értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

4. Az inkubáció után a felülúszóból hígítási sort készítettünk, meghatározandó a 2 órás
baktérium csíraszámot.
5. A sejteket tartalmazó petricsészékhez 3 ml kanamycinnel kiegészített MEM-et
(Sigma) adtunk, majd inkubáltuk 1,5 órán át 37 C°-on, 5% CO2 jelenlétében.
6. Az inkubáció leteltével eltávolítottuk a MEM-et, majd háromszor mostuk PBS-sel a
sejt tenyészetet.
7. Feloldottuk a sejteket 3 ml lízis oldat hozzáadásával (inkubáció: 30 perc 37 C°-on,
CO2 nélkül), majd az inkubáció után pipettával szuszpendáltuk.
8. Az így nyert lizátum felülúszójából hígítási sort készítettünk, majd BTK lemezekre
szélesztettük, így határozva meg a Vero/CEF sejtek belsejébe jutott baktériumok
számát.
A kanamycin rezisztencia esetleges kialakulását a tesztelt baktériumtörzseken rendszeresen
ellenőriztük.
5.2.4. in vitro IL-8 indukciós kísérletek
A Salmonella törzsek IL-8 indukciós képességét csirke embrió fibroblaszt (CEF) sejteken
vizsgáltuk valós idejű (real-time) PCR segítségével. A sejtkultúra indukciója az alábbiak
szerint zajlott:
1. A CEF sejteket háromszor egymás után PBS-sel mostuk
2. A tesztelendő baktérium egyéjszakás, stacioner TSB levestenyészetét 200-szorosára
hígítottuk DMEM (Sigma) használatával, ezt használtuk a fertőzéshez. (A pontos
kiindulási baktériumszám megállapításához tízes léptékű hígítási sort készítettünk, a
hígításokat BTK agar felszínére szélesztettük (inkubáció: 37 C°, O/N).)
3. Az így nyert hígított baktérium kultúra 3ml-ét adtuk a Vero/CEF sejtek tenyészetéhez
petricsészében (36 mm átmérőjű, Nunc). A fertőzött sejteket 4 órán át 37 C°-on, 5%
CO2 mellett inkubáltuk.
4. Az inkubáció után a DMEM-et eltávolítjuk, majd steril PBS-sel háromszor mossuk a
sejteket.
5. Hogy a petricsészéről károsodás nélkül leválasszuk a sejteket, a sejtkultúrát 0,25%
tripszint tartalmazó PBS 2 ml-ében inkubáljuk 5-10 percig 37˚C-on.
79