III. évfolyam OKLA szakirány - Sejttenyésztés ea. oktatási segédanyag

Sejttenyésztés
Alapvetés és néhány elméleti kérdés
öt – itt egyetlen prezentációban összefoglalt – előadásban
Dr. Schlammadinger József
ny. egyet. docens
DE OEC ÁOK Humángenetikai Tanszék
2007
(október 2-i változat)

Mentegetőzés
Az alábbiakban olvasható szöveges magyarázatok sokkal hosszabbak
a kelleténél. Ennek praktikus oka az interneten való elérhetőség.
Azok a hallgatók is, akik nem tudnak résztvenni az előa-
dásokon (évekre visszanyúló tapasztalatok szerint vélhetően ez a
többség), legyenek képesek egy lehetőleg egységes és egész, azaz
valamelyest is használható képet kialakítani arról, amit ezek az
előadások – a megelőző években – felvállaltak.
A reprodukált ábrák általában katalógusokból vétettek, feloldásuk,
élességük emiatt kívánnivalókat hagy maga után.
A szakszavak k(idegen – vagy mára már csak kidegen eredetű, de elmagyarosodott
– kifejezések) igen következetlen írásmódjáért,
nemkülönben a gépelési hibákért az alulírottat terheli felelősség.
Debrecenben, a 2007. év
szeptember hó 3-án

Elöljáróban:
Itt és most mit értünk a sejttenyésztés fogalmán
1) Bár széltében-hosszában elterjedt különféle prokarióta és
egysejtű eukarióta szervezetek, valamint növényi sejtek in
vitro tenyésztése té (akárha több köbméteres fermentorokban
is), nemkülönben alacsonyabbrendű, soksejtű állatfajokból
is készítenek sejttenyészeteket (ipari méretekben is),
valamint
2) )jól definiált in vitro körülmények között emlős szervrészleteket,
szöveteket is fenntartanak,
ebben a prezentációban emlős sejtek – mint individuumokból
álló populációk – kontrollált in vitro körülmények közötti
fenntartását, szaporítását, különböző kutatási és ipari jel-
legű ű célra alkalmas l minőségben ő és mennyiségben való előállításának
fontosabb, általánosítható alapjait tekintjük át.

Szemléletünk: egy kis történeti visszapillantás (olvasmány)
után a legegyszerűbb, legolcsóbb módszerek bemutatása. A
bonyolultabb és a (sokszorosan) drágább eljárások is ezeken
alapulnak.
Kiindulópont és eredeti cél: szervek és szövetek szervezeten
kívüli életben tartása.
1878. Claude Bernard. Szövetek in vitro fenntartása elméleti
alapjainak megfogalmazása.
1880-as évek eleje. Sydney Ringer különböző physiologiás
sóoldatokat fejlesztett ki (NaCl + KCl + CaCl 2 + MgCl 2 ),
amelyekben túlélő szíveket tartott fenn (egy-két napig).
1885. Wilhelm Roux. Csirke medullaris lemez physiologiás
oldatban. Az ő nevét viseli a Roux-flaska (tenyésztőedény).
1903. Salamandra leukocyták életben tartása függőcseppben.
(>1 hónap, szaporodtak is.)

Használt (táp)közegek: különféle sóoldatok, ascites folyadék,
embrió-kivonat, vérplazma (alvadt kakasplazma) stb.
1907-1910. Ross Granville Harrison. A szövettenyésztés technikai
alapjainak megteremtése.
1911- Alexis Carrel* (és munkatársai). Sebészeti technikák
bevezetése (asepsis, antisepsis), megfelelő tápközegek keresése,
alkalmas edényzet kifejlesztése. (Pl. Carrel-flaska.)
„Bármilyen szövet, akármennyi ideig fenntartható in vitro,
megfelelő subcultivatiós technikával. ” (Csirkeembrió szívéből
készült explantatumból indított tenyészetet 32 évig sikerült
folyamatosan in vitro fenntartani, mikoris lezárták a
kísérletet. Ezt az eredményt sokan vitatják.**)
1940- Szintetikus tápközegek (medium) kifejlesztésének
korszaka. k
1952. Moscona. Szövetek trypsin emésztése ► tényleges
sejttenyésztés.
* L. következő oldal. ** L. a sejttenyészetek fenntarthatóságának teóriáját.

(Alexis Carrel. Francia sebész, aki élete nagyobb részét az Amerikai Egyesült
Államokban töltötte. tötte. 1887-ben született a Lyon melletti ett Sainte
Foyban, Párisban halt meg 1944-ben. Orvosi/fiziológiai Nobel-díj 1912-
ben: érvarratok technikájának kifejlesztéséért, ami a sikeres szervátültetések
előfeltétele volt. Az ismeretlen ember c. könyve természettudományos
és filozófikus alkotás, a maga idejében világsiker volt, sok
nyelvre lefordították, magyarul is megjelent a II. világháború előtt.
Ebben az emberiség nagy problémái megoldásának keresője, egy intellektuális
morál (vagy morális intellektus) nyilvánul meg. Másik oldala:
a II. világháború alatt Franciaországban a vichyi kormánynak dol-
gozott és a negatív eugenikát propagálta.)
Egy kis nevezéktan
A sejttenyésztés modern kifejezés. Régen szövettenyésztésről
beszéltek, ennek megvalósítása volt a cél él(l. előbb). A technika
változásával, fejlődésével ennek helyét fokozatosan és
folyamatosan vette át a sejttenyésztés, ám ma újra nő az
igény szövetek in vitro fenntartására is.

A sejttenyésztés egyik korai alapművelete: a szö-
veti sejtek dezintegrálása
(1) Mechanikus feldarabolás.
(2) Trypsin (vagy egyéb protease,
pl. collagenase) kezelés
(37°C-on).
(3) A sejtek mosása (centrifugá-
lással). l)
(4) Számolás haemocytome-
terben.
(5) Tenyésztő edénybe helyezés,
feltöltés tápfolyadékkal,
37°C CO 2 termosztátban a
sejtek szaporítása, azaz in
vitro primer kultúra létrehozása.

Ugyanerre az emésztéses szétválasztásra vérből, ill. csontvelő-
ből, nyirokcsomókból, thymusból származó sejtek esetén nincs
szükség. Ebből máris következtethetünk bizonyos alapvető különbségekre
a sejtféleségek között.
Primer kultúrát indíthatunk kis szövetdarabból, mint explantatumból
is:
A kivágott szövetdarabkát
(biopsiás
anyagot) a tenyésztőedény
aljára he-
lyezzük, tápfolyadékkal
ellátjuk. A
letapadt szövetrész-
ből sejtek nőnek
ki az üvegfelületre.

Ezek a sejtek – az esetek túlnyomó többségében – fibroblastok
(amelyek igen nagy in vitro proliferációs kapacitással rendelkeznek,
szemben egyéb, magasabban differenciált szöveti sej-
tekkel). Egy érdemben igen kevés kötőszöveti állományt tartalmazó
szövetből is rendkívül nehéz, különleges technikát igénylő
feladat a jellemző szöveti sejtek tiszta tenyészetének előállí-
tása (pl. keratinocyták bőrből).
A tömör (solid) szövetekből származó sejtek általában adherencia-dependensek,
azaz a tenyésztőedény aljára (esetleg más
hordozóhoz) letapadva képesek növekedni (kivétel néhány
rosszindulatú daganatból származó sejt), míg a vérképző- éké ő és
immunrendszeri eredetű sejtféleségek szuszpenzióban.
Egy kis nevezéktan
Sejttenyészetek esetén a növekedés kifejezés a tenyészet egészére,
nem pedig az egyes sejtekre vonatkozik, azaz érdemben a
sejtproliferációt, a sejtek szaporodását jelenti.

A sejttenyésztés fizikai
környezete:
a sejttenyésztő laboratórium
Alapfelszerelés
Germicid lámpa
Lamináris box pl. ►
Gázégő
Központi vákuum vagy helyi
vákuumpumpa, felfogó
edénnyel
Inverz (fordított) mikroszkóp
Vízfürdő 37°C
CO 2 termosztát
Centrifuga
Hűtőszekrény
Vertikális légáramlású, belső
keringtetésű steril munkahely,
szűrt levegő kibocsátással

Bár a sejttenyésztés különböző munkafázisai egy jól tisztán
tartott és kevés jövés-menéssel megzavart laboratóriumban
is elvégezhetők, célszerű, hogy a sejttenyésztő laboratórium
teljesen izolált helyiség legyen, amihez olyan kiszol-
gáló tér kapcsolódik, ami önmagában is megfelelően tiszta,
más laboratóriumi célokra nem használatos.
A sejttenyésztő laboratóriummal szemben támasztott első és
legfőbb követelmény a steril munkafeltételek biztosítása.
Az in vitro sejttenyészeteknek t k nincs immunvédelme, rendkívül
érzékenyek a különféle (prion-, vírus-, mycoplasma-,
baktérium-, gomba-) fertőzésekre. Ezek gyakorlatilag a
környezet minden eleméből származhatnak, ide értve az
ott dolgozókat is. Ugyanakkor ez utóbbiakat is meg kell
védeni a tenyészetekből esetleg rájuk átterjedhető infectioktól!
A sterilitás első számú feltétele a lamináris box.

Nem szabad azt hinni, hogy a lamináris box sterilizál is!
Vertikális áramlású lamináris box
munkaasztala
Az előtérben látható, a levegő elszívá-
sára szolgáló rácsra szigorúan tilos
bármit is rátenni!

A lamináris boxban steril (pontosabban: részecske-mentes)
levegő áramlik vízszintesen vagy függőlegesen. Mind a
horizontális, mind a vertikális elrendezésnek megvannak a
maga előnyei és hátrányai, amelyekhez az ott dolgozónak
alkalmazkodnia kell. (A csíramentes levegő védi az éppen
nyitott edényekben a tenyészeteket vagy a tápfolyadékot.)
A munkaasztalt használat után (alkalmasint esetleg előtte is)
át kell törölni, pl. 70%-os etil- vagy izopropilalkohollal. (Ez
nem igazán sterilizál, ahhoz fertőtlenítő oldat szükséges
[ill. használaton kívül folyamatos UV-besugárzás germicid
lámpával], de általában kellő tisztaságot biztosít.)
Egyszer használatos műanyag eszközök alkalmazása mellett
is általában szükség van gázégőre, egy-egy flaska vagy cső
szájának, ill. pipetta végének a lángon való gyors áthúzására.
Üveg eszközöknél ezt akkor is elengedhetetlennek kell
tartanunk, t ha a steril tartójukból tój éppen akkor vettük ki
azokat, vagy egy flaska kupakját most csavartuk le.

A tenyészetbe helyezendő fedőlemezeket lehet pl. úgy is sterilizálni,
hogy alkoholba mártjuk (NB! l. még lent!), majd ezt gázlángon le-
égetjük róla. Ez néhány más eszköz esetén is célravezető lehet.
A gázégőnek őrlánggal ellátott szerkezetűnek kell lennie: nem engedhető
meg a folyamatosan nagy lángon égés munkavédelmi
szempontból (sérülés veszélye, a kis kubatúrájú és nem vagy csak
nagyon rosszul szellőző laboratóriumban az oxigén elhasználódá-
sa és az égéstermékek felhalmozódása), ill. magának a lamináris
boxnak a nem kívánatos hőterhelése okán sem. Az őrlángról csak
akkor és csak annyi időre kapcsoljunk k át a Bunsen-égő ő főlángjára,
amikor és amennyi időre azt az ott végzett munka éppen megkívánja.
Tekintettel arra, hogy a sejttenyésztő laboratórium – a fentiek értelmében
is – veszélyes üzem, a kiszolgáló laboratórium felé üveg-
ablakkal l ellátott tt kell legyen: a kültérben tevékenykedő k munkatárs
észrevehesse, ha bent valami baj történik az ott dolgozóval.
A sejttenyésztő laboratóriumban semmiféle gyulladásveszélyes
anyag, párolgó (és/vagy robbanásveszélyes) folyadék nem tartható!

A germicid lámpa,
mint a neve is mutatja, csíraölő hatású. Zárttéri
levegő sterilizálására, csírátlanított eszközök és anyagok steril
állapotban tartására, a baktériumok és penészgombák szaporo-
dásának megakadályozására alkalmas. Így használják – egyebek
között – steril fülkék levegőjének csírátlanítására, lamináris
boxokban, valamint sterilizált eszközök és anyagok védelmére.
Az alacsony nyomású germicid lámpa tulajdonképpen egy fénycső,
amelyben nincs fénypor. Kvarcüvegből készül, azaz az UV
sugárzást (253,7 nm-es Hg-vonal) átengedi. Ennek DNS-roncsoló
hatása van, így pusztítja el a baktériumokat, gombaspórákat.
Az UV-sugárzástól a bőrt, szemet védeni kell, ezért ez a lámpa
csak akkor kapcsolható be, ha senki sem tartózkodik a laboratóriumban!
Ne feledjük: az UV sugárzás ugyanúgy visszaverődik
tükröző felületekről, mint a látható fény! Tudnunk kell azt
is, hogy bizonyos festékek, műanyagok stb. az UV-fény fotokémiai
hatása következtében degradálódnak.

A sterilizáláshoz szükséges további eszközök, amelyek a
csatlakozó laboratóriumban b helyezhetők h el:
Hőlégsterilizáló. Amint a neve is mutatja, forró (160-180°C)
levegővel sterilizál. Biztonsággal elöli a vírusokat is, két
órás kezelési időtartam alatt. Csak üvegekhez (meg szili-
kongumihoz) és – bizonyos – fémeszközökhöz alkalmas.
Autokláv. Forró gőzzel csíramentesít. A nedves eljárás esetén
132°C is elegendő a tökéletes sterilizáláshoz, de bizonyos
esetekben (pl. műanyagok) ebből kényszerű engedményt
kell tenni (pl. 115°C-on 30 percig végezni a műveletet).
Rendkívül fontos, hogy az autoklávban a sterilizálási i folyamat
alatt a munkakamra valóban csak gőzt tartalmaz-
zon, levegőt ne, és hogy a becsomagolt edények, eszközök
belsejében se maradjon levegő.
Folyadékok (vizes oldatok) sterilizálása esetén elengedhetet-
Folyadékok (vizes oldatok) sterilizálása esetén elengedhetet
len, hogy a munkakamra csak nagyon lassan hüljön le!

Autokláv
(A munkakamrába
itt éppen
folyadékot he-
lyeznek kbe, a
megfelelő flaskákban.)
Figyeljük meg
az ajtó biztonságos
bezárá-
sára szolgáló
csavarokat!
Ezeket apródonként
kell
meghúzni!
Folyadék autoklávozása esetén az edények zárókupakja lazán, de teljesen becsavarható.
Üres edényeknél a kupak inkább külön sterilizálandó (anyagi minősége függvé-
nyében). Ilyenkor a szájadékot záró alufólia legyen lazán felhelyezve l és az edénybe
cseppentsünk néhány csepp kétszer desztillált vizet. (Kivételnél az első lépés
az alufólia tökéletes zárásúra való megszorítása.)

Magában a
sejttenyésztő
laboratórium-
ban szükséges:

Fordított (inverz) mikroszkóp és centrifuga
A kondenzor és a tárgyasztal
között elég nagy a
távolság ahhoz, hogy egy
tenyésztő flaska is kényelmesen
elférjen
A sejttenyésztő laboratóriumban
szükséges centrifuga kis teljesítményű,
általában 100 fordulat/
perc elegendő, de 200 g-nél nagyobb
érték azért sem kell, mert
az már károsítaná a sejteket

A fordított mikroszkópnak feltétlenül
fáziskontraszt (vagy DIC =
differenciál interferencia kontraszt,
de az nagyon drága) berendezésnek
kell lennie, mert csak így
ítélhető meg jól a – festetlen! – élő
sejtek állapota. A sejtek haemocy-
tometerben való számolásához a
kondenzor leengedhető, tenyésztőedényben
való vizsgálatukhoz a
kondenzor felemelhető.
Az objektívek (maximálisan 40×
nagyítással) nagyobb tárgytávolságot
engednek meg, azaz a vastagabb
aljú tenyésztőedényekben
(és számoló kamrákban) is élesre
állítható a kép, jól láthatók a sejtek.
A fáziskontraszt beállítása ugyanúgy
történik, mint a hagyományos
mikroszkópon.

CO 2 termosztát
Követelmények:
Hőmérséklet tartása 37°C-on.
Páratartalom lehetőleg 100%-
on (praktikus követelmény kb.
98% relatív nedvesség). Ehhez
buborékoltató párologtató
edény van beépítve (itt a belső
ő
üvegajtón), de célszerű alulra
plusz egy-két vizes tálcát is
betenni. Vízbe: CuSO 4 .
CO 2 (~5%) a belső atmoszférában
szabályozható. (Drá-
gább készülékben az [O 2 ] is.)
A CO 2 palack a steril terüle-
ten kívül legyen elhelyezve!
Külső (fém) ajtó fűthető.
Polcok: vízszintbe állítva.
A beltér rendszeresen tisztítandó
és sterilizálandó!

Az elhasznált tápfolyadék leszívása zárt, utólag tökéletesen dezinficiálható
rendszerben kell történjen, akár vákuumpumpa működteti azt (mint itt: c,
d = lábkapcsoló), akár központi vákuumra van kötve. A rendszeres tisztítás
alapvető jelentőségű (pl. a leszívó cső minden munkafolyamat
utáni átöblítése dezinficiens oldattal).
szívópalackba
A gyűjtő (a)
előzetesen valamilyen
alkalmas
dezinficiens
teendő.
(Az elszívó
rendszerbe a
második (b)
szívópalack
nem engedi át
az esetleg felcsapó
folyadékot.)
Az elhelyezés
ne legyen
baleset-
veszélyes!

Feltétlenül szükséges még a sejttenyésztő laboratóriumban egy
37°C hőmérsékletű vízfürdő. Ebben kell előmelegíteni a felhasználandó
tápfolyadékokat, a sejttekkel érintkezésbe kerülő fiziológiás
oldatokat stb. Ez a berendezés különösen gondos
tisztítást, dezinficiálást igényel!
Jó, ha a leírtak mellett a sejttenyésztő laboratóriumban érhető még
el: háztartási hűtőszekrény, amiben a közvetlen felhasználásra váró
tápfolyadékok, pufferek, EDTA oldat stb. tárolhatók, a mélyhűtőjében
enzim-oldatok és hasonlók.
A csatlakozó (előkészítő) ítő)laboratóriumban b kll kell még -20°C fagyasztó
láda (vagy szekrény). Célszerű ugyanitt a folyékony N 2 -es
tároló edény (a hozzá tartozó szállító tartállyal) vagy pedig egy
ultramélyhűtő fagyasztóláda -135°C tárolási hőmérséklettel és az
ehhez szükséges folyékony CO 2 , ill. folyékony N 2 -es – áramkima-
radás esetén – biztonsági i tartalékot t t jelentő, a mélyhűtőbe fagyasztó
folyadékot adagoló készülékhez kapcsolódó tároló edény.
Ne feledkezzünk el olyan „apróságok”ról, mint pl. marker tollak!

Folyékony nitrogénnel üzemelő tárolóedény és a benne megfelelő
felfüggesztésben elhelyezhető ampullatartó.
A rendszer rendkívül biztonságos, feltéve, hogy a folyékony nitrogént
(ami – sajnos – elég gyorsan párolog és drága), mindig
pótolják. Ugyanakkor ne feledjük: a tartály tál nagyon sérülékeny!
(Ugyanez vonatkozik az utánpótlást szállító kannára is.)
Az edény száját hőszigetelő dugó zárja.
Fontos! A folyékony
nitrogénes
tárolóban precíz,
naprakész leltár
szerint kell elhelyezni
a benne
őrzött tenyészeteket,
amelyek jól
láthatóan jelöltek
legyenek!
-196°C! Munkavédelmi
rendszabályok
betartása!

(Fogyó)eszközök és anyagok
a sejttenyésztésben Ezeknek se szeri,
se száma, felsorolhatatlanok.
A fontosabbak
között vannak
egyszer és több-
ször használatos
eszközök.
Az utóbbiak általában üvegből vannak (de pl. a folyadéktároló flaskák kupakja
műanyagból). Az üveg előnye – az átlátszósága mellett – a jó tisztíthatóság, kényelmes
sterilizálhatóság. A képen bemutatott (Roux-típusú) tenyésztőedényen
láthtóh látható, hogy nagy lt letapadási dáiflülttbit felületet biztosít a benne tenyésztett tttsejteknek, jtk kre-
latíve kis térfogat mellett. Régen (a XX. század első felében, amikor CO 2 termosztátok
még nem léteztek) gumidugóval zárták a tenyésztő flaskákat. Ha jól
állították be a pH-t, egy ilyen edényben hosszú ideig fenn lehetett tartani egy
tenyészetet. Amennyiben közben valamilyen műveletet kellett elvégezni, amilyen
pl. a mintavétel vagy valamely anyag hozzáadása a sejtekhez, a gumidugóba g il-
lesztett, úgyszintén zárható csövön át ez megtehető volt. Később, a CO 2 termosztátok
elterjedésével megjelentek a (papír)vatta dugók.

A valaha érdemben
csakis
üvegbőlké-
szült tenyésztő
edények helyét
mára gyakorlatilag
átvették
az egyszer
használatos
műanyagok.
Ezek gyakorta
olcsóbbak,
mint ha üvegeket
mosoga-
tunk.
(a) Tenyésztő flaskák, (b) Petri csészék (angolban inkább culture dish), (c) 24 (há-
tul), ill. 96 lyukú lemez. A flaskák esetén nagyon fontos, hogy a légcsere megtörténhessen
a külső és belső tér között, a sterilitás veszélyeztetése nélkül. Ehhez a
kupak teljes rácsavarása után azt egy fél fordulattal meg kell lazítani. Ma már
vannak steril szellőzést zárt állapotban is biztosító ókupakok k k (l. a következő
k ő
oldalon). Az egyéb edényeknél a fedő eleve nem légmentesen zár.

▲ „Háromemeletes” tenyésztőedény,
szellőző kupakkal
Tenyésztés nagyobb
felületen
(letapadva növekedő
sejtek számára
megnövelt ltfelület,
gazdaságos tápfolya-
dék kihasználással)
Kerek, forgat-
ható („roller”)
tenyésztőedények
és az azo-
kat befogadó, a
CO 2 termosztátba
beszerelhtő
hető, forgató
állvány ►

Tenyésztés nagyobb térfogatban
szuszpenzióban növekvő sejtek
Itt kétféle keverő megoldást láthatunk: mág-
neses (fent), ill. forgólapátos (lent). Ezen a
módon több liternyi tenyészet is előállítható.
Megoldották a több tíz-, száz- vagy akár ezer
liternyi tenyészet előállítását különféle fermentorokban.
Ezek is lehetnek keverőlapá-
tosak (-propelleresek), de van pl. olyan, amiben
alulról steril (előnedvesített) levegő átbuborékoltatásával
egyidejűleg goldják meg a
keverést, a kívánatos O 2 -ellátás biztosítását,
és a megfelelő CO 2 koncentráció (ezáltal a
pH értékének) beállítását (részletesebben l. a
továbbiakban).
(Letapadva növő sejtek apró, a mediumban
könnyen lebegtethető üveg vagy műanyag
gyöngyökre olthatók és így tenyészthetők.)

Egyebek
Éd Érdemben fl felsorolhatatlan, lhttl menynyi
és milyen egyszer- vagy többször
használatos eszköz (pl. csi-
pesz, olló, gumirendőr [= rubber
policeman]), edény stb. szükséges
egy sejttenyésztő laboratóriumban.
Néhány példa: folyadéktáro-
ló (jól zárható) flaskák, centrifugacsövek
(természetesen kupak-
kal), mérőhengerek, fecskendők,
steril szűrők, pipetták, Pasteurkapillárisok,
pipettatartó dobozok,
mikropipetták, műanyag
pipettahegyek, és így tovább.
Természetesen mind sterilen!

Akkumulátoros pipettázó
A felső és alsó gombbal irányítható a felszívás, ill. kiengedés. A
toldatban, amibe a pipetta illeszkedik, steril szűrő van. Ez mege-
lőzi a pipetta tartalmának esetleges kontaminációját. Ettőlfüg-
getlenül azonban: célszerű vattadugós pipettákat használni.
Van az eszköznek digitális változata is, amelyen a mérendő térfo-
gat előre beállítható. Ehhez – értelemszerűen – nem szükségesek
beosztással ellátott pipetták.
Ez sem csodaszer. Nagyon kényelmetlenné tud válni olyan lamináris
box használatakor, ahol alacsony a benyúló nyílás.

Az egyszerhasználatos (általában műanyag, de van üveg is) eszközök
steril csomagolásban érkeznek a laborba. Ennek sértetlen-
ségét mindig ellenőrizni kell! Felbontáskor fontos, hogy ami aktuálisan
nem szükséges, annak sterilitása hosszú távon megmaradjon.
A felhasznált, bármilyen tenyészettel érintkezésbe került eszközök
fertőzötteknek tekintendők és ennek megfelelően kezelen-
dők, azaz a veszélyes hulladékokra k előírt megsemmisítési i eljárás-
á
ra (=égetés) kell zárt csomagolásban eljuttatni azokat.
Kartondobozok ne kerüljenek a
sejttenyésztő laboratóriumba!
Nem egyszerhasználatos, azaz is-
mételten alkalmazni kívánt, tenyészettel
érintkezésbe került eszközök
esetén dezinficiáló szerben
kell ezeket összegyűjteni, majd
speciális mosogatási eljárással tenni
újra felhasználhatóvá.

Nagyon fontos,
hogy mindig legyünk tisztában a felhasznált anya-
gok fizikai és kémiai paramétereivel.
Így
hőállóság (sterilizálhatóság), lángállóság stb. Ollók, szikék
élét az ismételt hőkezelések kilágyíthatják, ha ezeknek túl
hosszan és túl magas hőmérsékleten ékl vannak kitéve.
Az üveg pipetták (Pasteur-kapillárisok) sterilizálásához,
eltartásához alkalmazott zárható fém hengerek mindkét
végében üvegszövet (vagy hasonló), ill. szilikon gumi betét
szükséges a törések megelőzésére. Ennek a bélésnek ugyanúgy
kell hőállónak lennie, mint a doboznak és az üveg pipettáknak.
Kémiai jellemzőő pl. az üvegek esetén azok oldhatósága. Nátronüvegben
sem tenyészteni, sem folyadékokat mérni és
tárolni nem szabad, erre boroszilikát üveg választandó,
amiből semmilyen ion sem oldódik ki.

A tenyésztőedény aljára letapadva növekvő sejtek Ca 2+ -hídon
keresztül kapcsolódnak k az aljzathoz. Ennek kkilkítáil kialakítási lehetősége
üveg esetén automatikusan adott, a műanyag pet-
ri csészék közül csak az alkalmas, amelyik belső felületét
megfelelő (hidrofil, negatív töltést hordozó) bevonattal látták
el. (Azaz az ún. közönséges mikrobiológiai Petri csészékben
– lényegesen olcsóbb! – nagyon rossz eredmények
érhetők el még a legkevésbé igényes letapadás-függő sejtek
esetén is. Ugyanakkor ilyen csészékben ékb a szuszpenzióban
fenntartott tenyészetek jól proliferálnak és megbízható
eredményekkel szolgálnak.)
Mindebből következik, hogy az egyszerhasználatos tenyésztőedények
valóban csak egyszer alkalmazhatók a letapadva
növő sejtekhez, mert a mégoly gondos és kímélő mosogatás
is eltávolítja az említett bevonatot. Azaz: itt és így takarékoskodni
nem szabad.

Az aszepszis fogalmát A. Carrel munkássága kapcsán emlí-
tettük, a sterilitás megteremtésének és megtartásának néhány
eszközéről (és módszeréről) már volt szó. Itt további kiegészítéseket
teszünk.
A többször használatos eszközök sterilizálására (1) fizikai és (2)
kémiai módszerek állnak rendelkezésre.
(1) A száraz és nedves hőről (hőlégsterilizáló, ill. autokláv) részletesen
szóltunk. Ide tartozik még az UV és gamma (esetleg
röntgen) sugár, azaz a sugársterilezés. Az UV fény csak ott
hat, ahová közvetlenül el tud jutni, ami „árnyékban” marad,
ott nincs hatás. Nyitott edények (és külön a fedelük) állíthatók
pl. egy germicid- vagy egy kvarclámpa alá (egyébként steril
környezetben). Kis kapacitású és nehézkes eljárás. Jobb a gam-
ma-sterilezés, ami nagy áthatolóképességű (nincs előtte „árnyékos”
hely). Hozzáférhetősége erősen korlátozott, de ahol a közelben
ilyen ipari berendezés, vagy pl. éjszaka nem használt
kobaltágyu működik, ott elérhető.

Az egyszerhasználatos pipettákat p általában egyedileg g (is) csoma-
golják. Modern sejttenyésztő laboratóriumokban ezekkel nem
szokás szájjal pipettázni, hanem egy erre a célra szolgáló szívó-
nyomó, steril illevegővel ő l operáló kis kézi készülékkel. l (Bemutattuk
a megelőzőekben.) Ennek ellenére megfigyelhetjük: a pipet-
ták végében vattadugó van az esetleges kontaminációk vagy a
túlszívás megelőzésére.
Üveg pipetták alkalmazásakor efféle vattadugót magunknak kell
behelyeznünk a szájvégbe (ami ennek megfelelő kialakítású), és
ez után végezni el a hőlégsterilizálást. A gyapotvatta kibírja a két
órás 160°C-os hőkezelést. De ha valami okból újra akarnánk
forró levegőben kezelni az ilyen pipettákat, akkor ki kell cserélni
a vattadugaszokat, mert azok a második alkalommal már megpörkölődnének.
(Autoklávra ez a megszorítás nem vonatkozik.)
Értelemszerű: egyéb (papír)vatta dugóknál is érvényes ez a szabály
(pl. Erlenmeyer flaskában rázott tenyészetek).

Szervetlen oldatok esetén (pl. pufferek) kiválóan
megfelel az autoklávozás. Vannak ú-
jabb tenyésztőfolyadék formulák is, amelyek
kibírják a hőkezelést (alkalmasint esetleg
azon az áron, hogy egyes hőlabilis komponenseket
utólag, sterilen kell hozzájuk ada-
golni).
Legelterjedtebb megoldás folyadékok esetén
azok sterilre szűrése. Régen erre a célra szinterelt
üvegszűrőket használtak, mára általánossá
vált a membránszűrők alkalmazása.
Rendkívül fontos: a gyártók hajlamosak a 0,45 m
gy j ,
pórusnagysá-gú szűrőmembránokat úgy reklámozni, hogy azok
sterilre szűr-nek. Ez nem igaz! Csak a ≤ 0,2 m pórusnagyság
megbízható!
És – értelemszerűen – az sem szűri ki a mycoplasmát meg a
vírusokat

A membránszűrő berendezéseknek számos (vagy inkább számtalan)
típusa van.
Vásárolhatók szétszedhető-összerakható kivitelben. Ezek auto-
klávozással sterilizálhatók. Nyomószűrők érdemben csak ebben
a típusban léteznek. Az egyszerhasználatosak vákuum segítsé-
gével szívják át a folyadékot a steril térbe. Ha egy ilyenen olyan
tápfolyadékot akarunk szűrni, amiben már benne van a szérum,
ez ebben az esetben igencsak csökkent szűrőkapacitást mutat.
Mivel a szérumot amúgy is csíramentesen* árulják, célszerű az
alapoldatot szűrni és ehhez sterilen adagolni a savót.
Ha mégis mindenképpen szérummal komplettált médiumot kell
szűrjünk, a nyomószűrő a helyes megoldás. Nyomógáz: N 2 .
Vákuum alkalmazása esetén nem szabad elfeledkezni arról,
hogy a CO 2 távozása miatt a tápfolyadék pH-ja megemelkedhet.
* Figyeljünk arra is, hogy az állati savót szállító cég a prion-, vírus-
és mycoplasma-mentességet is garantálni tudja.

Membránszűrő alkalmatosságok oldatok (pufferek,
tápfolyadékok k stb.) sterilre szűréséhezű ééh
Balra: kis térfogatú szűréshez ű fecskendőre ő tehetőő
feltét. Középen: saját felfogó edénnyel rendelkező
vákuumszűrők. Afelső részbe töltött folyadék a toldathoz csatlakoztatott
szívás nyomán sterilen gyűlik össze a felfogó edénybe.
Nagyon fontos! Vízlégszivattyú (az esetleges vízvisszaáramlás mi-
att) semmiképpen sem használható! Jobbra: ugyanaz, de csavaros
tetejű tároló flaskában történik a steril oldat felfogása.

(2) Kémiai sterilizálási módszerek
Kevés olyan csíramentesítő ágens van, amelyik ne támadná meg a
bőrt. Így csak az enyhébb hatásúak alkalmasak a kéz dezinficiálására
(amilyenek pl. a sebészek műtét előtti bemosakodására
szolgáló szerek). Célszerű a gumikesztyű viselése, és ha az nem
steril, szükség esetén erősebb hatású dezinficienssel is áttörölhető.
Ilyen, az egészségügyben é alkalmazott l oldatok jók ollók, szikék
stb. kezelésére, pipetták, tenyésztőedények stb. használat utáni,
mosogatás előtti fertőtlenítésére. Mindig célszerű az aktuális lehe-
tőségekről, kínálatról tájékozódni.
Általánosan elterjedt nézet, hogy a 70%-os etilalkohol sterilizál.
Ez nem igaz, még baktérium-spórák is lehetnek benne. De lemosásra
(pl. lamináris box munkafelülete) alkalmazható (akár steriáá
után). Ha már, akkor az izopropilalkohol jobb.
lizálás
Az utóbb említett célra alkalmasak különféle jód-tartalmú olda-
tok is, bár leginkább csak fém felületeken, s alkalmasint l 70%-os
etanollal utána letörölve.

Nagyon jó a formaldehid (gáz) vagy vizes oldata, a formalin.
Hermetikusan zárt térben alkalmazandó! Viszont nehéz a ma-
radványaitól (sterilen!) megszabadulni. Így leginkább erősen
fertőzött tenyészetek (pl. fonalas gomba, élesztő) és az ezekkel
érintkezett tt edényzet kezelésére é alkalmas. l A HCHO az adott légtérben
minden külön le nem zárt helyet elér.
Úgyszintén jó (és hasonló kautélákkal használható) anátrium
nátrium-
(vagy egyéb) -hipoklorit (Hypo) oldat, megfelelő hígításban.
(Ilyet szolgáltat pl. a Neomagnol tabletta is.)
Ugyanígy elér minden térrészt az etilénoxid az eszközökben,
amelyekhez alkalmazzák (és ami 60°C-on hatásos, mely hőmér-
sékleten a legkényesebb műanyagok ű sem károsodnak). k) Ez a gáz
azonban erősen rákkeltő és rendkívül nehéz az etilénoxidos ste-
rilizáló berendezés környezetében dolgozókat ettőlahatástól
megvédeni. (A sterilizálási ciklus befejeztével a gázt ki szokták
engedni a környezetbe, ami a felelőtlenség csúcsa.)
Alkalmazásának az is ellene szól, hogy az így sterilizált felületekhez
adszorbeálódott anyagot elég nehéz „kiszellőztetni”.

Mosogatás
Az ismételten használható eszközöket ök (üveg tenyésztőedények, tő pipetták,
Pasteur-kapillárisok stb.) sterilizálás előtt gondosan el kell mo-
sogatni.
Ez azzal kezdődik, hogy semmiféle szennyeződést nem hagyunk rájuk
száradni, hanem a munkafolyamat után azonnal dezinficiáló fo-
lyadékba merítjük ezeket. Innentől szétválik a különböző típusú eszközök
útja. A jól hozzáférhető bennékű edények (pl. Petri csészék)
ennek utána – ha szükséges, mechanikus tisztogatást követően – valamilyen
detergens megfelelő töménységű oldatába kerülnek (l. aktu-
ális használati utasítás), amelyben puha (= nem karcoló) mosogató
kefével, vagy alkalmas gumikesztyűbe bujtatott kézzel a felületeket
jól átdörzsöljük. Vannak kifejezetten a sejttenyésztő laboratóriumi
mosogatáshoz ajánlott (neutrális) detergensek, de elmondható, hogy
sok háztartási mosogatószer is megfelelő. A lényeg a felületek alapos
fizikai kezelése az oldatban, és az igen gondos, alapos öblögetés. Ha
csak nyomai is maradnak ott a szernek az a sejteket elpusztíthatja.

Az öblítés először folyó, ill. többször váltott csapvízben történik.
Oda kell figyelni arra, hogy ne maradjanak légbuborékok az edényekben,
mert ott a víz nem érintkezhet a tisztítandó felülettel.
Célszerű, hogy az öblítésben legyen egy éjszakán át tartó áztatási
periódus is. (Ugyanez vonatkozik a következő ő lépésekre é is.)
A csapvizes öblítést ioncserélt vízzel történő követi, legalább há-
rom váltásban, hosszabb áztatási időkkel, majd – a sejttenyésztésben
általánosan megkövetelt tisztaságú – desztillált vízzel, úgyszintén
háromszor. A receptúrák általában háromszor desztillált
vizet emlegetnek, de gyakorlatilag a kétszer desztillált is megfelel,
ha a kiinduló csapvízben nincs sok oldott volatilis anyag, ill. ha
előzőleg már ionmentesített vízből indulunk ki a desztillálásnál.
Ilyenkor arra kell különösen ügyelni, hogy az edények mozgatása
közben ne érjünk a csupasz bőrünkkel olyan felülethez, amely a
sejtekkel, vagy akárha csak a tenyésztő folyadékkal érintkezhet a
későbbiekben. Ugyanez vonatkozik a szárításra való kipakolásra
is, ide értve, hogy az tökéletesen tiszta és pormentes helyen történjen.

A pipetták és hasonlók (pl. Pasteur-kapilláris) belsejének meg-
tisztítása komoly kihívást jelent. Bár erre a célra is árulnak speciális
detergenseket, mind a mai napig legjobban bevált szer a
krómkénsav. Egyúttal ez a legveszélyesebb is – sajnos. Lehetőleg
ne a sejttenyésztő laboratórium előterében, hanem egy külön, jól
szellőző helyiségben használjuk, a megfelelő munkavédelmi előírások
maradéktalan betartásával (védőszemüveg vagy maszk,
gumikesztyű). A savazóhenger nyílása feltétlenül legyen zárható.
A pipettákból először el kell távolítani a vattadugókat, t majd egyszerű
átöblítés után kiszárítani őket. Semmi sem érintkezhet ned-
ves állapotban a krómkénsavval, mert ez rendkívül veszélyes, gőz
fejlődése súlyos balesetet okozhat! A megszáradt pipettákat hegyükkel
felfelé kell behelyezni a savazó kosárba, és azt – átmérőjének
megfelelően – lehetőleg teljesen kitölteni.
A kosarat nagyon lassan engedjük bele a savazóhengerbe, amelyben
pontosan a kívánt mennyiségű krómkénsav van. (Ha több,
kifolyhat! Ha kevesebb, nem lepi el a legkényesebb részeket.)

A savazó kosarat az elhelye-
zés után még nagyon finom
mozdulatokkal fel-le meg kell
egy kicsit rázni (balesetveszély!),
hogy a legkényesebb
helyről, a pipetták hegyéből
minden levegő eltávozzon. A
savkezelés folyamata (kb. 3
nap, több is lehet) alatt ez a
mozgatás néhányszor még
megismétlendő.
Balra: savazó henger. Középen: pipettaöblítő.
Jobbra: savazó kosár.

Ak krómkénsavat ké tjobb, ha kiki ki-ki saját magának tudja elkészíteni,
de erre ma már általában nincsenek berendezkedve
a laboratóriumok. A gyári kiszerelés gyengébb minőségű:
hamar kimerül. E kimerülés jele a barna színből zölddé
válás. Az ilyen savat már nem szabad, de legalábbis nem
érdemes használni. (NB! Ugyanolyan balesetveszélyes,
mint a friss!) Az elhasznált krómkénsav rendkívül veszé-
lyes hulladék! Eliminálásához i áh a megfelelő lő szabályok betartandók!
A savazás végén a kosár felemelése (de a hengerbőlkinem
nem
vétele) útján ki kell csepegtetni a savat a pipettákból, majd
megfelelő védelem mellett az üres pipattaöblítőbe pp
kell át-
helyezni a savazó kosarat. Lefedés után az öblítési folyamat
elindítható. A továbbiakban a már ismertetettek szerint
kell eljárni.

Mosogatás után a sterilizálás a már említett berendezésekkel
történhet. Ehhez a kezelendő eszközöket, anyagokat a megfelelő
módon be kell csomagolni, hogy majdan sterilek is maradjanak.
Hőlégsterilizálás
Pipetták (vattadugóval), Pasteur-kapillárisok: fém dobozba zártan.
Szükség szerint individuálisan, alufóliában is kiégethetők.
Petri csészék: alkalmas számban egy-egy alufóliába csomagolni.
Tenyésztő flaskák, tárolásra szolgáló üvegek: a nyakra is ráterjedően
dupla alufóliával zárni a száját. (Itt: szorosan.)
Ollók, csipeszek stb.: alufóliába csomagolva.
Autokláv
Műanyag kupakok: úgy tekerni alufóliába, hogy az a sterilizálandó
oldalon csőszerűen nyitva maradjon. Bele két-három
csepp kétszer desztillált víz. Autoklávozás á után az alufóliát
azonnal, még a tetthelyen rászorítani.

Apróbb gumi, műanyag (pl. mikropipetta hegy) stb.: üveg-
edényben (Petri csésze, főzőpohár), amibe néhány csepp
kétszer desztillált vizet tettünk és az alufóliát némiképpen
felbillentve, a gőz útját biztosítva helyeztük rá. (Majd az
autoklávozás á végén, é a lehülés után, a munkakamrát
k kinyitva azonnal rászorítjuk a fóliát a szájadékra.)
Gamma sugárral történő sterilizáláshoz olyan átlátszó fóliába
célszerű csomagolni az eszközöket, amelyben azok hosszú
ideig tárolhatók csíramentes állapotban. Pl. polietilén, poli-
karbonát zacskók.
Ismételten hangsúlyozni kell, hogy az etilénoxidos sterilizálás
kerülendő! Ha mégis alkalmazza l valaki, a serilitást jól
megőrző csomagolásnak olyannak kell lennie, hogy a gáz
könnyen bejusson és ki is szellőzhessen. (Ez utóbbihoz al-
kalomadtán egy-két hónap is szükséges lehet.)
Bármilyen módszerről legyen is szó, a csomagolásnak olyan-
nak kell lennie, hogy a lamináris boxban könnyen, sterilen
nyitható legyen.

Milyen sejteket tenyésztünk
Minden sejttenyészet primer kultúraként kezdi pályafutását. Sok
esetben megfelelnek az eredeti explantatumból származó sejtek,
máskor szelektálni kell a kívánatosakat. Az első passzálás (szubkultiváció)
után az in vitro tenyészet sejtjeit immár a szekunder
kultúra megjelölés illeti. Szokás ettől az átoltástól kezdve sejtvo-
nalról beszélni.
A primer kultúrák és az ezekből származók sejtjeire általában
jellemző, hogy annak a szövetnek megfelelő morfológiát mutatják,
ahonnan vétettek, és ami ennél fontosabb, őrzik annak diffe-
renciált biokémiai funkcióit, valamint a kiindulási organizmus
diploid kromoszómaszámát. (Szuszpenzióban a sejtek gömbölyűek.)
A daganatos eredetűeket kivéve az ilyen tenyészetek élettartama
erősen korlátozott: a sejtek osztódási kapacitása kb. 50 mitózisra
elegendő. (Ez leginkább embrionális eredetnél igaz, felnőtt szervezetből
történő indításkor 30 sejtgenerációra is korlátozódhat.)

Különféle, letapadva, egy rétegben (monolayer) növő
sejttípusok in vitro morfológiai jellemzői
A
B
(A) Endothel, confluens kultúra:
a sejtek egymáshoz illeszkednek.
(B) Fibroblast, semi-confluens:
orsó alakú, nyúlványos sejtek.
(C) Neuralis sejtek, kb. 60-70%-os
confluentia:
rövidebb orsó, ill. csillag alakok.
Valamennyi (eredetiben) 400×.
C

Az in vitro szaporodó tenyészetek sejtjeit passzálni kell. Adherencia-dependens
sejtek esetén nem szabad megvárni, hogy azok a
rendelkezésükre álló felület teljes egészét elfoglalják, azaz a tenyészet
confluenssé váljék, hanem kb. 70-80%-os lefedettségnél el kell
végezni az átoltást. Minden egyes tenyészetről tudnunk kell azt,
hogy hányadik passzázsnál tart. NB! Ez nem jelenti azt, hogy há-
nyadik mitózisnál. (Ez utóbbi erősen függ a le/át/oltás sűrűségétől.)
Ha a primer kultúra előnyeit kamatoztatni akaró kísérleti rend-
szerben összehasonlítható eredményeket
akarnak elérni, akkor nagy denzitással indítják
a tenyészetet és néhány passzálás után
– lehetőleg sok – szubkultúrát lefagyasztanak,
folyékony N 2 -ben eltesznek.
Ezek egyenkénti felolvasztásával folyamatosan
biztosítható a nagyjából homogén (egy-
mással összehasonlítható) és még nem elöregedett
tenyészeteken való munka.

Az aljzathoz (vagy más szilárd felszínhez) letapadva tenyészthető
(adherencia-dependens) dependens) sejtek esetén releváns kifejezés a con-
fluentia, szuszpenzióban fenntarthatók esetében ez nem használható.
Mindkét növekedési típusnál meg kell különböztessük a leoltási
késlekedést, az exponenciális növekedési szakaszt és a telítési
fázist. Ha jól proliferáló tenyészetből átoltással szubkultúrát
hozunk létre, a sejtek előrehaladása a sejtciklusban leáll, majd
egy-két nap után éri el az adott körülmények közötti maximális
ütemet. Végül, ha a sejtek egy egységre (cm 2 vagy ml) eső száma
telítéshez közeledik, a mitotikus aktivitás lecsökken, majd
leáll. Ha túl sokáig maradnak ebben a stacioner fázisban, az
elégtelen tápanyagellátás miatt megindul a tenyészet involúciója,
pusztulása. A tönkrement sejtekből felszabaduló anyagok
károsítják a még élőket!
Ebben a proliferációs ió viselkedésben is lényeges különbség van a
letapadva, ill. a szuszpenzióban szaporodó sejtek között.

Sejttenyészetek növekedési dinamikája
logN
vagy
lnN

Egy kis nevezéktan
Plating efficiency (megtapadási hatásfok). Azt mutatja meg, hogy
az 1 cm 2 -re számított leoltási sejtszámból mekkora hányad tapad
valóban le és kezd el szaporodni. Ez sohasem 100%! (Értelemszerűen
csak adherencia-dependens sejtekre vonatkoztatható
paraméter, de a szuszpenzióban növekvőknél sem 100% a
továbbiakban jól szaporodó sejtek aránya, itt ml-re számítva.)
Fontos tudni minden egyes sejtféleség, sejtvonal esetén, hogy
mekkora az optimális leoltási sejtszám, 1cm 2 -re vagy 1 ml-re
vonatkoztatva. Ez igen tág határok között váltakozhat. A sejtek
között van bizonyos kooperativitás, kondícionálják a maguk
számára a mediumot, ami ha túl alacsony a sejtszám, nem
tud működni, és nem indul be a proliferáció. Ugyanakkor a fe-
leslegesen túl sűrűre választott leoltás nagyon röviddé teheti a
tenyészetnek az exponenciális növekedési fázisban eltöltött idejét,
és a sejttenyészetek többségében ez a periódus az, ami alkalmas
az elvégzendő kísérletek megbízható és összehasonlítható
eredményekkel szolgáló kivitelezésére.

A letapadás-függő, egy rétegben növekvő tenyétkb
jll jellemző ő a sejtek mozgása az aljzaton,
mindaddig, amíg egymáshoz nem érnek. Ekkor
megállnak (a mozgás kontakt-gátlása), majd más
irányban, ha arra még van hely, tovább vándorol-
szetekben
hatnak. Ha nincs már hely a felületen, akkor a
sejtek szaporodása is leáll. Ezen folyamat közben
a sejtek az aljzatot is kondícionálják: extracellula-
ris matrix (ECM) fehérjéket és egyéb molekulákat lák is deponálhatnak.
Vannak sejtek, amelyek – főleg a differenciált funkcióikat megkö-
zelítő állapotban való proliferációjukhoz – egyenesen azt kívánják
meg, hogy az aljzatot ECM molekulákkal előzetesen vonják be (pl.
collagen, fibronectin stb). Ennek megvannak a bevált technikái, de
kaphatók gyárilag így előkészített tenyésztőedények is. Léteznek
olyan fóliabetétek, amelyek az említett fehérjebevonatot hordozzák,
és a hagyományos Petri csészékbe illeszhetők be.

Bizonyos (kényes, igényes) sejtféleségek kondícionált mediumot
kívánnak: valamilyen más sejtféleség exponenciális (vagy
esetleg már stacioner) fázisú tenyészetéről leszívott és újból
sterilre szűrt tápfolyadékában hajlandók csak szaporodni.
Megint mások csak tápláló rétegre (feeder layer) oltva tenyészthetők
in vitro. Ebben az esetben valamilyen sejtféleség
egyrétegű ű tenyészetét tét állítják elő, majd ennek sejtjei további
szaporodását lehetetlenné teszik (pl. a DNS roncsolásával:
rtg., UV, esetleg kémiai ágens), és ezekre telepítik az igényes
sejteket, szaporítandó azokat.
Egy kis nevezéktan
A sejtpopuláció megkettőződési ideje (population doubling
time). Megmutatja, hogy egy adott sejtszám mennyi idő alatt
duplázódik (az exponenciális növekedési szakaszban).
Nem tévesztendő össze a sejtciklus idejével! Ez ugyanis még primer
kultúrákban is sejtről sejtre változó lehet, másrészt mindig
vannak nem osztódó sejtek is egy tenyészetben.

Letapadva növő primer kultúrák sejtjei – ha normál szövet-
ből származnak (= nem transzformáltak) – egy rétegben
(monolayer) képesek benőni a tenyésztő edény alját, ezután
a szaporodásuk leáll, azaz a sejtek kontakt-gátlást mutatnak.
(A gátlás kiterjed a sejtek vándorlására is.)
Ez igaz a belőlük származó másodlagos tenyészetekre is, nem
igaz viszont az ún. transzformált sejtvonalakra.
Eleve transzformáltnak tekintendők a daganatszövetekből in-
dított tt tenyészetek t sejtjei, de a normál szekunder kultúrák
is átalakulhatnak. Ennek több jele is van, amelyek közül
legfontosabb az ún. immortalizáció. Ez azt jelenti, hogy a
sejtek immár korlátlan ideig tenyészthetők in vitro.
Másrészt megszűnik a kontakt-gátlás, a sejtek több rétegben
képesek egymásra nőni (egy bizonyos határig).
Megváltozik a transzformált sejtek genomja, akár annyira,
hogy ez a kariotípusukban kb is megnyilvánul l(és egy adott tenyészet
sejtjei különféle aberrációkat is mutathatnak).

Mi vezethet egy szekunder kultúra, egy sejtvonal transzformáció-
jához
Bekövetkezhet ez spontán, amit kifejezetten elősegít, ha a tenyészetet
többször is confluentiáig hagyták nőni – letapadva sza-
porodó sejtek esetén.
Lehet a transzformáció valamilyen – nem azonosított – kémiai
ágens, vírusfertőzés stb. következménye is, és lehet szándékosan
előidézett (pl. fertőzés Epstein-Barr vírussal).
Egy kis nevezéktan
A sejtvonal kifejezést általában egy adott primer kultúrára visz-
szavezethető, ő jól tenyészthető ő (ennek megfelelően lő az esetek
többségében transzformáltnak tekinthető) sejtekre használják,
azaz itt a közös ősből eredés meghatározó. Az ún. „established
cell line” tartósan azonosnak tekinthető önmagával, de ez a kitétel
erős fenntartással fogadandó. A sejtvonalak irodalmilag
azonosíthatók, ha magunk állítunk elő ilyet, igen részletes leírást
kell adni róla, bármilyen közleményben szerepeljen is.

Egy kis nevezéktan
A sejttörzs megnevezés valamennyire rokon a sejtvonallal, általában
ilyenből is származik (ritkán primer kultúrából),
valamilyen szelekciós vagy klónozási eljárás eredményeként.
Ennek megfelelően ez névleg még inkább azonos önmagával és
az eredeteként szereplő sejtpopulációval. Névleg…
Hangsúlyozni kell ugyanis, hogy a hosszú ideig in vitro tenyésztett
sejtek populációjában spontán szelekció megy végbe: minél
jbb jobb alkalmazkodás lkl kdá az in vitro körülményekhez. kh Ez egyben
dedifferenciálódást is jelent. Ezért az ilyen sejtpopulációk
egyedei rendkívül tarka képet tudnak mutatni pl. a kariotí-
pusukat illetően (gyakran igen hasonlatosan a daganatsejtekhez,
amelyekből alkalmasint származnak is), és ha ez
annyira változatos, mint amennyire, akkor nyilván a genomjukban
is sok eltérés lehet azokban a génekben, amelyek nem
szükségesek k feltétlenül az in vitro létezésmód é fenntartásához.
tá áh

Az eddigiekből értelemszerűen következik, hogy a letapadás-
függő és a szuszpenzióban fenntartható sejtféleségek jelentik
az alapvető különbséget a sejttenyészetek között.
A következő szint a transzformált és nem transzformált sejtek
megkülönböztetése, majd pedig a jól jellemzett sejtvonalak
közötti különbségek megállapítása.
Az adherencia-dependens sejtek/sejtvonalak, ha rosszindulatú
daganatból származnak, és/vagy már hosszú időt töltöttek
el in vitro ahhoz, hogy kifejezetten transzformáltaknak
lehessen őket tekinteni, hajlamosakká válnak arra, hogy
szuszpenzióban is proliferáljanak, avagy lágy agarban
kolóniát képezzenek (ahol – értelemszerűen – nincs szilárd
megtapadási felület), amellett, hogy több rétegben képesek
egymásra növekedni. (Meg kell azonban jegyezni, hogy a
legfelső réteg sejtjei ilyen esetekben gyakran leválnak és
ezzel együtt el is pusztulnak.)

A szuszpenzióban fenntartott sejtek elvileg bármilyen tenyészedényben
növeszthetők, de soha nem szabad megfeledkezni a morfológiai
kontroll szükségességéről, ami legalább az aljzat felől
plánparallel lemezzel való lehatárolást jelent.
Az aljzathoz rögzülten fenntartott sejtek esetén ezen lemeznek
kell plánparallelnek lennie. Morfológiai vizsgálatokra szánt tenyészetek
– megfelelően előkészített, kezelt – fedő- vagy tárgylemezre
növeszthetők. (Van olyan – sajnos meglehetősen drága – megoldás,
amiben egy tárgylemez alkotja a tenyésztő flaska alját. Erről
a felső rész eltávolítható, a
lemez a ránőtt sejtekkel
fixálóban, festékoldat(ok)-
ban kezelhető, (immun)cito-
Speciális tenyésztő ő cső, ő ami egy keskeny,
k
kémiai reakciók végezhetők
hosszúkás fedőlemez befogadására alkalmas.
Ennél egyszerűbb a fedőlemezt
el rajta stb.)
egy Petri csésze aljára tenni.

Sejtszuszpenziókból (NB! itt és most ide értendők az aljzatuk-
ról felválasztott, valamilyen mediumban vagy fiziológiás
pufferoldatban eloszlatott sejtek is) citocentrifugával, kicseppentéssel,
kenetkészítéssel stb. állítható elő morfológiai
vizsgálatokhoz megfelelő lő denzitású preparátum. Sh Soha ne
feledkezzünk meg ilyenkor arról a tényről, hogy a tenyészfolyadék
egyik fontos komponense valamilyen állati szé-
rum, amiben számos olyan fehérje van, ami adszorbeálódhat
a vizsgálni kívánt sejtekhez. Felhívjuk a figyelmet az
öblítés szükségességére!
Ugyanez a megfontolás fokozottan érvényes a biokémiai, mo-
lekuláris biológiai stb. feldolgozásba vont, vagy valamilyen
(tudományos, diagnosztikai, ipari) produkciót (pl. vírus,
speciális fehérjék stb.) szolgáló sejtek szuszpenzióira. Mo-
noklonalis antitesteket termelő hybridomák tápfolyadékában
vagy vírusvakcínák előállítására szolgáló tenyészeteké-
ben pl. nincs semmilyen en savó, nehogy abból keveredhessen
eredhessen
bármiféle fehérje a termékhez.

Miben, hogyan tenyésztjük az emlős sejteket
Természetesen tápfolyadékban, szintetikus mediumban. Minden
sejtféleségre létezik a számára optimális medium. Primer kultúrák
indításakor alkalmasint ezt magunknak kell megkeresnünk, és ezek
általában komplex mediumokat igényelnek, míg megalapozott sejtvonalak
esetén az ún. bazális medium elegendő szokott lenni. Az iro-
dalomban, ill. a sejtek forrásánál megtalálható egy-egy sejtvonal tápközeg
igénye. Különbségek vannak általában a szuszpenziós, ill. letapadás-függő
tenyészeteket támogató mediumok között (pl. az utóbbi
esetén sokkal fontosabb a Ca 2+ , mint az előbbinél), de azért szerencsére
jóval kisebb a használt tápközegek száma, mint a sejtfélesé-
geké.
Amint a bevezetésben már esett szó róla, a mediumok célirányos fejlesztése
a múlt század 40-es éveiben kezdődött. Akkor a sejttenyész-
tés elsődleges célja még a víruskutatás volt. (A vírusok – ismeretesen
–csak élő sejtekben szaporíthatók.) Enders, Weller és Robbins
kapott Nobel-díjat (1954-ben) a polio vírus majom vesesejtekben
való tenyésztésének megoldásáért.

Nem csak a víruskutatásban, hanem a vírus-oltóanyagok kifejlesztésében
is alapvető szerepet játszottak az in vitro sejttenyésze-
tek. (A gyermekbénulás elleni első oltás – mint ismeretes – Jonas
Salk nevéhez fűződik [1955-től alkalmazták], majd ezt felváltotta
az egyszerűbben [peroralisan] és egyúttal hatásosabban is alkalmazható
Sabin-csepp [Albert B. Sabin, 1957-től].)
Néhány imertebb bazális medium: MEM (Minimum i Essential
Medium); BME (Basal Medium [Eagle]), DMEM (Dulbecco’s
modified MEM, emelt aminosav- és vitamin-szint), GMEM
(Glasgow MEM, BHK-21 sejtekhez adaptálva), Medium 199 stb.
Komplex medium: RPMI 1640 (eredetileg leukémiás sejtekhez,
később kiderült, hogy nagyon sok sejtféleségnek – közöttük
adherencia-dependenseknek is – jó), Iscove’s DMEM (nagyobb
sejtsűrűség eléréséhez), Leibovitz’s L-15 Medium (CO 2 -ot nem
tartalmazó atmoszférához), McCoy’s 5A Medium (citogenetikai
vizsgálatokhoz), Nutrient Mixture Ham’s F-12 és így tovább…
(A mediumokat szállító cégek katalógusait ajánlhatjuk az érdeklődőknek.)

– Anorganikus sók
A mediumok alapvető összetevői
(Puffer-rendszerek)
– Nyomelemek
– Szénhidrátok
– Aminosavak
– Vitaminok
– Zsírsavak és lipidek
– Fehérjék és peptidek
– Szérum
– Fenolvörös indikátor
– Egyebek, speciális igények kielégítésére
A megfelelő szakkönyvekben és kereskedelmi katalógusokban
számos medium összetétele is megtalálható. Ezek közül egyet
idézünk (mennyiségi adatok nélkül) a következőkben.

Szervetlen sók
adják az alapját a tápfolyadék ozmótikus koncentrációja pontos
beállításának. Ez elvileg 300 milliosmol, de a legjobb termosztátban
is elpárolog valamennyi víz a folyadék fázisból, ezért 280 millios-
molra állítják be a koncentrációt. Természetesen a gyakoribb ionok
iránti igényt is ezek a szervetlen sók fedezik, valamint az oldat
vegyhatásának pH 7,2 - 7,4 közé állítását is, ha bikarbonát pufferelésről
van szó. (Ne feledjük: vannak ott foszfátok is!)
Nyomelemek
Ezeken olyan életfontos ionokat értünk, mint Fe, Cu, Zn stb. Ha
nem is mindig, de sok esetben nem szervetlen só formájában jelen-
nek meg ezek a tápfolyadékok össztevői között. Miért Mert felvételük
fehérjéhez kötött formában lehetséges (pl. transferrin), és
ez a konjugáció csak sejteken belül történik. Bár vannak vas-, rézcinkszulfátot
tartalmazó formulák, ezen ionok forrása leginkább a
mediumokhoz rutinszerűen ű hozzáadott szérum (foetalis vagy borjú,
marha, ill. lósavó stb., l. a továbbiakban).

Szénhidrátok
Általában D-glükózrólD van szó, de igen sok formulában szerepel
fruktóz, galaktóz, mannóz vagy egyéb. Bár nem szénhidrát, itt
említhető meg, hogy sok sejtvonal igényel pluszban piruvátot.
Aminosavak
Nem csak a 20-féle L-aminosav, hanem néhány más (pl. hidroxiprolin)
is szerepelhet. Bizonyos mediumokat bizonyos sejtek
számára pluszban ki kell egészíteni a nem esszenciális
aminosavak keverékével, esetleg egyéb, rokon vegyületekkel.
Vitaminok
Ezek azért esszenciális szerves vegyületek, mert az emlős szerve-
zetnek feltétlenül szüksége van rájuk, de nem tudja azokat előállítani.
A lista érdemben megegyezik a táplálkozásunkban
szükséges vitaminokéval.
Zsírsavak és lipidek
Ezek általában (de nem minden esetben) a tápfolyadékhoz adott
szérumból származnak.

Fehérjék és peptidek
Szállító fehérjék ionok és hidrofób molekulák számára (pl.
transzferrin a vas esetén), hormonok, növekedési faktorok.
Mindezek a mediumhoz adagolt vérszérumban találhatók meg.
Számos sejtféleség kifejezetten igényli a savóban levő növekedési
faktorokat (növekedési hormonok), és ezért foetalis borjú-
savót kell a tápközegéhez adagolni, már az újszülött borjú vérszéruma
sem biztos, hogy maximális növekedést garantál, a
felnőtt állatból származó pedig elégtelen.
Szérum (vérsavó)
Az eddigiekben előadottak szerint az egyik legfontosabb tápfo-
lyadék dékkomponens, ugyanakkor a legrosszabbul ldefiniált iál is.
Számos sejt beéri felnőtt marha- vagy lószérummal, mások
csakis foetalis borjúsavón hajlandók proliferálni. (Bizonyos hu-
mán sejtekhez pedig emberi vérszérum szükséges.)
Ennek a komponensnek a beszerzése kifejezetten bizalmi kérdés:
az abszolút sterilitáson felül külön hangsúlyozottan vírus-,
prion- és mycoplasma-mentesnek kell lennie.

Nem is ajánlás!
Ez itt nem a
reklám helye!
Az állati vérsavók általában 500 ml-es kiszerelésben,
fagyottan (szárazjégben) szerezhetők be, műanyag
flaskákban. Eltartás: -20°C-on (megbízható
mélyhűtőben). Célszerű ezeket az első felhasználás
szándékolt ideje előtt felolvasztani (alkalma-
sint 30 percig 56°C-on hőkezelni – l. a továbbiakban),
és olyan adagokban sterilen, csíramentes, a
befagyasztást jól kibíró edényekbe szétmérni, ami
egyszeri mediumkészítéshez szükséges.
A szérumok többszöri felolvasztása és újra fa-
gyasztása nem kívánatos, de a fenti egyszeres procedúrát
általában jól bírják.
A tényleges használatba vétel előtt ki kell próbálni
az újonnan érkezett szérumot azokon a sejteken,
amelyek tenyésztéséhez használni kívánják. Vannak
sajnos a sejtproliferációt (vagy bizonyos sej-
tek szaporodását) nem támogató savó-készítmények
is. Nagyobb megrendelés esetén sok cég vál-
lalja, hogy kisebb mintákat ad kipróbálásra, s a
legjobban beváltból szállít több literes tételt.

A szérumban számos olyan komponens van, amit csak ebből kaphatnak meg a
tenyésztett tett sejtek. A megelőzőekben ő őe nem említettek közül néhány: laminin,
fibronectin, szabadgyökfogók, nehézfémeket és mérgeket megkötő molekulák.
Tulajdonképpen ez lenne az ideális tápközeg a sejttenyészetek számára,
de általában elegendő 5 – 10%-os arányban alkalmazni a teljes mediumban.
(Csak nagyon igényes sejtek kívánnak 20%-nyi savótartalmat.)
Az 1980-as és 90-es években különféle szérum-mentes mediumformulákat dolgoztak
ki (pl. hybridoma tenyészetekhez), de ezek közös jellemzője a rendkívüli
drágaságuk, mert a legfontosabb szérumfehérjéket (növekedési faktorok,
hormonok, transzferrin stb.) tisztított formában kell hozzáadni az adott mediumhoz.
Bizonyos esetekben ez megéri: monoklonális antitestek, vakcinák
előállítása, mert itt a termék elviseli a magasabb költségeket.
Foetalis borjúsavó esetén nem feltétlenül, de felnőtt állatból származó szérum
esetén szükséges a hőinaktiválás: 56°C-on 30 perc. (A nemkívánatos fehérjekicsapódás
megelőzésében, valamint a gyors, egyenletes átmelegedéshez jó
szolgálatot tesz, ha a hőkezelés rázatás közben történik.) Ez az eljárás
inaktiválja a complement-rendszert, az antitesteket, és néhány enzimet,
amilyen pl. az LDH (laktát dehidrogenáz), mely utóbbi indikátora lehet a
sejtek tenyészetbeni sérülésének, éüléé szétesésének. éé k(Nem apoptosis, hanem
necrosis!)

Esetleges vírus- vagy mycoplasma szennyeződés feltételezésekor
szokás 254 nm-es UV-fénnyel besugarazni a szérumokat, mivel
ez elroncsolja a DNS-t. (Ezt ebben az esetben jobbnak tartják a
gammasugaras kezelésnél, amit úgyszintén szoktak alkalmazni a
vérsavók sterilizálásához.)
áh Egyes vizsgálatokhoz (pl. jelzett aminosavak vagy nukleozidok be-
építése) dializált szérumot használnak, amelyből a 10 kDa-nál
kisebb molekulákat fiziológiás NaCl elleni dialízissel távolítják
el. (Vigyázat: ilyenkor hormonok is távoznak a savóból!)
A foetalis borjúsavó a legdrágább készítmény, a donor marháktól
nyert a legolcsóbb. Ez utóbbi esetében is garanciát kell adjon a
szállító a megelőzőekben ő említett kontaminációk iók hiányát á illető-
ő
en, de pl. arra is, hogy a vér nem tartalmazott szabad haemo-
globint.
Mivel vérszérumról (-savóról) van szó, értelemszerű a fibrinogénmentesség.
Emberi savó csak AB és Rh + donoroktól nyerhető: nincs anti-A,
anti-B, ill. anti-D ellenanyag a szérumban.

RPMI 1640 (RPMI = Rosswell Park Memorial Institute)
Általánosan használható tápközeg szuszpenzióban (az eredeti definíciója
szerint), ill. letapadva proliferáló sejtekhez is.
Anorganikus sók: Ca(NO 3 ) 2 , KCl, MgSO 4 , NaCl, NaHCO 3 ,
Na 2 HPO 4 .
Aminosavak: Mind a 20 L-aminosav L + hidroxiprolin. Kiemelendő a
glutamin abban az értelemben, hogy hamar elbomlik az oldat tárolása
során, ezért időről időre pótolandó.
(Ez természetesen mindenféle mediumra vonatkozik. Gyárilag előállított, kereskedelmi
forgalomban beszerezhető folyadék formában árult mediumokba eleve
nem is tesznek glutamint, ez közvetlenül a felhasználás előtt adandó hozzá, vi-
szont NaHCO 3 van benne, ami a por alakban kapható formulákban nincs.)
Vitaminok: D-biotin, D-Ca-pantotenát, kolin-klorid, fólsav, i-inozitol,
nikotinamid, para-amino-benzoesav, piridoxal, riboflavin,
tiamin, B12.
Egyéb szerves: D-glükóz, (redukált) glutation, (HEPES),
fenolvörös.

Fenolvörös indikátor és a medium pH-ja
Mint a megelőzőekben ő említettük, ttük az emlős sejtek tápközegéül szolgáló
mediumok kívánatos pH-ja 7,2 – 7,4. A steril folyadékban ez –
értelemszerűen – közvetlenül nem mérhető, ezért – néhány kivételtől
eltekintve – a mediumokhoz (de a fiziológiás sóoldatok egy részéhez
is) fenolvörös indikátort adnak. Ennek „lazacvörös” színe
mutatja, ttj hogy a tenyészet tpH-ja Hj rendben van. Savasodás esetén
(ami leggyakrabban a sejtek túlszaporodásakor, azaz elmulasztott
időbeni átoltáskor jelentkezik) a szín a sárga felé tolódik el, míg a
lúgosodásra lila elszíneződés hívja fel a figyelmet. Ezek a színek a
CO 2 termosztát üveg ajtaján keresztül jól megítélhetők. A tenyé-
szetekre a tápfolyadék lúgosodása jelenti a nagyobb veszélyt.
A „hagyományos”nak mondható mediumokban bikarbonát puffer
állítja be a pH-t. Ehhez szükséges a CO 2 -szint kb. 5%-ra állítása a
termosztát belső atmoszférájában. Sok formulában szerepel HE-
PES (alkalmasint NaHCO 3-tal együtt, de számos sejtféleség nem
tolerálja ezt a puffer-anyagot, ugyanakkor mások HEPES-pufferelés
esetén is igénylik a CO 2 -t).

A mediumok összetevői között felsorolt „egyebek” közé sok-
féle anyag kerülhet, itt az antibiotikumokat és antimikotikumokat
kell kiemelnünk.
A. Carrel és kollégái munkája kapcsán az aszepszis mellett
említettük az antiszepszist. A leggondosabban végzett steril
munka során is érheti a sejttenyésztőt „váratlan baleset”,
bakteriális, mycoplasma vagy gombafertőzés. Ezek megoldásának
legegyszerűbb módja a befertőződött tenyészet el-
pusztítása. Sokszor azonban olyan értékes és pótolhatatlan
t tl
sejtekről van szó, ami indokolhatja az antibiotikus vagy
antimikotikus anyagokkal való kezelési kísérletet. Egyes la-
boratóriumokban ezt oda egyszerűsítik, hogy eleve tesznek
a használt mediumokba antibiotikumot, tipikusan penicillint
és streptomycint (az utóbbi helyett vagy vele együtt
gentamicint), igen ritkán antimikotikumot is.
Az eljárás alapvetően helytelen: így ki-ki „magának állít elő”
antibiotikum-rezisztens baktériumokat.

Fertőzésveszély!
A bakteriális és gombafertőzések veszélye – valamint magának a
sejtpopuláció pillanatnyi állapotának megítélése – miatt rendkívül
fontos a rendszeres mikroszkópos kontroll. Ha egy ilyen fertőzés-
re még annak kezdeti állapotában derül fény, van esély a sikeres
kezelésre, később már nincs.
(A vírusfertőzések egészen más kategóriát képviselnek.)
Baktérium-kontamináció esetében arra általában nincs idő, hogy
a fertőző ágens azonosítására és a célzott kezelés érdekében mik-
robiológiai tenyésztést és ez után antibiotikum-érzékenységi tesztet
végezzenek. (Ezt legfeljebb utólagosan lehet, de úgy célszerű is
elvégeztetni.) Első helyen ilyen esetekben az ampicillin ajánlható,
ami penicillin-származék, de ritkább ellene a rezisztencia, mint
maga a penicillin ellen. Kombinálható gentamicinnel, ha a mediumban
ilyen nem volt. NB! Az antibiotikumok élettartama a tápfolyadékokban
rövid!
Szóba jön még: kanamycin, neomycin (azaz aminoglikozid anti-
biotikumok) és néhány egyéb készítmény (pl. ciprofloxacin), ami
nem vagy csak igen kevéssé toxikus a fertőzött tenyészet sejtjeire.

Rosszabb a helyzet fonalas gomba vagy élesztő fertőzések esetén.
Az ezek ellen hatásos antimikotikumok (Fungizon [amphotericin
B], Nystatin és egyebek) általában inkább mérgezőek az eukarióta
sejtekre (a gombák is eukarióták!), mint az antibiotikumok.
Akármilyen kontaminációról legyen is szó, annak kifejezetten toxikus
hatása van a tenyésztett emlős sejtekre. Ha ez utóbbiak leta-
padva nőnek, valamivel jobbak az esélyeink: a medium leszívása és
többszörös átöblítés (antibiotikumot vagy antimikotikumot tartalmazó,
előmelegített fiziológiás sóoldattal) fizikailag is sok fertőző
ágenst távolít el.
Nem láthatók – értelemszerűen – fénymikroszkóppal a sejteket
megtámadó vírusok, de az ilyen fertőzésnek ő kis megvannak a látható
jelei. A bimbózással a környezetbe jutó vírusok ún. „blebbing”-
et okoznak: apró, sejtmembránnal fedett „bimbók” emelkednek ki
a sejtfelszínből (amelyek majd leválnak), valamint az „értő” szem
számára világossá válik, hogy a tenyészetnek „valami baja van”,
amit nem elöregedés, nutriens hiány, vagy egyéb hasonló – relatíve
egyszerűbb – ok magyaráz. A vírusfertőzés nem kezelhető!

Külön megfontolás tárgyát kell képezze a mycoplasma (PPLO)
fertőzés. Forrása lehet a kísérletező (aki ilyen léguti fertőzésben
szenved), vagy a használt szérum. Ez az ágens mikroszkóposan
nem látható, intracellularisan helyezkedik el a membrán alatt.
Fltű Feltűnő ő lht lehet a sejtek jtkmegjelenése jl (l. pl. lbl balra lent: „tükörtojás” tükötjá”
képletek). Rendkívüli módon meghamisíthatja a sejttenyészettel
kapott eredményeket. Ha felmerül a gyanú, többféle diagnoszti-
kus módszer is szóba jöhet (pl. mikrobiológiai eljárás), ezek közül
a Hoechst 33258 jelű fluoreszcens DNS-festékkel való kimutatás
látható alul: középen negatív minta, jobbra fertőzött sejtek.
Kezelés pl.: anti-PPLO agent (tylocin), ciprofloxacin, BM cyclin
stb.

Fiziológiás (élettani) sóoldatok
Sá Számos esetben merül ülfl fel annak szükségessége, üké é hogy a tenyésztett
ttt
sejtek ne mediumban legyenek (pl. öblítés), de mindenképpen
olyan izozmótikus közegben, amelyben jól túlélnek. A legegy-
szerűbb formula a fiziológiás nátriumklorid: 0,150 M NaCl (=
300 mosmol). Ez azonban (mivel nem pufferelt, a levegőből
elnyelt CO 2 miatt) kissé savanyú, rövid túlélést biztosít, igen
kevéssé használt. Inkább oldószer hozzáadott vegyületekhez.
Az ún. „balanced salt solutions”-ról említettük, hogy ezekből fejlesztették
ki a szintetikus mediumokat.
Az egyik legáltalánosabban lá használt sóoldat a PBS (phosphate
h buffered saline: KH 2 PO 4 , NaCl, Na 2 HPO 4 ), ill. ennek Dulbecco-féle
változata (Ca 2+ és Mg 2+ ionokat is tartalmaz). A kétértékű
fémionok hiányában az oldat nem támogatja a sejtek letapadását,
ezt használják pl. az aljzatról trypsinnel vagy EDTAval
történő felválasztás esetén.

Ismertebb fiziológiás sóoldatok (emlős sejtekhez):
Earle’s balanced salt solution (ebből lett pl. a BME medium)
és a hozzá nagyon hasonló
Hanks’ balanced salt solution.
Ez utóbbi összetétele (gyári készítményként beszerezhető porban,
koncentrációk g/literben, kizárólag csak tájékozta-
tásképpen): CaCl 2 vízmentes (0,14), KCl (0,40), KH 2 PO 4
(0,06), MgSO 4 vízmentes* (0,09767), NaCl (8,00), Na 2 HPO 4
(0,04788), 04788) D-glükóz (1,00) és fenolvörös ö (0,01).
01)
* Gyárilag konfekcionált oldat esetén ezt MgCl 2 és MgSO 2
helyettesíti, az ilyen készítményben NaHCO 3 is van.
(A por formában megvásárolható gyári mediumokhoz és sóoldatokhoz
azok feloldásakor kell hozzámérni a címkén megadott
mennyiségű NaHCO 3 -t, ha folyadékban vásároljuk a
kész mediumot, abban pedig glutamin nincs. Ha recept
alapján magunk mérünk össze valamilyen oldatot, figyelni
kell egyes vegyületek [pl. MgCl 2 ] higroszkópos voltára!)

Egyéb vegyületek a sejttenyésztő laboratóriumban
Trypsin. 0,25%-os oldatát (Ca 2+ és Mg 2+ ion mentes fiziológiás
sóoldatban, alkalmasint annak glükózt is tartalmazó változatában)
használják az adherencia-dependens sejtek felválasztására
az aljzatról. Hasítja azokat az extracelluláris fehérje-hídakat,
amelyeknek a sejtek letapadásában van szerepük. (NB! Ez
is lehet fertőzési forrás! Az elkészített oldatot – magától értetődően
– sterilre kell szűrni, de ez nem véd az esetleges viralis
vagy mycoplasma kontamináció esetén, ami egy efféle állati fehérjénél
nem kizárható. Célszerű ezért UV-sterilizált, kifejezetten
sejttenyésztési célokra előállított készítményt használni.)
Alkalmasint EDTA-val kombináltan alkalmazzák.
EDTA. Alkalmazása esetén a fent említett fertőzési veszély nem
áll fenn. Kelátképző, ő megköti a Ca 2+ ionokat, amelyek a sejteket
a hordozó aljzatukhoz kapcsolják, így segíti elő azok fel-
válását. 0,02%-os oldatát használják (Ca 2+ és Mg 2+ mentes
PBS-ben oldva).

DMSO (dimetil-szulfoxid). Lefa-
gyasztandó sejtekhez adagolják,
mint krioprotektív ágenst (nem
engedi meg a belső szerkezeteket
roncsoló méretű jégkristályok
képződését). A közhiedelemmel ►
ellentétben nem szükséges a sterilizálása,
mert elpusztítja a bakté-
riumokat, de ehhez természetesen
az tartozik hozzá, hogy a tároló ü-
vegből való kiméréskor a steril pi-
petta nehogy hozzáérjen a flaska
szájához vagy belső falához.
Glicerin. Ezt is krioprotektív anyagként adják a lefagyasztandó sejtek
szuszpenziójához. Természetszerűleg: sterilizálandó!
Speciális anyagok, amelyek egyedi igényeket szolgálnak és itt felsorolhatatlanok.

Munka a sejttenyésztő laboratóriumban
A lamináris boxban a levegőáramot a tervezett munkavégzés előtt
30-45 perccel be kell kapcsolni (és ilyenkor az UV-lámpát még
bekapcsolva hagyni, mert a munkát végző ekkor még nem tevékenykedik
a sejttenyésztő laboratóriumban).
A munkavégzés feltételeit és szabályait érdemben már említettük a
megelőzőekben, különösen hangsúlyozva a sterilitási követelményeket.
Szóltunk a letapadva, ill. szuszpenzióban szaporodó sejtekről,
valamint a morfológiai kontroll szükségességéről.
Ez utóbbival kapcsolatban alapszabály, hogy rendszeres legyen,
mert egyfelől ennek alapján ítélhető meg az átoltás szükségessége
g
(amit ha idejében nem teszünk meg, kárt okozhatunk tenyészeteinkben),
másrészt a sejtek általános állapota, nemkülönben a te-
nyészetek esetleges fertőzöttsége.
Lehetőleg ne kezeljünk egyszerre többféle sejtvonalat, ám ha ez elkerülhetetlen,
mindig előzetesen jelöljük j meg a használandó tenyészedényeket
aszerint, hogy mi kerül beléjük. (Sejtféleség, dátum,
passzázs-szám stb.)

Morfológiai kontroll
Kb. semiconfluens
tenyé-
szet, ►
közele-
dik az
ideális
Jellegzetes epiteloid megjelenés átoltási
sűrűség-hez. ű HeLa
Involúcióban levő tenyészet
►
Confluens
tenyészet,
régen át
kellett
volna
oltani.

Munka a lamináris boxban:
mediumcsere letapadva növő tenyészeten
Sejttípustól (és mediumtól) függően két-három (esetleg
négy) naponként friss tápfolyadékot kell kapjanak
a sejtek, a nutriensek kimerülése miatt.
A munkát végző gumikesztyűt
visel. Célszerű
lenne, ha ezt a köpenye
ujjára is ráhúzta volna:
szabad bőrfelületrőlhám-
pikkelyek sodródhatnak
le, amelyek garantáltan
nem sterilek
A tenyésztőedényt a gáz- A mediumot vákuumhoz
láng mellet nyitja, a flas- csatlakoztatott Pasteur-
ka száját egy pillanatra kapillárissal i l szívja le, amit
áthúzza a lángon. szintén áthúzott a gázlángon.
Friss mediummal ellátás.
A zárókupak visz-
szahelyezése előtt: gázlángon
áthúzás. Majd a
kupak lazítva a helyére.

Fenntartás, átoltás (passzálás) és sejtszámolás
Szaporodásuk során (és következtében) téb a tenyészetek t sejtjei elfogyasztják
a rendelkezésükre álló tápanyagokat: „meg kell etetni”
őket, azaz friss mediumot kell kapjanak. Ez az esetek nagy részé-
ben – szuszpenzióban fenntartott sejteknél mindenképpen – egyben
átoltást is jelent.
A letapadva proliferálók még ez előtt elérhetik azt a sűrűséget,
amelynél mindenképpen át kell oltani őket új tenyészedénybe, friss
mediummal ellátva. Ám ha a sejtdenzitás nem igényel még átoltást,
az ilyen tenyészetek kezelése az egyszerűbb: a medium leszívása
után a megfelelő mennyiségű friss (előmelegített!) tápfolyadékot
adagoljuk a tenyészedénybe. (L. a három ábrát a megelőző dián.)
Mit értünk ezeknél a megfelelő” mennyiségen Általában azt ami
Mit értünk ezeknél a „megfelelő mennyiségen Általában azt, ami
a tenyészedényben 2 mm (maximálisan 3 mm) folyadékvastagsággal
borítja be a sejteket. Ez képes elegendő nutrienst biztosítani és
megfelelő gázdiffúziót (O 2 , CO 2 ) is lehetővé tesz.

Akár átoltásról, akár számolásról legyen is szó (a kettő nem igazán
választható el egymástól), az adherencia-dependens sejteket minden-
képpen flkll fel kell választanunk az aljzatukról. tkólEnnek fizikai ik iés kémiai
i
módszerei vannak.
Fizikai: valamilyen alkalmas kaparóeszközzel (ilyen pl. a már említett
„rubber policeman”), ami kevéssé károsítja a sejteket, választjuk
fel azokat az alapjukról. Nem igazán jó megoldás, mert meglehe-
tősen nagy anyagveszteséggel ljár.
Kémiai: A mediumot leszívjuk, majd az enzim vagy EDTA oldószereként
szolgáló, előmelegített, Ca 2+ és Mg 2+ ion mentes fiziológiás sóoldatban
(alkalmasint annak glükózt is tartalmazó változatában) öblítés.
Trypsin oldat. Úgyszintén előmelegítve, igen kis (de a felszínt mindenképpen
egyenletesen, jól beborító) mennyiségben alkalmazzuk.
A sóoldat leszívása után ezt adjuk a tenyészethez, majd az edényt behelyezzük
a 37°C-os termosztátba, 5-10 percre. (Ki kell tapasztalni,
hogy az adott sejtféleség számára mi optimális.) A sejtréteg leválása
az edény mozgatásával á jól láthatóvá á válik, de kétely esetén mikroszkópos
kontrollal ez mindenképpen alkalmasan megítélhető.

Az enzimet ezután közömbösíteni kell. Ez történhet trypsin-inhibitor
alkalmazásával, vagy – egyszerűbben – a sejtek szérumot tartalmazó
mediumban való felvételével, lé l lecentrifugálásával á l és a véglegesnek
szánt mediumban való – kívánt denzitású – felszuszpendálásával.
Trypsin helyett szoktak alkalmasint egyéb proteázt is használni. A
kezelés mindenképpen a külső felületi fehérjék jó részének elvesztésével
jár. Ez nem jelentkezik az EDTÁ-val való felválasztás esetén,
ám ne felejtsük: ezt az oldatot is le kell öblíteni a sejtekről.
Az átoltás – mint a megelőzőekben láttuk – mindenképpen kapcsoló-
dik a tenyészetek t morfológiai i kontrolljával.
l
Minden sejtféleségnek megvan az optimális passzálási denzitása, s
ehhez a leoltási sejtszám meghatározásával alkalmazkodunk.
Szuszpenzióban szaporodó sejtek esetén könnyű a dolgunk: fel-le
pipettázással pp egyenletessé tesszük a sejtek eloszlását a közegükben
(a leülepedetteket fel kell keverni), a szuszpenzióból egy kicsiny mintát
haemocytometerbe teszünk és ott megszámoljuk a sejteket. A
lt letapadás-függőknél a felválasztás után úgyszintén gondoskodnunk
d k
kell az egyenletes denzitású szuszpenzióból való mintavételről.

Néhány haemocytometer típus rácsbeosztása
A sejtszámláló kamrákat
– mint a haemocytometer név
is mutatja – vérsejtek megszámolására
fejlesztették ki. Különféle
változataik vannak, a felső ábra a
–meglehetősen elterjedt – Neubauer
típus beosztását mutatja. A
beosztás elve: egy-egy (nagyobb)
négyzet pontosan 1×1 mm-es.
(Ugyanez igaz a hazánkban jobban
elterjedt Bürker kamrára is, l.
következő két ábra.) A (belekar-
colt) beosztást hordozó (vastag)
alap és a fedőlemez távolsága 0,1
mm. Így az egységnyi térfogat 0,1
mm 3 , vagyis 0,1 l.

Bürker kamra
Mindkét változat (leszorító
rugó nélkül vagy azzal)
esetén gondoskodni
kell a fedőlemez tökéle-
tes felfekvéséről, azazaa
0,1 mm kamramélység
betartásáról.
Csakis a rácsbeosztást
t
hordozó, a környezetéből
kiemelkedő felszílht
lehet sejtszuszpenzió!
Ha ezen túlfolyik, az
nen
hibaforrás!

A Bürker kamra rácsbeosztása
1 2
3 4 5 tekkel).
A hármas vonalak középsői
által körbezárt négyzet pon-
tosan 1 mm 2 , a kamra vastagsága
0,1 mm, azaz az 1
mm 2 -en megszámolt sejtek
0,1 l térfogatban vannak.
Tenyésztett emlős sejteket
nem érdemes kisebb térfogategységben
gy g számolni, mert
ezek meglehetősen nagyok
(szemben pl. a vörösvérsejtekkel)
Célszerű 7 négyzetben szá-
molni (pl. a jelzettek), a két
szélső értéket elhagyni, az
ötből számolt átlagot 10 000-
6 7 rel szorozva kapjuk az 1 mlben
levő sejtek számát.

Számolás a Bürker kamrában
Csak az élő, ,jó állapotban levő sejteket szabad átoltani, ill. a meg-
számolt mennyiségbe beszámítani. Ezt vitális festéssel szokták ellenőrizni:
az ép, jó membránfunkciójú sejtek nem vesznek fel tri-
pánkéket a környezetükből (= kizárják ezt a festéket), míg a sérült,
pusztulóban lévő vagy már el is halt sejtek megfestődnek.
Ezeket nem számolják, ill. ha túl nagy arányban vannak jelen, annak
okát meg kell keresni és meg kell szüntetni.
A tripánkék bármilyen szuszpendáló közeghez hozzáadható, meg-
felelő (fiziológiás sóoldatban elkészített) törzsoldatból néhány l,
hogy a végkoncentráció 0,2% legyen.
Fel kell hívni azonban a figyelmet arra, hogy ha valaki jól ismeri
az általa tenyésztett sejteket, és rendszeresen elvégzi azok morfológiai
kontrollját, a fáziskontraszt mikroszkópos kép igen megbíz-
ható információt ad azok állapotáról, tripánkék festés nélkül is.
(Jó fénytörés, erős halo-jelenség = egészséges sejt.)
(Ha a sejtállapot megítélhetőségének g követelményétől eltekintünk, Bürker
kamrában számolni közönséges fénymikroszkóppal is lehet, de itt pl. nehézséget
okozhat a rácsbeosztás felismerése, ami fáziskontraszttal jól látható.)

Hibalehetőséget rejt magában, ha nem figyelünk a határoló vonalakat
érintő (vagy azokon fekvő) sejtek „beszámítsam – ne szá-
moljam” kérdésére. Ha mind a négy vonalat érintő sejteket számoljuk,
többet kapunk, ha egyiket sem, kevesebbet.
A probléma megoldására legtöbben azt ajánlják, hogy két vonal
(mondjuk a felső és a bal) esetében igen, két másik vonal (példánkban
a jobb és az alsó) esetén pedig nem számoljuk az azokat
akárha a legkisebb mértékben is érintő sejteket. Ez külön abból a
szempontból is fontos, hogy egymással határos négyzetekben számolunk.
Bizonyos sejtek vonatkozásában azonban tehetünk engedményt
(nem igazán jogos, tudományosan nem megalapozott, de kényelmes):
a tenyésztett sejtek többsége van olyan nagy, hogy eléggé
megbízhatóan eldönthető, a nagyobb vagy a kisebb része van az
adott, éppen számolt négyzet területén.
Vigyázat! A számláló kamrát nem szoktuk sterilizálni! Ha bemértük
a mintánkat, az erre használt pipetta már nem steril.

Leoltás után a frissen tenyészedénybe telepített sejteket (még mi-
előtt az erre hajlamosak letapadhatnának) t óvatos mozgatással minél
egyenletesebben el kell oszlatni az új környezetükben. (Ha a
termosztát polcai rosszul vannak beállítva, azok rezgése miatt a
sejtek egyenlőtlenül töltik be a rendelkezésükre álló teret. Ez megbízhatatlanná
teheti a tenyészet viselkedését.)
Akár Petri csésze, akár tenyésztő flaska, a mozgatásánál mindig
ügyelni kell arra, nehogy a folyadék a széléhez (szájadékához, ku-
pakjához) érhessen, mert ez is fertőzési forrás lehet. Még steril
gumikesztyűben dolgozva is mindig kínosan ügyelni kell arra,
mihez nyúlunk, mihez érhetünk hozzá, és mihez nem.
Akár medium-csere, akár átoltás, akár a letapadva növő tenyészetek
leszívott mediumáról, akár a lecentrifugált sejtek felülúszójá-
ról legyen szó, azt mindig úgy kell összegyűjteni, hogy ne kerülhessen
át a második szívópalackba (l. a megelőzőekben) és mindig
dezinficienshez (pl. Neomagnol tabletta a felfogó edényben)
adódjék. Végezetül a leszívó rendszer csövét is át kell öblíteni
dezinficienssel.

A használt sejtvonal egyszerű fenntartása esetén is mindig célszerű
megfelelő tartalékokkal dolgozni, azaz pl. az átoltásnál duplikátumokat
(sőt: triplikátumokat) készíteni. (Ezeket, ha ténylegesen csak
sejtfenntartásról van szó, lehet igen kis mennyiségben létrehozni, lényeg
az egymástól – legalábbis részbeni – függetlenség.) Ugyanakkor,
amikor a korábban megvoltak közül a legjobb kinézetű tenyészetből
készítjük a szubkultúrát, a második legjobbat érintetlenül,
vagy csak egy medium-cserével mint biztonsági tartalékot tehetjük
el. (Igen sok sejtféleség kibírja azt, hogy ha már passzálni kellene is,
egy későbbi involúciós fázisból – szükség esetén! – még visszanyerhe-
tő legyen a sejtvonal. NB! Ez célszerű, ű de kényszermegoldás, nem
pótolja a folyékony N 2 -ben való tartalékolást.)
Ismételten meg kell említeni e helyen, hogy bármilyen sejtféleségről,
sejtvonalról legyen is szó, az folyamatosan adaptálódik az in vitro tenyésztés
körülményeihez, azaz egyre kevésbé azonos az első leoltás-
kori önmagával!

Ha kísérletbe kívánjuk ál-
lítani a sejteket, és az előre
láthatóan hosszabb ideig
tart majd, akkor
célszerű ű a
már bemutatott elvet követni
bármilyen sejtvonal esetén:
nagyobb sejtmennyiség
előállítása után azt olyan
porciókban fagyasztani le,
amelyekből majd újabb és
újabb kísérleti tenyészetek
t indulhatnak, melyek közül
egyet-egyet csak limitált
ideig (pl. egy hónap) használunk.
Tárolás: folyékony N 2 .

A sejtek lefagyasztása és felolvasztása
rutin eljárás minden sejtte-
nyésztő laboratóriumban. lb tói b Alapelv: l a tárolási hőmérséklet ékl elérése é a
lefagyasztás során egyenletesen, és nagyjából 1°C/perc hőmérsékletcsökkenéssel
történjen, a felolvasztás és a 37°C-ra való felmelegítés
viszont olyan gyorsan, amilyen gyorsan csak lehet.
Kaphatók olyan fagyasztó
betétek, amelyek a folyékony
N 2 -es tároló edény
Fagyasztó betétben elérhető
hőmérsékletcsökkenés
szájadékába helyezhetők,
h és a kipárolgó hideg N 2 a
hűtőközegük. Ennél egy-
Ideális
szerűbb (olcsóbb) eljárás
hőmérsékletcsökkenés
vastagabb falú műanyag
db dobozba b (pl. hungarocell)
rakni az ampullákat, és ezt
a dobozt előbb (egy éjszakára*) -20°C mélyhűtőbe tenni, majd át-
helyezni -70°C – -80°C-ra (fél vagy egy napra*), és innen vinni át
az ampullákat folyékony N 2 -be. (* Ez a két időtartam felcserélhető.)

Fagyasztó ampullák
Az ampullák töltése jégbe
állított állványban történik!
Vitatható, hogy milyen fagyasztó ampulla típus a jobb: üveg vagy
műanyag. Az üvegbe semmilyen körülmények között nem kerülhet
be a folyékony N 2 , míg a csavaros tetejű műanyagba – legalábbis
kllő kellő elővigyázatosság á híján – igen; viszont az üveg leforrasztása
speciális berendezést igényel, és az ilyen ampullák néha felrobbannak,
azaz igen balesetveszélyesek.
A műanyag csövecskék kupakját minden egyes lépésben külön
meg kell szorítani (anélkül, hogy a tartalom felmelegedhetne)!

A fagyasztás legnagyobb
veszélye a sej-
tekre az intracelluláris
jégképződés. Ez – értelemszerűen
– elkerülhetetlen,
az okozott kár
(sejtpusztulás) mini-
malizálására á krioprotektív
ágenst, mindenekelőtt
DMSO-t
[(CH 3 ) 2 SO] használnak.
Ha ez valamilyen
okból ellenjavallt llt (pl.
HL60 sejtekben haemoglobin
szintézist in-
dukál), helyettesíthető
glicerinnel.
(Figyeljük meg: a folyékony N 2 -es tárolóban gőz- és folyadékfázisú N 2 egyaránt
van. Az ampullatartó belógatható úgy, hogy csak az elsőbe érjen bele.)

A fagyasztva tároláshoz szükséges medium összetételére vonatkozóan
több recept is forgalomban van, ezen a helyen egyet muta-
tunk be:
az illető sejtekhez szokásosan használt medium,
20% foetalis borjúsavó,
10% DMSO,
+ a szokásos egyéb adalékok.
Lefagyasztáskor a sejtek nem 37°C-on vannak, hanem szobahőn,
így történik az öblítésük is (a trypsinből vagy EDTÁ-ból). Majd
olvadó jégbe állított tt ampullákba pipettázunk be 1 - 15 1,5 - 2 ml-t t( (a
befogadó térfogattól függően, az ampullát sohasem maximálisan teletöltve),
az előzetesen 2-4×10 6 sejt/ml-re beállított denzitású sejt-
szuszpenzióból.
Ha csavaros kupakú műanyag csövekben fagyasztjuk le a sejteket
és nem gondoskodunk a zárókupakok ismételt, maximális meghúzásáról,
előfordulhat, hogy a folyékony nitrogén, ami mindig bakte-
riálisan szennyezettnek tekintendő, bejut az ampulla belsejébe, és a
felolvasztott tenyészetet fertőzött állapotban nyerjük vissza.

Ennek elkerülésére jó az a megoldás, ha az ampullatartók csak a
gőzfázisba nyúlnak be, a -178°C-on tárolás is maximális biztonsá-
got nyújt. Ugyanakkor nagyon kényelmetlen: a folyadékfázisban
igen kevés N 2 lehet az adott tárolóedényben, sűrű utántöltésre van
szükség. Ennek során viszont nehezen kerülhető el, lhogy az ampullákra
valamennyi folyékony nitrogén rá ne folyhasson.
Bármelyik ampullaféleségről legyen is szó, célszerű ezeket a kivétel
után azonnal 37°C-ra felmelegített 70%-os etanolba mártani és
intenzíven mozgatni a teljes felolvadásig, majd gázlángon g áthúzás
(= külső leégetés) után nyitni ki. A sejtszuszpenziót csakis steril
pipettával lehet kinyerni az ampullából (nem pedig kiönteni).
Üveg ampullák felolvasztása l esetén a vonatkozó munkavédelmi
óvórendszabályokat (védőkesztyű, -álarc) be kell tartani, mert
ezek könnyen felrobbanhatnak a melegítés hatására. Felnyitás:
mint az injekciós készítményeknél. Műanyag csövecskéknél gondolni
kell a zárókupak ismételt meghúzására még a felolvasztás
megkezdése e előtt ő (nehogy az etanol* bejuthasson a belső térbe). ébe)
* Mint említettük, a 70%-os etanol nem tekinthető csíramentesnek, hacsak
előzetesen sterilre nem szűrtük, ami itt erősen ajánlott. Ugyanakkor: toxikus.

A felolvasztott szuszpenziót egyesek szobahőn levő, mások
előmelegített mediummal hígítják fel (egyszerre vagy lé-
pésenként). A lényeg: mielőbb kimosni a DMSO-t (vagy
glicerint) a sejtekből, mert az rendkívül toxikus. Ehhez
savót tartalmazó mediummal történő két-három átmosás
szükséges, majd a sejtek a végső tápközegükbe és tenyész-
tőedényükbe kerülnek.
k
Az eljárást reggeli – kora délelőtti órán célszerű elkezdeni,
majd mikroszkópos kontrollal ellenőrizni a sikerességet.
Ez az adherencia dependens tenyészetek esetén a jó kiterülést
és letapadást jelenti. Ha ezek a sejtek kitapadtak, még
aznap délután mediumcserét kell végrehajtani, majd másnap
reggel újból. A felolvasztás utáni napon a szuszpenziós
tenyészeteken is tápfolyadékot kell cserélni.
A sejtek visszanyerése messze nem 100%-os. Eldönthetetlen
kérdés, hogy a veszteségek a lefagyasztás vagy a felolvasz-
l
tás során keletkeznek-e. (Nyilván mindkettő…)

Miért tenyésztünk sejteket in vitro
Erre a kérdésre itt nem lehet válaszolni! l Ahány sejttenyésztő tő laboratórium,
annyiféle cél, feladat. Molekuláris sejtbiológia ma már
lb
elképzelhetetlen sejttenyésztő laboratórium nélkül, ugyanúgy a mo-
lekuláris genetika. De a hagyományos (és nem annyira rutin, pl.
amniocentesisből származó anyag) citogenetikai vizsgálatok is in
vitro sejttenyésztést tétié igényelnek. kAfl felsorolás lá a végtelenségig étl éi folytatható.
Amit még feltétlenül fel kell idézni a megelőzőekben már említettek
közül: vírusdiagnosztika, vakcinák készítése, monoklonális ellen-
fltt
anyagok előállítása (és nagyüzemi gyártása). Gyógyszerek (egyéb
xenobiotikumok) esetleges mutagenitásának és/vagy toxicitásának
tesztelése, ill. hatásmechanizmusának vizsgálata (sok állatkísérlet
megspórolható ezáltal).
In vitro tenyésztett emlős (és alkalomadtán nem csak ilyen, hanem
pl. rovar vagy akárha növényi) sejtek alkalmasak lehetnek olyan
terápiás célú fehérjék előállítására, amelyek bakteriális rekombináns
technikával nem készíthetők (pl. helyspecifikus glikozilálás).

Hogyan szerezhetünk sejteket
Az eddig előadottakból világossá kellett váljon, hogy saját speciális
céljainknak leggyakrabban a magunk által indított primer sejtkultúrák
felelhetnek meg.
Más esetekben viszont jók a megalapozott sejtvonalak (sejttörzsek),
amelyek megvásárolhatók kommerciális forrásokból, ill. beszerez-
hetők kollegiális ajándékként. Mindkét esetben rendkívül fontos,
hogy egy majdani, ezekre alapozott közleményben (szabadalomban
stb.) az eredetnek és az egyéb vonatkozású pontos specikikáci(ók)-
nak szerepelniük kell (a saját metodikai leírás mellett).
Hogyan kerülhetnek ezek a sejttenyészetek a mi sejtlaborunkba
Lefagyasztott sejteket tartalmazó ampullák szárazjégben meglehetősen
biztonságosan szállíthatók: a CO 2 hó/jég hőmérséklete ≈-79°C
elég alacsony a sejtek megmaradásához, áh és ezt egészen megbízhatóan
tartja, ingadozások nélkül, ami különösen fontos szempont ilyen
relatíve „magas” hőmérséklet esetén. (A folyékony N 2 természetesen
jobb, de nehézkes termoszban szállítani, nem küldhető pl. postán.)

A tenyésztett emlős sejtek általában jól
tolerálják a szobahőn tartást. Ha letapadva
proliferáló sejteket akarunk nagyobb
távolságra küldeni (vinni), azokat
leoltjuk egy jól zárható tenyészedénybe,
kb. 50%-os denzitásig növesztjük (eköz-
ben meggyőződünk arról, hogy rendben
vannak), majd a flaskát teljesen feltöltjük
meleg mediummal, a kupakot erősen
rászorítjuk és a mellékelt ábra szerint
parafilmmel is lezárjuk, lassan hagyjuk
lehülni szobahőre. Hűteni nem szabad!
Hasonló módon szuszpenziós tenyészetek
is szállíthatók, de azoknak elég egy jól
záródó centrifugacső is.
Szükség esetén (pl. CO 2 termosztát tisztítása)
a sejttenyésztő laboron belül is
megoldás lehet ez a tárolási mód.

Sors bona, nihil aliud.