értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

Az új plazmidűzési módszer a Salmonella Enteritidis 2102 törzs esetében hatékonyan
működött. A kezelés hatására a vizsgált mutánsok több mint 50%-a virulencia plazmidját
elvesztette. Ennél is magasabb lett a kanamycin szenzitív mutánsok aránya, melyek nem
feltétlenül vesztették el a teljes plazmidjukat, azonban legalább akkora deléció lejátszódott
plazmidjukon, amely az ott elhelyezkedő kanamycin rezisztencia gént érintette. Eljárásunk
hatékonyságát mutatja, hogy mindkét elvégzett párhuzamos kísérlet esetében a deléciós
mutánsok aránya több mint 70% volt (X. táblázat).
A módszer további előnye, hogy nem csak a teljes plazmid kiűzésére alkalmas, hanem –
amint azt a PCR és plazmid profil eredmények egybehangzóan mutatják - segítségével
részleges deléciók is létrehozhatók. Ezek a deléciós mutánsok főként ismeretlen plazmidok
esetében játszhatnak fontos szerepet, hiszen a deléciós származékok analízisével a plazmid
funkciója is meghatározható. A delécióval nyert csonkolt plazmidoknak ugyancsak fontos
szerepe lehet, ha az eredeti, natív plazmid visszatérését kívánjuk megakadályozni. Ilyen
esetben ugyanis a teljes elimináció helyett egy, a kívánt génektől mentes, de replikációra még
képes csonka plazmid kialakítása és fenntartása lehet a megoldás. Ez a szempont fontos lehet
a vakcina jelölt törzs fejlesztése során is, ha a virulencia plazmid képes a visszatérésre a
plazmid mentes törzsbe. A vakcina jelölt törzsben a virulencia plazmid eliminációja (vagy egy
kisebb méretű deléciós plazmid származék) egy újabb megkülönböztető jegyet jelent a vad
törzshöz képest.
A módszernek fontos tulajdonsága, hogy egyszerű, és olyan plazmidok eliminációja esetében
is alkalmazható, amelyek nem hordoznak fenotípusos markert, mivel PCR segítségével
viszonylag gyorsan azonosítható a célplazmidon bekövetkezett Tn10 inszerció. Olyan esetben
pedig, amikor ismeretlen szekvenciájú, de meghatározott fenotípussal rendelkező plazmidot
szeretnénk kiűzni, szintén használható. Ilyenkor a fenotípus eltűnése jelzi a Tn10 inszerciót.
A leírt transzpozon alapú plazmidűzési technika általánosan használható más fajok esetében
is, ha a szükséges komponensek (plazmidok, transzpozázok, antibiotikum markerek)
működnek az adott baktériumban. Saját (jelen dolgozatban nem ismertetett) adataink szerint
enterotoxikus Escherichia coli-ban szintén jól működik a módszer (Imre és mtsai., 2006).
A transzpozonok régóta alkalmazott eszközök a plazmid űzési eljárások során. Eleinte a
hagyományos módszerek esetében használták a kiűzendő plazmid jelölésére, nyomon
követésére például a Tn1, Tn5, Tn10 elemeket (Poppe és Gyles 1988). Majd a direkt
szelekciós módszerek esetébenben gyakran az „öngyilkos” gén plazmidra juttatását oldották
74