You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
IPARI ENZIMEK 2.<br />
1.1. Proteázok<br />
• 6200 t tiszta enzim/év<br />
• Mosószeripar, tejipar, gyógyszeripar, bőripar, élelmiszeripar<br />
• Fehérje hidrolizátum: tápoldat, infúzió. Élelmiszer<br />
• Peptid kötéseket bont (létrehoz) (Hidrolízis-szintézis)<br />
• Aktiválás proteolízissel: pepszinogén, tripszinogén, proinzulin, véralvadás<br />
• Fehérje lebontás: élelmiszer, tejalvadás, mosó<strong>enzimek</strong>, infúzió, vérrögoldás<br />
• Fehérje/peptid szintézis: aszpartám előállítás<br />
1.1.1. Alkalikus proteázok<br />
Jellemzői<br />
• Szerin proteáz<br />
• Mosószer-proteáz<br />
o Jó detergens és<br />
o hőstabilitás<br />
o Jól bírja a lúgos közeget<br />
o Nagy a kelát és perborát stabilitása<br />
Termelő mikrobák:<br />
• Streptomyces nemzetség<br />
• Aspergillus nemzetség<br />
• B. amyloliquefaciens: szubtilizint termel, ami egy szerin proteáz és amely<br />
reverzibilis acilezésre képes<br />
Screening<br />
• pH = 10-es fehérje-agaron szélesztéssel<br />
Törzsjavítás<br />
• Célja: az adott törzs több enzimet termeljen (Génsebészet és a protein engineering)<br />
1.) erős promótert teszünk az adott gén elé<br />
2.) multikópiás plazmid: az adott gén több példányban legyen jelen<br />
• törzsjavítással foglalkozó cégek: NOVO, GIST-BROCADES, PROCTER-<br />
GAMBLE<br />
Fermentáció<br />
• Fed batch fermentáció<br />
• NH 4 és aminosav koncentrációra figyelni kell, alacsonyan kell tartani az egész<br />
fermentáció alatt<br />
• Nagy oxigén bevitel kell: 1 VVM , 48-72 h<br />
• 1971-ben allergia krízis: mivel ezek por állagúak voltak allergiát okoztak így gyöngyszemcsézték<br />
őket, ezzel elkerülve allergén hatásukat.<br />
• Stabilitásuk érdekében kutatások folytak melyek bebizonyították, hogy a Met 222<br />
(mely a stabilitásért felelős) Ser-re cserélve jobb aktivitást tapasztaltak de stabilitása<br />
nem volt jobb.<br />
1
1.1.2. Neutrális proteázok<br />
Jellemzői<br />
• Olyan fehérjebontó enzim, amely semleges pH-n dolgozik<br />
• Érzékeny: hőre<br />
o Stabilizátorokra CaCl 2 , NaCl<br />
o Alkalikus proteáz gyorsan lebontja<br />
Termelő mikrobák<br />
• Bacillus subtilis<br />
• Str. griseus<br />
• Aspergillus oryzae<br />
Felhasználás<br />
• Élelmiszeripar: kenyér, keksz gyártás<br />
• Bőripar:<br />
Szőrtelenítésre használják mivel a bőr is egy fehérje ezért ennek egy irányított<br />
folyamatnak kell ennek lennie<br />
Régen emberi fekáliával kezelték a bőröket - emberi emésztő <strong>enzimek</strong><br />
1.1.3. Savas proteázok<br />
Jellemzői<br />
Cys proteáz<br />
Enzimek, melyek hasonlóak a pepszinhez (pH opt =2-4), ilyen papain, bromelin<br />
Felhasználás<br />
• Emésztést elősegítő<br />
• Szója szósz előállítás<br />
• Glutén hidrolizátum<br />
Rennin = chimozim = gasztriktin<br />
Jellemzői:<br />
• (enyhén) savas proteáz<br />
• Sajtgyártás legfontosabb enzime.<br />
• Ez egy alvasztó enzim, Asp van az aktív centrumban tehát aszparagin-proteáz<br />
• 3-4 hetes borjú gyomorban található pre-pro chymozin formában<br />
• Izoenzim: chymosin A 244. aminosav Asp, 40%, nagyobb az aktivitása<br />
chymosin B 244. aminosav Gly, 60%,<br />
A tehénben vagy A illetve vagy B van<br />
A megnövekedett igényt nem tudták fedezni( 64 Mt sajt gyártása évente), ezért arra<br />
törekedtek hogy valahogy megpróbálják pótolni a hiányzó mennyiséget.<br />
Pótlással többféleképpen próbálkoztak:<br />
1) állati pepszinek (csirke pepszinIzrael, Csehország)<br />
2) savas penész proteázok<br />
• M. miehei<br />
• M. pusillus<br />
• Endothia parasitica kereskedelmi készítmény 1937 (SUPRAREN USA,<br />
Franciaország)<br />
• Ez is egy savas proteáz (pH = 4-5,5)<br />
• Hőstabilitása viszonylag nagy, ez itt nem jó tulajdonság, megmarad az<br />
aktivitás a hőkezelés után is.<br />
• Extracelluláris enzim, kicsapódhat<br />
2
3.) Rekombináns DNS technika<br />
1980 elején a borjú renin gént klónozták RENNET R szabadalmaztatták és<br />
engedélyeztették<br />
Gazdaszervezet:<br />
• E. coli: az enzim oldhatatlan „inclusin body” formába van,<br />
• Az összfehérje 15-20%-a rennin<br />
• probléma, hogy nem élelmiszeripari mikroba,<br />
veszélyesnek minősül<br />
• B. subtilis: élelmiszeripari mikroba, de glikozilálja az enzimet<br />
• Kluyveromyces lactis<br />
• Élelmiszeripari, SCP tejsavón<br />
• 1950-60-ban savóból izolálták<br />
• A tejiparban használatos béta–galaktozidázt ezzel termelte<br />
a Gist- Brocades<br />
• Aktív enzim szekrécióval rendelkezik<br />
• 1988-tól ezzel termeltették az enzimet (Franciaország:<br />
Gist- Brocade, Hollandia)<br />
• Rekombináns K. lactis előállítása<br />
8. ábra Plazmid<br />
A fenti ábrán látható ez a plazmid. Az expressziós vektorba beleraktak egy<br />
laktóz promóter régiót, laktóz terminátor régiót, pro-chymosin DNS-t, egy<br />
transzpozont és egy szignál-peptid részt is. Az élesztő alfa-faktor leadert, mint<br />
szignál szekvenciát használva a prochymosint extracellulárisan termeli.<br />
Mivel a törzs kevés extracelluláris fehérjét termel, könnyű a rennint izolálni:<br />
Prochymosin chymosin MAXIREN R<br />
3
Scale up: könnyű mert ezzel az enzimmel termelték a β-galaktozidázt (bár az<br />
intracelluláris enzim volt).<br />
Élő sejtet nem tartalmazhat a termék, ezért azokat benzoesavval megölik,<br />
alacsony pH-n és szűrik, közben a fenti reakció végbemegy. A termék tartósítását<br />
benzoesavval vagy NaCl-dal végzik, a lényeg az, hogy DNS-t nem tartalmazhat.<br />
Régebben plazmidos rekombináns élesztővel termeltették a prochymosint, ma<br />
a prochymosin gént a kromoszómába építették be.<br />
MAXIREN R :<br />
• Tisztább, mint a borjú rennin, nincs kísérő enzim (pepszin+ egyéb)<br />
• A rennintel kémiailag és biológiailag teljesen azonos<br />
• Ez kereskedelmi termék az egész világon.<br />
• Termelése olcsó<br />
• Állandó tisztaságú, mentes állati szervmaradványoktól<br />
• Mennyisége korlátlan<br />
• 1988-tól ipari termelés Seclinben Franciaországban, ez az üzem ISO 9002<br />
Bizonyítvánnyal rendelkezik rekombináns tenyésztésére. Sőt kóser<br />
engedéllyel is rendelkezik, oly módon, hogy növényi, vegetáriánus<br />
élelmiszernek minősítették termékeiket.<br />
Az engedélyeztetés nehéz volt sok mindent figyelembe vesznek: DNS stabilitást,<br />
patogenitást, mutagenitást, toxikusságot. Etetési tesztnek kell megfelelni. Sajtgyártási<br />
teszteket is csinálnak. Organoleptikus vizsgálatokat, valamint allergológiai<br />
vizsgálatokat is. Valamint az EC előírásokat be kell tartani, melyek a termelésre és a<br />
termékre vonatkozik.<br />
A sajtgyártás technológiái<br />
Ez az első termék amelynél enzimet és mikrobát is használnak évek óta.<br />
A fontos tej fehérjék:<br />
Fehérje %<br />
Foszfát csoportok<br />
molekulánként<br />
Kazein<br />
alfa s1-kazein 32 8<br />
alfa s2- kazein 8 10-13<br />
béta-kazein 32 5<br />
kappa-kazein 8 1-2<br />
80<br />
Savó fehérjék<br />
béta-laktoglobulin 12 0<br />
béta laktalbumin 4 0<br />
immunglobulin 3 0<br />
szérum albumin 1 0<br />
20<br />
Hőstabil P miatt<br />
kalcium kötő.<br />
Micella képző<br />
Ezek ultraszűréssel<br />
eltávolíthatók<br />
4
0,1 kalcium jelenlétében a kazein micellában van mely a következő ábrán látható:<br />
9. ábra Kazein micellában<br />
Rennin hatás:<br />
1.fázis: κ-kazein hidrolízise<br />
10.ábra κ-kazein hidrolízise<br />
5
11.ábra Aktív chymosin előállítása<br />
A rennin fenilalanin-metionin hasítást csinál, mely hatására keletkezik két fehérjedarab<br />
és ez a vágás destabilizálja az egész szerkezetet.<br />
2. fázis : koaguláció, mely a hőmérséklettel és a kalcium ionokkal nő<br />
Sajtérlelés:<br />
Bizonyos sajtokat érlelni kell (4 hét-2 év), az idővel fordított arányban<br />
változik a víztartalom. Valamint előfordulhatnak: kémiai, biokémiai,<br />
mikrobiológiai változások.<br />
• Ha tejcukor maradt a rendszerben és mikrobák beleesnek akkor<br />
rossz ízt produkálnak<br />
• Sok szabad zsírsav keserű ízt ad<br />
• A fehérje bomlás folyamatos<br />
1.1.4. Fémproteázok<br />
Thermolizin az aszpartám gyártás fontos enzime.<br />
Törzsizolálás: meleg helyekről<br />
• BOC:Benzil-oxi-karbonil-származék, mely hidrogénezéssel eltávolítható<br />
• Egyébként:random dipeptidek és oligopeptidek képződnek<br />
Aszpartám gyártás<br />
6
Az aszpartám egy mesterséges édesítőszer, ami a fenilalanin metilészterének és<br />
aszparaginsavnak a kondenzációjával keletkezik a Thermolizin segítségével.<br />
Ahhoz, hogy a fenilalanin-metilészter aminocsoportja reakcióba lépjen az aszparaginsav<br />
karboxil csoportjával a rajtuk lévő másik funkciós csoportokat blokkolni kell.<br />
A metilészter a karbonsavat alapból blokkolja az aszparaginsav aminocsoportját pedig egy<br />
benzoil-oxi-karbonil (BOC) csoporttal blokkolják.<br />
Tehát a szintézishez szükséges:<br />
1) L-aszparaginsav<br />
2) Fenilalanin a fenilalanin nem baj , ha racém, mert az enzim amúgyis csak az L<br />
konformációkat kapcsolja össze, a D-fenilalanin csapadékot képez az aszpartámmal,<br />
ami kiszűrhető.<br />
3) Ebből a kettőből a thermolizin enzim hatására csapadék keletkezik, a reakció közel<br />
semleges pH-n és 50°C-on megy végbe.<br />
4) A csapadékot elválasztják<br />
5) Majd visszaoldják.<br />
Az enzimes kezelés előnyei:<br />
• Nincs β -izomer képződés<br />
• Az enzim tökéletesen sztereoszelektív: racém Phe is használható<br />
• Nincs racemizáció a szintézis alatt<br />
• A reakció vizes közegben végrehajtható<br />
7
12.ábra Aszpartám előállítás<br />
• Oldott enzimet használnak<br />
• Vizes fázis<br />
• Fermentáció:<br />
o Szakaszos keverős reaktor<br />
o pH=7-7,5<br />
o T=50°C<br />
1.2. Lipáz<br />
A zsírok fizikai tulajdonságai a zsírsav komponensektől függnek.<br />
Ezek a tulajdonságok változnak:<br />
• Frakcionált kristályosításkor:szilárd és folyadék frakció<br />
• Hidrogénezéssel: telítetlen telített, o. p. növekedés: margaringyártás<br />
• Átészterezés: kémiai: statisztikus folyamat<br />
Enzimes: irányítható régióspecifikusság<br />
Jellemzői<br />
• A lipázok a zsírok módosítását végzik, az észter kötéseket hidrolizálják<br />
A hidrolízis sebessége eltérő, függ: a hossztól, a telítetlen kötésektől valamint más<br />
sebességgel hidrolizálják a glicerin szélső és a középső észtereit.<br />
• A növényolaj ipar, zsíripar számára káros a lipáz hatása, itt célszerű a lipázokat távol<br />
tartani.<br />
8
• Az átészterezési reakciókban fontos szerepet játszanak, a trigliceridben lévő kötött és a<br />
szabad zsírsavak statikus folyamatban kicserélődnek és egyensúly alakul ki.<br />
• Extracelluláris enzim<br />
• Induktora a növényi olaj<br />
• Represszora a glükóz és a glicerin<br />
• Szubsztrát specifitás<br />
• Zsírsav specifikusság: nem erős, de a specifikusság mértéke függ: a<br />
zsírsav hosszától és a telítetlen kötések helyétől és számától<br />
• Glicerin specifikusság<br />
a) egyes <strong>enzimek</strong>nél nincs glicerin specifikusság, a kémiai<br />
reakcióhoz hasonlóan ez is egy statisztikus átészterezés vagy<br />
bontás. (Candida nemzetség)<br />
b) Regiospecifikusság: 1, 3-ra specifikus:.Mucor és Rhizopus<br />
nemzetség tagjai<br />
• Használják immobilizált enzimként vagy makropórusú hordozóhoz rögzítve (diatómaföld,<br />
akrilát, poli-propiléngyanta)<br />
Termelő mikroorganizmusok:<br />
• Aspergillus nemzetség<br />
• Mucor nemzetség<br />
• Rhyzopus nemzetség<br />
• Candida nemzetség<br />
Felhasználás<br />
• Emésztést elősegíti (pankreász lipáz pótló)<br />
• Sajtérlelésben: ízjavító (P.raquefartii spóra)<br />
• Szappan ipar (Candida lipáz)<br />
• Átészterezés, észterképzés<br />
Átészterezés folyamata:<br />
Ezekben a kétfázisú rendszerekben fontos szerepe van a víznek.<br />
Ha a víz koncentrációja nagy(vizes fázis) hidrolízis<br />
Ha a víz koncentrációja kicsi(szerves fázis)szintézis<br />
Zsírok átészterezése:<br />
a) Trigliceridek között<br />
9
) Triglicerid és zsírsav között<br />
A hozzáadott zsírsav beépül és „új zsír” képződik.<br />
10
Esettanulmány:<br />
Pálmaolaj (olcsó) kakaóvaj (drága)<br />
Triglicerid Pálmaolajban%<br />
Enzimes termék<br />
%<br />
Kakóvaj<br />
%<br />
StStSt 5 3 1<br />
POP 58 16 16<br />
POSt 13 39 41<br />
StOSt 2 28,5 27<br />
StLnSt 9 8 8<br />
StOO 4 4 6<br />
St = sztearát (18)<br />
P = Palmitát (16)<br />
O = Oleát (18)<br />
Ln = Linolát (18)<br />
A kakóvaj már testhőmérsékleten olvad:<br />
- élelmiszerek<br />
- kúpok<br />
Aroma anyag előállítás<br />
Észter előállítása lipáz enzimmel (Candida antaretica)<br />
11
15.ábra Észter előállítása lipáz enzimmel<br />
• i-propanol az oldószer<br />
• pH=7<br />
• T= 60°C<br />
• Immobilizált enzim<br />
• Hozam:99%<br />
Probléma:<br />
A képződő víz eltávolítása, itt szintézisről van szó.<br />
a) azeotróp desztillációval, a propanolt folyamatosan táplálják a reaktorba<br />
b) pervaporáció<br />
i-propil–mirisztát alkalmazása: szapan, kenőcs, bőrkrém előállítása<br />
Az eljárás alkalmas más észterek előállítására is. Gyártó:UNICHEM (Hollandia)<br />
1.3. Penicillin aciláz<br />
• G penicillin 6-amino-penicillánsav + fenilecetsav<br />
• Félszintetikus penicillin előállítása a 6-amino-penicillánsavból történik.<br />
• Enzimfermentáció<br />
• E.coli ATCC III05 mutáns<br />
• Fenil-ecetsav adagolás:induktív enzim<br />
12
• Glükóz katabolit represszió<br />
• Oxigénlimit szükséges a jó enzimtermeléshez<br />
• Intracelluláris enzim alkalmazása esetén a sejteket nagynyomású homogenizátorral fel<br />
kell tárni.<br />
Penicillin hidrolízis:<br />
a) sejttömeggel szakaszos hidrolízis<br />
• Penicillin+sejt pH=8, 37°Chidrolízis<br />
• Szűrés, pH = 2 6APA extrakció(metil-izobutil keton)<br />
• 6-APA kicsapás izoelektromos ponton, pH = 4, 3<br />
b) Immobilizált sejttel vagy enzimmel. Előny: ár, tisztaság<br />
1.4. Fitáz<br />
• Fitinsav: mezoinozit-hexafoszfát<br />
• Fitin: a fitinsav Ca v. Mg sója<br />
• növényi sejtfal komponense<br />
• Állattartás: nagy mennyiségű trágya N és P tartalma nagy probléma, mert eutrofizációt<br />
okoz<br />
• Növényi fitin P az állat ezt felhasználja. De a sertés és a csirke gyomra nem termel<br />
fitázt. Így vagy foszfort vagy fitázt kell a takarmányhoz adni.<br />
Termelő mikroorganizmusok:<br />
Asp. niger kis mennyiségben termeli, gazdaságtalan. A Gist-Brocades 1985 táján<br />
klónozta a gént glüko-amiláz promóter szekvenciához, és ezt a „kazettát” integrálták<br />
statisztikusan Asp. niger genomjába. Ennek az lett az eredménye, hogy a titer jelentősen<br />
megnőtt, a termelés gazdaságossá vált. Szűrés után koncentrálás: folyadék (ultraszűrés+<br />
szorbit). Por: búzakorpa hordozó<br />
NATUPHOS R = nem kell foszfort adni a takarmányba és a trágya foszfor tartalma 25-30%-<br />
kal csökken.<br />
13
Change language