értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

A soron következő RNS kivonást a BIO-RAD Aurum Total RNA Mini Kit-jével, a cDNS-sé
való átírást pedig a iScript cDNA Kit-jével végeztük a gyártó útmutatásai szerint.
A Real-time PCR futtatásához BIO-RAD iCycler iQ TM típusú készüléket használtunk, az
eredmények számítógépes értékelését pedig a Gene Expresion Macro TM Version 1.1 program
segítségével végeztük.
A reakció elegy összetétele az alábbi volt:
Összetevők: térfogat:
MQ víz 9 µl
2×iQ TM SYBR Green Supermix 12,5 µl
(SYBR Green PCR puffer, iTaq DNA polymeráz, dNTP mix,
SYBR Green I, 20 nM fluorescein, 6 mM MgCl2)
Primerek 10 pmol/µl 0,75 µl
cDNS templát (10×hígított) 2 µl
teljes térfogat: 25 µl
Az IL-8 (és GAPDH, mint referencia háztartási gén) real-time PCR-hez használt PCR
program, melynek első fázisában (az 1-2. szakasz során) az adatgyűjtés és elemzés, míg
második részében (a 3-5. szakasz során) az olvadáspont analízis zajlott:
1. szakasz: (1×) 94,0˚C 03:00 perc
2. szakasz: (40×)
1. lépés: 94,0˚C 00:15 perc
2. lépés: 62,0˚C 00:20 perc
3. szakasz: (1×) 95,0˚C 01:00 perc
4. szakasz: (1×) 65,0˚C 01:00 perc
5. szakasz: (60×) 65,0˚C 00:05 perc
Az olvadáspont meghatározás során az 5. szakaszban minden második lezajlott
ciklus után 0,5˚C-kal emeltük a hőmérsékletet, így jutva el 60 ciklus után 95˚C-hoz.
80