értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
A soron következő RNS kivonást a BIO-RAD Aurum Total RNA Mini Kit-jével, a cDNS-sé<br />
való átírást pedig a iScript cDNA Kit-jével végeztük a gyártó útmutatásai szerint.<br />
A Real-time PCR futtatásához BIO-RAD iCycler iQ TM típusú készüléket használtunk, az<br />
eredmények számítógépes értékelését pedig a Gene Expresion Macro TM Version 1.1 program<br />
segítségével végeztük.<br />
A reakció elegy összetétele az alábbi volt:<br />
Összetevők: térfogat:<br />
MQ víz 9 µl<br />
2×iQ TM SYBR Green Supermix 12,5 µl<br />
(SYBR Green PCR puffer, iTaq DNA polymeráz, dNTP mix,<br />
SYBR Green I, 20 nM fluorescein, 6 mM MgCl2)<br />
Primerek 10 pmol/µl 0,75 µl<br />
cDNS templát (10×hígított) 2 µl<br />
teljes térfogat: 25 µl<br />
Az IL-8 (és GAPDH, mint referencia háztartási gén) real-time PCR-hez használt PCR<br />
program, melynek első fázisában (az 1-2. szakasz során) az adatgyűjtés és elemzés, míg<br />
második részében (a 3-5. szakasz során) az olvadáspont analízis zajlott:<br />
1. szakasz: (1×) 94,0˚C 03:00 perc<br />
2. szakasz: (40×)<br />
1. lépés: 94,0˚C 00:15 perc<br />
2. lépés: 62,0˚C 00:20 perc<br />
3. szakasz: (1×) 95,0˚C 01:00 perc<br />
4. szakasz: (1×) 65,0˚C 01:00 perc<br />
5. szakasz: (60×) 65,0˚C 00:05 perc<br />
Az olvadáspont meghatározás során az 5. szakaszban minden második lezajlott<br />
ciklus után 0,5˚C-kal emeltük a hőmérsékletet, így jutva el 60 ciklus után 95˚C-hoz.<br />
80