Kósa János Pál - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

A postmenopausalis és glükokortikoid indukálta
csontvesztés genomikai hátterének vizsgálata
Doktori tézisek
Kósa János Pál
Semmelweis Egyetem
Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Speer Gábor egyetemi adjunktus, Ph.D.
Hivatalos bírálók: Dr. Bálint B. László, egyetemi tanársegéd Ph.D.
Dr. Várbíró Szabolcs, egyetemi tanársegéd Ph.D.
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Sasvári Mária egyetemi tanár, D.Sc.
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Korányi László főorvos, D.Sc.
Dr. Kiss Csaba főorvos, Ph.D.
Budapest
2009.

BEVEZETÉS
A primer és szekunder csontvesztés hátterében álló komplex genetikai hatások
még teljes egészében nem tisztázottak. Tudjuk, hogy a menopausat követő ösztrogén
hiányos állapotban gyorsul a remodeling, fokozódik a gyulladást mediáló citokinek
expressziója. Jelenlegi ismereteink alapján a glükokortikoidok többféle módon is
befolyásolják a csontképződést, elsősorban az osteoblastok funkciójának gátlásán
keresztül. Azonban a fent említett mechanizmusok pontos genomikai és
transzkriptomikai okait nem ismerjük.
A felnőttkori csontélettanra a remodelling folyamata jellemző, amely a felnőtt,
érett csont folyamatos átépülését jelenti. A remodelling során a csontformáció és -
reszorpció térben és időben szorosan kapcsoltan zajlik és egészséges szervezetben a két
folyamat intenzitása megegyezik. A felnőtt szervezet tehát – ideális esetben – tartani
tudja csúcs-csonttömegét, miközben a folyamatos remodelling következtében a teljes
vázrendszer megújul. A szerves és szervetlen állomány képzése több szinten szabályzott
folyamat. A csontállomány termelése és bontása végeredményben a csontsejtek, az
osteoblastok, az osteoclastok és az osteocyták jól összehangolt együttműködésének
köszönhető.
A csontszöveti remodelling összehangoltan működik (coupling), ha a csontbontás
és építés mértéke megegyezik. Az összhang felbomlásakor (uncoupling), a túlzott
reszorpció következtében nem marad elegendő csontgerenda, melyre új csont rakódhat,
vagy az osteoblastok nem képesek teljesen kitölteni a reszorpciós gödröket. A folyamat
a csont ásványianyag-tarlamának egyre nagyobb mértékű megfogyatkozásához és végül
csontritkulás kialakulásához vezethet.
A csontanyagcserét szabályozó molekulák és jelátviteli rendszerek közöl
elsősorban a csont élettani folyamatainak szabályozásában kulcsfontosságú
RANK/RANKL/OPG rendszert emelnénk ki. Az NF-κB receptor aktivátor molekula
ligandumát (RANKL) az osteoblast-vonal sejtjei és aktivált T-sejtek is termelik. A
RANKL elősegíti az osteoclast képzést, fúziót, differenciációt, aktivációt és túlélést,
ezzel is a csontreszorpció, és a csontvesztés irányába hatva. A RANKL specifikus
receptorát, a RANK-ot (NF-κB receptor aktivátor molekula) stimulálja, amely
korlátozott számú sejttípusban (progenitor és érett osteoclastok, myeloid-eredetű
2

dendritikus sejtek) expresszálódik. A RANK aktiváció a c-Jun, NF-κB, Akt/PKB
útvonalakat is magába foglaló intracelluláris kaszkád beindulásához vezet. Az
osteoprotegerin (OPG) RANKL szolubilis, a jelátvitelben szerepet nem játszó receptora.
A remodelling során kiemelt jelentősége van a szöveti RANKL/OPG hányadosnak.
Amennyiben az OPG expresszió csökken, vagy a RANKL expresszió megnő, a
csontbontás fokozódik, a remodelling egyensúlya a reszorpció irányába billen.
A csont morfogenetikus proteinek (BMP) a transzformáló növekedési faktor β
(TGFβ) polipeptid szupercsalád tagjai. A csont morfogenetikus fehérjék számos
extraszkeletális szövetben expresszálódnak, de a csontszövet szempontjából
legfontosabbak a BMP-2, -4, -6, és -7 molekulák. Alapvető funkcióik közé tartozik a
mesenchymalis sejtek differenciálása az osteoblastikus vonal irányába, elősegítve az
osteoblastikus érést és működést.
Egyéb lokálisan ható, a postmenopausás csontvesztésben jelentős szerepet játszó,
az osteoblastok által termelt interleukin-1 kettős hatású molekula. Egyfelől serkenti az
osteoblastok kollagéntermelését, másfelől részben közvetlenül, részben a reszorpciót
fokozó interleukin-6 expressziójának és hatásának erősítésével az osteoclastokat
aktiválja. Az IL-6 nagyon erős reszorpciós hatású molekula, és ezt jól példázza, hogy
IL-6 illetve IL-1 hiányos egerekben még ovariectomia hatására sem alakul ki
csontritkulás. Az interleukin-11 szintén az osteoclastok működését serkenti. A tumor
nekrózis faktor mindkét sejtre serkentő hatású, tehát a teljes remodelling folyamatát
fokozza.
Kutatásaink másik fő iránya a glükokortikoid indukálta csontvesztés molekuláris
biológiai hátterének megértése volt. A csontvesztés másodlagos okok miatt (egyéb
endokrinológiai, gasztroenterológiai hematológiai betegségek, vagy gyógyszerek) is
kialakulhat, ekkor szekunder osteoporosisról beszélünk. A szekunder csontritkulás
egyik leggyakoribb oka a gyógyszer indukálta - és ezen belül is a glükokortikoid
indukálta, - csontvesztés. Mivel a glükokortikoidok alkalmazása széleskörű, rendkívül
sok indikációjuk van. Napjainkban a nyugati felnőtt lakosság közel 1%-a orális
glükokortikoid kezelés alatt áll, ezért számos betegséghez kapcsolódhat másodlagosan
csontvesztés. A glükokortikoid indukálta csontvesztés pathogenesise komplex és
multifaktoriális. A glükokortikoid indukálta csontvesztés celluláris mechanizmusa
egyelőre részlegesen ismert. Hosszú glükokortikoid kezelésben részesülők vizsgálata
3

csökkent csont-turnovert és csökkent csontképzést igazolt. A glükokortikoid kezelés a
csontmátrixban és a csontösszetételben is változást eredményezhet, ami meghatározza a
csont törékenységét és a törések kockázatát. A postmenopausas csontvesztésben a
trabekuláris csonttérfogat csökkenése a csontreszorpció fokozódásának eredménye
lehet, ezzel ellentétben ez a jelenség a glükokortikoid indukálta csontvesztés esetében a
csökkent csontképzés miatt van. Több más tényezőknek is szerepe van a glükokortikoid
indukálta csontvesztés létrejöttében, ilyenek pl. a kalcium háztartás szabályozásának
változása és szex-hormonok. A glükokortikoid használat következtében csökken a
bélben a kalcium felszívódás és csökken a vesében a kalcium tubularis reabszorpciója
is. Elmondható, hogy a glükokortikoid indukálta csontritkulás a csont és
kalciumháztartásra kifejtett közvetlen és közvetett hatások összegeként jön létre.
Mára már közismert, hogy az immunrendszer és a csontrendszer funkcionális
kapcsolatban áll egymással. Sejtalkotóik a csontvelői mikrokörnyezetben interakcióba
lépnek és különböző citokinek termelésén illetve jelátviteli mechanizmusokon keresztül
részt vesznek egymás szabályozásában. A menopausat követő nemi hormon hiány mind
a csontszövet, mind az immunrendszer élettani folyamatait közvetve és közvetlenül
egyaránt befolyásolja, megváltoztatva ezzel komplex kölcsönhatásukat. Többek között
postmenopausas korban szignifikánsan fokozódik a gyulladásos citokinek (interleukin-
1, interleukin-6, tumor necrosis faktor) expressziója, amely az aktivált T limfocitákon
serkenti a RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) kifejeződését és
ezáltal a csontbontó osteoclastok érését, aktivitását.
Vizsgálatainkban célunk volt postmenopausas nemi hormonok hiányában
szignifikánsan változó csontszöveti expressziót mutató gének meghatározása, illetve
néhány új kandidáns génben található egypontos nukleotid polimorfizmus azonosítása
postmenopausalis nőkben. Egy aktív glükokortikoid analógnak, a dexametazonnak
(DEX) az osteoblastok életképességére és a csontfejlődésben szerepet játszó gén
kifejeződésére gyakorolt hatásának vizsgálata. Továbbá az immunrendszer
szabályozásában központi szerepet betöltő gének expressziós mintázatának analízise
postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus csontszövetekben.
4

CÉLKITŰZÉSEK
I. A postmenopausas csontvesztés transzkripciós és genomikai szintű molekuláris
genetikai vizsgálata
I/a. Postmenopausas nőkből izolált csontszövet minták komplex génexpressziós
profil meghatározása
Célunk a csontanyagcserében és a csont homeosztázisában nélkülözhetetlen
szerepet játszó, előre leválogatott közel 150 kandidáns gén menopausat követő
csontszöveti mRNS expressziós mintázatának vizsgálata ABI 7500 kvantitatív valós-
idejű RT-PCR rendszerben TaqMan Assay felhasználásával.
I/b. Postmenopausas nőkből izolált csontszövet minták immunológailag releváns
génexpressziós profiljának meghatározása
Különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gének
eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausas nőkben, osteo-
immunológiai megközelítésben.
I/c. Postmenopausas nők egypontos nukleotid polimorfizmusainak vizsgálata
Célunk új kandidáns gének egypontos nukleotid polimorfizmusainak
feltérképezése 353 magyar postmenopausalis nő genetikai mintájában. Annak
vizsgálata, hogy a szarvas modellben azonosított és a humán mintákon validált, a
csontritkulás pathomechanizmusában potenciális szereppel bíró gének allélikus
variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra.
II. A glükokortikoid indukálta csontvesztés in vitro génexpressziós hatásai
osteoblast sejteken
Egy ismert glükokortikoid analóg, a dexametazon a csont fejlődésében,
életképességében szerepet játszó gének expressziójára kifejtett hatásának vizsgálta
immortalizált egér csontsejtvonal (MC3T3-E1) és egér calvariából izolált osteoblastok
felhasználásával. A feltételezhetően szerepet játszó gének további vizsgálata
fehérjeszinten és géncsendesítési (gén knock-down, siRNA) kísérletekben.
5

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
1. Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők vizsgálati csoportja
A postmenopausas nem osteoporotikus csoportban (POST csoport) 10 csontmintát
elemeztünk, míg a kontrollként használt premenopausas nem osteoporotikus csoport (PRE
csoport) 7 nő csontmintáját tartalmazta. A postmenopausalis nők életkorának medián értéke
55.00 év (tartomány: 47-57). A kontroll premenopausalis nők életkorának medián értéke
52.00 év (tartomány: 50-57). Nem találtunk szignifikáns különbségeket a vizsgált POST és
PRE csoportok átlag életkorában, csont-ásványianyag tartalmában, dohányzását illetően,
bevitt kalcium mennyiségében, alkohol és kávé fogyasztásában, fizikai aktivitásában, illetve
nem részesültek semmilyen biológiai terápiában. Azonban erőteljes szignifikáns eltéréseket
észleltünk a szérum ösztradiol szintekben (p = 0,0006) és a csontanyagcsere markereinek
koncentrációiban, azaz; osteocalcin (p = 0,002) és beta-crosslaps (p = 0,01) értékek esetében
a két vizsgálati csoport alkotó nők tekintetében.
2. Az egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) analízisek vizsgálati csoportja
A polimorfizmus vizsgálatokhoz 353 magyar, független mintaválasztásból származó
postmenopausalis stádiumú nő vérmintáját gyűjtöttük össze (5. táblázat). A kiválasztott nőkön
a Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászati Klinikáján csontsűrűség mérés történt kettős
energiájú röntgensugár - abszorpciometria (DEXA) segítségével. A BMD értékeket a
lumbalis gerinc (L2-L4) és a teljes femur vonatkozásában Lunar Prodigy DXA készülékkel
(GE Medical Systems, Diegem, Belgium), a radiust tekintve Norland pDEXA denzitométerrel
(CooperSurgical Inc, Trumbull, CT, USA) határoztuk meg. A vizsgálatból kizártuk azokat a
résztvevőket, akiknél endokrinológiai vagy egyéb krónikus betegségek gyanúja merült fel,
illetve akik hormonpótló terápiában vagy egyéb olyan gyógyszeres kezelésben részesültek,
amely befolyásolhatja a csontanyagcserét. Továbbá, nem kerültek bevonásra azok a
személyek, akik szérum ALPL, TSH, PTH, 25-OH D-vitamin szintjében a normálértékektől
eltérés volt tapasztalható.
3. Humán csontszövet minták izolálása
A vizsgálatainkban felhasznált humán csontminták a diagnosztizált III. stádiumú primer
osteoarthritist gyógyító műtétet szolgáló csípőizületi totál endoprotézis beépítésekor
leforgácsolódott csontszövet darabok összegyűjtéséből származtak. A primer osteoarthritis
minősítése az Amerikai Ortopédsebészeti Társaság (AAOS) ajánlásával a Kellgren-Lawrence-
féle rendszer alapján történt. A gyűjtést követően a friss mintákat azonnal alaposan
megtisztítottuk a csontvelőtől, illetve egyéb vérszennyeződésektől PBS felhasználásával,
majd folyékony nitrogénben tároltuk. A vizsgálat a Semmelweis Egyetem Tudományos és
Kutatásetikai Bizottsága által jóváhagyva készült (SOTE-TUKEB 6392-1/2004-1018EKU,
6

SOTE-TUKEB 33/2008). Minden betegtől – részletes felvilágosítás után – írásos beleegyező
nyilatkozatot is kértünk.
4. Direkt messenger RNS (mRNS) szeparálás csontszövetből
A humán csontmintákat folyékony nitrogén alatt elporítottuk freezer-mill 6750 készülék
segítségével. Az RNS izolálást Dynabeads Oligo (dt)25 kit felhasználásával végeztük. Ezután
az mRNS-t 2 µl DN-áz I. enzimmel kezeltük. Az mRNS tisztítását a NucleoSpin RNA Clean-
up kit segítségével a gyártó előírása szerint végeztük. A humán mRNS-t cDNS-re fordítunk át
reverz transzkripció során, random primer és ribonukleáz inhibitort felhasználása mellett.
5. DNS szeparálás perifériás vérből
A polimorfizmus meghatározásokhoz összegyűjtött 353 résztvevő EDTA-s vérmintájából
genomiális DNS-t izoláltunk Roche High Pure PCR Template Purification kit
felhasználásával. A tisztított DNS minőségét és mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel
határoztuk meg, majd minden mintát 10 ng/µl DNS végkoncentrációra higítottunk.
6. A vizsgált gének kiválasztása a génexpressziós analízisekhez, kvantitatív valós idejű
RT-PCR és a vizsgálati csoportok statisztikai összehasonlítása
Kvantitatív valós idejű RT-PCR módszer alkalmazásával olyan kandidáns géneket
vizsgáltunk melyek eltérő génexpressziós aktivitása szerepet játszhat a menopausat követően
megváltozott csontszöveti anyagcsere-folyamatok kialakulásában. A kvantitatív real-time
PCR-hez előre megtervezett és validált gén-specifikus TaqMan próba alapú génexpressziós
Assayt használtunk az Applied Biosystemstől. A kiválasztott 147 gén amplifikálásához ABI
Prism 7500 valós idejű PCR rendszert használtunk.
7. Gének és SNP-k kiválasztása a genomikai analízisekhez, genotipizálás
Az SNP analízisekhez öt olyan, humán csontszövetben expresszálódó gént (ALPL, MMP2,
TIMP2, FGFR1, FABP3) választottunk, amelyek vizsgálataink szerint is meghatározó
szerepet tölthetnek be a csontanyagcserében. A kiválasztott 21 SNP-kről elmondhatjuk, hogy
az „in silico” kapcsoltsági adatok alapján a genotipizált SNP-k 29%, 80%, 64%, 41% illetve
55%-os mértékben reprezentálják az ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2 és TIMP2 gének (és
upstream illetve downstream nem kódoló régióik) összes allelikus variánsát r 2 >0.8
valószínűséggel.
8. Többváltozós transzkriptomikai adatelemzések
A nagyszámú vizsgált gén illetve SNP egyes mintacsoportokkal összefüggéesit hagyományos
statisztikai adatelemzések mellett többváltozós (multiparametrikus) elemzésekkel is
vizsgáltuk. A diszkriminancia elemzés (Discriminant Function Analysis, DFA) segítségével
egyes eleve megadott géncsoportok közötti elválások maximalizálhatók, míg a A
főkomponens analízis (Principal Components Analysis, PCA) egy standard technika, amely
7

széles körben alkalmazható az orvosbiológiai kutatásokban, különösen microarray és egyéb
génexpressziós adattömegek statisztikai kiértékelésében. A módszer összegzi a multivariációs
adatrendszereket néhány fontos, egymástól független és az eredeti adatstruktúrát jól tükröző
dimenzióba, mely dimenziókat komponenseknek nevezünk.
9. A glükokortikoid indukálta csontvesztés vizsgálatához használt csontsejt kultúrák,
sejt életképességi tesztek, kezelések
Az in-vitro kísérletekhez egér calvariából izolált osteoblastokat és egér pre-osteoblast
sejtvonalat, MC3T3-E1 sejteket használtuk fel. Jelen tanulmányban felhasznált konfluens
MC3T3-E1 sejteket differenciált osteoblastoknak tekintettük mivel az osteocalcin (késői
osteoblast differenciációs marker) jól mérhetően kifejeződött bennük. A dexametazon
kezeléseket, sejtéletképességi vizsgálatokat és fluoreszcencia aktiválta áramlási citometria
(FACS) méréseket a gyártók előírásai szerint alkalmaztuk.
10. Totál RNS preparálás egér sejtekből, mennyiségi valós idejű polimerizációs
láncreakció és az adatok statisztikai értékelése
A sejtekből totál RNS-t izoláltunk spin-column módszerű eljárással, Roche High Pure Total
RNA Isolation System segítségével. A cDNS-sé átfordított mintákat triplikátunként
vizsgáltunk ABI Prism 7500 real-time PCR rendszeren. A glükokortikoid indukálta
csontvesztés expressziós vizsgálatához kiválogatott 110 gén expresszió adatainak a
kiértékeléséhez hagyományos statisztikai módszereklet használtunk.
11. A BMP-8 fehérje Western blot analízise és siRNS kezelés alapú géncsendesítés
Az MC3T3-E1 sejtekből western blot technika segítségével határoztuk meg a dexametazon
kezelés hatására szignifikánssan megváltozó BMP-8 fehérje mennyiséget, míg a vizsgált
fehérje funkcionális szerepét Ambion siRNS alapú géncsendesítéses vizsgálatokkal igazoltuk.
EREDMÉNYEK
1. Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők csontszöveti
génexpressziós mintázatának vizsgálata egyváltozós Mann-Whitney U teszt segítségével
Hét kollagén molekula (COL2A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL12A1,
COL15A1), három nem-kollagén típusú extracelluláris mátrix (ECM) molekula (MGP,
BGLAP, FN1) és két szerves mátrix bontó enzim (MMP13, BMP1) génkifejeződési mintázata
szignifikánsan nagyobb volt a postmenopausalis stádiumú nem osteoporotikus csontban.
Postmenopausas nőkben a közös TGFB/BMP jelátviteli hálózatba tarozó öt gén (BMPR1A,
TGFB2, TGFB3, TGFBR2, SMAD4) nagyobb transzkripciós aktivitását észleltük.
Ugyanebben a csoportban két nélkülözhetetlen osteoblast specifikus transzkripciós faktor
(RUNX2, SP7) és újabb kettő, amely a Wingless útvonalban (TCF7L2) illetve a porcsejtek
8

érésében (SOX9) játszik szerepet, megnövekedett génexpressziós szintet mutatott. Két MAPK
(mitogénaktivált protein kináz) kaszkád által szabályozott növekedési faktor génje (PDGFA,
FGFR1), valamint két osteoclast stimuláló faktor (TNFSF11/RANKL, IL6) és egy, a
differenciálódott osteoblastokat jelző molekula (ALPL) génátíródása is felerősödött a
postmenopausas csoportban.
2. Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők csontszöveti
génexpressziós mintázatának vizsgálata többváltozós statisztikai analízisek segítségével
Diszkriminancia adatelemzést (dfa) alkalmaztunk, hogy a postmenopausas és premenopausas
csoportot multidimenzionális térben elkülönítsük a csontszöveti génexpressziós adataik
alapján, illetve meghatározzuk azokat a géncsoportokat, amelyek a legnagyobb
diszkriminációs képességgel rendelkeznek. Az ER-béta által szabályozott gének csoportja
rendelkezett a legnagyobb megkülönböztető erővel, amely egyértelműen szétválasztotta a
post- és premenopausas csoportokat. Az ECM fehérjéket kódoló gének csoportja és a
TGFB/activin/nodal szabályozási útvonalhoz kapcsolódó gének szintén erős korrelációt
mutattak a kanonikus változóval és a vizsgált nem osteoporotikus nők két csoportjának
határozott szétválasztását tették lehetővé. A növekedési faktorok és a BMP kaszkád génjei
gyengébb elkülönítő erővel bírtak (1. ábra)
BMP útvonal
WNT útvonal
TGFB/activin/nodal útvonal
Növekedési faktorok/MAPK útvonal
Lipid anyagcsere
ER-béta jelátvitel
ER-alfa jelátvitel
TGFB/BMP útvonal (p ≤ 0.05)
ECM (p ≤ 0.05)
-12
-10
-8
9
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
POST
PRE
1. ábra: Tíz postmenopausas nem osteoporotikus (POST, fekete rombusz) és hét premenopausalis nem
osteoporotikus (PRE, üres rombusz) nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.
Főkomponens analízis alapján elmondhatjuk, hogy a premenopausas nők mérsékelt
génexpressziós aktivitással jellemezhetők, ezért egy relatív kompakt csoportot képeznek az 1-
es és 2-es komponensek mentén negatív irányban (2.ábra).
12
14
16

14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
POST08
1
0
POST11
-1
-2
-3 PRE07
-4 PRE04
-5
-6
POST10
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Component 1
POST03
14
13
12
11
10
9
8
POST07
7
6
POST01
5
4
PRE01
POST04
3
2
POST02 POST08
1
0
POST11
-1PRE05
POST06
PRE06 -2 PRE02
-3 PRE07
-4 PRE04
-5
-6
POST10
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
PRE03
-14
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Component 1
POST03
POST07
POST01
PRE01
POST04
POST02
PRE05
POST06
PRE06 PRE02
PRE03
15
Component 2
10
10
12
POST05
2. ábra: A PCA diagramon a 17 vizsgált nő pozíciója látható a két főkomponens mentén.
A csontszöveti komplex génexpressziós mintázat alapján a postmenopausalis és
premenopausalis fenotípusok elkülönülnek egymástól. A nagyon hasonló transzkripciós
aktivitással rendelkező premenopausas nők (fehér PRE) egy diszkrét csoportot képezve
elválnak a postmenopausas (fekete POST) nőket magában foglaló halmaztól.
3. Az immunrendszer működését szabályozó gének expressziós változásainak valós idejű
RT-PCR vizsgálata postmenopausas csontszövetben
A 3. ábrán mutatjuk be a szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató 9 gén expressziós
változására vonatkozó adatait (RQ POST / RQ PRE) 17 nem osteoporotikus nő
csontszövetében.
14
16

GAPDH-hoz viszonyított
relatív génexpresszió
1000,00
100,00
10,00
1,00
0,10
0,01
0,00
C3
CD14
CD86
HLA-A
11
IL-10
IL-6
ITGAM
TGFB3
POST
PRE
TNFSF11
3. ábra: Szignifikánsan megváltozott expressziós mintázatot mutató 9 gén mRNS-ének relatív mennyisége 10
postmenopausalis (fekete oszlop) vs. 7 premenopausalis stádiumú nem osteoporotikus (szürke oszlop) nő
csontszövetében log skálán feltüntetve.
Hat, különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gén
ötszörös illetve annál nagyobb mértékben megnövekedett expressziós mintázattal rendelkezik
a postmenopausas csontban. A transzkripció fokozódásának mértéke a postmenopausas
csontban a premenopausas nem osteoporotikus csontszövethez viszonyítva a C3 esetén 5,15-
szoros, a CD86 esetén 5,91-szoros, az IL-10 esetén 6,97-szoros, az IL-6 esetén 6,43-szoros a
TGFB3 esetén 3,34-szoros, a TNFSF11 esetén pedig 18,49-szoros volt (10. ábra). Három gén
kifejeződése csökkent postmenopausalis állapotban. A represszió mértéke a CD14 esetén
18,32-szoros, a HLA-A esetén 8,69-szoros, végül az ITGAM esetén pedig 5,63-szoros volt.
Az immunológiailag releváns gének közül DFA kiértékelés alapján a legerőteljesebb
diszkriminációs hatás a T-limfociták működésében, és annak szabályozásában szerepet játszó
gének esetén volt azonosítható, mely génhalmaz élesen elválasztotta a POST és PRE
csoportokat (4. ábra).

9
7
5
3
1
-1
-3
-5
-7
-9
-11
-13
- POST - PRE
T sejt aktiváció B sejt aktiváció
Gyulladási
reakció
Komplementrendszer Fagocitózis Antigén prezentáció
Korr.
Korr.
Korr.
Korr.
Korr.
Gén KV. Gén KV. Gén KV. Gén Korr. KV. Gén
KV. Gén
KV.
CD86 0.579 CD86 0.638 ICAM1 0.570 C3 0.529 TLR4 0.469 CD86 0.585
TNFSF11 0.564 IL-10 0.572 IL-12A 0.453 IFNG 0.364 SCARA3 0.344 TNFSF11 0.569
IL-10 0.519 CD40 0.487 IL-8 -0.104 IL-6 0.330 FCGR2A -0.010 CD40 0.446
CD40 0.442 IFNG 0.368 TNF -0.192 IL-1B 0.254 ITGAX -0.118 IFNG 0.337
IFNG 0.334 IL-6 0.317 IL-1B -0.315 TNF 0.154 VCAM1 -0.129 TNFRSF11 0.330
IL-6 0.288 TGFB1 0.154 IL-6 -0.401 C5R1 -0.003 ICAM1 -0.474 IL-6 0.291
HLA-
IL-1B 0.226 DRB1 -0.069 IFNG -0.465 ITGAX -0.114 ITGAM -0.515 IL-1B 0.229
HLA-
TGFB1 0.139 CD80 -0.140 C1QA -0.453 ITGB2 -0.544 DRB1 -0.063
TNF 0.138 IL-7 -0.337 ITGAM -0.500 CD14 -0.614 VCAM1 -0.113
HLA-
DRB1 -0.062
ITGB2 -0.528 CD80 -0.128
CD80 -0.127 IL-12A -0.329
IL-7 -0.306 ICAM1 -0.414
IL-12A -0.326 HLA-A -0.670
HLA-A -0.664
4. ábra: Tíz postmenopausalis (POST, fekete vonal) és hét premenopausalis nem osteoporotikus (PRE, fehér
vonal) és nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.
4. Új génpolimorfizmusok összefüggése a postmenopausalis csontvesztéssel
A SNPstream genotipizálási módszer technikai pontossága 100%-os volt vizsgálatunkban,
azaz a párhuzamosan genotipizált minták eredményeiben nem volt eltérés. A végső
adatbázisunk tehát 21 SNP genotípsuát és 353 személy adatait tartalmazta (összesen 7413
validált genotípus eredmény). Az FGFR1-ben található rs6996321 SNP szignifikáns
kapcsolatot mutatott a lumbalis BMD-vel (a mean BMD±S.E.M. 0,858±0,013; 0,912±0,015
és 0,916±0,029 a G/G, A/G és A/A genotípusok esetén). A korrigált BMD értékek
szignifikáns különbséget mutattak a domináns genetikai modellben (a korrigált BMD
különbségek -0,031±0,011 és 0,031±0,011 g/cm 2 voltak a G/G és a A/G+A/A csoportok
esetén, p=0,002) (12. ábra). A FABP3-ban található rs10914367 polimorfizmus homozigóta
recesszív genotípusa szignifikánsan magasabb BMD-t eredményezett a teljes femur
tekintetében (a mean BMD±S.E.M. 0,783±0,009; 0,776±0,028 és 0,945±0,029 volt a G/G,
12

A/G és A/A genotípusokban, míg a korrigált BMD különbségek a recesszív modellben -
0,004±0,008 és 0,143±0,037 voltak a G/G+A/G és az A/A csoportokban, p=0,028) (5. ábra).
Korrigált lumbális BMD
0.050
0.025
0.000
-0.025
-0.050
G/G
n=166
rs6996321
(p=0,002)
A/G + A/A
n=187
13
Korigált femur BMD
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
-0.05
G/G + A/G
n=342
5. ábra: Egyedi SNP-k összefüggése a csontdenzitással.
rs10914367
(p=0,028)
5. A glükokortikoid indukálta csontvesztés in vitro vizsgálata, sejtéletképesség
Az egér osteoblast sejtekeket különböző koncentrációjú dexametazon (DEX) mellett
tenyésztettük 1-48 órán keresztül. A sejtéletképességet meghatározva 1,1 ± 0,8 nM EC50
értéket kaptunk MC3T3-E1 és 3,7 ± 2,3 nM calvaria osteoblast sejtek esetében. A FACS és a
konfokális lézer scanning mikrószkópos eredmények alapján apoptotikus sejthalált
igazoltunk.
6. A DEX hatása a génexpressziós profilra MC3T3-E1 és calvaria osteoblastokon
A DEX transzkripció moduláló hatását egymással párhuzamosan növesztett, DEX
kezelésben részesült és kezeletlen sejtkultúrák eredményeinek összehasonlításával vizsgáltuk.
. A 110 vizsgált gén közül az MC3T3-E1 sejteken 5, míg calvaria sejteken 6 mutatott
szignifikánsan megváltozott kifejeződést. Ezek közül 5 gén azonos volt a két osteoblast típus
esetében, de találtunk egy génterméket a calvaria sejteken, amit nem sikerült detektálni az
immortalizált sejtvonalon (1. táblázat).
A/A
n=11
1. táblázat: Hat, calvaria sejteken szignifikáns génexpresszió változást mutató gén
0,1 µM/16 óra DEX kezelés hatására.
Gén szimbólum Calvaria osteoblast MC3T3-E1 sejtvonal
Átlag SD P érték Átlag SD P érték
BMP-4 1,39 0,11 0,03 1,95 0,14 0,02
BMP-8 14,72 2,42 0,00 51,46 3,84 0,00
COL2A1 0,55 0,12 0,04 0,66 0,11 0,02
COL9A1 1,71 0,19 0,01 n/a n/a n/a
MMP2 1,42 0,15 0,04 2,16 0,19 0,01
Smad3 0,43 0,05 0,03 0,36 0,01 0,00

A mennyiségi valósidejű RT-PCR eredményeket a kezelten kontroll sejtek eredményeire normalizáltuk és
arányként jelenítettük meg.
Kísérleteinkben két nagyságrendbeli emelkedést tapasztaltunk a BMP-8 mRNS esetében 16
órás DEX kezelés eredményeképpen. A DEX mindkét osteoblast típusú sejt esetében idő és
koncentrációfüggő BMP-8 kifejeződés változást indukált (6.ábra) a BMP-8 géntermék fehérje
szintű emelkedését western blottal igazoltuk.
mRNS kifejeződés (a.u.)
60
50
40
30
20
10
0
a, b,
UTC 30m 1h 3h 5h 24h
Calvaria
MC3T3-E1
14
mRNS kifejeződés (a.u.)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
UTC 1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M
Calvaria
MC3T3-E1
6. ábra: BMP-8 mRNS relatív expressziója osteoblast sejteken. Az a panelen az időfüggő BMP-8 expresszió
változásokat láthatunk (0,1 µM DEX). A b panelen a koncentráció BMP-8 expresszió változásokat láthatunk (16
óra). A BMP-8 relatív expressziókat GAPDH kifejeződésre normalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk
(a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak.
A szignifikancia értékeket az adott minta és az UTC között számoltuk (*: P < 0,05, **: P < 0,01).
7. A BMP-8 gén kifejeződésének gátlása / géncsendesítés siRNS rendszer
felhasználásával, funkcionalitás bizonyítása
Kimutattuk a BMP-8 specifikus mRNS 9,7-szeres csökkenését 24 órás 1 nM DEX
kezelést követően siRNS módszerrel (7. ábra). Ez a 89%-os BMP-8 specifikus géncsendesítés
szignifikánsan növelte az MC3T3-E1 sejtek pusztulását a kontrollhoz képest. A 24 órás DEX
kezelés hatására bekövetkező sejthalál 6,9%, 10,8% és 21,9%-ról 11,0%, 32,6% és 38.7%-ra
növekedett 1, 10, 100 nM DEX jelenlétében a géncsendesítés eredményeként.

Cell death (%)
50
40
30
20
10
0
*
1 10 100
DEX concentration (nM)
15
*
negative control
siRNA
Bmp-8 siRNA
7. ábra: BMP-8 gén specifikus géncsendesítése fokozza a DEX indukálta sejthalált MC3T3-E1 sejteken. A
különdöző DEX koncentrációk mellett előkezelt sejteket BMP-8 specifikus (■) és negatív kontroll (□) siRNS-
KÖVETKEZTETÉSEK
ekkel transzfektáltuk 20 nM koncentrációban / 48 órát. (*: P < 0,05)
Az postmenopausas csontvesztést befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai
tényezők egymással való kapcsolata teljes egészében nem ismert. Az egyes gének,
génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban. A menopausat
követő multifaktoriális változások hátterében poligénes hatás és az egyes gének egymással
való interakciója valószínűsíthető.
• Vizsgálatunkba a postmenopausalis és premenopausas nők csontszövetében
szignifikánsan eltérő génexpressziós mintázatot mutattunk ki. A genetikai
adatelemzésben új megközelítési módok, ill. statisztikai rendszerek alkalmazása
(DFA, PCA) lehetővé tették számos olyan új gén, illetve géncsoport azonosítását,
amelyeket a menopausa csontra kifejtett hatásaival eddig még nem hoztak
összefüggésbe. A transzkripciós hálózatban megfigyelt változások tovább segíthetik
az ösztrogén hiányában módosuló csontanyagcsere folyamatok megértését.
• Kimutattuk a postmenopausalis csont immunológiai szempontból meghatározó
transzkriptomikai eltéréseit és a genetikai adatok alapján egyértelműen
megkülönböztettük a postmenopausalis és premenopausalis fenotipusokat.
Azonosítottunk olyan, az immunrendszer működéséhez szorosan kapcsolt géneket,
amelyek markánsan megváltozott kifejeződése eddig nem volt ismert a
postmenopausalis csontvesztés vonatkozásában.

• Kutatómunkánk során néhány gén – ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2 –
polimorfizmusainak összefüggését vizsgáltuk a postmenopausalis csontvesztéssel. Az
öt gén új kandidánsként szerepelhet a további humán vizsgálatokban, mivel az
ortológ-modell, a szarvas-agancsképzés kapcsán kerültek először látóterünkbe,
génexpressziós változásaikat humán csontszövetben is leírtuk.
Régóta tudjuk, hogy a tartós, szisztémás glükokortikoid kezelés egyik jelentős
mellékhatása a csontvesztés. Az elöregedő, jelentős gyógyszer felhasználó civilizált
társadalmak számára minden tekintetben fokozódó problémát jelentenek a csontrendszer
megbetegedései. Az ezekben szenvedő emberek száma emelkedik, azonban a pontos ok-
okozati összefüggésekről, lezajlásuk lépéseiről nagyon kevés információ áll
rendelkezésünkre. Munkánk során a nyugati felnőtt lakosság jelentős részét érintő szteroid
okozta csontvesztés a megnövekedett glükokortikoid mennyiség hatására, a
csontanyagcserében szerepet játszó gének kifejeződésében bekövetkező változásokat
kerestünk.
• Eredményeink azt mutatják, hogy a GC terápia egyértelmű génexpressziós profil
változást eredményez olyan gének esetében is, amelyek jelentős szerepet játszanak a
csontfejlődésben és a remodellingben aktívan résztvevő csontsejtek működésében.
Ezek a változások csökkent csontképződés és növekedő csontbomlás irányába
mutatnak, amelyek a csonttömeg csökkenéséhez vezetnek.
• A csontmetabolizmusban új szereplőnek számító BMP-8 kifejeződésében bekövetkező
markáns változások vélhetően további kutatásokat indukálhatnak, amelyek jelentősen
hozzájárulhatnak a glükokortikoid indukálta csontvesztés pathomechanizmusának
jobb megértéséhez. A géncsendesítéses vizsgálatok bizonyították a BMP-8 fontos
szerepét a GC jelek továbbításában osteoblastokon, a knock-down eredmények a
BMP-8, a DEX hatással szembeni, védő szerepét támasztják alá.
16

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
Originális cikkek kumulatív impakt faktora (IF): 51,281
Az értekezés témájával összefüggő saját közlemények jegyzéke
János P. Kósa*, Bernadett Balla*, János Kiss, Adrienn Borsy, János Podani, István Takács,
Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Gábor Speer, László Orosz and Péter Lakatos:
Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of non-osteoporotic women
Menopause 2009 March;16(2):367-377 IF: 3,452
* These authors equally contributed to this work
János P. Kósa*, Bernadett Balla*, János Kiss, János Podani, István Takács, Áron Lazáry,
Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Attila Karsai, Gábor Speer, Péter Lakatos:
Postmenopausal Expression Changes of Immune System-Related Genes in Human Bone
Tissue J Clin Immunol. 2009 Aug 7. [Epub ahead of print]DOI 10.1007/s10875-009-9321-9
* These authors equally contributed to this work IF: 3,248
Bernadett Balla; János P. Kósa; János Kiss; János Podani; István Takács; Gábor Speer;
Krisztián Bácsi; Áron Lazáry; Zsolt Nagy; Péter Lakatos: Transcriptional profiling of immune
system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone
tissue Clin Immunol. 2009 May;131(2):354-9. IF: 3,606
Borsy, Adrienn; Podani, János; Stéger, Viktor; Balla, Bernadett; Kósa, János P.; Gyurján Jr.,
István; Molnár, Andrea; Szabolcsi, Zoltán; Szabó, László; Jáko, Eéna; Zomborszky, Zoltán;
Nagy, János; Vellai, Tibor; Lakatos, Péter; Orosz, László: Identifying novel genes involved in
both deer physiological and human pathological osteoporosis Molecular Genetics and
Genomics 2009 Mar;281(3):301-13. IF: 2,838
Balla Bernadett, Kósa János, Takács István, Kiss János, Podani János, Borsy Adrienn,
Lazáry Áron, Bácsi Krisztián, Nagy Zsolt, Speer Gábor, Orosz László, és Lakatos Péter:
Menopauza hatása a csontszöveti génkifejeződésre posztmenopauzás és premenopauzás korú
nem oszteoprotikus nőkben Magy Belorv Arch 2008; 61(3):208-219. IF: -
Áron Lazáry*, János P. Kósa*, Bálint Tóbiás, Judit Lazáry, Bernadett Balla, Krisztián Bácsi,
István Takács, Zsolt Nagy, Tibor Mező, Gábor Speer, Péter Lakatos: Single nucleotide
polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture
risk Eur J Endocrinol. 2008 Aug;159(2):187-96. IF: 3,791
* These authors equally contributed to this work
Bernadett Balla * , János P. Kósa * , János Kiss, Adrienn Borsy, János Podani, István Takács,
Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Gábor Speer, László Orosz and Péter Lakatos:
Different Gene Expression Patterns in the Bone Tissue of Aging Postmenopausal
Osteoporotic and Non-osteoporotic Women Calcif Tissue Int. 2008 Jan;82(1):12-26.
* These authors equally contributed to this work IF: 2,737
17

Kósa P. János, Kis Adrián, Bácsi Krisztián, Nagy Zsolt, Balla Bernadett, Lazáry Áron,
Takács István, Speer Gábor és Lakatos Péter: Új, a glükokortikoidok csontsejtekre gyakorolt
hatásának közvetítésében szerepet játszó gének azonosítása izolált és immortalizált egér
osteoblast sejteken Magy Belorv Arch. 2007; 60. 435-441 IF: -
Áron Lazáry, Bernadett Balla, János P. Kósa, Krisztián Bácsi, Zsolt Nagy, István Takács,
Péter Varga, Gábor Speer and Péter Lakatos: Effect of gypsum on proliferation and
differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells.Biomaterials. 2007 28(3):393-9 IF: 6,262
További saját közlemények jegyzéke
Bácsi Krisztián, Kósa János, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Takács István, Nagy Zsolt, Speer
Gábor és Lakatos Péter: A kalciummetabolizmus jelentősége a csontritkulás és a colorectalis
daganat patogenezisében Orvosképzés 2009; LXXXIV, S2:101-110 IF: -
Szendrői Attila, Speer Gábor, Tabák Ádám, Kósa P. János, Horváth Henrik, Romics Imre,
Lakatos Péter: A D vitamin, ösztrogén és calcium sensing receptor genotípusainak valamint a
szérum kalciumnak a prosztatarák kialakulásában betöltött szerepe Uroonkológia (2009
March – elfogadott) IF: -
K. Bácsi, E. Hitre, J. P. Kósa, H. Horváth, Á. Lazáry, P. L. Lakatos, B. Balla, B. Budai, P.
Lakatos, G. Speer: Effects of the lactase gene 13910 C/T and calcium-sensing receptor gene
A986S G/T polymorphisms on the incidence and recurrence of colorectal cancer in Hungarian
patients. BMC Cancer. 2008 Nov 3;8(1):317. IF: 3,087
K. Bácsi, J. P. Kósa, Á. Lazáry, B. Balla, H. Horváth, A. Kis, Zs. Nagy, I. Takács, P.
Lakatos, G. Speer: LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density
in postmenopausal women. Osteoporos Int. 2009 Apr;20(4):639-45. IF: 4,290
Lazáry A, Speer G, Varga PP, Balla B, Bácsi K, Kósa JP, Nagy Z, Takács I, Lakatos P.:
Effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus
pulposus cells. J Orthop Res. 2008 May;26(5):601-607. IF: 2,963
Lazáry A, Balla B, Kósa J, Bácsi K, Nagy Z, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P.:
A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának összefoglalása. A gipsz szerepe a
csontpótlásban: molekuláris biológiai megközelítéssel, saját eredményeink alapján Orv Hetil.
2007 Dec 23;148(51):2427-33. IF: -
Bácsi Krisztián, Kósa János, Lazáry Áron, Horváth Henrik, Balla Bernadett, Speer Gábor,
Lakatos Péter: A CYP3A7-1C-polimorfizmus hatása a csont ásványianyag-tartalmára
posztmenopauzás nőkben Orv Hetil. 2007 Jul 8;148(27):1273-80. IF: -
Gábor Földvári, Márton Márialigeti, Norbert Solymosi, Zoltán Lukács, Gábor Majoros,
János P. Kósa, Róbert Farkas: Hard Ticks Infesting Dogs in Hungary and their Infection with
Babesia and Borrelia Species. Parasitol Res. (2007) 101:S25-S34 IF:1,512
Bácsi Krisztián, Kósa János, Lazáry Áron, Horváth Henrik, Balla Bernadett, Lakatos Péter és
Speer Gábor: A dehidroepiandroszteron és dehidroepiandroszteron-szulfát jelentősége
különböző kórállapotokban Orv Hetil. 2007 Apr 8;148(14):651-7 IF: -
18

Tóbiás Bálint, Both Mária és Kósa P. János: Egy genetikai kutatás eredményei a
biológiaórán A biológia tanítása. 2007. Jan; XV(1):12-18 IF: -
Folhoffer A, Ferenci P, Csak T, Horvath A, Hegedus D, Firneisz G, Osztovits J, Kosa JP,
Willheim-Polli C, Szonyi L, Abonyi M, Laszlo Lakatos P, Szalay F. : Novel mutations of the
ATP7B gene among 109 Hungarian patients with Wilson's disease Eur J Gastroenterol
Hepatol. 2007 Feb;19(2):105-111. IF: 1,830
Bacsi K, Kosa JP, Borgulya G, Balla B, Lazary A, Nagy Zs, Horvath C, Speer G, Lakatos P.:
CYP3A7*1C polymorphism, serum dehydroepiandrosterone sulphate level and bone mineral
density in postmenopausal women Calcif Tissue Int. 2007 Mar;80(3):154-9. IF: 2,435
Gábor Speer, Péter Szenthe, János P. Kósa, Ádám G. Tabák, Anikó Folhoffer, Péter Fuszek,
Károly Cseh and Péter Lakatos: Myocardial infarction is associated with the S allelic variant
of the Sp1 binding site polymorphism of collagen type 1A1 gene Acta Cardiol. 2006
Jun;61(3):321-325. IF: 0,519
Bajnok É, Takács I, Tabák Á, Speer G, Nagy Z, Horváth C, Mészáros S, Kósa J, Nyíri P,
Lakatos P: Génpolimorfizmusok lehetséges szerepe a toxikus adenoma és az azt kísérő
osteopathia kialakulásában. Magyar Belorvosi Archívum, 2006. 60:97-102. IF: -
Speer Gábor, Szenthe Péter, Kósa P. János, Tabák G. Ádám, Nagy Zsolt, Folhofert Anikó,
Cseh Károly, Lakatos Péter: Az 1-es típusú kollagén A1-génjének -1245 G/T polimorfizmusa
összefügg a miokardiális infarktussal: az új patogenetikai faktor? Cardiologia Hungarica
2005;35:64-69 IF: -
M. Sárvári, I. Vágó, C. S. Wéber, J. Nagy, P. Gál, M. Mák, J. P. Kósa, P. Závodszky and T.
Pázmány: Inhibition of C1q-beta-amyloid binding protects hippocampal cells against
complement mediated toxicity, Journal of Neuroimmunology, Volume 137, Issues 1-2, April
2003, 12-18 IF: 3,054
Tamas Pazmany, János P. Kósa, Thomas B. Tomasi, Laszlo Mechtler, Andrea Turoczi and
Attila Lehotzky: Effect of transforming growth factor-1 on microglial MHC-class II
expression, Journal of Neuroimmunology, Volume 103, Issue 2, 3 January 2000, Pages 122-
130 IF:3,355
Tamas Pazmany, Laszlo Mechtler, Thomas B. Tomasi, János P. Kósa, Andrea Turoczi and
Zoltan Urbanyi: Differential regulation of major histocompatibility complex class II
expression and nitric oxide release by –amyloid in rat astrocyte and microglia,
Brain Research, Vol 835, Issue 2, 24 July 1999, 213-223 IF:2,302
19

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Lakatos Péter professzor segítőkészsége közismert. Mégis megkülönböztetett tiszteletemet,
elismerésemet és külön baráti köszönetemet fejezem ki azért - a mellett, hogy a Klinikán
laboratóriumában biztosította a kutatómunkámhoz szükséges feltételeket - elindított ezen az úton,
valamint, hogy munkám során végig mellettem volt és határozottan támogatott. Szakmai
útmutatásán túl atyai jó tanácsai, kritikai megjegyzései is segítettek a dolgozat elkészítésében.
Korábbi közleményeim és jelen dolgozatom elkészítésében útmutatásai irányítottak.
Szeretném megköszönni témavezetőmnek, dr. Speer Gábor adjunktus úrnak baráti segítségét,
bíztatását a Ph.D. dolgozat megírására és természetesen, hogy elvállalta témavezetésemet és a
dolgozatom kijavításával is segítette munkámat.
Különös hálával tartozom dr. Takács Istvánnak, dr. Nagy Zsoltnak és dr. Tóth Tamásnak az együtt
végzett munkáért és a sok szakmai segítségért.
Köszönöm kutatócsoportunk tagjainak, elsősorban Balla Bernadettnek, dr. Lazáry Áronnak, dr.
Bácsi Krisztiánnak, dr. Kis Adriánnak, Tóbiás Bálintnak és mindazoknak, akik az elmúlt évek
során tanácsaikkal és kritikájukkal támogatták munkámat.
Köszönetemet fejezem ki Podani János professzor úrnak, aki megismertetett a többváltozós
statisztikával, nélküle a dolgozat statisztikai kiértékelése sokkal közérthetőbb és semmitmondóbb
lenne.
Köszönöm az ELTE Genetika tanszékén dolgozó kollégák segítségét, elsősorban Borsy
Adriennek, Stéger Viktornak, Vellai Tibor és Orosz László professzor uraknak.
Köszönöm laboratóriumunk minden kedves munkatársának, elsősorban Szabóné Sinkovits
Tünde, Keresztényi Györgyi és Máté Edit türelmét és gyakorlati segítségét.
Végül feleségem és lányaim segítségét köszönöm, akik az otthon melegét biztosították,
melyből bármikor erőt meríthettem.
20