értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
5.2.2. Táptalajok, antibiotikumok<br />
Standard bakteriális táptalajként LB (Sambrook és mtsai., 1989) és TSB tápfolyadékot (17 g<br />
pepton, 3 g szójakivonat, 2,5 g glükóz, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 1 l deszt. vízben), valamint<br />
LB tápagart használtunk. Az állatkísérletekben a szervinvázió és a bél baktérium titer értékek<br />
meghatározásához Rappaport-Vassiliadis (RV) szelektív dúsítót (táplevesként valamint a<br />
hígításokhoz) és Brómtimolkékes (BTK) differenciáló tápagart (Merck) (a baktérium titer<br />
meghatározásához) használtunk a szalmonelláknak a háttérflórától ezúton való könnyebb<br />
elkülöníthetősége miatt. Az antibiotikumokat (Sigma) minden esetben az alábbi<br />
koncentrációban használtuk: nalidixinsav (Nal): 50 µg/ml, spektinomicin (Spe): 50 µg/ml,<br />
kloramfenikol (Cm): 20 µg/ml. A kanamycin (Km) esetében 250 µg/ml volt a sejtkultúrák<br />
esetében alkalmazott koncentráció.<br />
A sejt inváziós és IL-8 indukciós vizsgálatok során médiumként 5% magzati borjú savóval<br />
kiegészített MEM-et (Minimum Essential Medium) (Sigma), míg interakciós médiumként 1%<br />
D-mannózzal és 5% magzati borjú savóval kiegészített DMEM-et (Dulbecco’s Modified<br />
Eagle’s Medium) (Sigma) használtunk.<br />
A sejtek feltárásához használt lízis oldat összetétele a következő volt: 0,025% tripszin és 1%<br />
Tween 20 feloldva 0,01 M NaH2PO4 (pH=8) oldatban.<br />
5.2.3. in vitro sejt inváziós kísérletek<br />
A sejt inváziós kísérletek (Barrow és Lovell, 1989) Vero és csirke embrió fibroblaszt (CEFchick<br />
embryo fibroblast) sejtek felhasználásával zajlottak az alábbiak szerint:<br />
1. A Vero/CEF sejteket háromszor egymás után PBS-sel (Sambrook és mtsai., 1989)<br />
mostuk<br />
2. A tesztelendő baktérium egyéjszakás, stacioner TSB levestenyészetét 200-szorosára<br />
hígítottuk DMEM (Sigma) használatával, ezt használtuk a fertőzéshez. (A pontos<br />
kiindulási baktériumszám megállapításához tízes léptékű hígítási sort készítettünk, a<br />
hígításokat BTK agar felszínére szélesztettük (inkubáció: 37 C°, O/N).)<br />
3. Az így nyert hígított baktérium kultúra 3ml-ét adtuk a Vero/CEF sejtek tenyészetéhez<br />
petricsészében (36 mm átmérőjű, Nunc). A fertőzött sejteket 2 órán át 37 C°-on, 5%<br />
CO2 mellett inkubáltuk.<br />
78