314-2318, 1993.
[10] Marshall, T., Williams, K.: Two-dimensional
electrophoresis of human urinary proteins following
concentration by dye precipitation. Electrophoresis
17:1265-1272, 1996.
[11] Negi, V. S., Aggarwal, A., Dayal, R. et al.: Complement
degradation product C3d in urine: marker of lupus
nephritis J. Rheumatol. 27(2):380-383, 2000.
[12] Nemes Vanda: Módszertani fejlesztések a vizeletfehérjék
térképezésében. Diplomamunka PTE/ÁOK
2002.
[13] Pedersen, L. M., Terslev, L., Slrensen, P. G. et
al.: Urinary albumin excretion and transcapillary escape
rate of albumin in malignancies. Med. Oncol.
17(2):117-122, 2000.
[14] Taira, K., Matsunaga, T., Kawahara, S. et al.: Fragments
of urinary fibrin/fibrinogen degradation products
and cross-linked fibrin degradation products in
various renal diseases. Thromb. Res. 53(4):367-377,
1989.
[15] Tsai, C. Y., Wu, T. H., Yu, C. L. et al.: Increased excretions
of beta2-microglobulin, IL-6, and IL-8 and
decreased excretion of Tamm-Horsfall glycoprotein in
urine of patients with active lupus nephritis. Nephron
85(3):207-214, 2000.

Vizeletvizsgálatok
311
A proteinuria klinikai szempontjai
Wittmann István
Fogalmak, definíciók
A fehérjevizelés (proteinuria) lehet normális és kóros.
A kóros eredete szerint lehet praerenalis, glomerularis,
tubularis és postrenalis. Praerenalis proteinuriában
a kóros körülmények között képződött és filtrált
fehérjék jelennek meg a vizeletben (pl. myoglobinuria,
Ig-könnyűlánc-vizelés stb.). A könnyűlánc-proteinuria
esetén beszélnek „túlfolyásos” (overflow) eredetről
is. Glomerularis proteinuriában a glomerularis
molekulatömeg-küszöb feletti (> 65 kDa), tubularis
proteinuriában pedig az ez alatti tömegű fehérjék
jelennek meg a vizeletben. Vérzések miatt lehetnek
plazmafehérjék a vizeletben postrenalis fehérjevizelésben.
Amennyiben a napi proteinürítés < 1 g, enyhe,
ha >3,5g, akkor nephroticus mértékű proteinuriáról
van szó. Amikor szinte csak albumin ürül a vizeletben,
akkor szelektív, amennyiben más nagy molekulatömegű
fehérjék is, akkor nem szelektív proteinuriával
van dolgunk.
Microalbuminuriáról akkor beszélünk, ha a vizeletben
speciális immunanalitikai módszerekkel
mérhető, kis mennyiségű albumin jelenik meg. Alkalmazzák
a vizelet-albuminkoncentrációt is, de ez a
legkevésbé elfogadott (> 20 mg/l koncentráció esetén
micro-, >200 mg/l esetén macroalbuminuria lehetősége
vetődik föl).
Az albuminuria definícióját a 11-33, 11-34. táblázat
foglalja össze.
A proteinuria, microalbuminuria
kialakulása
A fehérjék és az albumin keringésben tartását a vese
több struktúrája szolgálja. A 65 kDa-nál nagyobb tömegű
fehérjék már csak kis mennyiségben jutnak át a
glomeruluson, ill. az átkerülő mennyiséget a vesetubulus
sejtjei majdnem teljes mértékben reabszorbeálják.
A 65 kD-nál kisebb molekulatömegű fehérjék
azonban szabadon átjutnak a glomerulus szűrő-rendszerein,
de legnagyobb részük szintén reabszorbeálódik
a proximalis tubularis sejtek kubilin- és megalinreceptorai
segítségével.
A fehérjék visszatartása a vese glomerulusában:
• Első vonalban a glomerularis ér fenesztrált
endothelje szolgál, mivel a fenesztrumokat az
endothel felszínén található glycocalyx lezárja.
• Második vonalbeli szűrőként a glomerularis
basalis membránt említhetjük, amelynek negatív
töltése (amit a szialiláltság és a heparinoidok
okoznak) és kicsiny pórusátmérője biztosítja a
szelektív (kis molekulatömegű és/vagy pozitív
töltésű) fehérjék áthaladását, ill. az ettől eltérők
visszatartását.
• Harmadik vonalban a glomerulus epithelsejtjei
(a podocyták) állábnyúlványai és a közöttük
feszülő membrán (slit membrane) tartja vissza a
keringésben a fehérjéket.
A glomeruluson mégis keresztüljutó fehérjék az említett
módon, aktív reabszorpcióval (ATP felhasználásával)
a tubularis epithelsejtekbe jutnak, ahol
nagyobbrészt degradálódnak. A belőlük képződő
11-33. táblázat. Az albuminuriák definíciója 24 órás gyűjtött
vizeletből *
Albuminuria
Ürítés 24 órás gyűjtött
vizeletben (mg/nap)
normoalbuminuria 300
*
Amennyiben 3-6 hónapon belül végzett 3 mérésből 2 pozitív,
akkor beszélünk micro/ vagy macroalbuminuriáról
11-34. táblázat. Az albuminuriák definíciója nem gyűjtött
vizeletből, az albumin/kreatinin hányados szerint *
Albuminuria
normoalbuminuria
Ürítés nőknél
(mg/mmol)
Ürítés férfiaknál
(mg/mmol)
25
*
Amennyiben 3-6 hónapon belül végzett 3 mérésből 2 pozitív,
akkor beszélünk micro- vagy macroalbuminuriáról.

312 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
aminosavak visszakerülnek a keringésbe, de a fehérjék
kisebb része többé-kevésbé intaktan ismét szecerneálódva
a vizelettel kiürül.
A vese glomerularis betegségeiben olyan mennyiségű
fehérje kerül a tubulusokba, amennyit az már
nem tud reabszorbeálni. Tubularis bajban a szabadon
filtrálódó fehérjék egy része nem reabszorbeálódik.
Mindkét károsodás a nephron pusztulásához
és végeredményben veseelégtelenséghez vezet. Ezért
a vizeletfehérje- vagy speciálisan az albuminürítés
meghatározása a veseállapot követésének egyik legfontosabb
módja.
A proteinuria, microalbuminuria
előfordulása és jelentősége
Populációs szintű, válogatás nélküli népességen végzett
vizsgálatokból tudjuk, hogy a microalbuminuria
előfordulása hozzávetőlegesen 6% körüli. Az analízisek
szerint a microalbuminuria összefüggése a vesebetegségekkel
és a cardiovascularis megbetegedésekkel
szoros.
Több mint 105 ezer beteg vizsgálatából az derült
ki, hogy az összmortalitás a 0,6 mg/mmol-os albumin/kreatinin
hányadoshoz képest 1,1 mg/mmol
esetén 20%-kal, 3,4 mg/mmol mellett 63%-kal, 33,9
mg/mmol esetén 122%-kal nő. Sőt mint látható, ez az
összefüggés az albuminuria normális tartományában
is létezik. Így tehát a vizeletalbumin-ürítés alacsony
tartományának vizsgálata is előnyökkel jár a beteg
vagy a magát egészségesnek gondoló egyén számára.
Tanulmányok arra is rávilágítottak, hogy minél jobban
csökkentjük az albuminürítés mértékét a kezelés
során, annál jobban csökken a veseelégtelenség és a
cardiovascularis betegség kockázata.
A metabolikus szindróma fejezetben leírtaknak
megfelelően (lásd 11.16. fejezet, a Metabolikus
szindróma WHO kritériumrendszere című részben)
korábban az volt az állásfoglalás, hogy a microalbuminuria
a metabolikus szindróma része. Az újabb
kritériumrendszerek (ATPIII, IDF) ugyan már nem
tartalmazzák a microalbuminuriát, de a WHO definíció
rávilágított a metabolikus szindróma és a microalbuminuria
szoros kapcsolatára. Így tehát microalbuminuriás
beteg vizsgálatakor a vesebetegségen
kívül keressük a cukorbetegséget, a dyslipidaemiát, az
obesitast, a hypertoniát és a micro-, valamint macrovascularis
szövődményeket.
Az albuminuria meghatározása
A vizeletalbumin mérésére kifejlesztett szemikvantitatív
módszer (tesztcsík) csak 300 mg/l és a feletti
albuminmennyiség kimutatására képes. Az első
kvantitatív analitikai módszer, amelyet ennél kisebb
koncentrációjú albumin mérésére fejlesztettek ki, egy
RIA módszer volt, amelyhez 125 I jelölt albumint használtak.
Ez azonban túl időigényesnek és költségesnek
bizonyult ahhoz, hogy a rutin laboratóriumi vizsgálat
részévé váljon. Ezért más immunanalitikai mérőmódszert
és automatizálható teszteket fejlesztettek
ki, pl. immunnefelometriás és immunturbidimetriás
módszert. Ennek során az albumint tartalmazó mintát
(szérum vagy vizelet) albuminellenes antitesttel
hozzák reakcióba, és az így keletkező immunkomplex
optikai tulajdonságát detektálják (turbidimetria vagy
fényszórás).
Meghatározás méretkizárásos
kromatográfiával
Napjainkban egy új, a méretkizárásos kromatográfián
alapuló, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás
(HPLC) módszer is rendelkezésünkre áll a microalbuminuria
detektálására. Az új módszert alkalmazó
első vizsgálat kimutatta, hogy a vizeletalbumin koncentrációját
a hagyományos immunológiai módszerek
diabeteses betegekben jelentősen alábecsülik. A
HPLC-vel mérhető vizeletalbumint ezt követően öszszes
(total) vizeletalbuminnak (t-uAlb) nevezték el.
Azon vizeletalbumin-frakciót, amely hagyományos
immun alapú módszerrel nem, de HPLC-vel mérhető,
nem immunreaktív vagy immunkémiailag nem
reaktív albuminnak nevezték el.
A HPLC-vel való mérésekhez használt kit szenzitivitása
(méréshatár): 3 mg/l, méréstartománya:
3-2000 mg/l, inter- és intra-assay pontossága 5,8 és
2,5%). A kit méretkizárásos kromatográfián alapul, és
mobil fázisként sótartalmú foszfátpuffert tartalmaz
(pH: 6,93).
A proteinuria, microalbuminuria
meghatározását befolyásoló tényezők
Klinikai tényezők
Ismert, hogy elsősorban fiatal, egészséges egyéneknél
előfordul a testhelyzettől függően, azaz felállást

Vizeletvizsgálatok
313
követően jelentkező, úgynevezett orthostaticus proteinuria.
Ennek jelentősége vitatott.
Húgyúti fertőzések, a legtöbb gyulladásos betegség,
akut lázas állapot, fizikai aktivitás, szívelégtelenség,
diétás proteinterhelés kiválthat átmeneti proteinuriát.
Felvetődik annak lehetősége is, hogy cukorbetegekben
vagy bármilyen betegségben, amelyben az
oxidatív stressz miatt karbonilstressz is létrejön és
ez módosítja az albumint, ennek következtében az
immunológiai módszerek nem képesek detektálni
a vizeletben az albumint. Újabb eredmények szerint
azonban ezek a tényezők nem tűnnek fontosnak az
albuminuria immunológiai alapú meghatározásában.
Preanalitikai tényezők
Tárolt vizeletből végzett albuminmeghatározás során
számítani kell arra, hogy csökkenő koncentrációértéket
kapunk. Igaz ez a -80 °C-os tárolásra is. Úgy
tűnik, hogy minél alacsonyabb a vizelet pH-ja, annál
nagyobb koncentrációban van jelen a vizeletben a
szabad SH-csoport, amely felelőssé tehető a vizeletalbumin
csökkenéséért. A vizeletben lévő albumin
egy része ugyanis enzimatikus emésztésen esett át, és
csak diszulfidhidak tartják össze. Ezek felbomlásakor
csökkent koncentrációt detektálunk HPLC-vel való,
molekulatömegre alapozott meghatározás során.
Irodalom
Anderson, S., Komers, R., Brenner, B. M.: Renal and
systematic manifestations of glomerular disease. The
Kidney. pp. 820-940. Saunders Elsevier, Philadelphia,
2008.
Cameron, J. S.: The patient with proteinuria and/or haematuria.
Oxford Textbook in Clinical Nephrology. pp.
389-414. Oxford University Press, New York, 2005.
Matsushita, K., van der Velde, M. et al.: Chronic Kidney
Disease Prognosis Consortium,.Association of estimated
glomerular filtration rate and albuminuria with
all-cause and cardiovascular mortality in general population
cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet
375(9731):2073-2081, 2010.
Krumme, B., Walb, D.: Diagnostische Massnahmen bei
Nierenerkrangungen und Beurteilung der Nierenfunktion.
Nephrologie. pp. 1-32. Thieme, Stuttgart, 2008.
Markó, L., Cseh, J., Kőszegi, T. et al.: Storage at -80 degrees
C decreases the concentration of HPLC-detected
urinary albumin: possible mechanisms and implications.
J. Nephrol. 22(3):397-402, 2009.
Markó, L., Molnár, G. A., Wagner, Z. et al.: Measurement
of the modification and interference rate of urinary
albumin detected by size-exclusion HPLC. Physiol.
Meas. 30(10):1137-1150, 2009.
Markó, L., Szigeti, N., Szabó, Z. et al.: Potential urinary
biomarkers of disease activity in Crohn’s disease. Scand.
J. Gastroenterol. 45(12):1440-1448, 2010.
http://emedicine.medscape.com/article/238158-overview
http://kidney.niddk.nih.gov/kudiseases/pubs/proteinuria
http://www.kidney.org/atoz/content/albuminuria.cfm
http://emedicine.medscape.com/article/244631-overview
http://www.gpnotebook.co.uk/simplepage.cfm?ID=
x20030124010449665170
http://care.diabetesjournals.org/content/27/suppl_1/s79.
full
http://www.ifcc.org/index.asp?cat=Publications&scat-
=eJIFCC_&suba=Vol_20_No_1&subx=LABORA-
TORY%20STANDARDS%20IN%20THE%20DIAG-
NOSIS%20AND%20MONITORING%20OF%20
THERAPY&zip=1&dove=1&zona=full&numero=-
&aq=1
http://hopkins-diabetesguide.org/clinical_tests/renal/full_
albuminuria.html
https://ssl.adam.com/content.aspx?productId=49&-
pid=49&gid=150230&site=welldynerx.adam.com&login=well1815

314 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Száraz-kémiai
fehérjekimutatások mint
betegágy melletti gyorstesztek
(POCT) – A POCT diagnosztikus
értékei, a vizsgálatok
hitelességének ellenőrzése
Liszt Ferenc
A laboratóriumi diagnosztika nem a szokásos laboratóriumi
környezetben, hanem a betegellátás közvetlen
közelében, legtöbbször nem laboratóriumi
képesítéssel rendelkező egészségügyi szakszemélyzet
által végzett tevékenysége az angol „Point-of-Care
Testing” kifejezés rövidítéséből származó POCT. A
POCT laboratóriumi diagnosztika, amelynek számos
szinonimája él az angolszász irodalomban (bedside
testing, near patient testing, home testing, self-management).
Definíció szerint magában foglal minden
olyan laboratóriumi vizsgálatot, amelyet a hagyományos
központi laboratóriumokon kívül végeznek. Ez
végezhető akár fekvőbeteg-intézményekben közvetlenül
a betegágy mellett, sürgősségi ellátás keretében
vagy az elsődleges ellátásban a háziorvosi rendelőben,
ill. a beteg által otthoni környezetben. A sürgősségi
betegellátás olyan klinikai helyzetet jelent, amikor
életfontos szervi dysfunctio, súlyos trauma, nagy
sebészeti beavatkozás, általános anesztézia, súlyos
sepsis vagy más súlyos kórképben szenvedő betegeket
kell ellátni. Ilyen klinikai helyzetet jelent intenzív osztályon,
műtőben, sürgősségi osztályokon, sürgősségi
és légi mentés során és a mellkasi fájdalom/trauma/
stroke egységekben való betegellátás. Ebben a fejezetben
csak a sürgősségi betegellátás keretében végzett
POCT-vizsgálatok diagnosztikus értékével foglalkozunk.
A POCT-diagnosztika elterjedését a klinikusok
laboratóriumi vizsgálatokkal szemben támasztott rövidebb
„turn-around-time” (TAT) igénye és a betegápolási
napok lerövidítéséből fakadó gazdaságossági
előnyök segítették. A központi laboratóriumi teszthez
képest rövidebb leletátfordulási időt nyújtó, sokszor
más módszertannal végzett POCT-vizsgálattal szemben
egyértelmű elvárás, hogy eredménye a központi
laboratóriumi teszthez hasonlóan megbízható és öszszevethető
legyen. A nem megfelelő minőségbiztosítással
alkalmazott POCT ugyanis a beteg számára
veszélyes lehet (pontatlan laboratóriumi eredmények
a kivitelezés hibáiból, rossz adatrögzítés, leletdokumentálás
miatt). A POCT-vizsgálatok gazdaságossági
előnye a betegápolási, leginkább az intenzív osztályon
töltött napok számának lerövidülésén keresztül érvényesül,
így azok túlzott gyakorisággal vagy központi
laboratóriumi szolgáltatással parallel „biztonsági” alkalmazása
költséges és felesleges. Az is nyilvánvaló,
hogy egyes klinikai állapotokban a gyors laboratóriumi
eredményeken alapuló döntéshozatal valóban
alapvető a beteg jobb gyógyulási esélyeinek biztosításához,
ugyanakkor más helyzetekben a gyors laboratóriumi
eredmény csupán a nagyobb fokú betegmegelégedettséget
szolgálja.
A betegellátás klinikai eredményességét
javító POCT-gyakorlat lehetőségei
a sürgősségi és intenzív terápiás ellátásban
A sürgősségi és intenzív betegellátás legfontosabb sajátsága,
hogy a beteg klinikai állapotában igen gyorsan
olyan jelentős változások történnek, ami azonnali
terápiás beavatkozást igényel. A vérnyomás, a pulzus,
a testhőmérséklet, a légzésszám és néhány biokémiai
marker olyan “vitális jeleknek” tekinthetők, amelyek
jelzik a beteg állapotának destabilizálódását. A klinikusnak
felkészültnek kell lennie ezen kritikus helyzetek
gyors diagnózisára és kezelésére annak érdekében,
hogy az életfontos szervek és szervrendszerek
következményes károsodását elkerülje. Ez a klinikai
környezet igen fontos területe lehet a megbízható,
pontos POCT-alkalmazásoknak, ami a vitális markerek
valós idejű követésével a kialakuló dysfunctio
azonnali kezelését teszi lehetővé, így javítva a beteggyógyulás
esélyeit.
A sürgősségi és intenzív terápiás betegellátás laboratóriumi
tesztpaneljét illetően ugyan általánosan
elfogadott javaslat nem létezik, több-kevesebb eltéréssel
azonban a laboratóriumi tesztek következő
csoportjai használatosak a fekvőbeteg-intézmények
sürgősségi gyakorlatában:
• Kardiológiai marker vizsgálatok.
• Gyulladásos marker vizsgálatok.
• Klinikai kémiai tesztek (vérgázok, ionok, vércukor,
laktát, a vesefunkció tesztjei, cooximetria).

Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) – A POCT diagnosztikus értékei, ...
315
• Hormonmeghatározások.
• Véralvadási tesztek.
• Toxikológiai vizsgálatok.
Hogy ezek közül mely vizsgálatok azok, amelyek
POCT-módszerrel végezve a betegellátás klinikai
eredményességét fokozzák, csak a POCT-használat
bizonyítékokon alapuló nemzetközi irányelvére támaszkodó
ajánlások alapján foglalható össze.
POCT alkalmazása sürgősségi kardiológiai marker
vizsgálatokra
A mellkasi fájdalom differenciáldiagnosztikája az
intenzív és sürgősségi osztályok egyik legnagyobb kihívása.
Az akut coronariabetegség korai kizárása vagy diagnózisa
alapvetően meghatározza a beteg további
kórházi elhelyezését, kezelését. E betegség differenciáldiagnosztikájában
a nemzetközi és magyar szakmai
irányelvek a következő biokémiai markerek használatát
ajánlják:
• cardialis troponin-I vagy troponin-T;
• kreatin-kináz MB izoenzimtömeg;
• mioglobin bizonyos esetekben.
A szakmai ajánlások a diagnosztikára és terápiára
vonatkozó ajánlásokkal összhangban a biokémiai
markerek a mellkasi fájdalom kezdetétől eltelt időre
vonatkoztatott eredményeitől függő döntéshozatalon
alapulnak. Ha hagyományos központi laboratóriumi
módszerekkel és a kapcsolódó logisztikai mechanizmusokkal
a cardialis markerek eredménye egy órán
belül nem biztosítható, akkor kvantitatív eredményt
adó és a központi laboratóriummal összehangolt
eredményt biztosító POCT bevezetése ajánlott.
A krónikus coronariabetegség kezelésére és diagnózisára
vonatkozó irányelv ajánlja az NT-pro-B natriuretikus-peptid
gyors, betegágy melletti meghatározását,
mert az echocardiográfiás vizsgálat nem áll mindig
rendelkezésre.
POCT-módszerek gyulladásos marker vizsgálatokra
A gyulladásos folyamat diagnosztikája minden orvosi
diszciplina központi kérdései közé tartozik. A
C-reaktív protein, procalcitonin és interleukin-6 marker
vizsgálata POCT-készüléken csak részben lehetséges.
A CRP meghatározásának elsősorban az alapellátásban,
a háziorvosi gyakorlatban, gyermekek
esetében van létjogosultsága. A prokalcitonin és az
interleukin-6 vizsgálatára módszertani okokból kifolyólag
csak szemikvantitatív POCT áll rendelkezésre.
POCT-módszerek sürgősségi klinikai kémiai vizsgálatokra
A fekvőbeteg-intézmények sürgősségi és intenzív
terápiás osztályai változatos összetételű sürgősségi
klinikai kémiai tesztpanelt tartanak szükségesnek
munkájukhoz. A gyors klinikai döntéshozatal érdekében
a vizsgálatok eredményére rövid leletátfordulási
időre van szükség, a tesztek egy részét már jelenleg
is POCT-műszerekkel végzik. Hogy a gyorsabb teszteredmény
valóban javítja a betegellátás klinikai eredményességét,
az inkább feltételezett, mint bizonyított.
Vérgázok
A vérgázanalízis tipikusan sokféle klinikai környezetben
alkalmazott POCT-eljárás. A sürgősségi
osztályokon a beteg gyors megítélése nagy előnyökkel
jár, hiszen a betegektől gyakran nem nyerhető
anamnézis, gyakran korábbi kezeléseikről szóló dokumentáció
sem áll rendelkezésre. A POC vérgáztesztek
alkalmazásával a vérgázeredményekhez való
hozzájutás ideje csökken, és bizonyíték vannak arra
vonatkozóan, hogy ezáltal nő a betegellátás klinikai
eredményessége.
Ionok
Az elektrolit-háztartás (Na + , K + , Ca ++ , Mg ++ )
POCT-módszerrel való megítélésének klinikai hasznossága
sürgősségi ambuláns, intenzív és műtétes
osztályok esetében bizonyított, elsősorban a TAT rövidülése
és a klinikai eredményesség fokozódása révén.
Vesefunkció: kreatinin, karbamid
Nem ajánlott sürgősségi osztályon lévő betegek
karbamid- vagy kreatininszint-meghatározását
POCT-módszerrel rutinszerűen végezni. Ugyanakkor
rutinszerűen alkalmazható cardiovascularis
diagnosztikai laboratóriumokban a karbamid vagy a
kreatinin meghatározása POCT-módszerrel, a POCT
ebben a környezetben javítja a betegellátás klinikai
hatékonyságát.
Vércukor, laktát
A kórházi környezetben POCT-módszerrel vég-

316 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
zett vércukor-meghatározás alkalmazása mellett vagy
ellen nincs elegendő bizonyíték. A laktát-POCT rutinszerű
alkalmazása intenzív, sürgősségi és műtétes
osztályok klinikusai számára ajánlott.
Cooximetria
Cooximetriának hemoglobinpigmentek egy időben,
több hullámhossznál mérő spektrofotometria
elvén való meghatározását nevezzük. Általában total
hemoglobin, oxigénszaturáció, oxihemoglobinfrakció,
karboxihemoglobin (HbCO) és methemoglobin
(MetHb) mérésére alkalmas. Rutinszerű alkalmazása
javasolt influenzaszerű tünetekkel vagy fejfájással
sürgősségi osztályra szén-monoxid-mérgezés gyanújával
felvett betegek szűrésére, methaemoglobinaemiás
betegeknél, sepsis kialakulásának monitorozásában.
POCT-alkalmazás hormonmeghatározásokra
A hormonmeghatározások általában nem tartoznak
a tipikusan POCT-módszerrel mérendő tesztek
közé, bizonyos klinikai alkalmazások (ectopiás terhesség
diagnosztikája, operatív beavatkozások) olyan
rövid TAT-ot igényelnek, amely a POCT-használat
mellett szólhat.
Vizelet-hCG
A hCG POCT eszközök alkalmasak lehetnek ectopiás
terhesség diagnosztikájára, de nem végeztek
összehasonlító vizsgálatokat központi laboratóriumi
módszerekkel. Nincs elegendő bizonyíték ahhoz,
hogy ajánlani lehessen a POC vizelet-hCG-mérő műszereket
ectopiás terhességben való alkalmazásra.
Intraoperatív-PTH meghatározás
A gyors PTH-teszt intraoperatív alkalmazása
klinikai előnyökkel járhat, ami a parathormon-
POCT-módszer bizonyos klinikai alkalmazások során
való bevezetését veti fel.
POCT-alkalmazás sürgősségi véralvadási vizsgálatokra
A sürgősségi és intenzív betegellátás területén
rövid TAT-igénnyel felvetődő véralvadási tesztek
POCT-módszerrel való meghatározásának bizonyított
klinikai hasznosságát megítélő National Academy
of Clinical Biochemistry irányelv főbb megállapításai
a hazai alkalmazások kialakítására vonatkozóan
is irányadók. Rendkívül fontos, hogy valamennyi
POCT alvadásmonitorozó készülékkel mért érték
egyformán jól reprodukálható és pontos legyen. A
POCT PI- és APTI-módszer bevezetése előtt az alkalmazó
intézmény feladata, hogy a POCT-módszerrel
mért értékek antikoaguláns terápia monitorozására
vonatkozó terápiás tartományait, döntési határértékeit
meghatározza, interpretálja azok központi laboratóriumi
hagyományos tesztekkel való összevethetőségét
és kialakítsa a POCT-vizsgálat helyét az
intézmény munkafolyamatában.
POCT-alkalmazás sürgős toxikológiai vizsgálatokra
A mérgezett beteg súlyos szervi dysfunctiók bekövetkezésének
lehetősége miatt intenzív terápiás ellátást
igényel, ennek része a mérgezést okozó ágens
kimutatása és koncentrációjának meghatározása.
Az ismeretlen anyaggal történt intoxikáció eseteiben
a sürgős toxikológiai vizsgálatok elsődleges célja
a diagnózis bizonyítása és a mérgező vegyület kiindulási
koncentrációjának megállapítása a terápia
követéséhez. A toxikológiai célra jelenleg elérhető
POCT-eszközök valamennyien immunoassay elvén
detektálják a vizsgált gyógyszer, gyógyszercsoport
jellegzetes metabolitjait, és szűrőmódszernek tekintendők.
Fontos ismerni más hatóanyag vagy gyógyszerszármazék
interferenciáját a POCT-tesztben. A
műszer cut-off-értékét (a döntési határ értékét) kiválasztásánál
mérlegelni kell. A cut-off körüli drogmennyiséget
tartalmazó minták negativitásának statisztikai
valószínűségét a gyártónak meg kell adnia,
olyan módon, hogy a nem laboratóriumi felhasználó
is felismerje a tévesen negatív eredményt.
A POCT-gyakorlat kialakításának szakmai
kérdései
Hol van szükség POCT-diagnosztika bevezetésére?
Valamennyi fekvőbeteget ellátó intézmény önállóan
dönt a POCT-vizsgálatok bevezetéséről. Indokolt lehet
minden olyan helyen, ahol a nagymértékben laboratóriumi
eredményen alapuló orvosi döntéshozatal
fokozott sürgősséget igényel és a klinikai-terápiás
beavatkozást késleltetné a nem helyszínen végzett
diagnosztikai teszt.
A POCT-vizsgálatok bevezetése előtt a következő
szempontok mérlegelendők:

Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) – A POCT diagnosztikus értékei, ...
317
• Van-e megalapozott klinikai igény POCTmódszerrel
végzendő laboratóriumi teszt bevezetésére?
• A bevezetendő POCT-módszer laboratóriumi
és klinikai szempontból egyaránt megfelelő-e?
• A bevezetendő POCT-módszer növeli-e a
betegellátás eredményességét klinikai, szervezési
vagy gazdaságossági szempontból?
• Mennyire költséghatékony a POCT-módszer a
hagyományos laboratóriumi teszthez képest?
• A kellő gyorsaság a már meglévő központi laboratóriumi
tesztekkel, azok átfutási idejének
csökkentésével biztosítható-e [a preanalitikai
idő csökkentése logisztikai átszervezéssel, a
hagyományos laboratóriumi vizsgálatok analitikai
időigénye és a posztanalitikai idő csökkentése
laboratóriumi információs rendszer (LIR)
fejlesztésével].
A POCT szükségességének eldöntését követően a
leginkább megfelelő készülék kiválasztására kell törekedni.
Ennek során feltétlenül figyelembe kell venni
azt, hogy a klinikai igény kielégítéséhez milyen analitikai
pontosságra, reprodukálhatóságra, ill. detektálási
határra van szükség.
Ki döntsön a POCT-diagnosztika szervezési kérdéseiben?
Azok a fekvőbeteg-ellátó intézmények, amelyek
POCT laboratóriumi vizsgálatokat alkalmaznak, az
intézmény minőségbiztosítási szabályozásának részeként
működő intézményi POCT-programban rögzítik
a POCT működtetésével kapcsolatos szabályozást.
A POCT-programnak tartalmaznia kell a következőket:
• A POCT-vizsgálatok helyét a fekvőbeteg-intézmény
laboratóriumi diagnosztikai stratégiájában.
Milyen diagnosztikai területen kívánja a
POCT-vizsgálatokat alkalmazni, és azok alkalmazása
mennyiben fejleszti az intézmény diagnosztikai
ellátását (gyorsaság, központi laboratóriumtól
távoli osztályok jobb ellátása stb.).
Tervet a POCT-vizsgálatok és a kórházi laboratórium
már alkalmazott módszereinek összehangolására.
• A POCT-vizsgálatok költségviselésének, esetleges
megosztásának meghatározását az adott
intézményben.
• A POCT-programba bevont egységek listáját, az
ott alkalmazott POCT-készülékekkel együtt.
• Fejlesztési tervet az intézményi POCTprogramra
vonatkozóan (milyen további tesztek
bevezetése szükséges osztályonkénti lebontásban,
költség-hatékonyság analízissel).
• Az intézményi POCT-rendszer szervezési és
minőségügyi kérdéseit:
- A döntéshozó és irányelvek megjelölése a bevezetendő
tesztek, műszerek és módszerek kiválasztásával
kapcsolatban.
- A vizsgálatokat végző és értékelő személyek
kijelölése, oktatásuk meghatározása.
- A POCT-eredmény/lelet dokumentálásának
módja.
- Vizsgálatok végzésének szakmai protokollja.
- A POCT-vizsgálatok végzésének és készülékek
minőségi kívánalmainak biztosítását
szolgáló dokumentumok (felelősök megjelölésével).
- A POCT-készülékek karbantartási protokollja.
- A POCT-vizsgálatok végzésének technikai
protokollja.
- A POCT-vizsgálatok minőségbiztosítási protokollja
(belső és külső minőség-ellenőrzés).
A POCT-vizsgálatok szakmai felelőssége
Ezek olyan különleges laboratóriumi vizsgálatok,
amelyek technikai kivitelezésében laboratóriumi
szakismeretekkel nem rendelkező egészségügyi szakszemélyzet
(orvosok, nővérek, intenzív osztályos aszszisztensek,
műtősnők stb.) is részt vehet.
A vizsgálatok minőségének ellenőrzése, a minőség
biztosítása a központi laboratórium vezetőjének
felelőssége, aki ezt megfelelő laboratóriumi szakszemélyzeten
keresztül biztosítja. Az egyéb laboratóriumi
vizsgálatokkal ellentétben a POCT-vizsgálatok
eredményei előzetes laboratóriumi orvosi validálás
nélkül kerülnek klinikai értékelésre. Ezért a megfelelő
(és kielégítően dokumentált) minőség-ellenőrzési
paraméterek mellett az egyedi vizsgálati eredmények
szakmai felelőssége - ha a vizsgálatot nem laboratóriumi
szakember végzi, hanem a betegellátó osztály
munkatársa - a betegellátó osztály vezetőjét terheli. A
POCT-mérőeszközök csak akkor használhatók, ha a
műszerek évenkénti független műszertechnikai ellenőrzését
elvégezték.

318 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A POCT-gyakorlat minőségbiztosítása
A POCT-diagnosztika hibaforrásai
A laboratóriumi eljárásokhoz hasonlóan a POCT-diagnosztika
is ugyanazokkal a - meghatározás preanalitikai,
analitikai és posztanalitikai fázisához
rendelhető - hibaforrásokkal terhelt. A POCT fő előnye
természetesen abban rejlik, hogy számottevően
csökkenti a leletátfordulási időt. Ugyanakkor számos
olyan vélemény is létezik, amely szerint a preanalitikai
fázisban a mintavétel, a mintatranszport,
valamint a posztanalitikai fázis adatközlési hibái is
eliminálódnak. Ez távolról sincs így, ezért a hibák kiküszöbölése
legalább akkora kihívás, mint a központosított
laboratóriumokban.
A POCT-folyamatban a következő hibák előfordulására
lehet számítani:
• A preanalitikai fázisban:
- A vizsgálat elrendelésekor nem megfelelő az
időzítés (pl. cardialis markerek, troponin,
mioglobin, CK-MB panelként kérése konfúziót
okoz).
- A minta nem a megfelelő betegtől származik,
vagy nincs meg a szükséges információ a beteggel
kapcsolatban.
- A minta gyűjtése nem megfelelő térfogatú, inkonzisztens
mintát eredményez.
• Az analitikai fázisban:
- A műszer kalibrációja nem megfelelő, ez különösen
a nem laboratóriumi képzettségű személyzet
miatt jelentkező veszélyforrás.
- Vizsgálati minta és reagens interakciójának
következtében: heterofil antitestek tévesen
negatív vagy pozitív értékeket eredményezhetnek
különösen az agglutinációval működő
meghatározásoknál. Az interferáló anyagok
jelenléte ugyan a laboratóriumi meghatározások
más típusait is befolyásolhatja, de a
POCT-diagnosztikában az eredményeket
szinte azonnal felhasználják a beteg kezelésében.
- Eredménygenerálás, az eredmény a módszer
kínálta határokon kívül található.
- Az eredmény nem validált, hiányos vagy nem
létezik minőség-ellenőrzés. A hagyományos
laboratóriumi gyakorlatban használt külső
minőség-ellenőrzési rendszerek csak módosításokkal
alkalmazhatók POCT-rendszerekre,
mivel az ún. „laboratóriumi típusú”
POCT-rendszerek mellett „cartridge” (mérőkazettás),
ill. „tesztcsík” alapú rendszerek is
léteznek.
• A posztanalitikai fázisban:
- A mérési eredmény értékelését, kezelését
nem megfelelő mértékegységben, referenciaérték
nélkül végzik.
- A kritikus értékek nincsenek jelezve, a döntéshozó
figyelmét semmi nem hívja fel, nincs
megfelelően dokumentálva. Mindkét esetben
a hibák csökkentése a POCT-készülék(ek) és
a beteg adatbázisának közvetlen informatikai
összekötésével oldható meg.
Rizikó-management a POCT területén
A POCT-diagnosztika biztonságát növelő számos
javaslat ellenére (College of American Pathologists,
National Institute of Health, USA, ISO) jelenleg az
irodalomban a leggyakrabban idézett veszélyforrások
a következők:
• A minőség-ellenőrzés végrehajtása és dokumentálása.
• Külső jártassági vizsgálatban nem kielégítő részvétel.
• Megfelelő helyesbítő eljárás megléte nem megfelelő
kontrollértékek esetén.
• A gyártó előírásainak maradéktalan betartása.
• Eljárás a mérés végrehajtására és az eredmény
közlésére.
• A kalibráció verifikálása háromhavonta, dokumentált
formában.
• A személyzet oktatásának és kompetenciájának
nyilvántartása.
• A személyzet folyamatos továbbképzésének
megvalósítása.
A POCT-gyakorlat minőségirányítási
rendszere
A POCT-diagnosztika minőségirányítási rendszerének
biztosítani kell a megbízható központi laboratóriumi
teszttel összevethető eredményszolgáltatást és
az ezt biztosítani tudó személyzet képzését, valamint
a műszerek kiválasztását, ellenőrzését. A minőségirányítás
a következő szempontokra terjed ki:

Száraz-kémiai fehérjekimutatások mint betegágy melletti gyorstesztek (POCT) – A POCT diagnosztikus értékei, ...
319
• Az új/alternatív POCT-készülékek, rendszerek
kiértékelése.
• A felhasználó javaslatainak és szakmai protokolljainak
kiértékelése.
• A műszerek beszerzési és installációs folyamatainak
ellenőrzése.
• Reagens- és fogyóanyag-beszerzések, karbantartások
gyakorlata.
• A POCT-kezelők folyamatos képzése, jogosítványhoz
juttatása és újravizsgáztatása.
• Minőségi kontrollok, minőségbiztosítás.
A POCT-vizsgálatok minőségének biztosítása
A vizsgálatok minőségének biztosítása és annak
ellenőrzése a laboratórium feladata. A minőség biztosítása
azonos alapelveken alapul, mint a laboratóriumban
elvégzett egyéb vizsgálatok minőségének
biztosítása. Módszerleírásokban kell rögzíteni a
POCT-vizsgálatok módszertani alapelveit, a módszer
korlátait, a kvantitatív mérés elvégzésének kritériumait,
analitikai és diagnosztikai érzékenységét
és specificitását. Meg kell határozni a kötelező belső
kontrollvizsgálatok gyakoriságát és a teendőket nem
elfogadható kontrollok esetén. Nyomon kell követni
a mérési bizonytalanságot, a visszavezethetőséget, és
dokumentálni kell a POCT-módszerrel és hagyományos
laboratóriumi módszerrel egyaránt mért paraméterek
egymással való. összevethetőségét.
A POCT-vizsgálatokat kötelező bevonni a külső
minőség-ellenőrzés körébe. POCT- és hagyományos
laboratóriumi vizsgálattal egyaránt végzett vizsgálatok
esetében minden kétséget kizáróan megállapíthatónak
kell lenni, hogy az adott külső minőség-ellenőrzési
eredmény melyik módszerrel készült. A
POCT-műszerek rendszeres, gyártó által előírt karbantartási
protokollját és a karbantartás elvégzésének
tényét dokumentálni kell. A laboratóriumi szakszemélyzetnek
a minőségbiztosítási feladatok ellátása
céljából mindenkor szabad bejárást kell biztosítani a
POCT laboratóriumi berendezésekhez.
A POCT-vizsgálatok kivitelezése, a vizsgálatokat
végző személyzet oktatása
POCT-vizsgálatot kizárólagosan erre kioktatott,
írásban felhatalmazott személyzet végezhet az előzetesen
engedélyezett, azonosítóval ellátott helyen, az adott
fekvőbeteg-ellátó intézmény POCT-szabályzatában
rögzített minőségügyi és módszerleírások alapján.
Az oktatást a laboratórium vezetője köteles megszervezni
és dokumentálni. Az oktatásba be kell vonni
az érintett klinikai osztályok vezetőjét is. Az oktatásnak
ki kell térni a POCT-berendezések biztonságos és
szakszerű használatára, a műszer korlátaira, a minta
típusára, a mérési interferenciákra, a műszer sajátságaiból
adódó interpretációs kérdésekre, a felhasználó
által elkövethető leggyakoribb hibákra, a minőségbiztosítás
kivitelezésére és a vizsgálatok elvégzése során
a személyzetet érintő veszélyforrásokra. Oktatni
kell az elvégzett vizsgálatok dokumentálásának módját.
Fontos a kapott POCT-eredmények értékelésének
és alarm értékek esetén a teendők meghatározásának
oktatása. Az oktatást (oktató, résztvevők) írásban dokumentálni
kell, és meg kell határozni a kapott „jogosítványok”
érvényességi idejét és az újraoktatás időpontját.
A POCT-vizsgálatok adatkezelése
A POCT-vizsgálatokat a laboratóriumi vizsgálatokkal
azonos módon kell dokumentálni. Az eredményről,
leletről másolatot kell készíteni a laboratórium
számára, és azt a laboratóriumi informatikai
rendszerben (LIR) rögzíteni kell (a betegeredmények
követhetősége, OEP-elszámolás érdekében) olyan
módon, hogy a POCT-mérések egyértelműen elkülöníthetők
legyenek a hagyományos laboratóriumi
tesztektől (pl. a mérést végző, ill. elfogadó személy
kódjának feltüntetésével).
Irodalom
Casagranda, I.: Point-of-care testing in critical care:
the clinician’s point of view. Clin. Chem. Lab. Med.
48(7):931–934, 2010.
Cowie, M. R.: Clinical applications of B-type natriuretic
peptide (BNP) testing. European Heart Journal
24:1710–1718, 2003.
Di Serio, F.: Integration between point-of-care cardiac
markers in an emergency/cardiology department and
the central laboratory: methodological and preliminary
clinical evaluation. Clin. Chem. Lab. Med. 43(2):202–
209, 2005.
Monteny, M.: Point-of-care C-reactive protein testing in
febrile children in general practice. Clin. Chem. Lab.
Med.44(12):1428–1432, 2006.
Morrow, D. A.: National Academy of Clinical Biochemistry
Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical
Characteristics and Utilization of Biochemical Markers

320 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
in Acute Coronary Syndromes. http://www.clinchem.
org/cgi/doi/10.1373/clinchem.2006.084194
Nichols, J. H. (ed.): Laboratory Medicine Practice Guidelines
Evidence-Based Practice for Point-of-Care Testing.
American Association for Clinical Chemistry. 2006.
Nichols, J. H.: Executive summary. The National Academy
of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice
Guideline: Evidence-based practice for point-of-care
testing. Clinica Chimica Acta 379:14–28, 2007.
Pfäfflin, A.: Inflammation markers in point-of-care testing
(POCT). Anal. Bioanal. Chem. 393:1473–1480,
2009.
Plebani, M.: Does POCT reduce the risk of error in laboratory
testing? Clinica Chimica Acta 404:59–64, 2009.
Price, C. P.: Improving healthcare accessibility through
point-of-care technologies. Clin. Chem. 53:1665–1675,
2007.
Zaninotto, M.: PATHFAST NT-proBNP (N-terminal-pro
B type natriuretic peptide): a multicenter evaluation
of a new point-of-care assay. Clin. Chem. Lab.
Med. 48(7):1029–103, 2010.

Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban
321
Fehérjék mint tumormarkerek
az orvosi laboratóriumokban
Kőszegi Tamás
A tumormarkerek jellemzői
A tumormarker definíciója
Tágabb értelemben a daganatos állapotot jelző minden
olyan eljárás, molekulakimutatás, amely segíti a
klinikust a daganatos betegséggel kapcsolatos kérdések
megválaszolásában és az orvosi döntések meghozatalában.
Szűkebb értelemben az emberi szervezetből
vett mintákban olyan molekulák és/vagy
folyamatok nyomon követését jelenti, melyek menynyiségi
és minőségi változásai összefüggésbe hozhatók
a daganatmegelőző állapotokkal, ill. a már kifejlődött
tumoros megbetegedéssel.
A tumormarkerek alapvetően két csoportra oszthatók:
• Elsődleges (primer) markerek. Olyan molekulák,
amelyeket a daganatsejtek termelnek, és menynyiségi
változásuk a vérből vagy a daganatszövetből
kimutatható. Szerkezetük szerint igen
sokfélék lehetnek: fehérjék, kis molekulatömegű
hormonok, nukleinsavak stb. A daganatos sejtek
sokszor „nem felejtenek”, azaz részlegesen
differenciálódnak azzá a szövetté, amelyből
transzformálódtak, és képesek sok olyan molekula
termelésére, amelyet az eredeti szövet is
produkált. Így alakulnak ki pl. a hormontermelő
tumorok vagy a plazmasejtes daganatok
(myeloma malignum).
• Másodlagos (szekunder) markerek. A tumor
növekedési sajátságaiból és a szervezet válaszreakcióiból
származó molekulák. Elvben bármilyen
mérhető laboratóriumi paraméter felfogható
szekunder markernek. Néhány példa: a
csontrendszert érintő folyamatoknál kalcium,
kollagén-keresztkötések, epeút-elzáródásakor
bilirubin, alkalikus foszfatáz, γ-GT, kiterjedt
daganatoknál leukocytosis, thrombocytaszám, a
CRP emelkedése stb. Ezek a paraméterek egyáltalán
nem daganatspecifikusak, de jelzik a
szervezet érintettségét.
Általános szempontok
A malignus transzformáció során szinte kivétel nélkül
egyetlen sejt alakul át korlátlan osztódásra alkalmas
állapotba. A transzformáció a sejt genetikai
anyagának finom változásait jelenti (különböző mutációk,
idegen nukleinsav beépülése, a DNS károsodása,
kromoszómarendellenességek), egyszerre több
változásnak is be kell következnie. Mindezek összességükben
az egész genom információtartalmához képest
elenyészően kicsiny eltérések, így amennyiben a
transzformált sejt túlél, az átírt géntermékek (fehérjék)
gyakorlatilag alig különböznek a kiindulási sejt
fehérjéitől. A különbség az egészséges és a daganatos
sejtek közt elsősorban a transzkripció megváltozásában
rejlik, azaz a malignus sejtekben a sejtosztódást
szabályozó fehérjék mennyiségi eltolódása következik
be. Így válhatnak pl. a normálisan is átíródó proonkogének
valódi onkogénné. A valóság természetesen
ennél sokkal bonyolultabb, de annyi bizonyos, hogy
a daganatsejtekben elsősorban a szintetizálódott fehérjék
mennyiségében és nem minőségében jön létre
változás.
A másik fontos szempont a daganatsejtek kimenekülése
a szabályozási folyamatok alól. Érvényes ez a
növekedési sajátosságokra (invazív növekedés) és az
általuk termelt biológiailag aktív molekulákra (növekedési
faktorok, hormonok). A visszacsatolási folyamatok
(feedback) a tumoros szöveteknél nem
működnek, a daganatsejtek autonóm módon megtermelik
a saját szaporodásukhoz szükséges növekedési
faktorokat (pl. parakrin vagy autokrin szekrécióval),
ill. a szervezet szükségleteitől függetlenül szintetizálják
és szekretálják a hormontermészetű molekulákat.
Sajátos mechanizmus működik myeloma multi plex
esetében, itt a kóros plazmasejtté transzformálódott
klón nem csak korlátlan szaporodásra képes, de
kontrollálatlan immunglobulin-szekrécióra is. A
transzformáció érinti az immunglobulin géneket is,
a szintetizált termékek nem töltenek be hasznos védőfunkciót
(paraproteinek), és az esetek egy részében
nem is a teljes molekula termelődik, hanem annak
egy lánca (nehézlánc-betegség, Bence-Jones-fehérje
vagy szabad könnyűlánc).
A fehérje természetű primer tumormarkereknél
nagy jelentőségűek a poszttranszlációs mechanizmusok.
A megszületett fehérjék intracellulárisan vagy a

322 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
keringésben módosulnak, a leggyakrabban cukrokkal
lépnek kapcsolatba. Nagyon sok tumormarker
glikoprotein vagy ún. mucingazdag protein, és módosult
szerkezetük különbözhet az egészséges sejtekben
termelt hasonló fehérjékétől.
Az orvosi terminológiában szokás a markereket tumorantigéneknek
is nevezni. Ez általában helytelen,
mert legtöbbjük az egészséges sejtekben is megtalálható
gének produktuma, így a szervezet számára nem
antigén sajátságú. Amennyiben a markerek valóban
antigének lennének, az immunrendszer képes lenne
hatékonyan védekezni a daganatsejtek ellen. Létezhetnek
azonban valódi, ún. neoantigének is, amelyek
mutáció vagy poszttranszlációs módosulás következtében
ténylegesen különböznek a normális génproduktumoktól.
A tumorantigén kifejezés onnan ered
és arra utal, hogy ha a tisztított tumormarkerrel egy
idegen fajt (leggyakrabban egér, nyúl, kecske stb.) immunizálunk,
akkor a beoltott állat specifikus immunglobulinokat
termel a beadott antigén ellen. Az állati
eredetű, tisztított antitestek felhasználhatók a tumormarker
kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására.
Peptid-fehérje tumormarkerek
A fehérje természetű tumormarkerek
extracelluláris térbe kerülésének
mechanizmusa
A sejtekben szintetizálódott fehérjék alapvetően kétféle
funkciót tölthetnek be:
• Szerepük a sejten belül van, pl. struktúrfehérjék
vagy a metabolizmusban vesznek részt.
• Funkciójukat az extracelluláris térben töltik be
(pl. véralvadási faktorok, albumin).
A primer tumormarkerek jelentős hányada peptid-fehérje
természetű és az első csoportba tartozik.
Ezért elsődlegesen akkor kerülnek ki az extracelluláris
térbe, amikor a daganatsejtek elpusztulnak. A malignus
sejtekre jellemző a fokozott turnover, a rövid
generációs ciklus, pusztulásuk elsősorban nekrózissal
történik a szervezet védekezése, a daganat esetleges
rossz vérellátása vagy éppen a terápiás beavatkozások
következtében. Mindezek ellenére a második típusú
mechanizmus is előfordul, ilyenkor a malignus sejtek
a markereket aktívan szekretálják (pl. peptidhormonok,
paraproteinek). A szisztémás keringésbe jutó
markerek egy része a vizeletben is megtalálható, ép
vesefunkciónál csak az albuminnál kisebb (filtrációs
küszöb alatti) molekulák, károsodott veséknél akár
teljes immunglobulinok is a vizeletbe kerülhetnek.
Az extracelluláris térbe kerülést befolyásoló egyéb tényezők
A tumormarkerek vérszintjét a fentieken kívül
még egyéb tényezők is befolyásolják (11-35. táblázat).
Az ideális fehérje természetű tumormarker jellemzői
1. Legyen specifikus, vagyis csak malignus folyamat
esetében legyen kimutatható.
2. Legyen kellően érzékeny, hogy a daganatos folyamatot
minél koraibb stádiumában jelezze.
3. Legyen szövet/sejt specifikus.
4. Vérszintje korreláljon a tumorsejtek mennyiségével.
5. Legyen jósló (prediktív, azaz maximális előrejelző)
értéke.
6. Legyen megbízhatóan mérhető.
Sajnos az eddigiekben vázoltak alapján az első három
pontban felsorolt követelmények nem teljesülnek
maradéktalanul. A laboratóriumi vizsgálatoknál
11-35. táblázat. Tumormarkerek vérszintjét befolyásoló mechanizmusok
Meghatározó tényező
produkció
szekréció
a szövet vérellátása
szövetszétesés
elimináció
Mechanizmus
a szintézis sebessége a sejtben
a sejtből való kiáramlás sebessége (aktív vagy passzív folyamatok)
oxigenizációs, nutritiós tényezők
a sejt-turnover sebessége, terápiás beavatkozások
a külvilág felé (pl. vizelet útján) vagy természetes metabolizmussal

Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban
323
ismert, hogy egy módszer diagnosztikai specificitása
és szenzitivitása gyakorlatilag sohasem éri el a 100%-
ot; ha a diagnosztikus küszöbérték változtatásával
növeljük a szenzitivitást, akkor csökken a specificitás
és fordítva. Mindennek oka az, hogy az egészségesekre
jellemző referenciatartomány átfedést mutat a betegekre
jellemző patológiás tartománnyal.
Tovább bonyolítja a helyzetet, hogy a legtöbb marker
referenciatartománya az egyénre jellemző és ebben
az örökletes tényezőkön kívül életmódi szokások
(pl. dohányzás) is szerepet játszhatnak. A tumormarkerek
jelentős hányada ezen kívül nem szövetspecifikus,
vagyis ugyanazt a markert többféle daganatsejt is
termelheti.
Ugyanakkor a felsorolás utolsó három feltétele jórészt
teljesül. A vérszint jó korrelációt mutat a malignus
sejtek számával, vagyis a daganat tömegével. Itt
jegyzendő meg, hogy a mai érzékeny analitikai módszerekkel
is kb. 1 g tumormassza (kb. 10 9 sejt) szükséges
ahhoz, hogy a vérbe kihíguló marker mennyisége
detektálható legyen. A prediktív értékről, a klinikai
felhasználásról és a mérési technikákról a fejezet későbbi
részeiben lesz szó.
A peptid-fehérje tumormarkerek felosztása és jellemzői
• Onkofötális markerek
CEA, carcinoembryonalis antigén
Normálisan az embrionális életben termelődő sejtfelszíni
glikoprotein, a sejtadhézióban tölt be fontos
szerepet. A születés után szintézise gyakorlatilag a
kimutathatóság határára csökken. Felnőttekben először
emésztőrendszeri daganatoknál mutatták ki
emelkedett vérszintjét, az lLszelektin és az E-szelektin
ligandja, szerepe valószínűleg a metasztázisok kialakulásában
fontos. Colontumoron kívül gyomor-,
hasnyálmirigy-, tüdő-, emlő- és medullaris carcinoma
markere is lehet, típusos példáját adva annak a
ténynek, hogy a markerek jelentős része nem szövetspecifikus.
Nem tumoros folyamatokban is emelkedett
lehet: erős dohányosoknál, gyulladásos bélbetegségekben,
májcirrhosisban.
AFP, a-fötoprotein
Szintén a magzati életben, az embriózsák és a máj
által termelt fehérje, amely ekkor az albuminhoz hasonló
funkciót tölt be. 591 aminosavból álló glikoprotein,
felnőttkorban szintézise minimálisra csökken,
funkciója ismeretlen. Az AFP több izoformában
fordul elő a keringésben. Rutinszerű meghatározásakor
az összes (total) AFP mennyiségét mérjük, de ma
már lehetőség van az L3-forma szelektív mérésére is.
Az L3 részesedése a total AFP-ből (L3%) prognosztikai
marker: minél nagyobb az L3 százaléka, annál
nagyobb a májcarcinoma kifejlődésének kockázata és
a rossz prognózis lehetősége. Az AFP-értékek emelkedettek
hepatocellularis carcinomában és csírasejtes
(de nem seminoma) daganatokban. Krónikus, nem
malignus májbetegségekben is emelkedett az AFP
(krónikus hepatitis, májcirrhosis).
• Hormonok
Kalcitonin
32 aminosavból álló polipeptid, a pajzsmirigy parafollicularis
sejtjeiben (C-sejtek) termelődik. Emelkedett
szérumszintet mutat a pajzsmirigy medullaris
carcinomájában, a CEA markerrel együtt.
PTH, parathormon
84 aminosavból álló polipeptid, a mellékpajzsmirigy
sejtjei termelik. A mellékpajzsmirigy adenomájában
vérszintje megemelkedik (primer hyperparathyreosis).
Primer folyamatoknál előfordul, hogy
ectopiás (nem a célmirigyben, hanem azon kívüli)
hormontermelés jön létre. A sebészi eltávolítás során
lehetőség van ún. intraoperatív PTH-meghatározásra,
mert a PTH féléletideje a periférián 4 perc. Sikeres
műtéti beavatkozás után a PTH-szintnek a referenciatartományba
kell visszatérnie.
PTH related protein, parathormonszerű fehérje
A PTH-hormoncsaládhoz tartozó fehérje, fiziológiásan
a csontrendszerre és az emlőmirigy fejlődésére
hat endokrin, parakrin, autokrin mechanizmusokkal.
Emelkedett vérszintje többféle malignus tumorhoz
társulhat: emlő-, tüdő laphámsejtes carcinoma. A
hormont szekretáló daganatok esetében a szérumkalciumszint
megemelkedik, gyakran ez a jelenség hívja
fel a figyelmet a malignus folyamatra (paraneoplasiás
tünet).
β-hCG, β humán koriongonadotropin
A hCG elsődlegesen terhesség alatt termelődik
nagy mennyiségben, először a fejlődő embrió, később
a placenta által. A hCG 244 aminosavból álló dimer
(α- és β-alegység), az α rész az LH, FSH és TSH hasonló
alegységével azonos. Csírasejtes tumorok és
trophoblastrendellenességek (mola hydatidosa, choriocarcinoma)
esetében a β-alegység vérszintje igen

324 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
magas lehet. Fontos a β-alegység szelektív mérési
lehetősége – monoklonális antitestekkel –, hogy az
esetleges keresztreakciókat az LH, FSH, TSH hormonnal
elkerüljük.
• Enzimek
PAP, prostata savi foszfatáz
Mérésének ma már nincs különösebb jelentősége,
mert a PSA-vizsgálat lényegesen több információt ad.
PSA, prostataspecifikus antigén
34 kDa tömegű szerin típusú proteáz, amely gyakorlatilag
csak a prostatában termelődik. Feladata az
ondó elfolyósodásának és a cervicalis nyák feloldásának,
így a megtermékenyítésnek az elősegítése. A
PSA a vérben szérumfehérjékhez kötött és nem kötött,
úgynevezett szabad PSA (fPSA) formában van
jelen. Ma már lehetőség van külön a total PSA (tPSA)
mérésére, ahol mindkét formát detektáljuk és külön
az fPSA meghatározására. FPSA-mérést csak akkor
végzünk, ha a tPSA meghaladja az adott életkorra
jellemző referenciatartomány felső határát. Az fPSA/
tPSA arány számításának külön információs értéke
van, kóros tPSA és 25% alatti fPSA arány malignus
folyamatot valószínűsít, míg 25% feletti arány esetében
inkább jóindulatú prostatahypertrophia jön szóba.
A prostata betegségein kívül a PSA ritkán emelkedett
lehet emlő, tüdő, méh- és vesedaganatoknál is.
• Mukoprotein markerek (CA)
CA 15-3
Nagy molekulatömegű, mucinban gazdag fehérje,
amely megtalálható egészséges és daganatos szövetek
hámsejtjeiben (emlő, bél, tüdő, petefészek, hasnyálmirigy).
A MUC 1 gén terméke, glikoprotein,
amelynek glikozilációja malignus folyamatokban az
egészségesre jellemzőtől eltérő lehet. Monoklonális
antitestekkel a CA 15-3 detektálható és mennyiségileg
meghatározható. Elsősorban emlőtumorban alkalmazzuk.
CA 125
A MUC 16 gén terméke, glikoprotein. Funkciója
elsődlegesen a hámsejtek védelme pl. a cornea, a
tüdő és a női nemi szervek esetében a kórokozókkal
és a kiszáradással szemben. Malignus folyamatokban
elsősorban petefészekrákban találhatunk emelkedett
értékeket. Emellett ritkán más tumoros állapotban
is jelezhet (tüdő, emlő, bélrendszeri stb.). Kismértékű
vérszintnövekedést láthatunk a hasüregben zajló
benignus gyulladásos folyamatoknál, egyéb petefészek-rendellenességeknél
és terhességben.
CA 19-9
Glikoprotein, nagy sziálsavtartalommal (másképpen
sziálsavas Lewis (a) antigén). A hasnyálmirigy, a
gyomor és a vastagbél daganatsejtjeinek adhézióját
segíti. Gyakran negatív eredményt ad daganatos betegségben
és hamis pozitívat benignus folyamatokban,
pl. az epevezeték és a máj betegségeiben.
CA 72-4
Más néven tumorasszociált glikoprotein (TAG 72).
Nagyon nagy molekulatömegű, mucinban gazdag fehérje,
amelyet sokféle malignus tumorban kimutattak
(emlő, vastagbél, hasnyálmirigy, gyomor). Jelenleg a
gyomordaganatoknál vizsgálják klinikai használhatóságát,
mert a gyomortumorok gyakran nem szekretálnak
markereket (némák). Benignus folyamatoknál
is emelkedhet a vérszintje (pl. krónikus májkárodosás,
benignus ovariumdaganatok).
• Egyéb fehérje markerek
CYFRA 21-1
Citokeratin 19 fragmens, 30 kDa molekulatömegű.
A citokeratinok az intermedier citoszkeleton filament
családba tartoznak, a hámsejtekre jellemzőek. A daganatos
sejtekből (pl. nekrózis következtében) kiszabaduló
filamentek degradálódnak és így kerülnek
a keringésbe. A CYFRA 21-1 nevű fragmens meghatározása
a nem kis sejtes tüdődaganatoknál a legeredményesebb,
jóllehet figyelembe kell venni, hogy
benignus légzőrendszeri betegségekben és más malignus
daganatokban is emelkedett vérszinteket találhatunk
(urológiai, nőgyógyászati, emésztőrendszeri
daganatok).
TPA
Szöveti polipeptid-antigén. Keringő fehérjekomplexek,
amelyeket a citoszkeleton 8-as, 18-as és 19-es
citokeratin komponensének degradációs termékei alkotnak.
A citokeratinok minden hámsejtben megtalálhatók,
így a hámsejt eredetű tumorokban is (tüdő,
emlő, bél, hólyag).
A fokozott sejtproliferáció jelzője, univerzális tumorasszociált
antigénnek tekinthető. Felezési ideje
egy nap, ebből következően gyorsan és érzékenyen
jelzi a tumoros folyamatok változását.
β 2
-mikroglobulin
Az MHC I. osztályú hisztokompatibilitási antigén
része, minden magvas sejt felszínén megtalálható.

Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban
325
Myeloma malignum esetében a kóros plazmasejtklónból
fokozott mértékben kerül a keringésbe részben
a sejtek elhalása, részben aktív szekréció által, így
a betegség aktivitását tükrözi. Kis molekulatömegű,
ezért a vese filtrálja, de ép veseműködésnél a tubulusokból
reabszorbeálódik.
Tireoglobulin (Tg)
660 kDa tömegű fehérje, a pajzsmirigy sejtjei termelik,
részt vesz a tirozin jodinálásában és a kész
pajzsmirigyhormonok tárolásában. Vérszintje a működő
pajzsmirigyszövet mennyiségével arányos, ezért
tumor miatti pajzsmirigy-eltávolítás után – amennyiben
a műtét sikeres volt – szérumkoncentrációjának a
kimutatási határ alá kell csökkennie. Mindezek alapján
a Tg-t tumormarkernek is tekintjük.
Ferritin
A ferritin óriásmolekula, alapvető funkciója a felszívódott
vas tárolása és leadása a szervezet vasszükségleteinek
megfelelően. Elsősorban a májban és a
bélhámsejtekben termelődik, vérszintje a vasraktárak
telítettségét tükrözi. Emelkedett ferritinszintet találtak
emlő-, máj-, vese- és néhány hematológiai malignitás
esetében, a vasstátustól függetlenül. Feltételezhető,
hogy a tumoros sejtek fokozott szétesése vagy
aktív ferritinszekréciója miatt emelkedik a ferritinkoncentráció
a vérben, de nem kizárt a daganatos betegséget
kísérő gyulladásos válaszreakció sem (akut
fázis fehérje). Mindent együttvéve a ferritin az egyik
legkevésbé specifikus tumormarkernek tekinthető.
Timidin-kináz
Két izoformája fordul elő, az 1-es és a 2-es. Katalizálják
a timidin foszforilálódását. A TK1 citoplazmatikus
lokalizációjú és aktivitása a sejtciklust követi,
ezért szérumkoncentrációja arányos a sejtproliferáció
mértékével. E sajátságának köszönhetően tumormarkerként
is alkalmazható különböző lymphomákban
és leukaemiákban, ill. szolíd tumorokban is (kissejtes
tüdő-, prostata-, emlő-, colorectalis carcinoma, laphámsejtes
fej-nyaki rákok) önállóan vagy más markerekkel
kombinálva.
S100 protein
Kalciumkötő, kisméretű fehérjecsalád, számos
sejtfunkció szabályozásában vesz részt. a- és b-alegységek
különböző kombinációiban fordul elő, eredetileg
az agyban mutatták ki, vérszintje egészségesekben
alacsony, de agysérülések, idegsebészeti beavatkozások,
agyi hypoxia következtében megemelkedik. Az
a-b alegységgel jellemezhető proteint a melanomasejtek
is szintetizálják, így az a melanoma malignum
tumormarkerének is tekinthető. Sajnos kezdeti stádiumban
a vizsgálat nem mutat kellő szenzitivitást, a
progresszióval azonban klinikai jelentősége nő. Meghatározható
külön az S100B protein is, a b-alegység
ellen termeltetett antitest segítségével.
HE4, humán epididymisprotein-4
Az ovarium hám eredetű, serosus malignus tumoraiban
szekretált glikoprotein, amelynek expressziója
a transzformált sejtekben megnő. Benignus folyamatokban
és cystákban vérszintje nem vagy alig emelkedik,
ezért érzékenyebb markernek tekinthető a Ca
125-nél. A legjobb eredmény akkor várható, ha a két
marker meghatározását együttesen használjuk a betegek
követésekor.
A neuroendokrin rendszer fehérje markerei
Lásd A fehérjék, mint neuroendokrin hormonok a
klinikai laboratóriumi kutatásokban című fejezetben.
Tumormarkerek használata az orvosi
gyakorlatban
Szűrés
A legtöbb marker specificitása és szenzitivitása túl
alacsony ahhoz, hogy a daganatos betegséget korai
stádiumban jelezze. Ezért a tumormarkerméréseket
szűrésre nem alkalmazzuk, néhány kivételtől eltekintve.
A kalcitoninmeghatározást akkor végezzük ilyen
célból, ha a beteg családjában már volt medullaris
carcinoma betegség, mert családi halmozódás előfordulhat.
A kalcitoninmérés érzékenysége és fajlagossága
ilyen esetben megközelíti a 100%-ot.
A tPSA-meghatározást általában 50 éves életkor
felett széles körben alkalmazzák szűrésre. A felső küszöbértéket
(nálunk ez általában 4,0 ng/ml) meghaladó
eredmény esetében az fPSA-mérést is elvégezzük.
A módszer szenzitivitása és specificitása meghaladja
a 90%-ot, jóllehet rengeteg tanulmány foglalkozik a
PSA-teszt klinikai eredményességével, és sokan megkérdőjelezik
annak hatékonyságát.
Egy biztos: sohase feledjük, hogy a tumormarkerméréseket
ki kell egészíteni más vizsgálóeljárásokkal
(pl. fizikális, képalkotó, szükség esetén biopszia).

326 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Diagnózis felállítása
Tumormarker-eredmény alapján sohasem szabad
definitív diagnózist megállapítani. Ennek oka nem
csak a markerek eddig felsorolt biológiai korlátja, hanem
jónéhány analitikai interferenciával és következetes
hamis eredménnyel is számolhatunk. A betegek
egy részében a rheumafaktor titere magas lehet, vagy
rendelkeznek heterofil állati immunglobulin-ellenes
antitestekkel. Sok betegben autoimmun folyamat
eredményeként magas az anti-Tg autoantitest menynyisége
a vérben. Ilyenkor az endogén antitestek a
tumormarker-meghatározás során alkalmazott immunoassay-kben
interferálhatnak a módszerrel és
hamisan alacsony vagy magas értéket eredményezhetnek.
A tumormarkermérések valójában inkább
megerősítő jellegűek, jóllehet elsősorban a neuroendokrin
rendszer daganataiban az első, tumort valószínűsítő
észlelet gyakran a nagy biológiai hatást kifejtő
hormon szintváltozásának kimutatása. Azonban
itt is egyéb megerősítő vizsgálatokat kell végezni. A
helyzetet nehezíti, hogy a neuroendokrin tumorok általában
igen kis méretűek és kimutatásuk képalkotó
eljárásokkal nehéz.
A betegség és a terápia követése (monitorozás)
A tumormarkermérések klinikailag legjobban alátámasztott
területe a monitorozás. Ennek legfőbb
oka, hogy a markerek vérszintje és a tumorsejttömeg
viszonylag jó korrelációt mutat egymással. A követéses
vizsgálat legfontosabb szempontjai:
• Mindig legyen kiindulási, a terápia megkezdése
előtti markerszint az összehasonlíthatóság érdekében.
• Annyiféle markert monitorozzunk, amennyi
biológiailag és technikailag lehetséges, a markerkombinációk
több esetben lényegesen emelik
a szenzitivitást.
• A monitorozás gyakoriságát általában nem a
marker féléletideje határozza meg, hanem a
betegség súlyossága és az alkalmazott terápia
intenzitása.
• A markereket mindig ugyanabban a laboratóriumban
és ugyanazzal a módszerrel monitorozzuk,
mert az eredmények sokszor készülék- és
módszerfüggők.
• Eredményes terápia során átmeneti markerkoncentráció-növekedés
is lehet a fokozott sejtpusztulás
következtében.
• A követés során, amennyiben konzekvens markerszint-emelkedést
észlelünk (akár a referenciatartományon
belül), a relapszus lehetősége
fennáll
Prediktív érték
A követéses vizsgálatoknál a tumormarker-vizsgálatoknak
mind a negatív, mind a pozitív prediktív
(jósló) értéke jónak mondható, azonban függ az adott
marker diagnosztikai érzékenységétől és specificitásától.
Az 11-74. ábrán egy metasztatikus emlődaganatban
szenvedő nő CA 15-3 és CEA értékeinek követését
látjuk.
A referenciatartományon belüli növekedés jelzi
a relapszust, a terápia során átmeneti markerszint-emelkedés
látható. A terápia kezdeti sikerét a
markerkoncentráció csökkenése jelzi, majd az újabb
relapszust a meredek emelkedés. A nagy markerkoncentrációk
a betegség kedvezőtlen prognózisát jelzik
(pozitív prediktív érték).
A tumoros állapotra jellemző peptid-fehérje spektrum
kutatása az elválasztási módszerek és a tömegspektrometria
fejlődésével egyre inkább előtérbe
kerül. Különösen az albuminnál kisebb méretű, gyakran
a fehérjék degradációja során kialakult peptidek
mutatnak az egészséges egyénekétől eltérő mintázatot.
Erről az ígéretes módszerről a tömegspektrometriát
tárgyaló fejezetekben olvashatnak.
11-74. ábra. Emlőtumoros beteg követése

Fehérjék mint tumormarkerek az orvosi laboratóriumokban
327
Irodalom
Koprowski, H., Herlyn, M., Steplewski, Z. et al.: Specific
antigen in serum of patients with colon carcinoma.
Science 212(4490):53-55, 1981.
Ugorski, M., Laskowska, A.: Sialyl Lewis a: a tumor-associated
carbohydrate antigen involved in adhesion and
metastatic potential of cancer cells. Acta Biochimica
Polonia 49(2): 303–311, 2002.
Perkins, G. L., Slater, E. D., Sanders, G. K. et al.: Serum
tumor markers. Am. Fam. Physician 68:1075-1082,
2003.
Diamandis, E. P., Fritsche, H. A., Lilja, H. et al. (eds):
Tumor Markers: Physiology, Pathobiology, Technology,
and Clinical Applications. AACC Press, 2002.
Hanausek, M., Walaszek, Z. (eds.): Tumor marker protocols.
Humana Press, 2010.
https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.
php?products_id=12676
http://tlc.istep.org.tw/ntu/Stream/nano/sec11/%E5-
%A5%88%E7%B1%B3%E7%94%9F%E7%89%A9-
%E6%8A%80%E8%A1%93_3.pdf

328 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Cardialis markerek
laboratóriumi diagnosztikája
és információs értéke
a klinikumban
Ludány Andrea, Kőszegi Tamás
Az akut myocardialis infarctus diagnózisa
A cardialis laboratóriumi markerek szerepének megítélése
egyre nagyobb hangsúlyt kap a mellkasi fájdalmak
és az akut coronaria-szindrómára gyanús
esetek diagnosztikájában, a rizikó (a veszélyeztetettség)
megállapításában és a sikeres kezelésben. Nehéz
a „klinikai diagnózis”, ha a betegség klinikai jelei
hiányoznak, mint pl. az ún. tünetmentes akut coronaria-szindrómában.
A legtöbb betegben a kezdeti
EKG sem diagnosztikus értékű. Ez magyarázza, hogy
a későbbiekben szívinfarctusnak nem bizonyult és
osztályra felvett betegek nagy számával ellentétben, a
fel nem ismert esetek száma ma is 1,5-2,0%-ra tehető
a nemzetközi adatok szerint.
A ma érvényes amerikai és európai kardiológiai
útmutatóban (ACC és ESC) az akut myocardialis infarctust
(AMI) egybehangzóan újradefiniálták. E szerint
a szívmarkerek és főként a cardialis troponin az
akut myocardialis infarctus új definíciójának középpontjába
került.
Az akut myocardialis infarctus diagnózisa most, az
útmutató szerint a következő kritériumok egyikén
alapul:
1. A cardialis biomarkerek (lehetőleg a troponin)
szintjének emelkedése, csökkenése vagy mindkettő;
legalább egy értéknél a felső referenciahatárt
meghaladóan, és a felsoroltak közül legalább egy, a
myocardialis ischaemiára utaló nyilvánvaló jellel:
• Ischaemiás tünetek.
• Az EKG-n új patológiás Q-hullám.
• Ischaemiás EKG-változások (új ST-T vagy új bal
szárblokk).
• Új nyilvánvaló változások a képalkotó vizsgálatnál.
2. A percutan coronariabeavatkozás során az eredetileg
normál troponin alapérték a referencia felső
határérték több mint háromszorosára emelkedése.
3. Hirtelen váratlan szívhalált megelőző típusos klinikai
tünetekkel, EKG-jelekkel vagy a coronaria angiográfia/bonclelet
friss thrombosis igazolásával.
4. A myocardialis infarctus patológiai elváltozásai.
Az eredeti WHO beosztástól az AMI új definíciója
szignifikánsan különbözik. Azt a beteget, akinek
emelkedett troponin értéke van negatív CK-MB
mellett, korábban instabil anginaként diagnosztizálták
(minor myocardialis károsodásként), ma mint
non-ST-szegment emelkedést, myocardialis infarctusként
diagnosztizálják (NSTEMI) még akkor is,
ha hiányoznak az EKG diagnosztikus jelei. Az új
standardok alkalmazása a myocardialis infarctus
definíciójában jelentős előrelépést jelent a cardialis
biomarkerek használatában. Gondoljunk például a
sürgősségi betegellátásra akut coronaria-szindróma
gyanúja esetén.
Az instabil anginával és az AMI-val foglalkozó
kórélettani tanulmányok közös patológiás utat állapítottak
meg, amely az érfali plaque (felrakódás) akut
felszakadásával kezdődik. A thromboticus események
sorozata vezet végül a thrombus kialakulásához.
Az infarctus vagy ischaemia ezt követő klinikai eseményei
az elzáródás mértékétől és a kollaterális vérátáramlás
(ha van egyáltalán) jelenlététől függnek.
Kórélettani tényekre támaszkodva az akut coronaria
szindróma kifejezést (ACS) ma egy egész klinikai
spektrumra használjuk, mely a kezdődő anginától
terjed az ST szegment emelkedéssel járó akut myocardialis
infarctusig (STEMI).
Az akut coronaria-szindróma jelenlegi cardialis
markerei
Cardialis troponinok
A troponinok a vázizomban és a szívizomban található
szabályozó proteinek. A három alegység, amelyet
identifikáltak, troponin I-t (TnI), troponin T-t
(TnT) és troponin C-t (TnC) tartalmaz. A troponin C
(TnC) vázizom és cardialis izoformáit kódoló gének
identikusak, úgy hogy nincs strukturális differencia
közöttük. Ezzel szemben a troponin I és a troponin
T szkeletális és cardialis alformái különböznek, és az
immunanalitika eljárások különbséget tesznek közöttük.
Ez a cardialis troponinok szívspecifikusságának
különlegessége. A szkeletális TnI és TnT strukturáli-

Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban
329
san különböző. Nincs keresztreakció a szkeletális és
cardialis TnI és TnT között egy adott tesztben (11-75.
ábra).
A cardialis troponinok release-kinetikájára irányuló
korai tanulmányok azt jelezték, hogy ezek a sejtkomponensek
nem tartoznak a cardialis nekrózis korai
markereihez. A korai generációjú troponintesztek a
szimptómák kezdetétől számított 4-8 órán belül szolgáltattak
pozitív eredményeket, hasonló idő elteltével
mint a CK-MB-kiáramlás. ámbár a troponin 7-10 napig
is emelkedett maradt az AMI kezdete után.
A cardialis troponinok kezdeti vizsgálataikor felfigyeltek
egy olyan instabil anginás maradék betegcsoportra,
akiknél a CK-MB normális, de troponinértékeik
emelkedettek voltak. Ezeknél a betegeknél
nagyobb arányban fordult elő szerencsétlen cardialis
esemény (halál, AMI) a felvételt követő 30 napban és
a kórtörténet nagyon hasonlított az NSTEMI-betegekére.
Az emelkedett troponinérték alkalmas akut coronaria-szindrómás
betegek rizikóbeosztására, és a magas
rizikójú betegek olyan megjelölésére, mint akiknél
nem kívánt kardiológiai esemény (halál, AMI)
az elkövetkező 6 hónapban megtörténhet. Klinikai
troponin- és CK-MB-tanulmányok megerősítik azt a
megfigyelést, hogy bár az AMI diagnózisához mindkettő
elég érzékeny és specifikus, de a CK-MB-nek
sem prediktív, sem prognosztikus értéke nincsen.
A cardialis troponinok érzékeny kardiospecifikus
markerek és prognosztikus információkat nyújtanak
az akut coronaria-szindrómás (ACS) betegekről,
ezért ezeket az ajánlott cardialis markerként tartják
számon.
A fokozott (emelt) érzékenységű és pontosságú
troponintesztek bevezetésével az AMI-betegek 80%-
ában a sürgősségi osztályra érkezést követő 2-3 órán
belül emelkedett troponinértékeket kapunk. Ez a korábbi
troponintesztek esetében csak mintegy 8-10
11-75. ábra. A troponinok organizációjának sematikus ábrázolása
a) Aktin és miozin
b) Miozinfej és -nyak
c) Vékony filamentum
d) Troponin I és troponin T

330 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
óra elteltével teljesült, és gyakran később emelkedett,
mint a CK-MB-szint.
Az új troponintesztek az ún. korán emelkedő biomarkereket
– mint pl. a mioglobin vagy a CK-MB-izoformák
– kezdik a klinikai használatból kiszorítani
(11-76. ábra).
2007-ben az Amerikai Kardiológiai Kollégium
(ACC) egymást követő troponinméréseket ajánlott a
nem típusos MI-betegek (NSTEMI) esetében a definitív
diagnózishoz: a felvételt követő ún. alapérték és
a 6-9 órás érték meghatározásával. Az AMI diagnózisához
- a megállapított cut-off-érték fölött - csak
egy emelkedett érték szükséges. A troponinértékek
változása (emelkedése vagy süllyedése) szükséges a
perzisztálóan magas troponinértékektől való elkülönítéshez
(pl. vesebetegségeknél).
11-76. ábra. A szérum szívmarkereinek időbeni követése
akut myocardialis infarctusban (AMI-ban)
Kreatin-kináz – MB-izoenzimek
A cardialis troponinok bevezetése előtt az ajánlott
biokémiai marker az AMI diagnózisához a
CK-MB-izoenzim-aktivitás volt. Kritériumként az
AMI megállapításához a következő volt az elfogadott:
Két egymást követő emelkedés a diagnosztikus
határérték (cut-off) felett, vagy egyetlen eredmény,
amely magasabb, mint a felső referenciahatárérték
kétszerese.
Jóllehet a CK-MB jóval koncentráltabb a myocardiumban
(mintegy 15%-a a total CK-nak), a vázizomban
is jelen van. A CK-MB szívspecifikussága
nem 100%. Hamis pozitív értékek fordulnak elő számos
klinikai állapotban, beleértve a traumát, a fizikai
megerőltetést és a myopathiákat.
A CK-MB-release kinetikájának ismerete a klinikus
számára fontos lehet. A CK-MB először 4-6 órával
a tünetek kezdete után jelenik meg, a maximális
szint 24 óránál jelentkezik, és 48-72 óra elteltével tér
vissza a normális tartományba. Az AMI korai és késői
(>72 óra) diagnózisában sajnos limitált a vizsgálat
értéke. Kiáramlási kinetikája viszont igen hasznos
lehet a reinfarctus felismerésében, az AMI-t követő
csökkenés ilyenkor ismét emelkedő értékeket mutat.
A thrombolyticus terápiánál megállapították, hogy
bár a CK-MB érzékeny és specifikus vizsgálat, a váratlan
és veszélyeztető cardialis események előrejelzésében
nem hasznosul és nincs prognosztikus értéke.
Nagyszámú akut coronaria-szindrómás (ACS)
beteg vizsgálata során azt találták, hogy az izolált
CK-MB-emelkedésnek limitált prognosztikus értéke
van ST-elevációval nem járó esetekben.
Relatív index, CK-MB és total CK
A relatív indexet a CK-MB (tömeg, mass)/totál
CK arányából számítják. Segíthet a klinikusnak a hamis
pozitív CK-MB-értékek – amelyek a vázizomból
származnak - elkülönítésében. Ha az arány kisebb
mint 3, ez a vázizomeredet mellett szól. Ha az arány
nagyobb mint 5, szíveredetre utal. A 3-5 arány a
„szürke zóna”, határozott diagnózist nem enged meg
anélkül, hogy ismételt időbeni vizsgálatokkal emelkedést
detektálnának.
A CK-MB/CK relatív indexet a CK-MB-emelkedés
AMI infarctusspecifikusságának növelésére vezették
be. Az érzékenysége viszont AMI-ban csökken, ha a
cardialis és szkeletális izomkárosodás együtt van jelen.
Ilyenkor pl. intenzív osztályokon a relatív inde-

Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban
331
xeken kívül az abszolút CK-MB-értéket is figyelembe
szokták venni, ezáltal a specificitás kissé növelhető, az
érzékenység egyidejű csökkenése mellett.
Végül is megállapítható, hogy a relatív index használata
csak akkor „működik”, ha vagy cardialis, vagy
vázizom-károsodás áll fenn, de nem mindkettő. Fontos
megjegyezni, hogy a relatív indexet egyedül nem
használjuk az AMI diagnózisához, ugyanis emelkedett
lehet akkor is, ha a total CK vagy a CK-MB normális
tartományon belül van. Az index klinikailag
csak akkor alkalmazható, ha mindkét érték emelkedett.
Mioglobin
A mioglobin felé azért fordult az érdeklődés, mert
a myocardialis infarctus (MI) korai markereként tartják
számon. Ismert hem protein, mind a vázizomban,
mind a szívizomban megtalálható. Kis molekulatömege
felel a gyors kiáramlási kinetikáért. A mioglobin
az infarctus kezdetét 2-4 órával követően tipikusan
emelkedik, a csúcsot 6-12 óra után éri el, és
24-36 órában tér vissza a normális értékre.
A rendelkezésre álló gyors mioglobin- (POCT-)
tesztek nem szívspecifikusak. Egymást követő, 1-2
óránként ismételt vizsgálatokkal némileg növelhető a
szenzitivitás és a fajlagosság. Az emelkedés vagy 1-2
óra elteltével 25-40%-os különbség egyértelműen sugallja
az AMI-t. A legtöbb tanulmányban a mioglobin
90% diagnosztikus szenzitivitást ér el AMI-ban.
A mioglobin negatív prediktív értéke nem elég
nagy az AMI diagnózisának kizárására. A mioglobint
értékelő eredeti régebbi tanulmányok, az AMI-t
(WHO definícióként) még a CK-MB-re standardizálták.
Az ESC/ACC troponinra standardizált új
AMI-definíció nál a mioglobintesztek diagnosztikus
érzékenysége jelentősen csökkent. Ez szignifikánsan
csökkentette alkalmazását is, és a legújabban kifejlesztett
troponintesztek a mioglobinméréseket talán
szükségtelenné teszik.
Kreatin-kináz MB izoformjai
A kreatin kináz MB-izoenzimnek 2 izoformja van:
CK-MB1 és CK-MB2. A CK-MB laboratóriumi meghatározása
a CK-MB1 és CK-MB2 izoformnak mindenkori
összegét jelenti. A CK-MB2 a szöveti izoform,
és AMI után ez áramlik ki a myocardiumból.
A periférián a szérumban CK-MB1-gyé alakul át. A
tünetek kezdetét követően ez gyorsan történik.
A CK-MB-izoformokat nagyfeszültségű elektroforézissel
lehet vizsgálni. Gyors leletmegfordulási
idővel (turnaround time, TAT) bíró automata analizátorok
is rendelkezésre állnak a mérésre. Számolják
a CK-MB2/CK-MB1 hányadosát. Normálisan a
CK-MB1 van túlsúlyban, ezért az arány jellemzően
kisebb mint 1. Az eredmény pozitív, ha a CK-MB2
emelkedett és az arány több mint 1,7.
A CK-MB-izoformok kiáramlási sebessége nagy. A
CK-MB2 a szérumban 2-4 órával a kezdet után detektálható,
és a csúcsok 6-9 óra között jelentkeznek.
Ez az AMI-nak egyik korai markere. Használatát két
nagyobb tanulmányban értékelve az érzékenységét 6
órával a tünetek kezdetét követően 92%-nak találták,
szemben a CK-MB 66% és a mioglobin 79% értékével.
A hátránya ennek a módszernek, hogy kivitelezése
személy- és időfüggő.
Mi a legjobb markerstratégia?
Minden egyes cardialis marker kiszabadulási kinetikájának
megismerése a szimptómák kezdete óta
eltelt idő jelentőségét hangsúlyozza. Az amerikai és
az európai kardiológusok (ACC/ESC) által elfogadott
útmutató az AMI diagnózisában a cardialis troponint
tartja egyértelműen a legjobb markernek.
Az újabb cardialis troponintesztek bevezetése (nagyobb
érzékenységük és kisebb cut-off-értékük miatt)
a hagyományos korai markereket - mint a mioglobin
és a CK-MB-izoformok – kiszorítja a használatból.
A sürgősségi ellátásban az amerikai orvosok legjobb
cardialis markerstratégiaként olyan 3 szintű
B-változatot ajánlanak, amely ki tudja zárni az
ST-emelkedés nélküli myocardialis infarctust (NSTE-
MI) a sürgősségi osztályokon fekvő betegeknél:
• Egyetlen(?) negatív CK-MB, troponin I vagy
troponin T a tüneteket követő 8-12 órában.
• Negatív mioglobin párosítva negatív CK-MBmass
méréssel, vagy negatív troponinmérési
eredmény a felvételkor és 90 perc múlva, ha a
beteg a tünetek kezdete óta 8 órán belül van.
• Negatív 2 órás CK-MB d-érték együtt negatív 2
órás troponin I d-értékkel, ha a beteg a tünetek
kezdete óta 8 órán belül van.
Megjegyzésünk erre az ajánlatra:
Természetesen ez az ajánlat számos buktatót rejthet
magában, különösen az említett „egyetlen” troponinmeghatározás
mint kritérium a viszonylag korai

332 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
időperiódusban. A szimptómák megjelenését követően
több mint 24 óra elteltével ajánlatosak inkább a
troponinmeghatározással a betegeket megítélni.
Az ajánlott ún.” d”-mérések természetesen igénylik
az adott tesztek variációs koefficienseinek az ismeretét
is, és nem szabad azt sem elfelejteni az értékelésnél,
hogy a referenciatartomány felső határ (cut-off)
értékétől is függ a mérés pontossága adott tartományban.
További instrukciók
Folytatva az ajánlott instrukciókat, a laktát-dehidrogenáz
végkép kihagyandó a marker stratégiából. A
rendelkezésünkre álló cardialis markerekkel ismételt
mintanyerésből kinetikát nyerhetünk. A minta nyerés
ajánlott időpontjai a markertől függnek. A korai diagnózis
fontossága esetén a 3-4 órás mintavétel, míg
más esetekben a 6-9 órás mintavétel vezet célra.
Mikor tekinthetnek el a kardiológusok a cardialis
marker eredmények ismeretétől? Ha a betegnek típusos
ischaemiás mellkasi fájdalma van diagnosztikus
EKG eltéréssel (ST eleváció), a beteg azonnali trombolitikus
terápiának vagy érplasztikának a várományosa.
A terápiás beavatkozás ilyenkor nem várhat
a cardialis markerek eredményeire, annál is inkább,
mert a szimptómák kezdete óta eltelt igen rövid idő
(6 órán belül) miatt a teszt alacsony detektálási érzékenysége
várható. Ilyenkor a re-perfúziós terápia
azonnal elvégzendő (11-77. ábra).
11-77. ábra. Cardialis markerek követése a reperfúziós terápia
sikerének megítélésében (STEMI: ST-elevációval járó
myocardialis infarctus)
A cardialis markerek szerepe az akut
coronaria-szindróma terápiás döntéseiben
Fejezetünkben azt hangsúlyoztuk, hogy a cardialis
markerek döntőek mind diagnosztikus, mind prognosztikai
szempontból. Klinikai vizsgálatok alapján
napjainkban kezdik felvetni azt a kérdést, hogy
mint indikátorok használhatóak-e az akut coronaria-szindróma
specifikus terápiás beavatkozásaihoz.
Jelenleg a terápiás stratégiák akut coronaria-szindrómában
elsődlegesen csak a klinikai indikációkra szorítkoznak
(pl. ischaemiás mellkasi fájdalom) vagy az
EKG változásokra (pl. ST-eleváció vagy -depresszió).
Nincs érvényes terápiás algoritmus olyan esetekre,
amelyek klinikai és EKG-jelek hiányában izolált pozitív
markereredményeken alapulnak.
Az ilyen kiemelt esetek klinikai vizsgálatai megerősítették,
hogy a pozitív troponineredmény egyedüliként
független indikátora a magas rizikónak. Ezért az
alacsony molekulatömegű heparin terápia (LMWH)
és/vagy a thrombocytaaggregáció-gátlók (GIIB/IIIA
inhibitorok) alkalmazása indokoltnak látszott és a
legelőnyösebbnek, legeredményesebbnek bizonyult
az ilyen betegeknél, akiknél az emelkedett cardialis
troponin magas rizikót jelzett.
Laboratóriumi medicina és a troponinok
A technológia fejlődése jelentősen megváltoztatta a
cardialis troponinok klinikai laboratóriumi vizsgálatait.
A harmadik generációs tesztek bevezetésével a
kimutatási határérték egy századára csökkent a troponin
T-nél (1 ng/ml-ről 0,01 ng/ml-re). A teszteknél
a keresztreakció a vázizom eredetű troponinnal
elhanyagolható. Más részről a point-of-care (POCT-)
tesztek bevezetésével a leletmegfordulási idő a teljes
vér analíziseknél jelentősen felgyorsult.
A gyorstesztek (POCT)
A szívmarkerek vizsgálatát a nap 24 órájában, a hét
minden napján és 1 órán belül kell elvégezni (NACB
ajánlás). A POCT olyan betegágy melletti eljárás,
amely gyors eredményeket kínál minden olyan esetben,
amikor a kórházi laboratórium nem tudja teljesíteni
az előbbieket.
POCT-vizsgálatokra gyártott tesztek a CK-MB-re,
a mioglobinra és a cardialis troponinokra (TnI és

Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban
333
TnT) egyaránt elérhetők kereskedelmi forgalomban.
A TnT-nél viszont csak kvalitatív POC-teszt kapható,
de TnI/POC tesztet mind mennyiségi, mind minőségi
vizsgálatra forgalmaznak. Használatuk sürgősségi
osztályokon különösen indokolt.
A troponinok döntési határértékei
Az értékeléshez néhány laboratóriumi alapfogalommal
kell tisztában lennünk. Egy adott módszer
kimutatási határértéke az a legalacsonyabb szint,
amelyet a módszer jelezni képes, noha ennél a pontnál
a mérés pontossága nem megfelelő. A 99 percentil
a felső referenciahatár, a vizsgálat normális tartományának
felső határát jelenti, és feltételezetten még
normális, egészséges populációból származik. Azaz
az egészséges felnőtt populáció 99%-ának értékei e
határérték alatt vannak. A cut-off alatt az értékek feltehetőleg
„normálok”, bár végül is a cut-off-érték a
mindenkori módszer érzékenységétől függ.
Itt szükséges megjegyezni, hogy a döntési küszöbérték
(cut-off) változtatásával egy teszt szenzitivitása
és specificitása ellentételesen változik.
A jelenleg is használt módszerek értékelését óvatosan
kell kezelni. Az aktuálisan a teszthez mellékelt
referenciatartomány ugyanis egy heterogén betegpopulációra
vonatkozhat – azaz a „valódi” normális
csoporton kívül olyan egyének kis értékeit is tartalmazhatja,
akik a magas rizikójú betegcsoportba tartoznak.
Ez azt is jelenti, hogy a valódi normális populációhoz
tartozó 99 percentiles cut-off-értékeknek
valójában lényegesen (akár 10-50-szer) alacsonyabbnak
kell lenniük a jelenleg megadottaknál. Vagyis általánosságban
sürgetővé vált az ultraszenzitív troponinmérő
módszerek kifejlesztése. Az ultraszenzitív
troponintesztekhez végül is alacsonyabb cut-off-érték
tartozik, ami a teszt diagnosztikus értékét növeli.
A variációs koefficiens (CV, vagy relatív standard
deviáció) egy teszt eredményeinek változását (ingadozását,
reprodukálhatóságát) fejezi ki. Akkor kapjuk,
ha ugyanazt a mintát ismételten analizáljuk, és az átlagtól
való eltérést százalékban fejezzük ki. Általában
a CV-érték emelkedik, ha a mérési eredmény kicsi.
A legalacsonyabb szintnél olyan magas a CV, amely
jelzi ebben a tartományban a mérés pontatlanságát.
Egy 10%-os CV még elfogadható, de akkor ideális,
ha kisebb mint 10% a 99 percentil cut-off-szintnél. A
jelenlegi troponinmérési módszerek legtöbbjénél ez
nem teljesül.
A forgalomban kapható tesztek érzékenysége, fajlagossága
és pontossága igen különböző. Ez visszavezethető
a standardizáció hiányára, a különböző
monoklonális antitestekre, a detektálandó TnI- és
TnT-molekulák patológiás módosulataira, az ellenanyagok
keresztreakcióira, amelyek a detektálható
TnI-molekulák degradációiból erednek. Általában az
immunkémiai analitikai technikák lumineszcens kimutatási
elven alapulnak.
A TnT-módszert egyetlen előállító szabadalmaztatta,
így a különbségek ennél a tesztnél elhanyagolhatóak.
Mind a 99 percentiles cut-off-érték, mind a
10% CV a troponin T-tesztekre megállapított. Ezzel
szemben akár 20-szoros különbségek fordulhatnak
elő a kereskedelmi forgalomban jelenleg kapható
nagyszámú TnI-teszt eredményei között, a saját 99
percentil cut-off-értékük magasságában és 10% CV
mellett. Ezzel a problémával extrém esetben akkor
találkozik a klinikus, ha a kevésbé érzékeny gyors
(POCT) TnI-tesztet követően a mintát újravizsgálják
egy érzékenyített TnT-módszerrel a központi laboratóriumban.
Összefoglalva mind a sürgősségi orvosnak, mind
a laboratóriumnak ismerni kell a rendelkezésre álló
troponintesztek cut-off-értékeit a 99 percentil referenciahatárnál
és az ehhez tartozó CV-értékeknél.
Emlékeztetni kell arra az ACC/ESC által kidolgozott
megegyezéses definícióra, amely a következő: bármely
emelkedése a mért troponinnak10% CV vagy a
99 percentil referenciahatár fölött megfelelő klinikai
állapotban myocardialis infarctusnak tartandó.
Cardialis markerek krónikus
vesebetegségben és nem ischaemiás
szívbetegségben
Krónikus vesebetegek
Hemodializált krónikus vesebetegek halálának
50%-ban cardiovascularis betegség az oka. Ezeknek
a betegeknek fokozott a rizikója coronaria-artériás
betegségre vagy akut coronaria-szindrómára. A rizikó
megítélésére cardialis markereket használtak.
Már korábbi tanulmányok is bizonyították, hogy
ezeknél a hemodializált vesebetegeknél az emelkedett
cardialis troponin nagy gyakorisággal jelentkezik.
A TnT-pozitív eredmények igen nagy (30-70%)
előfordulásáról számoltak be cardialisan tünetmen-

334 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
tes vesebetegeknél. Az emelkedett troponin I előfordulása
ugyanakkor kisebb volt. A CK-MB-emelkedés
okilag közvetlen összefüggésben van a
vese-clearance értékkel.
Biokémiai tanulmányok azt mutatják, hogy a troponinszint-emelkedés
a myocardiumból származik
(így ez nem hamis pozitívitás), és nincs összefüggésben
a vesebetegséggel kapcsolt myopathiával. A
legújabb adatok azt sugallják, hogy a tünetmentes
betegeknél az emelkedett troponinok szubklinikai
microinfarctusokra utalhatnak, ami klinikailag különbözik
az akut coronaria-szindrómától. A krónikus
vesebetegnek gyakran van pangásos szívbetegsége és
magas vérnyomása, ami függetlenül emelheti a troponinértéket.
Az emelkedett troponinérték klinikai szignifikanciája
vitatott. A legalaposabb tanulmányok megerősítették,
hogy a TnT-emelkedés és a cardialis mortalitás
között összefüggés van. Veseelégtelenség és emelkedett
TnT együtt a legnagyobb globális rizikó a mortalitásra
vagy az AMI-ra.
A dialízis nincs befolyással a troponinértékekre.
A CK-MB-molekula dialízálható, ezért a vesepótló
kezelést követően a szérumban/plazmában csökken
a szintje. Az emelkedett troponin megítélése ezért a
krónikus vesebetegeknél nem egyszerű. Mérsékelten
magas rizikójú betegeken végzett sorozatos troponinmérések
– keresve a troponinértékek emelkedését
- szükségesek az AMI felismerésére. Ugyanakkor a
csekély rizikójú, egyébként is tünetmentes páciensek
esetében a klinikus az emelkedett troponinszintet hamis
pozitivitásként értékeli.
Troponinok nem ischaemiás szívbetegségekben
A különböző fokú myocardialis károsodásnak klinikailag
fokozott morbiditás és mortalitás a következménye.
Az emelkedett troponinérték olyankor is
érzékeny markere a rejtett myocardialis károsodásnak
vagy nekrózisnak, ha a klinikai állapot nem ischaemia
következménye. Ischaemia nélküli pangásos
szívbetegségekben vagy bal kamrai funkciózavarokban
a TnT-szintnek rizikót jelző, prognosztikailag
értékelhető jelentéstartalma van. Különböző klinikai
állapotok, mint subarachnoidalis vérzés, pulmonalis
embolia, akut pulmonalis hypertensiót követő jobb
kamrai feszülés emelkedett troponinszinttel járnak.
Az itt következő felsorolásban olyan állapotok vagy
betegségek szerepelnek, amelyek közvetlenül nincsenek
összefüggésben atheroscleroticus koszorúér-betegségekkel:
• Beültetett pacemaker.
• Szapora és nem ritmusos szívműködés.
• Magas vérnyomás.
• Szívizomgyulladás.
• A szívizom zúzódása.
• Heveny és krónikus pangásos szívbetegség.
• Szívműtét.
• Vesebetegség.
• Tüdőembolia.
• Subarachnoidalis vérzés.
• Sepsis.
• Csökkent pajzsmirigyműködés.
• Shock.
Sürgősségi cardialis markerek
A laboratóriumi medicinában igen sok cardialis markert
vizsgáltak idáig és vizsgálnak napjainkban is folyamatosan.
Keresik azt az ideális paramétert, amely pl.
az akut coronaria-szindrómára 100%-ban érzékeny és
100%-ban specifikus. Újabban felismert markerek:
Natriuretikus peptidek
A cardiovascularis rendszert idegi hormonális mechanizmusok
befolyásolják. A sympathicus rendszer
aktiválásával a katekolaminok révén, a renin-angiotenzin-aldoszteron
rendszer (RAAS) aktiválásával,
a vazopresszin aktiválással (ADH-hatásra vízvisszatartás)
és a natriuretikus peptidek felszabadulásával.
Máig megkülönböztethetjük a következő natriuretikus
peptideket:
• ANP (A típusú natriuretikus peptid; korábban
mint A: atrialis, vagyis pitvari natriuretikus
peptidet jelölték).
• BNP (B típusú natriuretikus peptid; korábban
mint B: brain jelölték, a kamrából származik).
• CNP (C típusú natriuretikus peptid; az érfali
endothelsejtekből származik).
A natriuretikus peptidek elnyomják a renin-angiotenzin-aldoszteron
rendszert: csökken a perifériás érellenállás,
megnő a nátriumürítés és a vízkiválasztás a
vesén keresztül.
Noha a CNP nem natriuretikus, hanem csak értágító
hatással rendelkezik, kémiai hasonlósága miatt

Cardialis markerek laboratóriumi diagnosztikája és információs értéke a klinikumban
335
sorolják az ANP-vel és a BNP-vel azonos csoportba.
A natriuretikus peptidek nem folyamatosan termelődnek
és tárolódnak az izomsejtekben, hanem a tágulás
és a nyíróerő hatására géntranszkripció aktiválása
révén képződnek.
A BNP (B típusú natriuretikus peptid), mint említettük,
a kamrai szívizomból - a kamrafal feszülésére
(nyomás- és térfogat-növekedéskor) válaszként – kerül
a véráramba. A klinikai laboratóriumokban automatizált
immunmódszerekkel határozzák meg az
NTproBNP-t (az elnevezés a hormon N-terminális
hasítási termékére utal). Lehetőség van az aktív BNP
hormon mérésére is. Mindkét meghatározás nagyon
költséges.
A BNP fontosnak tűnik a klinikusok számára. Eddigi
ismereteink szerint a BNP alacsony értékének
igen nagy a negatív prediktív értéke a kamrai diastolés
nyomásfokozódás megítélésében. Ezért a differenciáldiagnosztikában
is fontos szerepe van. Az akut
coronaria-szindrómás betegek rizikójának megállapításához
is használatos. Számos vizsgálati adat utal a
BNP akut coronaria-szindrómát (ACS) jósló indikátor
szerepére. Továbbá nem csak az ACS, hanem fenyegető
váratlan cardialis események, akár a szívhalál
előrejelzője is lehet, különösen ha a troponinérték is
emelkedik.
C-reaktív protein
A C-reaktív protein mint nem specifikus gyulladásos
marker közvetlenül részt vesz a scleroticus érfali lerakódás
(plaque) kialakulásában. Rendkívül kiterjedt
klinikai tanulmányok igazolták már a kilencvenes évek
elejétől, hogy a kardiológiai betegek gondozásában, a
megelőzésben az emelkedett CRP-értékek előre jelzik
a jövőben veszélyeztető cardialis eseményeket. Ezért
használják a betegek cardialis rizikóprofiljának a kialakításában.
A független „prediktorok” (jósló, előrejelző
paraméterek) csoportjába tartozik. A TnI-vel és
a BNP-vel együtt használatos, de nem specifikus természete
miatt diagnosztikus markerként korlátozott
az értéke. A klinikai laboratóriumokban az újabban
bevezetett nagy érzékenységű automatizált módszert
(High-Sensitive CRP, HS CRP) alkalmazzák mérésére,
csökkent cut-off-érték mellett.
Mieloperoxidáz
A mieloperoxidáz (MPO) leukocytaenzim, reaktív
oxigéneket hoz létre, amelyek prothromboticus
lipidoxidációs termékekkel, plaque-instabilitással,
plaque-képződéssel és nitrogén-monoxid (NO) csökkenéséből
fakadó érösszehúzódással vannak kapcsolatban.
Szignifikánsan emelkedett MPO-értékeket találtak
angiográfiával igazolt koszorúér-betegségben. Használják
továbbá cardiovascularis rizikót jelző független
prediktorként is sürgősségi osztályokon, mellkasi
fájdalmak esetén. Negatív troponin T „baseline”-érték
mellett akár korai markerként is jelentkezhet, a
tünetek fellépte után 2 órán belül. A teszt korai markerkénti
használata a plaque-ok sérülékenységét jelző
képességén alapszik. További MPO-ra irányuló
tanulmányok szükségesek a mellkasi fájdalommal,
sürgősséggel felvett betegpopulációnál: még meghatározásra
vár a vizsgálat szenzitivitása, specificitása,
pozitív, valamint negatív prediktív értéke.
Ischaemia által módosult albumin
A jelenlegi cardialis markerek - beleértve a troponint
és a CK-MB-t - érzékenyek a szívizomnekrózis
kimutatásában. A sejthalál jelzői, amely az AMI-ban
jön létre. A legtöbb akut coronaria-szindrómás betegnél
viszont a myocardialis ischaemia infarctus nélkül
zajlik le. Azok a szívmarkerek viszont, amelyek
képesek jelezni az ischaemiát, értékes kiegészítői lehetnének
a diagnosztikus eljárásnak.
Az ischaemia ilyen új markere lehetne, az ischaemia
okozta módosult albumin (IMA). Akkor keletkezik,
ha a keringő szérum albumin közvetlen kontaktusba
kerül az ischaemiás szívizommal. Az IMA mérése
az albumin kobalt-kötésén (ACB) alapszik, ugyanis a
módosult forma nem képes kötni a kobalt(II)iont. Egy
30 perces leletmegfordulási (TAT) idővel rendelkező,
tehát gyors IMA tesztet fejlesztettek ki és dobtak piacra
a myocardialis ischaemia markereként.
A kezdeti kísérletes és klinikai vizsgálatok nagyon
biztatóak, mert az értékeléshez szükséges paramétereket
is meghatározták. Egyéb molekuláris, ill.
EKG-vizsgálatokkal kombinációban szenzitivitása és
negatív prediktív értéke tovább növelhető, de specificitása
elmarad a kívánatos értéktől. Hasznosulása
azokban az ACS esetekben lesz várható, ahol az EKG
és a troponinszintek nem diagnosztikusak. Figyelembe
kell venni azonban, hogy a szérumban az emelkedett
IMA-koncentráció néhány óra alatt lecseng,
féléletideje 2-3 óra.

336 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Irodalom
Schreibe, D., Miller, Suzanne M.: Use of Cardiac
Markers in the Emergency Department – (Updated:
Jul 8, 2009) http://emedicine.medscape.com/article/811905-overview
Dörner, K.: Klinische Chemie und Hämatologie. pp. 407-
414. 6. aktualisierte Auflage. Georg Thieme Verlag,
Stuttgart-New York, 2006.

A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai
337
A liquorfehérjék újabb vizsgálati
módjai
Komoly Sámuel
A liquor cerebrospinalist (továbbiakban „liquor”) hagyományos
felfogás szerint az agykamrák plexus chorioideusai
termelik részben filtrációval, részben aktív
transzport útján.
A liquor minőségi fehérje-összetétele fiziológiásan
lényegben megegyezik a vérszéruméval, kivétel
a b 2
-transzferrin. A liquor fehérjetartalma azonban a
vérszéruménál sokkal kisebb (150-400 mg/l), tehát a
liquor egyfajta „ultrafiltrátumnak” tekinthető. Megjegyzendő,
hogy a liquor fehérjetartalma újszülöttekben
nagyobb, és szintén nem mindig kórjelző, ha 60
év felett mérsékelten emelkedett összfehérjeértéket
találunk.
A liquor széruménál lényegesen kisebb fehérjetartalmát
az magyarázza, hogy a liquorteret és a központi
idegrendszert egészében a szervezet víztereitől
ún. gátrendszerek választják el. Ilyen vér-liquor, ill.
vér-agy gát, szintén létezik egy ilyen barrier-funkció
a liquorteret a koponyacsont felől határoló lágyagyhártyában
is. A vér-liquor gát biológiai szubsztrátuma
a plexus chorioideust borító epithelsejtek közötti
szoros kapcsolódás, amit sejtmorfológiai fogalomként
zonula occludesként ismerünk. Hasonló módon
zonula occludensekkel kapcsolódnak egymáshoz a
vér-agy gát kulcselemei, az agyi ereket bélelő endothelsejtek
is. Az utóbbiak még abban is különböznek,
a többi szervünkben található endothelsejtektől, hogy
nem fenesztráltak (nincsenek bennük pórusok). A
meningealis barrier szubsztrátuma az egyik lágyagyhártya
(arachnoidea, pókhálóhártya) sejtjeit összekapcsoló
zonula occludensek rendszere.
A liquorvizsgálat indikációi
A liquorvizsgálat nélkülözhetetlen neuroinfekciók
azonosításában (meningitis, encephalitis), segíthet
egyes neuroimmunológiai betegségek diagnózisában
és differenciáldiagnosztikájában: sclerosis multiplex,
dysimmun neuropathiák (Guillain-Barré-szindróma,
krónikus inflammatiós demyelinisatiós neuropathia,
CIDP). Liquorvételre szükség lehet a subarachnoidalis
vérzés diagnosztikájában, amennyiben
subarachnoidalis vérzésre utaló jellegzetes tünet mellett
(a beteg élete legrosszabb, legerősebb fejfájását éli
meg) a CT-vizsgálat nem mutat vérre utaló hiperdenzitást
a subarachnoidalis térben. Liquorvizsgálat igazolhatja
továbbá egyes malignus betegségek intracranialis
propagációját (pl. lymphomák, leukaemiák,
carcinomák: meningosis carcinomatosa) a liquorban
található tumorsejtek kimutatásával.
A liquorból végzett fehérjeanalízis alapelvei
A korrekt liquorfehérje-vizsgálat alapfeltétele,
hogy a liquormintát vevő orvostól a laboratóriumban
dolgozó szakemberek megfelelő tájékoztatást kapjanak
a liquorvétel indikációjáról, helyéről, a levett liquor
betegágy melletti makroszkópos észlelése során
megfigyeltekről.
Liquorminta nyerése
Lumbálpunkciót Quincke végzett először 1891-
ben. A liquort az esetek döntő többségében lumbálpunkcióval
veszik. Ennek technikai részletei
megtalálhatók tankönyvekben. Amennyiben a lumbálpunkció
technikai vagy egyéb okból nem végezhető
vagy kontraindikált, ugyanakkor a liquorvizsgálat
abszolút indikált, liquor nyerhető cisternapunkcióval:
a nyakszirtcsont és az első nyakcsigolya közötti résben
behatolva, röntgen képerősítő kontrollja mellett.
A mintavételre lehetőség van más okból behelyezett
agykamradrénen keresztül is. Tudni kell azonban,
hogy a liquor fiziológiás fehérjetartalma az agykamrai
és a cisternalis liqorban kisebb (~100-200 mg/l),
a lumbalis durazsákból vett liquorban viszont eléri a
400 mg/l értéket.
A levett liquor makroszkópos értékelése
A punkcióval nyert liquor fiziológiásan víztiszta,
átlátszó. Víztiszta liquort két frakcióban (más ajánlások
szerint, mintegy 12 ml liquort 3-4 csőben szétosztva),
véres liquort 3-5 frakcióban, frakciónként
1,5-2 ml-t bocsátunk le steril csövekbe.
Ha a frakciókban gyűjtött véres liquor feltisztul,
arteficiális vérzésről van szó, azaz a punkció során
valószínűleg megsérült egy véna az epiduralis vénás
plexusban; ez a vérzés spontán szűnik. Amennyiben
az egyes frakciók vétele során a liquor nem tisztul fel,
akkor a liquort le kell centrifugálni. Patológiás vérzés
esetén a centrifugált liquor színe megtört lehet, spekt-

338 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
rofotometriával a felülúszóban hemoglobin-bomlástermékek
mutathatók ki. Arteficiális vérzés esetén a
felülúszó víztiszta. Arteficiális vérzésre utal az is, ha a
félretett véres liquorban alvadék képződik. Subarachnoidealis
vérzés esetén a véres liquor nem alvad meg:
félretéve a liquort, a vörösvérsejtek néhány óra alatt
a kémcső aljára ülepednek, de a liquort felrázva a levételkor
észlelt homogénen véres liquort látjuk.
Ha az első lumbálpunkció során kapott és lecentrifugált
liquor felülúszója sárga, az nagyon nagy valószínűséggel
néhány nappal a punkció előtt történt patológiás
vérzésre utal (elsősorban aneurysmaruptura,
esetleg intraparenchymás vérzés liquortérbe törése).
Magas szérumbilirubin-szint esetén vagy kivételesen
nagy dózisú - ma már nagyon ritkán alkalmazott -
tetracyclinkezelés mellett is észlelhetünk sárga színű
liquort.
A liquorvétellel egy időben vért is kell venni a betegtől,
ugyanis az albuminhányados és az intrathecalis
IgG-szintézis megítéléséhez a szérum parallel
vizsgálata is szükséges. A liquor- és vérmintákat hűtés
nélkül, lehetőség szerint egy órán belül a vizsgálatokat
végző laboratóriumba kell szállítani, és egy órán
belül javasolt elvégezni a vizsgálatokat. A 3-4 órás tárolás
4 °C-on még elfogadható, ezt követően a liquor
felülúszóját és a szérumot centrifugálás (pl. 8000-10
000 rpm-en, 15 percig) után mélyhűteni kell (ideálisan
~-70 °C-on). Ezekből a mintából már csak fehérjeanalízis
végezhető.
Pándy-reakció
Pándy Kálmán módszerét 1910-ben írta le a betegágy
melletti azonnali, helyszíni tájékozódó vizsgálatra
a modern kézikönyvek még mindig ajánlják.
A módszer lényege, hogy óraüvegbe öntött telített
karbolsavas oldathoz néhány csepp liquort adunk: ha
nem alakul ki opaleszcencia, a liquorösszeférje nem
emelkedett. Opaleszcencia kialakulásának számos
oka lehet, amelyek közül a helyes ok kiválasztására a
modern liqordiagnosztikai módszerek adnak lehetőséget.
A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai
Mind a mai napig nincs nemzetközileg egységesen
használt „referencia”-metodika, ezért minden laboratóriumnak
be kell állítani az általa használt metodika
saját normálértékeit, normáltartományait. Természetesen
az azonos metodikával dolgozó laboratóriumok
célszerű, ha minőségbiztosítási rendszerhez (pl. nemzetközi
INSTAND hazai viszonylatban a QualiCont)
csatlakoznak.
Mennyiségi fehérjeanalízis
Az Esbach-, Nogouchi-, Nonne-Apelt-, Takata-Ara-,
Lange-reakció ma már elavult eljárásnak
tekinthető. A Mancini-féle radiális immundiffúzió
munkaigényes és nagy gyakorlatot igénylő eljárás. Az
említett eljárások helyébe a legtöbb laboratóriumban
az immunnefelometriás mérés lépett, egyes esetekben
ELISA és RIA is alkalmazható speciális fehérjemeghatározásokra.
Egyre több előre összeállított mérőszett
(kit, gyári teszt) kapható kereskedelmi forgalomban,
ami egyszerűsíti, pontosabbá és összehasonlíthatóvá
teszi a különböző laboratóriumok munkáját, mérési
eredményeit.
Ma már nem elégedhetünk meg csak az összfehérje
meghatározásával. Minimális követelmény az
összfehérje emellett a liquor-, a szérumalbumin és
az IgG-koncentráció meghatározása. A liquor és az
egyidejűleg vett szérumminta albumin- és immunglobulin-koncentrációit
nem csak azonos módszerrel,
hanem lehetőleg azonos mérési sorozatban is kell
meghatározni.
Elengedhetetlen a liquor- és szérumminták párhuzamosan
futatott izoeleketromos fokuszálással
végzett elektroforézisének elvégzése is, megfelelő készülékkel
(Pl. SEBIA ® CSF-electrophoresis system).
További információ az interneten található [4].
Elektroforézishez a liquort jellemzően natívan
(magasabb összfehérjénél hígított formában) egyidejűleg
viszik fel a hordozó közegre, általában 200-szorosára
hígított szérummal.
A liquor- és a szérumalbumin, valamint az
IgG-koncentráció ismeretében lehetséges két, diagnosztikailag
informatív index (Q) meghatározása:
1. Albuminhányados
liquoralbumin
Q Alb
=
szérumalbumin
2. IgG-index (leírója után Link-index)
liquor-IgG × szérumalbumin
Q IgG
=
liquoralbumin × szérum-IgG

A liquorfehérjék újabb vizsgálati módjai
339
Az albuminhányados és az IgG-index egyaránt dimenzió
nélküli szám. IgA- és IgM-index is meghatározható,
ezeknek azonban nincs igazi gyakorlati
jelentőségük. Az albuminhányados a gátrendszerek
integritásának vizsgálatára alkalmas, normálértéke az
életkorral változik.
Az IgG-index az intrathecalis immunglobulin-szintézisről
nyújt felvilágosítást általában 0,7 felett
tartják kórosnak. Leírója szerint (H. Link) az emelkedett
IgG-index csak akkor értékelhető az intrathecalis
IgG-képzés jelének, ha az albumin hányados
fiziológiás tartományban van. Az intrathecalis IgG
11-78. ábra. Az intrathecalis IgG-képzés helye
forrásaként a gátrendszerek agyi, liquor felőli oldalán
elhelyezkedő lymphocytás-plazmasejtes infiltraciók
valószínűsíthetők, amelyek jellemzően a kis erek perivascularis
terében lokalizálódnak (11-78. ábra). Az
oligoklonális gammopathia (OGP) agarózgél-elektroforézisnél
általában 2-5 extra csík formájában jelenik
meg, izoelektromos fokuszálásnál pedig 6-9-es
pH-tartományban kettőtől akár 9-15 diszkrét csík
formájában is látható (11-79. ábra a, b, c).
Biomarker fehérjék vizsgálata a liquorban
Az utóbbi évek törekvése, hogy neurodegenerativ
betegségek iv vivo diagnosztikájának felállításához liquorban
specifikus és szenzitív biomarker fehérjéket
azonosítsanak.
Tau-protein és amyloid b-peptid
Az Alzheimer-kór keletkezésében a jelenlegi elméletek
szerint fontos szerepet játszhat a tau- (t) protein
(ennek is kórosan foszforilált formái), ill. a b-amyloid
prekurzor proteinből a β- és γ-sectertasok által kihasított
Aβ 1-42
peptidek. A tau- és foszforilált tau-szint
emelkedését az egyidejűleg észlelhető alacsony Aβ 1-42
peptid koncentrációt tartják Alzheimer-kórra specifikus
jelenségnek. Az említett fehérjék, ill. peptidek
meghatározására kereskedelmi forgalomban kapható
szendvics-ELISA kiteket ajánlanak.
11-79. ábra. Oligoklonális
gammopathia (OGP)
agaróz-gélelektroforézise

340 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
14-3-3 protein
A szervezetben mindenütt előforduló protein,
emelkedett lehet prionbetegségekben, ezen belül is
jellemzően sporadikus Creutzfeldt-Jakob-betegségben.
Kimutatását Western-blot vagy kereskedelmi
forgalomban kapható kvantitatív ELISA-technikával
végzik. Tudni kell azonban, hogy a 14-3-3 protein
koncentrációja a liquorban megemelkedhet
más dementiaformákban, metabolikus és hypoxiás
encephalopathiákban is.
Amennyiben Creutzfeldt-Jakob-betegségre utaló
klinikai tüneteken (progresszív dementia, myoclonusok)
túl a liquorban 14-3-3 protein is kimutatható, az
megerősíti ennek a ritka betegségnek (prevalenciája
1/10 6 lakos) a gyanúját, azonban a betegség definitív
diagnózisa csak post mortem neuropatológiai vizsgálattal,
a betegségre jellemző kóros prion protein immunhisztokémiai
vizsgálatával lehetséges.
b 2
-transzferrin
Ez a fehérje a szérumban nem, csak a liquorban
fordul elő. Izoelektromos fokuszálással mutatható
ki, amelyet az egyik technika szerint immunifixáció,
majd ezüstözés követ. Kimutatásának akkor van gyakorlati
jelentősége, ha liquorcsorgás gyanúja vetődik
fel. Ez többnyire fejsérülések (koponyaalapi törések)
után alakul ki, de létezik előzmény nélküli spontán
liquorfolyás az orrüregből vagy a külső hallójáratból.
Amennyiben az említett nyílásokon ürülő nedvben a
b 2
-transzferrin kimutatható, akkor igazolt a liquorcsorgás
(szenzitivitás 80-100%, specificitás 95%).
S-100 protein
Referenciatartománya liquorban: < 5 µg/l (szérumban
< 0,2 µg/l).
Kalciumkötő fehérje többek között a Schwann-sejtekben,
az astrogliában, a melanocytákban is kimutatható.
Érzékenyen jelzi a központi idegrendszer, a
vér-agy gát károsodásait. Fejsérülés, hypoxia hatására
is emelkedik a szintje.
Neuronspecifikus enoláz (NSE)
Referenciatartománya liquorban: < 25 µg/l (szérumban
< 13 µg/l).
Agyi infarctus esetében több nappal az insultus
után szintje megemelkedik, agyoedemában szintén.
Alzheimer-kórban nem változik. Intracerebralis vérzés
utáni prognosztikai marker, 100 µg/l feletti érték
esetén diffúz kéregkárosodásra utal.
Kreatin-kináz BB izoenzim (CK-BB)
Referenciatartománya liquorban: < 5 U/l.
Az agyi eredetű CK-BB izoenzim a szérumban
gyakorlatilag minimális mennyiségben található. Liquorban
szintje emelkedik stroke-ban, fejsérülésekben,
demyelinisatiós betegségekben, tumorokban,
meningitisben.
Irodalom
[1] Pándy K.: A cerebrospinalis folyadék vizsgálatának
újabb módjai. Orv. Hetil. 4:72-73, 1910.
[2] Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis.
Report from an EFNS task force. European Journal of
Neurolog 13:913-922, 2006.
[3] EFNS guidelines on disease-specific CSF investigations.
European Journal of Neurology 16:760-770, 2009.
[4] http://www.laboratorytalk.com/news/anc/anc128.
html#ixzz1DNwDWuQj

A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban
341
A fehérjék mint neuroendokrin
hormonok a klinikai
laboratóriumi kutatásokban
Mezősi Emese, Kőszegi Tamás
A neuroendokrin rendszer és hormonjai
A neuroendokrin rendszer
A neuroendokrin rendszer anatómiailag többlépcsős
felépítése alkalmas arra, hogy a szervezetben
mindig az aktuális szükségleteknek megfelelő menynyiségű,
hatékony szabályozó funkcióval rendelkező
hormon termelődjön. Szokás a többszintű hormonális
szabályozó rendszert „endokrin tengelyeknek” is
nevezni.
A legfelső szinten az agykéreg áll, a kérgi válaszok
képesek direkt az agy célhormon termelő- és szabályozó
struktúráira hatni (gátlás vagy serkentés), ill. a
szervezet különböző válaszreakcióin keresztül a hormontermelést
befolyásolni. Amennyiben a kérgi befolyást
kikapcsolnánk, az agy specifikus területei akkor
is képesek a periférián keringő hormonszinteket
vagy egyéb kulcsfontosságú vezérlő komponenseket
érzékelni és az annak megfelelő gátló vagy stimuláló
választ közvetíteni (feedback).
A többlépcsős szabályozó „tengely” sematikusan a
11-80. ábrán látható.
A hypothalamus és a hypophysis áll a szabályozás
középpontjában. A hypothalamus a perifériás vérben
keringő hormonszinteket érzékelve csökkenti vagy
növeli a hypophysist stimuláló release-hormon elválasztást.
Ezek általában peptid természetű molekulák,
pl. a pajzsmirigy „tengelyben” a TRH (tireotrop
releasing hormon), ez mindössze 3 aminosavból álló
tripeptid (11-81. ábra).
A releasing hormonok a hypophysisbe jutva trop
(serkentő) hormontermelést váltanak ki, amely hormonok
azután a véráramba kerülve eljutnak a endokrin
célmirigyhez, ahol stimulálják annak „utolsó
lépcsős” hormontermelését, azét a hormonét, amely a
szervezet célsejtjeire hat. Ez a látszólag túlbiztosított
szabályozás képes a mindenkori hormonegyensúlyt
fenntartani, és szükség esetén a célsejtek funkcióját
11-81. ábra. A TRH szerkezete: pGlu-His-Pro-NH 2
(piroglutamil-hisztidil-prolinamid)
11-80. ábra. A neuroendokrin
szabályozás
főbb tengelyei

342 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A neuroendokrin rendszer betegségei,
a hormontermelés változásai
11-82. ábra. A pajzsmirigyhormonok elválasztásának szabályozása
nagymértékben befolyásolni (pl. nemi hormonok).
Az utolsó lépcsőben gyakran nem fehérje természetű
hormonok szintetizálódnak (pl. szteroidok), a peptid
- fehérje hormonok a karmester szerepét töltik be a
magasabb szintű agyi regulációban. A visszacsatolásnak
(feedback) nagy jelentősége van a szabályozásban,
ezt a pajzsmirigyhormonok elválasztásának példáján
keresztül mutatjuk be (11-82. ábra).
A negatív visszacsatolás elve: a keringő szabad
hormonszintek érzékelése alapján a hypothalamus és
a hypophysis a serkentő hormonok szintézisét csökkenti
vagy fokozza.
A neuroendokrin rendszer fehérje- és peptidhormonjai
A hormonok kivezetőcső nélküli endokrin mirigyekben
termelődnek, és a vérárammal jutnak el a
távoli célsejtekhez. A sejtek összehangolt működésében
a klasszikus endokrin szabályozás mellett a sejtek
közötti információcsere egyéb formái is fontos szerepet
játszanak. Parakrin szekréció során a hormon a
környezetében található sejtek működésére hat, amelyekhez
diffúzióval jut el. Autokrin hatásról akkor beszélünk,
ha a hírvivő molekula az őt elválasztó sejtre
fejti ki hatását. A hormonok kémiai szerkezetük alapján
glikoproteinek, peptidek, aminosavszármazékok
és lipidek (pl. szteránvázas vegyületek) lehetnek. Ebben
a fejezetben részletesen a fehérje- és peptidhormonokkal
foglalkozunk.
A polipeptidhormonok általában prohormonként
termelődnek, az aktív hormon további enzimatikus
hasítás során alakul ki. Példa erre a proinzulin, ahol a
harmadlagos szerkezet kialakulása során a peptidlánc
két vége között diszulfidhidak keletkeznek, majd a
molekula középső részén található C-peptid kihasad.
A C-peptid-szint mérésének alapvető jelentősége van
az endogén inzulinszekréció megítélésében diabetes
mellitusban szenvedő betegen, valamint az insulinoma
diagnosztikájában. A megszintetizált aktív hormon
szekréciós granulumokba kerül, ahonnan specifikus
inger hatására szabadul fel. Előfordul, hogy egy
nagy fehérjemolekulából számos hormon keletkezik,
pl. a proopiomelanokortin a prekurzora az ACTH,
a-MSH, b-MSH, b-lipotropin és enkefalin hormonnak.
A polipeptidhormonok sejtfelszíni receptorokon
keresztül fejtik ki hatásukat. A receptorok szerkezetéről
és a jelátvitel módjáról az utóbbi években tudásunk
jelentősen gyarapodott, lehetőséget adva a hormonhatás
receptor szintű módosítására. A klinikai
gyakorlatban legfontosabb peptidhormonokat (a teljesség
igénye nélkül) a 11-36. táblázat foglalja össze.
Az endokrin betegségek négy fő kategóriába sorolhatók:
• Fokozott hormontermelés.
• Csökkent hormontermelés.
• A célszövetek megváltozott érzékenysége a hormonnal
szemben.
• Az endokrin mirigyek tumorai.
A hormonszekréció rendellenességei
A hormontúltermeléssel és hormonhiánnyal járó
kórképek változatos klinikai tünetekkel jelentkeznek.
A tünettan ismerete nélkülözhetetlen ahhoz,
hogy a megfelelő laboratóriumi vizsgálatot kérjük a
diagnózis felállításához. A túltermelés és a hiány egyaránt
lehet a hypothalamus, a hypophysis és a perifériás
endokrin mirigy szintjén. A perifériás endokrin
szervek rendellenességei a leggyakoribbak, ilyenkor
primer funkciózavarról beszélünk. Lényegesen ritkábban
fordulnak elő a hypophysis betegségei (szekunder
funkciózavar) és extrém ritka a hypothalamus
működészavara következtében létrejövő kórkép
(tercier funkciózavar). A pajzsmirigy primer túlmű-

A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban
343
11-36. táblázat. Peptidhormonok a klinikai gyakorlatban
Hormon Termelődés helye Aminosavtartalom
gonadotrop releasing hormon (GnRH) hypothalamus 10
növekedési hormon serkentő hormon (GHRH) hypothalamus 44
tireotrop releasing hormon (TRH) hypothalamus 3
kortikotrop releasing hormon (CRH) hypothalamus 41
vazopresszin hypophysis 9
oxitocin hypophysis 9
szomatosztatin hypothalamus 28, 14
adrenokortikotrop hormon (ACTH) hypophysis 39
tireotrop hormon (TSH) hypophysis 211
luteinizáló hormon (LH) hypophysis 204
folliculusstimuláló hormon (FSH) hypophysis 210
növekedési hormon (GH) hypophysis 191
prolaktin hypophysis 199
inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1) máj 70
pitvari natriuretikus peptid szívpitvar 28
parathormon (PTH) mellékpajzsmirigy 84
inzulin pancreas b-sejt 51
kalcitonin C-sejt 32
glukagon pancreas a-sejt 29
leptin zsírszövet 167
ghrelin gyomor 28
ködése esetén a pajzsmirigyhormonok szintje emelkedett,
a hypothalamus és a hypophysis ezt érzékeli,
és negatív feedback-mechanizmus következtében a
TRH- és a TSH-termelés lecsökken. A laboratóriumi
leletben tehát alacsony TSH- és emelkedett szabad
T 4
- és T 3
- érték látható. Ha azonban a hypophysis
TSH-termelő adenomája okoz pajzsmirigy-túlműködést,
a TSH emelkedett és ezt a pajzsmirigyhormonok
magas szintje kíséri. A pajzsmirigy elsődleges
alulműködésében a pajzsmirigyhormonok csökkent
értéket mutatnak, a TSH szintje pedig emelkedett. A
pajzsmirigy alulműködésének hátterében általában
autoimmun gyulladás, a mirigy műtéti eltávolítása
vagy előzetes radiojódkezelés áll. A hypophysis betegsége
miatt létrejövő másodlagos pajzsmirigy-alulműködésben
a TSH termelése csökkent és ehhez a
pajzsmirigyhormonok alacsony szintje társul. A hypophysis-pajzsmirigy
és a hypophysis-gonad tengely
működésének megítéléséhez az alaphormonszintek
mérése általában elegendő. A hypophysis-mellékvese
és a GH-IGF-I tengely működése azonban gyakran
csak stimulációs vagy szuppressziós tesztekben ítélhető
meg. Ezek részletes tárgyalása meghaladja a jelen
fejezet kereteit.
Neuroendokrin tumorok jellemzése a fehérjetermékek
szintjén
Hormonhatású anyag termelése a neuroendokrin
tumorok jelentős részében kimutatható. A klasszikus
hormontúltermeléssel járó kórképek közé tartoz-

344 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
nak a hypophysis elülső lebeny adenomái. Ezek közül
a leggyakoribb a prolaktintermelő tumor, amelyre
diagnosztikus a 150 ng/ml feletti prolaktinszint. Ritkábban
fordulnak elő a növekedési hormont termelő
daganatok, amelyek a pubertás előtt gigantismust, ezt
követően acromegaliát okoznak. A diagnosztikában
perdöntő az oralis glukóztolerancia-tesztben nem
szupprimálódó növekedési hormon szint (>1 ng/ml)
és a korra és nemre normalizált IGF-I emelkedett értéke.
Az ACTH-termelő daganatok laboratóriumi diagnosztikája
különösen nehéz. Átfedés lehet a normális
felső tartomány és a hypophysistumor által termelt
ACTH-szint között, ezért ACTH-termelő daganat
gyanúja esetén fontos a diurnális ritmus vizsgálata
(adenoma esetén a diurnális ritmus eltűnik) és a
kortizolszint szupprimálhatóságának kimutatása
(dexamethasonszuppressziós tesztek), e tesztek számos
típusa ismert. A hypophysisadenoma által okozott
Cushing-kór nehezen különíthető el a benignus
hörgőcarcinoid ACTH-termelése következtében kialakult
ectopiás Cushing-szindrómától. Jelentősen
emelkedett ACTH-szint mérhető rosszindulatú kissejtes
hörgőcarcinomában, ennek elkülönítése általában
nem okoz problémát.
A hypophysis tumorai gyakran nem csak egy hormont
termelnek, előfordul GH és prolaktin együttes
szintézise, ill. FSH-LH-TSH termelés és számos
egyéb kombináció. A hypophysisfunkció vizsgálatakor
és a hormontúltermeléssel járó kórképek diagnosztikájában
ezért valamennyi hypophysishormon
és a perifériás hormonok vizsgálata is szükséges
(TSH-fT 4
, LH-FSH-tesztoszteron, ACTH-kortizol,
GH-IGF-I). Számos, korábban inaktívnak gondolt
hypophysistumor a-alegységet termel (ez közös a
TSH, az LH és az FSH hormonban), így ennek vizsgálata
további előrelépést jelenthet a diagnosztikában.
A pajzsmirigy rosszindulatú daganata a medullaris
carcinoma, amely a C-sejtekből indul ki, és kalcitonintermelése
által mutatható ki. A kalcitonin fontos
tumormarker, amelyet használunk a pajzsmirigygöbök
preoperatív diagnosztikájában és a medullaris
carcinoma miatt operált betegek posztoperatív követésében
is.
A mellékpajzsmirigy adenomája következtében
létrejövő elsődleges mellékpajzsmirigy-túlműködés
gyakori kórkép, ennek laboratóriumi diagnózisa az
emelkedett szérumkalciumszinttel együtt mért emelkedett
parathormonkoncentráció alapján mondható
ki. A parathormonmeghatározásnak van intraoperatív
formája is, amikor műtét során a műtét eredményességének
igazolására használják a parathormonmérést,
erre a parathormon rövid féléletideje ad
lehetőséget.
A széruminzulin meghatározása a hasnyálmirigy
b-sejtjeiből kiinduló daganat gyanúja esetén jelent segítséget.
Ezek a betegek az alacsony vércukorszint tünetei
miatt fordulnak orvoshoz, a diagnosztikában az
inzulin mellett a C-peptid és esetenként a proinzulin
meghatározására is szükséges lehet. Diagnosztikus
értékű az alacsony vércukorszint mellett észlelt emelkedett
inzulin- és C-peptid-szint.
Általános neuroendokrin tumormarkernek tekinthető
a kromogranin-A, amely az utóbbi időben terjedt
el a klinikai gyakorlatban. A kromogranin-A az
endokrin és neuroendokrin sejtek szekretoros granulumaiban
található 439 aminosav hosszúságú fehérje,
amely a hormonokkal együtt szekretálódik. Álpozitív
emelkedés észlelhető súlyos hypertoniában, veseelégtelenségben
és protonpumpagátló gyógyszer adása
során. Elsősorban a carcinoid tumorok diagnosztikájában
használjuk.
A fehérje- és peptidhormonok
meghatározásának klinikai jelentősége
és nehézségei
A hormonok a keringésben igen kis koncentrációban
vannak jelen, ezért meghatározásuk csak olyan módszerrel
lehetséges, amely nagy érzékenységgel és jó
specificitással rendelkezik biomolekulák kimutatására.
Ezek a módszerek a hagyományos laboratóriumi
eljárásoknál több nagyságrenddel érzékenyebbek. A
szenzitív TSH meghatározás pl. femtomoláris (10 -15
mol) mennyiségben képes meghatározni a TSH-molekulák
mennyiségét. A TSH-meghatározás az egyik
legérzékenyebb módszer, a többi peptidhormon méréstechnikája
sajnos jóval elmarad a TSH-mérés mögött.
Az endokrinológiában az antitestkötésen alapuló
módszerek a leggyakoribb vizsgálóeljárások.
Ennek során a fehérjemolekula specifikus epitópja
ellen termelt antitest és a kérdéses peptidhormon között
reverzibilis immunkémiai reakció zajlik. Kezdetben
radioimmunoassay-ket használtak, napjainkban
elterjedtek a nem izotóp jelölésű (alternatív) és au-

A fehérjék mint neuroendokrin hormonok a klinikai laboratóriumi kutatásokban
345
tomatizált módszerek. Az immunanalitikai módszer
alapelvéből azonban számos hibalehetőség adódik.
Az egyik legfontosabb probléma, hogy az immunreaktív
molekulák koncentrációja nem mindig arányos
a biológiai aktivitással. Erre példa a parathormonmeghatározás,
amelynek első generációs assay-i
egy antitestet használtak, és bemérték az inaktív
C-terminális fragmenseket is. A második generációs
assay-k két antitesttel dolgoznak, az egyik a molekula
N-terminális, a másik a C-terminális régiója ellen
irányul, az intakt, biológiailag aktív parathormon
meghatározását célozva. Előfordulhat, hogy a monomer
hormon polimerré kapcsolódik, emiatt biológiai
aktivitása csökken, immunreaktivitása azonban megmarad.
Ez történik pl. macroprolactinaemia esetén,
amikor tévesen mérünk emelkedett prolaktinszintet.
További probléma, hogy az antigén-antitest reakciót
befolyásolja a közeg, amelyben zajlik: a plazmában a
fehérjefrakciók, az ionerősség vagy a pH változása. A
módszert autoantitestek vagy heterofil antitestek is
zavarhatják. Immunometrikus módszerek alkalmazásakor
fordul elő, hogy a mintában lévő rendkívül
nagy koncentrációjú antigén az első antitest kötőkapacitását
meghaladja, és a jelet adó második antitestet
is telíti, így tévesen alacsony hormonszintet mér
(„high-dose-hook” effektus).
A peptidhormonok kutatásának eredményei
A peptidhormonok kutatása kiemelt jelentőségű, a
gyógyászatban való alkalmazásuk igazi sikertörténet,
és napjainkban is bevezetés előtt állnak új készítmények.
Az inzulin felfedezése volt az első jelentős lépés,
amit rövidesen követett az első beteg kezelése (1922),
és azóta betegek millióinak életét mentette meg az inzulin.
Az elhúzódó hatású inzulin előállítása a farmakológia
fejlődésének újabb állomásait jelzi. Mérföldkőnek
számít az inzulin aminosavszekvenciájának
megismerését követően a géntechnológia fejlődése
révén a rekombináns technikával előállított humán
inzulinok világméretű elterjedése. Az inzulinkezelés
alapját ma a humán inzulinok adják, Magyarországon
a kilencvenes évek elejétől érhetők el ezek a készítmények.
A fehérjekutatás újabb jelentős eredménye
volt az inzulinanalógok előállítása a humán inzulin
aminosavszekvenciájának megváltoztatása révén. A
cél a hatás megrövidítése vagy megnyújtása volt az
élettanihoz leginkább hasonló inzulinkinetika elérése
érdekében. Az inzulinterápia ugyanis minden törekvés
ellenére korlátokkal bír: nem a megfelelő időben,
mennyiségben és nem a megfelelő helyre kerül az inzulin,
így az étkezést követő gyors inzulincsúcs nem
utánozható és az étkezések között feleslegesen magas
marad az inzulinszint. Az első gyors hatású inzulinanalóg
a lispro-inzulin volt, ahol a B-lánc 28. és 29.
helyén lévő két aminosav sorrendjét megcserélték
(prolin-lizin helyett lizin-prolin). A lispro-inzulin rövid
idő alatt monomer formát vesz fel, ezért gyorsabban
szívódik fel, hatásmaximuma nagyobb, hatástartama
pedig rövidebb, mint a humán inzuliné. Ennek
számos előnyét élvezik a betegek: nem kell várni az
inzulin beadása és az étkezés között (humán inzulinnál
a várakozási idő 30-40 perc), étkezés után kevésbé
emelkedik meg a vércukor, elhagyhatók a főétkezések
közötti étkezések. Ma két további gyors hatású inzulinanalóg
is forgalomban van, az aszpart-inzulin és a
glulizin, amelyek farmakokinetikája nagyon hasonló
a lispro-inzulinéhoz. Problémát jelentett a megfelelően
hosszú hatástartamú, naponta egyszer adható bázisinzulin
előállítása is. A két, klinikai gyakorlatban
használt hosszú hatástartamú inzulinanalóg a glargin
és a detemir, amelyek hatása már közelíti az ideális
bázisinzulint. A glargin molekulában az A-lánc 21.
helyén aszparagin helyett glicin van, a B-lánc végéhez
pedig két további arginin kapcsolódik. A molekulaszerkezet
ilyen módosításával sikerült elérni, hogy az
oldhatóság megváltozott, alacsony pH-n oldható, a
subcutisban lévő neutrális pH-n pedig kicsapódik az
inzulinmolekula, ami a felszívódást jelentősen megnyújtja.
A detemir hatástartamát más mechanizmussal
sikerült megnövelni. Itt a B-lánc 30. aminosava
hiányzik, a 29. aminosavhoz pedig egy zsírsavlánc
kapcsolódik, ami autoasszociációra teszi hajlamossá
a molekulát, és fokozza az albuminhoz való kötődést
is. A detemir lassabban szívódik fel és a keringésben
az albuminról fokozatosan válik le, hatástartama 12-
20 óra.
Az inzulin után rekombináns technikával előállított
következő hormon a növekedési hormon volt, ez
megoldást jelentett a gyermek-, majd később a felnőttkori
súlyos növekedési hormon hiány ellátására.
Hormonkészítmények egész sora került a következő
években a gyógyászatba. Néhány további példa a
teljesség igénye nélkül,: a GnRH-analógok alapvető
szerepet játszanak a prostatarák,az emlőrák, az endometriosis
kezelésében, alkalmazzák őket az asszisztált

346 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
reprodukciós programokban. Az utóbbiban a rekombináns
FSH és LH is nélkülözhetetlen. A szomatosztatin
analógjai (octreotid, lanreotid) a neuroendokrin
tumorok, az acromegalia kezelésének hatékony
eszközei. A rekombináns TSH a pajzsmirigy differenciált
carcinomáinak radiojódkezelésében kapott szerepet.
A dezmopresszin a centrális diabetes insipidus
szuverén szere. A teriparatid, a parathormon N-terminális
1-34 aminosavfragmentuma rendkívül hatékony
az osteoporosis kezelésében.
2010-ben kerültek hazánkban forgalomba a GLP-
1- (glukagonszerű peptid-1) agonisták, amelyek a
2-es típusú diabetes mellitus új kezelési lehetőségét
jelentik (exenatid, liraglutid). Az első tapasztalatok
rendkívül kedvezőek. A GLP-1 a bélrendszer distalis
részében, a nyálkahártya L-sejtjeiben termelődik.
Plazmaszintje a táplálékfelvétel hatására jelentősen
emelkedik. Fokozza az inzulin szintézisét, ugyanakkor
gátolja a glukagon elválasztását, lassítja a gyomorürülést
és csökkenti az étvágyat. Testsúlycsökkentő
hatása járulékos előny a diabetes mellitus kezelésében.
A GLP-1 szekréciója 2-es típusú diabetesben jelentősen
csökkent. A GLP-1 rendkívül gyorsan metabolizálódik
a keringésben, felezési ideje < 2 perc. A
lebontást a dipeptidil-peptidáz-IV (DPP-IV) enzim
végzi. A GLP-1-agonisták klinikai alkalmazásának
feltétele volt az élettartam megnövelése. Az exenatid
előállításában egy Arizonában élő gyík nyálából
izolált polipeptid, az exendin-4 segített. Ez a molekula
aminosavszekvenciájában 53% homológiát mutat
a humán GLP-1-gyel, de rezisztens a DPP-IV-gyel
szemben. A GLP-1-receptoron agonistaként működik.
Az exenatid az exendin-4 szintetikus változata.
A liraglutid a natív GLP-1 egy aminosavban és egy
16 szénatomos oldalláncban módosított analógja, a
DPP-IV hatásával szemben az albuminhoz való kötődés
védi meg.
A neuroendokrin hatású anyagok rohamosan bővülő
tárházát jelentik az adipokinek, a kizárólag vagy
döntően a zsírszövetben termelődő hormonok. A korábban
már jól karakterizált leptin mellett ide tartozik
az adiponektin, a rezisztin, a viszfatin, az apelin, a
vaszpin, a hepcidin, a chemerin és az omentin, amelyek
fiziológiás funkciója még csak részben ismert.
A kutatások egyik fő célpontja az étvágyszabályozás
megismerése. Az étvágyszabályozásban az adipokinek
mellett a bélhormonok is alapvető szerepet játszanak,
a GLP-1 mellett kiemelt fontosságú a ghrelin, a peptid
YY és az oxintomodulin. Az elhízás incidenciája
a világon aggasztó mértékben emelkedik, a testsúly
gyógyszeres csökkentése pedig jelenleg megoldatlan,
némi reményt csak az előbb említett GLP-1-agonisták
jelentenek. A bélben és a zsírszövetben termelődő
hormonok a szervezet tápláltsági állapotáról szállítanak
információt a hypothalamus étvágyszabályozó
központjaiba. Hatásuk jobb megismerése új terápiás
célpontokat jelenthet az elhízás és az ehhez kapcsolódó
civilizációs betegségek terápiájában.
Irodalom
Chaudhri, O. B., Wynne, K., Bloom, S. R.: Can gut hormones
control appetite and prevent obesity? Diabetes
Care 31(S2):84-89, 2008.
Drab, S. R.: Clinical studies of liraglutide, a novel, once-daily
human glucagon-like peptide-1 analog for improved
management of type 2 diabetes mellitus. Pharmacotherapy
29:43S-54S, 2009.
Freeman, J. S.: Insulin analog therapy: improving the
match with physiologicinsulin secretion. J. Am. Osteopath.
Assoc. 109(1):26-36, 2009.
Hartman, I.: Insulin analogs: impact on treatment success,
satisfaction, quality of life, and adherence. Clin.
Med. Res. 2008; 6(2):54-67.
Kovács L. G., Toldy E., Lőcsei Z., Mezősi E.: In: Debreczeni
L., Kovács L. G. (szerk.): Endokrinológiai laboratóriumi
vizsgálatok. Gyakorlati laboratóriumi medicina.
397-425. old. Literatúra Medica Kiadó, Budapest,
2008.
Leövey A., Nagy V. E., Paragh G. et al.: Az endokrin és
anyagcsere betegségek gyakorlati kézikönyve. 403-415.
old. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2011.
Modlin, I. M., Gustafsson, B. I., Moss, S. F. et al.: Chromogranin
A-biological function and clinical utility
in neuro endocrine tumor disease. Ann. Surg. Oncol.
17(9):2427-2443, 2010.
Pregun I., Bodoky G., Rácz K. et al.: Carcinoid daganatok.
Orv. Hetil. 151(46):1885-1894, 2010.
Wozniak, S. E., Gee, L. L., Wachtel, M. S. et al.: Adipose
tissue: the new endocrine organ? A review article. Dig.
Dis. Sci. 54(9):1847-1856, 2009.

A csontanyagcsere fehérjemarkerei
347
A csontanyagcsere
fehérjemarkerei
Kőszegi Tamás
A csontrendszer
A csontrendszer funkciói
A csontszövet nagyon sokrétű feladatot lát el.
Amellett, hogy szilárd vázat képez a test és az izomrendszer
számára, a csontvelőben képződnek a vörösés
fehérvérsejtek, a csont óriási kalciumraktárként is
funkcionál, hatékonyan részt vesz a sav-bázis egyensúly
szabályozásában és részese az endokrin folyamatok
szabályozásának is. Mindez csak úgy képzelhető
el, hogy a csontszövet rendkívül dinamikusan képes
válaszolni a szervezetet érintő hatásokra, elsősorban
biológiailag aktív fehérjék termelésével és a sejtes állomány
funkciójának gátlásával vagy stimulációjával.
Ez a fejezet elsősorban a csontanyagcserét érintő legfontosabb
folyamatokat foglalja össze, a fehérje természetű
komponensekre fokuszálva.
A csont összetétele
A csontszövet alapvetően anorganikus és organikus
összetevőkre bontható. Az anorganikus komponens
elsősorban vízből (ez a nedves súly 40%-a) és
hidroxi-apatit kristályokból áll, míg az organikus rész
a sejtes elemeket is magába foglaló „mátrixból” (11-
37. táblázat).
A csontszövet felépítése
Sejtes elemek
Osteoblastok. Az osteoblastok mononukleáris
sejtek, a csontújdonképződés helyein találhatók és
oszteoidnak nevezett, elsősorban kollagéntartalmú
csontszövetprekurzort termelnek. Pluripotens mesenchymalis
őssejtekből származnak, amelyek egy
része adipocytává is képes differenciálódni. A csontfelépítésben
vesznek részt (lásd később), éretlen
csontsejteknek (osteocyták) is tekinthetők. Feladatuk
elvégzése után a differenciált osteoblastok megnyúlt,
lapos „lining” sejtekké is alakulhatnak, ill. apoptotikus
mechanizmusok által el is pusztulhatnak.
Osteoclastok. Többmagvú, nagy sejtek, a monocyta
őssejtvonalból származnak. A csontlebontásban
vesznek részt, a lebontás helyein ún. lacunákban találhatók,
és aktivitásukkal üregeket képeznek az osteoblastok
és az új csontszövet számára. Fagocitózisra
képes sejtek, valamint lebontó enzimeket is termelnek
(részletesen lásd később). Mind az osteoblastok,
mind az osteoclastok aktív mozgásra képesek.
Osteocyták. Érett csontsejtek, az osteoblastokból
alakulnak ki, amelyek a mineralizációs folyamat során
mintegy befalazzák magukat és osteocytává differenciálódnak.
Az osteocyták is aktívak maradnak:
részt vesznek a kalciumhomeosztázis fenntartásában,
a mineralizációban, információkat közvetítenek a lebontó
és felépítő sejtek felé. Mechanoreceptorként
működve szabályozzák a csont terheléstől függő átépülését.
A csont mint dinamikusan átépülő szövet
Az első pillantásra statikusnak látszó, nagy szilárdságú
csontrendszer rendkívül élénk anyagcserét folytat
egész életünk során. Körülbelül 10 évente a teljes
csontállomány ásványi anyagának egésze kicserélődik.
A születés után igen intenzív csontosodási és növekedési
folyamatok zajlanak, majd 20 és 30 éves kor
közt éri el a csontsűrűség (BMD, bone mineral density)
a maximumát. Az átépülési folyamatok felnőttkorban
sem állnak le, de a menopauza után a nemek
között nagy különbség alakul ki a lebontó és felépítő
folyamatok egyensúlyában. Az angol irodalom a folyamatos
csontátépülésre a „remodeling” kifejezést
11-37. táblázat. A csontszövet összetétele
Csontalkotók csoportjai Arányuk a csontszövetben Alkotórészek
anorganikus összetevők
mátrix (organikus
összetevők)
kb. 60-65% száraz súlyra
vonatkoztatva
kb. 30-55% száraz súlyra
vonatkoztatva
hidroxiapatit (kalciumfoszfát kristály),
magnézium, egyéb elemek
I-es típusú kollagén, egyéb fehérjék
sejtes elemek (osteoblast, osteoclast, osteocyta)

348 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
használja. Érthető, hogy a remodeling szabályozásában
a biológiailag aktív fehérjék, a nemi és egyéb
hormonok és a kalcium-anyagcserét befolyásoló
D-vitamin is részt vesz. A karmester jellegű fehérjék
egy részét a csontszövet sejtes elemei termelik. A folyamatos
csontátépülés a terheléshez való alkalmazkodást
és a csontot érő mikrosérülések helyreállítását
szolgálja. Az aktív metabolizmus és átépülés ellenére
a reszorpciós és mineralizációs folyamatok az időtengelyen
relatíve lassan mennek végbe, néhány hét
szükséges a teljes átépüléshez.
A csontanyagcsere
Osteoblastok által termelt faktorok
Oszteoid
A csont organikus mátrixának fő alkotója, több fehérjéből
álló komplex struktúra.
Legfontosabb fehérje alkotói a következők:
I-es típusú kollagén. Csontspecifikus óriásmolekula,
két α 1
- és egy α 2
-láncból álló tripla hélix. Prokollagén
monomerként születik, a lizin és a prolin aminosav
poszttranszlációs hidroxiláción megy keresztül,
majd a monomerek szekretálódnak és mindkét
végükről (N- és C-terminális) részleges proteolízissel
peptidek hasadnak le. A termékek „ragadóssá”
válnak, és hosszú lineáris polimereket képeznek,
amelyeket a hidroxilált lizineken keresztül keresztkötések
stabilizálnak. A hidroxilációs folyamatokhoz
C-vitamin kofaktor szükséges, ennek hiányában
skorbut alakul ki.
Oszteokalcin. Nagy mennyiségben termelődő kis molekulatömegű
fehérje, aktiválásához K-vitamin szükséges,
amely elősegíti a γ-szénatom karboxilációját. A
karboxiláció a szomszédos glutamát mellett alakul ki,
az így létrejövő két szomszédos karboxilcsoport képes
lesz a kalciumion megkötésére. A Ca 2+ megcsapdázáshoz
integrinkötő szialoprotein is szükséges, az
immobilizált komplex ezután kristályosodási magot
képez, és kialakul a hidroxi-apatit (Ca 5
(PO4) 3
(OH)).
Az oszteokalcin működéséhez még egy másik gén átírására
is szükség van, amelyet a D-vitamin specifikus
kötőfehérjéje aktivál.
A nem karboxilált oszteokalcin egy része a keringésbe
kerül, és fokozza az inzulinelválasztást, ill. növeli
a zsírszövet inzulinérzékenységét, ezáltal stimulálja
az adiponektintermelést. Így az oszteokalcin a
szervezet anyagcseréjét is befolyásolja.
Oszteonektin. Az oszteoid komplex része, és összeköttetést
biztosít a hidroxi-apatit és a kollagénmátrix
közt.
Csontspecifikus alkalikus foszfatáz (BAP). Az alkalikus
foszfatáz (AP) izoenzimje, az osteoblastok felszínére
lokalizálódik, és foszfatáz aktivitásával részt vesz
a mineralizációban. A fokozott osteoblastaktivitás a
magyarázata annak, hogy az aktív csontnövekedés
időszakában a szérum AP-aktivitása a felnőtt-értékekhez
képest jóval nagyobb.
Citokinek. Az IL-1 és az IL-6, az osteoclastok érését
segíti elő. Az érési folyamat bonyolult, az osteoblastok
felszínén található és szekretált RANKL (receptor aktivált
nukleáris faktor k-B ligand) összekapcsolódik
az osteoclast prekurzor sejteken lévő RANK fehérjével,
elindítva az osteoclastok érését.
A gp 130 citokincsalád. Az utóbbi néhány évben több
biológiailag aktív fehérjét azonosítottak, amelyek
döntően befolyásolják a csontanyagcserét, és hatásuk
a gp 130-nak nevezett közös jelátviteli rendszeren
keresztül valósul meg. Ide tartoznak: IL-6, IL-11,
onkosztatin M, leukaemiainhibitor faktor (LIF), kardiotrofin-1.
Ezek a citokinek molekuláris felépítésükben
nagyon hasonlóak egymáshoz, a szolubilis
gp 130 rendszeren keresztül mind az osteoclastokra,
mind az osteoblastokra hatnak, és szerepük patológiás
állapotokban is jelentős (pl. oszteolitikus csontáttétek,
Paget-kór).
Egyéb növekedési faktorok. A csontátépülést az eddig
felsoroltakon kívül még számos biológiailag aktív fehérje
szabályozza, amelyek a csontsejtekben, a csontmátrixban
és a környező szövetekben termelődnek.
Hatásmechanizmusuk még nem teljesen tisztázott,
csak néhányat emelünk ki közülük. Transzformáló
növekedési faktor-β (TGF-β), csont eredetű növekedési
faktor (BDGF), fibroblast növekedési faktor
család (FGF), PDGF, egyéb csontnövekedési faktor
(bone morphogenetic protein, BMP). A TGF-β család
kiemelt szerepet játszik az osteoblastok proliferá-

A csontanyagcsere fehérjemarkerei
349
ciójában, amelyek azután BMP-t választanak ki, megindítva
ezzel a mineralizációt.
Mátrix metalloproteinázok, kollagenázok. Úgy tűnik,
az osteoblastok által szekretált proteolitikus enzimek
a még nem mineralizálódott oszteoidot képesek feloldani,
ami kemotaktikus úton vonzza az osteoclastokat,
és azok tovább folytatják a reszorpciót, mintegy
helyet készítve az osteoblastok számára. Így a létrejövő
kis üregekben megindul a csontújdonképződés
és a mineralizáció.
Oszteoprotegerin. Képes a RANKL-molekulához kötődni,
így inaktiválja azt. Az osteoclastaktiváció a
RANKL és az oszteoprotegerin expresszió egyensúlyától
függ.
Osteoclastok által termelt faktorok
Az osteoclastok differenciálódásához szükség van
a felsorolt faktorokon kívül macrophag kolónia stimuláló
faktorra (MCSF) és prosztaglandin E-re is.
Mindezen folyamatokat a parathormonelválasztás is
szabályozza. Az osteoclastok képesek protonszekrécióra,
így a csont anorganikus összetevőit savval oldják
fel. Az organikus komponenseket lizoszomális enzimeik
segítségével emésztik meg.
Lizoszomális savanyú hidrolázok. Nagyon sok enzim
sajátságú fehérje tartozik ide, amelyek többek közt a
kollagén lebontását is végzik. A teljesség igénye nélkül
néhány: tartarátrezisztens savanyú foszfatáz, katepszin-molekulacsalád,
szulfatázok, glikozidázok
stb.
A csontanyagcsere endokrin szabályozása
A vérplazma ionizált kalcium szintje a meghatározó
az endokrin szabályozásban, ugyanis a mellékpajzsmirigy
speciális sejtjei képesek az ionizált forma koncentrációjának
érzékelésére.
Parathormon (PTH). A mellékpajzsmirigyben termelődő,
84 aminosavból álló polipeptid, alacsony
ionizált kalcium szint stimulálja, magas pedig gátolja
a szekrécióját. Féléletideje a keringésben 4 perc. Az
osteoclastok aktivitását stimulálja, így emeli a vér kalciumszintjét.
A stimuláció nem közvetlenül, hanem
az osteoblastokon keresztül valósul meg: az osteoblastok
a magas PTH-szint következtében fokozzák az
IL-1, IL-6 és más citokinek, ill. az MCSF és a RANKL
termelődését, fokozva az osteoclastok érését. Hoszszú
távú hatást a PTH-szekrécióra a szervezet aktív
D-vitamin-szintje fejt ki.
Kalcitonin. Polipeptidhormon, a pajzsmirigy C-sejtjeiben
termelődik, a PTH-val ellentétesen a kalciumszintet
csökkenti. Jelentősége jóval kisebb, még nagy
kalcitoninkoncentrációnál (pl. kalcitonint termelő
tumornál) sem okoz problémát a kalciumhomeosztázisban.
Növekedési hormon (hGH). 191 aminosavból álló fehérje,
a hypophysisben termelődik, elválasztását a hypothalamus
szabályozza. Nélkülözhetetlen a csontok
hosszanti növekedéséhez, hiánya törpenövést, túlprodukciója
gigantismust eredményez. Hatását indirekt
módon fejti ki, fokozva a máj inzulinszerű növekedési
faktor szekrécióját.
Inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1). Az inzulinhoz
hasonló szerkezetű polipeptid, degradációját
specifikus kötőfehérje akadályozza meg. Képes a
csontban a mineralizált területeken deponálódni más
növekedési faktorokkal együtt (TGF-β, thrombocyta
eredetű növekedési faktor, PDGF) és ott hosszú ideig
aktív állapotban maradni. Parakrin módon hat, a
chondrocyták stimulációjával és az osteoblastok osztódásának
serkentésével. Az IGF-1 hatása kiegyensúlyozottabb,
mint a hGH-é, de a növekedés szabályozásában
mindkettő egyaránt fontos. A csontban
deponálódott növekedési faktorok elősegítik a csontáttéteket
adó tumorok gyors proliferációját.
Pajzsmirigyhormonok. Elengedhetetlenül szükségesek
a normális csontmetabolizmushoz, de hatásukról
még keveset tudunk. A trijódtironin (T 3
) hormon
nukleáris támadáspontú, és a génátírást szabályozza,
a DNS-hez specifikus kötőfehérjéken keresztül kapcsolódik.
Újabban kimutatták, hogy a TSH (thyroideastimuláló
hormon) az osteoclastok aktivitását
gátolja. A nem kezelt veleszületett hypothyreosis is
törpenövést eredményez.
Szteroidhormonok. Nem fehérje természetű molekulák,
de a csontmetabolizmusban mégis fontos szere-

350 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
pet töltenek be. Az androgének és ösztrogének szintén
nukleáris támadáspontúak, de hatásuk nagyon
összetett. Az ösztrogének gátolják az osteoclastok
tevékenységét, stimulálják az oszteoprotegerin szekrécióját
és gátolják az osteoclastaktivációt elősegítő
faktorok szintézisét. Megfelelő ösztrogénszintnél a
csontvesztés lassú, a menopauza után ez felgyorsul.
Férfiakban az androgén hormonok mennyisége csak
időskorban csökken számottevően, ezért a csontok
ásványi anyagának vesztése a nőkhöz képest jóval később
következik be.
A glukokortikoidok egyaránt hatnak a felépítő és a reszorpciós
mechanizmusokra. Gátolják az osteoblastokban
a kollagén, az oszteokalcin és az oszteoprotegerin
szintézisét, fokozzák a RANKL-produkciót.
Ennek következtében nő az osteoclastok száma és
aktivitása, fokozódik a csontvesztés.
A fizikai aktivitás szerepe
Régóta ismert, hogy a fizikai inaktivitás csontsűrűségvesztést
eredményez. A csont mechanikai terhelését
az osteocyták érzékelik, egyelőre kevéssé ismert
mechanizmusok alapján, és képesek szintén alig ismert
molekuláris folyamatokkal információt közvetíteni
a szomszédos osteoblast- és osteoclastsejtek felé.
Ily módon a fizikai terhelés befolyásolja, stimulálja a
csontmetabolizmust, a mechanikai szükségleteknek
megfelelően átépülnek a csontgerendák. Újabban azt
is feltételezik, hogy az izom-összehúzódások közvetítette
erőhatás az izmok tapadási helyén szintén aktiválja
az osteocytákon keresztül a lebontó és felépítő
folyamatokat. A megfelelő fizikai aktivitás ily módon
segíti elő a csontsűrűség megőrzését.
Táplálkozás
Ahogyan az előzőkben láttuk, a csontanyagcsere
hat az egész szervezet metabolizmusára az inzulinválasz
módosításán keresztül. Ugyanakkor a szervezet
tápanyag-ellátottsága is visszahat a csontmetabolizmusra
a leptin mediálta folyamatok következtében.
A leptint az adipocyták termelik (szokás ezért adipokinnek
is nevezni), és vérszintje az egyén zsírraktárának
nagyságával arányos. A leptin szintje diurnális
ingadozást mutat, mennyisége a táplálékfelvételtől
is függ. Elsődlegesen az agyban fejti ki hatását a hypothalamuson
keresztül. A hypothalamus impulzusai
a sympathicus neuronokon keresztül stimulálják
a b 2
-adrenerg receptorokat (noradrenalinválasz). Az
osteoblastok és az osteoclastok aktivitása a stimulustól
függően nőhet vagy csökkenhet, egyelőre a mechanizmusáról
keveset tudunk. Egy azonban biztos,
a tápláltsági állapot és a csontsűrűség között összefüggés
van, pl. anorexia nervosában alacsony leptinszintet
és osteoporosist látunk.
A 11-83. ábrán a csontátépülés folyamatai láthatók.
A leggyakoribb csontanyagcsere-betegségek
Osteoporosis
Az osteoporosist népbetegségként tartja számon
az irodalom, holott természetes biológiai folyamatok
eredménye. Amiért mégis betegségként is foglalkoznunk
kell vele, azt az a körülmény magyarázza, hogy
a civilizációs, táplálkozással–életmóddal összefüggő
tényezők fokozottan segítik kialakulását. Szerepet
játszik ebben a fizikai inaktivitás, az ásványi anyagokban
szegény táplálkozás, a fokozott foszfátbevitel
11-83. ábra. A csontátépülés ciklusai

A csontanyagcsere fehérjemarkerei
351
(pl. foszforsavat tartalmazó üdítő italok és ömlesztett
sajtok fogyasztása), ami acidosist és következményes
kalciumkiáramlást eredményez a csontokból.
Az osteoporosis diagnózisa egyértelműen képalkotó
technikákon alapul, de ezek a módszerek nem
mondanak semmit a csontmetabolizmus dinamikájáról.
Osteoporosisnál ugyanis a csontturnover
fokozódik, de a formáció mindig kisebb mértékű
a reszorpciónál, ezért csökken a BMD. Az állapotfelmérés
helyes stratégiája a csontsűrűségméréshez
hozzárendelt biokémiai marker meghatározás. A betegség
követéséhez ezután a továbbiakban elegendő a
biokémiai paraméterek monitorozása.
Laboratóriumi monitorozás
Csontfelépülést jelző (formációs) markerek:
• Oszteokalcin (jobb a teljes, de labilis molekula
helyett annak degradációs termékét meghatározni,
ezt „N-MID-oszteokalcin” névvel jelölik).
• Prokollagén propeptidek (N- vagy C-terminális
I. típusú prokollagén propeptid, P1NP).
• Csont eredetű alkalikus foszfatáz.
• D-vitamin: 25(OH)D 3
és/vagy 1,25(OH) 2
D 3
.
Csontleépülést jelző (reszorpciós) markerek:
• Tartarátrezisztens savanyú foszfatáz (TRAP).
• N- vagy C-terminális I. típusú kollagén telopeptid.
• Vizelet-piridinolin- és dezoxi-piridinolin-ürítés.
A kollagén hármas hélixének stabilizálásában a kollagén
monomerek két végén (N- és C-terminális)
lineáris szakaszok, ún. telopeptidek találhatók. A telopeptidek
gyűrűs vegyületek (piridinolin, PYD és
dezoxi-piridinolin, DPD) segítségével kovalensen
kötődnek a szomszédos kollagénrostok helikális régiójához
(11-84. ábra).
11-84. ábra. A csont eredetű kollagén stabilizációja (keresztkötés)
(DPD: dezoxi-piridinolin)
A reszorpciós markerek széles skáláját határozhatjuk
meg, a kis molekulatömegűeket (PYD és DPD)
elsősorban a vizeletből, ebben az esetben a mért értékeket
a vizelet kreatininkoncentrációjának hányadosaként
adjuk meg. A vérszérumból mérhetjük az
ún. b-keresztkötést, amely a C-terminális telopeptid
8 aminosavból álló stabil degradációs terméke. Az
NTX és CTX nevű reszorpciós marker a telopeptidek
amino- és karboxi-terminális degradációs termékei,
szintén a vérszérumból határozzuk meg őket.
Paget kór
Ismeretlen eredetű betegség, ahol az osteoclastok
aktivitása (csontreszorpció) fokozódik és a csontfelépítés
ezt nem tudja kompenzálni. A biokémiai követésnél
a reszorpciós markerek mennyiségi növekedését
tapasztaljuk.
Daganatos csont áttétek
A malignus folyamatok jó részében a daganatra
jellemző tumormarkerek mérése terjedt el. A tumormarker-koncentrációk
növekedése azonban nem
mond semmit a folyamat szöveti lokalizációjáról.
Csontmetasztázisok gyanújakor nagyon hasznos lehet
a csontszövet érintettségének megítélése szempontjából
a reszorpciós markerek követése.
Irodalom
Ali, S. M., Demers, L. M., Leitzel, K. et al.: Baseline serum
NTx levels are prognostic in metastatic breast cancer
patients with bone-only metastasis. Annals of Oncology
15:455–459, 2004.
Srivastava, A. K., Vliet, Elizabeth L., Lewiecki, E. M.
et al.: Clinical Use of Serum and Urine Bone Markers
in the Management of Osteoporosis. Curr. Med. Res.
Opin. 21(7):1015-1026, 2005.
Buckley, K. A., Fraser, W. D.: Receptor activator for nuclear
factor kappaB ligand and osteoprotegerin: regulators
of bone physiology and immune responses/potential
therapeutic agents and biochemical markers. Ann.
Clin. Biochem. 39(6):551–556, 2003.
Czupalla, C., Mansukoski, H., Riedl, T. et al.: Proteomic
Analysis of Lysosomal Acid Hydrolases Secreted by
Osteoclasts. Molecular & Cellular Proteomics 5:134–
143, 2006.
Helmberg, A.: Bone metabolism. http://helmberg.at/bone-metabolism.htm
Heynmann, D., Rousselle, A.-V.: gp 130 Cytokine family
and bone cells. Cytokine 12(10):1455-1468, 2000.

352 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Hill, PA, Orth, M.: Bone remodelling. British Journal of
Orthodontics 25: 101-107, 1998.
Robling, A. G., Castillo, A. B., Turner, C. H.: Biomechanical
and Molecular Regulation of Bone Remodeling.
Annu. Rev. Biomed. Eng. 8:455–498, 2006.
Utility of Bone Markers in Osteoporosis. http://emedicine.
medscape.com/article/128567-overview
Vesper, H., Cosman, F., Endres, D. B. et al: Application of
Biochemical Markers of Bone Turnover in the Assessment
and Monitoring of Bone Diseases; Approved Guideline.
NCCLS document C48-A (ISBN 1-56238-539-
9), NCLLS Pennsylvania USA, 2004.

A metabolikus szindróma és a fehérjék
353
A metabolikus szindróma
és a fehérjék
Wittmann István
A metabolikus szindróma jelentőségét az adja, hogy
a mai magyar és általánosságban a nyugati típusú
életmódot folytató populációkban folyamatosan és
drasztikusan növekvő arányban fordul elő, ill. ezekben
a populációkban a mortalitási statisztikák élén
járó kardiovaszkuláris betegségek legfőbb kockázati
tényezője. Ráadásul újabb adatok alapján úgy tűnik,
hogy a nyugati típusú életmódot folytató népességek
második legjelentősebb haláloka, a rákos halálozás
kialakulásában is szerepet játszhat.
A metabolikus szindróma komponenseinek száma
az utóbbi időben állandó vita tárgya volt. A különböző
kritériumrendszerek eltérő komponenseket soroltak
ide (lásd később). Mégis mindegyikben közös
az anyagcsere-eltérések és a vérnyomás (a hemodinamikai
változások) egy tünetegyüttesben való szerepeltetése.
Sőt a hemodinamika- és az anyagcserezavarok
kapcsolatának megjelölésére számos elnevezés
is született. Bízvást állíthatjuk, hogy egyik elnevezés
sem ideális abból a szempontból, hogy a kockázati
tényezők és következményeik koherens, együttes
megnevezését rövid formában jelenítse meg. A jelenleg
egyre elterjedtebben használt kardiometabolikus
elnevezéssel kapcsolatban több kritika is felvetődött.
Egyrészt ebből az elnevezésből teljesen hiányzik a hypertonia
megjelölése, holott az nagyon fontos komponense
a szindrómának, és ráadásul ez a terápiásan
leginkább befolyásolható. A kardiometabolikus megjelölés
úgy tűnteti fel a szindrómát, mintha a szív- és
anyagcsere-betegségek közös kockázatát jelölné, holott
a szívbetegség kockázatául szolgáló anyagcsere- és
magasvérnyomás-betegséget jelöli. Hozzá kell tenni
ehhez azt is, hogy nem csak a szívbetegség, hanem
minden artériás, macrovascularis betegségnek a kockázati
tényezőit összegzi, azaz fennállása esetén nem
csak az ischaemiás szívbetegséget, hanem a perifériás,
az agyi és egyéb artériás betegséget is keresni,
megelőzni és szükség esetén kezelni kell.
Mi több, az utóbbi időben azt is felismerték, hogy
a nyugati civilizáció egyik legköltségesebb egészségügyi
kezelési eljárásának, a vesepótló kezelésnek az
indokát jelentő végállapotú veseelégtelenség kialakulásában
is meghatározó szerepet játszik a metabolikus
szindróma.
A metabolikus szindróma definíciói
Mint a címből is kitűnik, a metabolikus szindrómának
az utóbbi években számos definíciója született.
Sőt néhány éve magának a szindrómának a létét is
kétségbe vonták. Ezzel kapcsolatban a klinikusok
álláspontja az, hogy a megelőzés és a kezelés szempontjából
a metabolikus szindróma létezésének hipotézisét
szükséges fenntartani, mert legeredményesebb
az együtt jelentkező tünetek egyidejű megelőzése és
kezelése, az ún. holisztikus, teljességre törekvő megközelítés.
Tudományos szempontból a patofiziológiai
megközelítés, amely a metabolikus szindróma középpontjába
az inzulinrezisztenciát állítja, szintén a
szindróma fogalmának megtartása mellett érvel. Az
epidemiológiai szempontú nézetek szerint továbbra
is kétséges a szindróma léte.
A metabolikus szindróma kritériumrendszerei közül
csak a legismertebbek kerülnek bemutatásra. A
legkorábbi a WHO által megadott kritériumrendszer
[13].
A WHO kritériumrendszere:
1. Inzulinrezisztencia, amit a következők valamelyikével
identifikálunk:
• 2-es típusú diabetes mellitus.
• Emelkedett éhomi plazmaglukózszint (IFG).
• Csökkent glukóztolerancia (IGT).
• Pozitivitás hyperinsulinaemiás-euglykaemiás
clamppel.
2. Ezenkívül bármelyik kettő a következőkből:
• Antihipertenzív kezelés és/vagy > 140/90
Hgmm vérnyomás.
• Szérumtriglicerid-szint > 1,7 mmol/l.
• Szérum HDL-koleszterinszint:
- férfi < 0,9 mmol/l;
- nő < 1,0 mmol/l.
• Testtömegindex (BMI) > 30 kg/m 2 és/vagy a
csípő-derék hányados (WHR):
- férfi > 0,9 (ffi);
- nő > 0,85.
• Vizelet-albuminürítés (UAER) > 20 mg/min,
vagy az albumin-kreatinin hányados (ACR) >
30 mg/g kreatinin.

354 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A National Cholesterol Education Program’s Adult
Treatment Panel III Report (ATPIII) szerinti kritériumrendszer
a következőképpen alakul [14]:
1. Abdominalis obesitas; derékkörfogat:
- férfi > 102 cm;
- nő > 88 cm.
2. Ezenkívül bármelyik kettő a következőkből:
• Szérumtriglicerid-szint > 1,7mmol/l.
• Szérum HDL-koleszterin-szint:
- férfi < 1,04mmol/l
- nő < 1,29mmol/l
• Vérnyomás > 130/85 Hgmm.
• Éhomi plazmaglukóz-koncentráció > 6,1
mmol/l.
A Nemzetközi Diabetes Szövetség (IDF) definíciója
[15]:
1. Centralis obesitas, derékkörfogat:
- férfi > 94 cm;
- nő > 80 cm.
2. Ezenkívül bármelyik kettő a következőkből:
• Szérumtriglicerid-szint > 1,7 mmol/l.
• Szérum HDL-koleszterin-szint:
- férfi < 1,03 mmol/l;
- nő < 1,29 mmol/l.
• Vérnyomás > 130/85 Hgmm vagy kezelt hypertonia.
• Éhomi plazmaglukóz-koncentráció > 5,6
mmol/l vagy 2-es típusú diabetes mellitus.
Az IDF legutóbbi, 2009-es definíciós revíziója szerint
az előző kritériumrendszer annyiban módosult, hogy
a centralis obesitas egyenrangúvá vált a többi komponenssel.
Azaz bármely három komponens együttes
jelenléte esetén a metabolikus szindróma diagnózisa
kimondható [16].
A metabolikus szindróma előfordulása
A metabolikus szindróma előfordulási adatai hatalmas
szórást mutatnak az alkalmazott kritériumrendszer
és a vizsgált populáció szerint. Az USA-ban a
National Health and Nutrition Examination Survey
(NHANES) tanulmányban az ATPIII-kritériumrendszerrel
33,9%, a WHO-kritériumok használatával
36,9% volt a metabolikus szindróma előfordulása. Két
másik amerikai tanulmányban (FOS, SAHS) 21-27%
közötti értékeket találtak az ATPIII-kritériumokat alkalmazva.
Két francia tanulmányban (STANISLAS,
DESIR) az ATPIII kritériumrendszerét alkalmazva
6-9% közötti értékek adódtak, jelentős nemi differenciával.
Ráadásul úgy tűnik, hogy az előfordulás
gyakoribbá válik, a NHANS-vizsgálatban 1988-1994
és 1999-2000 között 5,6 mmol/l-es éhomi plazmaglukózt
alapul véve 28-ról 31,9%-ra, 6,1 mmol/l-es
éhomi plazmaglukózt véve 23,1-ről 26,7%-ra nőtt. Mi
több, a legutóbbi, 2009-es IDF-kritériumrendszert alkalmazva
a 20 év feletti populációban 40,1%-osnak
adódott a metabolikus szindróma előfordulási értéke,
férfiak körében 41,9, nők körében 38,3%-kal.
A metabolikus szindróma patogenezise
Az inzulin szerepe
Kétféle megközelítés különíthető el, amelyek a kritériumrendszerekben
is megnyilvánultak. Az egyik szerint
(lásd WHO-kritériumrendszer) a metabolikus
szindróma kialakulásának központi eleme az inzulinrezisztencia,
a másik megközelítés (lásd ATPIII- és
IDF-kritériumrendszer) a zsírsejtek eltéréseit helyezi
a középpontba. Ez utóbbit a szubklinikus gyulladás
során írjuk le részletesen és az inzulinrezisztencia kialakulásának
okát is később tárgyaljuk.
Az inzulinrezisztencia következményeképpen hyperinsulinaemia,
szénhidrát- és zsíranyagcsere-zavar
alakul ki. Érdekes módon az inzulinszekréció két fázisa
– az első vagy korai és a második vagy késői fázisa
- eltérően változik (11-85. ábra) [17].
A kezdetei normoglykaemiás (normális glukóz-tolerancia,
NGT) fázisban általában csak obesitas van,
esetleg nem komplett vagy komplett metabolikus
szindrómával és csökkenő első, ill. emelkedő második
fázisú inzulinszekrécióval. A betegség progreszsziója
során csökkent glukóztolerancia (IGT) alakul
ki, és tovább csökken az első, ill. maximálisra nő a
második fázisú inzulinszekréció. Amikor a második
fázisú inzulinszekréció is csökkenni kezd a pancreas-szigetek
b-sejtjeinek kimerülése miatt, akkor diagnosztizáljuk
a 2-es típusú diabetes mellitust (DM).
Az inzulinszekréció károsodását az is jelzi, hogy az
inzulinrezisztencia előrehaladtával folyamatosan nő a
keringésben a proinzulin/inzulin arány, jelezve, hogy
az inzulinszekréciós granulumokban az inzulin érési

A metabolikus szindróma és a fehérjék
355
11-85. ábra. Az inzulinszekréció első (korai) és második
(késői) fázisának változása a betegség fennállásának előrehaladtával
folyamata is károsodik. Ráadásul az emelkedő vércukorszint
miatt mind nagyobb lesz a működésében
károsodott, nem enzimatikusan glikált inzulin és inzulinreceptor
aránya.
Amennyiben a metabolikus szindrómás betegnek
károsodik a vesefunkciója (említettük, hogy a metabolikus
szindróma a veseelégtelenség leggyakoribb
oka), akkor csökken a kis molekulatömegű fehérjék
eliminációja is. A vesében ugyanis a 65 kDa molekulatömeg
alatti fehérjék szabadon filtrálódnak, majd a
proximalis tubularis sejtek által reabszorpcióra kerülnek.
A reabszorpció után túlnyomó részük a tubularis
sejtekben lebomlik. Így tehát veseelégtelenségben
a csökkenő filtráció miatt megemelkedik az inzulin,
sőt a C-peptid szintje is, ami miatt az inzulinrezisztencia
ezekben a betegekben kevésbé szembetűnő,
ill. kezelésük során a gyógyszerek és az inzulin dózisa
gyakran csökkenthető. A C-peptidről szerkezeti,
fiziológiai, szabályozási információ az interneten olvasható
[18].
Fehérjék az inzulin kivételével
Obesitasban a zsírsejtek által termelt
proteinek
Obesitasban a zsírsejtek extracelluláris mátrixfehérjéket,
anyagcsere, immun hatású és egyéb proteineket
termelnek:
• Extracelluláris mátrixfehérjék: a 2
-makroglobulin,
katepszin B, D, L, S, kollagén a 1
III, IV, VI,
XIV, XV, XVII, kollagén a 2
I, IV, VI, kollagén a 3
VI, disztroglikán, entaktin, fibulin 2, 3, fibronektin,
galektin-3-kötő fehérje, gelzolin, laminin
a 4
, b 1
, g, lizil-oxidáz, matrilin-2, mátrix-metalloproteináz
1-24, szöveti metalloproteáz
inhibitor 1-4, oszteonektin, perlekán, prokollagén
C-proteináz aktiváló protein, protein-lizin-6-oxidáz,
spondin-1, tenacin, trombospondin
1, 2.
• Anyagcsere-hatású termékek: adipszin, adiponektin,
apelin, apo-E, IGF-1, IGF-1-kötő fehérje,
lipoprotein-lipáz, leptin, éhezés indukálta
obesitasfaktor, PAI-1, rezisztin, retinolkötő protein-4,
vaszpin, viszfatin.
• Immunhatású proteinek: a 1
savas glikoprotein,
kolóniastimuláló faktor-1, komplementkomponens-inhibítor
C1, komplement C1, C2, C3, C4,
C7, komplementfaktor B, C és D, CRP, haptoglobin,
interleukin 1-b, interleukin 4, 6, 7, 8, 10,
12, 18, lipokalin 24p3, macrophagmigrációt
gátló faktor-1, monocyta kemoattraktáns protein-1,
szérumamiloid A3, TNF-a.
• Egyéb proteinek: angiopoetin 1, 2, angiotenzinogén,
kalcitonin, kemerin, ciklofilin A, C, extracelluláris
szuperoxid-dizmutáz (SOD), galektin-1,
fibroblastnövekedési faktor, májnövekedési
faktor, aldoszteron-releasing faktor, idegnövekedési
faktor, pigment-epithelium eredetű
faktor, transzferrin, stroma eredetű faktor-1,
transzformáló növekedési faktor-b (TGF-b),
szöveti faktor, vascularis endothelialis növekedési
faktor.
Ezek közül a fehérjék közül a következőkkel foglalkozunk
részletesebben, tekintettel arra, hogy szorosabb
a kapcsolatuk a metabolikus szindrómával: extracelluláris
mátrix fehérjék, tumornekrózis-faktor-a
(TNF-a), interleukin-6 (IL-6), monocyta kemoattraktáns
protein-1 (MCP-1), leptin, adiponektin, rezisztin,
retinolkötő protein-4, viszfatin, aldoszteron-releasing
faktor.
Extracelluláris mátrix fehérjék
Obesitasban a zsírsejtek megváltoztatják az extracelluláris
mátrix összetételét, ami lokális gyulladáshoz
vezet. Ectopiás zsírszövet képződik az erek
és a szív körül, amely károsítja működésüket, talán
éppen citokinek termelése révén is. Ma még nem

356 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
tudjuk, hogy az extracelluláris mátrix megváltozása
oka vagy következménye-e az obesitasban látott eltéréseknek.
TNF-a [19]. Szérumszintjének emelkedése a sejtek
felszínén megtalálható citokinreceptor aktivációján
keresztül intracelluláris oxidatív stresszt indukál. Ennek
mechanizmusa a NADPH-oxidáz enzim aktivációja,
ami fokozott szuperoxid szabadgyöktermelést
indít meg. A szuperoxid szabad gyököt a SOD emzim
diszmutálja hidrogén-peroxiddá, amely gátolja az inzulin
intracelluláris jelátvitelét és ezáltal inzulinrezisztenciát
vált ki. A folyamat pozitív visszacsatolást
idézhet elő azáltal, hogy az intracelluláris oxidatív
stressz az NF-k-B nukleáris receptort aktiválva további
citokin- és citokinreceptor-expressziót indukálhat
és ezzel circulus vitiosus alakulhat ki.
Interleukin-6 (IL-6) [20]. Az inzulinrezisztenciával
való kapcsolata ellentmondásos. Egyesek szerint
az inzulinreceptor-szubsztrát ubikvitin keltette
degradációját okozza a májban és a zsírsejtekben.
A vázizomban azonban fizikai aktivitás során, amikor
az inzulinérzékenység jelentősen javul, drámai
IL-6-emelkedést írtak le.
Monocyta kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) [21].A
zsírsejtek által termelt MCP-1 kemotaktikus hatású
a macrophagokra. A zsírszövet macrophaginfiltrációja
fontos szerepet játszik a szubklinikus gyulladás
kialakulásában, amely nagy jelentőségű az inzulinrezisztencia
létrejöttében (nem kis részben szerepe van
ebben a macrophagok által termelt citokineknek, lásd
a TNF-a-nál).
Leptin [22].Elnevezése a görög leptosz (sovány) szóból
ered. Ez a 167 aminosavból álló hormon elsősorban
a zsírsejtekben termelődik, és az étvágyat, valamint
az energi-felhasználást szabályozza. Túltáplálás
hatására termelése nő, éhezéskor csökken. Receptora
a citokinreceptor-családba tartozik, jelátvitelében
szerepel az inzulinreceptor-szubsztrát is. Növeli a citokintermelést
és ezáltal is befolyásolja a szubklinikai
gyulladást. Fölvetődött a leptinkezelés lehetősége
obes, metabolikus szindrómás betegek esetében, a kezelés
azonban hatástalannak bizonyult, mert leptinrezisztencia
alakult ki a betegekben. A legmagasabb
leptinszinteket szérumban metabolikus szindrómás,
uraemiás betegekben lehet mérni, ennek szerepe lehet
az uraemiás fogyás kialakulásában.
Adiponektin [23]. Ezt a 30 kDa-os molekulatömegű
proteint is a zsírsejtek termelik; szérumszintje inzulinrezisztenciában
csökken. Polimer formában van
jelen a keringésben, oligomer (trimer, hexamer) és
polimer (18-szoros) formája is előfordul. Inzulinérzékenységet
javító formája nagymértékű polimerizációs
fokot mutat. Ubikviter két receptorán (AdipoR1
és AdipoR2) keresztül fejti ki hatását, amely többek
között az AMP-kinázon (AMPK) keresztül jön létre.
Rezisztin [24]. Ez a 12 kDa molekulatömegű, homodimerként
szekretálódó fehérjehormon zsírsejtekben
és macrophagokban is expresszálódik. Kimutatták
kapcsolatát az inzulinrezisztenciával, gátolja az inzulin
kiváltotta glukóz- és zsírsavfelvételt. Úgy tűnik,
hogy szoros, de ellentmondásos kapcsolatban áll a
gyulladásos folyamatokkal. Lipopoliszaharid (LPS)
növeli a rezisztin termelődését, és a rezisztin hatására
emelkedik a TNF-a-képződés. Ugyanakkor néhány
sejtkísérletben ezeket az eredményeket nem sikerült
megerősíteni és humán epidemiológiai vizsgálatokban
az egyéb adipokinre való korrigálás után a rezisztin
inzulinrezisztenciára kifejtett hatása kismértékűnek
tűnt.
Retinolkötő protein-4 [25]. Overexpressziója során
inzulinrezisztenciát írtak le, sőt a szérumszintje
összefüggést mutatott a metabolikus szindróma
komponenseivel, az obesitassal, a magas
systolés vérnyomással, a szérumtriglicerid-szinttel
és a HDL-koleszterin-koncentrációval. Szoros inverz
korrelációt találtak a zsírszöveti GLUT-4 (az inzulinfüggő
glukóztranszporter) expressziójával. Mivel a
retinolkötő protein-4 az A-vitamin transzportere, a
továbbiakban szükség lesz annak megvizsgálására,
hogy van-e összefüggés az A-vitamin metabolizmusa
és a metabolikus szindróma között.
Viszfatin [26]. A zsírsejtekben és a macrophagokban
termelődő adipokin. Korai B-sejt-növekedési faktorként
ismerték meg először, és csak később derült ki,
hogy hat a szénhidrát-anyagcserére is. Számos gyulladásos
folyamatot befolyásol, ezért úgy tekinthetünk
rá, mint primeren gyulladásos mediátorra. A vércukorszintet
csökkenti, az inzulinrezisztenciát mérsék-

A metabolikus szindróma és a fehérjék
357
li. Ezt a hatását azzal éri el, hogy növeli az IRS-1 és
az IRS-2 tirozin-foszforiláltságát és aktiválja az Akt-t.
Érdekes módon a viszfatin kötődik az inzulinreceptorhoz,
de más pozícióban, mint az inzulin. Szérumszintje
nem változik az étkezéssel párhuzamosan, és
koncentrációja csak mintegy tizede az inzulinénak.
Aldoszteron-releasing faktor [27]. A 2003-ban közölt
adatok arra utalnak, hogy a zsírsejtek termelnek egy
speciális fehérje természetű hormont, amely a mellékveséből
aldoszteronszekréciót indukál. Az aldoszteron
pedig intracellulárisan oxidatív stresszt kelt,
gátolja az inzulinreceptor-szubsztrát tirozinjának
foszforilálását és serkenti a szerin foszforilálását. Ez
csökkenti az inzulin-jelátvitelt (a részleteket lásd még
később).
Az endoplazmatikus retikulum stressz
Az endoplazmatikus retikulum az a sejtorganellum,
amely a fehérjék szintézisét végzi. Fokozott fehérjeszintézis
esetén az endoplazmatikus retikulum
nem tud megbirkózni a feladattal és károsodik működése,
ilyenkor endoplazmatikus retikulum stresszről
beszélünk. Következménye, hogy a fehérjék „folding”-ja
nem történik megfelelően, és a fehérjék az
endoplazmatikus retikulumban akkumulálódnak.
Ennek hatására a sejt speciális folyamatokat indít
be (unfolded protein response, UPR), amelyek eredménye
citokintermelés és gyulladás lesz. Az endoplazmatikus
retikulum stressz során az inzulinreceptor-szubsztrát
szerin-foszforilációja alakul ki, amely
önmagában inzulinrezisztenciát kelt.
Egyéb hormonok
Sok hormon esetében igazoltak inzulinrezisztenciát
okozó hatást. Közismert a glukokortikoidok, a pajzsmirigyhormonok,
a növekedési hormon (IGF-1), a
sympathicus idegrendszer jelátvivőinek és a glukagonnak
a kontrainzuláris hatása.
Gastrointestinalis hormonok
Ghrelin [28]. A ghrelin génnek 3 terméke ismert:
az acil-ghrelin, a dezacil-ghrelin és az obesztatin. Az
acil-ghrelin 28, a dezacil-ghrelin 27, az obesztatin 23
aminosavból áll, és a preproghrelinből proghrelinen
keresztül képződnek. Az acil-ghrelin (GHS-R1a és
GHS-R1b) és a dezacil-ghrelin (GHS-Rx) receptora
ismert, de az obesztatiné nem. Az acil-ghrelin a gyomor
X/A sejtjeiben képződik, növeli a gastrointestinalis
traktus motilitást, képes átlépni a vér-agy gáton
és fokozza az étvágyat, de az obesztatin nem képes
passzálni a vér-agy gátat. Az acil-ghrelin csökkenti
az inzulinszekréciót és az inzulinérzékenységet. Ezzel
szemben a dezacil-ghrelin növeli az inzulinszekréciót
és javítja az inzulinérzékenységet. Ezek alapján úgy
tűnik, hogy az acil- és dezacil-ghrelin aránya fontos
lehet az inzulinérzékenység szempontjából és a dezacil-ghrelinnek
talán terápiás szerepe is lehet a metabolikus
szindrómában. Ezirányú további vizsgálatok
szükségesek.
Inkretinek [29]. Hagyományosan két hormont szokás
itt megemlíteni, amelyek a metabolikus szindróma
szempontjából fontosak lehetnek: a glukagonszerű
peptid-1-et (GLP-1) és a glukózdependens inzulinotrop
peptidet (GIP). Az inzulinrezisztenciával járó 2-es típusú
diabetes mellitus kezelésében mind szélesebb
körben alkalmazott ún. inkretinkezelés ezek befolyásolásán
vagy hatásuk imitálásán keresztül valósul
meg. A GLP-1 az ileum és a vastagbél L-, a GIP a duodénum
K-sejtjeiben termelődik. Mindkettő glukózszintfüggően
stimulálja az inzulinszekréciót, elsősorban
a korai (első) fázist. Ez a hatásuk a nervus vagus
afferentációjának befolyásolásán keresztül valósul
meg. A GLP-1 gátolja a gyomorürülést, csökkenti a
táplálékfelvételt és így a testsúlyt is, gátolja a glukagonszekréciót,
de mindezekre a GIP nincs hatással.
A GLP-1 és a GIP lebontását végző enzim, a dipeptidil-peptidáz-4
(DPP-4) percek alatt hatástalanítja
ezeket a hormonokat. A DPP-4 enzim gátlók nagy
számban kerültek forgalomba az utóbbi években az
obes, 2-es típusú cukorbetegek kezelésére. GLP-1-mimetikus
hatással rendelkező, a DPP-4-inaktivációra
rezisztens készítmények is elérhetők, amelyeknek
testsúlycsökkentő hatásuk van.
Az inzulin intracelluláris jelátvitelében
szerepet játszó proteinek és működésük
károsodása metabolikus szindrómában
Az inzulin intracelluláris jelátvitelére egy olyan fehérjefoszforilációs
kaszkádrendszer jellemző, amely
az inzulinjelet döntően négy irányba továbbítja (11-
86. ábra).

358 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
11-86. ábra. Az inzulin intracelluláris jelátvitelének sematikus
ábrázolása
A folyamat részletei az interneten megtalálhatók:
Inzulin-jelátvitel, vasodilatatio, AKT, eNOS [30],
[31].
Inzulin, sejtosztódás, MAPK-rendszer [32], [33].
Szabad gyökök, inzulin, inzulinrezisztencia, jelátvitel
[34], [35], [36] [37].
Az anyagcsere- és a vasodilatatiós hatás kialakulásában
egyrészt az Akt (protein-kináz B) útvonal játszik
döntő szerepet. Ebben a foszforilációs rendszerben
ugyan fontos szerepe van az Akt-nak, de annak csak
egy eleme, hiszen előtte az inzulinreceptor-szubsztrátok
(IRS, 1-4 izoenzim), a PI-3 kináz, a PDK (foszfoinozitiddependens
protein-kináz) és utána is számos
kináz játszik abban szerepet, hogy kialakuljon
az inzulin anyagcserehatása. Ez által transzlokálódik
a glukóz izomra és zsírszövetre jellemző inzulinfüggő
transzportere, a GLUT-4 (glukóztranszporter-4) az
intracelluláris kompartmentből a plazmamembránba,
aminek segítségével bejuthat a glukóz a sejtekbe.
Másrészt viszont az Akt közvetlen módon foszforilálja
az aktiválóhelyen az endotheliális nitrogén-monoxid-szintáz
(eNOS) enzimet és ez által vasodilatatiót
okoz.
Harmadrészt a mitogén aktiválta protein-kináz
(MAPK) rendszeren keresztül sejtproliferációt, differenciációt,
valamint endotelinszekréciót vált ki. Az
endotelin-1 pedig vasoconstrictor hatású.
Az inzulin tehát egyszerre hat az anyagcserére és
a hemodinamikára (a vérnyomásra), azaz megadja a
metabolikus szindróma anyagcsere-eltéréseinek és a
vérnyomás emelkedésének a közös kulcsát.
Metabolikus szindrómában inzulinrezisztencia
van, amely azonban több szempontból is szelektív.
Egyrészt szervszelektív, azaz a vesében az inzulin
nátriumot retineáló hatása megtartott marad, így a
hyperinsulinaemia nem képes kompenzálni az inzulinrezisztencia
miatt kiesett anyagcserehatást, de a vesében
a fokozott nátriumretenció miatt folyadék-viszszatartáshoz
és vérnyomás-emelkedéshez vezet.
Másrészt pedig szelektív az inzulinrezisztencia olyan
szempontból is, hogy míg az Akt-útvonal nem működik
jól, addig a MAPK-útvonalon normális a jelátvitel.
Ennek az utóbbinak az a következménye, hogy
a második fázisú fokozott inzulinszekréció hatására
létrejövő hyperinsulinaemia fokozott mitogén hatása
következtében az érfali simaizomban sejtproliferáció
alakul ki, amely az atherosclerosis korai jellegzetessége.
Sőt újabban ennek a fokozott MAPK-hatásnak
szerepet tulajdonítanak a metabolikus szindrómában
jelentkező megnövekedett tumorkockázatnak is.
Végül az inzulinrezisztenciában az inzulin intracelluláris
jelátvitelének megtartott MAPK-útvonala
az említett módon az endotelin-1 fokozott termeléséhez
és felszabadulásához vezet, ami ellensúlyozza az
inzulin-eNOS-nitrogén-monoxid útvonal vasodilatatiós
hatását, sőt vasoconstrictiót okoz, amely vérnyomás-emelkedéshez
vezet.
Felvetődik a kérdés, hogy mi okozza az inzulin-jelátvitelnek
ezt a szelektív károsodását. A korrekt válasz
erre a kérdésre az, hogy ma még nem tudjuk
pontosan. Néhány újabb bíztató eredmény szerint
szerepe lehet ebben a jelátviteli fehérjék nem enzimatikus
glikációjának, valamint az enzimatikus O-glikozilációnak.
Ugyancsak szerepet játszhat a folyamatban a fehérjék
redoxregulációja. Ismert ugyanis, hogy az inzulin
jelátvitelében fontos szerepe van a hidrogén-peroxidnak,
amely az inzulin hatására részben a NADPH-oxidáz,
részben a szétkapcsolt eNOS aktiválása révén
termelődik. Az eNOS szétkapcsolódásának számos
oka lehet metabolikus szindrómában, pl. az eNOS
glutationilációja révén is. A hidrogén-peroxid az
adenozin-monofoszfát-kináz (AMPK) aktivációján
keresztül befolyásolja az inzulin anyagcserehatását,
valamint az extracelluláris receptor-kináz (ERK) aktiváló
foszforilációját bontó foszfatáz enzim SH-csoportjának
oxidálása révén is. A foszfatázt inaktiválva
az ERK foszforilációját és így aktivitását is stabilizálja.
Ez utóbbi a MAPK-útvonal aktiválódásában, sejtproliferációban
és vasaconstrictióban jelenik meg. Azt is
kimutatták, hogy a hidrogén-peroxid akut hatása az
inzulin anyagcserehatásának növekedéséhez, króni-

A metabolikus szindróma és a fehérjék
359
kus hatása annak csökkenéséhez vezet, valószínűleg
az IRS-1 foszforilációjának megváltoztatása révén.
Tovább bonyolítja a képet, hogy az Akt és a
MAPK-rendszer között intracellulárisan egy ultrarövid
visszajelzéses rendszer is működik, amely az
mTOR-IRS (mammalian target of rapamycin, az Akt
útvonal egyik effektora) és az ERK-IRS vonatkozásában
valósulhat meg, így az inzulin-jelátviteli utak
egymás aktivitását is szabályozzák.
*
Összefoglalás. A metabolikus szindrómára úgy kell
tekintenünk, mint korunk legjelentősebb egészségügyi
kihívására. A fehérjék szintjén az extracelluláris
mátrix proteinektől a hormonokon és a citokineken
át az intracelluláris foszforilációs kaszkádban részt
vevő proteinekig számtalan közreműködő identifikálható
a tünetegyüttes kialakulásában.
Irodalom
[1] Alberti, K. G., Eckel, R. H., Grundy, S. M. et al.:
International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology
and Prevention; Hational Heart, Lung, and
Blood Institute; American Heart Association; World
Heart Federation; International Atherosclerosis Society;
International Association for the Study of Obesity.
Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim
statement of the International Diabetes Federation Task
Force on Epidemiology and Prevention; National Heart,
Lung, and Blood Institute; American Heart Association;
World Heart Federation; International Atherosclerosis
Society; and International Association for the Study of
Obesity. Circulation 120(16):1640-1645, 2009.
[2] Antuna-Puente, B., Feve, B., Fellahi, S. et al. Adipokines:
the missing link between insulin resistance
and obesity. Diabetes Metab. 34(1):2-11, 2008.
[3] Chen, C. Y., Asakawa, A, Fujimiya, M. et al.: Ghrelin
gene products and the regulation of food intake and gut
motility. Pharmacol. Rev. 61(4): 430-481, 2009.
[4] Giles, W. H.: A comparison of the prevalence of the
metabolic syndrome using two proposed definitions.
Diabetes Care 26(3): 575-581, 2003.
[5] Ford, E. S., Giles, W. H., Mokdad, H.: Increasing prevalence
of the metabolic syndrome among U.S. adults.
Diabetes Care 27(10): 2444-2449, 2004.
[6] Graham, T. E., Yang, Q., Blüher, M. et al.: Retinol-binding
protein 4 and insulin resistance in lean, obese, and
diabetic subjects. N. Engl. J. Med. 354(24):2552-2563,
2006.
[7] Halberg, N., Wernstedt-Asterhol, I., Scherer, P.
E.: The adipocyte as an endocrine cell. Endocrinol. Metab.
Clin. North Am. 37(3):753-768, 2008.
[8] Maumus, S., Marie, B., Siest, G. et al.: A prospective
study on the prevalence of metabolic syndrome among
healthy french families: two cardiovascular risk factors
(HDL cholesterol and tumor necrosis factor-alpha)
are revealed in the offspring of parents with metabolic
syndrome. Diabetes Care 28(3):675-682, 2005.
[9] Pang, S. S., Le, Y. Y.: Role of resistin in inflammation
and inflammation-related diseases. Cell Mol. Immunol.
3(1):29-34, 2006.
[10] Rabe, K., Lehrke, M., Parhofer, K. G. et al.: Adipokines
and insulin resistance. Mol. Med. 14(11-12):
741-751, 2008.
[11] Rasouli, N., Kern, P. A.: Adipocytokines and the
metabolic complications of obesity. J. Clin. Endocrinol.
Metab. 93(11. Suppl. 1.):S64–S73, 2008.
[12] Vachharajani, V., Granger, D. N.: Adipose tissue:
A motor for the inflammation associated with obesity.
IUBMB Life 61(4):424–430, 2009.
[13] http://whqlibdoc.who.int/hq/1999/WHO_NCD_NCS_
99.2.pdf
[14] http://circ.ahajournals.org/cgi/reprint/109/3/433
[15] (http://www.idf.org/webdata/docs/MetS_def_update2006.pdf
[16] http://circ.ahajournals.org/cgi/content/abstract/120/
16/1640?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RE-
SULTFORMAT=&fulltext=metabolic+syndrome+joint+statement&searchid=1&FIRSTINDEX=0&resourcetype=HWCIT
(metabolikus szindróma 2009. évi
definíciója)
[17] http://en.wikipedia.org/wiki/Insulin
[18] http://en.wikipedia.org/wiki/C-peptide
[19] http://en.wikipedia.org/wiki/Tumor_necrosis_factoralpha
[20] http://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_6
[21] http://www.scitopics.com/Monocyte_chemoattractant_protein_1.html
[22] http://en.wikipedia.org/wiki/Leptin
[23] http://en.wikipedia.org/wiki/Adiponectin
[24] http://en.wikipedia.org/wiki/Resistin
[25] http://en.wikipedia.org/wiki/Retinol_binding_protein_4
[26] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18691043
[27] http://www.pnas.org/content/100/24/14211.long
[28] http://en.wikipedia.org/wiki/Ghrelin
[29] http://www.glucagon.com/pdfs/CellMetabolism2006.
pdf
[30] http://edrv.endojournals.org/cgi/content/full/28/5/463
[31] http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/101/13/1539
[32] http://endo.endojournals.org/cgi/content/full/141/3/922
[33] http://erc.endocrinology-journals.org/cgi/content/full/
16/2/429

360 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
[34] http://www.sciencedirect.com/science?_ob=Article-
URL&_udi=B6T38-51P9YB8-2&_user=10&_coverDate=12%2F13%2F2010&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&-
view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVer-
sion=0&_userid=10&md5=4ef2847708edb8103de1-
fe3224d3dc86&searchtype=a
[35] http://hyper.ahajournals.org/cgi/content/abstract/50/
2/384
[36] http://www.medscape.com/viewarticle/448389_3
[37] http://edrv.endojournals.org/cgi/content/short/23/5/599

A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában
361
A proteomika kutatási
eredményei a jelen és a jövő
klinikai laboratóriumában
Márk László
A patológiás körülményekre jellemző molekuláris folyamatok
diagnosztikája során a legváltozatosabb típusú
és koncentrációjú biomolekulák, többek között
proteinek, peptidek, hormonok, gyógyszermetabolitok
megbízható minőségi és mennyiségi vizsgálatát
igényli. Ennek a kihívásnak megfelelően a klinikai laboratóriumok
a legmodernebb analitikai módszerekkel
vértezik fel magukat, ebben az eszköztárban többek
között megtalálható a gáz- és folyadékkromatográfiával
kapcsolt tandem tömegspektrometria is. A különböző
polaritású és szerkezetű biomarkerek vizsgálata
során szinte az összes ionforrás- és analizátortípust
alkalmazzák, de a legelterjedtebbek az elektrospray
és a lézerdeszorpciós ionizáción alapuló, valamint a
kvadrupól, ioncsapdás és repülési idő analizátorral, ill.
ezek kombinációjával ellátot készülékek. A jelenlegi
gyakorlatban a tömegspektrometriát elsősorban a kis
molekulatömegű vegyületek meghatározására használják,
így nagy jelentősége van az újszülöttkori szűrés,
az endokrin betegségek diagnosztikája, a toxikológia
és a farmakológia területén. A biopolimerek, elsősorban
peptidek, polipeptidek és fehérjék tömegspektrometriára
épülő diagnosztikus vizsgálata teljesen új és
rendkívül perspektívikus irányt képvisel a laboratóriumi
medicina területén. Segítségével nem csupán a
vegyületek mennyiségi vizsgálatát lehet elvégezni, de
egyaránt megvalósítható a potenciális biomarkerek
szekvenciájának, poszttranszlációs kémiai módosításainak
és metabolitjainak vizsgálata.
A tömegspektrometria alkalmazása a proteomikában
A proteomika napjaink egyik legdinamikusabban
fejlődő tudományága, amely az elmúlt évtizedekben
mind módszertanát, mind bioinformatikai hátterét tekintve
forradalmi változásokon ment keresztül. A proteomika
kifejezést először 1995-ben kezdték el használni
egy sejt, szövet vagy szerv összes fehérjéjének
kvalitatív és kvantitatív meghatározására. A proteom
a genom által kifejezett teljes fehérjeállományt jelenti,
így e fogalom az élő szervezetben előforduló összes,
szerkezetében akár a legkisebb mértékben eltérő fehérje
megismerésével foglalkozó tudományterület, amely
a genommal kapcsolatos kutatás kiegészítőjeként jött
létre. Mára már önálló területté nőtte ki magát a tudományos
köztudatban. Jelentőségét az is nagyon jól
bizonyítja, hogy a proteomikai vizsgálatok a korszerű
gyógyszerkutatás és az orvostudomány továbbfejlesztésében,
ill. a mainál hatékonyabb diagnosztikai eljárások
és terápiás szerek kifejlesztésében elengedhetetlenné
vált. A proteomika kutatási területébe tartozik
az egyes fehérjék eredetének felderítése, rendszertani
besorolása, a különböző forrásból származó, de azonos
biológiai funkciót ellátó proteinek szerkezetének
és lokalizációjának meghatározása, jelenlétének vagy
hiányának igazolása. A modern fehérjeanalitikai eljárások
segítségével lehetővé vált a komplex biológiai
rendszerek teljes proteomjának akár szubfemtomol
tartományban végzendő kvalitatív és kvantitatív vizsgálata.
A tömegspektrometriás eljárások nagy érzékenységüknek,
rendkívüli specifikusságuknak, széles
koncentrációtartományon belüli alkalmazhatóságuknak,
reprodukálhatóságuknak, ill. automatizálhatóságuknak
köszönhetően kiválóan alkalmazhatóak a klinikai
diagnosztikában. Az MS - a jelenleg általánosan
alkalmazott rutin-diagnosztikai eljárásokkal szemben
- olyan dinamikus analitikai szemléletmódot tesz lehetővé,
amely egyedülálló lehetőségeket nyújt többek
között a diagnosztikai jelentőségű biomarkerek kimutatása,
a lipidomika, ill. a metabolomika területén.
Segítségével lehetőségünk van a már jól bevált és pontosan
validált diagnosztikai biomarkereken túl azok
analógjainak, izoformáinak, metabolitjainak és molekuláris
kölcsönhatásainak vizsgálatára, ill. új diagnosztikus
jelentőségű biomolekulák kimutatására. A
tömegspektrometria további előnye, hogy az archivált
tömegspektrumok kiértékelése és statisztikai elemzése
bármikor megismételhető, így a jövőben olyan paraméterek
és komponensek is elemezhetővé válnak,
amelyek patológiás és diagnosztikai szerepe a vizsgálatok
lefolytatásakor még nem ismert.
A tömegspektrometria igen gyors és hatékony
diagnosztikai módszer lehet a fertőző humán patogének
kimutatására. Különböző intakt mikroorganizmusok,
mint baktériumok, vírusok és gombák
kimutatására elsősorban a MALDI TOF tömegspektrometriát
alkalmazzák, amelynek többek között
rendkívüli előnye nagy mintaáteresztő képessége és
egyszerű mintaelőkészítési igénye, valamint az, hogy

362 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
széles tömegtartományban (kb. 50 Da-tól 500 000
Da-ig) alkalmazható. A módszert hatékonyan alkalmazzák
olyan tömegesen előforduló fertőzések esetében,
mint pl. a HIV, a mikobakteriális fertőzések és
a malária, de nem csupán a kórokozók kimutatása
végezhető el a MALDI TOF MS segítségével, hanem
meghatározható az új multidrogrezisztens patogének
jelenléte és kialakulása egyaránt. A humán patogének
proteomjának meghatározása alkalmas fajspecifikus
diagnózis felállítására, amelyet kiválóan kiegészít a
kórokozókra jellemző kisebb molekulatömegű komponensek,
pl. mycobacterium esetében a sejtmembránt
felépítő specifikus mikolsavak azonosítása.
Rendívül perspektivikus alkalmazási terület a vírusfertőzések
(HIV, HBV, HCV, HPV stb.) során a fertőzött
sejten belül tapasztalható proteomikai változások
tömegspektrometriás vizsgálata, amelyre 2D-PAGE
gélelektroforézist, MALDI TOF MS-t, folyadékkromatográfiával
kapcsolt tandem tömegspektrometriát,
SELDI proteinchipet és proteinmikroarray technikákat
lehet alkalmazni. A gazdasejt expressziós proteomikai
elemzésén kívül diagnosztikai szempontból
jelentős lehet a gazdaszervezet immunválaszára
jellemző biopolimerek, biomarkerek kimutatása és a
fertőző patogén proteomjának és annak módosulásainak
evolúciós vizsgálata.
Az újszülöttkori szűrések esetében a tömegspektrometria
jól bevált, hatékony diagnosztikai módszer,
azonban főként a különböző lipidek és egyéb kis molekulatömegű
biomarkerek (pl. aminosavak) kimutatására
használják. Viszonylag kevés az olyan applikáció,
amelyben diagnosztikai jelentőségű peptidek és
fehérjék kimutatását végzik el. Ezek közül az egyik
legjelentősebb a hypophysis adenilát-cikláz-aktiváló
polipeptidje (PACAP) jelenlétének, lokalizációjának
és koncentrációjának vizsgálata.
A tömegspektrometriára épülő peptidomika és
proteomika egyik legnagyobb felhasználási területe
az onkológia. A belignus és malignus elváltozások
korai fázisban végzett kimutatása és differenciálása,
valamint a gyógyszeres és sugárterápia nyomon követése
egyaránt elvégezhető a modern tömegspektrometria
segítségével. Számos olyan vizsgálat látott
napvilágot, amelyekben különböző testfolyadékok
(vér, szérum, vizelet, nyál stb.) proteomikai vizsgálatát
végezték el tumorokra jellemző, korai fázisban
is kimutatható biomarkerek keresése céljából. Többek
között ilyen potenciális tumorbiomarker lehet az
annexin 1 és 2, valamint a peroxiredoxin-2, amelyek
hatékonyan mutathatók ki nem invazív módon pl. a
betegek nyálából is.
A központi idegrendszerben igen kis mennyiségben
előforduló neuropeptidek és proteinek nagyhatékonyságú
vizsgálata az egyik legfontosabb alkalmazási területe
a tandem tömegspektrometriának. Ennek kiváló
példája a már említett PACAP MALDI TOF és ESI tömegspektrometriás
vizsgálata (11-87. ábra). A PACAP
legnagyobb mennyiségben a központi és a perifériás
idegrendszerben fordul elő, de kimutatható más szövetekben
is, ilyenek pl. az endokrin mirigyek, az ivarszervek,
a gastrointestinalis traktus teljes hossza és a
cardiovascularis rendszer. A PACAP számos endokrin
hatása ismert (pl. a pajzsmirigy, a gonadalis szteroidogenezis,
a spermiogenezis és az ovarialis follicularis fejlődés
befolyásolása, a pancreas inzulintermelésének és
a mellékvese katekolaminszintézisének stimulációja és
a memóriafolyamatok serkentése). Központi szerepet
játszik a ritmusszabályozásokban (pl. alvásszabályozás,
hőszabályozás). Részt vesz a húgyúti szervek vizeletürítési
reflexében, a simaizom reflexáns hatásában és
a stresszadaptációs magatartás szabályozásában. A
PACAP-nál beszélnünk kell neurotrofikus és neuroprotektív
hatásról is. A PACAP különböző jelátviteli
utakon keresztül fejti ki antiapoptotikus, protektív hatásait,
amelyek egymással szorosan konvergálnak. A
citoprotektív hatásokért, majdnem minden esetben
a PAC1-receptor felelős, de a hatások közvetítésében
a VPAC is szerepet játszik. E vegyület neuroprotektív
hatásával szorosan összefügg az idegrendszer fejlődésében
betöltött szerepe. A PACAP és receptorai már
igen korán megjelennek az új idegrendszerben, és
szerteágazó hatásaik vannak a neurogenezisre, a neuronalis
differenciációra, az idegrendszeri mintázat kialakítására
és a gliasejtek fejlődésére.
Napjaink egyik legígéretesebb peptid és protein
biomarker diagnosztikai alkalmazása a MALDI TOF/
TOF tömegspektrometriára épülő képalkotó módszer
(MALDI Imaging), amelynek során egy speciális
mintatartóra 10-20 mikronos szövettani metszetet
és mátixot szárítunk. Ezt követően a mintáról előre
meghatározott szisztémában és lézerintenzitással
több ezer tömegspektrumot veszünk fel, ezeket a
megfelelő szoftver az egyes m/z értékekhez tartozó
intenzitások eloszlását képeként jeleníti meg. A módszer
óriási előnye, hogy párhuzamosan alkalmazható
az egyéb (in vivo fluoreszcens, NMR, MRI, CT, FT

A proteomika kutatási eredményei a jelen és a jövő klinikai laboratóriumában
363
IR) képalkotási módszerekkel, így olyan új tudományos
és diagnosztikai eredményeket szolgáltathat,
amelyek forradalmasítják a klinikai diagsztika mai
módszertanát.
A tömegspektrometria a közeljövőben a modern
diagnosztikai laboratóriumok egyik leghatékonyabb,
kulcsfontosságú költségkímélő eszköze lesz. Specificitása,
érzékenysége, kitűnő automatizálhatósága és
széles spektrumú alkalmazhatósága révén forradalmasíthatja
az egyes betegségek és kórokozók kimutatásának
technológiáját.
Irodalom
Gross, J. H.: Mass Spectrometry: A Textbook. Springer,
Heidelberg, 2004.
Lipton, M. S., Pasa-Tolic, L.: Mass Spectrometry of Proteins
and Peptides. Humana Press, New York, 2009.
Talián Cs. G., Márk L., Melegh B.: Tömegspektrometria.
In: Debreczeni L., Kovács L.G. (szerk.): Gyakorlati
Laboratóriumi Medicina. 477–492. old. Literatura Medicina
Kiadó, Budapest, 2008.
Vékey, K., Telekes, A., Vértes, A. (eds): Medical Applications
of Mass Spectrometry. Elsevier, Amsterdam, 2008.
11-87. ábra. A PACAP jelenlétének tömegspektrometriás igazolása:
a, b) PACAP standard
c, d) Humán szérum
e, f) Anyatej

364 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
A daganatok epidemiológiai
biomarkerei
Kiss István
A daganatok a fejlett országokban a második legfontosabb
halálokot képezik, de ha nem a halálozások
abszolút számát, hanem az elvesztett életéveket
vesszük alapul, akkor számos országban már az első
helyre kerültek.
Ennek ellenére az is tény, hogy az utóbbi évtizedekben
a daganatos betegségek terápiájának hatékonysága
folyamatosan növekedett, bár néhány daganattípus
esetében még napjainkban sem túl jók az
ötéves túlélési arányok (pl. hasnyálmirigy-daganatok,
tüdőrák). Az említett javulás részben új gyógyszerek
és új kezelési stratégiák (pl. célzott terápia, monoklonális
antitestek, antiszensz oligonukleotidok)
kifejlesztésének, részben a meglevő kezelési módok
továbbfejlesztésének (pontosabb, hatékonyabb besugárzás),
részben pedig a daganatok korábbi diagnózisának
tudható be.
Daganatszűrés
A daganatok előfordulási mintázatait, az ötéves
túlélések változását, valamint a halálozási adatokat
elemezve egyértelmű, hogy a felsorolt tényezők közül
populációs szinten a legnagyobb jelentősége a korai
diagnózisnak van. Éppen ezért a daganatos betegségek
terén kiemelt fontossága van az igen korai, még
tünetmentes állapotban való diagnosztizálásnak. Mivel
tünetmentes stádiumról van szó, a beteg nyilvánvalóan
nem fordul orvoshoz; épp ellenkezőleg, az
egészségügy részéről van szükség aktív magatartásra,
ami az „egészséges” népesség (ill. annak kiválasztott
csoportjai) szűrővizsgálatát jelenti. Mivel itt nem klinikai
vizsgálatokról van szó, hanem nagy lélekszámú
tünetmentes populációk teszteléséről, ezekkel a vizsgálatokkal
kapcsolatban speciális kívánalmak érvényesülnek.
A szűrővizsgálatok kockázatának a klinikai
vizsgálatoknál sokkal kisebbnek kell lennie, a
várható mellékhatások és szövődmények ritkább előfordulásával,
továbbá jóval egyszerűbbnek, olcsóbbnak
is kell lenniük, cserében specifitásuk általában
kisebb mértékű a diagnosztikus vizsgálatokénál. A
daganatok szűrésére számos lehetőség áll rendelkezésre,
pl. megtekintés (melanoma), fizikális vizsgálat,
mammográfia, kolonoszkópia stb. Mivel e módszerek
többsége egyelőre nem tökéletes, ill. számos daganatot
illetően nem is létezik megfelelő szűrőmódszer,
folyamatos kutatás irányul olyan szenzitív és specifikus
biomarkerek kidolgozására és validálására, amelyek
alkalmasak lennének nagy populációk daganatos
szűrővizsgálatára. Ezek a biomarkerek – a tumormarkerek
– tehát nem csak a klinikus számára fontosak,
hanem még inkább hasznosak lennének az epidemiológia,
ill. a közegészségügy és a betegségmegelőzés területén.
Tumormarkerek
A tumormarkerek kutatása nem korlátozódik a fehérje-,
ill. peptid természetű markerekre, a vizsgálati
lehetőségek skálája igen széles. Próbálkoztak már
többek között keringő tumorsejtek kimutatásával,
mutációt hordozó sejtek detektálásával, keringő vagy
a vizeletben található szabad nukleinsavak vizsgálatával,
DNS-metilációs vagy mikroRNS-mintázatok
azonosításával különböző vizsgálati anyagokban. A
jelenlegi gyakorlatban mégis szinte kizárólag fehérje
alapú tumormarkerek használatosak.
A tumormarkerek jelenlegi legfőbb felhasználási
területe a klinikai alkalmazás: Számos tumor markert
alkalmaznak rutinszerűen a terápia hatékonyságának
monitorozása és az adott betegség kiújulásának észlelése
céljából. Ezzel ellentétben az epidemiológiai,
szűrési, betegségmegelőzési célzatú felhasználás ma
egyelőre nagyon korlátozott keretek között mozog. A
fehérje, ill. peptid alapú tumormarkerek populációs
szintű felhasználását egyrészt technikai, másrészt elvi
problémák nehezítik.
A technikai nehézséget a kiválasztott fehérjék megfelelően
szenzitív és specifikus kimutatása jelenti. Az
emberi szérumban található egyedi fehérjék koncentrációja
igen széles tartományban mozog (úgy hogy
22 fehérje adja az összfehérje-mennyiség 99%-át), a
40 g/l koncentráció körül jelen lévő albumintól a néhány
pg/l-nyi különböző citokinen át a csak komoly
metodikai nehézségek árán mérhető, jelenlegi módszereinkkel
a kimutathatóság határát súroló molekulákig.
Önmagában, tiszta oldatból a kimutatás nem
jelentene ekkora problémát, de a nagyságrendekkel
nagyobb koncentrációban jelen lévő egyéb fehérjék
megnehezítik a kis mennyiségben megtalálható biomarkerek
kimutatását. A specifikus fehérjedepléciós
eljárások (pl. az albumin immundepléciója) eltávolít-

A daganatok epidemiológiai biomarkerei
365
ják ugyan a nagy mennyiségű, zavaró fehérjéket, de
nagyon gyakran ezek a fehérjék részben vagy egészben
megkötik a vizsgálandó fehérjemolekulákat, így
azoknak a koncentrációja is jelentősen csökkenhet.
A technikai nehézségek mellett elvi problémák is
jelentkeznek. Számos biomarker inter- és intraindividuális
variabilitása meglehetősen nagy mértékű,
ami nagyon megnehezíti szűrővizsgálati alkalmazás
során a megfelelő határérték kijelölését. A szűrővizsgálatokkal
ellentétben az interindividuális variabilitás
nem okoz gondot a klasszikus (azaz klinikai) tumormarkerként
való alkalmazásban, mivel itt a vizsgált
személy korábban mért értékeihez – amelyet tehát
alapértéknek tekintünk – viszonyíthatunk. További
nehézséget okoz az intraindividuális variabilitás,
amely egyrészt random fiziológiás variabilitást jelent,
másrészt pedig a tumormarkerek szintje nem csak a
daganat jelenléte miatt emelkedhet meg, hanem más
betegségek, állapotok is növekedést okozhatnak, sőt
egyes markerek értéke az életkor előrehaladásával is
változik. Leggyakrabban jóindulatú daganatok, gyulladások,
az érintett szerv hypertrophiája vezet emelkedett
tumormarkerszinthez, vagyis téves pozitivitáshoz.
E problémák miatt jelenleg csakugyan széles körben
mindössze egyetlen tumormarkert használnak
szűrési célzattal, a prostataspecifikus antigént (PSA),
amely kiválóan alkalmas az epidemiológiai-prevenciós
jellegű felhasználás minden problémájának illusztrálására.
A PSA alkalmazását 1986-ban kezdték meg szélesebb
körben, prostatarákos betegeknél, a terápia
nyomon követésére és az esetleges rekurrens daganatok
észlelésére. Ugyanekkor már vizsgálatok folytak
az esetleges szűrési célú alkalmazás tekintetében is,
amely azután a kilencvenes évektől vált elterjedtté,
elsősorban az Amerikai Egyesült Államokban. A szűrővizsgálatok
hatására a betegség incidenciája először
természetszerűleg jelentős emelkedést mutatott, majd
valamelyest csökkent. Jelentősen csökkent ugyanakkor
a prostatarák-mortalitás – és ebben matematikai
modellezések szerint 45-70%-nyi szerepe lehetett a
szűrővizsgálat alkalmazásának –, ill. eltolódás mutatkozott
az újonnan felfedezett prostatarákok stádiumát
illetően, a kedvezőbb stádiumú, ill. grádusú
esetek irányába. Mindmáig e tényezők szolgáltatják a
legfőbb érvet a PSA-szűrés mellett. Ugyanakkor más
epidemiológiai vizsgálatok ellentmondani látszanak
a PSA-szűrések hasznosságát igazoló eredményeknek.
Az USA 9 régiójának prostatarák-mortalitási
elemzése pl. nem talált jelentős különbségeket, annak
ellenére, hogy a PSA-szűrések gyakoriságában, alkalmazásában
igen nagy eltérések voltak az egyes régiók
között. Egy másik vizsgálatban pedig a Seattle és
Connecticut régió összevetése azt mutatta, hogy míg
Seattle környékén a szűrés gyakorisága több mint ötszöröse
volt a Connecticutéinak, prostatabiopsziát
pedig több mint kétszer olyan gyakran végeztek, a
mortalitás mégis gyakorlatilag ugyanannyi volt. A
PSA-szűrés hatékonyságát vizsgáló korai tanulmányok
is egymástól jelentősen eltérő eredményeket
mutattak. A PSA-szűrések szenzitivitása és specifitása
sajnos meglehetősen csekély. A nem kielégítő szenzitivitást
jelzi, hogy egy vizsgálat a 2 ng/ml-nél alacsonyabb
PSA-szintet mutató férfiak körében 33,7%-os
prostatarák-gyakoriságot talált. A specificitást egy
másik vizsgálat a 2,6-10 ng/ml-es tartományban kb.
25-35%-nak írta le. Ezek az adatok a szűrővizsgálati
használhatóságot tekintve jóval elmaradnak pl. a kolonoszkópia
96,6% szenzitivitásától és 100%-os specifitásától
(ha végpontként az adenocarcinomát tekintjük).
A PSA-szűrővizsgálatok egyébként különböző
határértékeket használnak. A legelterjedtebb a 4 ng/
ml volt, de ezt számos országban, ill. intézményben
lecsökkentették 2,5 ng/ml-re, de van, ahol 2 ng/ml-t
javasolnak. Újabban nem ritkán figyelembe veszik azt
is, hogy a PSA-szint az életkorral növekszik, vagyis
életkor-specifikus határértékeket adnak meg.
A PSA-szűrések hatékonyságának értékelését évtizedeken
keresztül nehezítette az a tény, hogy nem
végeztek e területen igazán nagy, randomizált kísérleti
epidemiológiai vizsgálatokat. Jelenleg azonban
két nagy randomizált vizsgálat is folyik, az egyik az
USA-ban zajlik (PLCO), a másik pedig egy multicentrikus
európai vizsgálat (ERSCP). Az amerikai tanulmány
eddigi eredményei szerint a mortalitás nem
különbözött szignifikánsan a szűrt és a kontrollcsoportok
között, az incidencia pedig valamivel magasabb
volt a szűrt csoportban. Ugyancsak nem volt eltérés
a talált daganatok stádiummegoszlását illetően,
viszont a Gleason 8-10-es daganatok valamivel gyakoribbak
voltak a kontrollok körében. Az ERSCP-tanulmány
az amerikai vizsgálattal ellentétben enyhe,
de statisztikailag szignifikáns túlélési előnyt talált a
PSA-szűrt csoportban a kontrollhoz képest. Ez a túlélési
előny az 55-69 éves korosztályra korlátozódott.

366 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
Az ERSCP-vizsgálat keretében a PSA-szűrővizsgálatok
16,2%-a adott pozitív eredményt, amelyből az elvégzett
biopsziás vizsgálatok alapján 75,9% bizonyult
hamis pozitívnak. Az adatok szerint egyébként egy
élet megmentéséhez 1410 ember szűrése, ill. 48 ember
kezelése volt szükséges.
Az ismertetett bizonytalan mortalitási előnnyel
szemben a másik oldalon jelentős potenciális hátrányok
állnak. Így például egy 67 éves ember esetén
a szűréssel megtalált prostatarák kezelése átlagosan
7 évvel a klinikai tünetek várható megjelenése előtt
kezdődik. Ugyanakkor csak minden negyedik prostatarákos
beteg halna meg 15 éven belül. A kiterjesztett
szűrővizsgálatok legnagyobb veszélye tehát a
túldiagnózis és a túlkezelés. Olyan prostatarákokat is
nagy számban diagnosztizálnának, ahol a beteg élete
során egyébként soha nem derülne ki a prostatarák,
mivel az esetek jó részénél a kórfejlődés meglehetősen
lassú. Ezek a betegek azután (feleslegesen) kezelésben
részesülnek, aminek súlyos szövődményei,
mellékhatásai lehetnek, ill. az életminőségük jelentős
csökkenéséhez vezetnek (ezek közül a legfontosabb
az inkontinencia és az erektilis zavarok). A PSA-szűrés
tehát eddigi ismereteink szerint nem alkalmas
arra, hogy megbízhatóan elkülönítse a várhatóan
gyors növekedést mutató tumorokat, ahol valóban
lenne értelme a korai kezelésnek. A sok hamis pozitív
diagnózis ráadásul komoly pszichés terhelést jelent az
érintetteknek, amely hosszabb ideig is fennállhat.
Az eddigiek ismeretében nem meglepő, hogy a
mértékadó testületek, társaságok (Európai Urológusok
Szövetsége, Japán Urológusok Szövetsége, Amerikai
Rák Társaság, Amerikai Preventív Medicina
Kollégium) nem javasolják a rutin PSA-szűrést a
prostatarák megelőzésére (ellentétben pl. a vastagbéldaganatokkal,
cervixtumorokkal, emlőrákkal, ahol
a rendszeres szűrés jól kidolgozott, konszenzuson
alapuló protokollon nyugszik, és fejlett országokban
szinte ”kötelező erővel” ajánlott). Az ajánlások általában
az érintett korosztály (többnyire 55 vagy 50 év
feletti férfiak) tájékoztatását javasolják a várható előnyökről
és hátrányokról, és a döntést az érintettekre
bízzák, azzal a megjegyzéssel, hogy 75 éves kor felett
e szűrés már semmiképpen nem ajánlott. Egyetlen
jelentősebb kivétel az Amerikai Urológusok Szövetsége,
amely ajánlja a rendszeres szűrővizsgálatot, de
– a PLCO és az ERSCP eredményei alapján – kritériumrendszerét
átdolgozva, nem egységes PSA-limitet
javasol, hanem mindenkinek a 40 éves korban
mért saját PSA-szintjéhez viszonyított határértéket. A
PSA-szűrés mellett szóló érv viszont a terápia folyamatos
fejlődése, differenciált kezelési (ill. aktív surveillance-)
sémák kidolgozása a különböző stádiumú
betegségekre, a szövődmények és a mellékhatások
csökkentésére szolgáló erőfeszítések, amelyek együttesen
a szűrt csoportokban idővel jelentősebb mortalitáscsökkenéshez
vezethetnek.
További lehetséges biomarkerek kutatása
Ráadásul a prostatarák az idős kor betegsége, ezért
gyakorisága a várható átlagos élettartam emelkedésével
várhatóan tovább nő, vagyis különösen fontos
lenne olyan biomarkerek azonosítása, amelyek a jelenlegi
egyszerű PSA-vizsgálatnál hatékonyabban és
specifkusabban lennének alkalmazhatók a prostatarák
szűrésére. Az e téren folyó intenzív kutatások
több irányban is bíztatóak. Ígéretesnek tűnik egyrészt
a PSA vizsgálatának továbbfejlesztése, pl. életkor-
vagy akár személyspecifikus határértékek kidolgozása,
a PSA-sűrűség vizsgálata, a szabad/teljes
PSA arány mérése, komplex PSA, PSA-sebesség, ill.
PSA-izoformák (pl. proPSA) vizsgálata formájában.
Tesztelik továbbá a PSA helyett/mellett további fehérje
vagy nem fehérje természetű (pl. PCA3 RNS
mennyisége a vizeletben, DNS-metilációs mintázatok)
tumormarkerek szűrővizsgálati alkalmazhatóságát
is. További szóba jöhető fehérjetermészetű marker
pl. a hK2 (humán kallikrein 2), amely a PSA-val
mintegy 80%-os homológiát mutató szerin-proteáz),
amely - úgy tűnik -, hogy az agresszív, extracapsularisan
terjedő prostatarák prediktív biomarkere. Az
uPAR (urokinase-type plasminogen activator receptor)
felhasználásának elvi alapját az adja, hogy a
prostatarák terjedése során az extracelluláris mátrix
degradációjában szerepe van a plazminogénkaszkád
aktiválódásának. A plazminogénaktivátor receptorának
(uPAR) megnövekedett koncentrációja már
bizonyítottan a rossz prognózis jele emlő-, vastagbél-
és tüdőrákban. Újabb vizsgálatok szerint e biomarker
alkalmas lehet a prostatarák szűrésére is. A
prostataspecifikus membrán antigén (PSMA) a prostata
epithelsejtek membránjának alkotórésze. Eddigi
vizsgálatát elsősorban műtéti anyagokból vagy biopsziából
vett szövetekben vizsgálták, de szűrővizsgálati
alkalmazhatóságát is tesztelik, a szérumból végzett
Western-blot vagy ELISA alapú meghatározással. A

A daganatok epidemiológiai biomarkerei
367
korai prostatarák-antigén (early prostate cancer antigen,
EPCA, ill. az ugyancsak mátrixprotein EPCA-2)
nukleáris mátrix protein, amely nagyobb mennyiségben
van jelen prostatarákos szövetben, mint egészségesben.
Egy – sajnos meglehetősen kis elemszámon
végzett – szűrővizsgálati jellegű tesztben a prostatarákot
az EPCA és EPCA-2 biomarker segítségével
92%-os szenzitivitással és 94%-os specificitással tudták
detektálni. Több vizsgálat irányult a kaveolin-1
(cav-1) lehetséges biomarker felhasználhatóságának
tisztázására. A fehérje a sejtmembrán-invaginációkban
található membránalkotórész, és szerepe van pl. a
molekuláris transzportfolyamatokban, a sejtadhézió
során, ill. a jelátviteli folyamatokban. A szérum emelkedett
cav-1-koncentrációja alkalmasnak bizonyult
olyan prostatarákos betegek azonosítására, akiknél a
PSA-szint két év során sem emelkedett 1,5 ng/ml fölé.
Az eddig felsoroltak mellett számos más potenciális
tumormarkerrel folynak vizsgálatok, pl. a komplement
4a komponens (C4a), a protein-C inhibitor,
a cink-α 2
-glikoprotein, a PEDF (pigment epithelium-derived
factor); remélhetőleg mihamarabb sikerül
epidemiológiai markerként, magas specificitással
és szenzitivitással széles körben alkalmazható biomarkereket
találni.
További lehetséges markerként jönnek szóba egyes
tumorantigénekkel szemben termelődő autoantitestek.
Prostatarákos betegek tumorantigénjeire adott
humorális immunválasz elemzésével sikerült kidolgozni
egy autoantitestpanelt, amellyel 81,6%-os
szenzitivitást és 88,2%-os specificitást értek el a daganat
azonosításában. Ugyancsak számos multidimenzionális
proteomikai vizsgálatot végeztek, főként
tömegspektrometria, MALDI-MS vagy SELDI-MS
alkalmazásával. Kapilláris-elektroforézis és tömegspektrometria
alkalmazásával egy 9 polipeptidből
álló mintázat segítségével, vizeletminta vizsgálata
alapján prostatrákos betegeket tudtak azonosítani,
92%-os szenzitivitással és 96%-os specificitással. A
szérumproteinek nagy dinamikus tartománya által
okozott problémákat esetleg kiküszöbölheti, ha a
vizeletfehérjéket próbáljuk meg vizsgálni. Itt viszont
technikai problémát jelenthet a szervetlen sók nagy
koncentrációja.
Az imént felsorolt, kísérleti jelleggel végzett vizsgálatok
némelyike meglepően magas szenzitivitással
és specificitással rendelkezett. Azonban ezeket a vizsgálatok
kis csoportokon végezték, laboratóriumi körülmények
között, tehát minden esetben szükség van
még nagyobb populációkon való validálásra. A széles
körű felhasználás lehetőségét korlátozhatja még
a vizsgálatok bonyolultsága és drágasága, de egészen
bizonyos, hogy amennyiben nagy sorozatban kerülnek
alkalmazásra, az árak jelentősen csökkenni fognak.
Egyelőre nem létezik a PSA-n kívül – ill. mint láthattuk
a PSA alkalmazása is meglehetősen vitatott –
olyan tumormarker, amelyet rutinszerűen alkalmaznának
nagy, egészséges populációk daganatszűrésére.
Éppen ezért itt nem térünk ki a klinikai tumormarkerek
tárgyalására. Erről a területről mindössze annyit
szükséges megemlíteni, hogy egyes tumormarkereket
„kvázi-szűrési” céllal szokás alkalmazni, vagyis pl. daganatkutatás
során az adott tumormarkerek meghatározását
szokásos elvégeztetni. Az ilyen célból alkalmazott
markerek egy része erősebben, de többségük
inkább kevésbé daganatspecifikus, és felhasználásuk
általában azon az elven alapul, hogy a tumorsejtekből
olyan fehérjék is a keringésbe jutnak (pl. differenciálatlan,
az embrionális fejlődési stádiumhoz közelebb
álló sejteket jellemző fehérjék), amelyek egészséges
sejtekből nem vagy csak igen kis mennyiségben.
Klasszikus tumormarkernek számít a carcinoembryonalis
antigén (CEA), amelyet a hatvanas évektől
használnak, és mára már megtalálta helyét, pl. a vastagbéldaganatok
klinikai markerei között. Ugyancsak
viszonylag gyakran kerül sor CA 15.3 vagy CA 19.9
marker vizsgálatára, ill. klasszikus embrionális jellegű
marker az a-fötoprotein (AFP) és a humán koriogonadotropin
(hCG). Különösen az olyan tumoroknál
lenne fontos szűrésre alkalmazható biomarkereket
fejleszteni, amelyeknél más szűrőmódszerek egyelőre
nem állnak rendelkezésre vagy nem elég hatékonyak,
pl. hasnyálmirigy-daganatok, ovariumtumorok. Ez
utóbbi daganattal kapcsolatban sok vizsgálatot végeztek
a CA 125-tel kapcsolatban, de úgy tűnik, a szűrővizsgálati
alkalmazás kivitelezése nem lehetséges.
A tumormarkerek kutatásának legizgalmasabb és
legtöbbet ígérő fejezete tehát az epidemiológiai markerek
kutatása. E területen van égetően nagy szükség
új tumormarkerekre, ugyanis a daganatepidemiológia
elmúlt ötven éve bebizonyította, hogy ott tudunk
igazán eredményesek lenni a mortalitás csökkentésében,
ahol sikerül igazán korai diagnózist felállítani.
A fehérjekutatás új eredményei bizakodásra adnak
okot megfelelő szűrővizsgálati módszerek kifejlesz-

368 11. fejezet A fehérjekutatás modern módszereinek alkalmazása a klinikai patológiában – Az új módszertanok ...
tését illetően. Mindazonáltal ezek a módszerek valószínűleg
nem egy fehérje vizsgálatán fognak alapulni
(dacára annak, hogy több százra rúg az e területen
vizsgált vagy vizsgálatra alapos okkal javasolt fehérjék
száma), az eddigi kutatások alapján nem várható,
hogy egyetlen fehérje a kellő szenzitivitást és specificitást
tudná biztosítani. Az analitikai módszerek, a
laboratóriumi medicina és a biomatematika fejlődése
a komplex proteomikai markerek irányába mutat,
amelyeknek a széles körben való elterjedése az utóbbi
időben megjelent publikációk alapján remélhetőleg
már nem sokáig várat magára.
Irodalom
Etzioni, R., Tsodikov, A., Mariotto, A. et al.: Quantifying
the role of PSA screening in the US prostate cancer
mortality decline.Cancer Causes Control 19:175–181,
2008.
Strope, S. A., Andriole, G. L.: Prostate cancer screening:
current status and future perspectives. Nat. Rev. Urol.
7:487–493, 2010.
Andriole, G. L., Crawford, E.. D., Grubb, R. L. 3 rd et
al.:Mortality results from a randomized prostate cancer
screening trial [published erratum in N. Engl. J. Med.,
2009. 360. 1797]. N. Engl. J. Med. 360:1310-1319, 2009.
Schröder, F. H., Hugosson, J., Roobol, M. J. et al.:Screening
and prostate-cancer mortality in a randomized
European study. N. Engl. J. Med. 360:1320-1328, 2009.
Smith, R. A., Cokkinides, V., Brooks, D. et al.: Cancer
screening in the United States, 2010: a review of current
American Cancer Society guidelines and issues in cancer
screening. CA Cancer J. Clin. 60:99–119, 2010.
Lin, D., Beyond, W.: PSA: utility of novel tumor markers
in the setting of elevated PSA. Urol. Oncol. 26:315-321,
2009.
Gion, M., Daidone, M. G.: Circulating biomarkers from
tumour bulk to tumour machinery: promises and pitfalls.
Eur. J. Canc. 40:2613–2622, 2004.
A tananyag elsajátításának ellenőrzéséhez segítséget
nyújtanak a http://tamop.etk.pte.hu/adatbazis/ címen
elérhető kérdések.

Tárgymutató
A tárgymutatóban a címszó előtti vízszintes vonalkák a
felettük lévő szó változatlan megismétlését jelentik (ahány
szó változatlanul ismételhető, annyi vonal van leírva). A
kötőjellel írt szavak egy szónak számítanak.
A vessző után írt, hátravetett szavak általában jelzőként,
a kifejezés előtt olvasandók. A / jellel elválasztott
kifejezések a szövegben mindkét formában előfordulnak.
A görög betűvel kezdődő kifejezések a betűrendben
a kiejtésük szerinti helyen találhatók. A számok és az
indexben lévő jelek a betűrendbe nem számítanak bele;
az előttük, illetve utánuk következő betűk alapján vannak
besorolva.
A
AAT 251
ABP 110
abszorbancia, látszólagos 163
acetonitriles kicsapás 236
acetonos precipitáció 47
acil-ghrelin 357
ACN 236
ACTH 343
- termelő hypophysis adenoma 344
actin binding protein (ABP) 110
ACS 328
adeniláz-ciklát-aktiváló polipeptid (PACAP) 362, 363
adipokin 346
adiponektin 356
adjuváns 133
adrenokortikotrop hormon (ACTH) 343
aequorin 143
AF 254
affinitás címke 58
- elektroforézis 60
- immunelektroforézis 60
- kromatográfia 57
AFP 224, 323
agarózgél elektroforézis 73
agglutináció 108
-, latex 142
agglutináció, passzív 142
-, zselatin 142
agglutinációs módszerek 141
AGP 238
akridíniumészter jelölőmolekula 166
akrilamid monomer 71
Akt útvonal 358
aktin alapú motor 110
- filamentum immunfluoreszcens kimutatása 53
aktinkötő fehérje 110
aktív centrum 33
aktivált parciális tromboplasztinidő (APTI) 284
- protein C (APC) 291
- - -rezisztencia 291
akut coronaria szindróma (ACS) 328
- - - cardialis markerei 328
- - - terápia, cardialis marker alkalmazás 332
- - -, rizikóbeosztás 329
- fázis fehérje elváltozások 223
- myocardialis infarctus (AMI) 328
- - -diagnosztikai kritériumai 328
akvaporin-5, könny 295
albumin 122, 222, 224
- elváltozások 223
-, ischaemia által módosított, cardialis marker 335
-, vizelet 307
albuminmentesítés 41
albuminuria 309, 311
- definíciója 311, 312
aldoszteron releasing faktor 357
a 1
-antitripszin 224
a ciano-4-hidroxi-fahéjsav (HCCA, CHCA) 179, 184
a fötoprotein (AFP) 224, 323
a hélix 102
a 2
-makroglobulin 225
a 2
-makroglobulin, vizelet 307
a 1
-mikroglobulin, vizelet 307
a 1
savanyú glikoprotein (AGP) 238, 309
alignment 69
alkalikus foszfatáz 151
- -, csontspecifikus 348
- gélelektroforézis 73

370 Tárgymutató
alkonyzóna 69
állandó semleges vesztés 183
állatkísérlet 216
állatkísérleti modell 218
állatvédelem 218
alvadási faktor, prokoaguláns 280
- inhibitor 281
amfolit 63
AMI 328, 330
amidofekete 75
amiláz, nyál 302
aminoacil tRNS 29
aminosav 27
- aktiválás 29
-, balra forgató, a 101
- dekarboxilezés 30
-, esszenciális 101
- dezaminálás 30
- szekvencia 28, 102
- -, szekvenciaazonosság 69
amplifikáció 279
amyloid b-peptid, liquor 339
ANA 254
- immunoblot 256
- kimutatás ELISA szűrőteszttel 255
- - indirekt immunfluoreszcenciával 254
- mintázat 256
ANA-ELISA 256
analit, A típusú 188
-, B típusú 188
analitikai interferencia 172
- referenciarendszer 188
analizátor, tömegspektrométer 179
analógia 68
ANA-pozitivitás 262
ANAscreen ELISA 255
ANCA 261
anionos detergens 41
ANP 334, 343
antibiotikum, tápoldat 208
anti-C1q komplementfaktor autoantitest 260
anti-CPP 260
antiegér antitest (HAMA) 157
antifoszfolipid antitest 292
- szindróma (APS) 253
- - diagnosztikai kritériumai 292
antigén 126
- feltárás 272
-, inkomplett 127
antigén jelölés 136
- -, radioizotópos 137
-, komplett 127
-, neo 127, 128, 322
- tisztítás 137
antigén-antitest reakció alkalmazása 139
antigéndetermináns 127
antigénspecifikus autoantitest ELISA 256
antihemofíliás faktor 280
anti-Jo-1 260
antikardiolipin antitest (ACA) 292
antikörper 104
antineutrofil citoplazma elleni antitesz (ANCA) 261
antinukleáris autoantitest (ANA) 254
- - ELISA (ANA-ELISA) 256
- faktor (AF) 254
antinukleoszóma-autoantitest 259
anti-RNP 259
anti-Scl-70 260
anti-Sm 259
anti-SS-A 259
anti-SS-B 259
antitest/ellenanyag 104
- definíció 126
- előállítás 132
- - immunizálással 133
- - rekombináns technológiával 135
- -, molekulafelismerő 109
- -, momoklonális 133
- -, poliklonális 133
antithyreoglobulin 262
anti-TPO 262
antitrombin defektus 290
- hiány, veleszületett 290
anyaion pásztázás 183
APC 291
APCI 178, 179
Apoenzim Reaktivációs Immunoassay (ARIS) 153
apoptózis kimutatása sejttenyészetben 215
APS 253, 292
APTI 284
-, megnyúlt 284
áramlási/flow citometria 240, 266
- citometriás immunoassay 159
ARIS 153
Arisztotelész 216
ASCA 263
assay interferencia 157
A típusú natriuretikus peptid 334

Tárgymutató
371
atmospheric pressure chemical ionization (APCI) 178, 179
ATP 29
atrialis natriuretikus peptid (ANP) 334
autoantitest (AAT) 251
-, analitellenes 173
-, anti-dsDNS 259
-, antinukleáris 254
-, egyes betegségekre jellemző 252
- meghatározás módszerei 254
- -, multiplex 257
-, patológiás 251
-, szervspecifikus 262
-, természetes 251
autofluoreszcencia 138
autoimmun betegség 251
- - diagnosztizálása 253
- - laboratóriumi eltérései 253
- -, szervspecifikus 252, 253
- -, szisztémás 252, 253
- - típusai 252
- hepatitis 263
- májbetegség autoantitest-immunoblot profil 263
- - autoantitestjei 264
- myositis autoantitestprofil immunoblot 261
autokrin 274
automatizáció fehérjeanalitikában 161
- -, tömegspektrometria 175
Avenzoar 216
Avery, Oswald 104
avidin-biotin-peroxidáz (ABC) eljárás 273
aviditás 131
B
bakteriális fehérje minta szolubilizáció 45
band pass emissziós filter 246
- - filter 246
BAP 348
Baylis, William Maddock 115
bázistriplet 102
BCG 222
BCR 191
Behring, Emil Adolf von 104
Bence-Jones-fehérje 227
Bence-Jones-fehérje kimutatása 230
Bence-Jones-proteinuria 233, 309
Benedikt-módszer 49, 298, 305
Berson 143
Berzelius, Jöns Jakob 101
b 2
-GPI antitest 260
b hCG 323
b humán koriongonadotropin (b hCG) tumormarker 323
b 2
-mikroglobulin 225
b 2
-mikroglobulin tumormarker 324
b 2
-mikroglobulin, vizelet 307
b 2
-transzferrin, liquor 340
b redőzött réteg 102
b-N-acetil- -D-glukózaminidáz (b-NAG), vizelet 307
b-NAG, vizelet 307, 309
betétes sejttenyészet 52
bioanalitikai fehérjevizsgálat 57
biogén amin 30
bioinformatika 67
bioinformatikai adatbázis 67
- adatkezelés 68
biokatalizátor 112
biológiai válaszmódosító 102, 116
biological response modifier 102, 116
biolumineszcencia 139
biuret reagens 49
bivalens reagens 139
blast ablak 243
blue-dextrán 41
BMD 347
Bonner-Laskey-módszer 84
Bradford-módszer 298
Bradford-reagens 50
Bradford-reakció 237
brefeldin 274
bróm-krezol-zöld (BCG) 222
B sejt dyscrasia 227
B típusú natriuretikus peptid (BNP) 335
Buchner, Eduard 113
Buchner, Hans Ernest August 105
Burdet, Jules 105
Burnet, Frank Macfarlane 105
Bürker-kamra 213
C, CS
C típusú natriuretikus peptid 334
CA 15-3 324
CA 19-9 324
CA 72-4 324
CA 125 324
c-ANCA 261

372 Tárgymutató
carcinoembryonalis antigén (CEA) 323
cardialis marker 328
- - instrukciók 331
- - orvosi alkalmazása, ACS 332
- - - -, nem ischaemiás szívbetegség 334
- - - -, vesebetegség 333
- -, albumin, ischaemia által módosított 335
- -, CK-MB-izoenzim aktivitás 330
- -, C-reaktív protein 335
- -, mieloperoxidáz 335
- -, mioglobin 331
- -, natriuretikus peptid 334
- -, sürgősségi 334
- -, troponin 328, 329
CBB 50, 75, 237
- festés Wang szerint 89
CCD 96
CD marker 266, 267, 269
- -, hematológiai malignitások 271
- nómenklatúra 267
CEA 323
CEDIA 153
celluláris immunitás 266
- - vizsgálata áramlási citometriával 266
Cenp-B 260
centromer elleni autoantitest (Cenp-B) 260
CGS mértékegységrendszer 187
CHAPS 42
charge-coupled device (CCD) 96
CHCA 179
Chemiluminescent Immunoassay (CLIA) 155
chip elektroforézis 59
-, kémiai 61
Christmas-faktor 280
CID 182
ciklikus citrullinált peptid elleni autoantitest (anti-CCP)
260
cisztatin, nyál 302
citokin, csont 348
- csoportosítás 274
- kimutatás 273
- - áramlási citometriával 275
citoszkeleton 109, 110
- fehérjék vizsgálata antitest felhasználásával 53
- - -falloidinnel 53
citozin-arabinozid (Ara-C) 212
CK-BB 340
CK-MB 330
CK-MB/totál CK relatív index 330
CK-MB1 331
CK-MB2 331
CK-MB-izoenzim aktivitás 330
Clauss-módszer 285
CLIA, akridíniumészter jelölésű 155
Cloned Enzyme Donor Immunoassay (CEDIA) 153
cluster of differentation (CD) 266
Cohen, Stanley 116
collision induced dissociation (CID) 182
colour gating 242
commutability 190
complement system 106
constant neutral loss 183
Coomassie Brilliant Blue (CBB) 50, 75
cooximetria POCT 316
Coulomb-erő 32
Coulomb-robbanás 178
cöruloplazmin 225
CRAB 229
C-reaktív protein (CRP) 225
- - cardialis marker 335
Creutzfeldt-Jakob-betegség 340
CRH 343
CRP 225
CRP, vizelet 307
Cushing-kór 344
Cushing-szindróma 344
cut-off 333
CYFRA 21-1 324
Czerkinsky, Cecil 277
csont dinamikus átépülése 347
csontanyagcsere 348
- endokrin szabályozása 349
-, fizikai aktivitás hatása 350
- rendellenessége 350
-, táplálkozás hatása 350
csontátépülés 350
csontfelépülési marker 351
csontleépülési marker 351
csontrendszer 347
csontsejt 347
csontspecifikus alkalikus foszfatáz (BAP) 348
csontsűrűség (BMD) 347
csontszövet 347
csontvelői őssejt transzplantáció 249

Tárgymutató
373
D
daganat epidemiológiai biomarker 364
daganatos csontáttét 351
daganatsejt-kultúra 51
dagantszűrés 364
daughter ion scan 183
D-dimer teszt 287
De Novo Sequencing 184
defenzin, nyál 302
DELFIA 155
denaturáló IEF + SDS elektroforézis 74
- SDS-gélelektroforézis Laemmli szerint 77
denaturált állapot 103
detergens, anionos 41
-, ikerionos 42
-, minta-előkészítés 41
-, nem ionos 42
-, - -, alkalmazása sejtfrakcionálásra 44
Detre (Deutsch) László 104, 126
dexamethason szuppressziós teszt 344
dezacil-ghrelin 357
dezaminálás 30proteáz 30
DHB 179
diabetes mellitus száraz szemmel 296
- - szemészeti szövődményei 298
- -, könnyfehérjék 297
dialízis, minta-előkészítés 40
DIC 288
differenciálcentrifugálás 43
2,5-dihidroxi-benzoesav (DHB) 179
dimetil-szulfoxid (DMSO) 135
dinein 111
dioxetán-foszfátészter fényemissziója 167
direkt fotometria 49
diszkontinuus gél 72
disszeminált intravascularis koaguláció (DIC) 288
ditioeritrol (DTE) 42
ditiotreitol (DTT) 42
DMSO 135
DNS eltávolítása mintából 48
- motor 111
dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-
PAGE) 62
domén 36
dot plot, kétszínű 246
- -, színes 242
2D PAGE 59
DTE 42
DTT 42
dynamic molecular sieving 62
dysproteinaemia 223
E
ECL 95, 167
- detektálás 95
- reagensek 96
ECLIA 156, 170
EDE 296
Edelman, Gerald 104
egérmáj fehérje szolubilizálás 46
- szövet alkalikus fehérje dúsítása 46
EGF, könny 295
egy foton számlálás 167
egyedi fehérje kimutatása immunfluoreszcenciás módszerrel
52
- - -immunkémiai módszerrel 55
- - -Western blot módszerrel 54
egyedi ion vizsgálat 182
egyes sejt lézeres vizsgálata 241
Ehrlich, Paul 104
EIA 143, 149
-, fluoreszcens 150
-, heterogén 149
-, homogén 152
-, kemilumineszcens 151
EIHIA 153
éjfélzóna 69
ekvivalencia elv 162
elasztikus rost 118
electron transfer dissociation (ETD) 182
ElectroSpray Ionization (ESI) 175
elektroendozmózis 65
elektroforézis, affinitás 60
-, agarózgél 73
- alkalmazása előfrakcionálásra 44
- - fehérjeelválasztásra 71
-, chip 59
- hordozói 71
-, kapilláris 59
- készülék 71
-, kétdimenziós, kombinációi 74
-, Laemmli-féle SDS gél 73
-, savanyú urea gél 73
-, zóna 60
elektrokemiluminescens immunoassay 143

374 Tárgymutató
elektrokemiluminescens jelölés 167
- Immunoassay (ECLIA) 156, 170
elektrokromatográfia 60
elektronionizáció 177
elektrospray, ionizációs (ESI) 175, 178
- tömegspektrometria (ESI-MS) 66
ELISA 149, 164
-, ANAscreen 255
-, befogó 148
-, direkt 148
-, indirekt 148
-, -, szendvics 149
-, kompetitív 148
-, szendvics 148
ELISPOT 150, 277
- dot analízis 278
ellenanyag/antitest definíció 126
- jelölés 136
- -, radioizotópos 137
-, momoklonális 133
-, poliklonális 133
- tisztítás 136
élő állapot 103
előfrakcionálás eljárásai 43
elsődleges fehérje szerkezet 28
EMA 263
embrionális sejt tenyésztése 203
emissziós fluoreszcencia 243
EMIT 149, 152
emlős sejtkultúra típusai 51
emlősszövet minta feltárása 46
ENA 259
endocitózis 34
endokrin 274
- mirigy 342
endomysium elleni antitest (EMA) 263
endoplazmatikus retikulum 34
- - stressz 357
- -, durva felszínű 34
- -, sima felszínű 34
Engelhardt 109
enhanced chemiluminescence (ECL) 95
eNOS 358
enzim 112
- aktivátor 33
-, egyszerű 33
- fehérje 33
- funkciók 114
- immunoassay (EIA) 143, 149, 150
enzim immunoassay, kolorimetrikus 149
- -, színreakción alapuló 149
- jelölés 138, 170
-, összetett 33
- tumormarker 324
enzimcitokémia 272
-, direkt 272
-, indirekt 272
enzimhisztokémia 115, 270
- technikája 272
Enzyme Inhibitory Homogenous Immunoassay (EIHIA)
153
Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) 152
enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) 149
- immunosorbent spot (ELISPOT) 277
enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) 149
epidermalis növekedési faktor (EGF) 295
epitóp 127
-, konformációs 127, 128
-, lineáris 127, 128
Eppendorf-pipetta 298
erősített kemilumineszcencia (ECL) 167
ESI 175, 178
ESI-MS 66
esszenciális aminosav 101
- táplálék 123
ETD 182
etikai megfontolások állatkísérlet végzésekor 218
European Community Bureau of Reference (BCR) 191
- Institute for Reference Materials (IRMM) 191
evaporative dry eye (EDE) 296
exenatid 346
exocitózis 34
exon 36
extracelluláris mátrix fehérje 117, 355
- szerkezet 117
extrahálható nukleáris antigének elleni autoantitestek
(ENA) 259
ezüstfestés, gélben, Gromova szerint 89
-, -, MS-kompatibilis, Gromova szerint 89
ezüstintenzifikálás 94
ezüstözés 75
-, direkt 85
- eljárásai 85
-, fehérjedúsítással, majd ezüstdetektálással, Marshall
szerint 87
-, kombinált, leszárított, festetlen vagy festett géllemezen
Willoughby-Lambert szerint 85
-, -, Willoughby-Lambert szerint 85

Tárgymutató
375
ezüstözés, módosított ultraszenzitív eljárással, Marshall
szerint 87
- ultravékony PAGE-lemezen, Sammons szerint 86
F
F ab
106, 129
FACS 43
fág display technika 135, 136
Fahey, John 104
faktoranalízis vizsgálat 282
falloidin 53
fast atom bombardment (FAB) 177
- ion bombardment (FIB) 178
FBS 208
F c
106, 129
FCM 240
FDP 281, 287
fehérje 27, 101
- alegység 28
- analitika automatizációja 161
- - -, tömegspektrometria 175
- analógia 68
- biochip 158
- bioinformatika 66, 67
-, biokatalizátor 112
- biológiai funkciók hordozója 103
- - szerepe 27
- definíciója 101
- detektálás immunoblotting módszerrel 90
- - - -, immunreakció előhívása 94
- - Mini-Trans-Blot készülékkel 90
- - nedves immunoblotting módszerrel 90
- - semi-dry immunoblotting módszerrel 90
- -, MS-kompatibilis 89
- detektálási protokollok 84
- doménszerkezete 36
-, biokatalizátor 112
-, egyszerű 28
-, enzim 112
-, extracelluláris szerkezet 117
-, hormon 115
-, kis molekulatömegű 234
-, kontraktilis 109
- elektroforézis 59, 60
- - technikák 60
- élő anyag produktum 101
- eltávolítása mintából 41
fehérje elválasztás elektroforézissel 71
- enzim 33
- ezüstözés, direkt, egydimenziós SDS-lapgélen 85
- felgombolyodás 29
- frakcionálás ultracentrifugálással 58
- homológia 68
-, hormon 115
- - meghatározás 344
- izoelektromos fokuszálása 63
- jelölés 75, 97, 137, 165
- jelölési protokollok 76
- kapilláris elektroforézis 59
- kimutatás, egyedi, immunkémiai módszerrel 55
- -, -, morfológiai módszerrel 52
- -, -, Western blot 54
- -, immunfluoreszcenciás 52
- -, száraz-kémiai 314
-, kis molekulatömegű 234
- koncentráció mérése 49
-, kontraktilis 109
- kölcsönhatás 31
- kromatográfia 57
- lebomlás 30
-, ligandum 122
- meghatározás 48
- -, Benedikt-módszer 49
- -, bioanalitikai 57
- -, Bradford-módszer 50
- -, direkt fotometria 49
- -, Lowry-módszer 49
- -, mikrobiuret-módszer 49
- - standardizálása 190
- minta koncentrációja 42
- módosult aminosav polimer 101
- molekulatömeg becslése kalibrációs egyenessel 57
-, motor 109
-, natívan rendezetlen 28
- oldatba vitele 41
- oldékonyság alkalmazása előfrakcionálásra 44
- ortológia 69
- osztályozás funkció alapján 28
-, összetett 28
- paralógia 69
-, raktározó 120
- rost 118
-, sejtnövekedési faktor 116
-, struktúraalkotó 34
- szekvenciaanalízis 69
- szekvenciaazonosság 69

376 Tárgymutató
fehérje szerkezet 27
- -, elsődleges 28, 102
- -, harmadlagos 28, 102
- -, másodlagos 28, 102
- -, negyedleges/kvartener 28, 102
- -, primer 28
- -, szekunder 28
- -, tercier 28
- szintézis 28
- szolubilizálás 41
- térbeli konformációja 28
-, transzportőr 121
- tumormarker 321
- - csoportok 323
- - -, enzim 324
- - -, hormon természetű 323
- - -, mukoprotein 323
- - -, onkofötális 323
- - extracelluláris térbe kerülése 322
- - jellemzői 322
- újdonképződés 101
- újragombolyodás 29
- vizsgálat, proteomikai 65
-, zsírsejt termelte 355
fehérjekomplex alegység 102
fehérjevizelés 311
fehérvérsejt alcsoportok elkülönítése 266, 269
felhődiagram 242
fenol eltávolítása mintából 41
fenolvörös 207
fényemisszió mérése 167
fényszűrő flow citometriában 246
ferment 113
ferritin 120
- tumormarker 325
festékkötéses jelölés 75
festékkötési reakció mennyiségi mérésre 237
festés, negatív 75
feszültségtüske 168
FIA 143, 153
-, heterogén 153
-, homogén 155
fibrin 119
fibrin/fibrinogén degradációs termék (FDP) 281, 287
fibrinogén 119, 280
- meghatározás 285
fibrinolitikus rendszer 281
fibrinolízis 287
fibrinopeptid A (FPA) 287
fibrinstabilizáló faktor 280
fikoeritrin 244
Fikoll-gradiens 43
FITC 53, 165, 244
- képlete 165
fitohemagglutinin (PHA) 274
Fitzgerald-faktor 280
flash típusú jelölés 166
flaska 206
flavin-adenin-dinukleotid (FAD) 153
flavoprotein 28
Fleming 295
Fletcher-faktor 280
flow citométer 240
flow/áramlási citometria (FCM) 240, 266
- - mérettartománya 241
- -, fluoreszcens jelölés 243
- citometriás immunoassay autoantitest meghatározásra
258
fluorescent activated cell sorting (FACS) 43
- scatter 240
fluoreszcein-izotiocianát (FITC) 53, 165, 244
fluoreszcencia 244
- rezonancia energia transzfer (FRET) 166, 168
-, lézer indukálta 62
fluoreszcens 4-metil-umbelliferon-foszfát (MUP) 151,
166
- DNS-festékek 269
- EIA 150
- életidő 165
- festés 75
- immunoassay (FIA) 143, 153
- -, heterogén 153
- jelölés 138, 165
- - flow citometriában 243
- -, molekulák 154
- mérés flow citometriában 244
- mikroszkóp 52
- polarizációs immunoassay (FPIA) 154, 155, 170
- Protection Immunoassay 155
- spektrofotometria 216
- színjelölés, kombinált 245
fluorofór 243, 268
fluorogén vegyület 166
fluorográfiás detektálás Bonner-Laskey szerint 84
fluoroimmunometrikus módszer 154
folding 29
Folin-reagens 49
folliculusstimuláló hormon (FSH) 343

Tárgymutató
377
folyadék fázisú izoelektromos fokuszálás 48
- szekunder ion tömegspektrometria (LSIMS) 177
forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA) 274
formalinos fixálás 272
forrásban bomlás 177
forward scatter (FSC) 241
- - treshold 247
foszfoprotein 28
foszforiláció 27
fotopolimerizáció 71
fötális marhasavó (FBS) 208
FPA 287
FPIA 154, 155, 170
fragment antigen binding (F ab
) 106, 129
- crystallizable (F c
) 106, 129
fragmentálás 182
FRET 166, 168
FSC 241, 266
FSH 343
G, GY
Gachon 294
Galenus 216
Gally, Joseph 104
g számláló 167
gammopathia, monoklonális 223, 227
-, -, besorolása 229
-, -, előfordulása 232
-, -, kivizsgálása 228, 229
-, -, malignus 227
-, oligoklonális 339
gél, gradiens 73
-, homogén 72
- koncentráció 72
gélelektroforézis (PAGE) 59, 71
-, alkalikus 73
-, -, nem denaturáló 73
- mikrochippel 62
gélelőkészítés autoradiográfiához 84
gélszűrés 43, 44, 236
genom 36
GH 343
ghrelin 343, 346, 357
GHRH 343
GIP 357
glargin inzulin 345
gliadin elleni antitest 263
glikoprotein 28
glomerulonephritis 309
glomerulus fehérjevisszatartó működése 311
glow típusú jelölés 167
GLP-1 357
- agonista 346
glukagon 343
glukagonszerű peptid-1 (GLP-1) 357
glukokortikoid 350
glukózdependens inzulinotrop peptid (GIP) 357
glutamin 207
glutáraldehides konjugálás 139
GnRH 343
Golgi-készülék 34
gonadotrop releasing hormon (GnRH) 343
Gömöri György 270
gp 130 citokincsalád 348
gradiens centrifugálás 43, 58
- gél 73
Gromova-módszer, ezüstfestés gélben 89
gyomor parietalis sejt elleni antitest 263
gyors atombombázás (FAB) 177
- ionbombázás (FIB) 178
gyorsteszt → POCT
gyulladásos marker vizsgálat POCT 315
gyűjtő gél 72
H
Hageman-faktor 280
HAMA 157, 173
Hanson 110
haptén 127
haptoglobin 225
harmadlagos fehérjeszerkezet 28
Harvey, William 216
hasnyálmirigy b-sejt daganat 344
HAT médium 134
hatpontos kalibráció 171
háttérfluoreszcencia kiküszöbölése 168
HbA 1c
mérés standardizálása 199
HBV 142
HCCA 179, 184
HCV 142
Heidelberger, Michael 104
Heidelberg-görbe 140
hemaglutináció 142
hemoglobin 122

378 Tárgymutató
hemoglobin, vizelet 307
hemolízis hatása mérésekre 172
hemosziderin 121
hemosztázis vizsgálata 279
hemprotein 28
Hep G-2 239
heparinkofaktor aktivitás 290
Hersko, Avram 30
heterofil antitest mintában 173
hGH 349
hibridóma 134, 204
hidrátburok 32
hidrogén-peroxid 358
hidroláz 33, 114
high dose hook effektus/hook effektus/ nagy dózis visszacsapási
effektus 145, 157, 173
hiperimmun savó 133
His-tag 58
hisztatin, nyál 302
hisztidin tag (His-tag) 58
hisztológia 119
HIV 142
homogén gél 72
homológia 68
hook effektus 145, 157
hormon 115
- meghatározás POCT 316
- természetű tumormarker 323
HPLC microalbuminuria kimutatására 312
Humán Anti-Mouse Antitest (HAMA) 157
- Cell Differentation Molecules (HCDM) Workshop 267
- epididymisprotein-4 (HE4) 325
- genom 36
- inzulin 345
Huxley 110
HYDRAGEL 73
hypergammaglobulinaemia 226
-, diffúz 226
-, diszkrét 227
hypoalbuminaemia 222
hypogammaglobulinaemia 226
hypophysis 341
- elülső lebeny adenoma 344
hypothalamus 341
I
időfelbontású számlálási technika 168
időkapuzott megfigyelés 168
IFCC Committee on Plasma Proteins 191
IFE 230
IgA 130
- szint szelektív emelkedése 228
IgA 1
105, 107, 130
IgA 2
105, 107, 130
IgD 105, 107, 130
IgE 105, 107, 130
IGF-1 343, 349
IgG 130
-, vizelet 307
IgG 1
105, 107, 130
IgG 2
105, 107, 130
IgG 3
105, 107, 130
IgG 4
105, 107, 130
IgM 105, 107, 129, 130
- szint szelektív emelkedése 228
ikerionos detergens 42
imidazol-cink festés 75
immortalizált sejtkultúra 51
immunaffinitás kromatográfia 58
immunfixációs elektroforetogram 230, 231
- elektroforézis (IFE) 230
- - vizeletfehérje-vizsgálatban 232
immunfluoreszcencia, indirekt, ANA kimutatására 254
immunfluoreszcenciás egyedi fehérje kimutatás 52
- fehérjekimutatás, direkt 52
- -, indirekt 52
immunglobulin (Ig) 104, 105, 127
- aviditás 131
- előállítás 132
- elváltozások 223
- izotípus 106, 129
- mérés 227
- monomer 106
- osztályok 106, 226
- szerkezet 105, 128
- szérumfehérjék 226
- valencia 131
immunizálás 132
immunkémia 125
immunkémiai analízis 164
- módszerek kimutathatósági értékei 174
immunkomplex, in vitro 140
immunoassay 125, 164
-, áramlási citometriás 159
-, befolyásoló faktorok 156
-, elektrokemiluminescens 143
-, enzim 143
- érzékenysége 125

Tárgymutató
379
immunoassay, fluoreszcens 143
-, heterogén 144, 145
-, -, szilárd fázisa/szendvics 145, 168, 169
imunoassay 142
-, homogén 144, 145, 169
-, - 164, 169, 170
- kalibrációja 171
-, kemiluminescens 143
- kis molekulatömegű fehérje kimutatására 238
-, kompetitív 144, 169
- közege 168
- mérési elve 143
-, multiplex 158
-, nem kompetitív/szendvics 144
-, radio 143, 145
-, szilárd fázisú 164
-, telítési 169
immunogén 127
immunológiai vizsgálómódszerek 139
immunoradiometrikus assay (IRMA) 147
immunreakció 108
- agarózgélben 75
- előhívása, kemilumineszcenciával 95
- -, Ni-DAB-reakcióval 94
- jelölésként 75
immunsejt fenotípus meghatározás 266, 270
- stimulálás 274
immunszerológia 108
immunturbidimetria 162
-, kompetitív, erősített 162
-, latexerősített, direkt 162
immunválasz szakaszai 126, 127
indirekt immunfluoreszcencia (IIF) 254
inhibitor 33
iniciáció 279
inkretin 357
inkubátor, sejttenyésztés 206
INR 283
in source decay (ISD) 177, 182
instabil angina 328
intenzív terápiás ellátás, POCT 314
interferáló vegyület eltávolítása mintából 40, 47
interferencia, analitikai 172
-, -, kiküszöbölése 173
interleukin-6 (IL-6) 356
International Normalised Ratio (INR) 283
- Union of Immunological Societies (IUS) 190
interrogation point 241
intracelluláris vázfehérje 109
intrinsic faktor elleni antitest 263
intron 36
inzulin 343
- intracelluláris jelátvitel 357, 358
- kutatás 345
- szerepe metabolikus szindrómában 354
inzulinanalóg 345
inzulinrezisztencia 354, 358
-, szelektív 358
inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1) 343, 349
ioncserés kromatográfia 57
ionforrás, tömegspektrométer 176
ionizáció módjai 177
ionok meghatározása POCT 315
ionomycin 274
IPG 74
IRMA 147
IRMM 191
ISD 177
Ishikawa 150
Ishizaka, Kikishige 104
Ishizaka, Teruki 104
IUS 190
izoelektromos fokuszálás 60, 63
- - agarózgélben 73
- - gélcsőben; 1. dimenzió 80
- - immobilizált pH-gradiens gélben (IPG) 74
- - lapgélen; 1. dimenzió 84
- - poliakrilamidgélben 73
izomeráz 33, 114
izotiocianát 165
izotóp, b-sugárzó 138
-, g-sugárzó 137
izotópos jelölés 75, 137, 165
J
JCTLM 190
jelölés, citokin 275
-, derengés típusú 167
-, elektrokemilumineszcenciás 167
-, enzimes 138, 170
- ezüstözéssel 75
-, felvillanás típusú 166
-, festékkötéses 75
- fluoreszcens festéssel 75, 138
- immunreakcióval 75
-, izotópos 75, 137
-, jel detektálása 167
-, kemilumineszcenciás 167

380 Tárgymutató
jelölt molekula eltávolítása, RIA 149
Jenner, Anthony 104
Jerne, Niels K. 105, 134
jodinációs reagens 165
Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine
(JCTLM) 190
Jurkat-sejt 180, 214
K
kalcitonin 343, 349
- tumormarker 323, 325
kalcium alvadási faktor 280
-, ionizált 349
kalibráció mestergörbével 172
-, hatpontos 171
kalibrációs görbe 171
kaotróp anyag 41
kapilláris elektroforézis 59
karbamid 30
karboanhidráz, nyál 302
kardiolipin antitest 260
kardiológiai ellátás POCT 315
karriermediált transzport 35
katalízis 33
kémiai chip 61
kémiai ionizáció (CI) 177
- polimerizáció 71
kemilumineszcencia 95, 139
-, erősített 167
kemilumineszcenciás jelölés 167
kemilumineszcens EIA 151
kemilumineszcens immunoassay (CLIA) 143, 155
- Mágneses Immunoassay (CMIA) 156
keratoconjunctivitis sicca 296
- -, primer 296
- -, szekunder 296
késleltetett fluoreszcenciájú immunoassay (DELFIA) 155
kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D PAGE)
59
kettős fokuszálású szektoros analizátor 180
kevert kötőszöveti betegség (MTCD) 253
Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) 133
kiméra antitest 135
kinezin 111
kis molekulatömegű fehérje 234
- - -biológiai szerepe 234
- - -dúsítása kimutatás előtt 236
- - -kimutatása 235
kis molekulatömegű fehérje kimutatása immunoassay-vel
238
- - -marker 235
- - -mennyiségi mérése 237
- - -csoportosítás 234
kis részecske mérés flow citometriával 248
kísérlet állatfajok 217
kitapadó sejtkultúra 51
KLH 133
klónszelekció 134
koagulométer 282
Koch, Robert 104
KODAK Image Station 2000R 96
kodon 28, 102
koenzim 33
kofaktor 115
- aktivitás 291
kollagén, I-es típusú 348
- rost 118
- szerkezet 351
kollagenáz 349
kommutabilitás 189
kompenzáció, számítógépes, flow citometriában 247
komplementrendszer 106
komplett DMEM médium készítése 208
konformációs epitóp 127, 128
konjugálás immunoassay során 139
konjugált monoklonális antitest 243
kontaktlencse 296
kontamináció sejttenyészetben 211
- -, bakteriális 211
- -, gombás 211
- -, mycoplasma 211
- -, vírusos 211
kontraktilis fehérje 109
kontrollcsoportos vizsgálat 200
konvergens evolúció 68
kortikotrop releasing hormon (CRH) 343
Köhler, Georges J. F. 105, 134
könny 294
- fehérje 294
- - daganatos betegségekben 297
- - diabetesben 297
- - dohányzókban 297
- - hepatitis C-ben 297
- - szisztémás betegségekben 297
- - térkép 299
- - vizsgálat MALDI TOF MS-sel 300
- - -O’Farrell-módszerrel 299
- - -SDS elektroforézissel, ezüstözéssel 299

Tárgymutató
381
könny fehérje térkép Western blottal, Gallyas-ezüstözéssel
és ECL-előhívással 299
- fiziológiai szerepe 294
- összetétele 294
-, reflex 298
könnyfilm rétegei 294
könnyminta vétele 298
könnyspecifikus prealbumin (TSPA) 295
könnyvesztés fokozódása 296
könnyűlánc proteinuria, túlfolyásos 311
kreatin-kináz (CK) 330
- BB-izoenzim (CK-BB) 340
- MB-izoenzim 330
- MB-izoformok 330, 331
kromatográfia 57
-, affinitás 57
-, elektro 60
-, immunaffinitás 58
-, ioncserés 57
-, ligandumreceptor 58
-, méretkizárásos 236, 312
-, -, microalbuminuria kimutatására 312
-, micelláris elektrokinetikus 60
kromatográfiás előfrakcionálás 44
kromogranin-A 344
kubilin 311
kumarin 166
Kühne, Wilhelm 109, 113
kvadrupól analizátor 180
L
lab-on-a-chip 61
Laboratóriumi Medicina Visszavezethetőségi Egyesített
Bizottsága (JCTLM) 190
Laemmli-módszer 77
Laemmli-féle SDS gél elektroforézis 73
Laemmli-féle SDS PAG elektroforézis 306
laktátvizsgálat POCT 316
laktoferrin, könny 295
-, nyál 302
laminár boksz 210
lanreotid 346
lapgél 72
latex agglutináció 142
LCM 43
leányion-pásztázás 183
Leeuwenhoek, Antoni van 109, 203
légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) 178, 179
Leiden-mutáció 291
leptin 343, 356
leukocyta proliferáció 309
Levey-Jennings-grafikon 200
Levi-Montalcini, Rita 116
lézer deszorpciós-ionizációs repülési idő tömegspektrometria
(MALDI-TOF) 66
- indukálta fluoreszcencia (LIF) 62
- mikrodisszekció (LCM) 43
LH 343
liáz 33, 114
LIF 62
ligandum fehérje 122
- receptor kromatográfia 58
ligáz 33, 114
limitált proteolízis 235
lineáris epitóp 127, 128
- ioncsapda analizátor 180
lipaemia hatása mérésekre 172
lipid eltávolítása mintából 40
lipokalin, könny 295
lipopoliszacharid (LPS) 274
lipoprotein 28, 122
liquor liquor cerebrospinalis 337
- albuminhányados 338
liquor fehérje vizsgálat 337
- fehérje vizsgálat, biomarker 338
- - -, elektroforézis 338
- - -, ELISA 338
- - -, IgG-index 338
- makroszkópos vizsgálata 337
- minta vétele 337
-, véres 337
liraglutid 346
lispro inzulin 345
living state 103
lizoszóma 34
lizoszomális savanyú hidroláz 349
lizozim, könny 295
-, nyál 302
long pass filter 247
Lowry-fehérjemeghatározás 49
LPS 274
LSIMS 177
luciferin 139
luciferin-adenozin-trifoszfát 151
lumbálpunkció 337
luminol 96, 151
- fényemissziója 167
lupus antikoaguláns 293

382 Tárgymutató
lupus nephritis 310
luteinizáló hormon (LH) 343
Lyubimova 109
M
makrogyöngy módszer 169
MALDI 175, 179
MALDI Imaging 184
MALDI TOF 66, 176, 184
malignus transzformáció 321
MAPK útvonal 358
Marshall-ezüstözés 87, 300
-, fehérjedúsítással 87
-, módosított 87
másodlagos fehérje szerkezet 28
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
175, 179
mátrix metalloproteináz 349
- segített lézerdeszorpció (MALDI) 175, 179
MBS 139
M csúcs 227
mechanoenzim 112
Mecsnyikov, Ilja 104
Medawar, Peter Brian 105
médium összetétel változása 215
-, sejttenyésztés 207
megalin receptor 311
MEIA 150, 152, 156
Meibom-mirigy 294
mellékpajzsmirigy adenoma 344
mélyvénás thrombosis (MVT) 287
mérés minőség-ellenőrzése 199
mérési eredmény metrológiai visszavezethetősége 189,
190, 192
méretkizárásos kromatográfia 236, 312
- - microalbuminuria kimutatására 312
Mértékegységek Nemzetközi Rendszere (SI) 187
mértékegységrendszerek 187
mestergörbe 172
mesterkalibráció 172
metabolikus szindróma 353
- - definíciója, ATPIII-kritériumok 354
- - -, IDF-kritériumok 354
- - -, WHO kritériumok 353
- - előfordulása 354
- - patogenezise 354
metabolizmus 35
metalloprotein 28
metilén-bisz-akrilamid 71
metionin 29
metrikus mértékegységrendszer 187
M gradiens 227
MGUS 227
- diagnosztikai kritériumai 229
micelláris elektrokinetikus kromatográfia 60
microalbuminuria 311
- előfordulása 312
microbead 248
- assay 158
- -, multiplex 159
Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA) 150, 151
MicroSpot Assay 158, 258
midnight zone 69
mieloperoxidáz cardialis marker 335
mikrobiuret módszer 49, 298, 305
mikrochip, elektroforetikus 61
mikrocsatornás detektor 182
mikrogyöngy 248
- módszer 158, 170
mikroorganizmus minta extrakció-szolubilizáció 45
Mikropartikulum Enzim Immunoassay (MEIA) 150, 151, 152
mikroszkópos módszerek immunsejtek vizsgálatára 270
mikrotubuláris alapú motor 111
Milstein, César 105, 134
miniatürizálás, mikrochip alkalmazás 61
Mini-Trans-Blot készülék fehérjedetektáláshoz 90
minor myocardialis károsodás 328
minőségi kontroll mikrogyönggyel flow citometriában 249
minta bevitel tömegspektrométerbe 176
minta előfrakcionálás 42, 48
- előkészítés 39
- -, protokollok 45
- -, sejtes 40
-, sejtes 51
- tárolás 42
- vétel állatkísérlet során 217
mioglobin 122
- cardialis marker 331
-, vizelet 307
miozin 111
MKSA mértékegységrendszer 187
m-maleimidobenzil-N-hidroxiszukcinimid-észter (MBS)
139
moat 243
Moll-mirigy 294
monenzin 274
monoclonal gammopathies undetermined significance
(MGUS) 227

Tárgymutató
383
monocyta kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) 356
monoklonális antitest/ellenanyag 133, 204
- - előnyei 135
- gammopathia 223
- gammopathiák nem meghatározott jelentőséggel
(MGUS) 227
- protein (M protein) 223, 227
monolayer sejtkultúra 51
morfológiai módszerek immunsejtek vizsgálatára 266
motorfehérje 109
moving boundary electrophoresis 59
M protein 223, 227
- - elektroforézise 230
mRNS 28, 102
- alternatív vágása 36
MS-kompatibilis fehérjedetektálás CBB-festéssel, Wang
szerint 89
- - ezüstfestéssel gélben, Gromova szerint 89
MTCD 253
mTOR-IRS 359
MUC 1 gén 324
MUC 16 gén 423
mucin 119
-, nyál 302
mukoprotein tumormarker 323
- tumormarker 324
multicolour labeling 245
multiparaméteres analízis 242
multiple reaction monitoring 183
multiplex ambiens assay 158
- microbead assay 258
multipotens őssejt 204
MUP 151, 152
mustársav 179
myeloma, aszimptomás, diagnosztikai kritériumai 229
- multiplex, célszervkárosodások kritáriumai 229
- - diagnosztikai kritériumai 229
-, nem szekretoros, diagnosztikai kritériumai 229
myopathia, idiopathiás gyulladásos 253
myosin 111
myositis overlap szindróma 262
N, NY
NAG 307
nagy dózis visszacsapási effektus/high dose hook effektus/
hook effektus 145, 157, 173
- molekulatömegű kininogén 280
nanoESI 178
natív állapot 103
natívan rendezetlen fehérje 28
nátrium-bikarbonát 207
nátrium-dodecil-szulfát (SDS) 41
natriuretikus peptid cardialis marker 334
NDAS 253
NDC 253
nefelométer 141
nefelometria 140, 164
negyedleges fehérjeszerkezet 28
nem denaturáló alkalikus gélelektroforézis 73
- - - - Ornstein-Davis szerint 76
- - - gél + SDS elektroforézis 74
- differenciált autoimmun betegség (NDAS) 253
- - collagenosis (NDC) 253
- - kötőszöveti betegség (UCTD) 253
nem ionos detergens 42
neoantigén 127, 128, 322
nephrosis-szindróma 309
neuroendokrin hormon fehérje 341
- - szekréció rendellenessége 342
- rendszer 341
- - betegségei 342
- tumor 343
- tumormarker 344
neuronspecifikus enoláz (NSE) 340
NGT 354
N-hidroxiszukcinimid (NHS) 139
NHS 139
niche 117
Ni-DAB reakció 94
- - ezüstintenzifikálással Gallyas szerint 94
Nidergerke 110
non-Sjögren tear-deficient dry eye (NSTD) 296
non-ST-szegment emelkedés myocardialis infarctus
(NSTEMI) 328
normálérték 193
normális glukóztolerancia (NGT) 354
növekedési hormon (GH, hGH) 343, 349
- - kutatás 345
- - serkentő hormon (GHRH) 343
- - termelő hypophysis adenoma 344
növényi minta feltárása 46
- - -, levél 46
- - -, mag 46
NP-40 42
NSTD 296
NSTEMI 328

384 Tárgymutató
nukleinsav eltávolítása mintából 41
nukleoprotein 28
nyál biológiai funkciói 301
- fehérje 301
- - funkcionális vizsgálata 303
- - összetétele 302
- - vizsgálat 302
- - vizsgálat elektroforézissel 303
- - - tömegspektrometriával 303
- minta vétele 302
O
O’Farrell-módszer 79, 80, 81
obesitas 354, 355
obesztatin 357
obscuration bar 241
octreotid 346
oligoklonális gammopathia 223, 232
onconeuronalis antitest immunoblot 264
one platform FCM-analízis 248
onkofötális tumormarker 323
onkogén 321
optikai filter 246, 247
orbitrap analizátor 181
Ornstein-Davis-módszer 76
orozomukoid 300
orthostaticus proteinuria 313
ortológia 69
osteoblast 347
- faktorok 348
osteoclast 347
- faktorok 349
osteocyta 347
osteoporosis 350
oszteoid 348
oszteokalcin 348
oszteonektin 348
oszteoprotegerin 349
oxidatív dezaminálás 30
oxidoreduktáz 33, 114
oxintomodulin 346
oxitocin 343
Ö
őssejt izolálás 205
-, multipotens 204
-, pluripotens 204
- tenyésztés 204
-, totipotens 204
-, unipotens 204
P
PACAP 362, 363
PAGE 71, 306
-, denaturáló 73
-, kétdimenziós, denaturáló rendszerben 79
-, nagy felbontású, kétdimenziós, O’Farrell szerint, 1.
dimenzió 79, 80
-, - -, -, - -, 2. dimenzió 81
-, natív 73
- planáris horizontális rendszerben 72
- vertikális rendszerben 72
Paget-kór 351
PAI-1 281
PAI-2 281
pajzsmirigy medullaris carcinoma 344
pajzsmirigyhormon 342, 349
p-ANCA 261
Pándy Kálmán 338
Pándy-reakció 338
PAP 273, 324
parajodofenol 95
parakrin 274
paralógia 69
paraneoplasiás antitest immunoblot 264
paraneoplasticus antigének 264
paraprotein 223, 227, 321
parathormon (PTH) 343, 349
- related protein 323
- tumormarker 323
parathormonszerű fehérje tumormarker 323
parent ion scan 183
Pasteur, Louis 113
passzálás 51, 209
-, tripszines 209
pásztázás 182
Pauling, Linus 102
PBC 242
PBS 45
PCA 236
PC-aktivátor 290
PCT 239
PEG 134
peptid 101

Tárgymutató
385
peptid hormon 343
- - kutatás 345
- - meghatározás 344
- YY 3465
Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 184
- - mapping 66
peptidil-transzferáz 29
peridinin-klorofill-protein komplex 244
perjodátos konjugálás 139
perklórsavas kicsapás 236
perklórsavas kicsapás + Western blot 237
peroxidáz 151, 302
-, könny 296
- reakció előhívása kemilumineszcenciával 95
- - -Ni-DAB-reakcióval 94
peroxidáz-antiperoxidáz (PAP) komplex 273
PHA 274
phage display 135
PI 282
-, megnyúlt 283
PINP 351
piridoxál-foszfát 30
pitvari natriuretikus peptid (ANP) 343
PIVKA 283
p-jodofenol 167
plazma albumin 222
- deszorpció (PD) 177
- fehérje 221
- - elektroforézis 222
- - funkciók 221
- - vizsgálat 222
- összfehérje 222
- tromboplasztin 280
plazmasejt 127
plazminogén aktivátor inhibitor 1 (PAI-1) 281
- - - 2 (PAI-2) 281
- plazmin átalakulás 281
plexus chorioideus 337
Pluckthun 135
pluripotens őssejt 204
PMA 274
PMA/ionomycin stimulálás 275, 276
POCT/gyorsteszt 314
- cooximetria 316
- diagnosztika, adatkezelés 319
- -, hibaforrások 318
- -, kialakítás szakmai kérdései 316
- -, minőségbiztosítás 318, 319
- -, minőségirányítási rendszer 318
- -, rizikó-management, biztonság növelése 318
POCT/gyorsteszt diagnosztika, szakmai felelősség 317
- -, személyzet oktatása 319
- -, szervezés 317
- gyulladásos marker vizsgálatokban 315
- hormonmeghatározás 316
- intenzív terápiás ellátásban 314
- ionok meghatározása 315
- kardiológiai ellátásban 315
- laktátvizsgálat 316
- PTH-meghatározás 316
- sürgősségi ellátásban 314
- - klinikai kémiai vizsgálatokban 315
- - toxikológiai vizsgálat 316
- - véralvadás-vizsgálat 316
- szívmarker vizsgálat 332
- vércukorvizsgálat 315
- vérgázanalízis 315
- vesefunkció-vizsgálat 315
- vizelet-hCG 316
Point of Care Testing (POCT) 314
poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE) 71
- - lemez szárítása zselatinnal Popescu szerint 98
polietilén-glikol (PEG) 134
poliklonális antitest ellenanyag 133
- gammopathia 223
polipeptid 102
-, intracelluláris, kimutatása szövettenyészeti sejtből 239
poliriboszóma 29
poliszacharid eltávolítása mintából 41
polivinilpolipirolidon (PVPP) 41
polymyositis/dermatomyositis 253
Popescu-módszer 98
porlasztásos ionizáció 178
Porter, Rodney Robert 104
post source decay (PSD) 182
posztszintetikus módosítás 29
poszttranszlációs módosítás 27, 123
- - vizsgálata 66
praethromboticus állapot jelei 287
prealbumin-transzferrin elváltozások 223
precipitáció 44, 108
precipitációs módszerek 140
- - automatizálása 161
precipitáló reagens 45
precipitátum mosáshoz 45
precíziós profil görbe 197
preimmun szérum 133
prekallikrein 280
primer sejt tenyésztése 203
- sejtkultúra 51

386 Tárgymutató
prionbetegség 339
proakcelerin 280
progresszív aktivitása 290
prokalcitonin (PCT) 239
prokonvertin 280
prolaktin 343
prolaktintermelő hypophysis adenoma 344
prolingazdag nyálfehérjék 302
proonkogén 321
propagáció 280
prostatarák tumormarker 365
- - kutatás 366
prostataspecifikus antigén (PSA) 365
prosztetikus csoport 33
proteaszóma 30
proteáz 30
proteázgátlás, minta-előkészítés 40
proteázgátló 40
protein 27, 101
14-3-3 protein 339
protein C (PC) 290
- - defektus 290
- - -, öröklött 290
- S (PS) 291
- - defektus 291
- - -, öröklött 291
proteinuria 311
- előfordulása 312
-, nephroticus mértékű 311
-, orthostaticus 313
proteolízis 40
proteom 37, 65
proteomika 37, 65, 361
proteomikai fehérjevizsgálat 65
protokollok mintaelőkészítésre 45
protosz 27
protrombin 280
protrombin 20210A polimorfizmus 292
protrombinidő (PI) 282
PSA 365
PSD 182
PTH 343, 349
- meghatározás, POCT 316
- tumormarker 323
pufferolt sóoldat (PBS) 45
pulmonalis embolia (PE) 287
PVPP 41
Q
quality control (QC) 249
Quincke 337
R
rácsrost 119
radiális megosztású immunofluorometrikus assay 154
radioimmunoassay (RIA) 143, 145, 164
-, kompetitív 147
-, szendvics 147
radioizotópos jelölés, antigén 137
- -, ellenanyag 137
raktárfehérje 120
receptor 115
redukálószer, minta-előkészítés 42
referenciaanyag készítése 192
referenciaérték 193, 194
referenciarendszer 188
referenciatartomány 194
refolding 29
rekombináns technika 345
relatív index 330
- standard deviáció 333
releasing hormon 341
repülési idő analizátor 181
részecskék eltávolítása mintából 48
retinolkötő fehérje, vizelet 307
- protein-4 356
rezisztin 356
rheumatoid arthritis 253
- faktor (RF) 173, 260
RIA 143, 145, 164
riboszóma 29, 102
- peptid kötőhelye 29
ribozim 113
rotációs motor 111
Roux, Wilhelm 203
Rowe, David 104
RPMI-1640 tápoldat összetétele 207
rRNS 102
Russell viperaméreg idő 293
ruténium komplex 167

Tárgymutató
387
S, SZ
S100 protein tumormarker 325
- -, liquor 340
Saccharomyces cerevisiae elleni antitest (ASCA) 263
Sahachiro, Hata 104
Sammons-ezüstözés 86
Sanger, Frederick 116
saponin 275
sárgaság hatása mérésekre 172
savanyú urea gél elektroforézis 73
savanyú urea gél + SDS gélelektroforézis 74
scan 182
Schibasaburo, Kitasato 104
Schirmer-teszt 298
Schleiden, Matthias Jakob 203
Schwaber, Jerrold 134
Schwann, Theodor 203
SDS 41
- elektroforézis homogén vagy exponenciális gradiens
poliakrilamid gélben; 2. dimenzió 81
- eltávolítása mintából 47
- PAGE 62
- tartalmú mintapuffer 45
sejt 35
- anabolizmus 35
- feltárás 40
- katabolizmus 36
- malignus transzformációja 321
- tenyésztés in vitro 51
sejtciklus követése sejttenyészetben 214
sejtes minta előkészítése 40
- modell 52
sejtfúzió 134
sejtkultúra/sejttenyészet 51
-, daganatsejt-kultúra 51
- detektálása 215
- - in vitro 215
-, immortalizált 51
-, kitapadó 51, 205
-, primer 51
-, szuszpenziós 205
sejtminta extrakció-szolubilizáció 45
- vizsgálata 51
sejtnövekedési faktor 116
sejtszám meghatározás mikrogyönggyel flow citometriában
248
- monitorozás sejttenyészetben 213
sejtszámláló automata 213
sejtszuszpenzió 51, 52
sejttenyészet/sejtkultúra fagyasztása 212
-, fagyasztott, felolvasztása 212
- fehérjemeghatározása 214
- kezelése 209
- kontaminációja 211
- -, kezelés 211
- sejtjeinek osztódása 213
- sejtpopulációja 213
- sejttípusainak keveredése 211, 212
- súlymérése sejtszám-monitorozáshoz 213
sejttenyésztés 203
-, embrionális sejt 203
- médiumai 207
-, őssejt 204
-, primer sejt 203
-, transzformált sejt 204
sejtvonal 51, 206
short pass filter 247
shuffling 69
SI mértékegységrendszer 187
- - alapegységei 187
- - származtatott egységei 187
side scatter (SSC) 240, 241, 266
SIMS 177
single ion recording 182
Sjögren Syndrome Tear Deficient Dry Eye (SSTD) 296
Sjögren-szindróma (SS) 253, 296
- száraz szemmel 296
Skerra 135
SLE 253
SLFIA 153
só szennyezés 40
spectral overlap 247
Spemann, Hans 117
SSC 241, 266
SSC-CD45 kapuzás 242, 243
SSTD 296
stacking gél 73
standardizálás állatkísérlet során 217
- problémái 198
Stanley, Jackie 105
Starling, Ernest Henry 115
sterilizálás sejttenyészetben 210
stop kodon 29
Straub F. Brúnó 110
Streptomyces conglobatus 274
struktúraalkotó fehérje 34
Stuart-Prower-faktor 280

388 Tárgymutató
Substrat-Labeled Fluorescent Immunoassay (SLFIA) 153
sürgősségi ellátás, POCT 314
- klinikai kémiai vizsgálat POCT 315
- toxikológiai vizsgálat POCT 316
- véralvadás-vizsgálat POCT 316
Svedberg, Theodor 122
Systėme International d’Unités (SI) 187
szállítófehérje 121
száraz szem szindróma 296
- - -diabetesben 296
szekréciós vezikula 34
szekretoros IgA, könny 295
- -, nyál 302
szekunder ion tömegspektrometria (SIMS) 177
szekvenciaanalízis 69
szekvenciaazonosság 69
szekvenciaillesztés 69
Szent-Györgyi Albert 109
szeparáló gél 73
szérum (tápoldatban) 208
szérum fehérje elektroforetogram 223
- - -, kóros 224
- - -, normális 223
- - elektroforézis 222
- - eltávolítása mintából 48
- - elváltozás, izolált 223
- - extra frakciói 223
- - frakció 131
- - -, a 1
224
- - -, a 2
225
- - -, b 225
- - -, g 226
- - vizsgálata 221
- hőinaktiválása 208
széruméheztetés 208
szérumkiegészítő 208
szérumprotein könnyben 295
szervspecifikus autoimmun betegség 252
szialomucin 294
sziálsavas Lewis (a) antigén 324
színjelölés, kombinált 245
színjelöléses kapuzás 242
szinkronizáció, sejttenyészet 213
szisztémás kötőszöveti betegség 252
- lupus erythematosus (SLE) 253
szívizomsejt, neonatális, izolálása 204
szolubilizáló rendszer 41
szomatosztatin 343
- analóg 346
szöveti plazminogén aktivátor (tPA) 281
- transzglutamináz (tTG) 263
szövetminta extrakció-szolubilizáció 45
szövettenyésztő lemez 52
sztatherin, nyál 302
szteroidhormon 349
szubcelluláris frakcionálás 48
szubsztrát 33
szulfobetain 42
szuszpenzióban növő sejtkultúra 51
szűrés sejttenyészetben 210
- tumormarker meghatározással 325
T, TY
TAFI 281
tag 58
Takamatsu 270
találkozási pont 241
tandem tömegspektrometria 182
tápoldat antibiotikumvédelme 208
- pH 208
- - indikátora 208
- sejttenyésztéshez 207
- szűrése 210
-, minimál 207
-, szérum 208
TAT 287, 314
tau-protein, liquor 339
TCA 40
TCA-s kicsapás 40
TDDE 296
tear-deficient dry eye (TDDE) 296
tenyésztőedény 206
tenyésztőflaska 206
térbeli konformáció 28
térdeszorpció 178
térionizáció 178
testnedvek fehérje-összetétele 294
tetrametil-rodamin-izotiocianát (TRITC) 53
tGT 262
Thomson, J. 177
thromboemboliás kórképek 287
thrombophilia 288, 289
- okai 288
TI 285
-, megnyúlt 285
timidin-kináz tumormarker 325

Tárgymutató
389
tiourea 41
- urea lízispuffer 45
tireoglobulin 325
tireotrop hormon (TSH) 343
- releasing hormon (TRH) 343
Tiselius, Arne 59
TnC 328
TNF-a 356
- kimutatása immunokemilumineszcenciás módszerrel
238
TnI 328
TnT 328
Tomasi, Thomas 104
Tonegawa, Susumu 105
totipotens őssejt 204
többszörös reakciómegfigyelés 183
töltéssel rendelkező vegyület eltávolítása mintából 47
tömegspektrometria 175
- alkalmazása 184
- - gyógyszerkutatásban 184
- - orvosi laboratóriumokban 185
- - proteomikában 184, 361
- - -, neuropeptidek 362
- - -, onkológia 362
- - -, újszülöttkori szűrés 362
tömegspektrométer 175
- analizátora 179
- detektora 181
-, hibrid 181
- ionforrásai 176
-, mintabevitel 176
-, tandem 182
- vákuumrendszere 175
tömegspektrum 183
tPA 281
TPA 167, 324
TRAK 263
transzaminálás 30
transzdukció sejttenyészetben 216
transzfekció sejttenyészetben 216
transzferabilitás 190
transzferáz 33, 114
transzferrin 225
-, könny 295
-, vizelet 307
transzformált sejt tenyésztése 204
transzkripció 28, 102
transzláció 29, 102
transzportfehérje/transzporter/transzportprotein 35, 121
transzporter/transzportfehérje/transzportprotein 35, 121
TRAP 351
TRH 341, 343
tributilfoszfin (TBP) 42
trijódtironin 349
tripropilamin (TPA) 167
tripszines passzálás 209
TRITC 53
Triton X-100 42
tRNS 29, 102
trombin által aktiválható fibrinolízisinhibitor (TAFI) 281
trombin-antitrombin komplex (TAT) 287
trombinidő (TI) 285
troponin 328, 329
- C (TnC) 328
- határértékek 333
- I (TnI) 328
- kimutatás 332
- T (TnT) 328
- teszt értékelés 329
TSH 343
TSH-receptor elleni antitest (TRAK) 263
TSPA 295
tumorantigén 322
tumorasszociált glikoprotein (TAG 72) 324
tumormarker 321
- alkalmazása monitorozásra 326
- - szűrésre 325
- fehérje 364
-, neuroendokrin 344
- poszttranszlációs módosulása 321
- prediktív értéke 326
-, primer 321
-, szekunder 321
turbidimetria 140, 141
-, alkalmazott antitest 163
-, - közeg 163
-, jel mérése 163
turn-around-time (TAT) 314
twilight zone 69
U
ubikvitin rendszer 30, 31
UCTD 253
ultracentrifugálás 58
ultraszűrés 236
unfolded protein response (UPR) 357

390 Tárgymutató
unipotens őssejt 204
uPA 281
urea 41
ureatartalmú lízispuffer 45
urokináz (uPA) 281
US National Reference Preparation (USNRP) 191
USNRP 191
UV-abszorbancia 237
V
vákuumionforrás 177
valencia 131
variációs koefficiens (CV) 333
vasculitis, szisztémás 253
vázfehérje, intracelluláris 109
vazopresszin 343
velőcső-záródási rednellenesség 224
vénás thromboembolia (VTE) 287
véralvadás 278
- fázisai 279
- inhibitorai 281
- kaszkád modellje 278
- sejtes modellje 279, 280
véralvadási szűrőteszt 282
- - értékelés 283
- teszt 282
vércukor vizsgálat POCT 315
vérgázanalízis POCT 315
vér-liquor gát 337
vérplazma fehérje vizsgálata 221
vérszérum fehérje vizsgálata 221
vesefunkció vizsgálat POCT 315
vesekárosodás 309
vesetranszplantáció utáni állapot 309
vezikula 34
viszfatin 356
vitálfestés 213
vizelet egyedi fehérje meghatározás 306, 307
- fehérje immunfixációs elektroforézise 232
- - összetétel 305
- - térkép változása 309, 310
- - vizsgálat elvei 307
- - -, biokémia 308
- - -, dúsítás Mashall szerint 307
vizelet fehérje vizsgálat, dúsítás Mashall szerint 307
- összfehérje 305, 307
- - megoszlása 306
- - -, Laemmli-féle SDS PAG elektroforézis 306
- - -, PAGE 306
- - mérés 305, 306
- teljes proteinkoncentráció 305
- vizsgálat 305
- -, proteinürítés 305
- hCG POCT 316
vizsgálat kontrollja 197
vizsgálati módszer követelményei 197
voltage pulse signal 245
VTE 287
W
Wang-módszer, CBB-festés 89
Western blot 54, 75
Westgard-szabályok 200
Willoughby-Lambert-ezüstözés 85
Wright, Almroth 104
X
xerostomia 296
Y
Yalow 143
Yalow, Rosalyn Sussman 137
Z, ZS
Zeiss-mirigy 294
zóna elektroforézis kapillárisban 62
- -, natív 60
- gélelektroforézis 60
zona occludens 337
zselatin agglutináció 142
zsírsejt fehérje 355