értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
4. Az inkubáció után a felülúszóból hígítási sort készítettünk, meghatározandó a 2 órás<br />
baktérium csíraszámot.<br />
5. A sejteket tartalmazó petricsészékhez 3 ml kanamycinnel kiegészített MEM-et<br />
(Sigma) adtunk, majd inkubáltuk 1,5 órán át 37 C°-on, 5% CO2 jelenlétében.<br />
6. Az inkubáció leteltével eltávolítottuk a MEM-et, majd háromszor mostuk PBS-sel a<br />
sejt tenyészetet.<br />
7. Feloldottuk a sejteket 3 ml lízis oldat hozzáadásával (inkubáció: 30 perc 37 C°-on,<br />
CO2 nélkül), majd az inkubáció után pipettával szuszpendáltuk.<br />
8. Az így nyert lizátum felülúszójából hígítási sort készítettünk, majd BTK lemezekre<br />
szélesztettük, így határozva meg a Vero/CEF sejtek belsejébe jutott baktériumok<br />
számát.<br />
A kanamycin rezisztencia esetleges kialakulását a tesztelt baktériumtörzseken rendszeresen<br />
ellenőriztük.<br />
5.2.4. in vitro IL-8 indukciós kísérletek<br />
A Salmonella törzsek IL-8 indukciós képességét csirke embrió fibroblaszt (CEF) sejteken<br />
vizsgáltuk valós idejű (real-time) PCR segítségével. A sejtkultúra indukciója az alábbiak<br />
szerint zajlott:<br />
1. A CEF sejteket háromszor egymás után PBS-sel mostuk<br />
2. A tesztelendő baktérium egyéjszakás, stacioner TSB levestenyészetét 200-szorosára<br />
hígítottuk DMEM (Sigma) használatával, ezt használtuk a fertőzéshez. (A pontos<br />
kiindulási baktériumszám megállapításához tízes léptékű hígítási sort készítettünk, a<br />
hígításokat BTK agar felszínére szélesztettük (inkubáció: 37 C°, O/N).)<br />
3. Az így nyert hígított baktérium kultúra 3ml-ét adtuk a Vero/CEF sejtek tenyészetéhez<br />
petricsészében (36 mm átmérőjű, Nunc). A fertőzött sejteket 4 órán át 37 C°-on, 5%<br />
CO2 mellett inkubáltuk.<br />
4. Az inkubáció után a DMEM-et eltávolítjuk, majd steril PBS-sel háromszor mossuk a<br />
sejteket.<br />
5. Hogy a petricsészéről károsodás nélkül leválasszuk a sejteket, a sejtkultúrát 0,25%<br />
tripszint tartalmazó PBS 2 ml-ében inkubáljuk 5-10 percig 37˚C-on.<br />
79