értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

5.2.2. Táptalajok, antibiotikumok
Standard bakteriális táptalajként LB (Sambrook és mtsai., 1989) és TSB tápfolyadékot (17 g
pepton, 3 g szójakivonat, 2,5 g glükóz, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 1 l deszt. vízben), valamint
LB tápagart használtunk. Az állatkísérletekben a szervinvázió és a bél baktérium titer értékek
meghatározásához Rappaport-Vassiliadis (RV) szelektív dúsítót (táplevesként valamint a
hígításokhoz) és Brómtimolkékes (BTK) differenciáló tápagart (Merck) (a baktérium titer
meghatározásához) használtunk a szalmonelláknak a háttérflórától ezúton való könnyebb
elkülöníthetősége miatt. Az antibiotikumokat (Sigma) minden esetben az alábbi
koncentrációban használtuk: nalidixinsav (Nal): 50 µg/ml, spektinomicin (Spe): 50 µg/ml,
kloramfenikol (Cm): 20 µg/ml. A kanamycin (Km) esetében 250 µg/ml volt a sejtkultúrák
esetében alkalmazott koncentráció.
A sejt inváziós és IL-8 indukciós vizsgálatok során médiumként 5% magzati borjú savóval
kiegészített MEM-et (Minimum Essential Medium) (Sigma), míg interakciós médiumként 1%
D-mannózzal és 5% magzati borjú savóval kiegészített DMEM-et (Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium) (Sigma) használtunk.
A sejtek feltárásához használt lízis oldat összetétele a következő volt: 0,025% tripszin és 1%
Tween 20 feloldva 0,01 M NaH2PO4 (pH=8) oldatban.
5.2.3. in vitro sejt inváziós kísérletek
A sejt inváziós kísérletek (Barrow és Lovell, 1989) Vero és csirke embrió fibroblaszt (CEFchick
embryo fibroblast) sejtek felhasználásával zajlottak az alábbiak szerint:
1. A Vero/CEF sejteket háromszor egymás után PBS-sel (Sambrook és mtsai., 1989)
mostuk
2. A tesztelendő baktérium egyéjszakás, stacioner TSB levestenyészetét 200-szorosára
hígítottuk DMEM (Sigma) használatával, ezt használtuk a fertőzéshez. (A pontos
kiindulási baktériumszám megállapításához tízes léptékű hígítási sort készítettünk, a
hígításokat BTK agar felszínére szélesztettük (inkubáció: 37 C°, O/N).)
3. Az így nyert hígított baktérium kultúra 3ml-ét adtuk a Vero/CEF sejtek tenyészetéhez
petricsészében (36 mm átmérőjű, Nunc). A fertőzött sejteket 2 órán át 37 C°-on, 5%
CO2 mellett inkubáltuk.
78