Sohajda Tamás - Cyclolab

Ciklodextrin komplexképzésen alapuló
királis elválasztás vizsgálata kapilláris
elektroforézissel
Sohajda Tamás
Cyclolab Ciklodextrin Kutató-Fejlesztő Laboratórium Kft.
1097. Budapest, Illatos u. 7. cyclolab@cyclolab.hu
www.cyclolab.hu

CE készülék vázlatos felépítése

Az EOF és a látszólagos
mozgékonyság
EOF kialakulása
A látszólagos
mozgékonyság
v ld
ld
⋅lt
l
µ = = =
d
⋅l
⎛
t
1 1
µ
eff
= ⋅
E tm
⋅ E tm
⋅U
⎜ −
U ⎝ t t
EOF
⎞
⎟
⎠

Elektroforézisen alapuló eljárások
összefoglalása
Módszer Kapilláris Az elválasztás alapja Alkalmazási lehetőségek
Kapilláris
zónaelektroforézis (CZE)
módosított / nem
módosított
ionmozgékonyság
sokrétű alkalmazás
Micelláris
elektrokinetikus
kromatográfia (MEKC)
nem módosított
az elektrolit és a micellák
közötti megoszlás
sokrétű alkalmazás
Kapilláris
gélelektroforézis (CGE)
módosított és
töltött
a részecskék
elektroforetikus vándorlása
és a közeg molekulaszűrő
hatása
fehérjék molekulaméret
szerinti elválasztása
Kapilláris izoelektromos
fókuszálás (CIEF)
módosított / nem
módosított
izoelektromos pont
amfoter sajátságú anyagok
elválasztása
Kapilláris izotachoforézis
(CITP)
nem módosított ionmozgékonyság híg oldatok dúsítása a CZE-t
megelőzően
Kapilláris
elektrokromatográfia
(CEC)
töltött kapillárisok
elsősorban az állófázissal
történő kölcsönhatások
általában megegyezik a
HPLC-nél ismertekkel

nagy felbontóképesség (N > 10 5 – 10 6 )
rövid analízis idő (ált. 30’, de akár 5’ alatt)
széles körben változtatható paraméterek
(pH, c(puffer, adalékok), ionerősség, T, U)
gyors módszerfejlesztés (kond.: 2-10')
egyszerű mintaelőkészítés
kicsiny mintaigény (injektálva 1-50 nl)
Kapilláris elektroforézis
hidrodinamikus és elektrokinetikus injektálás
vizes vagy nemvizes puffer
magas szintű automatizáltság (replenishment)
Gyors,
Egyszerű,
Olcsó
UV detektálás kapillárisban (v. indirekt, F, LIF, Amp., Vez.kép., MS)

A kapilláris elektroforézis analitikai
kémiai alkalmazásai
Kisméretű ionok:
Szervetlen anionok és kationok
Szerves anionok és kationok
Alkoholok, fenolok, szénhidrátok
Aminosavak, peptidek,
oligopeptidek
Nukleozidok, nukleotidok
Vitaminok, toxinok
Növényvédőszerek,
gyógyszerhatóanyagok
Nagyméretű ionok:
Fehérjék
Nukleinsavak és
fragmentjeik
Vírusok és sejtek
Nanorészecskék

Királis kapilláris elektroforézis
Gyors, egyszerű és olcsó analitikai módszer
Királis szelektorok: ciklodextrinek, koronaéterek,
makrociklusos antibiotikumok, fehérjék, micellák - számuk
egyre növekszik
A ciklodextrinek és származékaik a leggyakrabban alkalmazott
királis puffer adalékok.
Több mint 4000 publikáció alkalmaz ciklodextrineket
kapilláris elektroforézisben (utóbbi 15-20 év).
Enantiomerarány és királis nyomszennyezés meghatározás
Enantiomer sorrend megváltoztatás

A királis kapilláris elektroforézis
alkalmazási területei I.
Enantiomerek elválasztása fontos különböző biológiai
aktivitásuk miatt
Az enantiomerek szelektív elválasztására folyamatosan
növekszik az igény a tudomány és az ipar területén:
• természetes királis anyagok analitikája
• enantioszelektív szintézisek analitikája
• gyógyszerhatóanyagok (pl. profének, béta-blokkolók, stb.)
• farmakokinetikai vizsgálatok
• agrokémiai anyagok (pl. herbicidek)

Enantiomerek elválasztása egyéb
ipar- és tudományterületeken:
• Kozmetikai ipar (illatszerek,
parfümök)
• Élelmiszeripar (bakteriális
fertőzések)
• Környezetvédelem (szennyezések
biodegradációja)
• Régészet (kormeghatározás)
• Űrkutatás (Murchison meteorit,
MOD I-II-II)
A királis kapilláris elektroforézis
alkalmazási területei II.
Murchison meteorit

OH
H
H
O
O
HO
O
OH
H
H
H
H
OH
H
H
H
O HO
OH
H
H
H
HO
O
OH
H
H
O
H
OH
H
H
O
O
OH
HO
H
OH
H
HO
H
H
O
H
H
H
OH
H
β-ciklodextrin
OH
H
O
OH
H
H
H
O
Ciklodextrinek, mint királis
szelektorok
HO
HO
O
H
OH
O
H
H
H
H
OH
O
H
OH
Apoláros üreg
Zárványkomplex képzés
Felhasználás
oldékonyság (+)
stabilitás (+)/(-)
biohasznosíthatóság (+)
peptidaggregáció (-)
mellékhatás, irritáció (-)
királis szelektor (+)

CD származékok csoportosítása
Ciklodextrin
töltése
Elválasztható
enantiomer
Ciklodextrin
származékok
semleges ionos α-,β-,γ-CD, alkil-,
hidroxialkil-, acetil-CD
negatív ionos karboxi-alkil-, szukcinilés
semleges szulfatált-, szulfoalkil-,
pozitív
- flexibilis, de nem szelektív
ionos
és semleges
- a stabilitási állandó megváltoztatása
- a „belső” szelektivitás növelése
A származékolás célja:
foszfatált-CD
amino: pri., szek., terc., kvat.,
- a mozgékonyság-különbség növelése a szabad és komplexált formák között

A ciklodextrinek zárványkomplexeket képeznek általában 1:1
sztöchiometriával.
K a : 10 – 10000 M -1
A zárványkomplex képzés
+
gazdamolekula
vendégmolekula
komplex
A zárványkomplex képzés sémája: a ciklodextrin hidrofób üregében
elhelyezkedő vízmolekulákat kiszorítja a hidrofób vendégmolekula

A koleszterin – β-ciklodextrin
komplex térbeli szerkezete
oldal és felülnézetből
Komplexképzés

( µ − µ )
i
eff
µ
i
eff
[CD]
=
free
µ + µ
free
Látszólagos komplex-stabilitási állandók
meghatározása
cplx
1+
K[CD]
K[CD]
Linearizáció (x-reciprok módszer):
EOF kialakulása
i
( µ
eff
− µ
free
)
i
= − K( µ
eff
− µ
free
) + K( µ
cplx
− µ
free
)
[CD]
Ábrázolás:
A látszólagos
mozgékonyság
µ =
v
E
versus
=
t
l
m
d
⋅ E
=
( µ − µ )
t
l
d
m
⋅l
⋅U
i
eff
t
free
µ
eff
ld ⋅l
⎛
t
1 1
= ⋅⎜
−
U ⎝ t t
EOF
⎞
⎟
⎠

Stabilitási állandók
meghatározása
(pH=9,2 Tos-Preg + HP-α-CD)
75 mM
EOF
Tos-Preg
CH 3
H 3 C
O
HO
CH 3
S O
NH
O
40 mM
20 mM
10 mM
CD nélkül
2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
t (perc)

x-reciprok módszer
µ − µ
eff
[ CD]
szabad
µ
eff
=
µ + µ
szabad
K [ C D ]
[ ]
kplx
1 + K C D
µ − µ
eff
szabad
Rundlett K. L., Armstrong D.W.: J. Chromatogr. A 721 (1) 173-186, 1996.

Kiralitás
C H 3
O
O
H
N
aszpartám (Asm)
(Nutrasweet®)
O
O
NH 3
+
O -
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
43%
36% 34%
41%
34%
25% 39% 42%
41% 58%
32%
25% 24% 18%
8%
1983-1986 1987-1990 1991-1994 1995-1998 1999-2002
Racemát Tiszta enantiomer Nem királis
NH 2
*
H 3 C
CH 3
OH
O
pregabalin (Preg)
(Lyrica®)
CH 3
N
O
O
CH 3
F
N
N
F
N
F
N
F
C H 3
N CH 3
O
N H
F
NH 2
O
vinpocetin
F
szitagliptin (Sgli)
(Januvia®)
dapoxetin (Dpx)
(Priligy®)

Kiindulás: µ R
= µ S
= µ free
CD típusú szelektor hozzáadásával a mozgékonyság-különbség:
Két feltételnek kell teljesülnie:
A királis elválasztás
követelményei
[ CD]( µ − µ )( K − K )
eff eff
free cplx S R
R S 2
∆µ = µ − µ =
1 + CD K + K + K K CD
[ ]( ) [ ]
R S R S
1. - legalább az egyik enantiomer esetén legyen:
μ szabad
≠ μ komplex
2. - a komplexek mozgékonyságai különbözzenek:
μ S,kplx ≠ μ R,kplx (K S ≠K R )
μ R,S,szabad
: nem komplexált enantiomerek mozgékonysága
μ kplx
: komplexált enantiomer mozgékonysága
μ R,S eff : enantiomerek effektív mozgékonysága
K S ,K R : enantiomerek stabilitási állandói

Az elválasztást befolyásoló
főbb tényezők
Ciklodextrin koncentráció (viszkozitás, felbontás, stb.)
pH (protonáltsági állapot, EOF mobilitás)
Alkalmazott feszültség (mobilitás)
Puffer koncentráció (ionerősség)
Hőmérséklet (viszkozitás, komplex stabilitás)
Szerves adalékanyag (stabilitás, viszkozitás, adszorpció)
Az elválasztás jellemzése: felbontási érték (R S
), szelektivitás (α)

A Wren-féle mozgékonyság-különbség
elmélet
[ CD]
opt
∆µ
=
K
1
R
K
K [CD] opt
1000 M -1 1 mM
100 M -1 10 mM
10 M -1 100 mM
S
∆µ (cm 2 *V -1 s -1 )
Δμ (cm 2·V -1·s -1 )
2,5E-06
2,0E-06
1,5E-06
1,0E-06
5,0E-07
0,0E+00
K R = 10
K S = 11
A maximum eltolódik
K R =10 ; K S =
11
K R = 100
K
K R =100 ; K S = S = 110
110
K R = 1000
K R =1000 K S = 1100 ; K S =
1100
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
Szelektor koncentráció (M)
Concentration of selector (mM)
K növekszik
Wren S.A.C. és Rowe R.C.: J. Chromatogr. 603 235-241, 1992.

Stratégia
pH kiválasztása:
CE → ionizált részecske → pK s függő pH választás
bázis: pH 2.5 – 3; sav: pH > pK s ; semleges: pH 2.5, 7.2, 9.2
Ciklodextrin kiválasztása:
Üregméret-függés → α-, β-, γ-CD származékok (natív, HP- vagy metil)
Szubsztituens-függés → natív-, semleges-, pozitív- és negatív CD-k
Optimalizálás:
pH, CD konc., puffer konc., hőmérséklet, feszültség, szerves adalék
CD-ek kombinálása – duál rendszerek

50 mM PA-β-CD
Az elválasztás CD
koncentráció függése
(pH=9,2 Tos-Preg + PA-β-CD)
EOF
Tos-Preg
CH 3
H 3 C
O
HO
R s = 0,61
CH 3
S O
NH
O
25 mM PA-β-CD
R s = 1,12
S
R
10 mM PA-β-CD
R s = 1,45
3,3 3,8 4,3 4,8 5,3
t (perc)

H
NH
O
Az elválasztás CD koncentráció
függése
O
CH 3
(Vinkadifformin + RAMEB-CD)
c CD
75 mM
N
CH 3
-
+
R S = 2,09
50 mM
R S = 1,75
25 mM
R S = 1,7
10 mM
R S = 1,12
5 mM
R S = 0,6
0 mM
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 t (perc)

pH = 9,2
EOF
Dns-Preg
S
Az elválasztás pH-függése
(Dns-preg + DIMEB-CD)
R
H 3 C
N CH 3
O S
NH
CH 3
H 3 C
R s = 1,11
HO
O
O
pH = 7,2
R s = 0,57
pH = 4,7
R s < 0,1
3,3 3,8 4,3 4,8 5,3
pH = 2,5
R
S
R s = 3,75
28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
t (perc)

Enantiomer sorrend megfordulás
(Vinkadifformin + RAMEB/RAMEG-CD)
NH
O
H
N
O
CH 3
75 mM RAMEB-CD
CH 3
50 mM RAMEG-CD

Szennyezésvizsgálat
(Tos-preg + PA-β-CD)
O
CH 3
S O
NH
CH 3
H 3 C
HO
O
(S)
0,1% enantiomer
szennyezés
(R)
7,5 7,7 7,9 8,1 8,3
idı (perc)

Duál CD rendszerek
Ionos + semleges/ionos CD
Cél: minél szélesebb „elválasztási ablak” és optimális CD arány elérése
Ionos CD: mozgékonyság (és szelektivitás) biztosítása
Semleges CD: szelektivitás (és mozgékonyság) biztosítása
Alkalmazott koncentrációk:
• függenek a stabilitási állandóktól
• ionos CD koncentráció maximálása
• semleges CD koncentráció beállítása

Imperanene „screening”
CD
Stabilitás, elválasztás
CD
Stabilitás, elválasztás
α-CD K

Duál CD rendszerek - Ipn
CD – 1 CD – 2 Felbontási érték (R S )
SB-γ-CD (5 mM) HP-α-CD (30 mM) 1,45
SB-γ-CD (5 mM) HP-β-CD DS~3 (50 mM) 0,69
SB-γ-CD (7,5 mM) HP-β-CD DS~4,6 (30 mM) 1,73
SB-γ-CD (5 mM) HP-β-CD DS~6,3 (50 mM) 2,22
SB-γ-CD (12,5 mM) PA-β-CD (10 mM) 4,47
SB-γ-CD (10 mM) SB-α-CD (5 mM) 1,72
SB-γ-CD (7,5 mM) SB-β-CD (5 mM) 0,88
SB-γ-CD (12,5 mM) SHP-β-CD (10 mM) 1,04

Köszönöm a figyelmet